CN1144874C - 具酶活性的重组羧肽酶b的生产 - Google Patents
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Classifications
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Abstract
本发明提供了一种生产具酶活性的CPB的方法，它包括将一种含有编码ProCPB的DNA的重组体细胞处理，使得此DNA指导ProCPB的表达，再从这些细胞中回收所表达的ProCPB，然后在ProCPB可折叠的条件下处理回收的ProCPB，将折叠的ProCPB酶切处理产生具酶活性的CPB，并纯化此具酶活性的CPB。
Description
这是于1995年1月25日提交的美国申请系列08/378,233号的部分继续，其内容在此引入作为参考。
发明背景
本项说明中各种发表文章均以括号内的阿拉伯数字引入作为参考，这些参考文献完全的引用可于本说明书末尾，权利要求之前找到。这些发表的公开内容整体作为参考文献引入本项说明，以便更完全地描述本发明相关的技术状况。
天然存在的羧肽酶B[肽酰-L-赖氨酸(-L-精氨酸)水解酶EC3.4.172]是一种含锌的胰外肽酶，它可特异地从肽链中去除C端的精氨酸、赖氨酸或鸟氨酸(1，2)。
天然存在的大鼠羧肽酶B是从一种前体蛋白，羧肽酶原B(Preprocarboxypeptidase B)产生的。此蛋白含有一个108个氨基酸长的N-末端片段，包括一段信号序列(13个氨基酸)和一段活性肽部位(95个氨基酸)。羧肽酶原B是没有酶活性的。
在羧肽酶原B转运到内质网的过程中，信号肽被切掉。得到的不具酶活性的羧肽酶原B前体由细胞分泌出来，然后通过胰蛋白酶将活性肽切离形成具酶活性羧肽酶B(7)。
成熟的大鼠羧肽酶B包含307个氨基酸(5)，分子量为35kD。它含有7个半胱氨酸残基，其中6个配对形成二硫键。
羧肽酶B在商业和研究上均有广泛用途，比如生产胰岛素和其他生物活性多肽，以及蛋白质序列分析。
商业上从猪的胰腺纯化而得的羧肽酶B非常昂贵，而且并不完全去除其他蛋白酶。
猪羧肽酶原B(Procarboxypeptidase B)前体的部分氨基酸序列和牛羧肽酶B的全部氨基酸序列已经发表(3，4中分别可见)。而且，大鼠基因和人类基因cDNA的全长核苷酸序列亦已经发表(5，6分别可见)。
Yamamoto等(6)曾报导缺失活性肽部位的起始11个氨基酸，不具酶活性的人羧肽酶原B的重组体表达。
他们亦报道了不具酶活性的β-半乳糖苷酶-羧肽酶原B融合蛋白的重组体表达，其中羧肽酶原B缺失活性肽的起始11个氨基酸。
欧洲公开588118号A2公开了一种骨相关的羧肽酶样蛋白，名为OSF-5。据推测OSF-5作为一种粘附分子或生长因子起作用，并可用作治疗骨代谢疾病的药物。然而，没有任何OSF-5实际功能或活性的报道，亦没有任何天然存在或重组的具生物活性的蛋白的生产得到证实。
本发明公开了重组的、高度纯化的、具酶活性而且并不昂贵的羧肽酶B的生产。具酶活性的羧肽酶B的生产以前从未见报道，因而此处公开的内容是全新的。
发明概述
本发明提供了一种生产具酶活性的羧肽酶B的方法，包括将一种含有编码羧肽酶原B的DNA的重组体细胞处理，使得此DNA指导羧肽酶原B的表达，再从这些细胞中回收羧肽酶原B，然后在羧肽酶原B可折叠的条件下处理回收的羧肽酶原B，再将折叠的羧肽酶原B酶切以产生具酶活性羧肽酶，并且纯化此具酶活性的羧肽酶B。
本发明进而提供了具酶活性羧肽酶B。
附图简述
图2和图3所示的质粒限制性酶切图谱并不代表位于质粒上的所有限制性酶切位点。然而，对于完全理解本发明所需的限制性酶切位点全部表示出来了。
图1：大鼠胰腺羧肽酶原B的氨基酸和相应的cDNA核苷酸序列
显示了大鼠胰腺羧肽酶原B的cDNA核苷酸序列和相应的氨基酸序列，以及成熟的羧肽酶B的核苷酸序列和活性肽的核苷酸序列。该DNA序列与Clauser等(5)发表的DNA序列有4个核苷酸不同；其中两个导致了氨基酸的改变：Lys14→Asn和Arg142→Asp。
亦显示了克隆中(实施例1)使用的三种引物的DNA核苷酸序列(较大的字体)：羧肽酶原B5′末端引物，成熟羧肽酶B5′末端引物和3′端引物。
根据与来源于牛胰(10，12)的羧肽酶A同源性对氨基酸进行编号，其中成熟的大鼠羧肽酶B的第一个氨基酸(Ala)计为4号。星号(*)指示与羧肽酶A比较，大鼠羧肽酶B带有的额外的氨基酸(Leu)。
图2：质粒pCPB和质粒pCPB-C的构建
质粒pABN用内切酶
BamHI和
NcoI消化，其2500bp的片段被分离并与
BamHI-NcoI消化的羧肽酶B cDNA的940bp长度的片段(如实施例1中所述获得)连接。新产生的质粒命名为pCPB，用来转化
大肠杆 菌4300。
质粒pCPB用
BamHI和
NdeI消化以分离大片段，质粒pCPB亦被AseI和
ScaI消化以分离大片段。
这两个大片段与5′端磷酸化的寡核苷酸混合形成异源的链体，其中该寡核苷酸是用聚合酶-连接酶缓冲液(5×缓冲液：32.5mMTris-HCl pH 7.5，40mM MgCl2，5mM 2-巯基乙醇，0.5M NaCl)通过定点突变制备的(实施例1)。将混合物煮沸变性DNA链，然后缓慢冷却变性DNA。反应产物用电穿孔法来转化大肠杆菌1645。转化子通过在含氨苄的LB琼脂培养生长，并通过用制备突变的5′端磷酸化的寡核苷酸片段进行原位的克隆差异杂交来筛选。
从阳性克隆中提取质粒DNA，经过限制性酶切分析和DNA核苷酸序列分析后，选出一种含有突变的SpeI位点克隆。新获得的质粒命名为pCPB-C，它编码在290位氨基酸发生了半胱氨酸变为丝氨酸的突变的羧肽酶B。质粒pCPB-C用来转化
大肠杆菌4300。
图3：质粒pProCPB-C和质粒pλProCPB的构建
如实施例1中所述获得的羧肽酶原B的cDNA，用
NdeI和
ClaI酶切以分离760bp片段，它编码活性肽部分和部分羧肽酶B。
质粒pPCB-C用
BamHI和
ClaI酶切以分离760bp片段，它编码羧肽酶B的剩余部分，包括Cys290→Ser突变。
质粒pAB用
NdeI和
BamHI酶切以分离2500bp片段，该片段编码所有在细菌中表达必需的元件。(见实施例1)。
以上三种片段被连接，新获得的质粒命名pProCPB-C。
质粒pProCPB-C和pPCB用
StuI和
XhoI酶切，一个3700bp的片段以质粒ProCPB-C中分离，此片段编码所有在细菌中表达所需元件(实施例1)，整个活性肽和部分羧肽酶B。
一个440bp的片段从质粒pCPB中分离，此片段编码羧肽酶其余部分。
这两个片段被连接，新形成的质粒命名为pλProCPB。
图4：重组体羧肽酶B和天然羧肽酶B的活性比较
商业上可得的猪羧肽酶B(Sigma)和如实施例5中所述制备的重组体羧肽酶B的活性根据Folk的方法(11)，以马尿酰-L-精氨酸为底物来测定。催化反应的Vo利用浓度为0.025-1.0mM的底物测得。
发明详述
质粒pλProCPB贮存在
大肠杆菌中，按照并满足布达佩斯条约关于国际认可的用于专利程序的微生物的保藏的要求，1994年8月4日以保藏号69673在美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏，ATCC位于马里兰州20852，Rockville，Parklawn Drive 12301。
此处所用的“CPB”表示通过重组体DNA方法或其他方法制备的一种多肽，它具有相同或基本上相同的任何天然存在的哺乳动物羧肽酶B的氨基酸序列。因而，术语CPB包括与天然羧肽酶B有一个或多个氨基酸，优选不超过大约10个氨基酸的差异的多肽。
此处所用的“ProCPB”表示通过重组体DNA方法或其他方法制备的一种多肽，其带有相同或基本上相同的任何天然存在的哺乳动物羧肽酶原B的氨基酸序列。因而，术语ProCPB包括与天然的羧肽酶原Bs有一个或多个氨基酸，优选不超过大约10个氨基酸的差异。
本领域技术人员可轻易决定利用已建立的大众所知的方法，哪些氨基酸残基可被加入，缺失或替换(包括用哪些氨基酸替换)。这些方法包括，比如：常规用于设计和制造编码多肽的细菌表达的DNA；用定点突变技术对cDNA的修饰和基因组序列的修饰；重组体蛋白和表达载体的构建；细菌的多肽表达；以及用常规的生化分析法测定多肽的生化活性。
此处所用的一种“具酶活性”CPB指具有天然存在的哺乳动物羧肽酶B的生物活性的CPB。为了此定义的目的，天然存在的羧肽酶B的生物活性即其特异性地去除肽C末端精氨酸、赖氨酸、或鸟氨酸的能力。
基本上同样的氨基酸序列在此处定义为与同源的或同等的序列相比，其带有氨基酸序列上的替换和/或缺失和/或增加，并可包含此类氨基酸高达10个残基。此同源或同等的序列多处可见描述，比如：Lehniger，《生物化学》第二版，Worth Pub.，N.Y(1975)，第4章；Creighton，《蛋白质结构，一种实用的方法》IRL Press at Oxford Univ.Press，Oxford，England(1989)；Dayhoff，《蛋白质序列和结构图片集》5卷，国家生物医学研究基金会，Maryland(1972)，第九章。此类氨基酸替换是本领域技术人员所熟知的。
在一个优选的实施方案中，编码ProCPB或CPB的DNA可从人、大鼠、牛或猪获得。此DNA可通过逆转录，聚合酶链式反应(PCR)，合成或半合成法，或通过一种以上此类方法，或通过其他本领域技术人员知道的方法得到。
编码ProCPB或CPB多肽的DNA可通过本领域技术人员熟知的方法致突变，比如，Bauer等(1985)，《基因》
37：73-81。突变的序列可被插入到此处所述合适的载体中，将此载体转入细胞中，通过处理使得突变的DNA指导多肽的表达。
本领域的技术人员都知道与本申请相关的保藏的质粒可轻易地用已知技术(例如：用定点突变或接头插入法)改变，以编码一种多肽表达。此类技术已有描述，例如：Sambrook J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)《分子克隆，实验指南》第二版，冷泉港实验室出版社。
可用于表达编码CPB或ProCPB的核酸的载体为病毒，如细菌病毒，例如：细菌噬菌体(如λ噬菌体)；粘粒；质粒和其他载体。编码ProCPB或CPB的cDNA用本领域熟知的方法插入到合适的载体中，例如，利用限制性内切酶位点，插入体和载体DNA均通过酶切产生互补末端，其碱基互相配对，然后用一种DNA连接酶连在一起。另外，带有与载体DNA限制性位点互补的碱基序列的合成的接头可被连接到插入段DNA上，然后再用切割此位点的限制性内切酶消化。其他方法亦是可行的。
本发明的载体包含的一段编码ProCPB或CPB的序列可在原核和真核宿主细胞的范围内表达，例如，细菌、酵母、真菌、细菌细胞或哺乳动物细胞如CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、鸡胚细胞、成纤维细胞、肾细胞或其他已知细胞系。
这些载体进一步还包括在宿主细胞内表达克隆的基因所必需的调节元件，定位在编码ProCPB或CPB的核酸附近，以便影响其表达。
表达必需的调节元件包括启动子和操纵子序列以及一个核糖体结合位点。例如，一种细菌表达载体可能包括诸如λPLOL或
deo启动子之类的启动子操纵子序列。为了启动翻译，可能需要利用核糖体结合位点λCII或
deo。此类载体可通过商业途径获得，亦可通过本领域所周知的方法由已知序列组装而成，例如：1989年5月16日授予并共同受让(co-assigned)的美国专利4,831,120号和1992年9月1日授予并共同受让的美国专利5,143,836号，均公开了有关λPL启动子的方法；而1989年2月22日公布，并共同受让的欧洲专利申请公开号303,972亦公开了有关
deo启动子的方法。其他适宜的元件比如阻遏物(repressor)和增强子亦可能存在。本领域的技术人员都知道怎样针对不同的表达系统，使用合适的调节元件。
本发明的表达质粒包括适宜的调节元件，它们定位在质粒上与编码ProCPB或CPB多肽的DNA邻近的部位，以便在适宜的宿主细胞内影响ProCPB或CPB多肽的表达。此类调节元件为启动子和操纵子，例如
deoP1P2和λPL；以及核糖体结合位点，如
deo和CII；同时还包括阻遏物和增强子。
在本发明的优选实施方案中，调节元件定位在编码ProCPB或CPB的DNA上游邻近部位。
本发明的质粒还包含ATG启动子。编码ProCPB或CPB的DNA与ATG启动子同相。
本发明的质粒亦包含一段DNA序列，此序列含有一个来源于一种可在宿主细胞内自主复制的细菌质粒的复制起点。适宜的复制起点可从许多来源得到，比如质粒pBR322(ATCC保藏号37017)。
本发明的质粒亦含一段具有与选择或鉴定表型特征有关的基因的DNA序列。当质粒存在于宿主细胞内时这种特征即呈现出现，如：一种抗药基因，像抗氨苄青霉素，氯霉素或四环素。
优选的细菌寄主细胞为大肠杆菌细胞，一种合适的大肠杆菌的例子是菌株4300，但其他大肠杆菌菌株和其他细菌亦可用作质粒的宿主。
用作宿主的细菌可是任何菌株包括营养缺陷型(如A1645)，原养菌(如A4255)，和溶解菌株；F+和F-菌株；带有λ原噬菌体的cI857阻遏物序列的菌株(如A1645和A4255)以及缺少
deo阻遏物和/或
deo基因的菌株(见欧洲专利申请公布号0303972，1989年2月22日公布)。大肠杆菌菌株4300已保藏在ATCC保藏号69363。
所有上述的大肠杆菌宿主菌株均可通过本领域熟知的方法“去除”它们所携带的质粒，例如R.P.Novick所描述的溴化乙锭法，《细菌学综述》33，210(1969)。
本发明提供了一个生产具酶活性CPB的方法，它包括处理一种带编码ProCPB DNA的重组体细胞，使得此DNA指导ProCPB的表达，从细胞中回收表达的ProCPB，在ProCPB可折叠的条件下处理回收的ProCPB，然后把回收的ProCPB用酶切分裂以产生具酶活性的CPB，并纯化此具酶活性的CPB。
在一个优选方案中，从重组体细胞中回收ProCPB包括破坏重组体细胞的细胞壁或其片段以产生细胞裂解产物，离心分离细胞裂解产物中的胞内沉淀物质，然后在合适的缓冲液中溶解胞内沉淀物质。
在另一个实施方案中，处理回收的ProCPB，包括在室温，pH9-9.5左右孵育ProCPB约20-40小时。
在又一个实施方案中，处理回收的ProCPB包括在室温、pH9-9.5左右、有ZnCl2、氧化型谷胱甘肽(GSSG)和还原型谷胱甘肽存在的条件下，孵育ProCPB约20-24小时。
设计的将折叠的ProCPB酶切分裂包括调整pH至8.5左右，并用胰蛋白酶在37℃，作用60分钟来切割ProCPB。
进一步设计的纯化具酶活性的CPB包括离子交换层析法。
本领域技术人员应该清楚的是任何离子交换层析法均可利用。一种弱的阴离子交换柱如DEAE-琼脂糖列为优选。弱的阴离子交换柱经常含有一个叔胺的功能基团(二乙基铵乙基)，但是亦可使用季铵乙基或季铵。
柱的基质可基于无机化合物、合成树脂、多糖或有机聚合物；可能的基质有：琼脂糖，纤维素，三丙烯酰基(trisacryl)，葡聚糖，玻璃珠，环氧乙烷丙烯酸珠，丙烯酰胺，琼脂糖/聚丙烯酰胺共聚物或亲水性乙烯基聚合物。
同样设计的纯化具酶活性的CPB包括离子交换层析和疏水性层析。
将为本领域技术人员欣赏的是任何疏水性柱均可使用，苯基琼脂糖为优选。功能基团可为苯基、苯甲基、辛基或丁基。基质可为上述的任一种。
在另一个优选实施方案中，纯化具酶活性的CPB包括离子交换层析，疏水层析和透滤法。
在一个特别的优选实施方案中，ProCPB由保藏于ATCC保藏号69673的质粒pλProCPB表达。
本发明进一步提供具酶活性的CPB，没有其他哺乳动物来源的物质。
实施例
下面的实施例是为了帮助理解本发明而不在于，亦不应被认为是限制其范畴。这些实施例中没有对一些常规方法的详细描述，如载体构建，将编码多肽的基因插入到此类载体或将所得载体导入宿主细胞。这些实施例中亦没有对常规的用于分析此类宿主载体系统产生的多肽的方法的详尽描述。此类方法对本领域一般的技术人员来说均为熟知而且在许多出版物中都有描述，它们的内容在此以参考文献的方式引入此说明，包括以下例的方式：
Sambrook，J.，Fritsch，E.T.和Maniatis，T.(1989)《分子克隆：实验指南》第2版，冷泉港实验室出版社。
实施例1：用PCR方法克隆大鼠羧肽酶B的cDNA
I.DNA扩增
总RNA由Sprague-Dawley大鼠胰脏中提取，以总RNA中分离40μgpoly A+mRNA(通过寡聚dT-纤维素柱)获得的poly A+mRNA的等份试剂(10μg)用作逆转录反应的模板，此逆转录反应中含有一个合成的羧肽酶B 3’-末端引物(5)(图1)。
形成3单链互补DNA后(ss-cDNA)，用乙醇沉淀mRNA，分出等份试剂ss-cDNA用来进行PCR扩增。
为了扩增编码CPB的DNA(940bp)，一个合成的与羧肽酶B 3′末端相应的引物和一个合成的与成熟的羧肽酶B的5′末端相应的引物同时使用(图1)。
为了扩增编码ProCPB的DNA(1230bp)，一个合成的与羧肽酶B3′末端相应的引物和一个合成的与羧肽酶原B 5′末端相应的引物同时使用(图1)。
PCR扩增条件如下：
1.3′端引物 2μg
2.5′端引物 2μg
3.ss-cDNA 5μl
4.缓冲液：
dNTP′s 0.2mM
Tris-HCl 50mM
KCl 20mM
MgCl2 8mM
5.Taq聚合酶I
2.5单位
总体积 100μl
6.矿物油(防止蒸发) 50μl
7.1个循环×[92℃ 1分钟；40℃ 2分钟和72℃ 4分钟]
8.35个循环×[92℃ 1分钟；53℃ 2分钟和72℃ 3分钟]
9.1个循环×[92℃ 1分钟；53℃ 2分钟和72℃ 15分钟]
PCR扩增产物以1％琼脂糖凝胶电泳分析，亦包括扩增对照和分子大小标准。观察到940bp和1230bp两个不同的带。940bp的带代表CPB核苷酸序列而1230bp带代表包含活性肽核苷酸序列的ProCPB核苷酸序列。
PCR扩增后，DNA通过氯仿和酚抽提，乙酸铵和异丙醇沉淀，从反应混合物中纯化出来。
II.质粒pCPB
质粒pCPB(图2)的构建是通过用
BamHI和
NcoI消化CPBcDNA，接着凝胶电泳纯化，然后将此片段亚克隆到
BamHI和
NcoI消化，在2500bp的质粒pABN片段上，此质粒编码以下在细菌中表达所必需的原件：
(i)λPL启动子通过诱导使得基因从大肠杆菌细胞中表达，也就是将温度由30℃变为42℃，使得温度敏感的阻遏物cI857失活；
(ii)
deo核糖体结合位点(rbs)；
(iii)色氨酸转录终止子(8)；
(iv)来源于pBR322的氨苄青霉素抗性基因；和
(v)pBR322复制起点。
III.质粒pCPB-C
天然存在的羧肽酶B氨基酸序列包括7个半胱氨酸残基，其中6个以二硫键配对相连，一个(Cys290)为游离半胱氨酸残基(1)。我们相信此游离半胱氨酸残基在重组体CPB再折叠过程中会形成不必要的分子间或分子内的二硫键。Cys290既不位于催化位点亦不位于羧肽酶底物结合位点，因而显然不是酶的活性所需(1，2)。所以我们决定生产一种此半胱氨酸为丝氨酸取代的CPB，此CPB命名为CPB-C。
合成一个含有2个核苷酸替换的5′末端磷酸化的寡聚核苷酸：
Thr Cys
......ACC TGT......羧肽酶B中原始序列
Thr Ser
5′ATC CGC CAG
ACT AGT GAG GAG ACA ATG 3′突变序列
SpeI
此寡聚核苷酸是为了通过图2中所描述的定点突变的方法，将质粒pCPB中编码Cys290的核苷酸以编码丝氨酸的核苷酸替换(9)，新得到的质粒命名为：pCPB-C。
IV.质粒pProCPB-C
具有ProCPB-C核苷酸序列命名pProCPB-C的质粒(含有Cys290→Ser突变)被构建好，并用来转化大肠杆菌4300。
V.质粒pλProCPB
具有ProCPB核苷酸序列名为pλProCPB的质粒被构建好(图3)，并被用来转化大肠杆菌4300。此质粒保藏于ATCC，在ATCC保藏号69673下，1994年8月4日。
质粒DNA由质粒pCPB，pCPB-C，pλProCPB，pProCPB-C制备，通过限制性酶切分析和核苷酸测序来鉴定正确序列的存在。
实施例2：发酵，生长条件和ProCPB与CPB的纯化
I
贮藏培养物
带有pλProCPB质粒的大肠杆菌4300的贮藏培养物在含氨苄(100μg/ml)的LB培养基上生长。
II
接种物
接种物在100ml含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养液中于30℃扩增至细胞浓度为O.D.660＝2.0。
生产培养液(LB培养液+氨苄(100μg/ml))接种后，30℃，孵育，通风，摇动并用NH3保持其pH为7.2。在生长过程中加入20克葡萄糖。一旦细胞浓度达到O.D.660为12，升温至42℃使ProCPB表达，2小时后，细胞浓度达到O.D.660为22-29，收获细菌。
III.纯化
质粒pλProCPB表达的ProCPB积聚在胞内沉淀物中，通过以下步骤分离：40克(湿重)细菌团悬浮于450ml含1mM PMSF(Sigma)，50mM Tris-HCl，pH8，10mM EDTA的缓冲液中，并用终浓度为50μg/ml的溶菌酶(Sigma)于37℃处理2小时。
混合物用超声处理并加入Triton X-100(Merck)至终浓度为2％，于室温搅动2小时。粗胞内沉淀物通过离心沉淀(14000rpm，30min，4℃，并用水洗。
含ProCPB的胞内沉淀物溶于含25mM NaCl，8M尿素，10mMDTT，20mM Bis-Tris pH7的缓冲液B中。溶液于缓冲液B平衡的DEAE-琼脂糖快速柱中层析，蛋白质用100mM NaCl的缓冲液B洗脱，ProCPB在0℃，用40％饱和的(NH4)2SO4沉淀。
后来出现具酶活性的CPB只有通过生产其前体蛋白来生产。然而，开始时，多肽CPB和CPB-C均以类似于上述生产ProCPB的方式生产，ProCPB-C亦是按同样方法生产的。使用的质粒分别为pCPB，pCPB-C和pProCPB-C(如实施例1中所述)，带有这些质粒的大肠杆菌的生长条件和多肽的纯化方法基本上与上述ProCPB的方法一致，只是用于溶解含重组CPB或CPB-C的胞内沉淀物的缓冲液含有pH9，20mM乙醇胺，10mM DTT和8M尿素。
值得注意的是在每一个方案中，如上述所生产和纯化的多肽均无酶活性。为了产生具酶活性的蛋白，多肽的折叠在实施例3中叙述。
实施例3：ProCPB-C的折叠和活化
多肽CPB和CPB-C按实施例2生产，但发现没有酶活性，使用已知的折叠方法(如下所述)亦得不到具酶活性蛋白质。
为了解决得不到具酶活性蛋白这个问题，发展了另一个方法， 包括前体蛋白的表达和折叠，然后处理以释放(remove)折叠的前体蛋白的活性肽部份。这样产生了如下的步骤。
按实施例2所生产的ProCPB-C，以10mg/ml浓度溶于8M尿素、5mM HCl并用100mM甘氨基、0.2mM ZnCl2 pH为9，10和11稀释至1mg/ml。这就是折叠溶液。
室温孵育以上折叠溶液17小时来完成折叠，此时产生的ProCPB-C没有酶活性(见表I)。
然后用HCl将含折叠的ProCPB-C的溶液的pH值调至8.5左右，并用胰蛋白酶(1∶200w/w)于37℃处理30分钟，释放活性肽。为了终止反应，加入PMSF至终浓度为0.1mM。
如此获得的折叠的CPB-C的酶活性根据Folk(1970)(11)的方法测定：一个活力单位定义为25℃时每分钟催化水解1μmol马尿酰-L-精氨酸底物，导致254nm处1厘米路径长的光吸收增加0.12的酶量。商业可得的猪的羧肽酶(Sigma)的特定的活性为230u/mg。
表I：不同条件下ProCPB-C(和来源于其的CPB-C)的特定活性
| 反应 | 特定活性(u/mg) |
| 1.仅含底物 | 0.0 |
| 2.pH为9时折叠胰蛋白酶处理无ProCPB-C存在 | 0.0 |
| 3.pH为9时折叠胰蛋白酶处理 | 4.3 |
| 4.pH＝9，仅仅折叠 | 0.0 |
| 5.pH＝10时折叠胰蛋白酶处理 | 1.7 |
| 6.pH＝11时折叠胰蛋白酶处理 | 0.3 |
| 7.商业的猪CPB | 230 |
表I指出了具酶活性的CPB-C的获得：ProCPB-C折叠后，用上述的医疗条件，以胰蛋白酶处理折叠的ProCPB-C。
表I进一步指出当折叠混合物的pH为9时CPB-C的特定活性比pH为10或11时要高。
实施例4：改进的折叠条件
下列实验是为了建立最优化的折叠和活化条件。我们假定通过胰蛋白酶切的折叠的ProCPB-C所获得的CPB-C的特定活性越高，那么此ProCPB-C的折叠条件越优。除以下实验外，“仅含底物”和“商业的猪羧肽酶”用来作为对照。
开始，当使用0.05-0.1mg/ml的ProCPB-C在pH 9.5进行折叠，结果得到了改进(如实施例3中所述)。
I.温度对于ProCPB-C折叠的影响
ProCPB-C的折叠如此进行：在温度为10-37℃，100mM甘氨酸缓冲液，pH9.5的条件下将0.05mg/ml多肽孵育90个小时。折叠的ProCPB-C的样品用胰蛋白酶(1∶200 w/w)处理，如此获得的CPB-C的特定活性用实施例3中所述方法测定。当ProCPB-C在20℃-30℃之间折叠时，获得最高的特定活性。
II.氧化和还原的谷胱甘肽对ProCPB-C折叠的影响
ProCPB-C的折叠如此进行：在25℃，氧化和/或还原的谷胱甘肽(GSSG/GSH)或抗坏血酸(表II)存在条件下，于pH9.5、0.01mMZnCl2，100mM甘氨酸缓冲液中孵育0.05mg/ml多肽。然后，孵育过的溶液于37℃用胰蛋白酶(1∶200w/w)处理1小时，如此获得的CPB-C的特定活性在18和45小时之后测定(如实施例3所述方法)。
表II：在折叠溶液中存在氧化剂/还原剂时CPB-C的特定活性
| 加入到折叠溶液中的氧化剂/还原剂 | 特定活性(u/mg) | |
| 18小时 | 45小时 | |
| 0.1mM GSSG | 2.18 | 16.39 |
| 0.1mM GSSG，1mM GSH | 16.37 | 26.90 |
| 16.5μM抗坏血酸* | 4.06 | 9.24 |
| 对照(无上述任一种) | 1.19 | 5.39 |
*抗坏血酸以每摩尔SH基团加2.5mol的浓度加入。
表II指出共同加入GSSG和GSH急剧增加了CPB-C的特定活性，因而推测其亦增加了ProCPB-C的折叠效率。单独加入GSSG或抗坏血酸亦增加ProCPB-C的折叠，只是幅度较小。
在另一系列实验中发现，在折叠溶液中加入0.1mM GSSG和0.5mMGSH时获得最理想的ProCPB-C的折叠。
III. 胰蛋白酶对折叠的ProCPB-C的活化
建立了获得最佳活性CPB-C的方法，即将孵育的折叠溶液用胰蛋白酶1∶50w/w于37℃处理1小时切割ProCPB-C释放活性肽。
IV.pH对ProCPB-C折叠的影响
pH对ProCPB-C折叠的影响通过一系列在前面优化的条件下的实验来确定。
ProCPB-C的折叠如此进行：以0.1mg/ml浓度在100mM甘氨酸、0.02mM ZnCl2、0.5mM还原型谷胱甘肽(GSH)，0.1mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)，在不同pH值(8.75-10.00之间)下，于25℃孵育24小时。折叠的ProCPB-C样品以胰蛋白酶(1∶50w/w；溶于1mMHCl，10mM CaCl2)处理，如此获得的CPB-C的特定活性用实施例3中描述的方法测定。
当ProCPB-C折叠在pH9.25进行时，获得最高的CPB-C特定活性。
V.ZnCl
2
对于ProCPB-C折叠的影响
折叠溶液中ZnCl2的浓度对于ProCPB-C折叠的影响通过一系列在前述优化条件下的实验来确定。当ZnCl2浓度比估计的CPB-C的浓度(mol/mol)高2-20倍时，产生的CPB-C的特定活性最高。当没有ZnCl2，而在折叠混合物中加入EDTA螯合掉残余二价离子时进行折叠，CPB-C的特定活性降低到零。
VI.蛋白质浓度对ProCPB-C折叠的影响
ProCPB-C的折叠在表III中指示的蛋白浓度下于优化的条件(如上述确定的)中进行24小时。胰蛋白酶消化后，CPB-C的活性按实施例3中所述方法测定。
表III：折叠溶液中蛋白质浓度作用下CPB-C的特定活性
| 蛋白质浓度(mg/ml) | 特定活性(u/mg) |
| 0.05 | 35.1 |
| 0.10 | 31.8 |
| 0.20 | 20.3 |
表III指出产生的CPB-C的特定活性在蛋白质浓度为0.05mg/ml时最高。
VIII.折叠时间对于CPB-C特定活性的作用
ProCPB-C最佳的折叠时间通过一系列在前述优化的条件下的反应来确定。
ProCPB-C的折叠以0.1mg/ml浓度在100mM甘氨酸，pH9.25，0.1mM GSSG，0.5mM GSH和0.01mM ZnCl2中进行。折叠的ProCPB-C样品以胰蛋白酶(1∶50w/w)处理，获得的CPB-C的特定活性按实施例所述方法，在折叠开始后的不同时间点测定(0-40小时之间)。
反应开始20小时后，用胰蛋白酶切割折叠的ProCPB-C，获得最高的CPB-C活性。折叠超过20小时并不改变CPB-C的特定活性。
实施例5：不同CPB蛋白的折叠和活化
如实施例2所述的生产和纯化的CPB、CPB-C、ProCPB和ProCPB-C分别以0.1mg/ml在100mM甘氨酸缓冲液、pH9.5、0.01mMZnCl2、0.5mM GSH、0.1mM GSSG中于室温折叠24小时，即使用的折叠条件基本上为实施例4中所建立的优化条件。
每种含折叠的CPB、CPB-C、ProCPB或ProCPB-C的溶液的pH值用HCl调为8.5，然后含ProCPB和ProCPB-C的溶液用胰蛋白酶(1∶50w/w)于37℃处理1小时，释放活性肽。加入PMSF至终浓度为0.1mM来终止反应。CPB、CPB-C、ProCPB和ProCPB-C的特定活性按实施例3所述方法测定。
表IV：
在优化的条件下折叠和活化后CPB、CPB-C、
ProCPB和ProCPB-C的特定活性
| 折叠 | 特定活性(u/mg) |
| 对照1 -不经胰蛋白酶处理 | 0.00 |
| -不加蛋白 | 0.00 |
| 折叠 CPB | 0.00 |
| -CPB-C | 0.08 |
| -ProCPB | 42.90 |
| -ProCPB-C | 20.90 |
1对照中“无胰蛋白酶”只是针对ProCPB-C而做。
表IV指出具酶活性的CPB仅仅可从表达含有活性肽前体的细胞中产生，因而，活性肽对于CPB的正确折叠是必不可少的。
表IV亦指出具最佳活性的CPB通过含游离Cys290残基的ProCPB(由质粒pλProCPB表达)折叠和活化产生，而不能由含Cys290→Ser突变的ProCPB折叠和活化产生。因而，Cys290显然为最佳的折叠和/或CPB的最高活性所必需。
实施例6：改进的ProCPB的折叠
I.来源于粗胞内沉淀物的ProCPB的折叠
ProCPB最佳的折叠条件发现基本上与实施例4中确定的ProCPBC的最佳折叠条件一致。
一个简单的用于折叠和活化ProCPB的方法如此进行：使用粗胞内沉淀物，省略实施例2的第III部份所述的起始纯化步骤。
发现含ProCPB的粗胞内沉淀物(如实施例2中产生的)可以高蛋白浓度溶解于100mM甘氨酸，pH9.5和8M尿素溶液中(表V)。
折叠在优化的条件下室温作用24小时。pH值升高到最适pH9.5(前已确定)。折叠的ProCPB用胰蛋白酶(1∶50w/w)切割，CPB的特定活性按实施例3中所述方法测定。
表V：含粗胞内沉淀物的折叠溶液中的蛋白浓度作用下CPB的特定活性
| 蛋白浓度(mg/ml) | 特定活性(u/mg) |
| 0.1 | 10.5 |
| 0.2 | 10.9 |
| 0.5 | 11.9 |
| 1.0 | 12.1 |
| 2.0 | 11.4 |
表V指出具酶活性CPB可从来源于粗胞内沉淀物的ProCPB折叠然后胰蛋白酶消化而得。而且，此CPB在所有测定的蛋白浓度下其酸活性水平相似。这个出乎意料的结果，因为折叠前用DEAE-琼脂糖纯化的CPB(实施例2)在折叠混合物中蛋白浓度增加时，其特定活性下降。显然，胞内沉淀物含有帮助ProCPB折叠的因子。
II.通过折叠来源于粗胞内沉淀物的ProCPB来扩大CPB
(i)生产
以42升带有质粒pλProCPB并表达ProCPB的大肠杆菌4300中纯化CPB至近乎均一。发酵和生长条件基本上与实施例2中所述一样。
粗胞内沉淀物用水洗，并以20mg/ml溶解于pH9.5，100mM甘氨酸，8M尿素溶液中，用pH9.5 100mM甘氨酸稀释至1mg/ml，加入0.1mM ZnCl2，0.5mM GSH和0.1mM GSSG，生成的折叠溶液于25℃孵育24小时。然后用HCl调其pH值为8.5，折叠的ProCPB用胰蛋白酶(20μg/ml)于37℃消化1小时。用0.1mM PMSF灭活胰蛋白酶。
(ii)纯化
具酶活性的CPB以20mg每ml树脂的浓度加入到以20mMTris-HCl pH8.0平衡的DEAE-琼脂糖快速柱中(Pharmacia)。CPB以pH8 80mM NaCl，20mM Tris-HCl洗脱。硫酸铵(0.8M)加入到DEAE洗脱液中，它可在20mM Tris-HCl pH8，0.8M硫酸铵平衡的苯基琼脂糖快速柱(Pharmacia)中进一步层析分离。CPB被0.4M硫酸铵洗脱下来，浓缩，并对100mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH8透滤，然后贮于-20℃。
在以上纯化步骤中，42升带质粒pλProCPB，O.D.660＝36的大肠杆菌4300按以上步骤处理，获得1.25升特定活性为637u/mg的具酶活性CPB。所有步骤产量为60％左右。
商业上猪羧肽酶B的特定活性在同样的条件下测定为298u/mg。
实施例7：具酶活性CPB的特征
如实施例5和6所述生产的CPB具有与猪羧肽酶B相仿的生化和酶学特征。
依据其氨基酸组成所计算的重组CPB的消光系数为ε1％ 280＝19.7，商业的猪羧肽酶B的消光系数为ε1％ 280＝21.4(1)。
重组CPB特定活性为637u/ml(马尿酰-L-精氨酸底物)并且根据原子吸收光谱测定，每摩尔酶含1摩尔锌原子。
N-末端氨基酸序列分析揭示其为Ala-Ser-Gly-His-Ser，正如根据成熟的大鼠羧肽酶B的氨基酸序列分析(5)预计的一样。
重组CPB活性的最佳pH值用25mM如下缓冲液来确定：NaOAc，pH4-6；Bis-Tris，pH6-7.5；Tris-HCl pH7.5-9；和甘氨酸，pH9-12。CPB特定活性依实施例3所述方法测定。pH为8时获得最好的CPB酶活性。CPB在55℃孵育导致50％的活力丢失而65℃则完全失活。
用马尿酰-L-精氨酸作底物来进行重组CPB的动力学分析。底物浓度高出0.5mM时便抑制CPB活力。
进一步研究揭示重组体CPB被其催化产物精氨酸抑制，精氨酸是羧肽酶B的竞争性抑制剂。相应的Lineweaver-Burk曲线显示Km值为0.38mM。
重组CPB亦可被一种强二价离子螯合剂：1，10-菲咯啉，因而证明Zn离子对CPB酶活性的重要性。在1mM 1，10-菲咯啉存在时，可察到1mg/ml重组CPB 50％的活力丢失。
实施例8：CPB将胰岛素原转变为胰岛素
如EP 347781 B1中所述的微胰岛素原(Mini-Proinsulin)可用胰蛋白酶和实施例5和6中生产的重组CPB处理，使之转变为胰岛素。
胰蛋白酶特异性地在其精氨酸残基和A链之间切割。然后CPB特异地将精氨酸残基从其B链的C-端水解下来。
商业的人胰岛素(Boehringer-Mannheim)可用作标准，同时胰蛋白酶和商业猪羧肽酶B切割的微胰岛素原以及胰蛋白酶单独切割的微胰岛素原亦可用作标准。
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序列表
(1)一般信息：
(i)申请人：Bio-Technology General Corp.
(ii)发明题目：具酶活性的羧肽酶B的生产
(iii)序列数：8
(iv)通信地址：
(A)收信人：Cooper & Dunham LLP
(B)街道：1185 Avenue of the Americas
(C)城市：纽约
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(E)国家：美国
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(v)机读形式：
(A)介质类型：软盘
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(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30
(vi)当前申请数据资料：
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(viii)委托/代理人信息：
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(ix)通讯信息：
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(2)SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征：
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(iii)前提：无
(iv)反义：无
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(2)SEQ ID NO：2的信息：
(i)序列特征：
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(iii)前提：无
(iv)反义：无
(ix)特征：
(A)名称/键：CDS
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(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：CAT GCT TCC GAG GAG CAC TTT GAT GGC AAC CGG GTG TAC CGT GTC AGT 48His Ala Ser Glu Glu His Phe Asp Gly Asn Arg Val Tyr Arg Val Ser1 5 10 15GTA CAT GGT GAA GAT CAC GTC AAC TTA ATT CAG GAG CTA GCC AAC ACC 96Val His Gly Glu Asp His Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu Ala Asn Thr
20 25 30AAA GAG ATT GAT TTC TGG AAA CCA GAT TCT GCT ACA CAA GTG AAG CCT 144Lys Glu Ile Asp Phe Trp Lys Pro Asp Ser Ala Thr Gln Val Lys Pro
35 40 45CTC ACT ACA GTT GAC TTT CAT GTT AAA GCA GAA GAT GTT GCT GAT GTG 192Leu Thr Thr Val Asp Phe His Val Lys Ala Glu Asp Val Ala Asp Val
50 55 60GAG AAC TTT CTG GAG GAG AAT GAA GTT CAC TAT GAG GTA CTG ATA AGC 240Glu Asn Phe Leu Glu Glu Asn Glu Val His Tyr Glu Val Leu Ile Ser65 70 75 80AAC GTG AGA AAT GCT CTG GAA TCC CAG TTT GAT AGC CAC ACC CGT 285Asn Val Arg Asn Ala Leu Glu Ser Gln Phe Asp Ser His Thr Arg
85 90 95
(2)SEQ ID NO：3的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：95个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学特征：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：His Ala Ser Glu Glu His Phe Asp Gly Asn Arg Val Tyr Arg Val Ser1 5 10 15Val His Gly Glu Asp His Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu Ala Asn Thr
20 25 30Lys Glu Ile Asp Phe Trp Lys Pro Asp Ser Ala Thr Gln Val Lys Pro
35 40 45Leu Thr Thr Val Asp Phe His Val Lys Ala Glu Asp Val Ala Asp Val
50 55 60Glu Asn Phe Leu Glu Glu Asn Glu Val His Tyr Glu Val Leu Ile Ser65 70 75 80Asn Val Arg Asn Ala Leu Glu Ser Gln Phe Asp Ser His Thr Arg
85 90 95
(2)SEQ ID NO：4的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：38个碱基对
(B)类型：核酸
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(ii)分子类型：cDNA
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(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：GCGCCATGGC AAGTGGACAC AGCTACACCA AGTACAAC 38
(2)SEQ ID NO：5的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：927个碱基对
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(C)链型：单链
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(ii)分子类型：cDNA
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(iv)反义：无
(ix)特征：
(A)名称/键：CDS
(B)位置：1..927
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：GCA AGT GGA CAC AGC TAC ACC AAG TAC AAC AAC TGG GAA ACG ATT GAG 48Ala Ser Gly His Ser Tyr Thr Lys Tyr Asn Asn Trp Glu Thr Ile Glu
100 105 110GCG TGG ATT CAA CAA GTT GCC ACT GAT AAT CCA GAC CTT GTC ACT CAG 96Ala Trp Ile Gln Gln Val Ala Thr Asp Asn Pro Asp Leu Val Thr Gln
115 120 125AGC GTC ATT GGA ACC ACA TTT GAA GGA CGT AAC ATG TAT GTC CTC AAG 144Ser Val Ile Gly Thr Thr Phe Glu Gly Arg Asn Met Tyr Val Leu Lys
130 135 140ATT GGT AAA ACT AGA CCG AAT AAG CCT GCC ATC TTC ATC GAT TGT GGT 192Ile Gly Lys Thr Arg Pro Asn Lys Pro Ala Ile Phe Ile Asp Cys Gly
145 150 155TTC CAT GCA AGA GAG TGG ATT TCT CCT GCA TTC TGT CAG TGG TTT GTG 240Phe His Ala Arg Glu Trp Ile Ser Pro Ala Phe Cys Gln Trp Phe Val160 165 170 175AGA GAG GCT GTC CGT ACC TAT AAT CAA GAG ATC CAC ATG AAA CAG CTT 288Arg Glu Ala Val Arg Thr Tyr Asn Gln Glu Ile His Met Lys Gln Leu
180 185 190CTA GAT GAA CTG GAT TTC TAT GTT CTG CCT GTG GTC AAC ATT GAT GGC 336Leu Asp Glu Leu Asp Phe Tyr Val Leu Pro Val Val Asn Ile Asp Gly
195 200 205TAT GTC TAC ACC TGG ACT AAG GAC AGA ATG TGG AGA AAA ACC CGC TCT 384Tyr Val Tyr Thr Trp Thr Lys Asp Arg Met Trp Arg Lys Thr Arg Ser
210 215 220ACT ATG GCT GGA AGT TCC TGC TTG GGT GTA GAC CCC AAC AGG AAT TTT 432Thr Met Ala Gly Ser Ser Cys Leu Gly Val Asp Pro Asn Arg Asn Phe
225 230 235AAT GCT GGC TGG TGT GAA GTG GGA GCT TCT CGG AGT CCC TGC TCT GAA 480Asn Ala Gly Trp Cys Glu Val Gly Ala Ser Arg Ser Pro Cys Ser Glu240 245 250 255ACT TAC TGT GGA CCA GCC CCA GAG TCT GAA AAA GAG ACA AAG GCC CTG 528Thr Tyr Cys Gly Pro Ala Pro Glu Ser Glu Lys Glu Thr Lys Ala Leu
260 265 270GCA GAT TTC ATC CGC AAC AAC CTC TCC ACC ATC AAG GCC TAC CTG ACC 576Ala Asp Phe Ile Arg Asn Asn Leu Ser Thr Ile Lys Ala Tyr Leu Thr
275 280 285ATC CAC TCA TAC TCA CAG ATG ATG CTC TAC CCT TAC TCC TAT GAC TAC 624Ile His Ser Tyr Ser Gln Met Met Leu Tyr Pro Tyr Ser Tyr Asp Tyr
290 295 300AAA CTG CCT GAG AAC TAT GAG GAA TTG AAT GCC CTG GTG AAA GGT GCG 672Lys Leu Pro Glu Asn Tyr Glu Glu Leu Asn Ala Leu Val Lys Gly Ala
305 310 315GCA AAG GAG CTT GCC ACT CTG CAT GGC ACC AAG TAC ACA TAT GGC CCA 720Ala Lys Glu Leu Ala Thr Leu His Gly Thr Lys Tyr Thr Tyr Gly Pro320 325 330 335GGA GCT ACA ACA ATC TAT CCT GCT GCT GGG GGA TCT GAC GAC TGG TCT 768Gly Ala Thr Thr Ile Tyr Pro Ala Ala Gly Gly Ser Asp Asp Trp Ser
340 345 350TAT GAT CAG GGA ATC AAA TAT TCC TTT ACC TTT GAA CTC CGG GAT ACA 816Tyr Asp Gln Gly Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Phe Glu Leu Arg Asp Thr
355 360 365GGC TTC TTT GGC TTT CTC CTT CCT GAG TCT CAG ATC CGC CAG ACC TGT 864Gly Phe Phe Gly Phe Leu Leu Pro Glu Ser Gln Ile Arg Gln Thr Cys
370 375 380GAG GAG ACA ATG CTT GCA GTC AAG TAC ATT GCC AAT TAT GTC CGA GAA 912Glu Glu Thr Met Leu Ala Val Lys Tyr Ile Ala Asn Tyr Val Arg Glu
385 390 395CAT CTA TAT TAG TGA 927His Leu Tyr * *400
(2)SEQ ID NO：6的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：309个氨基酸
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(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：Ala Ser Gly His Ser Tyr Thr Lys Tyr Asn Asn Trp Glu Thr Ile Glu1 5 10 15Ala Trp Ile Gln Gln Val Ala Thr Asp Asn Pro Asp Leu Val Thr Gln
20 25 30Ser Val Ile Gly Thr Thr Phe Glu Gly Arg Asn Met Tyr Val Leu Lys
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50 55 60Phe His Ala Arg Glu Trp Ile Ser Pro Ala Phe Cys Gln Trp Phe Val65 70 75 80Arg Glu Ala Val Arg Thr Tyr Asn Gln Glu Ile His Met Lys Gln Leu
85 90 95Leu Asp Glu Leu Asp Phe Tyr Val Leu Pro Val Val Asn Ile Asp Gly
100 105 110Tyr Val Tyr Thr Trp Thr Lys Asp Arg Met Trp Arg Lys Thr Arg Ser
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130 135 140Asn Ala Gly Trp Cys Glu Val Gly Ala Ser Arg Ser Pro Cys Ser Glu145 150 155 160Thr Tyr Cys Gly Pro Ala Pro Glu Ser Glu Lys Glu Thr Lys Ala Leu
165 170 175Ala Asp Phe Ile Arg Asn Asn Leu Ser Thr Ile Lys Ala Tyr Leu Thr
180 185 190Ile His Ser Tyr Ser Gln Met Met Leu Tyr Pro Tyr Ser Tyr Asp Tyr
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210 215 220Ala Lys Glu Leu Ala Ihr Leu His Gly Thr Lys Tyr Ihr Tyr Gly Pro225 230 235 240Gly Ala Thr Thr Ile Tyr Pro Ala Ala Gly Gly Ser Asp Asp Trp Ser
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275 280 285Glu Glu Thr Met Leu Ala Val Lys Tyr Ile Ala Asn Tyr Val Arg Glu
290 295 300His Leu Tyr * *305
(2)SEQ ID NO：7的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：39个碱基对
(B)类型：核酸
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(ii)分子类型：cDNA
(iii)前提：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：CGCGGATCCT CACTAATATA GATGTTCTCG GACATAATT 39
(2)SEQ ID NO：8的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：27个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学特征：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)前提：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：ATCCGCCAGA CTAGTGAGGA GACAATG 27
Claims (10)
1.一种生产具酶活性的哺乳动物胰CPB的方法，该方法包括：
(a)培养一种含编码ProCPB的DNA的重组体细胞，使得此DNA指导ProCPB的表达；
(b)从细胞中回收表达的ProCPB；
(c)在ProCPB可折叠的条件下折叠回收的ProCPB；
(d)将折叠的ProCPB用酶切处理，产生具酶活性的CPB；和
(e)纯化具酶活性的CPB。
2.根据权利要求1的方法，其中回收步骤(b)包括：
(i)破裂重组体细胞的细胞壁，产生细胞裂解液；
(ii)通过离心从裂解液中分离胞内沉淀物；和
(iii)将胞内沉淀物溶于合适的缓冲液。
3.根据权利要求1的方法，其中处理步骤(c)包括在室温，pH值为大约9-9.5将ProCPB孵育大约20-24小时。
4.根据权利要求1的方法，其中处理步骤(c)包括在室温、pH为大约9-9.5，存在ZnCl2、氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽的条件下，将ProCPB孵育大约20-24小时。
5.根据权利要求1的方法，其中酶切步骤(d)包括：
(i)调节pH至大约8.5；和
(ii)用胰蛋白酶于37℃作用大约60分钟切割ProCPB。
6.根据权利要求1的方法，其中纯化步骤(e)包括离子交换层析。
7.根据权利要求1的方法，其中纯化步骤(e)包括离子交换层析和疏水层析。
8.根据权利要求1的方法，其中纯化步骤(e)包括离子交换层析、疏水层析和透滤。
9.根据权利要求1的方法，其中ProCPB由保藏号为ATCC 69673的质粒pλProCPB表达。
10.根据权利要求1的方法产生的具酶活性的哺乳动物胰CPB，不含任何其他来源于哺乳动物的物质。
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