CN1297058A - 用移动终止分析检测核酸序列的变异 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测已知核酸序列预定的位点存在任何突变的方法。本方法用引物延伸分析来检测突变。用无标记的终止子与标记的非终止子一起补充引物延伸反应,来检测模板链上的第一个核酸碱基是否是突变体,该碱基相对于紧靠引物3′端的核酸碱基。在引物延伸反应中,终止子互补于模板链上的野生型碱基,该碱基相对于紧靠引物3′端的核酸碱基。非终止子是其它核苷酸,而且有标记。当终止子掺入引物延伸链时,引物延伸反应终止。引物延伸链上标记的非终止子的掺入,显示预定的核酸碱基位点发生了突变。

Description

用移动终止分析检测核酸序列的变异
本发明涉及核酸序列检测领域。本发明涉及一种检测在感兴趣的预定的核酸碱基位点上任何类型突变的方法。本发明指的方法称为移动终止分析，也称为特异性终止分析，或移动终止子序列对比(alignment)(可缩写为STA)。
本发明方法的实践应用包括遗传病的诊断、传染病的诊断、法医技术、亲子鉴定(paternity determinations)和基因组作图，其中被检测的突变位点是已知的。
过去十年，已鉴定了遗传中易于形成癌症的基因，而且鉴定了许多与癌症相关的突变。用于这些突变的诊断测试提供了对个体癌症出现可能性更精确的预计。对癌症相关突变的早期诊断是本发明的目的之一。
基因突变有四种主要类型。第一种是点突变，是由正常DNA序列中单个核苷酸的替代造成的。大部分情况中，这种突变造成编码链读框移位，导致正常蛋白合成的终止。在家族性腺息肉病(FAP)患者中发现的APC基因的点突变就是一种典型例子(Kinzler等人，Science 253,661-665(1991);Joslyn等人，Cell 66,601-613(1991);Nishisho等人，Science 253,665-669(1991))。第二种是插入突变，其中单个或多个核苷酸被插入到正常DNA序列中。第三种是缺失突变，其中在正常DNA序列中缺失了单个或多个核苷酸。插入突变和缺失突变都将造成严重的变化，如读框移位、蛋白合成的早期终止和一个或多个氨基酸的增加或缺少。第四种是基因易位，发生在基因片段掺入另一基因时。在慢性骨髓性白血病患者中发现的费城染色体就是这种现象的例子(Konopka等人，Cell 37 1035(1984))。蛋白结构的改变造成细胞的一系列紊乱，从而导致癌症的起病。
在无数正常的DNA中检测一个突变的DNA是很难的。直接读出一种分离的DNA的序列的化学或酶促DNA测序方法，在研究实验室中已被用作分析和鉴定基因突变的最精确的方法。然而，临床应用这种测序方法是不切实际的，因为它受到以下限制：进行这种分析所需的专业技术水平，工作量，与购置仪器和完成测序反应的试剂相关的高成本，以及完成整个项目所需的长周期。最后，这种测序方法还有另外一个缺点：该程序需要大量的DNA模板，而这从患者处采集的10ml血样中获得是很困难的。
常规突变检测方法的例子包括：限制性片段长度多态性(RFLP)(Botstein等人，Am.J.Hum.Genet.,32,314-331(1980)，和White等人，Scientific American,258：40-48(1988))；单链构象多态性(SSCP)(Howell等人，Am.J.Hum.Genet.,55,203-206(1994)；等位基因特异的寡核苷酸杂交(Studencki.等人，Am.J.Hum.Genet.,37,42-51(1985)，和Saiki等人，Nature,324,163-166)；寡核苷酸-连接分析(Landgrun等人，Science,241,1077-1080(1990)；和等位基因特异PCR(ASPCR)(Wu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,86,2757-2760(1989)，和Okayama等人，J.Lab.Clin.Med.114,105-113(1989))。
这些技术中的一些只适合检测点突变。其余技术中的一些只可用于检测插入或缺失突变，如破坏或构建限制性内切酶切割位点，但不适用于检测单碱基的突变。例如，用这些技术如RFLP，将不能检测不影响酶切位点的点突变。其它技术要求特异性探针杂交的最佳条件。另外，上述技术要求特殊的实验仪器如凝胶电泳设备和杂交设备、时间和劳力。
已知一些以引物延伸为基础的方法来检测突变(Mohan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,1143-1147(1991),Prezant等人，Hum.Mutation 1,159-164(1992),Fahy等人，Nucleic Acid Research,25,3102-3109(1997)，和美国专利No.5,846,710(1998)和5,888,819(1998))。这些方法包括：用硫代核苷酸进行引物延伸；用标记的互补于突变核苷酸碱基的核苷酸，从侧翼于突变核苷酸的寡核苷酸引物进行引物延伸；和用标记的互补于突变碱基的双脱氧核苷酸终止子，进行引物延伸。
这些以引物延伸为基础的突变检测技术快速、容易操作且可能应用于临床。然而，这些方法至少有两个缺陷。首先，所有这些方法的基础都是只将一种标记的核苷酸掺入到引物延伸链中。只有一种类型的标记的核苷酸(选自A、C、G、T或U)、或标记的双脱氧核苷酸的掺入只允许检测特异性点突变，这种点突变对于用于分析的标记核苷酸互补的核苷酸碱基来说是特异性的。
假设，当不同类型或性质的突变在同一位点发生时，如A变为C或CT或TCT并带有许多其它变换，这些已知的方法需要至少用标记的G、C、A分别进行三次测试。或者，一次测试分析可以用不同的标记过的核苷酸，并结合凝胶分析和特异性标记检测系统来分别检测G、C、A突变体。然而，作三次独立的测试需要至少从患者采三次血样。这样多体积的血样或复杂的凝胶分析流程不但增加了测试的费用、时间和劳力，更重要的是，由于完成这些分析所需的试管和众多步骤可能标错，增加了失误的机率。所以，这些以引物延伸为基础的方法不便于或不适合用于大量样品的筛选或临床进行常规实验。
其次，这些以引物延伸为基础的分析的敏感性需要改进。因为这些测试中得到的引物延伸的链只带有一个标记的核苷酸或标记的双脱氧核苷酸，产生的信号多种多样，而且它们的强度依赖于所用的化学标记物的种类。但通常，这种信号是微弱的。
因此，在突变检测领域中需要一种快速、低成本、工作量不大且临床可应用的技术，可用于检测在特定位点核酸碱基上发生的任何类型的突变，并提供强而且精确的检测信号。
本发明满足了上述需要。
虽然本发明具有普通以引物延伸为基础的方法的部分优点，如对特定位点的突变的测试设计简单，然而本发明提供的方法克服了上述以引物延伸为基础方法相关的缺陷。本发明可广泛应用于检测和鉴定所有类型的突变。与传统方法相比，它是效能价格合算、省时且工作量低。
本发明较上述方法的一些关键优点为1)无需凝胶电泳按大小分离就可在一只反应管内检测所有类型突变的能力；2)多种标记的核苷酸掺入引物延伸链引起的强信号，产生的高测试敏感性；和3)高精确性，因为在同一时间可将两种或三种不同的核苷酸或核苷酸类似物标记插入引物延伸链中。这些优点使本发明由于其简单的发明流程，可应用于任何临床中存在的基因突变的常规测试。本发明亦适用于自动筛选大量样品。
本发明涉及一种方法，用于在一个反应中检测已知核酸序列中预定的核苷酸(靶碱基)上发生的任何突变。本发明方法用引物延伸分析检测突变。较佳地，引物互补于且序列特异性地杂交于毗邻预定核苷酸碱基的感兴趣位点的核酸，形成双链，使感兴趣的核酸中的靶碱基成为紧靠引物3’端下游的未配对的碱基。引物延伸反应试剂包括一种无标记的终止子核苷酸类型(或任选地无相应的核苷酸碱基)和三种标记的(或任选为不同标记或无标记的)非终止子核苷酸，其中终止子核苷酸互补于感兴趣的核酸的预定位点上的靶碱基。标记的非终止子核苷酸不互补于靶碱基。终止子核苷酸掺入引物(它互补于感兴趣的核酸中的靶碱基)的3’端，将终止引物延伸反应，而不会进一步掺入任何标记的非终止子核苷酸。如果由于突变，靶碱基改变了，标记的非终止子将序列依赖性地掺入引物。这样，任何由引物检出的标记信号，将显示在预定的核酸碱基位点发生了突变。
本发明的目的是提供一种方法检测或定量样品中的靶核酸，包括：
(a)制备一种引物，该引物互补于感兴趣的核酸模板中紧靠预定位置处靶核苷酸碱基上游的序列；
(b)如果核酸是双链，处理含有感兴趣核酸的样品，得到跨越特定位置的不配对的核苷酸碱基；如果感兴趣的核酸是单链，直接采用步骤(c)；
(c)在高度严谨的条件下，将(b)中的靶核酸与(a)中的引物退火，得到引物一核酸双链，其中感兴趣核酸中的靶核苷酸碱基是紧靠引物3’端下游的第一个未配对碱基；
(d)使引物延伸反应试剂与(c)中的引物一核酸双链混合，该引物延伸反应试剂包括：(ⅰ)一种终止子核苷酸或任选为无核苷酸，该核苷酸互补于感兴趣核酸预定位点的靶碱基，和(ⅱ)与(ⅰ)中的终止子核苷酸不同的三种非终止子核苷酸，其中至少一种任选地标记了可检测标记物；
(e)用酶或化学方法进行引物延伸反应，其中使所述终止子核苷酸或非终止子核苷酸掺入引物，取决于紧靠引物3’端下游核酸模板中的未配对核苷酸碱基的种类，而且在序列中掺入互补于感兴趣核酸中所述靶核苷酸碱基的所述终止子核苷酸，将终止所述的引物延伸，而不会使任何标记的非终止子核苷酸掺入引物，其中所述的引物是无标记的，另外，当靶核苷酸碱基变为其它任何类型的核苷酸时，如果用质谱分析法作为检测方法，则用所述可检测标记物标记的或任选地无任何标记物标记的互补于突变核苷酸碱基的非终止子核苷酸，经所述引物延伸反应被序列依赖性地掺入引物中；和
(f)经检测引物中掺入的标记的非终止子，确定在感兴趣的核酸中的预定位点上的核苷酸碱基的存在和种类。
在一优选实施例的步骤(b)中，感兴趣的核酸碱基毗邻于预定位点上需要鉴定的核苷酸碱基，而且需要鉴定的核苷酸碱基是紧靠双链3’端下游预定位点的未配对的碱基。在一优选实施例的步骤(d)中，步骤(c)中的双链与至少一种标记的非终止子和至少一种无标记的终止子接触。另外，在步骤(d)中，步骤(c)中的双链与非终止子接触，其中每个非终止子用相同或不同的可检测标记物标记。
在另一优选实施例中，可实践上述方法，其中模板依赖性的酶是大肠杆菌DNA聚合酶I或大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T4 DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、水生栖热菌DNA聚合酶、逆转录病毒逆转录酶、或上述组合。
在另一优选实施例中，本发明的核酸是脱氧核糖核酸、核糖核酸或脱氧核糖核酸和核糖核酸的共聚物。引物是寡脱氧核苷酸、寡核糖核苷酸或脱氧核糖核酸和核糖核酸的共聚物。模板是脱氧核糖核酸，引物是寡脱氧核苷酸、寡核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的共聚物，以及模板依赖性酶是DNA聚合酶。较佳的模板是核糖核酸，引物是寡脱氧核苷酸、寡核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的共聚物，模板依赖性酶是逆转录酶。较佳的是，模板为脱氧核糖核酸，引物是寡核苷酸，酶是RNA聚合酶。较佳的是，模板为核糖核酸，引物为寡核糖核苷酸，模板依赖性酶是RNA复制酶。
上述方法的步骤(d)中，步骤(c)中的双链接触至少一种标记的非终止子和至少一种终止子(其标记不同于非终止子)。另外步骤(e)中，检测掺入的标记非终止子和至少一种终止子(其标记不同于非终止子)的标记信号。
根据本发明的方法，感兴趣的核酸可在体内被酶促合成、在体外被酶促合成、或非酶促合成。本发明方法的另一实施例中，寡核苷酸引物可在体内被酶促合成、在体外被酶促合成、或非酶促合成。另外，寡核苷酸引物可包括一种或更多组成成分，这使得可以从未掺入的试剂和/或感兴趣的核酸中亲和分离出引物。
特别是，在一优选实施例中，寡核苷酸引物包括生物素，使得可以通过使生物素结合于链霉抗生物素蛋白(其附着于固相载体)，从未掺入的试剂和/或感兴趣的核酸中亲和分离出引物。在本发明的另一实施例中，寡核苷酸引物序列包括的DNA序列，使得可以通过与存在于核酸(附着于固相载体)的互补序列配对的碱基，从未掺入的试剂和/或感兴趣的核酸中亲和分离出引物。在本发明的另一实施例中，感兴趣的核酸包括一种或更多组成成分，使得可以从未掺入的试剂和/或引物中亲和分离出感兴趣的核酸。感兴趣的核酸可包括生物素，其使得可以通过将生物素结合于链霉抗生物素蛋白(其附着于固相载体)，从未掺入的试剂和/或引物中亲和分离出感兴趣的核酸。
本发明的方法中，感兴趣的核酸的序列包括的DNA序列，使得可以通过与核酸(附着于固相载体)中互补的序列配对的碱基，从未掺入的试剂和/或引物中亲和分离出感兴趣的核酸。寡核苷酸引物可以用可检测标记物标记。寡核苷酸引物标记所用的可检测标记物，不同于试剂中或附着于感兴趣的核酸的任何可检测的标记物。感兴趣的核酸可用可检测的标记物标记。感兴趣的核酸标记所用的较佳可检测标记物，不同于任何试剂中存在的或附着于引物的检测标记物。
本发明的另一实施例中，感兴趣的核酸包括非天然的核苷酸类似物。该非天然核苷酸类似物包括脱氧肌苷或7-脱氮-2’-脱氧鸟苷。感兴趣的核酸可通过聚合酶链式反应合成。
本发明的另一方法中，样品包括生物体基因组DNA、它们的RNA转录物、或从这些RNA转录物制备的cDNA。样品可包括生物体基因组外DNA、它们的RNA转录物、或从这些RNA转录物制备的cDNA。本发明的方法中，较佳的是，在适当的变性条件下于步骤(d)的引物延伸反应后，从感兴趣的核酸中分离引物。较佳的变性条件包括加热、碱、甲酰胺、尿素、乙二醛、酶和它们的组合。更佳的变性条件包括用0.2N NaOH处理。
本发明方法的实践所用的核酸来自任何生物体包括：植物、微生物、病毒或鸟。该生物体可以是脊椎动物或无脊椎动物。较佳的生物体是哺乳动物。更佳的生物体是人。哺乳动物也可以是马、狗、牛、猫、猪或羊。
从以下发明描述、附图和权利要求将对本发明的这些和其它目的有更充分的理解。
图1A-1C.显示本发明突变检测方法优选实施例的模式图。“L”代表野生型核苷酸，包括A、G、C、T、或U。“L*”代表无标记的终止子，如互补于L的双脱氧核苷酸。“M”代表在L位点的突变，突变核苷酸包括A、G、C、T、或U。“W”代表互补于M的核苷酸，可以包括带有可检测标记的A、G、C、T、或U。“n”代表一种或多种核苷酸或核苷酸类似物，包括A、G、C、T、和U。“y”代表一种核苷酸或核苷酸类似物，包括A、G、C、T、或U，用可检测的标记物标记且互补于M或n。
图2.
将1μl STA反应混合液点样于薄层层析片上，然后将该片置于含有1M NaCl和1M HCl的溶剂中。在室温中干燥该层析片10分钟，并使其暴露于柯达胶片30分钟，胶片由自动胶片显影器进行显影。用于STA测试的模板在每一片下作了标记。上部箭头显示游离核苷酸的前沿，下部箭头显示掺入[-32P]dCTP的引物延伸链。
这里所用的“核酸”或“核苷酸”可以是脱氧核糖核酸、核糖核酸或脱氧核糖核酸和核糖核酸的共聚物。核酸样品可以是天然的或合成的。核酸样品可以是天然来源的核酸，也可来自任何生物体。可用于本发明方法的一些生物体为：植物、微生物、病毒、鸟、脊椎动物、无脊椎动物、哺乳动物、人、马、狗、牛、猫、猪或羊。靶核酸可以是天然的，或可以是体内酶促合成的、体外酶促合成的或非酶促合成的。
含有一种感兴趣的核酸或多种感兴趣的核酸的样品可以含有来自生物体的基因组DNA、它们的RNA转录物、或由这些RNA转录物制备的cDNA。含有一种感兴趣的核酸或多种感兴趣的核酸的样品也可含有生物体基因组外的DNA、它们的RNA转录物、或由这些RNA转录物制备的cDNA。同样，该感兴趣的核酸或这些感兴趣的核酸可通过聚合酶链式反应合成。
感兴趣的核酸可包括非天然核苷酸类似物，如脱氧肌苷或7-脱氮-2’-脱氧鸟苷。这些类似物使DNA双链失去稳定，且可以与引物退火，在双链样品中发生延伸反应，而无需完全分离链。
感兴趣的核酸可以包括一种或更多组成成分，使得可以从未掺入的试剂和/或引物中亲和分离出感兴趣的核酸。例如，感兴趣的核酸可以含有生物素，使得可以通过使生物素结合于抗生物素蛋白或其类似物(附着于固相载体)，从未掺入的试剂和/或引物中亲和分离出感兴趣的核酸。感兴趣的核酸序列可包括的DNA序列，可通过与存在于核酸(附着于固相载体)中的互补序列配对的碱基，从未掺入的试剂和/或引物中亲和分离出感兴趣的核酸。感兴趣的核酸可用可检测标记物标记；该可检测标记物不同于试剂中存在的或附着于引物的任何可检测标记。
这里的“正常核苷酸”或“正常碱基”是从中检查突变的在该碱基位点鉴定的野生型或以前已知的标准核苷酸碱基。“标准核苷酸碱基”包括任何已知的碱基可以是野生型或已知的突变型碱基(只要该碱基是已知的和希望了解其变体的)。所以，例如正常碱基可以是已知的野生型碱基，而在该位点寻找突变。相反，已知的碱基可以是已知的突变体，则在该位点寻找野生型碱基的存在。另外，已知的正常碱基可以是已知的突变体，而对其寻找另一个突变体变异碱基。所以，本发明的方法可应用于用于确定该位点是否存在任何其它碱基变体的任何已知的序列。
这里的术语“引物”或“寡核苷酸引物”指一种寡核苷酸，当处于存在各种因子如核苷酸和酶(如DNA聚合酶)以及适合的温度和pH的条件，允许合成与核酸(模板)链互补的引物延伸产物时，其具有作为合成起始点的能力。
术语“引物”也可定义为从任何来源得到的任何核酸片段。例如，引物可以通过破碎较大的核酸片段(如基因组DNA、cDNA、或从PCR得到的DNA)产生。也就是说，引物的特性不受如何得到该引物的限制，无论其是破碎天然或合成核酸或由合成核酸引物得到的。另外，引物可以是寡脱氧核糖核苷酸、寡脱氧核糖核苷酸共聚物、寡核糖核苷酸、核糖核苷酸共聚物、或脱氧核苷酸和核糖核苷酸共聚物。引物可以是天然或合成的。寡核苷酸引物可以是体内酶促合成的、体外酶促合成的、或体外非酶促合成的。引物可以用可检测标记物标记；该可检测标记物不同于试剂中或附着于感兴趣的核酸的任何可检测标记物。另外，引物的序列必须相应于感兴趣的特定位置的侧翼序列，该位置毗邻被鉴定的核苷酸碱基或为其上游。
另外，引物必须具有与感兴趣的核酸中的核苷酸杂交或退火的能力。一种实现所希望的杂交的途径是，让模板依赖性引物充分或完全互补于已知的碱基序列。
寡核苷酸引物可包括一种或多种组成成分，使得可以从未掺入的试剂和/或感兴趣的核酸中亲和分离出引物。这些亲和组成成分包括，但不限制于，毛地黄皂苷、磁珠、和配体，如蛋白配体(包括抗体)。较佳的组成成分是生物素。在用生物素的实验中，含有生物素的引物通过生物素结合于抗生物素蛋白和其类似物(附着于固相载体)，可从未掺入的试剂和/或感兴趣的核酸中亲和分离出引物。寡核苷酸引物序列可包括的DNA序列，通过与核酸(附着于固相载体)中互补序列配对的碱基，能从未掺入试剂和/或感兴趣的核酸中亲和分离出引物。
这里所用的术语“引物延伸反应”指的是在反应条件下可进行模板依赖性核酸合成反应。部分地通过适当的模板依赖性酶的存在，可创造发生模板依赖性引物延伸反应的条件。一些适合的模板依赖性酶是DNA聚合酶。DNA聚合酶可以有许多类型。但DNA聚合酶必须是引物和模板依赖性的。例如可以用大肠杆菌DNA聚合酶I或大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶(“测序酶”)、水生栖热菌DNA聚合酶、或逆转录病毒逆转录酶。同样在一些流程中可用RNA聚合酶，如T3或T7 RNA聚合酶。在杂交和延伸反应中，不同的聚合酶必须用不同的条件和不同的温度范围。
这里所用的术语“引物延伸链”包括，在引物被加入后，形成与双链中模板相反的链。较佳的是，通过终止子结合于模板终止引物延伸。
这里所用的术语“模板”指的核酸，包括双链DNA、单链DNA和RNA，或任何它们的修饰，而且可以是任何长度或序列。
这里所用的术语“终止子”或“链终止子”指核酸碱基，如A、G、C、T、或U，或类似物，该类似物在掺入与模板链相反的引物延伸链时能有效地终止引物延伸反应。较佳的终止子是双脱氧核苷酸。同样较佳的是，终止子或者无标记或者有标记，但应区别于非终止子的标记。当这里所用的术语“终止子”或“链终止子”引用为单数时，并不意味所用的是单个核苷酸分子。术语“终止子”的单数形式是指用于分析的核苷酸、核酸碱基或核酸类似物的类型。例如，如果终止子是ddA，则单数形式指所有ddA整体，而不是ddA单分子。另外，“终止子”可以是特定类型核苷酸的缺乏，这样可以通过基因座上缺少特定核苷酸而终止引物的延伸。例如，如果希望引物延伸反应终止于模板链上“C”的对面，则在引物延伸反应混合物中应包括非终止碱基A、T和C，但不能有“G”(与“C”互补)。所以，缺乏互补碱基将终止引物延伸反应，其效果与加入双脱氧终止子核苷酸的效果一样。
这里所用的术语“非终止子”或“非链终止子”包括的核苷酸碱基，在掺入引物延伸链时不终止引物延伸反应。较佳的是，在引物延伸反应中至少标记一种非终止子。如这里所用，当术语“非终止子”或“非链终止子”为单数时，并不意味所用的是单个核苷酸分子。术语“非终止子”的单数形式是指用于分析的核苷酸、核酸碱基或核酸类似物的类型。例如，如果终止子是G，则单数形式是指所有的G的整体，而不是指单分子G。
这里所用的术语“突变体”或“突变”指模板链上任何不同于野生型或正常碱基的碱基。用本发明方法检测的突变可以是任何类型的突变，包括单碱基突变、插入、缺失、或基因易位，只要与紧靠退火的引物3’碱基相对的模板上的碱基受到影响。
这里所用的术语“标记物”指任何连接于终止子或非终止子来提供检测信号的分子。标记物可以是放射性的、化学发光的，蛋白配体如抗体，或者如果用荧光基团时，每一类型的非终止子核苷酸碱基可用不同的荧光基团。这些荧光标记物的发射光谱应可分辨。
另外，确定在引物延伸产物中掺入核苷酸碱基的水平的方法，可用质谱技术测定，在美国专利No.5，885,775中已列举，这里引用作为参考。
这里所用的短语“高度严谨的杂交条件”指核酸杂交条件如，但不限制于，42℃用0.1XSSC洗涤条件。在常规分子生物学手册中一般可找到杂交条件，如Ausubel等人的Current Protocols in Molecular Biology,Greene和Wiley,pub.(1994)，这里引用作为参考。
这里所用的“薄层层析(TLC)”可在以纤维素产品为基础的纸介质上进行，但可由能让分子很好分散并形成均匀一层的任何物质组成。该物质包括，但并不限制于，无机物如硅胶、氧化铝、硅藻土或硅酸镁。有机物包括，但并不限制于，纤维素、聚酰胺或聚乙烯粉末。薄层层析方法一般描述于化学手册，如阐述于Freifelder,Physical Biochemistry-Applicationsto Biochemistry and Molecular Biology,second ed.,由Freeman和Co.出版(1982)，这里引用作为参考，尤其是第8章在229-232页讨论了层析技术尤其是薄层层析。
本领域技术人员将理解，不同于非终止子标记的终止子，可用于辨别引物延伸链中终止子或非终止子的掺入。本发明申请中出于简化说明，终止子示例为缺少特定类型的核苷酸，但该说明对权项无任何形式的限制。本发明还包括不同标记的或未标记的终止子，只要终止子上的标记不同于非终止子上的标记。
本领域技术人员同样可以理解，只要模板序列至少有部分已知就可设计一种引物，该引物能结合于模板链而发生引物在模板链上的结合。本领域的技术人员还可理解，本发明的方法可通过用一支或更多支分析试管中的若干引物实践。
本发明方法的一个特性为，如果非终止子同样被标记的话，就可产生强信号，因为当在预定的位点有变异时，几种标记的非终止子掺入引物延伸链将产生有加和作用的信号。其比传统的变异检测方法(每一引物延伸链仅掺入一个信号标记)产生更有利的信号强度。当各种终止子或非终止子有特异的不同标记物时，观察其信号可提高精确度。
以下实施例用于说明本发明，但对权项无任何限制。
实施例
实施例1
选择人APC基因序列为本发明中STA测试的靶序列。合成相应于野生型APC序列4317-4347的寡核苷酸和三种不同类型的突变，并用作模板。STA测试中用到的引物列于表1。
表1
名称     序列 说明
模板
Oapc-w     5′CCTGGACAACCATGCCACCAAGCAGAAGTA(SEQIDNO：1) 野生型
Oapc-p     5′CCTGGAtAACCATGCCACCAAGCAGAAGTA(SEQID NO：2) 点突变
Oapc-i  5′CCTGGAtgtAACCATGCCACCAAGCAGAAGTA(SEQIDNO：3) 插入突变
Oapc-d  5′CCTGG……AACCATGCCACCAAGCAGAAGTA(SEQIDNO：4) 缺失突变
STA引物STA0902     TTGGTACGGTGGTTCGTCTT 5’(SEQIDNO：5)
STA：每个STA反应都在20μl缓冲液(10mM Tris-HCl,pH7.5,50mM KCl，和5mM MgCl2)中进行，该缓冲液含有50ng模板寡核苷酸、1μM引物、2个单位的DNA聚合酶、1μl[α-32P]标记的dCTP(20μCi/ml,3000Ci/mmol Dupont-NewEngland Nuclear)、dATP、dTTP和1μl没有标记的dd GTP。混合物在37℃温育30分钟，然后在100℃加热3分钟。将1μl反应混合液加样于TI片，该片用于薄层层析(TRIM USA,MD)。用含有1M HCl和1M NaCl的溶液延伸这些片10分钟。用该流程从TI片上未掺入的核苷酸中完全分离出引物。用放射自显影术观察标记的引物，并用闪烁计数器(Beckman LS 5000)计数放射性。图2显示了放射自显影图，在表2中显示了相应于放射自显影图的计数结果。
表2
    模板     总计数     标记的引物
    无模板     76,675     95
    Oapc-w     79,599     117
    Oapc-p     82,584     4,821
    Oapc-i     75,376     8,602
    Oapc-d     100，634     6，571
如表2显示的计数，右栏为掺入引物延伸中[α-32P]-dCTP的量，一种野生型的寡核苷酸Oapc-w被用作模板。在引物退火后第一个不配对的核苷酸是C，其与终止子ddG互补配对。当模板依赖性的引物延伸反应开始时，终止子ddG迅速掺入引物的3’端，作为第一个被延伸的核苷酸，由结合的ddG封闭了标记的核苷酸的进一步掺入。结果，引物只被一个核苷酸碱基延伸，它即为终止子核苷酸。由于在终止子结合后，其它核苷酸碱基不可能与引物结合，引物延伸反应终止了。Oapc-w样品的放射性计数显示，该计数类似于无任何模板的样品，即背景对照。
与此相比，Oapc-p是点突变寡核苷酸。模板的制造是通过用突变型T置换野生型模板3’端第一个不配对的核苷酸的野生型C。在该实验中，dATP替代了终止子ddG，在引物延伸反应开始时，互补性配对于突变的核苷酸T。在终止子ddG掺入模板链C残基相对的位置后，引物延伸反应终止了。
在包括插入突变的寡核苷酸突变体中，表1和2的Oapc-i，第一个不配对的核苷酸是T，其不互补于终止子ddG。在该实验中，引物的延伸是通过与其相对的dATP结合到引物延伸链，然后引物进一步的延伸通过加入以下物质：[α-32P]-dCTP、dATP、两个[α-32P]-dCTP和dATP。通过核苷酸聚合酶将ddG顺序掺入在第一次碰到C时终止了延伸过程。最终结果是三个[α-32P]-dCTP被掺入引物延伸链中。
如插入突变一样，可用本发明的STA试剂和方法分析寡核苷酸缺失突变，Oapc-d(表1和2)。引物的延伸通过依次掺入的两个[α-32P]-dCTP和dATP，用ddG终止。由此，两个[α-32P]-dCTP被掺入引物延伸链。这些结果提供了有力的证据证明本发明的STA方法可以检测所有类型的突变。本STA方法只进行一次测试就将能鉴定任何类型突变的存在。
尤其在缺失和插入突变(Oapc-I和Oapc-d)中，多个标记的核苷酸掺入引物延伸链。这种多个标记显著地提高了检测敏感性。另外，该测试的敏感性可通过用不同核苷酸(用同种可检测标记物标记的)进一步增加。例如，在延伸引物中所有的非终止子都可被标记，如[α-32P]-CTP、[α-32P]-ATP、[α-32P]-TTP。
多重标记同样提供了用不同的可检测标记物标记非终止子核苷酸的可能，来区别每一个非终止子核苷酸碱基。例如，核苷酸可用不同的荧光染料标记，然后引物被延伸时携带不同的荧光标记物。同一时间不同信号的检测将增加STA测试的精确性。与本发明的STA试剂和方法相关的这些先进的多重标记特性，与本领域的已知方法相比提供了更好的突变检测敏感性和精确性。
实施例2
人APC基因的PCR产物作为测试样品。用标准PCR流程进行APC基因片段的PCR扩增。人APC cDNA用作模板。用于PCR的引物列于表3。
表3
    引物 方向     说明
    5’TCCACCTGAACACTATGTTC(SEQIDNO：6) 正向 野生型
5’AGGTGGTGGAGGTGTTTTACTTCTGCTTGGCGGCA(SEQIDNO：7) 反向 野生型
5’AGGTGGTGGAGGTGTTTTACTTCaGCTTGGCGGCA(SEQIDNO：8) 反向 T点突变为A
 5’AGGTGGTGGAGGTGTTTTACTTCgcaGCTTGGCGGCA(SEQIDNO：9) 反向 插入突变GCA
 5’AGGTGGTGGAGGTGTTTTACTTC……GGCGGCATGGT(SEQIDNO：10) 反向 缺失突变TGCTT
通过组合引物产生四种不同的约200bp的PCR产物。它们为APC-w：野生型；APC-p：点突变；APC-i：插入突变；APC-d缺失突变。将PCR产物加样到1％琼脂糖凝胶，来除去模板和游离的核苷酸。然后用Qiax DNA纯化试剂盒(Qiagen)纯化产物。STA引物被设计为5’-AGGTGGTGGAGGTGTTTTACTTC-3’(SEQ ID NO：11)，STA反应在总体积为20μl的缓冲液中进行，该缓冲液含有10mM Tris-HCl,pH 8.3,50mM KCl,2mM MgCl2,0.05pmol双链PCR产物，5pmol引物，20pMdATP,dGTP,1μCi[α-32P]标记的CTP,20μM无标记的双脱氧TTP和2个单位的Taq DNA聚合酶。在热循环仪(Perkin Elmer,GeneAmp 9600)中进行20次循环(94℃，20秒；55℃，1分钟)。将1μlSTA产物加样在Trim片(由日本TRIM Corporation制造的薄层层析片)上，进行放射性计数，如实施例1所述。结果显示于表4。
表4
    总计数     标记的引物
    无模板     182,245     343
    Papc-w     208,271     595
    Papc-p     197,494     5,568
    Papc-i     176,984     10,372
    Pape-d     195,570     12.010
用[α-32P]dCTP延伸了所有三种类型突变样品中的引物。由掺入标记物的引物延伸产生的信号的强度，很好的与标记的核苷酸的数量(携带于引物延伸链的)相关。
实施例3
本发明的STA试剂和方法应用于人APC基因的RNA片段。将实施例2的人APC基因的PCR产物连接入TA克隆载体3.1(TA克隆试剂盒，Invitrogen)。构建了4个载体，列于表5。
表5
    载体     插入     说明 RNA产物的名称
    Tapc-w     APC-w     野生型     Rapc-w
    Tapc-p     APC-p     点突变     Rapc-p
    Tapc-i     APC-i     插入突变     Rapc-I
    Tapc-d     APC-d     缺失突变     Rapc-d
用体外RNA合成试剂盒(Promega，WI)合成对应于每个载体的RNA。37℃在含有2μg载体和T7聚合酶的缓冲液中合成RNA 1小时。加入LiCl和100％乙醇终止反应。在-20℃温育15分钟后，通过离心(14,000g,15分钟)沉淀RNA，纯化的RNA悬浮于无RNA酶的水中。用实施例2所述的STA引物混合5μgRNA于总体积10μl的缓冲液中，该缓冲液含有10mM Tris-HCl pH7.6,50mM NaCl和10mM KCl。混合液在65℃加热变性3分钟，然后在冰中淬灭2分钟。如实施例1所述进行STA反应，缓冲液含有1μl[α-32P]-标记的dCTP(250μCi/ml,3000Ci/mmol Dupont-New England Nuclear)，10μM dATP,dGTP和10μM无标记的ddTTP，和20个单位的逆转录酶。在40℃温育15分钟后，以100℃加热2分钟终止反应。如实施例1所述，将1μl的反应产物加样于Trim片上，计数放射性。结果显示于表6。
表6
    样品     总数     标记的引物
    无模板     167,496     690
    Rapc-w     172,734     435
    Rapc-p     166,979     1,745
    Rapc-i     170,801     7,348
    Rapc-d     174,888     7,360
上述所有步骤包括化学、操作和流程是自动的或是能够自动的。因此，将本发明优选模式纳入适当编程的机器人工作区的操作，将显著节省成本并将增加任何诊断流程(依赖于检测得自生物样品的核酸中特定核苷酸序列或序列差异)的效率。
这里引用的所有参考文献都全部引证包括在说明书中。

Claims (36)

1．一种检测或定量样品中靶核酸的方法，其特征在于，包括：
(a)制备一种引物，该引物互补于感兴趣的核酸模板中紧靠预定位置处靶核苷酸碱基上游的序列；
(b)如果核酸是双链，处理含有感兴趣核酸的样品，得到跨越特定位置的不配对的核苷酸碱基；如果感兴趣的核酸是单链，直接采用步骤(c)；
(c)在高度严谨的条件下，将(b)中的靶核酸与(a)中的引物退火，得到引物-核酸双链，其中感兴趣核酸中的靶核苷酸碱基是紧靠引物3’端下游的第一个未配对碱基；
(d)使引物延伸反应试剂与(c)中的引物-核酸双链混合，该引物延伸反应试剂包括：(ⅰ)一种终止子核苷酸或任选为无核苷酸，该核苷酸互补于感兴趣核酸预定位点的靶碱基，和(ⅱ)与(ⅰ)中的终止子核苷酸不同的三种非终止子核苷酸，其中至少一种任选地标记了可检测标记物；
(e)用酶或化学方法进行引物延伸反应，其中使所述终止子核苷酸或非终止子核苷酸掺入引物，取决于紧靠引物3’端下游核酸模板中的未配对核苷酸碱基的种类，而且在序列中掺入互补于感兴趣核酸中所述靶核苷酸碱基的所述终止子核苷酸，将终止所述的引物延伸，而不会使任何标记的非终止子核苷酸掺入引物，其中所述的引物是无标记的，另外，当靶核苷酸碱基变为其它任何类型的核苷酸时，如果用质谱分析法作为检测方法，则用所述可检测标记物标记的或任选地无任何标记物标记的互补于突变核苷酸碱基的非终止子核苷酸，经所述引物延伸反应被序列依赖性地掺入引物中；和
(f)经检测引物中掺入的标记的非终止子，确定在感兴趣的核酸中的预定位点上的核苷酸碱基的存在和种类。
2．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引物是脱氧核糖核酸或核糖核酸的片段、寡脱氧核糖核苷酸、寡核糖核苷酸、或脱氧核糖核酸和核糖核酸的共聚物。
3．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的感兴趣的核酸是脱氧核糖核酸、核糖核酸或脱氧核糖核酸和核糖核酸的共聚物。
4．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶核苷酸定义为任何已知的碱基，包括野生型或已知的突变型碱基，只要碱基是已知的而且希望知道它的变异。
5．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的终止子核苷酸是双脱氧核糖核苷酸，非终止子核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
6．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的终止子核苷酸是未标记的。
7．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的终止子核苷酸用不同于非终止子中标记物的可检测标记物标记。
8．如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述的步骤(d)中，步骤(c)中的双链与非终止子核苷酸接触，而每个非终止子用相同或不同的可检测标记物标记。
9．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的可检测标记物是酶、放射性同位素、荧光分子或蛋白配体。
10．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的检测通过质谱术进行。
11．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酶是模板依赖性的。
12．如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的模板依赖性酶是DNA聚合酶。
13．如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I或大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、或水生栖热菌DNA聚合酶。
14．如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的酶是RNA聚合酶或逆转录酶。
15．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引物包括一种或多种组成成分，从而可以从未掺入的试剂和/或感兴趣的核酸中亲和分离出引物。
16．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引物包括一种或多种组成成分，使引物连接到固体表面。
17．如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述的组成成分包括生物素或毛地黄皂苷。
18．如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的组成成分包括生物素和毛地黄皂苷。
19．如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述的组成成分包括DNA或RNA序列，使得通过碱基配对于附着于固相载体的核酸中的互补序列，可从未掺入的试剂和/或感兴趣的核酸中亲和分离出引物。
20．如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的组成成分包括DNA或RNA序列，使得通过碱基配对于附着于固相载体的核酸中的互补序列，从而可以从未掺入的试剂和/或感兴趣的核酸中亲和分离出引物。
21．如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述的组成成分包括DNA或RNA序列，可通过碱基配对于固体表面存在的互补序列，将引物连接到固相载体。
22．如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的组成成分包括DNA或RNA序列，可通过碱基配对于固体表面存在的互补序列，将引物连接到固相载体。
23．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的感兴趣的核酸是体内、体外酶促合成的，或非酶促合成的。
24．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的感兴趣的核酸是通过聚合酶链式反应合成的。
25．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的感兴趣的核酸包括非天然的核苷酸类似物。
26．如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述的非天然核苷酸类似物包括脱氧肌苷或7-脱氮-2’-脱氧鸟苷。
27．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的样品包括生物体的基因组DNA、它们的RNA转录物、或从这些RNA转录物制备的cDNA。
28．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的样品包括生物体的基因组外DNA、它们的RNA转录物、或从这些RNA转录物制备的cDNA。
29．如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述的生物体包括植物、微生物、细菌、病毒。
30．如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述的生物体包括植物、微生物、细菌、病毒。
31．如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述的生物体包括脊椎动物或无脊椎动物。
32．如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述的生物体包括脊椎动物或无脊椎动物。
33．如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述的生物体是哺乳动物。
34．如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述的生物体是哺乳动物。
35．如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述的生物体是人。
36．如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述的生物体是人。
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