CN1105704A - 能产生有用种子的油料种子作物 - Google Patents

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Abstract

提供了一种氨基酸组成和/或脂肪酸组成改变 了的油料种子作物。这种作物是通过把种子储存蛋 白的反义基团导入油料种子作物而制备的。

Description

本发明涉及能产生具有改变过的氨基酸组成和脂肪组成的有用种子的油料种子作物，以及一种制备这种作物的方法。更具体地说，本发明涉及带有被引入的种子蛋白的反义基因的油料种子作物以及制备这种作物的方法。
这里所用“油料种子作物”一词是指用于从其种子中获取油类（脂肪）的作物。这种作物被广泛栽培，作为食用油的来源，如油菜子油和芝麻油，或是作为工业上作用的各种油类的来源。例如，其种子中脂类含量约为60%的芸苔属（Brassica）植物在世界上很多地方都有栽培。油料种子饼粉中含有高蛋白，被用作饲料和肥料。
然而，已知油菜子油含有一种对人体有害的芥子酸，还知道芸苔属油饼粉中含有对牲畜有毒性作用的glycocynolate。因此，为了通过常规育种方法来降低这类有害成份的含量而付出了巨大努力。结果，在加拿大育成了“双低”变种，该变种的芥子酸含量不到其种子油中种子重量的2%，而且1克饼粉中glycocynolate的含量少于30微摩尔。
近来，油类的消费一直在增加，与之相关的市场也开始需求油类的多样化。这样，就需要具有高脂类含量和有价值的脂肪酸成份的油料种子来满足各种目的。例如，作为食用油，需要含有微量芥子酸和低水平饱和脂肪酸的油料种子，因为这种油有益于人体健康。另一方面，工业上则需要含有大量芥子酸、中链脂肪酸和/或多不饱脂肪酸。作为饼粉，则要求它含有大量的蛋白质或必需的氨基酸。
要通过常规和杂交育方法育成新的理想品种是很麻烦的，而且，以这种方法为特殊目的而改变有价值的成份是很困难的。常规的杂交育种方法，包括艰苦而费时的过程，以期从各种变种中筛选出所需的品种并建立纯系。为了从各种变种中得到理想的品种，还采用了其它方法，如γ-射线辐射和体细胞克隆变异。但是，通过上述方法得到的品种通常不能用于栽培，因为，除目的基因之外，品种里的其它其因通常也会同时突变。
相反，将有关基因工程技术的方法用于特别制备理想的品种是有利的，因为此类方法可以仅改变特定基因并将目的基因引入作物。更具体地说，这种方法包括以下步骤：1）分离编码理想表型的基因;2）修饰该基因，以使其能够在理想的组织或部位上表达;3）将该基因引入作物使其表达理想表型。
上述步骤1）中编码理想表型的基因的例子包括编码与种子储存化合物的生物合成有关的酶的基因和储存蛋白基因。种子储存化合物主要是脂类、蛋白质类和碳水化合物，其含量随着植物种类而变化。已经知道，这些化合物是在胚发生期间积累的，而且，这些化合物的生物合成途径也是密切相关的。更具体地说，这些化合物是由完全相同的起始物质合成的。就芸苔属而言，已知脂类和蛋白质积累在种子里，但是与储存脂类生物合成有关的所有酶类均未分离出来。已经从拟南芥层（Arabidopsis）（Plant Phys.，87，859-866，1988;plant Mol.Biol.，11，805-820，1988）、萝卜（Raphanus Sativus）（Plant Mol.Biol.，20，467-479，1992;Gene，99，77-85，1991），芸苔（Brassica napus）（Plant Mol.Biol.，5，191-201，1985;Plant Mol.Biol.，14，633-635，1990）等植物中分离出了编码芸苔素（napin）或十字花科素（curuciferin）（储存蛋白）的基因。
上述步骤2）是筛选和构建“DNA部分”，它是一种给定储存蛋白质的反义基因（反义寡核苷酸），当其被引入作物时能够抑制编码所述特定蛋白质的基因表达并改变作物的表型。就芸苔（B.napus）而言，由芸苔素启动子驱动的由DHFR基因和芸苔素基因组成的嵌合基因表达的例子已有报导（S.E.Radde，Theor，Appl.Genet.，75，685-694，1988），但是，引入储存蛋白的反义基因的例子还未见报导。就引入反义基因而言，有这样一则报导，当把ADP-葡萄糖-焦磷酸化酶的反义基因（马铃薯中的一种淀粉合成酶）引入马铃薯以后，淀粉数量减少，而蔗糖和某些蛋白质的数量增加（EMBO J.，11，1229-1238，1992）。
上述步骤3）是一个将理想基因引入作物的过程。就芸苔而言，已知一种由通过电击法导入了目的DNA的原生质体再生植株的方法（Plant Science，52，111-116，1987）。再生通过土壤杆菌介导的转化导入了目的DNA的植株的方法也是已知的（日本公开专利出版号：1-500718）。
为了提高油料种子作物，如芸苔层作物的储存蛋白质含量并改变其氨基酸组成，本发明人进行了深入研究。研究的结果是，本发明者已发现通过导入种子储存蛋白的反义基因，可以改变芸苔属作物种子的氨基酸组成。令人惊奇的是，本发明人还发现通过引入这样一种反义基因还可改变种子中脂肪酸的组成和必需氨基酸的组成。本发明就是基于上述发现。
因此，本发明的目的是提供一种用种子储存蛋白的反义基因转化的油料作物，用于制备这种转化的油料种子作物的方法，用于该方法上的重组载体，以及由转化的作物得到的种子。
下面将对本发明做进一步的详细说明。
如上所述，任何可以从其种子里提取油（脂肪）的油料种子作物均可在本发明中使用。油料种子作物的例子有油菜子、芝麻、Tougoma（hima）、Egoma、花生、橄榄、大豆、玉米、亚麻、向日葵、和油棕。比较理想的油料种子作物有油菜子、大豆和玉米，本发明中最理想的作物是油菜子。
种子储存蛋白不受限制，但最好使用芸苔素和/或十字花科素。这两种蛋白质是芸苔属植物种子里的主要蛋白质。油菜里的芸苔的总种子蛋白中分别有20%和60%是芸苔素和十字花科素。芸苔素是由芸苔属植物合成的1.7S储存蛋白质的总称，它包括几个部分不同的氨基酸序列的蛋白质。编码这些蛋白质的基因形成由20或更多基因组成的基因族。任意两种植物之间这些基因的同源性均为90%或更高。十字花科素是芸苔中12S储存蛋白的总称，包括4种亚单位对。编码这4种亚单位对的基因的同源性比芸苔素的低，即使同种的两个基因之间的同源性也只有40%或更低。
在本发明中，将这种种子储存蛋白的反义基因导入作物。种子储存蛋白的任何反义基因均可使用。不过，以采用具有与目的植物的一内源基因有高同源性的DNA序列为宜，因为当它们的同源性高时，由导入的反义DNA转录的反义RNA可有效地与该内源基因的转录子杂交。反义基因可以同目标基因CDNA或基因组DNA的全长或局部相一致。当把芸苔来反义基因用于本发明中时，首先以芸苔等的基因组DNA为模板通过PCR法分离芸苔素基因。例如，为了分离芸苔素基因和十字花科素基因，可以采用芸苔的基因组DNA通过PCR法将这些基因扩增，对芸苔素基因来说，基于由RaskL.报导的大约为1111-1783 bp的napA碱基序列（J.Biol.Chem.，26212196-12201，1986）;对十字花科素基因而言，基于由A.J.Ryan报道的680～1278bp的CruA碱基序列（Nuc.AcidRes.，17，3584，1989）。PCR是扩增目的DNA区域的方法，通过重复加热使模板变性、引物和模板退火和采用热稳性聚合酶使DNA延长等步骤来实现（Saiki，Science，239，487-491，1988）。更具体地说，可以按照在Mol.Gen.Genet.（211，27-34，1988）中所述的方法从Westar（B.napus CV.）等的叶子里分离基因组DNA，并可以把约300ng的基因组DNA用作模板。加热变性模板以分离单股正链和单股负链、引物和模板退火、以及采用热稳性聚合酶合成DNA的步骤被重复20～30次，以扩增与芸苔素基因互补的DNA。扩增的DNAs有90%或更多与芸苔素的转录区相符合，25%与十字花科素的转录区相符合。
其次，构建了一种带有反义基因的表达载体。例如，一种表达载体，必需具备特定的启动子，以便该反义基因可在芸苔种子里充分表达。而且，最好采用能够在与编码储存蛋白的内源遗传基因同一时间、同一地点表达反义基因的表达载体，以便有效减少不需要的蛋白质数量。例如，当把编码芸苔素的反义基因用于转化作物时，可以通过PCR法以芸苔等的基因组DNA为模板获得启动子，而以与napA碱基序列上的约1～1145bp的序列一致的寡核苷酸作为引物。当把十字花科素的反义基因用作插入基因时，可以采用十字花科素基因的启动区，并把上述cruA序列的大约1～709bp的序列扩增，以便使用。在使用之前证实由PCR法扩增的启动子片段的功能是重要的，因为假基因的启动子是不能用的。
表达载体可能还包括一个终止子，以便有效地终止基因的转录，并稳定所产生的RNA。任何能够在植物细胞中起作用的终止子均可使用。例如，可以使用胭脂碱合成酶基因NOS的终止子（pBI221，Jefferson，EMBOJ.，6，3901-3907，1987）。
转化植物的方法的例子有土壤杆菌介导的转化法，电击法，等等。对土壤杆菌介导的转化法来说，pLAN系列的质粒较适宜（Plant Cell Rep.，10，286-290，1991），而对电击法来说，pUC系列的质粒较适宜。这种质粒含有的新霉素磷酸转移酶基因和潮霉素磷酸转移酶基因可作为选择标记。质粒可能还包括2或多个从下列基因中选择的外源基因：新霉素磷酸转移酶基因，潮霉素磷酸转移酶基因，氯霉素乙酰转移酶基因，β-葡萄糖苷酸酶基因等;而且最好把外源基因中的一个用作筛选转化子的选择标记。最理想的选择标记是新霉素磷酸转移酶。在电击法中，可使用含有一个选择标记基因或其它外源基因的一个质粒，或使用两个质粒，其中的一个含有选择标记基因，另一个含有其它的外源基因。
通过把这种质粒导入油料种子作物的下胚轴或原生质体可制备出种子储存蛋白量改变了的油料种子作物。
土壤介导的转化可按照在日本公开（Kohyo）专利出版号：1-500718中公开的方法进行。
在电击法中，来自芸苔属的原生质体可按如下方法制备。将在无菌条件下培养的幼芽用含有一种酶如纤维素酶、果胶酶等的等渗溶液在25～30℃处理5～20小时，使细胞壁降解。处理之后，过滤处理液以除去未消化的细胞，将滤液离心以得到提纯的原生质体（日本专利申请号：4-276069）。在电击之前，将得自B.napus cv.Westar的6×105细胞/ml的原生质体和包括芸苔素反义基因或十字花科素反义基因和新霉素磷酸转移酶基因（例如，40-80μg/ml）的DNA表达载体（如，40-80μg/ml）悬浮于液体介质（如缓冲液）中，这种介质含有30-200mM KCL，0-50mM Mgcl，以及0.2-0.6M的甘露醇。然后，通过电脉冲把载体导入原生质体。电脉冲处理的适宜条件是由100～1000μF的电容器所得到的200-1000V/cm的直流脉冲初级电压，并施以1-30毫秒的脉冲宽度。可将电击过的原生质体以105细胞/ml的浓度悬浮于KM培养基（Planta，126，105-110，1975）中，KM培养基含有0.05-0.5mg/l的2，4-D，0.02-0.5mg/l的NAA，0.1-2.0mg/l的BAP，和0.4M的葡萄糖，并在25℃在黑暗中培养该混合物。培养3-4周之后，可形成0.5～1mmΦ的菌落。如果被导入的质粒含有新霉素磷酸转移酶基因作为选择标记，可在培养1周之后加入10-50μg/ml的卡那霉素，以便有效地筛选转化的菌落。将该菌落转移到含有10-50μg/ml卡那霉素的培养基上，如含有0.5-2mg/l2，4-D，0.1-0.5mg/l BAP，1-5%山梨醇，1-5%蔗糖，0.5-2g/l酪蛋白水解物（CH）和0.5-1%琼脂糖的MS（Murashige andskoog，1962）固体培养基，在光照（1000-4000Lux）条件下，在25℃培养2-4周以后，得到直径为3-5mm的绿色愈伤组织。然后，再在不含卡那霉素的培养基中培养所得到的愈伤组织，如在含有0.01-0.1mg/lNAA，0.5-2mg/lBAP，1-5%山梨醇，0.5-2%蔗糖，0.05-0.5mg/lCH和0.5-1%琼脂糖的MS固体培养基中，在光照（1000-4000Lux）条件下在25℃培养，以得到再生的功芽。然后，把再生的幼芽放在根诱导培养基上培养，如含有0.05-0.2mg/l NAA，0.01-0.05mg/l BAP，1-5%蔗糖和0.2%Gellight（Kelco，Divisionof Merck and Co.，Inc）的MS固体培养基。
可按照在Mol.Gen.Genet.（211，27-34，1988）中公开的方法从再生植株的叶子里提取基因组DNA。所得300ng基因组DNA通过PCR扩增，以筛选含有种子储存蛋白的反义基因的转化子。当把芸苔素反义基因导入芸苔属植物时，把与napA基因（如上）上从第1-19bp位置之间的序列和NOS终止子上从第1579-1595bp位置之间的序列（5＇-GCATGACGTTATTTATG-3＇，pCaMVNEO;Fromm等，Nature，319，791-793，1986，SEQ ID No：5）相一致的引物用于PCR扩增。当被导入的是十字花科素反义基因时，采用与CruA基因（如上）从第1bp至上游第18bp之间的序列和NOS终止子的一部分相一致的引物。含有种子储存蛋白的反义基因的再生植株，在驯化以后在温室里栽培。栽培3-6个月后，转基因植株产生种子。采Southern吸印杂交分析（Southern，J.Mol.Biol.，98，503-517，1975）可以证实导入基因的存在。例如，把按照Wolbot等人的方法（Mol.Gen.Gent.，211，27-34，1988）制备的10μg基因组DNA放在100μl反应混合物（TOYOBO.Co）中，用适当的限制性酶降解。所得溶液用乙醇沉淀。所得沉淀用70%的乙醇洗涤，干燥，溶于10μl蒸馏水中。向所得溶液中加入2μl染料（Molecular Cloning）。然后，采用0.8%的琼脂糖凝胶（FMC SEAKEM GTG琼脂糖，TBE缓冲液）对该溶液电泳。按照在“Direction of AmershamHybond N Mebrane”中所述方法，对分离的片段进行部分酸水解和碱变性处理，以便把这些片段转移到hybond硝酸纤维素膜上。该膜在含有50%甲酰胺，4×SSCP（Molecular Cloning）、1% SDS、0.5%脱脂乳，0.25mg/ml牛精液DNA的溶液中，在42℃预杂交1小时以上。按下述方法可获得探针。把用于转化原生质体的质粒按上述方法用适当的限制性酶降解。所得溶液用乙醇沉淀。所得沉淀用70%的乙醇洗涤，干燥，在5μl蒸馏水中溶解。向该溶液中加入1μl染料（Molecular Cloning）。然后用0.8%的琼脂糖凝胶（FMC SEAKEM GTG 琼脂糖，TBE缓冲液）对该溶液进行电泳，以便回收含有反义基因的DNA片段或其部分片段（Moleculovr Cloning）。得到的片段用作探针。采用多引物标记试剂盒（Amersham）用[α32P]dCTP标记该DNA片段（25ng）。把热变性DNA片段（探针）加入杂交溶液（0.1g葡聚糖硫酸酯/ml预杂交溶液）中。将从上述预杂交溶液中取出的预杂交膜浸入杂交溶液中，并在42℃静止过夜。然后，把该膜在100ml2×SSC+0.1%SDS中处理15分钟，两次，并振动，用100ml0.1×SSC+0.1%SDS洗涤两次，每次15分钟，进行放射性自显影处理以检测专门与探针杂交的带。
种子储存蛋白反义基因的表达可通过对用标准方法提取的总种子蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）证实。例如，总蛋白质首先在100μl种子样品缓冲液（62.5mMTris-HCL pH6.8，2%SDS，10%甘油，5%2-巯基乙醇，0.0001%溴酚蓝）中提取，然后，通过SDS-PAGE（Nature，227，680-685，1970）分离15μg蛋白质。所得凝胶用含有0.25%考马斯亮蓝、45%乙醇和10%乙酸的溶液染色，然后浸泡在含有乙醇、乙酸和水（25∶8∶65）的脱色液中脱色。把芸苔素反义基因用于转化芸苔时，可在4KD和9KD处分别检测到与芸苔素的α链和β链相应的带。当被导入的是十字花科素反义基因时，可在约20KDa和约30KDa处分别检测到与十字花科素的亚单位对的3或4条α链和3或4条β链相应的带。通过比较这些谱带与未转化植株谱带的宽度，可推测芸苔素或十字花科素的含量，并进而证实芸苔素或十字花科素的反义基因的表达程度。
根据上述方法，获得了本发明的油料种子作物，其氨基酸组成和/或脂肪酸组成在营养方面有所改进。例如，可获得本发明的营养油料种子作物，其不饱和脂肪酸，如亚油酸或亚麻酸和必需氨基酸、如赖氨酸、甲硫氨酸或半胱氨酸的含量均得以提高。
通过以下实施例对本发明作进一步说明。这些实例只是象征性的，不应将其误认为是对本发明任何一方面的限定。
附图中：
图1表示在例1和8中制备的载体的构建。
图2表示总种子蛋白含量，其中，W表示自然存在的种子，B.napus cv.Westar，T表示转化的种子。
图3表示种子中脂肪酸的组成，其中，○表示自然存在的种子，B.napus cv.Westar，而●表示转化的种子。
例1载体pNAKM的构建（图1）
采用以napA基因序列（J.Biol.Chem.，262，12196-12201，1987）为基础的引物，通过PCR法扩增芸苔素启动子区和部分芸苔素基因。首先，通过CTAB方法（Focus，12，13-15，1989）从B.napusCV.Westar的叶子中提取基因组DNA。具体地说，把适量的液态氮加进装有大约5g叶子的研钵中，并用研棒把叶子研碎。随后，加入15mlDNA提取液（2%CTAB，1.4M Nacl，0.2% 2-巯基乙醇，20mMEDTA和100mMTris-HCL（PH8）），并进一步研磨。将提取液转移到聚丙烯管中，在65℃放置1小时以上，并偶尔伴以振动。将等体积的含有苯酚（用10mMTris-HCL（PH8）和1mM EDTA）、氯仿和异戊醇（25∶24∶1）的溶液加入上述提取液中并混合。该混合物以15000rpm的速度离心15分钟（KUBOTA，KR-20000T）。将上清液转移到另一只管中，加入2/3体积的异丙醇。将混合物在室温下放置30分钟以上，并以14000rpm的速度离心20分钟。除去上清液，得到沉淀物。加入适量70%乙醇洗涤沉淀物，然后将沉淀物干燥。再把沉淀物溶于750μl含有1g/ml氯化铯的TE（10mM Tris-HCL（Ph8.0）和1mMEDTA）中。向该溶液中加入一滴10mg/ml的溴化乙锭，并以100000rpm的速度离心过夜（BECKMAN，TL-100）。回改带部分，用正丁醇处理除去溴化乙锭，转移到透析膜中（Sanmitsu Pure Chemicals）并在水中脱盐。在存在30mM乙酸钠的情况下向透析膜中所得液中加入2.5体积的乙醇，在低温下以15000rpm的速度将混合物离心15分钟，回收基因组DNA。将回收的DNA溶于TE溶液中以得到1μg/ml的DNA溶液。
将基因组DNA（300ng）用于由PCR法扩增芸苔素启动子区和芸苔素编码区。将napA基因上从第1-19bp的序列（J.Biol.Chem.，262，12196-12201，1987）（5＇-AAGCTTTCTTCATCGGTGA-3＇：SEQ ID No.1）和与napA基因上从第1125-1145bp之间的21个bp互补的序列（5＇-CAAGATTAAAAACATACACGA-3＇：SEQ ID No.2）用作扩增芸苔素启动子区的引物;将napA基因上从第1111-1131bp之间的序列（5＇-CTCATCAATACAAACAAGAT-3＇：SEQ ID No.3）和与napA基因上第1763-1783之间的20个bp互补的序列用作获得芸苔素编码区的引物。PCR用DNA热循环器（Perkin Elmer Cetus）、在按上述公司的Gene-Amp-Kit方法制备的混合物中进行。
为了获得芸苔素启动子区，将100μl的反应混合物循环30次，一个循环包括：变性步骤，在94℃持续1分钟;退火步骤，在52℃持续2分钟;延伸步骤，在72℃由热稳性聚合酶进行3分钟。为了获得芸苔编码区，循环30次，一个循环包括：变性步骤，在94℃持续1分钟;退火步骤，在50℃持续2分钟;延伸步骤，在72℃由热稳性聚合酶进行3分钟。采用琼脂糖凝胶电泳对反应混合物（1/20体积）进行分析，检测谱带。一条在1.1KD处的带相当于启动子，在0.7kb处的带相当于芸苔素编码区。
上述DNA片段（1.1kb和0.7kb）用乙醇沉淀，分别克隆在PUC质粒的HincⅡ和SmaⅠ位点上（pNap，pNAS）。
然后，把所得到的pNAS（10μg）在缓冲液（100μlTOYOBO）中用XbaI和KpnI在37℃消化3小时，通过1%的Seakem GTG琼脂糖（FMC）凝胶电泳进行分级分离，电泳时采用1XTBE缓冲液（Molecular Cloning，Maniatis）（MUPID，Cosmobio，100V，30分钟）。然后用0.5μg/l溴化乙锭对凝胶染色，并提取与芸苔素编码区相应的条带。将该条带转移至一透析膜中，并在4℃、120mA条件下电泳1小时，以回收DNA。将等体积的苯酚加入回收的DNA中，摇动混合物，得到双相溶液。回收水相，并用氯仿对其做进一步处理，以纯化DNA片段。然后，用乙醇沉淀该DNA片段，并将沉淀溶于5μl水中。将所得溶液（1μl）和2μl用同样方法由pNap制备的含有芸苔素启动子的溶液放在TAKARA连接试剂盒反应混合物（30μl）中，在4℃连接，过夜。
将含有连接质粒DNA（10μl）的混合物用于转化大肠杆菌（E.coli）的感受态细胞DH5α（BRL）（Inoue，Gene，96，23-29，1990）。在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂糖培养基上筛选含有该质粒的转化细胞菌落（Molecular Cloning）。通过碱性SDS法（Molecular Cloning），从含有筛选出的菌落（LB培养基）的培养液（1ml）中制备DNA。制得的DNA（1/50体积）在10μl含有0.5μg/mlRNase的反应混合物中，用1U的HindⅢ和KpnⅠ（TOYOBO）在37℃消化30分钟。在对消化的DNA进行凝胶电泳分级分离之后，筛选在凝胶上出现1.8KD片段的克隆。将含有具有部分芸苔素基因的质粒的克隆在反方向上与芸苔素启动子接合。
采用来自pBⅠ221（TOYOBO）的NOS区的终止子。
质粒pBⅠ221（10μg）在缓冲液（120μl，TOYOBO）中用SacI在37℃温度下消化过夜。所得DNA片段用苯酚和氯仿提纯，用乙醇沉淀并溶解在20μl水中。所得溶液（8μl）用10μlTAKARA平端试剂盒处理，得到平端DNA片段。将平端DNA片段溶解在5μl水里，并把2μl的该溶液与1μl含有KpnI接头（TOYOBO）的溶液混合，连接平端DNA片段，接头使用的是TAKARA连接试剂盒。用KpnⅠ接头连接的DNA片段波进一步纯化、回收、并溶于5μl的水中。所得溶液用EcoRⅠ和KpnⅠ处理，以获得包括载体部分和NOS的末端部分的DNA片段。
由此得到的DNA片段（0.1μg）与具有部分芸苔素反义基因和芸苔素启动子融合的DNA片段连接，得到pNAAS质粒。该质粒用于通过电击法转化原生质体。
按下述方法构建了可用于土壤杆菌介导的转化的质粒。通过用一个多克隆位点取代一结构基因（35SP-GUS-NOST）由pLAN421制备出含有四环素抗性基因和壮观霉素抗性基因作为大肠杆菌的选择标记，并含有胭脂碱抗性基因作为植物选择标记（Plant Cell Rep.，10，286-290，1991）的质粒pKM424，用HindⅢ和EcoRⅠ消化。消化的质粒用苯酚处理，并用乙醇沉淀，以提纯DNA。用同样的酶处理pNASS质粒，得到含有芸苔素启动子和芸苔素反义基因的DNA片段。将由pLAN421制得的DNA片段和带有芸苔素反义基因的DNA片段连接，获得pNAKM。
将所得质粒用于转化根瘤土壤杆菌（Agrobacte-rium，tumefaciens）EHAIO菌株。把EHA101的单菌落在YEB培养基（0.1%酵母抽提物、0.5%牛肉膏、0.5%胨和0.5%蔗糖（pH7.0））中培养过夜。将培养物（1ml）加入含有25μg/ml卡那霉素（km），12.5μg/ml氯霉素（cm），25μg/ml壮观霉素（Sp）和1μg/ml四环素（Tc）的新配YEB培养基上，在30℃培养5-6小时。所得培养物以4000rpm的速度离心5分钟。所得沉淀加入20ml10mM的Tris-HCL（pH8）洗涤。将沉淀悬浮于400μlYEB培养基中，并将90μl的悬浮液与10μl含有10ngpNAKM的溶液混合，在-110℃放置5分钟，在37℃放置25分钟。向所得溶液中加进400μl的YEB培养基，将混合物在30℃培养过夜。将所得培养物（50μl）放在含有50μg/mlKm、25μg/ml Cm、50μg/ml Sp和2μg/mlTc的YEB琼脂糖培养基上，在30℃培养两夜，以筛选含有质粒的菌落（DNA Cloning）。用碱性SDS法（Molecular Cloning）从含有菌落之一YEB培养基中制备DNA，所得DNA在10μl含0.5μg/mlRNase反应混合物中由1U的HindⅢ和EcoRⅠ（TOYOBO）在37℃消化30分钟。在对该混合物进行凝胶电泳之后，筛选在凝胶上出现2.1kb条带的克隆。
实施例2  带有芸苔素反义基因的愈伤组织的转化、筛选和再生。
B.napus cv.Westar的种子用10%的过氧化氢溶液处理25分钟并干燥。处理过的种子在MS琼脂糖培养基上在光照（1000-4000lux）下培养2-3周。将消过毒的下胚轴切成2-5mm长度，放在预培养基上（B5-维生素;Gamborg等Exp.Cell.Res.，50，151-158，1968），并在有光地方培养过夜。含有MS琼脂糖培养基的预培养基中含有1mg/12、4-D，3%蔗糖，以及0.7%琼脂糖，它由消毒滤纸下面的烟草培养细胞BY-2覆盖。将带有pNAKM质粒的土壤杆菌单菌落放在含有抗菌素的YEB液体培养基（5ml）中，在30℃培养过夜。将培养物以3000rpm的速度离心10分钟，沉淀用含有3%蔗糖的MS液体培养基洗涤一次，然后悬浮在同一种MS培养基中。向含有土壤杆菌的悬浮液中加进预先培养的下胚轴，在25℃振荡培养5-20分钟。所得溶液用无菌纸巾过滤，除去过量的土壤杆菌并回收下胚轴。将这些下胚轴在上述预培养基中培养3夜，使下胚轴感染土壤杆菌。然且将被感染的下胚轴转移到消除培养基（含有维生素B5、1mg/l2、4-D，3%蔗糖，0.7%琼脂糖和500mg/l羧苄青霉素（Cb）的MS琼脂糖培养基）上并培养3天，抑制土壤杆菌的生长。
然后，把上述下胚轴转移到第一选择培养基（含维生素B5、3mg/l BAP、1mg/l玉米素、2%蔗糖、0.7%琼脂糖、30mg/l Km，500mg/l Cb的MS琼脂糖培养基）上并培养2周。结果，只有带有pNAKM质粒的转化植物细胞生长并形成绿色愈伤组织。
此外，将下胚轴再转移到第二选择培养基（含有维生素B5、3mg/l BAP、1mg/l玉米素、1%蔗糖、0.7%琼脂糖、30mg/l Km和500mg/l Cb的MS琼脂糖培养基）上并培养3周。结果，转化的愈伤组织进一步生长。然后，仅把每个愈伤组织部分转移到一培养基（含有维生素B5、3mg/l BAP、1mg/l玉米素、1%蔗糖、0.7%琼脂糖和250～500mg/l Cb的MS琼脂糖培养基）上发芽。再生的幼芽在用于细胞伸长的培养基（含有0.1mg/l BAP，250mg/l Cb和0.7%琼脂糖的B5琼脂糖培养基）中培养，然后转移到生根培养基上并驯化。
由再生植株制备的基因组DNA并以与导入的质粒序列相应的引物进行PCR扩增，筛选含有芸苔素反义基因的转基因植株。基因组DNA是按照Mol.Gen.Genet.（Vol211，27-34，1988）中的方法制备的。将50-100mg卡那霉素抗性植株在缓冲液（15%蔗糖，50mMTris-HCL（pH8），50mMNaEDTA，500mM Nacl）中研碎，通过离心分离细胞核部分。沉淀用洗涤剂液（1.5% SDS，20mM Tris-HCL（pH8），10mMEDTA）处理，溶解的核成份用0.6倍体积的异丙醇沉淀，得到核酸。所得核酸用70%的乙醇洗涤并干燥，获得基因组DNA。对这些DNA（300ng）进行PCR处理。
将芸苔素启动子上第1～19bp之间的寡核甙酸（SEQ ID：No.1）和与NOS终止子上第1579-1595bp之间的序列互补的寡核苷酸（SEQID：No.5：pCa-MVNEO;Fromm，Nature，319，791-793，1986）用作引物。PCR反应包括一个在94℃变性1分钟的步骤，在45℃退火2分钟的步骤，以及在72℃延伸3分钟的步骤。在PCR扩增之后，通过凝胶琼脂糖电泳分析10μl反应混合物，检测扩增带。通过PCR法证实整合了导入基因的转化植株在花盆中栽培。3-6个月后产生种子。
实例3  芸苔素反义基因在成熟种子里表达的测定
100μl用于蛋白质分离的样品缓冲液（62.5mMTris-HCL（pH6.8），2%SDS，10%甘油）中加入半粒成熟的种子。种子在缓冲液中被研碎，对混合物离心。部分上清液（相当于15μg蛋白质）通过SDS-PAGE根据分子量进行分级分离。所得凝胶用考马斯亮蓝染色，然后脱色检测芸苔属的含量。芸苔素含量的变化是通过显影分析（Ⅰmaging analysis system，MKSIPS）测量芸苔素的带与另一种蛋白质，如十字花科素的带之间相对值的变化而确定的。如果芸苔属的含量降低，则芸苔素带的量/十字花科素带的量的比值降低。剩下的半粒种子放在种子培养基（含3%蔗糖的MS琼脂糖培养基）上发芽。由萌发的籽苗制备基因组DNA，并按照在例2中所述PCR法进行分析。证实了导入的基因遗传到下一代。芸苔素含量的降低与导入基因的存在有关。表1表示SDS-PAGE显影分析结果与通过PCR法证实的导入基因的存在之间的关系。Westar 1-8是从未转化的B.napuscv.Westar成熟种子获得的对照，以处理转化种子的相同方法处理这些种子。
Figure 941052613_IMG1
N.C.＝未计数
实例4  成熟种子中总蛋白质含量的测定
通过采用Bio-Rad蛋白测定试剂盒（Bio-RadLabs.）测定在例3中提取的总种子蛋白质。将200μl试剂加进799μl的蒸馏水中。然后加入1μl的样品，并把混合物在室温下放置30分钟。测量该溶液在595nm波长处的吸光率。结果表明，降低的芸苔素含量与总蛋白质含量之间不相关（图2）。
实例5  成熟种子蛋白的氨基酸成份分析
将7个通过SDS-PAGE法确定的芸苔素含量下降了的切成两半的半粒种子放在适量冰冻丙酮中匀浆。混合物离心并将沉淀物干燥。然后将200μl70%的甲酸加进干燥的沉淀中去溶解蛋白质。离心之后将50μl的上清液除去、干燥，并在HCL蒸汽和氮气存在的条件下，在110℃水解24小时。向水解产物中加入100μl柠檬酸缓冲液，并得混合物离心。对上清液（20μl）进行氨基酸分析。对来自非转化的B.napus cv.Westar的成熟种子进行相同处理，并分析其氨基酸组成作为对照。该试验结果表明，转化种子的蛋白质的氨基酸组成改变了，而且接近预计的结果，芸苔素含量的降低被十字花科素含量的增加所补偿。表2表示转化种子里蛋白质的氨基酸组成，其中，氨基酸用一个字母符号代表。
Figure 941052613_IMG2
实例6  成熟种子中总脂肪酸含量和脂肪酸组成的分析
将通过SDS-PAGE确定的芸苔素含量降低了的10个切成两半的半粒种子在5ml氯仿和甲醇（3∶1）中匀浆。将上清液转移至离心管中。将这一过程重复三次，收集所有上清液，在室温下放置20分钟。往上清液中加5ml蒸馏水和5ml氯仿，将混合物在4℃以3000rpm速度离心20分钟。将下层转移到一烧瓶中在30℃蒸发，同时加进适量的乙醇。在蒸发提取物中加入50nmol甲基十五烷酸（C15∶0）和2ml溶在甲醇中的2.5%的硫酸溶液，甲基化反应在80℃进行2小时。然后加入2ml已烷，搅拌混合物并静置。将上层-己烷层转移到另一支试管中进行真空干燥（Theor.Appl.Genet.，80，241-245，1990）。然后加入100μl已烷。通过气相色谱法分析所得混合物（2μl）的脂肪酸（GC-9A，Shimadzu C0.;50m×0.25mmΦ×0.25μm膜Cyanopropy123柱，TOYO KASEI KOGYO C。.185℃，1ml/miknHe;Injector，200℃）。从未转化B.napus cv.Westar的5粒种子中提取脂肪酸用作对照。将转基因种子的脂肪酸组成同对照比较。结果表明，转基因种子的脂肪酸含量与对照的一样，不过，在转基因种子中油酸的含量下降而亚油酸和亚麻酸的含量增加（图3）。
实例7  芸苔素反义基因在后代植株中表达的检测
将在例2中的再生植株（T0代）所产生的种子（T1代）发芽并获得新种子（T2代）。按照例3中所述方法测定新种子中芸苔素的含量。同样按照例5中所述方法测定种子脂肪酸的组成。结果表明，T2代种子中芸苔素的含量也降低了，油酸的含量降低了，亚油酸和亚麻酸的含量增加了。
实例8  载体（pNACRU）的构建（图1），导入了十字花科素反义基因的愈伤组织的转化、筛选和表达。
按照上述PCR法分离出以cruA基因序列（Nuc.AcidRes.，17 3584，1989）为基础的部分十字花科素基因。为此，重复在分离部分芸苔素基因时所用方法，不同的是将cruA基因上从第680-700bp之间的21个碱基序列（5＇-AAAAACCACAACTAAGTA-3＇;SEQ ID No：6）和与第1261-1278bp之间的18个碱基互补的序列（5＇-CACTGATGAGTCCTGGAA-3＇;SEQ ID No：7）用作十字花科素的编码区的引物。十字花科素编码区在0.6kb左右有一条谱带。回收与这条带相应的DNA，并将其克隆在质粒pUC19的SamI位点（pCAS）上。pCAS（10ng）在做与芸苔素基因相同的处理之后，切除十字花科素的编码区并将其在反义方向上插在芸苔素启动子与NOS终止子之间。所得质粒在进行电击法转化时采用。用于土壤杆菌介导的转化的质粒按以下方法制备：将得自质粒pCRAS的包括芸苔素启动子、十字花科素反义基因和NOS终止子的DNA片段连接在pKM24的HindⅢ和EcoRⅠ位点上（pCAKM）。将所得质粒按上述方法转化到根瘤土壤杆菌EHA101中。具有导入的十字花科素反义基因的愈伤组织的转化、筛选和再生以与例2相同的方式进行，不同的是，把十字花科素编码区上从第1个bp到上游第18个bp之间的序列（SEQ ID NO：7）和与NOS终止子（如上）第1579-1595bp之间的17个碱基互补的序列用作PCR扩增的引物。
实例9  成熟种子中蛋白质的氨基酸组成分析。
以与例5相同的方法，对通过SDS-PAGE测定的十字花科素含量降低了的8个切成两半的半粒种子进行氨基酸分析。分析结果表明，十字花科素反义基因的导入导致总蛋白质的氨基酸组成中必需氨基酸，如半胱氨酸，甲硫氨酸和赖氨酸含量的增加。表3表示进行过转化的种子的氨基酸分析结果。
根据本发明，要改变油料种子作物种子里的氨基酸组成和脂肪酸组成是可行的。特别是，本发明提供的油料种子作物能产生具有理想的脂肪酸组成和/或氨基酸组成的高营养价值的种子，如油酸含量减少而亚油酸和亚麻酸含量增加的种子或必需氨基酸，如赖氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸含量提高了的种子。
序列表
（1）一般资料
（ⅰ）申请人：MITSUBISHI公司
MITSUBISHI KASEI公司
（ⅱ）发明名称：能产生具有改变过的氨基酸组成和脂肪酸组成的有用种子的油料种子作物
（ⅲ）序列数：7
（ⅳ）有关地址：
（A）收信人：
（B）街道：5-2，Marunouchi 2-chome，Chiyoda-Ku
（C）城市：东京
（E）国家：日本
（F）邮政编码：100
（ⅴ）计算机阅读形式：
（A）媒体类型：软盘
（B）计算机：IBM PC兼容型
（C）操作系统：PC-DOS/MS-DOS
（D）软件：Patent In Release ＃1.0，Version＃1.25
（ⅵ）本申请资料
（A）申请号：
（B）申请日：
（C）分类：
（ⅷ）律师/代理人资料：
（A）姓名：
（2）有关SEQ ID No：1的数据
（ⅰ）序列特征
（A）长度：19bp
（B）类型：核酸
（D）拓扑学：线型
（ⅱ）分子类型：合成DNA
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：1：
AAGCTTTCTT CATCGGTGA
（2）有关SEQ ID No：2的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：21bp
（B）类型：核酸
（D）拓扑学：线型
（ⅱ）分子类型：合成DNA
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：2：
CAAGATTAAA AACATACACGA
（2）有关SEQ ID No：3的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：20bp
（B）类型：核酸
（D）拓扑学：线型
（ⅱ）分子类型：合成DNA
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：3：
CTCATCAATA CAAACAAGAT
（2）有关SEQ ID No：4的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：20bp
（B）类型：核酸
（D）拓扑学：线型
（ⅱ）分子类型：合成DNA
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：4：
TATGTAAGGT TTTATCTAGG
（2）有关SEQ ID No：5的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：17bp
（B）类型：核酸
（D）拓扑学：线型
（ⅱ）分子类型：合成DNA
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：5：
GCATGACGTT ATTTATG
（2）有关SEQ ID No：6的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：21bp
（B）类型：核酸
（D）拓扑学：线型
（ⅱ）分子类型：合成DNA
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：6：
AAAAACCACA ACAACTAAGT A
（2）有关SEQ ID No：7的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：18bp
（B）类型：核酸
（D）拓扑学：线型
（ⅱ）分子类型：合成DNA
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：7：
CACTGATGAG TCCTGGAA

Claims (17)

1、一种用种子储存蛋白的反义基因转化的油料种子作物。
2、如权利要求1所述的油料种子作物，其特征在于所述种子储存蛋白是芸苔素（napin）。
3、如权利要求2所述的油料种子作物，其特征在于所述转化是为了改变种子里的氨基酸组成和脂肪酸组成。
4、如权利要求3所述的油料种子作物，其特征在于所述改变脂肪酸组成是指改进油酸、亚油酸和亚麻酸的含量。
5、如权利要求3所述的油料种子作物，其特征在于上述脂肪酸组成的改变是指提高亚油酸和亚麻酸的含量。
6、如权利要求1所述的油料种子作物，其特征在于编码储存蛋白的基因由nap A碱基序列表示。
7、如权利要求1所述的油料种子作物，其特征在于上述反义基因是以序列表中的SEQ ID No：3碱基序列和SEQ ID No：4碱基序列的互补序列为引物产生的合成DNA。
8、如权利要求1所述的油料种子作物，其特征在于储存蛋白质是十字花科素（cruciferin）。
9、如权利要求8所述的油料种子作物，其特征在于转化是为了改变种子里的氨基酸组成。
10、如权利要求9所述的油料种子作物，其特征在于上述氨基组成的改变是指改进赖氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸的含量。
11、如权利要求9所述的油料种子作物，其特征在于上述氨基酸组成的改变是指赖氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸含量的提高。
12、如权利要求1所述的油料种子作物，其特征在于编码储存蛋白的基因由cruA碱基序列表示。
13、如权利要求1所述的油料种子作物，其特征在于反义DNA是以序列表中的SEQ ID No：6碱基序列和与SEQ ID No：7的碱基序列互补的序列为引物产生的合成DNA。
14、一种载体包括种子特异启动子下游的一个油料作物种子储存蛋白质的反义基因。
15、一种制备转化的油料种子作物的方法，其特征在于通过把权利要求14所述载体和油料种子作物的下胚轴或原生质体悬浮在液体培养基中进行转化、愈伤组织发育并由愈伤组织再生作物。
16、一种改变油料种子作物的氨基酸组成和/或脂肪酸组成的方法，其特征在于通过把权利要求14所述载体和油料种子作物的下胚轴或原生质体悬浮在液体培养基中转化油料种子作物。
17、从权利要求1所述油料种子作物中获得的种子。
CN94105261A 1993-03-31 1994-03-31 能产生有用种子的油料种子作物 Pending CN1105704A (zh)

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