CN1294682A - 用于血红蛋白和细胞分析的组合物与方法 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了一种用于测定血样中总血红蛋白浓度、计数白细胞和分类计数三种白细胞亚群的无氰化物的溶解剂组合物以及方法。所说的无氰化物溶解剂组合物包含溶解红细胞并释放血红蛋白的季铵盐或吡啶鎓盐、与血红蛋白形成稳定色原的有机配体和调节试剂以进行阻抗测定的盐,所述有机配体选自:三唑及其衍生物、四唑及其衍生物、4,6-二羟基-1,3,5-三嗪-2-羧酸、蜜胺、苯胺-2-磺酸、喹哪啶酸、2-氨基-1,3,4-噻二唑、三嗪及其衍生物、尿唑、DL-2-哌啶酸、异烟酰胺、邻氨基苯甲腈、6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶、腺嘌呤、3-(2-噻吩基)丙烯酸、苯甲酸和苯甲酸的碱金属和铵盐、吡嗪及其衍生物。无需预稀释血样即可将溶解剂组合物与血样混合并在预定吸收波长测定样品混合物的UV吸收。在自动细胞计数仪上,利用DC阻抗测定方法同时进行白细胞计数和白细胞亚群分类计数。
Description
本发明是1997年1月21日提交的悬而未决的美国申请08/786505的部分连续申请。
发明背景
发明所属技术领域
本发明涉及用于手工或自动测定血样中总血红蛋白浓度及用于同时进行白细胞计数或白细胞亚群的分类计数的溶解剂组合物、稀释剂以及方法。
现有技术的讨论
总血红蛋白的测定是全血携氧容量的指示。测定血样中血红蛋白(Hgb)的能力是诊断分析的十分重要的部分,在监控对影响血红蛋白之疾病的疗法的反应以及对针对其它疾病但可能对血红蛋白水平产生不利影响的疗法的反应中也是重要的。
正常人外周血液中的白细胞是由五种类型组成的,即,淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。后三种类型的白细胞一起被称作粒细胞。不同类型的白细胞具有不同的生物功能。血样中的不同类型白细胞的计数和分类为临床诊断提供了有价值的信息。
白细胞的分类和计数通常通过分类计数法(也称为手工方法)进行。自动血液分析仪也常用于白细胞计数,该仪器使用溶血试剂以溶解红细胞并制备仅包含白细胞的样品。然后样品混合物通过阻抗方法分析。现已开发了一种更先进的装置,该装置对包括淋巴样细胞(淋巴细胞)和髓样细胞(单核细胞和粒细胞)的不同类型的白细胞数量计数(分类计数)(Ledis等的美国专利4286963)。白细胞还被进一步区别为三种亚群,即单核细胞、淋巴细胞和粒细胞(Ledis等的美国专利4485185)。理想地,人们希望能在同一个自动步骤中完成多项诊断分析,如血红蛋白测定和白细胞计数或白细胞亚群分类计数。
在许多用于血红蛋白测定的已知方法中,氰化物血红蛋白方法被国际血液学标准化委员会推荐为标准方法。Matsubara和Okuzono对该方法的改良导致其在临床实验室中广泛地应用。按照该方法,在红细胞的所有血红蛋白形式的血红素基的铁离子由铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白。然后高铁血红蛋白和氰阴离子(其对血红素铁离子具有十分高的亲和性)结合,形成氰化正铁血红蛋白色原。这种极端稳定的色原在540nm具有最大吸光度,这可以通过紫外光谱测定法人工测定。
尽管通过标准的氰化正铁血红蛋白方法及其改良的自动方法形成的色原稳定,然而,由于使用氰化钾,试剂废物引起了巨大的环境关注。在过去十年中,人们付出了巨大的努力以开发不使用氰化物的自动血红蛋白分析方法。
Oshiro等(临床生物化学(Clin.Biochem.),1583(1982))报道了一种用于血红蛋白分析的试剂,该试剂包含十二烷基硫酸钠(SLS)和Triton X-100(非离子型表面活性剂),为中性pH(7.2)。SLS用于溶解红细胞,并被认为进一步产生SLS-血红蛋白复合物,它在539nm处具有最大吸光度并在572nm处有肩峰。反应在5-10分钟内完成,总血红蛋白测定是定量的。然而,如后来在Satata的美国专利5,242,832中所解释的,使用Oshiro方法不可能在进行血红蛋白测定的同时分析白细胞。
Sakata的美国专利5,242,832公开了用于对血样白细胞计数并测定血红蛋白浓度的无氰化物溶解剂。该溶解剂包含至少一种第一表面活性剂(季铵盐)、至少一种第二表面活性剂(包括阳离子表面活性剂和兼性表面活性剂)以及至少一种选自下列化合物的血红蛋白稳定剂:Tiron、8-羟喹啉、联吡啶、1-10-菲咯啉、酚类化合物、双酚、吡唑及其衍生物、2-苯基5-吡唑啉酮及其衍生物、苯基3-吡唑啉酮以及咪唑及其衍生物。Sakata指出将白细胞分离成两个或三个组(包括淋巴细胞的聚集体,单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的聚集体以及嗜中性粒细胞的聚集体)只有通过使用至少两种适合的表面活性剂和严格控制表面活性剂浓度才能完成。Sakata还指出溶解剂优选的pH值是5.0-8.0。如果pH值是3.0或更小,对白细胞的破坏增加,这样使白细胞的测定困难,如果pH值是9.0或更大,血红蛋白的稳定性随时间变差。
Kim的美国专利5612223公开了用于测定全血样中的血红蛋白的无氰化物方法与试剂。该试剂包括配体(选自下列化合物:咪唑及其衍生物、N-羟乙酰胺、H-羟胺、吡啶、噁唑、噻唑、吡唑、嘧啶、嘌呤、喹啉和异喹啉)以及一种强红细胞溶解能力的表面活性剂(选自十二烷基二甲基胺氧化物和辛基苯氧基多乙氧基乙醇)。该分析方法快速,不到10秒。然而,该试剂仅在极端碱性(pH值11-14)条件下操作。此外,Kim没有说明白细胞计数或区别白细胞亚群的能力。
Stephanos等在“单体血红蛋白的铁配体识别”(Biochimica etBiophysica Acta,1295(1996)p209-221)中公开了与血红蛋白单体结合的有机配体。
Benezra等的美国专利4852338描述了测定血样中血红蛋白浓度的方法。该方法包括如下步骤:(1)将血样与一种包括浓度为2-4%的离子表面活性剂的试剂组合物接触形成反应混合物,其中试剂组合物的pH为11.3-约13.7并且不含离子性氰化物;(2)测定吸光度。该方法仅用于测定血红蛋白的浓度。Benezra等没有教导白细胞计数或区别白细胞亚群。
Toda等的美国专利5250437描述了测定血红蛋白和分析白细胞的一种试剂。该试剂不含氰化物,但含有(1)至少一种季铵盐与另一种表面活性剂的组合,所述表面活性剂包括季铵盐、非离子表面活性剂、吡啶鎓盐、两性表面活性剂和式R1R2R3N-CH2Ph(其中R1、R2和R3是烷基)的阳离子表面活性剂;和(2)至少一种能氧化血红蛋白中血红素的氧化剂。该试剂能将白细胞区分为至少两个部分。该方法需要使血红蛋白变性并氧化血红素。
Larsen的美国专利4529705描述了一种用于白细胞电子计数和血红蛋白浓度测定的即可稀释又可溶解血样的试剂。该试剂包含下列成分的水溶液:(1)溶解样品中血红细胞的季铵盐去污剂(detergent);(2)至少一种防止血样中血小板聚集的阴离子,其选自硫酸根、碳酸根、甲酸根和乙酸根;和(3)用于将血红蛋白转化为色原的碱金属氰化物。该方法提供了使用单一试剂稀释和溶解血样用于白细胞计数并测定血红蛋白浓度的便捷性。但血红蛋白的测定仍需有氰化物的存在。
如上所述,目前的血红蛋白测量试剂和方法或存在毒性或缺乏在同一个自动化步骤中就可完成多项诊断分析的能力,例如血红蛋白测定以及白细胞的计数或白细胞亚群的分类计数。
这就需要新的无氰化物血红蛋白测定方法和多功能试剂以在同一个自动化步骤中可以完成多项诊断分析。
发明概述
综上所述,本发明的目的是提供一种用于测定血样中的血红蛋白浓度并对白细胞计数的即可稀释又可溶解血样的新的无氰化物溶解剂组合物。
该无氰化物溶解剂组合物包含足以溶解红细胞并释放血红蛋白量的季铵盐或吡啶鎓盐、和足以与血红蛋白形成稳定的色原量的有机配体、和足以调节用于阻抗测定之溶解试剂电导率量的盐的水溶液,所述有机配体选自三唑及其衍生物、四唑及其衍生物、4,6-二羟基-1,3,5-三嗪-2-羧酸(oxonic acid)的碱金属盐、蜜胺、苯胺-2-磺酸、喹哪啶酸、2-氨基-1,3,4-噻二唑、三嗪及其衍生物、尿唑、DL-2-哌啶酸、异烟酰胺、邻氨基苯甲腈、6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶、3-(2-噻吩基)丙烯酸、苯甲酸以及苯甲酸的碱金属盐和铵盐、吡嗪及其衍生物。
本发明还提供使用该稀释并溶解血细胞样品的新无氰化物溶解剂组合物测定血红蛋白浓度并对白细胞计数的方法。该方法包括下列步骤:(1)将血样与该新的无氰化物的溶解剂组合物混合以溶解红细胞并形成稳定的血红细胞色原;(2)测定该形成的血红蛋白色原在预定波长处的吸光度;(3)由测定的吸光度计算血红蛋白总浓度;(4)用DC阻抗测定方法在自动血液分析仪上计数白细胞的数量;和(5)报告所述血样的白细胞数量。
由随后对优选实施方案的详细描述中将更清楚地认识到,本发明与现有技术相比特别有利,它提供了即可稀释又可溶解血细胞样品用于血红蛋白测定和白细胞计数(无需预先稀释血样)的新的无氰化物溶解剂组合物。
从随后的参考附图的优选实施方案的描述中可以更好地了解本发明。
附图的简要描述
图1a和1b是按照在实施例1中描述的方法使用本发明实施例1的溶解剂组合物处理的全血样品的吸收光谱(配方1b和1c)。
图2显示了按照实施例1的方法使用配方1a的溶解剂组合物处理的血样的一系列吸收光谱。在十二小时内以一小时间隔总共获得了十二张图谱。
图3a和3b显示了按照在实施例2中所描述的方法使用实施例2的溶解剂组合物以及标准的磷酸缓冲盐水和商业血液稀释剂COULTERISOTON_Ⅲ作为稀释剂处理的全血样图谱。
图4a至4d显示了通过在商业血液分析仪COULTER COUNTER_ S-Plus Ⅳ型上使用本发明实施例4的溶解剂组合物获得的四个全血样品的白细胞亚群分布直方图。
图5a和5b显示了在自动化商业血液分析仪COULTER_ STKS上使用常规溶解剂COULTER LYSE S_ Ⅲ diff获得的血红蛋白浓度和白细胞数量与在相同仪器上使用本发明实施例3的溶解剂组合物(配方3a)获得的结果之间的相关性。
图6a和6b显示了在自动化商业血液分析仪COULTER_ STKS上使用COULTER_ LYSE S_ Ⅲ diff溶解剂获得的血红蛋白浓度和白细胞数量与在相同仪器上使用本发明实施例3的溶解剂组合物(配方3b)获得的结果之间的相关性。
图7a至7e显示了在COULTER COUNTER_ S-Plus Ⅳ上所获得的白细胞数量、白细胞差别计数和血红蛋白浓度与在相同仪器上使用本发明实施例4的溶解剂组合物(配方4a)和稀释剂获得的结果的相关性。
图8a和8b是按照在实施例5中描述的方法使用本发明实施例5的溶解剂和稀释剂组合物(配方5a和5b)处理的两个全血样品的吸收光谱。
图9a和9b显示按照在实施例6中所描述的方法使用实施例6的溶解剂和稀释剂组合物处理的全血样的图谱和白细胞亚群的分布直方图。
图10a和10b显示使用实施例7所述的溶解剂(配方7a)和方法测定的全血样的图谱和白细胞亚群的分布直方图。
图11a和11b显示使用实施例7所述的溶解剂(配方7b)和方法测定的全血样的图谱和白细胞亚群的分布直方图。
优选实施方案的详细描述
一般来说,要用光度测定法测定血样中的总血红蛋白浓度,必须使用溶血试剂溶解红细胞并释放血红蛋白,然后把血红蛋白转化成稳定的色原,这种色原可以在预定的波长由紫外光谱发现和测定。对于定量和精确的测定,所形成的色原需要是稳定的,至少在测定的时间范围内稳定。红细胞的溶解可以通过酸溶解、渗透溶解和使用各种天然以及合成的表面活性剂完成。释放的血红蛋白包括各种形式,如氧合血红蛋白、脱氧血红蛋白、高铁血红蛋白、碳氧血红蛋白等。
大多数把血红蛋白转化成稳定色原的有效方法是提供配体,该配体对血红素铁具有高亲和性以形成稳定的血红蛋白复合物。这已用氰化正铁血红蛋白方法成功地证明,其中氰阴离子对血红素铁具有极高的亲和性。术语血红蛋白复合物和血红蛋白色原在本发明上下文中可以互换使用。通常,在缺少高亲和性配体的情况下,所形成的血红蛋白色原不十分稳定。其吸光度有变化,并且在大多数情况下随时间衰减。在这种情况下,分析方法不可靠(即使很好地监控并校正降解反应的动力学),因为色原可能对环境(如温度和样品制备条件等)十分敏感。当提供了适合的血红蛋白配体时,血红蛋白转变可以是定量的,形成的血红蛋白复合物的稳定性确保分析方法的可靠性。
配体的选择取决于要完成的分析,例如,仅用于血红蛋白测定,或用于多个诊断分析,如血红蛋白测定同时结合白细胞计数或白细胞亚群分类计数。如果配体不与其它分析相容,对于血红蛋白测定来说极好的配体可能不适合于后者的应用。Sakata公开的例子(在U.S.5,242,832中)中用于溶解红细胞并形成Hgb-SLS色原的SLS不能用于白细胞测定。
本发明的第一个实施方案涉及一种无氰化物的溶解剂组合物,该组合物用于测定血样中总血红蛋白浓度,或同时进行白细胞计数或白细胞亚群的分类计数。无氰化物溶解剂组合物包含以下物质的水溶液:
(Ⅰ)至少一种足以溶解红细胞并释放量血红蛋白量的表面活性剂,该表面活性剂选自:
其中R1是有10-18个碳原子的烷基、链烯基或炔基;R2、R3和R4是有1-4个碳原子的烷基,X-是氯或溴阴离子;
其中n是7-12的整数,X-是阴离子基团;
烷基磺酸、或烷基磺酸的碱金属盐;
有机磷酸酯,或有机磷酸酯的碱金属盐;
(Ⅱ)足以与血红蛋白形成稳定的色原量的有机配体,该有机配体选自:
(a)三唑如1,2,3-三唑和1,2,4-三唑,及三唑衍生物如1,2,4-三唑-3-硫醇、1,2,4-三唑钠盐衍生物、三唑二羧酸和三唑的杂环衍生物;
(b)四唑及其衍生物如5-氨基四唑;
其中M是碱金属阳离子;
(e)苯胺-2-磺酸
(f)喹哪啶酸
(h)下式的三嗪及其衍生物
其中R1、R2和R3是-H、-OH、-SH、-COOH以及三嗪的杂环衍生物;
(k)异烟酰胺
(m)6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶
(n)腺嘌呤
(o)3-(2-噻吩基)丙烯酸
其中R是-H、NH4 +或碱金属阳离子;
其中R1、R2 R3和R4是-H、-CN、-OH、-SH、-COOH或-CONH2。
如本领域普通技术人员所知,上述有机配体的衍生物是指带有母体化合物的功能部分如三唑环、四唑环和三嗪环的衍生物分子。
溶解剂组合物的pH是1-13。
在表面活性剂中,季铵盐是更优选的。在溶解剂组合物中的表面活性剂的浓度需要足以溶解红细胞并释放血红蛋白、而同时保存白细胞核。为了对白细胞计数,不需要使白细胞膜保持完整。一般来说,使用上述的本发明溶解剂组合物中的表面活性剂时,当红细胞完全溶解和破坏时,白细胞膜部分溶解。白细胞留下的核使得可以使用DC阻抗方法计数白细胞并将白细胞亚群区别成淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。在溶解剂组合物中的表面活性剂浓度是大约2g/L至大约250g/L,优选地是大约4g/L至大约80g/L。
在溶解剂组合物中的有机配体的浓度需要足以形成稳定的血红蛋白色原。该浓度随配体类型变化而变化,取决于配体对血红蛋白的亲和性。一般来说,如果在溶解剂组合物中的配体的量不足,所形成的血红蛋白色原不稳定。发现在本发明的溶解剂组合物中的有机配体的浓度在大约1g/L至大约30g/L、优选地大约2g/L至大约15g/L的宽范围中有效。
在溶解剂组合物中的化学成分的浓度就是在采用常用的血液分析仪使用适合的血液稀释剂进行血红蛋白及白细胞测定的条件下的浓度。然而,化学成分的浓度可以依赖于溶解剂组合物和稀释剂的体积比而改变。
任选性的添加剂也可以包含在溶解剂组合物中,浓度使其存在与溶解剂组合物的主要功能组分相容即可。这些添加剂有保存剂,它具有抗氧化性质(以增加组合物的货架寿命)以及抗微生物性质。
本发明的第一实施方案还涉及使用上述无氰化物溶解剂组合物测定血样中的总血红蛋白浓度、或同时对白细胞计数或对白细胞亚群的分类计数的方法。
将抗凝结的血样通过适合的血液稀释剂稀释,然后将足量的上述溶解剂组合物与所稀释的样品手工混合或机械混合。血液的稀释比是大约125∶1至大约500∶1(总试剂量相对于血液)。然后在添加溶解剂组合物后8-60秒在紫外分光计上或在装备有紫外检测器的自动血液分析仪上、在预定的用于总血红蛋白测定的吸光波长下用光度法测定样品混合物。也可以将样品混合物引入装备有紫外检测器和DC阻抗测定装置的血液分析仪中,以测定血样的血红蛋白浓度和对白细胞计数,或基于所获得的群体分布直方图进一步区别白细胞亚群。在后一种情况下,白细胞分成三个亚群,包括淋巴细胞,单核细胞和粒细胞。
利用装备有DC阻抗测定装置的血液分析仪对白细胞计数的检测方法在Wallace H.Coulter的美国专利2,656,508中有综合描述,其内容整个引入本文作为参考。使用DC阻抗测定法区别白细胞亚群的方法在美国专利4,485,175和4,528,274中有描述。
以上所述的有机配体(如三唑和蜜胺)不仅可以与血红蛋白形成稳定的色原,而且使白细胞在处理的样品混合物中稳定。该白细胞稳定效果阻止了白细胞溶解和核收缩,有利于基于其核体积分离白细胞亚群,并使得可能在大范围pH值内将白细胞分成三个亚群。实施例4说明了在本发明的溶解剂组合物中使用白细胞稳定化配体的成功例子。
另一方面,上述的一些有机配体(如苯胺-2-磺酸和喹哪啶酸)表现出对白细胞亚群的核大小的中等到强的冲击。当这些配体用于血红蛋白测定时,白细胞亚群破裂成一或两个组,使白细胞的区别变得困难。然而,即使有这些配体,白细胞核大小远保持在溶解剂组合物处理样品后的细胞碎片之上,并在常用的DC阻抗测定装置的检测限之上,这样,如在实施例3中的应用所说明的,白细胞的精确计数可以方便地在商业血液分析仪上完成。
一般来说,包含上述有机配体和表面活性剂的第一实施方案的溶解剂组合物可以在非常大范围的pH值内测定血样的总血红蛋白浓度。优选地,一种或几种季铵盐与任何有机配体的结合用于提供通过DC阻抗测定方法测定血样中的总血红蛋白浓度和白细胞计数。更优选地,一种或几种季铵盐与和白细胞分类分析相容的有机配体的结合用于提供血样的总血红蛋白浓度的测定、白细胞计数和白细胞亚群的分类计数。在最优选的方式中,白细胞被分成三个亚群,包括淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。
无氰化物溶解剂组合物和使用该组合物的方法与现有技术的血红蛋白测定方法相比具有几个优点。本发明使得可以在无氰化物的条件下精确测定血样中的血红蛋白浓度并确定白细胞数量或将白细胞亚群区别成淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。溶解剂组合物将存在于血样中的血红蛋白在大约8秒-60秒(取决于所使用的有机配体与稀释剂)迅速转化成稳定的色原,使得可以进行快速自动分析。血红蛋白色原一旦形成,在测定时期是稳定的。
图2显示了按照实施例1的方法使用配方1a的溶解剂组合物(包含四唑作为血红蛋白配体、COULTER_ ISOTON_ Ⅱ(商业血液稀释剂)作为稀释剂)处理的血样的一系列吸收光谱。图2说明了在添加溶解剂组合物后从12秒至12小时(以一个小时的间隔)获得的十二个图谱。Hgb-四唑色原的图谱十分稳定,在十二小时的数据收集期间没有表现出任何变化或衰减。
具体血红蛋白色原的性质取决于用于溶解剂组合物的有机配体。通过使用以上所述的有机配体用本发明的溶解剂组合物处理血样形成的大多数色原在大约510nm至大约560nm具有最大吸光度。因此,色原可以通过大部分商业的血液分析仪结合具体色原的吸光系数测定。
第一实施方案的溶解剂组合物可以与许多适合的血液稀释剂一起使用。图3显示了使用包含四唑的溶解剂组合物(实施例2)、并使用标准的磷酸缓冲盐水和商业血液稀释剂COULTER_ 1SOTON_Ⅲ作为稀释剂由上述方法处理的全血样的图谱。用这两种稀释剂,基本上形成了相同的血红蛋白色原,可以在540nm下测定。
不同于以前的试剂,上述的溶解剂组合物具有宽范围的pH值(1-13)。这加宽了可以用作血红蛋白配体的化学药品的范围。例如,4,6-二羟基-1,3,5-三嗪-2-羧酸的钾盐与血红蛋白形成稳定的色原,在538nm具有强吸光度。然而,4,6-二羟基-1,3,5-三嗪-2-羧酸的钾盐仅在低pH值(小于pH3)下易溶于水中。以前的中性和碱性试剂不可能使用这种化学物质用于血红蛋白的测定。Sakata在美国专利5,242,832中说明:如果pH值是3.0或更低,对白细胞的破坏增加,这样使白细胞的测定变得困难。图4显示了按照本发明的方法使用实施例4的溶解剂组合物(含有0.5%的4,6-二羟基-1,3,5-三嗪-2-羧酸钾盐,并具有2.3的pH值)和COULTER_ lSOTON_ Ⅲ(作为稀释剂)所获得的白细胞亚群分布直方图。如图4c和4d所说明的,白细胞被清楚地分成淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。图6b显示了在商业自动血液分析仪COULTER_ STKS上获得的白细胞数量与在相同的仪器上使用实施例3的溶解剂组合物之一(配方3b)获得的结果之间具有极好的线性相关性,其中溶解剂组合物的pH值仅为1.67。
第一实施方案的溶解剂组合物和使用该组合物的方法提供了精确的血红蛋白测定、精确的白细胞计数以及白细胞亚群的分类计数。图5a和6a显示了在COULTER_ STKS上使用常用的溶解剂获得的血红蛋白浓度和使用实施例3的溶解剂组合物(配方3a和3b)获得的血红蛋白浓度之间具有极好的线性相关性。图5b和6b说明了在COULTER_ STKS上获得的白细胞数量和在相同的仪器上使用配方3a和3b所获得的结果之间具有极好的相关性。
该实施方案的溶解剂组合物提供了在常见的干扰材料存在下精确的血红蛋白测定。总共72个全血样品在COULTER_ STKS上使用实施例3的配方3a分析。样品的70%是各种疾病(如镰状细胞危象和丙型肝炎)的临床样品。已知这些异常的血液含有异常血红蛋白和血红蛋白测定的干扰材料。然而,使用本发明的溶解剂组合物和方法的测定结果与常用的氰化物-Hgb方法相关性极好(如由图5和6所示),这表明了各种临床样品的总血红蛋白浓度都可以通过使用本发明的溶解剂组合物测定。
本发明的第二个实施方案涉及另一种利用有机配体稳定血红蛋白的功能的方式,它是将有机配体添加到血液稀释剂而非溶解剂组合物中。按照以上所述的方法,血样在与溶解剂混合之前使用血液稀释剂预先稀释。当稀释剂含有以上所述的有机配体时,在通过溶解剂从红细胞释放之后的样品混合物中的血红蛋白分子立即与有机配体接触以形成稳定的血红蛋白色原。因此,该替代方式用于血样中血红蛋白测定的相同目的。然而,它使试剂设计者基于其特定需要(例如,有机配体对溶解剂或稀释剂需要进行的血红蛋白测定以外的其它检测的相容性,或有机配体对溶解剂或稀释剂中的其它化学成分的相容性)可以选择最适合的方式。实施例5说明了有机配体在血液稀释剂中这种应用以形成稳定的血红蛋白色原,其中的溶解剂仅含有表面活性剂。图9a显示了按照实施例6的方法使用包含三唑作为血红蛋白配体的稀释剂处理的血样的图谱。色原的特征与使用在图1a中显示的包含相同配体的溶解剂组合物所获得的色原的特征相同。图9b显示了通过使用实施例6的稀释剂在COULTER COUNTER_ S-Plus Ⅳ上获得的血样的白细胞分布直方图,其中溶解剂仅含有表面活性剂。该例子显示了当以这种替代方式使用时,有机配体与白细胞分类分析的相容性。
本发明的第三个实施方案使用单一溶解剂组合物稀释并溶解血细胞样品用于血红蛋白测定以及白细胞分析,而无需用血液稀释剂进行预稀释。在该方法中,调节第一个实施方案的溶解剂组合物中的化学成分的浓度至足以溶解红细胞并形成稳定的血红蛋白色原。为进行白细胞计数或分类计数白细胞亚群,调节该同一溶解剂组合物的电导率使其可用于阻抗测定。通过加入足够量的一种或多种盐调节电导率。用于本发明的该单一的溶解剂组合物的适宜盐包括各种阴离子的碱金属盐。适宜的实例包括硫酸、盐酸、甲酸、乙酸和柠檬酸的碱金属盐及碱金属碳酸氢盐。需加入足以调节所述溶解剂的电导率至使用自动血液分析仪可进行测定的水平的盐。使用该单一溶解剂,可将血细胞样品中的白细胞区分为至少两个亚群,优选区分为三个亚群,同时可测定血红蛋白浓度并计数白细胞总数。如附图10b和11b所示,使用实施例7的单一溶解剂可获得两个白细胞亚群,它们是淋巴样细胞和髓样细胞群。
用于该单一溶解剂的表面活性剂包括季铵盐和吡啶鎓盐,在第一个实施方案中对它们进行了详细描述。优选将季铵盐用于该单一溶解剂。该单一溶解剂中的表面活性剂和有机配体的浓度通常低于与稀释剂使用的溶解剂组合物中的浓度。表面活性剂的浓度为约0.3g/L-约200g/L。有机配体的浓度为约0.1g/L-约30g/L。该单一溶解剂的pH范围和与稀释剂使用的溶解剂的pH略有不同。该单一溶解剂的pH为约3-约13,优选为约3.5-约11。实施例7显示了两个单一试剂方法的实例。
单一试剂方法提供了一步样品制备法,降低了设备的成本。
下列实施例是对本发明的说明,决不能解释为限制如在权利要求书中所定义的本发明的范围。可以理解:按照以上公开的内容,可以使用不同的其它成分和比例。
实施例1
制备下列组成的试剂。配方1a四唑 5.0g十四烷基三甲基溴化铵 15.0g蒸馏水,调整至1升pH 2.77配方1b三唑 10.0g十二烷基三甲基氯化铵(50%溶液) 35.0ml十四烷基三甲基溴化铵 3.5g蒸馏水,调整至1升pH 6.19配方1c喹哪啶酸 5.0g十二烷基三甲基氯化铵(50%溶液) 50.0ml蒸馏水,调整至1升pH 2.55配方1d蜜胺 5.0g十四烷基三甲基溴化铵 3.6g十二烷基三甲基氯化铵(50%溶液) 36.0ml蒸馏水,调整至1升pH 4.55配方le四唑 5.0gChemfac NB-104(由Chemax公司制造的复合磷酸盐) 30.0g蒸馏水,调整至1升pH 7.11
用2500μl的ISOTON_ Ⅱ稀释11.6μl的全血样品,然后将403μl的上述溶解剂组合物之一与预先稀释的样品手工混合。立即在BeekmanDU 7500分光光度计上测定样品的吸收光谱。图1a和1b显示了按照上述方法使用配方1b和1c处理的血样的图谱。图2显示了从按照上述方法使用配方1a处理的血样获得的总共十二个图谱。在添加溶解剂组合物之后从12秒-12小时以一小时的间隔获得的图谱。
实施例2
制备下列组成的试剂。四唑 5.0g十二烷基三甲基氯化铵(50%溶液) 36.0ml十四烷基溴化铵 3.6g蒸馏水 1升pH 2.73
用2500μl的血液稀释剂稀释11.6μl的全血样品,然后将403μl的上述溶解剂组合物与预先稀释的样品手工混合。立即在Beekman DU7500分光光度计上测定样品的吸收光谱。使用了五种商业血液稀释剂用于血红蛋白测定,即COULTER_ ISOTON_ Ⅲ、COULTER_ ISOTON_Ⅱ、Technicon H·TM Systems RBC DIL(Technicon仪器公司的商品)、标准磷酸缓冲盐水和标准氯化钠盐水。所形成的色原在大约540nm具有最大吸收峰,在大约565nm具有肩峰。当不同的稀释剂用于血红蛋白测定时,色原的最大吸收仅有轻微不同,即用ISOTON_ Ⅲ在540nm,ISOTON_ Ⅱ、Technicon H·TM Systems RBC DIL以及标准的磷酸缓冲盐水在539nm,标准的氯化钠盐水在538nm。在添加上述溶解剂组合物之后,色原在8秒-约35秒(取决于使用的血液稀释剂)后立即形成。图3显示了按照上述方法使用标准的磷酸缓冲盐水和ISOTON_Ⅲ(作为稀释剂)获得的图谱。
实施例3
制备下列组成的试剂。配方3a四唑 5.0g十四烷基三甲基溴化铵 15.0g蒸馏水,调整至1升pH 12.06配方3b苯胺-2-磺酸 5.0g十四烷基三甲基溴化铵 10.0g十六烷基三甲基溴化铵 4.0g蒸馏水 1升pH 1.67配方3c喹哪啶酸 5.0g十二烷基三甲基氯化铵(50%溶液) 40.0ml蒸馏水 1升pH 2.58
将大约70个血样(其血红蛋白浓度为6-17g/dL,白细胞数目为1,000/μL-40,000/μL)在校准的COULTER_ STKS仪器上在标准仪器设置下(除溶解剂外,LYSE S_ Ⅲ diff由上述制剂代替)分析。对于每一种配方,大约一半样品是各种疾病的临床样品。在配方3a的情况下,70%样品是临床样品。图5显示了通过使用参考试剂(LYSE S_ Ⅲdiff)获得的血红蛋白浓度和白细胞数量(表示为以103/μL为单位的WBC)与在相同的仪器上使用配方3a获得的结果之间的相关性。图6显示了通过使用LYSE S_ Ⅲ diff获得的血红蛋白浓度和白细胞数量与在相同的仪器上使用配方3b获得的结果之间的相关性。
图5和6说明了在血红蛋白浓度和WBC测定上本发明的溶解剂组合物和常用的含氰化物溶解剂之间极好的线性相关性。
实施例4
制备下列组成的试剂。
溶解剂配方4a三唑 10.0g十二烷基三甲基氯化铵(50%溶液) 35.0ml十四烷基三甲基溴化铵 3.5g蒸馏水,调整至1升pH 6.39配方4b4,6-二羟基-1,3,5-三嗪-2-羧酸钾盐 5.0g十二烷基三甲基氯化铵(50%溶液) 35.0ml十四烷基三甲基溴化铵 3.5g蒸馏水,调整至1升用HCl将pH调整至2.3稀释剂硫酸钠 9.7g氯化钠 4.0g蒸馏水,调整至1升用1%NaOH将pH调整至7.14
将85个血样(其血红蛋白浓度为6-17g/dL,白细胞数目为1,500/μL-45,000/μL)在校准的COULTER COULTER_ S-Plus Ⅳ上在标准仪器设置下使用参考试剂LYSE S_ Ⅲ diff和ISOTON_ Ⅲ分析。然后在相同的仪器上再次分析相同的样品,只是溶解剂LYSE S_ Ⅲ diff由上述溶解剂组合物代替,ISOTON_ Ⅲ由上述稀释剂代替。图4显示了在COULTER COULTER_ S-Plus上获得的四个血样的白细胞亚群分布直方图。图4a和4b使用配方4a和上述稀释剂获得,其中图4a显示了正常血液的直方图,图4b显示了具有高单核细胞的血样的直方图。图4c和4d使用配方4b和ISOTON_ Ⅲ获得,其中图4c显示了正常血液的直方图,图4d显示了具有大于90%粒细胞的临床样品的直方图。图7a-7e显示了使用参考试剂获得的白细胞数量(以103/μL为单位的WBC,图7a)、淋巴细胞%(图7b)、单核细胞%(图7c)、粒细胞%(图7d)和血红蛋白浓度(图7e)与使用配方4a和上述稀释剂获得的结果之间的相关性。回归曲线的相关系数、斜率和截距说明了血红蛋白浓度、WBC、淋巴细胞%和粒细胞%极好的线性相关性,以及对单核细胞%的良好相关性。
实施例5溶解剂十二烷基三甲基氯化铵(50%溶液) 36.0ml十四烷基三甲基溴化铵 3.6g蒸馏水,调整至1升pH 6.88稀释剂配方5a四唑 5g标准磷酸缓冲盐水 1升pH 3.86配方5b2-氨基-1,3,4-噻唑 5.0g硫酸钠 9.7g氯化钠 4.0g蒸馏水,调整至1升pH 6.04
用2500μl的上述稀释剂之一稀释11.6μl的全血样品,然后将403μl的上述溶解剂组合物与预先稀释的样品手工混合。立即在BeekmanDU 7500分光光度计上测定样品的吸收光谱。图8a至8b显示了按照上述方法分别使用配方5a和5b处理的血样的图谱。
实施例6溶解剂十二烷基三甲基氯化铵(50%溶液) 36.0ml十四烷基三甲基溴化铵 3.6g蒸馏水,调整至1升pH 6.88稀释剂三唑 5.0g硫酸钠 9.7g氯化钠 4.0g蒸馏水,调整1升pH 6.06
将10个血样在校准的COULTER COULTER_ S-Plus Ⅵ上使用上述的溶解剂和稀释剂分析。图9a显示了在COULTER COULTER_ S-Plus上获得的血样的白细胞亚群分布直方图。这些样品也在分光计上按照实验5中描述的方法使用上述溶解剂和稀释剂处理和测定。图9a显示了用于图9b的相同血样的光谱。光谱和白细胞亚群分布直方图与三唑用于溶解剂组合物时获得的特征相同。
实施例7配方7a十二烷基三甲基氯化铵(50%溶液) 5.0ml三唑 3.0g硫酸钠 15.9g蒸馏水,调整至1升pH 6.30配方7b十二烷基三甲基氯化铵(50%溶液) 5.0ml四唑 1.0g硫酸钠 15.9g蒸馏水,调整至1升pH 3.69
将10微升全血样品与2.5毫升上面的配制品之一手工混合。立即在Beckman DU 7500分光光度计上测定吸收谱。附图10a和11a显示了分别加入配制品7a和7b后15秒测得的光谱。在血液学实验分析仪上,将另外的12微升全血样品与3.0毫升上面的配制品之一自动化混合。在加入溶解剂10秒后,通过DC阻抗测定分析样品混合物。附图10b和11b显示了获得的白细胞亚群分布直方图。如本领域普通专业技术人员所知,根据与溶解剂接触的白细胞的大小,调整DC阻抗测定的增益以覆盖所有的细胞范围。
Claims (15)
1.一种稀释并溶解血细胞样品用于测定血红蛋白浓度和白细胞计数的无氰化物溶解剂组合物,该组合物包含下列物质的水溶液:
(Ⅰ)一种由下列分子结构式表示的季铵盐:
其中R1是有10-18个碳原子的烷基、链烯基或炔基;R2、R3和R4是有1-4个碳原子的烷基,X-是氯或溴阴离子;或
一种由下列分子结构表示的吡啶鎓盐:
其中n是7-12的整数,X-是阴离子基团;其中季铵盐或吡啶鎓盐的含量足以溶解红细胞并释放血红蛋白;
(Ⅱ)足以与血红蛋白形成稳定色原量的有机配体,该有机配体选自:
(a)三唑及其衍生物;
(b)四唑及其衍生物;
(c)下式的4,6-二羟基-1,3,5-三嗪-2-羧酸的碱金属盐:
其中M是碱金属阳离子;
(e)苯胺-2-磺酸
(g)2-氨基-1,3,4-噻二唑
(h)下式的三嗪及其衍生物
其中R1、R2和R3是-H、-OH、-SH、-COOH以及三嗪的杂环衍生物;
(i)尿唑
(j)DL-2-哌啶酸
(k)异烟酰胺
其中R是-H、NH4 +或碱金属阳离子;和
其中R1、R2 R3和R4是-H、-CN、-OH、-SH、-COOH或-CONH2;以及(Ⅲ)足以调节溶解剂的电导率以进行阻抗测定量的盐。
2.权利要求1的溶解剂组合物,其中用于调节溶解剂的电导率的盐包括碱金属硫酸盐、氯化物、甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐和碳酸氢盐。
3.权利要求1的溶解剂组合物,其中所述的表面活性剂包含大约0.3g/L至大约200g/L浓度的季铵盐。
4.权利要求1的溶解剂组合物,其中所述的表面活性剂包含大约0.5g/L至大约130g/L浓度的吡啶鎓盐。
5.权利要求1的溶解剂组合物,其中所说的有机配体的浓度为大约0.1g/L至大约30g/L。
8.一种使用稀释并溶解血细胞样品的无氰化物溶解剂组合物测定血样的总血红蛋白浓度和白细胞计数的方法,该方法包括:
(1)将血样与溶解红细胞并形成稳定的血红蛋白色原的无氰化物溶解剂组合物混合,其中所述溶解剂组合物包含下列物质的水溶液:
其中R1是有10-18个碳原子的烷基、链烯基或炔基;R2、R3和R4是有1-4个碳原子的烷基,X-是氯或溴阴离子;或
其中n是7-12的整数,X-是阴离子基团;其中季铵盐或吡啶鎓盐的含量足以能溶解红细胞并释放血红蛋白;
(Ⅱ)足以与血红蛋白形成稳定色原量的有机配体,该有机配体选自:
(a)三唑及其衍生物;
(b)四唑及其衍生物;
其中M是碱金属阳离子;
(d)蜜胺
(e)苯胺-2-磺酸
(f)喹哪啶酸(g)2-氨基-1,3,4-噻二唑
(h)下式的三嗪及其衍生物
其中R1、R2和R3是-H、-OH、-SH、-COOH以及三嗪的杂环衍生物;
(i)尿唑
(j)DL-2-哌啶酸
(m)6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶
(o)下式的苯甲酸或苯甲酸的碱金属或铵盐
其中R是-H、NH4 +或碱金属阳离子;和
(p)下式的吡嗪及其衍生物
其中R1、R2 R3和R4是-H、-CN、-OH、-SH、-COOH或-CONH2;以及
(Ⅲ)足以调节溶解剂的电导率以进行阻抗测定量的盐。
(2)在预定的波长下测定形成的血红蛋白色原的吸光度;
(3)由所测定的吸光度计算所述血样的总血红蛋白浓度;
(4)在自动血液分析仪中用DC阻抗测定法计数白细胞的数量;和
(5)报告所述血样的白细胞数量。
9.权利要求8的方法,其中所形成的血红蛋白色原在大约510nm至大约560nm具有最大吸光度。
10.权利要求8的方法,其中所述溶解剂组合物包含下列物质的水溶液:
(Ⅰ)一种由下列分子结构式表示的季铵盐:
其中R1是有10-18个碳原子的烷基、链烯基或炔基;R2、R3和R4是有1-4个碳原子的烷基,X-是氯或溴阴离子;其中季铵盐的量在用于测定血红蛋白浓度中足以溶解红细胞并释放血红蛋白,在白细胞分类分析中还保持白细胞亚群的核;和
(Ⅱ)足以与血红蛋白形成稳定色原量的有机配体,该有机配体选自:
(a)三唑及其衍生物;
(b)四唑及其衍生物;
(d)下式的4,6-二羟基-1,3,5-三嗪-2-羧酸的碱金属盐:其中M是碱金属阳离子;
(e)2-氨基-1,3,4-噻二唑
(g)DL-2-哌啶酸
(h)异烟酰胺
其中R1、R2 R3和R4是-H、-CN、-OH、-SH、-COOH或-CONH2;和
(Ⅲ)足以调节溶解剂的电导率以进行阻抗测定量的盐。
11.权利要求10的方法,其中所述季铵盐的浓度为约0.3g/L-约20g/L。
12、权利要求10的方法,还包括下列步骤:
按照群体分布直方图区分白细胞亚群;和
报告白细胞亚群的数量。
13、权利要求10的方法,其中的有机配体是三唑。
14、权利要求10的方法,其中的有机配体是四唑。
15、权利要求12的方法,其中的白细胞被区分为至少两个亚群。
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