CN1283664C - 促红血球生成素偶联物 - Google Patents

促红血球生成素偶联物 Download PDF

Info

Publication number
CN1283664C
CN1283664C CNB2004100036029A CN200410003602A CN1283664C CN 1283664 C CN1283664 C CN 1283664C CN B2004100036029 A CNB2004100036029 A CN B2004100036029A CN 200410003602 A CN200410003602 A CN 200410003602A CN 1283664 C CN1283664 C CN 1283664C
Authority
CN
China
Prior art keywords
conjugate
erythropoietin
epo
glycoprotein
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
CNB2004100036029A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1515590A (zh
Inventor
帕斯卡尔·塞巴斯蒂安·拜隆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27495518&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN1283664(C) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN1515590A publication Critical patent/CN1515590A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1283664C publication Critical patent/CN1283664C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]

Abstract

本发明提供了一种促红血球生成素与聚(乙二醇)的偶联物，它含有一种具有至少一个自由氨基基团并具有使骨髓细胞提高网状细胞和血红细胞产生的体内生物学活性的促红血球生成素糖蛋白，该促红血球生成素糖蛋白选自人类促红血球生成素及其类似物，该人类促红血球生成素类似物具有人类促红血球生成素的序列，该序列通过加入1至6个糖基化位点或至少一个糖基化位点的重排而被修饰；所说的糖蛋白与“n”个式-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR的聚(乙二醇)基团共价相连。

Description

促红血球生成素偶联物
技术领域
本发明涉及促红血球生成素偶联物。
背景技术
红血球生成(Erythropoiesis)是指血红细胞的生成，以补偿细胞的损失。红血球生成是一种受控的生理机制，它提供足够的血红细胞用于组织供氧。天然状态下存在的人类促红血球生成素(hEPO)是由肾脏产生的，是一种刺激血红细胞生成的体液因子(Carnot，P和Deflandre，C(1906)C.R.Acad.Sci.143：432；Erslev，AJ(1953 Blood(血液)8：349；Reissmann，KR(1950)Blood 5：372；Jacobson，LO，Goldwasser，E，Freid，Wand Plzak，LF(1957)Nature(自然)179：6331-4)。天然存在的EPO刺激骨髓中的定向类红细胞祖先的分裂和分化，并通过与类红细胞前体上的受体结合发挥其生物学活性(Krantz，BS(1991)Blood 77：419)。
利用重组DNA技术通过生物合成已生产出了促红血球生成素(Egrie，JC，Strickland，TW，Lane，J等(1986)Immunobiol.72：213-224)，它是插入在中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)并在其中表达的克隆的人类EPO基因的产物。主要的、完全加工形式的hEPO的一级结构示于SEQ ID NO：1。在Cys7-Cys161和Cys29-Cys33之间有两个二硫键。没有糖基的EPO多肽链的分子量为18,236Da.。在完整的EPO分子中，约40％的分子量是由该蛋白质上在糖基化位点使该蛋白质糖基化的碳水化合物基团带来的(Sasaki，H，Bothner，B，Dell，A和Fukuda，M(1987)J.Biol.Chem.262：12059)。
因为人类促红血球生成素在血红细胞生成中是必须的，这种激素可用于治疗其特征为血细胞生成低或缺陷型的血液疾病。在临床上，EPO被用于治疗慢性肾衰竭(CRF)病人的贫血(Eschbach，JW，Egri，JC，Downing，MR等(1987)NEJM 316：73-78；Eschbach，JW，Abdulhadi，MH，Browne，JK等(1989)Ann.Intern.Med.111：992；Egrie，JC，Eschbach，JW，McGuire，T，Adamson，JW(1988)Kidney Intl.33：262；Lim，VS，Degowin，RL，Zavala，D等(1989)Ann.Intern.Med.110：108-114)，以及治疗化学治疗中的AIDS和癌症病人的贫血(Danna，RP，Rudnick，SA，Abels，RI In：MB，Garnick，ed.Erytihropoietin in Clinical Applications-An InternationalPerspective.New York，NY：Marcel Dekker；1990：p.301-324)。但是，由于其短的血浆半衰期和对蛋白酶降解的敏感性，通过商业途径获得到蛋白质治疗剂，例如EPO，的生物利用率是有限的。这些缺点限制了它们临床利用的潜力。
发明内容
本发明提供了一种促红血球生成素偶联物，所说的偶联物含有一种具有至少一个自由氨基基团并具有使骨髓细胞提高网状细胞和血红细胞产生的体内生物学活性的促红血球生成素糖蛋白，该促红血球生成素糖蛋白选自人类促红血球生成素及其类似物，该人类促红血球生成素类似物具有人类促红血球生成素的序列，该序列通过加入1至6个糖基化位点或至少一个糖基化位点的重排而被修饰；所说的糖蛋白与“n”个式-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR的聚(乙二醇)基团共价相连，其中每个聚(乙二醇)基团的-CO(即羰基)与所说的氨基之一形成酰胺键；其中R是低级烷基；x是2或者3；m是约450至约900；n是1至3；并且n和m的选择应使该偶联物的分子量减去促红血球生成素糖蛋白是从20千道尔顿至100千道尔顿。本发明还提供了含有本文所述的偶联物的组合物，其中，该组合物中其中n是1的偶联物的百分比至少是百分之九十。
与没有修饰的EPO(即没有PEG相连的EPO)和常规的PEG-EPO偶联物相比，本发明的偶联物在循环系统中的半衰期和在血浆中的存留时间延长，并且在体内的临床活性提高。本发明的偶联物与EPO具有相同的用途。特别是，本发明的偶联物与EPO治疗患者的方式相同通过刺激骨髓中定向类红细胞祖先的分裂和分化可用于治疗患者。
本发明提供了一种偶联物，所说的偶联物含有一种具有至少一个自由氨基基团并具有使骨髓细胞提高网状细胞和血红细胞产生的体内生物学活性的促红血球生成素糖蛋白，该促红血球生成素糖蛋白选自人类促红血球生成素及其类似物，该人类促红血球生成素类似物具有人类促红血球生成素的序列，该序列通过加入1至6个糖基化位点或至少一个糖基化位点的重排而被修饰；所说的糖蛋白与“n”个式-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR的聚(乙二醇)基团共价相连，其中每个聚(乙二醇)基团的-CO(即羰基)与所说的氨基之一形成酰胺键；其中R是低级烷基；x是2或者3；m是约450至约900；n是1至3；并且n和m的选择应使该偶联物的分子量减去促红血球生成素糖蛋白是从20千道尔顿至100千道尔顿。
已发现，本发明的偶联物可以与非修饰的EPO相同的方式使用。但是，本发明的偶联物在循环系统中的半衰期和在血浆中的存留时间延长，清除率降低，并且在体内的临床活性提高。由于这些性能得到改善，本发明的偶联物可每周施用一次，而不是像非修饰的EPO那样每周施用三次。施用频度的降低使患者更易于配合，改善治疗效果，以及改善患者的生活质量。与常规的与聚(乙二醇)相连的EPO的偶联物相比，发现具有本发明的偶联物的分子量和连接结构的偶联物具有改善的效力，稳定性，AUC，循环半衰期，并且成本下降。
本发明的偶联物可以与EPO相同的施用用方式以治疗有效的量施用给患者。治疗有效量是用于在体内造成骨髓提高网状细胞和血红细胞产生所需要的偶联物的量。确切的偶联物的量依据待治疗的疾病的确切类型，待治疗病人的状态，以及该组合物中的其它成分对该因子所需的优选的量。例如可以施用，例如每周一次，每公斤体重0.01至10微克，优选0.1至1微克。
含有该偶联物的药物组合物可被配制成通过多种方式使用的有效剂型，从而施用给患有血红细胞产生过低或缺乏的血液疾病患者。该偶联物的平均治疗有效量可发生变化，具体地说应基于医生的建议。
按照本发明制备的促红血球生成素糖蛋白可按照现有技术已知的方法使用药学上可接受的载体制备成适用于注射的药物组合物。例如，适当的组合物描述于WO97/09996，WO97/40850，WO98/58660，和WO99/07401。用于配制本发明的产品的药学上可接受的载体包括人血清白蛋白，人血浆蛋白等。本发明的化合物可被配制在pH7的含有一种渗透调节剂，例如132mM氯化钠，的10mM磷酸钠/钾缓冲液中。该药物组合物可任选地含有一种防腐剂。该药物组合物可含有不同量的促红血球生成素，例如10-1000微克/ml，例如50微克或400微克。
术语“促红血球生成素”或者“EPO”是指一种糖蛋白，它具有(SEQID NO：1)或者(SEQ ID NO：2)所示的氨基酸序列或者或者与其基本上同源的氨基酸序列，其生物学性能与刺激血红细胞产生和刺激骨髓中定向类红细胞祖先的分裂和分化相关。本文中适用的这一术语包括这样一种人为修饰的蛋白质，例如通过定点诱变或通过偶然的突变。这些术语也包括具有1至6个额外的糖基化位点的类似物，在该糖蛋白的羧基端具有至少一个额外的氨基酸的类似物，其中，该额外的氨基酸包括至少一个糖基化位点，以及包括至少一个糖基化位点重排的氨基酸序列的类似物。这些术语包括天然和重组产生的人类促红血球生成素。
本发明的促红血球生成素偶联物可由式I表示：
P-[NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]n    (I)
其中x，m，n和R与上述定义相同。在式I中，P是本文描述的促红血球生成素糖蛋白的残基，(即没有与示于式I中的羰基形成酰胺键的氨基基团)，它具有造成骨髓细胞提高网状细胞和血红细胞产生的体内生物学活性。
在本发明的优选的实施方案中，R是甲基。优选m是约650至约750，和n优选是1。
在本发明的最优选的实施方案中，R是甲基，m是约650至约750，和n是1，即上述的偶联物具有下式：
[CH3O(CH2CH2O)mCH2CH2CH2CO-NH]n-P
其中m是650至750，n是1和P与上述定义相同。优选m的平均值为约680。
优选上述定义的偶联物的糖蛋白是人类促红血球生成素。上述的人类促红血球生成素及其类似物可通过内源基因的激活作用来表达。优选人类促红血球生成素糖蛋白SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的那些，最优选SEQ ID NO：1的那些。
而且，P可以选自促红血球生成素的残基和它的具有1至6个额外的糖基化位点的类似物。如下文所述，EPO的制备和纯化在现有技术中是已知的。EPO是指天然的或重组的蛋白质，优选人类的蛋白质，它可从任意一种常规的来源得到，例如组织，蛋白质合成，用天然的或重组的细胞进行的细胞培养。任何一种具有EPO活性的蛋白质，例如突变蛋白或以其它的方式修饰的蛋白质均包括在本发明的范围内。重组的EPO可通过在CHO-，BHK-或者HeLa细胞系中，通过重组DNA技术或通过内源基因的激活进行表达来制备。通过内源基因的激活对蛋白质，包括EPO，的表达是现有技术中已知的技术，它们公开于，例如U.S.Patents Nos.5,733,761，5,641,670，和5,733,746，和国际专利申请Nos.WO 93/09222，WO 94/12650，WO 95/31560，WO 90/11354，WO 91/06667和WO 91/09955，其内容引入本文作为参考。用于制备促红血球生成素糖蛋白产品的优选的EPO为人类的EPO。优选该EPO为具有SEQ ID NO：1或者SEQ IDNO：2，更优选具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的人类EPO。
在一个实施方案中，P可以是具有1至6个额外的糖基化位点的糖蛋白类似物的残基。用一个或多个寡糖基团对蛋白质的糖基化发生在多肽骨架上的特定的位点，并极大地影响该蛋白质的物理性质，例如蛋白质的稳定性，分泌性，亚细胞定位和生物活性。糖基化通常为两种类型。O-连接的寡糖连接在丝氨酸或者苏氨酸残基上，N-连接的寡糖连接在天冬酰胺残基上。存在于N-连接的和O-连接的寡糖的一种类型的寡糖是N-乙酰神经氨酸(唾液酸)，它是一个含有9个或更多个碳原子的氨基糖的家族。唾液酸通常是N-连接的和O-连接的寡糖的末端残基，并且，由于它携带负电荷，从而赋予糖蛋白酸性。人类促红血球生成素具有165个氨基酸，含有三个N-连接的和一个O-连接的寡糖链，该寡糖链占约40％的糖蛋白的总分子量。N-连接的糖基化发生在位于位点24，38，和83的天冬酰胺残基上，O-连接的糖基化发生在位于位点126的丝氨酸残基上。该寡糖链被末端唾液酸残基修饰。从糖基化的促红血球生成素酶切除所有的唾液酸残基导致体内活性的丧失，但不造成体外活性的丧失，因为促红血球生成素的唾液酸化防止了它被肝结合蛋白质的结合，以及随后的清除。
本发明的糖蛋白包括人类促红血球生成素的类似物，它在人类促红血球生成素的氨基酸序列中具有一个或多个变化，从而导致唾液酸连接位点的数目提高。这些糖蛋白类似物可通过定点诱变产生，例如氨基酸残基的增加，缺失，或替换，从而提高或改变可进行糖基化的位点的。具有高于人类促红血球生成素的唾液酸水平的糖蛋白类似物是通过增加糖基化位点产生的，而不影响该蛋白质生物活性所需的二级或三级结构。本发明的糖蛋白也包括在糖基化位点具有提高的水平的碳水化合物连接的类似物，这通常涉及在临近N-连接的或者O-连接的位点一个或多个氨基酸的替换。本发明的糖蛋白也包括从促红血球生成素的所基末端具有一个或多个氨基酸延伸并提供至少一个额外的碳水化位点的类似物。本发明的糖蛋白也包括具有一种包括至少一个糖基化位点重排的氨基酸序列的类似物。这种糖基化位点的重排涉及在人类促红血球生成素中一个或多个糖基化位点的缺失，以及一个或多个非天然存在的糖基化位点的增加。增加促红血球生成素上碳水化合物链的数目，并因而增加每个促红血球生成素分子中唾液酸的数目可带来几个优点，例如稳定性提高，对蛋白酶裂解的抗性提高，免疫原性降低，血清半衰期延长，和生物活性提高。具有额外的糖基化位点的促红血球生成素类似物公开于Elliot的欧洲专利申请640 619，公开日1995年3月1日。
在优选的实施方案中，本发明的糖蛋白含有一种氨基酸序列，它包括至少一个额外的糖基化位点，例如，但不限于，含有通过选自下组的修饰而被修饰的人类促红血球生成素的序列的促红血球生成素：
Asn30Thr32；
Asn51Thr53，
Asn57Thr59；
Asn69；
Asn69Thr71；
Ser68Asn69Thr71；
Val87Asn88Thr90；
Ser87Asn88Thr90；
Ser87Asn88Gly89Thr90；
Ser87Asn88Thr90Thr92；
Ser87Asn88Thr90Ala162；
Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90；
Asn30Thr32Val87Asn88Thr90；
Asn89Ile90Thr91；
Ser87Asn89Ile90Thr91；
Asn136Thr138；
Asn138Thr140；
Thr125；和
Pro124Thr125。
在本文中使用的用于表示氨基酸序列修饰的符号是指由上标数字表示的相应的没有修饰的蛋白质(例如SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：2的hEPO)的位点被改变为紧接在各个上标数字之前的氨基酸。
该糖蛋白也可以是在该糖蛋白的羧基末端具有至少一个额外的氨基酸的类似物，其中，该额外的氨基酸包括至少一个糖基化位点，即上述的偶联物也指这样一种化合物，其中该糖蛋白具有一种序列，该序列含有人类促红血球生成素的序列和在人类促红血球生成素序列的羧基末端的第二序列，其中，该第二序列含有至少一个糖基化位点。该额外的氨基酸可含有一种衍生于人绒膜促性腺激素的羧基末端的肽片段。优选该糖蛋白是一种选自下组的类似物：(a)具有氨基酸序列，Ser Ser Ser SerLys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser AspThr Pro Ile Leu Pro Gln(SEQ ID NO：3)的人类促红血球生成素，从羧基端延伸；(b)还含有Ser87 Asn88 Thr90 EPO的(a)中的类似物；和(c)还含有Asn30 Thr32 Val87 Asn88 Thr90 EPO的(a)中的类似物。
该糖蛋白也可以是具有这样一种氨基酸序列的类似物，该氨基酸序列包括至少一个糖基化位点的重排。这种重排可以含有人类促红血球生成素中N-连接的碳水化位点中的任意一个的缺失，和在人类促红血球生成素的氨基酸序列的第88位增加一个N-连接的碳水化位点。优选该促红血球生成素是一种选自下组的类似物：Gln24 Ser87 Asn88 Thr90 EPO；Gln38Ser87 Asn88 Thr90 EPO；和Gln83 Ser87 Asn88 Thr90 EPO。
本文中所使用的“低级烷基”是指具有1至6个碳原子的直链或支链的烷基基团。低级烷基基团的例子包括甲基，乙基和异丙基。按照本发明，R是任意一种低级烷基。优选其中R是甲基的偶联物。
符号“m”表示在聚(氧化乙烯)基团(OCH2CH2)中氧化乙烯残基的数目。氧化乙烯的一个单一的PEG亚基具有约44道尔顿的分子量。因而，该偶联物的分子量(不包括EPO的分子量)依赖于“m”的数量。在本发明的偶联物中，“m”是从约450至约900(相应于约20kDa至约40kDa的分子量)，优选从约650至约750(相应于约30kDa的分子量)。数字m的选择应使得到的本发明的偶联物具有与非修饰的EPO相当的生理活性，该活性可以代表与相应的非修饰的EPO的活性相同的、更高的活性，或者是该活性的一部分。分子量为“约”某一数值是指该分子量是在通过常规分析技术确定的这一数量的一个合理的范围内。“m”的选择应使与促红血球生成素糖蛋白共价相连的每个聚(乙二醇)基团的分子量是从约20kDa至约40kDa，优选约30kDa。
在本发明的偶联物中，数字“n”是与促红血球生成素的自由氨基(包括赖氨酸的ε-氨基和/或氨基端氨基基团)通过酰胺键共价相连的聚乙二醇基团的数目。本发明的偶联物每分子的EPO具有一个，两个，或三个PEG基团。“n”是从1至3的整数，优选“n”是1或2，最优选“n”是1。
式I的化合物可通过式II的化合物与促红血球生成素糖蛋白缩合从已知的聚合物材料制备：
Figure C20041000360200101
其中，R和m如上文所述。其中x是3的式II的化合物是聚(乙二醇)的α-低级烷氧基，丁酸琥珀酸亚胺基酯(低级烷氧基-PEG-SBA)。其中x是2的式II的化合物是聚(乙二醇)的α-低级烷氧基，丙酸琥珀酸亚胺基酯(低级烷氧基-PEG-SPA)。可使用任何一种常规的将活化的酯与一种胺反应形成一种酰胺的方法。在上述的反应中，所例举的琥珀酸亚胺基酯是一种造成酰胺形成的离去基团。使用例如式II的化合物的琥珀酸亚胺基酯来生产与蛋白质的偶联物的方法公开于U.S.Patent No.5,672,662，1997年9月30日授权(Harris，等)。
人类EPO含有9个自由氨基基团，氨基端氨基基团加上8个赖氨酸残基的ε-氨基基团。当PEG化试剂(pegylation reagent)与式II的SBA化合物结合时，发现在pH 7.5，蛋白质∶PEG比率为1∶3，和反应温度为20-25℃时，产生单-，二-，和痕量的三-PEG化的产物的混合物。当PEG化试剂是式II的SPA化合物时，在除了蛋白质∶PEG比率为1∶2外相似的条件下，主要产生了单-PEG化的产物。PEG化的EPO可以混合物的形式施用，或者以阳离子交换层析分离的不同的PEG化的产物的形式使用。通过操纵反应条件(即，反应试剂的比率，pH，温度，蛋白质浓度，反应时间等)，不同的PEG化的(pegylated)的产物可以变化。
人类促红血球生成素(EPO)是一种刺激红细胞生成的人类糖蛋白。其制备和治疗应用描述于例如U.S.Patent Nos.5,547,933和5,621,080，EP-B 0 148 605，Huang，S.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)2708-2712，EP-B 0 205 564，EP-B 0 209 539和EP-B 0411 678以及Lai，P.H.等，J.Biol.Chem.261(1986)3116-3121，an Sasaki，H.等，J.Biol.Chem.262(1987)12059-12076。用于治疗应用的促红血球生成素可通过重组方式生产(EP-B 0 148 605，EP-B 0 209 539和Egrie，J.C.，Strickland，T.W.，Lane，J.等(1986)Immunobiol.72：213-224)。
在无血清培养基中表达和制备促红血球生成素的方法描述于，例如，WO 96/35718，Burg，公开于1996年11月14日。和欧洲专利申请No.513738，Koch，公开日为1992年6月12日。除了上述的文献外，已知可进行含有EPO基因的重组CHO细胞的无血清发酵。该方法描述于例如EP-A 0513 738，EP-A 0 267 678以及Kawamoto，T.等，Analytical Biochem.130(1983)445-453，EP-A 0 248 656，Kowar，J.和Franek，F.，Methods inEnzymology 421(1986)277-292，Bavister，B.，Expcology 271(1981)45-51，EP-A 0 481 791，EP-A 0307247，EP-A 0343635，WO 88/00967。
在EP-A 0 267 678中描述了一种在S-琼脂糖上的离子交换层析，一种在C8柱上的制备性反相HPLC和一种凝胶过滤层析用于无血清培养中制备的EPO在透析后进行纯化。在这一方面，凝胶过滤层析步骤可被快流S-琼脂糖(S-Sepharose fast flow)上的离子交换层析替换。也有人提议在离子交换层析之前进行在蓝色Trisacryl柱上的染料层析。
一种纯化重组的EPO的方法描述于Nobuo，I.等，J.Biochem.107(1990)352-359。在这一方法中，在纯化步骤前EPO是用Tween20，苯甲基磺酰氯，乙基马来亚酰胺，抑胃酶肽A，硫酸铜和草氨酸处理的。包括WO 96/35718，Burg，公开于1996年11月14日，的出版物公开了一种在无血清发酵方法中(EPOsf)制备促红血球生成素的方法。
EPO和本发明的EPO偶联物的比活性可通过多种已知的方法进行测定。本发明的纯化的EPO蛋白质的生物活性时，通过注射将该EPO蛋白质施用给病人与没有注射的对照组相比导致骨髓细胞提高网状细胞和血红细胞的生成。本发明中得到的或纯化的EPO蛋白质，或其片段的生物学活性可按照Annable，等，Bull.Wld.Hlth.Org.(1972)47：99-112和Pharm.Europa Spec.Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)的方法进行测定。另一个用于测定EPO蛋白质的活性的方法，normocythaemic小鼠检测(normocythaemic mouse assay)，该方法描述于实施例4。
本发明提供了一种由上述的偶联物组成的组合物。一种含有至少90％的单-PEG偶联物，即其中n是1，是通过实施例5所示的方法制备的。通常促红血球生成素糖蛋白的单-PEG偶联物是所期望的，因为它们与二-PEG偶联物相比具有较高的生物活性。单-PEG偶联物的百分含量以及单-和二-PEG产物的比率可被控制，通过收集在洗脱峰周围较宽的级分来降低组合物中单-PEG的百分率，或者通过收集较窄的级分来提高组合物中单-PEG的百分率。约90％的单-PEG偶联物是产率和活性之间较好的平衡。有时可能需要其中例如至少92％或至少96％的偶联物为单-PEG产物(n等于1)的组合物。在本发明的一个实施方案中，其中n是1的偶联物的百分率为90％至96％。
本发明也提供了一种由一种偶联物或如上说述的组合物以及一种药学上可接受的载体的药物组合物。
本发明的偶联物和组合物特别适用于制备用于治疗或防治与慢性肾衰竭病人(CRF)，AIDS相关的贫血的疾病的药物，以及用于治疗进行化疗的癌症病人的药物。
本发明的另一个实施方案是一种用于防治和/或治疗涉及慢性肾衰竭病人(CRF)，AIDS和进行化疗的癌症病人的贫血的方法，包括向患者施用上述的组合物的步骤。
本发明还涉及一种用于制备上述的化合物的方法，包括将式II的化合物：
与一种促红血球生成素进行缩合，其中R，m和x与上述定义相同。
本发明也涉及用于治疗与慢性肾衰竭病人(CRF)，AIDS以及进行化疗的癌症病人相关的贫血的、上述的化合物。
参照下述实施例进一步描述本发明，这些实施例不限定本发明的范围。
                         实施例
               实施例1：人类EPO的发酵和纯化
a)接种体的制备和发酵
将一小瓶来源于产生EPO的CHO细胞系(可使用ATCC CRL8695，公开于EP 411678(Genetics Institute))的Working Cell Bank从液氮罐的气相中取出。将细胞转移至玻璃转瓶中，并被培养在湿润的二氧化碳培养箱中的碳酸氢盐缓冲的培养基中。用于接种体制备和发酵的典型的无血清培养基公开于欧洲专利申请513 738，Koch，公开日为1992年6月12日，或者WO 96/35718，Burg，公开日1996年11月14日，例如含有培养基DMEM/F 12(例如JRH Biosciences/Hazleton Biologics，Denver，US，orderNo.57-736)，还含有碳酸氢钠，L+谷氨酰胺，D+葡萄糖，重组胰岛素，亚硒酸钠，二氨基丁烷，氢化可的松，硫酸亚铁(II)，天冬酰胺，天冬氨酸，丝氨酸和一种哺乳动物细胞的稳定剂，例如聚乙烯基醇，甲基纤维素，葡聚糖，聚乙二醇，Pluronic F68，血浆增容剂聚明蚀肽(HEMACCEL)或者聚乙烯基吡咯烷酮(WO 96/35718)。
通过显微镜检查污染的微生物的存在，并检测细胞密度。在每一个分级步骤中进行这些检测。
在最初的生长期后，将细胞培养物用新鲜的培养基进行稀释，达到最初的细胞密度，并进行另一个生长周期。重复这一过程，直至达到每玻璃转瓶约2升的培养体积。在进行约12次加倍后，得到1至5升的培养物，然后将其用作10升接种发酵罐的接种体。
在3-5天后，10升发酵罐的培养物可被用作100升接种发酵罐的接种体。
再过3-5天后，100升发酵罐的培养物可被用作1000升生产发酵罐的接种体。
b)收获和细胞分离
使用一种分批重新补料方法(batch refeed process)，即，当达到所需的细胞浓度时，收获约80％的培养物。将剩余的培养物用新鲜的培养基重新装满并培养至下一次收获。一个生产周期是有最多10次随后的收获组成的：9个部分收获和1个在发酵最后的完全收获。每3-4天收获一次。
将测定后的收获物转移到一个冷却的容器中。通过离心或过滤除去细胞并将废弃。将离心步骤中的含有EPO的上清液进行在线过滤并将其收集到一个第二冷却的容器中。在纯化过程中每次的收获物是分别处理的。
纯化EPO-蛋白质的一个典型的过程描述于WO 96/35718，Burg，公开日1996年11月14日。下文描述该纯化过程。
a)蓝色琼脂糖层析(Blue Sepharose Chromatgraphy)
蓝色琼脂糖(Blue Sepharose)(Pharmacia)是由琼脂糖珠组成的，其表面上共价连接了Cibacron蓝色染料。由于EPO与蓝色琼脂糖的结合强于大多数的非蛋白质污染物，一些蛋白质类杂质和PVA，EPO可在这一步骤中富集。蓝色琼脂糖珠的洗脱是通过提高盐浓度以及pH来进行的。
柱中装载了80-100升的蓝色琼脂糖，用NaOH再生，并用平衡缓冲液进行平衡(氯化钠/钙和醋酸钠)。装入酸化的和过滤的发酵罐上清液。在装载完成后，首先将柱用含有较高氯化钠浓度的相似的缓冲液洗涤，然后用Tris-碱缓冲液洗涤。用Tris-碱缓冲液洗脱产物，并按照总洗脱图谱以一个单一的级分收集。
b)Butyl Toyopearl层析
Butyl Toyopearl 650C(Toso Haas)是一种聚苯乙烯基的基质，在其上共价偶联了脂肪丁基-残基。由于EPO与这种胶的结合强于大多数的杂质和PVA，用含有异丙醇的缓冲液进行洗脱。
柱中装载了30-40升的Butyl Toyopearl 650C，用NaOH再生，用Tris-碱缓冲液洗涤并用含有异丙醇的Tris-碱缓冲液进行平衡。
将蓝色琼脂糖洗脱物调整至柱平衡缓冲液中的异丙醇的浓度并加样到柱上。然后，将柱用含有提高的异丙醇浓度的平衡缓冲液洗涤。用洗脱缓冲液洗脱产物(具有高的异丙醇含量的Tris-碱缓冲液)，并按照总洗脱图谱以一个单一的级分收集。
c)Hydroxyapatite Ultrogel层析
Hydroxyapatite Ultrogel(Biosepra)是由羟基磷灰石组成的，它被整合在琼脂糖中，以改善机械性能。EPO对羟基磷灰石具有低的亲合性，因而与蛋白质杂质相比可在低磷酸盐浓度下洗脱。
柱中装载了30-40升的Hydroxyapatite Ultrogel(Biosepra)，用磷酸钾/氯化钙缓冲液和NaOH，然后用Tris-碱再生。然后用含有低浓度的异丙醇和氯化钠的Tris-碱缓冲液进行平衡。
将含有EPO的Brtyl Toyopearl层析的洗脱液装载到柱上。然后，将柱用平衡缓冲液和没有异丙醇和氯化纳的Tris-碱缓冲液洗涤。用含有低浓度的磷酸钾的Tris-碱缓冲液洗涤产物，并按照总洗脱图谱以一个单一的级分收集。
d)在Vydac C4上的反相HPLC
RP-HPLC材料Vydac C4(Vydac)是由硅胶颗粒组成的，其表面上携带有C4-烷链。从蛋白质杂质中分离EPO是基于疏水相互作用的强度不同。在稀释的三氟乙酸中以乙腈进行梯度洗脱。
制备性HPLC是使用不锈钢柱(装有2.8至3.2升的Vydac C4硅胶)进行的。通过加入三氟乙酸酸化Hydroxyapatite Ultrogel洗脱液，并加样到Vydac C4柱上。对于洗涤和洗脱，使用一种在稀释的三氟乙酸中的乙腈梯度。收集级分，并立即用磷酸盐缓冲液进行中和。将IPC限度范围内的EPO级分合并。
e)DEAE琼脂糖层析
DEAE琼脂糖(Pharmacia)材料是由与琼脂糖珠的表面共价相连的二乙基氨基乙基基团组成的。EPO与DEAE基团的结合是由离子相互作用介导的。乙腈和三氟乙酸流经柱时不被保留。在这些物质被洗涤之后，通过用低pH的乙酸盐缓冲液洗涤柱除去痕量的杂质。然后将柱用中性磷酸盐缓冲液洗涤并用逐渐提高离子强度的缓冲液洗脱EPO。
将柱用DEAE Sepharose fast flow进行装填。将柱体积进行调整以保证EPO装载量是在3-10mg EPO/ml胶的范围内。将柱用水和平衡缓冲液进行洗涤(磷酸钠/钾)。用合并的HPLC洗脱液级分加样并将柱用平衡缓冲液进行洗涤。然后将柱用洗涤缓冲液(醋酸钠缓冲液)进行洗涤，再用平衡缓冲液洗涤。然后，用洗脱缓冲液(氯化钠，磷酸钠/钾)洗脱EPO，并按照总洗脱图谱以一个单一的级分收集。
将DEAE琼脂糖柱的洗脱液调整至特定的导电率。将得到的药物进行无菌过滤，装入聚四氟乙烯瓶中，并保存在-70℃。
         实施例2：用mPEG-SBA对EPO进行PEG化
按照实施例1的无血清方法(EPOsf)纯化的EPO通过分析方法确定为均一的，并显示出由8个同型组成的典型的同种型。通过normocythaemic小鼠检测具有190,000IU/mg的比活。所使用的PEG化试剂为甲氧基-PEG-SBA，它是一种其中R是甲基；x是3；和m是从650至750(平均约680，相应于平均分子量约30kDa)的式II的化合物。
PEG化反应(pegylation reaction)
向100毫克的EPOsf(9.71ml的10.3mg/ml EPOsf贮存液，5.48微摩尔)中，加入10ml的含有506mg的30kDa甲氧基-PEG-SBA(16.5微摩尔)(得自Shearwater Polymers，Inc.，Huntsville，Alabama)的0.1M的磷酸钾缓冲液，pH 7.5并在室温(20-23℃)下混合2小时。最终的蛋白质浓度为5mg/ml，并且蛋白质∶PEG试剂的比率为1∶3。2小时后，通过用冰醋酸将pH调整至4.5终止反应，并贮存在-20℃，直至纯化。
纯化
1.偶联物混合物：将约28ml的SP-SEPHAROSE FF(磺基-丙基阳离子交换树脂)装入AMICON玻璃柱(2.2×7.5cm)，并用20mM乙酸盐缓冲液pH 4.5在流速为150ml/小时的条件下进行平衡。将含有30mg蛋白质的6ml反应混合物用平衡缓冲液稀释5倍，并加样到柱上。没有吸附的材料用缓冲液洗去，并将吸附的PEG偶联物混合物用平衡缓冲液中的0.175MNaCl从柱中洗脱。没有修饰的EPOsf仍保留在柱上，并用750mM NaCl洗脱。将柱用初始缓冲液重新平衡。通过SDS-PAGE对样品进行分析并测定它们的PEG化的程度。发现0.175M NaCl洗脱液含有单-，以及二-和痕量的三-PEG化的(pegylated)产物，而750mM NaCl洗脱液含有非修饰的EPOsf
2.二-PEG和单-PEG-EPOsf：在前一个步骤中从柱中洗脱出的纯化的偶联物混合物用缓冲液稀释4倍，并被重新加样到柱上，如前文所述进行洗涤。分别用0.1M NaCl和0.175M NaCl从柱中洗脱出了二-PEG-EPOsf和单-PEG-EPOsf。也用750mM NaCl进行洗脱，洗脱出任何非修饰的EPOsf。
或者，将反应混合物用乙酸盐缓冲液稀释5倍并加样到SP-琼脂糖柱(约0.5mg蛋白质/ml胶)上。洗涤柱，如前文所述洗脱出单-PEG-EPOsf，二-PEG-EPOsf和非修饰的EPOsf。
结果
通过化学偶联一种线性PEG分子合成出PEG-EPOsf，其数均分子量为00kDa。PEG-EPOsf衍生于EPOsf的伯氨基基团和30kDa PEG-丁酸的琥珀酰亚胺酯衍生物之间的反应，得到一种酰胺键。
结果总结于表1。由单-和二-PEG-EPOsf组成的纯化的偶联物混合物通过SDS-PAGE分析不含有非修饰的EPOsf。偶联物混合物占23.4mg或者初始材料的78％。阳离子交换层析分离单-和二-PEG-EPOsf表明，在偶联物混合物中单-与二-PEG的比率几乎是1∶1。在反应完成后，各种组分的比率为单∶二∶非修饰的＝40∶38∶20(％)。总产率几乎是定量的。
 表1，EPOsfPEG化的结果
  样品   蛋白质(mg)   产率(％)
  Rxn.Mix.   30   100
  单-   12.0   40
  二-   11.4   38
  非修饰的   6.0   20
  偶联物混合物   23.4   78
          实施例3：用mPEG-SPA的EPO的PEG化
将实施例2中使用的EPOsf的另一个等分试样与30kDa甲氧基-PEG-SPA(Shearwater Polymers，Inc.，Huntsville，Alabama)反应。反应是在蛋白质∶试剂比率为1∶2的条件下进行的，纯化是按照实施例2的方法进行的。主要制备除了单-PEG化的产物。
         实施例4：通过normocythaemic小鼠测试测定
            PEG化的(pegylated)EPO的体内活性
Normocythaemic小鼠生物检测是现有技术已知的(Pharm.EuropaSpec.Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2))和Ph.Eur.BRP的促红血球生成素的专著中的一个方法。将样品用BSA-PBS稀释。正常健康小鼠，7-15周龄，腹膜下施用0.2ml的EPO-级分，它含有非PEG化的EPO或者实施例2或者3中的三-，二-或者单-PEG化的(pegylated)EPO。在6天的时间内，通过尾静脉穿孔抽血，并将其稀释，使1微升的血存在于1ml的0.15微摩尔的丫啶橙染色溶液中。染色时间为3至10分钟。在荧光显微镜下在一个流式细胞计数器中，通过分析红色荧光柱状图进行网状细胞计数。网状细胞计数是以绝对值表示的(被分析的每30,000个血细胞)。对于给出的数值，每组每天由5个小鼠组成，并对小鼠仅抽血一次。
在另一个试验中，对小鼠施用单剂量的非修饰的EPO(25ng的EPO)，实施例2的PEG(SBA)-EPO混合物(10ng的偶联物)，实施例2的单-和二-PEG化的(pegylated)EPO(10ng的偶联物)，实施例3的PEG(SPA)-EPO(10ng的偶联物)，和缓冲液。结果示于表2。结果显示，与使用剂量为25ng的非修饰的EPO相比，每个小鼠使用相同剂量(10ng)，PEG化的(pegylated)EPO产物具有优良的活性和长的半衰期，这是通过网状细胞计数的显著提高和网状细胞计数的最大值的变化表明的。
                               表2
  EPO(非修饰的)   30kDaSPAPEG   单30KSBA   二30KSBA   PEG-EPOSBA偶联物混合物   对照缓冲液
  72小时   1000   1393   1411   994   1328   857
  96小时   500   1406   1501   926   1338   697
  120小时   约200   1100   1182   791   944   701
  144小时   约0   535   607   665   660   708
实施例5：主要为单-PEG-EPO的制备
PEG化反应(pegylation reaction)
在按照实施例1的方法制备的100mM磷酸钾缓冲液pH7.5中的100mg(5.48微摩尔)的EPOsf中加入溶解在3ml 1mM HCl中的329mg(10.96微摩尔)的30kDa PEG-SBA试剂。加入足量的100mM的磷酸钾缓冲液pH7.5，使反应混合物的体积为20ml。最终蛋白质浓度为5mg/ml，以及蛋白质∶PEG试剂的比率为1∶2。在常温下(20-22℃)将反应混合物混合2小时。2小时后，通过用冰醋酸将pH调整至4.5终止反应，并贮存在-20℃，直至纯化。
纯化
将上述步骤中的反应混合物用10mM醋酸钠，pH 4.5，进行1∶5稀释，并加样到装填在4.2×19cm柱中的300ml SP-Sephrose FF(磺基丙基阳离子交换树脂)中。将该柱预先用相同的缓冲液平衡。用一个Gilson UV监视器在280nm监视柱流出物，并用一个Kipp和Zonen记录仪记录。将柱用300ml或1床层体积的平衡缓冲液洗涤，除去过量的试剂、反应副产物和寡聚PEG-EPO。然后用2床体积的100mM NaCl洗涤，除去二-PEG-EPO。然后用200mM NaCl洗脱单-PEG-EPO。在单-PEG-EPO的洗脱过程中，弃去最初的50ml的蛋白峰，收集作为150ml级分的单-PEG-EPO。仍保留在柱上的非修饰的EPOsf用750mM NaCl洗脱。所有的洗脱缓冲液是在平衡缓冲液中制备的。所有的洗脱样品通过SDS-PAGE并通过高效尺寸排阻层析(SEC)进行分析。然后将不含有可检测到的非修饰的EPOsf、从150ml级分得到的单-PEG-EPO合并物浓缩至约4.5至7.5mg/ml并过滤进贮存缓冲液，10mM磷酸钾，100mM NaCl，pH 7.5。浓缩/过滤是使用Millipore LabscaleTM TFF System和截留50kDa分子的MilliporePellicon XL Biomax 50膜在常温下进行的。将浓缩的单-PEG-EPO进行无菌过滤并贮存在-20℃。
约75％的EPOsf被PEG化(pegylated)。在纯化后，总产率为约30％单-PEG-EPO，不含有可检测到的非修饰的EPOsf，和约25％的二-PEG-EPO。剩余的蛋白质为寡聚物和非PEG化的EPOsf。从150ml级分得到的单-PEG-EPO合并物含有约90％的单-PEG-EPO和约10％的二-PEG-EPO。
序列表
<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司
<120>促红细胞生成素与聚乙二醇的偶联物
<130>IN040102
<160>3
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>165
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>1
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu
  1               5                  10                  15
Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His
             20                  25                  30
Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
         35                  40                  45
Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp
     50                  55                  60
Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
 65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp
                 85                  90                  95
Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu
            100                 105                 110
Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala
        115                 120                 125
Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val
    130                 135                 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp
                165
<210>2
<211>166
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>2
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu
  1               5                  10                  15
Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His
             20                  25                  30
Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
         35                  40                  45
Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp
     50                  55                  60
Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
 65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp
                 85                  90                  95
Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu
            100                 105                 110
Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala
        115                 120                 125
Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val
    130                 135                 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>3
<211>28
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>3
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg
  1               5                  10                  15
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
             20                  25

Claims (7)

1.一种含有偶联物的组合物，所说的偶联物中的每一个含有一种具有至少一个自由氨基基团并具有使骨髓细胞提高网状细胞和血红细胞产生的体内生物学活性的促红血球生成素糖蛋白，该促红血球生成素糖蛋白选自人类促红血球生成素及其类似物，该人类促红血球生成素类似物具有通过加入1至6个糖基化位点或至少一个糖基化位点的重排而被修饰的人类促红血球生成素的序列；所说的糖蛋白与“n”个式-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR的聚(乙二醇)基团共价相连，其中每个聚(乙二醇)基团的-CO与所说的氨基之一形成酰胺键；其中R是低级烷基；x是2或者3；m是从450至900；n是1至3；并且n和m的选择应使该偶联物的分子量减去促红血球生成素糖蛋白的分子量是从20千道尔顿至100千道尔顿；其中n是1的偶联物的百分比是至少90％。
2.按照权利要求1所述的组合物，其中，n是1的偶联物的百分比是至少92％。
3.按照权利要求1的组合物，其中，n是1的偶联物的百分比是至少96％。
4.按照权利要求1的组合物，其中，n是1的偶联物的百分比是从90％至96％。
5.一种药物组合物，含有权利要求1至4中任意一项所述的组合物和一种药学上可接受的赋形剂。
6.权利要求1至4中任意一项所述的组合物在制备用于治疗或预防在慢性肾衰竭病人、AIDS中的贫血相关的疾病或用于治疗进行化疗的癌症病人的药物中的应用。
7.用于治疗与慢性肾衰竭病人、AIDS和进行化疗的癌症患者的贫血相关的疾病的权利要求1至4中任意一项所述的组合物。
CNB2004100036029A 1999-07-02 2000-06-29 促红血球生成素偶联物 Expired - Lifetime CN1283664C (zh)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14225499P 1999-07-02 1999-07-02
US60/142,254 1999-07-02
US15022599P 1999-08-23 1999-08-23
US60/150,225 1999-08-23
US15154899P 1999-08-31 1999-08-31
US60/151,548 1999-08-31
US16615199P 1999-11-17 1999-11-17
US60/166,151 1999-11-17

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB001078895A Division CN1184233C (zh) 1999-07-02 2000-06-29 促红血球生成素偶联物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1515590A CN1515590A (zh) 2004-07-28
CN1283664C true CN1283664C (zh) 2006-11-08

Family

ID=27495518

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB2004100036029A Expired - Lifetime CN1283664C (zh) 1999-07-02 2000-06-29 促红血球生成素偶联物
CNB001078895A Expired - Lifetime CN1184233C (zh) 1999-07-02 2000-06-29 促红血球生成素偶联物

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB001078895A Expired - Lifetime CN1184233C (zh) 1999-07-02 2000-06-29 促红血球生成素偶联物

Country Status (52)

Country Link
US (2) US6583272B1 (zh)
EP (2) EP1064951B1 (zh)
JP (2) JP3727009B2 (zh)
KR (1) KR100593143B1 (zh)
CN (2) CN1283664C (zh)
AR (2) AR024625A1 (zh)
AT (1) ATE370748T1 (zh)
AU (1) AU736067B2 (zh)
BG (1) BG65449B1 (zh)
BR (2) BR0002276A (zh)
CA (1) CA2310536C (zh)
CO (1) CO5190661A1 (zh)
CY (2) CY1107719T1 (zh)
CZ (1) CZ299516B6 (zh)
DE (3) DE60036053T2 (zh)
DK (1) DK1064951T3 (zh)
DO (1) DOP2000000030A (zh)
EA (1) EA003777B1 (zh)
ES (2) ES2289985T3 (zh)
FR (2) FR2795734B1 (zh)
GB (2) GB2393960C (zh)
GC (1) GC0000197A (zh)
GE (1) GEP20022804B (zh)
GT (1) GT200000109A (zh)
HK (2) HK1068354A1 (zh)
HR (1) HRP20000436B1 (zh)
HU (1) HU226233B1 (zh)
ID (1) ID26447A (zh)
IL (1) IL137056A0 (zh)
IS (1) IS2492B (zh)
IT (1) IT1318606B1 (zh)
LU (1) LU91363I2 (zh)
MA (1) MA26746A1 (zh)
MX (1) MXPA00006547A (zh)
MY (1) MY128500A (zh)
NL (1) NL300289I9 (zh)
NO (2) NO327043B1 (zh)
NZ (1) NZ505454A (zh)
OA (1) OA11442A (zh)
PA (1) PA8497801A1 (zh)
PE (1) PE20010297A1 (zh)
PL (1) PL202758B1 (zh)
PT (1) PT1064951E (zh)
RS (1) RS49928B (zh)
SG (1) SG92717A1 (zh)
SI (1) SI1064951T1 (zh)
SK (1) SK286301B6 (zh)
SV (1) SV2002000120A (zh)
TN (1) TNSN00147A1 (zh)
TR (1) TR200001956A2 (zh)
TW (1) TWI235667B (zh)
UY (1) UY26228A1 (zh)

Families Citing this family (224)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1037927B1 (en) 1997-12-08 2004-05-19 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation
US20030105294A1 (en) * 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
JP2002511432A (ja) * 1998-04-15 2002-04-16 レキシジェン ファーマシューティカルズ コーポレイション 新脈管形成インヒビターの同時投与による抗体−サイトカイン融合タンパク質媒介性免疫応答の増強
US7304150B1 (en) 1998-10-23 2007-12-04 Amgen Inc. Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia
US7345019B1 (en) * 1999-04-13 2008-03-18 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Modulation of excitable tissue function by peripherally administered erythropoietin
CZ299516B6 (cs) * 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7067110B1 (en) 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
MXPA02001417A (es) * 1999-08-09 2002-08-12 Lexigen Pharm Corp Complejos multiples de citosina-anticuerpo.
US20050202538A1 (en) * 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
AU4314801A (en) * 2000-02-11 2001-08-20 Lexigen Pharm Corp Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
US6586398B1 (en) * 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
DK1311285T4 (en) † 2000-05-15 2017-07-24 Hoffmann La Roche Liquid pharmaceutical composition containing an erythropoietin derivative
CN1270775C (zh) * 2000-06-29 2006-08-23 默克专利有限公司 通过与免疫细胞因子摄入促进剂联合治疗来增强抗体－细胞因子融合蛋白介导的免疫反应
EP1333036B1 (en) * 2000-10-16 2009-01-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Peg-modified erythropoietin
WO2002049673A2 (en) * 2000-12-20 2002-06-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugates of erythropoietin (pep) with polyethylene glycol (peg)
CN100528235C (zh) * 2000-12-20 2009-08-19 霍夫曼-拉罗奇有限公司 红细胞生成素共轭物
US20030072737A1 (en) * 2000-12-29 2003-04-17 Michael Brines Tissue protective cytokines for the protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues and organs
US7767643B2 (en) 2000-12-29 2010-08-03 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
EP1234583A1 (en) * 2001-02-23 2002-08-28 F. Hoffmann-La Roche Ag PEG-conjugates of HGF-NK4
KR100900176B1 (ko) * 2001-03-07 2009-06-02 메르크 파텐트 게엠베하 하이브리드 이소타입 항체 부분구조를 포함하는 단백질을위한 발현 기술
DE10112825A1 (de) 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
US6992174B2 (en) * 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
DK1383785T3 (da) * 2001-05-03 2011-05-23 Merck Patent Gmbh Rekombinant tumorspecifikt antistof og anvendelse deraf
US6818613B2 (en) 2001-11-07 2004-11-16 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Aqueous sustained-release formulations of proteins
KR100467751B1 (ko) 2001-12-03 2005-01-24 씨제이 주식회사 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질
AU2002357784B2 (en) 2001-12-04 2008-07-31 Merck Patent Gmbh Immunocytokines with modulated selectivity
WO2003053997A2 (en) * 2001-12-06 2003-07-03 Fibrogen, Inc. Methods of increasing endogenous erythropoietin (epo)
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209822A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
WO2003078959A2 (en) 2002-03-11 2003-09-25 Ortho Mcneil Pharmaceutical, Inc Methods for shp1 mediated neuroprotection
WO2004003176A2 (en) * 2002-07-01 2004-01-08 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Recombinant tissue protective cytokines and encoding nucleic acids thereof for protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues, and organs
PL375265A1 (en) 2002-07-24 2005-11-28 F.Hoffmann-La Roche Ag Polyalkylene glycol acid additives
US7459435B2 (en) * 2002-08-29 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
US20050176627A1 (en) * 2002-09-09 2005-08-11 Anthony Cerami Long acting erythropoietins that maintain tissue protective activity of endogenous erythropoietin
ATE466085T1 (de) * 2002-09-09 2010-05-15 Hanall Pharmaceutical Co Ltd Protease-resistente modifizierte interferon alpha polypeptide
BR0314227A (pt) 2002-09-11 2005-10-25 Fresenius Kabi De Gmbh Derivados de amido de hidroxialquila
US7459436B2 (en) * 2002-11-22 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
US7388079B2 (en) * 2002-11-27 2008-06-17 The Regents Of The University Of California Delivery of pharmaceutical agents via the human insulin receptor
PT1572748E (pt) * 2002-12-17 2010-09-28 Merck Patent Gmbh Anticorpo humanizado (h14.18) do anticorpo 14.18 de rato que se liga ao gd2 e a sua fusão com a il-2
US7553930B2 (en) 2003-01-06 2009-06-30 Xencor, Inc. BAFF variants and methods thereof
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7587286B2 (en) 2003-03-31 2009-09-08 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
US7610156B2 (en) 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
US7642340B2 (en) 2003-03-31 2010-01-05 Xencor, Inc. PEGylated TNF-α variant proteins
US7279174B2 (en) * 2003-05-08 2007-10-09 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Stent coatings comprising hydrophilic additives
NZ543934A (en) 2003-05-12 2008-06-30 Affymax Inc Novel spacer moiety for poly (ethylene glycol)-modified peptide-based compounds
EA010095B1 (ru) 2003-05-12 2008-06-30 Афимакс, Инк. Новые пептиды, которые связываются с рецептором эритропоэтина
EP1625156B1 (en) * 2003-05-12 2012-09-19 Affymax, Inc. Peptides that bind to the erythropoietin receptor
US20050107297A1 (en) * 2003-05-12 2005-05-19 Holmes Christopher P. Novel poly(ethylene glycol) modified compounds and uses thereof
CN1826131A (zh) * 2003-05-30 2006-08-30 森托科尔公司 利用转谷氨酰胺酶形成新的促红细胞生成素缀合物
WO2005011587A2 (en) * 2003-07-30 2005-02-10 New Century Pharmaceuticls Chalaropsis lysozyme protein and its method of use in anti-bacterial applications
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
US7645733B2 (en) * 2003-09-29 2010-01-12 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Tissue protective cytokines for the treatment and prevention of sepsis and the formation of adhesions
WO2005035564A2 (en) 2003-10-10 2005-04-21 Xencor, Inc. Protein based tnf-alpha variants for the treatment of tnf-alpha related disorders
CN1901934B (zh) * 2003-12-19 2013-09-11 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 促红细胞生成素在治疗慢性炎症性肠病中铁分布紊乱中的用途
EP1548031A1 (en) * 2003-12-22 2005-06-29 Dubai Genetics FZ-LLC Nature-identical erythropoietin
CA2551916C (en) * 2003-12-31 2014-04-29 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
CA2553528C (en) * 2004-01-21 2012-12-04 Nektar Therapeutics Al, Corporation Method of preparing propionic acid-terminated polymers
ZA200606225B (en) * 2004-02-02 2007-11-28 Ambrx Inc Modified human four helical bundle polypeptides and their uses
EP1725589A1 (en) 2004-03-11 2006-11-29 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination
US7588745B2 (en) * 2004-04-13 2009-09-15 Si Options, Llc Silicon-containing products
US7253650B2 (en) 2004-05-25 2007-08-07 International Business Machines Corporation Increase productivity at wafer test using probe retest data analysis
EP1814910A4 (en) * 2004-11-11 2009-04-29 Affymax Inc NEW AT ERYTHROPOIETIN RECEPTOR BINDING PEPTIDES
WO2006062685A2 (en) * 2004-11-11 2006-06-15 Affymax, Inc. Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
CA2595695A1 (en) 2005-01-25 2006-08-03 Cell Therapeutics, Inc. Biologically active protein conjugates comprising (nn[s/t]) peptide repeats and having increased plasma half-life
WO2006089228A2 (en) * 2005-02-16 2006-08-24 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugates of an epo moiety and a polymer
US8324159B2 (en) * 2005-06-03 2012-12-04 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7919461B2 (en) 2005-06-03 2011-04-05 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7550433B2 (en) * 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US20070072795A1 (en) * 2005-09-28 2007-03-29 Anton Haselbeck Treatment of neurodegenerative disorders
ATE491722T1 (de) * 2005-10-04 2011-01-15 Zymogenetics L L C Herstellung und reinigung von il-29
US8142781B2 (en) * 2005-10-07 2012-03-27 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for blood-brain barrier delivery
US8741260B2 (en) * 2005-10-07 2014-06-03 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for delivery of GDNF to the CNS
US8124095B2 (en) * 2005-10-07 2012-02-28 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for delivery of erythropoietin to the CNS
US20080171696A1 (en) * 2005-10-21 2008-07-17 Avigenics, Inc. Pharmacodynamically enhanced therapeutic proteins
US20070092486A1 (en) * 2005-10-21 2007-04-26 Avigenics, Inc. Glycolated and glycosylated poultry derived therapeutic proteins
US8841255B2 (en) 2005-12-20 2014-09-23 Duke University Therapeutic agents comprising fusions of vasoactive intestinal peptide and elastic peptides
US8178495B2 (en) 2008-06-27 2012-05-15 Duke University Therapeutic agents comprising a GLP-1 receptor agonist and elastin-like peptide
US20130172274A1 (en) * 2005-12-20 2013-07-04 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
WO2007100905A2 (en) * 2006-02-28 2007-09-07 Nexgen Therapeutics, Llc Acryloyloxyethylphosphorylcholine containing polymer conjugates and their preparation
EP1997505A4 (en) 2006-03-22 2013-02-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd PREPARATION OF ERYTHROPOIETIN SOLUTION
ES2529234T3 (es) * 2006-08-04 2015-02-18 Prolong Pharmaceuticals, LLC Eritropoyetina modificada
JP5959795B2 (ja) 2006-08-18 2016-08-02 アーメイゲン・テクノロジーズ・インコーポレイテッドＡｒｍａｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． 血液脳関門送達のための物質
EP2120998B1 (en) * 2006-11-28 2013-08-07 HanAll Biopharma Co., Ltd. Modified erythropoietin polypeptides and uses thereof for treatment
JP2010517529A (ja) * 2007-02-02 2010-05-27 アムジエン・インコーポレーテツド ヘプシジン及びヘプシジン抗体
WO2008137066A1 (en) * 2007-05-02 2008-11-13 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Use of compacted nucleic acid nanoparticles in non-viral treatments of ocular diseases
CL2008002053A1 (es) * 2007-07-17 2009-05-22 Hoffmann La Roche Metodo para la purificacion de una eritropoyetina monopeguilada (epompeg) que consiste en proporcionar una solucion que contiene eritropoyetina mono, poli y no peguilada y hacerla pasar por dos pasos de cromatografia de intercambio cationico y metodo para producir epo mpeg que incluye metodo de purificacion.
CL2008002054A1 (es) * 2007-07-17 2009-05-29 Hoffmann La Roche Metodo para la regeneracion de una columna de cromatografia de intercambio cationico despues de la elusion de eritropoyetina monopeguilada y metodo para obtener una eritropoyetina monopeguilada, incorporando el metodo de regeneracion de la columna de intercambio cationico.
CA2694762A1 (en) 2007-07-27 2009-02-05 Armagen Technologies, Inc. Methods and compositions for increasing alpha-l-iduronidase activity in the cns
EP2205280B1 (en) 2007-09-27 2019-09-04 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
US8796206B2 (en) 2007-11-15 2014-08-05 Amgen Inc. Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stabilised by antioxidants for parenteral administration
EP2669313B1 (en) 2008-01-11 2016-03-23 Serina Therapeutics, Inc. Multifunctional forms of polyoxazoline copolymers and drug compositions comprising the same
US8101706B2 (en) 2008-01-11 2012-01-24 Serina Therapeutics, Inc. Multifunctional forms of polyoxazoline copolymers and drug compositions comprising the same
WO2009094551A1 (en) 2008-01-25 2009-07-30 Amgen Inc. Ferroportin antibodies and methods of use
CN103694337B (zh) 2008-02-08 2016-03-02 Ambrx公司 经修饰瘦素多肽和其用途
TWI395593B (zh) 2008-03-06 2013-05-11 Halozyme Inc 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制
WO2009128917A2 (en) 2008-04-14 2009-10-22 Halozyme, Inc. Modified hyaluronidases and uses in treating hyaluronan-associated diseases and conditions
EP2816059A1 (en) 2008-05-01 2014-12-24 Amgen, Inc Anti-hepcidin antibodies and methods of use
AU2009296397B2 (en) 2008-09-26 2012-11-08 Ambrx Inc. Modified animal erythropoietin polypeptides and their uses
CA2742871C (en) 2008-11-13 2018-10-23 Herb Lin Methods and compositions for regulating iron homeostasis by modulation of bmp-6
US8927249B2 (en) 2008-12-09 2015-01-06 Halozyme, Inc. Extended soluble PH20 polypeptides and uses thereof
CA2748889A1 (en) 2009-03-18 2010-09-23 Armagen Technologies, Inc. Compositions and methods for blood-brain barrier delivery of igg-decoy receptor fusion proteins
PL2459291T3 (pl) 2009-07-30 2018-07-31 F.Hoffmann-La Roche Ag Ruchomy chromatograficzny rozdzielacz kolumnowy
WO2011024025A1 (en) * 2009-08-28 2011-03-03 Avesthagen Limited An erythropoietin analogue and a method thereof
JP5734985B2 (ja) 2009-09-17 2015-06-17 バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニムＢａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＳＡ ヒアルロニダーゼおよび免疫グロブリンの安定な共製剤およびそれらの使用方法
CA2775012A1 (en) * 2009-09-23 2011-03-31 Biogenerix Ag Process for the purification of recombinant human erythropoietin (epo), epo thus purified and pharmaceutical compositions comprising same
HUE044865T2 (hu) * 2009-10-09 2019-11-28 Armagen Inc Eljárások és készítmények a központi idegrendszerben iduronát-2-szulfatáz-aktivitás növelésére
CA2778105C (en) 2009-10-23 2019-04-02 Amgen Inc. Vial adapter and system
WO2011075185A1 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Oligasis Targeted drug phosphorylcholine polymer conjugates
KR101880905B1 (ko) * 2010-04-27 2018-07-23 에스씨아이엘 테크놀로지 게엠베하 안정한 수성 ｍｉａ／ｃｄ－ｒａｐ 제제
AU2011265005B2 (en) 2010-06-07 2015-04-09 Amgen Inc. Drug delivery device
ES2661089T3 (es) 2010-07-20 2018-03-27 Halozyme Inc. Métodos de tratamiento o prevención de los efectos secundarios adversos asociados con la administración de un agente anti-hialuronano
WO2012035037A1 (en) 2010-09-14 2012-03-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for purifying pegylated erythropoietin
MX347297B (es) 2011-02-02 2017-04-21 Hoffmann La Roche Soporte para columna de cromatografía.
WO2012109387A1 (en) 2011-02-08 2012-08-16 Halozyme, Inc. Composition and lipid formulation of a hyaluronan-degrading enzyme and the use thereof for treatment of benign prostatic hyperplasia
CA2831100C (en) 2011-03-31 2020-02-18 Mark Dominis Holt Vial adapter and system
EP4074355A1 (en) 2011-04-20 2022-10-19 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
US9993529B2 (en) 2011-06-17 2018-06-12 Halozyme, Inc. Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
CA2851521C (en) 2011-10-14 2020-09-22 Amgen Inc. Injector and method of assembly
JP6162707B2 (ja) 2011-10-24 2017-07-12 ハロザイム インコーポレイテッド 抗ヒアルロナン剤治療のためのコンパニオン診断およびその使用方法
US8486399B2 (en) 2011-12-02 2013-07-16 Armagen Technologies, Inc. Methods and compositions for increasing arylsulfatase A activity in the CNS
EP3130347B1 (en) 2011-12-30 2019-09-18 Halozyme, Inc. Ph20 polypeptide variants, formulations and uses thereof
US9913822B2 (en) 2012-04-04 2018-03-13 Halozyme, Inc. Combination therapy with an anti-hyaluronan agent and therapeutic agent
CN102816227A (zh) * 2012-08-30 2012-12-12 深圳赛保尔生物药业有限公司 回收促红细胞生成素的方法
US9278124B2 (en) 2012-10-16 2016-03-08 Halozyme, Inc. Hypoxia and hyaluronan and markers thereof for diagnosis and monitoring of diseases and conditions and related methods
EP2922590B1 (en) 2012-11-21 2020-02-05 Amgen Inc. Drug delivery device
WO2014144096A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
WO2014152006A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Intrinsic Lifesciences, Llc Anti-hepcidin antibodies and uses thereof
TWI639449B (zh) 2013-03-15 2018-11-01 美商安美基公司 用於注射器之匣盒
AU2014238267B2 (en) 2013-03-22 2019-08-15 Amgen Inc. Injector and method of assembly
TW201534726A (zh) 2013-07-03 2015-09-16 Halozyme Inc 熱穩定ｐｈ２０玻尿酸酶變異體及其用途
EP3041513B1 (en) 2013-09-08 2020-08-05 Kodiak Sciences Inc. Factor viii zwitterionic polymer conjugates
CA2926110C (en) 2013-10-24 2023-05-23 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
CA2920894C (en) 2013-10-24 2023-03-14 Amgen Inc. Injector and method of assembly
US10994112B2 (en) 2014-02-05 2021-05-04 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
EP3139977B1 (en) 2014-05-07 2021-02-17 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
WO2015187802A1 (en) 2014-06-03 2015-12-10 Amgen Inc. Devices and methods for assisting a user of a drug delivery device
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
PL3186281T3 (pl) 2014-08-28 2019-10-31 Halozyme Inc Terapia skojarzona enzymem rozkładającym hialuronian i inhibitorem punktu kontrolnego odpowiedzi immunologicznej
US10323088B2 (en) 2014-09-22 2019-06-18 Intrinsic Lifesciences Llc Humanized anti-hepcidin antibodies and uses thereof
BR112017007765B1 (pt) 2014-10-14 2023-10-03 Halozyme, Inc Composições de adenosina deaminase-2 (ada2), variantes do mesmo e métodos de usar o mesmo
EP3943135A3 (en) 2014-10-14 2022-06-29 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audible indicators
WO2016061562A2 (en) 2014-10-17 2016-04-21 Kodiak Sciences Inc. Butyrylcholinesterase zwitterionic polymer conjugates
ES2785311T3 (es) 2014-12-19 2020-10-06 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con botón móvil o campo de interfaz de usuario
US10799630B2 (en) 2014-12-19 2020-10-13 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
US10538589B2 (en) 2015-01-14 2020-01-21 Armagen Inc. Methods and compositions for increasing N-acetylglucosaminidase (NAGLU) activity in the CNS using a fusion antibody comprising an anti-human insulin receptor antibody and NAGLU
EP3556411B1 (en) 2015-02-17 2021-06-30 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
US11806509B2 (en) 2015-02-27 2023-11-07 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a turnable threshold of resistance to needle guard movement
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
ES2755717T3 (es) 2015-12-09 2020-04-23 Amgen Inc Autoinyector con tapa de señalización
US11066465B2 (en) 2015-12-30 2021-07-20 Kodiak Sciences Inc. Antibodies and conjugates thereof
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
ES2814287T3 (es) 2016-03-15 2021-03-26 Amgen Inc Reducir la probabilidad de rotura de cristal en dispositivos de administración de fármaco
CN105820232B (zh) * 2016-04-08 2019-05-17 昂德生物药业有限公司 单修饰聚乙二醇重组人促红素的制备方法及其制品和应用
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
JP7309363B2 (ja) 2016-05-13 2023-07-18 アムジエン・インコーポレーテツド バイアル・スリーブ組立体
WO2017200989A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
WO2017209899A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
EP3478342A1 (en) 2016-07-01 2019-05-08 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
CA3027143A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for purifying pegylated erythropoietin
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
WO2018081234A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Amgen Inc. On-body injector
CA3049780A1 (en) 2017-01-17 2018-07-26 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
MX2019009755A (es) 2017-02-17 2019-10-07 Amgen Inc Mecanismo de insercion para dispositivo de suministro de farmacos.
MX2019009625A (es) 2017-02-17 2019-10-09 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos con trayectoria de flujo de fluido esteril y metodo relacionado de ensamblaje.
AU2018231107B2 (en) 2017-03-06 2023-04-20 Amgen Inc. Drug delivery device with activation prevention feature
WO2018164829A1 (en) 2017-03-07 2018-09-13 Amgen Inc. Needle insertion by overpressure
MX2019010671A (es) 2017-03-09 2019-10-21 Amgen Inc Mecanismo de insercion para dispositivo de administracion de farmacos.
WO2018172219A1 (en) 2017-03-20 2018-09-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for in vitro glycoengineering of an erythropoiesis stimulating protein
EA037969B1 (ru) 2017-03-28 2021-06-17 Эмджен Инк. Система и способ сборки штока поршня и шприца
WO2018226515A1 (en) 2017-06-08 2018-12-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
CN110709121B (zh) 2017-06-08 2022-06-24 安进公司 扭矩驱动式药物递送装置
CA3177086A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Catalyst Biosciences, Inc. Modified membrane type serine protease 1 (mtsp-1) polypeptides and methods of use
MA49447A (fr) 2017-06-22 2020-04-29 Amgen Inc Réduction des impacts/chocs d'activation d'un dispositif
EP3641861A1 (en) 2017-06-23 2020-04-29 Amgen Inc. Electronic drug delivery device comprising a cap activated by a switch assembly
MA49562A (fr) 2017-07-14 2020-05-20 Amgen Inc Système d'insertion-rétractation d'aiguille présentant un système à ressort en double torsion
MA49626A (fr) 2017-07-21 2020-05-27 Amgen Inc Élément d'étanchéité perméable aux gaz pour récipient à médicament et procédés d'assemblage
EP4085942A1 (en) 2017-07-25 2022-11-09 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
EP3658206A1 (en) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc. Drug delivery device with container access system and related method of assembly
MA49838A (fr) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc Systèm de administration de médicaments avec pression hydraulique-pneumatique de chambre
WO2019036181A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Amgen Inc. BODY INJECTOR WITH STERILE ADHESIVE PATCH
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
WO2019070472A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 Amgen Inc. FLOW ADAPTER FOR MEDICATION DELIVERY DEVICE
EP4257164A3 (en) 2017-10-06 2024-01-17 Amgen Inc. Drug delivery device with interlock assembly and related method of assembly
MA50348A (fr) 2017-10-09 2020-08-19 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament comprenant un ensemble d'entraînement et procédé d'assemblage associé
MA50528A (fr) 2017-11-03 2020-09-09 Amgen Inc Systèmes et approches pour stériliser un dispositif d'administration de médicament
EP3706830A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
US20200338271A1 (en) 2017-11-06 2020-10-29 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
WO2019094138A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Amgen Inc. Plungers for drug delivery devices
CN111263651B (zh) 2017-11-16 2022-06-17 安进公司 具有停顿和终点检测的自动注射器
MA50904A (fr) 2017-11-16 2020-09-23 Amgen Inc Mécanisme d'insertion d'aiguille pour dispositif d'administration de médicament
SI3731872T1 (sl) 2017-12-29 2022-04-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Postopek za zagotavljanje sestavka PEGiliranih beljakovin
SG11202005990RA (en) 2017-12-29 2020-07-29 Hoffmann La Roche Process for providing pegylated protein composition
ES2909454T3 (es) 2017-12-29 2022-05-06 Hoffmann La Roche Procedimiento para proporcionar una composición de proteína PEGilada
US20190351031A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Halozyme, Inc. Methods of selecting subjects for combination cancer therapy with a polymer-conjugated soluble ph20
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
US20210369982A1 (en) 2018-07-24 2021-12-02 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
MA53375A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
WO2020028009A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
DK3613486T3 (da) * 2018-08-24 2021-01-04 Uga Biopharma Gmbh Metode og anlæg til rengøring af epo og/eller et epo-derivat
JP2022500095A (ja) 2018-09-24 2022-01-04 アムジエン・インコーポレーテツド インターベンション投薬システム及び方法
AU2019350660A1 (en) 2018-09-28 2021-03-18 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
US20200101229A1 (en) 2018-10-02 2020-04-02 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
AR116607A1 (es) 2018-10-05 2021-05-26 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con indicador de dosis
BR112021007016A2 (pt) 2018-10-15 2021-07-13 Amgen Inc. dispositivo de administração de fármaco tendo mecanismo de amortecimento
EA202191038A1 (ru) 2018-10-15 2021-07-06 Эмджен Инк. Способ платформенной сборки для устройства доставки лекарственного средства
AU2019370159A1 (en) 2018-11-01 2021-04-22 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
US20220031953A1 (en) 2018-11-01 2022-02-03 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial needle retraction
MA54048A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament avec rétraction partielle de l'organe d'administration de médicament
US11613744B2 (en) 2018-12-28 2023-03-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use
EP3958934A1 (en) 2019-04-24 2022-03-02 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
JP2022545227A (ja) 2019-08-23 2022-10-26 アムジエン・インコーポレーテツド 構成可能な針シールド係合構成要素を備えた薬物送達デバイス及び関連方法
WO2021072265A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
WO2022063082A1 (zh) 2020-09-22 2022-03-31 美国杰科实验室有限公司 一种糖基化修饰的促红细胞生成素及其应用
WO2022159414A1 (en) 2021-01-22 2022-07-28 University Of Rochester Erythropoietin for gastroinfestinal dysfunction
CN117279929A (zh) 2021-05-10 2023-12-22 凯奥目生物科学株式会社 抗体组合物的纯化方法
AU2022279223A1 (en) 2021-05-21 2023-10-19 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container
WO2023209074A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods of restoring erythropoiesis in patients suffering from a sf3b1 mutant myelodysplastic syndrome by correcting coasy mis-splicing
CN116492448A (zh) * 2023-04-12 2023-07-28 深圳赛保尔生物药业有限公司 负载peg-epo及间充质干细胞的组合物、药物及其制备方法

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
KR850004274A (ko) * 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
JPS6197229A (ja) 1984-10-18 1986-05-15 Chugai Pharmaceut Co Ltd 安定なエリトロポエチン製剤
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5641663A (en) * 1985-11-06 1997-06-24 Cangene Corporation Expression system for the secretion of bioactive human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and other heterologous proteins from steptomyces
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5674534A (en) * 1992-06-11 1997-10-07 Alkermes, Inc. Composition for sustained release of non-aggregated erythropoietin
NZ250375A (en) 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
US5681811A (en) 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5359030A (en) * 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
IL192290A0 (en) * 1993-08-17 2008-12-29 Kirin Amgen Inc Erythropoietin analogs
US5643575A (en) * 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
ES2093593T1 (es) * 1995-05-05 1997-01-01 Hoffmann La Roche Proteinas obesas (ob) recombinantes.
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US6025324A (en) * 1996-05-15 2000-02-15 Hoffmann-La Roche Inc. Pegylated obese (ob) protein compositions
TW517067B (en) * 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
DK0902085T3 (da) * 1997-09-01 2004-04-05 Aventis Pharma Gmbh Rekombinant human erythropoietin med fordelagtig glycosyleringsprofil
JP2002531089A (ja) 1998-11-30 2002-09-24 イーライ・リリー・アンド・カンパニー 赤血球産生性化合物
JO2291B1 (en) * 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
CZ299516B6 (cs) * 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
WO2001068141A2 (en) 2000-03-17 2001-09-20 Maxygen Aps Dispersions of polypeptide conjugates
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
DK1311285T4 (en) * 2000-05-15 2017-07-24 Hoffmann La Roche Liquid pharmaceutical composition containing an erythropoietin derivative

Also Published As

Publication number Publication date
US20030120045A1 (en) 2003-06-26
JP2001064300A (ja) 2001-03-13
DK1064951T3 (da) 2007-10-08
GEP20022804B (en) 2002-09-25
NZ505454A (en) 2001-12-21
FR07C0051I2 (fr) 2008-05-09
CO5190661A1 (es) 2002-08-29
IS2492B (is) 2009-02-15
EP1839676A2 (en) 2007-10-03
MY128500A (en) 2007-02-28
NO2009010I1 (no) 2009-05-25
EP1839676A3 (en) 2008-09-03
AR055650A2 (es) 2007-08-29
GB2393960C (en) 2012-08-29
RS49928B (sr) 2008-09-29
HRP20000436B1 (en) 2008-01-31
HK1033328A1 (en) 2001-08-24
SK9872000A3 (en) 2002-06-04
GB2353281A (en) 2001-02-21
GB2393960B (en) 2004-08-04
TNSN00147A1 (fr) 2005-11-10
JP2004155787A (ja) 2004-06-03
ES2191511B1 (es) 2005-01-01
NO20003372L (no) 2001-01-03
NL300289I1 (nl) 2007-11-01
DE122007000064I2 (de) 2010-03-25
SG92717A1 (en) 2002-11-19
ITMI20001479A0 (it) 2000-06-30
SK286301B6 (en) 2008-07-07
CY2007021I1 (el) 2009-11-04
CY1107719T1 (el) 2010-07-28
GB2393960A (en) 2004-04-14
MXPA00006547A (es) 2004-10-28
AR024625A1 (es) 2002-10-16
GB2353281B (en) 2004-06-09
HK1068354A1 (en) 2005-04-29
CN1280137A (zh) 2001-01-17
JP3727009B2 (ja) 2005-12-14
LU91363I9 (zh) 2018-12-31
BG65449B1 (bg) 2008-08-29
GT200000109A (es) 2001-12-21
DOP2000000030A (es) 2002-07-15
ES2191511A1 (es) 2003-09-01
BG104570A (en) 2001-09-28
KR20010049676A (ko) 2001-06-15
KR100593143B1 (ko) 2006-06-26
MA26746A1 (fr) 2004-12-20
FR2795734B1 (fr) 2005-09-30
HU226233B1 (en) 2008-07-28
CA2310536C (en) 2007-09-11
HUP0002553A3 (en) 2005-11-28
IL137056A0 (en) 2001-06-14
GB0400086D0 (en) 2004-02-04
HRP20000436A2 (en) 2001-06-30
AU4274400A (en) 2001-01-04
LU91363I2 (fr) 2007-11-12
HUP0002553A2 (en) 2001-03-28
EA003777B1 (ru) 2003-08-28
SI1064951T1 (sl) 2007-12-31
FR2795734A1 (fr) 2001-01-05
DE60036053T2 (de) 2008-01-03
NL300289I9 (nl) 2019-08-21
DE10031839A1 (de) 2001-02-01
PL341187A1 (en) 2001-01-15
PL202758B1 (pl) 2009-07-31
UY26228A1 (es) 2000-10-31
BRPI0002276B1 (pt) 2019-05-14
FR07C0051I1 (zh) 2007-12-14
CN1184233C (zh) 2005-01-12
PA8497801A1 (es) 2001-12-14
DE60036053D1 (de) 2007-10-04
CN1515590A (zh) 2004-07-28
ES2289985T3 (es) 2008-02-16
EA200000607A1 (ru) 2001-02-26
OA11442A (fr) 2004-04-28
PT1064951E (pt) 2007-09-10
SV2002000120A (es) 2002-01-31
BR0002276A (pt) 2001-12-11
ATE370748T1 (de) 2007-09-15
CY2007021I2 (el) 2009-11-04
PE20010297A1 (es) 2001-03-07
NO2009010I2 (no) 2014-06-02
EP1064951A3 (en) 2002-03-20
ID26447A (id) 2001-01-04
NO327043B1 (no) 2009-04-06
CZ299516B6 (cs) 2008-08-20
ITMI20001479A1 (it) 2001-12-30
GC0000197A (en) 2006-03-29
GB0016205D0 (en) 2000-08-23
TR200001956A2 (tr) 2001-01-22
DE122007000064I1 (de) 2008-01-03
NO20003372D0 (no) 2000-06-28
CZ20002386A3 (cs) 2002-04-17
TWI235667B (en) 2005-07-11
EP1064951A2 (en) 2001-01-03
BRPI0002276B8 (pt) 2021-05-25
IS5554A (is) 2001-01-02
US6583272B1 (en) 2003-06-24
IT1318606B1 (it) 2003-08-27
HU0002553D0 (en) 2000-08-28
EP1064951B1 (en) 2007-08-22
AU736067B2 (en) 2001-07-26
CA2310536A1 (en) 2001-01-02
YU40700A (sh) 2003-12-31
NL300289I2 (nl) 2010-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1283664C (zh) 促红血球生成素偶联物
CN1194014C (zh) 促红细胞生成素与聚乙二醇的偶联物
CN100528235C (zh) 红细胞生成素共轭物
CN1558952A (zh) 聚乙二醇化和双糖基化的红细胞生成素
CN1346369A (zh) 用于预防和治疗贫血的方法以及组合物
CN1429116A (zh) 新的药物组合物
CN1901934A (zh) 促红细胞生成素在治疗慢性炎症性肠病中铁分布紊乱中的用途
CN1680449A (zh) 聚乙二醇修饰后具有体内生理活性的重组促红细胞生成素
RU2232163C2 (ru) Конъюгаты эритропоэтина и полиэтиленгликоля, фармацевтические композиции (варианты), способ профилактического и/или терапевтического лечения нарушений и способ получения коньюгата или композиции

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1068354

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CX01 Expiry of patent term
CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20061108