CN1142832A - Cs-1模拟肽，利用该肽的组合物和方法 - Google Patents

Cs-1模拟肽，利用该肽的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1142832A
CN1142832A CN94194969A CN94194969A CN1142832A CN 1142832 A CN1142832 A CN 1142832A CN 94194969 A CN94194969 A CN 94194969A CN 94194969 A CN94194969 A CN 94194969A CN 1142832 A CN1142832 A CN 1142832A
Authority
CN
China
Prior art keywords
peptide
group
amido
ring
ncy
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN94194969A
Other languages
English (en)
Inventor
托马斯·S·阿列纽斯
马里亚诺·J·埃利塞斯
费德里科·C·加埃塔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cytel Corp
Original Assignee
Cytel Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cytel Corp filed Critical Cytel Corp
Publication of CN1142832A publication Critical patent/CN1142832A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0205—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-(X)3-C(=0)-, e.g. statine or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0207—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-(X)4-C(=0), e.g. 'isosters', replacing two amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/021—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-(X)n-C(=0)-, n being 5 or 6; for n > 6, classification in C07K5/06 - C07K5/10, according to the moiety having normal peptide bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
    • C07K5/06113—Asp- or Asn-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0808—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/081—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing O or S as heteroatoms, e.g. Cys, Ser
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0815—Tripeptides with the first amino acid being basic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0819—Tripeptides with the first amino acid being acidic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0821—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1008—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/101—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1013—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing O or S as heteroatoms, e.g. Cys, Ser
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1019—Tetrapeptides with the first amino acid being basic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Abstract

本发明涉及能够抑制在炎性白细胞上表达的VLA-4受体和在内皮细胞上表达的纤维蛋白连接素CS-1肽之间的结合的一种肽，所说的结合与免疫炎性疾病有关。还公开了含有所说肽的药物组合物以及利用该结合抑制肽治疗免疫炎性状态的方法。

Description

CS-1模拟肽，利用该肽的组合物和方法
技术领域
本发明涉及炎性细胞与在其表面表达纤维蛋白连接素的CS-1部分的内皮细胞的结合，更具体的说涉及由基本长度的模拟肽化合物对这种结合的抑制作用。背景技术
免疫应答依赖于作为宿主防御基础结构之一的白细胞交换和免疫监视。通常这种免疫监视不仅允许通过淋巴组织进行正常的白细胞循环，而且允许在炎症位点进行白细胞快速的补充以及外渗到邻接组织。在这些白细胞的交换作用中，α4β1(CD49d/CD29，VLA-4)细胞粘附受体是一种活性的参加者[Hemler，Ann.Rev.Immunol.，8：365-400(1990)；Hemler et al.，Immunol.Rev.，114：45-65(1990)]。
有三个不同的研究组分别发现VLA-4整合素异型二聚体并且鉴定为淋巴细胞上的一种表面抗原[Sanchez-Madrid et al，.Eur.J.Immunol.，16：1343-1349(1986)；Clayberger et al.，J.Immunol.，138：1510-1514(1987)；Hemler et al.，J.Biol.Chem.，262：11478-11485(1987)]。在整合素族内，在下列几点VLA-4是独特的：(i)与β1亚族的相关成员相反，VLA-4主要在造血谱系细胞上面表达[Hemler，Ann.Rev.Immunol.，8：365-400(1990)]，并且其功能是参与细胞与细胞以及细胞与胞外基质(ECM)的粘附作用[Hemler，Ann.Rev.Immunol.，8：365-400(1990)]；(ii)尽管与其它的整合素α亚单位有序列同源性，但是α4亚单位与亚单位族内的两个主要结构簇不一致，因为α4失去了一个插入的I-区，并且在靠近转膜区不进行转译后的切割[Hemler，Ann.Rev.Immunol.，8：365-400(1990)；Hynes，Cell，69：11-25(1992)]，和(iii)α4含有一个类似胰蛋白酶切割位点，导致至少两个不同的结构变异体α4-150和α4-80/70在与细胞类型相特异的表面表达[Pulido et al.，FEBS Lett.，294：121-124(1991)；Teixido et al.，J.Biol.Chem.，267：1786-1791(1992)；Rubio et al.，Eur.J.Immunol.，2：1099-1102(1992)]。
VLA-4整合素可能是在表达CD34的造血干细胞上面存在的最早的粘附受体之一[Teixido et al.，J.Clin.Invest.，90：358-367(1992)]。但是VLA-4仅在成熟的T和B淋巴细胞，天然的杀伤细胞(NK)，单核细胞，嗜碱性细胞和嗜酸性粒细胞上表达，但不在红细胞，血小板和中性粒细胞上表达[Hemler，Ann.Rev.Immunol.，8：365-400(1990)；Gismondi et al.，J.Immunol.，146：384-392(1991)；Walsh et al.，J.Immunol.，146：3419-3423(1991)；Bochner et al.，J.Exp，Med.，173：1553-1556(1992)；Dobrina et al.，J.clin.Invest..，88：20-26(1991)；Weller et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：7430-7433(1991)]。
至今，由VLA-4整合素和称为细胞因子诱导性液泡细胞粘附分子-1(VCAM-1)[Elices et al.，Cell adhesion molecule-1(VCAM-1)Exp.Med.，171：1369-1374(1990)；Rice et al.，J.Clin.Invest.，85：2019-2022(1990)；Carlos et al.，Blood，76：965-970(1990)]以及一组普遍存在的ECM蛋白纤维蛋白连接素[Wayner et al.，J.Cell Biol.，109：1321-1330(1989)；Guan et al.，Cell，60：53-61(1990)；Ferreira et al.，J.Exp.Med.，171：351-356(1990)Elices et al.，Cell，60：577-584(1990)]的两种独立相对的受体结构之一之间的直接分子作用可以解释由VLA-4介导的最大的粘附作用。
VCAM-1是免疫球蛋白(Ig)基因总科的一个成员[Osborn et al.，Cell，59：1203-1211(1989)；Rice et al.，Science，246：1303-1306(1989)]，它主要在液泡内皮上表达，以应答原炎性细胞因子如IL-1，TNFα，和IL-4[Osbornet al.，Cell，59：1203-1211(1989)；Rice et al.Science，246：1303-1306(1989)；Thornhill et al.，J.Immunol.，145：865-872(1990)；Masinovsky et al.，J.Immunol.，145：2886-2895(1990)；Thornhill et al.，J.Immunol.，146：592-598(1991)；Schleimer et al.，J.Immunol.，148：1086-1092(1992)；Birdsall et  al.，J.Immunol.，148：2717-2723(1992)；Swerlick et al.，J.Immunol.，149：798-705(1992)；Brescoe et al.，J.Immunol.，149：2954-2960(1992)]。已将VCAM-1上的VLA-4的结合位点定位至6-Ig类区VCAM-1异型的最远N-末端(开头)Ig类区[Taichman et al.，Cell Requl.，2：347-355(1991)；Vonderheide et al.，J.Exp.Med.，175：1433-1442(1992)；Osborn et al.，J.Exp.Med.，176：99-107(1992)]，和7-Ig类区VCAM-1异型的第一和第四N-末端Ig类区[Vonderheide et al.，J.Exp.Med.，175：1433-1442(1992)；Osborn etal.，J.Exp.Med.，176：99-107(1992)]。在由VLA-4整合素识别的VCAM-1中的两个独立的Ig类区内的具体的氨基酸序列仍然有待定义。
相反，已经鉴别了纤维蛋白连接素(FN)内的VLA-4的高亲合力的肽识别序列[Wayner et al.，J.Cell.Biol.，109：1321-1330(1989)；Ferreira et al.，J.Exp.Med.，171：351-356(1990)；Guan et al.，Cell，60：53-61(1990)；Mouldet al.，J.Biol.Chem.，265：4020-4024(1990)；Garcia-Pardo et al.，J.Immunol.，144：3361-3366(1990)；Komoriya et al.，J.Biol.Chem.，266：15075-15079(1991)]。该序列包括25氨基酸残基的长度，称为CS-1[Humphries et al.，J.Cell Biol.，103：2637-2647(1986)；Humphries et al.，J.Biol.Chem.，262：6886-6892(1987)]。
该FN基因含有三个隔开的外显子称为EIIIA，EIIIB和V或IIICS，它们适用于另一种拼接方法[Hynes，″Fibronectin″，Springer-Verlag，New York(1990)]。在IIICS区域中存在的其它的受体和供体拼接信号可以使由多个IIICS多肽变体产生的FN的差异增大，例如，五个人FN[Vibe-Pedersen et al.，FEBS Lett.，207：287-291(1987)；Hershberger et al.，Mol.Cell.Biol.，10：662-671(1990)]。因此，仅有这些分子变异体的一个子集合表达由VLA-4识别的25个氨基酸的CS-1序列[Wayner et al.，J.Cell.Biol.，109：1321-1330(1989)；Guan et al.，Cell，60：53-61(1990)]。
已经鉴别出特定的VLA-4识别的CS-1的最小基本序列为三肽Leu-Asp-Val(LDV)[Komoriya et al.，J.Biol.Chem.，266：15075-15079(1991)；Wayner et al.，J.Cell.Biol.，116：489-497(1992)；Wayner WO 91/03252 1991年3月21日公开；Wayner WO93/12809 1993年7月8日公开和Humphries WO 92/13887，1992年8月20日公开]，尽管VLA-4与LDV的结合亲合力比与天然CS-1 25聚体的亲合力至少低2个数量级。Nowlin et al.，J.Biol.Chem.，268(1)：20352-20359(1993)最近描述了胱氨酸连接的环五肽可以通过Arg-Gly-Asp和纤维蛋白连接素的CS-1区抑制结合。
VLA-4与β1整合素亚族的其它成员共有促进微生物病原体结合穿透到哺乳动物细胞中的能力。因此，已经描述了β1整合素与细菌蛋白质入侵素[Isberget al.，Cell，60：861-871(1990)；Ennis et al.，J.Exp.Med.，177：207-212(1993)]以及与原生动物Trypanosoma cruzi[Fernandez et al.，Eur.J.Immunol.，23：552-557(1993)的特异性作用。
大量的体外研究表明，VLA-4与它的两个已知配体，VCAM-1和CS-1 FN的相互作用显著的生物学意义。例如已经证明与VCAM-1结合的VLA-4由下列细胞粘附到细胞因子刺激的液泡内皮，这些细胞有淋巴细胞[Elices et al.，Cell，60：577-584(1990)；Rice et al.，J.Exp.Med.，171：1369-1374(1990)；Schwartz etal.，J.Clin.Invest.，85：2019-2022(1990)；Carlos et al.，Blood，76：965-970(1990)；Shimizu et al.，J.Cell Biol.，113：1203-1212(1991)]，单核细胞[Carlos et al.，Blood，77：2266-2271(1991)；Jonjic et al.，J.Immunol.，148：2080-2083(1992)，天然杀伤细胞(NK)[Allavena et al.，J.Exp.Med.，173.：439-448(1991)]，和嗜酸性粒细胞[Walsh et al.，J.Immunol.，146：3419-3423(1991)；Bochner et al.，J.Exp.Med.，173：1553-1556(1992)；Dobrina etal.，J.Clin.Invest.，88：20-26(1991)；Weller et al.，Proc.Natl.Acad，Sci.USA，88：7430-7433(1991)]。由于这种作用介导白细胞-内皮的吸附，因而认为VLA-4/VCAM-1的相互作用是炎症产生的关键。
换过来说，已有大量的文献记载在红细胞生成作用中存在VLA-4/CS-1的相互作用，在该红细胞生成作用中造血祖先表达的VLA-4[Hemler et al.，Immunol.Rev.，114：45-65(1990)；Williams et al.，Nature，352：438-441(1991)；Roldanet al.，J.Exp.Med.，175：1739-1747(1992)；Sawada et al.，J.Immunol.，149：3517-3524(1992)；Wadsworth et al.，J.Immunol.，150：847-857(1993)]和其ECM微环境的吸附作用对前体的成熟和分化起着关键的作用。因此，已经证明CS-1肽可以抑制(i)鼠造血干细胞与骨髓基质衍生的ECM的结合[Williams et al.，Nature，352：438-441(1991)]，(ii)由骨髓衍生的B细胞祖先分泌免疫球蛋白[Roldan et al.，J.Exp.Med.，175：1739-1747(1992)，](iii)鸡B细胞的粘液囊和后粘液囊的发育[Palojoki et al.，Eur.J.Immunol.，23：721-726(1993)]和(iv)由胸腺基质的细胞单层诱导的胸腺细胞的吸附和分化[Utsumi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：5685-5689(1991)；Sawada et al.，J.Immunol.，149：3517-3524(1991)]VLA-4/CS-1也与胚胎发育有关，因为已经证明CS-1肽干扰鸟的中央嵴细胞的迁移[Dufour et al.，EMBO J.，7：2661-2671(1988)]。
除了VCAM-1以外，还证明FN和CS-1与类风湿性关节炎(RA)的病因有关[Laffon et al.，J.Clin.Invest.，88：546-552(1992)]。已经确立了FN的CS-1拼接变异体在介导炎性细胞例如嗜酸性粒细胞沿表达VLA-4的白细胞的内皮细胞单层迁移的作用[Kuijpers et al.，J.Exp.Med.，178：279-284(1993)]。
在各种动物模型中利用抗-VLA-4抗体进行的体内研究有力地证明了由大量的研究工作暗示的VLA-4在白细胞的交换和炎症中起作用。实质上，皮肤、脑、肾、肺和内脏是各种各样的VLA-4依赖性炎性反应的靶，这种反应大多数是由单核白细胞和嗜酸性粒细胞的补充引起的。
更具体地说，这些体内研究如下：在小鼠和大鼠中进行的接触超敏(CH)和延迟型超敏(DTH)[Ferguson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：8072-8076(1991)；Issekutz，Cell Immunol.，138：300-312(1991)；Issekutz，J.Immunol.，147：4178-4184(1991)；Elices et al.，Clin.Exp.Rheumatol.，11：S77-80(1993)；Chisholm，et al，Eur.J.Immunol.，23：682-688(1993)]；小鼠和大鼠中的实验性自发免疫脑脊髓炎(EAE)[Yednock et al.，Nature，356：63-66(1992)；Baron et al.，J.Exp.Med.，177：57-68(1993)]；大鼠的肾毒性肾炎[Mulligan et al.，J.Clin.Invest.，91：577-587(1993)]；豚鼠的被动皮肤过敏[Weg et al.，J.Exp.Med.，177：561-566(1993)]；大鼠中免疫复合物诱导的肺损伤[Mulligan et al.，J.Immunol.，150：2401-2406(1993)；Mulligan et al.，J.Immunol.，150：2407-2417(1993)]；猴的自发性结肠炎[Poldolsky et al.，J.Clin.Invest.，92：372-380(1993)]和羊的哮喘[Lobb，WO 92/13798 1993年7月22公开]。
因此，从体内研究得到的初步结果是VLA-4引起仿效人的慢性状态的炎性应答。在鼠的接触超敏的体内模型中，CS-1肽部分地抑制T淋巴细胞补充到皮肤的炎性位点[Ferguson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：8072-8076(1991)]，因为从FN的细胞吸附区得到的Arg-Gly-Asp肽也在该动物模型中具有抑制作用，作者总结出由白细胞整合素与ECM蛋白例如FN的相互作用可以促进免疫T细胞迁移到组织中的抗原激发位点[Ferguson et al.，Proc.Natl.，Acad.Sci.USA，88：8072-8076(1991)]。
在最近的研究中Elices及其同事们[Elices et al.，Clin.Exp.Rheumatol.，11：S77-80(1993)]不能够重复产生天然的CS-1肽对接触超敏性的抑制作用。相反，他们发现通过蛋白质的降解CS-1肽快速地从血液循环中被清除。
已经确立了VLA-4和CS-1肽在各种慢性和急性免疫炎症中的作用，因此，找到这样的化合物是至关重要的，即能够抑制VLA-4-淋巴细胞的相互作用、并且与由重复给药而可诱导免疫应答的抗VLA-4抗体不同的、或者不同于巨大的并且制备成本高的并且快速降解的CS-1肽的化合物。下文中描述了比CS-1本身更有效力的这样的小分子。发明简述
本发明涉及模拟CS-1的抑制肽，使用该抑制肽的组合物和方法。
一种有关的肽对应于通式A的序列
  X-B-Asp-Z                  A
其中B是一种α-疏水氨基酸残基，它的侧链具有约2-5个亚甲基的长度，优选的是亮氨酸；
X是一个以酰胺键连接到Bα-胺的氮原子上的基团，所说X基团具有键合到所说酰胺键的羰基碳上的环结构，所说的键合通过一个具有0-约2个亚甲基长度的间隔基连接，包括所说间隔基和羰基碳的X的长度是约3-喹啉羰基的长度或者更小，所说的环结构是5-和6-元环或者一个融合的6，6-或者6，5-元环；和
Z选自于下列基团
(a)Xaa-NCy1，其中Xaa是Val，Ile，Leu或者芳香氨基酸残基；即具有一个含1或者2个融合的芳香环的侧链的氨基酸残基，NCy1是一个含有环的基团，该基团具有一个位于环上的氮原子，该氮原子与Xaa的α-羧基形成一个酰胺键，并且NCy1的环含有5-或6-个原子包括所说环上氮原子；和
(b)NCy2，其中所说的氮原子是环基团的胺取代基，该氮原子与所说Asp的α-羧基基团形成一酰胺键，该胺取代基与一个6-或者7-元环键合，或者与一个融合的6，6-或者6，7-员内酰胺环体系键合，其中所说携带胺取代基的环是饱和的并且在所说内酰胺的羰基的α位上含有胺取代基。
优选的所说肽对应于通式I的序列
     X-Leu-Asp-Z                I
其中X是一个以酰胺键连接到Leuα-胺的氮原子上的基团，所说X基团具有键合到所说酰胺键的羰基碳上的环结构，所说的键合通过一个具有0-约2个亚甲基长度的间隔基连接，包括所说间隔基和羰基碳的X的长度是约3-喹啉羰基的长度或者更小，所说的环结构是5-和6-元环或者一个融合的6，6-或者6，5-元环；
Z选自于下列基团
(a)Xaa-NCy1，其中Xaa是Val，Ile，Leu或者芳香氨基酸残基；即具有一个含1或者2个融合的芳香环的侧链的氨基酸残基，NCy1是一个含有环的基团，该基团具有一个位于环上的氮原子，该氮原子与Xaa的α-羧基形成一个酰胺键，并且NCy1的环含有5-或6-个原子包括所说环上氮原子；和
(b)NCy2，其中所说的氮原子是环基团的胺取代基，该氮原子与所说Asp的α-羧基基团形成一酰胺键，该胺取代基与一个6-或者7-元环键合，或者与一个融合的6，6-或者6，7-员内酰胺环体系键合，其中所说携带胺取代基的环是饱和的并且在所说内酰胺的羰基的α位上含有胺取代基。
通式I和下文中的通式II和通式III的肽是水溶性的，并且在一个体外检测试验中所说的肽抑制Jurkat细胞(ATCC TIB 152)与固相结合的SEQ ID NO：1的肽结合，所说的检测试验是在pH值为7.2-7.4的含水缓冲液中进行的，其抑制程度比由SEQ ID NO：3的肽显示的对所说结合的抑制程度高约10-3000倍。
在一个更优选的实施方案中，X基团具有通式Ar-Y-C(O)-，并且该肽对应于下面的通式II的序列；
Ar-Y-C(O)-Leu-Asp-Xaa-NCy1             II
其中Ar是吡唑基，苯基，吡啶基，或者3-喹啉基；
Y是一个间隔基，它可以不存在，或是-CH2-，-CH(NH)-，-O-或者-NH-；或者Ar-Y-C(O)-与所说Leu的氮原子一起形成一个苯二甲酰亚氨基，1，2，3，4-四氢喹唑啉-2，4-二酮-3-基或者5-phenyldantoin-3-基，和
Ar-Y-C(O)-具有约3-喹啉羰基的长度或者更短；
Xaa是一个芳香族氨基酸残基；即具有一个芳香侧链的氨基酸残基。
NCy1是一个含有胺的5-或6-元环的基团，其中所说的氮原子位于环上并且与Xaa的α-羧基形成一个如前所讨论的酰胺键。
Ar-Y-C(O)-最优选的是苯乙酰基，因此，在最优选的实施方案中，所说的肽对应于下面的通式III序列，
N-苯乙酰基-Leu-Asp-Phe-NCy3          III
其中NCy3优选的是选自于下列组的NCy1：吗啉酰氨基，硫代吗啉酰氨基，4-(噻二氧代)哌啶酰氨基，D-2-(羧酰胺)-吡咯烷酰氨基，哌啶酰氨基，和取代的哌啶氨基其取代基选自于下列组：4-羟基，4-甲氨酰和4-羧基，哌嗪酰氨基和取代的哌嗪酰氨基其取代基选自于下列组：4-N-羧甲基，4-N-羧酰氨基甲基，4-N-(5-羟基乙烯氧基乙基)，和吡咯烷酰氨基。
还涉及含有上述抑制肽的组合物。所说组合物含有分散或溶于一种药物学上可接受的稀释剂，优选为水的肽。该组合物中含有的肽的量为降低炎症的量。有时，该量也称作为抑制CS-1/VLA-4结合所需的量。在一个优选或者最优选组合物中利用了上文中讨论的优选的或最优选的肽。
还涉及用于治疗纤维蛋白连接素CS-1/VLA-4介导的炎症的方法。该方法包括给具有炎症或者为预防目的需要进行治疗的哺乳动物施用降低炎症所需量的前面所说的抑制肽。在该方法中使用更优选的或最优选的抑制肽是更优选的或最优选的。
本文中显示的所有肽的通式或者序列都是从左到右书写的，并且是从氨基末端到羧基末端的方向。下面的表中重复了本文中使用的20个天然氨基酸的衍生物和残基的缩写：
                  通用表
        缩写                 氨基酸1-字母                3-字母Y                     Tyr        酪氨酸G                     Gly        甘氨酸F                     Phe        苯丙氨酸M                     Met        甲硫氨酸A                     Ala        丙氨酸S                     Ser        丝氨酸I                     Ile        异亮氨酸L                     Leu        亮氨酸T                     Thr        苏氨酸V                     Val        缬氨酸P                     Pro        脯氨酸K                     Lys        赖氨酸H                     His        组氨酸Q                     Gln        谷氨酰胺E                     Glu        谷氨酸W                     Trp        色氨酸R                     Arg        精氨酸D                Asp          天冬氨酸N                Asn          天冬酰胺C                Cys          半胱氨酸X                Xaa          另一个残基或者几个残基之一本发明有几点益处和优点。
一个突出的益处是所说的抑制肽比CS-1本身具有更大的抑制VLA-4/CS-1结合作用的效力。
本发明的另一个益处是已经证明典型的抑制肽可以有效地降低在宿主哺乳动物中的各种典型的免疫炎症疾病。
本发明的一个优点是在实验哺乳动物宿主中以高达600毫克/kg/天的浓度给药时没有观察到毒副作用。
本发明的另一个优点是所说的抑制肽具有相对小的分子量，容易以高产率和纯度制备。
本发明的其它的益处和优点对本领域内技术人员而言，根据下面公开的内容是显而易见的。附图简述
下面的附图是公开内容的一部分：
图1示出用CS-1肽本身和具有其部分序列的较短的肽，对携带VLA-4的Jurkat细胞与固相结合的CS-1肽(SEQ ID NO：1)的结合的体外抑制情况。显示的数据为相对于所给出的“标准”(SEQ ID NO：3)的百分数。在标准物的左面显示了在肽B12(SEQ ID NO：2)的“N-末端”有缺失的肽的资料，在标准物的右面显示了在肽B12“C末端”有缺失的肽的数据。肽序列以单字母密码表示。
图2是以类似于图1所述获得的和表示的数据。在这里，进一步描述了更短的缺失肽的抑制作用。
图3是图1中讨论的结合数据的另一个图。该图利用了以log值为标尺的座标。这些数据排列在五个组中，并且以相对于所指定的标准肽(SEQ ID NO：3)的位置显示，其中D-脯氨酸以“p”表示。最右手的两组数字表明，三个不同的X组对单个指定肽的作用和三个Z组的作用，其中X是苯乙酰基(Ac)，Z则如图所示。
图4显示为图4A和图4B两组，表示所说肽在治疗兔的哮喘中的效果。图4A显示在诱导哮喘攻击之后6个小时内动力学惯量(Cdyn)的变化百分数。在空心圈显示由含有抑制肽N-苯乙酰基-Leu-Asp-Phe-吗啉酰胺的喷雾组合物治疗兔的数据，用涂黑的圈表示未治疗的兔的数据；两种圈当中包括误差线。该纵座标的单位为起始动力学惯量值的变化百分数，横座标的单位为攻击之后的小时数。
图4B显示用图4A中提供的数据进行的同样的研究得到的肺抗性(LR)变化的百分数。纵座标是原始的肺抗性值变化的百分数，横座标表示时间。
图5显示在14只鼠的耳朵检测的抑制肽N-苯乙酰基-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2对延迟型超敏性的作用的研究结果。在免疫接种之后，用一个移植泵在24小时内给有七只老鼠的组仅提供盐水溶液进行处理并且攻击。对其它免疫接种的七只老鼠的组进行同样的攻击，但是每只老鼠用含有上述抑制肽的水性药物组合物处理同样的24小时，所说的药物组合物也是采用一个移植泵供应给老鼠。纵座标的单位为在攻击位点膨胀直径的英寸数。
图6显示对实验性的自动免疫脑脊髓炎(EAE)进行治疗的两次研究中，每次治疗的六只老鼠得到的平均临床分数。涂黑的圈是利用抑制肽N-苯乙酰基-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2进行治疗的结果，涂黑的方框显示的是用实施例6无规序列肽进行治疗的结果。纵座标显示在每次研究中六只老鼠的平均分数，横座标表示EAE起始的天数。
图7显示在图4中描述的患有哮喘的羊模型中相对于基底的肺抗性SRL的变化百分数。空心圈的喷雾组合物含有N-苯乙酰基-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2，涂黑的圈表示的是无规序列的该肽(实施例6)，在合适处包括误差线。发明详述
本发明涉及一种抑制肽，含有所说肽的组合物以及使用该肽的方法。所说肽抑制纤维蛋白连接素的CS-1肽与炎性细胞VLA-4表面受体的结合，因此，本文中有时将该肽称为抑制肽。A肽
所说肽被认为是整个纤维蛋白连接素分子的模拟体，或者至少是结合到VLA-4受体上的纤维蛋白连接素的25个残基(25-聚体)CS-1部分(SEQ ID NO：1)。从下述讨论可以看出，所说肽与VLA-4受体的结合比存在于纤维蛋白连接素中的CS-1 25聚体肽与VLA-4受体的结合更紧密。
广义上说，所说的抑制肽可定义为具有下列通式A的结构：
        X-B-Asp-Z                 A
其中B是一种α-疏水氨基酸残基，它的侧链具有约2-5个亚甲基的长度；
X是一个以酰胺键连接到Bα-胺的氮原子上的基团，所说X基团具有键合到所说酰胺键的羰基碳上的环结构，所说的键合通过一个具有0-约2个亚甲基长度的间隔基连接，包括所说间隔基和羰基碳的X的长度是约3-喹啉羰基的长度或者更小，所说的环结构是5-和6-元环或者一个融合的6，6-或者6，5-元环；和
Z选自于下列基团
(a)Xaa-NCy1，其中Xaa是Val，Ile，Leu或者芳香氨基酸残基；即具有一个含1或者2个融合的芳香环的侧链的氨基酸残基，NCy1是一个含有环的基团，该基团具有一个位于环上的氮原子，该氮原子与Xaa的α-羧基形成一个酰胺键，并且NCy1的环含有5-或6-个原子包括所说环上氮原子；和
(b)NCy2，其中所说的氮原子是环基团的胺取代基，该氮原子与所说Asp的α-羧基基团形成一酰胺键，该胺取代基与一个6-或者7-元环键合，或者与一个融合的6，6-或者6，7-员内酰胺环体系键合，其中所说携带胺取代基的环是饱和的并且在所说内酰胺的羰基的α位上含有胺取代基。
通式A的肽是水溶性的并且在一个体外检测试验中所说的肽抑制Jurkat细胞(ATCC TIB 152)与固相结合的SEQ ID NO：1的肽结合，所说的检测试验是在pH值为7.2-7.4的含水缓冲液中进行的，其抑制程度与由SEQ ID NO：3的肽显示的抑制所说结合的程度相等或者高至约3000倍。
通式A的肽序列可能需要CS-1(SEQ ID NO：1)和B12(SEQ ID NO：3)纤维蛋白连接素肽提供的Asp。除了该Asp以外，由于Glu和其它残基几乎不能抑制结合，所以似乎需要Asp的大小和电荷以便于结合，在选择B残基时考虑大小和相对疏水性似乎是最重要的。对其它残基的要求将在下文中讨论。
B残基侧链的长度是约2-5个亚甲基。利用商业上可购买的原子模型或计算机程序可以很方便地从标准键长度Van der Waals半径确定所说长度。利用该侧链长度可以看到环己丙氨酸和苯丙氨酸有一个长约五个亚甲基的侧链；即一个亚甲基加上侧链中的四个环碳。一个具有甲基，硫和两个亚甲基的甲硫氨酸侧链还要更短。
典型的B残基如氨基酸选自于下列组，亮氨酸(Leu)，环己丙氨酸，正亮氨酸(Nle)，甲硫氨酸(Met)，高丝氨酸，苏氨酸(Thr)，苯丙氨酸(Phe)，缬氨酸(Val)，正缬氨酸(Nva)和异亮氨酸(Ile)。B最优选的是Leu。
优选的所说的抑制肽具有相应于下列通式I的结构
     X-Leu-Asp-Z               I
X是一个以酰胺键连接到Leu的氮原子上的基团，所说X基团具有键合到所说酰胺键的羰基碳上的环结构，所说的键合通过一个具有0-约2个亚甲基长度的间隔基连接，包括所说间隔基和羰基碳的X的长度是约3-喹啉羰基的长度或者更小，所说的环结构是5-和6-元环或者一个融合的6，6-或者6，5-元环；和
Z选自于下列基团
(a)Xaa-NCy1，其中Xaa是Val，Ile，Leu或者一个具有一个含1或者2个融合的芳香环的侧链的氨基酸残基，NCy1是一个含有环的基团，该基团具有一个位于环上的氮原子，该氮原子与Xaa的α-羧基形成一个酰胺键，并且NCy1的环含有5-或6-个原子包括所说环上氮原子；和
(b)NCy2，其中所说的氮原子是环基团的胺取代基，该氮原子与所说Asp的α-羧基基团形成一酰胺键，该胺取代基与一个6-或者7-元环键合，或者与一个融合的6，6-或者6，7-员内酰胺环体系键合，其中所说携带胺取代基的环是饱和的并且在所说内酰胺的羰基的α位上含有胺取代基。
通式I以及下文中通式II和通式III的肽是水溶性的并且在一个体外检测试验中所说的肽抑制Jurkat细胞(ATCC TIB 152)与固相结合的SEQ ID NO：1的肽结合，所说的检测试验是在pH值为7.2-7.4的含水缓冲液中进行的，其抑制程度比由SEQ ID NO：3的肽显示的抑制所说结合的程度高10至约3000倍。
检验通式I，可以看到至少存在CS-1(SEQ ID NO：1)和B12(SEQ ID NO：2)纤维蛋白连接素肽的Leu和Asp。除去这两个残基，所述抑制肽的序列/结构和CS-1或B12部分完全不同。
因此，在CS-1和天然蛋白质中有一个以肽-(酰胺-)键合到Leu残基的α-胺基团上的异亮氨酸(Ile；I)，一个含有环形结构的基团或者成分X是借助由含有环形结构的基团提供的羧基以酰胺键键合到B或者Leu残基α-氨基(分别是通式A或者I)的氮原子上。所提供的酰胺键可以作为含有羧基酰胺[-C(O)NH-]，尿烷[-O-C(O)NH-]或者脲[-NH-C(O)NH-]的间隔基团的一部分存在，该间隔基团将含有环结构的基团连接到Leu残基。
从广义上说该环结构可以是任何五或者六元环，该环是饱和的或者含有不饱和的烯键。该环结构可以含有除碳以外的一个或多个原子，例如氮，氧或硫。该环结构也可以是融合的环系统，其中两个六元环融合在一起(6，6-)或者一个六元环与一个五元环融合(6，5-)。该环状结构的环优选的是芳香环。
典型的环结构包括四氢呋喃，四氢吡喃，环戊基，环己基，苯基，吡啶基，嘧啶基，吡嗪基，吡唑基，吡咯烷基，呋喃基，哌啶基，萘基，喹啉酰基，萘烷基，喹唑啉基，咪唑基，苯硫基等等，苯基和吡啶基的环状结构是特别优选的。
一个环结构可以直接键合到酰胺键的羰基[-C(O)-]，该酰胺键键合到B或者Leu残基上。该环与羰基之间也可以由高至约2个亚甲基(-CH2-)或者一个亚乙基(-CH2-CH2-)的长度间隔开。
一个亚甲基的Van der Waals半径(约2.0)比一个氧基(-O-；约1.40)或者一个亚氨基(-NH-；约150)稍微长一些，在亚甲基，氧基和亚氨基之间的足够相似性使得含有-CH2-O-，-CH2-NH-，-NH-NH-，或者-O-NH-的间隔基团具有类似的长度并且是在亚乙基-CH2-CH2-的长度范围内。如果利用键长度(距离)则获得类似的结果。所说的间隔包括-HC(CH3)-CH2-，-CH2-CH2-，-NH-O-，-HN-NH-，-CH2-O-和-CH2-NH-，并且优选的是没有不饱和键。
利用苯环作为典型的芳香环结构，可以看到所说的X基团包括3-甲基-3-苯基丙酰基，3-苯基丙酰基，苯基羟氨基羰基，[Ph-NH-O-C(O)-]，苯酰肼羰基[Ph-NH-NH-C(O)-]，苄氧基羰基[Ph-CH2-O-C(O)-]，苯氧基乙酰基[Ph-O-CH2-C(O)-]，苄基氨基羰基[Ph-CH2-NH-C(O)-]，和苯胺乙酰基[Ph-NH-CH2-C(O)-]，其中“Ph”是一个苯基。
因此，合乎需要的是前面描述的环结构借助于一个具有长度为0个亚甲基(直接键合)，一个或两个亚甲基的间隔基键合到B-或者Leu-连接的酰胺基的羰基碳上。但是不同的，该间隔基具有约一个亚乙基或更短的长度。
键合到B或者Leu α氨基的氮原子上的苯乙酰基，苯氧羰基或者苯胺基羰基含有一个具有约1个亚甲基长度的间隔基。苯基(苄氧基)，1-或者2-萘基(1-或者2-萘羰基)，2-，3-或者4-吡啶基(2-，3-或者4-吡啶羰基)，2-或者3-苯硫基(2-或者3-噻吩基；2-或者3-噻吩羰基)和2-或者3-呋喃基(2-或者3-呋喃羰基)环结构直接键合到酰胺的羰基碳上，因此，利用具有长度为0个亚甲基的间隔基定义一个X基团。由是苄酯基[Ph-CH2-O-C(O)-]，苄氨基羰基[Ph-CH2-NH-C(O)-]，苯氧甲基羰基[Ph-O-CH2-C(O)-]等等的X基团提供长度为约2个亚甲基的间隔基。
也可以用C1-C2烷基或者羟基取代所说的5-或者6元环结构。因此，以苯基为例典型的取代的环结构包括2-，3-或者4-乙基苯基，2，6-，3，4-或者2，3-二甲基苯基，2-，3-或者4-羟基苯基，2，6-，2，-4-，3，4-和3，5-二羟基苯基，等等。
据认为X取代基的环结构在所说的抑制剂中以某种方式将抑制肽固定到VLA-4受体的结合区以便使B或者Leu和Asp基团处于合适的构型。由于具有所假定的将该肽固定到其受体中的作用，除了在前面说明的有关间隔基团长度以外，对于含有环结构的和间隔基的X的大小有某些限制。因此从键合到B或者Leu上的酰胺键的羰基含有的碳，到环的末端或者与羰基最远的取代基，间隔基加上含环结构部分的X的总长度为约3-喹啉羰基的大小或者更小。
由于3-喹啉羰基是所说的最长的含环结构的X取代基，所以3-喹啉羰基没有加到其长度上的上面讨论的取代基。
按照前面讨论的方法，可容易地确定一个给定的X取代基的长度。例如可以利用空间填充模型构造典型的含环结构的X基团，然后比较所制备的模型的相对大小。也可以利用公开的键长度和键角度制备该尺寸的2维图形。计算机作图程序也是公知的和可以获得的，可用于制备与3-喹啉酰基进行长度比较的X基团模型。
包括间隔基，环状结构，羰基的X取代基和B或者Leu的α-氨基氮一起可以形成一个芳香环取代的环亚氨基。所说的环亚氨基的例子是苯二甲酰亚氨基(优选的)，2，3-和3，4-吡啶二羧亚氨基，高苯二甲酰亚氨基和1，2，3，4-四氢喹唑啉-2，4二酮-3-基中的任一种，其中芳香环和环亚氨基融合在一起。
在另一个典型的化合物中，B或者亮氨酸氮原子是一个在5-苯海因-3-基的环内的亚氨基氮原子，所以芳香苯环是环间隔基的取代基并且与连接到亮氨酸残基上的羰基约有一个亚氨基的间隔。在B或者Leu氮原子上形成的2-苯基琥珀酰亚氨基中存在含有类似结构的亚氨基氮的X基团。
因此，可将上述讨论的X基团的含有环状亚氨基和海因的部分认作为特定的间隔基团，该基团限制了环状结构的构型的自由度。因此，例如一个苯基乙酰基的羰基、亚甲基和苯基部分每个都是游离的并可以有一个或多个构型，一个苯二甲酰亚氨基X基团仅围绕亮氨酸氮-次甲基键的轴旋转。
值得注意的是虽然X取代基必须含有可如前面所讨论的被取代的环结构，该X取代基也可包括除在环结构以外的部位的取代基。如果存在其它的取代基则X优选的是一个具有环状侧链的氨基酸残基，因此包括伯胺或仲胺。这里，X优选的为脯氨酰基，苯丙氨酰基，酪氨酰基或者苯基甘氨酰基残基，其α氨基的氮原子键合到该进一步的取代基上。
该进一步的取代基可以是一个氨基酸残基，所说残基为CS-1多肽序列的残留部分到其N末端，它具有从SEQ ID NO：1的N末端的第19位异亮氨酸开始的多肽序列。由此，限定了一个单个的残基或者18个单独的氨基酸残基的取代序列。
借助一个X的胺基团连接的另一个典型的进一步取代基是生物素。在一个特定的实施例中以酰胺键键合到ε-氨基癸酸上的生物素是以酰胺键键合到作为X基团的苯丙氨酸(Phe)的α胺上。得到的化合物含有借助一个十二原子的链连接到Phe X基团上的生物素融合的环。
还应明白具有环状侧链的X基团氨基酸残基也可以不含有取代基。还可以用C1-C6酰基，例如甲酰基，乙酰基，异丁酰基或者己酰基，将该残基的α胺的氮原子酰基化。键合到α胺基团的氮原子上的C1-C6酰基在该氮原子上形成一个酰胺键，并且与未取代的游离α胺提供的正电荷相比，在pH7.2-7.4没有给该肽提供离子电荷。
前面讨论的通式中的Z基团可以是两种类型的基团之一。在一个实施方案(A)中Z基团是以肽键键合到Asp羧基上的一个疏水氨基酸残基Xaa，并且该残基连接到含有环的NCy1基团，该NCy1具有与Xaa的α-羧基形成一个酰胺键的环上氮原子(NCy1的氮)。NCy1的环含有5-或者6-原子，包括所说的氮原子(NCy1的氮)。所说的疏水氨基酸残基是那些具有脂族侧链的氨基酸例如缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸。更优选的Xaa含有一个疏水的芳香族氨基酸残基；即Xaa是具有含一个或两个融合芳香环的芳香侧链的氨基酸。所说芳香族氨基酸的例子是天然存在(遗传编码的)的苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸，以及苯基甘氨酸，高苯丙氨酸，对-硝基苯丙氨酸，苯硫基甘氨酸(噻吩基甘氨酸)等等。
典型的NCy1基团包括吗啉基，硫代吗啉基，硫代吗啉基砜[4-(噻二氧代)哌啶基]，哌啶基，哌嗪基，吡咯烷基，吡唑基，吡唑啉基，恶唑烷基和例如它们各自相应的酰胺。一个NCy1环也可以被选自于下列基团的一个或两个取代基所取代，所说取代基为羧基，羧酰胺，C1-C4亚烷基羧基，C1-C4亚烷基羧酰胺，羟基，羟甲基，(CH2CH2O)nH，其中n是1，2或3，以及C1-C4烷基。吡咯烷2位上的羧基取代基提供脯氨酸，其D-和L-形式是本文中所说的两种类型。当是吗啉基，哌啶基，哌嗪基和4-羟基哌啶基时特别优选的是D-脯氨酰基(有时以黑体小写单字母氨基酸密码显示为“p”或D-Pro)的酰氨基衍生物(D-Pro-NH2)。
典型的C1-C4烷基包括甲基，乙基异丙基，正丁基和t-丁基。C1-C4烷基还可以与NCy1例如哌嗪的第二个氮原子形成一个季铵基。当C1-C4的烷基是甲基时，碘是阴离子并且典型的NCy1基团是4，4-N，N-二甲基哌嗪鎓基碘化物。
典型的C1-C4亚烷基羧基和C1-C4亚烷基羧酰胺基团包括亚甲基羧基(-CH2CO2H；羧甲基)和亚甲基羧酰氨基(-CH2CONH2；羧酰氨甲基)，亚乙基羧基(-CH2CH2CO2H；羧乙基)和亚乙基羧酰氨基(-CH2CH2CONH2；羧酰氨基乙基)以及亚丁基羧基(-C4H8CO2H；羧丁基)和亚丁基羧酰氨基(-C4H8CONH2；羧酰氨基丁基)。其中n是1，2或3的典型的(CH2CH2O)nH基团，包括2-羟乙基(n＝1)，5-羟基乙烯氧基-乙烯(乙烯氧基乙醇；5-羟基-3-氧杂戊基；n＝2)和8-羟基-3，5-二氧杂-癸基(n＝3)。
当NCy1包括哌嗪基时，第二个(四位的)氮原子不仅被烷基化作用而季铵化，还被酰胺化。哌嗪基-4-N-酰胺的典型的酰基部分包括C1-C7酰基例如甲酰基，乙酰基，丙酰基，异丁酰基，己酰基和苯甲酰基，而且包括氨磺酰例如苯基亚磺酰氨基，甲苯基氨磺酰(甲苯磺酰基)，甲基亚磺酰氨基(甲磺酰)和三氟甲基亚磺酰氨基(三氟甲磺酰基)。
因此，在这些Z是Xaa-NCy1的实施方案中，Xaa是一个特定的氨基酸残基，它的氨基与所指定的Asp残基的α-羧基形成一个酰胺(肽)键，并且它的羧基与NCy1的5或6元环内存在的氮原子形成酰胺键。
在Z是NCy2的另一个实施方案(B)中，所说的氮原子(NCy1的氮)是一个环基(Cy2)的胺取代基，它的取代氮原子与所说Asp残基的α-羧基形成一个酰胺键。该胺取代基键合到一个环基上面，该环基是(i)一个六或七元环或者(ii)一个融合的6，6-或者6，7-员内酰胺环系统，其中携带有胺取代基的环是饱和的(没有不饱和烯烃)并且含有在内酰胺的羧基上α位取代的胺。
将环系统连接到该肽的其余部分上的氮原子是一个环结构的取代基，而不是一个如在NCy1中的环原子。另外以氮作为取代基的环是两种类型，6-或7-元环或者6，6-或者6，7-员融合环系统，所说环之一是内酰胺。在每种情况下，在该实施例中没有Xaa氨基酸残基。
典型的所说类型的含有胺取代基的6-和7-元环NCy2基团包括苄胺，苯乙胺，2-(N-吗啉)-乙胺，N-[1-(羧酰氨基甲基)-己内酰氨-3-基]胺，N-(己内酰胺-3-基)胺和N-(戊内酰胺-3-基)胺基团，所说的胺基与Asp的α-羧基形成相应的酰胺。典型的含有氨基取代的6，6-和6，7-融合的环内酰胺的NCy2包括在表1基团的脚注7显示的N-[1-(2-N-吗啉乙基)-2-氧代-四氢喹啉-3-基]胺，N-(2-氧代-四氢喹啉-3-基)胺和6，7-融合的环的三环化合物，所说的胺与Asp的α-羧基形成相应的酰胺。
通常已经发现一旦(i)上面讨论的通式的X基团由含有芳香环的部分占据，该部分与羰基间隔基一个亚甲基的距离或者间隔基小于一个亚甲基的距离，(ii)Z是一个芳香氨基酸，和(iii)NCy1是L-或D-脯氨酰胺或者如上讨论的5或6员的含氮环，基本上说还可以存在连接到肽的任一末端不损害所说肽的抑制活性的其它取代基，只要所说的肽是水溶性的。
因此，例如具有连接到序列Leu-Asp-Phe-Pro上的一个N末端苯乙酰基的SEQID NO：5的肽进一步包括以酰胺键键合到Pro上的取代的四亚乙基二胺基团，其中，四个苯乙酰基-Leu-Asp-Phe-Pro基团是以酰胺键键合到四亚乙基二胺氮原子上，并且还具有VLA-4结合抑制作用，所说抑制作用比标准SEQ ID NO：3的10聚体肽高约210倍。
同样，PheLeuAspPhe-D-Pro-NH2肽在其N末端含有一个含铕的螯合剂，所说螯合剂键合到N末端Phe的氮原子上。该肽显示出比SEQ ID NO：3肽的结合抑制作用高约120倍。
预测SEQ ID NO：12肽，苯乙酰基-Leu-Asp-Phe-Pro-NH(CH2)5C(O)NHC18H37是一个良好的抑制剂。但是该肽不是水溶性的并且形成一个混浊的悬液而不是一个溶液。该肽显示的结合抑制作用类似于由标准的SEQ ID NO：3 10聚体肽的作用。
虽然一旦掌握了如下文中讨论的足够的资料，熟练的技术人员通常可以对所说肽的预期的效力进行准确的预测，但是与结合现象有关的结构-功能关系如本文中讨论的还没有完全弄明白。的确，基本上所有由前面讨论的通式定义的化合物均抑制CS-1肽和VLA-4受体的结合。而且，由于直接键合到通式1的Leu和Asp上的取代基变化很大并且影响对VLA-4的结合抑制作用，因此，在标准的体外检测中与已知的标准10聚体肽抑制剂相比，优选的所说抑制肽不仅由其结构限制，而且由其作为抑制剂的效力所限制，从而所说的抑制剂仅包括那些比已知的10聚体抑制剂的结合抑制作用高一个数量级或多个数量级的抑制肽。
因此，所说的抑制肽在PH7.2-7.4的含水缓冲液中可以抑制含有VLA-4受体的炎性细胞[Jurkat细胞(美国典型培养物收集中心，Rockville，MD 20852，ATCCTIB 152)]与固相结合CS-1肽(SEQ ID NO：1)的结合，其抑制程度比标准的SEQ ID NO：3的10聚体肽[GPEILDVPST，单字母表示]的抑制作用高约10倍到1000倍并且更优选的是3000倍。更优选的是所述结合被抑制约50-3000倍，最优选的是约100-3000倍。
按照肽的浓度检测结合抑制率，即该肽抑制标准数目的Jurkat细胞与标准量的结合到微滴板孔表面的CS-1肽的结合作用的一半所需的浓度。该浓度通常以IC50值表示，较小的数目表示抑制50％的结合需要较低的浓度，因此，具有更强的效力。下文中进一步提供了具体的检测方法。
简而言之，通式A或I的肽抑制纤维蛋白连接素的CS-1肽区与VLA-4受体的结合。但是，优选的是具有至少比SEQ ID NO：3的肽高10倍的抑制作用的抑制剂。
更优选的是下面通式II的肽
Ar-Y-C(O)-Leu-Asp-Xaa-NCy1              II
其中Ar是吡唑基，苯基，吡啶基(2-，3-或4-)，或者3-喹啉基；
Y是一个间隔基，它可以不存在，或是-CH2-，-CH(NH)-，-O-或者-NH-；
或者Ar-Y-C(O)-与所说Leu的氮原子形成一个苯二甲酰亚氨基，1，2，3，4-四氢喹唑啉-2，4-二酮-3-基或者5-苯海因-3-基基团，和
Ar-Y-C(O)-具有约3-喹啉羰基的长度或者更短；
Xaa是一个芳香族氨基酸残基；即具有芳香侧链的氨基酸残基，例如苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，高苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸，噻吩基甘氨酸和苯基甘氨酸，和
NCy1是一个含有胺的5-或6元环，其中所说的氮原子位于环上并且与Xaa的α-羧基形成一个酰胺键，如前面讨论的。
因此，进一步对通式II的水溶性化合物检查显示，其结合抑制作用比SEQID NO：3肽的抑制作用至少高10倍，因此，不需要体外研究以完全鉴定，尽管该检测可用于所有优选的抑制肽。
结合上述考虑，Ar-Y-C(O)，通式I的更优选的X基团是优选为苯甲酰基，苯乙酰基，4-吡啶羰基(异烟酰基)，3-吡啶羰基(烟酰基)，3-吡啶乙酰基，苯胺基羰基，3-喹啉酰基，吡唑羰基，色氨酰基和3，4-二羟基苯甲酰基，最优选的是苯乙酰基(苄羰基)，或者Ar-Y-C(O)与亮氨酸的氮原子一起形成苯二甲酰亚氨基。Xaa优选的是Phe，Tyr或者Trp，最优选的是Phe。NCy1优选的是吗啉酰胺；哌啶酰胺；或者取代的哌啶酰胺，其中的取代基选自于下列组，羟基，羧基，羧酰氨基；哌嗪基或者4-取代的哌嗪基，其中4-取代选自于下列组：C1-C4烷基，C1-C4亚烷基羧基，C1-C4亚烷基羧酰胺，(CH2CH2O)nH其中n是1，2或3；硫代吗啉基；L或D-脯氨酰氨基；吡咯烷基；3，4-二羟基吡咯烷基；2-(羟甲基)吡咯烷基和4-(噻二氧代)哌啶基，最优选的是吗啉酰胺，D-脯氨酰胺，哌啶基，上面所说取代的哌啶基，哌嗪基，上面所说取代的哌嗪基和吡咯烷基。
最优选的肽对应于下面通式III的肽的序列，
苯乙酰基-Leu-Asp-Phe-NCy3          III
其中NCy3是最优选的NCy1基团并且选自于下列组：吗啉酰氨基，硫代吗啉酰氨基，4-(噻二氧代)哌啶酰氨基，D-2-(羧酰氨基)吡咯烷酰氨基，哌嗪酰氨基，取代的哌嗪酰氨基其取代基选自于下列组：4-N-羧甲基，4-N羧酰氨基甲基，4-N-(5-羟基乙烯氧基乙烯)和4-N-p-甲苯氨磺酰，吡咯烷酰氨基，哌啶酰氨基和取代的哌啶酰氨基其中取代基选自于下面组：4-羟基，4-氨甲酰，4-羧基。
下面的表1中列出了典型的抑制肽以及相对于SEQ ID NO：3标准肽而言，这些肽的结合抑制作用效力。
                 表1
对结合VLA-4的CS-1的相对肽抑制作用ID NO：通式1      X                 Z2                    相对效力6
   XLDFZ     苯乙酰基        4-N(羧甲基)哌嗪酰胺8         2579
   XLDFZ     苯乙酰基        4-(噻二氧代)哌啶酰胺9        1060
   XLDFZ     苯乙酰基        4-(氨基甲酰)哌啶酰胺10       933
   XLDFZ     苯乙酰基        吗啉酰胺                      844
   XLDFZ     苯乙酰基        4-(羧基)哌啶酰胺              828
   XLDFp     吡啶-4-羰基     酰胺                          656
   XLDYp     苯乙酰基        酰胺                          640
   XLDFZ     苯乙酰基        4-羟基哌啶酰胺                603
   XLDFZ     苯乙酰基        哌嗪酰胺                      506
   XLDFZ     苯乙酰基        4-N-(5-羟乙基氧基亚乙基)-
                             哌嗪酰胺11                   505
   XLDFZ     苯乙酰基        硫代吗啉酰胺                  493
   XLDFp     吡啶-3-乙酰基   酰胺                          469
   XLDFP     苯乙酰基        酰胺                          405
   XLDFP     苯乙酰基        4-N-(甲苯氨磺酰)-哌啶酰胺     360
   XLDFZ     苯乙酰基        4-N-(羧酰氨基甲基)哌嗪酰胺    319
   XLDFZ     苯乙酰基        吗啉酰胺                      313
   XLDFZ     苯乙酰基        4，4-N，N-(二甲基)-哌嗪鎓
                             碘化物12                     313  XLDFp      苯乙酰基            酰胺                           313XLDFZ      苯乙酰基            吗啉酰胺                       291XLDFZ      苯乙酰基            吡咯烷酰胺                     250XLDFZ      苯乙酰基            哌啶酰胺                       231XLDFp      苯胺基羰基          酰胺                           227XJDFp      苯乙酰基            酰胺   J＝环己基-Ala5         217XLDFPZ      苯乙酰基            肽取代的四亚乙基-戊胺3        209XLDFp      吡啶-3-羰基         酰胺                           201XLDFZ      苯乙酰基            3，4-二羟基吡咯烷酰胺          194XLDFZ      苯乙酰基            2-(羟甲基)脯氨酰胺             184XLDWp      苯乙酰基            酰胺                           184BZFLDFp      B＝生物素酰胺       Z＝ε-酰氨基己酰   酰胺        150XLDVp      苯二甲酰亚氨基      酰胺                           140ZXFLDFp      ε-酰氨基己酰       Z＝铕标记4        酰胺        118XLDVp      苯乙酰基            酰胺                           106XLDZ       苯乙酰基            N-[1-(羧酰氨基甲基)己内酰胺
                             -3-基]酰胺                      97XLDJp      苯乙酰基            酰胺            J＝高-Phe5     94XLDFZ      3，4-二羟基         哌啶酰胺                        81
         苯乙酰基XLDFp      苯甲酰基            酰胺                            75XLDVp      吡啶-3-羰基         酰胺                            71XLDJp      苯乙酰基            酰胺           J＝苯基-Gly5    61XLDFp      3-喹啉羰基          酰胺                            56XLDFp      1，2，3，4-四氢喹   酰胺                            56
         唑啉-2，4-二酮-
         3-基XLDZ       苯乙酰基            6，7-融合的环内酰胺7           50XKDFp      苯乙酰基            酰胺              J＝Nle5      49PLDFp      游离胺              酰胺                            47XLDZ       苯乙酰基            N-[(1-羧酰氨基甲基)-2-氧代-     45
                             四氢喹啉-3-基]酰胺XFLDLZ     GlcNAc-O-           哌啶酰胺                        41
         (CH2)5-C(O)XLDJp      苯乙酰基            酰胺          J＝对硝基-Phe5   40XLDVP      苯甲酰基            酰胺                            37FLDFp        乙酰基             酰胺                             35XLDFp        苄氧羰基           酰胺                             34XLDFZ        (5-苯基)海因基     哌啶酰胺                         34XLDFp        吡唑羰基           酰胺                             35FLDFp        乙酰基             酰胺                             33XLDZ         苯乙酰基           N-(2-氧代-四氢喹啉-3-基)酰胺     31XLDZ         苯乙酰基           N-(己内酰胺-3-基)-酰胺           27XLDFZ        苯乙酰基           丙醇酰胺                         25XLDYZ        4-吡啶羰基         哌啶酰胺                         24XLDZ         苯乙酰基           N-[1-(2-N-吗啉乙基)2-氧代-       20
                            四氢喹啉-3-基]酰胺XLDVp        特戊酰             酰胺                             20XLDVp        苯甲酰基           酰胺                             20XLDZ         苯乙酰基           苄基酰胺                         19XLDZ         苯乙酰基           苯乙酰胺                         19XJDFp        苯甲酰基           酰胺          J＝环己基-Ala5    17XLDZ         苯乙酰基           N-D-(己内酰胺-3-基)酰胺          17XLDSp        苯乙酰基           酰胺                             17XLDYZ        苯乙酰基           t-丁酯                           15XLDVp        苯丙酰基           酰胺                             14XLDZ         苯乙酰基           N-(2-N-吗啉)乙酰胺               13XJDVp        苯甲酰基           酰胺          J＝环己基-Ala5    11FLDVp        游离胺             酰胺                             10XLDFp        2-哌嗪羰基         酰胺                              9XLDGZ        苯乙酰基           吗啉酰胺                          9XLDVp        2，3-二甲基        酰胺                              9
         苯甲酰基XLDVp        3，4-二甲基        酰胺                              8
         苯甲酰基XLDVp        吡啶-2-羰基        酰胺                              8XLDZ         苯乙酰基           Z＝N-[1(N-环己基)丁内酰胺         7
                            -3-基]酰胺XLDZ         苯乙酰基           N-(1-异丁基-2-氧代-四氢喹啉       6
                            -3-基)酰胺XLDFZ        苄基               哌啶酰胺                          6fLDVp        游离胺             酰胺                              5XLDVp          环己羰基         酰胺                             5XLDVp          2，6-二甲基      酰胺                             5
           苯甲酰基XLDFp          2-喹啉羰基       酰胺                             4XLDVp          3-甲基戊酰基     酰胺                             3XLDZ           苯乙酰基         N-(四氢异喹啉-3-基)酰胺          3pLDFp          游离胺           酰胺                             3XLDFp          8-喹啉磺酰基     酰胺                             3XLDFZ          苯乙酰基         正丁酰胺                         3XLDVp          四甲基戊酰基     酰胺                             3XLDY           苯乙酰基         正丁酯                           3XLDZ           苯乙酰基         苄基羟酰胺                       3XLDFp          对-溴苯乙酰基    酰胺                             3ILDFp          游离胺           酰胺                             2XLDFPZ         苯乙酰基         癸酰胺                           2ILDVPILDVp     游离胺           酰胺                             2XJDFp          苄酰胺           酰胺         J＝二羧基-Leu5     2XLDVp          环己乙酰基       酰胺                             2XLDZ           苯乙酰基         N′-t-Boc-酰肼                   2ILDFP          游离胺           酰胺                             2XLDVp          1-萘酰           酰胺                             1XLDVp          环己丙基         酰胺                             1XLDZ           苯乙酰基         N′-苄基-N′-环戊羰基酰肼        1FJDFp          游离胺           酰胺      环己基-Ala5           1iLDVp          游离胺           酰胺                             1ILDVp          游离胺           酰胺                             1IJDFp          游离胺           酰胺      环己基-Ala5           1XLDVp          肉桂酰           酰胺                             1GPEILDVPST     游离胺           游离酸                           1XLDFPZ         苯乙酰基         HN(CH2)5C(O)NHC10H17        1XLDVp          金刚烷羰基       酰胺                             1XLDVp          2-萘酰           酰胺                             1ILDVP          游离胺           酰胺                             1ILDVP          游离胺           游离酸                           1XLDF           苯乙酰基         酰胺                           ＜1XLDFZ          苯乙酰基         N-(4-辛酰氧基)哌啶酰胺         ＜1
XLDFZ     苯乙酰基           N-(4-硬脂酰氧基)哌啶酰胺        ＜1
XLDZ      苯乙酰基           酰肼                            ＜1
SFDFS     乙酰基             酰胺                            ＜1
IJDVp     游离胺             酰胺       J＝环己基-Ala5      ＜1
XLDFp     4-溴苯磺酰基       酰胺                            ＜1
LDFZ      游离胺             哌啶酰胺                          0
JDFZ      J＝异丁氧基羰基    哌啶酰胺                          0
XLDZ      苯乙酰基           N′，N′-二苄基酰肼               0
XLDZ      苯乙酰基           N-(1，3-二苯基丙-2-基酰胺         0
XLDZ      苯乙酰基           二苄基酰胺                        0
XLDFp     苯磺酰基           酰胺                              0
LDV       乙酰基             酰胺                              0
LDF       乙酰基             酰胺                              0
LDF       游离胺             酰胺                              0
LDV       游离胺             酰胺                              0
fLDVp     游离胺             游离酸                            0
XLDFp     苯乙酰基           酰胺         无规                 0注：1用相同的单字母密码的小写字母表示L-氨基酸残基的D-异构体，因此，
 p＝D-脯氨酸；f＝D-苯丙氨酸；i＝D-异亮氨酸。
 N-末端α-胺如所示被取代，或者指示为“游离胺”
2Z的C-末端羧基的状态合适地表示为“酰胺”(-NH2)或“游离酸”。
3Z是C-末端Pro羧基与含有以酰胺键与之键合的4个N-苯乙酰基-
 LDFP肽的四亚乙基戊胺之间形成的酰胺。
4以酰胺键与Z键合的二亚乙基三胺五乙酸铕(II)。
5“高-Phe”＝高苯丙氨酸；“苯基-Gly”＝苯基甘氨酸；
 “对硝基-Phe”＝对硝基苯丙氨酸；“β-羧基-Asp”＝
 β-羧基精氨酸；“环己基-Ala”＝环己基丙氨酸；
 “二羧基-Leu”＝二羧基亮氨酸；“Nle”＝正亮氨酸。
6相对活性约为SEQ ID NO：3的肽显示的活性的1/10或更小
 定义为相对效力为0。
Figure A9419496900331
表1数据可用于预测一种被改变的或者另一种抑制肽的结合抑制效力。因此，可以检验表1的结构并且利用所观察到的相对抑制效力计算单个残基或者末端基团的相对作用。利用这种计算，可以预测另一个所说肽的效力高约5-10倍。
例如，将由N-苯乙酰基-Leu-Asp-Val-D-Pro-NH2显示的抑制作用和N-苯乙酰基-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2显示的抑制作用进行比较，可以看出用Phe替代Val使得抑制作用加强3倍，其它类似的吡啶-3-羰基衍生物之间的不同同样为3倍。
因此可以预测刚才上面所说的肽的N-苯甲酰基衍生物，同样地其效力约有3倍的不同。表1的数据指明所观察的不同点是约3.8倍，从而证明了预测的结果。
进一步利用这些简单化的程序，从肽N-苯乙酰基-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2和N-苯乙酰基-Leu-Asp-Phe-哌啶酰胺可以计算出D-Pro-NH2提供的活性比哌啶酰胺高约1.3倍。将后一肽的活性与具有吗啉酰胺基团的肽的活性进行比较，可以计算出吗啉酰胺活性比哌啶酰胺基团的活性加强了约3.6倍。将肽N-苯乙酰基-Leu-Asp-Tyr-吗啉酰胺和N-苯乙酰基-Leu-Asp-Tyr-D-Pro-NH2进行比较，发现吗啉酰胺的活性比D-Pro-NH2强约2.05倍。利用这两种计算，可以计算出吗啉酰胺提供的活性比哌啶酰胺活性强约7.4倍(2.05×3.6倍)。预测的加强作用是用开头的两个肽(7.4/1.3)得到的作用的5.7倍，但是在前面预测的范围内。
表1的数据还说明与本领域内其它的肽相比，本文所说的抑制肽显示的结合抑制作用有未预料到的加强。例如，在WO93/12809报道的作为与VLA-4受体结合所需的基本肽的Leu-Asp-Val(LDV)肽显示，与SEQ ID NO：3的肽相比，作为N-乙酰基C-酰胺衍生物时其相对抑制结合活性为约1，作为N-游离胺C-酰胺时为0。用Leu-Asp-Phe(LDF)观察到类似的结果(在那篇公开的申请中未公开该肽，但是，它是本文中的重要的核心肽)。相反，如果将本文定义的X和Z基团加到任一个肽的末端，观察到抑制作用加强了约1-3个数量极。
图1，2和3显示的数据还证明相对于本领域内的其它肽而言，所说的肽所显示的未预料到的结合抑制作用。利用单字母密码显示肽序列。
例如，图1说明利用CS-1(SEQ ID NO：1)肽，CS-1肽B12区(CS-1 B12；SEQID NO：2)，本文中上述和其它地方以及本领域内所说的标准的10聚体肽肽(SEQ ID NO：3)，和B12肽的几个缺失类似物(每一个都含有Leu-Asp序列)完成的体外相对抑制作用的研究结果。在标准的10-聚体的左边显示N末端缺失类似物，该10聚体右边显示C末端缺失类似物。正如所看到的，CS-1肽比B12，10聚体或者该10聚体的九聚体缺失类似物的抑制效力高约3倍。后三种肽都比其它的B12相关肽的效力高。
图2的类似方法获得的数据说明了利用标准的10聚体肽的缺失类似物获得的结合抑制效果。在标准的10聚体的左边显示N和C末端的缺失，用以分离出C末端的Leu-Asp-Val序列，而标准的10聚体右边显示的缺失用以分离出Asp-Val-Pro序列。这些肽和图1的肽都具有游离的N末端氨基和C末端羧基。
图3的数据是用类似的方法获得的，但是以log值表示，以便容纳所有的数据。图3显示的数据分成从左至右五个组。
第一组显示CS-1肽和10聚体标准物的数据，接着的三条显示具有天然CS-1肽的Leu-Asp-Vlal序列的5聚体C酰胺的数据，利用D-脯氨酸代替天然L-脯氨酸得到的加强作用，然后是利用苯丙氨酸和D-脯氨酸代替缬氨酸和D-脯氨酸得到的加强效果。接着的两条显示当含有环结构的X基团(这里苯丙氨酸作为游离胺)用于替代天然序列的异亮氨酸时获得的三个前面所说的肽获得的进一步的加强作用。第四组说明利用两个相邻序列[XLDFp-NH2]的较好的肽序列，与苯丙氨酸基团相比，通式I的三个X基团的效果。在最后的三种肽中以苯乙酰基(Ac)作为X基团，其中利用三个环状胺(NCy1)使通式I的D-脯氨酸Z基团发生改变。正如所看到的，利用吗啉酰胺基团作为Z基团，并且利用苯乙酰基作为X基团以及利用苯丙氨酸作为通式I的Xaa，在这些研究中能够提供最大的效力。
因此，表3的数据显示与标准的10聚体和本领域的肽相比，本发明所说的肽抑制效果的变化约为三个数量级，本发明所说的肽的效果比这些肽的标准物的效力增加约10倍，增加约50-100倍，增加约1000倍。
除了比CS-1或者标准的10聚体肽具有更强的效力以外，本发明所说的抑制肽，尤其是具有非天然存在的末端基团例如N-苯乙酰基和C-吗啉酰胺或者D-Pro-NH2的肽，在血清中比CS-1肽相对的更稳定。因此，在7.2-7.4的PBS(也含有百分之十的鼠或人血清)中经过24小时之后抑制肽N-苯乙酰基Leu-Asp-Phe-吗啉酰胺和N-苯乙酰基-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2的效力没有损失。相反，在同样的条件下，在不到一小时的时间内，CS-1肽失去了其效力。B合成
本发明所说的抑制剂是肽或肽衍生物，并且同样可以利用公知的合成方法很方便的合成。下文中提供了具体的合成实施例。
对于具有C末端氨基酸酰胺或者游离酸残基的材料，可以利用固相合成法。因此，将N末端受保护的C末端残基连接到具有二苯甲基胺取代基的固相载体上。尽管t-Boc，CBZ或者其它的封阻基团也可与其它的固相载体一起使用，但是在这些合成中使用了Fmoc胺封阻基团。在用哌啶除去Fmoc基团的封阻后，结合另一个残基。在结合之后进一步去封阻，结合，去封阻等等步骤直到制备出一个固相连接的所需序列的肽。对于每种肽都合适的是，在最后的N-去封阻步骤后加上一个N末端X基团或者有时预结合到N-末端残基。通过与三氟乙酸(TFA)发生反应，从固相载体上除去所需的肽和任何伴随的功能性保护基团。当利用二苯甲基胺固相载体时该操作步骤得到C-酰胺作为末端的肽。
也可以利用t-Boc N-保护基团或者另一个固相载体或者苄基氨基-取代的固相载体(其中对羟基甲基苯基羧基(PAM)首先与载体上的胺发生反应形成一个羧酰胺)制备所需的肽。然后用羟基形成一个连接到第一个肽上的酯，此后利用标准的t-Boc合成技术。合成完的去保护的固相连接的肽与氨水发生反应以提供前面讨论的C末端酰胺肽，而其与另一种胺例如吗啉或者哌啶或者其它的NCy1或者NCy2胺发生反应提供了下述一种肽，该肽的C末端残基是以酰胺键键合到NCy1或NCy2基团。去保护的PAM连接的肽与氢氧化物发生反应提供了相应的C末端羧基。
在其它的实施例中，利用液相肽合成法。例如在一种溶液中利用碳化二亚胺将吗啉或者其它的NCy1或者NCy2基团偶合到本发明所说的C末端t-Boc保护的残基上。用酸除去t-Boc保护基，进一步加上t-Boc保护残基，随后去封阻并进一步叠加。在最后的t-Boc去除步骤完成之后加上N末端X基团例如苯乙酸，完成合成，所不同的是对Asp残基去保护。利用一个苄基酯保护基团进行催化脱氢，完成该步骤。
不论使用哪一种合成方法，通常按照以前用的方法回收和纯化抑制肽。回收和纯化技术是公知的在本文中不再详述。C组合物和方法
如在别处说明的，免疫系统白细胞效应细胞或者炎性细胞，例如单核细胞，T细胞和嗜酸性粒细胞在细胞表面携带有VLA-4受体。在炎性细胞从血迁移(交换)到组织的早期阶段，这些细胞结合到血管内皮细胞表面存在的纤维蛋白连接素的CS-1区。这些炎性细胞与单克隆抗体P4C2(Wayner et al.，J.Cell.Biol.，109：1321-1330(1989)，Wayner WO 98/12809，Hemler et al，J.Biol.Chem.，262(24)：11478-11485(1987))和单克隆抗体HP1/2(Lobb WO 93/13798，1993年7月22日出版)发生免疫反应。
一旦进入组织中，炎性细胞通过一到多种机理加强炎性应答。在一种机理中，由炎性细胞释放细胞因子，化学引诱反应剂例如，白细胞介素-1β(IL-1β)，IL-2，肿瘤坏死因子α(TNFα)和淋巴细胞衍生的趋化因子，进一步导致炎性细胞迁移至该区。在另一种机理中，炎性细胞错误地将患有炎症的哺乳动物细胞识别为非自我细胞并攻击这些细胞，将它们杀死。这些和其它的免疫炎性应答加强机理是熟练的技术人员公知的并且不需要进一步阐述。因此通过帮助炎性加强效应细胞从血迁移到组织中，纤维蛋白连接素CS-1肽如此介导炎性疾病。
所说的抑制肽阻碍CS-1和VLA-4的结合，并且抑制随后的携带VLA-4受体的炎性细胞迁移到组织中，并且抑制加重了的炎性状态。对炎性细胞迁移的抑制导致由这些炎性细胞引起的纤维蛋白连接素CS-1/VLA-4介导的炎性应答降低，从而降低了所观察到的炎症。
由CS-1和VLA-4介导的并且可由所说的抑制肽降低炎症的特定的炎性疾病是非常多的。这些炎症类型的举例包括哮喘，关节炎例如类风湿关节炎和骨关节炎，异体移植排斥，各种类型皮肤炎症和中央神经系统脱髓鞘疾病。
特定的病理性炎性状态(其中已经观察到了所说的CS-1的表达并且如不处于病理状态(即正常组织)则没有观察到所说的表达)包括类风湿关节炎(滑膜)，骨关节炎(滑膜)，牛皮癣，肾脏移植，肺哮喘，人类和感染SIV的猴子的内脏的淋巴结高内皮小静脉(HEV)以及患有炎性内脏疾病的人或者动物，具有哮喘肺的和心脏移植的兔，在实验性自身免疫的脑脊髓炎(EAE)的鼠脑和延迟型超敏性(DTH)的皮肤，以及患有诱导性关节炎的大鼠的关节。
本发明还涉及含有溶解于或分散于一种药物学上可接受的载体或稀释剂(优选的是水)中的本发明所说的抑制肽的药物组合物，所说的组合物用于治疗如前面讨论的CS-1/VLA-4介导的炎性疾病。所说组合物含有前面所讨论的抑制CS-1/VLA-4结合(降低炎症)所需量的抑制肽。
因此，本发明还涉及一种药物组合物，可用于治疗一种或多种上文中所说的疾病。所说的药物组合物由前面描述的抑制肽组成，该肽以抑制结合所需量(降低炎症)分散于或溶于一种药物学上的可接受的稀释剂中，其中所说的肽抑制剂抑制含有VLA-4的白细胞和在内皮细胞表面表达的纤维蛋白连接素肽CS-1区之间的结合作用。所说的药物组合物适用于在各种各样的药物释放系统中使用。适用于本发明方法的药物释放系统的简述可参见Langer，Science，249：1527-1533(1990)。
对于本发明所说的药物组合物，该肽的使用剂量为根据例如特定的肽，给药方式，所治疗的特定的疾病和其严重程度患者的总的健康状况和患病状态以及指定的内科医生或者兽医的判断的不同而变化。可采用非肠道的，局部的，口服的或者定位的方式给药，例如喷雾或者经皮肤的途径将本发明的药物组合物用于预防和/或者治疗。根据给药方法的不同可采用各种各样的单位剂量形式使用本发明的药物组合物。例如，适用于口服给药的单位剂量形式包括粉剂，片剂，丸剂，胶囊，糖衣药丸。
优选的是采用静脉注射的方法使用本发明的药物组合物。因此本发明特别涉及适用于静脉给药的组合物，该组合物包括所说的抑制肽溶于或分散于药物学上可接受的稀释剂(载体)，优选的是水性载体而得到的一种溶液。可使用各种各样的水性载体，例如，水，缓冲的水，0.9％的盐水，缓冲的含水乙醇溶液等等。可采用常规的公知的灭菌技术对这些组合物进行灭菌或者过滤灭菌。可将得到的水溶液包装或者冻干，在给药以前将该冻干的制剂与无菌水溶液结合使用。该组合物可以含有药物学上可接受的辅助物质如调节物理状态所需要的物质，例如pH调节剂和缓冲试剂，毒性调节剂，增湿剂等等，例如乙酸钠，乳酸钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙，单月桂酸山梨酯，油酸三乙醇胺等等。
所使用的抑制肽的浓度通常为或者至少是约0.0001％，高至约0.1％(重量)并且主要是由体液的量，粘度等根据选定的特定的给药方法来选择。
因此，可以将用于静脉输注的典型的药物组合物制备成含有250ml的无菌的林格氏溶液普通盐水或PBS并且含有约0.25mg到约25mg的抑制肽。制备非肠道给药的化合物的实际的方法
是已知的或者是本领域内的技术人员显而易见的并且在例如Reminqton′sPharmaceutical Sciences，17th ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA(1985)(引入本文作为参考)中详细描述了该方法。
对于固体组合物，可以使用常规的无毒性的固体稀释剂(载体)，包括例如药物级的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，滑石粉，纤维素，葡萄糖，蔗糖，碳酸镁等等。对于口服给药的组合物，通过掺用任何通常使用的赋形剂，例如前面那些列出的那些载体，和通常10-95％的活性成分，即前面描述的肽抑制剂(优选的是约20％)(参见Remington′s，见上文)，优选的是利用将该固体剂量穿过胃并且进入肠的肠包衣，形成一种药物学上可接受的无毒的组合物。
对于喷雾用的组合物，优选的是将本发明所说的抑制肽与一种表面活性剂和助剂一起加到一种溶液中例如，含水乙醇或者DMSO溶液。该抑制肽的通常的百分数为约0.0001％到约0.1％(重量)，并且优选的是0.0001％到约0.001％。当然所使用的表面活性剂是无毒的，并且优选的是在助剂中是可溶的。典型的所说试剂是含有6-22个碳原子脂肪酸或其环状酸酐，例如己酸，辛酸，月桂酸，棕榈酸，硬脂酸，亚油酸，亚麻酸，olesteric和油酸，与脂族多羟基醇的的酯或部分酯，所说的醇为例如聚乙二醇，甘油，赤癣醇，阿拉伯醇，甘露醇，山梨醇，由山梨醇衍生的己糖醇水合物，以及这些酯的聚氧乙烯和聚氧丙烯衍生物。可以使用混合的酯，例如混合的或天然的甘油酯。表面活性剂的重量可以为占组合物重量的0.1到约20％，并且优选的是0.25-5％。通常采用助剂来补充组合物的其余重量。能液化的助剂通常在环境条件下为气体，并且在加压下可浓缩。合适的能液化的助剂是含有高至5个碳原子的低级链烷，例如丁烷和丙烷，优选的是氟化的或者氟氯化的链烷。也可以使用上述物质的混合物。在生产喷雾剂时，用合适的助剂充满装备有合适的阀门的容器，该容器含有细分的化合物和表面活性剂。因此将成分保持于高压下直到通过阀门的作用释放。还可以使用以空气作为助剂，用泵刺激喷雾(原子化的或者雾化)。
例如，对于治疗兔的哮喘，本发明所说肽的剂量是对于2-3公斤的动物约1-100mg/天的范围，对于人哮喘的患者其剂量为对于70公斤的患者使用约1-100mg/天的范围。通常采用有一个雾化器喷雾的方式给哮喘患者给药。实际上治疗应该在发病开始之后尽可能快地给药。
含有抑制肽的药物组合物可用于预防和/或治疗。在用于治疗时将该药物组合物施用到患有上面所说疾病的患者，其用量为足于抑制表达VLA-4的白细胞与表达CS-1肽区的内皮细胞结合；即降低炎症并从而至少部分抑制疾病的症状和其并发症所需的量。适用于达到上述目的量定义为“治疗有效剂量”或者“抑制结合的量”或者“降低炎症所需量”。上述使用的有效量依据疾病的严重程度，患者重量和总体状态而定，但是通常使用抑制肽的量为每天约1mg/kg-约500mg/kg，最通常使用的剂量为约1mg/kg到约10mg/kg的化合物/天。
在用于预防时，将含有所说肽的组合物施用到对特定的疾病敏感的患者或者处以该特定病的危险之中。将该量定义为预防有效剂量并且是足于抑制表达VLA-4的白细胞与表达CS-1肽内皮细胞的结合。在这种情况下使用，精确的量还依据患者的健康和体重状况而定，但通常为约1mg/kg/天到约500mg/kg/天的范围，最通常使用的是约1mg/kg/天到约20mg/kg/天。
用于测算本发明所说的抑制肽抑制结合所需的量的另一种方法是在一个体外研究中将该肽显示的抑制作用与由CS-1提供的或者10聚体标准物提供的抑制作用进行比较。进行所说比较简便的方法是利用两种被比较物质的IC50值以及达到IC50值所需的CS-1或者标准的10聚体肽的量和抑制肽的量，抑制肽的量是几个参考化合物的IC50值的几倍。
通常对于其IC50值至少是标准10聚体的IC50值的1/10的化合物(效力高10倍)，当以标准10聚体的摩尔量的1/10使用时，该量为有效结合抑制作用的量。更优选的该量是10聚体量的1/50。还要优选的是该量相当于10聚体量的1/100。只要该量将结合作用抑制50％，能够进一步抑制结合的更大的浓度是优选的。
因此，对于体外使用，最小的CS-1/VLA-4抑制量是IC50值。对于体内使用，通常使用的CS-1/VLA-4抑制量首先是IC50值浓度，并且按照需要可以降低或者可以增加该肽在所用的水性介质，即pH为7.2-7.4的水性介质中的溶解度极限值，其中使用非肠道给药方法时该水性介质为普通盐水，或者当口服给药时，介质为胃肠液。
采用由治疗的内科医生或者兽医选定的剂量水平和使用方法可以进行单次或多次使用本发明的组合物。在任何情况下，所配制的药物组合物可以提供足于有效治疗病人的抑制肽的量。
本发明还涉及治疗纤维蛋白连接素CS-1/VLA-4介导的炎症的方法。在这样一种方法中，将前面讨论的抑制肽施用到需要所说治疗的哺乳动物中，例如具有炎症或者在异体移植之前需要预防的哺乳动物。优选的是以上面讨论的药物组合物给药。所使用的该肽的量为降低炎症(CS-1/VLA-4结合抑制)的量。维持哺乳动物例如小鼠，大鼠，兔，猴或人成活直到由天然的体内过程除去该肽。在一天或几天或几个星期可多次给药，对于哺乳动物是异体移植的受体在其整个生活期内多次给药，也可以是单次给药。
用于测定足于抑制CS-1和VLA-4之间的结合作用的所需量的方法已经讨论过，其特别是用于体外研究中。对于体内使用，可用许多公开的检测方法测定经过特定的治疗是否可以降低炎症。例如可以估算在治疗前、后关节炎患者疼痛的关节的数目或者患者的活动能力。通过测量已知的实验动物的动力学惯量或者肺抗性可以测算关节炎发作的减少。也可以方便的检测在DTH观察到的肿胀的量，采用同样的方法可检测与标准对照相比，异体移植排斥的情况或者没有排斥作用。实施本发明的最好的模式实施例1      X-Leu-Asp-Phe-Z的合成
从NOVA Biochem Co.，La Jolla，CA购买被保护的氨基酸，Boc-Phe-OH，Boc-Asp(OBn)-OH和Boc-Leu-OH，不用进一步纯化可直接使用。苯乙酸，吗啉，二异丙基乙胺(DIEA)和1-羟基苯并三唑(HOBt)可从Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI获得。乙基-3-(3-二甲基氨基)-丙基碳化二亚胺·HCl(EDC)可从Bachem Co.，Torrance，CA.获得。溶于二噁烷中的4N HCl可从Pierce Co.，Pockford，IL获得，按照收到的形式使用。
在一个GE QE-300，300MHz NMR分光光度计记录1HNMR光谱。A Boc-Phe-吗啉酰胺的制备
将溶于100ml干燥的二甲基甲酰胺(DMF)中的Boc-Phe-OH(10g，38mmol)，吗啉(3.3g，38mmol)和1-羟基苯并三唑(5.1g，38mmol)装入250ml烧瓶中。在0℃向该溶液中加入二异丙基乙胺(DIEA)直到pH达到8，然后加入EDC(8.8g，46mmol)。将该溶液慢慢地加温到室温，在室温下(约22℃)搅拌该混合物8小时。通过真空蒸发除去DMF，加入乙酸乙酯和水，将各层分离。用乙酸乙酯(50ml×2)提取水层，用1N HCl洗涤合并的提取物，再用饱和的NaHCO3，水和盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并浓缩得到无色的液体(12.8g，37.3mmol，99％的产率)，根据1HNMR对该液体进行定性为Boc-Phe-吗啉。B HCl-Phe-吗啉酰胺盐的制备
将Boc-Phe-吗啉酰胺(12.8g，38mmol)置于250ml烧瓶中，然后加入溶于二恶烷中的4N HCl(30ml)。将该混合物搅拌六小时，此时TLC(硅胶；CHCl3∶MeOH∶乙酸，90∶8∶2)显示反应完成。除去二恶烷和过量的盐酸。以100％的产率获得了一种白色的固体，由1HNMR鉴别为HCl-Phe-吗啉酰胺(10.3g，38mmol)。C N-苯乙酰基-Leu-Asp(β-O-苄基)-Phe-吗啉酰胺的制备
利用上文中描述的偶合和去保护操作法将Boc-Asp(β-OBn)-OH，Boc-Leu-OH和苯乙酸依次加入到HCl-Phe-吗啉酰胺中。从乙酸乙酯和己烷中结晶出由此获得的白色固体，其产率为95％，经1HNMR鉴别为所需的酯。D N-苯乙酰基-Leu-Asp(β-O-Bn)-Phe-吗啉酰胺的合成
向上述苄基酯(10g，15mmol)的甲醇(100ml)溶液中加入10％的钯-炭(2.0g)。蒸发含有该混合物的烧瓶并且三次补充氢气。然后在氢气的条件下剧烈的搅拌该混合物约5小时直到完全氢解，由TLC(CHCl3∶MeOH∶乙酸，90∶8∶2)显示结果。用硅藻土过滤该反应混合物，除去甲醇得到一种白色固体，由1HNMR鉴别97％的产率为XLDFZ(8.4g，14.5mmol)。
用同样的方法制备具有不同于碳化二亚胺[C(O)-NH2]C末端酰胺连接的Z基团的肽。实施例2：典型的固相肽合成法
从Nova Biochem，La Jolla，CA获得Fmoc保护的氨基酸，羟基苯并三唑(HOBt)和Rink酰胺NBHA树脂。从Chem Impex Inc.，Chicago，IL获得二异丙基碳化二亚胺(DIC)。从Aldrich Chemical Company，St.Louis，MO获得哌啶。从Burdick andJackson，Muskegon，MI获得二甲基甲酰胺(DMF)，异丙醇(IPA)，二氯甲烷(DCM)，和二甲基乙酰胺(DMA)。上述所有试剂都按制造商的说明使用，不需进一步纯化。
根据Fmoc-Pro与Rink酰胺MBHA树脂的第一次偶合反应描述在合成期间重复的标准去保护/偶合循环：
用溶于DMF(130ml)中的20％哌啶将Fmoc-MBHA树脂(10.6g.，5mmol)处理3分钟。通过过滤除去该溶液，再用溶于DMF(130ml)中的20％哌啶将该树脂处理17分钟。通过过滤除去该溶液，用DMF(各130ml)洗涤树脂五次，用IPA(130ml)洗涤两次，用DMF(130ml)洗涤两次。向树脂中加入溶于DMA(50ml)中的Fmoc-D-脯氨酸的HOBt酯(在室温下由溶于50ml DMA中的10mmoles Fmoc-D-脯氨酸和10mmoles HOBt的溶液与12mmoles DIC反应20分钟形成的)并且使之反应2小时。用DMF(130ml)洗涤树脂五次以及用DCM(130ml)洗涤两次。由标准的Kaiser′s检测法检测结合到树脂上的氨基酸。
将上述循环重复进行，每次循环用下列的氨基酸：Fmoc-Phe，Fmoc-Asp(β-OBn)，Fmoc-Leu和苯乙酸。将树脂在真空下干燥24小时，然后在室温下与95％的TFN/5％水(60ml)反应2小时。通过过滤从树脂上分离该肽的TFA溶液，真空蒸发TFA。从含水乙醇中结晶出固相残留物得到1.8g的产物N-苯乙酰基-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2。在HP Amino Quant 1090和NMR通过氨基酸分析鉴定该肽的特性，由HPLC(WATER HPLC系统)检测该肽的纯度。实施例3：体外结合检测法
将用51铬标记的人T成淋巴细胞系，Jurkat细胞(ATCC TIB 152)用于检测由上文中讨论的各种肽所提供的体外结合抑制作用。在这些检测中发现CostarTM96孔平底微滴板(catalog No.9050，Cambridge，MA)能提供最好的结果。
按如下所述制备平板：以0.5-1μg/ml的浓度将25聚体CS-1肽(SEQ ID NO：1)溶于0.1M NaHCO3 pH9.5的缓冲液中(该缓冲液还含有10μg/ml牛血清白蛋白(BSA))，或者以1-2.5μg/ml的浓度将连接到卵白蛋白上的CS-1肽的结合物(CS-1-OVA)溶于相同缓冲液中，以二者之一作为底物。用50μl底物或者仅用作为对照的缓冲液包被微滴板的每个孔。将这些孔完全干燥并用pH为7.4的PBS洗两次。然后在室温下用每孔200μl的PRMI/1％BSA封阻每个孔的非特异性结合位点2小时。两种固相固定的底物提供同样的结果。
将Jurkat细胞(3-5×106细胞)置于带有盖的15mlFalconTM圆底试管。将试管离心，然后去除多余的培养基。
向离心过的细胞中加入200μl的51Cr标记的溶液并且在温暖的房间里与细胞接触90-120分钟。通常该步骤提供50,000-100,000cpm/孔，每孔的存活率为约80-100％细胞。更长的接触时间提供更大的标记量，但细胞存活性较低。
用(i)完全培养基，(ii)1mM EDTA/PBS和然后(iii)无血清成分的RPM1/1％BSA洗涤标记的细胞。每次洗涤之后，将细胞离心。最后以1×106活细胞/ml的浓度将细胞重新悬浮于无血清的RPMI/1％BSA，将提供的浓度稀释1倍。
    在装入1.5ml cryogenic带螺丝帽的试管中将抑制肽制备成浓度为20mg/mlDMSO的原液，贮存于-70℃。利用FlowTM圆底或者V形底微滴板，以60μl/孔的浓度在RPMI/1％BSA中制备两倍于检测浓度的抑制肽。
通常利用四个起始的稀释液。对于效力低的肽例如标准的10聚体SEQ ID NO：3，起始稀释液浓度为500μg/ml，100μg/ml，20μg/ml，和4μg/ml。对于效力高的肽例如N-苯乙酰基-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2，通常的起始浓度为10μg/ml，2μg/ml，0.4μg/ml和0.08μg/ml。
然后，将51Cr标记的细胞(每孔60μl，1×106的细胞)与稀释的肽溶液混合。将该混合物于室温下(约22℃)保持30分钟。
将100ml的各种抑制肽/细胞混合物转移到底物包被的孔中。对于每个稀释度同样的试验重复三次。在37℃将得到的平板培养30分钟，然后用RPMI/1％BSA以200μl/孔的量缓慢地洗涤三次。用显微镜观察结合情况，尤其是在第二次洗涤之后。
然后通过向每个孔中加入100μl溶于水中的0.5％的十二烷基硫酸钠溶液将结合的细胞裂解。然后对得到的溶液进行处理，利用通常的操作进行计数和计算IC50值。在每个平板上设置合适的阳性和阴性对照，以便将单独检测的结果标准化并进行比较。
表1的结果即是如此标准化。对于肽N-苯乙酰基-Leu-Asp-Phe-吗啉酰胺的绝对的IC50值为0.18-0.30μM。实施例4    小鼠的延迟型超敏性A起始研究
Chisholm et al.，Eur.J.Immunol.，23：682-688(1993)报道了在鼠接触型超敏性模型中利用大鼠抗小鼠α-4-抗体封阻VLA-4作用的体内结果。这些研究者注意到设计为干扰VLA-4介导的吸附的治疗剂是体内炎性过程的有效的阻断剂。
利用灌注了恶唑酮的脾T细胞研制了过继性转移延迟型超敏性鼠模型。在Elices et al.，Clin.Exp.Rheum.，11(Suppl.8)：577-580(1993)中描述了该模型，其操作步骤在下文中描述。
将BALB/c小鼠的腹部剃光并且在0和1天用溶于丙酮/棕榈油(4∶1)中的3％的噁唑酮涂覆(在腹部涂50μl，在每个脚掌涂5μl)。在第5天将该鼠杀死，取出脾脏，尼龙羊毛柱获得脾T细胞。
分别将普通盐水或含有25×106/动物的噁唑酮-免疫T细胞的盐水注射到裸鼠中。然后通过在每个耳朵上涂10μl的2％噁唑酮攻击该鼠。所有的操作在无菌条件和没有内毒素的缓冲液中进行。
在进行攻击或者盐水注射以前，将泵移植到鼠中，该泵可以将普通盐水，含有肽N-苯乙酰基-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2的普通盐水或者含有具有无规序列的肽的普通盐水以6mg/kg/天连续地供应24小时。此后用微型游标测径器在24小时内检测攻击位点或盐水注射位点肿胀的直径。
图5中显示用盐水和所说的抑制肽进行治疗的研究结果。尽管由于可能是非CS-1介导的炎症导致获得的数据中有稍微的重叠，但是可以清楚地看到与未治疗的对照相比，以本发明的抑制肽给药可以降低这种类型的CS-1/VLA-4介导的免疫炎症。利用无规的肽没有降低炎症。利用600mg/kg/天的相同的肽进行的另一项研究没有显示由该肽产生的毒性。B扩大研究
按照上面所说完成扩大研究，所不同的是没有利用无规肽对照，该研究中使用了表1的其它的抑制肽以及更大的小鼠组。相对于仅用载体注射的结果进行统计学分析。结果显示于下面的表2中。
                        表2*肽                              抑制百分数        p值          nAc-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2         36            0.0002       30Ac-Leu-Asp-Phe                    29            0.015        8Ac-Leu-Asp-Phe                    30            ＜0.0001     24.Phth-Leu-Asp-Val-D-Pro-NH2         --            N.S.         8Ac-Leu-Asp-Phe                    --            N.S.         22*Ac＝N-苯乙酰基；Phth＝N-苯二甲酰亚氨基；和N.S.＝与载体没有显著的差异。
对于所研究的五种抑制肽中的四种注意到攻击以后肿胀减少，其中三种肽抑制剂从统计学上说可以显著地降低肿胀。第四种肽可以重复地产生抑制作用，但是不是统计学上的显著水平。该第四种化合物对水分十分敏感。因此可以相信实际上供应的药剂量低于所说的6mg/kg/天剂量，因为存在着吸水性，并且剂量的降低导致没有统计学意义上显著的结果。
在本文检测的过继性免疫应答中转移的T细胞是效应细胞。在炎性免疫应答期间T细胞表达分别与纤维蛋白连接素的CS-1和RGD发生作用的VLA-4和VLA-5。Ferguson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，88：8072-8076(1991)证明将约50μg/ml的标准肽(SEQ ID NO：3)与免疫T细胞混合后可以消除转移的免疫应答例如本文研究的应答。这些研究者还告诉我们将肽和T细胞分别给药不会导致所说的消除作用。
本文可以看到将6μg/ml的所说抑制肽单独给药，可以基本上抑制免疫应答。还可以看到抑制肽和T细胞不需要预先混合，在Ferguson et al.的结果中需要混合。
N-苯二甲酰亚氨基衍生物显示的平均肿胀程度稍微高于仅用载体显示的程度，原因目前还不清楚，尽管仅利用一个浓度，在表1所说的体外研究中该N-苯二甲酰亚氨基衍生物显示约1/5-1/6的Ac-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2的活性，所以在活性范围的低末端值该低活性的化合物没有显示活性作用是可以预料到的。实施例5  哮喘兔的治疗
用屋尘螨抗原对刚出生的到四月龄的六只新西兰白兔免疫接种。接种后，三只兔接受以100mg/kg的量溶于50％乙醇水溶液(作为稀释剂)的肽抑制剂N-苯乙酰基-Leu-Asp-Phe-吗啉酰胺的单次给药的雾化组合物，另三只兔仅接受稀释剂本身。在以肽给药之后用屋尘螨抗原攻击所有的兔约15-30分钟，与没有接受肽的动物作为对照。
一旦进行免疫接种和攻击之后，在约3个星期内炎性状态退至基础水平。此后利用作为对照的三只动物作为接受抑制肽的患者，并且用最初接受该肽的三只兔子用作为对照。
这里进行了所说的交叉研究。因此，在上面的研究之后，在三个多星期时间后用溶于上述稀释剂的上述抑制肽处理三只最初的对照兔，三只前面接受该肽的兔仅以稀释剂给药。然后再攻击所有六只兔。
在该交叉研究中两部分以肽或稀释剂给药之前，根据动力学惯量(Cdyn)和肺抗性(RL)和支气管肺泡灌洗(BAL)检测起始的肺功能从而获得效应细胞数，这里为嗜酸粒细胞。然后对该研究的两部分，在攻击之后每半小时进行同样的检测，共检测6小时(早期过敏反应)，以及攻击之后24小时内进行同样的研究(晚期过敏反应)。
由Dr.W.J.Metzger of East Carolina University，Greenville，N.C.，按照W.J.Metzger in CRC Handbook of Late Phase Reactions，W.Dorsch，ed.，Chapter 35，CRc Press，Boca Raton，FL(1990)pages 347-362描述的方法完成这些研究。
图4A和4B显示了肺功能参数研究的结果。其中受攻击的、抑制肽治疗的动物的数据显示于空心环，受攻击的、未治疗的对照动物的数据显示于实心环中。得自该研究的两部分的平均值为所说的数据。
从图4A中可以看到，在整个6小时内受攻击的和被治疗的动物的Cdyn值约停留在起始值。受攻击的未治疗的动物的Cdyn值在整个6小时内快速地降至起始值的40％，然后停留在该值。
图4B的数据显示受攻击的并由抑制肽治疗的动物的RL值在整个6小时内停留在起始值和该值的200％之间，在该时间即将结束的时候有稍微的升高。在攻击以后起始的两小时内，受攻击的但是未治疗的动物的RL值上升至200-300％，在后4小时之内上升到约400-1200％。
在下面的表2中提供了在炎性免疫应答的早期(2-4小时)和晚期(24小时)与受攻击的对照动物相比，用抑制剂治疗的受攻击的动物的平均数据的总和。
                     表2
Ac-Leu-Asp-Phe-吗啉酰胺*的体内效力参数         阶段                      降低的百分数Cdyn        早期                           94.4
         晚期                           86.6RL          早期                           80.1
         晚期                           82.6*N-苯乙酰基-Leu-Asp-Phe-吗啉酰胺
从这些研究得到的BAL数显示在该交叉研究中，与未治疗的受攻击的动物相比，在24小时之后抑制肽治疗的受攻击的动物的嗜酸性细胞降低88.1％。
从上述数据和图4A和4B可以看出与未接受治疗的动物相比，在治疗的动物中以降低炎性有效量的本发明的肽雾化给药可以大大地降低哮喘反应。实施例6  兔心脏移植模型
将新西兰白兔SPF的心脏移植到类似兔的颈部以分析外植体-宿主的免疫排斥模型，以及所说肽对该免疫炎性应答的影响。这些研究由Dr.M.Rabinovitch ofthe Hospital for Sick Children，Toronto，Ontario，Canada完成。实验动物模型
按照以前描述的试验方案[Alonso et al.，Am.J.Pathol.，87：415-442(1977)；Clausell et al.，Circulation，89：2768-2779(1994)]，以及得到了在多伦多的病残儿童医院的关心动物委员会批准利用3.5-4公斤的新西兰雌性白兔(Charles River Lab.，Saint Laurent，Quebec)用于进行异体心脏移植。未对动物进行选择以有利于HLA-错配，宿主兔是没有巴斯德杆菌感染的并且供体是远系繁殖的动物。给宿主和供体兔喂养Purina 5321-0.5％胆固醇饲料((ResearchDiets Inc.，Nwe Brunswick，NJ)并且利用已经证明可用于加速异体移植心脏治疗过程的方案[Alonso et al.，Am.J.Pathol.，87：415-442(1977)]。用该饲料喂养4天然后进行移植，在移植后的受体继续用该饲料喂养直到完成整个实验。
以前有人描述了异体心脏移植的技术[Clausell et al.，Circulation，89：P2768-2779(1994)]。简单的说，在受体兔的颈部的靠前部位垂直切开分离出左边的普通颈动脉以及同侧的外部颈静脉。通过将主动脉末端到受体颈动脉侧面以及肺的末端到受体的外部颈静肺侧面解剖而将异体心脏放在颈部，然后在约30分钟的时间内供体心脏局部缺血。根据由加拿大国家社会医疗研究制定的照顾实验动物的原则照顾手术后的动物。
所说的治疗包括从Leu-Asp-Val(LDV)序列衍生的四肽抑制剂，N-苯乙酰基-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2(治疗用的)[Komoriya et al.，J.Biol.Chem.，266：15075-15079(1991；Wayner et al.J.cell Biol.，116：489-497(1992)](在体外研究中该肽加强抑制)和同样的合成四肽N-苯乙酰基-Asp-Leu-Phe-D-Pro-NH2的无规形式(对照)(不产生对VLA-4的抑制)。两种肽都是由Cytel Corporation，San Diego.CA合成。
在移植开始的那一天，随机的挑选动物并且用约1mg/kg s.c.的无规肽(对照组)治疗或者用1mg/kg s.c.的抑制肽进行治疗。肽的使用量是根据表1中预先的体外研究凭经验推断出适用于体内模型的量。不进行其它的免疫抑制治疗。通过触诊每天监测移植体并且坚持7-8天，即监测前面描述的与心肌排斥(受损伤的心脏收缩)有关的终点，并在该模型中研究异体心脏治疗[Clausell et al.，Circulation，89：2768-2779(1994)]。在对照组(n＝7)和治疗组(n＝7)共研究了14只动物。心脏的准备
用致死剂量的乙醇(480mg i.V.)(MTC Pharmaceutical，Cambridge，ON)杀死动物，取出宿主和供体的心脏并且用盐水穿过主动脉灌注到冠状动脉，随后通过用2％的多聚甲醛(Sigma，St，Louis，MO)进行光固定。由于前面的描述指明在兔中异体心脏移植治疗同样分配到整个冠状动脉循环[Foegh et al.，TransplantProc.，21：3674-3676(1989)]以及Dr.Rabinovitch和其同事们的工作[Clausell et al.，Circulation，89：2668-2779(1994)]，从心脏的基底到顶点的方向横向切开。不同的心脏切片保存于10％的福尔马林(BDH Inc.，Toronto，ON)用于进行光学显微镜研究或者立即冷冻到O.T.C Compound Tissue Tek(MilesInc.，Elkart，IN)中用于特定的免疫组织化学研究。排斥等级
根据修改的Billingham′s标准将从供体心脏获得的样本用苏木精：曙红进行染色以便进行排斥的组织学等级分析。对切片进行等级分析的工作是由病残儿童医院的高级病理学家(Dr.G.J.Wilson)进行的，他们不了解供体心脏是从对照或者从抑制肽治疗的动物获得的。用光学显微镜对宿主和供体冠状动脉进行定量的估测
利用Movat pentachrome方法对来自于对照和治疗兔的宿主和供体的心脏的三个不同的用烷烃包埋的组织切片进行染色以用光学显微镜观察。用结合了计算机控制的图像分析系统的Zeiss显微镜(Perceptics Inc.，NuVision software)进行形态测量分析，所说方法描述于Clause ll et al.，Circulation，89：2768-2779(1994)。在来自各个研究动物的所有的三个心脏切片中计算具有内部损伤的脉管的数目并且以占脉管总数的百分数表示。
在宿主心脏中共分析了对照组999个脉管，治疗组1054个脉管。在供体心脏中，共分析了对照组827个脉管，治疗组617个脉管。为了测定内部加厚的程度的严重性，在所有的三个切片中间检测每一个可追踪的脉管的直径，将冠状动脉划分为小(直径＜100μm)，中等(直径＞100＜500μm)以及大(直径＞500μm)。然后按照前面描述的Eich et al.，Circulation，87：261-269(1993)的方法在每一个脉管的大小分类级别中对内部加厚的程度进行定量测算。在每个受影响的脉管中测算由外部的中央层(ML)，内部的弹性薄层(IEL)和腔包围的面积，由通式IT＝IEL-腔面积/ML-腔面积×100计算出内部加厚的面积(IT)相对于脉管面积的值。免疫组织化学研究
在所有的免疫组织化学分析中，对宿主和供体的心脏的冠状动脉进行比较，比较对照和治疗组的内部加厚的不同的大小范围和有无加厚。在Rabinovitch实验室由两名有经验的研究者对在所检查的切片中研究的每个特定抗原相对丰度进行半定量的分级，即最低限度的(+/-)，很少的(+)，中等丰度(++)到高丰度的(+++)。最后的评分标准是按照达到90％的一致性的单个的分类级别。(1)炎性细胞的定性
为鉴定两个研究组中异体移植冠状动脉中存在免疫炎性反应，用抗兔MHC II型抗原和兔T细胞的单克隆抗体(由Dr.peter Libby，Brigham and Women′sHospital，Boston，MA提供的礼物)以及还抗兔巨噬细胞的单克隆抗体(RAM 11，Dako Corp.，Carpinteria，CA)进行免疫过氧化物酶染色。将切片在空气中风干2小时，在丙酮中固定20分钟，浸于D-PBS(Gibco，Burlington，ON)/0.1％BSA(Boehringer-Manneim，Germany)。通过在PBS/0.1％BSA+3％过氧化氢(BDH)将切片浸30分钟封阻内源性过氧化物酶的活性。在利用10％普通的羊血清(Sigma)进行非特异性的封阻步骤之后，在室温下以1∶10的稀释度将抗体加到切片上保持一小时。然后清洗切片，在室温下以1∶50的稀释度用羊抗鼠过氧化物酶结合的二级抗体(Bio-Rad，Richmond，cA)保温45分钟并用3，3′-二氨基联苯胺(DAB)(Sigma)显色10分钟。用普通的鼠异型IgG(Dako Corp.)处理对照切片。(2)免疫检测细胞粘附分子
为了评价所说的治疗对异体移植冠状动脉表达吸附分子的影响，对来自对照和治疗组的宿主和供体心脏的冷冻切片进行ICAM-1和VCAM-1的免疫过氧化物酶染色。抗ICAM-1(mAb Rb2/3)和抗VCAM-1(mAb Rb1/9)的单克隆抗体是由Dr.MyronCybulsky(Brigham and Women′s Hospital，Boston，MA)热情提供的，并且在室温下以1∶10的浓度使用1小时。基本上按照上面的描述完成免疫染色。(3)纤维蛋白连接素的评价
通过对冰冻切片进行免疫过氧化物酶的染色确定在来自对照和治疗组的宿主和供体心脏的冠状动脉上表达的纤维蛋白连接素。在室温下以1∶100的稀释度使用抗细胞纤维蛋白连接素的单克隆抗体(Chemicon Int.Inc.，Temecula，CA)1小时，基本上按照上面所述完成余下的免疫组织化学程序。该抗体并不识别血浆纤维蛋白连接素。统计学分析
得到的数据以平均值+/-SE表示。在有关对照和治疗组的损伤的影响和严重程度的分析中，利用Student′s的t试验检测显著性。利用Fisher′s的精确检测法分析从免疫组织化学得到的分类变量值之间的相关性，如果两个组(对照和治疗)＞+认为是阳性。如果p＜0.05则认为差异显著。
上述研究的结果概括于下面的表3中。
                     表3在冠状动脉上的表达           抑制肽        抑制肽MHC II型                       ±c          ++T细胞                          ±            ++巨噬细胞                       ±            +ICAM-1                         ±            +VCAM-1                         ±            +总的纤维蛋白连接素             ±            ++脉管的内部增厚脉管百分数a                   35d          88严重程度(脉管面积的百分数)b   16e          36a对于抑制剂和对照肽组发生的基底(兔本身宿主心脏)分别是：12％和10％。b对于抑制剂和对照肽组严重程度的基底(兔本身宿主心脏)分别是：12％和12％。c评分标准：-，阴性；±最小值；+，小；++，中等丰度；+++，高丰度。d p＜0.001。e p＜0.001。
从上述结果可以看出，利用本发明的抑制肽可以大大降低在心脏移植中看到的炎性诱导的损害。从脉管内壁加厚的结果中尤其可以证明这种对损害的降低作用，在有关由MHC II抗原显示的炎性标记的表达，T细胞和巨噬细胞，和总纤维蛋白连接素的存在增加的结果中也可间接看到这种损坏作用大大降低。实施例7  体外猪异体移植模型
利用猪冠状动脉内皮细胞(EC；如在IEL中存在的)和平滑肌细胞(SMC；如在动脉的中央层中存在的)在体外进行同样的研究。利用一个转膜系统，在M-199培养基(Gibco Labs.)中培养两种类型的细胞，其中SMC位于底层。在开始检测以前用100ng/ml白细胞介素-1β(IL-1β)刺激SMC 24小时。用Ficoll-Hypaque分离猪周围血淋巴细胞，放射性标记和在EC上面培养过夜(约18小时)。
与未受刺激的SMC相比，可观察到转内皮淋巴细胞在IL-1β-刺激的SMC中迁移。在该培养基中存在10μg/ml的实施例6的抑制肽，苯乙酰基-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2可以将淋巴细胞的迁移降低约30％(p＜0.05)，而相同量的无规序列的对照肽没有降低迁移。
EC和SMC纤维蛋白连接素和IL-1β的表达增加是免疫炎性应答的特征，所说应答与小猪的异位心脏移植之后快速的移植动脉治疗有关。上述结果表明在该体外模型中IL-1β可诱导纤维蛋白连接素的产生，从而导致转内皮淋巴细胞的迁移。上述结果还显示可用所说的抑制肽降低这种免疫炎性应答。实施例8  小鼠中的实验性自身免疫脑脊髓炎
实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)是一种中央神经系统的脱髓鞘疾病，在小鼠和大鼠的敏感性品种中可诱导该疾病，该大鼠和小鼠是用髓磷脂碱性蛋白，蛋白脂蛋白(PLP)或它们的免疫显性T细胞决定蔟免疫接种的，或者注射了与这些决定蔟相特异的CD4-阳性T细胞克隆。EAE用作为人多种硬化的动物模型。在两种疾病中，循环中的白细胞例如T细胞和单核细胞穿透血/脑障碍层并且损害髓磷脂，导致瘫痪。
通过在0天时用对应于PLP139-151位的50μg的肽(在PBS和完全佛氏佐剂(CFA)的1∶1的混合物中乳化)免疫接种雌性的SJL/J小鼠(8-14周龄)可诱导EAE。在每只鼠的后胁腹的两个位点皮下注射0.2ml的佐剂乳液。24-72小时之后给所有的小鼠静脉注射107灭活的百日咳博德特氏杆菌单位/100μl。
每天观察小鼠，从第8天开始出现EAE临床症状，并且将疾病分为0-5个等级，即0＝没有疾病；1＝尾巴松软；2＝后肢中等无力；3＝后肢轻瘫；4＝前肢中等无力的截瘫；5＝四肢瘫痪或者濒死前状态。
在第8和第9天用溶于0.2ml不完全佛氏佐剂中的1mg/小鼠的抑制肽N-苯乙酰基-Leu-Asp-phe-D-Pro-NH2腹膜注射。同样的方法将具有无规序列的肽[N-苯乙酰基-Asp-Leu-Phe-D-Pro-NH2]注射到小鼠内作为对照。在表1中显示了该对照肽的相对效力为＜1。
将临床症状的总分或平均分相对于时间作图。计算出第8-35天之间相应的曲线下面的面积，从而计算出抑制肽对EAE的抑制百分数。按如下方法计算抑制百分数：
％抑制率＝100-(抑制肽的面积+对照的面积)×100
在图6中显示了经过31天以后两个典型的曲线，其中黑圈为用抑制肽治疗的六只鼠的平均分，黑框为接受了无规序列对照肽的六只鼠平均分。正如所看到的，与对照肽治疗的动物相比，用本发明的抑制肽治疗的动物显示临床症状明显改善。实施例9  在人类风湿关节炎中表达CS-1
用显微镜检查从人类风湿性关节炎(RA)患者经外科手术获得的滑膜标本表达的纤维蛋白连接素CS-1肽。利用抗CS-1抗体采用免疫过氧化物酶技术对组织的超薄切片进行染色，并用透射电子显微镜进行研究，这些研究显示在血管内皮的腔和腔浆膜上表达CS-1。将关节空间的界面处的滑膜内层的浆膜的滑液细胞进行染色，未发现在正常的滑液中所表达的CS-1肽。
利用Jurkat T细胞系和冷冻的RA滑液切片进行结合研究。采用抗VLA-4抗体或者用作为标准的10聚体CS-1肽(500μg/ml)(SEQ ID NO：3)可以抑制Jurkat细胞吸附，但用抗VLA-5，VCAM-1-A或者VCAM-1-B的抗体或者无规的10聚体序列的肽不能抑制。受刺激的MOLT-4细胞产生类似的结果。在Elices et al.，J.Clin.Invest.，93：405-416(January 1994)中报道了这些结果。
利用抑制肽N-苯乙酰基-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH-2可观察到对Jurkat细胞与人RA滑膜切片的结合产生同样的抑制作用，而对与正常的滑膜切片的结合没有产生抑制作用。当使用该肽时显示于表1中的其IC50值比标准10聚体的IC50值低312倍。其IC50值的绝对值是约0.5μmol。
这些结果显示在人慢性免疫炎症类风湿性关节炎中CS-1肽部分和VLA-4的重要性。这些结果还显示所说的抑制肽能够抑制人免疫炎症中炎性细胞的结合。实施例10  哮喘羊的治疗
由Dr.William M.Abraham of the Department of Research，Mount SinaiMedical Center，4300 Alton Road，Miami Beach，FL 33140在双重隐蔽的交叉研究治疗六只哮喘羊。已经证明羊对吸入的Ascuris suum抗原产生早期和晚期支气管炎反应。通常该项研究按照Abraham et al.，J.Clin.Invest.，93：776-787(1994)的描述进行。
本文所用的抑制肽是N-苯乙酰基-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2，对照肽含由前面描述的具有相同残基而序列无规的肽。用于雾化肽的载体是磷酸缓冲盐水。在攻击以前三天每天施用肽两次，每次剂量为1mg/kg，在第4天在攻击前0.5小时以及攻击后4小时使用同样的剂量。由于这是一个交叉研究，每只动物接受一种或另一种治疗，随后休息，然后进行另一种治疗。因此，每只动物都可作为其自身的对照。
从图7可看到，用抑制肽治疗的动物显示在攻击时产生与基础的特异性肺抗性(SRL)相比较小的变化，然后以比用对照肽处理的动物更快的速度恢复其本来的肺功能。另外，从攻击后3-4小时到研究结束(攻击后8小时)肺功能保留在基础值，而对照肽处理的动物其肺功能(SRL)增加。
还对攻击后应答的波长进行分析。这里攻击后24小时特异性的肺抗性SRL恢复到基础值，但是在这段时间内羊对吸入的氨基甲酰胆碱产生高度应答。将攻击前和攻击后24小时氨基甲酰胆碱吸入的PC400值进行比较，表明与肽抑制剂治疗的组所需的量相比(约27BU)，对照肽治疗的动物将SRL值提高至盐水对照值的4倍所需的氨基甲酰胆碱的剂量要小的多[约12个呼吸单位(BU)]。在这里攻击前的值为约20-23BU，因此，抑制肽使动物的SRL值比攻击前的值更大，表明与攻击前的应答相比，其产生的对氨基甲酰胆碱的应答降低。
虽然已对本发明的优选实施方案进行的描述，并且仅作为举例，本领域内技术人员能够认识到对其进行各种修改，变化，删改和替代仍在本发明的范围内。
序列表(1)一般资料：(i)申请人：
(A)姓名：Cytel Corporation
(B)街道：3525 John Hopkins Court
(C)城市：San Diego
(D)州：加利福尼亚
(E)国家：美国
(F)邮编：92121
(G)电话：619-552-2794
(H)传真：619-552-8801(ii)发明名称：CS-1模拟肽，利用该肽的组合物和方法(iii)序列数：15(iv)计算机可读形式：
(A)媒体类型：Floppy disk
(B)计算机：IBM PC兼容
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.25(vi)目前的申请资料：
(A)申请号：PCT/US94/
(B)申请日：1994年12月5日(2)SEQ ID NO：1的资料：(i)序列特征：
(A)长度：25个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)几何结构：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly1               5                   10                  15Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr
          20                  25(2)SEQ ID NO：2的资料：
(A)长度：12个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)几何结构：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
Leu His Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr
1               5                   10(2)SEQ ID NO：3的资料：(i)序列特征：
(A)长度：10个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)几何结构：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr
1               5                   10(2)SEQ ID NO：4的资料：
(A)长度：4个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)几何结构：线性(ii)分子类型：肽(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：1
(D)其它资料：/标记＝Xaa
             /注释＝“Xaa＝苯乙酰基-Leu”(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：4
(D)其它资料：/标记＝Xaa
             /注释＝“Xaa＝Pro-NH2”(xi)序列描述：SEQ ID NO：4
Xaa Asp Tyr Xaa
1(2)SEQ ID NO：5的资料：
(A)长度：4个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)几何结构：线性(ii)分子类型：肽(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：1
(D)其它资料：/标记＝Xaa
             /注释＝“Xaa＝苯乙酰基-Leu”(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：4
(D)其它资料：/标记＝Xaa
             /注释＝“Xaa＝在C末端Pro羧基和含有4个与之结合的N-苯乙
                     酰基-Leu-Asp-Phe-Pro肽的四亚乙基戊胺之间形成的
                     酰胺”(xi)序列描述：SEQ ID NO：5
Xaa Asp Phe Xaa
1(2)SEQ ID NO：6的资料：
(A)长度：4个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)几何结构：线性(ii)分子类型：肽(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：1
(D)其它资料：/标记＝Xaa
             /注释＝“Xaa＝GlcNAc-O-(CH2)5-C(O)-Phe”(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：4
(D)其它资料：/标记＝Xaa
             /注释＝“Xaa＝Leu-哌啶酰胺”(xi)序列描述：SEQ ID NO：6
Xaa Leu Asp Xaa
1(2)SEQ ID NO：7的资料：
(A)长度：4个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)几何结构：线性(ii)分子类型：肽(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：1
(D)其它资料：/标记＝Xaa
             /注释＝“Xaa＝苯甲酰-Leu”(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：4
(D)其它资料：/标记＝Xaa
             /注释＝“Xaa＝Pro-NH2”(xi)序列描述：SEQ ID NO：7
Xaa Asp Val Xaa
1(2)SEQ ID NO：8的资料：
(A)长度：4个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)几何结构：线性(ii)分子类型：肽(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：1
(D)其它资料：/标记＝Xaa
             /注释＝“Xaa＝特戊酰-Leu”(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：4
(D)其它资料：/标记＝Xaa
             /注释＝“Xaa＝Pro-NH2”(xi)序列描述：SEQ ID NO：8
Xaa Asp Val Xaa
1(2)SEQ ID NO：9的资料：
(A)长度：4个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)几何结构：线性(ii)分子类型：肽(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：1
(D)其它资料：/标记＝Xaa
             /注释＝“Xaa＝苯乙酰基-Leu”(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：4
(D)其它资料：/标记＝Xaa
             /注释＝“Xaa＝Pro-癸酰胺”(xi)序列描述：SEQ ID NO：9
Xaa Asp Phe Xaa
1(2)SEQ ID NO：10的资料：
(A)长度：10个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)几何结构：线性(ii)分子类型：肽(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：10
(D)其它资料：/标记＝Xaa
             /注释＝“Xaa＝Pro-NH2”(xi)序列描述：SEQ ID NO：10
Ile Leu Asp Val Pro Ile Leu Asp Val Xaa
1               5                   10(2)SEQ ID NO：11的资料：
(A)长度：5个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)几何结构：线性(ii)分子类型：肽(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：5
(D)其它资料：/标记＝Xaa
             /注释＝“Xaa＝Pro-NH2”(xi)序列描述：SEQ ID NO：11
Ile Leu Asp Phe Xaa
1               5(2)SEQ ID NO：12的资料：
(A)长度：4个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)几何结构：线性(ii)分子类型：肽(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：1
(D)其它资料：/标记＝Xaa
             /注释＝“Xaa＝苯乙酰基-Leu”(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：4
(D)其它资料：/标记＝Xaa
             /注释＝“Xaa＝Pro-NH(CH2)5-C(O)NHC18H37”(xi)序列描述：SEQ ID NO：12
Xaa Asp Phe Xaa
1(2)SEQ ID NO：13的资料：
(A)长度：5个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)几何结构：线性(ii)分子类型：肽(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：5
(D)其它资料：/标记＝Xaa
             /注释＝“Xaa＝Pro-NH2”(xi)序列描述：SEQ ID NO：13
Ile Leu Asp Val Xaa
1               5(2)SEQ ID NO：14的资料：
(A)长度：5个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)几何结构：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：14
Ile Leu Asp Val Pro
1               5(2)SEQ ID NO：15的资料：
(A)长度：5个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)几何结构：线性(ii)分子类型：肽(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：1
(D)其它资料：/标记＝Xaa
             /注释＝“Xaa＝乙酰基-Ser”(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：5
(D)其它资料：/标记＝Xaa
             /注释＝“Xaa＝Ser-NH2”(xi)序列描述：SEQ ID NO：15
Xaa Phe Asp Phe Xaa
1               5

Claims (38)

1、一种通式A的肽
    X-B-Asp-Z                A
其中B是一种α-疏水氨基酸残基，它的侧链具有约2-5个亚甲基的长度；
X是一个以酰胺键连接到B的氮原子上的基团，所说X基团具有键合到所说酰胺键的羰基碳上的环结构，所说的键合通过一个具有0-约2个亚甲基长度的间隔基连接，包括所说间隔基和羰基碳的X的长度是约3-喹啉羰基的长度或者更小，所说的环结构是5-和6-元环或者一个融合的6，6-或者6，5-元环；和
Z选自于下列基团
(a)Xaa-NCy1，其中Xaa是Val，Ile，Leu或者具有一个含1或者2个融合的芳香环的侧链的氨基酸残基，NCy1是一个含有环的基团，该基团具有一个位于环上的氮原子，该氮原子与Xaa的α-羧基形成一个酰胺键，并且NCy1的环包括所说环上氮原子在内含有5-或6-个原子；和
(b)NCy2，其中所说的氮原子是环基团的胺取代基，该氮原子与所说Asp的α-羧基基团形成一酰胺键，该胺取代基与一个6-或者7-元环键合，或者与一个融合的6，6-或者6，7-员内酰胺环体系键合，其中所说携带胺取代基的环是饱和的并且在所说内酰胺的羰基的α位上含有胺取代基；
在一个体外检测试验中，所说的肽抑制Jurkat细胞(ATCC TIB 152)与固相结合的SEQ ID NO：1的肽结合，所说的检测试验是在pH值为7.2-7.4的含水缓冲液中进行的，其抑制程度与由SEQ ID NO：3的肽显示的抑制所说结合的程度相等或者高至约3000倍。
2、根据权利要求1所说的肽，其中B选自于下列组：亮氨酸，环己丙氨酸，正亮氨酸，甲硫氨酸，高丝氨酸，苏氨酸，苯丙氨酸，缬氨酸，正缬氨酸和异亮氨酸。
3、根据权利要求2所说的肽，其中所说X基团的环结构含有一个芳香环。
4、根据权利要求3所说的肽，其中Z是Xaa-NCy1。
5、根据权利要求4所说的肽，其中Xaa是具有一个侧链的氨基酸残基，该侧链含有一或二个融合的芳香环。
6、根据权利要求5所说的肽，其中NCy1的环被一或二个选自下列基团的取代基所取代，所说取代基包括羧基，C1-C4亚烷基羧基，羧酰胺，C1-C4亚烷基羧酰胺，羟基，羟甲基，(CH2CH2O)nH，其中n是1，2或3，和C1-C4烷基。
7、通式I的肽
     X-Leu-Asp-Z         I
其中
X是一个以酰胺键连接到Leu的氮原子上的基团，所说X基团具有键合到所说酰胺键的羰基碳上的环结构，所说的键合通过一个具有0-约2个亚甲基长度的间隔基连接，包括所说间隔基和羰基碳的X的长度是约3-喹啉羰基的长度或者更小，所说的环结构是5-和6-元环或者一个融合的6，6-或者6，5-元环；和
Z选自于下列基团
(a)Xaa-NCy1，其中Xaa是Val，Ile，Leu或者具有一个含1或者2个融合的芳香环的侧链的氨基酸残基，NCy1是一个含有环的基团，该基团具有一个位于环上的氮原子，该氮原子与Xaa的α-羧基形成一个酰胺键，并且NCy1的环包括所说环上氮原子在内含有5-或6-个原子；和
(b)NCy2，其中所说的氮原子是环基团的胺取代基，该氮原子与所说Asp的α-羧基基团形成一酰胺键，该胺取代基与一个6-或者7-元环键合，或者与一个融合的6，6-或者6，7-员内酰胺环体系键合，其中所说携带胺取代基的环是饱和的并且在所说内酰胺的羰基的α位上含有胺取代基；
在一个体外检测试验中，所说的通式I的肽抑制Jurkat细胞(ATCC TIB 152)与固相结合的SEQ ID NO：1的肽结合，所说的检测试验是在pH值为7.2-7.4的含水缓冲液中进行的，其抑制程度是由SEQ ID NO：3的肽显示的抑制所说结合的程度约10至约3000倍。
8、根据权利要求7所说的肽，其中所说X基团的环结构含有一个芳香环。
9、根据权利要求8所说的肽，其中所说芳香环被一个C1-C2烷基或者羟基基团所取代。
10、根据权利要求8所说的肽，其中Z是Xaa-NCy1。
11、根据权利要求10所说的肽，其中Xaa是具有一个侧链的氨基酸残基，该侧链含有一或二个融合的芳香环。
12、根据权利要求7所说的肽，其中Z是Xaa-NCy1，Xaa是其侧链有一或二个融合的芳香环的氨基酸残基。
13、根据权利要求12所说的肽，其中NCy1的环被一或二个选自下列基团的取代基所取代，所说取代基包括羧基，C1-C4亚烷基羧基，羧酰胺，C1-C4亚烷基羧酰胺，羟基，羟甲基，(CH2CH2O)nH，其中n是1，2或3，和C1-C4烷基。
14、根据权利要求7所说的肽，其中Z是NCy2。
15、根据权利要求12所说的肽，其中NCy2选自于下列组：苄基酰氨基，苯乙基酰氨基，2-(N-吗啉基)-乙基酰氨基，N-羧酰氨基甲基-N-(3-己内酰氨基]酰氨基，N-(3-己内酰氨基)酰氨基，N-(3-戊内酰氨基)酰氨基，N-2-(4-吗啉基)乙基-N-(2-氧代-四氢喹啉-3-基]酰氨基，以及N-(2-氧代-四氢喹啉-3-基)酰氨基基团。
16、根据权利要求7所说的肽，其中X是具有一个环状侧链的氨基酸残基。
17、根据权利要求16所说的肽，其中X氨基酸残基的α氨基的氮原子被C1-C6酰基基团酰基化。
18、如下通式的肽
Ar-Y-C(O)-Leu-Asp-Xaa-NCy1
其中Ar是吡唑基，苯基，吡啶基，或者3-喹啉基；
Y是一个间隔基，它可以不存在，或是-CH2-，-CH(NH)-，-O-或者-NH-；
或者Ar-Y-C(O)-与所说Leu的氮原子一起形成一个苯二甲酰亚氨基，1，2，3，4-四氢喹唑啉-2，4-二酮-3-基或者5-phenyldantoin-3-基，和
Ar-Y-C(O)-具有约3-喹啉羰基的长度或者更短；
Xaa是一个芳香族氨基酸残基；和
NCy1是一个含有胺的5-或6元环基团，其中所说的氮原子位于环上并且与Xaa的α-羧基形成一个酰胺键。
19、根据权利要求18所说的肽，其中Y为不存在。
20、根据权利要求18所说的肽，其中Xaa选自下列组：苯丙氨酰基，色氨酰基，酪氨酰基。
21、根据权利要求18所说的肽，其中Ar-Y-C(O)-是选自于下列基团的取代基，苯甲酰基，苯乙酰基，3-吡啶羰基，4-吡啶羰基，3-吡啶乙酰基，苯氧基羰基，苯胺基羰基，吡唑羰基，色氨酰基和3，4-二羟基苯甲酰基。
22、根据权利要求18所说的肽，其中NCy1选自于下列基团：吗啉酰氨基，硫代吗啉酰氨基，4-(噻二氧代)哌啶酰胺，哌啶酰氨基，4-取代的哌啶酰氨基其取代基选自于下列组：羟基，氨甲酰基和羧基，L-2-(羧酰胺)吡咯烷酰氨基，D-2-(羧酰胺)吡咯烷酰氨基，吡咯烷酰氨基，3，4-二羟基-吡咯烷酰氨基，2-(羟甲基)吡咯烷酰氨基，哌嗪酰氨基和4-取代的哌嗪酰氨基其取代基选自于下列组：羧甲基，羧酰氨基甲基，(5-羟乙烯氧基-亚乙基)和p-甲苯亚磺酰氨基。
23、根据权利要求22所说的肽，其中Ar-Y-C(O)-与所说Leu的氮原子形成一个苯二甲酰亚氨基。
24、下列通式的肽
苯乙酰基-Leu-Asp-Phe-NCy3
其中NCy3选自于下列组：吗啉酰氨基，硫代吗啉酰氨基，4-(噻二氧代)哌啶酰胺，D-2-(羧酰氨基)-吡咯烷酰氨基，哌啶酰氨基，4-取代的哌啶酰氨基其取代基选自于下列组：羟基，氨甲酰基和羧基，哌嗪酰氨基和4-取代的哌嗪酰氨基其取代基选自于下列组：羧甲基，羧酰氨基甲基，(5-羟乙烯氧基亚乙基)和p-甲苯亚磺酰氨基，以及吡咯烷酰氨基。
25、一种治疗纤维蛋白连接素CS-1/VLA-4-介导的炎症的方法，该方法包括给具有所说炎症的哺乳动物施用减少炎症所需量的下列通式的肽
  X-Leu-Asp-Z
其中
X是一个以酰胺键连接到Leu的氮原子上的基团，所说X基团具有键合到所说酰胺键的羰基碳上的环结构，所说的键合通过一个具有0-约2个亚甲基长度的间隔基连接，包括所说间隔基和羰基碳的X的长度是约3-喹啉羰基的长度或者更小，所说的环结构是5-和6-元环或者一个融合的6，6-或者6，5-元环；和
Z选自于下列基团
(a)Xaa-NCy1，其中Xaa是Val，Ile，Leu或者具有一个含1或者2个融合的芳香环的侧链的氨基酸残基，NCy1是一个含有环的基团，该基团具有一个位于环上的氮原子，该氮原子与Xaa的α-羧基形成一个酰胺键，并且NCy1的环包括所说环上氮原子在内含有5-或6-个原子；和
(b)NCy2，其中所说的氮原子是环基团的胺取代基，该氮原子与所说Asp的α-羧基基团形成一酰胺键，该胺取代基与一个6-或者7-元环键合，或者与一个融合的6，6-或者6，7-员内酰胺环体系键合，其中所说携带胺取代基的环是饱和的并且在所说内酰胺的羰基的α位上含有胺取代基；
在一个体外检测试验中，所说的通式I的肽抑制Jurkat细胞(ATCC TIB 152)与固相结合的SEQ ID NO：1的肽结合，所说的检测试验是在pH值为7.2-7.4的含水缓冲液中进行的，其抑制程度是由SEQ ID NO：3的肽显示的抑制所说结合的程度约10至约3000倍。
26、根据权利要求25所说的方法，其中所说的CS-1介导的炎症是哮喘。
27、根据权利要求26所说的方法，其中所说的给药是吸入方法。
28、根据权利要求25所说的方法，其中所说的给药是通过非肠道的方法。
29、根据权利要求25所说的方法，其中所说的CS-1介导的炎症是类风湿性关节炎或者骨关节炎。
30、根据权利要求25所说的方法，其中所说的CS-1介导的炎症是同体移植排异性。
31、根据权利要求25所说的方法，其中所说的CS-1介导的炎症是皮肤炎症。
32、根据权利要求25所说的方法，其中所说的CS-1介导的炎症是中枢神经系统脱髓鞘疾病。
33、一种药物组合物，包括溶于或分散于药物学上可接受的稀释剂中的减少炎症所需量的一种肽，所说的肽具有下列的通式
X-Leu-Asp-Z
其中
X是一个以酰胺键连接到Leu的氮原子上的基团，所说X基团具有键合到所说酰胺键的羰基碳上的环结构，所说的键合通过一个具有0-约2个亚甲基长度的间隔基连接，包括所说间隔基和羰基碳的X的长度是约3-喹啉羰基的长度或者更小，所说的环结构是5-和6-元环或者一个融合的6，6-或者6，5-元环；和
Z选自于下列基团
(a)Xaa-NCy1，其中Xaa是Val，Ile，Leu或者具有一个含1或者2个融合的芳香环的侧链的氨基酸残基，NCy1是一个含有环的基团，该基团具有一个位于环上的氮原子，该氮原子与Xaa的α-羧基形成一个酰胺键，并且NCy1的环包括所说环上氮原子在内含有5-或6-个原子；和
(b)NCy2，其中所说的氮原子是环基团的胺取代基，该氮原子与所说Asp的α-羧基基团形成一酰胺键，该胺取代基与一个6-或者7-元环键合，或者与一个融合的6，6-或者6，7-员内酰胺环体系键合，其中所说携带胺取代基的环是饱和的并且在所说内酰胺的羰基的α位上含有胺取代基；
在一个体外检测试验中，所说的通式I的肽抑制Jurkat细胞(ATCC TIB 152)与固相结合的SEQ ID NO：1的肽结合，所说的检测试验是在pH值为7.2-7.4的含水缓冲液中进行的，其抑制程度是由SEQ ID NO：3的肽显示的抑制所说结合的程度约10至约3000倍。
34、根据权利要求33所说的药物组合物，其中所说的X基团的环结构含有一个芳香环。
35、根据权利要求33所说的药物组合物，其中Z是Xaa-NCy1。
36、根据权利要求33所说的药物组合物，其中Z是Xaa-NCy1，Xaa是其侧链有一或者二个融合芳香环的氨基酸残基。
37、根据权利要求36所说的药物组合物，其中X具有下列通式
Ar-Y-C(CO)-
其中Ar是吡唑基，苯基，吡啶基，或者3-喹啉基；
Y是一个间隔基，它可以不存在，或是-CH2-，-CH(NH)-，-O-或者-NH-；
或者Ar-Y-C(O)-与所说Leu的氮原子一起形成一个苯二甲酰亚氨基，1，2，3，4-四氢喹唑啉-2，4-二酮-3-基或者5-phenyldantoin-3-基，和
Ar-Y-C(O)-具有约3-喹啉羰基的长度或者更短；
38、根据权利要求37所说的药物组合物，其中Ar-Y-C(O)-是苯乙酰基，Xaa是Phe，NCy1是选自于下列组的基团的NCy3：吗啉酰氨基，硫代吗啉酰氨基，4-(噻二氧代)哌啶酰胺，D-2-(羧酰氨基)-吡咯烷酰氨基，哌啶酰氨基，4-取代的哌啶酰氨基其取代基选自于下列组：羟基，氨甲酰基和羧基，哌嗪酰氨基和4-取代的哌嗪酰氨基其取代基选自于下列组：羧甲基，羧酰氨基甲基，(5-羟乙烯氧基亚乙基)和p-甲苯亚磺酰氨基，以及吡咯烷酰氨基。
CN94194969A 1993-12-06 1994-12-05 Cs-1模拟肽，利用该肽的组合物和方法 Pending CN1142832A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16410193A 1993-12-06 1993-12-06
US08/164,101 1993-12-06
US34902494A 1994-12-02 1994-12-02
US08/349,024 1994-12-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1142832A true CN1142832A (zh) 1997-02-12

Family

ID=26860265

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN94194969A Pending CN1142832A (zh) 1993-12-06 1994-12-05 Cs-1模拟肽，利用该肽的组合物和方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US6117840A (zh)
EP (1) EP0737204A4 (zh)
JP (1) JPH09509146A (zh)
CN (1) CN1142832A (zh)
CA (1) CA2177840A1 (zh)
NZ (1) NZ277206A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110423265A (zh) * 2019-04-03 2019-11-08 中国药科大学 一种环肽类trf2抑制剂的制备方法和用途

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5871734A (en) * 1992-01-13 1999-02-16 Biogen, Inc. Treatment for asthma with VLA-4 blocking agents
SK9192000A3 (en) * 1997-12-17 2001-03-12 Merck & Co Inc Integrin receptor antagonists
US6586403B1 (en) * 2000-07-20 2003-07-01 Salpep Biotechnology, Inc. Treating allergic reactions and inflammatory responses with tri-and dipeptides
US7153835B2 (en) * 2002-02-04 2006-12-26 Salpep Biotechnology, Inc. Anti-inflammatory peptides
CN1930183B (zh) * 2003-08-13 2010-12-29 康哲医药研究(深圳)有限公司 包含苯丙氨酰-谷氨酸及苯丙氨酰-谷氨酰-谷氨酸的生物活性肽

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0031237B1 (en) * 1979-12-19 1984-10-17 National Research Development Corporation Quinazoline derivatives, processes for their preparation, compositions containing them and their use as anti-cancer agents
FR2575163B1 (fr) * 1984-12-20 1987-03-20 Sanofi Sa Tri- et tetrapeptides reduits inhibiteurs de la secretion gastrique, procede d'obtention et compositions pharmaceutiques les contenant
US4822606A (en) * 1986-04-07 1989-04-18 Duke University Immunosuppressive synthetic peptides and analogs thereof based on retroviral envelope sequences
US5294551A (en) * 1987-08-25 1994-03-15 Regents Of The University Of Minnesota Cell culture substrate coated with polypeptides having fibronectin activity
US5340802A (en) * 1989-06-30 1994-08-23 Abbott Laboratories Peptide analog type-B CCK receptor ligands
IE902238A1 (en) * 1989-06-30 1991-01-16 Abbott Lab Tetrapeptide type-b cck receptor ligands
JP2717602B2 (ja) * 1990-01-16 1998-02-18 富士写真フイルム株式会社 感光性組成物
AU1221292A (en) * 1991-02-07 1992-09-07 Victoria University Of Manchester, The New cell adhesion peptides
AU3420693A (en) * 1991-12-24 1993-07-28 Fred Hutchinson Cancer Research Center Competitive inhibition of high-avidity alpha4-beta1 receptor using tripeptide ldv

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110423265A (zh) * 2019-04-03 2019-11-08 中国药科大学 一种环肽类trf2抑制剂的制备方法和用途

Also Published As

Publication number Publication date
JPH09509146A (ja) 1997-09-16
CA2177840A1 (en) 1995-06-15
EP0737204A1 (en) 1996-10-16
NZ277206A (en) 1997-11-24
US6117840A (en) 2000-09-12
EP0737204A4 (en) 1999-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1195778C (zh) 细胞粘附抑制剂
CN1114961A (zh) 细胞粘连肽抑制剂
Sillerud et al. Design and structure of peptide and peptidomimetic antagonists of protein-protein interaction
US5192746A (en) Cyclic cell adhesion modulation compounds
US5811391A (en) Cyclic CS-1 peptidomimetics, compositions and methods of using same
CN1161152C (zh) 用于抑制血管生成的方法和组合物
US5510332A (en) Process to inhibit binding of the integrin α4 62 1 to VCAM-1 or fibronectin and linear peptides therefor
AU693143B2 (en) CS-1 peptidomimetics, compositions and methods of using the same
CN1313146C (zh) 用于抑制αvβ5介导的血管生成的方法和组合物
CN1203087C (zh) 因子VIIa抑制剂
CA2204793A1 (en) Fibronectin adhesion inhibitors
CN1226172A (zh) 用于抑制血管发生的方法和组合物
CN1226254A (zh) 用于抑制αV、β5介导的血管发生的方法和组合物
CN1150206C (zh) 含有n-取代甘氨酸的血管舒缓激肽拮抗剂肽
CN1187490A (zh) 用作白细胞粘合抑制剂和vla－4拮抗剂的5－元杂环化合物
CN1041950A (zh) 新型肽酶抑制剂
EP0769958A1 (en) Inhibitors of leukocyte adhesion
CN1561344A (zh) 血管生成抑制三肽、组合物及其使用方法
CN1311796A (zh) 肽类抗血管生成药
CN1125054C (zh) 新的咪唑啉衍生物、它们的制备方法、用途以及含有它们的药物制剂
CN101029080A (zh) 用于对iap抑制卡斯蛋白酶进行去阻遏的方法及组合物
CN1491942A (zh) N-[n-n-(4-（哌啶-4-基)丁酰基)-n-乙基甘氨酰基]化合物的不吸湿的稳定结晶形式
CN1142832A (zh) Cs-1模拟肽，利用该肽的组合物和方法
CN1856504A (zh) 抗梗塞分子
CN1237075C (zh) 用作层粘连蛋白/巢蛋白相互作用抑制剂的低分子量肽衍生物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication