CN1207173A - 物质的测定方法及试片 - Google Patents

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Abstract

本发明是根据测定分析对象物质的化学反应生成的可检测物质来测定分析对象物质的方法。通过使包括可检测物质的生成反应的反应系统中存在层状无机化合物,可以进行高灵敏度的测定。另外,通过使可检测物质稳定化,可以提高测定精度。此外,还可以提高化学反应的反应速度,迅速进行测定。再有,即使在含有生成不溶性物质的反应的反应系统中也可以保持高的灵敏度。本发明还涉及利用包括试样中的分析对象物质生成可检测物质的化学反应的反应系统、通过测定上述可检测物质来测定上述分析对象物质的分析用试片。该试片配备有至少1个包括用于检测上述可检测物质的检测部的试验部分,至少在上述试验部分中含有层状无机化合物,从而可以抑制色素扩散和洗脱,实现准确的检查和分析并且易于操作。

Description

物质的测定方法及试片
发明领域
本发明涉及采用一种反应系统，该系统根据试样中的分析对象物质的化学反应，生成可检测物质例如染料，通过测定该可检测物质来测定生物成分或环境试样等分析对象物质的方法，以及涉及该方法中使用的试片。
发明背景
有关检测并定量分析试样中的分析对象物质、例如体液中的尿或血等生物成分，食品、医药、自然环境中存在的微量物质、工业化学物质、废弃物中的微量物质等的方法，已经涉及采用分析对象物质参与的反应系统、测定反应生成的色素等可检测物质的方法。
这类方法例如有，在过氧化物酶(POD)存在下，使分析对象物质的化学反应生成的过氧化氢与被氧化性显色剂(色素前体)进行氧化还原反应，对生成的色素化合物进行比色定量的方法等，这种方法由于十分简便在临床检查中被广泛使用。此外，还有一种方法是，利用酶等使电子传递物质(介体)与分析对象物质之间产生氧化/还原反应，根据生成的电子传递物质的氧化体/还原体在电极上还原/氧化时的电化学应答测定分析对象物质。
但是，采用以往的方法时，如果分析对象物质量少，测定的灵敏度不足，不能得到高精度的测定结果，因此，人们希望研制出提高测定灵敏度的高精度的测定方法。
以往的方法还有一个缺点是，反应时间很长，因此测定需要耗费很长时间，或者，到达检测反应结束需要很长时间，因此采用根据反应速度进行定量的速率法时定量精度较差。为了解决上述问题，以往有人对反应系统加热，以提高反应速度或者提高参与反应的试剂的浓度等方法。但是，采用反应系统加热的方法时，为了进行加热需要有热源，使分析变得复杂化。另外，在生成物质是热不稳定的情况下，检测发生困难，因此不能采用这种方法。另一方面，提高试剂浓度的方法，由于检测的本底计数上升和分析成本的增加，也不实用。另外还有一种方法是，为了提高反应速度而添加催化剂等，但有很多检测反应目前还找不到适宜的催化剂，这种方法也未达到实用程度。如上所述，以往的方法存在许多不足，因而迫切希望更简单、反应速度快、能迅速进行测定的新方法。
此外，在生成可检测物质的反应系统中，包括生成对反应溶剂不溶解的物质的场合，存在下面不利的问题：
(1)在间歇式自动生化检验装置等使用液体试剂进行光学检测的测定时，如果反应生成的色素不溶解于溶剂，它们就会析出，附着在测定池的壁上，遮住入射光和透射光，或者造成分注嘴污染，使测定难以进行。
(2)同样，在使用液体试剂进行光学检测时，如果生成不溶性副产物，这些副产物就会析出，附着在测定池的壁上，遮住入射光和透射光，或者造成分注嘴污染，或者由于聚集而引起散射或遮光等，使测定难以进行。
(3)在将试样点滴或渗透到试片中，使之反应，用光学方法检测生成的色素的测定过程中，如果生成的色素不溶解于试样溶剂，这些色素就会不均匀地沉淀到试片基材上，或者色素产生聚集，导致测定精度恶化。
(4)在间歇式自动生化检验装置等使用液体试剂的电极测定过程中，如果生成不溶性副产物，电极表面就会被不溶性沉淀物覆盖，引起电极污染，使电化学应答降低，导致测定精度恶化。
不溶性与难溶性的差别在于不溶解于溶剂的程度，在本发明中，下文中所述的不溶性也可以由难溶性替换。
另一方面，特别是在生成的可检测物质于反应溶剂中不溶解的场合，采用以往的方法时，可检测物质的生成反应系统不均一，反应不能迅速进行，因此有时导致反应速度和测定灵敏度低下，例如在使用酶的反应系统中，有时生成物会沉淀到酶附近，阻碍反应的进行。
因此，利用在进行反应的反应溶剂中生成不溶性副产物的反应来测定的方法几乎都不能使用。因此，不得不选择采用不生成不溶性生成物的反应检测系统，或者采用合成化学方法使生成物可以溶解于反应溶剂中，研制、开发新的检测反应系统，但是，这样的反应系统十分有限。要研制、开发只生成可溶性物质的反应系统需要大量的人力和物力。另外，为了实现可溶解化、乳化或分散等状态，需要添加表面活性剂，但添加表面活性剂对于测定成本是不利的，而且还妨碍反应进行，有许多副作用，未必是一个好的解决办法。因此，迫切需要以更简单的方式解决上述问题，研制出在不溶性生成物存在的条件下也能进行测定的新方法。
另外，利用生成上述过氧化氢的反应系统测定分析对象物质的方法，有许多反应随着氧化而产生过氧化氢，因此这些方法是重要的测定方法。但以往的方法由于下述原因不能保证容易地进行准确地测定，即在这些测定方法中，色素化合物等可检测物质的量或浓度必须与过氧化氢等特定物质在某些情况下定量相关，由于过剩的过氧化氢的强氧化性或生物试样中的抗坏血酸等的强还原性，使比色定量法中的氧化还原系统受到影响，上述色素化合物等可检测物质被分解，致使测定产生误差。
例如，在这些测定方法中，葡萄糖等分析对象物质受葡糖氧化酶等氧化酶的作用一下子生成过量的过氧化氢时，除了色素前体与过氧化氢的反应外，还出现生成的色素与过氧化氢的反应。结果，生成的色素在它形成的同时就被过氧化氢所分解，导致退色。
另外，过氧化物酶使过氧化氢生成富有反应性的超氧化物等活性氧类，如果试样中存在这样的过氧化物酶，或存在具有类似作用的过渡金属离子及其配合物，活性氧类就会与生成的色素反应，使之分解、褪色。这种干扰也会给测定带来一些麻烦。此外，生成色素等可检测物质的反应在暴露于大气中的状态下进行时，生成的色素被空气中的氧或溶解在反应液中的氧所氧化，发生分解和褪色。
因此，人们进行了各种试验，寻找可以提供不易分解的稳定物质的色素前体以及添加各种稳定化剂等，但结果都不甚理想。
另外，在生物试样中含有抗坏血酸、尿酸、胆红素等还原性物质，它们对氧化还原反应的影响很大，特别是在抗坏血酸共存条件下如何准确进行测定，多年来一直是临床分析中研究的课题。除了上述色素前体的探索之外，人们还进行了各种尝试，研究利用酶的选择分解、利用添加过碘酸的分解、利用铁-乙二胺四乙酸螯合物的氧化分解、利用半透膜的选择分离等抑制干扰手段(参见太田宜秀、小川丰《临床检查》34(4)，502-504(1990)；特公平1-41223；特公平2-4861；特公平4-18630；特开平5-95795；特开平7-155196)。
此外还有一种方法是，利用除氧化还原反应之外的各种公知的反应(例如酸碱反应之类的缩合反应，或重氮盐的偶联反应、配合物形成反应等)生成与特定的分析对象物质存在定量关系的色素(例如偶氮系色素等)，用光学方法对生成的色素进行定量，从而测定特定的分析对象物质。这些方法在分析化学手册中有详细的描述，是一些重要的方法。但是，有的时候，这样生成的色素是不稳定的化合物，会被环境中的氧及试样中的氧化性物质或还原性物质、试样中的氢离子或碱、光等的作用所分解，在测定这样的物质时，例如，要求操作迅速，或者要求在用氮置换大气的环境或遮光的环境中进行操作，不然的话就会产生误差。
另外，在使用电子传递物质(介体)的方法的场合，还有一种方法是，在酶反应进行一预定时间，这期间电子传递物质发生氧化/还原，使电子传递物质的氧化体/还原体蓄积起来，经过一定时间后，蓄积的电子传递物质的氧化体/还原体在电极上还原/氧化，产生很大电化学应答，从而能以高的灵敏度测定分析对象物质，但是，有时蓄积的电子传递物质的氧化体/还原体被与其共存的还原性物质或氧化性物质所还原/氧化，发生分解反应，致使测定产生误差。
如果可检测物质不发生分解，保持稳定，测定时能保证定量关系，且通过时间积分可以得到更高的S/B比(信噪比)，这样就可以改善分析精度及提高灵敏度。因此，为了研制可以稳定地生成容易测定的可检测物质的反应系统，迄今为止人们作出了大量的努力。例如在许多化学手册中记载了迄今所研制的生成稳定可检测物质的反应所用各种试剂。
但是，探索这样的生成稳定物质的反应系统要耗费大量的人力和时间，寻求生成稳定、易检测的可检测物质的反应系统的努力一直没有间断。因此，即使目前使用的测定方法中，许多情况下不得已要把由pH值、水分、氧化还原物质等共存物、光等分解的不稳定物质也作为检测物质进行测定。
另一方面，通过测定基于试样中的分析对象物质的化学反应而生成的色素等可检测物质来测定分析对象物质，用于检查和分析尿等液体试样中的成分的分析用试片，通常由进行液体试样的吸收、扩散、反应、检测等一系列分析过程的试验部分和支承试验部分的支承部分构成，必要时还有传感器、试样吸入装置等。上述试验部分由担负各种功能的层或区域等部分组成，一般地说，这些部分包括：用于吸入试样并将其导入试验部分的试样吸入部；用于使试样在试验部分中均匀渗透、扩散的扩散渗透部；含有与试样中所含分析对象物质反应的试剂的试剂部；引起检测反应等反应的反应部；利用吸附或分配等类似于色谱的作用将试样中的成分和检测反应生成的色素分离的展开部；利用试样移动的时间调整反应进行的时间控制部；利用吸附作用截留或除去试样中的成分或生成的色素等的保持部；通过反射率、透射吸收或荧光等检测色素的检测部；吸收过剩的试液、添加的洗涤液和展开液、防止逆流的吸收部等。
在实际的试片中，这些担负上面各种作用的部分不一定是分别独立存在的，例如检测部与试样吸入部、试剂部、反应部合而为一的石蕊试纸就是一个部分兼有几种作用。
此外，还可以举出具有扩散层(兼作试样吸入层)、检测层(兼作试剂层和反应层)、或含有与兼作试剂层的反应层独立的检测层的单层型或多层型的试片。其中有许多是用粘结层粘贴在支承体上。有的时候，还有在反应层与检测层之间具有用于除去干扰成分的展开层或保持层的试片。还有的时候，扩散层兼作展开层，通过粘结层与试剂层连接。在通过测定反射率进行检测的场合，有时在检测层的前后还要设置反射层。试样被滴到兼作试样吸入层的扩散层上，均匀地扩散、溶解试剂层内的试剂，进行反应，因而例如由色素前体生成色素。在试剂层和反应层兼作检测层的场合，色素可以直接进行测定，而在具有独立的检测层的场合，要等生成的色素进一步移动到检测层时再进行测定。(参见H.G.Curme，等.，Clinical Chemistry，24(8)，1335-1342(1978)、B.Walter，Analytical Chemistry，55(4)，498A(1983)、近藤朝士「ぶんせき」1984(7)，534、近藤朝士「ぶんせき」1986(6)，387、分析化学手册第8页(日本分析化学会编：改订第4版、丸善(1991))、特开平6-213886(北岛昌夫等))。
再有，还可以举出利用试样平面移动的试片，该试片包括滤纸小片上的试片末端的展开液浸透部，与之相邻的试样吸入部，靠近其中央兼作试剂部(其上固定有酶)的反应部，在其顶端兼作试剂部(固定其上的色素前体等)、反应部和保持部的检测部。在这种场合，将试样滴到试样吸入部后，利用毛细管作用使展开液从试片的末端开始渗透，从而使试样移动，在兼作第1试剂部(其上固定有酶)的反应部样品与酶反应，生成过氧化氢，生成的过氧化氢借助展开液而移动，在兼作第2试剂部(固定有色素前体等)和反应部及保持部的检测部中使色素前体显色，吸附并保持生成的色素等(可检测物质)。因为与展开液移动的同时，过氧化氢移动，与此同时发生显色反应，分析对象物质的量增加时，显色的幅度增长，从而可以测定物质。(参见M.P.Allen，等人.，ClinicalChemistry，39(9)，1591-1597(1990)’、D.Noble，Analytical Chemistry，65(23)，1037A(1993))。
这样的试片可以用于尿化验、生化检验、免疫色谱检验等。作为免疫色谱试片的例子，例如将固定有抗体的滤纸(可以说整个包括试剂部、反应部、展开部、保持部和检测部)的一端，在由作为试剂的酶连接抗原和含有抗原(分析对象物质)的试样混合而成的展开液中浸渍，使之展开，同时在作为第2试剂的显色液(含有色素前体)中展开，这时，预先存在的酶连接抗原部分被展开及被捕集而呈带状显色。显色带的长度与试样中的抗原含量成正比。(参见R.F.Zuk，等人.，ClinicalChemistry，31(7)，1144-1150(1985))。
作为免疫色谱试片的另一个例子，可以举出，在小片膜滤器上的一端配备有兼作试样吸入部的试剂部(第1抗体固定化着色胶乳)，在靠近中央配备有兼作展开部的试剂部(识别与第1抗体之抗原相同的抗原，但表位不同的第2抗体)，还配备有展开部，另外，配备有兼作试剂部(抗第1抗体抗体)和保持部的检测部。将试样滴加到试样吸入部时，抗原(分析对象物质)与第1抗体发生抗原抗体反应，免疫复合体直接与试样同时移动，在兼作展开部的试剂部中它与第2抗体发生层叠反应。但是，未形成免疫复合体的过剩的第1抗体，随试样移动的同时通过展开部，在兼作试剂部(抗第1抗体抗体)和保持部的检测部中被捕捉。通过测定固定第1抗体的着色胶乳(含有作为可检测物质的色素)的显色，可以测定分析对象物质。(参见M.W.Davidson，AnalyticalTroceedings，29，459(1992))。
但是，在上述各种试片中，与分析成分反应生成的色素在试样液、反应液等中往往具有溶解性，结果产生许多问题，如色素洗脱入大量溶液中，向扩散层反冲，以及具有多个试验部的多项目试纸中的色素等附着到邻接的试验部上等等。另外，伴随着干燥，色素等向试验部的边缘移动，中央部位的浓度减小，周边部位的浓度增大。
这些现象使得测定的灵敏度、准确性和精度降低，这些问题对于浸渍在试样液中测定的尿试纸中特别突出，无论哪一种试样都普遍存在这个问题。
为了解决这个问题，人们曾经提出了下列方法：在试验部上覆盖保护层，防止试剂洗脱出(特开平2-38861)；由吸收性好的多孔质结构体(多孔质层、多孔性膜)构成的试验部均匀吸收试样，防止邻接的试验部的液体间交汇的方法(特开平2-6541)；选用生成不溶性色素的反应方法；利用不溶性、疏水性的粘结剂(固着剂)捕捉生成的色素的方法(特开平7-181174)；在多项目试纸中扩大邻接的试验部间的距离的方法；控制、调整浸渍时间的方法；控制测定时间，在扩散发生之前进行测定的方法等。但是，在试验部上覆盖保护层或用沉淀凝固法等制成多孔质结构的方法，使试纸的制造工艺过于复杂。如果选用生成不溶性色素的反应，则产生抑制酶活性的生成物。以疏水性高分子作为粘结剂的试片，带来水性试样溶液的吸收恶化等缺点。另外，对多项目试片来说，通常一个传感器要在多个试验部间移动，进行反射光测定，因此如果扩大试验部间的距离，势必要增大面积，对于传感器的移动不利。其它的方法都有各自尚待解决的问题，例如，控制浸渍时间的方法在尿检验中带来很多麻烦，控制检测时间的方法在其与反应时间的关系上不容易掌握等。这些问题目前尚未发现令人满意的解决办法。
另外，上述使用电子传递物质(介体)、根据氧化/还原时的电化学应答测定分析对象物质的方法，以及根据与特定的离子形成配位键或离子键的配合物(离子载体)所形成的配合物在液膜电极中的移动、测定伴随的膜电位来测定作为分析对象物质之离子的方法，作为重要的测定方法已广为人知，但使用电子传递物质的氧化体/还原体或配位化合物的电极，通常在不溶性的聚合物中添加电子传递物质或配合物，以防止电子传递物质或配合物的洗脱或扩散，同时，为了使电子移动迅速起见，使电子传递物质或配合物保持在电极表面附近，但由于聚合物中物质的移动受到限制，试样中的分析对象物质或由分析对象物质生成的中间物质，与不溶性聚合物中的电子传递物质或配合物的反应受到阻碍，同样也未找到一个令人满意的解决方案。
发明概述
本发明的目的是，提供测定基于分析对象物质的化学反应而生成的色素等可检测物质，来高灵敏度测定分析对象物质的测定方法。这里所说的测定包括定量测定和定性测定两方面的含义。
本发明的另一目的是，在上述分析对象物质的测定方法中，提供使上述可检测物质稳定化来提高测定精度并实现高灵敏度的方法。
本发明的又一目的是，在上述测定方法中提高化学反应的反应速度、从而可以迅速进行测定的新方法。
本发明的再一个目的是，利用包括生成不溶性物质反应的反应系统的上述方法，来提供高灵敏度的测定方法。
此外本发明还有一个目的是，提供可以抑制色素等扩散、洗脱，而准确地进行检查和分析并且操作简便的分析用试片。
本发明人发现，通过在层状无机化合物存在下，进行形成可检测物质的反应，或者使试片上用于检测可检测物质的检测部等试验部分中含有层状无机化合物，可以实现上述目的，从而完成本发明。
因此本发明提供一种分析物的测定方法，该方法利用试样中的分析对象物质的化学反应生成可检测物质的反应系统，测定上述可检测物质，从而测定分析对象物质，其特征是，在包含可检测物质的生成反应的反应系统中，存在层状无机化合物(以下称为“本发明的测定方法”)。
另外，本发明提供了上述物质测定方法，该方法包括在上述反应系统中添加层状无机化合物，使可检测物质吸附在该层状无机化合物上之步骤(以下称为“本发明的第1方法”)。
在本发明的第1方法中，通过使生成的可检测物质吸附在层状无机化合物上，可以实现高灵敏度的测定。即，例如使可检测物质吸附在层状无机化合物上并沉降，结果提高了光学或电化学检测时的测定灵敏度。在这种场合，有时可检测物质吸附在层状无机化合物上，作为胶态凝聚物沉降下来，但并不一定必须凝聚。
此外，本发明提供了分析物的测定方法，其特征是，使上述反应系统中存在层状无机化合物，以抑制可检测物质的分解(以下称为“本发明的第2方法”)。
在本发明的第2方法中，使生成待测定的可检测物质的反应系统中存在层状无机化合物，几乎在可检测物质生成的同时，或者在被共存的物质分解之前，该可检测物质与上述层状无机化合物形成复合体，从而可以抑制可检测物质由于反应系统中共存的物质的作用而被分解。
另外，本发明还提供了分析物的测定方法，其特征是，通过在层状无机化合物存在下进行上述可检测物质的生成反应，提高上述生成反应的反应速度(以下称为“本发明的第3方法”)。
在本发明的第3方法中，通过在层状无机化合物存在下进行可检测物质的生成反应，可以提高上述生成反应的反应速度，可迅速进行测定，不仅大幅度缩短测定时间，而且可以缩短到达检测反应终点所需要的时间，结果，在根据反应速度进行定量测定的鉴定法中可以提高测量精度。提高可检测物质的生成反应速度的机理目前尚不十分清楚，据认为是由于上述生成反应的反应起始物质或反应中间体附着在层状无机化合物上，在表面上浓缩，从而提高了反应速度。
另外，本发明还提供了分析物的测定方法，其特征是，构成上述反应系统的至少一个反应是生成对于反应溶剂不溶解的物质的反应(以下称为“本发明的第4方法”)。
在本发明的第4方法中，通过在包括形成可检测物质之反应的反应系统中优选层状无机化合物以分散状态存在，即使该可检测物质或该反应的副产物等不溶解于反应溶剂，也能象均一系统一样迅速进行反应。据信，这是由于生成的不溶性可检测物质或不溶性副产物吸附在层状无机化合物上，与该层状无机化合物一起均匀分散于反应系统中的缘故。另外，在本发明中，通过使溶剂不溶解的可检测物质或不溶性的副产物吸附在层状无机化合物上，可以防止该可检测物质或副产物析出到反应系统中，导致检测时操作困难。
防止检测时操作困难的条件，可以具体举出如下：
(1)在间歇式自动生化检验装置等使用液体试剂进行光学检测的测定中，反应生成的色素对于溶剂是不溶解的情况下，通过将色素吸附在层状无机化合物上，可以防止由于色素析出而附着在测定池壁上遮蔽入射光和透射光等，或者引起分注咀的污染，或者凝聚而引起吸光系数异常、散射或遮光等造成测定困难。
(2)同样，在使用液体试剂进行光学检测的测定中，若生成不溶性副产物，通过使副产物吸附在层状无机化合物上，可以防止副产物吸附在测定池壁上、遮住入射光和透射光等，或者引起分注咀的污染，或者凝聚而引起散射或遮光，避免了测定困难。
(3)在将待测定的试样滴加或浸渗到试片中、并形成用光学方法测定的色素的测定过程中，在生成的色素不溶解于试样溶剂的场合，通过使色素附着在层状无机化合物上，可以避免色素不均匀沉淀到试片的反应部或检测部上，或者产生色素凝聚，导致测定精度恶化。
(4)在间歇式自动生化检验装置等使用液体试剂的电极测定中，生成不溶性副产物的场合，通过使该副产物附着在层状无机化合物上，可以防止由于电极表面被不溶性沉淀附着物覆盖而引起电极污染，或者电化学应答低下，导致测定精度恶化。
本发明测定方法，只要是包括基于试样中的分析对象物质的化学反应生成可检测物质的反应系统，通过测定上述可检测物质来测定上述分析对象物质的方法均可使用，没有特别的限制。当然，可检测物质也可以是分析对象物质本身。另外，即可以是通过测定可检测物质定性测定分析对象物质的方法，也可以是根据上述可检测物质与分析对象物质存在量的相关关系，利用包括形成可检测物质的反应系统定量测定分析对象物质的方法。此外，不只限于通过上述分析对象物质的化学反应直接生成可检测物质的反应系统的情况，也包括上述分析对象物质的化学反应与可检测物质的生成反应通过其它的化学反应间接相关的情况。其中，本发明的方法特别适合于可检测物质是通过氧化还原反应生成色素或电子传递物质的反应系统的测定方法，以及生成的可检测物质是偶氮染料等色素或离子载体与分析对象物质的配合物等的反应系统的测定方法。
尤其是以光学方式测定由生物体成分经氧化酶反应生成的过氧化氢与被氧化性显色剂之间氧化还原反应定量生成色素的方法，可以用于临床检查体液中各种成分的定量和环境分析等，将本发明的测定方法用于这类分析、检测，可以实现高灵敏度的测定。
特别是本发明的第2方法，例如在氧化还原反应系统中，反应系统中作为反应中间体或试样中的夹杂物同时存在许多氧化性物质、还原性物质或过氧化物酶类物质，由于反应系统中的这些共存物质的作用，可检测物质有时会被分解，在这种情况下使用本发明的第2方法十分有效。
采用本发明的第2方法，在使用上述过氧化氢与被氧化性显色剂的氧化还原反应的测定方法中，可以克服由于反应系统中存在的过剩的过氧化氢等氧化性物质，和抗坏血酸、尿酸、胆红素等还原性物质的作用使色素分解、褪色，造成测定误差等问题。
另外，本发明的第3方法，在可检测物质的生成反应中反应起始物质或反应中间体是阳离子性化合物的场合，通过在反应系统中添加具有阳离子交换性能的层状无机化合物，可以使上述反应起始物质或反应中间体吸附在层状无机化合物的表面上并浓缩，提高上述生成反应的速度，迅速进行测定，因而本发明的第三方法特别适用于采用这样的反应系统的测定方法。
另外，本发明的第4方法，只要是采用含有生成反应溶剂不溶解的可检测物质或不溶性副产物的反应的反应系统的方法均可适用，没有特别的限制。
本发明的测定方法可用于作为分析对象物质检测，优选定量尿或血液等体液中的生物成分、食品、医药、自然环境中存在的微量物质、工业化学物质、废弃物中的微量物质等。
另外，本发明提供了一种分析试片，该试片包括基于试样中的分析对象物质的化学反应生成可检测物质的反应系统测定上述可检测物质，从而测定上述分析对象物质，其特征是，配备至少1个用于检测上述可检测物质的检测部的试验部分，至少在上述试验部分中含有层状无机化合物(以下该试片称为“本发明的试片”)。
本发明的试片可以由二层或多层包括用于检测可检测物质的检测层(作为检测部)在内的层所组成的试验部分、至少在检测层中含有层状无机化合物。另外，本发明的试片也可以是上述试验部分含有用于扩散试样的扩散层的试片、这样，试样通过扩散层扩散到达检测层。此外，本发明的试片还可以是具有检测可检测物质的检测区作为检测部的至少一个试验部分，且至少在上述检测区中含有层状无机化合物的试片。再有，本发明的试片还可以是具有用于扩散试样的扩散区的试片、试样通过该扩散区扩散到达检测区。此外，本发明的试片还可以是检测区由用于检测可检测物质的检测层的两层以上构成。另外，本发明的试片还可以是试验部分具有试样中的分析对象物质与试剂反应的反应部，在上述反应部中生成可检测物质的试片。另外，本发明的试片还可以将上述检测部设置在试样扩散后通过反应部后到达之处的位置。再有，本发明的试片还可以是在上述检测部中，试样所含分析对象物质与试剂进行反应而生成上述可检测物质。
在本发明的试片中，由于试样部中含有层状无机化合物，分析对象物质与试剂反应生成的色素等和层状无机化合物吸附在一起，结果，抑制了色素等被试液和反应液等扩散和洗脱，可以实现高灵敏度和高精度和分析。
本发明的试片适用于使用固相分析液体中所含成分的方法，特别适用于分析尿中的葡萄糖、胆红素等成分。在分析这类液体中所含成分时，分析物与试剂反应生成的色素等容易溶解在试样中，扩散和洗脱，因而使用本发明的试片效果很好。
试剂只要与分析对象物质能发生可检测反应即可，没有特别的限制，优先选用可以与分析对象物质反应，生成色素化合物，电子传递物质的氧化体/还原体，或离子载体与离子的配位化合物等可检测物质的试剂。另外，所述的生成色素化合物的反应，只要是生成可以光学检知的化合物的反应即可。可以是显色的反应，也可以是引起变色、荧光、发光等的反应。另外，在生成的色素等化合物是水溶性的场合，往往在试液或反应液等中扩散、洗脱，因此，本发明的试片特别适用于采用能生成这类水溶性色素化合物的试剂的场合。
附图的简要说明
图1是实施例1中测定的吸收光谱图。
图2表示实施例2和实施例3获得的过氧化氢校准曲线图。
图3表示将图2的校准曲线的纵轴和横轴分别取对数的校准曲线图。
图4表示实施例4中添加过氧化氢后的吸光率随时间变化图。
图5是实施例5中测定的吸收光谱图。
图6表示实施例6中求出的抗坏血酸浓度的校准曲线图。
图7是实施例7中测定的吸收光谱图(添加绿土系统)。
图8是实施例7中测定的吸收光谱图(不添加绿土系统)。
图9是实施例7中测定的亚硝酸钠浓度33μmol/l的吸收光谱图(添加绿土系统或未添加系统)。
图10表示实施例8中求出的亚硝酸钠浓度的校准曲线图。
图11表示实施例9中进行的POD显色系的绿土添加效果试验中吸光率随时间变化图。
图12表示实施例10中进行的含有抗坏血酸的POD显色系的绿土添加效果试验中吸光率随时间变化图。
图13是图12中0-60秒区间的放大图。
图14表示实施例11中测定的吸光率随时间变化图。
图15表示实施例12中测定的未添加绿土系统的吸光率随时间变化图。
图16表示实施例12中测定的添加绿土系统的吸光率随时间变化图。
图17表示实施例12中测定的亚硝酸钠浓度25.0μmol/l添加绿土系统或未添加系统的吸光率随时间变化图。
图18表示实施例13中浸渗绿土的滤纸上色素扩散状态示意图。
图19表示实施例13中未经处理的滤纸上色素扩散状态示意图。
图20是实施例15中的反应池示意图。
图21是实施例16中的试片示意图。
图22是实施例17中的试片示意图。
这些图中，参考号1表示添加绿土的场合，2表示没有添加绿土的场合，3表示添加绿土而没有添加过氧化氢的场合；4表示亚硝酸浓度33μmol/l的场合，5表示亚硝酸浓度16μmol/l的场合，6表示亚硝酸浓度8μmol/l的场合，7表示亚硝酸浓度0μmol/l的场合；8表示实施例1试样，9表示实施例2试样，10表示实施例3试样，11表示实施例4试样，12表示实施例5试样；13表示亚硝酸钠浓度50.0μmol/l的场合，14表示亚硝酸钠浓度25.0μmol/l的场合，15表示亚硝酸钠浓度12.5μmol/l的场合，16表示亚硝酸钠浓度6.3μmol/l的场合，17表示亚硝酸钠浓度1.6μmol/l的场合；18表示色素斑，19表示除去色素的显色液，20表示玻璃，21表示涂膜，22表示PET；23表示浸渗试剂的滤纸(检测层)，24表示双面胶带(粘接层)，25表示浸渗层状无机化合物分散液的滤纸，26表示浸渗试剂的滤纸，27表示滤纸；28表示试样吸入区，29表示扩散区，30表示反应区，31表示控制反应时间的区域，32表示保持区域，33表示吸收过剩试样的区域。
发明优选实施方案
I.本发明的测定方法
本发明的测定方法是，利用包括基于试样中的分析对象物质的化学反应生成可检测物质的反应系统来测定可检测物质，从而测定上述分析对象物质的方法。
1.可检测物质
本发明中使用的反应系统包括生成下述可检测物质的反应。
可检测物质只要是能吸附在本发明的层状无机化合物上即可，没有特别的限制。可以吸附在层状无机化合物上的物质具体地可以是下列化合物：胺、多胺等胺类；亚胺、聚亚胺等亚胺类；多烯类；苯胺衍生物、苯醌衍生物、芳香族稠环化合物等芳香族化合物；占吨、丫嗪、噻嗪等杂环化合物；离子与冠醚或缬氨霉素等环状配位体的配合物等；这些化合物分子内也可含有季氮原子、酚羟基、磺酸基、羧基。
可以吸附在层状无机化合物上的物质，例如在H.Van Olphen著的《An Introduction to Clay Colloid Chemistry，Second Edition》(KriegerPublishmient，Malabar)的第11章“Interaction of Clays and OrganicCompounds”中有详尽的描述。另外，在特公昭50-8462(加藤忠义)等中介绍了许多种可以吸附的化合物，其中列举了可以用光学方法、电化学方法检测的物质。
(1)可以用光学方法检测的物质
可用光学方法检测的物质可以举出色素。色素包括荧光色素和发光物质等，另外，所述生成色素的反应只要是生成可用光学方法检知的物质的反应即可，不仅可以是显色反应，也可以是引起变色、荧光、发光等的反应。
所述的色素可以举出由色素前体经氧化还原反应、酸碱反应、及缩合反应等各种显色反应生成的色素化合物、荧光物质、发光物质、以及由配位键、离子键等生成的色素配合物或荧光配合物等。
由氧化还原反应生成的色素优先选用具有芳香环等共轭系的化合物，具体地可以举出如下：以4-氨基-1，2-二氢-1，5-二甲基-2-苯基-3H-吡唑-3-酮(4-氨基安替比林，以下简称为4-AA)为代表的成色剂与氢供体(N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺等トリンダ-试剂类)氧化缩合生成的色素；邻甲苯胺、联苯胺类(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺等)的氧化显色体色素；2，6-二氯-4-[(4-羟苯基)亚氨基]-2，5-环已二烯-1-酮等无色体氧化生成的色素；4-羟苯基乙酸酯等氧化后生成的荧光物质；化学发光物质等发光物质及其激发体；四唑鎓盐的还原色素等甲类；1，1′-二甲基-4，4′-二吡啶鎓盐等被还原后生成的色素等。
所述的氢供体，是在过氧化氢共存的条件下、通过过氧化物酶的作用与4-氨基-1，2-二氢-1，5-二甲基-2-苯基-3H-吡唑-3-酮(4-AA)或3-甲基-2-苯并噻唑啉腙缩合生成苯醌染料的苯酚之类化合物，具体地可以举出：二氯苯酚、邻甲氧基苯酚、1，2，3-三羟基苯、二甲基苯胺、N-乙基-N-磺丙基间茴香胺、N-乙基-N-磺丙基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺、N-乙基-N-磺丙基间甲苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)间茴香胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)茴香胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基茴香胺、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基茴香胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基茴香胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)间甲苯胺、N-(3-磺丙基)苯胺等。
在上述利用4-AA与氢供体在过氧化氢存在下反应，生成苯醌系色素的反应系统的方法中，用吸收光度计测定生成的苯醌系色素，间接地测定过氧化氢，从而可以测定分析对象物质。
另外，上述的邻甲苯胺、联苯胺类可以举出邻甲苯胺、联茴香胺、3，3′-二氨基联苯胺、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺、N-(3-磺丙基)-3，3′，5，5′-四甲基联苯胺等。
无色体是氧化后形成色素而显色的无色的色素前体。无色体氧化形成的色素可以举出：2，6-二氯-4-[(4-羟苯基)亚氨基]-2，5-环已二烯-1-酮、2，6-二氯-4-[(3-氯-4-羟苯基)亚氨基]-2，5-环已二烯-1-酮、7-(二乙氨基)-3-亚氨基-8-甲基-3H-吩噁嗪盐、3-(二乙氨基)-7-氨基-5-苯基吩嗪鎓盐、3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓盐、1-羟基-5-甲基吩嗪鎓盐、7-羟基-3H-吩噁嗪-3-酮-10-氧化物。无色体可以举出：4，4′-亚苄基双(N，N-二甲基苯胺)、4，4′-双[N-乙基-N-(3-磺丙基氨基)-2，6-二甲基苯基]甲烷、1-(乙氨基硫羰基)-2-(3，5-二甲氧基-4-羟苯基)-4，5-双(4-二乙氨基苯基)咪唑、4，4′-双(二甲氨基)二苯胺、N-(羧基甲氨基羰基)-4，4′-双(二甲氨基)二苯胺盐、10-(羧基甲氨基羰基)-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪盐等。
除此之外，氧化后显色的色素前体还可以举出：4-甲氧基苯酚、4-乙氧基苯酚、2-乙氧基苯酚、1-(2-羟基-5-甲氧基苯基)乙酮、2-羟基-5-甲氧基苯甲酸、2-羟基-5-甲氧基苯甲醛、2-羟基-5-甲氧基苯甲酸甲酯、4-甲氧基-2-硝基苯酚、2-氯-4-甲氧基苯酚、4-羟基-3-甲氧基苯甲醛、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸等。
另外，还可以举出：3-(4-羟苯基)-2-丙烯酸、2-羟苯基乙酸、3-羟苯基乙酸、4-羟苯基乙酸、3-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、2-氨基苯甲酸、3-氨基苯甲酸、4-氨基苯甲酸、3，4-二氨基苯甲酸、3，5-二氨基苯甲酸、4-氨基-2-氯苯甲酸、4-氨基-3-甲基苯甲酸、4-氨基-3-甲氧基苯甲酸、4-氨基邻苯二甲酸等。
另外，还可以举出：2，4-二氨基-6-羟基嘧啶、4，5-二氨基-6-羟基嘧啶、4-氨基-2，6-二羟基嘧啶、6-羟基-2，4，5-三氨基嘧啶、4，5-二氨基-2，6-二羟基嘧啶、4-氨基-6-羟基-2-甲基嘧啶、4-氨基-6-羟基嘧啶、4-氨基-6-羟基-2-甲氧基嘧啶等。
此外，4-羟基苯基乙酸等被氧化后生成荧光物质，所述荧光物质可以举出由下列化合物氧化后生成：4-羟基苯基乙酸、(4-羟基-3-甲氧基苯基)乙酸、3-(4-羟基苯基)丙酸、4-羟基-(2-氨乙基)苯酚、4-羟基-N，N，N-三甲基苯麦它明鎓、α-氨基对羟基氢化肉桂酸、4-羟基苯乙胺、N-(4-羟苯基)乙酰苯胺、2，7-二氯荧光素二乙酸酯等。
化学发光物质之类的发光物质可以举出：萤虫荧光素、海萤虫荧光素、多管水母系、光泽精衍生物、鲁米诺衍生物(氨基苯二酰肼)、吖啶鎓酯、过草酸酯等。
例如，在上述利用联苯胺类和无色体在过氧化氢存在下进行氧化反应而显色的反应系统的方法中，用吸收光度计等测定生成的色素，间接地测定过氧化氢，从而可以测定分析对象物质。
在上述利用生成荧光物质和发光物质的反应系统的方法中，用荧光光度计或发光光度计进行测定，间接地测定过氧化氢，从而可以测定分析对象物质。
在生成这类色素的氧化反应中，参与氧化反应的氧化剂不限于过氧化氢，也可以使用其它各种公知的氧化剂。还可以添加过氧化物酶等氧化酶。另外，还可以在生成色素的氧化反应之前进行生成上述氧化剂的反应。
另外，作为四唑鎓盐可以举出：2，3，5-三苯基四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(1-萘基)-2H-四唑鎓盐、3，3′-二甲氧基-4，4′-亚联苯基-双[2-(对硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓]盐、3，3′-[3，3′-二甲氧基-(1，1′-联苯基)-4，4′-二基]-双(2，5-二苯基-2H-四唑鎓)盐、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓盐、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐、3，3′-(1，1′-联苯基-4，4′-二基)-双(2，5-二苯基-2H-四唑鎓)盐、3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓盐等。′
还原后生成的色素可以举出1，1′-二甲基-4，4′-联吡啶鎓盐、1，1′-二苄基-4，4′-联吡啶鎓盐等的还原体。另外，7-羟基-3H-吩噁嗪-3-酮-10-氧化物等还原后生成荧光物质，此类例子可以举出：7-羟基-3H-吩噁嗪-3-酮-10-氧化物、5-氰基-2，3-双(4-甲基苯基)-2H-四唑鎓盐、2，3-双(4-氰基苯基)-5-氰基-2H-四唑鎓盐等还原后生成的荧光物质。
例如，在上述利用四唑鎓盐和无色体在还原剂存在下还原反应而显色的反应系统的方法中，用吸收光度计或荧光光度计等测定生成的色素，间接地测定还原剂，从而可以测定分析对象物质。另外，也可以在生成色素的还原反应之前进行生成还原剂的反应。
在这类生成色素的还原反应中，参与还原反应的还原剂优先选用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或磷酸化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，但不限于上述化合物，也可以使用各种公知的还原剂。
在酸碱反应中生成的色素可以举出溴甲酚绿等随着pH的变化而显色或变色的化合物。这类化合物除了溴甲酚绿之外还可以举出溴酚蓝、酚红、溴焦倍酚红、邻苯三酚红等砜酞类色素，孔雀绿、玫红酸等三苯甲烷类色素，喹哪啶红、N-(对羟基苯基)-2，6-二氯对苯醌亚胺肟等喹啉类色素，7-羟基-3H-吩噁嗪-3-酮-10-氧化物等噁嗪酮类色素，6，7-二羟基-4-甲基香豆素等香豆素类色素，苯胺低聚物等导电性高分子化合物等等。
例如通过加入酸或碱利用随pH变化而显色或变色的化合物反应系统的方法中，用吸收光度计等测定生成的色素，间接地测定酸或碱，从而可以测定分析对象物质。另外，通过加入氢离子利用随着pH变化而显色或变色的化合物反应系统的方法中，用吸收光度计等测定生成的色素，可测定氢离子浓度，从而可以测定分析对象物质。
除此之外，其它公知的各种显色反应中生成的色素可以举出：2-甲氧基-4-吗啉代苯重氮盐等重氮盐经过偶合生成的偶氮系色素，通过醛与2，3-二甲基-2，3-双(羟基氨基)丁烷的反应等各种公知的显色反应生成的色素，通过组胺与邻酞醛的反应等各种公知的反应生成的荧光物质，利用酶使4-甲基繖形磷酸盐等酶底物反应而生成的色素和荧光物质。
重氮盐经过偶合生成的偶氮系色素可以举出：3-吲哚氧基与2-甲氧基-4-吗啉代苯重氮盐经偶合生成的偶氮系色素；尿胆素原与3，3′-二甲氧基联苯基-4，4′-重氮盐经偶合生成的偶氮系色素；在亚硝酸盐存在下、4-氨基苯胂酸与N-1-萘乙二胺反应生成的偶氮系色素；同样在亚硝酸盐存在下、2，4-二氯苯胺与N，N-二乙基-N′-1-萘基萘乙二胺草酸盐反应生成的偶氮系色素等。
在上述利用生成偶氮系色素反应系统的方法中，用吸收光度计测定生成的色素，可以测定作为反应起始物质的分析对象物质(在上例中是3-吲哚氧基、尿胆素原、亚硝酸盐)。生成偶氮系色素的反应不限于上述例子，还可以使用其它各种公知的生成偶氮系色素的反应。
另外，通过各种公知的显色反应生成的色素可以举出下面所述的公知显色反应生成的色素，但本发明不限于这些色素。所述的显色反应可以举出：检测醛的过氧化氢与1，4-二氨基苯的反应；检测醛的2，3-二甲基-2，3-双(羟基氨基)丁烷的反应；检测醛的3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙与氧化剂的反应；检测仲胺的10H-吩噻嗪与溴的反应；检测硫醇的2，2′-二硫代二吡啶的反应等。
上述利用公知的显色反应的方法中，用吸收光度计等测定生成的色素，从而可以测定作为反应起始物质的分析对象物质(在上例中是醛、仲胺、硫醇)。但可以利用的公知显色反应并不限于上述例子。
利用各种公知的反应生成的荧光物质，可以举出用下面所述的试剂进行的公知的检测反应中生成的荧光物质，但并不限于这些。所述试剂可以举出：检测胍基化合物的2-羟基-1，2-二苯基乙酮、检测组胺的邻苯二醛、检测精脒的邻苯二醛、检测α-酮酸的1，2-二氨基-4，5-二甲氧基苯等。
上述利用公知的检测反应的方法中，用荧光光度计等测定生成的荧光物质，可以测定作为反应起始物质的分析对象物质(在上例中是胍基化合物、组胺、精脒、α-酮酸)。可以利用的公知检测反应并不限于上述例子。
另外，通过酶进行反应时、生成色素或荧光物质的酶底物可以举出：胰凝乳蛋白酶的底物N-甲苯磺酰基-L-苯基丙氨酸-2-酰氨基吖啶酮、氨基肽酶的底物L-丙氨酸-α-酰氨基吖啶酮、测定酯酶的7-乙酰氧基-N-甲基喹啉鎓盐、酯酶的底物7-乙酰氧基-3H-吩噁嗪-3-酮、磷酸酶的底物4-甲基繖形磷酸盐、磷酸酶的底物5，10，15，20-四(4-膦酰氧基苯基)卟吩等，但不限于这些。
利用上述通过酶使酶底物分解的反应方法中，用吸收光度计或荧光光度计测定生成的色素或荧光物质，间接地测定酶，从而可以测定分析对象物质，酶或酶底物例如也可以化学地结合在抗体或其片段上。
由配位键、离子键生成的色素配合物或荧光配合物，包括金属离子或阴离子与配位体等化合物通过配位键和离子键形成配合物而生成色素、荧光物质等显色、变色的化合物。形成金属离子配合物而显色、变色的化合物，除了作为金属指示剂和铬离子载体已知的化合物外，还包括与有色过渡金属离子形成配合物而着色的化合物，具体地可以举出如下：乙二胺四乙酸、2，2-联吡啶、1-羟基-2-(2-羟基苯基偶氮)苯、二苯并-18-冠-6、二环已基-18-冠-6、环状多胺类、calix[4]芳烃、3-[N，N-双(羧甲基)氨基甲基]-1，2-二羟基蒽醌、5′，5″-二溴焦倍酚砜酞、2-羟基-1-(1-羟基-2-萘基偶氮)-6-硝基-4-萘磺酸盐、2，6-二氯-4′-羟基-3′，3″-二甲基品红酮-5′，5″-二羧酸盐、3，3′-双[N，N-双(羧基甲基)氨基甲基]荧光素、8-[N，N-双(羧基甲基)氨基甲基]-4-甲基繖形酮、2，7-双(2-胂羧基苯基偶氮)-1，8-二羟基-3，6-萘二磺酸、5-氯-2-羟基-3-(2，4-二羟基苯基偶氮)苯磺酸、5-[(六氢-2，4，6-三氧代-5-嘧啶基)亚氨基]-2，4，6(1H，3H，5H)-嘧啶三酮盐、2-(5-溴-2-吡啶基偶氮)-5-[N-丙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯胺盐、1，8-二羟基-2-(2-吡啶基偶氮)-3，6-萘二磺酸盐、2-亚硝基-5-[N-丙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯酚等。
另外，与-价阳离子形成有色配合物的化合物可以举出四[3，5-双(三氟甲基)苯基]硼酸盐、四苯基磷鎓盐等。
另外，与钙离子形成荧光配合物的化合物可以举出：1-[2-氨基-5-(2，7-二氯-6-羟基-3-氧代-9-占吨)苯氧基]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸、1-[2-氨基-5-(2，7-二氯-6-羟基-3-氧-9-占吨)苯氧基]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸-五乙酰氧基甲基酯、1-[6-氨基-2-(5-羧基-2-噁唑基)-5-苯并呋喃氧基]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸盐、1-[6-氨基-2-(5-羧基-2-噁唑基)-5-苯并呋喃氧基]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸五乙酰氧基甲基酯、1-[2-氨基-5-(6-羧基-2-吲哚基)苯氧基]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸盐、1-[2-氨基-5-(6-羧基-2-吲哚基)苯氧基]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸盐五乙酰氧基甲基酯、8-氨基-2-[(2-氨基-5-甲基苯氧基)甲基]-6-甲氧基喹啉-N，N，N′，N′-四乙酸盐、8-氨基-2-[(2-氨基-5-甲基苯氧基)甲基]-6-甲氧基喹啉-N，N，N′，N′-四乙酸五乙酰氧基甲基酯、3，3′-双[N，N-双(羧甲基)氨基甲基]荧光素、8-[N，N-双(羧甲基)氨基甲基]-4-甲基繖形酮等。
另外，与阴离子形成有色配合物的四苯钟盐、与氯离子形成配合物时荧光强度减少的溴化N-乙氧基羰基甲基-6-甲氧基喹啉鎓、与硼形成配合物的8-羟基-1-(亚水杨基氨基)-3，6-萘二磺酸盐等均包括在内。
上述利用形成配合物的反应方法中，用吸收光度计或荧光光度计等测定由离子和配位体形成的色素和荧光物质，通过测定色素和荧光物质的量，来测定分析对象物质(多数情况下是离子)。
(2)可用电化学方法检测的物质
下面说明可用电化学方法检测的物质。
可用电化学方法检测的物质可以举出电子传递物质(介体)以及离子载体与离子的配合物等。
所谓离子载体，是通过酶等使分析对象物质氧化/还原，同时从分析对象物质直接接受电子或向分析对象物质直接供给电子的化学物质，用电极使电子传递物质的还原体/氧化体进行氧化/还原，根据氧化/还原时的电化学应答可以测定分析对象物质。另外，电子传递物质从分析对象物质也可以不直接授/受电子，而是借助一种通过酶等能使分析对象物质氧化/还原的化学物质，反应的同时电子传递物质可间接从分析对象物质接受电子或向分析对象物质供给电子。用电极使与分析对象物质还原/氧化的同时若电子传递物质的氧化体/还原体与之有定量关系时，根据此时的电化学应答可测定分析对象物质。
电子传递物质，优先选用在所使用的电极的可测定范围内的电位(碳电极一般是-1.2V至+1.0V)下可以氧化还原的物质，具体地说可以举出：1，1′-二甲基-4，4′-联二吡啶鎓盐、1，1′-二苄基-4，4′-联二吡啶鎓盐、1，4-二氨基苯、2-甲基-1，4-萘醌、N-甲基吩嗪鎓盐、1-羟基-5-甲基吩嗪鎓盐、1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓盐、9-二甲氨基苯并α-吩噁嗪-7-鎓盐、二茂铁衍生物、六氰合铁(II)盐、7-羟基-3H-吩噁嗪-3-酮-10-氧化物、3，7-二氨基-5-苯基-吩嗪鎓盐、3-(二乙氨基)-7-氨基-5-苯基吩嗪鎓盐、1，4-苯二醇、1，4-二羟基-2，3，5-三甲基苯、N，N，N′，N′-四甲基-1，4-苯二胺、Δ2，2′-双-1，3-二硫酚、2，6-二甲基苯醌、2，5-二甲基苯醌、2，3，5，6-四甲基-2，5-环已二烯-1，4-二酮、2，6-二氯-4-[(4-羟苯基)亚氨基]-2，5-环已二烯-1-酮、2，6-二氯-4-[(3-氯-4-羟苯基)亚氨基]-2，5-环已二烯-1-酮、7-(二乙氨基)-3-亚氨基-8-甲基-3H-吩噁嗪盐、3，7-双(二甲氨基)吩噁嗪-5-鎓盐等。
在该例中，可检测物质是上述电子传递物质的氧化体/还原体，所述的生成可检测物质的反应是电子传递物质的氧化/还原反应。如上所述，例如，在电极上使与分析对象物质存在定量关系的电子传递物质的氧化体/还原体发生还原/氧化，测定此时的氧化还原电流等电化学应答，就可以测定分析对象物质。例如电子传递物质在电极上被氧化/还原时，抗坏血酸和过氧化氢，作为电子供给/接受物质，测定此时的电化学应答，根据该结果可以间接地测定分析对象物质。
离子载体，是与作为分析对象物质的特定的离子能选择性地产生配位键或离子键、形成配合物的配位体等的化合物，离子载体在液膜电极中使用已经广为人知。
具体地说，与阳离子生成配合物的离子载体可以举出：四[3，5-双(三氟甲基)苯基]硼酸盐、四苯基磷鎓盐、缬氨霉素、环(N′，N′-二辛基-D-天冬酰基-L-脯氨酰基-L-丙氨酰)2、双(苯并-15-冠-5)、双[(苯并-15-冠-5)-4-甲基]庚二酸酯、双(12-冠-4)、双[(12-冠-4)甲基]-2-十二烷基-2-甲基丙二酸酯、14-冠-4、十二烷基-甲基-14-冠-4、6，6-二苄基-1，4，8，11-四氧杂环四癸烷、二苯并-18-冠-6、二环已基-18-冠-6、4，16-二-N-十八烷基氨基甲酰基-3-氧杂丁酰-1，7，10，13，19-五氧杂-4，16-二氮杂环二十一烷等。
另外，与阴离子形成配合物的离子载体可以举出四笨基钟盐、6-甲氧基-N-(3-磺丙基)喹啉鎓盐等。
所述的液膜电极被用于测定分析物特定离子的方法，在电极表面上设有多孔质的高分子层，高分子层中渗透离子载体，该离子载体只与试样中特定的离子结合，在高分子层内移动，选择性分离该特定的离子，测定此时产生的膜电位，从而可以测定作为分析对象物质的特定离子。当然，在电化学检测方法中使用离子载体并不限于上述液膜电极的例子。
在大量的液体中，离子载体与某种特定离子结合，未结合的离子不能移动，只有结合生成的配合物可以移动，在设置这样的高分子层的电极中进行该离子的选择性分离，测定此时产生的膜电位，可以测定作为分析对象物质的该离子。
在该例中，所述的可检测物质是离子载体与特定离子的配合物，生成可检测物质的反应是离子载体与特定离子以配位键或离子键形成配合物的反应。如上所述，根据上述作为分析对象物质的特定离子的浓度，通过电化学测定产生的膜电位，可以测定该分析对象物质。
2.本发明适用的测定方法
本发明的测定方法适用于借助生成这类可检测物质的反应系统的方法，特别适用的方法可举出如下：
(a)利用包含生成过氧化氢反应，或以过氧化氢为氧化剂的氧化反应的反应系统的方法，具体地说，例如由分析对象物质借助于氧化酶反应系统生成过氧化氢，及在过氧化物酶共存条件下使过氧化氢与被氧化性显色体(色素前体)进行氧化还原反应，测定该反应生成的色素化合物。
(b)利用包含生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或磷酸化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)的反应或使用NADH或NADPH作为还原剂的反应的反应系统的方法，具体地说，例如由分析对象物质借助于脱氢酶反应系统生成NADH或NADPH，在电子传递物质存在下使其对色素前体发生作用而还原，测定所生成的色素化合物。
(c)在酸性条件下使芳香族伯胺与亚硝酸反应，生成重氮盐，使生成的重氮盐与待偶合试剂反应，生成偶氮色素，然后测定生成的偶氮色素，从而测定亚硝酸盐、重氮盐、偶合化合物的方法。
(d)由具有磷酸酯的4-甲基繖形酮等荧光酶底物，利用碱性磷酸酯酶的作用使磷酸酯分离出，生成荧光物质，对生成的荧光物质以激发光照射，测定产生的荧光，从而测定用荧光酶底物标记的物质和碱性磷酸酯酶的方法。
(e)用氧化酶/还原酶等使1，4-二氨基苯等介体氧化/还原，测定生成的介体的氧化体/还原体在电极反应中被还原/氧化时的电流应答，从而测定氧化酶/还原酶及用氧化酶/还原酶标记的物质的方法。
当然，可检测物质也可以是分析对象物质本身，例如，测定溶解于水的葡萄糖在电极表面上被氧化时的电化学应答，从而测定该分析对象物质的情况就是如此。
本发明的第4种测定方法是利用在溶剂中生成可检测物质的反应的反应系统的方法，该方法包括生成对于溶剂不溶解的物质的反应。该方法非常适合用于生成不溶性可检测物质的测定方法。且该方法特别适合用于可检测物质是可以用光学方法测定的物质的测定方法。
所述的溶剂没有特别的限制，可以任意使用以往公知的溶剂，例如可以从蒸馏水等水、乙醇等醇类、丙酮等酮类、乙醚等醚类、乙酸乙酯等酯类、氯仿等卤代烃类、苯或甲苯等芳香族烃类中选择适合于分析对象物质及其检测反应系统的溶剂。优先选用水。另外，如众所周知，在干式化学中可以使用含有分析对象物质的血液、唾液、尿等试液作为反应溶剂。
利用在进行反应的反应溶剂中生成不溶性物质的反应的测定方法，没有特别的限制，例如可以举出：利用在反应中生成可以光学检测的不溶性物质的反应的测定方法；利用在进行反应的溶剂中生成不溶性的副产物，并生成可以光学检测的物质的反应的测定方法；利用在反应溶剂中生成不溶性的副产物，并生成可以电化学检测的物质的反应的测定方法。
利用在反应溶剂中生成可以光学检测的不溶性物质的反应的测定方法没有特别的限制，具体地可以举出下列检测反应。
有关氧化反应可以举出：利用苯酚与4-氨基-1，2-二氢-1，5-二甲基-2-苯基-3H-吡唑-3-酮在水溶液中氧化缩合以检测过氧化氢；使N-甲基-吖啶-9-羧酸盐在水溶液中氧化、生成不溶于水的荧光物质N-甲基吖啶酮以检测过氧化氢；在链烷磺酸盐存在下，使10-(羧基甲氨基羰基)-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪盐水溶液氧化，使之显色以检测过氧化氢等反应。
有关还原反应可以举出：使7-羟基-3H-吩噁嗪-3-酮-10-氧化物还原，生成不溶解于酸性水溶液的荧光物质7-羟基-3H-吩噁嗪-3-酮，以检测还原物质；使3，3′-(3，3′-二甲氧基-4，4′-亚联苯基)-双[2-(对硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓]盐、5-氰基-2，3-双(4-甲基苯基)-2H-四唑鎓盐、2，3-(4-氰基苯基)-5-氰基-2H-四唑鎓盐等还原、生成不溶解于水的甲色素以检测还原物质等反应。
其它的反应可以举出：在弱酸性水溶液中4-甲基繖形硫酸盐与烯丙基硫酸酯酶反应检测烯丙基硫酸酯酶；2-氯-4-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷与β-葡糖苷酶在水溶液中反应检测β-葡糖苷酶；利用偶氮苯对苯基肼磺酸与醛的缩合反应检测醛；重氮盐与2-萘酚之间进行重氮偶合反应检测亚硝酸；利用1，3-二氨基-4-(5-溴-2-吡啶基偶氮)苯与钴离子在中性水溶液中形成有色不溶性配合物检测钴离子等反应。
利用生成可用光学方法检测的物质的反应，其中包括生成不溶于反应溶剂的副产物的反应，或者利用生成可用电化学方法检测的物质的反应，其中包括生成不溶于反应溶剂的副产物的反应，这些方法由于存在上述现有技术一节中所述有关问题，基本上都不能采用。因此，本文未举出这类测定方法的具体例子，但本发明不受这些限制。
不溶性物质一旦在其不溶解的溶剂中生成，就会立即从液相中析出，吸附在附近的固相上，这是经常可以观察到的现象。如果附近没有固相，不溶性物质在液相中就会形成分子集合体，分子集合体进一步长大，聚集或沉淀。本发明的层状无机化合物是小到足以均匀分散的微小粒子，因为本发明中的不溶性可检测物质或副产物这类不溶性可检测物质，在刚刚生成后是单分子或非常小的分子集合体，因此该不溶性物质可以有效地被吸附到层状无机化合物上，与之一起均匀地分散。
本发明的第4种测定方法是，在生成不溶性物质的检测反应系统中存在具有能吸附各种各样物质且能充分均匀分散的层状无机化合物，从而吸附上述不溶性物质，且解决现有技术一节中所述的因不溶性物质产生的问题。另外，层状无机化合物的存在不会妨碍检测及检测反应的进行。在本发明的第4种测定方法中，包括生成不溶性物质的反应的反应系统可以优选举出四唑鎓盐的还原反应。
可以用本发明的第1-第4测定方法测定的分析对象物质，可以举出尿或血液等体液中的生物成分，食品、医药、自然环境中存在的微量物质，工业化学物质，以及废弃物中的微量物质等。
3.层状无机化合物
本发明的测定方法的特征是，在上述包括可检测物质的生成反应的反应系统中存在有层状无机化合物。下面对层状无机化合物加以说明。
本发明的层状无机化合物是具有下述晶体结构的无机化合物，即其晶体结构例如为Si四面体、Al四面体等多面体的一组在同一平面排列而构成层、片状结构的各层重叠在一起，例如层状粘土矿物和水滑石。
所述的粘土矿物是指铝硅酸盐矿物，它占粘土的大半(细的土壤状无机粒状物，用水润湿时具有可塑性)，通常其最小构成单位是Si被4个O(氧原子)包围的Si四面体，和Al或Mg被6个OH基或O包围的Al(或Mg)八面体。
层状粘土矿物的结构是，Si四面体共享1个平面，保持在顶点的O向着同一方向，形成六角网状的片(四面体片)，或者，Al(或Mg)八面体共享脊状角，形成片(八面体片)，这些片重叠成层状。一个四面体片与一个八面体片组成一层，即1∶1层，多个1∶1重叠形成的矿物称为1∶1型矿物，由2片四面体片夹持一片八面体片组成一层，即2∶1层，多个2∶1层重叠形成的矿物称为2∶1型矿物，在2∶1型的层间还插入一片八面体片形成的矿物称为2∶1∶1型矿物。另外，八面体片是Mg(OH)2，在所有的八面体位上存在金属离子的矿物称为三八面体型(Trioctahedral)，八面体片是Al(OH)3，而1/3八面体位是空孔的矿物称为二八面体型(Dioctahedral)。本发明中使用的层状无机化合物优先选用2∶1型矿物。
构成本发明的层状无机化合物的元素最好是选自锂、钠、钾、镁、铝、硅、氧、氢、氟和碳中的至少一种，具体地说可以举出用下面所示的1-9式表示的化合物。这些化学式所代表的化合物中也可以含有结晶水。当然，这些化学式表示矿物学或化学意义上的纯化合物，而实际的层状无机化合物中有时会含有硅酸钠等杂质，因此通过元素分析等确定层状无机化合物化学式时，有时未必与这些化学式一致，这一点例如文献(D.W.Thompson，J.T.Butterworth，J.Colloid Interf.Sci.，151，236-243(1992))已有记载。
       MxSi4(Al2-xMgx)O10X2             ...(1)(1式中，M是H、Li、Na、K中的任一种，X是OH、F中的任一种，x是＜2的正数。)
       Mx(Si4-xAlx)Al2O10X2             ...(2)(2式中，M是H、Li、Na、K中的任一种，X是OH、F中的任一种，x是＜4的正数。)
       MxSi4(Mg3-xLix)O10X2             ...(3)(3式中，M是H、Li、Na、K中的任一种，X是OH、F中的任一种，x是＜3的正数。)
   Mx(Si4-xAlx)Mg3O10X2            ...(4)(4式中，M是H、Li、Na、K中的任一种，X是OH、F中的任一种，x是＜4的正数。)
   MSi4Mg2.5O10X2                  ...(5)(5式中，M是Li、Na中的任一种，最好是Na，X是OH、F中的任一种，最好是F。)
   M2Si4Mg2O10X2                   ...(6)(6式中，M是Li、Na中的任一种，最好是Li，X是OH、F中的任一种，最好是F。)
   Mg6Al2(OH)16X2                  ...(7)(7式中，X是卤素、NO3、SO4、CO3、OH中的任一种或有机酸的阴离子，最好是CO3，在X是卤素、OH、NO3或一价有机酸时，x是2，X是SO4、CO3、或二价有机酸时，x是1。)
   Na0.33Si4(Mg2.67Li0.33)O10X2    ...(8)(8式中，X是OH、F中的任一种，最好是OH。)
   Naa-b(Si4-aAla)(Mg3-bAlb)O10X2  ...(9)(9式中，X是OH、F中的任一种，最好是OH，a是＜4的正数，b是＜3的正数，并且a-b＞0。)
本发明的层状无机化合物的具体例子可以举出：高岭石、多水高岭土、蛇纹石等1∶1型粘土矿物；滑石、叶蜡石、绿土(smectite)、蛭石(上面的2式所表示的粘土矿物，以下相同)、包括氟四硅云母(5式)和镍纹石(6式)在内的云母等2∶1型粘土矿物；绿泥石等2∶1∶1型粘土矿物；2∶1-2∶1∶1型中间矿物；imogolite等准晶质粘土矿物；水铝英石等非晶质粘土矿物；水滑石(7式)等。
另外，在绿土中，根据同型置换的四面体和八面体晶格中的离子种类，可以分为蒙脱石(1式)、含有40-80％蒙脱石的天然物膨润土、贝得石(2式)等二八面体型、锂蒙脱石(3式，最好是8式)、皂石(4式)，最好是9式)、囊脱石等三八面体型。
水滑石是由上述7式、具体地说是由Mg6Al2(OH)16CO3·4H2O表示的层状矿物，是Mg(OH)2(水镁石：中心具有Mg2+的氧八面体层重叠的结构)中的Mg2+的一部分同型置换成Al3+的层状矿物，它具有正电荷，由于层间的CO3 2-而保持电中性，且具有阴离子可交换性。虽然不是硅酸盐矿物但常常被用来作为粘土矿物。
下面的表1中示出上述本发明的层状无机化合物中的几种的组成。
               <表1>矿物名                        组成*高岭石(Kaolinite)           Si2Al2O5(OH)4多水高岭土                  Si2Al2O5(OH)4 *2H2O蛇纹石                      Si2(Mg2+，Fe2+)3O5(OH)4滑石(Talc)                  Si4Mg3(OH)2O10叶蜡石(Pyrothyllite)        Si4Al2(OH)2O10蒙脱石(montmorillonite)     MIxSi4(Al2-xMgx)O10(OH)2·nH2O贝得石(Beidellite)          MIx(Si4-xAlx)l2O10(OH)2·nH2O锂蒙脱石(Hectorite)         MIxSi4(Mg3-xLix)O10(OH·F)2·nH2O皂石(Saponite)              MIx(Si4-xAlx)Mg3O10(OH)2·nH2O囊脱石(Nontronite)          MIx(Si4-xAlx)Fe2O10(OH)2·nH2O蛭石(Vermiculite)           MIx(Si4-xAlx)Al2O10(OH)2·nH2O水滑石(Hydrotalcite)        Mg6Al2(OH)16CO3·4H2O*MI是由单价阳离子表示的可交换阳离子
本发明的层状无机化合物的平均粒径只要是足以进行均匀分散的较小粒径即可，没有特别的限制。由于层状无机化合物一般是板状的粒子，并且处于多个粒子时而凝聚、时而分开的动平衡状态，要想定义平均粒径比较困难，不容易明确地说明适宜的粒径范围，如果非要说出粒径大小的话，那么，用光散射法或电子显微镜观察等方法测定的值，在分散于水中的状态下，以1nm以上、20μm以下为宜，优选10nm或10nm以上、2μm或2μm以下。这些粒子具有离子可交换性，根据色素等的电荷或极性可以进行吸附，离子可交换性来源于构成层的金属离子置换所产生的层电荷。对于表1分子式所示的组成的原子团来说，层电荷的绝对值为0.2-1左右。
另外，在结构中含有铁等过渡金属离子作为置换离子或含杂质的层状无机化合物，由于这些离子而产生颜色并显示氧化还原特性，且产生负反应，致使透明性变差，因此最好是不被过渡金属离子置换，但本发明不受这个限制。
在这些粘土矿物等层状无机化合物中，还可以通过构建季铵盐等柱状物，预先调整层间距离和层间的电荷或极性。
本发明的上述层状无机化合物中，优选2∶1型粘土矿物，特别是具有离子可交换性的膨润性粘土矿物。
膨润性粘土矿物中，优选膨润土、绿土、蛭石和合成氟云母，特别是合成锂蒙脱石或合成皂石等合成绿土，或者以合成氟云母为代表的膨润性合成云母(或Na型云母)等合成云母(天然的云母通常是非膨润性的粘土矿物)。膨润作用是由于具有离子交换性的阳离子或阴离子而产生的，因为可检测物质能很快由层间表面或被称为“卡片罩”的粘土缔合表面吸附，因此优先选用膨润性的层状无机化合物。粘土矿物吸附阴离子性物质、阳离子性物质、非离子性的极性有机化合物，水滑石吸附阴离子性化合物。在H.Van Olphen著的《An Introduction to Clay ColloidChemistry，Second Edition》(Krieger Publishment，Malabar)的第11章“粘土和有机化合物的相互作用”中详细叙述了可以吸附在层状无机化合物上的化合物。在本发明中，这些化合物可以单独使用，也可以2种以上并用。
本发明的上述层状无机化合物，不限于使用合成物或天然物，但优先择用合成物。合成物与天然物不同，它是化学上均匀的，可以定量地处理吸附的可检测物质，因其层间不存在铁等有色的金属，因此透明度高，可以进行定量的、光学的操作和处理。这里所说的“合成”，至少对于绿土来说，主要是指用水热合成法或熔融法制造的。天然物经过精制后得到的膨润性粘土矿物也可以使用。
这类层状无机化合物有一些市场上有售，例如コ-プケミカル(株)制造的商品名ル-センタィトSWN或ル-センタィトSWF(合成锂蒙脱石)或MF(氟云母)、クニミネ工业(株)制造的商品名スメクトンSA(合成皂石)、协和化学工业(株)制造的商品名チキソピ-W或商品名キョ-ワ-ド500(合成水滑石)、ラポ-公司制造的商品名ラポナィト(合成锂蒙脱石)、(株)ナカヲィテスク社销售的天然膨润土、(株)丰顺矿业公司制造的商品名マルチグル(膨润土)等。
业已知悉，上述的层状无机化合物可以吸附胺、多烯、各种色素等有机化合物。以往，被用来作为吸附油、色素等的水处理剂、制造葡萄酒或甜米酒等的蛋白去除剂、吸附、除去杂质的脱色精制剂等。另外，这些层状无机化合物能产生被称为“因光异色”的现象，用来作为提供特定的反应位点的材料，此外，最近人们还发现它可以提高天然色素的光稳定性。
但是，在本发明的第1方法中发现，通过在该层状无机化合物上吸附可检测物质，可以提高测定的灵敏度。因此，通过添加该层状无机化合物，例如，在使用上述4-AA和氢供体的反应系统中进行过氧化氢测定定量程度更高。将这样的粘土矿物等层状元机化合物用于物质的测定以提高灵敏度的例子目前尚未见有报导。
另外，在本发明的第2方法中，可检测物质被吸附在该层状无机化合物上，形成复合体，可检测物质在反应系统中受到保护，与分解反应有关的电子能级由于吸附而发生变化，因此在反应系统中添加这些层状无机化合物来试图达到此种效果。结果，可检测物质被吸附到层状无机化合物上，而且被吸附的可检测物质在过剩的过氧化氢和抗坏血酸等存在下可以保持十分稳定。通过添加该层状无机化合物，例如使用上述4-AA和氢供体的反应系统中进行过氧化氢测定可以达更高的精度。这种在用于测定分析对象物质的反应系统中添加粘土矿物等层状无机化合物，使生成的可检测物质保持稳定，提高测定该分析对象物质时的灵敏度和精度的例子，迄今为止还没有见报导过。
另外，在本发明的第3方法中，为了分析目的可在该层状无机化合物存在下进行生成可检测物质的反应，虽其机理尚不十分清楚，但据认为，使可检测物质的反应前体吸附在该层状无机化合物上，可以使之在层状无机化合物表面上浓缩，从而可以提高可检测物质的生成反应速度，提高测定速度。
另外，在本发明的第4方法中，通过使层状无机化合物分散在包括可检测物质的生成反应的反应系统的溶剂中，即使生成不溶性物质，也可以实现高灵敏度和高速度的检测。象这样使粘土矿物等层状无机化合物分散在溶剂中、用于物质的测定的例子尚未见到有报导。
更为出人意料的，即使在反应系统中存在层状无机化合物，也不会妨碍检测反应，因此，添加该层状无机化合物不会损害测定精度。
在本发明中，使层状无机化合物存在于反应系统中的方法取决于所使用的反应系统，可以优选选自分散液、溶胶、凝胶、淤浆、凝聚体、凝结体和烧结的多孔体中等任一种形态，将其分散存在于上述反应系统的反应介质中。上述反应系统的反应介质可以举出生成可检测物质的反应的反应溶剂。另外，在本发明的第4方法中，可以举出不溶解生成的反应物质的反应溶剂。
使层状无机化合物存在于反应系统中的方法，优选地可以举出使层状无机化合物分散于溶剂中，使之以分散液的形式添加到反应系统中的方法。所述的溶剂没有特别的限制，可以任意使用以往公知的溶剂，例如可以从蒸馏水等水、乙醇等醇类、丙酮等酮类、乙醚等醚类、乙酸乙酯等酯类、氯仿等卤代烃类、苯或甲苯等芳香族烃类中选择适合于分析对象物质及其检测反应系统的溶剂。最好是使用下面所述的缓冲剂，将该层状无机化合物分散于缓冲剂中，以缓冲溶液的形式添加进去。另外，也可以使用含有分析对象物质的血液、唾液、尿等试液作为反应溶剂，这在干式化学中已为人们所周知。
层状无机化合物的添加量根据所使用的反应系统来确定，此外还取决于所使用的层状无机化合物本身，因此所加之量要达到能消除这样的情况，即相对于可检测物质，吸附位点过少，不能充分吸附可检测物质，使可检测物质残留在溶液中，反之吸附位点过多，吸附可检测物质时出现浓度偏差，就是说添加量要适中。
添加到反应系统中的层状无机化合物的适宜量按下面所述来确定。即，层状无机化合物吸附色素之量主要与上述层电荷的程度相关，因此对于各种层状无机化合物可以求出其相应色素的吸附位点的总量。在检测反应中，如果试剂的浓度已经确定，就可以大致算出生成的色素等的最大量值，从而在添加各种类型层状无机化合物时，其量要使得可能形成色素的最大量也超不过该层状无机化合物的总吸附位点。
至于层状无机化合物的添加时间，没有特别的限制，可以在可检测物质的生成反应之前添加，也可以在生成反应之后添加，优先选择在可检测物质的生成反应之前预先添加到反应系统中，使之分散于反应系统中。
层状无机化合物分散于反应系统中的原因是，层状无机化合物与参与可检测物质生成反应的反应起始物质、反应中间体或反应生成物容易产生吸附等相互作用，另外还因为均匀分散、没有浓度差的状态适合于检测。因此，这里所说的“分散”，可以是层状无机化合物分散于溶液中的状态，也可以是分散于溶胶、凝胶等状态，只要是容易产生上述相互作用并适合于检测的状态就可以。
另外，在本发明的第4方法中，将层状无机化合物均匀分散于反应溶剂中，使之存在于反应系统中，可以使不溶性的物质吸附到层状无机化合物上。
用于分散层状无机化合物的分散介质不一定要与进行反应的反应溶剂相同。层状无机化合物可以是分散于以反应溶剂作为分散介质的分散液状态，也可以是能渗透反应溶剂的溶胶、凝胶、凝聚体、凝结体或烧结多孔体的状态，只要能使层状无机化合物均匀分散，对分散介质没有特别的限制。
能渗透反应溶剂的溶胶、凝胶、凝聚体、凝结体或烧结多孔体状态的层状无机化合物，可以用来作为干式化学等试片中的兼作反应部的检测部，只要层状无机化合物是可以均匀分散的形态，就可以将本发明的测定方法用于试片。
具有可交换性阳离子或可交换性阴离子的层状无机化合物通过搅拌或超声波处理等分散于水中时，只要浓度适当，基本上都可以形成均一分散液。但是，由于添加电解质、添加有机化合物、长时间静置或温度变化等，层状无机化合物的粒子彼此凝聚或凝结，或形成凝胶或沉淀。这些凝聚一般由粒子彼此间较弱相互作用引起，经过搅拌很容易重新分散。
关于层状无机化合物的分散、凝聚和再分散，例如在下列文献中有详细描述：H.Van Olphen著的《An Introduction to Clay ColloidChemistry，Second Edition》(Krieger Publishment，Malabar)的第三章“The Theory of Stability of Hydrophobic Sols.”、第四章“Successesof the Theory of Stability-Further Theories and Refinement”、第七章“E1ectryc Double-Layer Structure and Stability of ClaySuspensions”和第八章“Peptization of Clay Suspensions”等。
吸附的程度受缓冲剂的组成(pH、离子强度、形成配合物的成分等)的影响。例如，分散于纯水中的绿土难以吸附食用色素青色一号(グリンァントブル-FCF)，而分散于pH6.5的双-三缓冲液[由双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷和盐酸制成]中的绿土则可以迅速吸附该色素。
本发明的方法中使用的缓冲剂和缓冲溶液的种类，除了上述的双-三缓冲液外，例如还可以举出磷酸缓冲溶液、柠檬酸缓冲溶液、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸缓冲液等，但不限于这些，可以根据所使用的反应系统适当选择。至于缓冲剂的pH和浓度等，也可以选择与所用反应系统相适应的条件。
缓冲剂的添加时间没有特别的限制，可以在添加层状无机化合物之前，也可以在添加之后，最好作为含有分散于其中的层状无机化合物的缓冲溶液的形式与层状无机化合物一起添加到反应系统中。
4.表面活性剂
用本发明的方法测定时，还可以向反应系统中添加各种表面活性剂。添加表面活性剂可以使含有难溶性物质的试样均匀分散，提高试样的润湿性，从而可使之均匀迅速地渗透到试片的试验部分中。因为表面活性剂具有使吸附到界面上的物质分散、溶解等作用，因此对生成的可检测物质由层状无机化合物的吸附造成干扰，或者引起生成的可检测物质溶解，从而削弱本发明的效果。因此，在本发明中，与层状无机化合物组合使用的表面活性剂应选用不妨碍生成的可检测物质与层状无机化合物吸附的表面活性剂。表面活性剂的用量与不妨碍上述吸附为限，少用为宜。当然，为了调整色素等可检测物质与层状无机化合物的吸附强度，可以使用各种公知的与反应系统相适应的表面活性剂，其量可加以控制。
不妨碍吸附的表面活性剂的种类是分子量比生成的色素不大很多的表面活性剂，并且所述表面活性剂的有机性值和无机性值应满足下面的公式：
(无机性值)＝(2.37±0.23)×(有机性值)-186.2±117.1
上述公式是通过研究已知结构的各种表面活性剂的阻碍吸附作用与有机性值和无机性值的关系后得出的。即，给各种官能基或原子指定点数，例如1个碳原子指定的有机性值为20，而羟基的无机性值为100，聚环氧乙烷的有机性值为30，其无机性值为60，硝基的有机性值为70，其无机性值为70等，对构成化合物的官能基和原子来说，将这些点数相加，求无机性值的总和和有机性值的总和，将无机性值和有机性值标绘在直角坐标系中，具有类似性质的化合物位于直角坐标系的同一区域，表现出与化合物的结构无关的共同的性质，这种有机概念图已为人们所公知(甲田善生《有机概念图一基础与应用》第11页、三共出版(1984))。本发明人研究了具有已知结构的许多表面活性剂阻碍吸附作用与无机性值和有机性值的关系，结果发现，不妨碍吸附的表面活性剂在有机概念图中满足上述关系式。虽然有关上述书中的有机概念图的计算数据可用于无机性值和有机性值的计算，但上述数学式是使用本间善夫制作的程序“个人计算机有机概念图”(日本化学软件学会等)提供的换算数据得到的。
不妨碍吸附的表面活性剂的种类和添加量的选择，例如可以按下面①-④中所述进行。
①向含有一定量的绿土、4-AA和N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺的反应液中添加过氧化氢，使之显色。
②向与①相同组成的反应液中按一定的浓度添加表面活性剂，同样添加过氧化氢，使之显色。
③用自然沉降、离心分离、过滤等方法分离出绿土，用分光光度计测定上清液或滤液的色调，比较①、②各自的绿土上生成色素的吸附量。或者，当观察到吸附引起的絮凝的情况下，以絮凝或沉降的程度来进行评价。
④选择不添加表面活性剂时和添加表面活性剂时几乎看不到差别的情况下所用表面活性剂种类和添加量。
在该方法中可以选用的适宜的表面活性剂的种类可以举出：正辛基-β-D-吡喃葡糖苷等糖烷基醚类，正辛基-β-D-硫吡喃葡糖苷、正庚基-β-D-硫吡喃葡糖苷等糖烷基硫醚类，正辛酰基-N-甲基葡糖酰胺、正壬酰基-N-甲基葡糖酰胺等糖酰胺类，β-D-吡喃果糖基-α-D-吡喃葡糖苷一癸酸酯等糖酯，N，N-双-(3-D-葡糖酰氨丙基)脱氧胆酰胺等。
另外，表面活性剂添加量没有特别的限制，相对于层状无机化合物总量的添加比例也没有特别的限制，只要选择与表面活性剂的种类和层状无机化合物的种类及反应系统相适应的量即可，最好是选择能充分发挥表面活性剂效果的量，例如不太多超过水系溶剂中使用的表面活性剂的临界胶束浓度的程度。例如，可以选用正辛基-β-D-硫吡喃葡糖苷的0.3％水溶液、β-D-吡喃果糖基-α-D-吡喃葡糖苷一癸酸酯的0.3％水溶液、N，N-双(3-D-葡糖酰氨丙基)脱氧胆酰胺的0.3％水溶液。
特别是在用本发明的第1-第3方法测定时，最好要使用表面活性剂。
5.具体的测定方法
本发明测定方法的优选实施方案是，预先向反应系统中添加层状无机化合物，使之分散。在分散液中有时会产生半透明的胶体状凝聚物，但本发明中也不一定产生凝聚。这种凝聚可以认为是层状无机化合物与吸附于其上的可检测物质复合体。通过搅拌可使该凝聚重新均匀地分散。另外，在凝聚带来不利时，只要使用磷酸盐系缓冲溶液，就可以提高层状无机化合物的分散性，抑制凝聚的发生。
另外，也可以使最终用于检测的可检测物质吸附在层状无机化合物上，而使之沉降，将可检测物质从反应系统中分离、浓缩，进一步提高测定灵敏度。吸附可检测物质的层状无机化合物的分离方法没有特别的限制，例如可以举出沉降、离心分离、过滤、色谱、电泳、溶剂蒸发等。举例来说，本发明中例举的层状无机化合物的分散液的过滤，可以使用排除界限分子量约1万或孔度约5nm的聚砜制的超滤膜进行。
在本发明中，测定被层状无机化合物吸附的可检测物质。其测定方法可以举出吸光测定方法、荧光测定、发光测定、电化学测定方法、光散射测定方法、反射率测定方法等。优选的方法可以举出以使用吸收光度计进行光吸收分析为代表的比色定量等光学的测定方法。由于本发明中使用的层状无机化合物在可见光～红外光区域基本上都不能吸收，因此，即使是胶体状的分散液或凝胶状，也可以进行测定。另外，直接在分散液的状态下测定时，系统可以选用乳白玻璃等手段。如下文中所述，可以使用层状无机化合物制成能浸渗反应溶剂的多孔质结构体，以该部分作为兼作反应部的检测部制成试片，用该试片进行反射率测定、吸光测定、荧光测定等。另外，还可以使用利用电极测定氧化还原电流或膜电位的电化学测定方法。使吸附可检测物质的层状无机化合物与电极接触，可以高灵敏度地测定电化学应答。
II.本发明的试片
本发明的试片是，用于通过测定试样中的分析对象物质与试剂反应后生成的可检测物质，来测定上述分析对象物质的分析用试片，配备有至少1个试验部分，该试验部分具有用于检测上述可检测物质的检测部。
试验部分是试片内承担试样的吸收、扩散、反应、检测等一系列分析过程的部分，其结构没有特别的限制。除上述可以通过反射率或透射/吸收、荧光等检测可检测物质的检测部外，配备有下列部分：用于吸入试样并导入试验部分、设置在试验部分的末端或末端附近的试样吸入部；用于使试样均匀渗透、扩散到试验部分内的扩散、渗透部；含有能与试样中所含的分析对象物质反应的试剂的试剂部；进行检测反应的反应部；通过与色谱类似的作用分离试样中的成分或检测反应生成的色素等的展开部；利用试样移动的时间控制反应进行的时间控制部；利用吸附作用收集或者除去试样中的成分或生成的色素等的保持部；用于吸收过剩的试液、添加的洗净液和展开液等，防止逆流的，与检测部相对，设置在与试样吸入部相反一侧，试验部分的末端或末端附近的吸收部等。
担负这些试验部分功能的各部可以彼此在功能上叠合，例如，检测部可以兼作试剂部和反应部，检测部可以兼作保持部等，即一个部可以兼有几种作用。
本发明试片的优选实施方案例如可以举出，配备有至少1个多层试验部分，该试验部分由含有能检测可检测物质的检测层(作为检测部)的二层或多个层构成的试片。作为检测层以外的层，可以设置用于吸入试样并导入试验部分中的试样吸入层；使试样均匀渗透、扩散到试验部分中的扩散层；含有与试样中所含有分析对象物质反应的试剂的试剂层；进行检测反应的反应层；设置在反应层与检测层之间、具有除去干扰成分功能的展开层或保持层；用于吸收过剩的试样、添加的洗净液和展开液、防止逆流的吸收层；用于将试验部分固定在支承体上的粘结层等。特别优选的方案是，除了上述检测层外，还含有用于扩散试样的扩散层，以使试样通过该扩散层扩散到达上述检测层。本发明的试片可以是具有1个这样的试验部分的试片，也可以是具有2个或多个试验部分的多项目试片。多项目试片一次可以分析多个试样，另外，对于各项目使用不同的试剂，即使是含有2种以上分析对象物质的试样，也可以同时分析其中的各种分析对象物质。
另一种优选实施方案，例如可以举出具有至少1个试验部分的试片，所述试验部分具有用于检测上述可检测物质的检测区域作为检测部。该试片上，上述检测区域以外的区域可以是下列区域：用于吸入试样并导入试验部分的试样吸入区域；用于使试样均匀渗透、扩散到试验部分内的扩散区域；含有与试样中所含的分析对象物质反应的试剂的试剂区域；进行检测反应的反应区域；通过吸附或分配等与色谱类似的作用分离试样中的成分或由检测反应生成的色素等的展开区域；利用试样移动的时间控制反应进行的时间控制区域；利用吸附作用收集或者除去试样中的成分或生成的色素等的保持区域；用于吸收过剩的试液、添加的洗净液和展开液，防止逆流的吸收区域等。特别优选的实施方案是，除上述检测区域外，还含有用于扩散试样的扩散区域，使滴在试片末端的试样通过该扩散区域，借助于毛细管渗透作用在试片上平面移动到达上述检测区域。在这种场合，上述检测区域也可以具有含有用于检测可检测物质的检测层的、由二层或多层构成的上述多层结构。另外，本发明的试片可以是具有1个由这样的检测区域和试剂区域组成的一个试验部分的试片，也可以是具有2个或多个上述试验部分的多项目试片，该多项目试片一次可以分析多个试样，另外，对于各项目使用不同的试剂，即使是含有2种或多种分析对象物质的试样，也可以同时分析其中的各种分析对象物质。
在本发明中，用于试样中的分析对象物质与试剂反应的反应部也可以与上述检测部分开设置，可检测物质在上述反应部中生成后，被导入上述检测部进行检测。在这种场合，上述检测部最好是设置在试样扩散后通过上述反应部到达的位置。具体地说，最好是从多层型试验部分的表面渗透过来的试样通过扩散层扩散，移动到作为中间层的反应层中，再通过反应层后到达的位置设置检测层。另外，最好是在试片上设置检测区域、反应区域和扩散区域，试样平面移动，通过扩散区渗透，移动到反应区域，并在通过上述反应区域后到达的区域处设置检测区域。
此外，在本发明中，上述检测部也可以同时兼作用于试样中的分析对象物质与试剂反应的反应部，在上述检测部中通过试样中的分析对象物质与试剂的反应生成上述可检测物质。
本发明的检测部，是实际检测通过分析对象物质与试剂反应生成的色素等可检测物质的部分，如上所述，有时也兼作进行上述反应的反应部和含有试剂的试剂部等，在这种场合，通常检测部中预先含有试剂。另一方面，在本发明中，试片也可以具有与上述反应部和试剂部独立的检测部，在这种场合，试验部分中不一定一开始就含有试剂，可以采取在添加试样之前和/或添加之后再加入试剂。另外，也可以采取添加分析对象物质与试剂反应生成的色素等可检测物质的溶液的形式。
本发明的试片通常由这样的试验部分和支承试验部分的片状、管状、棒状的支承部分构成，根据需要还可以附带电极等传感器以及试液吸入装置等。
本发明特别适合于利用下面所述的能生成色素等可检测物质的试剂和反应系统的试片。
作为试剂，与本发明的测定方法一节中所述的一样，只要是其反应生成的色素等可检测物质与本发明的层状无机化合物能产生吸附作用、形成复合体即可，没有特别的限制。
生成吸附在层状无机化合物上的可检测物质的试剂，可以在下列化合物中选取，即通过氧化还原反应、酸碱反应、缩合反应、配合物形成反应等生成色素、荧光色素等可以光学检测的物质的色素前体等化合物，以及生成可以电化学检测的介体(电子传递物质)的氧化体/还原体或配合物的化合物等。
试样、试剂或反应物大多是以水作为溶剂的溶液，上述可检测物质只要是水溶性的，就可以很容易扩散、洗脱，因此，若可检测物质是水溶性的，可以充分发挥本发明的效果。所以，所使用的试剂最好是能生成水溶性可检测化合物的试剂，实际上这样的试剂被大量地使用。但本发明不限于此。试样、试剂或反应物也可以是水以外的溶剂形成的溶液，在这种场合，所用的试剂也可以是能生成被该溶剂扩散、洗脱的可检测物质的试剂。当然，生成在试样溶剂中不溶性的可检测物质的试剂，或反应产物也可用。
作为试剂，只要是生成本发明测定方法一节中例示的可检测物质的试剂均可使用，例如色素前体可以使用具有芳香环等共轭系的化合物，具体地可以举出如下：以4-氨基-1，2-二氢-1，5-二甲基-2-苯基-3H-吡唑-3-酮为代表的成色剂和氢供体(N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺等)色素前体试剂类(氧化缩合后产生醌系色素)；邻联甲苯胺、联苯胺类(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)等氧化生成显色色素的色素前体；2，6-二氯-4-[(4-羟苯基)亚氨基]-2，5-环已二烯-1-酮等色素的无色体(氧化后显色)；4-羟苯基乙酸等氧化后生成荧光物质的化合物；化学发光物质之类的发光物质；四唑鎓盐(还原后生成甲)和1，1′-二甲基-4，4′-联吡啶鎓盐等还原后生成色素的试剂类；溴甲酚绿等随着pH改变而显色或变色的化合物；2-甲氧基-4-吗啉代苯重氮盐等重氮盐(偶联后生成偶氮系色素)、2，3-二甲基-2，3-双(羟基氨基)丁烷(与醛反应后显色)等各种公知的显色反应用试剂；邻苯二甲醛(与组胺反应后生成荧光物质)等各种公知反应用试剂；4-甲基繖形磷酸盐等酶底物；2-(5-溴-2-吡啶基偶氮基)-5-[N-丙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯胺盐等形成配合物而显色或变色的化合物；以及可生成上述可检测物质的化合物。
生成这类可检测物质的反应系统可以举出本发明的测定方法一节中阐述的反应系统，具体地可以举例如下：
(a)包含过氧化氢生成反应或以过氧化氢为氧化剂的氧化反应的反应系统。
(b)包含生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或磷酸化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)的反应，或者以NADH或NADPH作为还原剂的反应的反应系统。
(c)利用在酸性条件下使亚硝酸与芳香族伯胺反应生成重氮盐的反应的反应系统。
(d)包含具有磷酸酯的4-甲基繖形酮等荧光酶底物通过碱性磷酸酯酶的作用使磷酸酯游离、生成荧光物质的反应的反应系统。
(e)包括利用氧化还原酶等使1，4-二氨基苯等介体氧化/还原、生成介体的氧化体/还原体的反应的反应系统。
利用这些反应系统的分析方法可以举出ELISA等免疫测定法、免疫色谱法、尿检查、血液生化检查、比色法等。使用这些分析方法的试片的具体例子在下列文献中有详细描述：H.G.Curme，et al.，ClinicalChemistry，24(8)，1335-1342(1978)、B.Walter，Analytical Chemistry，55(4)，498A(1983)、近藤朝士“分析化学”1984(7)，534、近藤朝士“分析化学”1986(6)，387、分析化学手册第8页(日本分析化学会：改订4版、丸善(1991))、特开平6-213886(北岛昌夫等)、M.P.Allen，等人.，Clinical Chemistry，36(9)，1591-1597(1990)、D.Noble，AnalyticalChemistry，65(23)，1037A(1993)、R.F.Zuk，等人，Clinical Chemistry，31(7)，1144-1150(1985)等。可以用这些方法分析的分析对象物质，可以举出尿或血液等体液中的生物成分，食品、医药、自然环境中存在的微量物质，工业化学物质，废弃物中的微量物质等，本发明的试片可以用于这些分析。
可以使用本发明试片的试样，可以是含有1种分析对象物质的试样，也可以是含有二种或多种分析对象物质的试样。
在本发明试片的试验部分中，可以根据需要含有分析试片中通常使用的公知化合物，例如亲水性聚合物等。
在本发明中，在试片的试验部分中、特别是其中生成色素的部分即检测部中必须含有层状无机化合物。
即，在构成上述试验部分的至少1个检测层或检测区域中必须含有层状无机化合物。具体地说，在由包括检测层在内的二层或多层层状构成的多层型试验部分中，至少在上述检测层中必须含有层状无机化合物。在这种场合，上述检测层以外的层中也可以含有层状无机化合物，例如试样吸入层、扩散层、试剂层、反应层、粘结层、保持层、展开层、吸收层等也可以含有层状无机化合物。
另外，在上述试验部分具有检测区域的场合，至少在上述检测区域中含有层状无机化合物。上述检测区域以外的区域中也可以含有层状无机化合物，例如试样吸入区域、扩散区域、试剂区域、反应区域、展开区域、时间控制区域、保持区域、吸收区域等也可以含有层状无机化合物。在这种场合，检测区域可以是多层结构，构成检测区域的层中至少在检测层中含有层状无机化合物。另外，在其它层中也可以含有层状无机化合物。
在试验部分中除了上述检测部外还具有用于试样中的分析对象物质与试剂反应的反应部的情况下，优选在试样扩散通过上述反应部后到达的位置处设置检测部，这样在反应部中生成的可检测物质移动到含有层状无机化合物的检测部中而被检测出来。
本发明的试片中使用的层状无机化合物，可以使用上述本发明的测定方法一节中例示的层状无机化合物。与本发明的测定方法所述相同，这些层状无机化合物中优选2∶1型粘土矿物，特别是具有离子可交换性的膨润性粘土矿物。在膨润性粘土矿物中，优先选用膨润土、绿土、蛭石或以合成氟云母为代表的膨润性合成云母(或Na型云母)等合成云母(天然云母通常是非膨润性粘土矿物)，特别优选的是合成锂蒙脱石或合成皂石等合成绿土或合成氟云母。它们可以单独使用，也可以二种或多种并用。象本发明这样利用层状无机化合物抑制色素等扩散、洗脱，使其含在试片中的作法以往还没有人尝试过。
另外，出人意料的是，即使在检测部等试验部分中添加上述无机化合物，也不会妨碍检测反应。因此，通过添加该层状无机化合物，不必担心洗脱出，所以可以更准确、简便地使用4-AA和氢供体的反应系统进行检测。
试验部分中含有层状无机化合物的部分最好是多孔质结构体，对于材质没有特别的限制，但最好主要由层状无机化合物构成，或者由层状无机化合物和选自亲水性聚合物、滤膜、滤纸或布、玻璃滤片等纤维集合体、纤维素或硅藻土等有机化合物或无机化合物的微粉末中的至少一种多孔质材料构成。
由层状无机化合物形成的多孔质结构体，可以举出层状无机化合物的溶胶、凝胶、凝聚体、凝结体或它们经干燥或烧结形成的多孔体。在多孔质结构体中可以添加下面将要介绍的缓冲剂。例如，在支承体上滴一滴层状无机化合物的1％分散液，浇注后冷冻干燥，可以得到吸水性好的多孔质层。
支承体可以是片状，也可以是管状或棒状，其材质没有特别的限制，可以是滤纸、无纺布、布、玻璃滤片等纤维集合体；玻璃珠、聚合物珠、二氧化钛等粒状物质；纤维素、硅藻土、可溶性盐类或疏水化多糖类等的粉末、粒状物质或微粉末；滤膜；聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)或聚乙烯等塑料板等有机高分子。特别优选由亲水性聚合物构成的凝胶、表面经过亲水化处理的滤膜或塑料板。
亲水性聚合物可以举出：聚环氧乙烷、聚环氧丙烷等聚环氧烷；羧甲基纤维素、羟乙基纤维素等纤维素衍生物；明胶及其衍生物(例如邻苯二甲酰化明胶等)；其它多糖类及其衍生物(琼脂糖、角叉胶、芰苷、壳聚糖等)；聚乙烯醇；聚乙烯吡咯烷酮；聚甲基丙烯酸盐类(聚甲基丙烯酸钠等以及它们与马来酸的共聚物等)；聚丙烯酰胺；聚甲基丙烯酸类(聚甲基丙烯酸羟乙基酯等)；甲基丙烯酰胺；聚砜；聚酰亚胺；聚苯乙烯；聚碳酸酯；聚醚醚酮；聚甲醛；褐藻酸钠；经过亲水处理(例如照射紫外线或进行硅烷醇处理使之亲水化)的聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯等聚烯烃系树脂等含这些化学结构的聚合物、共聚物、缔合物等。
另外，上述亲水性聚合物最好是利用交联剂进行接枝聚合的网状结构、或通过疏水亲和性缔合作用而不溶于水的聚合物。
这样的亲水性聚合物的具体例子可以举出：由戊二醛交联的聚赖氨酸、聚环氧乙烷交联生成物、聚丙烯酰胺接枝聚合物、聚丙烯酸酯接枝聚合物、淀粉-丙烯酸酯接枝聚合物等。
另外，试验部分中可以同时含有选自亲水性聚合物、滤膜、纤维集合体及有机化合物或无机化合物的微粉末中的至少一种多孔质形成材料和层状无机化合物，形成上述多孔制结构体。形成这类多孔质结构体的方法可以举出：预先制备多孔质结构体形成材料与层状无机化合物的混合液，将其浇注或浸渗到上述支承体中，或者预先用多孔质结构体形成材料制成多孔质膜等多孔质支承体，将层状无机化合物的分散液或上述混合液浇注或浸渗到该多孔质支承体中等。
为制造多孔质结构体时混合层状无机化合物，例如可以采用与亲水性聚合物或微粉末等一起混炼，同时制膜。另外，也可以将层状无机化合物溶解或分散于下面所述的缓冲剂中，将所得缓冲溶液干燥，把该干燥物混合到原料中。
另外，在将层状无机化合物的分散液或混合液浸渗到多孔质支承体中的方法中，使用的溶剂种类没有特别的限制，可以任意使用以往公知的溶剂，例如可以从蒸馏水等水、乙醇等醇类、丙酮等酮类、乙醚等醚类、乙酸乙酯等酯类、氯仿等卤代烃类、苯或甲苯等芳香族烃类等中选择与所用的检测反应系统相适应的溶剂。最好是使用下面所述层状无机化合物溶解或分散于缓冲剂中形成的缓冲液浸渗支持体。溶液或分散液的浓度可以根据反应系统适当选择，没有特别的限制。
下面举例说明含有层状无机化合物的层或区域的制造方法。
制造含有层状无机化合物的层或区域时，可以使用将上述层状无机化合物的溶胶、凝胶、凝聚体、凝结体干燥或烧结形成的多孔质结构体。例如，在塑料板上浇注一滴层状无机化合物的1％分散液，然后冷冻干燥，可以得到吸收性好的多孔质层。
另外，还可以使用选自上述亲水性聚合物、滤膜、纤维集合体及有机或无机微粉末中的至少一种多孔质结构体形成材料进行制造。
亲水性聚合物优先选用明胶、聚丙烯酸或其衍生物、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、多糖类或其衍生物、多肽、多胺或其衍生物等。亲水性聚合物可以以凝胶或凝胶的干燥体的形式使用。
另外，亲水性聚合物也可以是通过添加戊二醛等已知的交联剂调节交联度的凝胶。它们可以单独使用，也可以组合使用。
为了获得上述材料与层状无机化合物复合而成的多孔质结构体，可以使用在使试验部分中含有层状无机化合物的方法一节中已经描述的各种方法。例如，在滤纸中浸渗分散于缓冲溶液中的层状无机化合物的1％的分散液，经热风干燥后可以得到多孔质的区域。另外，将该滤纸的小片粘贴在塑料板上，也可以得到多孔质层。
举例来说，可以采用下述操作程序。在层状无机化合物的3％的分散液中，混合进同等量预定浓度的聚丙烯酰胺水溶液，其中聚丙烯酰胺与层状无机化合物之重量比为1∶1至4∶1，持续搅拌几小时。必要时添加碳酸钠或醋酸等的稀水溶液，将混合液的pH调整至5-9。另外，根据需要使混合液成为碱性，添加N，N-亚甲基双丙烯酰胺达到2％，照射电子束，引起交联反应。将所得混合液涂布在塑料板上，干燥后即可得到多孔质膜。
这样制成的含有层状无机化合物的多孔质结构体，具有良好的吸水性，可用于作为试片的试验部分。当然，试验部分的制作不限于上述例子。例如可以采用各种公知试片的试验部分的制造例。这样的试片，在下列文献中有明确记载：H.G.Curme等人，Clinical Chemistry，24(8)，1335-1342(1978)、B.Walter，Analytical Chemistry，55(4)，498A(1983)、近藤朝士“化学分析”1984(7)，534、R.F.Zuk等人，Clinical Chemistry，31(7)，1144-1150(1985)、近藤朝士“化学分析”1986(6)，387、特开平2-654 1(K.Hildenbrand)、M.P.Allen等人，Clinical Chemistry，36(9)，1591-1597(1990)、特开平3-163361(E.J.Kiser等人)、分析化学便览第8页(日本分析化学会编：改定4版、丸善(1991))、D.Noble，AnalyticalChemistry，65(23)，1037A(1993)、特开平5-157745(真锅秀彦等人)、特开平6-213886(北岛昌夫等人)、特开平6-222061(H.Brandt等人)等。
层状无机化合物的分散液的浓度、与亲水性聚合物的混合比以及要调整的pH值，可以根据层状无机化合物的种类、要吸附的色素种类、所用亲水性聚合物的种类和数量、缓冲剂的种类和数量、混合液的粘度等作为参数选择适宜的条件，以得到所需要的多孔性程度、多孔质层的膜厚、试验部分的机构强度等。
在按上述制成的多孔质结构体中，添加与试液中的分析对象物质反应、生成可检测物质的试剂，可以将该多孔制结构体用来作为试片的试验部分。
层状无机化合物的添加量根据所采用的反应系统确定，根据所使用的层状无机化合物，所加量要能够消除下述弊病：相对于生成物质来说吸附位点过少，生成物质不能完全吸附，残留在溶液中，或者吸附位点过多，使生成物质吸附时浓度产生差异，因此添加量应当适中。为添加到反应系统中层状无机化合物的量适宜，可以对各种层状无机化合物求出相对于色素的总吸附位点数，添加层状无机化合物时应考虑生成的色素最大量不超过层状无机化合物的总吸附位点。
如上所述，因为吸附的程度受缓冲剂的组成(pH、离子强度、形成配合物成分等)影响，因此，通过改变缓冲剂的组成、浓度或pH或者改变吸附到层状无机化合物上的过程中可以与色素等竞争的化合物的添加量，可以调整至所要求的吸附程度。上述所谓可竞争的化合物例如可以举出金属离子、有机胺类、羧酸类、磷酸盐等，另外还可以使用表面活性剂、可溶性聚合物等。
至于所使用的缓冲剂或缓冲液的种类、缓冲剂的pH、浓度等，与在本发明的测定方法一节中记载的一样。
缓冲剂的添加方法没有特别的限制，可以将层状无机化合物溶解或分散在缓冲剂中，制成含有层状无机化合物的缓冲溶液或其干燥物。
另外，制造试片时，在层状无机化合物的分散液中有时会生成半透明的胶体状凝聚体，不过，通过搅拌分散液可以使该凝聚体重新均匀分散。在凝聚会产生不利后果时，可以用磷酸盐缓冲溶液提高层状无机化合物的分散性，从而抑制凝聚的产生。
此外，试验部分中还可以含有各种表面活性剂。添加表面活性剂能提高试验部分等在支承体上的涂布性能。但是，表面活性剂具有使吸附在界面上物质分散、溶解的作用，对生成的可检测物质在层状无机化合物上的吸附形成干扰，或者引起生成的可检测物质的溶解，有可能削弱本发明的效果。因此。在本发明中与层状无机化合物组合使用的表面活性剂，应当选用不妨碍生成的可检测物质与层状无机化合物吸附的哪些表面活性剂。表面活性剂的用量应以不妨碍上述吸附为限度少量使用。表面活性剂的种类和用量的具体例子与上述本发明测定方法一节中所述相同。
                         实施例
下面通过实施例具体地说明本发明。
                         实施例1
按表2所示的最终浓度取POD(过氧化物酶)、色素前体4-AA和N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(以下简称EHSDA)、缓冲剂Bis-tris(pH6.5)和层状无机化合物绿土，向其中添加过氧化氢使其最终浓度达到120μmol/l，反应后得到反应溶液。在450-750nm之间测定所得反应溶液的凝聚部分的吸收光谱。
另外，按表3所示的最终浓度取POD、4-AA、EHSDA和Bis-tris缓冲液，向其中添加过氧化氢使其最终浓度达到120μmol/l，反应后得到反应溶液。同样在450-750nm之间测定所得反应溶液的吸收光谱。
吸光率的测定，使用JascoV-550(日本分光计社制造)、以0.5nm的间隔进行，扫描速度是200nm/分，带宽是1.0nm。使用池长1cm的测定池(聚甲基丙烯酸甲酯制成)，添加绿土时产生凝聚，为了只测定凝聚部，使用0.1ml窄缝。测定结果示于图1中。
                   <表2>
        试剂                    最终浓度
   POD(过氧化物酶)               1U/ml
   4-AA*1                       2mmol/l
   EHSDA*2                      2mmol/l
   Bis-tris缓冲液*3             100mmol/l
   绿土*4                       0.1％
                                 (总3ml)
*1)4-氨基安替比林(4-氨基-1，2-二氢-1，5-二甲基-2-苯基-3H-吡唑-3-酮
*2)N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺
*3)双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷
*4)ル-センタィトSWN(合成绿土：コ-プケミカル公司制造)
                 <表3>
    试    剂                最终浓度
POD(过氧化物酶)             1U/ml
4-AA                        2mmol/l
EHSDA                       2mmol/l
Bis-tris缓冲液              100mmol/l
                            (总量3ml)所使用的试剂如下面的表4中所示。
                           <表4>试剂                     试剂浓度     制造厂家              试剂纯度POD(过氧化物酶)          30U/ml       东洋纺(株)4-AA                     60mmol/l     和光纯药(株)          特级试剂EHSDA                    60mmol/l     SIGMAbis-tris缓冲液           0.25mmol/l   ナカララィテスク(株)  专门制备绿土                     0.3％        コ-プケミカル(株)过氧化氢                               三德化学工业(株)     特级试剂
由图1中的结果可以看出，在色素吸附在绿土上的条件下反应可以与未添加绿土的条件下同样进行。未添加绿土的情况下，最大吸收是593nm，添加绿土时最大吸收是约578nm。
                      实施例2
按表3所示的最终浓度取POD、4-AA、EHSDA和bis-tris缓冲液(pH6.5)，装入池长1cm的石英测定池中，在37℃下保温3分钟。调整温度后添加表5中所示浓度的过氧化氢，开始反应，反应开始3分钟后测定吸光率。测定3分钟后反应到达终点。
测定仪器使用JascoV-550(日本分光计社制造)，测定波长为593nm(最大吸收附近的波长)。根据该结果可以求出未添加绿土时的过氧化氢的校准曲线。
                    <表5>
  过氧化氢浓度(μmol/l)   吸光率
  第1次   第2次   平均
    2001005025136.34.21.6     1.700.850.420.210.100.040.010.01     1.700.850.420.210.100.040.010.01     1.700.850.420.210.100.040.010.01
                      实施例3
[试验方法]
按表2所示的最终浓度取POD、4-AA、EHSDA和Bis-tris缓冲液(pH6.5)和合成绿土，装入池长1cm的测定池(聚甲基丙烯酸甲酯制造)中，在37℃下保温180秒，调整温度。调整温度后按表6所示的最终浓度添加过氧化氢，添加过氧化氢后10秒起测定吸光率，每2秒钟测定一次，持续测定1800秒。测定装置使用JascoV-550(日本分光计社制造)，测定波长为577nm(最大吸收附近的波长)。为了只测定凝聚部，使用0.1ml窄缝。以过氧化氢浓度0μmol/l的测定结果作为空白试验，求出测定开始1800秒后与空白的吸光率的差(ΔAbs)，求出添加绿土后过氧化氢的校准曲线。
[结果]
结果与实施例2的未添加绿土的结果一起示于图2中。对于图2的结果，进一步将纵轴和横轴取对数，所得到的校准曲线示于图3中。由表3、表6、图2和3可以选看出，吸附色素的吸光率与过氧化氢之间存在着相关关系。添加绿土时，在过氧化氢浓度0-200μmol/l之间得到r＝0.999的校准曲线。[r：相关系数]
由图2和图3可以看出，未添加绿土的场合最小检测极限大约是6μmol/l，相比之下，添加绿土的场合大约是3μmol/l，灵敏度提高了。另外，校准曲线的斜率约增至2倍。
                   <表6>
  过氧化氢浓度(μmol/l)     吸光率     ΔAbs
    20010050251 36.34.21.60     3.612.021.010.760.490.400.360.310.31     3.301.700.700.450.180.090.050.00
                     实例4
[试验方法]
按上面表2所示的最终浓度取POD、4-AA、EHSDA和Bis-tris缓冲液(pH6.5)和合成绿土，装入池长1cm的测定池(聚甲基丙烯酸甲酯制造)中，调整温度37℃下保温180秒。调整温度后按最终浓度达到100μmol/l添加过氧化氢，添加过氧化氢后20秒起测定吸光率，每2秒钟测定一次，持续测定600秒。测定装置使用JascoV-550(日本分光计社制造)，测定波长为577nm(最大吸收附近的波长)。为了只测定凝聚部，使用0.1ml用的窄缝。另外，以过氧化氢浓度0μmol/l的测定结果作为空白试验。
另外，按上面表3所示的最终浓度取POD、4-AA、EHSDA和Bis-tris缓冲液(pH6.5)，装入池长1cm的测定池(聚甲基丙烯酸甲酯制造)中，调整温度37℃下保温180秒。调整温度后按最终浓度达到100μmol/l添加过氧化氢，添加过氧化氢后20秒起测定吸光率，每2秒钟测定一次，持续测定600秒。测定装置使用JascoV-550(日本分光计社制造)，测定波长为593nm(最大吸收附近的波长)。使用0.1ml窄缝。
[结果]
结果示于图4中。由图4可以看出，添加绿土具有敏化作用。还发现，添加过氧化氢后约30秒时显色反应达到终点。另外，即使显色后添加绿土，未加绿土时也观察到色素的吸附和凝聚。
                      实施例5
按表7所示的最终浓度，取四唑鎓盐3，3′-(3，3′-二甲氧基-4，4′-亚联苯基)-双[2-(对硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓氯化物(以下简称“四唑鎓盐”)]、缓冲剂磷酸缓冲液(将磷酸氢二钠与磷酸二氢钠混合、调整到pH 8.5)、L-抗坏血酸以及绿土(商品名ル-センタィトSWN：コ-プケミカル公司制造、合成绿土)，装入试管中使之反应、显色。该反应是已知生成不溶于水的甲的反应。将所得显色液稀释10倍，在400-800nm之间测定吸收光谱。另外，为了比较，除了不添加绿土外与上述同样操作，按表7所示的最终浓度取四唑鎓盐、磷酸缓冲液和L-抗坏血酸装入试管中使之显色。在400-800nm之间对所得显色液测定吸收光谱。
吸收率的测定使用日本分光计社制造的分光光度计(JascoV-550)。使用池长1cm的测定池(聚甲基丙烯酸甲酯制)。测定结果示于图5中。
              <表7>
试剂                        最终浓度
四唑鎓盐                    1mmol/l
磷酸盐缓冲液(pH8.5)         100mmol/l
L(+)-抗坏血酸               333μmol/l
绿土                        0.1％或0％
                            (总量3ml)
在未添加绿土的系统中显色呈兰色，最大吸收波长约为633nm。在添加绿土的系统中显色呈紫红色，最大吸收波长约为535nm。由此可以确定，在添加绿土的条件下，反应可以与未添加绿土时同样条件下进行。另外，在未添加绿土的系统中，测定池的内表面上析出被认为是甲的沉淀附着物，反之，在添加绿土的系统中，测定池内表面上没有观察到沉淀或凝聚。另外，由于最大吸收向波长短的一侧移动，因此在使用本实施例同样的显色反应系统的情况下，吸光率的测定最好是添加绿土的系统和未添加绿土的系统各自在其最大吸收波长附近的波长即633nm(未添加绿土系统)、535nm(添加绿土系统)下进行。
                     实施例6
按表8所示的最终浓度，取与实施例5中使用的相同的四唑鎓盐、磷酸盐缓冲液(pH8.5)和绿土装入试管中，在30℃下保温3分钟。保温后按表9中所示的各浓度(0-333μmol/l的范围内)添加L-抗坏血酸，在30℃下进行30分钟反应后测定吸光率(测定波长：535nm)。以未添加抗坏血酸(0μmol/l)的试样作为空白试验，根据测定结果制作校准曲线。
另外，为了进行比较，除了不添加绿土外与上述同样操作，按表8所示的最终浓度取四唑鎓盐和磷酸盐缓冲液装入试管中，在30℃下保温3分钟。保温后按表10所示的各浓度添加抗坏血酸(0-333μmol/l)，在30℃下反应30分钟后测定吸光率(测定波长：633nm)。以未添加抗坏血酸的试样作为空白试验，根据测定结果制作校准曲线。
图6中示出所得到的校准曲线。在未添加绿土的系统中，在抗坏血酸最终浓度41.7-333.3μmol/l的范围内得到r(相关系数)＝0.9972的校准曲线。在添加绿土的系统中，在抗坏血酸最终浓度5.2-133.3μmol/l的范围内得到r＝0.9985的校准曲线。所得到的校准曲线的斜率，添加绿土的系统是未添加绿土系统的约2.5倍，由此可知，添加绿土具有敏化作用。另外，在未添加绿土的系统中，试管内表面上析出被认为是甲的沉淀附着物，反之，添加绿土的系统中试管内没有观察到沉淀或凝聚。
另外，吸收率的测定使用日本分光计社制造的分光光度计(JascoV-550)。使用池长1cm的测定池(聚甲基丙烯酸甲酯制)。
                <表8>
试剂                           最终浓度
四唑鎓盐                       800μmol/l
磷酸盐缓冲液(pH8.5)            100mmol/l
L(+)-抗坏血酸                  0-333.3μmol/l
绿土                           0.1％或0％
                               (总量3ml)
        <表9绿土添加系统>
  抗坏血酸最终浓度(μmol/l)     吸光率(Abs)
    5.210.420.841.766.783.3133.3     0.1740.2590.4370.8181.1651.4042.097
   <表10不添加绿土系统>
  抗坏血酸最终浓度(μmol/l)     吸光率(Abs)
    41.762.583.3125.0166.7250.0333.3     0.1030.1780.2710.4800.7731.3581.903
                      实施例7
按表11所示的最终浓度依次取盐酸、绿土(コ-プケミカル公司制造、商品名ル-センタィトSWN)、2，4-二氯苯胺和亚硝酸钠，混合后添加津田试剂(N，N-二乙基-N′-1-萘基萘乙二胺草酸盐)使之反应生成偶氮系色素而显色。在400-800nm之间测定吸光光谱。另外，亚硝酸钠是以4种浓度(0、8、16和33μmol/l)添加的。结果示于图7中。
另外，为了进行比较，除了不添加绿土外与上述同样操作，按表11所示的最终浓度添加盐酸、2，4-二氯苯胺和亚硝酸钠，然后添加津田试剂使之显色。在400-800nm之间测定吸光光谱。另外，亚硝酸钠是以4种浓度(0、8、16和33μmol/l)添加的。结果示于图8中。另外，图9中示出对于添加绿土的系统和未添加绿土的系统亚硝酸钠浓度33μmol/l条件下的吸光光谱。吸收度的测定使用日本分光计社制造的分光光度计(JascoV-550)。使用池长1cm的测定池(聚甲基丙烯酸甲酯制)。
           <表11>
试剂                     最终浓度
盐酸                     1mol/l
2，4-二氯苯胺            200μmol/l
亚硝酸钠                 0-33μmol/l
津田试剂                 200μmol/l
绿土                     0.1％或0％
                         (总量3ml)
在未添加绿土的系统中显色呈紫红色，最大吸收波长约为540nm。在添加绿土的系统中显色呈紫色，最大吸收波长约为555nm。由此可以确定，在添加绿土的条件下，反应可以与未添加绿土时同样进行。另外，由于最大吸收向波长长的一侧移动，因此在使用与本实施例同样的显色反应系统的场合，吸光率的测定最好是添加绿土的系统和未添加绿土的系统各自在其最大吸收波长附近的波长，即分别在540nm(未添加绿土系统)、555nm(添加绿土系统)下进行。
                    实施例8
按表12所示的最终浓度，取与实施例7中使用的相同的盐酸、2，4-二氯苯胺、亚硝酸钠和津田试剂装入测定池(聚甲基丙烯酸甲酯制)，在30℃下反应10分钟，充分显色后添加绿土，产生凝聚而沉降，添加绿土后30秒开始测定凝聚的吸光率(测定波长：555nm，每1秒测定1次，持续20分钟。为了只测定凝聚的吸光率，使用0.1ml用窄缝。另外，亚硝酸钠是按表13所示的各浓度(0-50μmol/l)添加的。以亚硝酸钠最终浓度0μmol/l的试样的结果作为空白试验，求出与测定开始20分钟后与空白样品的吸光率之差(ΔAbs)，制成校准曲线。
另外，作为不添加绿土的系统，与上述同样按表12所示的最终浓度取盐酸、2，4-二氯苯胺和亚硝酸钠装入测定池中，在30℃下保温3分钟后添加津田试剂，添加10秒后开始测定吸光率(测定波长：540nm)，每1秒测定1次，持续10分钟。另外，亚硝酸钠是按表14所示的各浓度(0-50μmol/l的范围内)添加的。求出测定开始10分钟后的吸光率(Abs)，制成校准曲线。以亚硝酸钠的最终浓度0μmol/l的试样的结果作为空白试验进行测定。本试验中使用的反应系统在10分钟时达到终点。
图10中示出所得到的校准曲线。在未添加绿土的系统中，在亚硝酸钠最终浓度1.6-50.0μmol/l的范围内得到r(相关系数)＝0.9991的校准曲线。在添加绿土的系统中，在亚硝酸钠最终浓度0.4-25.0μmol/l的范围内得到r＝0.9940的校准曲线。所得到的校准曲线的斜率，添加绿土的系统是未添加绿土系统的约2.5倍，由此可知，添加绿土具有敏化作用。
另外，吸收率的测定使用日本分光计社制造的分光光度计(JascoV-550)。使用池长1cm的测定池(聚甲基丙烯酸甲酯制)。
           <表12>
试剂                  最终浓度
盐酸                   1μmol/l
2，4-二氯苯胺          200μmol/l
亚硝酸钠               0-50μmol/l
津田试剂               200μmol/l
绿土                   0.1％或0％
                       (总量3ml)
        <表13绿土添加系统>
  亚硝酸钠取终浓度(μmol/l)     吸光率(ΔAbs)
    0.40.83.112.520.025.0     0.0990.1610.4451.6102.0342.620
         <表14无绿土系统>
  抗坏血酸最终浓度(μmol/l)     吸光率(ΔAbs)
    1.66.312.525.050.0     0.1030.1780.2710.4801.358
                    实施例9
按表15所示的最终浓度，取POD(过氧化物酶)、色素前体4-AA和N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(以下简称EHSDMeA)缓冲剂Bis-tris缓冲液(pH 6.5)和层状无机化合物绿土放入池长1cm的测定池(甲基丙烯酸酯制)中，将该试样在37℃下保温180秒。另外，除了不添加绿土外以相同的组成和浓度制成另一试样，同样进行保温。
对这些试样进行温度调节后，按表15所示各试样中添加过氧化氢，添加过氧化氢20秒后开始测定吸光率，每2秒1次，共测定1800秒。测定使用日本分光计社制造的分光光度计(JascoV-550)。测定波长为630nm。由于添加绿土时产生凝聚，为了只测定凝聚部，使用0.1ml窄缝。另外，制备添加绿土而不添加过氧化氢的相同浓度试样，作为添加绿土系统的本底，对该反应溶液同样进行测定。
             <表15>
试剂                    最终浓度
POD(过氧化物酶)         1U/ml
4-AA*1                 0.05mmol/l
EHSDMeA*2              5mmol/l
Bis-tris缓冲液*3       100mmol/l
绿土*4                 0.1％
过氧化氢                10mmol/l
                        (总量3ml)
*1)4-氨基安替比林(4-氨基-1，2-二氢-1，5-二甲基-2-苯基-3H-吡唑-3-酮)
*2)N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺
*3)双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷
*4)ル-センタィトSWN(合成绿土：コ-プケミカル公司制造)
所使用的试剂如下面表16中所示。
                            <表16>
试剂                 试剂浓度      制造厂家              试剂纯度
POD(过氧化物酶)      30U/ml        东洋纺(株)
4-AA                 1.5mmol/l     和光纯药(株)           特级试剂
EHSDMeA              150mmol/l     同仁化学(株)
Bis-tris缓冲液       0.25mmol/l    ナカララィテスク(株)   专门制备
绿土                 0.3％         コ-プケミカル(株)
过氧化氢             300mmol/l     三德化学工业(株)        特级试剂
结果示于图11。由图11可以看出，未添加绿土的试样从反应开始约3分钟后观察到吸光率降低，而添加绿土的试样没有观察到吸光率降低。由此证实，即使添加绿土，检测反应仍与不添加时同样进行，另外还证实，4-AA与EHSDMeA氧化缩合生成的色素通过吸附在绿土上，不会被过氧化氢氧化分解，从而抑制了其退色。
                      实施例10
按表17和表18所示的最终浓度，取POD、4-AA、EHSDMeA、xBis-tris缓冲液(pH 6.5)和绿土放入池长1 cm的测定池(甲基丙烯酸酯制)，制成5种不同试样(试样№1-5)，将它们分别在37℃下保温180秒。
对这些试样进行温度调节后，添加表18所示之量的过氧化氢，开始反应。添加过氧化氢60秒后，添加表18所示之量的抗坏血酸，添加20秒后测定吸光率，每秒1次，共测定300秒。测定使用JascoV-550(日本分光计社制造)。测定波长为630nm。为了只测定凝聚部分，使用0.1cm用的窄缝。
               <表17>
试剂                      试剂浓度
POD(过氧化物酶)           1U/ml
4-AA                      2μmol/l
EHSDMeA                   2μmol/l
Bis-tris缓冲液            100μmol/l
绿土*1                   (参见表18)
过氧化氢                  (参见表18)
L(+)抗坏血酸              (参见表18)
                          (总量3ml)*1)ル-センタィトSWN(合成绿土：コ-プケミカル公司制造)
                    <表18>
试样编号      绿土      抗坏血酸          过氧化氢
(％)         (mg/dl)    (μmol/l)
1            0          0                 100
2            0          5(284 μmol/l)    100
3            0.1        0                 100
4            0.1        5(284 μmol/l)    100
5            0.1        0                 0使用的试剂如下面表19中所示。
                        <表19>试剂               试剂浓度       制造厂家              试剂纯度POD                30U/ml         东洋纺(株)4-AA               60mmol/l       和光纯药(株)          特级试剂EHSDMeA            60mmol/l       同仁化学(株)Bis-tris缓冲液     0.25mmol/l     ナカララィテスク(株)  专门制备绿土               0.3％          コ-プケミカル(株)过氧化氢           3mmol/l        三德化学工业(株)      特级试剂抗坏血酸           150mg/dl       ナカララィテスク(株)  特级试剂
结果示于表18和图12中。图13中示出图12中0-60秒区间的放大图。表20中示出测定开始后0秒、60秒、30秒的吸光率(Abs)。另外，为了排除由于凝聚而产生的影响，对№3和№4试样求出与№5试样的差(ΔAbs)，结果示于表20中的括号内。
由图12和图13可以看出，在未添加绿土的系统中，添加抗坏血酸后立即发生退色，测定开始时(添加抗坏血酸20秒后)，显色程度只有未添加抗坏血酸时的20％左右，测定开始60秒后(添加抗坏血酸80秒后)变成无色。
相比之下，在添加绿土的系统中，测定开始时(添加抗坏血酸20秒后)保持约90％的显色程度，测定开始60秒后(添加抗坏血酸80秒后)保持约80％的显色程度，300秒后(添加抗坏血酸320秒后)仍可以看到约50％的显色程度。
上述结果表明，通过添加绿土可以抑制因抗坏血酸而引起的生成色素的分解。
               <表20>试样编号    0秒后         60秒后        300秒后
        (ΔAbs)       (ΔAbs)       (ΔAbs)1           1.15          1.14          1.112           0.23          0.00          0.003           1.26(1.16)    1.33(1.23)    1.63(1.49)4           1.16(1.06)    1.07(0.97)    0.84(0.70)5           0.10          0.10          0.14
                       实施例11
按表21所示的最终浓度，取四唑鎓盐3，3′-(3，3′-二甲氧基-4，4′-亚联苯基)-双[2-(对硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓]氯化物(以下简称“四唑鎓盐”)、缓冲剂磷酸盐缓冲液(将磷酸氢二钠与磷酸二氢钠混合、调整到pH 8.5)、L-抗坏血酸以及绿土(商品名ル-センタィトSWN：コ-プケミカル公司制造、合成绿土)，装入测定池(聚甲基丙烯酸甲酯制)，在30℃下保温180秒。然后添加L-抗坏血酸开始反应。添加10秒钟后开始测定吸光率。每秒1次，共测定300秒，观察吸光率随时间的变化。测定波长535nm，反应温度30℃。
另外，为了进行比较，除了不添加绿土外与上述同样操作，按表21所示的最终浓度取四唑鎓盐和磷酸盐缓冲液装入测定池(聚甲基丙烯酸甲酯制)中，在30℃下保温180秒。然后添加L-抗坏血酸开始反应。添加10秒钟后开始测定吸光率。每秒1次，共测定300秒，观察吸光率随时间的变化。测定波长633nm，反应温度30℃。
另外，吸收率的测定使用日本分光计社制造的分光光度计(JascoV-550)。使用池长1cm的测定池(聚甲基丙烯酸甲酯制)。测定波长都是最大吸收波长附近的波长。
测定结果以吸光率随时间变化的曲线的形式示于图14中。在添加绿土的系统中，测定开始后约50秒反应达到稳定，而未添加绿土的系统，测定开始后约300秒反应才达到稳定。由此可知，添加绿土提高了反应速度。
该反应是生成不溶解于水的甲的公知反应，但添加绿土的系统在测定池内没有观察到沉淀或凝聚。
            <表21>
试剂                     最终浓度
四唑鎓盐                 800μmol/l
磷酸缓冲液(pH8.5)       100mmol/l
L(+)-抗坏血酸            83.3μmol/l
绿土                     0.1％或0％
                         (总量3ml)
                    实施例12
按表22所示的最终浓度，取盐酸、绿土(コ-プケミカル公司制造、商品名ル-センタィトSWN)、2，4-二氯苯胺和亚硝酸钠装入测定池(聚甲基丙烯酸甲酯制)中，在30℃下保温180秒钟。亚硝酸钠的浓度在0-50μmol/l的范围，采用1.6、6.3、12.5、25.0和50.0μmol/l5种浓度。
保温后添加津田试剂(N，N-乙基-N′-1-萘基萘乙二胺草酸盐)，添加10秒后开始测定吸光率，每秒1次，共测定600秒，观察吸光率随时间的变化。测定波长555nm，反应温度30℃。
另外，为了进行比较，除了不添加绿土外与上述同样操作，按表22所示的最终浓度取盐酸、2，4-二氯苯胺和亚硝酸钠装入测定池(聚甲基丙烯酸甲酯制)，30℃保温180秒，然后加入津田试剂，添加10秒后开始测定吸光率，每秒1次，共测定600秒，观察吸光率随时间的变化。测定波长540nm，反应温度30℃。
吸收度的测定使用日本分光计社制造的分光光度计(JascoV-550)。使用池长1cm的测定池(聚甲基丙烯酸甲酯制)。两种情况下测定波长都是最大吸收波长附近的波长。
图15-图17中以吸光率随时间的曲线示出测定结果。其中，图15是未添加绿土系统的曲线，图16是添加绿土系统的曲线，图17是亚硝酸钠浓度25.0μmol/l的场合的添加绿土系统和未添加绿土系统的曲线。根据这些曲线，未添加绿土系统在测定开始后300秒左右反应达到终点，而添加绿土系统在测定开始后约30秒反应达到终点。由此可知，添加绿土提高了反应速度。
             <表22>
试剂                  最终浓度
盐酸                  1mol/l
2，4-二氯苯胺         200μmol/l
亚硝酸钠              0-50μmol/l
津田试剂              200μmol/l
绿土                  0.1％或0％
                      (总量3ml)
                  实施例13
按表23所示的最终浓度，取POD(过氧化物酶)、色素前体4-AA和N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺(以下简称EHSDA)以及缓冲剂Bis-tris缓冲液(pH 6.5)，向其中添加过氧化氢，得到显色液。将30μL所得到的显色液滴到在层状无机化合物(合成绿土：商品名ル-センタィトSWN、コ-プケミカル公司制造)的1％分散液(溶剂：蒸馏水)中浸渗后干燥的滤纸(东洋滤纸社制造的№2滤纸)和未经处理的滤纸上，观察其扩散的情况。显色液呈圆形渗透、扩散，测定其直径的最大部分和最小部分，根据其平均值求出色素扩散的斑点的面积。
          <表23>
试剂                最终浓度
POD                 1U/ml
4-AA*1             2mmol/l
EHSDA*2            2mmol/l
Bis-tris缓冲液*3   100mmol/l
过氧化氢            10μmol/l
                    (总量3ml)
*1)4-氨基安替比林(4-氨基-1，2-二氢-1，5-二甲基-2-苯基-3H-吡唑-3-酮
*2)N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺
*3)双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷所使用的试剂如下面表24所示。
                       <表24>试剂              试剂浓度         制造厂家              试剂纯度POD               30U/ml           东洋纺(株)4-AA              60mmol/l         和光纯药(株)          特级试剂EHSDA             60mmol/l         SIGMABis-tris缓冲液    0.25mmol/l       ナカララィテスク(株)  专门制备绿土              1％              コ-プケミカル(株)过氧化氢                           三德化学工业(株)       特级试剂
表25中示出所得到的直径、面积和色斑的色调。另外，图18和图19中示出显色液扩散后滤纸的样子的示意图。
                           <表25>
  直径(mm)   面积(mm2)   色调
  渗透绿土的滤纸未处理的滤纸     7-820-22     44350   青紫青
与未处理的滤纸相比较，浸渗了绿土分散液的滤纸中色素的扩散受到抑制，色斑较小(面积约为1/8)。但显色液中除去色素外的无色部分的扩散与未处理的滤纸扩散程度相同。由此可知，色素选择性地与滤纸中的绿土吸附在一起。
另外，与未处理的滤纸相比，浸渗了绿土的滤纸中色斑的色调更浓，并且色调向波长较短一侧移动。此外，在绿土中浸渗的滤纸即使用水洗，色素也没有洗脱。
由此可知，在滤纸中添加绿土可以使色素吸附在滤纸上，防止色素扩散和洗脱出。
因此，采用本发明的试片，生成的色素不会移动或洗脱，可以提高测定的精度和灵敏度。另外，因为色素不移动或由于试验部分的干燥而引起浓缩，以及即使将试片浸泡在试样中生成色素也不会洗脱，所以可以简便地进行测定。
                      实施例14
将尿试纸(用于测定尿中的亚硝酸盐、葡萄糖、潜血、胆红素和尿胆素原的多项目试纸，是市售的试纸，将各相应的试剂浸渗到滤纸中形成试验部分，与校正用的试验部分一起粘贴在塑料膜上制成)放入按一般配方制成的对照尿中浸渍后立即取出，放置约30秒直至观察到显色，然后将与实施例13中使用的相同的浸渗绿土的滤纸片压在其上面，使色素转移到浸渗绿土的滤纸片上。目视观察滤纸片上的色素的展开。用自来水充分洗净，目视观察褪色的情况。
作为对照，使用未经绿土处理的东洋滤纸№2和№131二种滤纸，同样进行操作。
各试验的测定方法和配方如下，结果示于下面的表26中。
·亚硝酸盐试验：Griess法
在酸性条件下使4-氨基苯胂酸与亚硝酸盐反应，生成重氮盐，再与N-1-萘乙二胺二盐酸盐偶合生成偶氮色素。按此方式，将一张滤纸浸渗0.26mg N-1-萘乙二胺二盐酸盐和0.57mg 4-氨基苯胂酸，将其分割成100份，用一片作为一个试验部分。一片吸收约6μl的溶液。
·葡萄糖试验：
在过氧化物酶催化剂的作用下，使由葡糖氧化酶产生的过氧化氢与显色指示剂(四甲基对苯二胺和愈创树脂，分别为色原体)反应而氧化显色。按此方式，将一片滤纸浸渗葡糖氧化酶470IU、过氧化物酶219PU、四甲基对苯二胺13.0mg和愈创树脂4.3mg，分割成100份，用一片作为一个试验部分。每一片吸收约6μl的溶液。
·潜血试验：
该方法是利用由血红蛋白引起的氢过氧化枯烯的分解，和由形成的活性基氧引起的邻联甲苯胺的氧化显色作用。使用联苯胺类(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺等)代替邻联甲苯胺也可以得到同样的效果。按此方式，将一张滤纸浸渗氢过氧化枯烯52.6mg和邻联甲苯胺7.6mg，分割成100份，用其中一片作为一个试验部分，一片吸收约6μl的溶液。
·胆红素试验：
该方法是在酸性条件下由重氮试剂2-甲基-5-硝基苯胺或磺胺酸和亚硝酸钠生成重氮盐，重氮盐在甘油茶碱存在下与胆红素偶合生成偶氮胆红素。按此方式，将一张滤纸浸渗2-甲基-5-硝基苯胺3.8mg、亚硝酸钠2.1mg和甘油茶碱少量，分割成100份，用其中一片作为一个试验部分。一片吸收约6μl的溶液。
·尿胆素原试验：
该方法是利用在酸性条件下尿胆素原与3，3′-二甲氧基联苯基-4，4′-重氮四氟化硼盐的偶氮偶合反应。按此方式，将一片滤纸浸渗3，3′-二甲氧基联苯基-4，4′-重氮四氟化硼酸盐0.36mg，分割成100份，用其中一片作为一个试验部分。一片吸收约6μl的溶液。
                            <表26>
    色素的扩展     由于洗涤引起的褪色
  试验 浸渗绿土   未处理 浸渗绿土   未处理
   No.2    No.131  No.2  No.131
  亚硝酸盐试验葡萄糖试验潜血试验胆红素试验尿胆素原试验 ○○○○○ ××××× ××××× ○○○○○ ××××× ×××××
色素的扩展         ···  ○：无扩展    ×：大量扩展
由于洗涤引起的褪色 ···  ○：未褪色    ×：有一些褪色
如表26的结果所示，浸渗层状元机化合物的滤纸，吸附色素未扩展洗涤后也没有褪色。由此可知，浸渗层状无机化合物的滤纸能抑制色素的扩散并防止洗脱。因此，本发明的试片，生成的色素不会移动或洗脱，可提高测定的精度和灵敏性。另外，不会发生因试验部分的干燥引起的色素浓缩和移动，即使将试片浸在试样中，生成的色素也不会洗脱，可以简便地进行测定。另外，在多项目试片一中，生成的色素不会污染相邻的试验部分，因此可以缩小试验部分间的距离，因而使试片小型化。
另外，若色素渗透到未处理的滤纸中、不遮光、在室温下使生成的色素暴露于空气中，观察变色和褪色，大约1个月后变成与刚反应后完全不同的显色状态，另一方面，吸附在含有层状无机化合物的滤纸中的生成色素，在不遮光及室温条件下暴露于空气中时，至少3个月内没有观察到色调的变化和褪色。
以上事实表明本发明的实用性，使用本发明的试片，即使在患者家中采集试样，在试片上反应显色后将已经显色的试片邮寄到远距离外的检查中心，也可以得到与刚刚反应显色后相同的测定结果。即，本发明的试片显色稳定，不会发生因干燥引起的色素浓缩和因渗水引起的洗脱，因此可以用来作为邮寄用的试片。
                   实施例15
用刮刀在经过紫外线处理的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜上涂布按下面表27所示制备的溶液，形成厚100μm的涂膜，然后干燥。将该涂膜连同PET薄膜一起切割成1cm见方的小片，按图20所示将其夹于玻璃板之间，且玻璃板间留出500μm的空间，制成反应池。图20中示出该反应池的示意图。
向该反应池中添加入2mmol/l过氧化氢，观察此时的显色情况。另外，除了不添加绿土外制备同样的溶液，同样制成反应池，观察显色的情况。
               <表27>
       试剂                最终浓度
       POD                 1U/ml
       4-AA                2mmol/l
       EHSDA               2mmol/l
       Bis-tris缓冲液      100mmol/l
       绿土*1             0.3％
       HPC-M*2            1％
*1)ル-センタィトSWN(合成绿土：コ-プケミカル公司制造)
*2)羟乙基丙基纤维素
在未添加绿土的涂膜中观察到生成色素从膜中洗脱，而添加绿土的涂膜未观察到色素洗脱。
                    实施例16
本实施例是具有多孔质结构体的检测层的本发明试片的制造配方的例子。图21中示出该试片的示意图。
将滤纸(Whatman公司制造、2 Chr)在按下面表28所示配制的含有酶GOD(葡糖氧化酶)和POD(过氧化物酶)的试剂溶液中浸渍，在40℃下干燥30分钟。将该滤纸切成5mm×5mm片，用双面胶带粘贴到5mm×100mm的白色塑料薄膜的一端上，制成以上述滤纸作为试验部分的试片。
                     <表28>
         试剂                     最终浓度
         GOD                      100U/ml
         POD                      100U/ml
         4-AA                     5g/l
         EHSDA                    3g/l
         磷酸盐缓冲液(pH7.0)      0.1mol/l
         绿土                     1％
在该试片上，用吸移管将6μl血浆滴到试验部分上，或将该试片在采集到玻璃杯内的尿中浸渍，进行反应后用反射计测定检测层的显色强度，可以测出血浆或尿中的葡萄糖浓度。本发明中的含有层状无机化合物的多孔质结构的层，在本实施例的试片中可以用来作为兼作试样吸入层和试剂层及反应层的检测层。
                       实施例17
本实施例是本发明的具有多孔质结构的检测区域的试片的制造方法例。图22中示出该试片的示意图。
将滤纸(Whatman公司制造、2 Chr)在按下面表29所示配制的含有酶GOD(葡糖氧化酶)和POD(过氧化物酶)的试剂溶液中浸渍，在40℃下干燥30分钟。将该滤纸切成5mm×5mm的片，将其压贴到5mm×100mm的另一滤纸(Whatman公司制造、2 Chr)的规定位置(图22的反应区域)上。然后，将另一新的滤纸(Whatman公司制造、2Chr)在按下面表30所示制备的层状无机化合物的分散液中浸渍，室温下自然干燥。将该滤纸切成5mm×5mm片，将其压贴到有反应区域的上述5mm×100mm的滤纸(Whatman公司制造、2 Chr)的规定位置(图22的保持区域)上。这样制成的试片具有试样吸入区域、扩散区域、反应区域、吸附可检测物质的保持区域、吸收多余试样的区域，保持区域兼作检测区域。
                  <表29>
     试剂                    最终浓度
     GOD                     100U/ml
     POD                     200U/ml
     4-AA                    5g/l
     EHSDA                   3g/l
     磷酸盐缓冲液(pH7.0)     0.1mol/l
                  <表30>
     试剂                    最终浓度
     Bis-tris缓冲液          0.1mol/l
     (pH6.5)
     绿土                    1％
将本试片的试样吸入区域放入装在小杯中的血浆或采集到玻璃杯中的尿中浸渍。试样通过试样吸入区域和扩散区域到达反应区域，与试剂混合后发生反应，形成反应液，在该反应溶液通过反应时间调整区域和保持区域后，将试片取出。用反射计测定保持区域中的显色强度，测得血浆或尿中的葡萄糖浓度。
本发明的含有层状无机化合物的多孔质结构，在本实施例的试片中可以用来作为兼作吸附反应液中所含可检测物质(色素)的保持区域的检测区域。
                    工业上的应用
本发明的测定方法可以用于高灵敏度和高精度地测定物质。采用本发明的第1方法，在反应系统中添加粘土矿物等层状无机化合物、吸附可检测物质后测定该物质，可以进行高灵敏度的测定。采用本发明的第2方法，在反应系统中添加粘土矿物等层状无机化合物，色素等可检测物质与层状无机化合物吸附在一起，对可检测物质形成保护作用，可以抑制由于过剩的过氧化氢或还原性的抗坏血酸引起的分解，使可检测物质保持稳定，从而可以防止可检测物质是色素时色素生成后褪色，可以稳定地进行高灵敏度、高精度以的测定。采用本发明的第3方法，在可检测物质的生成反应系统中添加粘土矿物等层状无机化合物，可以提高上述生成反应的反应速度，迅速进行测定。采用本发明的第4方法，在反应溶剂中分散粘土矿物等层状无机化合物，进行可检测物质的生成反应，即使是生成不溶性物质的反应系统，也可以实现高灵敏度的测定。另外，采用本发明的试片，色素等不易扩散和洗脱，可以以高灵敏度、准确性简便地进行分析。
本发明的测定方法可以用于尿或血液等体液中的生物成分、食品、医药和自然环境中存在的微量物质、工业化学物质、废弃物中的微量物质的检测和测定。

Claims (47)

1.分析物的测定方法，该方法是利用包括试样中的分析对象物质生成可检测物质的化学反应的反应系统测定上述可检测物质，从而测定分析对象物质，其特征是，在包括可检测物质的生成反应的反应系统中存在层状无机化合物。
2.权利要求1所述的分析物测定方法，其特征是，该方法包括在上述反应系统中添加层状无机化合物，使可检测物质吸附在该层状无机化合物上的工序。
3.权利要求1所述的分析物测定方法，其特征是，通过使上述反应系统中存在层状无机化合物，抑制可检测物质的分解。
4.权利要求1所述的分析物测定方法，其特征是，通过在层状无机化合物存在下进行上述可检测物质的生成反应，提高上述生成反应的反应速度。
5.权利要求1所述的分析物测定方法，其特征是，构成上述反应系统的反应中至少有一个是生成反应溶剂不溶解的物质的反应。
6.权利要求1-5中任一项所述的测定方法，其特征是，层状无机化合物是2∶1型粘土矿物。
7.权利要求6所述的测定方法，其特征是，2∶1型粘土矿物是膨润性层状粘土矿物。
8.权利要求7所述的测定方法，其特征是，膨润性层状粘土矿物是选自膨润土、绿土、蛭石和合成氟云母中的至少一种。
9.权利要求8所述的测定方法，其特征是，所述的绿土是合成绿土。
10.权利要求9所述的测定方法，其特征是，所述的合成绿土是选自锂蒙脱石和皂石中的至少一种。
11.权利要求1-5中任一项所述的测定方法，其特征是，层状无机化合物是水滑石。
12.权利要求1-5任一项所述的测定方法，其特征是，所述的可检测物质是可以用光学方法或电化学方法检测的物质。
13.权利要求12所述的测定方法，其特征是，所述的可检测物质是可以用光学方法检测的色素。
14.权利要求1-5中任一项所述的测定方法，其特征是，生成所述可检测物质的反应是氧化还原反应。
15.权利要求12所述的测定方法，其特征是，所述的可检测物质是选自电子传递物质、电子供给物质和电子受容物质中的，可以用电化学方法检测的化合物。
16.权利要求14所述的测定方法，其特征是，生成所述可检测物质的反应是氧化还原反应，含有上述形成可检测物质反应的反应系统包括过氧化氢的生成反应或以过氧化氢作为氧化剂的氧化反应。
17.权利要求14所述的测定方法，其特征是，生成上述可检测物质的反应是氧化还原反应，包括生成上述可检测物质的反应的反应系统包含生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或磷酸化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的反应，或者包含有以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或磷酸化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸作为还原剂的反应。
18.权利要求14所述的测定方法，该方法是由分析对象物质经化学反应生成过氧化氢，过氧化氢与可氧化显色的显色剂发生氧化还原反应而生成与上述分析对象物质存在定量相关关系的色素，通过对该色素进行比色定量分析来测定上述分析对象物质，其特征是，使上述氧化还原反应系统中存在层状无机化合物，至少使因过氧化氢而引起的色素分解得到抑制。
19.权利要求3所述的测定方法，该方法是由分析对象物质经化学反应生成重氮盐，重氮盐与偶合试剂发生偶合反应而生成与上述分析对象物质存在定量相关关系的偶氮化合物，通过对该偶氮化合物进行定量分析来测定上述分析对象物质，其特征是，使上述偶合反应系统中存在层状无机化合物，抑制上述偶氮化合物的分解。
20.权利要求3所述的测定方法，其特征是，可检测物质的分解包括由抗坏血酸引起的上述可检测物质的分解。
21.权利要求4所述的测定方法，其特征是，上述可检测物质的生成反应的反应起始物质或反应中间体是可以吸附在层状无机化合物上的阳离子性化合物。
22.权利要求21所述的测定方法，其特征是，所述的反应起始物质或反应中间体是重氮盐。
23.权利要求21所述的测定方法，其特征是，所述的反应起始物质或反应中间体是四唑鎓盐。
24.权利要求5所述的测定方法，其特征是，生成上述可检测物质的反应是四唑鎓盐的还原反应。
25.权利要求1-5中任一项所述的测定方法，其特征是，使上述层状无机化合物以选自分散液、溶胶、凝胶、淤浆、凝聚体、凝结体和烧结多孔体中的任一种形态分散存在于上述反应系统的反应介质中。
26.权利要求25所述的测定方法，其特征是，所述的层状无机化合物是以该层状无机化合物的分散液的形式添加到上述反应系统中。
27.一种分析试片，该试片是采用包括试样中的分析对象物质生成可检测物质的化学反应的反应系统来测定上述可检测物质，从而测定上述分析对象物质的分析用试片，其特征是该试片配备有至少1个试验部分，所述的试验部分具有用于检测上述可检测物质的检测部，且至少在上述试验部分中含有层状无机化合物。
28.权利要求27所述的试片，其特征是，由二个或多个用于检测可检测物质作为检测部的检测层构成的至少一个试验部分，且至少在检测层中含有层状无机化合物。
29.权利要求28所述的试片，其特征是，所述试验部分还含有用于扩散试样的扩散层，试样通过扩散层扩散到达检测层。
30.权利要求27所述的试片，其特征是，配备有至少1个试验部分，所述的试验部分具有用于检测可检测物质作为检测部的检测区，至少在上述检测区中含有层状无机化合物。
31.权利要求30所述的试片，其特征是，所述的试验部分还具有用于扩散试样的扩散区，试样通过该扩散区扩散到达检测区。
32.权利要求30所述的试片，其特征是，所述的检测区域由包含用于检测可检测物质的检测层的两层或多层构成。
33.权利要求27所述的试片，其特征是，所述的试验部分还具有用于试样中的分析对象物质与试剂反应的反应部，在上述反应部中生成可检测物质。
34.权利要求33所述的试片，其特征是，所述的检测部设置在试样扩散通过反应部后到达的位置。
35.权利要求27所述的试片，其特征是，在所述的检测部中通过试样中的分析对象物质与试剂反应而生成上述可检测物质。
36.权利要求27-35中任一项所述的试片，其特征是，所述试片中的含有层状无机化合物的部分由多孔质结构体构成。
37.权利要求36所述的试片，其特征是，所述的多孔质结构体是由上述层状无机化合物形成，或者是由上述层状无机化合物和选自亲水性聚合物、滤膜、纤维集合体以及有机化合物或无机化合物的微粉中的至少一种形成。
38.权利要求27-35中任一项所述的试片，其特征是，层状无化合物是2∶1型粘土型矿物。
39.权利要求38所述的试片，其特征是，2∶1型粘土矿物是膨润性层状粘土矿物。
40.权利要求39所述的试片，其特征是，所述膨润性层状粘土矿物是选自膨润土、绿土、蛭石和合成氟云母中的至少一种。
41.权利要求40所述的试片，其特征是，所述的绿土是合成绿土。
42.权利要求41所述的试片，其特征是，所述的合成绿土是选自锂蒙脱石和皂石中的至少一种。
43.权利要求27-35中任一项所述的试片，其特征是，所述的试验部分中含有试剂。
44.权利要求43所述的试片，其特征是，在向试验部分中添加试样之前和/或添加之后，添加溶解了试剂的试剂溶液，使上述试验部分中含有试剂。
45.权利要求27-35中任一项所述的试片，其特征是，在含有层状无机化合物的部分中还含有缓冲剂或其干燥物。
46.权利要求27-35中任一项所述的试片，其特征是，所述的试剂是可以与分析对象物质反应、生成可用光学方法检测的物质的试剂。
47.权利要求46所述的试片，其特征是，可用光学方法检测的物质是水溶性的。
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