CN1142996C - 稳定的杀菌／增强通透性蛋白质产物及其药用组合物 - Google Patents

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Abstract

公开了新的杀菌/增强通透性(BPI)蛋白质产物，其中第132位或135位半胱氨酸残基被另一种氨基酸残基所取代，优选丙氨酸或丝氨酸残基和/或其中193位的亮氨酸残基是羧基末端残基。还公开了为在合适的宿主细胞中生产相同的蛋白质产物而进行的DNA序列编码方法，以及含有该类似物用于治疗革兰氏阴性细菌感染和其后遗症的稳定匀质药用组合物。

Description

稳定的杀菌/增强通透性蛋白 质产物及其药用组合物
本发明涉及新的杀菌/增强通透性的蛋白质产物及其稳定的药用组合物。
脂多糖是革兰氏阴性细菌外膜的一种主要成份，它由与寡聚糖苷核心保守区相连的血清型特异性O侧链多糖和脂类A组成(Raetz，Ann.Rev.Biochem.，59：129-170(1990))。LPS是革兰氏阴性败血症性休克发病机理中的一种重要介质，而所说的休克是美国密切观察治疗单位的主要死亡原因之一(Morrison，et al，Ann.Rev.Med.38：417-432(1987))。
在各种哺乳动物组织中已经鉴定了LPS结合蛋白质(Morrison，Microb.Pathol.，7：389-398(1989)；Roeder，et al.，Infect.，Immun，，57：1054-1058(1989))。其中研究最广泛的LPS-结合蛋白质是杀菌/增强通透性的蛋白质(BPI)，它是在多形核白细胞嗜苯胺蓝颗粒中发现的一种碱性蛋白质。经酸提取法结合离子交换层析[Elsbach，J.Biol.Chem.，254：11000(1979)]或E.coli亲和层析[Weiss，et al.，Blood，69：652(1987)]已从多形核嗜中性白细胞中分离出人BPI蛋白质，它对广谱革兰氏阴性细菌具有强有力的杀菌活性。
BPI蛋白质对许多革兰氏阴性细菌具有细胞毒性，而它对革兰氏阳性细菌、真菌或哺乳动物细胞的毒性尚未见报道。人BPI蛋白质的全部氨基酸序列以及编码该蛋白质的DNA已由Gray等人描述(Gray，et al，J.Bio.Chem，264：9505(1989)图1)。
本文引用上文以供参考(SEQ ID NO：1和2)。Gray等人的论文公开了从人早幼粒细胞白血病HL-60细胞系(ATTC CCL 240)的DMSO诱导细胞中得到cDNA文库，并从该文库中分离人BPI编码cDNA。从该DMSO诱导的HL-60细胞中得到新制备的cDNA文库得到的DNA进行多步PCR扩增表明存在人BPI编码cDNA，其中位于氨基酸位置151的缬氨酸特异性密码子是GTC(如SEQ ID NO：1所列出)或GTG。而且还发现用GTG限定151位缬氨酸的cDNA种类将185位氨基酸限定为赖氨酸(AAG)(如SEQ ID NO：1和2)或谷氨酸残基(GAG)。
与人BPI全蛋白质的N端部分相对应的蛋白裂解片段具有天然得到的55KDa人BPI全蛋白质之抗菌效力。与N-端部分相反，分离的人BPI蛋白质C端区域仅仅表现出微弱的可检测抗菌活性(Ooi，etal，J.Exp.Med.，174：649(1991))。含有大约人BPI全蛋白质的头199个氨基酸的BPI N端片段以23KD的蛋白质形式用重组方法生产出来了(Gazzano-Santoro et al.，Infect.Immun.60：4754-4761(1992))。
为了治疗人革兰氏阴性脓毒病而设计的BPI产物的临床应用导致了在生产大量重组BPI(rBPI)产物方面的巨大努力，该重组产物适于掺入稳定的类似药用制品。
例如，由Grinna共同拥有、悬而未决的美国专利申请08/072,063公开了纯化在经遗传转化的哺乳动物宿主细胞培养物中表达和分泌的重组BPI的新方法。所说纯化方法的效率在本文的转化CHO细胞的产物中得以证实，所说的CHO细胞表达编码人BPI 31个氨基酸的先导序列和成熟蛋白质起始的199个氨基末端残基(即相应于从SEQ.ID.NO：2氨基酸-31到199)的DNA。由Theofan等共同拥有、悬而未决的美国专利申请08/064693涉及新的重组产生的BPI蛋白质类似产物，它来源于编码BPI先导序列和人BPI 191或199氨基末端残基的DNA与编码免疫球蛋重链恒定区的DNA融合的表达。
生产用于治疗人革兰氏阴性脓毒症的药用级BPI产物的努力尚未产生一致满意的结果。其主要理由在于人BPI氨基酸序列的特性和生产该产物的重组宿主细胞环境的特性。例如，以转染的CHO宿主细胞之分泌产物产生的、含BPI起始199个残基[rBPI(1-199)]的生物学活性rBPI产物能以较高产量被纯化。然而，分离的BPI产物最初包括BPI的二聚体形式以及半胱氨酸加合物(adduct)种类。而且，BPI产物在生理温度和pH下贮存可能不稳定，结果形成额外的二聚体和加合物种类。在保留生物学活性的同时，二聚体和加合物种类并非优选掺与用于人类的药用制品中。二聚体的形成和半胱氨酸加合物种类的形成很可能是因为BPI含有3个半胱氨酸残基，它们都位于具有生物学活性的BPI氨基末端区域即132、135和175位。在宿主细胞质内和/或细胞培养物上清液中，三个半胱氨酸中的两个之间形成一个二硫键后允许形成二聚体或与剩余的游离半胱氨酸形成半胱氨酸加合物。
即使是单体rBPI产物，根据其羧基末端残基数目不同表现出不同程度的微观多相性。例如，在含有以编码rBPI(1-199)的DNA转化或转染的宿主细胞之培养基中，难以检测到全长的表达产物。相反在这类细胞中得到的表达产物是一批不同的羧基末端被截短的rBPIN-端片段种类。事实上，在这样一批不同的rBPI种类中，预期的全长产物(1-199)常检测不到。在宿主细胞质和/或培养物上清液中，rBPI(1-199)产物羧基末端氨基酸序列的多相性可能是由羧基肽酶的活性引起的。
在药用级BPI产物的制备中碰到的另一个问题是产物中肉眼可见的颗粒的形成，它降低了产物的匀质性，也降低了其活性。根据本发明含rBPI产物的优选的药用组合物含有poloxamer(聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物)表面活性剂和多乙氧基醚(聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯)表面活性剂的组合物。在共同拥有、共同未决、共同备案的美国专利申请08/012,360中教导了这种组合物在抗颗粒形成稳定药用活性多肽时具有协同作用。最优选的组合物是其中的rBPI产物存在于含0.1％重量的poloxamer 188(PluroniC F-68，BASF Wyandotte，Parsippany，NJ)和0.002％重量的多乙氧基醚80(Tween 80，ICI America Inc.，Wilmington，DE)的浓度为1mg/ml之柠檬酸盐缓冲液(0.02M柠檬酸，0.15M NaCl，pH5.0)中。
在本领域中，仍需要改进rBPI产物以适于配制稳定的匀质药用制品。该产物应能较理想地从转化的宿主细胞中大批量地获得，能保留BPI的杀菌和结合LPS的生物学活性，并能限制其形成二聚体和半胱氨酸加合物的能力，以及具有羧基末端变化小的特征。
本发明提供一种新的、具生物学活性的重组BPI(rBPI)蛋白质和蛋白质片段产物，其特征在于经阻止二聚体化和半胱氨酸加合物形成而以使该产物非常适于药用。本发明还提供其特征在于减少羧基末端的分子多相性的rBPI产物。本发明还提供编码rBPI产物和类似物产物的新DNA序列、含该DNA的质粒载体、以该质粒稳定转化或转染的宿主细胞、重组体制备方法、稳定的药用组合物和治疗方法。
按照本发明的一个方面，提供了含BPI N端片段的rBPI蛋白类似物，其中132或135位的半胱氨酸被另一种氨基酸(优选非极性氨基酸，如丝氨酸或丙氨酸)取代。在本发明的一个优选实施方案中，含BPI开始199个N端残基的多肽132位的半胱氨酸残基在命名为“rBPI(1-199)ala132”的重组产物中被一丙氨酸残基所取代。在本发明的另一优选实施方案中，含BPI开始199个N端残基的BPI片段135位半胱氨酸被丝氨酸替代，所得重组产物命名为“rBPI(1-19)Ser135”。最优选的是命名为“rBPI(1-199)ala132”的重组产物，其特征在于根据其羧基末端残基的一致性减少了多相性。在本发明的一个优选实施方案中，也描述了一种含BPI开始193个氨基末端残基的多肽，紧接着193位亮氨酸密码子有一终止密码子。
另一方面，本发明提供了编码上述rBPI蛋白质和包括类似产物的蛋白质片段产物之DNA序列。这样的DNA序列也可编码BPI先导序列的31个氨基酸残基和BPI多聚腺苷信号。本发明还提供了含有编码上述产物和类似物的DNA之自主复制的DNA质粒载体以及用DNA以足以允许其表达的方式被稳定转化或转染的宿主细胞。按照本发明转化或转染的宿主细胞在大规模生产本发明的rBPI蛋白产物的方法中表明具有实用性。
本发明也仔细考虑了融合蛋白形式的rBPI蛋白类似产物，包括在氨基末端融合的本发明的rBPI蛋白类似产物和在羧基末端融合的免疫球蛋白重链恒定区或其等位突变体。在由Theofan等共同未决、共同拥有的美国专利申请08/064,693号中描述了天然序列的BPI/免疫球蛋白融合蛋白。此处引用其公开的内容以供参考。本发明还进一步考虑了生产上述融合蛋白的方法。
编码从BPI N末端氨基酸约176位到大约198位的具生物学活性的rBPI蛋白质片段产物之DNA序列也在本发明的范围内。这些DNA可在真核宿主细胞(如CHO细胞)中产生BPI产物，其中产物羧基末端残基表现出较少的多相性。在此优选的是编码BPI 193个N端残基的DNA(例如，编码BPI先导序列的31个氨基酸、开始193个N端氨基酸以及一个或多个终止密码子的DNA)。最优选的DNA是该DNA另外编码132位或135位的半胱氨酸被取代的蛋白质(例如：rBPI(1-193)ala132”)。
最后，本发明还提供了在药用稀释剂、辅剂和载体中含有本发明rBPI蛋白产物的稳定而匀质的药用组合物。该药用组合物能阻止形成rBPI产物颗粒。这类组合物在治疗革兰氏阴性菌感染及其后遗症(包括与内毒素相关的休克和一种或多种相关性疾病，如弥散的血管内血凝固，贫血，血小板减少，白细胞减少，成人呼吸窘迫综合症，肾衰，低血压，发烧和代谢性酸中毒)中有用。
根据下面通过优选实施例对本发明的详细描述，对本领域的技术人员而言，本发明的大量的其它方面和优点将是显而易见的。
附图的简要描述
图1代表rBPI(1-199)产物的SDS-PAGE分析结果。
图2代表rBPI(1-193)和rBPI(1-199)ala132产物的SDS-PAGE分析结果。
图3描绘了rBPI(1-199)产物阴离子交换HPLC分析的结果。
图4表示了rBPI(1-199)ala132产物阳离子交换HPLC分析的结果。
图5表示rBPI(1-199)反相HPLC过柱的结果。
图6代表rBPI(1-199)ala132产物反相HPLC过柱的结果。
图7代表含rBPI产物有或无polokamer/聚乙氧基醚表面活性成份的药用组合物在pH7.0和57℃时浊度实验的结果。
下面的详细描述涉及在半胱氨酸残基和/或高度一致的羧基末端含有一个氨基酸取代的各种rBPI产物制品的生产和特性。更具体地说，实施例1涉及一种例证方法，以此在编码例证的BPI蛋白质N-端片段的核苷序列中诱导碱基置换，并将这种突变序列插入质粒载体。实施例2提出将实施例1的载体插入适当的宿主细胞并进一步描述本发明的重组BPI蛋白多肽产物的表达。实施例3涉及编码本发明半胱氨酸置换类似产物的DNA构建和使用它进行体外转录/翻译程序。实施例4涉及本发明rBPI产物多肽的特征。
                     实施例1
构建含BPI半胱氨酸置换类似物的载体
A. 质粒pING4519和pING4520的构建
表达载体pING4503用作编码命名为rBPI(1-199)的重组表达产物的DNA之来源，所说的DNA即编码具有31个残基的信号序列和成熟的人BPI N端开始199个氨基酸的多肽，如SEQ ID NOs：1和2所示，除了151位的缬氨酸指定为GTG而不是GTC，185位残基是谷氨酸(指定为GAG)而不是赖氨酸(指定为AAG)。
由Theofan等共同未决、共同拥有的美国专利申请08/064,693已描述了质粒pING4503，此处引用作为本发明的背景资料以供参考。简单地说，pING4503的构建以质粒pING2237N为基础，后者含有小鼠免疫球蛋白重链增强子成份、来自Abelson鼠白血病病毒(A-MuLV)DNA的LTR增强子-启动子成份、在待表达基因5′端的SV40 195/165剪接连接区和在待表达基因3′端的人基因组γ-1多聚腺苷化位点。质粒pING2237N也有小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)可选择的标记。编码rBPI(1-199)的DNA，包括30bp的天然5′非翻译区和编码31个氨基酸信号序列以及BPI 199个N-端氨基酸的碱基，被插入到pING4503单一的SalI和SstII限制性位点。
以pING4503为基础构建pING4519和pING4520两载体来表达rBPI(1-199)半胱氨酸取代类似物，在该类似物中，BPI的三个天然形成的半胱氨酸残基中的一个被另一种氨基酸所取代。在这些构建体中使用在编码rBPI(1-199)的DNA中仅出现一次并位于半胱氨酸132和半胱氨酸135之间的PvuII位点(CAGCTG)。由于在pING4503中存在另外几个PvuII位点，因此首先必须从SalI和SstII消化的pING4503中分离出含编码rBPI(1-199)插入序列的SalI-SstII片段。再用PvuII消化纯化的SalI-SstIIrBPI(1-199)插入片段，得到大约为529bp的SalI-PvuII片段和大约为209bp的PvuII-SstII片段，分别纯化每个片段。
除了pING4519含有编码在132位的天然半胱氨酸密码子被丙氨酸密码子取代的rBPI(1-199)DNA插入片段外，质粒pING4519与pING4503是相同的。如上所述，从宿主细胞表达和分泌这一插入片段的过程中得到的重组产物称为“rBPI(1-199)ala132”。为了产生pING4519，使用引物BPI-6：AAGCTTGTCGACCAGGCCTTGAGGT(SEQ IDNO：3)和BPI-14：CTGGAGGCGGTGATGGTG(SEQID NO：4)从pING4503经PCR扩增BPIDNA序列，BPI-6在30bp BPI非翻译区的5′端引入一个SalI限制性位点，BPI-14在132位引入PvuII位点的一半和编码缬氨酸所必须的取代碱基上。PCR扩增使用GeneAmp RCR试剂盒(PerRinElmer Cetus，Norwalk，CT)按生产商的说明完成。所得的PCR片段用SalI消化，得到随后用于三片段连接的529bp的SalI平头片段，将它与上述大约为209bp的PvuII-SstII片段以及SalI和SstII消化pING4503所得的大片段一起用于产生pING4519。
除了pING4520含有编码135位天然半胱氨酸密码子被丝氨酸密码子取代的rBPI(1-199)之DNA插入片段外，质粒pINH4520与pING4519是相同的。如上所述，宿主细胞表达这一插入片段所得的重组产品命名为“rBPI(1-199)Ser135”。为产生pINH4520，从pING4513经PCR扩增BPI DNA序列，除了选择标记用gpt代替DHFR，cDNA插入序列用编码信号序列及全长BPI(456残基)代替仅编码rBPI(1-199)的部分外，质粒pING4513与pING4503基本相似。
PCR扩增用引物BPI-15和引物BPI-7完成。BPI-15：CTCCAGCAGC-CACATCAAC(SEQ ID NO：5)在5′端引入突变的PvuII位点的一半(其中“CTG”变为“CTC”)和编码135位丝氨酸所需的取代碱基，BPI-7：GAACTTGGTTGTCAGTCG(SEQ ID NO：6)代表位于编码BPI残基199序列下游的rBPI编码序列。该PCR片段用在135位半胱氨酸诱变位点下游剪切的BstBI消化，所得的约100bp平头BstBI片段用凝胶纯化。将上述529bp SalI-PvuII BPI限制性片段、100bp平头BstBI片段及BstBI-SalI消化pING4503所得的大片段相连接产生pING4520。
B. 质粒pING4530的构建
构建另一载体pING4530与pING4519一样，用丙氨酸代替了半胱氨酸，但它含有gpt选择标记(具有霉酚酸抗性)代替了从pING4503至pING4519携带的DHFR标记。为构建pING4503，从pING4519中分离出1629bp的SalI-DraIII限制性片段，该片段包含全部rBPI(1-199)ala132编码区以及位于3′端编码区另外的大约895bp的载体序列。将该片段与从pING4513分离出的大(约7230bp)DraIII-SalI载体片段连接产生pING4530。
C. 质粒pING4533的构建
构建质粒pING4533以表达rBPI(1-199)ala132，其中在-27位指定的BPI信号序列的第五个氨基酸密码即甲硫氨酸(ATG)置于Kozak翻译起始序列GCCACCRCCATGG(SEQ ID NO：7)[Kozak，Nucl.Acid.Res.，15：8125(1987)]一致序列中，而且编码BPI信号肽的前4个氨基酸的DNA序列被移去。该步骤使用PCR引物BPI-23和引物BPI-2，经来自含人BPI cDNA全长的质粒[pGEM-7zf(+)]之BPI序列的PCR扩增来实现。BPI-23：ACTGTCGACGCCACCATGGCCAGGGGC(SEQ ID NO：8)引入一个SalI限制性位点和位于BPI信号肽-27位的ATG(甲硫氨酸)前的核苷GCCACC。引物BPI-2：CCGCGGCTCGAGCTATATTTTGGTCAT(SEQID NO：9)与rBPI(1-199)编码序列3′端相对应。
用SalI和EcoRI消化约700bp的PCR扩增的DNA，纯化所得的270bp片段，它包含大约BPI(1-199)编码序列的前面1/3。该SalI-EcoRI片段与另外两个片段连接产生含gpt标记的pING4533，另外的两个片段是：(1)来自pING4519的420bp EcoRI-SstII片段，它编码132位半胱氨酸被丙氨酸取代后所得的BPI(1-199)，(2)来自pING4502(除不含30bp 5′非翻译区和具有gpt标记而不是DHFR外与pING4503基本相似的载体)的大约8000bp的SstII-SalI载体片段。
D. 构建质粒pING4221、pING4222和pING4223
构建与pING4533相似的载体，它具有一段含有与信号序列-27位甲硫氨酰残基相应的优选Kozak翻译起始位点的插入序列和132位半胱氨酸被丙氨酸取代。但在这些构建体中BPI片段编码序列在193残基处终止。如上所述，宿主细胞表达该DNA得到的重组产物称为“rBPI(1-193)ala132。经先用在BPI DNA插入片段5′端剪切的SalI和用可在残基192处形成3bp的3′粘性末端的AlwNI消化pING4533，制备含该插入片段的载体。然后纯化所得的大约700bp的片段。这一片段与以SstII-SalI消化pING4533所得的大片段以及两个退火后互补的寡聚核苷BPI-30：CTGTAGCTCGAGCCGC(SEQ ID NO：10)和BPI-31：GGCTCGAGCTACAGAGT(SEQ ID NO：11)一起再连接。它取代了AlwNI和SstII位点之间含193残基(亮氨酸)密码子，终止密码子和XhoI限制性位点5′到SstII位点的区域并导致AlwNI和SstII位点的重新产生和在紧靠193氨基酸(亮氨酸)密码子(CTG)之后安置终止密码TAG。所得的质粒命名为pING4223并且有gpt标记。除用不同的SstII-SalI载体片段产生具不同选择标记的载体外，严格按制备pING4223所述的方法制备相似的构建体。例如，除用his标记(涉及抗组氨醇)代替gpt外，pING4221与pING4223是相同的，除用DHFR标记代替gpt外，pING4222与pING4223是相同的。
E. 构建质粒pING4537、pING4143、pING4146、pING4150和pING4154
构建一系列载体，它们含有编码rBPI(1-193)ala132的插入序列、优选的Kozak转录起始位点和不同的选择标记，这与所述的pING4221、pING4222和pING4223基本相同，除了SstII位点3′端的人基因组γ-1重链多聚腺苷化和转录终止区被轻链多聚腺苷化序列及其后面的小鼠轻链(Kappa)基因组转录终止序列所取代。在并列基因表达研究中，轻链多聚腺苷化信号和转录终止区可能导致Sp2/0和CHO-K1细胞中的BPI表达水平增长2.5-5倍。
构建上述载体，先构建与含rBPI(1-199)ala132插入片段的pING4533相似的载体pING4537。然而，pING4537含有人轻链多聚腺苷化序列而不含人重组链序列。小鼠Kappa 3′序列从pING3170得到。pING3170是一种表达载体，它编码人轻链cDNA并包括一段小鼠基因组轻链3′转录终止序列。以SstI消化pING3170，它剪切掉小鼠轻链终止密码子上游35bp再用T4 DNA聚合酶处理使其变成平末端，然后用BamHI剪切，纯化含有小鼠Kappa 3′序列的大约1350bp的片段。所得的片段由人轻链恒定区cDNA 3′部分大约250bp的片段和多聚腺苷化信号及其后在Lui et al.，J.Immunol.139：352l(1987))中所述的构建体内被称为Δ8的BamHI连接子组成。约1350bp的片段的剩余部分由BglII-BamHI小鼠Kappa 3′基因组片段[Xu et al，J.Brol.Chem.261：3838(1986)中的片段“D”]组成，它提供转录终止序列。这一片段与另外两片段一起用于3片段连接，另外的两个片段来自pING4533，一个为含有全部BPI插入序列和经SstII消化，T4聚合酶处理和NotI消化得到的部分载体的3044bp的片段(即含全部BPI插入片段和部分载体)，另一条为约4574bp的BamHI-NotI片段。所得的载体pING4537除在基因组3′非翻译区存在上述区别外，其它与pING4533相同。
用pING4537作为Kappa 3′片段的来源构建含Kappa 3′非翻译序列的另外的质粒。以Xhol(其单一位点刚好紧靠BPI终止密码子之后)和BamHI消化pING4537分离Kappa 3′非翻译序列。所得的约1360bpXhoI-BamHI片段用于一系列3片段连接以产生下面4种载体，所有载体均含有编码rBPI(1-193)ala132的插入片段并在信号肽-27残基处有最佳Kozak翻译起始位点。这4种载体为：(1)pING4143(gpt标记)，经pING4223 4574bp BamHI-NotI片段(gpt标记)、约3019bp的pING4223 Not-XhoI含BPI插入序列的片段和pING4537 XhoI-BamHI片段相连接得到；(2)pING4146(DHFR标记)、以约4159bp的pING4222BamHI-NotI片段(DHFR标记)、约3019bp的含BPI插入片段的pING4223 NotI-XhoI片段和pING4537 XhoI-BamHI片段相连接得到；(3)pING4510(hid标记)、以含his约4772bp的pING4221 BamHI-NotI片段、含BPI插入片段的pING4222 NotI-XhoI片段和pING4537 XhoI-BamHI片段相连接得到；(4)pING4154(neo标记)，以约4042bp含neo的pING3174 BamHI-BsaI片段、约3883bp含BPI插入片段的pING4221 BsaI-XhoI片段和pING4537 XhoI-BamHI片段相连接得到。质粒pING3174含有编码抗体重链DNA的插入片段并含有neo标记。从Southern et al.，J.Mol.Appl.Genet.，1：327(1982)报道的pSv2neo质粒得到neo基因及其侧翼序列。
F. 质粒pING4144和pING4151的构建
构建两个除了rBPI编码序列的表达用人巨细胞病毒(hCMV)早期增强子/启动子代替Abelson鼠白血病病毒(A-MuLv)LTR启动子来控制外，分别与pING4143和pING4150相同的质粒pING4144和pING4151。因而，pING4144和pING4151均含有132位的半胱氨酸突变为丙氨酸、最佳Kozak翻译起始顺序和人轻链poly-A/小鼠Kapp基因组转录终止区。原始载体(pING4143和pING4150)核苷酸879至1708之间的区域被相应于核苷酸-598到+174的hCMV增强子/启动子区域取代，如Boshart et al.，Cell 41：521(1985)图3所示，此处引用以供参考。为将hCMV启动子区域引入BPI表达载体，先用从含有启动抗体轻链插入片段表达的hCMV启动子之质粒pING2250得到的，含EcoRI-SalI/hCMV启动子的、约1054bp的片段取代的1117bp含EcoRI-SalI(I/A-MuLv启动子的片段来构建质粒pING4538。为构建pING4144，将下面3个片段连接起来：(1)来自pING4538含rBPI(1-193)约2955bp的NotI-XhoI片段；(2)来自pING4537约1360bp的XhoI-BamHI片段；(3)来自pING4221含his基因约4770bp的BamHI-NotI片段。
G. 质粒pING4145、pING4148和pING4152的构建
构建除了含野生型(天然序列)132位的半胱氨酸来代替丙氨酸取代物外分别与pING4143、pING4146和pING4150相同的质粒pING4145、pING4148和pING4152。因此，三个质粒都含rBPI(1-193)插入序列、优选的Kozak翻译起始序列和人轻链poly A/小鼠Kappa基因组转录终止后区。3种质粒按如下方法构建。为构建质粒pING4145，将下面三个片段连接起来：(1)来自pING4140(除在132位含野生型半胱氨酸外pING4140与pING4221相同)含NotI-XhoIBPI(1-193)约3000bp的片段；(2)来自pING4537约1360bp的XhoI-BamHI片段和(3)来自pING4223含gpt基因约4570bp的BamHI-NotI片段。为构建pING4148，将下面三个片段连接起来：(1)来自pING4140的NotI-XhoI片段；(2)来自pING4537的XhoI-BamHI片段；和(3)来自pING4222含DHFR基因约4150bp的BamHI-NotI片段。为构建pING4152，将下面3个片段连接起来：(1)来自pING4142(除132位含野生型半胱氨酸外pING4142与pING4223相同)；(2)来自pING4537的XhoI-BamHI；和(3)来自pING4221含his基因约4770bp的BamHI-NotI片段。
下表I总结了上面A部分到G部分已描述其制备的质粒成份。
                                表I
质粒      BPI产物          信号序列    标记     3′末端      启动子
pING4519  (1-199)Ala132   31AA        DHFR*   人基因组     A-MuLv
                                                HCγ-1
                                                Poly A
pING4520  (1-199)Ser135   31AA        DHFR*   人基因组     A-MuLv
                                                HCγ-1
                                                Poly A
pING4530  (1-199)Ala132   31AA        gpt      人基因组     A-MuLv
                                                HCγ-1
                                                Poly A
pING4533  (1-199)Ala132   Kozak起始   gpt      人基因组     A-MuLv
                           序列；               HCγ-1
                           27AA信号             Poly A
pING4223  (1-193)Ala132   Kozak起始   gpt      人基因组     A-MuLv
                           序列；               HCγ-1
                           27AA信号             Poly A
                              表I(续)
pING4221  (1-193)Ala132     Kozak起始  his         人基因组  A-MuLv
                             序列；                 HCγ-1
                             27AA信号               Poly A
pING4222  (1-193)Ala132     Kozak起始  DHFR        人基因组  A-MuLv
                             序列；                 HCγ-1
                             27AA信号               Poly A
pING4537  (1-199)Ala132     Kozak起始  gpt         人Kappa   A-MuLv
                             序列；                 Poly A/
                             27AA信号               小鼠Kappa
                                                    基因组转
                                                    录终止子
pING4143  (1-193)Ala132     Kozak起始  gpt         人Kappa   A-MuLv
                             序列；                 Poly A/
                             27AA信号               小鼠Kappa
                                                    基因组转
                                                    录终止子
                               表I(续)
pING4146  (1-193)Ala132     Kozak起始  DHFR    人Kappa    A-MuLv
                             序列；             Poly A/
                             27AA信号           小鼠Kappa
                                                基因组转
                                                录终止子
pING4150  (1-193)Ala132     Kozak起始  his     人Kappa    A-MuLv
                             序列；             Poly A/
                             27AA信号           小鼠Kappa
                                                基因组转
                                                录终止子
pING4144  (1-193)Ala132     Kozak起始  gpt     人Kappa    hCMV
                             序列；             Poly A/
                             27AA信号           小鼠Kappa
                                                基因组转
                                                录终止子
                       表I(续)
pING4145  (1-193)     Kozak起始  gpt       人Kappa    A-MuLv
                      序列；               Poly A/
                      27AA信号             小鼠Kappa
                                           基因组转
                                           录终止子
pING4148  (1-193)     Kozak起始  DHFR      人Kappa    A-MuLv
                      序列；               Poly A/
                      27AA信号             小鼠Kappa
                                           基因组转
                                           录终止子
pING4152  (1-193)     Kozak起始  his       人Kappa    A-MuLv
                      序列；               Poly A/
                      27AA信号             小鼠Kappa
                                           基因组转
                                           录终止子
                              表I(续)
pING4151  (1-193)ala132    Kozak起始  his      人Kappa    hCMV
                            序列；              Poly A/
                            27AA信号            小鼠Kappa
                                                基因组转
                                                录终止子
pING4154  (1-193)ala132    Kozak起始  neo      人Kappa    A-MuLv
                            序列；              Poly A/
                            27AA信号            小鼠Kappa
                                                基因组转
                                                录终止子
*改变的DHFR基因如在共同未决、共同拥有的美国专利申请08/064,693中所述，本文引用以供参考。
                       实施例2
转染细胞以表达rBPI半胱氨酸置换类似物
按照本发明，哺乳动物细胞是生产rBPI蛋白类似物的优选宿主，因为这类细胞使得被表达的蛋白质正常分泌、折叠和翻译后修饰。目前生产本发明的类似物的优选哺乳类宿主细胞包括来源于成纤维细胞和淋巴的细胞，如CHO-K1细胞(ATCC CCL61)；CHO-DG44细胞，从哥伦比亚大学Lawrence Chasin博士处得到的二氢叶酸还原酶缺陷[DHFR-]突变型CHO Toronto；CHO-DXB-11，由Lawrence Chasin博士提供的CHO-K1 DHFR-突变型；Vero细胞(ATCC CRL81)；幼年仓鼠肾(BHK)细胞(ATCC CCL10)；Sp2/0-Ag14杂交瘤细胞(ATCC CRL1581)；NSO骨髓瘤(ECACC No.85 110503)。
可用各种方法完成哺乳动物的转染。一个通用的方法包括表达载体DNA的磷酸钙沉淀并随后被宿主细胞摄取。另一种通用的方法是电穿孔，经强电场的产生导致细胞通过由此产生的细胞膜孔摄取DNA[Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Man-ual，Cold Spring Laboratory Harbor Press，16.30-16.31(1989)]。为便于转染细胞的挑选，在表达载体中插入一基因，该基因之产物允许转染细胞在选择条件下存活和生长。大量的这类基因已被鉴定。这些包括别人已公开的：(1)neo，编码抵抗氨基糖苷抗生素G418的原核基因；(2)E.coli鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)，编码在存在黄嘌呤时对霉酚酸的抗性(MPA)[Mulligan et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.uSA，78：2072-2076(1981)]；(3)二氢叶酸还原酶，允许DHFR细胞在缺乏核苷的条件下生长，并在提高氨甲蝶呤浓度时进行基因扩增；(4)Salmonella tyjphimurium的hisD基因，允许细胞在存在组胺醇时生长[Hartman et al，，Proc.Nat.Acad.Sci USA，85：8047-8051(1988)]；(5)E.coli的trpB基因[Hartmanet al.Proc.Nat.Acad.Sci.uSA，85：8047-8051(1988)]，它允许细胞在存在吲哚(不含色氨酸)时生长；和(6)谷氨酰胺合成酶基因，它允许细胞在缺乏谷氨酰胺的培养基中生长。这些选择标记单个或以各种组合使用的有效性为生产以高水平表达重组产物的哺乳动物细胞系提供了灵活性。
A.以pING4533转染CHO-K1细胞
质粒pING4533含有与A-MuLv启动子、优选的Kozak翻译起始序列、人γ-1重链3′非翻译区和用于选择MPA-抗性细胞的gpt标记物融合的编码rBPI(1-199)ala132的基因序列。
CHO-K1细胞系在含10％小牛血清(FBS)及谷氨酰胺/青霉素/链霉素(Irvine Scientific，Irvine，CA)的Ham氏F12培养基中维持。用40μg先以NotI消化，以酚氯仿提取和乙醇沉淀的pING4533 DNA经电穿孔转染细胞。电穿孔后，细胞在非选择性Ham氏F12培养基中恢复24小时。然后细胞用胰蛋白酶消化下来，以5×104个细胞/ml的浓度重悬于含MPA(25μg/ml)和黄嘌呤(250μg/ml)的Ham氏F12培养基中，然后在96孔平板中以104个细胞/孔涂板。未转染的CHO-K1细胞不能在这种培养基中生长，因为其嘧啶的合成被MPA所抑制。
在第二周，在96孔板上观察到由转染细胞组成的菌落。使用rBPI(1-199)作标准以抗BPI ELISA分析含单个菌落的孔内上清液中BPI-反应蛋白质的存在。在本试验中，用纯化的兔抗rBPI(1-199)抗血清亲来先封闭Immulon-II 96孔板(Dynatech，Chantilly，VA)。加入上清液样品，用纯化的生物素标记的兔抗rBPI(1-199)抗血清和过氧化物酶标记的抗生物素蛋白进行检测。
用这种方式筛选了约800个菌落。将具有最高产量的31个菌落转移到24孔板进行产率分析。在24孔板上细胞在含10％FBS的Ham氏F12培养基中，长到汇合。按照由Grinna共同拥有、共同未决的美国专利申请08/072,063所述，一旦细胞达到汇合，去掉Ham氏F12培养基，加入1ml HB-CHO无血清培养基(Irvine Scientific)和40μl灭菌的S-琼脂糖珠(Pharmacia，Piscataway，NJ)。然后细胞培养7天，之后，移出S-琼脂糖珠并用含0.1M NaCl，10mM Tris的缓冲液(pH7.5)洗涤。经加入1.0M NaCl的Tris缓冲液将产物从珠上洗脱下来，并按上面所述用ELISA定量。在本试验中，命名为A153的高产转化子分泌约3μg/ml并适应在Excell 301无血清培养基(JRH Scientific，Lenexa，KS)中生长。适应的细胞在含Excell301培养基和S-琼脂糖珠的1.5L发酵罐中生长，在120-140小时时以C4 HPLC分析从S-琼脂糖珠洗脱下来的产品(50ml等分试样)来测定产率。在这些步的发酵中产率为15-25μg/L。
B. 用pING4222转染CHO-DG44细胞
质粒pING4222含有与A-MuLv启动子、优选的Kozak起始序列、人γ-1重键3′不翻译区和在无核苷酸培养基中选择转染细胞的小鼠DHFR基因相融合的编码rBPI(1-193)ala132类似物的DNA。
CHO DG44细胞系在含10％FBS和谷氨酰胺/青霉素/链霉素的Ham氏F12培养基中维持。用Wigler，et al，Cell.11：223(1977))的磷酸钙法以线性化的pING4222 DNA(40μg以PvuI消化，酚-氯仿提取，乙醇沉淀)转染该细胞。磷酸钙处理后，细胞在96孔板上以大约104个细胞/孔涂板，在含有无核苷αMEM培养基(Irvine Scien-tific)和透析FBS(100ml血清对4L用6000-8000 MW载留的0.015M NaCl冷溶液4℃透析16小时)的选择培养基中生长获得转染细胞。未转染的CHO-DG44细胞不能在该培养基中生长，因为在含选择血清的培养基中缺乏核苷且细胞为DHFR突变型。
在第二周，每孔约含有2-3个菌落。如A部分所述以ELISA分析96孔板内上清液中rBPI(1-193)ala132的存在。将24个高产克隆转移到24孔板上含有0.05μM氨甲蝶呤的选择性αMEM培养基中诱导编码rBPI类似物的DNA之基因扩增。监测其生长，细胞转移到新的24孔板上。按A部分对pING4533/CHO-K1转染细胞的描述从S-琼脂糖洗脱物中测定其产率。将5个高产菌落合并，在96孔板上以有限稀释法进行亚克隆。用ELISA分析含单菌落孔内上清液中的rBPI(1-193)ala132水平。然后将20个高产亚克隆转移到24孔板上，用含0.4μM氨甲蝶呤的培养基再进行一次扩增，用ELISA测定扩增的细胞产物表达的水平。高产细胞克隆4、75和80在含S-琼脂糖的24孔板上7天后分泌25-37μg/ml的产物。
C.以pING4223和pING4221转染Sp2/0细胞
为获得所需rBPI产物的最佳表达而采取的一种战略包括：用含第一标记的第一表达质粒转染细胞，筛选高产细胞，再用含不同标记的第二表达质粒转染同一细胞。用Sp2/0细胞对这一战略描述如下。
质粒pING4233含有与A-MuLv启动子、优选的Kozak翻译起始序列、人γ-1重链3′非翻译区和用于选择MPA抗性细胞的gpt标记相融合的编码rBPI(1-193)ala132 BPI的DNA。
Sp2/0细胞系在含10％FBS和谷氨酰胺/青霉素/链霉素的DMEM培养基中维持。以电穿孔法用40μg经NotI消化、酚-氯仿提取和乙醇沉淀的pING4223 DNA转染Sp2/0细胞。细胞在非选择性DMEM培养基中恢复48小时。离心细胞并以5×104细胞/ml重悬于含MPA(6μg/ml)和黄嘌呤(250μg/ml)的DMEM培养基中，在96孔板上以104细胞/孔涂板。未转染的Sp2/0细胞不能在该培养基中生长，因为MPA抑制了嘧啶的合成。在1.5-2周，在96孔板上观察到由转染细胞形成的菌落。用ELISA分析含单菌落孔内上清液中产生反应的蛋白质的存在。将高产细胞转移到24孔板上，在存在和不存在10-7M地塞米松的条件下分析细胞生长处于衰退时期的24孔培养物中的产率，地塞米松能引起A-MuLv启动子与糖皮质激素受体相互作用而增强表达。最佳产率细胞克隆2×3在不存在和存在地塞米松时分泌产物分别约为3μg/ml和7μg/ml。
以电穿孔法用含有用于选择转染细胞的his基因之pING4221再转染克隆2×3。在含10％FBS的DMEM培养基中恢复48小时后，用96孔板将细胞以约104个细胞/孔在含6μg/ml MPA、250μg/ml黄嘌呤和8mM组氨醇的DMEM/FBS培养中涂板。未转染的细胞不能在含组氨醇和MPA的培养基中生长。在第1.5-2周，在96孔板上观察到转染的细胞。以ELISA分析含单菌落的孔内上清液中rBPI反应蛋白质的存在。
将最高产细胞转移到24孔板上。在存在或不存在10-7M地塞米松的条件下测定在24孔培养物处于细胞生长的衰退期时的产率。最高产细胞(克隆2×3-130)在不存在和存在地塞米松时分泌产率分别为15μg/ml和30μg/ml。在96孔板中以有限稀释法再亚克隆分离物。用ELISA法筛选含单菌落的孔。最高产细胞转移到24孔板上繁殖，在存在和不存在10-7M地塞米松的条件下再试验24孔培养物。最高产亚克隆NO.25在缺乏和存在地塞米松时分泌产物分别为16μg/ml和33μg/ml。
D. 用pING4143和pING4150转染Sp2/0细胞
质粒pING4143含有与A-MuLv启动子、优选的Kozak翻译起始序列和小鼠Kappa轻链3′非翻译序列以及用于选择MPA抗性细胞的gpt基因相融合的编码rBPI(1-193)ala132的DNA。以电穿孔法，用40μg先以NotI消化、酚氯仿提取、乙醇沉淀的pING4143 DNA转染Sp2/0细胞。电穿孔后，细胞在非选择性DMEM培养基中恢复48小时。然后离心细胞并以5×104细胞/ml的浓度重悬于含MPA(6μg/ml)和黄嘌呤(250μg/ml)的DMEM培养基中，在96孔板上以104细胞/孔涂板。
约2周后，在96孔板上观察到转染细胞组成的菌落。以ELISA分析含单菌落孔内上清液中BPI反应蛋白质的存在。将最高产细胞转移到24孔板上。在存在和不存在10-7M地塞米松的条件下测定24孔培养物处于细胞生长衰退时的产率。最高产的克隆134在缺乏和存在地塞米松时分泌的产物分别约为12μg/ml和28μg/ml。
用电穿孔法以载体pING4150转染克隆134，pING4150含有与A-MuLv启动子、小鼠轻链3′非翻译区、用于选择转染细胞的his基因相融合的编码rBPI(1-193)ala132的DNA。在电穿孔前，载体先消化、酚-氯仿提取和乙醇沉淀。细胞在含10％FBS的DMEM培养基中恢复48小时后，在含6μg/ml MPA、250μg/ml黄嘌呤和8mM组氨醇的DMEM/FBS培养基中以大约104细胞/孔在96孔板上涂板。未转染的细胞存在MPA和组氨醇时不能生长。在大约2周后，在96孔板上观察到由转染细胞组成的菌落。以ELISA分析含单菌落孔内上清液中BPI反应蛋白质的存在。将最高产细胞转移到24孔板上。在存在和不存在10-7M地塞米松的条件下测定24孔培养物处于细胞生长衰退期时的产率。最高产克隆134-11被重新命名为C1770。克隆C1770在不含地塞米松时分泌36μg/ml，而在存在地塞米松的条件下分泌量大于42μg/ml。
E. 以pING4143转染CHO-K1细胞
按A部分用pING4533转染CHO-K1细胞所述的方法用pING4143DNA转染CHO-K细胞系。在大约两周后，以ELISA分析含单个菌落的约800个孔内上清液中BPI反应蛋白质的存在。将高产细胞转移到24孔板上。分泌约9-13μg/ml的高产细胞再在无血清培养基中适应，为在发酵罐中的生长作准备。这些细胞也可再用另一载体再转染，如分别含有his或neo选择标记的pING4150或pING4154，以提供产生更高水平的rBPI产物之细胞系。
F. 以pING4144转染CHO-K1细胞
除了用人巨细胞病毒(hCMV)启动子代替A-MuLv启动子外，质粒pING4144与pING4143相似。按上面A部分所述的方法用pING4144DNA转染CHO-K1细胞系。在大约2周后，以ELISA分析含单个菌落的约200个孔内上清液中BPI反应蛋白质的存在。将高产细胞转移到24孔板上并在含丁酸盐的24孔板上测定rBPI的表达。在本试验中，高产细胞(克隆174)在不含丁酸时约分泌3-5μg/ml而在存在5mM丁酸的条件下分泌约15-18μg/ml。高产细胞可在无血清培养基中适应，为其在发酵罐内的生长作准备。这些细胞也可用另一质粒再转染，如用pING4151或pING4155它们均含有受hCMV启动子控制的rBPI基因，但分别以his或neo作选择性标记，以提供产生更高水平的BPI之细胞系。
G. 以pING4143转染NSO细胞
以电穿孔法用pING4143 DNA转染NSO细胞。在约3周后，在96孔板上观察到由转染细胞组成的菌落。以ELISA分析含单个菌落孔内上清液中BPI反应蛋白质的存在。将高产细胞转移到24孔板上。分析处于衰退期的24孔培养物的产率。最高产细胞分泌15-16μg/ml。高产细胞可按上述方法以另一载体(如pING4150)再转染以产生更高产细胞。
H. 用pING4232转染NSO细胞
以电穿孔法用pING4132转染NSO细胞，pING4132含有与优选的Kozak翻译起始序列融合并克隆到载体pEE13上的、编码rBPI(1-193)ala132的DNA[Bebbington，et al，Biotechnology，10：169-175(1992)]。载体pEE13含有用于选择能在缺乏谷氨酰胺的培养基中生长的转染细胞的谷氨酰胺合成酶基因。在大约3周后，在96孔板上观察到转染细胞组成的菌落。以ELISA法分析含单个菌落孔内的上清液。将最高产细胞转移到24孔板上。测定衰退期24孔培养物的产率，在衰退期的24孔培养物中分泌7-15μg的最高产细胞可在不同浓度的甲硫氨酸Sulfoximine存在的条件下进行扩增。
I. 以pING4145转染Sp2/0细胞
质粒pING4145含有与A-MuLv启动子、优选的Kozak翻译起始序列，小鼠Kappa轻链3′非翻译序列、用于选择MPA抗性细胞的gpt基因相融合的编码rBPI(1-193)ala132的DNA。以电穿孔法用40μg先以NotI消化、酚-氯仿提取、乙醇沉淀的pING4145 DNA转染Sp2/0细胞。电穿孔后，细胞在非选择性DMEM培养基中恢复48小时，再离心，以5×104细胞/ml的浓度重悬于含MPA(6μg/ml)和黄嘌呤(250μg/ml)的DMEM培养基中。然后细胞在96孔板上以约104细胞/孔涂板。大约2周后，在96孔板上观察到由转染细胞组成的菌落。然后以ELISA法分析含单个菌落孔内上清液中BPI反应蛋白质的存在。将最高产细胞转移到24孔板上，在存在和不存在10-7M地塞米松的条件下分析衰退期24孔培养物的产率。
为增强BPI的表达，可经电穿孔法用一载体转染最高产的Sp2/0转染细胞，该载体含有与A-MuLv启动子、小鼠轻链3′非翻译区、用于选择转染细胞的his基因相融合的编码rBPI(1-193)ala132的基因序列。
J. 以pING4145转染CHO-K1
按上面A部分所述的方法以pING4145 DNA转染CHI-K1细胞系。大约2周后，以ELISA分析含单菌落的约500-800孔内上清液中BPI反应蛋白质的存在。将高产细胞转移到24孔板上并在含S-琼脂糖的24孔平板上检测BPI的表达。然后高产细胞在无血清培养基中适应，为在发酵罐中生长作准备。为制备产生更高水平rBPI产物的细胞系，可用含有不同选择性标记的载体再感染该细胞。
K. rBPI产物在昆虫细胞中的表达
可表达BPI产物的另一真核系统是被含有编码rBPI产物的DNA之重组杆状病毒感染的昆虫细胞。产生重组病毒并由之表达重组产物的系统可经商售途径购得(Invitrogen，San Diego，CA)。将编码包括31个氨基酸信号序列的rBPI(1-199)之DNA克隆到pBlueBac转移载体(Invitrogen)的NheI位点上。以这一载体和野生型AcMNPV(Autographa californica多核多分泌病毒，Invitrogen)联合转染Sf9昆虫细胞(BRL； ATCC CR2 1711)。然后，鉴定和纯化重组病毒噬斑，并按BRL所述的方法用它来产生高滴度重组病毒种子。
重组产生的杆状病毒用于进一步感染Sf9细胞。为此，用杆状病毒感染8个独立的60mm培养皿中的Sf9细胞。在一天内的不同时间收集感染细胞培养皿中的培养基来对8个培养皿中的每一个进行取样。收集后，培养基以1000rpm离心10分钟并将上清液贮存于4℃。然后，用4ml PBS漂洗细胞一次，以100μl/培养皿的NP40裂解缓冲液(1％NP40，150mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH8.0)冰浴30分钟裂解细胞。再用细胞刮器将细胞收集到Eppendorf管中。细胞裂解物在小离心机中旋转2分钟。裂解物上清液转移到一新管中并贮存于-20℃。以ELISA分析每天每一时间点所取的培养基样品中的BPI含量，以Western印迹法用抗BPI抗体分离裂解物。
感染后1-4天内以ELISA在培养基中检测不到rBPI产物。然而，在感染后5-6天时，在培养基样品中检测到rBPI产物的高峰值200-500ng/ml。Western印迹分析裂解物表明：在感染后第2天有一BPI反应带。这条带到第6天变得更清晰。
下面的表II对上述A-J部分的感染详情进行了总结：
                     表II
宿主细胞                                 转染所用的质粒
CHO-DG44                                 pING4222
CHO-K1                                   pING4533，pING4143
                                         pING4144，pING4145
NSO                                      pING4143，pING4232
SP2/O                                    pING4223，再用pING4221
                                         pING4143，再用pING4150
                                         pING4145
                     实施例3
构建用于体外转录和翻译rBPI(1-199)ala132和rBPI(1-199)Ser135的质粒
使用质粒pIC127作为编码rBPI(1-199)DNA的来源进行体外转录/翻译研究。pIC127的构建按下述进行。从含有编码BPI全长cDNA的质粒pGEM-72f(+)中经PCR扩增编码包括31个氨基酸信号序列的rBPI(1-199)之DNA。使用引物BPI-3：GTCGACGCATGCGAGAGAACATGGC(SEQ ID NO：12)和BPI-2：CCGCGGCTCGAGCTATATTTTGGTCAT(SEQ IDNO：9)进行扩增使SalI位点引入到5′端和XhoI及SstII位点引入到3′端。为生产pIC102，将所得的PCR扩增片段平末端克隆到质粒pT7T318U(Pharmacia LKB Technology，Piscataway NJ)多克隆区的SmaI位点上。
经用BamHI和Asp718I消化pIC102质粒切除编码rBPI(1-199)和31个氨基酸信号肽的pIC102插入片段。在pIC102中BamHI位点在SalI位点侧面，Asp718I位点在SstII位点侧面。切出的片段末端用T4 DNA聚合酶变成平末端，并将该平末端片段克隆到先用PstI和EcoRI消化再用T4 DNA聚合酶平头化的质pGEM1(ProMega，Madi-son，WI)上。所得的构建体命名为pIC124，该质粒rBPI(1-199)编码插入片段的取向为其5′端与pGEM1中的Sp6启动子相邻。
经去掉pIC124中两个HincII位点之间的区域来切去pIC124插入片段中的31个氨基酸信号序列以制备pIC127。切掉的区域用一连接子代替以恢复BPI的起始密码子(ATG)和编码第一个氨基酸的序列。从HincII和SstII消化pIC124中分离出两个片段：(1)含有不包括第一个氨基酸密码子的rBPI(1-199)编码区之HincII-SstII片段；(2)含质粒剩余部分的SstII-HincII片段。通过使用两个互补的退火寡聚核苷BPI-28：GACGCCACCATGGTC(SEQ ID NO：13)和BPI-29：GACCATGGTGGCGTC(SEQ ID NO：14)形成的连接子来插入BPI编码序列的第一个密码子和BPI序列前的编码甲酰氨酸的密码子。这两个寡聚核苷与从pIC124得到的HincII-SstII和SstII-HincII片段连接起来形成pIC127。
为进行rBPI(1-199)ala132和rBPI(1-199)Ser135的体外转录/翻译、用pIC127构建了两上质粒pML101和pML102。为此，用SstII和EcoRI消化pIC127，纯化所得的SstII-EcoRI大片段。为构建含有rBPI(1-199)ala132插入片段的pmL102，将来自pING4519的EcoRI-SstII片段与来自pIC127的SstII-EcoRI片段连接起来。为了构建含有rBPI(1-199)Ser135插入片段的pML102，将来自pING4520的EcoRI-SstII片段与来自pIC127的SstII-EcoRI片段连接起来。
使用耦联网状细胞溶胞系统(Reticulocyte Lysate System)的TNT SP6(ProMega，Madison，WI.)从质粒pIC127、pML101和pML102体外表达出rBPI(1-199)、rBPI(1-199)Ser135和BPI(1-199)ala132。该系统允许使用真核翻译系统体外耦联克隆基因的转录和翻译。按产品说明，用2μg质粒DNA在含35S-甲硫氨酸(以产生标记蛋白)的25μl总体积中进行每个耦联的转录/翻译。将5μl等份试样的标记蛋白产品加入到20μl尿素样品缓冲液中，95℃加热3分钟。每个样品的等份试样(10μl)在含有或不含DTT(50mM)的15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳。凝胶固定和染色后，经放射自显影可看到标记的蛋白带。放射自显影的结果表明：编码rBPI(1-199)、rBPI(1-199)ala132和rBPI(1-199)Cys135的cDNA表达出约23Kd预计大小、代表BPIN-端片段的蛋白产物。而且，所有3种表达产物rBPI(1-199)、rBPI(1-199)ala132和rBPI(1-199)cys135都能产生BPI(1-199)二聚体预计大小较高分子量种类以及较大的种类，所有这些高分子量种类随DTT的减少而消失。rBPI(1-199)Cys135和rBPI(1-199)ala132产物中二聚体种类的表达被认为可能是使用无细胞的体外转录/翻译系统而引起的。这一系统不允许适当的转录后加工、折叠等，而这些步骤在细胞翻译中正常进行。因此，在该体外系统中可能并不总是形成适当的二硫键，导致在某些情况下形成二聚体。
在上述体外表达系统中产生的标记蛋白然后用于试验其LPS结合活性。用来自Salmonella minnesota R7(Rd突变体)的LPS(5mg/ml甲醇贮备培养物)在0.1M Na2CO3/20mM EDTA(乙二胺四乙酸)pH9.4的条件下包被微滴定板孔(在50μl孔中共含2μg LPS)。4℃保温过夜后，用水漂洗小孔并37℃干燥。孔用215μl Dulbecco′s-PBS/0.1％BSA 37℃封闭3小时。然后弃去封闭液，用PBS/0.2％Tween-20洗涤孔。然后将rBPI样品(2μl翻译反应物)加入到50μl总体积的PBS/0.2％Tween中。4℃保温过夜后，以PBS/0.2％Tween洗涤孔三次。以液闪计数测定每孔剩余的标记蛋白量。结果表明上述所有三种BPI种类发生几乎相等的LPS结合。rBPI(1-199)的结合为48,690cpm；rBPI(1-199)ala132的结合为59,911cpm；rBPI(1-199)Cys135为52,538cpm。上述每一值代表三次测量的平均值。对照(无DNA)的平均结合量为5,395cpm。
                     实施例4
产物特征鉴定
A. 物理特征鉴定
使用反向(C4)HPLC、阳离子交换(MA7C)HPLC、SDS-PAGE、电喷射离子化质谱仪(ESI-MS)来完成rBPI产物的特征鉴定。经单步纯化程序或多步程序从转瓶或10升发酵罐收获物中纯化待鉴定的rBPI产物。单步纯化程序(在由Grinna共同未决、共同拥有的美国专利系列申请08/072,063中已公开，此处引用以供参考。)必须增加一步洗涤步骤。简单地说，在含rBPI产物的生长培养基中加入S-琼脂糖珠。然后从培养基中移出S-琼脂糖并用20mM乙酸钠和100mMNaCl pH4.0洗涤。用20mM乙酸钠和700mM氯化钠(pH4.0)进行第二次洗涤。用20mM乙酸钠和1000mM NaCl(pH4.0)洗脱纯化的rBPI产品。
多步纯化程序包括纯化按上述方法首先单独纯化的各批rBPI产品汇集物。以单步纯化法分别纯化20批单独的rBPI产物后，将它们汇集起来，先将汇集物中的盐浓度稀释到200mM，然后再纯化。将汇集物样品加到S-琼脂糖柱上，先用pH4.0 20mM乙酸钠和200mMNaCl洗涤，再用700mM氯化钠洗涤。用20mM乙酸钠和1000mM氯化钠以pH4.0洗脱rBPI产品。纯化的rBPI产物用于分析测定其物理特征。
1、 rBPI产物的SDS-PAGE分析
用14％聚丙烯酰胺凝胶和tris-甘氨酸缓冲系统在还原和非还原条件下进行rBPI产物的SDS-PAGE分析。为便于观察，用考马斯兰或银染色蛋白质带。
如图1所示，非还原的rBPI(1-199)表现为一条约23KD的主带和一约为40KD的小带。经与同时电泳的标准品比较鉴定主带为rBPI(1-199)，经免疫染色鉴定小带是rBPI(1-199)的二聚体形式。经分离的rBPI(1-199)样品中加入1/20体积的0.4M二硫苏糖醇(DDT)、SDS-PAGE显示出唯一的一条与上述非还原条件下鉴定的23KD单体rBPI(1-199)种类相对应的非常明显的带。
对rBPI(1-199)ala132产物的SDS-PAGE分析显示出唯一的一条在还原条件下与单一23KD rBPI(1-199)带一起迁移的带。在非还原条件下，rBPI(1-199)ala132与在rBPI(1-199)中所见的两条较快迁移、位置非常接近的带(与23KD带相对应)一起迁移。这些结果(图2所示)表明纯化后rBPI(1-199)ala132基本上以单体形式存在。因此，半胱氨酸残基被丙氨酸取代后的rBPI产物表现出对二聚体形成有明显的抵抗。
2、 rBPI产物的阳离子交换HPLC分析
使用MA7C柱的阳离子交换HPLC也用于测量rBPI产物中的二聚体含量。使用40％缓冲液B(20mM MES，1M NaCl，pH5.5)以1.0ml/min平衡过的Bio-Rad MA7C筒(4.6×30mm，Bio-Rad目录号125-00556)。将1ml样品稀释成100μg/ml并将200μl稀释样品注射加样到柱上来分析rBPI(1-199)产物。在6分钟内以梯度为40％到100％的缓冲液B洗脱rBPI。缓冲液A含20nM MES(pH5.5)，在229nm下监测吸光率。
对rBPI(1-199)的分析显示出两个峰值。第一个洗脱峰大约滞留3分钟，如图3所示。第二个较小的洗脱峰在大约6分钟时。经与纯化的单体和二聚体标准品滞留时间相比，鉴定出第一个峰(如图3所示)代表rBPI(1-199)单体，图3中的第二个峰代表rBPI(1-199)二聚体。当在加样前以DTT还原样品后，不出现第二个峰(二聚体)。
用相同的程序检测rBPI(1-199)ala132的洗脱情况。如图4所示。rBPI(1-199)ala132洗脱时，仅在与观察到的rBPI(1-199)单体峰相对应的滞留时间时出现单一的峰。在rBPI(1-199)ala132样品中没有二聚体存在的证据。
3、 rBPI产物的反相(C 4 )HPLC和电喷射-离子化质谱仪分析
以反相HPLC和电喷射-离子化质谱仪(ESI-MS)揭示rBPI产物的微观不均一性。为进行HPLC分析，用37％可动相B(80％乙腈/.065％TFA)以流速0.5ml/分平衡Brownlee BU-300 C4柱。将rBPI(1-199)样品(每1ml)稀释成100μg/ml，用50μl该样品加样。用37％可动相B洗柱2.5分钟，然后用37％到50％可动相B的梯度在20分钟内洗脱。可动相A为5％乙腈/0.1％TEA，在220nm下监测光吸收率。
rBPI(1-199)产物的反相HPLC分析结果如图5所示。rBPI(1-199)产物洗脱出一个第二(主)峰及一个位于第二峰前沿的部分可辨的第一(小)峰。在以DTT还原时，仅从柱上洗脱出一个与第二峰相对应的峰。
用相同的程序分析rBPI(1-199)ala132产物。如图6所示，rBPI(1-199)ala132洗脱出一个与上面提及的第二(主)峰相对应的峰。
分离并分析来自3批不同的rBPI(1-199)、与上述第一和第二峰相对应的洗脱物，以ESI-MS测定其含量。对rBPI(1-199)电泳产生的第二(主)峰洗脱物的分析揭示出其质量略低于199个氨基酸蛋白质预期的质量。这些资料表明，在第二峰洗脱物中发现的含量最丰富的质量与1-193rBPI蛋白质片段相对应。然而，其它种类也存在从1-198到1-194的大小范围。对rBPI(1-199)ala132HPLC产生单一峰的洗脱物的分析揭示的结果与从上述产生第二(主)峰的洗脱物得到的结果相似。这些结果与rBPI(1-199)产物羧基末端截短所得的肽图谱资料一致。
当对rBPI(1-193)产物进行相同分析时，观察到C端不均一性显著减小。从rBPI(1-193)产物得到的ESU-MS资料揭示出大约85％的蛋白质含有BPIN端氨基酸的前191、193或193(十一个N端丙氨酸)。结果如表III所示。
                             表III
               rBPI(1-193)和rBPI(1-199)HPLC单
               体峰的电喷射-离子化质谱分析结果
表达的rBPI产物       近似分子量      预测的氨      近似相关强度*
                                     基酸残基
                     21407           1-193         50.9％
                     21606           1-195         28.9％
                     21505           1-194         20.1％
rBPI(1-199)          21738           1-196         ＜10％
                     21846           1-197         ＜10％
                     21966           1-198         ＜10％
                     21408           1-193         36.2％
                     21193           1-191         34.1％
rBPI(1-193)          21293           1-192         ＜10％
                     21477           1-193+N-      14.5％
                                     端丙氨酸
                     20924           1-189         15.2％
*只有检测到以大于10％的量存在的种类被定量，然后将这些种类标准化到100％。
这些资料表明：rBPI(1-193)编码DNA产生显著量的rBPI(1-193)蛋白质，而rBPI(1-199)编码DNA产生非全长(即BPI N端1-199氨基酸)蛋白质。根据这些和其它的资料，表明使用rBPI编码DNA的截短形式出现不均一性的显著减少和目标蛋白质(即为生长该蛋白而获得DNA插入密码子)产量的显著提高，而且保持最佳杀菌和LPS结合活性。预计表达DNA截短后，其表达产物不均一性的程度比在175位半胱氨酸残基之后未截短的表达DNA显著减少。编码rBPI蛋白质，在BPIN端前176个氨基酸到BPI N端前193个氨基酸之间的范围内被截短的DNA形式表达产物也预期能达到充分的杀菌和LPS结合活力。
ESI-MS资料还揭示出rBPI产物氨基末端微观不均一性的存在。在所形成的rBPI产物中发现氨基末端有一丙氨酸残基并经胰蛋白酶肽测序证实。
如图5所示，对第一(小型)反相HPLC峰产生的洗脱物的ESI-MS试验显示，该蛋白质的质量分布除了每个质量值约高119-120道尔顿外，与第二(主)峰形成的质量分布相似。这些资料表明，上述洗脱产生的HPLC第一(小)峰含以二硫键相连的半胱氨酸加合蛋白质，因为这是质量一致转变的原因。
为试验由rBPI(1-199)产生的反相HPLC第一(小)峰代表半胱氨酸加合的蛋白质，用以近似克分子当量与游离巯基结合的Ellman氏试剂(二硫硝基苯酸，DTNB)处理rNPI(1-199)。处理后证实每mol rBPI(1-199)中，游离巯基不超过1mol。假定在BPI中存在三个半胱氨酸残基(132、135和175位)，这些结果支持在rBPI产物中有一个分子内二硫键相连或其巯基中有两个在空间上不可得的观点。rBPI(1-199)ala132显示出不与Ellman氏试剂反应。
4、rBPI(1-199)产物的贮存稳定性
分析在含20mM柠檬酸，0.15M氯化钠缓冲液，0.1％ poloxam-er，0.002％polysorbate 80的缓冲液(pH5.0)中的rBPI(1-199)(1mg/ml)样品以测定在建议的贮存温度2℃-8℃和较高温度22℃和37℃下其贮存稳定性。
表IV列出了在2℃-8℃的贮存结果，表明二聚体的存在增加(从1％到4％)，但在样品中无显著的半胱氨酸加合物或颗粒形成的增加。
                             表IV
                                          ％              ％
贮存时间        外观/颜色       pH        未知杂质        二聚体用HPLC
开始            透明/无色       5.1       ND              1.0
4周             透明/无色       5.0       ND              3.2
8周             透明/无色       5.0       ND              4.4
                           ％        LAL
贮存        蛋白质      半胱氨酸     抑制           颗粒/mL     颗粒/mL
时间        mg/mL       加合物       IC50，nG/mL   ≥10μm     ≥25μm
开始        1.04        12           10             230         5
4周         1.02        11           11             113         2
8周         1.02        14           9              125         5
然而，在增高温度的22℃和37℃下贮存显示出样品中二聚体和颗粒的存在有显著的提高而且半胱氨酸加合物的量大量增加。结果如表5所示。另外，当rBPI(1-193)ala132在22℃到37℃下贮存时，贮存两周后检测不到二聚体。在相同条件下，rBPI(1-199)表现出显著的增多。
                        表V
                                      ％         ％温度       贮存时间  外观/颜色  pH  未知杂质 二聚体用HPLC
 22℃ 开始     透明/无色  5.1  ND       1.0
4周      透明/无色  5.0  ND       4.5
8周      透明/无色  5.0  ND       6.8
 37℃ 4周      少量颗粒   5.0  ND       7.9
8周      大量颗粒  5.0    ND      13.1
                      表V(续)
                            ％       LAL温度         贮存 蛋白质 半胱氨酸    抑制    颗粒/mL  颗粒/mL时间 mg/mL  加合物  IC50，nG/mL ≥10μm  ≥25μm
22℃ 开始 1.04   12          10        230      5
4周  1.02   12          10        100      4
8周  1.02   14           6        126      3
37℃ 4周  0.96   16          12      1,709     20
8周  0.88   18           7      20,287   611
5、rBPI产物药用组合物的浊度
实验测定了各种含rBPI药用组合物的浊度。其中，浊度涉及药用组合物不折叠(即，丧失三级蛋白质结构)和/或形成颗粒(各个蛋白质之间相互作用形成大(＞10μm颗粒)的倾向。在柠檬酸缓冲液(20mM柠檬酸钠/150mM氯化钠，pH5.0)或含1.0％poloxamer188(含聚氧丙烯-聚氧乙烯抑制性共聚物的poloxamer表面活性剂)和0.002％多乙氧基醚80(含聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯的多乙氧基醚表面活性剂)的柠檬酸缓冲液中试验的药用组合物含有rBPI(1-199)、rBPI(1-199)ala132或rBPI(1-193)ala132。如上所述，由McGr-egor等人美国专利系列申请No.＿＿＿＿＿＿(申请日1993年2月1日，Attorney Docket No.27129/31162)指出了poloxamer/多乙氧基醚表面活性剂系统组合物的使用可稳定药用组合物，在此引用以供参考。
在pH7.0或pH5.0时在升高的温度下分析样品以测定它们对时间的浊度抗性。分析前，所有样品用50mM磷酸钾或20mM柠檬酸缓冲液(pH7.0)稀释到0.1mg/ml。使用装备有循环水浴附着温度控制杯托的Shimadzu UV-160UV-Vis分光光度计(Shimadzu，Pleasan-ton，CA)，将样品装入石英杯进行浊度测量。在所需温度(57℃，65℃或85℃)下平衡杯托温度，测定在280nm下的吸光值以证实样品已稀释到了适当的浓度。此后，在1小时内每隔2分钟测量350nm下样品的吸光值以测定吸光值随时间的变化。
结果如图7所示，其中“按配方的”指rBPI产物在上述含polo-xamer/多乙氧基醚组合物的柠檬酸缓冲液中，“未按配方的”指rBPI组合物在仅含柠檬酸的缓冲液中。浊度以较慢的速率改变(即，吸光值对时间增加的速率较慢)表示对不折叠和形成颗粒的稳定性增强。如图7所示，加入上述表面活性剂组合物导致所有试验的组合物稳定性(抵抗颗粒形成和不折叠)增强。而且，不管是否存在表面活性剂组合物，rBPI(1-199)ala132和rBPI(1-193)ala132与野生型组合物相比在对不折叠和颗粒形成的抗性方面显示出极大的改善。在pH5.0和65℃、pH5.0和75℃和85℃时分别得到相同的结果。
总之，含表面活性剂组合物和/或去掉半胱氨酸的组合物与无表面活性剂和/或具有野生型BPI(1-199)N-端结构的组合物相比，随时间的延长和温度的升高其稳定性表现出极大的提高。
B. 体外活性特征
利用产物与LPS的结合，LAL抑制试验和产物的杀菌潜力测定了rBPI(1-199)ala132产物的体外活性。
1、 rBPI(1-199)ala 132 与LPS的结合
用E.coli(菌株0111-B4)或S.minnesota(Rd突变株)脂多糖(Sigma Chemical，St.Louis.MO)样品(各20μg到60μg)测定rBPI(1-199)ala132产物结合LPS的能力。
以SDS-PAGE和银染观察或电转移到适当预染标准的硝化纤维素膜(BA25，Schleicher and Schciell，Keene，N.M.)上对LPS样品进行大小分离。将膜浸入37℃、pH7.4的50mM Tris，0.2M NaCl(TBS)和30mg/ml牛血清白蛋白(BSA)中30分钟进行LPS印迹。然后，膜在含2-4μg纯化或部分纯化的rBPI(1-199)ala132或对照蛋白质((rBPI(1-199)或rBPI全蛋白))的溶液中21℃到42℃保温12-18小时。保温后，用TBS-BSA洗涤膜。在30分内至少更换三次溶液。洗过的膜在与含1mg/ml BSA的TBS按1∶1000稀释的兔抗-rBPI(1-199)中保温3小时。接着至少洗涤膜三次，并按产品说明使用化学发光检测系统(Tropix Systems，Bedford，MA)，用5×PBS和0.25％明胶(Bio-Rad)代替I-区来显影。
结果表明：rBPI(1-199)ala132与固定于硝酸纤维素膜上的LPS的结合与rBPI(1-199)一样好或更好。
2、 E.coli生长抑制分析
以rBPI(1-199)或rBpI(1-199)ala132类似物处理E.coli并监测肉汤生长抑制作为杀菌活性的测量来实施E.coli肉汤生长抑制试验以测定rBPI产物的杀菌潜力。本试验使用的具有短链LPS的“粗糙型”E.coli菌株命名为J5(E.coli菌株0111：B4的粗糙型UDP-4-表异构酶-不足突变型)。细胞在三乙醇胺缓冲的无机盐培养基(Simon，et al.Proc.Nat.Acad.Sci，51：877(1964))中生长，该培养基使E.coli对BPI更敏感。洗涤细胞并以约5×108个细胞/ml的密度重悬于0.9％NaCl中。大约5×106到1×107个E.coli细胞与浓度为5μg/ml的rBPI(1-199)或rBPI(1-199)ala132类似物的缓冲溶液(10％Hanks平衡盐溶液，40mM Tris-HCl，pH7.5，0.1％酪蛋白水解产物)以200-400ml的体积一起保温30-60分钟。另外，分别以rBPI(1-199)或rBPI(1-199)ala132类似物与100mM MgCl2进行试验。保温后，以10体积的含0.9％NaCl的营养肉汤稀释细胞。然后监测几小时内的肉汤生长。
结果表明：rBPI(1-199)ala132类似物比rBPI(1-199)具有相同或更高效价的杀菌活力。加入MgCl2后，与预期的一样，rBPI(1-199)ala132类似物和rBPI(1-199)的杀菌活力都减小。
3、 LAL抑制试验
用LAL抑制试验鉴定rBPI(1-199)ala132结合LPS的能力。在Gazzano-Santoro，Infect.Immun.，60：4754-4761(1992)中描述了一种LAL抑制试验。LAL试验结果表明：rBPI(1-199)ala132的IC-50值为10，与rBPI(1-199)的相等。这些资料表明，该类似物与野生型rBPI产物对LPS的结合相匹敌。
C. rBPI(1-199)ala 132 在致死性内毒素血症的动物模型中的效力
内毒素血症动物模型用于评价rBPI(1-199)ala132和rBPI(1-199)抗内毒素性休克的比较效力。
雄性ICR小鼠接受800μg/kg放线菌素D和0.5μg/kg或1.0μg/kg内毒素(E.coli，Strain 0111：B4)的静脉注射。内毒素注射后，立即给小鼠静脉注射(0.5mg/kg或5.0mg/kg)rBPI(1-199)或BPI(1-199)ala132。缓冲的载体用作对照。然后，记录7天内的死亡。结果在下面表VI中列出。
                           表VI
                  BPI剂量        #死亡数/总数     ％死亡率
仅用缓冲液        0              14/15μ                         93
rBPI23           0.5mg/kg       7/15               47
                  5.0mg/kg       8/15               53
rBPI23-cys        0.5mg/kg       14/15              93
                  5.0mg/kg       8/16               50
如表VI中所见，rBPI(1-199)ala132和rBPI(1-199)都对内毒素的致死效应提供显著保护。尽管本发明提供了优选的实施例，本领域的技术人员将认识到各种修饰和取代也在本说明的范围内。例如：以丙氨酸或丝氨酸以外的其它非极性氨基酸取代BPIN-端片段132或135位的半胱氨酸是从本发明可预料到的。因此，附加权利要求和将来的任何修正均在所述范围内。
                        序列表(1)一般资料：
(i)申请人：Theofan，Georgia
           Horwitz，Arnold
           Burke，David
           Baltaian，Manik
           Grinna，Lynn S
(ii)发明题目：稳定的杀菌/增强通透性蛋白质产物及其药用组合物
(iii)序列号：14
(iv)通信地址：
    (A)地址：Marshall，O′Toole，Gerstein，Murray &
             Bicknell
    (B)街道：Two First National Plaza
    (C)城市：芝加哥
    (D)州：伊里诺
    (E)国家：美国
    (F)邮编：60603
(v)计算机可读形式：
    (A)介质类型：Floppy盘
    (B)计算机：IBM PC兼容
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：petentIn Release #1.0，Version #1.25
(vi)最近申请资料
    (A)申请号：
    (B)申请日：
    (C)分类：
(vii)代理人资料
    (A)姓名：Meyers，Thomas C.
    (B)登记号：P-36，989
    (C)参考/备案号：27129/30911
(ix)电讯资料：
    (A)电话：312/346-5750
    (B)电传：312/346-9740
    (C)用户电报：25-3856(2)SEQ ID NO：1资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：1813个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA
(ix)特征：
    (A)名字/键：CDS
    (B)位置：31..1491
(ix)特征：
    (A)名字/键：mat肽
    (B)位置：124..1491
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：CAGGCCTTGA GGTTTTGGCA GCTCTGGAGG ATG AGA GAG AAC ATG GCC AGG GGC      54
                             Met Arg Glu Asn Met Ala Arg Gly
                             -31 -30                 -25CCT TGC AAC GCG CCG AGA TGG GTG TCC CTG ATG GTG CTC GTC GCC ATA      102Pro Cys Asn Ala Pro Arg Trp Val Ser Leu Met Val Leu Val Ala Ile
        -20                 -15                 -10GGC ACC GCC GTG ACA GCG GCC GTC AAC CCT GGC GTC GTG GTC AGG ATC      150Gly Thr Ala Val Thr Ala Ala Val Asn Pro Gly Val Val Val Arg Ile
     -5                   1               5TCC CAG AAG GGC CTG GAC TAC GCC AGC CAG CAG GGG ACG GCC GCT CTG      198Ser Gln Lys Gly Leu Asp Tyr Ala Ser Gln Gln Gly Thr Ala Ala Leu10                  15                  20                  25CAG AAG GAG CTG AAG ACG ATC AAG ATT CCT GAC TAC TCA GAC AGC TTT      246Gln Lys Glu Leu Lys Arg Ile Lys Ile Pro Asp Tyr Ser Asp Ser Phe
             30                  35                  40AAG ATC AAG CAT CTT GGG AAG GGG CAT TAT AGC TTC TAC AGC ATG GAC      294Lys Ile Lys His Leu Gly Lys Gly His Tyr Ser Phe Tyr Ser Met Asp
         45                  50                  55ATC CGT GAA TTC CAG CTT CCC AGT TCC CAG ATA AGC ATG GTG CCC AAT      342Ile Arg Glu Phe Gln Leu Pro Ser Ser Gln Ile Ser Met Val Pro Asn
     60                  65                  70GTG GGC CTT AAG TTC TCC ATC AGC AAC GCC AAT ATC AAG ATC AGC GGG      390Val Gly Leu Lys Phe Ser Ile Ser Asn Ala Asn Ile Lys Ile Ser Gly
 75                  80                  85AAA TGG AAG GCA CAA AAG AGA TTC TTA AAA ATG AGC GGC AAT TTT GAC      438Lys Trp Lys Ala GLn Lys Arg Phe Leu Lys Met Ser Gly Asn Phe Asp90                  95                 100                 105CTG AGC ATA GAA GGC ATG TCC ATT TCG GCT GAT CTG AAG CTG GGC AGT      486Leu Ser Ile Glu Gly Met Ser Ile Ser Ala Asp Leu Lys Leu Gly Ser
            110                 11S                 120AAC CCC ACG TCA GGC AAG CCC ACC ATC ACC TGC TCC AGC TGC AGC AGC      534Asn Pro Thr Ser Gly Lys Pro Thr Ile Thr Cys Ser Ser Cys Ser Ser
        125                 130                 135CAC ATC AAC AGT GTC CAC GTG CAC ATC TCA AAG AGC AAA GTC GGG TGG      582His Ile Asn Ser Val His Val His Ile Ser Lys Ser Lys Val Gly Trp
    140                 145                 150CTG ATC CAA CTC TTC CAC AAA AAA ATT GAG TCT GCG CTT CGA AAC AAG      630Leu Ile Gln Leu Phe His Lys Lys Ile Glu Ser Ala Leu Arg Asn Lys
155                 160                 165ATG AAC AGC CAG GTC TGC GAG AAA GTG ACC AAT TCT GTA TCC TCC AAG      678Met Asn Ser Gln Val Cys Glu Lys Val Thr Asn Ser Val Ser Ser Lys170                 175                 180                 185CTG CAA CCT TAT TTC CAG ACT CTG CCA GTA ATG ACC AAA ATA GAT TCT     726Leu Gln Pro Tyr Phe Gln Thr Leu Pro Val Met Thr Lys Ile Asp Ser
            190                 195                 200GTG GCT GGA ATC AAC TAT GGT CTG GTG GCA CCT CCA GCA ACC ACG GCT     774Val Ala Gly Ile Asn Tyr Gly Leu Val Ala Pro Pro Ala Thr Thr Ala
       205                 210                 215GAG ACC CTG GAT GTA CAG ATG AAG GGG GAG TTT TAC AGT GAG AAC CAC     822Glu Thr Leu Asp Val Gln Met Lys Gly Glu Phe Tyr Ser Glu Asn His
    220                 225                 230CAC AAT CCA CCT CCC TTT GCT CCA CCA GTG ATG GAG TTT CCC GCT GCC     870His Asn Pro Pro Pro Phe Ala Pro Pro Val Met Glu Phe Pro Ala Ala
235                 240                 245CAT GAC CGC ATG GTA TAC CTG GGC CTC TCA GAC TAC TTC TTC AAC ACA     918His Asp Arg Met Val Tyr Leu Gly Leu Ser Asp Tyr Phe phe Asn Thr250                 255                 260                 265GCC GGG CTT GTA TAC CAA GAG GCT GGG GTC TTG AAG ATG ACC CTT AGA     966Ala Gly Leu Val Tyr Gln Glu Ala Gly Val Leu Lys Met Thr Leu Arg
            270                 275                 280GAT GAC ATG ATT CCA AAG GAG TCC AAA TTT CGA CTG ACA ACC AAG TTC    1014Asp Asp Met Ile Pro Lys Glu Ser Lys Phe Arg Leu Thr Thr Lys Phe
        285                 290                 295TTT GGA ACC TTC CTA CCT GAG GTG GCC AAG AAG TTT CCC AAC ATG AAG    1062Phe Gly Thr Phe Leu Pro Glu Val Ala Lys Lys Phe Pro Asn Met Lys
    300                 305                 310ATA CAG ATC CAT GTC TCA GCC TCC ACC CCG CCA CAC CTG TCT GTG CAG    1110Ile Gln Ile His Val Ser Ala Ser Thr Pro Pro His Leu Ser Val Gln
315                 320                 325CCC ACC GGC CTT ACC TTC TAC CCT GCC GTG GAT GTC CAG GCC TTT GCC    1158Pro Thr Gly Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Val Asp Val Gln Ala Phe Ala330                 335                 340                 345GTC CTC CCC AAC TCC TCC CTG GCT TCC CTC TTC CTG ATT GGC ATG CAC    1206Val Leu Pro Asn Ser Ser Leu Ala Ser Leu Phe Leu Ile Gly Met His
            350                 355                 360ACA ACT GGT TCC ATG GAG GTC AGC GCC GAG TCC AAC AGG CTT GTT GGA    1254Thr Thr Gly Ser Met Glu Val Ser Ala Glu Ser Asn Arg Leu Val Gly
        365                 370                 375GAG CTC AAG CTG GAT AGG CTG CTC CTG GAA CTG AAG CAC TCA AAT ATT    1302Glu Leu Lys Leu Asp Arg Leu Leu Leu Glu Leu Lys His Ser Asn Ile
    380                 385                 390GGC CCC TTC CCG GTT GAA TTG CTG CAG GAT ATC ATG AAC TAC ATT GTA    1350Gly Pro Phe Pro Val Glu Leu Leu Gln Asp Ile Met Asn Tyr Ile Val
395                 400                 405CCC ATT CTT GTG CTG CCC AGG GTT AAC GAG AAA CTA CAG AAA GGC TTC    1398Pro Ile Leu Val Leu pro Arg Val Asn Glu Lys Leu Gln Lys Gly phe410                 415                 420                 425CCT CTC CCG ACG CCG GCC AGA GTC CAG CTC TAC AAC GTA GTG CTT CAG    1446Pro Leu Pro Thr Pro Ala Arg Val Gln Leu Tyr Asn Val Val Leu Gln
            430                 435                 440CCT CAC CAG AAC TTC CTG CTG TTC GGT GCA GAC GTT GTC TAT AAA          1491Pro His Gln Asn Phe Leu Leu Phe Gly Ala Asp Val Val Tyr Lys
        445                 450                 455TGAAGGCACC AGGGGTGCCG GGGGCTGTCA GCCGCACCTG TTCCTGATGG GCTGTGGGGC    1551ACCGGCTGCC TTTCCCCAGG GAATCCTCTC CAGATCTTAA CCAAGAGCCC CTTGCAAACT    1611TCTTCGACTC AGATTCAGAA ATGATCTAAA CACGAGGAAA CATTATTCAT TGGAAAAGTG    1671CATGGTGTGT ATTTTAGGGA TTATGAGCTT CTTTCAAGGG CTAAGGCTGC AGAGATATTT    1731CCTCCAGGAA TCGTGTTTCA ATTGTAACCA AGAAATTTCC ATTTGTGCTT CATGAAAAAA    1791AACTTCTGGT TTTTTTCATG TG                                             1813(2)SEQID NO：2资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：487氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Arg Glu Asn Met Ala Arg Gly Pro Cys Asn Ala Pro Arg Trp Val-31 -30                 -25                 -20Ser Leu Met Val Leu Val Ala Ile Gly Thr Ala Val Thr Ala Ala Val-15                 -10                  -5                   1Asn Pro Gly Val Val Val Arg Ile Ser Gln Lys Gly Leu Asp Tyr Ala
          5                  10                  15Ser Gln Gln Gly Thr Ala Ala Leu Gln Lys Glu Leu Lys Arg Ile Lys
     20                  25                  30Ile Pro Asp Tyr Ser Asp Ser Phe Lys Ile Lys His Leu Gly Lys Gly
 35                  40                  45His Tyr Ser Phe Tyr Ser Met Asp Ile Arg Glu Phe Gln Leu Pro Ser50                  55                  60                  65Ser Gln Ile Ser Met Val Pro Asn Val Gly Leu Lys phe Ser Ile Ser
             70                  75                  80Asn Ala Asn Ile Lys Ile Ser Gly Lys Trp Lys Ala Gln Lys Arg Phe
         85                  90                  95Leu Lys Met Ser Gly Asn Phe Asp Leu Ser Ile Glu Gly Met Ser Ile
    100                 105                 110Ser Ala Asp Leu Lys Leu Gly Ser Ash Pro Thr Ser Gly Lys Pro Thr
115                 120                 125Ile Thr Cys Ser Ser Cys Ser Ser His Ile Asn Ser Val His Val His130                 135                 140                 145Ile Ser Lys Ser Lys Val Gly Trp Leu Ile Gln Leu Phe His Lys Lys
            150                 155                 160Ile Glu Ser Ala Leu Arg Asn Lys Mer Asn Ser Gln Val Cys Glu Lys
        165                 170                 175Val Thr Asn Ser Val Ser Ser Lys Leu Gln Pro Tyr phe Gln Thr Leu
    180                 185                 190Pro Val Met Thr Lys Ile Asp Ser Val Ala Gly Ile Asn Tyr Gly Leu
195                 200                 205Val Ala Pro Pro Ala Thr Thr Ala Glu Thr Leu Asp Val Gln Met Lys210                 215                 220                 225Gly Glu Phe Tyr Ser Glu Asn His His Asn Pro Pro Pro Phe Ala Pro
            230                 235                 240Pro Val Met Glu Phe Pro Ala Ala His Asp Arg Met Val Tyr Leu Gly
        245                 250                 255Leu Ser Asp Tyr Phe Phe Asn Thr Ala Gly Leu Val Tyr Gln Glu Ala
    260                 265                 270Gly Val Leu Lys Met Thr Leu Arg Asp Asp Met Ile Pro Lys Glu Ser
275                 280                 285Lys Phe Arg Leu Thr Thr Lys Phe Phe Gly Thr Phe Leu Pro Glu Val290                 295                 300                 305Ala Lys Lys Phe Pro Asn Met Lys Ile Gln Ile His Val Ser Ala Ser
            310                 315                 320Thr Pro Pro His Leu Ser Val Gln Pro Thr Gly Leu Thr Phe Tyr Pro
        325                 330                 335Ala Val Asp Val Gln Ala Phe Ala Val Leu Pro Asn Ser Ser Leu Ala
    340                 345                 350Ser Leu Phe Leu Ile Gly Met His Thr Thr Gly Ser Met Glu Val Ser
355                 360                 365Ala Glu Ser Ash Arg Leu Val Gly Glu Leu Lys Leu Asp Arg Leu Leu370                 375                 380                 385Leu Glu Leu Lys His Ser Asn Ile Gly Pro Phe Pro Val Glu Leu Leu
            390                 395                 400Gln Asp Ile Met Asn Tyr Ile Val Pro Ile Leu Val Leu Pro Arg Val
        405                 410                 415Asn Glu Lys Leu Gln Lys Gly Phe Pro Leu Pro Thr Pro Ala Arg Val
    420                 425                 430Gln Leu Tyr Asn Val Val Leu Gln Pro His Gln Asn Phe Leu Leu Phe
435                 440                 445Gly Ala Asp Val Val Tyr Lys450                 455(2)SEQ ID NO：3：
(i)序列特征：
    (A)长度：25个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA
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(i)序列特征：
    (A)长度：18碱基对
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(ii)分子类型：cDNA
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    (B)类型：核酸
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(ii)分子类型：cDNA
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    (A)长度：18碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA
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(i)序列特征：
    (A)长度：13bp
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(ii)分子类型：cDNA
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    (A)长度：27bp
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(ii)分子类型：cDNA
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Claims (27)

1.一种杀菌/增强通透性蛋白质或其生物学活性片段的多肽，其中132位的半胱氨酸残基被一不同的氨基酸取代。
2.权利要求1中的多肽，其中取代所说的半胱氨酸残基的氨基酸选自由丙氨酸和丝氨酸组成的氨基酸组中的一种非极性氨基酸。
3.权利要求1中的多肽，其中132位的半胱氨酸残基被丙氨酸所取代。
4.根据权利要求1、2或3的多肽，除了132位半胱氨酸残基被取代外，其含有杀菌/增强通透性蛋白质氨基末端从176到199的起始氨基酸残基。
5.根据权利要求4的多肽，其含有杀菌/增强通透性蛋白质起始193个氨基末端氨基酸残基。
6.编码权利要求1-5任一项的多肽的DNA。
7.一种编码其中132位半胱氨酸残基被一不同的氨基酸取代的杀菌/增强通透性蛋白质或其生物学活性片段的多肽的DNA。
8.权利要求7的DNA，其编码31个氨基酸先导序列和杀菌/增强通透性蛋白质的前193个N端残基，并在紧靠193位亮氨酸残基密码子之后有一终止密码子。
9.权利要求7的DNA，编码31个氨基酸先导序列和杀菌/增强通透性蛋白质前199个N端残基，并在紧靠199位异亮氨酸密码子之后有一终止密码子。
10.一种含有权利要求6-9任一项的DNA的自主复制DNA载体。
11.一种用权利要求6-9任一项的DNA稳定转化或转染的宿主细胞。
12.一种根据权利要求11的真核宿主细胞。
13.一种生产杀菌/增强通透性蛋白质或其生物活性片段多肽的方法，该方法包括在合适的培养基中繁殖一种用权利要求6-9任一项的DNA稳定转化或转染的宿主细胞，并从所述宿主细胞或所述培养基中分离所述多肽。
14.一种生产杀菌/增强通透性蛋白质或其生物活性片段多肽的方法，包含在合适的培养基中繁殖权利要求11的宿主细胞并从所说的宿主细胞或所说的培养基中分离所说的多肽。
15.一种杂种融合蛋白质，包含在其氨基末端的权利要求1的多肽，在其羧基末端的免疫球蛋白重链恒定区或其等位变体。
16.编码权利要求15的杂种融合蛋白质的DNA，。
17.一种含有按权利要求16的DNA自主复制DNA载体。
18.一种用权利要求17的DNA稳定转化或转染的宿主细胞。
19.一种生产权利要求15的杂种融合蛋白的方法，其包括在适当的培养基中繁殖权利要求18的宿主细胞并从所说的宿主细胞或所说的培养基中分离所说的融合蛋白。
20.一种药物组合物，其含有权利要求1-5任一项的多肽和药用上可接受的稀释剂、辅剂或载体。
21.一种药物组合物，其含有权利要求15的杂种融合蛋白质和一种药用上可接受的稀释剂、辅剂或载体。
22.一种DNA，其编码以193位亮氨酸残基作为羧基末端残基的杀菌/增强通透性蛋白质的生物活性片段。
23.权利要求22的DNA，其编码31个氨基酸先导序列和杀菌/增强通透性蛋白质N端的前193个氨基酸残基，并在紧靠193位亮氨酸密码子之后有一终止密码子。
24.一种含有权利要求22或23的DNA自主复制DNA载体。
25.一种用权利要求22或23的DNA稳定转化或转染的宿主细胞。
26.一种生产生物学活性杀菌/增强通透性片段的方法，其包括在适当的培养基中繁殖以权利要求22或23的DNA稳定转化或转染的宿主细胞，并从所述宿主细胞或所说的培养基中分离所说的片段。
27.一种药物组合物，其含有按权利要求26的方法产生的片段和药用上可接受的稀释剂、辅助剂或载体。
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