CN1163125C - 用于缺血性损伤组织的复苏和修复的溶液及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种方法和复苏液，该方法和复苏液用来引导缺血性损伤的器官和组织修复至功能损伤得到消除的程度；和防止受处理的器官或组织在循环恢复过程中进一步受到组织损伤。该方法包括在28℃-37℃的温和温度下用本发明的复苏液冲洗器官，以除去在血流停止期间积聚的血液和酸中毒产物；以及用复苏液灌注冲洗过的器官或组织。其中，复苏液含新颖组合的成分，以便(i)扩张器官或组织内的血管，(ii)通过提供营养素重建器官或组织的功能，(iii)使缺血性损伤的器官或组织恢复细胞的完整性和功能，(iv)重建氧化性代谢，使靠无氧性呼吸而存活的缺血性损伤的器官或组织重新适应充氧的复苏液。

Description

用于缺血性损伤组织的复苏和修复的溶液及方法
发明领域
概括地说，本发明涉及组织和器官的保存、维持和修复。更具体地说，本发明提供一种方法，即通过使用本文提供的组合物，恢复缺血性损伤器官或组织的完整性、功能和活力。
发明背景
现在仍极度缺乏可供移植的器官。目前，临床移植中主要的限制因素是持续缺乏活器官。例如，肾移植主要取决于能否获得心脏尚在跳动的死尸供体中取出的器官。此外，移植用器官的一个主要的但至今未采用的来源是无心跳死尸。无心跳死尸是指受伤后即死的和受伤后仅存活了很短时间的事故受害者。在这些情况中，不用这类器官的理由是因为心脏一旦停止跳动，则没有循环血液供应(暖缺血)，导致损伤酶级联反应发生。
勉强合格，但因暖缺血而功能受损的器官，不能耐受低温引起的进一步损伤。在用来保存移植器官的低温条件下，脂质双层发生相变化，成为凝胶状，流动性大大降低，在细胞膜中基本呈冻结状的脂质阻碍了O2的利用，即使在高O2张力存在时也如此。代谢结果是糖原酵解，这是一种与缺氧症类似的状态。已有报道，在18℃以下，低温会抑制肾脏的小管活动，在4℃，氧的利用约为正常体温时的5％。
低温贮存还可导致血管痉挛和随后发生的器官水肿。低温保存的器官会发生肾小球内皮细胞肿胀，失去脉管的完整性并伴有肾小管坏死；此现象归因于所用的低温条件。低温还可抑制Na/K依赖性ATP酶，并导致细胞体积调节能力的丧失。体积调节能力的丧失是引起细胞肿胀和损伤的原因。供应丰富的氧可有效地降低肿胀程度。若没有足够的氧输送，缺氧会导致较小的血管在灌注几小时后发生破裂。缺氧以及随后发生的ATP贮备的耗竭，意味着在传统的保存条件下厌氧性糖原酵解是主要的能量来源。局部缺血时发生的氧化磷酸化所需分子氧的缺乏，导致线粒体内NADH的积聚和ATP贮备的耗竭。随后发生的核苷损耗可能是遭受暖缺血和长期冷缺血的组织在恢复供血后不能重新产生ATP的一个非常重要的因素。不能提供足够的氧已导致器官保存对低温的常规性依赖。
因此，缺血(不管是暖缺血还是冷缺血)是一种损伤性酶级联反应，它可作为死前期和死亡期的特征。死前期以三种方式产生有害作用：组织缺氧；营养失调；和不能除去毒性代谢废物。循环血液的缺乏导致分子氧的缺乏。由此产生的组织缺氧诱发能量贮备的耗竭(如线粒体中ATP贮备的耗竭)。ATP的耗竭导致细胞变化，包括水肿、失去正常细胞的完整性和失去膜极性。这些细胞变化引出缺血死亡期，导致代谢废物的积聚、蛋白酶激活和细胞死亡。
代表本领域低温器官保存现状况、并在低温条件下提供最佳器官保存的现有灌注液，含有防止低温诱发组织水肿的成分、可促进器官在移植后发挥功能的代谢物质、抗氧化剂、膜稳定剂、胶体、离子和盐(Southard等，1990，Transpl.49：251；Southard等，1990，Transpl.Proc.21：1195)。该灌注液配方设计成可通过低温引起的代谢抑制来保存器官。它能使低温贮藏中常见的水肿和血管痉挛现象减少到最低程度，却不能用于充分扩大了的器官供体库。
这是由于如下事实，即勉强合格但因暖缺血而功能受损的器官或组织不能耐受低温引起的进一步损伤。即使是仅缺血30分钟，也会损伤移植后的器官功能。例如，使用有心跳死尸的器官，瞬时无功能的比率估计为25％，而仅缺血30分钟，则瞬时无功能的比率增加到约60％。因此，60％的无心跳死尸的肾不能立即发挥功能，因为受到了死前缺血性损伤。而且，不可逆的缺血性损伤被认为发生在仅仅数小时或更短时间无血流的器官中(Klatz等，美国专利No.5,395,314)。除非能开发出新的器官来源，否则移植手术的数目将维持不变。此外，供体库无法充分扩大，因为得不到对暖缺血性损伤器官或组织的死前缺血性损伤进行修复的方法/系统。
最近的努力集中在供血中断后立即再灌注溶液进行复苏，来预防缺血性损伤。例如，在外科手术或器官移植中使用美国专利No.4,415,556中公开的一种保护液，以预防器官受到缺血性损伤。该保护液被用作灌注液以改善器官灌注过程中的需氧代谢。美国专利No.5,395,314描述了一种在供血中断后以低温保存溶液(约8-10℃)作大脑循环使脑复苏的方法，设计用该低温保存溶液降低器官代谢、输送氧和抑制自由基损伤。
虽然这些方法和保存溶液对防止器官缺血性损伤有用，但其有益效果由于实践上和功能上的种种限制而大打折扣。首先，这些方法和溶液要能有效地防止缺血性损伤，则必须在供血中断后立即(数分钟内)施用。逻辑上的限制(例如器官供体是事故受害者)会严格地将这些方法和溶液限定到只能在医院里使用。其次，不可逆缺血性损伤被认为发生于数分钟无血流的器官(如大脑)或数小时无血流的器官(心脏、肾脏)。勉强合格，但因暖缺血而功能受损的器官或组织不能耐受移植前的低温贮存或移植后的血流恢复引起的进一步损伤。一个理由是在缺血-再灌注之后的循环恢复，可能反而导致组织的进一步损伤(McCord等，1985，N Engl J Med 312：159-163)。循环的恢复导致损伤组织的再充氧。缺血性损伤组织的再充氧可导致氧-自由基的形成、自由基清除剂的耗竭和趋化物质的释放，从而引起进一步的组织损伤。
因此，需要一种方法和溶液，它能克服而非仅仅抑制死前期器官或组织的缺血影响，并能在致命性缺血的最早期支持器官或组织的修复过程。一种引导缺血损伤器官和组织修复至功能损伤得以消除的程度，并能防止恢复循环时组织进一步损伤的方法，此法就可导致器官供体库充分扩大。
发明概要
在本发明之前无血流器官或组织被认为是遭受到了不可逆的缺血性损伤。本发明提出一种方法和组合物，用于器官和组织缺血性损伤 之后引导受损器官和组织修复并防止恢复循环时组织的进一步损伤。因此，本发明的方法和组合物不同于目前在缺血性损伤 之前使用的、以预防或抑制这些损伤为目的的方法和组合物。本发明的方法，是一种至少在缺血死前期中采用本发明的复苏液，使缺血性损伤器官或组织的完整性和功能重建的方法。而且，本发明的方法和溶液还可用于预防或抑制无血流器官或组织在恢复血循环时所引起的进一步组织损伤。
本发明的方法包括在约28-37℃的温和温度时用本发明的复苏液经动脉系统冲洗器官以除去血流停止期间器官或组织中积聚的血液和酸中毒产物；再用复苏液灌注冲洗过的器官或组织，其目的是(i)扩张器官或组织内的血管，尤其是受到阻塞的微血管，(ii)通过提供营养素重建器官或组织的功能，(iii)恢复缺血损伤器官或组织的细胞完整性和功能，(iv)通过使靠缺氧呼吸而存活的缺血性损伤器官或组织重新适应充氧的复苏液，重建氧化性代谢，使器官或组织适合移植和/或适应血液循环的恢复。
图面的简单说明
图1是使用本发明的复苏方法和溶液处理器官的流程图。
图2是使用本发明的方法和复苏液进行犬同种移植后的天数与器官功能参数(血清肌酐)的关系图。
图3是使用本发明的方法和复苏液进行犬同种移植后的天数与器官功能参数(尿肌酐)的关系图。
图4是使用本发明的方法和复苏液进行犬自体移植后的天数与器官功能参数(血清肌酐)的关系图。
图5是使用本发明的方法和复苏液进行犬自体移植后的天数与器官功能参数(尿肌酐)的关系图。
优选实施方式的详细描述
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定义
在后面的说明书和权利要求书中使用的“无血流”一词，指的是在血液循环可能停止并随后出现暖缺血的任何情况下，器官或组织的血液循环停止。它包括为了外科手术或由于自然的原因(如心脏病发作)而停止心脏跳动。在后面的说明书和权利要求书中使用的“器官或组织”一词，指的是包括(但不限于)肾脏、心脏、肝脏、肺、小肠、胰腺、脑、眼和皮肤在内的“器官”。在后面的说明书和权利要求书中使用的“复苏液”一词，指的是一种缓冲的生理溶液，它所提供的手段，可重建因血流停止而遭受缺血性损伤的器官的完整性和功能，并可预防或抑制无血流器官恢复血循环时可能引起的组织进一步损伤。
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本发明的方法，是一种至少在缺血死前期中采用本发明的复苏液，使缺血性损伤的器官或组织的完整性和功能重建的方法。用本发明的方法和复苏液重建器官的完整性和功能是先前未曾预料到的，因为在本发明之前，认为只要数小时或更短时间内无血流的器官的缺血性损伤是不可逆的。而且，本发明的方法和溶液还可用于预防或抑制无血流器官恢复血液循环时可能引起的组织进一步损伤。
本发明的方法和溶液提供了一种去除在器官无血流期间积聚的血液和酸中毒产物的手段；一种重建细胞的完整性和功能，从而恢复器官功能的手段；一种使器官或组织重新适应充氧环境的手段。根据下述各点，发现使缺血性损伤的器官的功能重建是可能的：(1)当与活的血管内皮细胞接触时，血液不会凝结，因此，缺血性损伤的器官可再灌注，只要这些内皮仍是活的和完整的；(2)血管动力学的重建，依赖于适当的内皮细胞依赖性血管扩张，以进行适当灌注使组织充氧，以及为正常的自我调节机制作准备；(3)为了复苏，必须适当扩张微血管，但为了恢复细胞的完整性不可改变正常的渗透性；(4)必须补偿在缺血过程中失去的营养素和重建细胞极性，以使细胞重获功能。
本发明的方法和溶液一起发挥作用，使缺血性损伤的器官复苏，目的是恢复器官的功能和使器官重新适应充氧环境。图1是使用本发明的复苏方法和溶液处理器官的流程图。
下面的实施例举例说明本发明实践的优选实施方式。在用来举例说明本发明的下述实施方式中，考虑下述概念是重要的。小牛模型和犬模型已被证实可用于评价拟用于人器官移植的有关组合物和方法，因为已表明这些模型能反映生理学基本原理。因此，当本发明的组合物和方法已在这些实验模型中得到证实时，这些组合物和方法主要将用于人。从这些实验模型扩大到人的生理学基本原理，是本领域技术人员所知道的，这包括对动物与人之间的差异的考虑，如器官体积和器官流量(例如可参见Harrison等，1977，J.Pharm.Sci.66：1679-1683)。应理解，这些实施例是举例说明而不是对本发明的限定。
实施例1-方法
本发明的方法涉及在器官停止血流但细胞基本死亡之前的时间(window)里进行调解(interceding)。本领域的技术人员能理解，可使用本发明方法的时间根据待处理器官的类型而不同。例如，可用本发明方法处理心脏的时间在约1小时以内，而可用本发明方法处理肾脏的时间则可多达血液停止后约4小时。为停止缺血性损伤酶级联反应以避免细胞死亡，在图1所示的方法中，本发明方法包括以下步骤：
1)在约28-37℃的温和温度，用本发明的复苏液经动脉系统冲洗缺血性损伤器官，其目的是(i)除去血流停止期间器官或组织中积聚的血液和酸中毒产物；
(ii)使细胞环境恢复到生理pH；
(iii)适当扩张微血管；
(iv)通过提供高能化合物和补充底物(包括但不限于葡萄糖、丙酮酸和尿苷5’-三磷酸(UTP))支持糖酵解的方法，维持正在进行的厌氧代谢作为挽救过程；
(v)提供代谢底物以启动厌氧代谢向氧化性代谢转换，恢复腺嘌呤化合物库，支持柠檬酸循环并重建电子传递链的连接，从而缓慢地导入分子氧以防止氧毒性引起的再灌注损伤；
(vi)提供一种使严重阻塞、水肿的缺血性损伤器官微血管内皮细胞床适当扩张，但基本上不改变器官渗透性的机制，其中，血管扩张使得器官组织能适当灌注，并提供稳定的灌注压、稳定的流量和恒定的温度、恒定的pH及恒定的充氧；
(vii)提供营养素以重建缺血性损伤器官的功能，从而提供恢复细胞完整性和功能所需的代谢物质；
2)在约28-37℃的温和温度，用本发明的复苏液经动脉系统灌注缺血性损伤的器官，其目的是
(i)使充氧、温度和pH正常化；
(ii)继续提供一种使器官血管系统适当扩张而又基本上不改变器官渗透性的机制，从而提供稳定的灌注压和稳定的血管流量；
(iii)继续提供营养素以重建缺血性损伤器官的功能，从而提供恢复细胞完整性和功能(如使细胞连接得更紧和重建膜极性)所需的代谢物质。
本领域的技术人员会理解，冲洗步骤中得到的一个或多个益处在灌注步骤中还将继续，本发明的复苏液可在整个过程(即，包括冲洗步骤和灌注步骤)中使用。
为了举例说明而不是限定的目的，在冲洗步骤中，在特定器官中通过套管将足量的复苏液缓慢注入主要的供血动脉，直至流出液中没有血液。用这种方法将器官无血流期间积聚在血管空间的血液和酸中毒产物从血管中除去。此外，恢复pH并输送新鲜底物，以维持厌氧代谢及保持细胞完整和功能所必需的其他细胞代谢通路。本领域的技术人员会理解，用于冲洗的复苏液的量是否充足也许取决于特定器官的类型和待冲洗器官的大小以及无血流时间的长短。为了举例说明而不是限定的目的，200-60ml的复苏液可能足够冲洗血流停止1-3小时的人肾脏。
为了举例说明而不是限定的目的，在灌注步骤中，用适合待复苏的缺血性损伤器官的收缩压缓慢足量的复苏液，直至流量达到特定器官类型的正常值附近。为了举例说明而不是限定的目的，以小于80mmHg的收缩压用本发明的复苏液缓慢灌注血流停止1-3小时的人肾脏，直至流量达到50ml/min以上。通过充氧器或通过本发明复苏液中的一种成分(输送化合物)缓慢导入分子氧，将pH调整到正常生理范围内。灌注过程中的器官充氧，及温度和pH的正常化，发生在灌注的最初15-30分钟内。随着器官血管的缓慢扩张，灌注压和流量开始稳定，器官迅速地转变成氧化性代谢。本领域的技术人员理解，灌注所需时间的长短取决于特定器官类型和待灌注器官的大小、以及血流停止时间的长短。然而，用本发明的方法(冲洗和灌注)处理缺血性损伤器官约2小时，对大多数器官(例如血流停止在0.5至4小时之间)的复苏，对器官功能的恢复也许是足够的。而且，若器官产生产物(如肾脏产生尿)，本发明方法可导致器官功能正常产物的产生。
本发明的方法已开发成可离体保存缺血性损伤器官并使其复苏而不需要传统性低温(4-10℃)的方法。该方法提供必需的氧输送、代谢所需的营养素、肿胀压、pH、灌注压和流量以支持器官的离体(最通常的是在各自的体内正常范围内或附近)代谢。接近正常的代谢率在此处定义为，正常代谢率的70～90％。此外，本发明的方法将离体代谢维持在这样一个水平上：它能提供足够的氧化性代谢，从而使器官产生功能正常时的产物。本发明的无需传统低温支持离体器官方法的开发，提供了支持接近正常的代谢率和确立手术后或移植后过程相关的功能能力的机会。
在另一实施方式中，使用包括薄片式或脉动式泵送系统的设备输送复苏液来实施本发明方法，该设备包括供应和控制灌注量和灌注压的装置；控制温度的装置；供应和控制呼吸气体导入和排出的装置。这样的设备本发明者在美国专利申请No.08/246,801中已有描述，其内容已纳入此处作为参考。这样的设备还可包括测试和/或收集已通过器官循环到监测器的灌注液，并可测定其一个或多个功能特性(如pH、各种压力、流量、血管阻力、各种化学成分、充氧情况、二氧化碳浓度和氧消耗量)的设备装置。此外，该设备装置，或与该设备装置连接的第二设备装置，可用来测定和/或收集由器官产生的器官产物(如肾脏产生的尿)，其中，随后进行的器官产物参数的测定，可能涉及本发明方法进行过程中或之后的器官的完整性和功能。
实施例2-复苏液
在本领域中，已知器官保存液和灌注液含有缓冲的生理溶液(如盐溶液或类似细胞培养液的基础培养液，在该基础培养液中加入了各种确定的添加剂)组成的底液。在一个优选实施方式中，本发明的复苏液还使用这样的底液，它含氨基酸、离子、生理盐、杂质、血清蛋白和/或多种因子、糖。除底液的成分之外，本发明的复苏液还含可分成至少3种成分类别的新颖组合的添加剂。本领域的技术人员能理解，各类别中的成分可用功能等价的化合物取代，以得到相同的结果。因此，下面列出各成分类别的目的是用于举例说明而不是限定本发明。
第一种成分类别是血管扩张剂，它含生理有效量的成分组合，该成分组合提供了一种手段，即通过平滑肌细胞的松弛来使大血管适当扩张，并能使微血管适当扩张。为确保血管系统的正常渗透性得到维持，以内皮细胞依赖性方式控制血管扩张。这样的成分组合可包括(i)内皮细胞介导的血管扩张物质(如乙酰胆碱、多巴胺、缓激肽、与精氨酸)；(ii)微血管扩张物质〔如前列环素(及其类似物，例如，卡巴环素)〕与Mg+；(iii)腺苷(及其类似物，如环己基腺苷)与维拉帕米，它们对钙通道阻滞介导的血管扩张具有组合效应(其他钙通道阻滞剂包括氟桂利嗪、硝苯地平、SNX-11、氯丙嗪和地尔硫)。使用这样的血管扩张剂组合的结果是，血管系统得到很好地扩张，与此同时，血管的完整性和正常的屏蔽功能得到保持。血管扩张剂占新颖组合的添加剂的1-50体积％(w/v)，将这些添加剂加入底液，形成本发明的复苏液。
第二种成分类别是化学能量底物，它含生理有效量的成分组合，该成分组合提供了一种手段，即能重建在血流停止期间丧失的氧化性代谢。血流停止过程引起细胞膜完整性丧失，导致细胞内成分(如离子、柠檬酸循环成分、连接的电子传递链的成分、和腺嘌呤化合物库的成分)的丧失。加入在复苏液中的这些化学能量底物包括丙酮酸、葡萄糖、ATP、AMP、辅酶A、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP-)、次黄嘌呤二核苷酸(FAD)、氯化焦磷酸硫胺(羧化辅酶)、尿苷-5’-三磷酸(UTP)、氯化物、腺苷、镁和它们的组合。若在细胞死亡发生之前重建组织细胞的能量供应，则血流停止期间的细胞变化是可逆的，组织细胞体积恢复正常。该化学能量底物占新颖组合的添加剂的0.01-90体积％。将这些添加剂加入底液，形成本发明的复苏液。
第三种成分类别是营养素，它含生理有效量的成分组合，该成分组合提供了这样一种手段，即促进一个或多个细胞修复过程，以重建血流停止期间丧失的细胞功能。该营养素组合可提供一种手段，即促进细胞较紧连接的重建和膜极性再生的蛋白合成，从而导致细胞功能恢复。加入复苏液中的这些营养素包括高浓度的氨基酸和镁(例如为通常血浆浓度的2-6倍)、核酸衍生物和核糖核苷；具有膜增效剂作用的生长因子，如酸性成纤维细胞生长因子(FGF)、碱性FGF、肝素和硫酸软骨素及它们的组合。这些营养素占新颖组合的添加剂的1-90体积％，将这些添加剂加入并溶解在底液中，形成本发明的复苏液。
本领域的技术人员会理解，属于三种成分类别中的任何一个或几个的成分，都具有本发明的方法所需要的附加功能。例如，镁离子(作为部分镁运载化合物而导入)同时起血管扩张剂和化学能量底物的作用；葡萄糖同时起营养素和化学能量底物的作用。此外，在一个优选实施方式中，复苏液中所含的氨基酸包括胱氨酸和半胱氨酸，胱氨酸和半胱氨酸的量使它们除起营养素作用外，还起自由基清除剂(最好为抗氧化剂)的作用，  自由基清除剂可在本发明方法的冲洗和灌注步骤中清除有毒的自由基。在本发明的复苏液中可包括其他抗氧化剂(如谷胱甘肽、环状糊精、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶、氯丙嗪和前列环素)或功能相等的化合物。这些抗氧化剂占新颖组合的添加剂的0.000-10体积％，将这些添加剂加入底液，形成本发明的复苏液。
在本发明另一个实施方式中，用本发明的复苏液进行复苏的组织包括神经组织(如脑)，复苏液还可含神经保护药〔如NMDA受体阻断剂(NMDA受体离子通道阻断剂，如Aptiganel和Cerestat；NMDA受体甘氨酸位点阻断剂，如ZD9379和GV 150-562A)〕、-氧化氮(NO)积聚阻断剂(如lubeluzole)和钠通道阻滞剂(如BW619-C89、fosphenytoin)以抑制钠流入细胞，触发谷氨酸释放。
在本发明的又一实施方式中，不是在复苏过程中通过充氧器导入分子氧，而是复苏液含一种或多种氧输送化合物(“氧运载体”)，这些氧输送化合物的作用是向缺血性损伤器官提供分子氧供氧化性代谢之用。这些氧运载体是本领域技术人员所知道的，包括但不限于，血红蛋白、稳定化的血红蛋白衍生物〔由溶血的红血球制得(如吡哆酸化血红蛋白)〕、聚氧乙烯轭合物(PHP)、重组血红蛋白产物、全氟化学药品(PFC)乳液和/或全氟化学药品微泡(统称为“全氟化学药品”)。这些氧运载体占新颖组合的添加剂的0.000-50体积％，将这些添加剂加入并溶解在底液中，形成本发明的复苏液；或占复苏液总量的0.000-20％(v/v)。
据称可用作氧运载体的PFC乳液例如在美国专利No.5,403,575、4,868,318、4,866,096、4,865,836、4,686,024、4,534,978、4,443,480、4,423,077、4,252,827、4,187,252、4,186,253、4,110,474和3,962,439中有叙述。这些液体PFC乳液包括(但不限于)全氟辛基溴、全氟辛基二溴、溴氟烃、全氟醚、FluosolDATM、F-44E、1，2-二全氟丁基-乙烯、F-4-甲基八氢醌醇-idizine、C9-C12全氟胺、全氟萘烷、全氟(1，2-二氢化茚)、全氟三甲基二环〔3，3，1〕壬烷、全氟甲基金刚烷、全氟二甲基金刚烷。可用作氧运载体的PFC微泡例如在美国专利No.5,409,688和5,393,524中有叙述。已公开的可用于制造这样的微泡的PFC包括(但不限于)十二氟戊烷(DDFP)、六氟化硫、戊烷、六氟丙烯、八氟丙烷、六氟乙烷、八氟-2-丁炔、六氟丁-1，3-二烯、异戊二烯、八氟环丁烷、十氟丁烷、顺-2-戊烯、二甲硫、乙基砷、糠基溴、顺-丙烯基氯、丁基氟、1，1-二氯乙烷、异丙基·甲基醚、异丙胺、甲酸甲酯、2-乙酰基呋喃、氟乙烯、1-戊烯、异丙基乙炔、全氟戊烷、异戊烷、乙烯基醚、2-丁炔、1，4-戊二烯、四甲基硅烷、二甲基膦、二溴二氟甲烷、2-氯-丙烯、二氟碘甲烷、乙醛、硼酸三甲酯、3-甲基-2-丁烯、1，1-二甲基-环丙烷、氨基乙烷、乙烯基溴、二硅烷基甲烷、三氯氟甲烷、溴氟甲烷、三氟二氯乙烷、全氟戊烯和其他含氟烃(美国专利No.5,409,688)。
在制备本发明复苏液的方法中，往底液中加入新颖组合的添加剂并使其溶解。这些添加剂可分成至少3种成分类别，即血管扩张剂、化学能量底物和营养素。虽然与本发明的方法一起使用的复苏液的成分可在前述成分和成分含量范围内变化，为了举例说明而不是限定的目的，一个优选的配方见表1(注意，为了清楚起见，可发挥至少3种成分类别中一个以上的作用的成分，列在下面的一个类别中)。
表1添加到底液中的添加剂(含量以mg/开底液计)
  血管扩张剂   含量
  精氨酸   140
  乙酰氯   2
  维拉帕米   0.2
  前列环素   0.06
  镁   600
  化学能量底物
  ATP   2
  AMP   2
  UTP   4
  辅酶A   10
  二磷酸吡啶核苷酸   28
  FAD   4
  三磷酸吡啶核苷酸单钠   4
  羧化辅酶   4
  营养素
  酸性和/或碱性FGF   200
  丙酮酸   220
  葡萄糖   2,000
  肝素   180
  胰岛素   10
  (核苷酸衍生物)
  脱氧腺苷   40
  脱氧鸟苷   40
  脱氧胞苷   40
  胸苷   40
  (核糖核苷酸)
  腺苷   40
  胞苷   40
  鸟苷   40
  尿嘧啶核苷   40
如此制得的复苏液的渗透性应大于330mOsm(渗透压毫克分子)，但最好在600mOsm以下，较佳的范围约为350-400mOsm。复苏液的pH范围应调至6.5-7.5，最好为7.3-7.45。
如前面所指出的，在另一实施方式中，复苏液还可含另外的抗氧化剂及一种或多种氧运载体，具体如下(每升底液)：
抗氧化剂                           含量
谷胱甘肽                            0.1mg
环状糊精                            500mg
氧运载体
全氟化学药品                        20％v/v
实施例3-血流停止的作用
进行以下实验以显示器官血流停止约30分钟所致暖缺血的作用。这样的暖缺血导致细胞完整性的迅速恶化。缺血损伤酶级联反应从失去腺嘌呤化合物库开始，直至发展成水肿。细胞完整性的丧失和水肿的出现，导致血管完整性的崩溃和正常渗透功能的丧失。在肾脏等器官中，可看到肾脏血流停止仅30分钟所引起的缺血性损伤导致血管极度收缩。血管极度收缩的结果是，没有充足的流量来对肾脏进行适当灌注。收缩血管中的高血管阻力，导致继发性缺氧而进一步恶化，从而引起功能能力的丧失(即，缺乏尿产物)。表2说明的是，在一个包括血流未停的小牛肾脏(“正常组”)和血该停止仅30分钟的牛肾脏(“缺血组)的实验动物模型系统中灌注特性(压力、流量和血管阻力)与器官功能(尿产物)的比较。血管阻力为：平均压力/平均流量。
                  表2
参数 正常组  缺血组
肾脏数 25  5
平均压力 50/30  44/40
平均流量 ＞95cc/min  12.9cc/min
平均血管阻力 0.4  3.26
尿产物 有  无
实施例4-本发明的复苏方法和溶液的效果
进行以下实验以显示本发明方法和溶液有能力克服而非仅仅抑制暖缺血对器官的影响，并能支持修复过程直至达到使器官功能损伤消除的程度。从安乐死的小牛获取肾脏，血流停止30分钟或60分钟，通过中线切开取出肾脏。肾脏取出前不作处理，包括不用抗凝剂。对照组各肾脏经30分钟无血流，从而在这期间遭受缺血性损伤。对照组肾脏取出后，在32℃用100cc的基础细胞培养液冲洗，洗去残留在肾脏各血管腔隙中的血液。各受试肾脏再经60分钟无血流，从而在这期间遭受缺血性损伤。受试肾脏取出后，在32℃用100cc的本发明复苏液进行冲洗。冲洗后，在改进型的MOX-100TM传输保存系系统中进行灌注。对照组肾脏在32℃进行灌注，使用先前开发的用暖保藏技术进行器官保藏的技术，所用的灌注液是基础细胞培养液。在32℃用本发明的方法和复苏液灌注受试肾脏。对照组(30分钟w/o发明)与试验组(60分钟w/发明)的灌注特性(压力、流量和血管阻力)和器官功能(尿产物)的比较见表3。
                     表3
参数 30’w/o发明   60’w/发明
肾脏数 5   16
平均压力 44/40   54/25
平均流量 12.9cc/min   97.4cc/min
平均血管阻力 3.26   0.47
尿产物 无   有
使受试肾脏遭受缺血性损伤1小时后，用本发明的方法和复苏液使其复苏，结果显示，其灌注特性(压力、流量和血管阻力)和器官功能(尿产物)如表2所示，在正常肾功能范围之内。由此证明，本发明的方法和复苏液有能力克服而非仅仅抑制暖缺血对器官的影响并能支持修复过程直至使器官功能损伤消除。
实施例5-损伤时间不同所产生的影响
进行以下实验以评估本发明的方法和复苏液对无血流1小时以上的器官的影响。从血流停止不同时间(分别为60分钟、90分钟、2小时和4小时)的安乐死的小牛身上取出肾脏，肾脏取出前不作处理，包括不用抗凝血剂。然后在32℃用100cc的基础细胞培养液冲洗各个肾脏。未发现任何一例肾脏的血管腔隙有血液凝结，血液只要与活的血管内皮接触看起来仍可流动。冲洗后，用本发明的方法和复苏液在30℃对各个肾脏灌注数小时。无血流60分钟，90分钟、2小时和4小时的肾脏平均灌注特性(压力、流量和血管阻力)和器官功能(尿肌酐浓度-肌酐廓清率；组织结构和构造)的比较见表4。
                                    表4
  参数   60’(N＝16)   90’(N＝5)   120’(N＝5)   240’(N＝2)
  压力(mmHg)     54/25     58/37     55/37     52/40
  流量(cc/min)     97.4     72     68.6     36.5
  血管阻力     0.47     0.67     0.73     1.27
  肌酐(mg/dl)     41.8     22.9     18.5     23.5
  组织结构和构造   保存良好 保存良好；内皮灶性失去光泽   总体良好；病灶性水肿   早期病灶性坏死
结果证明，本发明的方法和复苏液至少可使无血流4小时的缺血性损伤器官复苏。例如，当遭受60分钟暖缺血损伤的肾脏用本发明的方法和复苏液灌注2小时后，其灌注特性与表1所列的正常肾脏的值相等。组织学评价支持功能数据，因为检查的组织切片显示，其形态和完整性看起来保存良好。
无血流90分钟和120分钟的肾脏，比无血流60分钟的肾脏有更广泛的细胞损伤(舒张压上升和流量减少)。然而，尽管受到这样的细胞损伤，这些肾脏仍能产生尿；并且，组织学检查看起来保存良好。此外，在这些肾脏中未检测到坏死。
无血流4小时的肾脏表现为流量大大下降，伴有微血管床收缩、舒张压上升。然而，重要的是要看到，这些肾脏仍表现有器官功能，产生的尿肌酐浓度为23.5mg/dl。组织学检查的结果是，这些肾脏出现了灶性早期坏死迹象。在与灶性肾小管坏死区相邻处观察到有丝分裂特征，表明主动修复过程已启动。因此，即使在无血流4小时后，证明本发明方法和复苏液仍有能力克服而非仅仅抑制暖块血对器官的影响并能支持修复过程直至使器官功能损伤消除。
重要的是要看到，对无血流2和4小时的对照组肾脏(未用本发明的方法和复苏液进行处理)也进行了组织学评价，以确定本发明方法和复苏液的相对优点。对受到2小时暖缺血损伤的对照组肾脏的组织学评价显示有早期弥漫性肾小管坏死。受到4小时暖缺血损伤的对照组肾脏显示肾小管细胞弥漫性崩溃。而受到2小时暖缺血损伤然后用本发明方法和复苏液处理的肾脏，显示细胞完整性得到重建。与对照组肾脏的广泛肾小管损伤相比，受到4小时暖缺血损伤然后用本发明方法和复苏液处理的肾脏仅显示灶性肾小管坏死。组织学评价进一步支持本发明的方法和复苏液逆转了无血流暖缺血事件酶级联反应的实际功效。
实施例6-复苏的器官体内功能
A.同种移植
对用本发明的方法和复苏液复苏、器官在复苏后的体内功能进行评价。用以下方法进行犬的同种移植：让供体犬死后停止血流60分钟，取肾；用本发明的复苏液冲洗肾脏；并在30-32℃用本发明的方法和复苏液灌注肾脏2小时；复苏后，将肾脏同种移植给一个双肾同时被切除的受体犬。因此，受体犬靠复苏肾存活。受体犬移植后的经过见图2和图3。
肾脏再灌注后结果良好，并在移植后2小时内产生尿。在移植后的整个观察期间，肾脏持续产生尿。如图2所示，受体犬的血清肌酐水平在移植后24小时曾微升至2mg/dl以上，但在移植后48小时内即回落到正常范围。直到移植后第10天，血清物质组成和化学特性仍保持正常，此时，发现急性器官排斥(给受体犬注射的免疫抑制药物的量不足)。如图3所示，尿肌酐值迅速上升，移植后48小时内处于大约70mg/dl的正常范围内。最初发生的急性肾小管坏死(ATN)这一非常轻微的小插曲在移植后48小时内即迅速消失。急性肾小管坏死的可逆性与移植肾支持受体持续生存的能力，证明了受到60分钟以上暖缺血损伤的器官，在移植后的生存能力和体内功能。因此，用本发明的方法和复苏液复苏的器官可在复苏后发挥体内功能。
B.自体移植
在另一实施例中，评价了用本发明的方法和复苏液复苏的器官在复苏后的体内功能。使用两条犬，取它们的左肾进行自体移植，以37℃的生理盐水液使肾脏暖缺血损伤2小时；然后将导管插入肾脏中并用本发明复苏液冲洗；用本发明的方法和复苏液在30-32℃灌注2小时；复苏操作后，将此肾脏自体移植给另一侧未处理肾已同时被切除的犬。因此，各受体犬只能依赖其复苏肾生存。受体犬移植后的经过见图4和图5。
肾脏再灌注后结果良好，并在移植后几小时内产生尿。在移植后的整个观察期间，  肾脏持续产生尿。如图4所示，两条犬的血清肌酐均曾出现与ATN相一致的微升。在各例中，血清肌酐峰值出现在移植后的第三天，分别为3.5mg/dl和2.8mg/dl。但在移植后第10天血清肌酐水平即恢复到正常范围。在移植后观察期的其余时间，血清物质组成和化学特性保持正常。如图5所示，尿肌酐值迅速上升，并在血清物质组成和化学特性正常化之前的数日里处于正常范围内。安乐死后的组织检查所见表明，肾脏基本正常。这些所见显示了肾小管内皮的再生。急性肾小管坏死的逆转与移植后肾脏支持受体犬持续生存的能力，证明了受到2小时以上暖缺血损伤的器官在移植后的生存能力和体内功能。因此，用本发明的方法和复苏液复苏的器官可在复苏后发挥体内功能。
实施例7-与已知保存液的比较
用本发明的方法和复苏液、或用本领域已知的保存液(基础培养液RSM-210TM或VIASPANTM中的任一种)使器官复苏，然后比较它们的功能和组织学状况。将无血流60分钟的各组肾脏用各自溶液在32℃冲洗，然后用各自溶液(即：VIASPANTM在4℃；或RSMTM，或本发明的复苏液在30-32℃)灌注，用同法复苏。无血流60分钟并用各自溶液处理的肾脏的平均灌注特性(压力、流量和血管阻力)和器官功能(尿肌酐浓度；组织结构和构造)的比较见表5。
                              表5
    参数     复苏液     RSM-210TM     ViaSpanTM
  压力(mmHg)     54/25     44/40     54/46
  流量(cc/min)     97.4     12.9     27
  血管阻力     0.47     3.25     1.8
  肌酐(mg/dl)     41.8     无尿     无尿
  组织结构和构造     保存良好     保存良好     肾小球肿胀早期肾小管坏死
表5结果证明，与RSM-210TM和VIASPANTM相比，本发明的复苏液在恢复缺血性损伤的器官的血管特性和功能方面有着超凡能力。例如，与用RSM-210TM或VIASPANTM冲洗和灌注的肾脏相比，在复苏操作中用本发明的复苏液冲洗和灌注的肾脏令人满意地显示出血管收缩减小且流量较高。与此相似，只有用本发明的复苏液冲洗和灌注的肾脏才恢复了器官功能，结果产生的尿量与肌酐分泌一致。组织学检查所见显示，肾结构保存良好，表明只有用本发明的复苏液或RSM-210TM冲洗和灌注的肾脏才得到足够的恢复和保存。而用VIASPANTM溶液冲洗和灌注的肾脏有组织学损伤迹象，包括肾小球肿胀和肾血管坏死。与本领域技术人员已知的保存液相比，证明本发明的方法和复苏液具有克服暖缺血对器官的影响和支持修复过程直至使器官功能损伤消除的卓越能力。
实施例8-复苏过程中的氧输送
如前面所详细讨论的，本发明的一个实施方式是在复苏液配方中包含作为其一个成分的一种或多种氧运载体。对作为复苏液中一个成分的各种氧运载体的效果及它们在输送分子氧中的相关作用，以及本发明的方法和复苏液支持正在进行的氧化性代谢的能力进行了评价。分别使用以下四种溶液使受到60分钟暖缺血的肾脏复苏：未加入氧运载体的复苏液(在表6中用“RS”表示)、加入清洗过的红血细胞的复苏液(在表6中用“RS-RBC表示”；15％v/v)、加入纯血红蛋白的复苏液(在表6中用“RS-Hgb”表示；60cc/L的市售制剂)和加入全氟化学药品溶液的复苏液(在表6中用“Rs-Pf”表示；20％v/v)。在30-32℃分别用上述溶液冲洗曾无血流60分钟的各组肾脏，然后在30-32℃分别用上述溶液灌注2小时，用同法复苏。无血流60分钟并用各不同溶液处理的肾脏的平均灌注特性(压力、流量和血管阻力)和器官功能(尿肌酐浓度；组织结构和构造)的比较见表6。
                                       表6
溶液  压力(mmHg) 流量(cc/min)   血管阻力     肌酐 组织结构和构造
RS     54/38     92.3     0.50     8.4     保存良好
RS-RBC     56/36     98.2     0.58     8.3     保存良好
RS-Hgb     58/42     66.67     0.75     18     保存良好
RS-Pf     54/25     97.4     0.47     41.8     保存良好
表6结果证明，随着复苏液中分子氧浓度的增加(通过作为复苏液中一个成分的一种更有效的氧运载体)，作为复苏过程的结果，器官功能得到改善。例如，有效的氧运载体全氟化学药品或纯血红蛋白，导致了复苏过程中更高浓度分子氧的输送。用含这些运载体中任一种的复苏液处理的肾脏，其功能得到的改善超过用未添加氧运载体的复苏液处理的肾，或用含效力较差氧运载体的复苏液处理的肾脏。例如，使用本发明的含纯血红蛋白或全氟化学药品的复苏液后，平均尿肌酐浓度分别提高至18mg/ml和41.8mg/dl。而复苏操作中未使用充氧器且复苏液缺乏氧运载体或含低浓度清洗过的红血细胞时，平均尿肌酐浓度分别为8.4mg/dl和8.3mg/dl。本发明复苏液的另一个实施方式证明，在复苏液中添加了一种或多种有效的氧运载体作为其中一个成分后，可在用本发明方法处理的缺血性损伤器官中看到该器官功能得到改善。
实施例9
本发明的方法和复苏液可用来克服暖缺血对无血流肝脏的影响，并支持修复过程直至使肝脏功能损伤消除。灌注所需时间的长短可能取决于血流停止时间的长短，用本发明的方法(冲洗和灌注)处理缺血性损伤的肝脏大约2小时也许对大多数肝脏(例如，无血流时间在0.5至4小时之间)的复苏，使其恢复器官功能是足够的。总的肝脏功能及肝脏生理学的各个方面可通过测定循环后的灌注液和肝脏产物(胆汁)中的成分而确定。肝脏功能特性可通过测定下列参数包括(但不限于)胆汁盐中的胆汁浓度、胆固醇、碱性磷酸酶；胆汁pH；及肝脏血管流量、氧消耗量和葡萄糖利用率(从灌注液测得)来加以评估。因此，按照实施例1和2中所述的方法和溶液，可对缺血性损伤的肝脏进行处理，然后对其代谢功能进行预期评估。
实施例10
本发明的方法和复苏液可用来克服暖缺血对无血流胰腺的影响并支持修复过程直至使胰腺功能损伤消除。灌注所需时间的长短可能取决于血流停止时间的长短，用本发明的方法(冲洗和灌注)处理缺血性损伤的胰腺大约2小时对大多数胰腺(例如，无血流时间在0.5至4小时之间)的复苏，使其恢复器官功能可能是足够的。总的胰腺功能及胰腺生理学的各个方面可通过测定循环后的灌注液和胰腺中的成分而确定。胰腺功能特性包括淀粉酶、脂肪酶等胰腺酶的浓度；激素胰岛素；胰腺分泌物pH、钠钾；及胰腺血管流量、氧消耗量和葡萄糖利用率(从灌注液测得)。因此，按照实施例1和2中所述的方法和溶液，可对缺血性损伤的胰腺进行处理，然后对其代谢功能进行预期评估。
实施例11
本发明的方法和复苏液可用来克服暖缺血对无血流心脏的影响并支持修复过程直至使心脏功能损伤消除。灌注所需时间的长短可能取决于血流停止时间的长短，而用本发明的方法(冲洗和灌注)处理缺血性损伤的心脏大约2小时对大多数心脏(例如，血流停止时间在0.5至4小时之间)的复苏，使其恢复器官功能可能是足够的。总的心脏功能及心脏生理学的各个方面可通过测定循环后的灌注液和心脏中的成分而确定。心脏功能特性可通过测定下列参数包括(但不限于)机械跳动和电跳动；心脏酶，如转氨酶(天冬氨酸转氨酶，AST)、乳酸脱氢酶(LD)、果糖1，6-二磷酸醛缩酶(ALS)、苹果酸脱氢酶(MD)、谷胱甘肽还原酶(GR)、肌酐磷酸激酶(CPK)、羟丁酸脱氢酶(HBD)；心脏血管流量、氧消耗量和葡萄糖利用率(从灌注液测得)来加以评估。因此，按照实施例1和2中所述的方法和溶液，可对缺血性损伤的心脏进行处理，然后对其代谢功能进行预期评估。
实施例12
本发明的方法和复苏液可用来克服暖缺血对无血流小肠的影响并支持修复过程直至使小肠功能损伤消除的程度。灌注所需时间的长短可能取决于血流停止时间的长短，用本发明的方法(冲洗和灌注)处理缺血性损伤的小肠大约2小时也许对大多数小肠(例如，血流停止时间在0.5至4小时之间)的复苏，使其恢复器官功能是足够的。总的小肠功能及小肠生理学的各个方面可通过测定循环后的灌注液和小肠中的成分而确定。小肠功能特性可通过测定下列参数，包括(但不限于)功能试验(如胃酸刺激试验、和用示踪分子进行的吸收试验)；小肠血管流量、氧消耗量和葡萄糖利用率(从灌注液测得)来加以评估。因此，按照实施例1和2中所述的方法和溶液，可对缺血性损伤的小肠进行处理，然后对其代谢功能进行预期评估。
实施例13
本发明的方法和复苏液可用来克服暖缺血对无血流肺的影响并支持修复过程直至使肺功能损伤消除。再灌注之前先用表面活性剂处理肺移植物可能有益(例如可参见Erasmus等，1996.Am.J. Respir.Crit.Care Med.153：665-670)。灌注所需时间的长短可能取决于血流停止时间的长短，但用本发明的方法(冲洗和灌注)处理缺血性损伤的肺约2小时也许对大多数肺(例如，血流停止时间在0.5至4小时之间)的复苏，使其恢复器官功能是足够的。总的肺功能及肺生理学的各个方面可通过测定循环后的灌注液中的成分〔如表面活性剂蛋白A(SP-A)含量〕而加以确定。肺功能特性可通过测定下列参数，包括(但不限于)FVC(最大肺活量)、FEV1(第一秒呼气肺活量)、PEFR(最大呼气流速)、VA(平均肺泡容量)、TLC(总肺活量)和DLCO(肺一氧化碳弥散功能，一氧化碳转移)来加以评估。因此，按照实施例1和2中所述的方法和溶液，可对缺血性损伤的肺进行处理，然后对其代谢功能进行预期评估。
应理解，此处描述的本发明的实施方式和实施例，目的仅是为了举例说明而不是限定本发明，本领域普通技术人员通过前面的描述和附图而能够明白的任何变化或改进将被认为是在附具的权利要求书及其等同的范围之内。

Claims (9)

1.一种抑制缺血性损伤并引导缺血性损伤修复至无血流器官的损伤得以消除程度的复苏液，所述复苏液含缓冲生理溶液，还含：
用于扩张器官血管系统的生理有效量的血管扩张剂；
使在血流停止期间器官所丧失的氧化性代谢重建的生理有效量的化学能量底物；
促进一个或多个细胞修复过程以重建在血流停止期间丧失的细胞功能的生理有效量的营养素。
2.根据权利要求1所述的复苏液，其中，所述血管扩张剂含选自下述物质的成分组合：用于内皮细胞介导的血管扩张的物质、用于微血管扩张的物质和钙通道阻滞剂。
3.根据权利要求2所述的复苏液，其中，所述用于内皮细胞介导的血管扩张的物质包含乙酰胆碱和精氨酸，所述用于微血管扩张的物质包含前列环素和Mg+，所述钙通道阻滞剂包含腺苷与维拉帕米。
4.根据权利要求1所述的复苏液，其中，所述化学能量底物包含选自下述物质的成分组合：腺嘌呤化合物库的成分、柠檬酸循环的成分和连接的电子传递链的成分。
5.根据权利要求4所述的复苏液，其中，所述化学能量底物选自丙酮酸、葡萄糖、ATP、AMP、辅酶A、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、次黄嘌呤二核苷酸(FAD)、氯化焦磷酸硫胺(羧化辅酶)、UTP、氯化物、镁、和它们的组合。
6.根据权利要求1所述的复苏液，其中，所述营养素选自氨基酸、镁、核酸衍生物、核苷、酸性成纤维细胞生长因子(FGF)、碱性FGF、肝素、硫酸软骨素及它们的组合。
7.根据权利要求1所述的复苏液，该溶液还含生理有效量的选自下述物质的成分：抗氧化剂、氧运载体和它们的组合。
8.根据权利要求1所述的复苏液，该溶液还含药用有效量的神经保护药物。
9.一种制备用于抑制缺血性损伤并引导缺血性损伤器官修复至无血流器官的功能损伤得以消除程度的溶液的方法，该方法包括往缓冲生理溶液中加入添加剂组合，其中，添加剂包括：
用于扩张器官血管系统的生理有效量的血管扩张剂；
使在血流停止期间器官所丧失的氧化性代谢重建的生理有效量的化学能量底物；
促进一个或多个细胞修复过程以重建在血流停止期间丧失的细胞功能的生理有效量的营养素；
其中，该溶液的pH范围调至pH6.5-7.5，并且溶液的渗透性大于330mOsm。
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