CN1243952A - 生物传感器 - Google Patents

Abstract

本发明揭示了可抑制保存时酶活性下降,具备良好保存稳定性的生物传感器。该传感器具备绝缘性基板、设置于前述基板的至少由工作电极和对极构成的电极系、以及形成于前述电极系上的至少含有酶和糖类的反应层,前述酶为选自葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶及果糖脱氢酶中的至少1种,前述糖类为选自海藻糖、蔗糖、甘油、甘露醇及核糖中的至少1种。所用酶为以吡咯并喹啉苯醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶时,糖类最好是使用海藻糖。

Description

生物传感器

本发明涉及能够简单、快速地以高精度对试样中的特定组分进行定量的生物传感器。

以往，为了能对试样溶液不作稀释和搅拌等，就可简单地对试样中的特定组分进行定量，设计了各种生物传感器。以下是生物传感器的一个例子(日本专利公开公报平2-062952号)。

利用网版印刷等方法，在绝缘性基板上形成由工作电极、对极和参比电极组成的电极系，再在该电极系上固定上含有亲水性高分子、氧化还原酶和电子接受体的酶反应层，这样就构成了生物传感器。

在用以上方法制成的生物传感器的酶反应层上滴加含有底物的试样溶液，使酶反应层溶解，酶与底物反应，在进行反应的过程中，电子接受体被还原。酶反应结束后，被还原的电子接受体进行电化学氧化反应，此时由得到的氧化电流值可以求出试样溶液中的底物浓度。

通过选择以底物为测定对象的酶，以上构成的生物传感器理论上可对各种物质进行测定。

酶以蛋白质为主成分，一般以干燥状态被保存于传感器内。

但是，受空气的温度和湿度等条件的影响，空气中的水分会从酶表面向酶内部转移。所以，如果酶长时间与空气接触，则存在于酶内部的水分量将发生微小变化，造成酶变性，酶活性下降。

制得传感器后，如果在保存过程中传感器内的酶活性发生经时下降，则会造成与底物反应的酶量不足。所以，导致所得响应电流值和底物浓度不成比例的问题。

解决这个问题的关键是使酶周围的环境有益于长时间保持酶活性。

此外，在酶反应时使电子和底物的移动等顺利进行，提高传感器的灵敏度也是非常必要的。

鉴于上述问题，本发明的目的是提供保存过程中可抑制传感器内的酶活性下降，保存稳定性较高的生物传感器。

特别是本发明还提供了小型、便宜的一次性使用的生物传感器。

本发明具备绝缘性基板，设置于前述基板上的至少由工作电极和对极构成的电极系，以及形成于前述电极系上的至少包含酶和糖类的反应层。前述酶为选自葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶及果糖脱氢酶中的至少1种。前述糖类为选自海藻糖、蔗糖、甘油、甘露醇及核糖中的至少1种。

本发明中希望使用的前述酶是以吡咯并喹啉苯醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶，前述糖类是海藻糖。

图1为本发明的一个实施例中的生物传感器的除了反应层之外的平面简图。

图2为同一生物传感器的主要部分的纵截面图。

图3表示本发明的实施例和比较例的生物传感器的响应特性。

图4表示具有不同酶量的反应层的传感器的响应特性。

图5表示具有不同海藻糖量的反应层的传感器保存后的响应值和初期响应值之比。

如上所述，本发明的生物传感器的反应层中包含糖类。如果在酶溶液中添加糖类，然后滴下该溶液，使其干燥，作成反应层，就可使酶表面被糖类覆盖。所以，即使温度和湿度等环境条件有所变化，也能够保护酶，长时间使酶活性稳定。

另外，由于糖类易溶于水，所以在反应层中添加试样溶液，使反应层直接溶解，就能够使酶反应和电极反应顺利进行，很方便。

可获得上述效果的糖类有很多种，适用于本发明的生物传感器的酶也有多种可供选择。

使用选自葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶及果糖脱氢酶中的至少1种时，反应层中最好是选用海藻糖、蔗糖、甘油、甘露醇及核糖中的至少1种。

特别是使用以吡咯并喹啉苯醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶时，如果使用海藻糖，则可显著维持前述酶活性，即使传感器被长时间保存，也能够获得良好的传感器灵敏度。

同时使用以吡咯并喹啉苯醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶和海藻糖时，以3～4μl血液为试样溶液的抛弃型(一次性)传感器顶端的前述酶和海藻糖的量一般分别是1～40个单位和4-400nM(毫微克分子量)，最好是5～20个单位和40～20nM。

电子接受体可以是铁氰化离子、对苯醌及其衍生物、吩嗪硫酸甲酯、亚甲蓝、二茂铁及其衍生物等。以试样溶液中溶存的氧为电子接受体时，也能够获得传感器响应。

本发明的生物传感器的反应层中除了上述酶类和糖类及电子接受体之外，最好还包含亲水性高分子。

通过在反应层中添加亲水性高分子，能够防止反应层从电极系表面剥离。而且，具有防止反应层表面出现裂缝的效果，对提高生物传感器的可靠性也有效。

理想的亲水性高分子可使用羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、羧甲基乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚赖氨酸等聚氨基酸、聚苯乙烯磺酸、明胶及其衍生物、丙烯酸或其盐的聚合物、甲基丙烯酸或其盐的聚合物、淀粉及其衍生物、马来酸酐或其盐的聚合物、琼脂糖及其衍生物。

生物传感器内的反应层除了可形成于电绝缘性基板上的电极系上之外，还包括其他各种形态。例如，可形成于前述基板的电极系上以外的地方，也可使用在前述基板间形成向前述电极系提供试样溶液的试样溶液供给通道的覆盖部件，形成于该覆盖部件露出于试样溶液供给通道的表面。

氧化电流的测定方法包括仅由工作电极和对极构成的二极电极方式和还包括参比电极的三极方式。三极法的测定准确性更高。

以下，列举具体的实施例，对本发明进行更为详细的说明。

图1为本发明的一个实施例中的生物传感器除去了反应层的平面简图。利用网版印刷法在聚对苯二甲酸乙二醇酯构成的电绝缘性基板1上涂布含银糊状物，形成导线2、3。然后，在基板1上涂布含有树脂粘合剂的导电性碳糊，形成工作电极4。该工作电极4与导线2接触。另外，在基板1上涂布绝缘性糊状物，形成绝缘层6。绝缘层6覆盖于工作电极4的外周部分，这样就能够保持工作电极4的露出部分面积一定。另外，还在基板1上涂布含有树脂粘合剂的导电性碳糊，使其与导线3接触，形成环状对极5。

图2为图1的生物传感器的纵截面图。按照图1制得的电极系上形成了亲水性高分子层7和至少含有酶和糖类的反应层8。

实施例1

在图1的基板1的电极上滴加作为亲水性高分子的羧甲基纤维素钠盐(以下略称为CMC)的0.5wt％水溶液，然后，在50℃的温风干燥器中使其干燥10分钟，形成CMC层7。接着，将5000个单位的以吡咯并喹啉苯醌(以下略称为PQQ)为辅酶的葡萄糖脱氢酶(以下略称为GDH)和20μM海藻糖及50μM铁氰化钾溶于1ml水中，在CMC层7上滴加该混合溶液4μl，形成反应层8，制得葡萄糖传感器。

试样溶液可使用各种浓度的葡萄糖水溶液。在反应层8上滴加调制而得的试样溶液。如果向反应层提供含有葡萄糖的试样溶液，则试样中的葡萄糖就会被GDH氧化。同时，反应层中的铁氰化钾被还原为亚铁氰化钾。

在滴加试样溶液1分钟后，以对极5为基准，在工作电极4上施加+0.5V的电压，使亚铁氰化钾氧化。5秒钟后，测定对极和工作电极间的电流值。同样，测定对应于各种浓度的葡萄糖水溶液的电流值，以横轴为葡萄糖浓度、纵轴为电流值作图，制成传感器的响应特性图。其结果如图3所示。

另外，将同样制得的生物传感器保存6个月后，同样制成响应特性图。其结果如图3所示。

从图3可看出，浓度和电流值之间有一定相关性，具有良好的直线性。此外，刚制作完毕的传感器和保存6个月后没有什么差别，这说明其具备良好的保存性。

比较例1

除了不在反应层8中添加海藻糖之外，其他操作与实施例1相同，制得葡萄糖传感器。然后，与实施例1同样，制得刚制作完毕的传感器和保存6个月后的传感器的响应特性图。其结果如图3所示。

从图3可看出，所得响应电流值比实施例1低。另外，保存6个月后的传感器的浓度和电流值之间的相关性下降，其响应电流值也比刚制作完毕时小。

然后，保持反应层中的海藻糖量一定(80nM)，改变以PQQ为辅酶的GDH量，制得传感器，保存6个月后向反应层提供各种浓度的葡萄糖试样溶液，测定传感器的响应性。其结果如图4所示。

另外，保存以PQQ为辅酶的GDH量一定(20个单位)，将海藻糖量分别定为4、40、200和400nM，制得传感器。提供浓度为10mM(毫克分子量)的葡萄糖试样溶液，分别测定初期和保存6个月后的传感器响应情况。保存后的响应值和初期响应值之比如图5所示。

从上述结果可看出，酶量为1个单位，葡萄糖浓度在600mg/dl以下时，葡萄糖浓度和传感器响应值呈直线性。酶量超过40个单位，较多时，成本较高。这就说明传感器顶端的酶量较好为1～40个单位，更好是5～20个单位。另外，海藻糖量为4nM和400nM时，保存性略有下降。所以，在4nM～400nM的范围内较理想，更好是在40～200nM的范围内。

实施例2

除了用葡萄糖氧化酶代替葡萄糖脱氢酶之外，其他操作与实施例1相同，制得葡萄糖传感器。然后，与实施例1同样，制得刚制作完毕的传感器和保存6个月后的传感器的响应特性图。

其结果是，葡萄糖浓度和电流值之间存在较高的相关性。另外，保存6个月后，于刚制作完毕时没有差别，这表示其具备良好的保存性。

比较例2

除了未在反应层8中添加海藻糖之外，其他操作与实施例2相同，制得葡萄糖传感器。然后，与实施例1相同，制得刚制作完毕的传感器和保存6个月后的传感器的响应特性图。

其结果是，所得响应电流值低于实施例2。保存6个月后的传感器的浓度和电流值之间的相关性下降，响应电流值也比刚制作完毕时低。

实施例3

除了用果糖脱氢酶代替葡萄糖脱氢酶之外，其他操作与实施例1相同，制得传感器。

用各种浓度的果糖溶液作为试样溶液。使用这些试样溶液，与实施例1同样，制得刚制作完毕的传感器和保存6个月后的传感器的响应特性图。

其结果是，果糖浓度和电流值之间存在较高的相关性。保存6个月后，与刚制作完毕时没有差别，显现出良好的保存性。

比较例3

除了未在反应层8中添加海藻糖之外，其他操作与实施例3相同，制得传感器。然后，与实施例3相同，制得刚制作完毕的传感器和保存6个月后的传感器的响应特性图。

其结果是，所得响应电流值低于实施例3。保存6个月后的传感器的浓度和电流值之间的相关性下降，响应电流值也比刚制作完毕时低。

如上所述，本发明能够获得具备良好的长期保存性的生物传感器。

Claims (4)

1.一种生物传感器，其特征在于，具备绝缘性基板、设置于前述基板的至少由工作电极和对极构成的电极系、以及形成于前述电极系上的至少含有酶和糖类的反应层，前述酶为选自葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶及果糖脱氢酶中的至少1种，前述糖类为选自海藻糖、蔗糖、甘油、甘露醇及核糖中的至少1种。

2.如权利要求1所述的生物传感器，其特征还在于，前述酶为以吡咯并喹啉苯醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶，前述糖类为海藻糖。

3.如权利要求2所述的生物传感器，其特征还在于，前述反应层中含有相当于传感器顶端的前述葡萄糖脱氢酶1～40个单位，海藻糖4～400nM。

4.如权利要求2所述的生物传感器，其特征还在于，前述反应层中含有相当于传感器顶端的前述葡萄糖脱氢酶5～20个单位，海藻糖40～200nM。

Images