CN1205239C - 聚合物吸附剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有选定孔隙度和渗透率特性的大孔聚合物，上述特性使得硬聚合物基质适用于中压和高压反相液相色谱(RPC)中。本发明还公开了相对于单体相，以选定比例的选定混合致孔剂制备所述聚合物的方法。这些聚合物在大规模的色谱柱中特别适用作固定相，而在较长的使用时间内不会增大压力，同时对目标生物分子如胰岛素，保持了良好的色谱性能。

Description

聚合物吸附剂及其制备方法
本发明涉及新的具有选定孔隙度和渗透率特性的大孔聚合物，上述特性使得硬聚合物基质适用于中压和高压反相液相色谱(RPC)中。这些聚合物在大规模的色谱柱中特别适用作固定相，而在较长的使用时间内不会增大压力。
用于RPC，特别是高效制备方式(例如在生物分子分离和提纯中所需的)的RPC中的固定相，必需在机械上是刚性的，以承受在色谱柱内产生的高操作压力。过去通常用于这些应用中的二氧化硅基质，具有令人满意的机械刚性；然而，二氧化硅基质不能在高pH值条件下操作，这严重地限制了它们在生物分子分离等较宽领域的应用。这一因素限制了对于操作色谱工作人员来说是可能的提纯选择，并对二氧化硅介质的使用寿命产生不利的影响(由于不能在苛刻的条件下清洗，因此它们分解更快)，导致商业化生产过程的总的经济性较差。
另一方面，基于有机聚合物的固定相，典型地可在非常宽的pH值条件下操作，更适用于生物分子的分离。色谱工作人员可选择开发高pH值方法，这对于某些分子来说可提供例如改进的溶解性、选择性和分离介质的容量特性等益处。此外，聚合物树脂还可以在苛刻的高pH值条件下进行清洗，由此提高了色谱柱的寿命，随之改善了方法的经济性。然而，在高效生物分子分离所用的中至高压条件下，现在的聚合物固定相在某种程度上是可压缩的。这种可压缩性对于分离操作来说是有害的，因为它限制了可操作的流率范围，并破坏了柱子中聚合物床体的整体性。例如，下述参考文献公开了用于高压分析操作的代表性柱条件(柱的内径小于0.5cm)的聚合物，其中“壁效应”对于减小聚合物的可压缩性是公知的；然而，这些参考文献没有公开大规模的高压商业化色谱柱操作，这时由于不存在壁效应，人们可以设想出其它的由聚合物的可压缩性所导致的压力聚集：Lloyd，L.L.and Warner，F.P.，Preparative High Performance LiquidChromatography on a Unique High-Speed Macroporous Resin，J.Chromatography，Vol.512，pp 365-376(1990)；和Lloyd，L.L.，RigidMacroporous Copolymers as Stationary Phases in High Performance LiquidChromatography，Review，J.Chromatography，Vol.544，pp 201-217(1991)。
通常在非溶剂存在下由含二乙烯基苯(DVB)的单体混合物的悬浮聚合制得的大孔共聚物，使聚合物具有较宽的孔径分布和表面积。例如，USP 4686269公开了一种用于分析级的液相色谱柱(内径为0.8厘米)的聚合物的制备方法，该聚合物的平均粒径为0.5～50微米，并含有至少60％的多乙烯基芳族单体，该方法使用基于单体总重量为50～300％的有机助溶剂对单体进行聚合；该文献并没有公开具有选定的孔隙度和参透率特性均聚合物的制备方法，上述特性使得硬聚合物基质在通常生产级色谱柱，即内径为2～100厘米，典型地为5～80厘米的高压使用条件下，不产生压缩。
聚合物的可压缩性转移性地通过分离介质限制了流动，在色谱体系中产生了额外的背压，并最终使周期时间变长。需要这样的一种聚合物固定相，在无明显压缩下，它可以承受在典型的RPC方法条件下所产生的中至高操作压力。此外，对于某些目标类的生物分子来说，固定相还必需具有令人满意的物质迁移和容量特性，以产生所需的色谱效能。
本发明所提出的问题是，提供一种适用于生物分子分离和提纯的大孔聚合物固定相，同时它在RPC过程中提供令人满意的压力和流动特性。
本发明提供一种含(a)50～100重量％的一种或多种多乙烯基芳族单体，和(b)0～50重量％的一种或多种单不饱和乙烯基芳族单体聚合单体单元的大孔聚合物；其中该聚合物(i)其总的孔隙度为0.7～2立方厘米每克；(ii)其操作中间孔隙度为0.7～1.9立方厘米每克；(iii)平均粒径为2～600微米；(iv)表面积为200～1500平方米每克；(v)在1MPa(10巴)压力下的流阻值为700至小于1800，在6MPa(60巴)压力下的流阻值为1500至小于7000；和(vi)总的胰岛素容量为75～150克胰岛素/升聚合物，动态胰岛素容量为60～150克胰岛素/升聚合物。
在一优选的实施方案中，本发明提供的上述大孔聚合物(a)其表面积为400～1000平方米每克；(b)操作中间孔隙度为0.9～1.4立方厘米每克；(c)平均粒径为10～75微米；(d)在1MPa(10巴)压力下的流阻值为700至小于1500，在6MPa(60巴)压力下的流阻值为1500至小于5000；和(e)总的胰岛素容量为90～150克胰岛素/升聚合物，动态胰岛素容量为75～150克胰岛素/升聚合物。
本发明还提供一种制备大孔聚合物的方法，该方法包括在100～170％的含疏水性致孔剂(porogen)和亲水性致孔剂的致孔剂混合物，以及0.5～10％的自由基聚合引发剂存在下，在含水悬浮液中聚合0～50％的单乙烯基芳族单体和50～100％的多乙烯基芳族单体；其中所有的百分数均基于单体的总重量；并且：(a)相对于疏水性致孔剂，存在的亲水性致孔剂的重量比为大于1.2/1至3/1；(b)亲水性致孔剂选自一种或多种(C4～C10)链烷醇，疏水性致孔剂选自一种或多种(C7～C10)芳烃和(C6～C12)饱和烃。
本发明还提供一种提纯混合生物分子的水溶液的方法，该方法包括在内径为2～100厘米的液相色谱柱中，使水溶液与上述大孔聚合物相接触，其中柱的操作压力为1-10MPa(10～100巴)。
现已发现，可制备适用于通过高压液相反相色谱进行大规模生物分子分离和提纯的新的大孔聚合物，使其具有选定的孔隙度和渗透率特性。特别地，已发现在特定的聚合条件下，相对于单体相使用特定比例的特定致孔剂溶剂，可出入意料地制得本发明的硬聚合物基质。新的大孔聚合物可用于高压RPC中，而不会有明显的可压缩性和压力聚集，同时对于目标生物分子来说可保持良好的产量和容量(动态的和平衡的)。
除非上下文有明确的说明，在整个说明书中所用的下述术语应具有下述含义。
术语“(甲基)丙烯酸烷基酯”是指相应的丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯；类似地，术语“(甲基)丙烯酸”是指丙烯酸或甲基丙烯酸及其相应的衍生物，如酯或酰胺。除非另加说明，所有的百分数均是基于聚合物或所包含的组合物的总重量，以重量％表示。术语“共聚物”是指含两个或多个不同单体单元，包括位置异构体的聚合物组成。这里使用下述缩写：g＝克；ppm＝(重量/体积)百万分之一份，cm＝厘米，mm＝毫米，ml＝毫升，L＝升。除非另加说明，所列范围应认为是包括的和可结合的，温度为摄氏度(℃)。
相比于现有的材料，适于作RPC固定相的大孔聚合物具有改进的结构刚性，使得这些聚合物可用于商业规模的生产方法。通过使用选定的聚合条件对聚合物基质的结构进行改性，可获得改进的结构刚性。
在制备本发明的大孔聚合物中，改进聚合物基质的孔隙度是很重要的。为有效地分离大的生物分子，固定相优选具有可使分子快速扩散进入和扩散出基质的开孔多孔结构。此外，较高的孔隙度水平提供了大的表面积，这反过来使得基质对于目标分子来说具有较高的容量。最现代地，商业化的聚合物RPC固定相似乎应围绕这些标准进行设计，并在低压力条件下(典型地，从0.1MPa(1巴)至小于1MPa(10巴)，优选0.1-0.5MPa(1～5巴)；1巴压力＝105帕斯卡或105Pa)使用。然而，在较高压力条件下(典型地1MPa-10MPa(10～100巴))，这些基质是可压缩的。本发明的大孔聚合物具有改进的聚合物刚性，同时对于目标分子来说保持有较高的容量和快速的粒子内扩散。
本发明的大孔聚合物适用于提纯溶解在水溶液中的生物分子混合物，它是通过在内径为2～100，优选5～80，更优选10～50厘米的液相色谱柱中，在柱子的操作压力为1-10(10～100)，优选2-8MPa(20～80巴)下，将所述溶液与大孔聚合物接触。典型地，制备级的RPC在2-8MPa(20～80巴)的压力下，于10～50厘米的色谱柱中进行。
所选择的聚合条件是制备本发明大孔聚合物的重要因素。选定的混合致孔剂相对于单体相的比例，以及亲水性致孔剂相对于疏水性致孔剂的比例，据信是制得本发明大孔聚合物的关键参数。
尽管不想受理论的限制，但据信在本发明的情形下，应改变聚合物基质的密度，使得每单位体积的总聚合物中含有更多的固体聚合物，由此增加基质的刚性，进而提高对目标分子的容量。据信致孔剂相对于单体量，以及疏水性致孔剂相对于亲水性致孔剂的平衡等的具体选择，将以有利于结合目标分子(在这里即生物分子)同时提高基质刚性的方式影响孔径分布。
典型地，本发明的交联大孔共聚物为平均粒径是2～600微米(μm)的球形共聚物珠粒。适用于通过高效反相液相色谱法(例如柱子的直径为2～100cm)分离并提纯生物分子的聚合物，典型地其平均粒径为2～150，优选5～100，更优选10～75，最优选10～30μm。适用于通过大规模的吸附法(例如柱子的直径上至几米，或者以发酵原汁清汤的方式)分离生物分子的聚合物，典型地其平均粒径为大于150至600，优选200～500，更优选250～400μm。
典型地，通过悬浮聚合法制得本发明的大孔聚合物，且该大孔聚合物的表面积为200～1500，优选300～1200，更优选400～1000平方米每克(m2/g)。优选大孔聚合物例如为USP 4382124中所公开的那些类型，其中在致孔剂(也称作“相增量剂”或“沉淀剂”)，即为单体的溶剂但为聚合物的非溶剂存在下，通过悬浮聚合在共聚物珠粒中引入孔隙。通常的大孔聚合物，如按照USP 4382124所制备的那些聚合物，典型地包括使用大范围的致孔剂类型、致孔剂相对于单体相的浓度、单体类型、交联剂类型、交联剂用量、聚合引发剂以及引发剂浓度。然而，本发明是基于发现使用某些选定的致孔剂类型、以特定的相对于单体相的浓度使用、特定的单体和选定量的交联剂、以及选定的聚合引发剂的浓度制得的大孔聚合物，在通过高效反相液相色谱法分离并提纯生物分子中，具有意想不到的相应于改进性能的刚性聚合物结构。
可用于适用于本发明的大孔聚合物制备中的适宜的多乙烯基芳族单体包括，例如选自二乙烯基苯、三乙烯基苯、二乙烯基甲苯、二乙烯基萘、二乙烯基蒽和二乙烯基二甲苯的一种或多种单体；应当理解的是，上述每一交联剂的任何位置异构体也是适宜的；优选的多乙烯基芳族单体是二乙烯基苯。典型地，大孔聚合物含有50～100％，优选65～100％，更优选75～100％的多乙烯基芳族单体单元。
除多乙烯基芳族交联剂外，任选地还可使用脂族交联剂，如二丙烯酸乙二醇酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、二乙二醇二乙烯基醚和三乙烯基环己烷。当使用脂族交联单体时，基于总的形成大孔共聚物的单体重量，作为聚合单元其典型含量为大孔聚合物的0～20％，优选0～10％，更优选0～5％。
可用于适用于本发明的大孔共聚物制备中的适宜的单不饱和乙烯基芳族单体包括，例如苯乙烯、α-甲基苯乙烯、(C1～C4)烷基取代的苯乙烯、卤素取代的苯乙烯(如二溴苯乙烯和三溴苯乙烯)、乙烯基萘和乙烯基蒽；单不饱和乙烯基芳族单体优选选自一种或多种苯乙烯和(C1～C4)烷基取代的苯乙烯。适宜的(C1～C4)烷基取代的苯乙烯包括，例如乙基乙烯基苯、乙烯基甲苯、二乙基苯乙烯、乙基甲基苯乙烯和二甲基苯乙烯；应当理解的是，上述每一乙烯基芳族单体的任何位置异构体也是适宜的；优选的单不饱和乙烯基芳族单体是乙基乙烯基苯。典型地，大孔聚合物含有0～50％，优选0～35％，更优选0～25％的单不饱和乙烯基芳族单体单元。
除乙烯基芳族单体外，任选地还可使用非芳族乙烯基单体，如脂族不饱和单体，例如氯乙烯、丙烯腈、(甲基)丙烯酸和(甲基)丙烯酸的烷基酯((甲基)丙烯酸烷基酯)。当使用非芳族的乙烯基单体时，基于总的形成大孔共聚物的单体重量，作为聚合单元其典型含量为大孔聚合物的0～20％，优选0～10％，更优选0～5％。
优选的大孔聚合物选自一种或多种二乙烯基苯共聚物、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，二乙烯基苯-乙基乙烯基苯共聚物，和苯乙烯-乙基乙烯基苯-二乙烯基苯共聚物；更优选的是二乙烯基苯-乙基乙烯基苯和苯乙烯-乙基乙烯基苯-二乙烯基苯聚合物。
适用于制备本发明的大孔聚合物的致孔剂包括疏水性致孔剂，如(C7～C10)芳烃和(C6～C12)饱和烃；以及素水性致孔剂，如(C4～C10)链烷醇和多亚烷基二醇。适宜的(C7～C10)芳烃包括例如一种或多种甲苯、乙苯、邻二甲苯、间二甲苯和对二甲苯；应当理解的是，上述每一烃的任何位置异构体也是适宜的。优选的芳烃为甲苯或二甲苯，或二甲苯的混合物，或甲苯和二甲苯的混合物。适宜的(C6～C12)饱和烃包括例如一种或多种己烷、庚烷和异辛烷；优选的饱和烃为异辛烷。适宜的(C4～C10)链烷醇包括例如一种或多种异丁醇、叔戊醇、正戊醇、异戊醇、甲基异丁基甲醇(4-甲基-2-戊醇)、己醇和辛醇；优选的链烷醇选自一种或多种(C5～C8)链烷醇，如甲基异丁基甲醇和辛醇。优选地，致孔剂混合物含有选自一种或多种(C5～C8)链烷醇的亲水性致孔剂和选自一种或多种(C7～C10)芳烃的疏水性致孔剂。
典型地，基于单体的重量，用于制备表发明聚合物的致孔剂的总量为100～170％，优选110～160％，更优选115～150％，最优选120～140％。当致孔剂的用量大于170％时，填充柱中在高压条件下，聚合物具有较差的流阻值(高可压缩性)；当致孔剂的用量低于100％时，聚合物具有较差的色谱性能(如在柱子的流通测试中由胰岛素容量测定的)。此外，用于制备本发明聚合物的致孔剂是基于混合的溶剂体系，该体系含有疏水性溶剂(“疏水性”致孔剂)和疏水性较低的溶剂(“亲水性”致孔剂)。应当理解的是，亲水性致孔剂具有一定的有限的水溶解度(例如0.5～5％)，它比疏水性致孔剂(典型地水溶解度为10～100ppm或更小)具有更大的水溶性。
典型地，亲水性致孔剂与疏水性致孔剂的比例为大于1.2/1至3/1，优选1.3/1至2.7/1，更优选1.4/1至2.5/1，最优选1.6/1至2.4/1。当亲水性/疏水性致孔剂的比例为约1.2/1和更低时，聚合物具有可接受的流阻性能，同时其色谱性能(在胰岛素容量测试中由受限的质量传递进入值测定)降低。当亲水性/疏水性致孔剂比例大于3/1时，聚合物的总的容量性能(在柱子流动测试过程中由降低的胰岛素吸附量测定)将降低。典型地，混合致孔剂含有(C7～C10)芳烃和(C4～C10)链烷醇；优选地，混合致孔剂含有二甲苯和甲基异丁基甲醇。
适用于制备本发明聚合物的聚合引发剂包括单体可溶性引发剂，如过氧化物、氢过氧化物和相关的引发剂；例如过氧化苯甲酰，叔丁基过氧化氢。过氧化二异丙苯，过氧化四氢萘，过氧化乙酰，过氧化丙酰，过辛酸叔丁酯(也称作叔丁基过氧-2-乙基己酸酯)，过辛酸叔戊酯，过苯甲酸叔丁酯，二过对苯二甲酸叔丁酯，过氧化二碳酸二环己酯，二(4-叔丁基环己基)过氧化二碳酸酯和过氧化甲乙酮。同样适用的还有偶氮引发剂，如偶氮二异丁腈，偶氮二异丁酰胺，2，2’-偶氮二(2，4-二甲基戊腈)，偶氮二(α-甲基丁腈)，以及二甲基-、二乙基或二丁基偶氮二(甲基戊酸酯)。优选的过氧化物引发剂为过氧化二酰基，如过氧化苯甲酰，和过氧酯如过辛酸叔丁酯和过苯甲酸叔丁酯；更优选的引发剂为过氧化苯甲酰。基于乙烯基单体的总重量，过氧化物引发剂的适宜用量为0.5～10％，优选1～9％，更优选2～7％，最优选3～5％。最优选地，基于单体的总重量，自由基引发剂的存在量为2～7％，且选自一种或多种过氧化二酰基和过氧酯。
适用于制备本发明大孔聚合物的分散剂和悬浮剂为具有羟烷基纤维素主链和含1～24个碳原子的疏水性烷基侧链的非离子表面活性剂，其中平均1～8个、优选1～5个氧化乙烯基团取代了羟烷基纤维素主链的每一重复单元，烷基侧链的存在量为，每100个羟烷基纤维素主链中的重复单元含有0.1～10个烷基基团。羟烷基纤维素中的烷基基团可含有1～24个碳原子，且可以为线性、支化或环状的。更优选的是每100个葡糖酐单元含有0.1～10个(C16)烷基侧链、且大约2.5～4个氧化乙烯基团取代了每一葡糖酐单元的羟乙基纤维素。基于总的水相重量，分散剂的典型用量为约0.01～4％。
其它适用于制备本发明大孔聚合物的分散剂和悬浮剂为含有亲水性主链的聚合物，它们可在两相的界面处使其亲油部分取向于单体相并使其亲水部分取向于水相。这些聚合物分散剂包括纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇和淀粉等。也可以使用分散剂的混合物。这些其它的分散剂是次优选的，因为它们倾向于制得某些程度上更大量的聚结的或其它不期望的物质。
一种典型的大孔共聚物的制备例如可包括，制备含悬浮助剂(如分散剂、保护胶体和缓冲剂)的连续水相溶液，然后与单体混合物混合，其中单体混合物含有50～100％的多乙烯基芳族单体、自由基引发剂和基于每一份单体混合物为1～1.7份的混合致孔剂(疏水性和亲水性致孔剂)。然后将单体/混合的致孔剂混合物在升高的温度下聚合(典型地例如为40～120℃，优选60～100℃；聚合1～20小时，优选3～15小时)，随后从所得的聚合物珠粒中通过各自方式将致孔剂除去；例如对于甲苯、二甲苯和(C4～C10)醇，可通过蒸馏或溶剂洗涤除去，对于多亚烷基二醇可通过水洗除去。然后通过通常的方式，如脱水随后干燥，分离出所得的大孔共聚物。
任选地，大孔聚合物的制备可包括酶处理，以净化残留有聚合过程中所用分散剂和悬浮剂的聚合物表面。酶处理典型地包括在聚合过程中、聚合后或聚合物分离后，将大孔聚合物与酶材料(选自一种或多种纤维素分解酶和蛋白水解酶)接触。在关于聚合物树脂的制备过程中使用酶的问题，可进一步一般性地和具体地详细参考日本专利申请61-141704和57-98504。适宜的酶包括，对于基于纤维素的分散剂体系例如为纤维素分解酶，如β-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖基水化酶，β-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，β-1，4-葡聚糖-4-葡萄糖水化酶，和β-1，4-葡聚糖-4-纤维素生物水化酶；对于基于明胶的分散剂体系例如为蛋白水解酶，如尿激酶、弹性蛋白酶和肠激酶。典型地，基于总的聚合物重量，相对于聚合物所用酶的量为2～35％，优选5～25％，更优选10～20％。
本发明的大孔聚合物特别适用于填充色谱柱应用，其中聚合物的孔隙度和机械强度使得允许在高产出速率下进行高效生物分子分离和提纯，而不会在较长的使用中产生压力集结。
任选地，还可对大孔聚合物进行涂敷，或者通过公知的方法如通常的磺化、氯甲基化和胺化法等，用各种通常可离子化的官能团(弱酸官能团，如羧酸基团；弱碱官能团，如伯、仲或叔胺官能团；强酸官能团，如磺酸基团；强碱官能团，如氯化或羟基化季铵盐基团)对大孔聚合物进行后功能化处理。
本发明大孔聚合物的特征在于改进的渗透性能(低流阻)，这是提高的刚性聚合物结构和选定的在聚合过程中引入到聚合物中的孔隙度的结果。由达西定律(方程1)，渗透率(K)与柱中产生的背压有关：
     ΔP＝μV/[K(dp)2]            方程1
其中：μ＝粘度(毫帕斯卡·秒或厘泊)
      V＝线性粘度(cm/hr)
      ΔP＝压力降(巴)
      dp＝聚合物的平均粒径(微米)
上述各变量的单位以其通常的方式表达；应当理解的是，需要单位转化以使方程1无量纲。聚合物的刚性越大(即可压缩性较小)，则聚合物的渗透率越大，对于任何给定的溶剂粘度、线性速度和粒径的结合，则转化成较低的背压。在对于色谱分离和提纯应用来说为典型的层流条件下，柱中的背压还可通过Carman-Kozeny方程(方程2)来表达：
      ΔP＝150·[(1-ε)2/ε3]·μV/(dp)2    方程2
其中：ε＝粒子间的空隙体积(cm3/cm3)
关于达西定律和Carman-Kozeny方程(方程1和2)，可一般性地和具体地参考例如Fundamentals of Preparative and Nonlinear Chromatography，G.Guiochon，S.Goshan Shirazi and A.Katti；Academic Press(1994)and UnitOperations in Chemical Engineering，W.L.McCabe，J.C.Smith and P.Harriott；McGraw Hill(1985)。
结合方程1和2可以看出，色谱柱中的渗透率(或流阻)与聚合物树脂床的粒子间空隙体积(即聚合物粒子之间的体积)有关；ε表示每单位体积聚合物床的空隙体积。该关系由方程3表示：
      1/K＝150·[(1-ε)2/ε3]             方程3
在本发明中，定义聚合物的“流阻”值为渗透率的倒数。“流阻”值将表明聚合物在中至高压条件下的表现：低流阻值表示可压缩性低，高流阻值表示可压缩性差。
此外，按照达西定律，渗透率或者流阻的表达中均包括粒径的影响(方程1中的dp)。本发明的一个目的是通过提高聚合物的刚性来改进流阻，而不考虑粒径的影响。应当理解的是，由方程1和2所示的，对于给定的聚合物，仅较小粒径将产生更高的背压。
典型地，本发明的大孔聚合物在1MPa(10巴)的操作压力下(中压)，其流阻值(即1/K)为700～小于1800，优选700至小于1500，更优选小于1300。在高压(以6MPa(60巴)为代表)操作下，大孔聚合物的流阻值为1500至小于7000，优选1500至小于5000，更优选小于4500。适用于RPC的大孔聚合物，(i)在10巴的压力下其流阻值小于1800，(ii)在6MPa(60巴)的压力下其流阻值小于7000。在商业RPC柱的中压至高压下，流阻值超过上述范围的聚合物，不能提供足够的抗压缩性，随之带来的问题是在操作过程中产出降低，柱压集结。
本发明大孔聚合物的特征在于由用于制备聚合物的致孔剂类型和比例所产生的选定的孔隙度和孔径分布。用MicromereticsTM ASAP-2400氮气孔隙测试仪测定孔隙度。按照IUPAC命名原则，孔隙度如下定义：
    微孔＝小于20埃的孔
    中孔＝20～500埃的孔
    大孔＝大于500埃的孔
在本发明中，“操作上的”微孔定义为直径小于50埃的孔，“操作上的”中孔定义为直径在50～500埃之间的孔。这里所用的“操作上”的孔隙度与按照IUPAC命名原则所定义的孔隙度的微小差别，是由于这样的事实，即在本发明的大孔聚合物中，为容纳感兴趣的生物分子的吸附，50埃是一个更适宜和接近的截止点(相对于20埃)。
典型地，本发明大孔聚合物的总的孔隙度为0.7～2，优选0.9～1.8，更优选1.0～1.7cm3/g。典型地，大孔聚合物的操作上的中孔隙度为0.7～1.9，优选0.8～1.7，更优选0.9～1.4cm3/g。典型地，大孔聚合物的操作上的微孔隙度为0～0.5，优选0～0.3，更优选0～0.2，最优选0至小于0.1cm3/g。典型地，大孔聚合物的大孔隙度为0～0.6，优选0～0.5，更优选0～0.3cm3/g。以总容量的形式，若大孔隙度值大于约0.6cm3/g，则对于目标分子尺寸和形状的生物分子来说，聚合物的工作容量降低。
对于大规模分离和提纯具有类似尺寸和分子构型的生物分子来说，用胰岛素容量作为用作适宜介质的聚合物基质的容量的指示。本发明大孔聚合物的动态胰岛素容量为60～150g/L，优选70～150g/L，更优选75～150g/L。该大孔聚合物的总胰岛素容量一般为75～150g/L，优选为80～150g/L，更优选为90～150g/L。动态容量是衡量聚合物基质可以多么快速地吸收生物分子的一个量度，并定义为当出现1％漏失(相对于吸附在聚合物上的总的胰岛素)时的漏出点处的胰岛素容量。胰岛素容量以g/L定义，即克胰岛素/升聚合物树脂。适用于高效、大规模生物分子的制备色谱的本发明的大孔聚合物，典型地，其动态和总的胰岛素容量值分别为60和75g/L；优选分别为70和80g/L；更优选分别为75和90g/L。
对于一种给定的生物分子(例如胰岛素)，聚合物树脂的总的容量是很明显的，因为它与提纯过程中可负载在柱子上的特定分子的质量有关。对于提纯方法来说很重要的首要经济因素(柱子的产出、溶剂的用量、工作或时间周期)与负载在柱子上的质量直接相关。
聚合物树脂的动态容量是很重要的，因为对于特定的分子，它与聚合物的传质效率有关，并且它指示了提纯可进行的时间表度。较低的动态容量说明聚合物基质不适于高速提纯方法。
在下述实施例中详细说明了本发明的一些实施方案。除非另加说明，所有的比例、份数和百分数均以重量计，所有所用的试剂均具有良好的商业质量。连同相应的说明，下面列出了实施例和表中所用的缩写：
MIBC＝甲基异丁基甲醇(4-甲基-2-戊醇)
DVB＝二乙烯基苯(间/对异构体的混合物)
EVB＝乙基乙烯基苯(间/对异构体的混合物)
BPO＝过氧化苯甲酰
rpm＝每分钟的转数
v/v＝体积/体积
w/v＝重量/体积
μm＝微米
nm＝纳米
g/L＝克/升
cm3/g＝立方厘米/克
μl＝微升
NA＝未分析
实施例1
该实施例说明本发明大孔聚合物的制备。
通过混合下述组分在一1升的烧杯中制备有机单体相：180g二乙烯基苯混合物(80％DVB/20％EVB)，73g邻二甲苯，147gMIBC，和10.6gBPO(纯度75％，25％水)。这些量对应于122％的混合致孔剂(基于总的单体)，亲水性致孔剂/疏水性致孔剂比例为2.0，以及4.5％的自由基引发剂BPO(基于总的单体)。在氮气气氛下将该混合物搅拌20分钟。
向一配有冷凝器、机械搅拌器、热电偶和氮气导入口的2升4颈反应烧瓶中，通过混合下述组分制备水溶液：783g去离子水，5.0g CulminalTM MHEC-8000(甲基羟乙基纤维素，由Hercules Chemical Company得到，20℃下2％水溶液的粘度为8000毫帕斯卡·秒(mPa·s＝厘泊，cP))，0.158g十二烷基硫酸钠，2.94g 50％的氢氧化钠(水溶液)和3.13g硼酸。在将温度迅速升高至80℃的同时，以250rpm的速度搅拌溶液，保持1小时。然后通过反应器的空气冷却在30分钟内将溶液冷却至室温。在固体反应物完全溶解后，停止搅拌并将有机相(上述制备的)加入到反应烧瓶中。
将反应混合物(混合的有机相和水相)在室温下以300rpm的速度搅拌20分钟，然后经47分钟加热到80℃。将反应混合物保持在80℃12小时，以使反应物聚合。然后将反应混合物转移到配有搅拌的压力容器中，并在100℃下加热5小时，以将剩余的反应物转化并完成聚合。
聚合反应完成后，在搅拌的同时调节反应混合物的温度至50℃。通过加入约3g硼酸，然后缓慢加入10％的硫酸(水溶液)，调节水/聚合物混合物的水相pH值，直至最终pH值调节至5.0。经24小时，以4等重量份，通过将酶粉末撒入反应器中，而向水/聚合物混合物中加入总量为25.0g的β-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(CellulaseTM 4000，由Valley Research，Inc.得到)。在酶处理的过程中温度保持在50℃。然后用50％的氢氧化钠(水溶液)将水/聚合物混合物的水相pH值调节至12.0，并将温度升高至90℃，保持2小时。将水/聚合物混合物冷却至室温，从烧瓶中移出，并放入到1升色谱柱中。从聚合物中过滤掉水相，然后用2升去离子水洗涤聚合物的填充床，然后用3.5升丙酮并最后用7升去离子水洗涤。然后在2.5mm(0.1英寸)汞柱真空下，于100℃对水润湿的聚合物干燥16小时。
按照上述制备聚合物1-4～1-11，所不同的是如表1所列改变了致孔剂百分数、MIBC/二甲苯比例和％BPO；聚合物样品1-6相应于上述的描述。表1中所列的所有带有后缀“C”的聚合物均被认为是与本发明进行对比的聚合物。聚合物样品1-5～1-9被认为是本发明大孔聚合物的代表。聚合物样品1-12C、1-13C和1-14C为商品可得的色谱级多乙烯基芳族聚合物，它们与按照上述制备的聚合物样品一起进行评价。
商品聚合物1-12C为30μm粒径的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)材料，由Amersham-Pharmacia Company，Uppsala，Little Chalfont，UK.，以SourceTM30RPC获得。商品聚合物1-13C为15μm粒径的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)材料，由Amersham-Pharmacia Company，Uppsala，Little Chalfont，UK.，以SourceTM15RPC获得。商品聚合物1-14C为15μm粒径的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)材料，由Polymer Labs Ltd.，Shropshire，UK.，以PLRP-S 300获得。
实施例2
该实施例描述了对本发明的大孔聚合物的胰岛素结合量的评价。将约5ml体积的样品填充到小级别的测试柱(内径1.0cm，长度6.3cm)中，并评价其从水溶液中对牛胰岛素的正面吸附；设计该测试的目的是要确定聚合物基质是否允许在典型的使用条件下，对目标探针分子(例如胰岛素)可进行快速有效的传质并具有高的容量。此外，将约20ml体积的样品填充到大一些级别的测试柱(内径1.0cm，长度25cm)中，并进行胰岛素的分级/分离；用该测试来证实聚合物基质在典型的方法条件下具有令人满意的性能。
将5克干燥的聚合物树脂(除非另加说明，均按照实施例1制备)与35ml 20％的乙醇/水(v/v)混合，并使其在室温下放置至少2小时。然后以150cm/hr的线速度，通过以20％v/v乙醇/水溶液进行流动填充，而将聚合物浆液填充到OmnifitTM玻璃柱中(尺寸：6.3cm长，10mm内径，由Millipore Corp.获得)。通过向柱中注入50μL于去离子水中的1％氯化钠溶液脉冲，同时以40cm/hr的线速度使20％v/v乙醇/水洗脱液流动，来证实柱子填充的质量。用HewlettPackard ChemstationTM软件计算柱子的效率(塔板数/米)和不对称性。可接受的柱填充参数的目标值为，效率最小是5000塔板/米，不对称性为0.8～1.8。
以5克/升水的浓度制备牛胰岛素(由Sigma Chemical Co获得)溶液。以150cm/hr的线速度将总量为200ml的该溶液泵入到柱中，用UV分光光度仪(SpectraflowTM 783，由ABI Analytical，Kratos division获得)，在291nm波长处检测流出液中牛胰岛素。
通过在UV相应曲线中，记录下在1％胰岛素漏失点(相对于吸附在聚合物树脂上的总的胰岛素的量)处吸附在聚合物树脂上的胰岛素的量，得到聚合物树脂的动态容量(g/L)。通过用UV分光光度仪测定流入液和流出液的胰岛素浓度，然后进行质量平衡，来确定树脂的总的容量(g/L)。结果总结于实施例3的讨论中。
实施例3
该实施例描述了如何评价本发明大孔聚合物的渗透率特性，即抗压缩性。聚合物的特征在于其“流阻”或1/K值(见方程3)。
在工业化的高压液相色谱中，经常使用配有活塞的柱子，该活塞直接在树脂上施加力(压力)。优选使活塞保持主动地压缩床体、其压力为等于或大于整个色谱周期中的最大预期流动压力。为测试本发明聚合物的渗透率性能，将聚合物树脂填充到ProChromTM Dynamic Axial Compression柱(型号LC.50)中，并用开始设定为1MPa(10巴)，然后设定为6MPa(60巴)压缩压力的活塞进行压缩。该测试的目的是表征每一样品的渗透率性能(抗压缩性)。详述如下：
将大约100克干燥的聚合物树脂(相当于大约500ml湿的树脂)加入到700ml20％乙醇/水(v/v)溶液中，并将其在室温下放置至少2小时。将该聚合物样品搅拌成浆液形式，并倒入5cm(内径)×54cm(长度)ProchromTM Dynamic AxialCompression L.C.50 316L不锈钢柱子(由Prochrom S.A.，France制造)中。使一活动的活塞部件(由转化为水压的外部气压驱动)在聚合物树脂床上施加可变的压力。首先将活塞设定为传递约1MPa(10巴)的水压；当活塞不再移动时，认为树脂床被压缩。然后测量床体的高度。使10ml 20％乙醇/水(v/v)溶液流过树脂床30分钟，以使床体达到平衡。
通常，为测定聚乙烯基芳族聚合物床体的粒子间空隙体积(或者渗透率)，出于与探针分子的相容性考虑，必须选择移动相以使其消除或降低探针分子与聚乙烯基芳族聚合物的疏水性表面之间的相互作用。可使用通常的探针分子，如线性聚苯乙烯、Blue葡聚糖和聚乙二醇，但需要使用非极性移动相(如四氢呋喃和甲苯)。然而在下述方法中使用的探针分子，不需要使用非极性溶剂，并可用于任何水-有机溶剂体系中，例如20％的乙醇。
为测定柱子中总的空隙体积(粒子内的和粒子间的)，向体系中注入2ml 1％氯化钠(w/v，在20％的含水乙醇中)。用电导率检测器检测盐。为仅测定粒子间空隙的体积，将含1％(w/v)0.1～0.9μm的离子化乳液聚合物或研细的离子化聚合物(例如带有可离子化官能团的交联聚苯乙烯，可离子化官能团例如为弱酸官能团(羧酸盐基团)，强酸官能团(磺酸盐基团)，或氯化季铵盐基团)的20％乙醇(含水)溶液，注入到流过床体的20％乙醇(含水)细流中。通过设在280nm处的UV检测器检测这些粒子。由于离子化聚合物探针粒子的尺寸，这些粒子不能穿过本发明聚合物树脂的孔隙。由于离子化聚合物探针粒子的表面性质(这些粒子具有芳族结构，且具有高浓度的分布于整个表面上的离子型基团)，因此可防止对本发明聚合物树脂的疏水性吸引/持留。
测定聚合物床体的总的空隙体积(盐探针洗脱体积)，并将其与聚合物粒子外的空隙体积(离子化的乳液或研细的聚合物洗脱体积)相结合。用这些值及测定的床体积，计算方程2和3中的ε。在1MPa(10巴)下测试后，再进行同样的6MPa(60巴)下的评价。
表1列出了本发明大孔聚合物(聚合物1-5至1-9)和各种对比聚合物(带后缀C的聚合物)的流阻值和胰岛素容量。参见实施例1中有关聚合物及其在表中相应确认的详细描述。表1中的项包括的致孔剂的百分数(基于总的单体)，亲水性致孔剂/疏水性致孔剂的比例(MIBC/二甲苯)，以及用于制备聚合物的自由基引发剂的百分数(基于总的单体)；在中压和高压下的以g/L表示的胰岛素容量，以及流阻值；在每一给定聚合物样品的胰岛素容量和流阻值之后的、作为附带说明的()项，给出了按照相同方法(相同的致孔剂百分数、亲水性致孔剂/疏水性致孔剂比例、和％BPO)制备的不同聚合物的数目，对这些不同的聚合物进行测试并进行平均，得到表1中所示的胰岛素容量和流阻值。表2中就选定的样品还给出了其它的聚合物性能(表面积、孔隙度)。
对比聚合物1-1C说明，致孔剂的用量太高使得高压下的压缩性不能令人满意，而聚合物1-10C和1-11C说明，致孔剂用量太低，虽然可获得令人满意的压缩性(低流阻值)，却使胰岛素容量极低。对比聚合物1-1C、1-2C和1-3C说明，降低致孔剂的用量倾向于改善流阻性能；但高压操作下的流阻性能仍不能令人满意。此外，低百分数的致孔剂和低MIBC/二甲苯比例结合时(对比聚合物1-4C)，动态胰岛素容量不能令人满意。
聚合物1-5至1-9是出人意料的高胰岛素容量和低流阻性能(高压下)相结合的代表，这是通过将用于制备本发明聚合物的致孔剂百分数和亲水性致孔剂/疏水性致孔剂比例参数进行平衡得到的。
商品聚合物样品1-12C和1-13C其压缩性能均不能接受，尽管聚合物1-12C具有足够的胰岛素容量性能。尽管商品聚合物1-14C具有在边缘上可接受的压缩性能，但其胰岛素容量仍低于可接受的值。
                                         表1
                                   流阻和胰岛素容量
    聚合物     致孔剂百分数     MIBC/二甲苯     ％BPO   胰岛素容量动态/总的   1/6MPa(10/60巴)下的1/K
    1-1C1-2C1-3C1-4C1-51-61-71-81-91-10C1-11C1-12C1-13C1-14C     17814414412212212212212212210067———     1.21.21.21.21.62.02.02.42.71.21.2———     1.51.54.54.54.54.58.24.54.51.51.5———   86/9286/108(3)86/12142/10871/11382/103(4)63/10581/9379/917/525/1586/91NA53/57   1,870/17,301,870/10,100(3)1,050/7,300NANA890/4,060(2)760/3,100NA1,050/3,500NA1,320/3,1001,180/12,0001,600/8,5701,660/6,270
                                       表2
                                其它的聚合物性能
  聚合物编号ID   表面积(m2/g)   总的孔隙度(m3/g)   操作上的中孔隙度(cm3/g)     操作上的微孔隙度(cm3/g)   大孔隙度(cm3/g)
  1-1C1-3C1-61-81-91-12C1-13C1-14C   743621528549524611481299   2.31.81.61.551.62.81.61.3   0.761.31.241.141.00.80.50.7     0.30.20.20.20.20.20.20.1   1.20.30.160.20.41.80.90.5
实施例4
该实施例描述了制备本发明的大孔聚合物时进行和不进行酶处理的影响。聚合物在使用中由于聚合物的表面污染(例如离子或带电荷的物质)所导致的珠粒间不期望的吸引力，有时会发生结块或聚结，酶处理会减小聚合物树脂的结块或聚结。使用酶处理的一个特别优点是，所得的球形聚合物粒子不会聚结，即粒子不会相互黏附形成结块。据信酶处理会从聚合物珠粒的表面清洗和除去微量的分散剂和悬浮助剂(在聚合过程中使用的)，由此使聚合物珠粒在柱子中流动自由且填充均匀，使床体积最小化，并导致使用中的压力降较低。
按下述处理以类似于实施例1所述方法制备的5个不同的大孔聚合物样品：用纤维素酶处理(描述如下)4个部分(4A-4D)，一个样品(4E)不用纤维素酶处理；评价样品的沉降性能。将每一聚合物树脂样品(3.5克干燥的，相当于大约25ml湿分散的体积)称重加入到25ml量筒中。向每一量筒中加入20ml 20％的乙醇(含水)。然后用玻璃棒搅拌量筒得到浆液，并使该混合物沉降约16小时或过夜。然后再用玻璃棒搅拌试样直至完全混合。样品混合后，取出玻璃棒并用20％的乙醇(含水)洗涤，调节量筒中的总体积至25.0ml(使用大约0.5ml 20％的乙醇进行洗涤并调节每一样品)。然后观察样品4天，并记录下作为时间函数的沉降床的体积(树脂)。结果列于表3中。
聚合物4A的酶处理(在高温固化之前)：
将大约250ml浆液状的树脂(含150ml树脂)加入到配有冷凝器、机械搅拌器、热电偶和氮气导入口的2升4颈烧瓶中。向该浆液中加入100ml去离子水，用硼酸将其pH值调节至5.0，然后向浆液中加入28g CellulaseTM 4000(聚合物的19％)。将该混合物加热至37℃并搅拌3小时。然后将反应混合物转移到配有搅拌的压力容器中，并在100℃下加热5小时。将水/聚合物混合物冷却至室温，从烧瓶中取出并放入到1升色谱柱中。从聚合物中过滤掉水相，并用7升去离子水，然后用3.5升丙酮，最后用7升去离子水对聚合物的填充床进行洗涤。然后在2.5mm汞柱下，于100℃对水润湿的聚合物干燥16小时。
聚合物4B的酶处理(高温固化后溶剂洗涤前)：
将大约250ml浆液状的树脂(含150ml树脂)转移到配有搅拌的压力容器中，并在100℃下加热5小时。将水/聚合物混合物冷却至室温，并转移至配有冷凝器、机械搅拌器、热电偶和氮气导入口的2升4颈烧瓶中。向该浆液中加入100ml去离子水，用硼酸将其pH值调节至5.0，然后向浆液中加入28gCellulaseTM 4000(聚合物的19％)。将该混合物加热至37℃并搅拌3小时，从烧瓶中取出并放入到1升色谱柱中。从聚合物中过滤掉水相，并用7升去离子水，然后用3.5升丙酮，最后用7升去离子水对聚合物的填充床进行洗涤。然后在2.5mm汞柱真空下，于100℃对水润湿的聚合物干燥16小时。
聚合物4C的酶处理(高温固化后，溶剂洗涤后，溶剂再洗涤之前)：
将大约250ml浆液状的树脂(含150ml树脂)转移到配有搅拌的压力容器中，并在100℃下加热5小时。将水/聚合物混合物冷却至室温，从烧瓶中取出并放入到1升色谱柱中。从聚合物中过滤掉水相，并用7升去离子水，然后用3.5升丙酮，最后用7升去离子水对聚合物的填充床进行洗涤。将混合物转移至配有冷凝器、机械搅拌器、热电偶和氮气导入口的2升4颈烧瓶中。向该浆液中加入100ml去离子水，用硼酸将其pH值调节至5.0，然后向浆液中加入28gCellulaseTM 4000(聚合物的19％)。将该混合物加热至37℃并搅拌3小时，从烧瓶中取出并放入到1升色谱柱中。从聚合物中过滤掉水相，并用7升去离子水，然后用3.5升丙酮，最后用7升去离子水对聚合物的填充床进行洗涤。然后在2.5mm汞柱真空下，于100℃对水润湿的聚合物干燥16小时。
聚合物4D的酶处理(高温固化后，溶剂洗涤后，干燥聚合物后，溶剂再洗涤前)：
将大约250ml浆液状的树脂(含150ml树脂)转移到配有搅拌的压力容器中，并在100℃下加热5小时。将水/聚合物混合物冷却至室温，从烧瓶中取出并放入到1升色谱柱中。从聚合物中过滤掉水相，并用7升去离子水，然后用3.5升丙酮，最后用7升去离子水对聚合物的填充床进行洗涤。然后在2.5mm汞柱真空下，于100℃对水润湿的聚合物干燥16小时。将干燥的样品转移至配有冷凝器、机械搅拌器、热电偶和氮气导入口的2升4颈烧瓶中。向该浆液中加入100ml去离子水，用硼酸将其pH值调节至5.0，然后向浆液中加入28g CellulaseTM4000(聚合物的19％)。将该混合物加热至37℃并搅拌3小时，从烧瓶中取出并放入到1升色谱柱中。从聚合物中过滤掉水相，并用7升去离子水，然后用3.5升丙酮，最后用7升去离子水对聚合物的填充床进行洗涤。然后在2.5mm汞柱真空下，于100℃对水润湿的聚合物干燥16小时。
聚合物4E的处理(不用酶)：
将大约250ml浆液状的树脂(含150ml树脂)转移到配有搅拌的压力容器中，并在100℃下加热5小时。将水/聚合物混合物冷却至室温，从烧瓶中取出并放入到1升色谱柱中。从聚合物中过滤掉水相，并用7升去离子水，然后用3.5升丙酮，最后用7升去离子水对聚合物的填充床进行洗涤。然后在2.5mm汞柱真空下，于100℃对水润湿的聚合物干燥16小时。
表3的结果说明，可以不同的方式对本发明的大孔聚合物进行酶处理，以使聚合物粒子的结块或聚结最小化。这可由下述得到说明，即沉降仅18小时后的处理过的聚合物(4A-4D)的压紧体积，为每一样品的初始分散体积的60％，相比之下未处理的聚合物为其初始分散体积的94％。
                                           表3
  样品 4A   4B   4C   4D   4E
  沉降时间小时 沉降的体积(ml)   沉降的体积(ml)   沉降的体积(ml)   沉降的体积(ml)   沉降的体积(ml)
  012345678182448 25.023.823.021.820.519.819.018.518.115.014.914.9   25.023.822.921.620.820.219.719.218.415.014.914.9   25.022.020.019.518.818.117.517.016.515.115.015.0   25.023.522.021.319.218.918.518.017.515.115.015.0   25.024.024.024.024.024.024.024.024.023.523.523.5
类似地，制备酶处理的和未经酶处理的聚合物树脂样品，并评价其用于柱操作时的压力降性能。将大约1200ml每一树脂浆液(含大约550ml聚合物树脂)放入6.2cm AmiconTM Vantage柱中。形成一545ml的树脂床，并使用RaininTMHPLX泵，以50ml/min(178cm/hr)的速度，用3倍床体积的USP(美国药典)等级的水进行洗涤，然后用65％丙酮/35％USP等级的水的混合物进行洗涤，最后用99.5％的丙酮以50ml/min的速度洗涤。用AshcroftTM压力测试装置，以0至6.9×106Pa(1000psi或磅每平方英寸)的范围测定压力。相对于未处理的样品(1.4×106Pa或200psi)，用纤维素酶处理的样品在柱子中具有较低的压力降(1.4×105Pa或20psi)。

Claims (9)

1.一种含下述聚合的单体单元的大孔聚合物：
(a)50～100重量％的一种或多种多乙烯基芳族单体，和
(b)0～50重量％的一种或多种单不饱和乙烯基芳族单体；
其中该聚合物
(i)其总的孔隙度为0.7～2立方厘米每克；
(ii)其操作上的中孔隙度为0.7～1.9立方厘米每克；
(iii)平均粒径为2～600微米；
(iv)表面积为200～1500平方米每克；
(v)在1MPa压力下的流阻值为700至小于1800，在6MPa压力下的流阻值为1500至小于7000；和
(vi)总的胰岛素容量为75～150克胰岛素/升聚合物，动态胰岛素容量为60～150克胰岛素/升聚合物。
2.权利要求1的聚合物，其中多乙烯基芳族单体选自一种或多种二乙烯基苯、三乙烯基苯、二乙烯基甲苯、二乙烯基萘、二乙烯基蒽和二乙烯基二甲苯。
3.权利要求1的聚合物，其中单不饱和乙烯基芳族单体选自一种或多种苯乙烯和(C1～C4)烷基取代的苯乙烯。
4.权利要求1的聚合物，其中聚合物
(a)其表面积为400～1000平方米每克；
(b)操作上的中孔隙度为0.9～1.4立方厘米每克；
(c)平均粒径为10～75微米；
(d)在1MPa压力下的流阻值为700至小于1500，在6MPa压力下的流阻值为1500至小于5000；和
(e)总的胰岛素容量为90～150克胰岛素/升聚合物，动态胰岛素容量为75～150克胰岛素/升聚合物。
5.权利要求1的聚合物，该聚合物含有下述聚合的单体单元：
(a)75～100重量％的一种或多种多乙烯基芳族单体，和
(b)0～25重量％的一种或多种单不饱和乙烯基芳族单体。
6.一种制备大孔聚合物的方法，该方法包括在100～170％的含疏水性致孔剂和亲水性致孔剂的致孔剂混合物，以及0.5～10％的自由基聚合引发剂存在下，在含水悬浮液中聚合0～50％的单乙烯基芳族单体和50～100％的多乙烯基芳族单体；其中所有的百分数均基于单体的总重量；并且其中：
(a)相对于疏水性致孔剂，存在的亲水性致孔剂的重量比为大于1.2/1至3/1；
(b)亲水性致孔剂选自一种或多种(C4～C10)链烷醇，疏水性致孔剂选自一种或多种(C7～C10)芳烃和(C6～C12)饱和烃。
7.权利要求6的方法，其中亲水性致孔剂选自一种或多种(C5～C8)链烷醇，疏水性致孔剂选自一种或多种(C7～C10)芳烃。
8.权利要求6的方法，进一步包括用选自一种或多种纤维素分解酶和蛋白水解酶的酶处理大孔聚合物，其中在聚合过程中、聚合后、或聚合物分离后将酶与大孔聚合物进行接触。
9.一种混合的生物分子的水溶液的提纯方法，该方法包括在内径为2～100厘米的液相色谱柱中，将所述水溶液与权利要求1的大孔聚合物进行接触，其中色谱柱的操作压力为1-10MPa。
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