CN1125341C - 用于目视检测条的化学计时器及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

一种用于直接读数的试剂检测条的化学计时器在涂上生物体液之后预定的时间变色。该检测条测量生物体液中被分析物的浓度。计时器是一干燥涂层，其组成为一种指示剂、一种水合后能与萄萄糖反应使指示剂变色的含酶试剂、一种抑制指示剂变色的抑制剂、葡萄糖、且可选一种不与试剂中的酶反应的醛糖。优选在涂层中含过量的试剂与萄萄糖，而且计时器变色所需的时间能由抑制剂浓度控制。醛糖使计时器稳定，很可能是通过干扰干燥状态下萄萄糖的糖基化反应而发挥其作用的。

Description

用于目视检测条的化学计时器及其制备和应用
技术领域
本申请是1995年3月27日提交的美国未决申请411,238号的部分继续申请。
本发明涉及用化学方法检测时间间隔的装置；更确切地说，是检测条测量出生物溶液中被分析物的浓度的时间间隔。
背景技术
为测量生物溶液中某种被分析物的浓度，人们研究了很多目测装置。例如，这些装置已用于测量血液、尿或唾液中的葡萄糖、胆固醇、蛋白质、酮、苯丙氨酸或酶。
含有酶组合物的干相试剂条在临床实验室、医生办公室、医院及家庭中广泛用来检测生物体液试样中的葡萄糖浓度。实际上，试剂条已经成为很多国家的数百万糖尿病患者每日的必需品。由于糖尿病能引起血液化学上危险的异常变化，因此会导致视觉丧失、肾功能衰竭及其它严重的医学后果。为减少产生这些后果的风险，大多数糖尿病人必须定期进行自我检测，并据此调节体内的葡萄糖水平，例如可通过控制饮食和/或注射胰岛素。一些病人对血糖浓度的检测次数可达每日四次或更多。
糖尿病人必须控制饮食，以调节糖的摄入和/或指导胰岛素的注射，还必须在这方面接受经常进行的血糖浓度检测结果的指导，对于他们来说，尤为重要的是拥有快速、廉价、精确的测定葡萄糖的试剂条。
已知试剂条含有一种指示剂，该指示剂根据涂在试剂上的生物体液中葡萄糖浓度的不同而显示不同的色调。一些试剂条用到化学的还原反应，不过更普遍的情况是涉及一种可氧化的染料或染料对。某些试剂条含有一种酶，如葡萄糖氧化酶，它能将葡萄糖氧化为葡糖酸和过氧化氢。试剂条中还含有一种可氧化的染料和一种具有过氧化活性的物质，该物质在过氧化氢的存在下能选择性地催化氧化可氧化的染料。(例如美国专利5,306,623号。)
Hochstrasser于1976年6月22日公布的美国专利3,964,871号公开了一种一次性指示剂条，可直接测量生物体液中的物质、如葡萄糖的浓度。记录物质浓度的指示剂既包括一种指示试剂，它在与被检测物质反应后氧化变色，也包括一种“拮抗剂”，它在一定程度上防止氧化了的指示剂积聚，直至其被完全消耗殆尽时为止。
Palmer等人在1989年5月24日出版的欧洲专利公开申请0317070号中公开了一种葡萄糖及其它被分析物的“数字”定量检测系统(亦见于1991年7月30日公布的美国专利5,036,000号)。该系统测量生物体液中有机化合物浓度，方法是先用一种对有机化合物具有特效作用的氧化酶氧化有机化合物，得到过氧化氢。该系统包括一个发色团为过氧化氢的还原剂，和一个在空气中稳定且具有更大的还原电位的过氧化氢还原剂，在空气中稳定的第一种过氧化氢还原剂被消耗掉以前，更大的还原电势的存在使由发色团引起的任何颜色变化不被检测出来。因此如果所测量的过氧化氢低于一个预定水平，该水平是相应于空气中稳定的过氧化物还原剂浓度的，那么结果是没有颜色变化。所以该系统定量测量浓度，而不依赖于颜色变化的强度。
Ismail等人在1987年3月10日公布的美国专利4649122中公开了一种生活力检测装置，该装置可确认用于检测被分析物浓度的受试组合物是否还具有生活力。通过润湿该装置来测量生活力。用水润湿后，检测条变色或发生其它改变，使用户确认检测条是具有生活力的。
White-Stevenx和Stover在《临床化学》1982年28卷4期589-595页中讨论了抗坏血酸对诊断检测的干扰作用。在使用了过氧化酶和氧化还原指示剂的检测中，抗坏血酸延迟了颜色的形成。
无论检测是在家庭、医生办公室、诊所还是在医院中进行，葡萄糖测定的精确性与再现性极为重要。如果是指示颜色变化的试剂条，就需要变色显著，而且对生物体液中所含有的葡萄糖以外的化合物的变化不敏感。虽然因给定波长吸光度的变化而产生的变色对于仪器测量的试剂条的精确性来说也是很重要的，但如果是目测试剂条，尤为重要的是，视力也许很差的糖尿病人应拥有一种检测试剂，该试剂依据葡萄糖浓度的不同而发生显著的颜色变化。
发明内容
由于变色涉及一系列化学反应，它就不是瞬时发生的。因此用户必须为反应的发生等上一段时间—一般为一分钟或不到。当用仪器读取试剂条时，计时器电路会给出一个显示反应完成的信号。不过，当试剂条为目测而不用仪器时，用户可能低估了反应所需的时间，过早读数，而得到不正确结果。或者，用户可能认为有必要等上足够的时间再进行读数，以确定反应完全，于是造成不必要的耽搁，用户也会感到不甚满意。因此需要一种“化学”计时器，也就是检测条上的一个元件，其变色与试样中葡萄糖(或其它所研究的被分析物)浓度无关，但是变色仅在一段时间过去以后才发生，这段时间足以完成与试样的产色反应。按照本发明，目视检测条在测量生物体液中被分析物浓度时，其化学计时器能使检测条用户确信，他或她已等候了足以得到正确的读数的时间，而无需用户再等候过长时间。化学计时器包括下列物质的干燥涂层，
a)一种显色指示剂组合物，
b)一种含酶试剂，当它形成水合物后，能与葡萄糖反应，使指示剂变色，
c)一种抑制剂，能抑制指示剂颜色上的改变，
d)葡萄糖，和
e)一种醛糖，基本上不与试剂中的酶反应，
其中干燥涂层中的抑制剂与葡萄糖的浓度选择，要使得葡萄糖在生物体液试样点在检测条上之后的预定时间内与试剂反应，以使指示剂变色。我们说指示剂“显色”，并非指定不是白色；实际上在优选的实施方式中，白色是指示剂水合之前的颜色。
在本发明的另一个实施方案中，测量点在目视检测条上的生物体液中被分析物浓度所用化学计时器的制备方法包括下列步骤：
a)在多孔膜上涂覆一层含酶试剂的溶液，当该含酶试剂形成水合物后能与葡萄糖反应，生成一反应产物；
b)将涂层干燥，形成第一层，然后
c)在第一层上涂第二层，第二层含有
i)一种指示剂，能与上述反应产物反应，引起变色，
ii)一种抑制剂，抑制指示剂颜色上的改变，
i)葡萄糖，和
iv)一种醛糖，基本上不与试剂中的酶反应。“基本上不与试剂中的酶反应”这样一种措词，用在本说明书和权利要求书中，意思是说与葡萄糖相比，与酶反应的程度要低得多；也就是说，不到葡萄糖反应能力的10％。
检测条以可见方式显示出点在检测条“样本面”的生物体液中所含有的被分析物浓度。结果在检测条的另一面(“检测面”)可见地显示出来。从液体样本点在样本面到在检测面看到相应的结果显示—一般为变色—之间通常存在一个延迟时间。因此，除非用户至少在等上最短一段时间以后再进行读数，否则读数值也许不正确。而且，正确的最小延迟时间还会受到环境或检测条化学的影响而改变，如环境温度或老化作用。本发明的化学计时器在液体样本点在检测条上之后经过足够长的时间给用户提供可见的显示。
检测条的化学组成自然要取决于所测量的被分析物/生物体液。可将检测条设计为能检测生物体液如血液、尿和唾液以及水中的葡萄糖或其它糖类、醇、胆固醇、蛋白质、酮、尿酸、苯丙氨酸或酶等被分析物。试剂检测条的化学计时器一般可以但不是必需采用与试剂检测条本身相同的被分析物/生物体液组合。例如，如果检测条用于测量全血中的醇成分，它实际上可以在其化学计时器中不包含醇和用于醇与检测条试剂之间的显色反应的抑制剂。这种情况下，计时器可能含有葡萄糖、与葡萄糖反应形成可区别颜色的试剂、和该反应的抑制剂。当血液点在检测条上，计时器被水合，并在一定时间后变色，这段延迟时间持续的长短取决于抑制剂的浓度。当然，有必要使葡萄糖反应时间能调整为适用于醇检测条，这样，“葡萄糖计时器”就适用于“醇检测条”了。为方便和简洁起见，本说明书详尽公开了计时器与试剂检测条用于检测血液中的葡萄糖。本领域的普通技术人员很容易将本文公开的信息用于检测其它被分析物/生物体液组合。
本发明的指示剂条提供了一种相对简便、快速的血糖浓度测定方法。它包括一个多孔基体，该基体具有一个样本面和一个检测面。通常基体为一种膜，这两种提法在本说明书及权利要求书中可互换使用。涂在基体上的检测试剂或多或少地浸润在基体孔中。为简化计，在本说明书及权利要求书中我们将基体上的试剂称为“涂层”，这是考虑到试剂涂层在一定程度上渗入了基体。基体接受点在样本面的未经测量的全血样本，该全血样本中含有红细胞和葡萄糖。基体的多孔性使液体从样本面到达检测面。例如借助于毛细管作用。于是检测试剂能与血液中的葡萄糖反应，在检测面或附近发生变色。由于红细胞具有明显的颜色，可能会给检测变色带来较大困难，因此基体孔径从样本面至检测面逐渐减小，这样在远离检测面处就可以截获红细胞。有多种材料可用于本发明的指示剂条及计时器的各种部件。其中一些材料公开在Kiser等人于1994年4月26日公布的美国专利5,306,623号中，结合在此作为参考。
检测试剂含有一种将葡萄糖转化为过氧化氢的成分，如葡糖氧化酶，和一种或几种用于检测由样本中存在的葡萄糖产生的过氧化氢的成分。检测过氧化氢的成分可以是一种过氧化酶，优选辣根过氧化酶，以及一种在反应过程中变色的“指示剂”。指示剂可以是一种可氧化染料或染料对。在过氧化氢的存在下，过氧化酶催化指示剂的氧化反应。试剂检测条涂层的最后一种成分是抑制剂，它延缓指示剂变色的氧化反应的进行。
在优选的实施方式中，指示剂条沿径向分段，使其相邻的节段具有不同的指示剂/抑制剂平衡。我们把这些节段称为“结果节段”。当存在足够的葡萄糖，首先使所有抑制剂都用完，其次氧化指示剂产生特有的颜色变化，某一结果节段才会变色。因此某一结果节段变色，表示出了最初的血样中葡萄糖的临界浓度。沿检测条的特定方向，每一个连续的结果节段都有相应于逐步升高的临界葡萄糖浓度的抑制剂/指示剂平衡。这一点是可以做到的，比如，所有节段的指示剂浓度都相同，而每个连续节段都具有比前一个节段逐步升高的抑制剂浓度。显然，其它抑制剂/指示剂平衡也是可能的。
如果结果节段的指示剂/抑制剂浓度范围对某一特定试样来说是适当的，邻近的节段与被分析物反应导致一个结果节段显色而相邻的节段不显色。此结果说明，样本中的葡萄糖浓度至少等于显色节段变色所需的临界浓度，但小于相邻节段变色所需的临界浓度。计时器涂层中含有指示剂条—上涂检测试剂的多孔基体—的成分，此外还含有葡萄糖。优选地，计时器中葡萄糖含量大大超过克服抑制剂作用所需的量。这种情况下，变色(在样本与计时器涂层发生水合作用之后)所需的时间长短，取决于抑制剂存在的多或少。检测条和计时器上的颜色变化，既可以直接用眼观测，也可以使用检测反射光变化的光学仪器。
理论上，试剂的化学状态在干燥时非常稳定，也不被计时器涂层中的葡萄糖所活化。不过如上所述，计时器即使保持干燥状态也不十分稳定。反而是在计时中的葡萄糖与小分子蛋白质之间形成稳定的化合物，也许还会在葡萄糖与涂层中的酶之间形成稳定的化合物。为防止上述糖基化反应对葡萄糖的消耗，可加入一种稳定剂。该稳定剂的糖基化作用比葡萄糖更强，但不与葡糖氧化酶反应。
计时器产生结果显示所需时间受到检测条参数的影响，后者同样影响产生可见的葡萄糖浓度显示所需时间。因此，如果环境温度较低或者检测条成分老化延长了正确测定葡萄糖浓度所必需的时间，也会使化学计时器显示结果的时间延长。最后还有一点，如果对检测条进行了误操作—如暴露在潮湿环境中—使检测条在使用前即发生标志着化学计时器反应完成的变色，用户应当留心，检测条已经不够精确，无法使用。
图1为本发明的直接读数的试剂检测条基体的透视图。
图2为本发明的直接读数的试剂检测条检测面的平面图。
图3为图2的检测条样本面的平面图。
本发明的计时器用化学方法测量预定的时间间隔。尤其是指测定生物体液中被分析物浓度的目视检测条。该检测条含有一种多孔基体，其上结合了一种检测试剂，该检测试剂产生与点在试剂上的生物体液样本中被分析物相应的颜色变化。
基体可以是均一的组合物，或是涂层的底物，可以是各向同性的或是各向异性的。它具有一个样本面，供上样之用，和一个检测面，进行变色观测。基体优选一种各向异性的膜；更优选具有较大范围孔径的各向异性膜。例如，延伸至整个基体的孔径梯度从约0.1微米至约150微米。在大孔一端，孔径范围更优选约30微米至约40微米。在基体孔径最小的一端，空体积相对较小，膜材料密度一般相当大，一层结构占到膜厚度的10％-20％。该层孔径范围优选为约0.1至约0.8微米，标准孔径优选为约0.3微米。生物体液点在样本面上后，在它渗入膜时会遇到不断变小的孔。最终，如红细胞等的固体成分到达膜中的某个位置后就不能进一步渗入了。标本的其余部分含有溶解的葡萄糖，渗入到达检测面。膜的各向异性和/或基体中分离成分的使用(详见下文)使这部分成分以相对较快的流速流经膜，即使同时进行固体成分的过滤作用也是如此。
当样本通过基体时，它与试剂的反应使检测面附近的空体积中的光吸收染料生成或分解，于是影响到了基体对光的反射作用。
聚砜和聚酰胺(尼龙)是合适的基体材料。也可使用其它具有类似性质的聚合物。聚合物经改性可引入其它官能团，使其具有荷电结构，因此基体表面可以是中性、阳性或阴性。
形成基体的多孔材料的一种优选的制备方法是不使用载体心层而使聚合物成型。这样一种基体比如购自Memter，Inc.，Tinonium，MD的各向异性聚砜膜。通常使用厚度不到200微米的基体，优选为约115至155微米。特别是当基体为尼龙或各向异性聚砜时，最优选约130至140微米的厚度。基体可选择粘附在一种载体上，使其具有物理形状和刚性，不过这并不是必要的。优选的，载体是将基体夹在中间的热塑片。样本面上的热塑片有一开口，供上样之用。检测面上的热塑片不影响对基体检测面颜色的观察。
用检测试剂处理膜的方法可以是用各种成分的混合物浸渍膜，于是使膜基体饱和。过量试剂可用机械方法除去，如手术刀或玻璃棒。然后将膜干燥。
检测试剂含有(i)一种将葡萄糖转化为过氧化氢的成分，(ii)一种检测过氧化氢的成分，和(iii)一种抑制检测过氧化氢的成分的成分。试剂可进一步选择含有一种分离成分，它能使诸如红细胞的固体成分被粘附或被截获在基体中，有效地除去生物体液中的固体成分。还可包括其它附加成分，详见下文和实施例。
将葡萄糖转化为过氧化氢的成分优选葡糖氧化酶，它是一种来自黑曲霉或青霉属的酶。葡糖氧化酶与葡萄糖及氧反应，生成葡糖酸内酯及过氧化氢。最佳葡糖氧化酶浓度取决于指示剂系统的组成。例如，如果指示剂系统为MBTHSB-ANS(详见下文)，适宜的葡糖氧化酶浓度范围为约500-1000U/ml，更优选为约700-2000U/ml，最优选为约1000U/ml。一般葡糖氧化酶浓度越高，反应进行得越快，反之亦然。
如此产生的过氧经氢与检测过氧化氢的成分反应，该成分含有一种过氧化酶，后者选择性催化过氧化氢与指示剂之间的反应。过氧化酶将过氧化氢作为氧化剂，能除去各种被反应物的氢原子。适宜的过氧化酶可含有正铁血红素，这是一种来自植物的红色氯化血红素。来自动物的过氧化酶也适用，如来自动物的甲状腺。尤其优选辣根过氧化酶(HRPO)作为检测过氧化氢的组成成分。
优选由过氧化酶催化过氧化氢反应直接或间接生成或分解指示剂染料，后者在预定的波长范围内吸收光。优选地，指示剂染料产生强烈吸收的波长不同于检测试剂产生强烈吸收的波长。指示剂的氧化形式可以是有色、浅色或无色的最终产品，该产品在基体的检测面显示颜色变化。也就是说，检测试剂是通过有色区域脱色、或者通过无色区域显色来表明样本中被分析物的存在。
用于本发明的指示剂包括(a)盐酸3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)与3，3-二甲氨基苯甲酸(DMAB)相结合；(b)MBTH与3，5-二氧-2-羟基苯磺酸(DCHBS)相结合；(c)4-氨基安替比林(4-AAP)与5-氧-1-(对磺苯基)-2-吡唑啉-3-羧酸(OPSP)；(d)4-AAP与N-(间甲苯基)-二乙醇胺(NDA)；(e)间2，2′-连氮-二(3-乙基苯并噻唑啉)磺酸(ABTS)；(f)4-AAP与4-甲氧基萘酚；(g)焦棓酚红(PGR)；(h)溴焦棓酚红(BPR)；(i)酸性绿25(AG)；或(j)[3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙]N-磺酰基苯磺酸一钠(MBTHSB)，与8-苯胺基-1-萘磺酸铵(ANS)相结合。优选MBTHSB-ANS。有关MBTHSB-ANS的其它信息见1995年9月7日提交的未决PCT申请US95/12091号，结合在此作为参考。
起抑制作用的成分延迟了过氧化氢与染料或染料前体的反应，例如通过还原过氧化氢或还原已氧化了的染料。抑制剂的作用原理有两种不同的作用方式。一是抑制剂与指示剂竞争，使指示剂发生变色的速度减慢。另一种方式是抑制剂不与指示剂竞争，因此在指示剂发生真正变色之前抑制剂实际上已经被消耗掉了。本发明的抑制剂作用机制优选后者。
适用的抑制剂包括2，3，4-三羟基苯甲酸；棓酸丙酯；3，4-二羟基肉桂酸；3，4-二羟基苯甲醛；棓酸；5，6-二氨基尿嘧啶；抗坏血酸；和异抗坏血酸。优选抗坏血酸；不过，抗坏血酸在水溶液中会起氧化反应。为还原氧化反应，可使用其它溶剂。优选的溶剂为伯醇，如乙醇、甲醇或异丙醇。优选乙醇，特别是其浓缩的溶液；也就是说，乙醇含量为50％以上。
尽管基体所优选的各向异性膜可以滤除红细胞并将它们留在远离检测面之处，检测试剂也可选择含有一种分离成分。分离成分通过在基体中螯合红细胞，能从含有红细胞的液体、即全血得到相对无色透明的液体。用于本发明的分离成分包括但不限于聚乙二醇、聚(甲基乙烯基醚/马来)酐、聚丙二醇、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸、聚乙烯醇、和聚乙烯磺酸，它们的pH在约4.0-8.0之间。这些分离成分在基体中的含量将依据其电荷及分子量、嵌入基体的其它成分、基体的pH及孔径、和基体干燥后的残余水分而变化。这些参数对本领域技术人员来说很容易确定。例如，若使用聚丙二醇作为分离成分，(如BASF，Wyandotte，MT出品的PPG-410)，含量优选2-30％重量体积比(w/v)，更好的优选为8-10w/v。其它分离成分的使用浓度也可为2-30％w/v。聚合的分离成分可渗入或嵌入基体中。某些水溶性盐也对分离作用有效。适用于分离血液成分的盐有柠檬酸盐、富马酸盐、和硫酸盐，某些酸也可用，如氨基酸、柠檬酸、肌醇六磷酸、和马来酸。(例如参见M.C.Fetter于1971年1月5日公布的美国专利3,552,928号)含有分离成分的一个有利之处在于由于固体成分如红细胞已基本上从生物体液中除去，使检测位置的背景颜色较少，不致于使由检测试剂产生的变色模糊不清。
基体中还可以嵌入其它成分，以提高试剂条的显色作用及可读性，保持基体的均一性及完整性。例如，检测试剂可包括盐和/或缓冲系，以使有助于分离基体中的染料。此缓冲系列如可含有柠檬酸，其在溶液中的含量为约0.01M至约1.0M，优选为约0.1M。也可使用其它酸性缓冲系。
也可使用使基体具有吸水性的化合物或起到稳定剂作用的化合物，如水解蛋白。此类化合物包括但不限于来自CROTEIN SPA(CRODA，Inc，NewYork，N.Y.)的牛血清蛋白、多肽及小分子蛋白质，此类化合物的使用浓度为约1.0mg/ml至约100.0mg/ml。若用CROTEN，优选20mg/ml。
基体涂层中也可包括其它稳定剂和防腐剂。如乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、及有关化合物；其使用浓度例如为约0.01mg/ml至约10.0mg/ml。防腐剂的目的之一是有助于使抑制剂保持稳定。
某些指示剂(如BPR)在基体中具有不必要的迁移趋势。如果使用这样一种指示剂，就要用一种离子对试剂来防止该迁移作用。例如，特别选用聚乙二醇衍生物商品POLYQUART(H)(Henkel，Inc.Ambler，PA)，它能促进指示剂与其它基体取代基之间形成离子对。
当通过显色反应显示出存在有被分析物(如MBTHSB-ANS)时，可加入表面活性剂，使颜色增强，提高与周围颜色的对比。
本发明在实施中也可使用有机溶剂，并可以将其包括在基体的检测试剂的配方之中，当然只要它与基体及检测试剂成分的性质相容。可能适用的有机溶剂包括氯仿、丙酮、醇、二氯甲烷、乙醚及石油醚、乙腈、及其混合物。本发明在实施中，特别优选70％乙醇水溶液。
涂在基体上或渗入基体中的检测试剂在检测条表面不是均一性的。相反，试剂优选地在基体上涂成一系列平行的条带，或称“结果节段”，其中相毗邻的结果节段的组合物中抑制剂浓度逐步升高。因此每一个连续节段需要样本中逐步增大的葡萄糖浓度，才能使节段变色。
基体的计时器节段涂上一种组合物，或用组合物渗入节段中，该组合物由检测试剂以及葡萄糖和一种醛糖组成，该醛糖不与试剂中的酶反应。加入葡萄糖的目的是使计时器节段在被加入到检测条上的含水样本水合之后发生变色。加入醛糖是为了使计时器节段稳定。我们并不希望拘泥于任何特定的理论，不过我们相信，需要加入醛糖是为了许多单糖与蛋白质中的氨基形成稳定的共价配合物的缘故。因此，计时器中某些葡萄糖可能与小分子蛋白质反应，也许还与检测试剂中的酶反应生成配合物。该过程(“糖基化作用”)无需酶的参与，分两步进行。第一步是可逆的，生成一种席夫碱，这是醛中糖的一种醛亚胺。在该醛亚胺转化为酮胺后，由于后者高度稳定，是不可逆的。
为防止在糖基化作用过程中葡萄糖被消耗，相信这种情况相是会发生在计器中的，因此我们将一种糖用作稳定剂，它是一种更有效的糖基化试剂，可成功地与葡萄糖竞争蛋白质上的氨基。也有必要使用一种不与葡糖氧化酶反应的糖，原因是显而易见的。
Bunn和Higgins发表在《科学》213，222(1981年7月10日)上的文章中称他们发现，单糖的糖基化作用的效率与溶液中糖的比例有关，该糖呈直链醛构型。摘自该文中的表1列出了一些醛糖与血红蛋白的反应速率，以k表示，所有这些醛糖都不与葡糖氧化酶发生反应。k值在理论上应尽可能地高，无论如何应高于葡萄糖的k值。实际上，稳定剂必须比葡萄糖更易于与蛋白质的氨基部分反应，否则，氨基部分将与葡萄糖反应并耗尽葡萄糖。因此稳定剂的含量应当足以能与所有这些氨基部分反应(也就是说，稳定剂至少与氨基部分具有相等的克分子数)。优选加入过量的稳定剂，尤其是当其k值仅仅比葡萄糖稍高一点的时候。这种情况下没有明显的葡萄糖消耗。根据上述标准，将甘露糖和半乳糖确定为合适的稳定剂。因为它们既廉价又易得，优选使用它们。
                表1醛  糖                       反应速率(k)D-葡萄糖                        0.60D-甘露糖                        3.26-脱氧-L-甘露糖(岩藻糖)         0.7D-阿洛糖                        1.4D-半乳糖                        2.8D-木糖                          2.9D-塔罗糖                        5.2D-阿卓糖                        5.0D-核糖                          10.0D-艾杜糖                        555，6-二-O-甲基-D-葡萄糖         104
检测试剂根据葡萄糖的存在而变色。因此在将葡萄糖与试剂组合在计时器中而不使其发生变色，在操作上需加小心。应使抑制剂的含量超过计时功能所需的量，以抵消上述影响。在涂上含有葡萄糖的溶液后，控制计时节段的干燥速率。实际操作中，首先将膜涂上含有缓冲系和酶的溶液，再将此涂层干燥形成第一层。然后涂第二层，溶液中含有指示剂、抑制剂、葡萄糖或醛糖。参数已预先设置好，如织物速率、烘箱温度和空气流量、以及涂层溶液的沉淀量，并适当调整抑制剂和/或葡萄糖浓度。如果不涂上第二层，另一种不太常用的做法是在一单独织物上制成第二涂层，叠合在第一层上。
样本点到检测条上时，计时器节段组合物发生水合作用，使显色反应开始进行。然后借助温度和检测试剂的性质，特别是抑制剂浓度、葡萄糖含量、水合速率及氧扩散速率来测定计时器节段变色所需的时间。
计时器变色时间取决于样本中葡萄糖浓度，也可以与该浓度无关。计时器中加入极过量的葡萄糖，变色时间就基本上与样本的葡萄糖浓度无关了。计时器中加入少量葡萄糖，变色时间也许就取决样本中的葡萄糖了，也就是说，如果样本中葡萄糖浓度越大，计时器变色越快。优选地，计时器涂层溶液中的葡萄糖浓度大于1500mg/dL，这使计时器基本上与样本葡萄糖浓度无关，无论样本浓度在所需的40-400mg/dL范围之内，还是在该范围以外。其次计时器组合物含有的抑制剂应当至少与具有最高抑制剂浓度的结果节段(与最高葡萄糖读数相对应)所含的同样多或更多。
计时器还发挥了重要的质量控制作用，在检测条因暴露于潮湿环境而被污染时，该作用尤为明显。检测条在使用前必须保持干燥，因为其中将葡萄糖转化为过氧化氢的成分(一般为酶)因暴露于潮湿环境中而易发生降解。因此如果检测条预先暴露于潮湿环境中了，检测结果会变得不可靠。但是用户对检测条的不可靠性不易察觉，可能还会使用它而得到不正确的结果。不过如果检测条含有计时器部分，则暴露于潮湿环境中会引起计时器变色，这样就会给用户发出一个警告：该检测条已坏。
附图说明
现在参考附图对本发明作进一步说明。图1为本发明的用于测量生物体液中被分析物含量的基体10。虽然图中基体10为弓形，不过它具有弹性，在使用时一般是平的。基体包括一个样本面12，供生物体液上样之用，和一个检测面14，其上或附近发生的变色指示存在有被分析物。变色来自被分析物与渗入孔16的试剂之间的相互作用。在测量血糖浓度中，优选样本面12附近的孔径较大，而检测面14的孔径减小。孔径梯度起到在样本面12附近截获红细胞的作用，这样红细胞的颜色就不会干扰对指示被分析物存在的变色的观察。
a、b、c、d是四个示意的结果节段。每一个连续的结果节段所含有的抑制剂比前一个节段逐步增多。因此举例来说，如果样本引起节段a、b、c变色，而d不变色(如图1所示)，这说明样本中葡萄糖浓度至少等于耗尽节段C所含抑制剂所需的葡萄糖浓度，但不足以克服节段d中抑制剂的作用。一旦结果节段固定标准，上述结果可得出葡萄糖浓度的定量测量值。节段t为计时器，除了渗入结果节段中的检测试剂以外，还加入了高浓度的葡萄糖。节段t中抑制剂含量至少等于结果节段，而且耗尽节段t中抑制剂所需时间至少等于耗尽其它节段中抑制剂所需时间。因此当节段t发生变色(如图1所示)时，表示已经过了足够使所有结果节段都发生变色的时间，结果节段的抑制剂浓度低至足以被样本中葡萄糖浓度耗尽的程度，于是能做出正确的测量而无需进一步的延迟。
实际做成的检测条中，图1的膜基体夹在两层盖片之间，盖片可以是本领域已知的任何适当的热塑膜。图2和图3分别是检测条20的样本面22和检测面24。使用时，血样加到样本面22的开口26中。样本经毛细管作用沿径向扩散开来，到达检测条的顶部和底部，并渗透至基体的检测面24。可选的通气孔28有助于样本沿检测条的扩散。通过可选的透明小窗30可以观察到样本的外观，使用户确认已有足够的样本供测量之需。检测面24上的指示剂环接纳显色反应所需的氧，并标示出血糖浓度。随着检测的进行，如果样本中血糖浓到达到或超过对应于指示剂环的量，检测面24上的指示剂环随之变色。因此，图3描绘的结果显示出样本葡萄糖浓度至少为120mg/dL，但小于150mg/dL。在计时器环32变色后的任何时间都能进行读数。注意到图中由与葡萄糖的反应所引起的变色是从白色变为彩色。不过，本系统用一种指示剂染料也能以另一种方式工作，该染料被葡萄糖诱发的氧化反应破坏后，相应的颜色变化是从彩色到白色。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下列实施例进一步说明本发明的各种实施方式。这些实施例不应理解为对本发明进行任何限制。例1———BPR指示剂
制备如下溶液：
     蒸馏水                     83.5g
1％(w/w)EDTA二钠           23.8g
乌头酸                     6.0g
NaOH(固体)                 2.2g
CROTEIN SPA                4.2g
咪唑                       0.6g
甘露糖醇                   3.0g
5％(w/w)SURFACTOL Q1       3.0g
    调至pH4.8
乙醇                       40.0g
PPG-40                     5.6g
酶溶液                     28.0g
酶溶液
       0.2M乌头酸          27.0g
       葡糖氧化酶          165,000U
       HRPO                340,000U将Memetec BTSH.55膜浸在上述溶液中进行包覆，过量部分用玻璃棒刮去。在180F、中等空气流量下在浮选干燥器中干燥已包覆的膜，使网膜在20秒内完全干燥。将网膜卷起来，准备进行第二次包覆，如下所述。
制备如下溶液：
    抗坏血酸(抑制剂)        标准溶液        稀释液
    蒸馏水                    190g           370g
    1％EDTA二钠                55g           107g
    BPR                      0.36g          0.71g
    POLYQUARTH               6g          11.8g
    PPG-410                  14.2g          27.8g
    抗坏血酸                 1.37g             —
    乙醇                      243g           477g
    计时器溶液
        稀释液(上述每份配方)                 120g
        抗坏血酸                           0.885g
        葡萄糖溶液                         17.25g该葡萄糖溶液为一种经变旋作用处理24小时的16,000mg/dL的葡萄糖水溶液，冷冻贮藏。
按如下比例制得储备溶液的稀释液：0.0405∶1、0.108∶1、 0.236∶1、0.369∶1、0.569∶1、1.260∶1。抑制剂浓度的逐步升高相应于结果环所显示的葡萄糖浓度的逐步增大。这些溶液以及计时器溶液一起涂在含酶膜的孔径较大的一面，使每平方毫米膜上积聚大约1×10-4毫升溶液。将膜湿润的十五秒，再按上述酶包覆步骤中相同的干燥条件进行干燥。结果表明，计时器反应时间约为70秒，95％的情况是在64秒和79秒之间。例2---MBTHSB-ANS指示剂
制备下列溶液：
     HPLC水                1500ml
     柠檬酸                16.92g
     柠檬酸钠              20.88g
     甘露糖醇                 15g
     EDTA二钠               1.26g
     GANTREZ S95            6.75g
     Crotein SPA              36g
     葡糖氧化酶            1.69MU
     HRPO                   1.5MU
     CARBOPOL 910*          75ml
     柠檬酸二钠**          225ml*11％的乙腈溶液**0.1M，pH5.0
Memtec BTS 30膜的包覆在液槽中进行，使大孔表面与包覆溶液接触；过量溶液同上用玻璃棒除去。将膜按实施例1进行干燥并卷起。
制得下列溶液：
溶液A(指示剂)          溶液B(润湿剂)70％(v/v)乙醇 2819ml       MAPHOS60A     41gMBTHSB         2.98g       70％(v/v)乙醇    205ml(NH4)ANS       25.83g溶液B            205ml2％DTPA        51.25ml
溶液C(抗坏血酸储备溶液)                溶液D(计时器)水               115ml      水                 53ml抗坏血酸         4.58g      抗坏血酸           8.75g乙醇             267ml      乙醇               123ml
                        用70％乙醇使体积为175ml
                        葡萄糖溶液        40.5ml
对于每一份抑制剂溶液，将溶液A体积定为263ml。为得到各种结果环，70％乙醇：溶液C的比率从58.9至0.200不等，这样在所有抑制剂溶液中加到溶液A中的70％乙醇+溶液C的体积均为87.5ml。这样仅改变了每份溶液中抑制剂的浓度。含有逐步升高的抑制剂的溶液和计时器溶液(溶液D)一起涂在膜孔径较大的一面。调整溶液沉积的速率，使每平方毫米膜上有8×105ml抑制剂。膜的干燥方法同上，只是在包覆与干燥之间的间隔为1.6分钟。结果表明，计时器反应时间约为60秒，血细胞比率从30％至55％或葡萄糖浓度从78mg/dl至420mg/dl均对其影响很小。例3———提高计时器稳定性
各向异性聚膜Memter BTS-30用试剂A包覆。所得膜在56℃的空气循环炉中干燥10分钟。然后用试剂B包覆，再按上述条件干燥。然后将膜加工成条形，供检测之用。
                      试剂 A
                      重量(g)
    水柠檬酸柠檬酸三钠甘露糖醇EDTAGANTREZ S95CROTEIN SPA葡糖氧化酶(126U/mg)辣根过氧化酶(410U/mg)MeCN中的CARBOPOL910的溶液(0.55mg/5ml)0.1M柠檬酸二钠     396345.1255.68403.361857.7237.612.25177.18598.3
                           试剂  B染料溶液：
乙醇                        22.5ml
水                           2.5ml
MBTHSB                      36.3mg
(NH4)ANS                  472.5mg
葡萄糖溶液(1)16,000mg/dl D-葡萄糖水溶液(2)16,000mg/dl D-葡萄糖+16,000mg/dl半乳糖水溶液(3)16,000mg/dl D-葡萄糖+16,000mg/dl核糖水溶液(4)16,000mg/dl D-葡萄糖+16,000mg/dl甘露糖水溶液
  葡萄糖(对照)   葡萄糖+半乳糖   葡萄糖+核糖     葡萄糖+甘露糖
染料溶液乙醇水溶液(1)溶液(2)溶液(3)溶液(4)抗坏血酸   5ml4.5ml0.06ml0.44ml———40mg     5ml4.5ml0.06ml—0.44ml——40mg     5ml4.5ml0.06ml——0.44ml—40mg     5ml4.5ml0.06ml———0.44ml40mg
四种组合物的检测条分成两组贮藏：·一组在56℃下贮藏七天—加速老化·另一组在5℃下贮藏七天—对照七天结束后，检测条用含有100mg/dl葡萄糖、血细胞比率为42.5％的全血进行测试。
“老化”的检测条只含有葡萄糖了，它显色完全所需时间(“反应终止时间”)比“新鲜”(即在5℃下贮藏)的检测条长得多。含有醛糖的检测条表现为反应终止时间明显缩短。
结果如表2所示。
                  表2
    糖     不同的反应终止时间(56℃与5℃比较)
    葡萄糖(对照)半乳糖/葡萄糖核糖/葡萄糖甘露糖/葡萄糖     28秒16秒14秒12秒
在上述说明书和实施例中，出现了下列商标：
CARBOPOL 910聚丙烯酸聚合物(B.F.Goodrich)
CROTEIN SPA水解胶原蛋白—分子量4000(Croda Inc.)
GANTREZ 595聚(甲基乙烯基醚/马来酸)(国际特殊产品)
MAPHOS 60A复合有机磷酸酯(PPG 工业公司)
POLYQUARTH聚乙二醇-15牛脂聚胺(Henkel加拿大有限公司)
SURFACTOL  Q1乙氧基化蓖麻油(CasChem，Inc.)
对本领域技术人员来说，上述说明书和实施例说明了本发明如何实施，但不是以任何方式限制本发明。也可对文中的详细描述作出各种替换，但不背离本发明的范围和宗旨。

Claims (15)

1、一种用于目测试剂条的化学计时器，该试剂条用于测量涂在其上的生物体液中的葡萄糖浓度，该计时器含有一干燥涂层，该涂层由
a)一种可变颜色的指示剂组合物，
b)一种含酶试剂，当其被水合后与葡萄糖反应，使指示剂变色，
c)一种抑制指示剂变色的抑制剂，
d)葡萄糖，和
e)一种醛糖，基本上不与试剂中的酶反应，组成，其中干燥涂层中抑制剂与葡萄糖浓度的选择要使葡萄糖在生物体液涂在试剂条上之后经过一段预定时间与该含酶试剂反应，使指示剂变色。
2、权利要求1的计时器，其中的试剂含有一种氧化酶。
3、权利要求1的计时器，其中的抑制剂含有抗坏血酸。
4、一种用于测量涂在其上的生物体液中的葡萄糖浓度的目测试剂条，含有权利要求1的化学计器。
5、一种用于目测试剂条的化学计时器的制备方法，该试剂条用于测量涂在其上的生物体液中的葡萄糖浓度，该方法包括下列步骤：
a)在一种多孔膜上涂覆一种含酶试剂的溶液，当该试剂被水合后与葡萄糖反应生成一反应产物，
b)将涂层干燥，形成第一层，
c)在第一层上涂第二层，第二层含有
i)葡萄糖，
ii)一种指示剂，与上述反应产物反应发生变色，
iii)一种抑制指示剂变色的抑制剂，和
iv)一种醛糖，基本上不与试剂中的酶反应。
6、一种生物体液中葡萄糖浓度的测量方法，该方法包括下列步骤：
a)将生物体液涂在一种检测条上，该检测条含有i)大量结果节段，每个节段与生物体液接触后变色，每个节段中至少含有预定量的葡萄糖，其含量与引起其它节段变色的葡萄糖含量各不相同，和
ii)一个根据权利要求1的计时器节段，在一段时间后变色，该时间段持续的长短基本上与生物体液葡萄糖含量无关，和
b)测定葡萄糖浓度，是通过观察在计时器节段变色以后发生变色的结果节段来进行的。
7、一种用于目视检测条的化学计时器，该检测条用于测量涂在其上的生物体液中的被分析物浓度，该计时器含有一干燥涂层，该涂层由
a)一种可变颜色的指示剂组合物，
b)一种含酶试剂，当其被水合后，能与葡萄糖反应使指示剂变色，
c)一种抑制指示剂变色的抑制剂，
d)葡萄糖，和
e)一种醛糖，基本上不与上述试剂中的酶反应。
8、权利要求7的计时器，其中的醛糖选自甘露糖和半乳糖。
9、权利要求7的计时器，其中的指示剂选自下列物质组：(a)盐酸3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)与3，3-二甲氨基苯甲酸(DMAB)组合；(b)MBTH与3，5-二氯-2-羟基苯磺酸(DCHBS)组合；(c)4-氨基安替比林(4-AAP)与5-氧-1-(对磺苯基)-2-吡唑啉-3-羧酸(OPSP)；(d)4-AAP与N-(间甲苯基)-二乙醇胺(NDA)；(e)2，2’-连氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉)磺酸(ABTS)；(f)4-AAP与4-甲氧基苯酚；(g)焦棓酚红(PGR)；(h)溴焦棓酚红(BPR)；(i)酸性绿25(AG)；或(j)[3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙]N-磺酰基苯磺酸～钠(MBTHSB)与8-苯胺基-1-萘磺酸铵(ANS)组合。
10、权利要求9的计时器，其中的指示剂为MBTHSB-ANS。
11、权利要求7的计时器，其中试剂中的酶含有一种氧化酶。
12、权利要求7的计时器，其中的抑制剂含有抗坏血酸。
13、一种用于测量涂在其上的生物体液中被分析物浓度的目视检测条，含有权利要求7的化学计器。
14、一件用于目视检测条的化学计器的制备方法，该检测条用于测量涂在其上的生物体液中的被分析物浓度，该方法包括下列步骤：
a)在一种多孔膜上涂覆一种含酶试剂的溶液，当该试剂被水合后能与葡萄糖反应生成一反应产物，
b)将涂层干燥，形成第一层，和
c)在第一层上涂覆二层，第二层含有
i)一种指示剂，能与上述反应产物反应发生变色，
ii)一种抑制指示剂变色的抑制剂，
iii)葡萄糖，和
iv)一种醛糖，基本上不与试剂中的酶反应。
15、权利要求14的方法，其中的被分析物为葡萄糖，其中的酶含有葡糖氧化酶。
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