CN1280483A - 聚乙二醇－grf偶联物的位点特异性制备 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种位点特异性地制备相对每分子hGRF含一个或多个与Lys12和/或Lys21和/或Nα共价结合的PEG单元的hGRF－PEG偶联物的方法,其特征在于,在溶液中进行hGRF肽与活化PEG之间的偶联反应,可用层析发纯化所需的hGRF－PEG偶联物。本发明的目的还包括用所述方法制备偶联物,以及它们在治疗、预防和诊断生长素缺乏中的用途。

Description

聚乙二醇-GRF偶联物的位点特异性制备
分明领域
本发明涉及位点特异性制备聚乙二醇-GRF偶联物的方法。所述偶联物相对每分子hGRF含一个或多个PEG单元，它们与Lys12和／或Lys21和／或Nα共价连接，所述方法的特征在于hGRF肽与活化PEG之间的偶联反应在溶液中进行，所需hGRF-PEG偶联物用层析法纯化。
本发明的目的还包括用所述方法制备此偶联物，以及它们在治疗、预防或诊断生长激素相关性疾病方面的应用。
发明背景
80年代早期分离到数组生长激素释放因子(GRF)，并进行了特征描述。
GRF(又称Somatorelin)是下丘脑分泌的一种肽，作用于受体促进垂体前叶分泌生长素(GH)。其存在形式为44，40或37氨基酸的肽，44氨基酸形式可生理转化成较短的形式。三种形式据报道都有活性，活性主要位于前29个氨基酸残基。据欧洲专利EP105759所述，已经用重组DNA技术制备了对应于人GRF1-29氨基酸序列的一种合成肽[hGRF(h-29)]，又称Sermorelin。
Sermorelin乙酸盐已被用于诊断和治疗生长素缺乏。
GRF的确具有治疗某些生长素相关疾病的医疗价值。用GRF刺激GH释放是促进长骨生长和蛋白质合成代谢的一种生理方法。
GRF应用中的一个问题是它的生物半衰期很短(约12-30分钟)。在血浆中，hGRF(1-29)-NH2被二肽基肽酶IV(DPP-IV)在Ala2和Asp3残基之间切断，迅速降解。
所以，为了防止或减缓酶降解，有必要对GRF特殊化学修饰以开发出生物稳定的长效GRF类似物。
聚乙二醇是一种亲水性、生物相容性无毒聚合物，其通式为H(OCH2CH2)nOH，其中n≥4。其分子量为200至20，000道尔顿不等。
已经证明：单甲氧基化形式的PEG与蛋白质和／或肽化学偶联显著延长后者的生物作用。象糖蛋白中的糖基一样，PEG提供保护性包膜，使分子增大，因而减少其代谢降解并降低肾清除速度。
PEG偶联反应已经是一种成熟的肽及蛋白质传递技术，进行最初基础研究的是Davis和Abuchowski(Abuchowski等，1977a和1977b)。PEG与肽或蛋白质偶联一般形成PEG与一个以上氨基酸残基的非特异性化学固着。所以，所述技术的关键之一是找到合适的化学方法使PEG分子与特定氨基酸残基共价偶联。
例如，三氯三嗪活化的PEG具有毒性且反应无特异性，但在被多种带化学接头(linker)的PEG试剂取代后能够特异性地与氨基(Benchamp等，1983；Veronese等，1985；Zalipsky等，1983；Zalipski等，1990；Delgado等，1990)，巯基(sulphydryl)(Sartore等，1991；Morpurgo等，1996)或胍基残基反应。
已经发现，许多PEG-蛋白偶联物受到保护而不被蛋白酶解，而且／或者免疫原性降低(Monfardini等，1995；Yamsuki等，1988)。
蛋白质PEG化中的另一技术难题是因为PEG-蛋白偶联物一般含不同数量的固着PEG分子，于是形成PEG：蛋白质化学计量不等的偶联物混合物。位点特异性PEG化仍是一个化学难题。PEG与GH的偶联是上述问题的典型例子(Clark等，1996)。已经证明，GH任意位置上的Lys残基均可被PEG化。
为了避免和减少酶活损失，可预先对活性位点加保护，这样，可以使酶性PEG化发生在非活性位点(Caliceti等，1993)。
最近，提出了另一种方法，将PEG与固相肽合成制备的低分子量肽(例如GRF)位点特异性偶联。在所述偶联物中，在固相合成过程中，将预先制备的PEG化氨基酸引入肽序列。但是，这一方法大大增加了产品纯化的难度，而产品纯化是固相合成中的关键步骤。PEG因其高分子量和多分散性使得其存在导致最终产品的纯度无法接受，和／或得到有氨基酸缺失的产品，据认为，后一种情况在Merrifield法中常发生。
最近的文献报道了单PEG化法，即用固相合成法仅将一个PEG分子固着于[Ala15]-hGRF(1-29)-NH2特定氨基酸残基(Felix等，1995)。该项研究显示：第21或25位被PEG化的[Ala15]-hGRF(1-29)-NH2完全保留亲本[Ala15]-hGRF(1-29)-NH2的体外活性。但是，其中没有说明PEG化偶联物是否比非PEG化偶联物作用更持久的体内数据。
最近，已经在猪模型和小鼠模型中证明：与非PEG化的相比，不同分子量PEG与几种hGRF类似物C末端固着增强作用持久性(Campbell等，1997)。
发明描述
与以上所述固相制备单PEG化hGRF相比，本发明涉及液相，位点特异性PEG化hGRF。
已知，hGRF微溶于中性／碱性缓冲液，而这正是PEG化反应最有效的化学条件。在hGRF稀溶液中，活化PEG(例如PEG酯)的水解会降低PEG化反应的得率。
我们发现：在hGRF具有高溶解度的合适溶剂中，有可能进行液相的位点特异性PEG化反应。如此，即使起始hGRF未被保护，PEG链也会高得率地几乎只结合Lys12、Lys21和／或Nα的伯氨基(ε-氨基)，这取决于反应条件。我们得到了同属于本发明范围内的以下4种偶联物，其中的hGRF∶PEG化学计量主要取决于PEG比hGRF的摩尔比：
hGRF-PEG偶联物：其中1分子PEG与Lys12共价结合，
hGRF-PEG偶联物：其中1分子PEG与Lys21共价结合，
hGRF-2PEG偶联物：其中2分子PEG与Lys12和Lys21共价结合，
hGRF-3PEG偶联物：其中3分子PEG与Lys12、Lys21和Nα共价结合。
“Nα”在本发明中表示肽N末端(Tyr)的氨基。
上述步骤之后，可对反应所得偶联物进行简单的层析分离，用凝胶过滤或直接上到C18 HPLC柱上，用水／乙腈梯度洗脱。优选第二种方法，因为它可用于产品的大规模制备和纯化。
所以，本发明的主要实施例是一种位点特异性制备不同hGRF-PEG偶联物的方法，所述偶联物，相对每分子hGRF，含有一个或多个与Lys12与和／或Lys21和／或Nα共价结合的PEG，所述方法的特征在于PEG化在溶液中进行，所需的hGRF-PEG偶联物用层性法纯化。
含有一个或多个与Lys12与和／或Lys21和／或Nα共价结合的PEG的PEG-hGRF偶联物也属于本发明范围内。本发明的优选化合物是一分子PEG与Lys12或Lys21共价结合的hGRF-PEG偶联物。
根据本发明的另一实施例，如果上述PEG链所结合的3个氨基中一个以上被某些化学基团可逆保护而不参与PEG化反应，将得到特定位点PEG化的所需偶联物，然后可用例如超滤或其他层析法从反应混合物中分离出这些偶联物。此时，制备方法还可以包括去保护反应。
去保护反应宜根据要去除的化学保护基根据已知方法进行。
根据本发明，如非另作说明，“hGRF”包括各种人GRF肽，较好的是1-44，1-40，1-29肽及其对应的酰胺(N末端或C末端具有酰胺基团)。优选的hGRF肽是hGRF(1-29)-NH2，氨基酸序列见SEQ IN NO．1。
“活化PEG”(或“PEG化剂”)是任何因为具有能够与蛋白质／肽内某些官能团反应生成PEG-蛋白质／肽而被用作蛋白质修饰剂的PEG衍生物。有关可用作蛋白质修饰剂的PEG衍生物可参见Harris(1985)。活化PEG可以是烷基化剂，例如PEG醛，PEG环氧化物或PEG tresylate，或者可以是酰基化剂，例如PEG酯。
最好使用单甲氧基化形式的PEG。其分子量最好在2，000至20，000之间。根据本发明，制备活化PEG，最好使用单甲氧基化PEG5，000。
如果活化PEG是酰基化剂，最好含有通过酰胺键与PEG连接的正亮氨酸或鸟氨酸残基。这些残基允许准确测定每摩尔肽所连接PEG单元(参见Sartore等，1991)。所以，更具体地说，优选的活化PEG是通过酰胺键与正亮氨酸α氨基结合的单甲氧基化PEG5，000。
也常使用分支PEG。分支PEG可表示为R(-PEG-OH)m，其中R是诸如戊赤藓糖醇或甘油之类核心部分，m是分支数。分支数m可从3至100以上。可对羟基进行化学修饰。
另一种分支形式例如PCT专利申请WO96／21469所述，仅一个末端接受化学修饰。这种PEG可用(CH3O-PEG-)PR-X表示，其中P等于2或3，R是诸如赖氨酸或甘油的核心，X是接受化学修饰的官能团，例如羧基。另一种分支形式，“悬垂式PEG”沿着PEG骨架，而不是位于PEG链的末端，具有羧基之类反应性基团。
所有上述分支PEG都可以如上所述“活化”。
“层析法”指：上样在支持体(固定相)上，溶剂(移动相)从中流过，如此将混合物各组分分开的各种技术。层析法的分离原理是基于固定相和移动相的不同物理性质。
已知的部分特定类型层析方法包括：液相层析，高压液相层析，离子交换层析，吸附层析，亲和层析，分配层析，疏水层析，反相层析，凝胶过滤层析，超滤层析或薄层层析。
“PEG化”即，通过该反应，由活化PEG和相应的蛋白质／肽得到PEG-蛋白质／肽偶联物。
根据需要高得率得到的是什么偶联物，PEG∶hGRF摩尔比可以是1∶1，2∶1或3∶1。
PEG化反应的溶剂选自高浓缩烟酰胺水溶液，解折叠剂(例如尿素)的缓冲水溶液或选自二甲基亚砜、二甲基甲酰胺／缓冲液或乙腈／缓冲液的极性有机溶剂。
溶液的pH一般保持在7至9之间。
Lys12和Lys21的化学保护基包括但不限于：Alloc(烯丙基氧基羰基)，Dde(1-(4，4-二甲基-2，6-二氧环己-1-内鎓烯)乙基)，Adpoc(1-(1’-金刚烷基)-1-甲基-乙氧基羰基)或2-Cl-Z(2-氯苄基氧基羰基)。Alloc是优选的赖氨酸保护基。
PEG化后，可按照Greene T．W．等1991所述方法之一去除Alloc。Dde可用DMF配制的2％肼溶液去除(W．C．Chan等，1991)。Adpoc的去除与Alloc相似(另可参见Dick F等1997)。2-Cl-Z可能需要更强的酸去保护(HF、TFMSA、HBr)或j加氢(参见Tam等，1987)。
Nα的保护基可以是烷基，例如甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，叔丁基，苄基或环己基。优选异丙基。所述烷基可用还原烷基化反应引入(参见Murphy等，1988或Hocart等，1987)。
[Nα-异丙基-Tyr1．Lys(Alloc)12]-hGRF和[Lys(Alloc)12，21]-hGRF也是本发明认为有用的新的PEG化中间体。
已知本发明的PEG化反应：
1．不改变肽的构象，
2．增强对蛋白酶解的抗性，
3．根据PEG化程度，不影响，或仅轻微降低生物活性，
4．能够得到在缓冲水溶液中溶解度更高的产物(偶联物)。
本发明的另一目的是提供基本纯的hGRF-PEG偶联物，使它们适合用作药物组合物的活性成分。
另一方面，本发明提供本发明偶联物在制造治疗、预防或诊断生长素相关疾病所用药物中的用途，例如生长素缺乏(GHD)，尤其是儿童生长素缺乏。
所述药物的形式最好是药物组合物，其中含有本发明的偶联物和一种或多种药学上认可的载体和／或赋形剂。所述药物组合物是本发明的另一项内容。
本发明实施例之一是将药学活性量的本发明偶联物给予可能患生长素相关疾病或已经显现出此类病症的个体。
本发明的另一目的是治疗、预防或诊断生长素相关疾病的方法，包括给予有效量的本发明偶联物和一种或多种药学上认可的赋形剂。
“有效量”指活性成分的量足以影响上述疾病的病程和严重性，结果缓解或压制所述病症。有效量取决于给药途径和患者情况。
“药学上认可的”包括任何不干扰活性成分生物活性，对接受个体无毒的载体。例如，若是胃肠外给予，所述活性成分可用诸如盐水、葡萄糖溶液、血清白蛋白和Ringer溶液等运载体配制成注射用单位剂型。
除药学上认可的载体之外，本发明组合物还可包含少量诸如稳定剂、赋形剂、缓冲剂和防腐剂等添加剂。
任何适合主要活性成分的给药途径均可使用。优选胃肠外给药，例如皮下、肌内或静脉注射。活性成分的给予剂量取决于根据患者年龄、体重和个体反应所做的处方。
治疗人的活性成分剂量约为5-6，000μg／kg体重，更好的是10-300μg／kg体重。
以上参照实施方式对本发明进行了描述，但其内涵覆盖本领域技术人员在本发明宗旨和范围内所能进行的各种修改和替换。
以下，将通过实施例对本发明进行描述，这些实施例不是对本发明的限定。
实施例涉及以下附图。
附图说明
图1是hGRF(1-29)-NH2的氨基酸序列。箭头所指是可发生PEG化的位点。
图2显示如实施例1所述，在DMSO中进行PEG化所得混合物的反相HPLC层析。前两个主峰是含1分子PEG链／摩尔hGRF的偶联物。后面的副峰是hGRF∶2PEG偶联物，最后面的副峰是hGRF∶3PEG偶联物。
图3a是本发明hGRF(1-29)和PEG偶联物受枯草杆菌蛋白酶的降解。
图3b是本发明hGRF(1-29)和PEG偶联物受糜蛋白酶的降解。
图4显示[Lys(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)12，21-hGRF(1-29)-NH2]的圆二色性光谱特征描述。该光谱与“天然”hGRF的重叠。
图5显示各种hGRF-PEG偶联物(第一DMSO制剂)在CHO-hGRFR-LUC体外试验的生物作用。
图6告知各种hGRF-PEG偶联物(第二DMSO制剂)在CHO-hGRFR-LUC体外试验的生物作用。数据代表两次独立试验的平均值。
图7显示各种hGRF-PEG偶联物(烟酰胺制剂)在CHO-hGRFR-LUC体外试验的生物作用。数据代表两次独立试验的平均值。
图8说明各种hGRF-PEG偶联物(第一DMSO制剂)在体外对大鼠垂体细胞释放GH的生物作用。
图9显示各种hGRF-PEG偶联物(第二DMSO制剂)在体外对大鼠垂体细胞释放GH的生物作用。
图10显示给雄性大鼠静脉注射hGRF(400μg／大鼠)后，血浆hGRF水平和血清GH水平的时间-反应曲线。各点代表9只大鼠的平均值±SEM。
图11A(该页第一图)显示给雄性大鼠静脉注射hGRF(400μg／大鼠)后，血清GH水平的时间-反应曲线。各点代表3只大鼠的平均值。
图11B(该页第二图)显示给雄性大鼠静脉注射hGRF(400μg／大鼠)后，血浆hGRF水平的时间-反应曲线。各点代表3只大鼠的平均值。
图12评价GRF活性的报导基因试验所用质粒pcDNA3-hGRF-R的限制性酶切图。
图13显示评价GRF活性的报导基因试验所用质粒pTF5-53LUC的限制性酶切图。
实施例缩写：乙腈(ACN)，烯丙基氧基羰基(Alloc)，苄基(BZL)，叔丁氧基羰基(Boc)，二氯甲烷(DCM)，二异丙基乙胺(DIEA)，二甲基甲酰胺(DMF)，二甲基亚砜(DMSO)，9-芴基甲基氧基羰基(FMOC)，2-[1H-苯并三唑-1-基]-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸(HBTU)，1-羟基苯并三唑(HOBt)，甲基叔丁基醚(MTBE)，正亮氨酸(Nle)，N-甲基吡咯烷酮(NMP)，2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢呋喃-6-磺酰基(Pmc)，叔丁基(tBu)，三氟乙酸(TFA)，三苯基甲基(Trt)。实施例1：hGRF的液相PEG化
实验中，单甲氧基化的PEG5，000(MPEG5，000)用作PEG化剂，通过酰胺键与正亮氨酸的α氨基结合，正亮氨酸在羟基处被活化成琥珀酰亚氨基酯。可参照例如Lu等1994所述进行制备。
人GRF1-29 hGRF(1-29)-NH2来自Bachem，用作hGRF肽。
因为hGRF(1-29)在PEG化所需中性或微碱性pH下在水溶液中的溶解度很低，所以采用替代反应条件A至E：
A．二甲基亚砜：20mg肽溶于1ml DMSO，立即加入适量PEG化剂。
B．体积比1∶1，pH8．0的二甲基甲酰胺／0．2 M硼酸缓冲液：立即加入肽和适量PEG化剂。
C．高浓缩烟酰胺水溶液(200mg／ml)：将200mg烟酰胺加入40mg hGRF(1-29)在1ml 10mM乙酸中所成溶液。在所述酸性溶液中加pH8．0的0．2M硼酸缓冲液1ml，达所需pH，然后加适量PEG化剂。
D．立即加入体积比1∶1，pH8．0的乙腈／0．2M硼酸缓冲液和适量PEG化剂。
E．立即加入0．2M硼酸缓冲液，5M尿素，pH8．0和适量PEG化剂。
在优选实施例中，搅拌加入无水PEG化剂，直至最后的PEG∶hGRF摩尔比为1∶1，2∶1或3∶1。优选2∶1。
使用不同的PEG∶hGRF摩尔比能够制备出以所需偶联物为主要偶联物的反应混合物。反应混合物室温下放置5小时，然后纯化。得到以下4种hGRF-PEG偶联物(A1-A4)：
  A1：[Lys(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)12-hGRF(1-29)-NH2]，
  A2：[Lys(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)21-hGRF(1-29)-NH2]，
  A3：[Lys(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)12，21-hGRF(1-29)-NH2]，
  A4：Nα-(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)[Lys(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)12，21hGRF(1-29)-NH2] 。
用1，000D截留值的滤膜凝胶过滤去除过量DMSO，二甲基甲酰胺，乙腈或脲以及反应副产物(羟基琥珀酰亚胺)。用10mM乙酸将体积调定为10ml，然后减少到1ml。以上过程重复3次。
凝胶过滤层析或反相层析分离hGRF-PEG偶联物。实施例2：凝胶过滤层析
通过凝胶过滤层析，产物各组分根据分子量不同而分离(此时，偶联物hGRF-PEG1∶1的MW=8，358，hGRF-PEG1∶2的MW=13，358，hGRF-PEG1∶3的MW=18，358)。用Superdex 75-Superose 12树脂串联柱系统(Biotech，Pharmacia)，10ml乙酸，1．5ml／min流速洗脱进行分离。
取收集到的流分1m在280nm处OD法分析蛋白质含量，碘试验测定PEG含量(Sims等，1980)。
在DMSO中用摩尔比1∶1的hGRF-PEG PEG化后，得到3个峰：
洗脱体积132ml处的hGRF-PEG偶联物(主峰)；
洗脱体积108ml处的hGRF-PEG偶联物(副峰)；和
洗脱体积108ml处的非轭体hGRF(副峰)。
在DMSO中用摩尔比1∶2的hGRF-PEG PEG化后，得到3个峰；
洗脱体积108ml处的hGRF-PEG偶联物(主峰)；
洗脱体积132ml处的hGRF-PEG偶联物(副峰)；和
洗脱体积73ml处的hGRF-PEG偶联物(副峰)。
在DMSO中用摩尔比1∶3的hGRF-PEG PEG化后，得到2个峰：
洗脱体积73ml处的hGRF-PEG偶联物(主峰)；和
洗脱体积108ml处的hGRF-PEG偶联物(副峰)。
收集洗脱峰，用截留值1，000D的滤膜超滤浓缩，冷冻干燥，溶于10mM乙酸，鉴定并定量后进行特征描述。
发现，洗脱体积73ml处的峰对应于化合物A4。
洗脱体积132ml处的峰对应于化合物A3。
洗脱体积108ml处的峰对应于化合物A2和A1的混合物。
232ml处的洗脱峰被发现是非偶联hGRF。
然而，所述方法无法分离分子量相同仅PEG化位点不同的hGRF-PEG偶联物(位点异构体)。
实施例3：反相层析
用RP-HPLC C18柱进行特异性更高的疏水层析。该方法能分开分子量相同的异构体。实际上，用这种方法，凝胶过滤所得对应于共价结合1分子PEG的偶联物的1个峰分成了2个峰。
用RP-HPLC C18制备柱(Vydac)进行反相层析，用H2O／0．05％TFA(洗脱液A)和乙腈／=0．05％TFA(洗脱液B)如下梯度洗脱：0-5分钟                        35％A5-35分钟                       35％A→2％A35-38分钟                      2％A38-40分钟                      2％A→35％B流速：10ml／min；环(loop)1μl；UV-Vis．检测器：280nm。在DMSO中用摩尔比1∶1的hGRF-PEG PEG化后，得到4个峰：1．13．2分钟，主峰；2．13．7分钟，主峰；3．14．4分钟，副峰；和4．8．9分钟，副峰。在DMSO中用摩尔比1∶2的hGRF-PEG PEG化后，得到4个峰：1．13．2分钟，副峰；2．13．7分钟，副峰；3．14．4分钟，主峰；和4．15．5分钟，副峰。
在DMSO中用摩尔比1∶3的hGRF-PEG PEG化后，得到2个峰：
1．14．4分钟，副峰；
2．15．5分钟，主峰。
收集洗脱峰，蒸发去除乙腈和TFA，然后冷冻干燥。将冻干产品溶于10mM乙酸溶液，如后文所述进行分离物的鉴定和定量分析。发现：
13．2分钟洗出的hGRF-PEG偶联物对应于A1化合物(GRF-1PEG，第1峰)。
13．7分钟洗出的hGRF-PEG偶联物对应于A2化合物(GRF-1PEG，第2峰)。
14．4分钟洗出的hGRF-PEG偶联物对应于A3化合物(GRF-2PEG)。
15．5分钟洗出的hGRF-PEG偶联物对应于A4化合物(GRF-3PEG)。
8．9分钟洗出的峰是非偶联hGRF。
作为典型实施例，图2显示了用2∶1的PEG∶hGRF摩尔比所得PEG化产物的反相层析。
通过溶剂蒸发／冷冻干燥获得干燥产物。实施例3a：用PEG10，000进行的hGRF液相PEG化
此实施例使用分子量为10，000Da，以赖氨酸为间隔基的分支单甲氧基PEG(得自Shearwater Polymer，Inc．)。所述分支PEG为PEG5，000与赖氨酸各氨基连接而得。
赖氨酸间隔基的羧基被活化成琥珀酰亚胺酯，在DMSO中，以0．9摩尔PEG比1摩尔GRF之比与hGRF(1-29)-NH2的氨基反应。
去除溶剂，在Superose 12 TM制备柱上凝胶排阻层析分离残留物。洗出2个峰，对应于两种hGRF-PEG偶联物。第一个副峰对应于2单位PEG10，000与hGRF结合的偶联物，第二个主峰对应于含1单位PEG10，000／hGRF的偶联物。实施例3a：用PEG20，000进行的hGRF液相PEG化
此实施例使用分子量为20，000Da，以赖氨酸为间隔基的分支单甲氧基PEG(得自Shearwater Polymer，Inc．)。
所述分支PEG为MPEG10，000与赖氨酸各氨基连接而得。
赖氨酸间隔基的羧基被活化成琥珀酰亚胺酯，在DMSO中，以0．9摩尔PEG比1摩尔GRF之比与hGRF(1-29)-NH2的氨基反应。
去除溶剂，在Superose 12 TM制备柱上凝胶排阻层析分离残留物。只得到1个峰。这个峰对应于1单位PEG20，000／hGRF的偶联物。实施例4：hGRF-PEG偶联物的分析性特征说明
根据以下试验，检测以上所得产物所结合的PEG链：
1．用三硝基苯磺酸盐比色法检测游离氨基(参见Habeed等，1966)；
2．用碘比色法检测PEG含量(参见Sims等，1980)。
3．在氨基酸分析中根据作为链标记的正亮氨酸使用PEG链数(参见Sartore等，1991)。
4．用质谱法测定偶联物的分子量。
用MALDI质谱仪测定偶联物的分子量和由于起始物PEG多分散性造成的多分散性。
根据氨基酸序列分析hGRF-PEG偶联物的PEG结合位点。每份样品稀释100倍。然后将10μl溶液溶液(约50pmol)加入测序仪。
用RP-HPLC分析型层析测定最终产品的纯度。
分析使用C18分析柱(Vydac)，用H2O／0．05％TFA(洗脱液A)和乙腈／0．05％TFA(洗脱液B)如下梯度洗脱：0-5分钟                           80％A5-50分钟                          80％A→5％A50-52分钟                         5％A52-54分钟                         5％A→80％B
流速：1ml／min；环20μl；UV-Vis．检测器：226nm。
20．7分钟时洗出的是非偶联hGRF。
22．9分钟时洗出化合物A1，23．4分钟时洗出化合物A2，24．4分钟时洗出化合物A3，25．5分钟时洗出化合物A4。
用圆二色性分析进行“天然”和结合有聚合物的肽的构象特征描述。
用190-300nm范围内的圆二色性分析进行非偶联hGRF与hGRF-PEG偶联物的光谱特征描述。样品(50μg／ml)溶于10mM乙酸或甲醇／10mM乙酸，摩尔比为30∶70和60∶40。在上述溶液中，如化合物A3的图4A所示，非偶联hGRF与hGRF-PEG偶联物的表现可重叠。在乙酸溶液中，肽具有随机构象，但随甲醇浓度升高，肽呈现α-螺旋结构。
以上结果证明：PEG偶联物不显著改变肽的结构特征。实施例 5：hGRF-PEG偶联物的稳定性评价
用例如枯草杆菌蛋白酶和糜蛋白酶等蛋白酶考察hGRF和hGRF-PEG偶联物的抗蛋白酶解稳定性。
用枯草杆菌蛋白酶所做研究为：肽在0．1M Tris HCl 0．005M CaCl2 pH8．0中所成的0．297mM溶液，以1∶50，000的肽／蛋白酶摩尔比，4℃保温。
在糜蛋白酶研究中，肽溶于0．08M Tris HCl 0．1M CaCl2 pH7．8中，肽／蛋白酶的摩尔比是1∶15，000。
用分析型RP-HPLC跟踪肽的降解，用的是C18柱，实施例4中的洗脱条件。在与蛋白酶保温前和保温一定的时间后计算对应于起始化合物的峰高。估算一定时间后的残留峰高百分比，记录在图3a和b中。实施例6：使用烷基化PEG的PEG化
用不同的酰化基团和烷化基团活化单甲氧基化PEG，hGRF与之偶联。
烷基化PEG具有所得偶联物保留赖氨酸上正电荷的优点。
如实施例1-4所述进行分离和特征描述。实施例7：hGRF-PEG偶联物活性的评价材料测试化合物人GRF1-29hGRF(1-29)-NH2，批号1299201，Bachem提供；人GRF3-29hGRF(1-29)-NH2，Bachem提供；人GRF3-29，ISL提供；和以上制备的hGRF-PEG偶联物。反应试剂CHO-hGRF-LUC体外试验：含核糖核苷和脱氧核糖核苷(Gibco)，并补充了10％胎牛血清(Gibco)加600μg／ml硫酸遗传霉素G418(Gibco)的MEMα培养基；细胞培养物裂解剂(Promega)；荧光素酶试剂(Promega)；和Luclite(Packard)。体外大鼠垂体细胞生物试验：
补充了50μg／ml硫酸庆大霉素(Sigma)的Earle’s平衡盐溶液(EBSS)(Gibco)。
含Earle’s平衡盐(Gibco)，12．5％胎牛血清(FBS)(Gibco)和50μg／ml硫酸庆大霉素的199培养基(M199)。
Amersham的大鼠GH试验试剂盒。
用于组织消化的酶溶液(定容至30mlEBBS)：
120mg胶原酶(Sigma)
30mg透明质酸酶(Sigma)
900mgBSA(Sigma)
再生后，溶液过滤灭菌，保存于37℃。体内生物试验Amersham的大鼠GH试验试剂盒。Phoenix Pharmaceutical的人GRF(1-44)放射性免疫试验试剂盒。动物：
SPF成年雄性Sprague-Dawley大鼠，体重200-250g，Charles River提供，适应至少7天后使用。方法CHO-hGRF-LUC体外试验：CHO-hGRF-LUC(克隆1-11-20)是载体pcDNA3-hGRF-R和pTF5-53LUC共转染到CHO-DUKX细胞系内获得的一个克隆细胞系。
质粒pcDNA3-hGRF-R是将人生长素释放因子受体(hGRF-R)的cDNA插入表达载体pcDNA3构建而成的。含hGRF-R cDNA的Bluescript是Dr．B．Gaylinn(University of Virginia)提供的，哺乳动物表达载体pcDNA3得自Invitrogen。hGRF-R编码序列由人巨细胞病毒(CMV)启动子驱动。其限制性酶切图见图12。
质粒pTF5-53LUC是将c-fos cAMP应答元件与荧光素酶编码序列上游的内源性启动子一起插入质粒poLuc构建而成。cAMP应答元件和c-fos启动子来自质粒pTF5-53(参见Fish等，1989)。具有多克隆位点的荧光素酶编码序列上游的无启动子报导基因载体(poLuc)由Dr．Brasier(University of Texas，Galveston)提供。其限制性酶切图见图13。
上述共转染得到的CHO-DUKX细胞常规培养在MEMα培养基中，培养基中含核糖核苷和脱氧核糖核苷，并补充了10％胎牛血清加600μg／ml硫酸遗传霉素G418。
细胞接种(40，000细胞／孔)到白色96孔板(Dynatech)上，试验前在200μl生长培养基中培养16-18小时。
次日，去除培养基，换以含不同浓度hRGF(1-29)室内参照标准(Bachem)或不同hRGF-PEG偶联物的培养基，然后孔板在37℃，5％CO2中培养2小时。培养结束时，用200μl PBS(Sigma)洗涤CHO-hGRF-LUC细胞2次，然后每孔加50μl细胞培养裂解剂(Promega)裂解。再室温培养15分钟后，加入150μl荧光素酶试剂(Promega)，在发光光度计(Dynatech)中读数。
另一种方法是，50，000细胞／孔接种CHO-hGRF-LUC细胞，与不同hRGF-PEG偶联物一起培养后，如前所述用PBS洗涤。每孔加入100μl含钙离子和镁离子的PBS，然后加100μl Luclite(Packard)。室温培养10分钟后，孔板在发光光度计(Lumicount-Packard)中读数。
结果表示为相对光单位(RLU)。hGRF(1-29)的体外大鼠垂体细胞生物试验
用CO2吸入杀死动物(SPF雄性Sprague-Dawley大鼠，体重200g)取出垂体。将组织切碎，装入瓶中，用酶溶液消化。瓶在37℃培养箱内放置1小时。
回收消化后的组织，洗涤细胞2次，计数细胞，校正到5×105／ml浓度。细胞接种(200μl／孔)到48孔板上，板在培养箱中放置72小时。
72小时后，细胞与不同浓度hGRF一起培养4小时。结束时，收集上清液，保存于-80℃。
用购得的大鼠GH放射性免疫试验试剂盒测定各份样品中的GH含量。体内试验
给动物静脉注射hGRF(1-29)(400μg／大鼠)。(氯胺酮-赛拉嗪)麻醉动物，几分钟后收集血液。每鼠从下腔静脉抽2ml血。将样品分成2等份：收集1ml，37℃保温3小时后离心获取血清；另1ml收集在含50μl 4mg／ml肝素的小管中，立即保存于冰上，4℃离心获取血浆。
给不同动物注射测试化合物后，在不同时刻收集血液样品。每次试验，每一时刻共用3只大鼠。
血浆和血清样品立即冷冻，保存于-20℃。
用购得的RIA试剂盒测定血清GH水平；用购得的测定hGRF(1-44)的RIA试剂盒测定血浆hGRF水平。结果
注：在这一部分和相关附图中，“GRF-1PEG第一峰”对应于[Lys(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)21-hGRF(1-29)-NH2]，“GRF-1 PEG第二峰”对应于[Lys(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)12-hGRF(1-29)-NH2]，“GRF-2PEG”对应于[Lys(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)12．21-hGRF(1-29)-NH2]，“GRF-3PEG”对应于Nα-(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)[Lys(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)12．21-hGRF(1-29)- NH2]。CHO-hGRF-LUC体外试验：
图5和6显示用DMSO制备的两批hGRF-PEG偶联物在CHO-hGRF-LUC体外试验中的活性。
我们发现，所有制剂都有活性，但程度略低于“天然”hGRF(hGRF接受与PEG化化合物相同的纯化步骤)，GRF-1PEG(第一峰和第二峰)的活性高于GRF-2PEG和GRF-3PEG。hGRF与“天然”hGRF之间没有发现有区别(未给出数据)。
我们观察到两批DMSO制备的hGRF-PEG偶联物(图5和图6)与两批烟酰胺溶液制备的偶联物(图7)具有相似的体外生物活性。图6还显示：与hGRF(1-29)相比，两种不同的hGRF(3-29)制剂没有显著的体外活性。hGRF1-29的体外大鼠垂体细胞生物试验
在用两种DMSO制剂中的hGRF-PEG进行的试验中，我们发现，GRF-1PEG第一峰是最具活性的化合物，其次是GRF-1PEG第二峰，GRF-2PEG，接着是GRF-3PEG(图8和9)。以上发现与报导基因试验所得非常一致。体内试验
在初步实验中，给大鼠静脉注射400μg hGRF后测定血清GH水平和血浆hGRF水平。结果见图10。如图所示，GH和hGRF水平都在hGRF注射后10分钟达到最高值。然后，血清GH水平迅速下降，60分钟后回到基线，但在以上时段，血浆hGRF水平却维持恒定。
图11A和11B中显示的是给大鼠静脉注射400μg GRF-1PEG第一峰及第二峰、GRF-2PEG和GRF-3PEG(DMSO制剂)后48小时内不同时刻的血液GH和GRF水平。
与hGRF1-29相似，静脉注射后10分钟，上述PEG化制剂都诱导产生一个血清GH峰。然而，GRF-1PEG第一峰及第二峰和GRF-2PEG所诱导的GH水平与hGRF1-29的相当，GRF-3PEG仍和体外试验结果一样，活性较低。
就血浆GRF水平而言，不论使用何种制剂(DMSO或烟酰胺)，用GRF-1PEG第一峰及第二峰所得的情况与GRF-2PEG和GRF-3PEG完全不同。注射GRF-1PEG第一峰及第二峰后48小时，血浆GRF水平回到基线，而GRF-2PEG和GRF-3PEG水平则较持久。
实施例8：PEG化起始化合物即位点保护hGRF(1-29)-NH2衍生物的固相合成
本实施例固相合成了在赖氨酸12和21的伯氨基各有一个特定保护基(N-烯丙基氧基羰基)的hGRF(1-29)-NH2衍生物。这样就可以在Nα-末端进行位点特异性PEG化。另一种氨基被保护的衍生物通过酰化封闭Nα-末端和N-烯丙基氧基羰基封闭赖氨酸12制备而得。这种衍生物用于赖氨酸21处的位点特异性PEG化。材料和方法肽合成
在Applied Biosystems Inc．431A型肽合成仪上用Fmoc化学法组装各种hGRF衍生肽-树脂，对每个残基使用低取代(0．16mmol／g)PAL-PEG-PS树脂和双偶联及加帽法以获得最佳的粗产物产量和纯度。此外，通过还原性烷基化人工给[N-异丙基-Tyr1，Lys(Alloc)12]-hGRF(1-29)-NH2]肽-树脂添加一个N末端异丙基。
全部肽树脂用TFA／1，2-乙二硫醇／苯硫醇甲烷／水[10∶0．5∶0．5∶0．5(v／v)]混合物剪切2小时，MTBE沉淀和离心分离出粗肽。反相梯度HPLC纯化冷冻干燥的肽，用Vydac18C制备柱和0．1％TFA水／乙腈缓冲液系统。全部纯化肽用分析型反相HPLC和MALDI-TOF质谱进行特征描述。材料
Fmoc-L-氨基酸(Bachem Bioscience，Perseptive Biosystem，NovaBiochem)，DMF，20L转鼓(drum)(J．T．Baker)，哌啶(Applied Biosystems，Chem-Impex)，HBTU(Rainin，Richelieu Biotechnologies)，NMM(Aldrich)，AceticAnhydride(Applied Biosystems)，树脂(Perseptive Biosystems Novabiochem)，芥子酸(Aldrich)，2-氰-4-羟-肉桂酸(Sigma)，乙腈(J．T．Baker)，TFA(Sigma，Pierce)，去离子水(Millipore Mille-Q Water System)。其他溶剂和试剂如下：试剂／溶剂              供应商NMP                     Applied Biosystems Inc．，J．T．BakerHBTU                    Applied Biosystems Inc．Richelieu Biotechnologies Inc．0．5M HOBt的DMF溶液     Applied Biosystems Inc．2．0M DLEA的NMP溶液     Applied Biosystems Inc．哌碇                    Applied Biosystems Inc．二氯甲烷                Applied Biosystems Inc．乙酸酐                  Applied Biosystems Inc．
氨基酸：ABI 431A合成仪上使用的大多数FMOC氨基酸是购自AppliedBiosystems的已称重1．0mmol管装品。FMOC-Lys(Alloc)-OH是购自PerseptiveBiosystems(Framignham，MA)的散装品和室内管装品。所用的全部氨基酸都是L构形。
树脂：用于hGRF类似物的的基本树脂是PAL-PEG-PS(肽酰胺接头-聚乙二醇-聚苯乙烯)树脂。PAL-PEG-PS支持体购自Perseptive Biosystems，一致具有良好的粗产物得率和纯度。0．16mmol／g的低取代树脂用于全部衍生物。低取代树脂一般用于长、难序列，通过减少成长肽链中的空间障碍和β平面形成确保更好的偶联。方法链组装-Applied Biosystems Inc．431A型肽合成仪
先在Applied Biosystems Inc．431A型肽合成仪上用Fmoc法组装被保护肽链，该合成仪使用快速FMOC循环程序(FastMocTM)。用HBTU活化和偶联，用20％哌碇去保护，NMP是用于去保护、氨基酸溶解和树脂洗涤的主要溶剂。氨基酸以已称重1．0mmol管装形式引入。0．25mmol FastMocTM循环使用1．0mmol管和40ml反应管。链组装-过程
0．25mmol程序化循环的步骤可概括如下：
1．哌碇去保护-先用NMP洗涤树脂，然后加入18％哌碇／NMP溶液，去保护3分钟。倒去反应管中的溶液，加入20％哌碇溶液，继续去保护约8分钟。
2．溶解氨基酸-在小管中加入NMP(2．1g)和0．9mmol 0．45M HBTU／HOBt的DMF(2．0g)溶液，混合6分钟。
3．NMP洗涤-倒干反应容器，树脂用NMP洗涤5次。
4．活化氨基酸并转移倒反应管(RV)-在小管中加入1m 2M DIEA的NMP溶液开始活化已溶解的氨基酸，然后从小管中转移倒RV中。
5．偶联和最后洗涤-活化氨基酸和N末端去保护的肽-树脂之间的偶联反应进行约20分钟，然后倒干RV，用NMP洗涤树脂。
6．加帽反应(如有必要)-在反应管中加入约12ml 0．5M乙酸酐，0．125MDIEA和0．015M HOBt的NMP溶液，涡流搅拌15分钟。这将酰化树脂上任何未偶联的位点，得到截断序列而非缺失序列，这简化了后面的纯化步骤。
完整的上述循环可见Applied Biosystems告使用者书No．35(431A型上的FastMocTM 0．25和0．10)。一次典型合成的标准步骤：
第1步：用DFM洗涤树脂3次。
第2步：用20％哌碇／DMF进行2次5分钟的去保护。
第3步：用DMF洗涤树脂6次。
第4步：用HBTU／NMM的DMF溶液活化的氨基酸偶联45分钟。
第5步：用DMF洗涤树脂3次。
对于难序列，在偶联之后可另外插入一步加帽反应，该反应用70％乙酸酐的DMF溶液进行20分钟，酰化肽-树脂上任何未偶联的位点，得到的最终粗产物是截断序列而非缺失序列。剪切／萃取
用于去除侧链保护基和从树脂上释放肽的剪切混合物是用于含精氨酸和／或甲硫氨酸肽的标准混合物。用于0．1-1．5g肽-树脂的是10ml三氟乙酸，0．5ml去离子水，0．5ml苯硫醇甲烷，0．5ml乙二硫醇(87％三氟乙酸，4．3％去离子水，4．3％苯硫醇甲烷，4．3％乙二硫醇)。剪切过程
将100mg-1g肽-树脂装入20ml玻璃管，冰浴冷却。制备剪切混合物，也冰浴冷却，然后加入肽-树脂，使得最终体积达到约10ml。
从冰浴中取出试管，温热至室温。盖上试管，反应混合物室温下搅拌2小时。
2小时后，溶液经中孔-粗孔滤膜真空过滤到30ml冷MTBE中。用1ml TFA洗涤反应管，经同一过滤漏斗过滤到冷MTBE中。然后将整个悬浮系转移到50ml的离心管中，室温下2，000rpm离心约10分钟。吸出上清液，沉淀重悬在40ml冷MTBE中，再次离心。重复该步骤一次以上。吸出最后的上清液，在沉淀中吹入氮气以蒸发掉大部分残留的醚。
然后将肽溶于20-30ml 1％-10％乙酸水溶液，用去离子水稀释至约100-150ml，夹套冷冻(shell frozen)，冷冻干燥。纯化RP-HPLC法
系统-Waters Delta Prep 4000
柱-Vydac反相C18柱，10μm，2．2×25cm(分类号：218TP1022)
缓冲液-A：水／0．1％TFA，B：乙腈／0．1％TFA
流速-15ml／min
检测-Waters 484 UV检测器，220nm
梯度-可变，一般为0．2％B／min至1．0％B／min
将50-100mg冷冻干燥的粗肽溶于200ml 0．1％TFA水溶液。然后通过“A”缓冲液储备管将肽溶液直接上到制备柱上，开始梯度程序。
收集到的组分在自动取样仪分析型HPLC系统上运行通宵。集合经峰积分判断纯度高于92％的重叠组分，用去离子水按4∶1稀释，夹套冷冻，然后在Virtis 25SL Freezedryer上冷冻干燥。特征描述反相HPLC
条件：
系统-Waters 510泵，717自动取样仪，490多波长UV检测仪
柱-Vydac C18，5μm，0．46×25cm(分类号218TP54)
缓冲液-A：水／0．1％TFA，B：ACN／0．1％TFA流速-1ml／min检测-UV：214nm，280nm梯度-2％B／min
将0．2-1．0mg／ml冷冻干燥的肽溶于0．1％TFA水溶液至0．5-1．0mg／ml的浓度，制成纯化肽样品。
将15-18μl注射到柱上，用0-50％CAN梯度程序，在25分钟内洗脱。用WatersExpert-Ease软件收集层析数据并保存。质谱
类型：MALDI-TOF(基质辅助的激光吸收／离子化飞行时间)
系统：Perseptive Biosystems Voyager Elite
基质：用67％ACN／0．1％TFA配制的10mg／ml a-氰基4-羟基肉桂酸溶液，或用50％ACN／0．1％TFA配制的10mg／ml芥子酸溶液
将肽样品溶于50％ACN／0．1％TFA，制备成1-20μmol浓度。在分析板各孔中先加入0．5μl基质溶液，然后加入0．5μl肽样品，然后自然干燥。将分析板放入仪器中，用对肽优化过的反射器延迟-萃取法(Reflector Delayed-Extraction)扫描和分析样品。收集并分析每份样品激光击打32-128次的累计数据信号。每次运行包括一份样品和一份用于校准的标准肽。特异性合成[Lys(Alloc)12，21]-hGRF(1-29)-NH2的制备
先在Applied Biosystems 431A型肽合成仪(参见前文合成方法部分)上用Fmoc化学法组装[Lys(Alloc)12，21]-hGRF(1-29)-PAL-PEG-PS树脂，包括N末端残基的Fmoc基团去保护。
肽-树脂用TFA：1，2-乙二硫醇∶苯硫醇甲烷∶水[10∶0．5∶0．5(v／v)]剪切2小时，MTBE沉淀分离出肽，得到240mg粗肽。Vydac C18柱(22×250mm)制备型反相HPLC纯化得到60mg纯化产物(分析型HPLC测得纯度＞95％)。MALDI-TOF质谱：算得：3523．8，测得：3524．2。[Nα-异丙基-Tyr1，Lys(Alloc)12]-hGRF(1-29)-NH2的制备先组装[Lys(Alloc)12]-hGRF(1-29)-PAL-PEG-PS树脂
先在Applied Biosystems 431A型肽合成仪(参见前文合成方法部分)上用Fmoc化学法组装[Lys(Alloc)12，21]-hGRF(1-29)-PAL-PEG-PS树脂，包括N末端残基的Fmoc基团去保护。通过还原性烷基化进行的Nα-异丙基化
如Hocart等1987年所述，用氰基硼氢化钠和对应的酮(丙酮)进行肽-树脂的还原性烷基化，添加Nα-异丙基。880mg肽-树脂(约70μmol)在5ml DCM中溶胀30分钟，然后加入10mmol(174μl)丙酮在7ml MeOH／1％HOAc中所成溶液，环境温度下间或搅拌2小时。然后加入溶于12ml MeOH／1％HOAc的2mmol(129mg)氰基硼氢化钠，混合物间或搅拌2小时，然后静置过夜(15小时)。定性水合茚三酮监测显示反应完全(无兰色)。肽-树脂用TFA：1，2-乙二硫醇∶苯硫醇甲烷∶水[10∶0．5∶0．5(v／v)]剪切2小时，MTBE沉淀分离出肽，得到200mg粗肽。Vydac C18柱(22×250mm)制备型反相梯度HPLC纯化，用水／乙腈／0．1％TFA溶液，得到50mg纯化产物(分析型HPLC测得纯度＞95％)。MALDI-TOF质谱：算得：3481．9，测得：3481．8。
实施例9：被保护hGRF(1-29)的PEG化
如实施例8所述制备的hGRF衍生物与实施例1和6所述的活化PEG偶联。
此时的纯化只需分离掉过量的试剂和副产物，不必进行实施例2和3所述的过程。
参考文献
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序列表(1)一般信息：(ⅰ)申请人：(A)姓名：Applied Research Systerms ARS Holding N．V．(B)街道：14 John B．Gorsiraweg(C)城市：Curacao(E)国家：The Netherland Antilies(F)邮政编码：无(G)电话：639300(H)传真：614129(ⅱ)发明名称：GRF-PEG偶联物的液相位点特异性制备(ⅲ)序列数量：1(ⅳ)计算机可读形式：(A)介质类型：软盘(B)计算机：IBM PC兼容机(C)操作系统：PC-DOS／MS-DOS(D)软件：PatentIn Release #1．0，1．30版(EPO)(2)SEQ ID NO．1的信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：29个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：(D)拓扑：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅲ)假设：无(ⅳ)反义链：无(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO．1：Tyr  Ala  Asp  Ala  Ile   Phe  Thr  Asn  Ser  Tyr  Arg  Lys  Val  Leu  Gly  Gln1                    5                        10                       15Leu  Ser  Ala  Arg  Lys  Leu  Leu  Gln  Asp  Ile   Met  Ser  Arg20                       25

Claims (19)

1．一种位点特异性地制备相对每分子hGRF含一个或多个与Lys12和／或Lys21和／或Nα共价结合的PEG单元的hGRF-PEG偶联物的方法，其特征在于，在溶液中进行hGRF肽与活化PEG之间的偶联反应，从反应混合物中分离出所需的hGRF-PEG偶联物并纯化。
2．根据权利要求1所述方法，其中的溶液是烟酰胺浓缩水溶液或解折叠剂的缓冲水溶液。
3．根据权利要求1所述方法，其中的溶剂是极性有机溶剂，选自：二甲基亚砜，二甲基甲酰胺／缓冲液或乙腈／缓冲液。
4．根据权利要求1所述方法，其中，从反应混合物中分离出hGRF-PEG偶联物，用层析法纯化。
5．根据前述权利要求中任一项所述方法，其中的hGRF-肽是hGRF(1-29)- NH2。
6．根据权利要求1所述方法，其中，在PEG化反应之前，hGRF在一个或多个以下位置被保护：Nα，Lys12和Lys21。
7．根据权利要求1或6所述方法，还包括PEG化后去保护。
8．根据前述权利要求中任一项所述方法，其中的活化PEG是单甲氧基化形式的烷基化或酰基化PEG。
9．一种相对每分子hGRF含一个或多个与Lys12和／或Lys21和／或Nα共价结合的PEG单元的hGRF-PEG偶联物。
10．根据权利要求9所述hGRF-PEG偶联物，其中，1个PEG单元与Lys12共价结合。
11．根据权利要求9所述hGRF-PEG偶联物，其中，1个PEG单元与Lys21共价结合。
12．根据权利要求9所述hGRF-PEG偶联物，其中，各有1个PEG单元与Lys21和Lys21共价结合。
13．根据权利要求9所述hGRF-PEG偶联物，其中，各有1个PEG单元与Lys21、Lys21和Nα共价结合。
14．权利要求1所述PEG化反应的中间体，即[Lys(Alloc)12，21]-hGRF。
15．权利要求1所述PEG化反应的中间体，即[Nα-异丙基-Tyr1，Lys(Alloc)12]-hGRF。
16．权利要求9至13所述hGRF-PEG偶联物作为药物的用途。
17．权利要求9至13任一项所述hGRF-PEG偶联物在制造治疗、预防或诊断生长素相关疾病所用药物的用途。
18．根据权利要求17所述用途，是用于制造治疗或诊断生长素缺乏(GHD)所用药物。
19．一种药学组合物，含权利要求9至13任一项所述hGRF-PEG偶联物和一种或多种药学上认可的载体和／或赋形剂。
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