CN1230997A - 甲醇毕赤酵母的转化 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了转化甲醇毕赤酶母的方法,用于转化甲醇毕赤酵母的DNA分子。在DNA分子存在下,使甲醇毕赤酵母细胞暴露于场强为2.5～4.5kV/cm,脉冲持续时间为1—40毫秒的脉冲电场中,由此将DNA分子导入细胞。DNA分子可包含一个表达单位,其包括与编码感兴趣的多肽或蛋白质的节段可操作地连接的甲醇毕赤酵母基因的转录启动子。DNA分子也可以编码一个选择性标记,如甲醇毕赤酵母ADE2基因。按照本发明转化的细胞可以用于制备具有商业重要性的蛋白质的生产系统中。

Description

甲醇毕赤酵母的转化
发明背景
甲基营养型酵母是那些能够利用甲醇作为唯一碳源和能量源的酵母。具有甲醇利用所必需的生化途径的酵母物种可分成四个属：汉逊酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属以及球拟酵母属。这些酵母属多少有点是基于细胞形态学和生长特点而人工合成的，并且不反映密切的遗传关系(Billon-Grand,Mycotaxon 35:201-204,1989;Kurtzman,Mycologia 84:72-76,1992)。此外。并非这些属中的所有物种都能够利用甲醇作为碳源和能量源。这一分类的结果是：在一属的单个物种之间的生理和代谢方面有极大的差异。
甲基营养型酵母是在重组蛋白质产生系统中利用的具有吸引力的候选者。一些甲基营养型酵母已经显示出在基本确定成分培养基上能快速生长至高生物量的特征。甲基营养型酵母的某些基因在诱导或者脱阻抑条件下得到严格调节和高度表达，这表明这些基因的启动子对于产生商业价值的多肽来说是有用的。参见，例如，Faber等，酵母，11:1331,1995；Romanos等，酵母，8:423,1992；以及Cregg等，生物/技术，11:905,1993。
在重组产生系统中用作为宿主的甲基营养型酵母的发展是缓慢的，其部分原因是由于缺乏合适的材料(例如启动子、选择性标记以及突变体宿主细胞)和方法(如转化技术)。大多数高度发展的甲基营养型宿主系统利用巴斯德毕赤酵母和多形汉逊酵母(Faber等，Curr.Genet.25:305-310,1994；Cregg等，同上；Romanos等，同上；美国专利号4,855,242；美国专利号4,857,467；美国专利号4,879,231以及美国专利号4,929,555)。
本领域仍然需要转化甲基营养型酵母的其它物种的方法，以及需要利用所转化的细胞来产生具有经济重要性的多肽，包括工业酶和药物蛋白质。本发明提供了在这些过程中有用的组合物和方法以及其它的相关优点。
发明概要
本发明提供了将DNA分子导入甲醇毕赤酵母细胞的方法和按照这些方法转化的细胞。
在本发明的一个方面中，所说的方法包括在线性DNA分子的存在下，使甲醇毕赤酵母细胞暴露于呈指数衰变的，场强为2.5～4.5kV/cm且时间常数为1～40毫秒的脉冲电场中，由此将DNA分子导入细胞。在本发明的一个实施方案中，DNA分子包括编码一种多肽的节段，所说的多肽不是甲醇毕赤酵母多肽，可操作地连接到甲醇毕赤酵母基因转录启动子和甲醇毕赤酵母基因转录终止子上。在优选的实施方案中，转录启动子是甲醇毕赤酵母AUG1基因启动子，在一个实施方案中，该启动子包含如SEQ ID NO:2中所示的核苷酸24至核苷酸1354的核苷酸序列。该DNA分子可进一步包含补充宿主细胞中的突变的选择性标记基因。在一个实施方案中，选择性标记基因是甲醇毕赤酵母基因，如甲醇毕赤酵母ADE2基因。
在本发明的第二个方面中，提供了用异源DNA转化甲醇毕赤酵母的方法，该方法包括在异源线性DNA分子的存在下，使甲醇毕赤酵母细胞的群体暴露于呈指数衰变的，场强为2.5～4.5kV/cm且时间常数为1-40毫秒的脉冲电场中，由此将异源DNA导入至少一部分群体中，回收DNA已导入其中的细胞。在本发明的一个实施方案中，每毫克异源DNA回收103～105个细胞。在另一个实施方案中，每毫克异源DNA回收0.9×104～1.1×104个细胞。在进一步的实施方案中，该方法还包括从回收的细胞回收整合转化体的步骤，如通过在以山梨糖醇作为碳源的生长培养基中培养细胞。在附加的实施方案中，细胞群体处于早期对数期生长。
在其它方面中，本发明提供了用以上公开的方法转化的甲醇毕赤酵母细胞。
一旦参考下列详细描述和附图，本发明的这些和其它方面将变得明显。
附图简要描述
图1说明电场强度和脉冲持续时间对甲醇毕赤酵母的电穿孔效率的影响。
图2是在质粒pCZR140和甲醇毕赤酵母基因组DNA之间的重组过程的示意图。
图3是质粒pCZR137和甲醇毕赤酵母基因组DNA之间的重组过程的示意图。
发明详细描述
在更详细地阐明本发明之前，先定义在本文中使用的某些术语是有用的：
＂早期对数期生长＂是在培养中的细胞生长期，其时的细胞浓度为2×106个细胞/ml至8×106个细胞/ml。
＂异源DNA＂指的是一个DNA分子或者一群DNA分子，这些DNA分子并不天然存在于给定的宿主细胞中。与特定宿主细胞异源的DNA分子可以包含得自该宿主细胞物种的DNA，只要宿主DNA与非宿主DNA结合。例如，一般认为可操作地连接到宿主DNA节段(包含转录启动子)上的DNA分子(包含编码多肽的非宿主DNA节段)是异源DNA分子。
＂整合转化体＂是异源DNA已经引入其中的细胞，其中的异源DNA已整合到该细胞的基因组DNA中。
＂线型DNA＂意指具有自由5′和3′末端的DNA分子，该DNA分子是非环状DNA分子。线型DNA可以由闭合环状DNA分子(如质粒)通过酶促消化或者物理破裂制得。
术语＂可操作地连接的＂意指DNA节段得到排列，以便它们一致实现其预期的目的，例如转录以启动子开始并且通过编码节段进行到终止子。
如上所述，本发明提供了制备具有营养缺陷型突变的甲醇毕赤酵母细胞的方法。可以用同源DNA(来源于宿主物种的DNA)和异源DNA来转化甲醇毕赤酵母的营养缺陷型突变体，并且所产生的转化体可以用于大量的不同生物应用中。本发明的突变细胞尤其能很好地适合于用异源DNA的转化，其中转化的细胞可以用来产生多肽和蛋白质，包括高级生物体(包括人类)的多肽和蛋白质。可以用其它DNA分子(包括DNA文库和合成DNA分子)转化营养缺陷型甲醇毕赤酵母细胞。因此本发明提供了这样一种宿主细胞，该宿主细胞可以用来表达基因多样化的文库，从而产生对于新的生物活性筛选出的产品，该宿主细胞可以在基因工程中用作为化合物文库筛选的靶，还可以得到基因修饰，从而提高它们在其它方法中的利用。
甲醇毕赤酵母菌株可得自美国典型培养物保藏中心(Rockville,MD)和其它储存处，并且可以在本发明中用作为原材料。在本发明的一个实施方案中，用异源DNA转化的细胞一般具有一个突变，该突变可以为在异源DNA分子上的基因(＂选择性标记＂)所互补。这一选择性标记使所转化的细胞得以在一定条件下生长，该条件即其中的未转化细胞不能成倍增加(＂选择性的条件＂)。选择的一般原则是本领域所熟知的。通常利用的选择性标记是编码合成氨基酸或者核苷酸所要求的酶的基因。在这些基因中有突变的细胞(营养陷型突变体)在缺乏特异性氨基酸或者核苷酸的培养基中不能生长，除非突变为选择性标记所互补。这样的＂选择性＂培养基的利用确保在宿主细胞之内的异源DNA的稳定维持。用于甲醇毕赤酵母中的这一类型的优选的选择性标记是甲醇毕赤酵母ADE2基因，该基因编码磷酸核糖基-5-氨基咪唑羧化酶(AIRC；EC 4.1.1.21)。当ADE2基因转化到ade2宿主细胞中时，该基因使细胞在缺少腺嘌呤的情况下得以生长。代表性甲醇毕赤酵母ADE2基因序列的编码链显示在SEQ ID NO:1中。所说明的序列包括5′-非编码序列的1006个核苷酸和3′-非编码序列的442个核苷酸，它们在核苷酸1007-1009都具有起始ATG密码子。在本发明的优选实施方案中，包含核苷酸407-2851的DNA节段用作为选择性标记，虽然也能利用更长或更短的节段(只要编码部分可操作地连接到启动子和终止子序列上)。本领域技术人员将认识到：本文提供的这一序列与其它序列表示各自基因的单一等位基因，并且期望等位变异存在。任何功能性ADE2等位基因都可以用于本发明中。可以用于本发明中的其它营养性标记包括甲醇毕赤酵母ADE1、HIS3以及LEU2基因，这些基因允许在分别缺少腺嘌呤、组氨酸和亮氨酸的情况下进行选择。异源基因(如得自其它真菌的基因)也可以用作为选择性标记。对于大规模的工业方法(其中需要最大限度地减少对甲醇的利用)来说，优选的是利用其中两个甲醇利用基因(AUG1和AUG2)缺失的宿主细胞。对于分泌的蛋白质的产生来说，缺乏液泡蛋白酶基因(PEP4和PRB1)的宿主细胞是优选的。可以用已知方法(如定点诱变)制备基因缺损的突变体。可以基于与它们的对应物酿酒酵母的同源性来克隆甲醇毕赤酵母基因。基于这样的同源性给出本文所揭示的ADE2基因的定义。
在本发明的另一个实施方案中，使用显性选择性标记，从而排除了对突变宿主细胞的需要。显性选择性标记是能对野生型细胞提供生长优势的标记。典型的显性选择性标记是对抗生素，如新霉素型抗生素(例如，G418)，潮霉素B，和博来霉素/腐草霉素型抗生素(例如，ZeocinTM,可得自Invitrogen Corp.,San Diego,CA)具有抗性的基因。用于甲醇毕赤酵母的优选的显性选择性标记是Sh bla基因，该基因抑制ZeocinTM的活性。
在本发明中使用电穿孔促进DNA导入甲醇毕赤酵母细胞。电穿孔法是这样一种方法，其利用瞬时透化细胞膜的脉冲电场，使大分子(如DNA)得以进入细胞。已有文献报道了与哺乳动物的(例如Neumann等，EMBOJ.1:841-845,1982)和真菌的(例如Meilhoc等，生物/技术，8:223-227,1990)宿主细胞一起利用的电穿孔法。然而，对于DNA转移进入细胞的真正机理并不充分了解。对于甲醇毕赤酵母的转化，人们已发现：当细胞暴露于指数衰减的脉冲电场(具有2.5至4.5kV/cm的电场强度和1至40毫秒的时间常数(τ))中时，电穿孔法是极为有效的。时间常数τ被定义为初始的峰值电压V0降至V0/e值时所需的时间。可以按照脉冲电路的总电阻与电容的乘积来计算时间常数，即τ=R×C。典型地，可以由用户预置或者选择电阻以及电容，这取决于所选择的电穿孔法设备。在任何情况下，按照制造厂商提供的上述电场强度和衰减参数的说明书来配置设备。电穿孔法设备由供应商(例如BioRad实验室，Hercules,CA)提供。
一般将用于转化甲醇毕赤酵母的DNA分子制备成双链的环状质粒，优选地，该质粒在转化之前被线性化。对于多肽或者蛋白质产生，除以上描述的选择性标记外，DNA分子还包括表达盒，其包含转录启动子、编码感兴趣的多肽或者蛋白质的DNA节段(如cDNA)以及转录终止子。将这些元件可操作地连接在一起，从而提供感兴趣的DNA节段的转录。优选的是，启动子与终止子是甲醇毕赤酵母基因的启动子与终止子。
特别优选的启动子是甲醇毕赤酵母醇利用基因(AUG1)的启动子。其代表性编码链序列显示在SEQ ID NO:2中。在SEQ ID NO:2中，起始ATG密码子位于核苷酸1355-1357。SEQ ID NO:2的核苷酸1-23是非AUG1多接头序列。特别优选的是利用包含SEQ ID NO:2的核苷酸24-1354的节段作为启动子，虽然附加的上游序列也可以包括在内。甲醇毕赤酵母含有第二个醇利用基因AUG2，该基因的启动子可以用于本发明中。其它的有用启动子包括那些二羟基丙酮合酶(DHAS)、甲酸脱氢酶(FMD)和过氧化氢酶(CAT)基因的启动子。DNA分子还包含使鉴定、选择和转化体维持得以实现的选择性标记。DNA分子还可以含有附加的元件，这样的复制起点和选择性标记使在交替宿主(例如大肠杆菌)中的DNA的扩增和维持得以实现。为了有利于DNA整合到宿主染色体中，优选的是DNA分子具有侧连在宿主DNA序列的两端的整个表达节段，包含启动子--感兴趣基因--终止子以及选择性标记。通过在表达节段的下游末端上包含3′未翻译DNA序列以及依赖于在5′末端上的启动子序列，可以便利地实现这一目的。当利用线型DNA时，表达节段将侧连切割位点，从而使分子得以线性化和使表达节段得以与其它序列(例如细菌复制起点和选择性标记)分离。优选的这样的切割位点是那些为不经常在DNA序列中切割的限制性内切酶所识别的切割位点，如那些识别8-碱基靶序列的切割位点(如NotⅠ)。
可以在甲醇毕赤酵母中产生的蛋白质包括工业和药物上感兴趣的蛋白质。这样的蛋白质包括得自植物和动物(尤其是如哺乳动物的脊椎动物)的高级真核蛋白质，虽然某些来源于微生物的蛋白质也具有很高的价值。可以利用本发明方法制备的蛋白质包括酶(如脂酶、纤维素酶和蛋白酶)；酶抑制剂(包括蛋白酶抑制剂)；生长因子(如血小板衍生的生长因子、成纤维细胞生长因子和表皮生长因子)；细胞因子(如促红细胞生成素和血小板生成素)以及激素(如胰岛素、leptin和胰高血糖素)。
为了在本发明中使用，在大约25-35℃温度下，在包含充分碳源、氮源以及痕量营养物质的培养基中培养甲醇毕赤酵母细胞。由常规手段(如摇动小瓶或者喷射发酵罐)用充分通气来提供液体培养物。优选的培养基是YEPD(表1)。可以通过在新鲜培养基中稀释使细胞传代，或者细胞可以在冷冻之下在平板上短期存储。对于长期存储，细胞优选在-70℃下保持在50％甘油溶液中。
                           表1YEPD
2％D-葡萄糖
2％BactTM蛋白胨(Difco实验室，底特律，MI)
1％BactoTM酵母提取物(Difco实验室)
0.004％腺嘌呤
0.006％L-亮氨酸ADED
0.056％-Ade-Trp-Thr粉
0.67％无氨基酸的酵母氮基质
2％D-葡萄糖
0.5％200X色氨酸、苏氨酸溶液ADEDS
0.056％-Ade-Trp-Thr粉
0.67％无氨基酸的酵母氮基质
2％D-葡萄糖
0.5％200X色氨酸、苏氨酸溶液
18.22％D-山梨糖醇LEUD
0.052％-Leu-Trp-Thr粉
0.67％无氨基酸的酵母氮基质
2％D-葡萄糖
0.5％200X色氨酸、苏氨酸溶液HISD
0.052％-His-Trp-Thr粉
0.67％无氨基酸的酵母氮基质
2％D-葡萄糖
0.5％200X色氨酸、苏氨酸溶液URAD
0.056％-Ura-Trp-Thr粉
0.67％无氨基酸的酵母氮基质
2％D-葡萄糖
0.5％200X色氨酸、苏氨酸溶液URADS
0.056％-Ura-Trp-Thr粉
0.67％无氨基酸的酵母氮基质
2％D-葡萄糖
0.5％200X色氨酸、苏氨酸溶液
18.22％D-山梨糖醇-Leu-Trp-Thr
通过结合以下物质所制得的粉状物：4.0g腺嘌呤、3.0g精氨酸、5.0g天冬氨酸、2.0g组氨酸、6.0g异亮氨酸、4.0g赖氨酸、2.0g甲硫氨酸、6.0g苯丙氨酸、5.0g丝氨酸、5.0g酪氨酸、4.0g尿嘧啶以及6.0g缬氨酸(所有L-氨基酸)-His-Trp-Thr粉
通过结合以下物质所制得的粉状物：4.0g腺嘌呤、3.0g精氨酸、5.0g天冬氨酸、6.0g异亮氨酸、8.0g亮氨酸、4.0g赖氨酸、2.0g甲硫氨酸、6.0g苯丙氨酸、5.0g丝氨酸、5.0g酪氨酸、4.0g尿嘧啶以及6.0g缬氨酸(所有L-氨基酸)-Ura-Trp-Thr粉
通过结合以下物质所制得的粉状物：4.0g腺嘌呤、3.0g精氨酸、5.0g天冬氨酸、2.0g组氨酸、6.0g异亮氨酸、8.0g亮氨酸、4.0g赖氨酸、2.0g甲硫氨酸、6.0g苯丙氨酸、5.0g丝氨酸、5.0g酪氨酸以及6.0g缬氨酸(所有L-氨基酸)-Ade-Trp-Thr粉
通过结合以下物质所制得的粉状物：3.0g精氨酸、5.0g天冬氨酸、2.0g组氨酸、6.0g异亮氨酸、8.0g亮氨酸、4.0g赖氨酸、2.0g甲硫氨酸、6.0g苯丙氨酸、5.0g丝氨酸、5.0g酪氨酸、4.0g尿嘧啶以及6.0g缬氨酸(所有L-氨基酸)200X色氨酸、苏氨酸溶液
3.0％L-苏氨酸、0.8％在H2O中的L-色氨酸对于平板，加入1.8％BactoTM琼脂(Difco实验室)
优选在早期的对数期生长中的细胞上进行甲醇毕赤酵母的电穿孔法。在固体培养基(优选为固体YEPD)上将细胞划线培养为单一菌落。在30℃下生长大约2天之后，利用得自新鲜平板的单一菌落来接种所需量的丰富培养基(如YEPD)而使细胞密度达到大约5-10×105细胞/ml。在大约25-35℃(优选为30℃)下通过剧烈摇动来培养细胞，直到它们处于早期对数期。然后通过如3000×g的2-3分钟离心来收获细胞，并再悬浮该细胞。通过还原细胞壁中的二硫键、在离子溶液(适合电穿孔法条件)中平衡它们以及冷却它们，使细胞处于电感受态(electrocompetent)。典型地，通过在pH6-8缓冲液(包含还原剂，如二硫苏糖醇(DTT)或者β-巯基乙醇(BME))中培养它们，使细胞处于电感受态，以还原细胞壁蛋白质而有利于尔后的对DNA的摄取。就这一点来说，优选的培养缓冲液是pH7.5的、包含25mM DTT的50mM磷酸钾缓冲剂的新鲜溶液。在大约30℃下在这一缓冲液(典型地是利用原培养量的五分之一)中培养细胞大约5-30分钟，优选为大约15分钟。然后收获细胞并在合适的电穿孔缓冲液(其利用时是经过用冰预冷的)中洗涤该细胞。基于这一考虑，合适的缓冲液包括包含弱缓冲剂、二价阳离子(如Mg++、Ca++)和渗透稳定剂(例如食糖)的pH6-8溶液。在洗涤之后，将细胞再悬浮于小量的缓冲液中，其时间为达到电感受态的时间，并且该细胞可以被直接利用或者等分和存储在冻结(优选为-70℃)下。优选的电穿孔缓冲液是STM(270mM蔗糖、10mMTris、pH7.5、1mM MgCl2)。在优选的方案中，使细胞接受两次洗涤，首先用原培养量的用冰预冷的缓冲液，然后用一半原培养量。在第二次洗涤之后，收获并再悬浮细胞，典型地是利用大约3-5ml缓冲液(对于200ml原培养量)。
利用少量电感受态细胞(典型地为大约100μl)和至多十分之一量的线型DNA分子，实施电穿孔法。例如，使0.1ml的在缓冲液中的细胞悬浮液(其离子强度不超过50mM)与0.1-10μg的DNA(体积≤10μl)混合。将这一混合液放置在用冰预冷的电穿孔小池中，并且使之受于呈指数衰减的脉冲电场，电场强度为2.5至4.5kV/cm，优选为大约3.75kV/em，时间常数为1至40毫秒，优选为10-30毫秒，更优选为15-25毫秒，最优选为大约20毫秒。为了达到所需脉冲参数，所利用的实际设备设置由所利用的设备决定。当利用具有2mm电穿孔小池的BioRad(Hercules,CA)Gene PulserTM电穿孔仪时，电阻设为600欧姆或者更大，优选为＂无穷大＂电阻值，而电容则设为25μF，以便获得所需电场特征。在脉冲之后，将细胞稀释大约10X而成为1ml YEPD肉汤，并在30℃下将其温育一小时。
然后收获细胞并将其平板接种在选择性培养基上。在优选的实施方案中，用少量(等于稀释量的电穿孔细胞)的1X酵母氮基质(6.7g/L无氨基酸的酵母氮基质，Difco实验室，底特律，MI)一次性洗涤细胞，并且将其平板接种在基本选择性培养基上。可以将具有ade2突变的细胞(已经用ADE2选择性标记转化过)平板接种在缺乏腺嘌呤的基本培养基(如ADED(表1)或者ADEDS(表1))上。用典型的方法，可以将细胞的250μl等分平板接种在4个单独ADED或者ADEDS平板上，以便选择Ade+细胞。
甲醇毕赤酵母识别某些极少存在的序列，即所谓的作为DNA复制起点的自主复制序列(ARS)，这些序列可以偶然地发生于用来转化的DNA分子中，使转化DNA得以保持在染色体外。然而。整合转化体一般优选用于蛋白质产生系统中。在包含山梨糖醇作为碳源的选择性培养基上，整合转化体具有超过ARS转化体的极强生长优势，由此提供了用于从所转化的细胞群体中选择整合转化体的方法。已经发现ARS序列存在于ADE2基因中，并且也有可能存在于甲醇毕赤酵母的AUG1基因中。用ADE2基因转化的甲醇毕赤酵母的ade2宿主细胞因此可以通过至少两种不同的方式成为Ade+。在ADE2基因中的ARS可以使转化DNA的不稳定染色体外维持得以存在(Hiep等，酵母，9:1189-1197,1993)。这样的转化体的菌落的特征为缓慢的生长速率和粉红颜色(由于所谓的Ade-子代的大量产生所致)。转化DNA也可以整合入宿主基因组中，产生快速生长的、白色的以及不能产生可检测量Ade-子代的稳定转化体。ADE D平板使所转化的细胞得以最迅速地生长，并且不稳定和稳定转化体也以大致相同的速率生长。在30℃下在ADED平板上温育3-5天之后，稳定转化体菌落是白色的，并且大致是不稳定的粉红色转化体的大小的两倍。ADE DS平板对于稳定转化体更是选择性的，该转化体在5-7天之后形成大(≈5mm)菌落，而不稳定(ARS保持)菌落则小得多(≈1mm)。因此更具选择性的ADEDS培养基优选鉴定和选择稳定转化体。对于一些应用，如从遗传多样性文库中筛选遗传因子的稀有组合，有时需要筛选大量的不稳定转化体，人们已观察到不稳定转化体的数量超过稳定转化体的数量大约100倍。在这样的情况中，本领域技术人员将认识到平板接种在较少选择性培养基(如ADED)上转化体细胞的用途。
整合转化体优选用于蛋白质产生方法中。可以增殖这样的细胞而无需连续选择性的压力，这是因为DNA很少从基因组中失去。可以由Southern印迹分析确认DNA整合到宿主染色体中。简言之，用限制性核酸内切酶消化转化的和未转化的宿主DNA，电泳分离之，将其印迹到支持膜上，以及用适当的宿主DNA节段探测之。在未转化的和转化的细胞中观测到的片段模式的不同预示有整合转化。可以选择限制酶和探针以便在基因组片段中确定转化DNA节段(如启动子、终止子、异源DNA以及选择性标记序列)。
异源蛋白质表达水平的不同产生于这样一些因子，如整合位点和表达盒的拷贝数以及各个分离物之间的启动子活性方面的不同。因此在选择产生菌株之前根据不同表达水平筛选一些分离物是有利的。有各种合适的筛选方法可供使用。例如，使转化体菌落生长在用结合蛋白质的膜(例如硝酸纤维素)覆盖的平板上。通过分泌或者其后的裂解以及与膜的结合，可以使蛋白质从细胞中释放出来。然后可以利用已知方法(包括免疫测定)分析结合的蛋白质。通过在液体培养基中适当地培养细胞以及适当地分析条件培养基或者细胞溶胞产物，可以获得更精确的表达水平分析。从培养基和溶胞产物中浓缩和纯化蛋白质的方法部分地由感兴趣的蛋白质决定。这样的方法易于由技术人员选择和实践。
对于小规模的蛋白质生产(例如平板或者摇瓶生产)来说，在存在甲醇以及缺乏干扰量的其它碳源(例如葡萄糖)的情况下，使携带包含甲醇调节的启动子(如AUG1启动子)的表达盒的甲醇毕赤酵母转化体生长。对于小规模的实验(包括表达水平的初步筛选)，可以使转化体在固体培养基上在30℃下生长，该固体培养基包含，例如20g/LBacto琼脂(Difco)、6.7g/L无氨基酸(Difco)的酵母氮基质、10g/L甲醇、0.4μg/L生物素以及0.56g/L-Ade-Thr-Trp粉。因为甲醇是易挥发的碳源，所以它在长时间温育时容易损失。通过在倒置平板的盖子上放置50％的甲醇水溶液，可以连续不断地供给甲醇，由此蒸发传输将甲醇转移到生长细胞上。总的来说，每100mm平板利用不到1mL的甲醇。利用生长在摇瓶中的培养物可以进行稍大规模的实验。用一典型方法，在如上所述的基本甲醇平板上在30℃下培养细胞两天，然后，将菌落用来接种少量的基本甲醇培养基(6.7g/L无氨基酸的酵母氮基质、10g/L甲醇、0.4μg/L生物素)，其细胞密度为大约1×106个细胞/ml。使细胞在30℃下生长。生长在甲醇上的的细胞有高的需氧量，并需要在培养期间进行剧烈摇动。每日补充甲醇(典型地为每天1/100量的50％甲醇)。
对于生产规模培养，用摇瓶制备高产量克隆的新鲜培养物。然后，所产生的培养物用来在发酵罐中接种培养基。典型地，通过剧烈振荡，在YEPD(在30℃下生长1-2天)中的500ml培养物用来接种5升发酵罐。在pH5.0下在28℃下使细胞生长在合适的培养基(包含盐、葡萄糖、生物素和痕量元素以及＞30％的溶解氧)中。在消耗了(以耗氧量减少作为指示)初填充的葡萄糖之后，将葡萄糖/甲醇进料传送到容器中以便引起感兴趣的蛋白质的产生。因为在限制碳条件下实现大规模的发酵，所以葡萄糖在进料中的存在并不阻抑甲醇诱导型启动子。
本发明由下列非限制性实施例进一步说明。实施例实施例1
通过UV暴露来诱变甲醇毕赤酵母细胞(来源于美国典型培养物保藏中心的CBS6515菌株，Rockville,MD)。通过以大约200-250个细胞/平板将细胞接种在几个平板上，首先产生致死曲线。然后，利用悬挂在离平板表面25cm处的G8T5杀菌灯(Sylvania)，将平板暴露于UV辐射下，持续时间如表2所示。然后保护平板以免可见光源照射并在30℃下温育两天。
                         表2
                     可存活的细胞时间                 平板1       平板2      平均值0秒                   225         229        2271秒                   200         247        2232秒                   176         185        1814秒                   149         86         1188秒                   20          7          1416秒                  0           2          1
然后利用2秒UV暴露进行大规模诱变，以提供大约20％的杀死。以大约104个细胞/平板将细胞平板接种在八个YEPD平板上，这些平板用尿嘧啶、腺嘌呤和亮氨酸(每种物质各为100mg/L)进行补充，补加这些物料以便给可能的缺乏有关营养物质的营养缺陷型生长补料。在UV暴露之后，用箔包裹这些平板，并在30℃下温育一夜。第二天，将平板上的菌落(总共为大约105)再悬浮于水中，并用水洗涤一次。足以给出0.1-0.2OD600的一定量细胞悬浮液用来接种500ml基本肉汤(用无氨基酸或者无氨的酵母氮基质制得)，其中用1％葡萄糖和400μg/L生物素补料。将培养物放置在2.8L折流板式Bell瓶(baffled Bell flask)中，并且在30℃下剧烈振荡一夜。第二天，细胞达到大约1.0-2.0OD600。使细胞成球状，并将其再悬浮于500ml的以5g/L硫酸铵补料的基本肉汤中。将细胞悬浮液放置在2.8L折流板式Bell瓶中，并在30℃下剧烈振荡6个小时。将50ml培养物放置在250ml瓶中而搁置在一边作为对照，并且在其余部分的培养物中加入1mg制霉菌素(Sigma化学公司，St.Louis,MO)，以便选择营养突变体(Snow，自然，211:206-207,1966)。通过振荡附加的一小时来温育培养物。然后由离心收获对照细胞和制霉菌素处理过的细胞，并用水洗涤三次。再悬浮所洗涤的细胞从而在50％甘油中得到1.0OD600并冻结之。以菌落形成单位表示的制霉菌素处理过的细胞相对于对照细胞的滴定揭示：制霉菌素富集使可存活细胞的数量减少了104倍。
将制霉菌素处理过的细胞的10-2稀释液平板接种在15YEPD平板上。将菌落复制铺板于基本平板(2％琼脂，1X YNB,2％葡萄糖，400μg/L生物素)上。营养缺陷型的频率为大约2-4％。挑选大约180个营养缺陷型菌落至YEPD+Ade,Leu,Ura平板中，并将其复制铺板于各种点滴(dropout)平板上。所有营养缺陷型都是Ade-。其中的30个在点滴平板上呈现出显著的粉红色(LEUD,HISD等：参见表1)。在30个粉红色突变体中，选择21个进行进一步的研究，余者对于在ADED平板上的生长是渗漏的或者为野生型细胞所污染。
然后对Ade-突变体进行互补分析和表型检验。为了确定由突变体限定的基因座的数量，将所有21个突变体配对成单一粉红色的Ade-检验菌株(菌株2#)。通过混合细胞悬浮液(OD600=1)以及把混合物的10μl等分试样平板接种在YEPD平板上，来实现配对。然后将细胞复制到SPOR培养基(0.5％乙酸钠，1％KCl,1％葡萄糖，1％琼脂)上，并在30℃下温育一夜。然后将细胞复制铺板于ADED平板上以评价表型。正如表3所示，一些突变体组合没有给出Ade+菌落(可能限定与菌株#2中的相同的遗传基因座)，而其它突变体组合则产生许多Ade+菌落(可能限定单独的遗传基因座)。因为当与#2配对时，突变体#3给出Ade+菌落，所以用突变体#3重复互补检验。如果该组突变体限定两个遗传基因座，那么当与#3配对时，所有突变体(当与菌株#2配对时，其没有给出Ade+菌落)都应该给出Ade+菌落。杂交的结果显示在表3中。
            表3
突变体 ×突变体#2 ×突变体#3
#1 + -
#3 + -
#10 + -
#15 + -
#18 + -
#24 + -
#28 + -
#30 + -
#2 - +
#6 - +
#8 - +
#9 - +
#11 - +
#17 - +
#19 - +
#20 - +
#22 - +
#27 - +
#4 + +
#12 + +
#16 + +
正如表3所示，大多数突变体属于两组之一，这与有两种腺嘌呤生物合成基因(当缺失时，其在有限腺嘌呤培养基上产生粉红色菌落)的想法一致。三个菌落(#4、#12和#16)可以限定第三基因座或显示出基因内互补。选择来源于两互补组之每一组的两种具有强烈色素形成的突变体(#3和#10；#6和#11)进一步鉴定。附加的分析表明Ade-是存在于这些菌株中的唯一营养缺陷体。
用载体pRS426(一种包含2μ和酿酒酵母URA3序列的穿梭载体，其中的URA3序列使载体pRS426得以在酿酒酵母中增殖)构建甲醇毕赤酵母克隆库。按照标准方法由菌株CBS6515制备基因组DNA。简言之，在丰富培养基中培养细胞一夜，用酶解酶原生质球化，以及用SDS裂解。用乙醇从溶胞产物中沉淀DNA，并用苯酚/氯仿混合物提取之，然后用乙酸铵和乙醇沉淀。DNA制备物的凝胶电泳显示出完整的高分子量DNA和可观数量的RNA的存在。通过当该酶的一系列稀释液存在时培养该DNA，用Sau3A部分消化DNA。由电泳分析消化液的样品，以便确定片段的大小分布。从凝胶上切割下在4和12kb之间迁移的DNA，并从凝胶切片上提取之。然后将大小分级的DNA连接到已用Bam HⅠ消化过和用碱性磷酸酶处理过的pRS426上。按照制造厂商推荐的方法，利用BioRad Gene PulserTM装置，在大肠杆菌MC1061细胞中电穿孔反应混合物的等分试样。
基因组文库用来由电穿孔法(Becker和Guarente，酶学方法，194:182-187,1991)转化酿酒酵母菌株HBY21A(ade2 ura3)。使细胞再悬浮于1.2M山梨糖醇中，并将六个300μl的等分试样平板接种在ADE D、ADE DS、URA D以及URA DS平板(表1)上。在30℃下温育平板4-5天。在ADE D或者ADE DS平板上没有回收到任何Ade+菌落。将得自URA D和URA DS平板的菌落复制铺板于ADE D平板上，可获得两个紧密相间的白色菌落。再划线这些菌落，并确定其为Ura+和Ade+。将这两种命名为Ade1和Ade6的菌株划线在包含5FOA(5氟代乳清酸；Sikorski和Boeke，酶学方法，194:302-318)的培养基上。获得复制铺板时发现为Ade-的Ura-菌落。这些结果表明：Ade+互补活性被基因连接到携带质粒的URA3标记上。得自酵母菌株Ade1和Ade6的质粒似乎与如下所描述的限制性酶切作图一致。将这些基因组克隆分别命名为pADE1-1和pADE1-6。
将总DNA与HBY21A转化体Ade1和Ade6分离，并将其用来转化大肠杆菌菌株MC1061为AmpR。由Ade1的2个AmpR菌落和Ade6的3个AmpR菌落制备DNA。用PstⅠ、ScaⅠ和PstⅠ+ScaⅠ消化DNA，并由凝胶电泳分析之。所有五个分离物产生相同的限制图谱。
由甲醇毕赤酵母P ADE2基因(也称作为ADE1；Hiep等，酵母，9:1251-1258,1993)的公布序列设计PCR引物。引物9080(SEQ ID NO:3)设计为在ADE2 DNA(SEQ ID NO:Ⅰ)的406-429碱基上引导，引物9079(SEQ ID NO:4)设计为在2852-2829碱基上引导。所包含的两种引物不能在扩增序列两端引入AvrⅡ和SpeⅠ位点。所产生的PCR片段大小的预测值为2450bp。
以五个推定的ADE2克隆作为模板利用质粒DNA进行PCR。100μl反应混合物包含1xTaq PCR缓冲液(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)、10-100ng质粒DNA、0.25mM dNTPs、100pmol的每种引物以及1μl Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)。PCR包括在94℃下进行30次30秒的循环、在50℃下进行30次60秒的循环、在72℃下进行30次120秒的循环。五个推定的ADE2基因组克隆之每一个都产生所需大小(2.4kb)的PCR产物。当用BglⅡ或者SalⅠ消化时，得自一个反应的DNA片段的限制性酶切图给出所需大小的片段。
集中阳性PCR反应物并用SpeⅠ消化之。用SpeⅠ消化载体pRS426,并用牛小肠磷酸酶处理之。利用常规连接条件在10μl反应混合物中使4μlPCR片段与1μl载体DNA结合。由凝胶电泳分析所连接的DNA。分析SpeⅠ消化液以便确定携带在pRS426之内的ADE2基因的亚克隆的质粒。将正确的质粒命名为pCZR118。
因为已由PCR扩增了pCZR118中的ADE2基因，所以有可能的是，可以产生使基因的功能特性不能存在的突变。为了检验这样的突变，将具有所需插入片段的亚克隆单独地转化到酿酒酵母菌株HBY2lA中。使细胞处于电感受态，并按照标准方法转化之。将转化体平板接种在URA D和ADE D平板上。三个表型组得到鉴定。克隆1、2、11和12在ADED上产生许多健壮生长的转化体。转化频率与Ura+转化体的频率相当。克隆6、8、10和14也给出向Ura+和Ade+的高效率的转化，但是Ade+菌落比那些在第一组中的菌落稍小。克隆3产生许多Ura+菌落，但不产生Ade+菌落，这表明克隆3携带非功能性ade2突变。集中克隆1、2、11、和12。
为了确定甲醇毕赤酵母ade2互补组，用克隆的ADE基因转化得自每个互补组的两个代表性突变体(#3和#10；#6和#11)，该突变体，当其生长在限制腺嘌呤上时，基于深红色素形成进行选择。由离心(3000xg,3分钟)收获早期对数期细胞的200ml培养物，并将其再悬浮于20ml的新鲜KD缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液，pH7.5，包含25mM DTT)。在30℃下在这一缓冲液中温育细胞15分钟。然后收获细胞，并将其再悬浮于200ml用冰预冷的STM(270mM蔗糖，10mM Tris,pH7.5,1mMMgCl2)中。收获细胞，并将其再悬浮于100ml用冰预冷的STM中。再一次收获细胞，并将其再悬浮于3-5ml用冰预冷的STM中。然后使来源于每种培养物的电感受态细胞的100μl的等分试样与NotⅠ消化的pADE1-1DNA混合。将细胞/DNA混合物放置在2mm电穿孔小池中，并利用设置为1000Ω电阻和25μF电容的BioRad Gene PulserTM使该混合物受于5kV/cm的脉冲电场中。在脉冲之后，通过加入1ml YEPD来稀释细胞，并在30℃下温育一小时。然后由和缓离心收获细胞，并再悬浮于缺乏腺嘌呤的400μl基本选择性培养基(ADED)中。将再悬浮样品分成200μl的等分试样，并将其平板接种在ADED和ADEDS平板上。在30℃下温育平板4-5天。突变体#6和#11给出Ade+转化体。当DNA被省略时，没有观察到任何Ade+转化体，因此，两个分离物似乎限定ade2互补组。ADE2序列显示在SEQ ID NO:1中。实施例2
实施例1中所揭示的甲醇毕赤酵母克隆库用作为克隆醇利用基因(AUG1)的源。克隆库作为独立库存储，其中每个库表示大约200-250个个体基因组克隆。来源于每个库的0.1μl＂小量制备＂DNA在利用PCR引物(8784,SEQ ID NO:5；8787,SEQ ID NO:6)的聚合酶链反应中用作为模板，该PCR引物由在多形汉逊酵母、博伊丁假丝酵母和巴斯德毕赤酵母的醇氧化酶基因中的保守序列的排列来设计。扩增反应进行如下：在94℃下30个30秒的循环，在50℃下30个30秒的循环，在72℃下30个60秒的循环；随后在72℃下温育7分钟。一个库(#5)给出大约600bp带。这一PCR产物的DNA测序揭示：它编码这样一种氨基酸序列，该氨基酸序列与为AOX1基因所编码的巴斯德毕赤酵母醇氧化酶之间有大约70％的序列等同性，与为MOX1基因所编码的多形汉逊酵母醇氧化酶之间有大约85％的序列等同性。克隆的AUG1基因的序列显示在SEQ IDNO:2中。
利用与初始扩增中所用的相同的引物由PCR分析#5库的亚库。进一步分解一个阳性亚库以便确定阳性菌落。在平板上划线这一阳性菌落，并由个体菌落制备DNA。在用ClaⅠ消化之后，三个菌落给出同一模式。
基因组克隆和PCR产物的限制性酶切图揭示：AUG1基因位于7.5kb基因组插入片段上，并且在PCR片段之内的位点可以在基因组插入片段之内得到独一无二的确定。因为在PCR片段之内的基因的取向是已知的，因此后一条信息提供在基因组插入片段之内的AUG1基因的近似位置和转录方向。在这一区域之内的DNA测序揭示基因在氨基酸水平上与其它已知的醇氧化酶基因之间有十分高的序列相似性。实施例3
用包含AUG1启动子和终止子、人GAD65 DNA(Karlsen等，美国国家科学院院报，88:8337-8341,1991)以及ADE2选择性标记的表达载体，基本上按照如上所述的过程，由电穿孔法转化ade2突变的甲醇毕赤酵母细胞。使菌落在琼脂基本甲醇平板(每100mm平板10至100个菌落)上形成膜片，该平板包含20g/L BactoTM琼脂(Difco)、6.7g/L无氨基酸的酵母氮基质(Difco)、10g/L甲醇以及0.4μg/L生物素。用硝酸纤维素覆盖琼脂，并将平板倒置在包含1ml 50％甲醇(在水中)的盖子上，并在30℃下温育3至5天。然后将膜转移至浸泡在0.2M NaOH、0.1％SDS、35mM二硫苏糖醇中的滤器上以便裂解粘着细胞。在30分钟之后，用蒸馏水从滤器冲洗下细胞碎片，并通过在0.1M乙酸中冲洗30分钟来中和滤器。
然后分析滤器中的粘着蛋白质。通过在室温下在TTBS-NFM(20mMTris pH7.4,0.1％Tween 20,160 mM NaCl,5％的无脂牛奶粉)中漂洗30分钟，封阻未占据的结合位点。然后将滤器转移到包含GAD6单克隆抗体(Chang和Gottlieb,J.Neurosci,8:2123-2130,1988)的溶液中，该单克隆抗体在TTBS-NFM中的稀释比率为1∶1000。在该抗体溶液中对滤器进行伴有至少一小时的和缓搅拌的温育，然后用TTBS(20mM TrispH7.4,0.1％Tween 20,160mM NaCl)洗涤两次，每次五分钟。然后用与辣根过氧化物酶(1μg/ml TTBS-NFM)缀合的山羊抗小鼠抗体温育滤器至少一小时，然后用TTBS洗涤滤器三次，每次5分钟。然后使滤器暴露于市售的化学发光试剂(ECLTM；Amersham Inc.,Arlington Heigths,IL)下。在X光胶卷上检测由阳性膜片产生的光线。
为了更精确地检测GAD65表达的水平，在摇瓶培养物中培养候选克隆。按照如上所述的方法，使菌落在30℃下在基本甲醇平板上生长两天。菌落用来接种20ml基本甲醇培养基(6.7g/L的无氨基酸的酵母氮基质、10g/L甲醇、0.4μg/L生物素)，其细胞密度为1×106个细胞/毫升。在剧烈振荡下使培养物在30℃下生长1-2天。每日在每种培养物中加入0.2ml的50％甲醇。由离心收获细胞，并且将其悬浮于用冰预冷的裂解缓冲液(20mM Tris pH8.0,40mM NaCl,2mM PMSF,1mM EDTA,1μg/ml亮抑蛋白酶肽，1μg/ml胃蛋白酶抑制剂，1μg/ml抑蛋白酶肽)中，其终体积为每g细胞糊状物10ml裂解缓冲液。将2.5ml所产生的悬浮液加入至2.5ml的400-600微米的、用冰预冷的、酸洗涤过的玻璃珠(其置于15ml容器中)中，并剧烈搅拌混合物一分钟，然后在冰上温育1分钟。重复这一过程直到细胞已经被搅拌了总共五分钟。由离心(1000xg,5分钟)除去大的碎片和未被打碎的细胞。然后将澄清的溶胞产物倒入一个干净的容器中。用样品缓冲液(5％SDS,8M尿素，100mM Tris pH6.8,10％甘油，2mM EDTA,0.01％溴酚蓝)稀释澄清的溶胞产物，并在4-20％丙烯酰胺梯度凝胶(Novex,San Diego,CA)上电泳。将蛋白质印迹到硝酸纤维素上，并用如上所述的GAD6抗体检测之。
在高细胞密度发酵条件下，对在摇瓶培养中显示出甲醇诱导的外源蛋白质的最高表达水平的克隆进行更深入的分析。首先在剧烈搅拌下在30℃下在0.5升YEPD肉汤中培养细胞1-2天，然后利用其来接种5升发酵装置(例如BioFlowⅢ；New Brunswick Scientific Co.,Inc.,Edison,NJ)。首先通过加入57.8g(NH4)2SO4、68gKH2PO4、30.8gMgSO4·7H2O、8.6gCaSO4·2H2O、2.0gNaCl以及10ml消泡剂(PPG)，用矿物盐来填装发酵容器。加入H2O以形成2.5L体积，并将溶液高压灭菌40分钟。在冷却之后，加入350ml的50％葡萄糖、250ml的10X痕量元素(表4)、25ml的200μg/ml生物素以及250ml细胞接种物。
                       表410X痕量元素：
FeSO4·7H2O    100mM    27.8g/L
CuSO4·5H2O    2mM      0.5g/L
ZnCl2           8mM      1.09g/L
MnSO4·H2O     8mM      1.35g/L
CoCl2·6H2O    2mM      0.48g/L
Na2MoO4·2H2O 1mM      0.24g/L
H3BO3          8mM      0.5g/L
KI                0.5mm    0.08g/L
生物素                     5mg/L
硫胺素                     0.5g/L每升加入1-2毫升H2SO4以便使化合物形成溶液
将发酵容器设置在28℃、pH5.0和＞30％溶氧量下运行。细胞将消耗初始的葡萄糖填装物(这由消耗葡萄糖期间的需氧量急剧增加表明)，其后，在葡萄糖被耗尽之后耗氧量减少。在初始的葡萄糖填装物用尽之后，将补加有NH4 +和痕量元素的葡萄糖-甲醇进料输送到容器中，其中0.2％(w/v)葡萄糖、0.2％(w/v)甲醇进料5个小时，其后为0.1％(w/v)葡萄糖、0.4％(w/v)甲醇进料25小时。以纯甲醇计，利用12.5ml/hr的初始输送速率和25ml/hr的最终速率通过容器的一个端口供给总共550克甲醇。利用包含175克葡萄糖、250ml 10X痕量元素以及99g(NH4)2SO4的700ml溶液，通过第二个端口供给葡萄糖。在这些条件下，葡萄糖和甲醇同时得到利用，并且伴随一旦葡萄糖-甲醇进料开始，就诱导GAD65表达。按照如上所述的用于摇瓶培养的方法，分析得自发酵容器的细胞的GAD65表达。
以一定时间间隔从发酵容器移去细胞，并随后对其进行分析。在利用葡萄糖的生长期间观察到低GAD65表达。葡萄糖的耗尽导致GAD65蛋白质的低水平表达；在发酵培养物的进料期间通过加入MeOH可提高表达水平。甲醇的加入对由甲醇反应性AUG1启动子驱动的人GAD65的表达有明显的刺激作用。实施例4
研究转化条件以便确定最适于甲醇毕赤酵母的有效转化的电场条件、DNA拓扑结构以及DNA浓度。所有实验都利用甲醇毕赤酵母ade2菌株#11。按照如前所述方法制备感受态细胞。利用BioRad GenePulserTM实施电穿孔法。
三个电场参数影响电穿孔的转化效率：电容、电场强度和脉冲持续时间。电场强度由电脉冲的电压决定，而脉冲持续时间则由仪器设置的电阻决定。在这一组实验中，检查了一组在各种电阻下的电场强度设置。在所有实验中，都利用了仪器的最高电容设置(25μF)。在冰上使电感受态细胞的100μl等分试样与10μlDNA混合，该DNA包含大约1μg的ADE2质粒pCZR133，该质粒已用限制酶NotⅠ线性化。将细胞和DNA转移到2mm的电穿孔小池(BTX Corp.,San Diego,CA)中，并使之接受电场强度为0.5kV(2.5kV/cm)、0.75kV(3.75kV/cm)、1.0kV(5.0kV/cm)、1.25kV(6.25kV/cm)以及1.5kV(7.5kV/cm)的电脉冲。在各种脉冲持续时间下检查这些场强条件。通过将仪器电阻改变为200欧姆、600欧姆或者＂无穷大＂欧姆值来调控脉冲持续时间。将脉冲过的细胞悬浮于YEPD中，并在30℃下温育一小时，并收获、再悬浮和平板接种之。进行三组独立的实验。在每一组中都发现：相比于所检验的其它条件，在＂无穷大＂欧姆值的电阻下的0.75kV(3.75kV/cm)的电穿孔条件给出极高的转化效率(参见图1)。
在建立最适脉冲条件之后，研究DNA拓扑结构对转化效率的影响。使电感受态细胞与1μg未切割的环状pCZR133混合，或者与1μgNotⅠ消化的pCZR133混合。在三个单独的实验中，用环状DNA回收平均大约25个转化体，而线型DNA产生平均近1×104个转化体。这些数据表明：相比于环状DNA，线型DNA以大得多的效率转化甲醇毕赤酵母。
最后，研究DNA浓度和转化效率之间的关系。使线型pCZR133 DNA的等分试样(1ng、10ng、100ng和1μg，在10μl水中)与100μl电感受态细胞混合，并在3.75kV/cm和＂无穷大＂欧姆值下实施电穿孔法。转化体的数量变化于大约10(1ng DNA)至104(1μgDNA)之间，并且发现该数量与DNA浓度成正比。实施例5
通过比较来源于野生型细胞和稳定的白色转化体菌落的DNA，检测到转化DNA整合进入甲醇毕赤酵母的基因组。鉴定出两类整合转化体。在第一类中，发现转化DNA整合进入同源位点。在第二类中，发现转化DNA取代内源性AUG1开放读框。虽然不希望被理论所束缚，但一般认为第二类转化体的出现是“置换型重组事件”(Rothstein，酶学方法，194:281-301,1991)，其中转化DNA经由双重组事件取代内源性DNA。
用AspⅠ消化过的pCZR140将甲醇毕赤酵母ade2菌株#11转化成为Ade+,pCZR140即一种基于Bluescript(Stratagene克隆系统，La Jolla,CA)的载体，该载体包含甲醇毕赤酵母ADE2基因和AUG1的突变体，其中在启动子和终止子区域之间的整个开放读框都已被缺失(图2)。由野生型细胞和在30℃下在YEPD平板上生长两天的转化体细胞制备基因组DNA。将大约100-200μl细胞悬浮于1ml H2O中，然后在微量离心机中离心30秒。回收细胞沉淀，并将其再悬浮于400μl SCE+DTT+酶解酶(1.2M山梨糖醇，10mM柠檬酸钠，10mM EDTA,10mM DTT,1-2mg/ml酶解酶100T)中，并在37℃下温育10-15分钟。加入400μl的1％SDS，并混合溶液直到澄清。加入300μl的5M乙酸钾(pH8.9)，混合溶液并在微量离心机中以全速离心五分钟。将750μl上清液转移到一新试管中，并用等体积苯酚/氯仿提取之。回收600μl所产生的上清液，并通过加入2倍体积的乙醇和在冷室中离心15分钟来沉淀DNA。在65℃下，在50mlTE(10mM Tris pH8,1mM EDTA)+100μg/ml RNA酶中，将DNA沉淀再悬浮大约1小时。在37℃下，用在100μl反应量中的Eco RⅠ(5μl)消化10μl DNA样品一夜。用乙醇沉淀DNA，由离心回收之，并将其再悬浮于7.5μl TE+2.5μl 5X加样染料中。将全部10ml量施用于在0.5XTBE(10 X TBE是108g/L Tris碱7-9,55g/L硼酸，8.3g/L EDTA二钠)凝胶中的0.7％琼脂糖的一条泳道上。在包含溴化乙锭的0.5 X TBE中在100V下运行凝胶。给凝胶拍照，并在400mA、20mV下用30分钟将DNA电泳转移到正衍生的尼龙膜(NytranN+,Schleicher&Schuell,Keene,NH)上。然后用2 X SSC冲洗该膜，该膜在变性溶液上印迹五分钟，用2 X SSC中和，然后在UV交联剂(Stratalinker,Stratagene克隆系统)中根据其自动设置交联阻尼。利用市售的试剂盒(ECLTM试剂盒，Amersham Corp.,Arlington Heigthts,IL)，使印迹杂交到PCR产生的AUG1启动子探针上。结果表明：转化DNA改变AUG1启动子DNA的结构，这与同源整合事件(图2)一致。
在第二个实验中，用NotⅠ消化过的pCZR137将甲醇毕赤酵母ade2菌株#11转化成为Ade+,pCZR137即在AUG1启动子和终止子之间包含人GAD65cDNA的载体(图3)。按照如上所述的方法，由野生型细胞和稳定的白色Ade+转化体制备基因组DNA，并用Eco RⅠ消化之。由电泳分离出所消化的DNA，并且将其印迹到膜上。用由PCR产生的、与AUG1开放读框或者AUG1启动子对应的探针探测印迹。结果显示：在转化体菌株中缺失AUG1开放读框DNA，并且AUG1启动子区域已经历过显著的重排。这些结果与转化DNA和宿主基因组之间的双重组事件(置换型)(图3)一致。
按照以上所述，明显的是：虽然为了说明本发明本文描述了本发明的具体实施方案，但是可以对其进行各种修饰而不偏离本发明的精神与范围。因此，除所附的权利要求书的限定外，本发明无其它限制。
                        序列表(1)一般信息：
(ⅰ)申请人：Raymond,Christopher K.
            Holderman,Susan D.
            Vanaja,Erica
(ⅱ)发明名称：甲醇毕赤酵母的转化
(ⅲ)序列数：6
(ⅳ)通讯地址：
    (A)收信人：ZymoGenetics,Inc.
    (B)街道：1201 Eastlake Avenue East
    (C)城市：Seattle
    (D)州：WA
    (E)国家：美国
    (F)ZIP:98102
(ⅴ)计算机可读形式：
    (A)介质类型：软盘
    (B)计算机：IBM PC兼容机
    (C)操作系统：DOS
    (D)软件：FastSEQ 1.5版
(ⅵ)当前申请数据：
    (A)申请号：
    (B)申请日：
    (C)分类：
(ⅷ)律师/代理人信息：
    (A)姓名：Parker,Gary E
    (B)登记号：31,648
    (C)参考/证书号：95-37
(ⅸ)联系信息：
    (A)电话：206-442-6673
    (B)传真：206-442-6678(2)关于SEQ ID NO:1的信息
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：3077个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：双链
    (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假拟：无
(ⅳ)反义：无
(ⅴ)片段类型：
(ⅵ)最初来源：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1：CAGCTGCTCT GCTCCTTGAT TCGTAATTAA TGTTATCCTT TTACTTTGAA CTCTTGTCGG    60TCCCCAACAG GGATTCCAAT CGGTGCTCAG CGGGATTTCC CATGAGGTTT TTGACAACTT   120TATTGATGCT GCAAAAACTT TTTTAGCCGG GTTTAAGTAA CTGGGCAATA TTTCCAAAGG   180CTGTGGGCGT TCCACACTCC TTGCTTTTCA TAATCTCTGT GTATTGTTTT ATTCGCATTT   240TGATTCTCTT ATTACCAGTT ATGTAGAAAG ATCGGCAAAC AAAATATCAA CTTTTATCTT   300GAACGCTGAC CCACGGTTTC AAATAACTAT CAGAACTCTA TAGCTATAGG GGAAGTTTAC   360TGCTTGCTTA AAGCGGCTAA AAAGTGTTTG GCAAATTAAA AAAGCTGTGA CAAGTAGGAA   420CTCCTGTAAA GGGCCGATTC GACTTCGAAA GAGCCTAAAA ACAGTGACTA TTGGTGACGG   480AAAATTGCTA AAGGAGTACT AGGGCTGTAG TAATAAATAA TGGAACAGTG GTACAACAAT   540AAAAGAATGA CGCTGTATGT CGTAGCCTGC ACGAGTAGCT CAGTGGTAGA GCAGCAGATT   600GCAAATCTGT TGGTCACCGG TTCGATCCGG TCTCGGGCTT CCTTTTTTGC TTTTTCGATA   660TTTGCGGGTA GGAAGCAAGG TCTAGTTTTC GTCGTTTCGG ATGGTTTACG AAAGTATCAG   720CCATGAGTGT TTCCCTCTGG CTACCTAATA TATTTATTGA TCGGTCTCTC ATGTGAATGT   780TTCTTTCCAA GTTCGGCTTT CAGCTCGTAA ATGTGCAAGA AATATTTGAC TCCAGCGACC   840TTTCAGAGTC AAATTAATTT TCGCTAACAA TTTGTGTTTT TCTGGAGAAA CCTAAAGATT   900TAACTGATAA GTCGAATCAA CATCTTTAAA TCCTTTAGTT AAGATCTCTG CAGCGGCCAG    960TATTAACCAA TAGCATATTC ACAGGCATCA CATCGGAACA TTCAGAATGG ACTCGCAAAC   1020TGTCGGGATT TTAGGTGGTG GCCAACTTGG TCGTATGATC GTTGAAGCTG CACACAGATT   1080GAATATCAAA ACTGTGATTC TCGAAAATGG AGACCAGGCT CCAGCAAAGC AAATCAACGC   1140TTTAGATGAC CATATTGACG GCTCATTCAA TGATCCAAAA GCAATTGCCG AATTGGCTGC   1200CAAGTGTGAT GTTTTAACCG TTGAGATTGA ACATGTTGAC ACTGATGCGT TGGTTGAAGT   1260TCAAAAGGCA ACTGGCATCA AAATCTTCCC ATCACCAGAA ACTATTTCAT TGATCAAAGA   1320TAAATACTTG CAAAAAGAGC ATTTGATTAA GAATGGCATT GCTGTTGCCG AATCTTGTAG   1380TGTTGAAAGT AGCGCAGCAT CTTTAGAAGA AGTTGGTGCC AAATACGGCT TCCCATACAT   1440GCTAAAATCT AGAACAATGG CCTATGACGG AAGAGGTAAT TTTGTTGTCA AAGACAAGTC   1500ATATATACCT GAAGCTTTGA AAGTTTTAGA TGACAGGCCG TTATACGCCG AGAAATGGGC   1560TCCATTTTCA AAGGAGTTAG CTGTTATGGT TGTGAGATCA ATCGATGGCC AAGTTTATTC   1620CTACCCAACT GTTGAAACCA TCCACCAAAA CAACATCTGT CACACTGTCT TTGCTCCAGC   1680TAGAGTTAAC GATACTGTCC AAAAGAAGGC CCAAATTTTG GCTGACAACG CTGTCAAATC   1740TTTCCCAGGT GCTGGTATCT TTGGTGTTGA AATGTTTTTA TTACAAAATG GTGACTTATT   1800AGTCAACGAA ATTGCCCCAA GACCTCACAA TTCTGGTCAC TATACCATCG ACGCTTGTGT   1860CACCTCGCAA TTTGAAGCTC ATGTTAGGGC CATTACTGGT CTACCCATGC CGAAGAACTT   1920CACTTGTTTG TCGACTCCAT CTACCCAAGC TATTATGTTG AACGTTTTAG GTGGCGATGA   1980GCAAAACGGT GAGTTCAAGA TGTGTAAAAG AGCACTAGAA ACTCCTCATG CTTCTGTTTA   2040CTTATACGGT AAGACTACAA GACCAGGCAG AAAAATGGGT CACATTAATA TAGTTTCTCA   2100ATCAATGACT GACTGTGAGC GTAGATTACA TTACATAGAA GGTACGACTA ACAGCATCCC   2160TCTCGAAGAA CAGTACACTA CAGATTCCAT TCCGGGCACT TCAAGCAAGC CATTAGTCGG   2220TGTCATCATG GGTTCCGATT CGGACCTACC AGTCATGTCT CTAGGTTGTA ATATATTGAA   2280GCAATTTAAC GTTCCATTTG AAGTCACTAT CGTTTCCGCT CATAGAACCC CACAAAGAAT   2340GGCCAAGTAT GCCATTGATG CTCCAAAGAG AGGGTTGAAG TGCATCATTG CTGGTGCTGG   2400TGGTGCCGCT CATTTACCGG GAATGGTTGC GGCGATGACG CCGCTGCCTG TTATTGGTGT   2460CCCTGTTAAA GGCTCTACTT TGGATGGTGT TGATTCACTA CACTCCATCG TTCAAATGCC   2520AAGAGGTATT CCTGTTGCTA CTGTGGCTAT TAACAATGCT ACTAACGCTG CCTTGCTAGC   2580TATCACAATC TTAGGTGCCG GCGATCCAAA TACTTGTCTG CAATGGAAGT TTATATGAAC   2640AATATGGAAA ATGAAGTTTT GGGCAAGGCT GAAAAATTGG AAAATGGTGG ATATGAAGAA   2700TACTTGAGTA CATACAAGAA GTAGAACCTT TTATATTTGA TATAGTACTT ACTCAAAGTC   2760TTAATTGTTC TAACTGTTAA TTTCTGCTTT GCATTTCTGA AAAGTTTAAG ACAAGAAATC   2820TTGAAATTTC TAGTTGCTCG TAAGAGGAAA CTTGCATTCA AATAACATTA ACAATAAATG   2880ACAATAATAT ATTATTTCAA CACTGCTATA TGGTAGTTTT ATAGGTTTGG TTAGGATTTG   2940AGATATTGCT AGCGCTTATC ATTATCCTTA ATTGTTCATC GACGCAAATC GACGCATTTC   3000CACAAAAATT TTCCGAACCT GTTTTTCACT TCTCCAGATC TTGGTTTAGT ATAGCTTTTG   3060ACACCTAATA CCTGCAG                                                  3077(2)关于SEQ ID NO:2的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：3386个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：双链
    (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假拟：无
(ⅳ)反义：无
(ⅴ)片段类型：
(ⅵ)最初来源：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2：GAATTCCTGC AGCCCGGGGG ATCGGGTAGT GGAATGCACG GTTATACCCA CTCCAAATAA     60AAGTGTAGTA GCCGGACTGA AAGGTTTTAG GAGTCTGTTT GTTTGTTCAT GTGCATCATT    120CCCTAATCTG TTAACAGTCT CGGAGTATAC AAAAAAGTAA GTCAAATATC AAGGTGGCCG    180GGGGCAGCAT CGAGACTCGA GATGGTACAT ACTTAAAAGC TGCCATATTG AGGAACTTCA    240AAGTTTTATC TGTTTTTAGA ATTAAAAGAC GATTGTTGTA ACAAAACGTT GTGCCTACAT    300AAACTCAAAT TAATGGAAAT AGCCTGTTTT GAAAAATACA CCTTCTTAAG TACTGACAAA    360GTTTTGTTAA ATGACTATCG AACAAGCCAT GAAATAGCAC ATTTCTGCCA GTCACTTTTA    420ACACTTTCCT GCTTGCTGGT TGACTCTCCT CATACAAACA CCCAAAAGGG AAACTTTCAG    480TGTGGGGACA CTTGACATCT CACATGCACC CCAGATTAAT TTCCCCAGAC GATGCGGAGA    540CAAGACAAAA CAACCCTTTG TCCTGCTCTT TTCTTTCTCA CACCGCGTGG GTGTGTGCGC    600AGGCAGGCAG GCAGGCAGCG GGCTGCCTGC CATCTCTAAT CGCTGCTCCT CCCCCCTGGC    660TTCAAATAAC AGCCTGCTGC TATCTGTGAC CAGATTGGGA CACCCCCCTC CCCTCCGAAT    720GATCCATCAC CTTTTGTCGT ACTCCGACAA TGATCCTTCC CTGTCATCTT CTGGCAATCA    780GCTCCTTCAA TAATTAAATC AAATAAGCAT AAATAGTAAA ATCGCATACA AACGTCATGA    840AAAGTTTTAT CTCTATGGCC AACGGATAGT CTATCTGCTT AATTCCATCC ACTTTGGGAA    900CCGCTCTCTC TTTACCCCAG ATTCTCAAAG CTAATATCTG CCCCTTGTCT ATTGTCCTTT    960CTCCGTGTAC AAGCGGAGCT TTTGCCTCCC ATCCTCTTGC TTTGTTTCGG TTATTTTTTT   1020TTCTTTTGAA ACTCTTGGTC AAATCAAATC AAACAAAACC AAACCTTCTA TTCCATCAGA   1080TCAACCTTGT TCAACATTCT ATAAATCGAT ATAAATATAA CCTTATCCCT CCCTTGTTTT   1140TTACCAATTA ATCAATCTTC AAATTTCAAA TATTTTCTAC TTGCTTTATT ACTCAGTATT   1200AACATTTGTT TAAACCAACT ATAACTTTTA ACTGGCTTTA GAAGTTTTAT TTAACATCAG   1260TTTCAATTTA CATCTTTATT TATTAACGAA ATCTTTACGA ATTAACTCAA TCAAAACTTT   1320TACGAAAAAA AAATCTTACT ATTAATTTCT CAAAATGGCT ATTCCAGATG AATTTGATAT   1380TATTGTTGTC GGTGGTGGTT CCACCGGTTG TGCTCTTGCT GGTAGATTAG GTAACTTGGA   1440CGAAAACGTC ACAGTTGCTT TAATCGAAGG TGGTGAAAAC AACATCAACA ACCCATGGGT   1500TTACTTACCA GGTGTTTATC CAAGAAACAT GAGATTAGAC TCAAAGACTG CTACTTTTTA   1560CTCTTCAAGA CCATCACCAC ACTTGAACGG TAGAAGAGCT ATTGTTCCAT GTGCTAACAT   1620CTTGGGTGGT GGTTCTTCCA TCAACTTCTT GATGTACACC AGAGCCTCTG CCTCCGATTA   1680CGATGATTGG GAATCTGAAG GTTGGACTAC CGATGAATTA TTACCACTAA TGAAGAAGAT   1740TGAAACTTAT CAAAGACCAT GTAACAACAG AGAATTGCAC GGTTTCGATG GTCCAATTAA   1800GGTTTCATTT GGTAACTATA CTTATCCAAA CGGTCAAGAT TTCATTAGAG CTGCCGAATC   1860TCAAGGTATT CCATTTGTTG ATGATGCTGA AGATTTGAAA TGTTCCCACG GTGCTGAGCA   1920CTGGTTGAAG TGGATCAACA GAGACTTAGG TAGAAGATCC GATTCTGCTC ATGCTTACAT   1980TCACCCAACC ATGAGAAACA AGCAAAACTT GTTCTTGATT ACTTCCACCA AGTGTGAAAA   2040GATTATCATT GAAAACGGTG TTGCTACTGG TGTTAAGACT GTTCCAATGA AGCCAACTGG   2100TTCTCCAAAG ACCCAAGTTG CTAGAACTTT CAAGGCTAGA AAGCAAATTA TTGTTTCTTG   2160TGGTACTATC TCATCACCAT TAGTTTTGCA AAGATCTGGT ATCGGTTCCG CTCACAAGTT   2220GAGACAAGTT GGTATTAAAC CAATTGTTGA CTTACCAGGT GTTGGTATGA ACTTCCAAGA   2280TCACTACTGT TTCTTCACTC CATACCATGT CAAGCCAGAT ACTCCATCAT TCGATGACTT   2340TGTTAGAGGT GATAAAGCTG TTCAAAAATC TGCTTTCGAC CAATGGTATG CTAACAAGGA   2400TGGTCCATTA ACCACTAATG GTATTGAGGC AGGTGTTAAG ATTAGACCAA CTGAAGAAGA   2460ATTAGCCACT GCTGATGACG AATTCAGAGC TGCTTATGAT GACTACTTTG GTAACAAGCC   2520AGATAAGCCA TTAATGCACT ACTCTCTAAT TTCTGGTTTC TTTGGTGACC ACACCAAGAT   2580TCCAAACGGT AAGTACATGT GCATGTTCCA CTTCTTGGAA TATCCATTCT CCAGAGGTTT   2640CGTTCACGTT GTTTCTCCAA ACCCATACGA TGCTCCTGAC TTTGATCCAG GTTTCATGAA   2700CGATCCAAGA GATATGTGGC CAATGGTTTG GTCTTACAAG AAGTCCAGAG AAACTGCCAG   2760AAGAATGGAC TGTTTTGCCG GTGAAGTTAC TTCTCACCAC CCACACTACC CATACGACTC   2820ACCAGCCAGA GCTGCTGACA TGGACTTGGA AACTACTAAA GCTTATGCTG GTCCAGACCA   2880CTTTACTGCT AACTTGTACC ACGGTTCATG GACTGTTCCA ATTGAAAAGC CAACTCCAAA   2940GAACGCTGCT CACGTTACTT CTAACCAAGT TGAAAAACAT CGTGACATCG AATACACCAA   3000GGAGGATGAT GCTGCTATCG AAGATTACAT CAGAGAACAC ACTGAAACCA CATGGCATTG   3060TCTTGGTACT TGTTCAATGG CTCCAAGAGA AGGTTCTAAG GTTGTCCCAA CTGGTGGTGT   3120TGTTGACTCC AGATTAAACG TTTACGGTGT TGAAAAGTTG AAGGTTGCTG ATTTATCAAT   3180TTGCCCAGAT AATGTTGGTT GTAACACTTA CTCTACTGCT TTGTTAATCG GTGAAAAGGC   3240TTCTACCTTA GTTGCTGAAG ACTTGGGCTA CTCTGGTGAT GCTTTGAAGA TGACTGTTCC   3300AAACTTCAAA TTGGGTACTT ATGAAGAAGC TGGTCTAGCT AGATTCTAGG GCTGCCTGTT   3360TGGATATTTT TATAATTTTT GAGAGT                                        3386(2)关于SEQ ID NO:3的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：38个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3：TGATCACCTA GGACTAGTGA CAAGTAGGAA CTCCTGTA                 38
(2)关于SEQ ID NO:4的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：39个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ IDNO:4：CAGCTGCCTA GGACTAGTTT CCTCTTACGA GCAACTAGA                39(2)关于SEQ ID NO:5的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：17个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5：TGGTTGAAGTGGATCAA                                         17(2)关于SEQ ID NO:6的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：17个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6：GTGTGGTCACCGAAGAA                                         17

Claims (22)

1．一种将DNA分子导入甲醇毕赤酵母细胞的方法，该方法包括在线性DNA分子的存在下，使甲醇毕赤酵母细胞暴露于呈指数衰变的，场强为2.5-4.5kV/cm，且时间常数为1-40毫秒的脉冲电场中，由此将所说的DNA分子导入所说的细胞。
2．根据权利要求1的方法，其中所说的DNA分子包含编码一种多肽的节段，所说的多肽不是甲醇毕赤酵母多钛，可操作地连接到甲醇毕赤酵母基因转录启动子和甲醇毕赤酵母基因转录终止子上。
3．根据权利要求2的方法，其中所说的转录启动子是甲醇毕赤酵母AUG1基因启动子。
4．根据权利要求3的方法，其中所说的AUG1基因启动子包含如SEQ IDNO：2所示的核苷酸24至核苷酸1354的核苷酸序列。
5．根据权利要求2的方法，其中所说的DNA分子进一步包含补充宿主细胞中的突变的选择性标记基因。
6．根据权利要求5的方法，其中所说的选择性标记基因是甲醇毕赤酵母基因。
7．根据权利要求5的方法，其中所说的标记基因是甲醇毕赤酵母ADE2基因。
8．根据权利要求7的方法，其中所说的ADE2基因包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸407至核苷酸2851的核苷酸序列。
9．根据权利要求1的方法，其中所说的DNA分子包含补充宿主细胞中的突变的选择性标记基因。
10．根据权利要求9的方法，其中所说的标记基因是甲醇毕赤酵母基因。
11．根据权利要求9的方法，其中所说的标记基因是甲醇毕赤酵母ADE2基因。
12．根据权利要求11的方法，其中所说的ADE2基因包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸407至核苷酸2851的核苷酸序列。
13．根据权利要求1的方法，其中所说的时间常数为10-30毫秒。
14．一种用异源DNA转化甲醇毕赤酵母的方法，该方法包括在异源线性DNA分子的存在下，使甲醇毕赤酵母细胞的群体暴露于呈指数衰变的，场强为2.5-4.5kV/cm且时间常数为1-40毫秒的脉冲电场中，由此将所说的异源DNA导入至少一部分所说的群体，并回收所说的DNA已导入基中的细胞。
15．根据权利要求14的方法，其中每毫克异源DNA回收103-105个细胞。
16．根据权利要求15的方法，其中每毫克异源DNA回收0.9×104-1.1×104个细胞。
17．根据权利要求14的方法，该方法进一步包括从所说的回收的细胞回收整合转化体的步骤。
18．根据权利要求17的方法，其中所说的回收步骤包括在以山梨糖醇为碳源的生长培养基中培养所说的细胞。
19．根据权利要求14的方法，其中所说的细胞群体处于早期对数期生长。
20．根据权利要求14的方法，其中所说的时间常数为10-30毫秒。
21．用权利要求1的方法转化的甲醇毕赤酵母细胞。
22．用权利要求6的方法转化的甲醇毕赤酵母细胞。
CN97197501A 1996-07-17 1997-07-14 甲醇毕赤酵母的转化 Pending CN1230997A (zh)

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