CN1214082A - 碱性纤维素酶及其生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了可得自芽孢杆菌属菌种CBS669.93的纤维素酶组合物。一种优选的纤维素酶理论分子量约为63kD,理论等电点约为5以及在40℃和60℃下对CMC的最适pH约为6。

Description

碱性纤维素酶及其生产方法
本发明涉及新的纤维素酶组合物。本发明进一步涉及优选得自芽孢杆菌属菌种(Bacillus sp.)的新纤维素酶组合物。本发明还涉及新纤维素酶在本领域中公认为有益地加入纤维素酶的组合物中的应用，包括作为洗涤剂组合物中的添加剂，用于处理含纤维素的织物，用于处理纸浆和纸以及用于处理供生产高果糖含量淀粉糖浆或乙醇的淀粉。
纤维素酶是能水解纤维素中β-D-葡糖甘键的酶。纤维素分解酶传统上分成三大类：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或纤维生物水解酶(cellobiohydrolases)以及β-葡糖苷酶(Knowles J.等(1987)，TIBTECH 5,255-261)；已知可通过大量细菌、酵母和真菌生产这些酶。
纤维素分解酶的已开发应用领域中的主要应用方面包括：使(木材)纤维素浆降解成糖类供(生物)乙醇生产，织物处理如“石洗(stonewashing)”和“生物抛光(biopolishing)”，以及用于洗涤剂组合物中。例如，已知纤维素酶适用于洗涤剂组合物以除去脏物，即清洁处理。例如，英国申请Nos.2,075,028、2,095,275和2,094,826阐述了掺入纤维素酶的洗涤剂改善的清洁性能。此外，英国申请No.1,358,599阐述了将纤维素酶用于洗涤剂以减小含棉织物的粗糙性。
纤维素酶在处理织物时的另一个有用特征是它们能重整用过的织物而使它们的颜色更光亮。例如，反复洗涤含棉织物会导致织物上浅灰色的色光(cast)，认为这是由于机械作用而引起的原纤维断裂和紊乱的缘故，有时称之为“毛球”。彩色织物上尤其可见到这种浅灰色的色光。因此，纤维素酶除去织物紊乱的表层从而改善织物的整个外观的性能很重要。
尽管本领域中知道具有一些或所有上述性能的许多纤维素酶组合物，但仍需要具有各种特性范围的新纤维素酶，它们例如适用于处理织物，用作洗涤剂组合物的成分，用于处理纸浆和纸，以及用于转化生物量。申请人已发现了这样一些纤维素酶，它们具有这类额外的特性且适用于纤维素酶的这类已知应用场合。
本发明的一个目的是提供具有有益性能的新纤维素酶，它适用于洗涤剂，处理织物以及纸浆和纸的制造。
按本发明，纤维素酶可得自或衍生自芽孢杆菌属菌种CBS 669.93，或是所述纤维素酶的衍生物。CBS 669.93在1993.12.23保藏在真菌菌种保藏中心(CBS),Baam，荷兰，保藏号为CBS 669.93(“CBS669.93”)。优选地，该新纤维素酶包括图2A-2C的氨基酸序列(SEQ.ID NO.1)，或其具有大于58％序列同一性的衍生物，优选具有至少80％序列同一性，更优选具有至少90％序列同一性。本发明还涉及新纤维素酶，它包括图2A-2C的氨基酸序列(SEQ.ID NO.1)，或其具有大于72％序列相似性的衍生物，优选具有至少80％的序列相似性，最优选具有至少90％序列相似性。
按另一个实施方案，提供了包括DNA的组合物，该DNA编码图2A-2C的氨基酸序列(SEQ.ID NO.1)，或其具有大于58％序列同一性的衍生物，优选具有大于80％序列同一性，更优选具有大于90％序列同一性。而且，提供包括DNA的组合物，该DNA编码图2A-2C的氨基酸序列(SEQ.ID NO.1)，或其具有大于72％序列相似性的衍生物，优选具有大于80％序列相似性，更优选具有大于90％序列相似性。
按本发明的另一个实施方案，提供了用编码本发明的氨基酸序列的DNA转化适当的微生物的方法。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，该纤维素酶是得自芽孢杆菌属菌种CBS 669.93、具有约为63kD的理论分子量的纤维素酶。该大约63kD纤维素酶具有约为5的理论等电点以及在40℃和60℃下对CMC约为6的最适pH。
图1显示得自CBS 69.93的大约63kD纤维素酶在40℃和60℃下pH/活性曲线图。
图2A-2C显示得自CBS 669.93的大约63kD纤维素酶的DNA序列(SEQ.ID NO.2)和相应的氨基酸序列(SEQ.ID NO.1)，加下线部分是前导肽序列，它在分泌时被裂解而产生成熟的酶。
“衍生物”是指通过下列方法得自天然蛋白质的蛋白质，即将一个或多个氨基酸加到天然蛋白质的C末端和N末端中的一个或两个末端上，取代天然氨基酸序列中一个或一些不同位点上的一个或多个氨基酸，在天然蛋白质的一端或两端或者在该氨基酸序列中一个或多个位点上缺失一个或多个氨基酸，或者在该天然氨基酸序列中的一个或多个位点上插入一个或多个氨基酸。酶衍生物的制备优选通过如下方法完成，即修饰编码天然蛋白质的DNA序列，将该DNA序列转化到适当的宿主中，再表达该修饰的DNA序列而形成该衍生酶。本发明的衍生物包括这样的肽，即它们包括与前体酶氨基酸序列(例如本发明的野生型或天然态酶)相比已改变的氨基酸序列，且这些肽保持前体酶的特征酶性质但在某些特定方面具有改变了的性能。例如，改变了的纤维素酶可能具有更高的最适pH或更高的温度抗性但保持其特有的纤维素分解活性。衍生物还包括在酶分子内氨基酸残基的化学修饰。
“可得自”芽孢杆菌668.93的纤维素酶指这种纤维素酶，它具有的氨基酸序列相当于可得自该有机体的纤维素酶的氨基酸序列。因此，与得自不同芽孢杆菌的本发明的63kD纤维素酶具有相同氨基酸序列的纤维素酶应“可得自”芽孢杆菌669.93。
“宿主细胞”指这种细胞，它能起宿主和本发明的重组DNA载体的表达载体的作用。在本发明一个优选的实施方案中，“宿主细胞”是指芽孢杆菌属的细胞。
“DNA构建物”或“DNA载体”指这种核苷酸序列，它包括编码上述任何新纤维素酶或纤维素酶衍生物的一个或多个DNA片段。
在一个优选的实施方案中，该纤维素酶得自真菌菌种保藏中心，Baam，荷兰，在布达佩斯条约下于1993.12.23保藏的保藏号CBS 669.93(描述于PCT申请/EP94/04312)。如本文所应用的那样，保藏的菌种将被称为CBS 669.93。在更优选的一个实施方案中，本发明的纤维素酶是得自CBS 669.93的大约63kD纤维素酶(基于成熟蛋白质的氨基酸序列求算的)(本文称为“63kD纤维素酶”)。该大约63kD纤维素酶就成熟蛋白质而言理论pI约为5以及在40℃和60℃下对CMC的最适pH约为6。
编码该大约63kD纤维素酶的氨基酸序列的基因是这样分析的，即应用CAOS/CAMM Center,University of Nijmegen,Holland的方法，通过与各种文库(GenBank,Swiss-Prot,EMBL和PIR)中的可及序列数据比较而分析的。把由本发明的DNA序列编码的纤维素酶与由公开的或已知的纤维素酶基因序列编码的纤维素酶进行比较的数据库检索显示，最大数量的氨基酸同一性见于灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)的纤维素酶CeIB。
采用如Pearson & Lipman在国家科学院院报〔美〕(Proc.Nat.Acad.Sci.),vol.85,pp.2444-2448(1988)中所述的TFastA程序，证实该大约63kD纤维素酶有58％的序列同一性和72％的序列相似性。该TFastA数据检索程序可以序列分析软件包6.0版的形式商购(GeneticComputer Group,Univ.Wisconsin Biotechnology Center,Madison,Wisconsin 53705)。灿烂芽孢杆菌的序列见于Jorgensen等，基因(Gene),vol.93,pp.55-60(1990)。因此，本发明包括这种纤维素酶，它具有图2A-2C的氨基酸序列(SEQ.ID NO.1)或其具有大于58％序列同一性，优选大于80％的序列同一性，最优选大于90％的序列同一性的衍生物。本发明进一步包括这种纤维素酶，它的氨基酸序列与图2A-2C的氨基酸序列(SEQ.ID NO.1)相比具有大于72％的序列相似性，优选大于80％的序列相似性，最优选大于90％的序列相似性。
本发明还公开了生产该纤维素酶的方法。在一个优选的实施方案中，该纤维素酶可通过在便于生产该纤维素酶的条件下培养合适的有机体如芽孢杆菌属菌种CBS 669.93而生产。优选地，这些条件包括通常为培养芽孢杆菌属以最大量地生产纤维素酶而提议的条件，并包括将得自纤维素的底物用作能源同时结合必需的盐、离子和其它熟知的成分。通常，用于培养细胞的培养基可以是适于生长细菌的任意常规的培养基。可将细胞在需氧条件下、含可同化的碳和氮以及其它必需营养物的营养培养基中进行培养。合适的碳源有碳水化合物如蔗糖、葡萄糖和淀粉，或是含碳水化合物的物质如粮谷、麦芽、大米和高梁。掺入培养基的碳水化合物浓度可变范围宽，例如高达25％和低到1-5％、但通常8-10％将是合适的，该百分数是作为葡萄糖的等效量求算的。营养培养基中的氮源可以是无机的和/或有机的氮源。合适的无机氮源有硝酸盐和铵盐。在涉及细菌培养的发酵过程中经常应用的有机氮源有大豆粉、棉籽粉、花生饼粉、酪蛋白、玉米、玉米浸泡液的浓缩物、酵母提取物、脲和白蛋白。此外，营养培养基还应含标准的痕量物质。
纤维素酶可通过常规方法从培养基回收，这类方法包括：通过离心或过滤从培养基分离细胞，如果需要的话，在细胞破裂后应用盐如硫酸铵沉淀上清液或滤液中的蛋白质组分，接着应用各种色谱法如离子交换色谱、亲和色谱或类似的技术上认可的方法纯化。至于本发明的碱性纤维素酶的生产，优选在碱性条件下应用含基于纤维素的能源的培养基进行培养。
优选地，本发明的纤维素酶是这样生产：利用基因工程技术用编码该纤维素酶的基因转化合适的宿主细胞，再在适合宿主细胞生长和纤维素酶表达的条件下进行表达。第一步，该染色体DNA可通过Saito和Miura的方法(Saito & Miura，生物化学与生物物理学学报〔荷〕，vol.72,pp.619(1963))或通过类似方法得自供体细菌菌株。限制酶切割这样获得的染色体DNA而产生含碱性纤维素酶基因的DNA片段。为此目的，任何限制酶，只要不切割所述基因的区域都可应用。在备择方法中，可应用切割该基因的限制酶，但应用更低的酶浓度或更短的培养时间以致只允许部分消化。一种优选的限制酶是Sau3A。从产生的消化混合物中，可分离合适的片段(4-10kb)并应用于用DNA构建物对适当的宿主细胞进行的转化，例如用包括编码本发明的63kD纤维素酶的大约9kbDNA片段和适当的载体序列的DNA构建物。
编码本发明的纤维素酶的基因可应用λ-噬菌体(表达)载体和大肠杆菌(E.coli)宿主细胞来克隆。(也可应用PCR克隆法，它利用保守域上设计的共有引物)。本申请人发现，转化编码本发明的纤维素酶的基因并在大肠杆菌中表达可产生活性蛋白质。在大肠杆菌内的首次克隆步骤之后，可将本发明的纤维素酶基因转移到更优选的工业表达宿主，例如芽孢杆菌属或链霉菌属(Streptomyces)，丝状真菌如曲霉属(Aspergillus)或木霉属(Trichoderma)，或者酵母如酵母属(Saccharomyces)。在这些宿主有机体中能达到的高水平表达和分泌使得纤维素酶在发酵培养基中积累，随后就可从培养基回收它。
优选地，该表达宿主细胞包括芽孢杆菌属菌种，更优选地是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在一个特别优选的实施方案中，该转化宿主缺失蛋白酶基因以保证产物纤维素酶在发酵液或其浓缩物中不遭受蛋白酶解。Ferrari等在美国专利No.5,264,366中提供了关于蛋白酶缺失芽孢杆菌属菌株的一个优选的一般性转化和表达方案，该文献并入本文作参考。还优选地，转化过的芽孢杆菌属宿主的发酵是在约为6.9的pH下进行的。在曲霉属中的转化和表达例如由Berka等描述于美国专利No.5,364,770中，该文献并入本文作参考。当该转化宿主细胞是芽孢杆菌属时，优选的启动子是aprE启动子。
该得自CBS 669.93的大约63kD纤维素酶已被证实在包括甘氨酸、乙酸铵、硼砂和/或Tris的缓冲体系中很有用。也发现了该纤维素酶对CMC的作用可因镁的存在而激活并因钙的存在而抑制。还发现了约250ppm:750ppm的镁与钙之比对活性有益。
按本发明，上述纤维素酶组合物可根据技术上认可的在洗涤剂中使用纤维素酶的方法而应用于洗涤剂组合物中。在碱性pH下该纤维素酶极好的活性应使本纤维素酶特别适用于高pH洗涤剂中。
本发明将在如下实施例中被更详细地阐释，提供这些实施例只是为了阐述而不能认为是限制本发明。
实施例1从碱性土壤和水样品筛选和分离纤维素酶
应用了两种方法从碱性土壤和水样品分离产纤维素酶的微生物。在一种方法中，将土壤和水样品悬浮于0.85％盐水溶液，再直接用于羧甲基纤维素(CMC)-琼脂扩散分析以检测生产纤维素酶的菌落。在第二种方法中，通过在40℃下在含纤维素的液体基本培养基或GAM培养基中培养1～3天使土壤和水样品富集包含纤维素酶的菌株。应用CMC-琼脂扩散分析对显示出细菌生长的培养物分析纤维素酶活性以检测生产纤维素酶的菌落。该CMC-琼脂扩散分析和富集过程利用pH约为9.7的基本培养基制品，该样品包括1％KNO3、0.1％酵母提取物(Difco)、0.1％KH2PO4、0.02％MgSO4·7H2O、1％Na2CO3、4％NaCl和0.25％CMC(Sigma C-4888)。为了固化而加入1.5琼脂。
将两种方法中的哪一个用于该CMC-琼脂扩散分析取决于待测试的是菌落还是液体级分。若测试菌落，将0.85％盐水溶液中的细胞悬浮液涂在含CMC的基本培养基上。在40℃下培养1～3天后，将平板进行复制铺板，用0.1刚果红浸渍亲代板达15分钟。用1M NaCl使平板脱色达30分钟。分离在菌落周围表现为清亮区的菌株作为可能的生产纤维素酶的微生物。这样分析液体级分：吸移40μl酶溶液或发酵液等分样注入培养皿中从一层5mm基本培养基冲出的孔内。在40℃下培养16小时后通过刚果红/NaCl处理检测纤维素酶活性。清亮区的直径是CMC酶活性的量度。
应用两种筛选方法中任一种时表现清亮区的菌株被选出用于逐渐生长并分离纤维素酶。在40℃下250r.p.m的培养箱振荡器(NewBrunswick Scientific,Edison,NJ,USA)中，将菌落在100毫升摇瓶内的25毫升GAM培养基中发酵72小时。在pH9和40℃下测定培养液中CMC酶活性以证实发酵液中纤维素酶的存在。用于生产酶的复合培养基(GAM)包括胨(Difco)0.5％，酵母提取物(Difco)0.5％，葡萄糖·H2O 1％,KH2PO4 0.1％,MgSO4·7H2O 0.02％,Na2CO3 1％,NaCl 4％。用4M HCl 将pH调到9.5，然后加入1％CMC。
应用上述方法，分离生产纤维素酶的微生物并进一步表征为能活动的、细长的杆形细菌，它出现长链且呈丝状外观，或表现为呈“V”形的成对细胞。近末端的孢子是具有清楚的孢子囊膨胀的椭球形物。GAM琼脂上的菌落表现为奶油色、环形、扁平、光滑而发亮，暴露出稍不规则的边缘。基于16S rRNA序列分析，该微生物被归类为芽孢杆菌属的菌种。本文将该有机体称为CBS 669.93，并在该保藏号下保藏在真菌菌种保藏中心，Baam，荷兰。
实施例2
DNA的分离，纤维素酶的转化和表达
选择亲碱性芽孢杆菌属菌株CBS 669.93作为供体菌株用于在大肠杆菌内表达克隆。按Saito & Miura在生物化学与生物物理学学报〔荷〕，vol.72,pp.619-629(1963)中描述的方法分离染色体DNA。
将分离后的染色体DNA通过限制酶Sau3A应用系列稀释的酶溶液部分地消化，是应用React Buffers(Gibco BRL Life Technologies,Gaithersburg,Md.,USA)在供应商建议的条件下在37℃下消化1小时。将消化过的DNA通过琼脂糖凝胶电泳进行分级分离，应用QIAquick GelExtraction Kit按供应商(QIAGEN Inc.,Chatsworth,Ca.USA)描述的方案从凝胶分离合适的级分(4-10kb)。
将染色体DNA的Sau3A片段用于按供应商(Stratagene CloningSystems,La Jolla,Ca.,USA)提供的方案在BamH1消化的CIAP处理过的ZAP Express载体中构建基因组基因文库。把含克隆化DNA插入片段的pBK-CMV噬菌体从该ZAP ExpressTM载体上切除，转化入大肠杆菌菌株XLOLR。
按Wood等在Meth.Enzym.,vol.160,pp.59-74(1988)中描述的方法通过琼脂扩散筛选重组克隆。分离在菌落周围表现为清亮区的菌株。在4*YEP培养基中发酵48小时后测定分离了的重组体的CMC酶活性，所述培养基包括酵母提取物(Difco)4％，蛋白胨(Difco)8％，乳糖0.2％，氨苄青霉素100μg/ml。该重组蛋白质被纯化(实施例3)，测得N端氨基酸序列如下所示：
Asn-Glu-Asp-Val-Lys-Thr-Leu-Asp-Ile-Gln(SEQ.ID NO.3)
应用QIAprep Plasmid Kit按供应商(QIAGEN Inc.)描述的方案分离生产纤维素酶的重组体的质粒DNA。该质粒含染色体DNA的大约9kb插入片段。测定2777bp片段的核苷酸序列，其中把一组得自N端氨基酸序列的简并的寡核苷酸用作确定9kb插入片段上的基因位置的引物。该2777bp片段含有一个1746bp的开放读框，从该读框可推断出574个氨基酸的蛋白质。编码所述纤维素酶的基因的核苷酸序列(SEQ.IDNO.2)和已分离的单一纤维素酶的推断氨基酸序列(SEQ.ID NO.1)示于图2A-2C。
实施例3
纤维素酶的纯化
使得自实施例2的纤维素酶生产菌落在由酵母提取物(Difco)4％、胨(Difco)8％、乳糖0.2％、100μg/ml氨苄青霉素构成的复合培养基(4*YEP)上生长。通过离心(8000rpm)从培养液分离发酵液。用硫酸铵(65％饱和溶液)沉淀上清液中的纤维素酶。将沉淀物溶于25mM磷酸盐缓冲液(pH7)+5mM EDTA，直至达到7mS/cm的电导率。将该溶液加到Q-Sepharose FF(直径5cm，长10cm)阴离子交换柱中，然后用25mM磷酸盐缓冲液(pH7)+5mM EDTA洗涤该柱直至吸光度为0.2AU。在80分钟内对该柱应用0～0.5M NaCl于25mM磷酸盐(pH7)中的梯度。接着在10分钟内应用0.5～1M NaCl的梯度。洗脱发生于第一个梯度中。洗脱后用1M NaOH清洗该柱(上流)，再用25mM磷酸盐(pH7)+5mM EDTA平衡。由洗脱分布曲线而定，所得纤维素酶的纯度高达约80％。
实施例4
本发明的纤维素酶的性能
为测定本发明的大约63kD纤维素酶的pH/温度曲线，在不同的pH和温度值下测定了该纤维素酶对CMC的活性。用10mM磷酸盐缓冲液(pH7)稀释而将包括该大约63kD纤维素酶的溶液与缓冲液合并。(应用包括100ml 1M磷酸、100ml柠檬酸和600ml蒸馏水的混合物的缓冲液控制pH，用4M NaOH将pH调节到4、5、6、7、8、9或10，然后用蒸馏水注入该混合物至1L)。稀释酶溶液直至在pH7和40℃下测得为0.05U/ml。在混合0.5ml Buffer、0.5ml底物(1％CMC)和0.1ml 10mM磷酸盐缓冲液后测定各缓冲体系以获得实际pH。pH4、5、6、7、8、9和10的溶液的实际pH分别为4.2、5.2、6.2、7、8、8.7和9.9。
图1阐明的结果显示该纤维素酶极好的碱活性。校正曲线的斜率取决于该酶底物混合物的pH，为此在各pH下采取两个葡萄糖标准样品即(500mg葡萄糖.H2)/100ml稀释10倍和25倍。
可应用如下修正了的PAHBAH方法(Lever M.分析生物化学〔美〕(Anal.Biochem.),1972,47,273-279和Lever M.，分析生物化学〔美〕,1977,81,21-27)测定纤维素酶活性。可这样测定pH/温度曲线，即应用固定的酶浓度，后者符合在pH7和40℃下测得的剂量响应曲线的线性范围。该酶浓度可用于测定所有其它测定条件下的活性。在一支试管中注入250μl于50mM pH9甘氨酸缓冲液中的2.5％CMC(购自Sigma的低粘度CMC)和250μl该63kD纤维素酶的等分样，用适当的缓冲液稀释。将该试管置于40℃的水浴中保温30分钟，随后加入1.5ml当日新配制的PAHBAH溶液(1％PAHBAH于100ml 0.5M NaOH中)和100ml铋溶液(100ml中含有48.5g硝酸铋、28.2g酒石酸钾钠和12.0gNaOH)。在70℃下将该混合物加热10分钟，然后在冰上冷却2分钟。在410nm处测定吸光度。为消除该酶样品的背景吸收而进行如下对照实验：在与试验试管同样的条件下将盛有底物的试管保温。保温后依次加入1.5ml PAHBAH和该酶制剂。一个单位(U)定义为从CMC等效物产生1μmol葡萄糖所需酶的量，以每分钟每克产物的还原糖而定。

Claims (18)

1．可得自或衍生自芽孢杆菌属菌种CBS 669.93的纤维素酶，或其衍生物。
2．含纤维素酶的组合物，该纤维素酶包括SEQ.ID NO.1的氨基酸序列，或其具有大于58％序列同一性的衍生物。
3．权利要求2的组合物，其中所述纤维素酶具有与SEQ.ID No.1的至少80％序列同一性。
4．权利要求3的组合物，其中所述纤维素酶具有与SEQ.ID No.1的至少90％序列同一性。
5．含纤维素酶的组合物，该纤维素酶包括SEQ.ID NO.1的氨基酸序列，或其具有大于72％序列相似性的衍生物。
6．权利要求5的组合物，其中所述纤维素酶具有至少80％的序列相似性。
7．权利要求5的组合物，其中所述纤维素酶具有至少90％的序列相似性。
8．权利要求1的组合物，其中所述纤维素酶得自芽孢杆菌属菌种CBS 669.93。
9．包括编码权利要求2或5的氨基酸序列的DNA的组合物。
10．包括编码权利要求3或6的氨基酸序列的DNA的组合物。
11．包括编码权利要求4或7的氨基酸序列的DNA的组合物。
12．包括权利要求9的DNA组合物的表达载体。
13．包括权利要求10的DNA组合物的表达载体。
14．包括权利要求11的DNA组合物的表达载体。
15．表达纤维素酶的方法，该方法包括：
(a)用编码权利要求2或5的氨基酸序列的DNA转化适当的微生物；
(b)在适合表达所述DNA的条件下制备含所述适当微生物的发酵液；
(c)在允许表达所需量的所述纤维素酶的条件下将所述发酵液保持一段时间；以及
(d)收集合所述纤维素酶的所述发酵液。
16．包括权利要求1、2或5的纤维素酶的洗涤剂组合物。
17．处理织物的方法，它包括将所述织物与权利要求1、2或5的纤维素酶接触。
18．处理基于纤维素的纸浆的方法，它包括将所述基于纤维素的纸浆与权利要求1、2或5的纤维素酶接触。
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