CN105866423A - 使用一组新型低丰度人类血浆蛋白生物标记对肝纤维化进行临床诊断 - Google Patents

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Abstract

本发明提出一组新型的用于诊断肝纤维化和肝硬化的人类血浆蛋白生物标记。目前没有可靠的评估肝纤维化的无创方式。基于2D‑PAGE的蛋白组学研究用于鉴别潜在的纤维化生物标记。分析了来自患有丙肝病毒(HCV)感染诱发的肝硬化的患者的血浆。鉴别了与肝瘢痕化相关且与病毒感染潜在相关的数种蛋白。这些生物标记可与国际公布WO/2008/031051中的多肽联合使用。这些新型生物标记的浓度可使用免疫分析来测定，其中，所述浓度将反映纤维化的程度。本发明提出所述新型生物标记中的每一个的纤维化评分分级。所有新型生物标记的分值相加的结果将给出更为可靠的纤维化程度指标，而非检测单个生物标记。

Description

使用一组新型低丰度人类血浆蛋白生物标记对肝纤维化进行临床诊断
本申请为2012年1月11日进入中国国家阶段、申请号为201080031411.7、申请日为2010年5月13日、发明名称为“使用一组新型低丰度人类血浆蛋白生物标记对肝纤维化进行临床诊断”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年5月14日提交的美国临时申请第61/178,334号的优先权。
技术领域
本申请总体上涉及使用一组抗体诊断肝纤维化或肝硬化的方法，所述抗体靶向一组丰度非常低的新型肝瘢痕化生物标记。这些新型蛋白还可用作肝炎、肝细胞癌(HCC)的生物标记以及肝瘢痕化、肝炎和HCC的药物靶标。
背景技术
肝纤维化：肝纤维化是创伤愈合反应，该创伤愈合反应以肝脏中瘢痕组织(即细胞外基质)的过度集聚为特征。组织的正常结构要素被过量的非功能性瘢痕组织取代。穿刺肝脏进行活检是诊断和评估纤维化的主要手段，但有充分证据显示该技术有许多限制和缺点，包括患者不适、疼痛、出血以及极少数病例中的死亡。此外，如果纤维化在整个肝脏当中不是均一的，那么，活检可能不可靠。肝纤维化可由包括酒精和病毒在内的多种因素引起。
肝硬化：肝硬化是肝瘢痕化的最严重的形式，并且，与肝纤维化不同，通常认为肝硬化是不可逆的且具有结节。在英国，肝硬化每年引起超过6000例的死亡，在美国，肝硬化每年引起大约27,000例的死亡，肝硬化是第九大致死因素(MacSween等，(2002)，Pathology of the Liver，第四版，ChurchillLivingstone)。肝硬化是HCC的主要风险因素，在肝癌的这个阶段，唯一的治疗手段是肝脏移植。在病毒诱发的肝癌病例中，肝瘢痕化和HCC可在移植后复发。有必要在可逆的肝瘢痕化早期阶段诊断纤维化，从而可预防不可逆的肝硬化。
丙型肝炎病毒：全球约1.7亿人口(即世界人口的3％(参见，例如WHO、J.Viral.Hepat.1999；6:35-47))感染丙型肝炎病毒(HCV、HepC)，美国约四百万人口感染丙型肝炎病毒。HCV是肝纤维化和肝硬化的主要病因。约80％急性感染HCV的个体成为慢性感染。因此，HCV是慢性肝炎的主要病因。一旦慢性感染该病毒，若不进行治疗病毒几乎绝不清除。在极少数病例中，HCV感染引发临床急性疾病甚至肝衰竭。慢性HCV感染在个体间可显著不同，其中一些个体具有临床上不明显的肝脏疾病或具有最轻度的肝脏疾病且从不发生并发症，而其它个体具有临床上明显的慢性肝炎并继续发展为肝纤维化和肝硬化。发展成肝硬化的携带HCV的个体中的约20％将发展为末期肝脏疾病并且发展成原发性肝癌的风险增加。
需要改进的方法来诊断患者中的肝纤维化和肝硬化。
发明内容
本发明提供检测纤维化和肝硬化的方法。
在一种实施方式中，本发明提供检测纤维化和肝硬化的方法，所述方法包括：(a)测定取自患者的生物样本中的HF-相关(HF-ASSOCIATED)多肽的水平；以及(b)将所述水平(a)与所述HF-相关多肽的对照水平进行比较以确定所述纤维化的阳性诊断或阴性诊断。这些生物标记可应用于表现出纤维化的任何疾病，所述纤维化例如肝纤维化、肾纤维化、心纤维化(cardialfibrosis)、皮肤纤维化、胰纤维化等等，但在特定的实施方式中所述纤维化为肝纤维化。本发明选择下组中的多肽：14-3-3蛋白ζ/δ、脂联素、甲清蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、α-2-HS-糖蛋白、载脂蛋白C-III、载脂蛋白E、C4b-结合蛋白β链、完整/裂解的补体C3dg、皮质类固醇结合球蛋白、纤维蛋白原γ链、pH 5.46至pH 5.49处的β结合珠蛋白、结合珠蛋白相关蛋白、血液结合素、免疫球蛋白J链、富亮氨酸α-2-糖蛋白、脂转移抑制剂蛋白、视黄醇结合蛋白4、血清对氧磷酶/芳香酯酶1、性激素结合球蛋白和锌-α-2-糖蛋白。这些生物标记可与国际公布WO/2008/031051中的多肽联合使用，所述多肽包括间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H4片段、α1抗胰凝乳蛋白酶、载脂蛋白L1、前清蛋白、白蛋白、CD5抗原样蛋白同等型、β2糖蛋白I、α2巨球蛋白及免疫球蛋白成分、结合珠蛋白的α1、α2和β链、补体成分(C3、C4和H因子-相关蛋白1)、脂联素、ApoE、凝血酶原、簇蛋白和血管紧张素原。在其它实施方式中，纤维化包括HF-相关多肽的差异调控。在其它实施方式中，样本取自血清或血浆。
在另一实施方式中，本发明提供检测HF-相关多肽的方法，所述方法包括：a)从患有纤维化或肝硬化的患者中分离生物样本，b)从未患有纤维化的患者中分离生物样本，c)用2D-PAGE分析来自a)和b)的样本，以及d)比较2D-PAGE结果以鉴别在患有和未患有纤维化或肝硬化的患者之间差异表达的多肽。使用2D-PAGE时，生物标记可使用常用的宽pH范围检测，所述宽pH范围例如pH 3至pH 10、pH 3至pH 11或pH 4至pH 7。丰度非常低的生物标记可用pH 3至pH 11的任何窄pH范围检测，所述窄pH范围例如但不限于：pH 3至pH 5.6、pH 3至pH 6、pH 3.9至pH 5.1、pH 4.7至pH 5.9、pH5至pH 8、pH 5.3至pH 6.5、pH 5.5至pH 6.7、pH 6至pH 11、pH 6.2至pH 7.5、pH 6.3至pH 8.3、pH 7至pH 10、pH 7至pH 11、pH 3.5至pH 4.5、pH 3至pH 7和pH 6至pH 9。覆盖这些窄pH范围的2D-PAGE凝胶也可用于鉴别其他疾病中的新型生物标记及药物靶标。
在另一实施方式中，本发明提供将纤维化严重程度分级的方法，所述方法包括：a)测定取自患者的生物样本中至少一种HF-相关多肽的水平；以及b)将所述患者的生物样本中的所述HF-相关多肽水平与预先测定的无纤维化至肝硬化的患者人群中的所述HF-相关多肽的水平进行比较。
在另一实施方式中，本发明提供在未治疗的个体中以及在治疗过程中的纤维化的预后方面有用的试剂盒，所述试剂盒包含HF-相关药剂，其中所述药剂特异性检测HF-相关多肽。在特定的实施方式中，所述药剂是结合HF-相关多肽的抗体或其功能等同物。这些抗体可用于进行免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定、蛋白斑点印迹、蛋白印迹(Western blot)、透射比浊法、散射比浊法等等。HF-相关多肽还可使用非抗体途径来定量，例如，但不限于，使用质谱进行多反应监测。所述试剂盒可进一步包含至少一种靶标，所述靶标特异性地检测用作预后指标的另一基因或基因产物。
在另一实施方式中，本发明提供测定纤维化的预后的方法，所述方法包括：(a)测定取自患者的生物样本中的HF-相关多肽的水平；及(b)将(a)的所述水平与所述HF-相关多肽的对照水平进行比较以确定所述纤维化的阳性诊断或阴性诊断。
附图说明
图1至图4这几幅图显示在主要的新型生物标记的表达中观察到的变化。每幅图显示2D-PAGE凝胶的放大区域，其中，所鉴别的蛋白的相应位置被圈出。图中显示了健康个体和肝硬化患者的代表性血浆凝胶图像。
图1显示脂转移抑制剂蛋白在正常血浆中出现但在肝硬化患者血浆中减少。
图2显示锌-α-2-糖蛋白在正常血浆中出现但在肝硬化患者血浆中减少。
图3显示pH 5.46至pH 5.49处的β结合珠蛋白的特征点(feature)减少。上方的图–β结合珠蛋白斑点的均匀分布阵列，该阵列显示正常血浆和肝硬化患者血浆无显著差别。下方的图–在约pH 5.46至pH 5.49处观察到的β结合珠蛋白斑点的放大图像，图中显示出在约pH 5.46至pH 5.49处观察到的β结合珠蛋白斑点在正常血浆中出现但在肝硬化患者血浆中减少。
图4显示肝硬化中补体C3的裂解减少。上方的图–显示补体C3dg未在正常血浆中出现但在肝硬化患者血浆中出现。下方的图–显示在补体C3α链的硫酯位点之前的补体C3α链的片段在正常血浆中出现但未在肝硬化患者血浆中出现。
具体实施方式
下列描述概括上面总结的发明。然而，本发明不限于所描述的特定方法学、试验方案、细胞系、动物种属、构建体、试剂且就其本身而言可改变。同样地，本文使用的术语仅描述特定实施方式，并非意于限定本发明的范围。
当与健康个体相比时，本发明的发明者发现多种蛋白在HCV-诱发的肝硬化患者的人类血浆样本中差异表达。该发现通过使用在凝胶基质中双向分离蛋白以给出离散蛋白斑点的技术来比较这些血清样本而实现。该方法使用pH3至pH 5.6的窄范围pH值固定pH梯度凝胶，该pH梯度凝胶不同于WO/2008/031051中使用的pH 3至pH 10的固定pH梯度凝胶。
除非另外定义，本文使用的所有技术术语和科学术语的含义与相关领域普通技术人员的普遍理解相同。
就描述及公开的目的而言，本文提及的所有公开出版物和专利通过引用并入本文，例如，可与本发明所述的内容结合使用的公开出版物中所描述的构建体和方法学。上面讨论的公开出版物及其全部内容在本发明的申请日之前被单独提供用于公开。本文不被解释为承认由于先于本发明的这种公开而本发明的发明人不享有在先权利。
a.定义
为方便起见，在下面提供说明书、实施例及附加的权利要求中采用的一些术语和短语的含义。
除非上下文另外明确说明，单数形式(“a”“an”和“the”)包括复数含义。
“2D-PAGE”是指双向聚丙烯酰胺凝胶电泳。
“ELISA”是指酶联免疫吸附测定。
“HCC”是指肝细胞癌。
“HCV”是指丙型肝炎病毒。
“HF”是指肝纤维化。
“kDa”是指千道尔顿。
“PBS”是指磷酸盐缓冲盐水。
“PBS-T”是指含吐温的PBS溶液。
“生物样本”包含取自有机体的、可用于诊断或监测分析的多种样本类型。该术语包含血液和生物来源的其他液体样本、固体组织样本(如活检样本)，或者由此而来的组织培养物或细胞及其后代。另外，该术语可包含循环肿瘤细胞或其他细胞。该术语尤其包含临床样本，并进一步包括细胞培养中的细胞、细胞上清液、细胞裂解液、血清、血浆、尿、羊水、生物液体及组织样本。该术语还包含获取后以任何方式处理的样本，所述处理例如用试剂处理、溶解、富集某些组分。
“生物分子序列”或“序列”是指多核苷酸或多肽序列的全部或部分。
“BLAST”是指基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment SearchTool)，它是检测与给定查询序列匹配的无间隔的子序列的一项技术。“BLASTP”是将氨基酸查询序列与蛋白序列数据库进行比较的BLAST程序。“BLASTX”是将核酸查询序列(双链)的六框概念翻译产物与蛋白序列数据库进行比较的BLAST程序。
在本文中可互换使用的“癌症”、“赘生物”和“肿瘤”是指表现出异常生长表型的细胞或组织，所述异常生长表型以细胞增殖显著失控为特征。本发明的方法及组合物尤其应用于癌前的(即，良性的)、恶性的、转移前的、转移的和非转移的细胞。
“纤维化以HF-相关多肽的差异调控为特征”是指具有表现出瘢痕化的组织的受治者，并且在所述瘢痕化的组织中HF-相关蛋白具有差异表达。
“纤维化表型”是指特征为纤维化细胞的多种生物现象。该现象可随纤维化的类型而变化，但纤维化表型通常由瘢痕组织形成中的异常情况来鉴别。
“细胞类型”是指来自给定来源(如，组织或器官)的细胞或处于给定分化状态中的细胞，或与给定病理或基因组成相关的细胞。
“互补的”是指探针分子与其靶标相互作用表面的拓扑相容性或相互配对。可将靶标与其探针描述为互补的，并且，接触表面的特征是彼此互补的。
术语“可检测的”是指使用本申请中描述的和本领域技术人员熟知的技术可观察的多肽表达模式。例如，多肽表达可通过标准技术(包括诸如蛋白印迹之类的免疫测定)来“检测”。
“诊断(“diagnosis”和“diagnosing”)”通常包括确定受治者对疾病或失调的易感性、确定受治者目前是否患有疾病或失调、对患有疾病或失调的受治者进行预后(例如，对转移前或转移的癌状态或纤维化的鉴别)和诊断评价(therametrics)(例如，监测受治者的症状以提供关于治疗效果或效力的信息)。
“差异表达”是指在基因的时间表达模式和组织表达模式中量的差异及质的差异。例如，差异表达的基因可在正常状态与疾病状态中使其表达被激活或完全不激活。这种性质上调控的基因可在受治者给定的组织、细胞类型或血清/血浆中表现出表达模式，所述表达模式在对照状态或疾病状态下是可检测的，或在对照状态和疾病状态下皆可检测但具有不同表达。如本文所使用的“差异表达的蛋白”是指唯一地鉴别出了差异表达的蛋白的氨基酸序列，从而使样本中差异表达的蛋白的检测与样本中差异表达的蛋白的出现相关联。
“表达”通常是指多核苷酸序列经历成功的转录和翻译，从而表达可检测水平的氨基酸序列或蛋白的过程。在一些语境中，表达是指mRNA的产生。在其它语境中，表达是指蛋白或其片段的产生。所述片段可通过酶切或者正常状态或疾病状态特有的生物过程产生。
“表达产物”或“基因产物”是当有机体中的基因被转录或翻译或翻译后修饰时产生的生物分子，例如蛋白或mRNA。
“蛋白片段”是指蛋白的一部分。例如，蛋白片段可包含通过消化从培养的细胞分离的全长蛋白而获得的多肽。在一种实施方式中，蛋白片段包含至少约6个氨基酸。在另一实施方式中，所述片段包含至少约10个氨基酸。在又一实施方式中，蛋白片段包含至少约16个氨基酸。
在本申请的上下文中，术语“功能等同物”是指具有与全部或部分天然HF-相关蛋白基本相似的功能特性或结构特性的蛋白。术语“功能等同物”意于包括天然HF-相关蛋白的“片段”、“突变子”、“衍生物”、“等位基因”、“杂交体”、“变体”、“类似物”或“化学衍生物”。
在免疫球蛋白的上下文中，术语“功能等同物”是指表现出与母体免疫球蛋白基本相似的免疫结合特性的免疫球蛋白分子。“免疫结合特性”是指在免疫球蛋白分子与该免疫球蛋白的特异抗原之间发生的非共价相互作用类型。实际上，例如，单克隆抗体免疫球蛋白的功能等同物可抑制母体单克隆抗体与其抗原结合。功能等同物可包含F(ab')2片段、F(ab)分子、Fv片段、噬菌体展示技术单链可变片段(scFv)、单结构域抗体、嵌合抗体等等，只要免疫球蛋白表现出母体免疫球蛋白的特性。
术语“融合蛋白”是指由两个或两个以上多肽构成的蛋白，虽然典型地，所述多肽不以天然状态连接，但所述多肽由其相应的氨基和羧基末端通过肽键连接形成单一的连续多肽。应当理解的是，两个或两个以上的多肽成分可直接相连或通过肽连接体/间隔区间接相连。
“基因”是指包含产生多肽或前体所需的调控序列和编码序列的多核苷酸序列。多肽可由全长编码序列编码或由编码序列的任何部分编码。基因可构成不间断的编码序列或者基因可包含以合适的剪接位点为边界的一个或一个以上内含子。此外，基因在编码区或非翻译区内可包含一种或一种以上修饰，所述修饰可影响表达产物的生物活性或化学结构、表达速率或表达调控方式。这样的修饰包括但不限于：一个或一个以上核苷酸的突变、插入、缺失和取代。就这点而言，这样修饰的基因可称为“天然”基因的“变体”。
“基因表达”是指多核苷酸序列经历成功的转录和翻译，从而表达可检测水平的核苷酸序列的过程。
如本文所使用的术语“同源性”是指互补性的程度。可存在部分同源或完全同源(即，一致)。部分互补序列是至少部分抑制相同序列与靶多核苷酸的杂交的序列；部分互补序列也是指使用功能性术语“基本同源”。低严格条件下，对完全互补序列与靶序列杂交的抑制可使用杂交测定(DNA印迹(Southernblot)或RNA印迹(Northern blot)、液相杂交等等)来检测。低严格条件下，基本同源的序列或探针将竞争并抑制完全同源的序列或探针与靶序列的结合(即，杂交)。这不是说低严格条件是允许非特异性结合的条件；低严格条件要求两序列的彼此结合是特异性的(即，选择性的)相互作用。没有非特异性结合可通过使用第二靶序列来检验，所述第二靶序列甚至缺乏部分互补程度(如，低于30％的一致性)；没有非特异性结合时，探针将不会与第二非互补的靶序列杂交。
本文可互换使用的“个体”、“受治者”、“宿主”和“患者”是指需要诊断、处理或治疗的任何哺乳动物受治者。在一种优选的实施方式中，个体、受治者、宿主或患者是人类。其他受治者包括已知发生了HCC和肝炎的土拨鼠和鸭。其他受治者可包括，但不限于：牛、马、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、灵长类及小鼠。
“分离的”是指在与天然生成多核苷酸、多肽、免疫球蛋白或宿主细胞的环境不同的环境中的多核苷酸、多肽、免疫球蛋白或宿主细胞。
“标记”是指能够直接提供可检测的信号的药剂或通过与信号产生系统中的一个或一个以上额外成员相互作用而提供可检测的信号的药剂。可直接检测且可在本发明中使用的标记包括荧光标记。具体的荧光基团包括荧光素、罗丹明、BODIPY、花青染料等等。本发明还考虑使用放射性同位素(例如35S、32P、3H，等等)作为标记。也可使用诸如胶体金或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚乙烯、乳胶)珠之类的色度标记。参见，例如，美国专利第4,366,241号、第4,277,437号、第4,275,149号、第3,996,345号、第3,939,350号、第3,850,752号和第3,817,837号。
术语“正常生理条件”是指有生命的有机体或细胞内的典型条件。尽管一些器官或有机体提供极端条件，但是有机体内和细胞内环境通常在pH 7左右(即，从pH 6.5至pH 7.5)变化，包含水作为主要溶剂，并存在于高于0℃且低于50℃的温度条件下。不同盐浓度取决于用作参考的器官、有机体、细胞或细胞区室。
本文可互换使用的“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，这些术语包括，但不限于：单链、双链或多链的DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体或包含嘌呤碱基和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的多聚体。这些术语还包括，但不限于：包含内含子序列的mRNA或cDNA。多核苷酸的骨架可包含糖和磷酸基团(如通常可在RNA或DNA中发现的)或者修饰的或取代的糖或磷酸基团。可选地，多核苷酸骨架可包含诸如亚磷酰胺之类的合成亚单位的多聚体，因此多核苷酸骨架可为寡脱氧核苷酸的氨基磷酸酯或混合的氨基磷酸酯-磷酸双酯寡聚体。多核苷酸可包含修饰的核苷酸(例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物)、尿嘧啶、其他糖和诸如氟代核糖和硫代酯之类的连接基团，以及核苷酸支链。核苷酸序列可由非核苷酸成分打断。多核苷酸可在聚合后进行进一步修饰，例如通过与标记成分结合来修饰。此定义中包括的其他类型的修饰为加帽、用类似物取代天然生成的核苷酸中的一个或一个以上，以及引入多核苷酸连接于蛋白、金属离子、标记成分、其他多核苷酸或固相支持物的方法。术语“多核苷酸”还包括肽核酸。多核苷酸可进一步包括基因组DNA、cDNA或DNA-RNA杂交体。
本文可互换使用的“多肽”和“蛋白”是指任何长度的氨基酸的聚合形式，可包括翻译的、非翻译的、化学修饰的、生物化学修饰的和衍生的氨基酸。多肽或蛋白可为天然生成的、重组的或合成的或这些的任何组合。此外，多肽或蛋白可包含天然生成的蛋白或肽的片段。多肽或蛋白可为单个分子或可为多分子复合物。另外，这样的多肽或蛋白可具有修饰的肽骨架。这些术语包括融合蛋白，所述融合蛋白包括含有异源氨基酸序列的融合蛋白，含有异源和同源前导序列的、含有或不含有N-末端蛋氨酸残基、免疫标记蛋白的融合蛋白等等。
疾病或失调的“易染病体质”指个体对该疾病或失调的易感性。例如，与正常/野生型个体相比，易感的个体在统计学上更可能患上癌症或纤维化。
术语“预后(“prognosis”和“prognose”)”是指预测疾病过程的行为或技术。另外，该术语是指通过疾病的一般过程所预期的或由个体病例的特定特征所显示的从疾病中生存并恢复的前景。此外，该术语是指根据其体征和症状鉴别疾病的行为或技术。
术语“预后指标”或“指标”是指可作为预后的根据或基础的任何事物或与预后的根据或基础相关的任何事物。这些术语进一步指鉴别诊断的任何根据或基础，包括如本文描述的测试结果和基因表达的特性，以及将疾病或病症与表现出类似症状的其他疾病或病症相区分。另外，术语“指标”或“预后指标”是指包括如本文描述的测试结果和基因表达的特性在内的任何根据或基础，术语“指标”或“预后指标”可用于区分恶性疾病可能的过程。
“蛋白捕获剂”是指可将蛋白结合于自身的分子或多分子复合物。在一种实施方式中，蛋白捕获剂以基本特异的方式结合它们的结合配偶体。在一种实施方式中，蛋白捕获剂可表现出低于约10-6的解离常数(KD)。蛋白捕获剂可包含诸如蛋白或多核苷酸之类的生物分子。该生物分子可进一步包含天然生成的、重组的或合成的生物分子。蛋白捕获剂的例子包括免疫球蛋白、抗原、受体或其他蛋白或其部分或片段。此外，应当理解的是，蛋白捕获剂不限于仅通过非共价相互作用与其结合配偶体相互作用的药剂。相反，蛋白捕获剂还可共价连接于与它们结合的蛋白。例如，蛋白捕获剂在结合后可与其结合配偶体发生光交联。
“序列一致性”是指相似或互补的程度。可存在部分一致性或完全一致性。部分互补序列是至少部分抑制相同序列与靶多核苷酸杂交的序列；也指使用功能性术语“基本一致”。低严格条件下，对完全互补序列与靶序列的杂交的抑制可使用杂交测定(DNA印迹或RNA印迹、液相杂交等等)来检测。低严格条件下，基本一致的序列或探针将竞争并抑制完全一致序列或探针与靶序列的结合(即，杂交)。这不是说低严格条件是允许非特异性结合的条件；低严格条件要求两序列彼此的结合是特异性的(即，选择性的)相互作用。没有非特异性结合可使用第二靶序列来检验，所述第二靶序列甚至缺乏部分程度的互补性(如，低于30％的一致性)，没有非特异性结合时，探针将不会与第二非互补靶序列杂交。
本文中对两个核酸或多肽序列观察序列一致性的另一方法包括参考当在特定区域内进行最大对应性的比对时的两个序列中的相同残基。如本文所使用的序列一致性的百分数是指通过在比较窗口中比较两个最佳对齐序列而测定的值，其中与两个序列的最佳比对的参考序列(不包含添加或缺失)相比，比较窗口中部分多核苷酸序列可包含添加或缺失(即，缺口)。所述百分数通过下列方式计算：测定在两条序列中都出现的相同核酸碱基位点的数目以产生匹配位点数目，用匹配位点数目除以比较窗口中位点的总数，然后将结果乘以100，从而产生序列一致性的百分数。
“严格条件”是指在此条件下探针可与其靶多核苷酸序列杂交而不与其他序列杂交的条件。严格条件是依赖序列的(例如，较长序列在较高温度的条件下特异性杂交)。通常，选择严格条件为约5℃，低于特定序列在限定的离子强度和pH条件下的热熔点(Tm)。Tm是平衡时50％与靶序列互补的探针与靶序列杂交的温度(在限定的离子强度、pH和多核苷酸浓度条件下)。典型地，严格条件对短探针(例如，10至50个核苷酸)而言是约pH 7.0至约pH 8.3，盐浓度为至少约0.01M至约1.0M的钠离子浓度(或其他盐)，且温度为至少约30℃的条件。严格条件还可通过加入诸如甲酰胺之类的去稳定剂而实现。
“基本纯化的”是指从自然环境中分离出来的化合物，且所述化合物至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约83％，至少约85％，至少约88％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，至少约99.9％，或至少约99.99％或更多不含与其天然结合的其它组分。
“靶蛋白”是指与蛋白捕获剂特异性杂交或结合的多肽，所述多肽通常来源于生物样本。所述靶蛋白的存在或缺乏会被检测，或者所述靶蛋白会被定量。所述靶蛋白具有可被指向靶标的相应的蛋白捕获剂识别的结构。所述靶蛋白或氨基酸还可指蛋白捕获剂所指向的更大蛋白的特定亚结构或期望检测其表达水平的整体结构(例如，基因或mRNA)。
术语“治疗(“treatment”，“treating”，“treat”，等等)”是指获得预期的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可为预防性的，和/或所述效果就部分或完全稳定或者部分或完全治愈疾病和/或由疾病引起的不利影响而言可为治疗性的。“治疗”包括哺乳动物(尤其是人类)疾病的任何治疗，并包括：(a)预防在受治者中发生疾病或症状，所述受治者可易于感染所述疾病或症状但尚未诊断出患有该疾病或症状；(b)抑制疾病症状，即，阻止其发展；或者(c)缓解疾病症状，即，使疾病或症状复原。
b.HF-相关多肽
一方面，本发明涉及“HF-相关多肽”，所述“HF-相关多肽”包括其差异表达与肝纤维化相关的多肽。HF-相关多肽还包括天然生成的蛋白的变体，其中这样的变体与天然生成的蛋白相同或基本相似。总体上，由BLAST检测时，变体多肽的序列与本文描述的HF-相关多肽具有至少约80％的序列一致性，通常具有至少约90％的序列一致性，且更通常地，具有至少约98％的序列一致性。变体多肽可为天然或非天然糖基化的。
总体上，如用本领域熟知的方法(例如BLAST)所测定的，本文描述的HF-相关多肽的变体具有大于至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约83％、至少约85％、至少约88％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.9％或可大于至少约99.99％的序列一致性。
在一种实施方式中，变体HF-相关多肽可为突变多肽。HF-相关多肽中的突变可由氨基酸取代、添加或缺失(但不限于此)产生。氨基酸取代可为保守氨基酸取代或去除非必须氨基酸的取代。总体上，保守氨基酸取代是保持被取代氨基酸的常规电荷、疏水性、亲水性和/或位阻效应的氨基酸取代。
在一些突变的HF-相关多肽中，氨基酸可被取代以改变磷酸化位点或乙酰化位点。
重要的是，变体多肽可设计成保持或具有提高的蛋白特定区域(例如，功能性结构域和/或与共有序列有关的区域，其中多肽是蛋白家族成员)的生物活性。用于产生变体的氨基酸改变的选择可基于氨基酸的可接近性(内部的与外部的)、变体多肽的热稳定性、预期糖基化位点、预期二硫桥、预期的金属结合位点及脯氨酸环内的预期取代。半胱氨酸耗竭突变蛋白可依照美国专利第4,959,314号的公开内容而产生。
变体还包括本文公开的HF-相关多肽的片段，尤其是生物活性片段及对应于功能结构域的片段。典型地，目标片段将为至少约10aa至至少约15aa长，通常至少约50aa长，并可长达300aa或更长。本文描述的蛋白变体由本发明范围内的多核苷酸编码。
本发明的HF-相关多肽在非天然生成的环境中提供，例如，从其天然生成的环境中分离。在一些实施方式中，HF-相关蛋白以基本纯化的形式存在。
c.HF-相关药剂：调节剂及结合配偶体
另一方面，本发明提供“HF-相关药剂”，所述HF-相关药剂是指由“HF-相关多肽结合配偶体”构成的一类分子。
HF-相关多肽结合配偶体是结合于HF-相关多肽的分子。示例性的多肽结合配偶体是免疫球蛋白。结合配偶体可调节HF-相关多肽的生物活性，但毋需如此。
d.免疫球蛋白
用于鉴别HF-相关蛋白的HF-相关药剂包括特异性结合于HF-相关多肽的免疫球蛋白及免疫球蛋白的功能等同物。术语“免疫球蛋白”和“抗体”可互换使用且在本文中以其最广的意义使用。因此，“免疫球蛋白”和“抗体”包括完整单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出预期的生物活性。在一种实施方式中，受治者免疫球蛋白包含至少一个人类恒定结构域。在另一实施方式中，HF-相关药剂免疫球蛋白包含表现出与人类恒定结构域至少约90％至95％的序列一致性但保持人类效应功能的恒定结构域。免疫球蛋白HF-相关药剂或其功能等同物可为人类的、嵌合的、人源化的、鼠的、CDR-嫁接的、噬菌体展示的、细菌展示的、酵母展示的、转基因小鼠产生的、诱变的和随机化的。
i.一般性抗体
术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括可结合抗原的完全组装的抗体和抗体片段(例如，Fab’、F’(ab)2、Fv、单链抗体、双价小抗体)，包括重组抗体和抗体片段。优选地，免疫球蛋白或抗体是嵌合的、人类的或人源化的。
重链和轻链的可变结构域识别同源抗原的特定表位或结合于同源抗原的特定表位。术语“表位”是指免疫球蛋白的可变末端结合的抗原上的特异性结合位点或抗原决定簇。表位可为线性的，即，由在原HF-相关序列中发现的氨基酸残基序列组成。表位也可为构象的，从而使得免疫球蛋白识别在折叠的HF-相关分子中发现的3-D结构。表位也可为线性与构象性元件的组合。此外，如由目标方位的肿瘤细胞表达的分子的碳水化合物部分也可为表位。
如果：1)免疫球蛋白表现出结合活性的阈值水平，和/或2)免疫球蛋白不与已知的相关多肽分子进行显著地交叉反应，那么认为所述免疫球蛋白是“特异性结合的”。本领域普通技术人员可容易地测定免疫球蛋白的结合亲和力，例如，通过Scatchard分析(Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.51:660-672、1949)来测定。在一些实施方式中，本发明的免疫球蛋白以高于其他蛋白至少103倍，更为优选地至少104倍，更为优选地至少105倍，甚至更为优选地至少106倍的水平结合于HF-相关蛋白。
ii.多克隆抗体和单克隆抗体
本发明的免疫球蛋白可为多克隆的或单克隆的，并可由任何本领域熟知的方法产生。
优选地，多克隆抗体通过多次皮下(sc)、腹膜内(ip)或肌肉内(im)注射相关抗原和佐剂而在动物中产生。将相关抗原结合于蛋白可以是有用的，所述蛋白在待免疫的物种中是免疫原性的。另外，诸如明矾之类的聚集剂或其他药剂适用于增强免疫反应。
术语“单克隆抗体”指从基本同源的抗体群获得的抗体。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一的抗原位点。此外，与典型地包括针对不同决定簇的不同抗体的多克隆抗体的制备不同，每个单克隆抗体针对抗原的单个决定簇。
除了其特异性外，单克隆抗体的优点还在于他们可被合成而不被其他免疫球蛋白污染。例如，单克隆抗体可通过杂交瘤方法或通过重组DNA方法产生。单克隆抗体HF-相关药剂还可从噬菌体抗体文库中分离。
iii.嵌合抗体和人源化抗体
根据可变区可来自一个物种(例如啮齿类)，恒定区可来自第二物种(例如人)这种定义，HF-相关多肽结合免疫球蛋白或抗体可为“嵌合的”。
非人类HF-相关蛋白结合抗体的“人源化”形式是嵌合抗体，所述嵌合抗体含有来自非人类免疫球蛋白的最少序列。大多数情况下，人源化抗体是其中受体高变区的残基被具有期望的特异性、亲和性及能力的非人类物种高变区的残基(供体抗体)取代的人类免疫球蛋白(受体抗体)，所述非人类物种例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类。一些情况下，人类免疫球蛋白的骨架区(FR)残基被相应的非人类残基取代。此外，人源化抗体可包含未在受体抗体或供体抗体中发现的残基。
通常，人源化抗体可包含基本全部的至少一个可变结构域，且典型地，人源化抗体可包含基本全部的两个可变结构域，其中，全部或基本全部高变环对应于非人类免疫球蛋白的高变环且全部或基本全部FR是人类免疫球蛋白序列的FR。在一种实施方式中，人源化抗体包含表现出与受体(非人类)FR(例如，鼠FR)的序列一致性为至少65％的人源化FR。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(尤其是人类免疫球蛋白)的至少一部分。
本领域已描述了对非人类抗体进行人源化的方法。优选地，人源化抗体含有从非人类来源引入的一个或一个以上氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常称为“导入”残基，这些非人类氨基酸残基典型地取自“导入”可变结构域。人源化基本上可通过用高变区序列取代人类抗体的相应序列来实现。因此，这样的人源化抗体是嵌合的，其中，用非人类物种中的相应序列取代基本上小于完整人类可变结构域的区域。实际上，典型地，人源化抗体是人类抗体，在该人类抗体中，一些高变区残基以及可能是一些FR残基被啮齿类抗体类似位点中的残基取代。待用于制备人源化抗体的人类可变结构域(轻链和重链)的选择对降低抗原性是非常重要的。
其他方法一般包括对抗体受体可变区骨架赋予供体CDR结合亲和力。一种方法包括同时嫁接并优化可变区结合片段的结合亲和力。另一方法涉及优化抗体可变区的结合亲和力。
iv.抗体片段
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、双价小抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。
对抗体进行木瓜酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段具有单个抗原结合位点，以及残余的“Fc”片段。Fab片段还包含轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CHI)。
胃蛋白酶处理产生含有两个抗原结合位点的F(ab’)2片段且该片段仍能与抗原交联。Fab’片段与Fab片段不同之处在于Fab’片段的重链CHI结构域羧基末端添加了几个残基，所述残基包括抗体铰链区的一个或一个以上半胱氨酸。Fab’-SH是其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有至少一个游离的巯基的Fab’在本文中的名称。F(ab’)2抗体片段起初作为成对Fab’片段而产生，所述成对Fab’片段之间含有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联为本领域所熟知的。
“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由一个重链可变结构域与一个轻链可变结构域以紧密的非共价结合方式形成的二聚体构成。在此构型中，每个可变结构域的三个高变区互相作用以限定VH-VL二聚体表面的抗原结合位点。六个高变区共同地赋予抗体抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个高变区的Fv的一半)也有能力识别并结合抗原，尽管亲和力比整个结合位点低。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中，这些结构域存在于单个多肽链中。Fv多肽可进一步包含VH和VL结构域之间的多肽连接体，所述多肽连接体能够使scFV形成抗原结合的预期结构。参见PLUCKTHUN，113THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES 269-315(Rosenburg和Moore主编1994)。另外参见国际公布WO 93/16185、美国专利第5,587,458号和第5,571,894号。
为了产生抗体片段已开发出多种技术。传统地，这些片段通过蛋白酶水解消化完整抗体而得到。然而，现在这些片段可直接由重组宿主细胞产生。
v.结合与标记
抗-HF-相关蛋白抗体可以它们“裸露的”形式或非结合的形式给药，或可具有与它们结合的其它药剂。
例如抗体可为可检测地标记的形式。抗体可通过使用放射性同位素、亲和标记(例如生物素、亲和素等)、酶标(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、荧光标记(例如FIFC或罗丹明等)、顺磁性原子等等而被可检测地标记。实现这样的标记的过程为本领域所熟知的。
vi.双特异性抗体
本发明的双特异性抗体是含有两个抗原结合位点的小抗体片段。每一片段包含重链可变结构域(VH)，所述重链可变结构域(VH)连接于在同一多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)。通过使用长度太短以致于无法使在同一条链上的两个结构域配对的连接体，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。
制备双特异性抗体的方法为本领域所熟知。全长双特异性抗体的传统生产是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性。
在另一方法中，具有预期的结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)可融合于免疫球蛋白恒定结构域序列。具体地，可变结构域与免疫球蛋白重链恒定结构域融合，所述重链恒定结构域包含至少部分铰链区、CH2区和CH3区。在一种实施方式中，融合蛋白包含第一重链恒定区(CHI)，因为它含有轻链结合必需的位点。编码免疫球蛋白重链融合和免疫球蛋白轻链(如果需要的话)的多核苷酸可插入单独的表达载体中并共转染到合适的宿主有机体内。当构建体中所使用的不等比例的三条多肽链提供最优产量时，上述方法在调整实施方式中的三个多肽片段的相互比例方面提供高度的灵活性。然而，当至少两条多肽链以相等速率表达引起高产时，或者当所述速率没有特别意义时，在一个表达载体中插入两条或全部三条多肽链的编码序列是可能的。
双特异性抗体还使用亮氨酸拉链和单链Fv(sFv)二聚体来产生。
e.纤维化治疗的诊断、预后及评估
因此，另一方面，本发明提供使用本文描述的HF-相关多肽诊断及预后纤维化的方法。在具体的非限制性实施方式中，该方法在检测细胞或血清/血浆中的HF-相关多肽、促进受治者中纤维化的诊断和受治者中纤维化严重性的诊断、促进受治者预后的确定、测定受治者对纤维化的易感性及评估受治者对治疗的响应性(例如，通过提供对治疗效果的测量(例如，在化疗方案之中或之后评估肿瘤负荷))方面有用。这些方法可包括检测患者生物样本(例如，血清/血浆或疑似或即将产生的纤维化组织或细胞)中HF-相关多肽的水平。本发明的检测方法可在分离的细胞上或在全部组织或体液(例如，血液、血浆、血清、尿液，等等)中体外或体内实施。在一种实施方式中，HF-相关多肽可用来检测并评估纤维化。这些生物标记可应用于表现出纤维化的任何疾病，例如肝纤维化、肾纤维化、心纤维化、皮肤纤维化、胰纤维化等，但更优选地，所述纤维化是肝纤维化。
f.检测HF-相关多肽
本发明提供检测血清或血浆中HF-相关多肽的方法。各种已知方法中的任何一种均可用于检测，包括但不限于：使用编码的多肽的特异性抗体的免疫测定和对编码的多肽的功能性检测，所述使用编码的多肽的特异性抗体的免疫测定例如，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、蛋白斑点印迹、蛋白印迹、透射比浊法、散射比浊法等等；所述对编码的多肽的功能性检测例如生物活性。HF-相关多肽还可使用非抗体途径来定量，所述非抗体途径例如，但不限于，使用质谱进行多反应监测。
在阅读本发明的说明书之后，对本领域普通技术人员来说显而易见的是，本文所述的检测方法和其他方法可易于改变。这样的改变在本发明预期的范围之内。例如，在上面的检测方案中，检测中使用的探针可固定于固相支持物上，且测试样本与固定的探针接触。测试样本与探针的结合随后可以各种方式检测，例如，通过检测结合于测试样本的可检测标记，从而有利于检测测试样本-固定的探针复合物。
本发明进一步提供使用HF-相关多肽的特异性抗体检测生物样本中HF-相关多肽的存在和/或测量HF-相关多肽水平的方法。具体地，检测生物样本中HF-相关多肽的存在的方法可包含如下步骤：使样本与单克隆抗体接触并检测样本中抗体与HF-相关多肽的结合。更具体地，抗体可使用化合物来标记，从而产生可检测信号，所述化合物包括但不限于：放射性标记、酶、发色团和荧光基团。
与合适的对照相比时，检测到HF-相关多肽的特异性抗体或其功能等同物的特异性结合是HF-相关多肽存在于样本中的象征。合适的对照包括已知不含HF-相关多肽的样本和与非特异性针对编码的多肽的抗体(例如，抗-独特型抗体)接触的样本。本领域已知检测特异性抗体-抗原相互作用的各种方法并可用于下列方法，包括但不限于，标准免疫组织学方法、免疫沉淀、酶免疫分析和放射免疫测定。一般而言，特异性抗体将直接或间接地被可检测地标记。直接标记包括放射性同位素；产物可检测的酶(例如，荧光素酶、3-半乳糖苷酶，等等)；荧光标记(例如，异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白，等等)；发射荧光的金属(例如，通过诸如EDTA之类的金属螯合基团连接于抗体的112Eu或镧系元素的其他成员)；化学发光化合物(例如，鲁米诺、异鲁米诺、吖啶盐，等等)；生物发光化合物(例如，荧光素、水母蛋白(绿色荧光蛋白)，等等)。抗体可连接(偶联)于不溶支持物，例如聚苯乙烯板或珠。非直接标记包括编码的多肽的特异性抗体(“特异性一抗”)的特异性二抗和特异性结合配对物的成员，其中，所述二抗如上文所述被标记，所述特异性结合配对物的成员例如，生物素-亲和素，等等。生物样本可接触并固定于诸如硝化纤维之类的固体支持物或载体上，所述固体支持物或载体能够固定细胞、细胞颗粒或可溶蛋白。随后所述支持物可用合适的缓冲液来洗涤，然后与可检测地标记的特异性一抗接触。检测方法是本领域所知晓的并将根据可检测标记发射的信号来选择检测方法。检测一般通过与合适对照及合适标准进行对比来实现。
g.试剂盒
检测方法可作为试剂盒的部分而提供。因此，本发明还提供用于检测生物样本中HF-相关多肽的存在和/或检测HF-相关多肽水平的试剂盒。使用这些试剂盒的步骤可由临床实验室、实验性实验室、医师或个人进行。本发明的试剂盒用于检测在纤维化过程中差异性表达的HF-相关多肽。该试剂盒可提供在步骤中有用的额外组分，包括，但不限于，缓冲剂、展开剂、标记、反应表面、检测方法、对照样本、标准、说明书及解释信息。
实施例
比较来自健康个体的血浆与来自肝硬化患者的血浆时建立的差异表达蛋白
与健康个体相比时，本发明的发明者发现多种蛋白在HCV-诱发的肝硬化患者的人类血浆样本中差异表达。该发现通过使用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)来比较这些血浆样本而实现，所述双向聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种在凝胶基质上双向分离蛋白得到离散蛋白斑点的技术。使用宽范围pH 3至pH 10的2D-PAGE先前已在国际公布WO/2008/031051中使用以鉴别肝纤维化的血清中的生物标记。本发明中纤维化生物标记的鉴别不同于国际公布WO/2008/031051，因为使用了窄范围pH 3至pH 5.6。选择此pH范围是因为它在三种丰度最高的血浆/血清蛋白(清蛋白、IgG、铁传递蛋白)的主要同等型的范围之外。这是首次将该pH 3至pH 5.6范围用于生物标记的发现。
新型生物标记在疾病中的发现受血清和血浆中的跨越了十个数量级的动态蛋白浓度范围的限制。因此，高丰度蛋白(尤其是白蛋白、免疫球蛋白和铁传递蛋白)限制了低丰度蛋白的检测。为了克服寻找生物标记中的这个问题，很多人尝试了基于抗体和基于染料亲和力的初步分离策略以在电泳前从样本中将高丰度蛋白耗竭从而提高低丰度蛋白的表现。但是，免疫沉淀法是昂贵的，因为需要大量抗体来耗竭这些高丰度的蛋白，而染料亲和法效率较低且特异性较低，伴随着大量非白蛋白的不必要的去除，且因此可能在蛋白质组分析中除去了潜在的生物标记。不像本发明使用的大量蛋白(2mg)，由于高丰度蛋白除去过程中的回收问题以及浓缩过程中的损失，多个样本在耗竭后以类似的高水平蛋白加样很有挑战性。
虽然有血浆中高丰度蛋白的问题，国际公布WO/2008/031051中已在宽范围pH 3至pH 10中使用2D-PAGE成功鉴别了肝纤维化的几个新型候选生物标记。本申请中，这组肝纤维化的生物标记通过使用窄范围pH 3至pH 5.6的2D-PAGE得以增加，该范围在白蛋白、免疫球蛋白和铁传递蛋白的主要同等型范围之外，从而使得加样的蛋白比国际公布WO/2008/031051多四倍。这使低丰度特征点的表现得以提高且使分离得以改善。使用此pH范围实现了血清酸性蛋白组及血浆酸性蛋白组基于凝胶的分离得以显著改善，并使在使用宽范围pH 3至pH 10的国际公布WO/2008/031051中不可见的低丰度肝纤维化生物标记得以鉴别。
实施例1
双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)
为了鉴别HCV-诱发的肝瘢痕化的生物标记，在基于2D-PAGE的蛋白组学研究中分析健康个体的血浆样本和HCV-诱发的肝硬化患者的血浆样本(每组6名个体)。全部血浆样本收集于P100管(BD，Oxford，UK)中。选择这些P100血浆管是因为与其他血液收集管不同，它们含有专有蛋白稳定剂，所述专有蛋白稳定剂当血液被收集时立刻溶解，所述专有蛋白稳定剂提高蛋白的回收及保存，使它们适用于蛋白组分析和生物标记的发现。与分析来自不同程度肝纤维化患者的血清的国际公布WO/2008/031051不同，本发明仅集中探讨来自健康个体的样本和来自肝硬化患者的样本之间差异表达的蛋白。采用该方法是因为先前在轻度纤维化和中度纤维化中鉴别的所有差异表达蛋白在肝硬化中也被发现，这表明在本研究中分析这些中间阶段将不会产生任何其它候选纤维化生物标记。将2毫克血浆蛋白在第一向凝胶中使用pH 3至pH 5.6的非线性梯度通过电荷分离，然后在第二向中使用9％至16％(w/v)的SDS-PAGE梯度通过分子量(尺寸)分离。如Gangadharan等，(2007)在Clin.Chem.，53，1792中所述的那样进行电泳、荧光染色和凝胶扫描。
实施例2
差异图像分析与蛋白鉴别
通过计算机辅助图像分析，在正常血浆样本与肝硬化血浆样本之间比较生成的斑点的二维阵列。全部2D-PAGE凝胶的扫描图像由如Gangadharan等，(2007)，Clin.Chem.，53，1792所述的计算机辅助图像分析来进行分析。大于或等于2倍差异的差异表达改变被认为是显著的。如Gangadharan等，(2007)，Clin.Chem.，53，1792所述，总共57个差异表达的特征点被切割、用胰蛋白酶消化并进行质谱分析。
实施例3
鉴别肝硬化引起的肝纤维化的人类血浆生物标记
差异图像分析显示了潜在的血浆生物标记的初步证据。参见图1至图4。该分析显示脂转移抑制蛋白、锌-α-2-糖蛋白、pH 5.46至pH 5.49处的β结合珠蛋白、结合珠蛋白相关蛋白、载脂蛋白C-III、载脂蛋白E、C4b-结合蛋白β链、对氧磷酶/芳香酯酶1、视黄醇结合蛋白4、甲清蛋白、α-2-HS-糖蛋白、皮质类固醇结合球蛋白、富亮氨酸α-2-糖蛋白和纤维蛋白原γ链的表达在肝硬化血清中减少了，而完整补体C3dg、免疫球蛋白J链、性激素结合球蛋白、14-3-3蛋白ζ/δ、脂联素和α-1-抗胰蛋白酶的表达增加了。还观察到糖蛋白血液结合素的翻译后修饰。
已在国际公布WO/2008/031051中所述的纤维化生物标记也被鉴别：CD5抗原样蛋白和Igα/κ链增加；α-1-抗胰凝乳蛋白酶、簇蛋白、补体C4、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H4和运甲状腺素蛋白减少。就间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H4而言，由质谱对肽序列的分析证实该蛋白的未裂解形式减少了，而先前在国际公布WO/2008/031051中只有35kDa和70kDa的裂解片段被鉴别为是减少的。
所有上述蛋白被质谱分析鉴定为最高得分蛋白。在凝胶特征点中鉴别出其他较低得分蛋白，尽管不能被排除，但是所述较低得分蛋白较不可能是产生差异表达改变的原因。鉴别出的较低得分蛋白是Igλ链和载脂蛋白AI增加，白蛋白、AMBP、凝血酶原、色素上皮衍生因子和血清淀粉样P-组分减少。
实施例4
血清/血浆中的这些新型蛋白的测量将有助于纤维化和肝硬化的可靠诊断，可减少肝活检的需要。这些测量可使用靶向这些蛋白的抗体的免疫测定而实现。
已发现补体C3的一个片段在肝硬化中增加并观察到所述片段在2D-PAGE凝胶上约pI 4.9的等电点的39kDa处。由质谱鉴定的该片段的氨基酸范围为955个至1201个。补体C3dg的氨基酸范围为955个至1303个且其理论分子量和等电点(39kDa和pI 5)与所观察到的凝胶特征点相符，证明该特征点中的补体C3是补体C3dg。已知补体C3dg在氨基酸1010至1013处具有可被纤溶酶(纤维分解相关的酶)裂解的硫酯位点。已知纤溶酶在纤维化中减少，这与肝硬化中观察到的未裂解的补体C3dg增加的水平一致。在国际公布WO/2008/031051中发现补体C3的一个片段在纤维化和肝硬化中减少，观察到所述片段在49kDa pI 6.9处，且质谱鉴定的氨基酸表明它是硫酯位点前的补体C3的α链，证明纤维化中纤溶酶介导的对补体C3的裂解减少(Gangadharan等，(2007)，Clin.Chem.，53，1792)。因此在本发明中，靶向补体C3的纤溶酶裂解位点(即与氨基酸1010至1013处硫酯位点重叠)的抗体将有助于确定裂解的程度。目前似乎没有针对补体C3硫酯位点区域的商售抗体。针对裂解区的抗体可更可靠地帮助确定肝瘢痕化中未裂解的补体C3的增加水平。
已知总结合珠蛋白在纤维化中减少且目前与其他蛋白一同使用以诊断肝纤维化(参见国际公布WO0216949)。在本发明中，发现含有pH 5.46至pH5.49处的β结合珠蛋白的2D-PAGE特征点在肝硬化中减少并显得比总结合珠蛋白更为可靠。已知结合珠蛋白含有四个潜在的糖基化位点，所述糖基化位点全部在其β链上。在血浆/血清中β结合珠蛋白通常被糖基化。当通过2D-PAGE分离血浆/血清时，发现β结合珠蛋白为pH 4.7和pH 5.8之间一排等间隔的特征点，所述特征点可在肝瘢痕化中显示为减少。在本发明中，pH5.46至pH 5.49处的结合珠蛋白的2D-PAGE凝胶特征点在肝硬化中减少并显得比pH 4.7和pH 5.8之间的β结合珠蛋白的其他特征点更为可靠。
实施例5
新型生物标记中的每一个的纤维化分级可用公式表示。测定肝纤维化不同阶段的血清中这些生物标记的平均浓度。目前临床上使用0至6的分级评估肝纤维化，其中0代表未纤维化，1-5代表从轻度到中度/严重的严重性增加的纤维化中间阶段，6为肝硬化(Ishak，(1995)，J Hepatol，22，696)。通过确定这七个阶段中的新型生物标记的浓度范围，可指定从0至6的类似评分系统。所有新型生物标记的分值相加的结果将给出更为可靠的纤维化程度指标，而非检测单个生物标记。
实施例6
免疫测定
本发明提供用于评估纤维化的试剂盒，所述试剂盒检测HF-相关多肽。这通过使用结合于HF-相关多肽的抗体来实现。这些抗体可用于进行免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定、蛋白斑点印迹、蛋白印迹、透射比浊法、散射比浊法等等。HF-相关多肽还可使用非抗体途径来定量，所述非抗体途径例如，但不限于，使用质谱进行多反应监测。
就ELISA而言，检测可在96孔板中进行。一种选择是使用非竞争性单位点结合ELISA。在这种检测中，用碳酸氢盐缓冲液制备已知浓度的抗原(在该实施例中，指新型生物标记和血清样本)，将所述抗原加入96孔板并在4℃下过夜孵育。然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)和吐温的溶液(PBS-T)洗板三次，再用含有牛血清白蛋白的PBS溶液封闭。37℃下孵育1小时后，加入针对抗原(在该实施例中，指目标生物标记)的一抗，37℃下孵育板1小时再用PBS-T洗涤三次。然后加入辣根过氧化物酶结合的二抗(针对一抗的动物来源)，并在37℃下孵育板1小时，然后用PBS-T洗涤三次。最后，向每孔加入诸如2,2'-连氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)之类的过氧化物酶底物，30分钟后在酶标仪上读取405nm处的吸光度。
可选地，可使用夹心ELISA。在这种类型的检测中，一种抗体结合于板孔的底部。加入抗原(该情况下指生物标记蛋白)，并通过洗涤除去未结合的产物。然后加入结合于该抗原的被标记的另一抗体。对结合的另一抗体的量进行定量(通常通过比色度)。除了新型生物标记外，本发明的发明者提出结合珠蛋白可通过ELISA测量。血清中的结合珠蛋白水平(结合临床医师测定的肝功能测试)将建立用于肝纤维化的更为可靠的得分。
尽管上述内容涉及特定的优选实施方式，将被理解的是，本发明并不局限于此。本领域普通技术人员将会对公开的实施方式做出各种改变并且这些改变将在本发明的范围之内。
本说明书中引用的所有公开出版物、专利申请及专利的全部内容通过引用并入本文。

Claims (6)

1.至少一种HF-相关的多肽在制备用于检测及评估人类患者的血清或血浆样本中的肝纤维化的试剂盒中用途，其中将所述人类患者的血清或血浆样本中至少一种HF-相关的多肽的水平与所述至少一种HF-相关的多肽的对照水平比较用于检测及评估所述人类患者中血清或血浆样本中的肝纤维化，其中所述至少一种HF-相关的多肽选自：皮质类固醇结合球蛋白、富亮氨酸α-2-糖蛋白、14-3-3蛋白ζ/δ、甲清蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、α-2-HS-糖蛋白、载脂蛋白C-III、C4b结合蛋白β链、完整/裂解的补体C3dg、裂解的补体C3dg、纤维蛋白原γ链、pH 5.46至pH 5.49处的β结合珠蛋白、结合珠蛋白相关蛋白、血液结合素、免疫球蛋白J链、视黄醇结合蛋白4、血清对氧磷酶/芳香酯酶1、性激素结合球蛋白和锌-α-2-糖蛋白。
2.如权利要求1所述的用途，其中，所述至少一种HF-相关的多肽包括皮质类固醇结合球蛋白。
3.至少一种HF-相关的多肽在制备用于人类患者的血清或血浆样本中的肝纤维化的严重性分级的试剂盒中用途，其中将所述人类患者的血清或血浆样本中至少一种HF-相关的多肽的水平与所述至少一种HF-相关的多肽的对照水平比较用于所述人类患者的血清或血浆样本中的肝纤维化的严重性分级，其中所述至少一种HF-相关的多肽选自：皮质类固醇结合球蛋白、富亮氨酸α-2-糖蛋白、14-3-3蛋白ζ/δ、甲清蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、α-2-HS-糖蛋白、载脂蛋白C-III、C4b结合蛋白β链、完整/裂解的补体C3dg、裂解的补体C3dg、纤维蛋白原γ链、pH 5.46至pH 5.49处的β结合珠蛋白、结合珠蛋白相关蛋白、血液结合素、免疫球蛋白J链、视黄醇结合蛋白4、血清对氧磷酶/芳香酯酶1、性激素结合球蛋白和锌-α-2-糖蛋白。
4.如权利要求3所述的用途，其中，所述至少一种HF-相关的多肽包括皮质类固醇结合球蛋白。
5.至少一种HF-相关的多肽在制备用于测定人类患者的血清或血浆样本中的肝纤维化的预后的试剂盒中的用途，其中将所述人类患者的血清或血浆样本中至少一种HF-相关的多肽的水平与所述至少一种HF-相关的多肽的对照水平比较用于测定所述人类患者的血清或血浆样本中的肝纤维化的预后，其中所述至少一种HF-相关的多肽选自：皮质类固醇结合球蛋白、富亮氨酸α-2-糖蛋白、14-3-3蛋白ζ/δ、甲清蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、α-2-HS-糖蛋白、载脂蛋白C-III、C4b结合蛋白β链、完整/裂解的补体C3dg、裂解的补体C3dg、纤维蛋白原γ链、pH 5.46至pH 5.49处的β结合珠蛋白、结合珠蛋白相关蛋白、血液结合素、免疫球蛋白J链、视黄醇结合蛋白4、血清对氧磷酶/芳香酯酶1、性激素结合球蛋白和锌-α-2-糖蛋白。
6.如权利要求5所述的用途，其中，所述至少一种HF-相关的多肽包括皮质类固醇结合球蛋白。
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