CN1056878C - 重组火鸡疱疹病毒及其衍生的活载体疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种Turkeys重组疱疹病毒(HVT)该病毒含有掺入HVT基因组一个插入区的异种基因。
本发明还涉及一种包含表达异种抗原多肽并对合适的动物宿主的感染诱导适应免疫反应的这样一种重组HVT的载体疫苗。

Description

重组火鸡疱疹病毒及其衍生的活载体疫苗
本发明涉及含有引进HVT染色体组插入区中的异种核酸序列的重组火鸡(Turkey)疱疹病毒(HVT)，包括由所述HVT染色体组插入区衍生的DNA序列侧接的异种基因的核酸序列，包含所述核酸序列的质粒，制备重组HVT的方法，由重组HVT感染的细胞培养物，含有重组HVT的疫苗，以及制备这种疫苗和含有针对重组HVT抗体的抗血清的方法。
马瑞克(Marek′s)病(MD)是一种使小鸡致癌的淋巴增生无序疾病，它导致T细胞淋巴瘤和外周神经的脱髓鞘作用，是造成家禽业经济损失的一个主要原因。
马瑞克病的病毒(MDV)已被鉴定为MD的病原。
原型MD疫苗由火鸡疱疹病毒(HVT)，最初由火鸡疱疹病毒中分离的血清型3MD病毒组成。它的不致病性、不致癌性、在体内和试管内的良好复制性、作为无细胞和联合细胞制剂时的可用性，以及高防护效能均已证实HVT可作为对有效控制家禽的马瑞克病十分成功和广泛应用的可靠疫苗。
现在，动物一般能够使用活的或失活的疫苗，或通过由相应病原体亚单位所衍生的疫苗来防止致病微生物的感染。
但是，这些类型的疫苗可能会有许多缺点。使用稀释的活病毒疫苗总免不了要冒使用不适当稀释致病微生物来给动物接种的危险。此外，稀释的病毒可能回复成毒性状态，导致被接种的动物患病，并可能蔓延使其它动物致病。
失活的疫苗通常只诱导低水平的免疫性，需要附加的免疫接种。进而，诱导病毒抗原因子的平衡可能通过失活处理而改变，结果降低了疫苗的防护效力。
此外，联合活体病毒疫苗的问题是各抗体组分的相互影响，这导致一种或多种构成组分相效力降低。
重组或自然衍生的亚单位疫苗还显示出许多缺点。首先，作为非复制构成物存在于免疫系统的多肽亚单位通常不诱导长期持久的免疫性，还需要存在佐剂。其次，作为复制构成物存在能比作为亚单位构成物存在时更有效地诱导免疫性。
本发明的目的是提供一种重组HVT，它不仅能用于制备抗MD疫苗，而且还能用于制备抗其它家禽传染病的疫苗，它排除了作为疫苗与活的稀释病原体联合使用的任何潜在危险，它以有效的方式促进体液的和细胞的免疫系统而不必明显地需要佐剂，并且它提供了多价疫苗的可能性而不必冒各种抗原组分相互不利影响的风险。
按照本发明，这种重组HVT的特征在于，它含有将多肽异种编码成HVT的异种核酸序列，所述核酸序列被引进HVT染色体组的插入区，所述区域如图1所示与由ORF-1的端部直至并包括ORF-5的染色体组区域相对应，而且位于HVT染色体组的DNA片断中，具有如图1所基本限定的限制性内切酶图。
本发明的重组HVT可由任何HVT病毒株，例如PB-THV1(可由Intervet International购得)或病毒株FC126衍生而得到。
在此使用的术语“重组HVT”指的是这样一种传染性病毒，它已经被掺入异种核酸序列，即对于与在HVT中自然存在的基因的核酸序列不同等的基因或其一部分编码DNA在遗传上改性。
当细胞被重组HVT感染时，则重组HVT以异种多肽形式表达异种基因。
术语“多肽”指的是具有生物活性的氨基酸分子链，不是指产物的特定长度，并且如果需要可在体内或试管内改性，例如通过糖基化、酰胺化、羧化或磷酸化；因此，特别是肽、寡肽和蛋白质均包括在多肽的定义之内。
对于有效的重组HVT而言，其前提是将异种核酸序列插入在染色体组HVT序列的容许位置或区域，例如可被用于掺入异种序列而不破坏HVT的基本功能如感染或复制所需这些功能的位置和区域。这种区域被称为插入区。
本发明所涉及的插入区对于掺入异种DNA而不破坏HVT基本功能而言以前尚未公开过。此外，还没有可得到的有关在此所述用于掺入异种DNA序列的HVT染色体组区域的限制性内切酶图的情报。
为制备本发明重组HVT而被用于掺入异种DNA序列的插入区，位于经过用酶Sau3A部分消化染色体组HVT DNA而产生的17.5Kb限制性片断之中。
所述片断经限制性内切酶制图详细分析(图1)，它基本上对应于HVT染色体组的Us区域，也许包括IRs和TRs结构的侧接部分。在HVT染色体组中的该Us区域和该IRs和TRs结构的相对位置由Igarashi等人示出(1987)。
此处所述的插入区分别位于大约1.2Kb、3.5Kb和2.8Kb的三个邻接的XhoI片断之中，并且开始于在HVT染色体组中1.2KbXhoI片断左侧位置起始的开放读码(ORF-1)的末端(图1)。所述大约5Kb的插入区连续通过ORF′s2、3、4和5，包括位于其间的非编码序列。相应于上述插入区的DNA序列可被用于将基因插入HVT染色体组，而不会破坏病毒的基本功能。
特别是，ORF-2和ORF-3可被用于异种基因的综合。
对于在ORF-2和ORF-3中的异种基因，较佳的插入位点是图1所示的BglII限制性位点。
β-半乳糖苷酶基因被插入在ORF-2或ORF-3中的单一BglII限制性位点，产生重组病毒，它是活的和稳定的，并且不仅在组织培养物中复制，而且还将鸡感染到如同由其中衍生出的HVT病毒一样可比较的程度。用特指的pMD07gal或pMD12gal质粒(图2)转化的大肠杆菌(E.Coli)被存放在C.N.C.Mof the Institute Pasteur at Paris underaccession number I-914和I-915，该质粒是通过将β-gal基因插入携带如图1所指出的相应XhoI片断的pMD07和pMD12的单一BglII位点而衍生出的。
在另一个实施例中，ORF-4和ORF-5的显著部分已由HVT染色体组中缺失，并由β-半乳糖苷酶标记基因代替，导致重组病毒可与在ORF-2或ORF-3中含标记基因插入的重组HVT病毒比较。
可以理解的是，对于HVT染色体组的DNA序列，在个别HVT病毒中间可能存在自然变化。这些变化可导致缺失、取代、插入、转化或增加一种或多种核苷酸，它们可能影响一个或多个限制性位点的位置，从而改变图1所示的限制性内切酶图。
此外，为引起上述改变而使用基因工程技术存在着潜力，导致了具有与图1所示图相关的限制性内切酶图的DNA序列。很清楚，包括掺入位于HVT染色体组区域中的插入区内的异种基因，并以这样的相关限制性内切酶图为特征的重组HVT也包括在本发明的范围之中。此外，由于本发明标志出的插入区不表现出基本的功能，所以所述区域可部分或全部缺失，在此之后，异种基因可被掺入到所述缺失处。可以理解，包括掺入到与本发明插入区相应的HVT染色体组区域中的并以此为特征的异种基因也构成本发明的部分。
总之，以上所基本限定的插入区表征了能被用于掺入异种核酸序列区域定位。
本发明所提出的较佳目的是提供一种重组HVT，它包括被掺入到插入区的异种核酸序列，其主要特征是如SEQ ID NO：1中所示的HVT DNA序列，它包括4个ORF。ORF-2，即一个209氨基酸的小开放读码位于核苷酸位置316和945之间，并包含来自pND07用于将基因插入HVT染色体组(图1，SEQID No：1)的BglII限制性位点，从而表明，对于通过ORF-2编码假设的多肽不具有将病毒保存在体内或试管内的基本功能。这也用于包含346氨基酸(SEQ ID No：3)的ORF-3，它在核苷酸位置1084和2124(互补的)之间以反向变换，并包含在pMD12中用于将基因插入HVT染色体组的BglII限制性位点(图1，SEQ ID No：1).ORF-4朝着在核苷酸位置2322和3170(互补的，图1，SEQ ID No：1)之间的IRs转换并将282氨基酸(SEQ ID No：4)编码，而ORF-5在核苷酸位置3320开始并连续直到核苷酸位置4504(图1，SEQ ID No：1)，将394氨基酸(SEQ ID NO：5)的多肽编码。
按照本发明，在核苷酸位置82的ORF-1末端后面开始的，大约5Kb的HVT染色体组的，其主要特征在于如SEQ IDNo：1所示DNA序列的，在中间包括四个开放读码和非编码序列的连续DNA的伸长可用于将异种基因插入HVT染色体组，而不破坏病毒的基本功能。
特别是，在示于SEQ ID NO：1的核苷酸位置316-945、1084-2124、2322-3170和3320-4504之间的DNA的伸长已被限定用于结合异种基因，单一的BglII限制性位点对于插入是最有利的位点。
很清楚，对于示于SEQ ID No：1所示的，表征本发明插入区的DNA序列，自然的变化存在于各个HVT病毒中间，导致一个或多个核苷酸的缺失、取代、插入、转化等。这些变化也可通过基因工程所引起。包含掺入上述与具有以上特征的插入区相关但不相同这样的HVT染色体组区域的异种基因的重组HVT也包括在本发明中。例如异种基因可被掺入SEQ ID No：1中所示HVT染色体组核酸序列中所引起的缺失部位。在此由SEQ ID No：1中所示DNA序列限定的HVT插入区的特征是在HVT染色体组中能被用于掺入异种核酸序列的区域的定位。
被掺入本发明HVT染色体组的异种核酸序列可由任何来源如病毒的、原核生物的、真核生物的或合成物的来源衍生。所述核酸序列可由病原体，较佳的是鸡的病原体衍生，在插入HVT染色体组后，可用它诱导对疾病的免疫性。较佳的是，试图将由传染性支气管炎病毒((IBV)、马瑞克病病毒(MDV)、新城疫病毒(NDV)、传染性Bursal病病毒(IBDV)、鸡的Aneamia剂(CAA)、呼吸道肠道病毒、鸟的Retro病毒、Eimeria种类、Salmonella种类、大肠杆菌和支源体gallisepticum衍生的核酸序列用于插入HVT染色体组的插入区。
此外，对于药用的或诊断的编码多肽的核酸序列，特别是免疫抑扬调节剂如淋巴激活素，干扰素或细胞分裂素(Cytokines)可被掺入上述插入区。
为表达重组HVT中异种核酸序列的基本要求是可行地连接到该异种核酸序列上的适宜的启动子。对于所属技术领域的普通技术人员显而易见的是，对启动子的选择延伸到在重组HVT感染的细胞中能引导基因转录的任何真核生物的、原核生物的或病毒的启动子，例如反病毒的长的末端复制物SV40衍生的启动子或存在于HVT中的启动子。
在体内的同系重组技术可被用于将异种核酸序列引进到HVT染色体组中。这通过首先构成用于与HVT重组的重组DNA分子来完成。这种分子可由任何适宜的质粒、宇宙粒(Cosmid)或噬菌体衍生，质粒为最佳，如果需要实际上可连接到启动子上，该分子含有异种核酸序列。上述核酸序列和启动子被引进到基因组HVTDNA片断中，该片断包含在此限定的，在重组DNA分子中半无性系化的插入区序列。应具有适当长度，以便在体内发生与病毒的HVT染色体组的同系重组。如果需要，可以做成这样的结构，它含有两个或多个不同的异种核酸序列，它们是由例如相同或不同的病原体衍生的，所述的序列通过在此规定的HVT序列的插入区被侧接。这种重组的DNA分子可被用于制备表达两种或多种不同抗原多肽的重组HVT，以提供多价的疫苗。其次，细胞，例如鸡胚胎或纤维细胞(CEF)可在含与适当HVT序列侧接的异种核酸序列的重组DNA分子存在时，用HVT DNA转染，从而在重组DNA分子中的插入区序列和HVT中的插入区序列之间发生重组。在没有重组DNA分子序列时，通过用含与适当侧接插入区序列侧接的异种核酸序列的核酸序列转染被感染的细胞也可引起重组。据此，重组病毒的后代在细胞培养物中产生并可以例如遗传型地或表型地通过杂交而被选择，检测被异种核酸序列结合的基因编码的酶的活性，或检测由免疫重组HVT表达的抗原异种多肽。所选择的重组HVT可以细胞培养方式大规模地被培养，此后含有由上述HVT表达的物质或异种多肽的重组HVT可由此被收集。
按照本发明，表达一种或多种不同的特定病原体的异种多肽的活重组HVT可被用于对感受这些病原体的动物，特别是鸟类如鸡、火鸡、鹑鸽和珍珠鸟接种。用这样的活载体疫苗接种后，最好继而在被接种的宿主复制重组HVT，从而在体内与HVT多肽一起表达异种多肽。然后该异种免疫多肽将导出既对HVT本身，也对上述多肽的免疫反应。如果由特定病原体衍生的异种多肽能刺激防护免疫反应，那么用本发明的重组HVT接种的动物将既对被MDV感染的，也对被该病原体随后的感染免疫。因而，按照本发明掺入HVT染色体组中的异种核酸序列可以在体内连续地表达，从而提供了对一种固态的、安全的和对病原体的长时间的免疫。
含有并表达一种或多种不同异种多肽的本发明的重组HVT可用作单价或多价疫苗。
本发明的重组HVT也可用来制备失活的疫苗。
对于动物施药，特别可通过气溶胶、饮水、口服、卵内接种、皮内、皮下或肌肉内的方式供给所推荐的重组HVT。
本发明的另一目的是制备含有由本发明重组HVT表达的异种多肽的亚单位疫苗、药用和诊断用制剂。这可以在促进异种多肽的表达的条件下，通过培养用上述重组HVT感染的细胞来达到。然后根据其所需用途可用常规技术将异种多肽提纯到一定程度，再将其处理成具有免疫、治疗或诊断作用的制剂。
上述对特定抗原体的活性免疫被用作健康动物的防护处理。不言而喻，已被特定抗原体感染的动物可以用包含本发明重组HVT诱发的，含有由编码抗原多肽的特定病原体所衍生的异种基因的抗体的抗血清处理。针对本发明重组HVT的抗血清可以通过使用激发适当免疫反应的有效量的上述重组HVT使动物，例如家禽免疫来制备。然后将该动物抽血并可制备抗血清。
实施例1
1、亚片断与HVT染色体组的Us区域分离
将鸡胚胎成纤维细胞(CEF)用来自HVT疫苗病毒株PB-THV1(由Interver International购得)的病毒感染，并在滚动瓶内培养48小时，直到该培养物达到90％的细胞病理效果(CPE)。细胞被收获，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，离心并以每毫升1-5×18个细胞的密度再悬浮于20mMTris-HCl，pH7.5，10mM EDTA中。加入SDS至最终浓度为0.5％，并加入蛋白酶K(Boehringer)至200μg/ml。在37℃培养2小时后，再加入100μg/ml蛋白酶K并继续培养1小时。将该溶液用酚/氯仿的混合物(1∶1)萃取两次，并将核酸用乙醇沉淀。将取自被感染细胞的全部DNA以0.5mg/ml的浓度溶于TE(10mM Tris-HCl，pH7.5，1mMEDTA)。按照酶厂商推荐的条件在100μl反应体积中于37℃用0.5单位Sau3A(Promega)经10秒钟培养出10微克DNA。将反应产物在0.8％琼脂糖凝胶上分离，并分离出16和20Kb之间的粒级。用1μg消化λEMBL3 DNA的BamHI/EcoRI(Promega)在10μl 30mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，10Mm DTT，0.1mM ATP中，于+4℃加入1U T4 DNA连接酶(Boehringer)将100毫微克这些DNA片断连接过夜。连接之后，在10μl体积中用BamHI消化十分之一的反应混合物，并使用市售萃取物(Promega)在试管内包装DNA。重组噬菌体以大约100pfu/平皿的密度在适当的大肠杆菌宿主菌株如LE392或K802上平板培养。按照Benton & Davis(1978)使用硝化纤维滤器制备双份该皿的复制物。第一份用取自未感染CEF的32P-示踪DNA杂交(Maniatis等人，1982)，而第二份用取自HVT感染细胞的32P-示踪DNA杂交。经洗涤并曝光在X射线胶片上之后，复式滤器的图象以正确取向叠加，并且用由感染细胞制成的探针给出特定信号的若干噬菌斑被分离，并来自它的噬菌体被放大。这些选择物之一，即特指的λHVT04通过17.5Kb插入物(图1)的限制性图详细分析。存在于这个片断中的序列基本对应于HVT染色体组的Us区域，包括该重复结构(Igarashi等人，1987)的侧接部分。
2、使用Us区域的亚片断将β-半乳糖苷酶基因插入HVT染色体组
为了在体内使得用完整病毒染色体组DNA发生重组过程，存在于λHVT04插入物中的两个XhoI片断在适当位置包含单一的Bgl II限制性位点。这两个片断由λHVT04通过XhoI的消化并用SalI消化的质粒载体pGEM3Z(Promega)连接而半无性系化。所得的携带有图1所指明的XhoI片断的质粒结构pMD07和pMD12，借助于单一BglII限制性位点被线性化，并且与由BamHI侧接的4.0Kb表达盒相连接，它们含有来自由早期启动子控制的大肠杆菌的β-半乳糖苷酶，该早期启动子则来自SV40。这种表达盒已由pCH110，即由Pharmacia购得的质粒通过在复制物的SV40起源附近取代72bp而衍生，它在pCH110中通过双链合成低核苷酸存在，并具有如下结构：
5′-GGATCCGTCGACCATG-3′
3′-GTACCCTAGGCAGCTG-5′
在pCH110的两个SphI限制性位点之间插入衔接物不在二者中任何一个位点上恢复对SphI的识别序列，并产生SV40早期启动子上游的BamHI和SalI位点。用BamHI依次消化这种构成物产生上述用于在pMD07和pMD12的BglII位点插入的4.0Kb表达盒，从而导致质粒pMD07gal和pMDgal它们的限制性图示于图2。质粒pMD07gal和pMD12gal的线性化DNA与由HVT感染的细胞制备的总的DNA一起基于按照Graham和V.d.Eb(1973)所述的磷酸钙沉淀的方法被引近CEF。来自含由HVT同源序列侧接的β-半乳糖苷酶构成物的2微克质粒DNA在最终体积为560μl H2O中与15μg HVT感染细胞的DNA混合，并加入750μl HBSP(20mMKCl，560mMNaCl，24mM葡萄糖，3mM Na2 HPO4，100mMHEPES，pH7.0)中，通过逐渐加入190μl 1M CaCl2溶液形成沉淀，再将该混合物在室温下培养30分钟。在此期间，来自在介质6/B8中10天久的胚胎的二次CEF的15ml悬浮液以每5×105个细胞的密度被接种在10Cm的皿中，该悬浮液组合物是以用2％牛犊胎儿血清补充的Eagle′s MinimalEssential Medium的Glasgow变体为基础的。将磷酸钙沉淀的DNA细心地加入到细胞悬浮液中，该玻璃皿在空气中于含5％CO2的增湿培养器中在37℃下培养。5小时后，除去介质，并将含等体积HBSP和30％甘油的溶液10ml在该细胞上分层。培养1-2分钟后，分离该溶液，用介质6/B8洗涤细胞，并将玻璃皿用新鲜介质培养3-5天，直至病毒CPI发育。含有表达β-半乳糖苷酶活性的重组HVT病毒的噬菌斑通过它们能将基质Bluogal(Gibco-BRL)，即一种5-溴基-4-氯代-3-吲哚基-β-半乳糖苷酶的化学衍生物转化成一种兰色反应产物的能力而被鉴别。用0.2mg/ml溶于二甲基亚砜的新鲜Bluogal将平皿染色，并培养直到兰色噬菌斑被检测出来。用来自pMD07和pMD12的半乳糖苷酶衍生物转染，这一切导致显著百分数(＞5)的兰色噬菌斑。来自用pMD07和pMD12的转染系列的正噬菌斑被显微检出并与新鲜CEF混合以使得放大病毒。当CPE可见时，收获细胞，并且在含有1％牛血清蛋白的Calstab缓冲液(每升H2O含74.35克蔗糖，0.52克KH2PO4，2.58克Na2HPO4·2H2O和0.92克谷氨酸钠)中通过在Vibracell 300 Cupborn装置内于15℃声学处理盛有该萃取物的塑料管制备溶菌产物。无细胞病毒在供滴定的新鲜CEF上平板培养，并检测含有染成兰色的重组HVT病毒的噬菌斑并如上所述予以放大。重复这一循环直到当用Bluogal感染该培养物时大于95％的病毒噬菌斑被标记为正。特别是如由pMD12衍生的A4-1/A10-4和由pMD12衍生的E1/E2所指明的四克隆被选择用于制备供鸡作接种试验的病毒原种。此外，部分原种被用于由被感染的CEF制备总DNA。用XhoI消化的DNA被接续在琼脂糖凝胶上并按照Maniatis等人(1982)所述被转移到硝化纤维素片上。使用非破裂的XhoI片断作为探针与消化非重组HVT病毒DNA的XhoI作作比较时，A4-1/A10-4和E1/E2的杂交试样由于插入β-半乳糖苷酶盒显示出在pMD07和pMD12中原始断片尺寸的预期增长。
β-半乳糖苷酶标记的基因用于显示ORF-4和ORF-5也代表潜在的插入区。为此目的，用合成的16-基双链低聚物取代在ORF-4中的核苷酸位置2311和ORF-5中的3428之间的pMD12中的1117bp SpeI片断，在pMD12中产生一个新的和单一的SalI位点，从而缺失ORF-4和ORF-5二者的显著部分。由pMD40指明的这种质粒的限制性图存在于图3A中。用于插入的β-半乳糖苷酶标记基因通过首先将单一的BamHI位点与SalI交换，并接着用含上述BamHI和SalI限制性位点的双链合成衔接物取代72-bp SphI片断而由pCH110衍生出来。
β-半乳糖苷酶标记的基因现被置在由SalI位点侧接的4.0Kb DNA片断上，并可以照这样被转移到pMD40中新产生的SalI位点，由此产生质粒pMD44(参见图3B)。
线性化的pMD44 DNA与来自HVT感染细胞的DNA-起被共同转染到上述次级CEF中。培养平皿直到CPE发育为止。用Bluogal对培养皿染色鉴别出有足够百分数的表达β-半乳糖苷酶活性的HVT噬菌斑。
这些结果可与在ORF-2和ORF-3中插入标记基因后所做的最初的观察相比较。
实施例2
用表达β-半乳糖苷酶活性的重组HVT给鸡接种
用50或1000pfu病毒原种A4-1和E1对10天久的白色来克亨鸡作肌肉接种。将等剂量的亲本HVT疫苗病毒株PB-THVI注入供比较的动物。在8天和15天时，收集血液样品并在Ficoll/Hypaque梯度分离器上分离白血细胞。将白血细胞在次级CEF上接种，并测定与被接种细胞数目相关的噬菌斑的数目。将这些滴定结果示于表1，它们证明，含有插入每个XhoI亚片断中(该XhoI亚片断分别存在于pMD07和pMD12中)的任何一个单-BglII限制性位点中的β-半乳糖苷酶基因的重组HVT病毒，相对于非重组PBTHVT疫苗病毒株，在可比较的倍数和水平上能够诱导鸡的病毒血症。用某些在CEF上的白血细胞滴定的Bluogal染色显示出，由仍然表达β-半乳糖苷酶基因的被感染的鸡回收的病毒大于90％。此外，在个别接种35天后的动物的血清样品中，证明了对β-半乳糖苷酶有效的ELTSA抗体效价。因此可得出结论，由存在于pMD07和pMD12中的邻接序列所限定的，来自HVT染色体组的Us的特殊区域可被用于稳定的综合异种基因，而不会影响该HVT病毒的基本功能，例如为感染和复制而必须的功能。此外还表明，插入这个区域的异种基因正是表现能在被感染动物血清中诱导高水平抗体效价的功能性蛋白质。
                                  表1
                            重组HVI诱导的白血细胞(WBC)病毒血症
病毒    剂量(pfu)      8天算出的噬菌斑       p.v.接种的细胞数(×105)         15算出的噬菌斑       p.v接种的细胞数(×105)
A4-1 50 8*1*20 6.81.53.2 214417 14.735.527.5
A4-1 1000 308*137* 5.71.51.21.7 72018 28.216.530.7
E1 50 9516001702*1* 0.73.32.51.82.1 14150558530 10.717.29.013.713.5
  E1     1000     2*1*15     1.81.35.2     247515     19.230.525.0
  PB1     50     132627126*     1.71.53.03.72.0     11013011029036     14.534.214.520.28.2
  PB1     1000     110185115065330     6.54.04.73.03.0     3260028034 5175     15.5122.519.56.727.5
*WBC在CEF平皿上接种5天后读数其它是接种3天后读数实施例3HVT的Us区域部分的序列分析
按照Sanger等人(1977)所述，使用在二脱氧链终止反应中的双链DNA制剂，将相应于如图1所示来自HVT基因组的有关XhoI限制性片断的质粒pMD07和pMD12的插入物进行精细的核苷酸序列分析。反应的第一阶段由与有关HVT基因片断侧接的pGEM3Z质粒载体中的SP6和T7启动子位点内部完成。该分析通过引入仅在一个取向上插入有关片断的渐进缺失完成。这些渐进缺失是使用核酸外切酶-III，即仅识别双链DNA和在3′至5′取向上消化双螺旋的一个链的单链核酸外切酶引入的。在待分析的片断末端附近选择造成5′-突出或钝头端的限制性位点，结合产生保护通过核酸外切酶-III降解的质粒载体中的引子起始位点SP6或T7的3′单链端的第二限制性内切酶，迫使该酶分离例如在pMD07或pMD12中存在的插入的DNA片断的一个链。每隔30秒由反应混合物中取样，并按照Henikoff(1984)所述步骤处理，产生重复循环的DNA分子，这些分子转化成合适的E.coli宿主病毒株。对分别引入pMD07和pMD12的原始1.2和3.5Kb片断的缺失位点，通过限制性图分析单独菌落的质粒DNA微制剂。使用链终止反应中来自微制剂的双链DNA，通过核苷酸定序分析含有在一个取向上插入片断的渐进缺失的一系列选择物。在变性丙烯酰胺凝胶上分离反应产物并通过自动射线照相在X线胶片上目测。用数字读数器阅读带型并使用射枪处理机和来自Gene-Master工作站(Bio-Rad)的其它程序采集数据。
邻近在pMD12中存在的XhoI片断的XhoI限制性片断由λHVT04(图1)半无性系化进入pMD36并按照上述相同步骤部分定序。
实施例4
在HVT基因组内的区域鉴定和精细分析之后，可进行基因插入，可以与一种编码β-半乳糖苷酶以外的任何基因构成重组HVT病毒。然而，将来自相关和非相关的禽类病原体的相关抗原编码的这些基因是特别有意义的。在下述段落中将描述这一用途的一个实例。该有意义的基因使传染性支气管炎病毒(IBV)，即一种鸡的高度接触传染冠形病毒的膜粒蛋白质的157Kd前体分子编码。这一糖基化的蛋白质是典型表面结构的主要组分，也称为噬菌体刺突，它在所有冠形病毒中，包括IBV中存在。从IBV病毒株M41，一种属于Massachusetts血清型的病毒株中分离出这一基因的复制物cDNA，并被放置在从劳氏肉瘤病毒(RSV)的长端重复序列(LTR)中产生的启动子要素后面。然后，包括启动子的基因被转移至与先前为插入β-半乳糖苷酶表达盒所用相同的在pMD07中的单一BglII限制性位点，并重组成HVT病毒基因组。筛分病毒的重组体后代以表达噬菌体刺突基因并分离规定的选择物，以限定的稀释度通过一种或多种平皿培养被无性系化。建立重组体IB/HVT病毒的纯系原种并用于随后的体内和试管内的鉴定。
1、从IBV病毒株M41中分离噬菌体刺突基因
通过将尿囊腔与104半卵传染剂量/每个卵接种使IBV病毒株M41中的病毒在10天久的含胚卵中生长。在37℃下24小时培养后，在4℃下将卵冷藏过夜。收集尿囊液，小心地使其在冰上冷却。通过在4℃及600xg经30分钟离心分离将血红细胞和碎片分离。在贝克曼19转子中于4℃以54000xg经4小时，从上清液中将病毒压成小丸。通过穿过注射针的重复通道将小丸再悬浮在冷TNE(10mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mMEDTA，pH7.5)中并在32ml，线性梯度20-60％蔗糖的TNE溶液中分层。在SW28转子中以24000rpm于4℃离心分离过夜后，通过侧壁用注射器将管道刺穿收集病毒带。用2体积TNE稀释后，在SW28转子中于4℃以18000rpm经90分钟将病毒压成小丸。将物料重新悬浮在小体积TNE中并添加十二烷基硫酸钠至最终浓度为0.5％。用200μg/ml蛋白酶K(Boehringer)将该制剂在37℃消化2小时并用1∶1酚/氯仿混合物萃取二次。用二体积乙醇，在有0.1M乙酸钠存在时，pH6.0，于-20℃下沉淀水相中的病毒RNA。在离心分离并用乙醇冲洗管子后，将小丸在真空中干燥并溶解在无菌水中，得到浓度为0.5mg/ml的RNA。该制剂含有通过琼脂糖凝胶电泳检查的＞90％IBV基因组RNA并贮存在-20℃。在75μl反应体积中使用5μg病毒RNA在有AMV逆转录酶存在时用低(dT)12-18进行第一链cDNA的合成。在44℃下培养30分钟后，通过在100℃加热3分钟使DNA/RNA杂种变性，随后在有E.coliDNA聚合酶I的大片断存在时合成第二链，在20℃下使该反应物培养2小时。用乙醇沉淀cDNA并在200μl反应体积中用10单位S1-核酸酶在37℃下消化30分钟。在10mM Tris-HCl，5mM EDTA，500mM NaCl，pH7.5的3.2ml 5-20％蔗糖梯度中将反应产物分层并在SW65转子中以30000rpm于15℃离心分离16小时。收集大小在500和5000碱基对之间沉淀的物料，用乙醇沉淀并溶解在20μl 0.1 SSC(15mM NaCl，1.5mM柠檬酸钠)中。按照酶供应者推荐的条件通过在30μl反应体积中用15单位末端转移酶(Gibco-BRL)在37℃下培养2分钟，双链cDNA的末端以10到15dG残基延伸。用5mM EDTA使反应停止。将10毫微克具尾的cDNA与在10μlTEN最终体积中的25摩尔过量磷酸化合成低聚物5′-dAATTCCCCCCCCCCC-3′在65℃加热2分钟，并通过在50℃培养过夜一起退火。在20μl 30mMTris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，10mMDTT，0.1mMATP中与10μg EcoRI消化的λgt10 DNA连接(Huynh等，1985)，添加1单位T4DNA连接酶并在4℃培养过夜。将DNA加入试管内封装的反应混合物(Promega)中并在E.coli的hf1A病毒株上平皿培养后通过对重组噬菌体的选择得到IBV菌株M41的cDNA库。
对于为噬菌体刺突蛋白质片断编码的cDNA克隆，通过在E.coli菌苔的培养皿中平皿培养100-200pfu筛分该库。准备硝化纤维的复式过滤器(Benton and Davis，1978)并用在含有10mM Tris-HCl，pH7.5，1M NaCl，0.1％SDS的杂化溶液和4×Denhardt′s溶液中的32P标记的合成低聚物于42℃下培养过夜(Maniatis等，1982)。
使用三种合成低聚物作为这些杂化溶液中的探针，它们含有如下核苷酸序列结构：I.5 ′-dTTAGGTGGTCTGAAGGCACTTTGGTAGTAGTA-3′II.5 ′-d TACCTACTAATTTACCACCAGAAACTACAAACTGCTG-3′III.5′-dTGGATCATTAAACAGACTTTTTAGGTCTG TATTGTT-3′选择用一个或较好为二个这些探针给出信号的重组噬菌体通过标准方法提纯噬菌斑(Maniatis等，1982)。来自λ噬菌体重组体的cDNA片断由EcoRI限制性位点侧接并因此由使载体pGEM3Z(Promega)无性系化的质粒转移到EcoRI位点中。
对两个选择物的限制性分析和局部定序表明，一个对完全的S1编码，而另一个对噬菌体刺突基因的S2的半个编码。这两个DNA片断的序列彼此部分重叠。特别是相对于S1/S2交点附近单一的M1uI-限制性位点彼此部分重叠。然后利用这一位点收集上述两个片断并得到具有载有编码IBV菌株M41的蛋白质膜粒的3.7KbBamHI插入物的质粒结构。
2、受LTR启动子控制的M41编码噬菌体刺突基因的HVT重组体质粒pIB18的结构
从RSV的LTR序列中选择在其插入进HVT病毒基因组后可以直接表达外部基因的一种强启动子。在pRSVcat的580bpNdeI/Hind III限制性片断上绘制出了该启动子图(Gorman等，1982)并借助在片断两个侧面上双链合成衔接物将该启动子在pGEM3Z(Promega)的Hind III和PstI位点之间插入。使载有LTR-启动子的载体pGEM3Z的Hind III位点和RSV片断的NdeI位点之间的连接具有30bp含有在一个位点上与HindIII相容而在另一位点上与NdeI相容的粘性末端的衔接物。然而，由于在六个碱基对识别序列的外核苷酸中仔细的修饰，在连接以后两个限制性位点都不复原。除了分离这两个位点外，在相应的位置形成在衔接物本身内部存在的一个新的限制性位点(BamHI)。将把LTR片断的HindIII位点连接到pGEM3Z的PstI位点的第二20Kb衔接物合成，这样不破坏在两端的识别序列并将三个合适的单一限制性位点加到已在pGEM3Z的聚衔接物，如PstI、SalI、XhoI和BamHI中存在的位点中。从而，生成的pGEM3Z的衍生物，即特指的pVECO1，含有650bp载有LTR启动子序列的限制性片断，继而立即再含七个可以插入外部基因的限制性位点。该650bp片断在两端通过BamHI限制性位点侧接并因此由pMD07转移到1.2KbHVT插入物中存在的单一的BglII位点。这两种限制性内切酶产生的接合端是相容的，但无论是对BglII或BamHI的原始识别序列，连接都不能复原。在朝TRs取向上载有LTR的一种生成的结构物被指定为pVECO4并通过限制性图检验(图4)。这一通用的HVT重组载体的结构可以使LTR启动子直接插入下游的外部基因并通过体内重组使完全表达盒随后综合成HVT基因组。LTR下游的，特别是对酶BglII，XhoI和EcoRV那些不同的限制性位点的位置以这样的方式设计，即甚至可以设想多基因的插入。这一载体的首要用途是构成表达IBV病毒株M41的噬菌体刺突基因的重组HVT病毒，它的分离已公开在上述段落。载有M41噬菌体刺突基因的3.7Kb BamHI限制性片断被插入LTR启动子下游的pVECO4的单一BglII位点。而且这一操作不能使连接后的各限制性位点复原。通过确认如图5中所存在的预期结构的限制性图分析含有在相对LTR启动子正确取向中插入基因的一个选择物。这一质粒特指为pIB18并随后用于鸡胚胎成纤维细胞(CEF)的并发转染。
3、IBV刺突基因的基因组插入进HVT以及膜粒蛋白质的表达
按照为构成β-半乳糖苷酶重组体的实施例1中所述的方法，使pIB18的线性化DNA与HVT感染的鸡细胞的总DNA一起转染。
通过使用对IBV单或多价血清的免疫荧光染色进行了表达噬菌体刺突蛋白质的HVT重组体的检测。如前面例1所述，在新鲜CEF上通过一次转染后的初步培养，收集并声学处理。滴定无细胞溶解产物后，使用小于1pfu/每孔，在限定的稀释度下使含CEF的微量滴定皿感染并培养直至CPE的检测。通过与新鲜CEF一起的二重微量滴定皿分别分离每个孔的细胞悬浮液并且再培养2天。然后固定一个皿，用IBV特殊血清染色并在显微镜下进行免疫荧光检查，计算含有大量IBV-正染色HVT噬菌斑的那些孔。
从相应的二重微量滴定皿的孔中发现存活的感染细胞并通过在新鲜CEF上的一或二个孔口放大。这一基于限定稀释度的无性系化步骤重复许多次并得到一些单独的在感染的细胞培养物上IBV特殊免疫荧光化验中为正染色的重组HVT病毒的分离物。
实施例5
1、由新城病病毒(NDV)分离编码融合(F)和血球凝集素(HN)蛋白质基因
将NDV疫苗病毒株克隆30(Intervet International，Holland)的病毒在受胚卵上生长30小时并在4℃培养过夜后收集尿囊液。通过单蔗糖梯度提纯病毒并通过在有SDS存在时的蛋白酶K的消化作用萃取基因组RNA。
用逆转录酶进行第一链cDNA的合成，使用20μg/ml无规10碱性低聚物使反应启动。
第二链的合成、S1-处理及包括插入进λgt10宿主的后续步骤如上面例4的部分1所述进行。
F基因特殊序列库的筛分通过噬菌斑32P标记的低核苷酸杂交进行。I.5 ′GGCAGGCCTCTTGCGGCTGCAGGGATTGTGGTAACAGG 3 ′II.5′G CAAAAGGCGCAACAGAAGACCTTGTTGTGGCTTGGC 3′分别识别代码区的5′和3′末端。HN基因序列的鉴别用低核苷酸进行。III.5′GAAAGAGAGGCGAAGAATACATGGCGCTTGGTATTCCGG3 ′IV.5′GAAATATCTAATACTCTTCGGGAATTCAGGATCGT3′通过比较在NDV-病毒株Australia -Victoria(McGinnes等，1986)，Italien(Espion等，1987和Wemers等，1987)，Beaudette(Chambers等，1986和Millar等，1986)和D26(Sato等，1987)方面所公布的数据设计这些探针的序列。
分离给出具有至少两个探针信号的正选择物并以限制性图表征。从这一系列中选择二个，分别复盖来自NDV病毒株-克隆30的F和HV。
DNA插入物被转移入质粒载体pGEM4Z中并用核酸外切酶Bal31操作以分离F和HV基因实际编码区上游或下游的过剩或重叠序列。
这导致了含有对通过BamHI限制性位点分别侧接的F、HV的完全基因编码的质粒pNDVO1和pNDVO3。
2、NDF的F和HV基因的基因组插入HVT
分别含有编码F和HV基因的质粒pNDVO1和pNDVO3的BamHI片断被插入HVT重组载体pNE04的BglII位点，生成pNDVO4和pNDVO5。
通过根据图6所示的这些结构的物理图的限制性分析验明相对于LTR启动子的插入基因的正确取向。
这些质粒的DNA与HVT感染细胞的DNA一起共同转染成例1部分2中所述的CEF。
在转染培养物放大后，得到无细胞溶解产物并在微量滴定皿中平皿培养。
通过使用多价NDV血清或抗特殊NDV抗原的单克隆抗体的免疫荧光染色进行表达F或HN蛋白质的HVT重组体的检测。
通过如例4的部分3中所述的限定稀释度进行重组病毒的富集。通过单噬菌斑分离和为分别表达由免疫荧光染色感染的CEF中F、HN的试验，建立纯系重组病毒制剂。
附图的说明
图1
基本上相应于HVT基因组Us区域的DNA片断的限制性内切酶图。指明了由四个开放读码和在其中未编码序列组成的插入区的相对位置。
图2
A)pMD07 gal的限制性图，这一质粒已通过将β-半乳糖苷酶基因插入在HVT基因组的1.2Kb XhoI片断中存在的单一BglII限制性位点，由pMD07衍生。
B)pMD12 gal的限制性图。这一质粒已通过将β-半乳糖苷酶基因插入在HVT基因组的3.5Kb XhoI片断中存在的单一BglII限制性位点，由pMD12衍生。
图3
A)pMD40的限制性图。通过合成含有SalT位点的低核苷酸取代pMD12中存在的1117bp SpeI片断。
B)pMD14的限制性图。通过将由SalI位点侧接的4.0KS β-半乳糖苷酶标志的基因插入pMD40的SalI位点而由pMD40衍生。
图4
表示插入pMD071.2Kb XhoI HVT片断的单一BglII位点的LTR启动子的pNEC04的限制性内切酶图。
图5
表示载有插入LTR启动子下游pVEC04的BglII位点的IBV病毒株M41的噬菌体刺突基因的3.7Kb BamHI片断的pIB18的限制性内切酶图。
图6A)pNDV04的限制性图。质粒含有由插入pVECO4BglII位点的BamHI位点侧接的NDV-F基因(见图4)。B)pNDVO5的限制性图质粒含有由插入pVECO4Bg1II位点的BamHI位点侧接的NDV-HV基因。
参考文献
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13. Sato et al.(1987)，Virus Res.7，241.
14. Wemers et al.(1987)，Arch.Virol.97，101.
序列表(2)序列标志(SEQ ID)信息No：1：(i)序列特征：(A)长度：4527碱基对(B)类型：核酸(C)链性：双(d)布局：直线(ii)分子类型：DNA(基因组)(Vi)原始来源：(A)有机体：Turkey疱疹病毒(B)病毒株：PB-THV1(IX)特征：(A)名称/关键：CDS(B)定位：1..81(D)其它信息：/1abe1＝ORF1的末端(ix)特征：(A)名称/关键：CDS(B)定位：316..945(D)其它信息/1abe1＝ORF2(ix)特征：(A)名称/关键：CDS(B)定位：补码(1084..2124)(D)其它信息：/1abe1＝ORF3(ix)特征：(A)名称/关键：CDS(B)定位：补码(2322..3170)(D)其它信息：/1abe1＝ORF4(ix)特征：(A)名称/关键：CDS(B)定位：3320..4504(D)其它信息：/1abe1＝ORF5(xi)序列描述：SEQ ID No：1：AACAGTTATA  TACGCGCATC  GGGCCACGTT  CCGCCTTCGA  GGGCACTTCC  GACAGATACG     60AATTTAAAGA  TGGATGAATA  ATTAAATTGG  AAAGAGTAAC  TATATTAATC  GAGCGTCATG    120ACGGCGTCCC  GTGAAAATGA  GAATTTTCTA  CTCGAAACAC  CGTGACATTT  GACAGACCTG    180GACTTGTTAT  TCTGATATAT  AGTGGGTGTG  TCTGACCGGC  AACATACATA  ATGTGCATGC    240GAAACCACTT  TTTCAGTGTA  CGCTGACATT  GTGCAACACG  GAGGGGTAGC  ATCTACATAC    300AATATATGTT  GATTAATGAT  TGGAGAAAAA  ACTATGCAGC  TCGCCGATCA  TATGGCTAAC    360TCGCCTTCGC  CTATATGGCG  GACCCCGCGG  GAAAAATCGA  CGTACCATCT  GATTTACAAC    420ACCAGTAATG  AACATGTCGC  ATCCCTGCCC  AGATCTGTGC  GCCCATTGGC  GCGTATCGTT    480GTGAATGCCG  CCGAAACACT  TCAGGTCGGT  ATGAGAGCCG  GGAGGCCGCC  ATCAGCAGGA    540GTTTGGCGAG  AGGTGTTTGA  TAGAATGATG  ACAGCCTTCC  GTGACTACGA  GCCTACTGCG    600ACATTTAATG  CTGCAGATCC  CATTAGAAAA  ATGGTCGAGA  CAGTTCTACA  GAATAATGAA    660GAGCCTCCGC  GGACGCATGC  TGAAATGGGT  AATCGCCTTA  TGAACATTAT  GTACTGGTGT    720TGCTTGGGAC  ACGCAGGACA  ATGCTCGATC  TGGCAGTTGT  ACGAGACGAA  TCAGGCCATT    780TTAAGTTTAT  TAGATGAAGT  GGTTATCGGC  ACAACAAATC  CCTTTTGCAC  CCTCGAGCAA    840TACTGGAAGC  CATTATGCAC  CGCAATCGCC  AACAAGGGGA  CCTCATCGCT  TGTTGAGGAT    900GCCAAAGTGG  CCGAGTACCT  GGTTAGCATG  CGCAAATTGA  TATAACACAG  GCACGCTCTG    960ATGTTACAGA  CCACAATACC  GCATACATTT  ATTGTAAGGT  TGTTAATAAA  GGTTTATTCT   1020ATGTAAGACT  ACAATACTTT  TGACATTGCT  TGTATACATA  TTAAATACTT  TCTCAAGTTC   1080CTATTACATA  AAATGGGATC  TATCATTACA  TTCGTTAAGA  GTCTGGATAA  TTTTACTGTT   1140TGCCAGCTTC  GATCTTGGAA  CGTACTGTGG  ATAGTGCCTT  ACTTGGAATC  GTGAAAATTT   1200GAAGCGTTCA  TTATTTGGAT  ATCTTCCGGT  TGTCCCATAT  CCCGCCCTGG  TACCGCTCGG   1260ATACCTTGCC  CGTATGGATT  CGTATTGACA  GTCGCGCAAT  TGGGGACCAA  CAACGCGTGG   1320GTCCACACTC  ATTCGGAAAT  TTTCCGATGA  TTCTGAATAT  TTATTGCCGC  TCGTTACGAG   1380TTGTTGGACA  TATCTGTAAT  ACAGTTCTTC  TTCTGAAGGA  TCGCTGCACA  TTTGATCTAT   1440ACATTGGCCA  GGATGTTCAA  GTCTCAGATG  TTGCATTCTG  GCACAGCACA  ACTTTATGGC   1500ATTTCCGACG  TAATCGTCCG  GCAGCCCTGG  GGGAGTTCTA  TATTCGCATA  TTGGGATGGT   1560AAGGACAATA  GCAGATCTCG  CAACCTCCAG  GGAGGCTATA  ATAACGTTTT  TAAAGGATGG   1620ACTTCTCATA  AAAATCTGTC  GCAAATTACA  CTGAGAATAT  CCTTTACTAG  CGCCGATTGA   1680GAGCATCGTC  GTCCAATTTT  CTAAATGGAA  AGAAAACAAG  GCGGGCAAGA  GTGTTCCAAA   1740CATTTTCATT  TTCGACGAAT  CTCTCAAATC  CCATGGCGTG  CAATTGATTG  CAAAATTGGC   1800ACTTCCGTTC  ACGTTTGTAT  CTCCAAACTC  TAAGATACTT  TTAATTGAAA  AACTACGTTC   1860TAGTGTGGAA  AGAAACCTAT  AGGCAGACCA  TAGAACTATT  TGACACCACA  TATCTTTTTG   1920TATGTCAAAC  TGACCATGAT  CGCATGTTGC  TGAATGCACT  AGGGCAATTC  GCTCGCGCGA   1980CTCCATACAT  TGAATAATTC  CACACGTCAG  CTCATCTGTT  AGCAAGGTCC  AGTAGTTGAA     2040GTCATTTATT  TTTCCCCGCG  GCTGGCCAAA  TCTACCTCTG  GGAATATCCA  AGTTGTCGAA     2100TATGATCGCA  CCGGCTCTGG  TCATGGTGAA  GGAACTTGTA  GCATAAAGAC  GCAGGTATCA     2160TAGGGGTAAT  ATTTTTTATT  CACTCACATG  CAAAAAGTAA  CGCATATTAG  CACCATGTAT     2220GGGCCATCAA  TTGACATTTG  CGTAGCACTA  CATCACGATT  ATGTACAACA  TAATGGGACA     2280ACAAATGGCA  AGTAGATGCA  ATTTCCTCAC  ACTAGTTGGG  TTTATCTACT  ATTGAATTTT     2340CCCCTATCTG  TGATACACTT  GGGAGCCTCT  ACAAGCATAT  TGCCATCATG  TACGTTTTTA     2400TCTACTGTCT  TAACGCCCAT  GGGAACGGAG  GCGTCGTCGT  CATGTATTGG  ACGGCAACAT     2460AGGCAGCAAC  ACAAATTGCG  TTTAGGTGGG  GTGCATGTGG  ACTCGATACC  AAGACCCTGC     2520AGCTGGGGAA  CGTCTGGTGG  AGAGCCGATA  ATTTGATATA  CGCACGCCAT  ATTACTATCG     2580TTGAAGTACG  CCTTATCTTC  TATGTTTTCA  AATTTAGGTT  CCCAAGTGGA  CGTGAGAAGT     2640GTTTGTATCT  CACATGGAAG  GGCCCAAGGC  ATTCCAGCCC  AGGTGCCTGG  TACTTTAATG     2700GCAAACAAAC  GTTTTGGTAG  AGGTATTGAT  TCTATTGCAG  TTCTGCAGAT  ATCTGCAGCT     2760CCGAGTATCC  ACAGGCTATA  CGATACGTTA  TCGGAGGCCT  CCGATTCTAG  CATTACATAG     2820CCGGTCAGTA  GATCCTGCCA  TTCGGTAGCG  CAACCGGCTA  CATCTTCAAA  CAGTCTCACA     2880ATAAATGCAT  CTCTCGTTCC  TGCCAATCCG  GAACCGGGCA  TACCACTCCC  ACCTGCCGAT     2940TTAATTCTCA  CAATTGGGCG  ATGCCGGCGG  GGCAAAACGA  ATGTGGATTT  GGCAAACCGA    3000CACAGGTCTG  CTGTACGGAC  TAATATGGGC  ACACCCACAT  CATTCTTCAG  ATGCTCCATG    3060CATTGTTCTA  TGAGAAAGAT  CCATAGGGTG  GAGGCAGCGT  CACGAGATCG  CCCAGGCAAT    3120CGATCGCATT  CGTCTAGTAA  AGTGACGAGA  GTTATCATGC  ACACACCCAT  GCCCACGCCT    3180TCCGAATAAC  TGGAGCTGTG  GAAGATCGGA  AACGTCTTTT  TGACTGCCGG  TCTCGTACTA    3240CTTTCGCACA  GGTGTATACC  CGGACGCGTA  CTATATATTT  TATATCATTC  AACGTCCCGA    3300AATTACATAC  GTGGCGGCGA  TGGAAGTAGA  TGTTGAGTCT  TCGAAAGTAA  GTGCCTCGAA    3360TATGGGTATT  GTCTGTGAAA  ATATCGAAAG  CGGTACGACG  GTTGCAGAAC  CGTCGATGTC    3420GCCAGATACT  AGTAACAATA  GCTTCGATAA  CGAAGACTTC  CGTGGGCCTG  AATACGATGT    3480GGAGATAAAT  ACCAGAAAAT  CTGCTAATCT  TGATCGTATG  GAATCTTCGT  GCCGTGAACA    3540ACGAGCGGCG  TGCGAACTTC  GAAAGTGTTC  GTGTCCTACG  TCTGCCGTGC  GCATGCAATA    3600CAGTATTCTT  TCATCTCTCG  CTCCGGGTTC  AGAGGGTCAT  GTATATATAT  GTACTAGATA    3660CGGGGACGCG  GACCAAAAAA  AATGCATAGT  GAAGGCAGTC  GTTGGAGGAA  AGAATCCCGG    3720GAGGGAAGTG  GATATTTTAA  AAACCATCTC  ACATAAATCA  ATTATAAAAT  TAATCCATGC    3780CTATAAATGG  AAAAATGTTG  TGTGTATGGC  AATGCGTGTA  TATCGTTATG  ATCTTTTCAC    3840ATATATTGAC  GGAGTCGGCC  CTATGCCCCT  TCAACAGATG  ATCTATATTC  AACGTGGACT    3900ACTAGAGGCG  CTAGCATACA  TACATGAAAG  GGGCATCATT  CACCGAGACG  TAAAGACGGA    3960GAATATATTC  TTGGATAATC  ACGAAAATGC  AGTTTTGGGT  GACTTCGGTG  CTGCATGTCA    4020ACTAGGAGAT  TGTATAGATA  CGCCCCAATG  TTACGGTTGG  AGCGGAACTG  TGGAAACAAA    4080TTCGCCGGAA  TTATCTGCAC  TTGATCCGTA  TTGCACAAAA  ACAGATATTT  GGAGTGCCGG    4140ATTGGTTCTA  TATGAGATGG  CAATTAAAAA  TGTACCATTG  TTTAGTAAGC  AGGTGAAAAG    4200TTCGGGATCT  CAGCTGAGAT  CCATAATACG  GTGCATGCAA  GTGCATGAAC  TGGAGTTTCC    4260CCGCAACGAT  TCTACCAACC  TCTGTAAACA  TTTCAAACAA  TATGCGGTTC  GTGTACGACC    4320GCCTTATACC  ATTCCTCGAG  TTATAAGAAA  TGGGGGGATG  CCAATGGATG  TTGAATATGT    4380CATTTCTAAA  ATGCTTACGT  TTGACCAGGA  GTTCAGACCT  TCTGCTAAGG  AAATATTGAA    4440TATGCCCCTA  TTTACTAAGG  CGCCGATTAA  CCTGCTTAAT  ATCACACCCT  CTGACAGTGT    4500CTAACGGTAT  ACAGGCGGGA  GCGGGTA                                           4527(2)序列标志(SEQ ID)信息No：2：
(i)序列特征：(A)长度：209氨基酸(B)类型：氨基酸(D)布局：直线
(ii)分子类型：蛋白质
(ix)特征：ORF-2
(xi)序列描述：SEQ ID No：2：Met Ile Gly Glu Lys Thr Met Gln Leu Ala Asp His Met Ala Asn Ser1               5                  10                  15Pro Ser Pro Ile Trp Arg Thr Pro Arg Glu Lys Ser Thr Tyr His Leu
         20                  25                  30Ile Tyr Asn Thr Ser Asn Glu His Val Ala Ser Leu Pro Arg Ser Val
     35                  40                  45Arg Pro Leu Ala Arg Ile Val Val Asn Ala Ala Glu Thr Leu Gln Val
 50                  55                  60Gly Met Arg Ala Gly Arg Pro Pro Ser Ala Gly Val Trp Arg Glu Val65                  70                  75                  80Phe Asp Arg Met Met Thr Ala Phe Arg Asp Tyr Glu Pro Thr Ala Thr
             85                  90                  95Phe Asn Ala Ala Asp Pro Ile Arg Lys Met Val Glu Thr Val Leu Gln
        100                 105                 110Asn Asn Glu Glu Pro Pro Arg Thr His Ala Glu Met Gly Asn Arg Leu
    115                 120                 125Met Asn Ile Met Tyr Trp Cys Cys Leu Gly His Ala Gly Gln Cys Ser
130                 135                 140Ile Trp Gln Leu Tyr Glu Thr Asn Gln Ala Ile Leu Ser Leu Leu Asp145                 150                 155                 160Glu Val Val Ile Gly Thr Thr Asn Pro Phe Cys Thr Leu Glu Gln Tyr
            165                 170                 175Trp Lys Pro Leu Cys Thr Ala Ile Ala Asn Lys Gly Thr Ser Ser Leu
        180                 185                 190Val Glu Asp Ala Lys Val Ala Glu Tyr Leu Val Ser Met Arg Lys Leu
    195                 200                 205Ile209(2)序列标志(SEQ ID)信息No：3：
(i)序列特征：
(A)长度：346氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)布局：直线
(ii)分子类型：蛋白质
(ix)特征：ORF-3
(xi)序列描述：SEQ ID No：3：Met Thr Arg Ala Gly Ala Ile Ile Phe Asp Asn Leu Asp Ile Pro Arg1               5                  10                  15Gly Arg Phe Gly Gln Pro Arg Gly Lys Ile Asn Asp Phe Asn Tyr Trp
         20                  25                  30Thr Leu Leu Thr Asp Glu Leu Thr Cys Gly Ile Ile Gln Cys Met Glu
     35                  40                  45Ser Arg Glu Arg Ile Ala Leu Val His Ser Ala Thr Cys Asp His Gly
 50                  55                  60Gln Phe Asp Ile Gln Lys Asp Met Trp Cys Gln Ile Val Leu Trp Ser65                  70                  75                  80Ala Tyr Arg Phe Leu Ser Thr Leu Glu Arg Ser Phe Ser Ile Lys Sar
             85                  90                  95Ile Leu Glu Phe Gly Asp Thr Asn Val Asn Gly Ser Ala Asn Phe Ala
        100                 105                 110Ile Asn Cys Thr Pro Trp Asp Leu Arg Asp Ser Ser Lys Met Lys Met
    115                 120                 125Phe Gly Thr Leu Leu Pro Ala Leu Phe Ser Phe His Leu Glu Asn Trp
130                 135                 140Thr Thr Met Leu Ser Ile Gly Ala Ser Lys Gly Tyr Ser Gln Cys Asn145                 150                 155                 160Leu Arg Gln Ile Phe Met Arg Ser Pro Ser Phe Lys Asn Val Ile Ile
            165                 170                 175Ala Ser Leu Glu Val Ala Arg Ser Ala Ile Val Leu Thr Ile Pro Ile
        180                 185                 190Cys Glu Tyr Arg Thr Pro Pro Gly Leu Pro Asp Asp Tyr Val Gly Asn
    195                 200                 205Ala Ile Lys Leu Cys Cys Ala Arg Met Gln His Leu Arg Leu Glu His
210                 215                 220Pro Gly Gln Cys Ile Asp Gln Met Cys Ser Asp Pro Ser Glu Glu Glu225                 230                 235                 240Leu Tyr Tyr Arg Tyr Val Gln Gln Leu Val Thr Ser Gly Asn Lys Tyr
            245                 250                 255Ser Glu Ser Ser Glu Asn Phe Arg Met Ser Val Asp Pro Arg Val Val
        260                 265                 270Gly Pro Gln Leu Arg Asp Cys Gln Tyr Glu Ser Ile Arg Ala Arg Tyr
    275                 280                 285Pro Ser Gly Thr Arg Ala Gly Tyr Gly Thr Thr Gly Arg Tyr Pro Asn
290                 295                 300Asn Glu Arg Phe Lys Phe Ser Arg Phe Gln Val Arg His Tyr Pro Gln305                 310                 315                 320Tyr Val Pro Arg Ser Lys Leu Ala Asn Ser Lys Ile Ile Gln Thr Leu
            325                 330                 335Asn Glu Cys Asn Asp Arg Set His Phe Met
        340                 345(2)序列标志(SEQ ID)信息No：4：
(i)序列特征：
(A)长度：282氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)布局：直线
(ii)分子类型：蛋白质
(ix)特征：ORF-4
(xi)序列描述：SEQ ID No：4：Met Gly Val Cys Met Ile Thr Leu Val Thr Leu Leu Asp Glu Cys Asp1               5                  10                  15Arg Leu Pro Gly Arg Ser Arg Asp Ala Ala Ser Thr Leu Trp Ile Phe
         20                  25                  30Leu Ile Glu Gln Cys Met Glu His Leu Lys Asn Asp Val Gly Val Pro
     35                  40                  45Ile Leu Val Arg Thr Ala Asp Leu Cys Arg Phe Ala Lys Ser Thr Phe
 50                  55                  60Val Leu Pro Arg Arg His Arg Pro Ile Val Arg Ile Lys Ser Ala Gly65                  70                  75                  80Gly Ser Gly Met Pro Gly Ser Gly Leu Ala Gly Thr Arg Asp Ala Phe
             85                  90                  95Ile Val Arg Leu Phe Glu Asp Val Ala Gly Cys Ala Thr Glu Trp Gln
        100                 105                 110Asp Leu Leu Thr Gly Tyr Val Met Leu Glu Ser Glu Ala Ser Asp Asn
    115                 120                 125Val Ser Tyr Ser Leu Trp Ile Leu Gly Ala Ala Asp Ile Cys Arg Thr
130                 135                 140Ala Ile Glu Ser Ile Pro Leu Pro Lys Arg Leu Phe Ala Ile Lys Val145                 150                 155                 160Pro Gly Thr Trp Ala Gly Met Pro Trp Ala Leu Pro Cys Glu Ile Gln
            165                 170                 175Thr Leu Leu Thr Ser Thr Trp Glu Pro Lys Phe Glu Asn Ile Glu Asp
        180                 185                 190Lys Ala Tyr Phe Asn Asp Ser Asn Met Ala Cys Val Tyr Gln Ile Ile
    195                 200                 205Gly Ser Pro Pro Asp Val Pro Gln Leu Gln Gly Leu Gly Ile Glu Ser
210                 215                 220Thr Cys Thr Pro Pro Lys Arg Asn Leu Cys Cys Cys Leu Cys Cys Arg225                 230                 235                 240Pro Ile His Asp Asp Asp Ala Ser Val Pro Met Gly Val Lys Thr Val
            245                 250                 255Asp Lys Asn Val His Asp Gly Asn Met Leu Val Glu Ala Pro Lys Cys
        260                 265                 270Ile Thr Asp Arg Gly Lys Phe Asn Ser Arg
    275                 280(2)序列标志(SEQ ID)No：5：
(i)序列特征：
(A)长度：394氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)布局：直线
(ii)分子类型：蛋白质
(ix)：特征：ORF-5
(xi)序列描述：SEQ ID No：5：Met Glu Val Asp Val Glu Ser Ser Lys Val Ser Ala Ser Asn Met Gly1               5                  10                  15Ile Val Cys Glu Asn Ile Glu Ser Gly Thr Thr Val Ala Glu Pro Ser
         20                  25                  30Met Ser Pro Asp Thr Ser Asn Asn Ser Phe Asp Asn Glu Asp Phe Arg
     35                  40                  45Gly Pro Glu Tyr Asp Val Glu Ile Asn Thr Arg Lys Ser Ala Asn Leu
 50                  55                  60Asp Arg Met Glu Ser Ser Cys Arg Glu Gln Arg Ala Ala Cys Glu Leu65                  70                  75                  80Arg Lys Cys Ser Cys Pro Thr Ser Ala Val Arg Met Gln Tyr Ser Ile
             85                  90                  95Leu Ser Ser Leu Ala Pro Gly Ser Glu Gly His Val Tyr Ile Cys Thr
        100                 105                 110Arg Tyr Gly Asp Ala Asp Gln Lys Lys Cys Ile Val Lys Ala Val Val
    115                 120                 125Gly Gly Lys Asn Pro Gly Arg Glu Val Asp Ile Leu Lys Thr Ile Ser
130                 135                 140His Lys Ser Ile Ile Lys Leu Ile His Ala Tyr Lys Trp Lys Asn Val145                 150                 155                 160Val Cys Met Ala Met Arg Val Tyr Arg Tyr Asp Leu Phe Thr Tyr Ile
            165                 170                 175Asp Gly Val Gly Pro Met Pro Leu Gln Gln Met Ile Tyr Ile Gln Arg
        180                 185                 190Gly Leu Leu Glu Ala Leu Ala Tyr Ile His Glu Arg Gly Ile Ile His
    195                 200                 205Arg Asp Val Lys Thr Glu Asn Ile Phe Leu Asp Asn His Glu Asn Ala
210                 215                 220Val Leu Gly Asp Phe Gly Ala Ala Cys Gln Leu Gly Asp Cys Ile Asp225                 230                 235                 240Thr Pro Gln Cys Tyr Gly Trp Ser Gly Thr Val Glu Thr Asn Ser Pro
            245                 250                 255Glu Leu Ser Ala Leu Asp Pro Tyr Cys Thr Lys Thr Asp Ile Trp Ser
        260                 265                 270Ala Gly Leu Val Leu Tyr Glu Met Ala Ile Lys Asn Val Pro Leu Phe
    275                 280                 285Ser Lys Gln Val Lys Ser Ser Gly Ser Gln Leu Arg Ser Ile Ile Arg
290                 295                 300Cys Met Gln Val His Glu Leu Glu Phe Pro Arg Asn Asp Ser Thr Asn305                 310                 315                 320Leu Cys Lys His Phe Lys Gln Tyr Ala Val Arg Val Arg Pro Pro Tyr
            325                 330                 335Thr Ile Pro Arg Val Ile Arg Asn Gly Gly Met Pro Met Asp Val Glu
        340                 345                 350Tyr Val Ile Ser Lys Met Leu Thr Phe Asp Gln Glu Phe Arg Pro Ser
    355                 360                 365Ala Lys Glu Ile Leu Asn Met Pro Leu Phe Thr Lys Ala Pro Ile Asn
370                 375                 380Leu Leu Asn Ile Thr Pro Ser Asp Ser Val385                 390

Claims (13)

1.生产重组HVT的方法，其特征在于将一个异源核苷酸序列引入HVT基因组的插入区，该插入区相应于从具有基本上由图1所限定的限制性内切酶图的HVT基因组的ORF-1末端直至并包括ORF-5的基因组区域。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于将一个异源核苷酸序列引入HVT基因组的插入区，该插入区相应于基本上由SEQ IDNO：1所示的DNA序列限定的核苷酸位置82的4504之间的DNA序列。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于插入区相应于ORF-2，ORF-3，ORF-4或ORF-5。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于在存在于ORF-2或ORF-3中的Bgl II限制性位点上掺入异源核酸序列。
5.根据权利要求1-4的方法，其特征在于插入区内的至少一部分HVT核酸序列被删除。
6.根据权利要求1-5的方法，其特征在于异源核酸序列编码一种多肽并处于在被所述重组HVT感染的细胞中调节所述核酸序列的表达的启动子的控制之下。
7.根据权利要求1-6的方法，其特征在于异源核酸序列编码一种鸟类病原体的抗原。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于抗原是从包括Marek氏病病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病病毒或传染性Bursal病病毒的组中衍生而来的。
9.一种生产核酸序列或其一部分的方法，该核酸序列包含至少一个对HVT异源的基因，在启动子的控制之下并侧接DNA序列，该方法的特征在于所述DNA序列衍生于HVT基因组的插入区，该插入区相应于从ORF-1的末端直到并包括ORF-5的HVT基因组区域。
10.一种生产重组DNA分子的方法，其特征在于将按照权利要求9的方法生产的核酸序列与其它核酸序列重组。
11.一种生产宿主细胞的方法，其特征在于用按照权利要求9的方法生产的核酸序列或用按照权利要求10的方法生产的重组DNA分子转化宿主细胞。
12.按照权利要求1-8的方法制备重组HVT的方法，其特征在于用HVT DNA和用按照权利要求10的方法生产的重组DNA分子共转染适宜的细胞培养物。
13.在启动异源核苷酸序列表达的条件下培养用按照权利要求1-8的方法生产的重组HVT感染的细胞的方法。
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