CN105209605A - 工程化肝组织、其阵列及其制备方法 - Google Patents

Abstract

工程化的、活的三维肝组织构建体，其包含：一个或多个层，其中每个层包含一种或多种肝细胞类型，该一个或多个层凝聚以形成活的三维肝组织构建体。在一些实施方案中，该构建体的特征在于具有如下的至少一种：至少一个包含多种细胞类型的层，该细胞类型相对于彼此空间排列，以创建平面几何形状；和多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其他层不同，以创建层状几何形状。还公开了阵列及其制备方法。还公开了通过组织的体内递送或在体外装置中使用组织，用于一种或多种肝功能的加强或恢复的工程化的、活的三维肝组织构建体。

Description

工程化肝组织、其阵列及其制备方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年3月15日提交的美国申请序列号13/841,430的权益并且是其部分继续申请，该申请通过引用整体并入本文。

背景技术

医疗行业面临着许多紧迫的问题。截至2012年6月，有114,636名患者因需要器官移植而在器官分享联合网络(UnitedNetworkforOrganSharing，UNOS)上登记。根据UNOS，在2012年1月至3月之间，只进行了6,838例移植。与进行的移植相比，每年有更多的患者加入UNOS名单，导致等待移植的患者人数净增长。

此外，一种新的药物化合物的研发成本约为18亿美元。参见Paul等人(2010).HowtoimproveR&Dproductivity:thepharmaceuticalindustry'sgrandchallenge，NatureReviewsDrugDiscovery9(3)：203-214。药物发现是发现和/或设计药物的过程。药物发现的过程通常至少包括以下步骤：确认候选物、合成、表征、筛选和分析治疗效果。虽然在技术上和对生物系统的了解上具有进展，但药物发现仍旧是一个冗长、昂贵且低效的过程，且新治疗剂发现率较低。

发明内容

本发明涉及再生医学和组织和/或器官工程的领域。更具体地，本发明涉及工程化的肝组织构建体、其阵列以及制造方法。

在一个方面，本文公开了工程化的、活的三维肝组织构建体，该构建体包含至少一个限定平面几何形状的区室(compartment)，该区室包含由边部(border)限定的内部(interior)，该内部包含实质细胞，该边部包含非实质细胞；所述细胞凝聚形成活的三维肝组织构建体；条件是该构建体的至少一个部分是生物打印的并且该构建体在使用时基本上不含预形成的支架。在一些实施方案中，该构建体进一步包含挤出化合物，该挤出化合物改善细胞对于生物打印的适合性。在一些实施方案中，该实质细胞源自以下来源中的一种或多种：成年哺乳动物肝组织；胎儿哺乳动物肝组织；建立的(established)源自肝脏的细胞系或株、胚胎干细胞(ESC)；ESC衍生的肝细胞样细胞、诱导多能干细胞(iPSC)；iPSC衍生的肝细胞样细胞；源自肝脏的成体干细胞/祖细胞；和源自非肝脏的组织的成体干细胞/祖细胞。在一些实施方案中，该非实质细胞包括以下一种或多种：血管细胞、内皮细胞、成纤维细胞、间充质细胞、免疫细胞、枯否(Kupffer)细胞、星形细胞、胆管上皮细胞、胆管上皮样细胞、窦内皮细胞、源自肝脏的干细胞/祖细胞以及非源自肝脏的干细胞/祖细胞。在一些实施方案中，该构建体包含暴露于一种或多种分化信号的干细胞/祖细胞。在进一步的实施方案中，该分化信号包括以下一种或多种：生物力学信号、可解析的/可溶解的(soluble)信号和物理信号。在进一步的实施方案中，该干细胞/祖细胞在构建体制造之前暴露于一种或多种分化信号。在进一步的实施方案中，该干细胞/祖细胞在构建体制造期间暴露于一种或多种分化信号。在进一步的实施方案中，该干细胞/祖细胞在构建体制造之后暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，该构建体包含一个或多个层。在进一步的实施方案中，该构建体包含多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其他层不同，以创建层状几何形状。在一些实施方案中，该构建体用于体外分析。在一些实施方案中，该构建体用于以下的一种或多种：药物发现；药物测试；临床前研究；毒性测试；吸收、分布、代谢和排泄试验(ADME)；药物代谢和药代动力学试验(DMPK)；疾病建模；传染病建模；宿主疾病建模；三维生物学研究；和基于细胞的筛选。在一些实施方案中，该构建体用于基于细胞的筛选，其中该筛选用于筛选一种或多种传染病、肝纤维化(例如，肝硬化)、肝癌、肝脂肪变性(例如，脂肪肝)、一种或多种代谢缺陷或一种或多种蛋白质缺乏。在进一步的实施方案中，该传染病包括病毒感染或寄生虫感染(例如，疟原虫感染等)。在一些实施方案中，该构建体用于长期组织毒性研究，其中分析以>3天且最多6个月的周期进行。在一些实施方案中，该构建体用于人体中一种或多种肝功能的加强。在进一步的实施方案中，该构建体用于植入受试者中的损伤、病变或退化(degeneration)部位处。在进一步的实施方案中，该构建体用于在体外装置中临床使用，该装置设计用于加强或恢复一种或多种肝功能。在一些实施方案中，该构建体是不受神经支配的。

在另一个方面，本文公开了工程化的、活的三维肝组织构建体，该构建体包含：一个或多个层，每个层包含一种或多种肝细胞类型，该一个或多个层凝聚以形成活的三维肝组织构建体，该构建体的特征在于具有如下的至少一种：至少一个包含多种细胞类型的层，该细胞类型相对于彼此空间排列，以创建平面几何形状；和多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其他层不同，以创建层状几何形状。在一些实施方案中，该构建体的至少一个部分是生物打印的。在一些实施方案中，工程化肝组织的每个层在X、Y和Z轴中包含多个细胞。在一些实施方案中，工程化肝组织的每个层在X、Y和Z轴中的厚度为至少约50微米。在进一步的实施方案中，该构建体进一步包含挤出化合物，该挤出化合物改善细胞对于生物打印的适合性。在一些实施方案中，该构建体在使用时基本不含预形成的支架。在一些实施方案中，该肝细胞源自以下来源中的一种或多种：成年哺乳动物肝组织；胎儿哺乳动物肝组织；胚胎干细胞(ESC)；ESC衍生的肝细胞样细胞、诱导多能干细胞(iPSC)；iPSC衍生的肝细胞样细胞；源自肝脏的成体干细胞/祖细胞；和源自非肝脏的组织的成体干细胞/祖细胞。在一些实施方案中，该构建体进一步包含以下细胞类型中的一种或多种：血管细胞、内皮细胞、实质细胞、非实质细胞、成纤维细胞、间充质细胞、免疫细胞、癌细胞、枯否细胞、星形细胞、胆管细胞、窦内皮细胞、源自肝脏的干细胞/祖细胞以及非源自肝脏的干细胞/祖细胞。在一些实施方案中，该构建体包含暴露于一种或多种分化信号的干细胞/祖细胞。在进一步的实施方案中，该分化信号包括以下一种或多种：生物力学信号、可解析的/可溶解的信号和物理信号。在进一步的实施方案中，该干细胞/祖细胞在构建体制造之前暴露于一种或多种分化信号。在进一步的实施方案中，该干细胞/祖细胞在构建体制造期间暴露于一种或多种分化信号。在进一步的实施方案中，该干细胞/祖细胞在构建体制造之后暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，该构建体用于体外分析。在进一步的实施方案中，该构建体用于以下的一种或多种：药物发现；药物测试；临床前研究；毒性测试；吸收、分布、代谢和排泄试验(ADME)；药物代谢和药代动力学试验(DMPK)；疾病建模；传染病建模；宿主疾病建模；三维生物学研究；和基于细胞的筛选。在一些实施方案中，该构建体用于基于细胞的筛选，其中该筛选用于筛选一种或多种传染病、肝纤维化(例如，肝硬化)、肝癌、肝脂肪变性(例如，脂肪肝)、一种或多种代谢缺陷或一种或多种蛋白质缺乏。在进一步的实施方案中，该传染病包括病毒感染或寄生虫感染(例如，疟原虫感染等)。在一些实施方案中，该构建体用于长期组织毒性研究，其中分析以>3天且最多6个月的周期进行。在一些实施方案中，该构建体用于人体中一种或多种肝功能的加强。在进一步的实施方案中，该构建体用于植入受试者中的损伤、病变或退化部位处。在进一步的实施方案中，该构建体用于在体外装置中临床使用，该装置设计用于加强或恢复一种或多种肝功能。在一些实施方案中，该构建体是不受神经支配的。

在另一方面，本文公开了工程化的、活的三维肝组织构建体，该构建体包含：多个层，每个层包含圆柱形的生物墨水，该生物墨水基本平行的轴向对齐，该生物墨水包含实质肝细胞；和任选地，在圆柱形生物墨水内或之间的非实质肝细胞；以及任选地，在圆柱形生物墨水之间的空隙空间。在一些实施方案中，该构建体的至少一个部分是生物打印的。在进一步的实施方案中，该构建体进一步包含挤出化合物，该挤出化合物改善细胞对于生物打印的适合性。在一些实施方案中，该实质细胞源自以下来源中的一种或多种：成年哺乳动物肝组织；胎儿哺乳动物肝组织；胚胎干细胞(ESC)；ESC衍生的肝细胞样细胞、诱导多能干细胞(iPSC)；iPSC衍生的肝细胞样细胞；源自肝脏的成体干细胞/祖细胞；和源自非肝脏的组织的成体干细胞/祖细胞。在一些实施方案中，该非实质细胞包括以下一种或多种：血管细胞、内皮细胞、成纤维细胞、间充质细胞、免疫细胞、枯否细胞、星形细胞、胆管上皮细胞、胆管上皮样细胞、窦内皮细胞、源自肝脏的干细胞/祖细胞以及非源自肝脏的干细胞/祖细胞。在一些实施方案中，该构建体包含一个或多个层。在进一步的实施方案中，该构建体包含多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其他层不同，以创建层状几何形状。在一些实施方案中，该构建体用于人体中一种或多种肝功能的加强。在进一步的实施方案中，该构建体用于植入受试者中的损伤、病变或退化部位处。在进一步的实施方案中，该构建体用于在体外装置中临床使用，该装置设计用于加强或恢复一种或多种肝功能。在一些实施方案中，该构建体是不受神经支配的。

在另一个方面，本文公开了工程化的、活的三维肝组织构建体阵列，每个构建体包含：一个或多个层，每个层包含一种或多种肝细胞类型，该一个或多个层凝聚以形成活的三维肝组织构建体，每个构建体的特征在于具有如下的至少一种：至少一个包含多种细胞类型的层，该细胞类型相对于彼此空间排列，以创建平面几何形状；和多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其他层不同，以创建层状几何形状。在一些实施方案中，每个构建体的至少一个部分是生物打印的。在进一步的实施方案中，每个构建体进一步包含挤出化合物，该挤出化合物改善细胞对于生物打印的适合性。在一些实施方案中，每个构建体在使用时基本不含预形成的支架。在一些实施方案中，该肝细胞源自以下来源中的一种或多种：成年哺乳动物肝组织；胎儿哺乳动物肝组织；胚胎干细胞(ESC)；ESC衍生的肝细胞样细胞、诱导多能干细胞(iPSC)；iPSC衍生的肝细胞样细胞；源自肝脏的成体干细胞/祖细胞；和源自非肝脏的组织的成体干细胞/祖细胞。在一些实施方案中，每个构建体包含暴露于一种或多种分化信号的干细胞/祖细胞。在进一步的实施方案中，该分化信号包括以下一种或多种：生物力学信号、可解析的/可溶解的信号和物理信号。在进一步的实施方案中，该干细胞/祖细胞在构建体制造之前暴露于一种或多种分化信号。在进一步的实施方案中，该干细胞/祖细胞在构建体制造期间暴露于一种或多种分化信号。在进一步的实施方案中，该干细胞/祖细胞在构建体制造之后暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，每个构建体进一步包含以下细胞类型中的一种或多种：血管细胞、内皮细胞、实质细胞、非实质细胞、成纤维细胞、间充质细胞、免疫细胞、癌细胞、枯否细胞、星形细胞、胆管细胞、窦内皮细胞、源自肝脏的干细胞/祖细胞以及非源自肝脏的干细胞/祖细胞。在一些实施方案中，该阵列用于体外分析。在进一步的实施方案中，该阵列用于以下的一种或多种：药物发现；药物测试；临床前研究；毒性测试；吸收、分布、代谢和排泄试验(ADME)；药物代谢和药代动力学试验(DMPK)；疾病建模；传染病建模；宿主疾病建模；三维生物学研究；和基于细胞的筛选。在一些实施方案中，该阵列用于基于细胞的筛选，其中该筛选是用于筛选一种或多种传染病、肝纤维化(例如，肝硬化)、肝癌、肝脂肪变性(例如，脂肪肝)、一种或多种代谢缺陷或一种或多种蛋白质缺乏。在进一步的实施方案中，该传染病包括病毒感染或寄生虫感染(例如，疟原虫感染等)。在一些实施方案中，该阵列用于长期组织毒性研究，其中分析以>3天且最多6个月的周期进行。

在另一个方面，本文公开了工程化的、活的三维组织构建体阵列，其中至少一个该构建体是肝组织构建体，每个肝组织构建体包含：一个或多个层，每个层包含一种或多种肝细胞类型，该一个或多个层凝聚以形成活的三维肝组织构建体，该肝组织构建体的特征在于具有如下的至少一种：至少一个包含多种细胞类型的层，该细胞类型相对于彼此空间排列，以创建平面几何形状；和多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其他层不同，以创建层状几何形状。在一些实施方案中，每个肝组织构建体的至少一个部分是生物打印的。在进一步的实施方案中，每个肝组织构建体进一步包含挤出化合物，该挤出化合物改善细胞对于生物打印的适合性。在一些实施方案中，每个肝构建体在使用时基本不含预形成的支架。在一些实施方案中，该肝细胞源自以下来源中的一种或多种：成年哺乳动物肝组织；胎儿哺乳动物肝组织；胚胎干细胞(ESC)；ESC衍生的肝细胞样细胞、诱导多能干细胞(iPSC)；iPSC衍生的肝细胞样细胞；源自肝脏的成体干细胞/祖细胞；和源自非肝脏的组织的成体干细胞/祖细胞。在一些实施方案中，每个肝组织构建体包含暴露于一种或多种分化信号的干细胞/祖细胞。在进一步的实施方案中，该分化信号包括以下一种或多种：生物力学信号、可解析的/可溶解的信号和物理信号。在进一步的实施方案中，该干细胞/祖细胞在构建体制造之前暴露于一种或多种分化信号。在进一步的实施方案中，该干细胞/祖细胞在构建体制造期间暴露于一种或多种分化信号。在进一步的实施方案中，该干细胞/祖细胞在构建体制造之后暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，每个肝组织构建体进一步包含以下细胞类型中的一种或多种：血管细胞、内皮细胞、实质细胞、非实质细胞、成纤维细胞、间充质细胞、免疫细胞、癌细胞、枯否细胞、星形细胞、胆管细胞、窦内皮细胞、源自肝脏的干细胞/祖细胞以及非源自肝脏的干细胞/祖细胞。在一些实施方案中，该阵列用于体外分析。在进一步的实施方案中，该阵列用于以下的一种或多种：组织-组织相互作用；药物发现；药物测试；临床前研究；毒性测试；吸收、分布、代谢和排泄试验(ADME)；药物代谢和药代动力学试验(DMPK)；疾病建模；传染病建模；宿主疾病建模；三维生物学研究；和基于细胞的筛选。在一些实施方案中，该阵列用于基于细胞的筛选，其中该筛选用于筛选一种或多种传染病、肝纤维化(例如，肝硬化)、肝癌、肝脂肪变性(例如，脂肪肝)、一种或多种代谢缺陷或一种或多种蛋白质缺乏。在进一步的实施方案中，该传染病包括病毒感染或寄生虫感染(例如，疟原虫感染等)。在一些实施方案中，该阵列用于长期组织毒性研究，其中分析以>3天且最多6个月的周期进行。

在另一方面，本文公开了制造活的三维肝组织构建体的方法，该方法包括：制备一种或多种包含非实质细胞的生物墨水；制备一种或多种包含实质细胞的生物墨水；将该生物墨水沉积到支持体上；并温育该沉积的生物墨水持续约1小时到约30天，以形成包含至少一个区室的活的三维肝组织构建体，该区室包含由包含非实质细胞的边部限制的包含实质细胞的内部。在一些实施方案中，该非实质细胞包括以下一种或多种：血管细胞、内皮细胞、成纤维细胞、间充质细胞、免疫细胞、癌细胞、枯否细胞、星形细胞、胆管上皮细胞、胆管上皮样细胞、窦内皮细胞、源自肝脏的干细胞/祖细胞以及非源自肝脏的干细胞/祖细胞。在一些实施方案中，该实质细胞源自以下来源中的一种或多种：成年哺乳动物肝组织；胎儿哺乳动物肝组织；胚胎干细胞(ESC)；ESC衍生的肝细胞样细胞、诱导多能干细胞(iPSC)；iPSC衍生的肝细胞样细胞；源自肝脏的成体干细胞/祖细胞；和源自非肝脏的组织的成体干细胞/祖细胞。在一些实施方案中，该构建体的至少一个部分是生物打印的。在进一步的实施方案中，该构建体进一步包含挤出化合物，该挤出化合物改善细胞对于生物打印的适合性。在一些实施方案中，该构建体在使用时基本不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，该构建体是不受神经支配的。

在另一方面，本文公开了制造工程化的、活的三维肝组织构建体的方法，该方法包括：制备一种或多种包含肝细胞的生物墨水；将该一种或多种生物墨水沉积到支持体上；并温育该一种或多种沉积的生物墨水持续约1小时到约30天；其中该构建体包含一个或多个层，每层包含一种或多种细胞类型，该一个或多个层凝聚以形成活的三维肝组织构建体。在一些实施方案中，该肝细胞源自以下来源中的一种或多种：成年哺乳动物肝组织；胎儿哺乳动物肝组织；胚胎干细胞(ESC)；ESC衍生的肝细胞样细胞、诱导多能干细胞(iPSC)；iPSC衍生的肝细胞样细胞；源自肝脏的成体干细胞/祖细胞；和源自非肝脏的组织的成体干细胞/祖细胞。在一些实施方案中，该构建体进一步包含以下细胞类型中的一种或多种：血管细胞、内皮细胞、实质细胞、非实质细胞、成纤维细胞、间充质细胞、免疫细胞、癌细胞、枯否细胞、星形细胞、胆管细胞、窦内皮细胞、源自肝脏的干细胞/祖细胞以及非源自肝脏的干细胞/祖细胞。在一些实施方案中，该构建体的特征在于具有如下的至少一种：至少一个包含多种细胞类型的层，该细胞类型相对于彼此空间排列，以创建平面几何形状；和多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其他层不同，以创建层状几何形状。在一些实施方案中，该构建体的至少一个部分是生物打印的。在进一步的实施方案中，该构建体进一步包含挤出化合物，该挤出化合物改善细胞对于生物打印的适合性。在一些实施方案中，该构建体在使用时基本不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，该构建体是不受神经支配的。

在另一个方面，本文中公开了用于构建活的三维肝组织构建体的方法，该方法包括：制备一个或多个包含哺乳动物肝细胞的凝聚的多细胞聚集体；将所述一个或多个凝聚的多细胞聚集体放置在支持体上，以形成如下的至少一种：至少一个包含多种细胞类型的层，该细胞类型相对于彼此空间排列，以创建平面几何形状；和多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其他层不同，以创建层状几何形状；并温育所述一个或多个多细胞聚集体持续约1小时至约30天，以使其凝聚并形成活的三维肝组织构建体。在一些实施方案中，该肝细胞源自以下来源中的一种或多种：成年哺乳动物肝组织；胎儿哺乳动物肝组织；胚胎干细胞(ESC)；ESC衍生的肝细胞样细胞、诱导多能干细胞(iPSC)；iPSC衍生的肝细胞样细胞；源自肝脏的成体干细胞/祖细胞；和源自非肝脏的组织的成体干细胞/祖细胞。在一些实施方案中，该肝组织构建体进一步包含以下细胞类型中的一种或多种：血管细胞、内皮细胞、实质细胞、非实质细胞、成纤维细胞、间充质细胞、免疫细胞、癌细胞、枯否细胞、星形细胞、胆管细胞、窦内皮细胞、源自肝脏的干细胞/祖细胞以及非源自肝脏的干细胞/祖细胞。在一些实施方案中，该构建体的至少一个部分是生物打印的。在一些实施方案中，该构建体进一步包含挤出化合物，该挤出化合物改善细胞对于生物打印的适合性。在一些实施方案中，该构建体在生物打印时或使用时不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，该构建体是不受神经支配的。

在另一方面，本文公开了制造活的三维肝组织构建体的方法，该方法包括将沉积到支持体上的一种或多种包含实质细胞的生物墨水和一种或多种包含非实质细胞的生物墨水温育持续约1小时到约30天以形成活的三维肝组织构建体，该构建体包含至少一个区室，该区室包含由包含非实质细胞的边部限制的包含实质细胞的内部。

在另一方面，本文公开了工程化的、活的三维肝组织构建体，该构建体包含一个或多个层，至少一个层包含至少两种细胞类型，该至少两种细胞类型包含实质肝细胞类型和非实质肝细胞类型，该至少两种细胞类型相对于彼此空间排列以创建平面几何形状，该平面几何形状包含至少一个实质肝细胞区室和至少一个非实质肝细胞区室，该一个或多个层凝聚以形成活的三维肝组织构建体，条件是该活的三维肝组织构建体在体外培养中保持基本存活至少7天并具有以下肝特征的至少两种：合成胆固醇；储存脂质；储存糖原；表达肝特异性蛋白质，该蛋白质包括以下的两种或更多种：白蛋白、纤维蛋白原、转铁蛋白、CYP450、α-1-抗胰蛋白酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、糖原合酶、因子VIII和因子IX；对肝调节物有响应，该肝调节物包括以下的一种或多种：激素、诱导物、毒物、药物、抗体、干扰RNA、小RNA、锁定核酸、病毒、细菌、寄生虫和炎症诱导剂；对肝毒物有响应，该肝毒物包括以下的一种或多种：醋氨酚、醇、曲伐沙星、甲氨蝶呤、双氯芬酸、曲格列酮、丙戊酸、胺碘酮；表达转运蛋白，该转运蛋白包括以下的一种或多种：BSEP、OATP1B1、NTCP、PGP、BCRP、OATP1B3、ABCB4、ATP8B1、多药抗药性转运蛋白(MDR)；制造后保持至少一些静止星形细胞；以及包含微血管结构。在一些实施方案中，该构建体在体外培养中保持基本存活至少14天。在一些实施方案中，该构建体在体外培养中保持基本存活至少28天。在进一步的实施方案中，该构建体在体外培养中保持基本存活至少40天。在各个实施方案中，该构建体在体外培养中保持基本存活至少7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或更多天。在一些实施方案中，使用生物打印机以全自动的流程生产该构建体。在一些实施方案中，该至少两种细胞类型包括来源于诱导多能干细胞(iPSC)的细胞。在一些实施方案中，该至少两种细胞类型包括来源于单核细胞或巨噬细胞的髓系细胞。在各个实施方案中，该构建体具有至少三个、四个、五个或六个、七个、八个或所有的肝特征。

附图说明

在所附权利要求书中详细阐明了本发明的新特征。通过参考以下阐明了说明性实施方案的发明详述(其中利用了本发明的原理)和附图，将获得对本发明特征和优点的更好理解，附图中：

图1为天然肝组织几何形状的非限制性、示例性图示。

图2为含有HepaRG细胞的生物打印肝构建体的成熟和生化表征的非限制性、示例性演示。将HepaRG细胞沉积在周界盒(perimeterbox)的中央，随后成熟96小时(A-C)。生物打印的肝构建体是代谢活性的，其在96小时产生白蛋白(D)和胆固醇(E)。在地塞米松处理后，细胞色素P450(CYP3A4)活性比未处理的对照高5倍(F)。

图3为以限定的几何图案(A，B)生物打印的结构的非限制性实例，其含有iPSC衍生的肝细胞(C)，该肝细胞在该工程化的、生物打印的构建体中合成比在2D培养对照中显著更高的白蛋白水平(D)(每百万个输入细胞)。

图4为含有非实质细胞离散球状体(B)的生物打印肝构建体(A)的成熟的非限制性、示例性演示。该生物打印的构建体在额外温育24小时后保持融合和稳定(C，D)。

图5为共打印的模具的溶解的非限制性、示例性演示，该模具允许在肝细胞的打印过程中进行空间和时间控制，并导致在x、y和z轴中产生用户指定的具有限定的形状和大小的区室。箭头指示打印后24小时共打印的模具已经溶解的区域和可以添加额外的细胞输入的区域。

图6为描绘了工程化肝组织的非限制性实例的宏观图像，在这种情况下，是使用多个肝脏细胞类型和水溶性挤出化合物(例如，PF-127)构成的生物墨水、并利用连续沉积机理生物打印的多层肝组织。(A)显示了单个功能单元的示意图，突出了通过图案化生物墨水和负空间(negativespace)构建的平面几何图形；(B)含有2x10⁸个细胞的用PF-127生物打印的镶嵌(tessellated)功能单元；(C)显示了在施加培养基20分钟后的构建体；和(D)示出了向该结构施加培养基并溶出挤出化合物16小时之后的构建体。记录该平面几何图形随着时间的保持度。

图7是图6的镶嵌构建体的非限制性显微照片，描绘了在镶嵌构建体中的示例性“轮辐(spoke)”。该显微照片显示了通过在多层镶嵌六边形结构中连续沉积来生物打印，然后培养16小时的星形细胞、内皮细胞和真皮成纤维细胞的福尔马林固定石蜡包埋的组织切片的苏木精和曙红染色。

图8为共打印的模具的溶解的非限制性实例，该溶解使得不同区室化的肝细胞区域融合(由箭头标出)。该区域随时间(B；T＝24小时)融合成固体的生物打印的组织。

图9为共打印的模具(4％明胶和2％藻酸盐)的非限制性实例，该模具用MMXBioprinter的注射器沉积模块(SDM)生物打印，以产生构建体(A)，该构建体在打印后72小时融合并成熟为肝组织(B)。在此实例中，如通过H&E染色(C)所证明的，该生物打印的组织是致密的，并且如通过与增殖细胞(E)相比相对较少的TUNEL染色的细胞(D)所证明的，该组织是存活的。

图10为共打印的模具(A；4％明胶和2％藻酸盐)的非限制性实例，该模具通过用注射器沉积模块(SDM)连续沉积而生物打印，以产生融合的三维肝组织构建体。向该结构的中央添加内皮生物墨水增加该构建体的复杂性(B)。E-钙粘蛋白(C)和CD31(D)染色表明，打印后144小时，上皮细胞和内皮细胞在其被生物打印的区域中普遍存在。TUNEL染色显示出温育144小时后在该工程化肝组织的核心内的有限细胞死亡(E)。

图11为由水凝胶组成的共打印的模具(共模具)(4％明胶：2％藻酸盐)(A)或由非实质细胞和基于水凝胶的挤出化合物组成的生物墨水(B)的非限制性实例。生物墨水共模具线含有150x10⁶个细胞每mL水凝胶挤出化合物。将HepG2细胞添加至该共模具结构并温育24h，产生融合的、生物打印的肝结构(C)。该挤出化合物的溶解在水性介质中随时间而发生。

图12为致密的细胞肝组织的非限制性实例，该组织通过在NovoGenMMXBioprinter上使用两个注射器沉积模块(SDM)连续沉积而制造。通过第一SDM模块沉积含有4％明胶和2％藻酸盐的共模具线，随后用第二SDM填充HepG2生物浆料。

图13为生物打印的具有层状几何形状的新组织(neotissue)的非限制性实例。生物打印NovoGel^TM水凝胶基底和共打印的限定盒，随后沉积包含肝上皮细胞生物墨水(HepG2细胞)的第一层，向其上生物打印由肝星形细胞和内皮细胞构成的第二层。在此实例中，通过连续沉积含有水凝胶挤出化合物的生物墨水生物打印了该星形细胞：EC层(A)。制造后立即获得的构建体总体图像显示了两个不同的生物墨水层(B)。培养48小时后对福尔马林固定、石蜡包埋的构建体的切片进行的苏木精和曙红染色(C)显示了两个层的不同形态和层状几何形状的建立。CD31-阳性细胞被限制在该构建体的上层，在该层中生物打印了内皮细胞和肝星形细胞的悬浮液(D)，而IGF-2-阳性HepG2仅在底层中发现(E)。

图14为生物打印的肝组织中细胞图案化和分层的非限制性实例。对石蜡包埋的组织切片进行的苏木精和曙红染色显示了相邻的新组织(A)，该新组织通过生物打印含有血管内皮细胞和肝星形细胞的多型细胞群体而形成。用CD31抗体对组织切片的染色显示了位于中央的内衬EC的微血管和CD31-阳性EC外层的存在(B)。

图15为用TGF-β1刺激生物打印的肝星形细胞组织的非限制性实例。生物打印的肝星形细胞片与浓度渐增的TGF-β1(0、1、10、50ng/mL)一起温育，导致生物打印的组织在总体观察上发生改变，细胞因子浓度的增加导致组织长出物形成的增加(A-D，0-50ng/mL)。来自生物打印的含有肝星形细胞的组织的组织切片的三色染色显示出胶原沉积和构建体大小的增加以及细胞密度的明显减少(E-H，0-50ng/mL)。

图16为以多孔样式生物打印的非限制性实例。在多孔板(A)中或多孔培养插入物(B)内产生生物打印的组织构建体，该构建体被任选地放置于合适的多孔板中用于长期保持和成熟。在此，组织构建体被生物打印在48孔聚苯乙烯板中(A)和6孔培养插入物的多孔膜上(B)。

图17为生物打印的肝管状结构的非限制性实例，该结构被设计并打印用于体外支撑。生物打印并调适(condition)包含70％HepG2/25％HUVEC/5％肝星形细胞的40mm长的生物墨水圆柱体。通过使用可移除的生物插入物水凝胶在该结构的中央构建了通道。

图18为平面和层状几何形状(包括其组合)的一系列非限制性实施例，这些几何形状与本文所述的构建方法相容，并再现天然组织结构的结构要素或空间要素和生物学。示例性的几何形状包括在结构上正确的组织，其具有血管网(A)、带状组织(B)、分叶组织(C)、灌注的/排列的组织(D)、具有固体+液体/液体界面的组织(E)、屏障(barrier)组织(F)以及具有层状几何形状的分层组织(G)。

图19为含有重复管状结构的体外肝装置的非限制性图示，该管状结构具有均匀间隔的空隙空间(描绘为被临时的填充体所占据；深色圆)，使得允许跨过和/或通过该工程化的肝组织灌注。

图20为生物打印的人肝组织的非限制性实例。

图21为显示生物打印的人肝组织的组织学表征的一系列非限制性显微照片；在这种情况下，显微照片示出了高组织密度(A)、ECM的产生(B)、脂质的产生(C)以及糖原的产生(D)。

图22为显示生物打印的人肝组织的组织学表征的一系列非限制性显微照片；在这种情况下，显微照片示出了被非实质间质围绕的肝细胞区域和明显的自组织成模拟天然肝组织的小叶型结构。

图23为显示由生物打印的人肝组织产生白蛋白(A)和胆固醇(B)的数据的非限制性实例。

图24为显示由生物打印的人肝组织产生转铁蛋白(A)和纤维蛋白原(B)的数据的非限制性实例。

图25为显示在制造后第10天生物打印的人肝组织中胆汁盐输出蛋白mRNA相对于持家基因RNA(18sRNA)的相对量的数据的非限制性实例。

图26为显示在生物打印的人肝组织中通过利福平处理持续诱导活性CYP3A4酶的数据的非限制性实例(A)，该诱导可以被维拉帕米抑制(B)。

图27为显示如根据乳酸脱氢酶(LDH)所测量的，在生物打印的肝组织中通过双氯芬酸处理来诱导CYP3A4，随后以较高的剂量进行组织损伤的数据的非限制性实例。

图28为显示在生物打印的肝组织中，在曲伐沙星相对于左氧氟沙星的多剂量研究中，白蛋白减少(A)和LDH增加(B)的数据的非限制性实例。

图29为显示在生物打印的肝组织中，在甲氨蝶呤的多剂量研究中，根据ATP所测量的活力降低(A)、白蛋白减少(B)和LDH增加(C)的数据的非限制性实例。

图30为显示如根据CYP的诱导所测量的，生物打印的肝组织对维生素D的响应的数据的非限制性实例。

图31为显示如根据IL-6的产量所测量的，在含有枯否细胞的生物打印的肝组织中，对LPS刺激的响应的数据的非限制性实例。

图32为显示如根据细胞因子(IL-10、IL-1b和TNF-α)的产量所测量的，在含有枯否细胞的生物打印的肝组织中，对LPS(10μg/ml(A)和100μg/ml(B))刺激的剂量依赖性响应的数据的非限制性实例。

图33为约90％汇合的肝窦内皮细胞(HSEC)单层的非限制性实例。

图34为显示如根据IL-6的产量所测量的，二维培养物中HSEC对LPS的响应的数据的非限制性实例。

图35为在非实质部分中引入HSEC的融合的三维生物打印的肝组织的非限制性实例。

图36为描绘小分子渗透穿过冷冻切片的三维生物打印肝组织的显微照片(FITC；5X)的非限制性实例。

具体实施方式

对于许多患有肝功能衰竭的患者，通过递送健康的细胞或组织来恢复即使部分肝质量，对患者的存活和肝功能也可以具有重大的影响。根据2011年UNOS数据库，在美国有超过10,000名患者等待肝移植，其中不到50％的患者真正接受了移植的肝脏。可以从移植的肝脏受益的患者比列在移植名单上的多得多，该名单通常为病情最严重的患者保留。而且，许多个体患有慢性退化疾病，对此移植不是现今的医疗保健模型。因此，功能性的肝组织将具有巨大临床价值。在美国，现在常规进行节段性的或部分的肝移植，其中单个器官被分成2-3个片或叶，每一片移植到等待名单中的患者中。因为健康的肝组织具有根据其大小和代谢需求而生长并适应个体的独特能力，所以部分质量移植的方法在临床上是可行的。

此外，由于不可预料的毒性，许多化合物在后期临床试验中或上市后失败，其占到化合物在III期中失败的35％(Curr.Pharm.Des.200511:3545)。不可预料的肝毒性占这些失败中的大多数，随后是心脏毒性和肾毒性。因此，需要更好的系统来提供对人体内表现的更精确的预测。

对能大大增加创新的、成本有效的新药的数量和质量而不造成不可承受的研究和开发成本的材料、工具和技术存在需求。因此，本发明人在本文中公开了工程化的肝组织构建体、其阵列及其制备方法，其在组织和器官工程化、体外分析、药物发现和其他领域中具有实用性。

肝组织的先前的模型集中在通过将细胞接种到预形成并且成形为适应预期应用的三维支架材料上，或使肝细胞通过随机组装形成多细胞球状体(其中产生了细胞球状聚集体但聚集体内没有指向结构)，来提供工程化的组织构建体。已接种到支架材料上的细胞是原代细胞、细胞系、工程化细胞和/或干细胞/祖细胞。当利用多能干细胞或祖细胞时，它们或者在接种到三维支架材料上之前在二维单层培养中经历分化程序，或者首先接种到支架材料上并随后在原位或在体外经历分化程序以产生期望的组织。就细胞产率、构建体内细胞的终末分化所需的时间以及所得三维结构的总体细胞性和结构而言，传统方法既费力又低效。

重要的是，先前的努力和技术未能产生限定的组织区室，该区室在结构内的特定位置存在特定细胞类型并且在构建体中一次保持数天或数周(最多40天)。另外，先前的努力和技术未能显示出有助于组织寿命的天然样结构，包括微血管结构和紧密连接。本文所述的技术使得能够对结构进行精细控制并使得能够产生高度限定的类似天然组织的几何形状。此外，该技术使得能够构建保持这些几何形状的高细胞密度组织，因此延长了组织的使用寿命。

在某些实施方案中，本文公开了工程化的、活的三维肝组织构建体，该构建体包含至少一个限定平面几何形状的区室，该区室包含由边部限定的内部，该内部包含实质细胞，该边部包含非实质细胞；所述细胞凝聚形成活的三维肝组织构建体；条件是该构建体的至少一个部分是生物打印的并且该构建体在使用时基本上不含预形成的支架。

在某些实施方案中，本文还公开了工程化的、活的三维肝组织构建体，该构建体包含：一个或多个层，每个层包含一种或多种肝细胞类型，该一个或多个层凝聚以形成活的三维肝组织构建体，该构建体的特征在于具有如下的至少一种：至少一个包含多种细胞类型的层，该细胞类型相对于彼此空间排列，以创建平面几何形状；和多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其他层不同，以创建层状几何形状。

在某些实施方案中，本文还公开了工程化的、活的三维肝组织构建体，该构建体包含：多个层，每个层包含圆柱形的生物墨水，该生物墨水基本平行的轴向对齐，该生物墨水包含实质肝细胞；和任选地，在圆柱形生物墨水之内或之间的非实质肝细胞；以及任选地，在圆柱形生物墨水之间的空隙空间。

在某些实施方案中，本文还公开了工程化的、活的三维肝组织构建体阵列，每个构建体包含：一个或多个层，每个层包含一种或多种肝细胞类型，该一个或多个层凝聚以形成活的三维肝组织构建体，每个构建体的特征在于具有如下的至少一种：至少一个包含多种细胞类型的层，该细胞类型相对于彼此空间排列，以创建平面几何形状；和多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其他层不同，以创建层状几何形状。

在某些实施方案中，本文还公开了工程化的、活的三维组织构建体阵列，其中该构建体中的至少一个是肝组织构建体，每个肝组织构建体包含：一个或多个层，每个层包含一种或多种肝细胞类型，该一个或多个层凝聚以形成活的三维肝组织构建体，该肝组织构建体的特征在于具有如下的至少一种：至少一个包含多种细胞类型的层，该细胞类型相对于彼此空间排列，以创建平面几何形状；和多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其他层不同，以创建层状几何形状。

在某些实施方案中，本文还公开了制造活的三维肝组织构建体的方法，该方法包括：制备一种或多种包含非实质细胞的生物墨水；制备一种或多种包含实质细胞的生物墨水；将该生物墨水沉积到支持体上；并温育该沉积的生物墨水持续约1小时到约30天，以形成包含至少一个区室的活的三维肝组织构建体，该区室包含由包含非实质细胞的边部限制的包含实质细胞的内部。

在某些实施方案中，本文还公开了制造工程化的、活的三维肝组织构建体的方法，该方法包括：制备一种或多种包含肝细胞的生物墨水；将该一种或多种生物墨水沉积到支持体上；并温育该一种或多种沉积的生物墨水持续约1小时到约30天；其中该构建体包含一个或多个层，每层包含一种或多种细胞类型，该一个或多个层凝聚以形成活的三维肝组织构建体。

在某些实施方案中，本文中还公开了用于构建活的三维肝组织构建体的方法，该方法包括：制备一个或多个包含哺乳动物肝细胞的凝聚的多细胞聚集体；将所述一个或多个凝聚的多细胞聚集体放置在支持体上，以形成如下的至少一种：至少一个包含多种细胞类型的层，该细胞类型相对于彼此空间排列，以创建平面几何形状；和多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其他层不同，以创建层状几何形状；并温育所述一个或多个多细胞聚集体持续约1小时至约30天，以使所述多细胞聚集体凝聚，并形成活的三维组织构建体。

在某些实施方案中，本文还公开了制造活的三维肝组织构建体的方法，该方法包括将沉积到支持体上的一种或多种包含实质细胞的生物墨水和一种或多种包含非实质细胞的生物墨水温育约1小时到约30天以形成活的三维肝组织构建体，该构建体包含至少一个区室，该区室包含由包含非实质细胞的边部限制的包含实质细胞的内部。

在某些实施方案中，本文还公开了工程化的、活的三维肝组织构建体，该构建体包含一个或多个层，至少一个层包含至少两种细胞类型，该至少两种细胞类型包含实质肝细胞类型和非实质肝细胞类型，该至少两种细胞类型相对于彼此空间排列以创建平面几何形状，该平面几何形状包含至少一个实质肝细胞区室和至少一个非实质肝细胞区室，该一个或多个层凝聚以形成活的三维肝组织构建体，条件是该活的三维肝组织构建体在体外培养中保持基本存活至少7天并具有以下肝特征的至少两种：合成胆固醇；储存脂质；储存糖原；表达肝特异性蛋白质，该蛋白质包括以下的两种或更多种：白蛋白、纤维蛋白原、转铁蛋白、CYP450、α-1-抗胰蛋白酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、糖原合酶、因子VIII和因子IX；对肝调节物有响应，该肝调节物包括以下的一种或多种：激素、诱导物、毒物、药物、抗体、干扰RNA、小RNA、锁定核酸、病毒、细菌、寄生虫和炎症诱导剂；对肝毒物有响应，该肝毒物包括以下的一种或多种：醋氨酚、醇、曲伐沙星、甲氨蝶呤、双氯芬酸、曲格列酮、丙戊酸、胺碘酮；表达转运蛋白，该转运蛋白包括以下的一种或多种：BSEP、OATP1B1、NTCP、PGP、BCRP、OATP1B3、ABCB4、ATP8B1、多药抗药性转运蛋白(MDR)；在制造后保持至少一些静止星形细胞；以及包含微血管结构。

某些定义

除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

如在本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数的指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一种核酸”包括一种或多种核酸，和/或本领域技术人员在阅读本公开内容等之后将会明白的、本文所述的类型的组合物。本文中任何提及的“或”意在包括“和/或”，除非另有说明。

如本文中使用的，“阵列”是指科学工具，包括多个空间排列的元件的关联(association)，以允许在一个样品上进行多个试验、在多个样品上进行一个或多个试验或两者。

如本文中使用的，“分析(assay)”是指：测试或测量物质(例如化学品、分子、生物化学品、蛋白质、激素或药物等)在有机或生物样品(例如细胞聚集体、组织、器官、有机体等)中的存在或活性的程序。

如本文中使用的，“生物相容性的(biocompatible)”是指对细胞造成伤害或毒性的风险有限。如在说明书和权利要求书中所呈现的，“生物相容性多孔容器”和“生物相容性膜”对哺乳动物细胞造成伤害或毒性的风险有限，但该定义并未延伸到隐含了这些生物相容性元件可以被植入到哺乳动物体内。

如本文中使用的，“生物墨水”是指在生物打印中使用的液体、半固体或固体组合物。在一些实施方案中，生物墨水包含细胞溶液、细胞聚集体、包含细胞的凝胶、多细胞体或组织。在一些实施方案中，生物墨水还包含支撑材料。在一些实施方案中，生物墨水还包含无细胞材料，该材料提供使得生物打印能够进行的特定生物力学性质。在一些实施方案中，生物墨水包含挤出化合物。

如本文中使用的，“生物打印”是指：经由与自动的或半自动的、计算机辅助的三维原型装置(例如生物打印机)相容的方法，利用细胞(例如细胞溶液、含细胞的凝胶、细胞悬浮液、细胞浓缩物、多细胞聚集体、多细胞体等)的三维精确沉积。

如本文中使用的，“凝聚(cohere)”、“凝聚的(cohered)”和“凝聚(cohesion)”指将细胞、细胞聚集体、多细胞聚集体、多细胞体和/或它们的层结合起来的细胞-细胞粘附性质。该术语可以与“融合(fuse)”、“融合的(fused)”和“融合(fusion)”互换使用。

如本文中使用的，“圆柱形的”是指基本具有圆柱体的形式。在各个实施方案中，圆柱形生物墨水基本具有圆柱体的形式并且在形式上是约99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％、65％或60％(包括其间的任何量)为圆柱形的。在进一步的各个实施方案中，圆柱形生物墨水沿其长度的大约99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％(包括其间的任何量)基本具有圆柱形的形式。在一些实施方案中，“圆柱形的”是指在制造时基本具有圆柱形的形式。

如本文中使用的，“层状”是指多层的、生物打印的组织，其中两个或多个平面层组合起来以增加该组织在Z平面的总厚度。在一些实施方案中，每个平面层在结构和/或组成上基本类似。在其他实施方案中，每个平面层在结构和/或组成上是基本上独特的。

如本文中使用的，“层”是指在X和Y平面中多个细胞厚度的细胞的联合。在一些实施方案中，本文所述的工程化肝组织包含一个层。在其他实施方案中，本文所述的工程化肝组织包含多个层。在各个实施方案中，层形成连续的、基本连续的或非连续的细胞片。在一些实施方案中，本文所述的工程化肝组织的每个层在X、Y和Z轴中包含多个细胞。在进一步的实施方案中，工程化肝组织的每个层在X、Y和Z轴中至少为约50微米厚。

如本文中使用的，“多层的”是指由两个或多个组织层构成，其中每个组织层是一个或多个细胞层的厚度。在一些实施方案中，组织层一次沉积一个。在其他实施方案中，同时沉积多个层。任选地，每个层是由多种细胞类型构成的。进一步地，在每个层中的多种细胞类型任选地在X-Y平面(即：水平平面)上以空间限定的结构相对于彼此排列。此外，在某些情况下，在Z-平面(即：垂直平面)上的层增加导致细胞在层内相对于彼此的受控空间定位，使得空间限定的结构在Z-平面上继续。

如本文中使用的，“多能细胞”是指能够经历分化成为两种或多种细胞类型的细胞。多能细胞包括，例如，间充质干细胞/基质细胞、诱导性多潜能干细胞和胚胎干细胞。

如本文中使用的，“实质细胞”是指肝细胞或肝细胞样细胞；而“非实质细胞”是指不是肝细胞或肝细胞样细胞的肝脏细胞。

如本文中使用的，“平面的”是指生物打印的多细胞组织的层，其中多个生物墨水组合物和/或空隙空间相对于彼此空间排列成基本在该组织层的X-Y平面内的限定的图案。例如参见图18A-E。在各个实施方案中，平面层是基本平面的，例如，约99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％、65％或60％(包括其间的任何量)空间排列成在该组织层的X-Y平面内的限定的图案。

如本文中使用的，“支架”是指：合成的支架，例如聚合物支架和多孔水凝胶；非合成的支架，例如预形成的细胞外基质层、死细胞层和脱细胞的组织，以及任何其他类型的预形成支架，它对于工程化组织和/或器官的物理结构而言是必要的，并且不能在不损坏/破坏所述组织和/或器官的情况下从该组织和/或器官除去。在进一步的实施方案中，脱细胞的组织支架包括脱细胞的天然组织或以任意方式由培养的细胞产生的脱细胞的细胞材料；例如，使之死亡或者脱细胞而留下它们在活着时产生的ECM的细胞层。因此，术语“无支架(scaffoldless)”意在隐含了：在使用时，支架不是工程化组织的必要部分，或者已经被除去或者保留作为工程化组织的惰性部分。“无支架(Scaffoldless)”可以与“不含支架(scaffold-free)”和“不含预形成的支架”互换使用。

如本文中使用的，“受试者”是指为人、非人的动物、任意哺乳动物或任意脊椎动物的任意个体。该术语可以与“患者”、“受体”和“供体”互换。

如本文中使用的，“支持体”是指能够接受所沉积的生物墨水的任何生物相容性表面。

如本文中使用的，“组织”是指细胞的聚集体。组织的实例包括但不限于：结缔组织(例如，网形结缔组织、致密结缔组织、弹性组织、网状结缔组织和脂肪组织)、肌肉组织(例如，骨骼肌、平滑肌和心肌)、泌尿生殖组织、胃肠组织、肺组织、骨组织、神经组织和上皮组织(例如，单层上皮和复层上皮)、内胚层来源的组织、中胚层来源的组织和外胚层来源的组织。

组织工程

组织工程是跨学科的领域，其应用并结合了工程学和生命科学的原理，指向生物替代品的发展，该生物替代品通过器官或组织的加强(augmentation)、修复或更换来恢复、保持或改善组织功能。经典组织工程学的基本方法是将活细胞接种到生物相容且最终可生物降解的环境中(例如支架)，随后在生物反应器中培养该构建体，以便初始细胞群体进一步扩充和成熟，以在植入后生成目标组织。采用模拟该生物细胞外基质(ECM)的适当支架，发育中的组织在一些情况下在体外和体内成熟之后采取了所需器官的形态和功能。然而，由于控制细胞在整个支架上的分布和空间排列的能力有限，达到足够高的细胞密度并具有类似于天然组织的结构是具有挑战性的。这些限制经常导致组织或器官具有较差的机械性能和/或不足的功能。在支架的生物降解性、残留聚合物的夹杂和制造工艺的工业规模化方面，存在额外的挑战。已经尝试了无支架的方法。目前的无支架方法受到一些限制：

·复杂的平面和/或层状几何形状，例如多层结构，其中一个或多个层在组成上或结构上与其他层不同，或者其中一个或多个层在相对于彼此空间限定的位置中包含多种细胞类型，通常需要将细胞类型在特定的结构中进行明确的高分辨率的放置，以再现性地获得类似天然组织的结果。

·规模和/或几何形状受到扩散和/或营养供给需要功能血管网络的限制。

·在一些情况下，组织的存活力受到限制材料的损害，该限制材料限制了扩散并限制细胞获得营养物。

在某些实施方案中，本文中公开了工程化的哺乳动物组织、工程化的肝组织/构建体、其阵列以及制造方法。本文中公开的组织工程方法具有以下优点：

·它们能够产生包含细胞的组织和/或器官。

·通过重新产生类似于天然组织的细胞间相互作用，它们模拟在天然组织的发育、稳态和/或发病中发现的环境条件。

·它们任选地获得活的三维组织和复合组织，其具有宽范围的复杂拓扑结构和几何形状(例如多层结构、节段、片、管、囊等)。

·它们与自动或半自动制造手段相容，并且是可规模化的。

生物打印使得生成微小规模组织类似物的改善方法成为可能，包括对体外分析有用的那些(参见下文)。

生物打印

在一些实施方案中，工程化肝组织/构建体及其阵列的至少一个部分是生物打印的。在进一步的实施方案中，生物打印的构建体是采用使用了快速原型技术的方法得到的，该快速原型技术是基于通过三维递送装置(例如生物打印机)将细胞和任选的限制材料向(例如由水凝胶和/或多孔膜组成的)生物相容性支撑表面上进行三维、自动化、计算机辅助的沉积，该细胞包括细胞溶液、细胞悬浮液、包含细胞的凝胶或浆料(paste)、细胞浓缩物、多细胞体(例如圆柱体、球形体、带形体等)。如本文中使用的，在一些实施方案中，在用于指代组织和/或器官时，术语“工程化的”是指：根据计算机脚本，通过计算机辅助的装置(例如生物打印机)，将细胞、细胞溶液、细胞悬浮液、包含细胞的凝胶或浆料、细胞浓缩物、多细胞聚集体和它们的层放置以形成三维结构。在进一步的实施方案中，计算机脚本例如是一个或多个计算机程序、计算机应用或计算机模块。在更进一步的实施方案，通过细胞或多细胞体的打印后融合来形成三维组织结构，在一些情况下，这类似于早期形态发生中的自组装现象。

尽管有许多方法可以用来将细胞、多细胞聚集体和/或它们的层布置在生物相容性表面上以产生三维结构，包括手动放置，但通过自动化的、计算机辅助的机器(例如生物打印机)来放置是有利的。采用这种技术递送细胞或多细胞体的优点包括：快速、精确和可再现地放置细胞或多细胞体以产生构建体，该构建体表现出具有各种组成的细胞、多细胞聚集体和/或它们的层的计划的或预先确定的取向或图案。优点还包括确保的高细胞密度，同时使细胞破坏减至最小。肝脏的实质细胞特别容易受到剪切力和其他生物力学应力的损害；因此生物墨水和本文所述的生物打印过程的结合使用提供了优于替代技术的独特优势，如图9中突出显示的生物打印后有利的实质细胞活力所突出显示的。

在一些实施方案中，生物打印方法是连续的和/或基本连续的。连续生物打印方法的非限制性实例是：经由连接到生物墨水储库的分配末端(例如，注射器、毛细管等)从生物打印机分配生物墨水(例如细胞，与赋形剂或挤出化合物组合的细胞，或细胞的聚集体)。在进一步的非限制性实施方案中，连续生物打印方法是按功能单元的重复图案(pattern)分配生物墨水。在各个实施方案中，重复功能单元具有任何适宜的几何形状，包括例如：圆形、正方形、矩形、三角形、多边形和不规则的几何形状，从而产生具有通过独特生物墨水和/或间隙空间的空间图案化而获得的平面几何形状的一个或多个组织层。在进一步的实施方案中，生物打印的功能单元的一个重复图案包括一个层，相邻地生物打印(例如堆叠)多个层以形成具有层状几何形状的工程化组织或器官。在各个实施方案中，相邻地生物打印(例如堆叠)了2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个层，以形成工程化组织或器官。在进一步的实施方案中，具有层状几何形状的组织的一个或多个层也具有平面几何形状。

在一些实施方案中，功能性单元由若干融合的或凝聚的管状结构组成，该管状结构在水平和垂直维度上排列以形成连续的肝组织结构，该肝组织结构含有均匀间隔的空隙空间或通道，这使得能够跨过和/或通过该工程化的肝组织而扩散。见图17和19。

在一些实施方案中，生物打印的功能单元以镶嵌图案重复。“镶嵌图案”是向该平面填充而没有重叠和空隙的图形平面。图6A显示任选地重复以产生图6B-D和图7所示的镶嵌图案的功能单元的实例。作为非限制性的实例，连续和/或镶嵌生物打印的优点包括提高的生物打印组织的生产率。另一个非限制性的示例性优点是不需要将生物打印机与先前沉积的生物墨水元件对准。在一些实施方案中，连续生物打印有利于从大型生物墨水储库打印较大的组织，该打印过程中任选地使用注射器机构。连续的生物打印也是利用挤出化合物、水凝胶、聚合物、生物墨水或能够在打印后保持其形状的任何可打印材料，共打印空间限定的边界的适宜方式；其中创建的边界任选地通过生物打印一种或多种生物墨水填充，从而创建具有空间限定的平面几何形状的镶嵌组织，例如参见图3A、5A、5B、6、8和11中说明的实施方案。

在一些实施方案中，连续生物打印中的方法包括：独立地或相对于彼此优化和/或平衡诸如打印高度、泵速、机器人速度(robotspeed)或其组合的参数。在某些情况下，用于沉积的生物打印机头速度为3mm/s，第一层的分配高度为0.5mm，而后面每个层的分配高度增加0.4mm。在一些实施方案中，该分配高度与生物打印机分配末端的直径基本相等。非限制性地，适宜的和/或最佳的分配距离不会导致材料变平或附着到分配针上。在各个实施方案中，生物打印机分配末端具有约20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000μm或更大的内径，包括其间的任何量。在各个实施方案中，生物打印机的生物墨水储库具有约0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100立方厘米或更大的容积，包括其间的任何量。在一些情况下，当系统中的残余压力积累较低时，该泵速是适宜的或最佳的。在一些情况下，有利的泵速取决于储库的横截面积与分配针之间的比例，该比例越大，则需要越低的泵速。在一些实施方案中，适宜的和/或最佳的打印速度使得能够沉积均匀的线，而不影响材料的机械完整性。

本文中公开的发明包括商业方法。在一些实施方案中，本文中公开的技术和方法的速度和可放大性用来设计、构建和操作用于生产供植入使用的工程化肝组织和/或器官或者用于生成基于细胞的工具(用于研究和开发，例如体外分析)的工业和/或商业设施。在进一步的实施方案中，工程化肝组织和/或器官及其阵列被生产、储存、分发、上市、宣传并销售，例如作为用于生物分析和高通量药物筛选的细胞阵列(例如微阵列或芯片)、组织阵列(例如微阵列或芯片)以及试剂盒。在其他实施方案中，工程化肝组织和/或器官及其阵列被制造并用来进行作为服务的生物分析和/或药物筛选。

工程化的肝组织

参照图1，天然肝组织由多种细胞类型组成，它们相对于彼此排列成独特的、空间图案的结构。每个肝小叶构成工作的肝脏功能性单元并大致是六边形的形状。实质细胞，或肝细胞，主要构成小叶，而在附属位置的多种非实质细胞(胆管细胞、窦内皮细胞、星形细胞和枯否细胞)围绕着小叶并在门静脉与胆管(沿小叶的周边)之间向中央静脉(在小叶的中心)发散。非实质细胞的定位和血液与胆汁分别沿窦和胆小管的流动一起作用，以形成对于肝细胞的合适的微环境，并因此影响那些细胞的功能和健康状态。多种病理学病况，如肝脏中的硬化或纤维化，导致关键代谢功能的丧失，这是由于肝细胞微环境遭到破坏并且由于细胞外基质的过度产生、炎症和致病细胞因子和生长因子的产生，肝脏结构进行性地被破坏。

生物打印使得能够从多种细胞输入三维地产生区室化肝组织，因此重现了天然组织结构和功能的关键要素。可以按照本文提供的实例产生分叶组织，其中实质和非实质细胞相对于彼此空间排列，从而在制造的每层组织内产生平面几何形状。随后可以添加如下的层：该层精确复制第一层的几何形状，或引入另外的特征如空隙空间或通道或另外的生物要素如肿瘤细胞或与病理学或修复/再生过程相关的其他生物或生化成分。除分叶图案外，人们利用附图可以意识到，可以产生复制组织内特定空间关系的生物打印的组织，该空间关系包括但不限于：血管/实质细胞；血管/肝细胞；肝细胞/胆管；纤维化组织/脉管系统；纤维化组织/肝细胞；肝细胞/免疫细胞；实质细胞/非实质细胞、肝窦/血液或血液替代物。在进一步的实施方案中，肝组织类似物包括：肝细胞或肝细胞样细胞和任选的胆管上皮细胞以及任选的非实质细胞类型，包括但不限于星形细胞、内皮细胞、枯否细胞、免疫细胞或肌成纤维细胞。

在某些实施方案中，本文中还公开了工程化肝组织，该组织包含凝聚的哺乳动物细胞，并进一步包含一层或多层哺乳动物细胞，其中该组织的至少一个部分是生物打印的。在某些实施方案中，一个或多个该组织层的特征在于平面几何图形，其中多种细胞类型或生物墨水类型和/或空隙空间存在于X-Y平面中的空间限定的位置中。在一些实施方案中，该组织是多层的，其中至少一个层在结构或组成上与其他层不同，赋予该组织特定的层状几何形状。在进一步的实施方案中，该层在Z平面中具有相似的厚度。在更进一步的实施方案中，该层在Z平面中具有可变的厚度。在进一步的实施方案中，任意的单层为一个细胞层的厚度。在一些实施方案中，该组织是肝类似物。在进一步的实施方案中，该肝组织类似物包含：肝细胞或肝细胞样细胞，和任选的胆管上皮细胞，和任选的非实质细胞类型，包括但不限于：星形细胞、内皮细胞、枯否细胞、免疫细胞或肌成纤维细胞。在一些实施方案中，所得的肝组织构建体在X、Y和Z平面中的厚度为至少约50微米。

在一些实施方案中，工程化肝组织/构建体是生物打印的，这是本文中描述的方法。在进一步的实施方案中，该工程化组织的至少一个部分是生物打印的。在更进一步的实施方案中，该组织的另外的部分是生物打印的。在一些实施方案中，如在本文中进一步描述的，在制造或者使用时，该组织不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，作为通过组织工程技术(包括生物打印)制造的结果，作为有机体的部分，本发明的组织进一步区别于在体内发育的组织。

在一些实施方案中，工程化肝组织包含任何类型的哺乳动物细胞。在各个进一步的实施方案中，工程化肝组织包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种或更多种细胞类型。在一些实施方案中，工程化肝组织的细胞是相互“凝聚的”或“粘附的”。在进一步的实施方案中，凝聚或粘附是指结合细胞、多细胞聚集体、多细胞体和/或其层的细胞-细胞粘附性质。

在一些实施方案中，工程化肝组织/构建体包括一个或多个细胞层。在进一步的实施方案中，该层中的一个或多个层的特征在于具有平面几何形状。在更进一步的实施方案中，该工程化组织的多个层具有平面几何形状；其中该平面几何形状在层间是可变的，或者是相同的。在更进一步的实施方案中，在制造过程中将单层中的平面几何形状(X-Y平面)在Z-平面中排列，以便在该复合组织的Z-平面中创建另外的几何形状。在一些实施方案中，该多层结构内的一个或多个层的特征还在于具有平面几何形状。

在一些实施方案中，细胞层包含一个或多个细胞片。在各个实施方案中，细胞片为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个细胞厚(包括其间的任何量)。在其他各个实施方案中，细胞片为约3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500μm厚或更厚(包括其间的任何量)。在一些实施方案中，组织层包含融合的细胞聚集体。在进一步的实施方案中，在融合之前，作为非限制性的实例，该细胞聚集体具有限定的形状和/或结构，为基本上球形的、细长的、基本上圆柱形的和类似带的形状。在各个实施方案中，融合的细胞聚集体形成大约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500μm厚或更厚(包括其间的任何量)的层。

在进一步的实施方案中，该一个或多个层包含任何类型的哺乳动物细胞。在各个进一步的实施方案中，每个层包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种或更多种细胞类型。在一些实施方案中，该工程化肝组织/构建体在一个或多个表面上包含一个或多个内皮细胞层。在其他实施方案中，该工程化肝组织/构建体在一个或多个表面上包含一个或多个上皮细胞层。

在各个实施方案中，该工程化肝组织为任意合适的尺寸。在一些实施方案中，生物打印的肝组织的尺寸随时间而改变。在进一步的实施方案中，由于例如细胞迁移、细胞死亡、细胞间的相互作用、压缩或其他形式的收缩，导致在生物打印后工程化肝组织收缩或缩小。在其他实施方案中，在生物打印后，由于例如细胞迁移、细胞生长和繁殖、天然组织的细胞外基质或其他产生细胞的部分的产生、细胞/组织的成熟或其他形式的扩展，导致在生物打印后工程化肝组织成长或扩展。

在一些实施方案中，该工程化肝组织的物理尺寸受到营养物质(包括氧)扩散到该构建体内部的能力的限制。在各个实施方案中，在生物打印时，该工程化肝组织/构建体在其最小维度上为至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000μm。在各个实施方案中，在生物打印时，该工程化肝组织在其最小维度上为至少约0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.5、4.75或5.0mm。在进一步的实施方案中，在生物打印时，该工程化肝组织/构建体在其最小维度上为约25μm至约500μm。

在各个实施方案中，该工程化肝组织为任意合适的形状。在一些实施方案中，选择形状以模拟特定的天然组织或器官。在进一步的实施方案中，选择形状以模拟特定的病理、病状或疾病状态。在一些实施方案中，该工程化肝组织具有基本上为平面的形状。在进一步的实施方案中，平面的组织具有任何适宜的平面几何形状，作为非限制性的示例，包括正方形、矩形、多边形、圆形、椭圆形或不规则形状。在一些实施方案中，在工程化肝组织中，通过特定细胞或生物墨水部分和/或空隙空间在X-Y平面中相对于彼此的定位，来形成平面的几何形状。

在一些实施方案中，通过适于在空间中相对于容纳容器固定该组织的位置的方式将该工程化肝组织/构建体固定在该容纳容器中。在一些实施方案中，该工程化肝组织由生物相容性材料限制，该生物相容性材料在一个或多个侧面上提供物理支撑并限制该工程化肝组织所占的空间。在进一步的实施方案中，该工程化肝组织被固定在表面上。在进一步的实施方案中，该工程化肝组织被固定在生物相容性表面上。在更进一步的实施方案中，如本文中描述的，通过固定在表面上和空间排布，将多个组织关联以形成阵列。在一些实施方案中，工程化肝组织在一个或多个侧面上经受由流体流动引起的剪切力。在进一步的实施方案中，施加的剪切力用来促进组织的成熟和发育和/或促进细胞外基质的迁移、分化、增殖、沉积；或者促进蛋白质或分子进入组织内的细胞或从组织内的细胞流出的转运。在其他实施方案中，该工程化肝组织在一个或多个表面上经历液体营养物的连续或周期性的灌注、再循环或搅动。在其他实施方案中，该工程化肝组织及其阵列被容纳于多孔生物反应器中，该生物反应器提供针对每个构建体的液体培养基的连续或周期性再循环。

组织几何形状

天然组织的特征在于：存在由组织的细胞和细胞外(即：空隙空间、细胞外基质、蛋白质物质等)组分驱动的空间和组成图案。部署合成支架以获得三维形状的组织工程化策略的固有挑战是：不能既复制天然组织的几何形状又复制生物属性。迄今为止，在支架结构内构建类似于天然组织的层状或平面几何形状、同时也允许在模拟天然组织的密度下引入细胞的尝试，被技术局限所妨碍。通过由细胞组成的生物墨水的空间限定沉积，根据在图18A-E中说明的实例，生物打印克服了这两个固有挑战(平面/层状几何形状和细胞密度)。在一些实施方案中，平面几何形状是从多生物墨水制剂创建的，由此以将每个组织部分/细胞群体/生物墨水制剂在X、Y和/或Z平面内相对于彼此受限的位置中放置的方法，来制造两个或更多个组织部分(即：间质的、上皮的、血管的、骨骼、软骨、实质的、皮层的、骨髓的、乳头状的、小叶的(lobular)等等)。在一些实施方案中，该平面几何形状引入空隙空间。在进一步的实施方案中，在平面几何形状中的空隙空间容纳模拟体液的至少一个部分的流体，例如血液、淋巴、胆汁、尿、分泌物等。在进一步的实施方案中，该空隙空间任选地含有非粘附细胞类型或体液衍生的部分(例如，血细胞、骨髓细胞、淋巴细胞、免疫细胞、癌细胞、血小板、蛋白质等等)。在更进一步的实施方案中，体液衍生部分的非粘附细胞类型任选地作为非空隙空间部分存在，该非空隙空间部分在制造之前、期间或之后已经被引入到该平面几何形状的包含细胞的部分中。在更进一步的实施方案中，非粘附细胞部分或体液衍生部分从空隙空间补充进入平面几何形状中包含细胞的空间中，作为细胞间相互作用或对分泌因素反应的结果。

在一些实施方案中，任选地通过在几何形状内部的空隙空间来启动流体流动或灌注。在一些实施方案中，平面几何形状允许产生组织-组织或组织-液体界面。在进一步的实施方案中，在容器中制造该组织，该容器是光学透明的，以允许实时观察在按几何形状创建的界面处的细胞。

在一些实施方案中，组织包含多个层，其中这些层中的至少一个在结构或组成上与该构建体中的其他层不同，从而在Z-平面中创建层状结构。层状结构的实例包括屏障组织，其拥有到底层间质组织的内皮或上皮屏障，如由在图18F中所示的实例中所描绘的。在一些实施方案中，组织的一个或多个层合并了血管或微血管部分。在进一步的实施方案中，血管或微血管部分的合并导致在该工程化组织的一个或多个部分中形成了微血管或假血管网。在一些实施方案中，具有层状几何形状的该组织的一个或多个部分是生物打印的。在一些实施方案中，彼此邻近地制造具有层状几何形状的一个或多个组织，从而产生组织界面。

在一些实施方案中，根据在图18G中阐明的非限制性实例，具有层状几何形状的多层工程化组织的一个或多个层也包括平面的几何形状。在一些实施方案中，在每个层中延续同样的平面几何形状，导致形成在X、Y和Z平面中具有连续结构的三维组织。在一些实施方案中，一个或多个层状层的组成或平面几何形状是变化的，使得所产生的三维组织在X、Y和Z平面中均具有复杂的结构。

参照图18A，在特定的实施方案中，制造了具有平面几何形状的工程化肝组织，该几何形状代表具有血管网的在结构上正确的组织。在此实施方案中，用包含实质细胞如肝细胞的第一生物墨水制造工程化肝组织。实质细胞的每个层任选地包含任何平面图案。在此实施方案中，用包含血管相关细胞如内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞以形成血管网的第二生物墨水制造工程化肝组织。任选地，此结构可以通过首先生物打印并建立血管网，然后第二步在该血管网周围制造肝组织而创建。

参照图18B，在特定的实施方案中，制造了具有平面几何形状的工程化肝组织，该几何形状代表组织带状连接。例如，这可以用于将肝腺泡的三个特定区域从门静脉周区域复制到中央小叶区域。

参照图18C，在特定的实施方案中，制造了具有平面几何形状的工程化肝组织，该几何形状代表分叶组织。在此实施方案中，用包含肝细胞以形成小叶的第一生物墨水制造工程化肝组织。每个几何小叶任选地在其边界内包含空间定向的结构。在此实施方案中，用包含基质/血管细胞以在小叶周围形成边部的第二生物墨水制造工程化肝组织。

参照图18D，在特定的实施方案中，制造了具有平面几何形状的工程化肝组织，该几何形状代表灌注的/排列的组织。在此实施方案中，第一组分形成通道、脉管或具有腔的管。在此实施方案中，第二组分形成组织补片，该补片任选地为相同大小/形状或不同大小/形状，任选地包含一种细胞类型或多种细胞类型，并且任选地包含通过在X、Y和/或Z平面中进行定向图案化而实现的一种或多种空间图案。

参照图18E，在特定的实施方案中，制造了具有平面几何形状的工程化肝组织，该几何形状代表固体+液体/液体组织界面。在此实施方案中，第一生物墨水形成内腔结构的外壁，在需要时第二生物墨水形成内腔结构的内壁，而第三组分任选地为含有细胞或其他生物学相关组分的流体。

参照图18F，在特定的实施方案中，制造了具有层状几何形状的工程化肝组织，该几何形状代表屏障组织。在此实施方案中，屏障层任选地为内皮细胞或上皮细胞并且间质层形成内腔组织的壁和/或表面，该组织坐落于多孔网或膜上。

参照图18G，在特定的实施方案中，制造了具有多个层的工程化肝组织，每个层具有平面几何形状并堆叠以形成具有层状几何形状的组织。在此实施方案中，X和Y轴的平面几何形状通过Z轴延续到制造的组织中。该几何形状的特征任选地包括连续的通道或细胞区室。

细胞

在一些实施方案中，本文公开了包含一种或多种类型的哺乳动物细胞的工程化肝组织(例如，肝类似物)。在进一步的实施方案中，该工程化肝组织包含肝细胞或肝细胞样细胞。在更进一步的实施方案中，适合的肝细胞或肝细胞样细胞包括但不限于初级肝细胞、细胞系如HepG2细胞、组织特异性祖细胞如HepaRG细胞或其组合。在进一步的实施方案中，该工程化肝组织包含胆管上皮细胞或胆管上皮样细胞。在进一步的实施方案中，该工程化肝组织包含非实质细胞。在更进一步的实施方案中，适合的非实质细胞包括但不限于血管细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞、脂肪细胞、脂肪形成细胞、间充质细胞、免疫细胞、枯否细胞、星形细胞、胆管上皮细胞、胆管上皮样细胞、窦内皮细胞、源自肝脏的干细胞/祖细胞、非源自肝脏的干细胞/祖细胞及其组合。

在一些实施方案中，任何哺乳动物细胞均适合包含在工程化肝组织及其阵列中。在进一步的实施方案中，该工程化肝组织的至少一个部分是粘附细胞类型。在进一步的实施方案中，仅举非限制性的实例而言，该哺乳动物细胞是肝细胞、实质细胞、非实质细胞、收缩性或肌细胞(例如，平滑肌细胞和成肌细胞)、结缔组织细胞(例如，成纤维细胞)、骨髓细胞、内皮细胞、上皮细胞、血管细胞、血细胞、淋巴细胞、周细胞、间皮细胞、基质细胞、未分化细胞(例如，胚细胞、干细胞和祖细胞)、源自内胚层的细胞、源自中胚层的细胞、源自外胚层的细胞及其组合。

在一些实施方案中，该工程化肝组织包含内皮细胞，诸如人内皮细胞。在一些实施方案中，适合的内皮细胞来源于组织，仅举非限制性实例而言，该组织包括肝组织、血液、血管、淋巴管、消化道组织、泌尿生殖道组织、脂肪组织、呼吸道组织、生殖系统组织、骨髓和脐带组织。

在一些实施方案中，该细胞是成体的、分化的细胞。在进一步的实施方案中，“分化的细胞”是在分离时具有与例如肝细胞或内皮细胞一致的组织特异性表型的细胞，其中从分离时到使用时都保持着组织特异性表型(或显示该表型的潜能)。在其他实施方案中，该细胞是成体的、未分化的细胞。在进一步的实施方案中，“未分化的细胞”是不具有或已经丧失明确组织特异性性状的细胞。在一些实施方案中，未分化的细胞包括干细胞。在进一步的实施方案中，“干细胞”是表现出潜能和自我更新的细胞。干细胞包括但不限于：全能干细胞、多能干细胞、多潜能细胞、寡能细胞、单能细胞和祖细胞。在各个实施方案中，干细胞是胚胎干细胞、成体干细胞、羊膜干细胞和诱导性多能干细胞。在另外其他的实施方案中，该细胞是成体的分化细胞与成体的未分化细胞的混合物。

在一些实施方案中，该工程化肝组织包含来源于多能干细胞/祖细胞的实质细胞。在各个实施方案中，该实质细胞源适当地来源于胎儿哺乳动物肝组织；胚胎干细胞(ESC)；诱导多能干细胞(iPSC)；源自肝脏的成体干细胞/祖细胞；和源自非肝脏的组织的成体干细胞/祖细胞。在一些实施方案中，工程化肝组织来源于在制造肝组织构建体中使用前已经部分或完全分化成为内胚层或肝表型的多能干细胞/祖细胞。

在一些实施方案中，该构建体包含已经暴露于一种或多种分化信号的干细胞/祖细胞。在进一步的实施方案中，该分化信号包括以下一种或多种：生物力学信号、可解析的/可溶解的信号(例如，生物化学信号)和物理信号。在工程化肝组织制造过程中的许多时间点，干细胞/祖细胞适当地暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，该干细胞/祖细胞在构建体制造之前暴露于一种或多种分化信号。在其他实施方案中，该干细胞/祖细胞在构建体制造期间暴露于一种或多种分化信号。在另外其他的实施方案中，该干细胞/祖细胞在构建体制造之后暴露于一种或多种分化信号。

在各个实施方案中，基于特定的研究目的或目标来选择、配置、处理或调整细胞的细胞类型和/或来源。在一些实施方案中，选择、配置、处理或调整一种或多种特定的细胞类型，以促进对特定疾病或状况的研究。在一些实施方案中，选择、配置、处理或调整一种或多种特定的细胞类型，以促进对特定受试者的疾病或状况的研究。在一些实施方案中，一种或多种特定的细胞类型来源于两个或更多个不同的人类供体。在一些实施方案中，一种或多种特定的细胞类型来源于特定的脊椎动物受试者。在进一步的实施方案中，一种或多种特定的细胞类型来源于特定的哺乳动物受试者。在更进一步的实施方案中，一种或多种特定的细胞类型来源于特定的人类受试者。在进一步的实施方案中，一种或多种特定的细胞类型来源于具有与疾病或组织功能有关的特定表型的特定受试者。在更进一步的实施方案中，受试者特异性的细胞通过活检或组织采样的方式，从所关注的目标组织中分离出来。在进一步的实施方案中，受试者特异性的细胞在分离之后立即用来制造组织。在其他实施方案中，在用于制造三维组织之前，将受试者特异性的细胞在体外操作；其中该操作包括如下的一种或多种：扩充、分化、定向分化、增殖、暴露于蛋白质或核酸、引入遗传载体、引入遗传或非遗传的细胞示踪部分、去分化(即：生成诱导多能干细胞或等效物)、冷冻保存。在一些实施方案中，从不同于目标组织的组织来分离受试者特异性的细胞。在进一步的实施方案中，该受试者特异性的细胞需要在目标组织内部分化成所关注的细胞类型。在更进一步的实施方案中，需要分化的受试者特异性的细胞在制造成三维结构之前、期间或之后分化。

培养细胞的方法

在本发明的工程化肝组织中使用的细胞类型以本领域已知的任何方式适当地培养。细胞和组织培养方法是本领域已知的，并且例如描述在Freshney,R.,CultureofAnimalCells:AManualofBasicTechniques,Wiley(1987)中，为了这些信息通过引用将其内容并入本文。在Doyle,A.,Griffiths,J.B.,Newell,D.G.,(编)CellandTissueCulture:LaboratoryProcedures,Wiley(1998)中也描述了适合与本发明一起使用的普通哺乳动物细胞培养技术、细胞系和细胞培养系统，为了这些信息通过引用将其内容并入本文。

适合于培养中的哺乳动物细胞的生长条件是本领域公知的。细胞培养基通常包括必需营养物和任选的附加成分，例如生长因子、盐、矿物质、维生素、富含血小板的血浆等，它们是任选地根据所培养的细胞类型而选择的。在一些实施方案中，选择特定的成分来增强细胞生长、分化和特异性蛋白质的分泌等。通常，标准的生长培养基包括含有4g/L葡萄糖的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)，补充有1-20％胎牛血清(FBS)、小牛血清或人血清、胰岛素(4微克/mL)、地塞米松(1.0微摩尔)、两性霉素B(0.25微克/mL)以及Glutamax(1x)。补充有胰岛素(1g/L)、亚硒酸钠(0.0067g/L)、转铁蛋白(0.55g/L)、地塞米松(1.0微摩尔)、青霉素(100U/mL)、链霉素(0.1mg/mL)、两性霉素B(0.25微克/mL)以及Glutamax(1x)的WilliamsE培养基，或本领域公知的各种其他培养基。优选地，细胞在无菌条件下、在1-21％O₂和优选3-5％CO₂的气氛中、在接近或达到细胞来源动物体温的温度下培养。例如，人类细胞优选在约37℃下培养。

细胞任选地与细胞分化剂一起培养，以诱导细胞沿着期望的路线分化。例如，细胞任选地与生长因子、细胞因子等一起培养。在一些实施方案中，术语“生长因子”指蛋白质、多肽或多肽的复合物，包括细胞因子，它们是由细胞产生的，并且影响其自身和/或多种相邻的或远处的其他细胞。一般而言，生长因子或者发育性地或者响应于众多生理学或环境刺激影响特定类型的细胞的生长和/或分化。一些但不是全部生长因子是激素。示例性的生长因子是胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、成纤维细胞生长因子(FGFs，包括碱性FGF(bFGF))、血小板衍生生长因子(PDGFs，包括PDGF-AA和PDGF-AB)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β，包括TGFβ1和TGFβ3)、表皮生长因子(EGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-8等。除了其他地方外，在MolecularCellBiology,ScientificAmericanBooks,Darnell等人编,1986；PrinciplesofTissueEngineering,第二版,Lanza等人编,AcademicPress,2000中讨论了生长因子。本领域技术人员将会理解：在本文描述的条件培养基中的任何及所有培养物衍生的生长因子都在本发明的范围内。

生物墨水和多细胞聚集体

在某些实施方案中，本文中公开了包含生物打印的细胞的三维活组织(包括肝组织/构建体)、其阵列和方法。在一些实施方案中，通过从生物打印机沉积或挤出生物墨水来生物打印细胞。在一些实施方案中，“生物墨水”包括包含多个细胞的液体、半固体或固体组合物。在一些实施方案中，生物墨水包含液体或半固体的细胞溶液、细胞悬浮液或细胞浓缩物。在进一步的实施方案中，细胞溶液、悬浮液或浓缩物包含液体或半固体(例如粘性的)载体和多个细胞。在更进一步的实施方案中，该载体是合适的细胞营养培养基，例如本文中描述的那些。在一些实施方案中，在生物打印之前，生物墨水包含多个细胞，这些细胞任选地凝聚成多细胞聚集体。在进一步的实施方案中，生物墨水包含多个细胞，并被生物打印以产生特定的平面和/或层状几何形状；其中在生物打印之前、期间和/或之后，生物墨水中的个体细胞发生凝聚。在一些实施方案中，该生物墨水是通过如下方法产生的：1)在固定的体积中收集多个细胞；其中细胞组分占总体积的至少约30％且至多100％。在一些实施方案中，生物墨水包含半固体或固体的多细胞聚集体或多细胞体。在进一步的实施方案中，通过如下步骤产生生物墨水：1)以预先确定的比例，将多个细胞或细胞聚集体与生物相容性液体或凝胶混合，以形成生物墨水；和2)使该生物墨水致密化，以产生具有期望的细胞密度和粘度的生物墨水。在一些实施方案中，通过离心作用、切向流过滤(“TFF”)或其组合来实现生物墨水的致密化。在一些实施方案中，生物墨水的致密化产生了可挤出的组合物，从而允许形成多细胞聚集体或多细胞体。在一些实施方案中，“可挤出的”是指能够通过被迫(例如在压力下)穿过喷嘴或孔口(例如，一个或多个洞或管)而成形。在一些实施方案中，生物墨水的致密化是由细胞生长到合适的密度而引起的。该生物墨水所需的细胞密度会随着所使用的细胞和要产生的组织或器官而改变。在一些实施方案中，该生物墨水的细胞是凝聚和/或粘附的。在一些实施方案中，“凝聚(cohere)”、“凝聚的(cohered)”和“凝聚(cohesion)”指将细胞、多细胞聚集体、多细胞体和/或它们的层结合起来的细胞-细胞粘附性质。在一些实施方案中，该术语可以与“融合(fuse)”、“融合的(fused)”和“融合(fusion)”互换使用。在一些实施方案中，该生物墨水另外包含支持材料、细胞培养基(或其补充物)、细胞外基质(或其组分)、细胞粘着剂、细胞死亡抑制剂、抗凋亡剂、抗氧化剂、挤出化合物和它们的组合。

在各个实施方案中，该细胞是任何合适的细胞。在进一步的各个实施方案中，该细胞是脊椎动物细胞、哺乳动物细胞、人类细胞或它们的组合。在一些实施方案中，在本文公开的方法中使用的细胞类型取决于要产生的构建体或组织的类型。在一些实施方案中，该生物墨水包含一种类型的细胞(也被称为“均质”或“单型”生物墨水)。在一些实施方案中，该生物墨水包含超过一种类型的细胞(也被称为“异质”或“多型”生物墨水)。

细胞培养基

在一些实施方案中，该生物墨水包含细胞培养基。该细胞培养基是任何合适的培养基。在各个实施方案中，作为非限制性的实例，合适的细胞培养基包括：Dulbecco磷酸盐缓冲盐水、Earle平衡盐、Hanks平衡盐、Tyrode盐、Alsever溶液、Gey平衡盐溶液、Kreb's-Henseleit改良缓冲系、Kreb's-Ringer碳酸氢盐缓冲系、Puck盐水、Dulbecco改良Eagle培养基、Dulbecco改良Eagle培养基/营养F-12Ham、营养混合物F-10Ham(Ham'sF-10)、培养基199、基本必需培养基Eagle、RPMI-1640培养基、Ames培养基、BGJb培养基(Fitton-Jackson改良)、Click培养基、CMRL-1066培养基、Fischer培养基、Glascow基本必需培养基(GMEM)、Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)、L-15培养基(Leibovitz)、McCoy5A改良培养基、NCTC培养基、SwimS-77培养基、Waymouth培养基、William培养基E或它们的组合。在一些实施方案中，该细胞培养基得到改良或补充。在一些实施方案中，该细胞培养基进一步包含白蛋白、硒、转铁蛋白、胎球蛋白、糖、氨基酸、维生素、生长因子、细胞因子、激素、抗生素、脂质、脂质载体、环糊精、富血小板血浆或它们的组合。

细胞外基质

在一些实施方案中，该生物墨水进一步包含细胞外基质或其衍生物的一种或多种组分。在一些实施方案中，“细胞外基质”包括由细胞产生并从细胞中转运到细胞外隙内的蛋白质，在细胞外隙中它们作为支持体将组织保持在一起、提供拉伸强度和/或促进细胞信号传导。细胞外基质组分的实例包括但不限于：胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、透明质酸盐、弹性蛋白和蛋白聚糖。例如，在一些实施方案中，该多细胞聚集体含有多种ECM蛋白质(例如，明胶、纤维蛋白原、纤维蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白和蛋白聚糖)。任选地将ECM组分或ECM组分的衍生物加入到用于形成多细胞聚集体的细胞浆料中。加入到细胞浆料中的ECM组分或ECM组分的衍生物任选地从人类或动物源纯化，或者通过本领域已知的重组方法产生。或者，该ECM组分或ECM组分的衍生物是由细长细胞体内的细胞自然分泌的，或者用于形成该细长细胞体的细胞任选地通过任何本领域已知的合适方法进行遗传操作，以改变一种或多种ECM组分或ECM组分的衍生物和/或一种或多种细胞粘附分子或细胞-基底粘附分子(例如，选择素、整合素、免疫球蛋白和粘附素)的表达水平。在一些实施方案中，ECM组分或ECM组分的衍生物促进细胞在多细胞聚集体中的凝聚。例如，将明胶和/或纤维蛋白原适当地加入到细胞浆料中，该浆料用于形成多细胞聚集体。通过加入凝血酶将纤维蛋白原转变为纤维蛋白。

在一些实施方案中，该生物墨水进一步包含促进细胞粘附的试剂。

在一些实施方案中，该生物墨水进一步包含抑制细胞死亡(例如，坏死、凋亡或自体吞噬)的试剂。在一些实施方案中，该生物墨水进一步包含抗凋亡剂。抑制细胞死亡的试剂包括但不限于：小分子、抗体、肽、肽体或它们的组合。在一些实施方案中，抑制细胞死亡的试剂选自：抗-TNF试剂、抑制白细胞介素活性的试剂、抑制干扰素活性的试剂、抑制GCSF(粒细胞集落刺激因子)活性的试剂、抑制巨噬细胞炎性蛋白活性的试剂、抑制TGF-B(转化生长因子B)活性的试剂(例如，参见图15和16)、抑制MMP(基质金属蛋白酶)活性的试剂、抑制胱天蛋白酶活性的试剂、抑制MAPK/JNK信号级联活性的试剂、抑制Src激酶活性的试剂、抑制JAK(Janus激酶)活性的试剂或它们的组合。在一些实施方案中，该生物墨水包含抗氧化剂。在一些实施方案中，该生物墨水包含氧携带者或其他的细胞特异性营养物。

挤出化合物

在一些实施方案中，该生物墨水进一步包含挤出化合物(即，改变生物墨水的挤出性质的化合物)。挤出化合物的实例包括但不限于：凝胶、水凝胶、肽水凝胶、基于氨基酸的凝胶、表面活性剂多元醇(例如PluronicF-127或PF-127)、热响应性聚合物、透明质酸盐、藻酸盐、细胞外基质组分(及其衍生物)、胶原、明胶、其他生物相容性天然或合成聚合物、纳米纤维和自组装的纳米纤维。在一些实施方案中，在生物打印之后，通过物理、化学或酶的方式将挤出化合物除去。

已经以各种方式定义了凝胶，有时被称作胶状物。例如，《美国药典》将凝胶定义为由小无机粒子组成的悬浮液或被液体互相渗透的大有机分子构成的半固体体系。凝胶包括单相或两相体系。单相凝胶由均匀分布在整个液体中的有机大分子组成，其分布方式使得在分散的大分子和液体之间不存在明显的边界。某些单相凝胶是由合成大分子(例如卡波姆)或由天然树胶(例如西黄蓍胶)制备的。在一些实施方案中，单相凝胶通常是水性的，但是也可以利用醇和油来制备。两相凝胶由小离散微粒的网络组成。

在某些情况下，凝胶被分类为亲水的或疏水的。在某些实施方案中，疏水凝胶的基质由液体石蜡与聚乙烯，或用胶态二氧化硅，或铝或锌皂胶凝的脂肪油组成。相反，亲水凝胶的基质一般由用合适的胶凝剂(例如，西黄蓍胶、淀粉、纤维素衍生物、羧乙烯基聚合物和硅酸镁铝)胶凝的水、甘油或丙二醇组成。在某些实施方案中，本文中公开的组合物或装置的流变学是假塑性、塑性、触变性或膨胀性的。

适宜的水凝胶包括衍生自胶原、透明质酸盐、透明质酸、纤维蛋白、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖及其组合的水凝胶。在其他实施方案中，适宜的水凝胶是合成聚合物。在进一步的实施方案中，适宜的水凝胶包括衍生自聚(丙烯酸)或其衍生物、聚(环氧乙烷)及其共聚物、聚(乙烯醇)、聚磷腈及其组合的水凝胶。在各个具体实施方案中，限制材料选自：水凝胶、NovoGel^TM、琼脂糖、藻酸盐、明胶、Matrigel^TM、透明质酸、泊洛沙姆、肽水凝胶、聚(异丙基正聚丙烯酰胺)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)、甲基丙烯酸羟乙酯、聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酰胺、聚(乳酸)、硅、丝或它们的组合。

在一些实施方案中，基于水凝胶的挤出化合物是热可逆凝胶(也称为热响应性凝胶或热凝胶)。在一些实施方案中，合适的热可逆水凝胶在室温下不是液体。在具体实施方案中，合适的水凝胶的胶凝温度(Tgel)为约10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃，包括其间的任何量。在某些实施方案中，合适的水凝胶的Tgel为约10℃至约40℃。在进一步的实施方案中，合适的水凝胶的Tgel为约20℃至约30℃。在一些实施方案中，本文所述的生物墨水(例如，包含水凝胶、一种或多种细胞类型和其他添加剂等)在室温下不是液体。在一些实施方案中，合适的热可逆水凝胶在哺乳动物的体温下不是液体。在具体的实施方案中，合适的水凝胶的胶凝温度(Tgel)为约22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、41℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃，包括其间的任何量。在某些实施方案中，合适的水凝胶的Tgel为约22℃至约52℃。在进一步的实施方案中，合适的水凝胶的Tgel为约32℃至约42℃。在一些实施方案中，本文所述的生物墨水(例如，包含水凝胶、一种或多种细胞类型和其他添加剂等)在哺乳动物的体温下不是液体。在具体的实施方案中，本文所述的生物墨水的胶凝温度(Tgel)为约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃，包括其间的任何量。在具体实施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是约10℃至约15℃。在另一具体实施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是约15℃至约20℃。在另一具体实施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是约20℃至约25℃。在另一具体实施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是约25℃至约30℃。在另一具体实施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是约30℃至约35℃。在另一具体实施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是约35℃至约40℃。在另一具体实施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是约40℃至约45℃。在另一具体实施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是约45℃至约50℃。

当并入水溶液中时，由聚氧化丙烯和聚氧化乙烯组成的聚合物形成热可逆的凝胶。在生物打印机装置中可以保持的温度下，这些聚合物具有从液态变为凝胶态的能力。该液态至凝胶态的相变取决于聚合物的浓度和溶液中的成分。

泊洛沙姆407(PluronicF-127或PF-127或Lutrol)是由聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物组成的非离子表面活性剂。其他泊洛沙姆包括188(F-68级)、237(F-87级)、338(F-108级)。泊洛沙姆的水溶液在酸、碱和金属离子的存在下是稳定的。PF-127是通式E106P70E106的可商购的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯三嵌段共聚物，具有13000的平均摩尔质量。该聚合物任选地采用增强聚合物的胶凝性质的合适的方法进一步纯化。它含有大约70％的氧化乙烯，这解释了它的亲水性。它是泊洛沙姆ABA嵌段共聚物系列中的一种。PF-127具有良好的增溶能力、低毒性，因此被认为是合适的挤出化合物。

在一些实施方案中，通过任何所述的手段来测量本文中提出的水凝胶和生物墨水的粘度。例如，在一些实施方案中，采用LVDV-II+CPConePlate粘度计和ConeSpindleCPE-40来计算水凝胶和生物墨水的粘度。在其他实施方案中，采用Brookfield(轴和杯)粘度计来计算水凝胶和生物墨水的粘度。在一些实施方案中，本文中中提及的粘度范围是在室温下测量的。在其他实施方案中，本文中提及的粘度范围是在体温下(例如，在健康人的平均体温下)测量的。

在进一步的实施方案中，该水凝胶和/或生物墨水的特征在于具有约500至1,000,000厘泊、约750至1,000,000厘泊、约1000至1,000,000厘泊、约1000至400,000厘泊、约2000至100,000厘泊、约3000至50,000厘泊、约4000至25,000厘泊、约5000至20,000厘泊或约6000至15,000厘泊的粘度。

在一些实施方案中，该生物墨水包含细胞和适合于连续生物打印的挤出化合物。在具体实施方案中，该生物墨水具有约1500mPa·s的粘度。在一些实施方案中，PluronicF-127和细胞材料的混合物适合于连续生物打印。这样的生物墨水适当地通过以下步骤制备：通过在冷(4℃)磷酸盐缓冲盐水(PBS)中连续混合48小时溶解PluronicF-127粉末至30％(w/v)。PluronicF-127也适当地溶解在水中。在一些实施方案中，采用标准无菌细胞培养技术将细胞培养和扩充。在进一步的实施方案中，例如将该细胞在200g下沉淀，并重悬浮在30％PluronicF-127中，并抽吸到附于生物打印机上的储库中，在一些实施方案中，这使之在约10℃至约25℃的胶凝温度下固化。在生物打印之前生物墨水的胶凝是任选的。生物墨水，包括包含PluronicF-127的生物墨水，任选地作为液体分配。

在各个实施方案中，PluronicF-127的浓度是具有合适的粘度和/或细胞毒性的任意值。在一些实施方案中，PluronicF-127的合适的浓度能够在生物打印时支撑重量同时保持其形状。在一些实施方案中，PluronicF-127的浓度为约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％。在一些实施方案中，PluronicF-127的浓度为约30％至约40％，或者约30％至约35％。

在一些实施方案中，在挤出化合物或赋形剂中明胶的浓度为6％并且藻酸盐的浓度为0.5％。在其他实施方案中，在挤出化合物或赋形剂中明胶的浓度为4％并且藻酸盐的浓度为2％。

在一些实施方案中，在使用之前除去生物墨水的非细胞组分(例如，挤出化合物等)。在进一步的实施方案中，非细胞组分例如是：水凝胶、肽水凝胶、基于氨基酸的凝胶、表面活性剂多元醇、热响应性聚合物、透明质酸盐、藻酸盐、胶原或其他生物相容性天然或合成聚合物。在更进一步的实施方案中，通过物理、化学或酶手段除去非细胞组分。在一些实施方案中，在使用时，一部分非细胞组分仍与细胞组分相关联。

在一些实施方案中，预处理细胞，以增加细胞相互作用。例如，为了在生物墨水成形之前增强细胞-细胞相互作用，适当地在离心之后在离心管内培养细胞。

示例性的细胞比例

在一些实施方案中，生物墨水包含多细胞体，该多细胞体进一步包含非实质肝细胞(例如，内皮细胞、肝星形细胞、枯否细胞)。在进一步的实施方案中，内皮细胞比肝星形细胞比枯否细胞的比例为任何合适的比例。在进一步的实施方案中，内皮细胞比肝星形细胞比枯否细胞的比例为约90:10:0至约10:90:0。在更进一步的实施方案中，内皮细胞比肝星形细胞比枯否细胞的比例为45:45:10。

在一些实施方案中，生物墨水包含多细胞体，该多细胞体进一步以100:0的比例包含肝细胞(例如，原代肝细胞、HepG2或HepaRG)和另外的细胞类型。在进一步的实施方案中，肝细胞与另外的非实质细胞类型(例如，内皮细胞)的比例为95:5。在进一步的实施方案中，干细胞与另外的非实质细胞类型(例如，内皮细胞、星形细胞)的比例为50:50。在更进一步的实施方案中，实质细胞与非实质细胞(例如，内皮细胞、星形细胞、枯否细胞)的比例为50:35:10:5。

细胞的自分选(self-sorting)

在一些实施方案中，用于形成构建体或组织的多细胞聚集体包含将要包括在工程化组织中的所有细胞类型(例如，肝细胞、内皮细胞、肝星形细胞和枯否细胞)；在这样的实例中，每个细胞类型迁移到合适的位置(例如，在成熟期间)，以形成工程化组织，如工程化肝组织。在其他实施方案中，用于形成结构的多细胞聚集体包括比将要包括在工程化组织中的所有细胞类型要少的细胞类型。在一些实施方案中，每个类型的细胞均匀分布在多细胞聚集体中，或组织的区域或层中。在其他实施方案中，每个类型的细胞定位在多细胞聚集体内的特定区域或组织的区域或层中。

例如，在以合适的比例(例如，70:15:10:5)包含肝细胞、内皮细胞、肝星形细胞和枯否细胞的工程化肝组织的情况下，相邻的、生物打印的凝聚多型生物墨水单元融合在一起。在成熟期间，内皮细胞在某种程度上定位在构建体的外围和中心，并组织成为微血管结构。在一些实施方案中，细胞类型在构建体内的定位模拟了体内或离体哺乳动物组织的分层结构。

预形成的支架

在一些实施方案中，本文公开了工程化的可植入组织和器官，其不含或基本不含任何预形成的支架。在进一步的实施方案中，“支架”是指合成的支架，例如聚合物支架和多孔水凝胶；非合成的支架，例如预形成的细胞外基质层、死细胞层和脱细胞的组织；以及任何其他类型的预形成支架，它对于工程化组织和/或器官的物理结构而言是必要的，并且不从该组织和/或器官除去。在进一步的实施方案中，脱细胞的组织支架包括脱细胞的天然组织或以任意方式由培养的细胞产生的脱细胞的细胞材料；例如，使之死亡或者脱细胞而留下它们在活着时产生的ECM的细胞层。

在一些实施方案中，该工程化的肝组织/构建体及其阵列，不利用任何预形成的支架，例如，来形成该组织、该组织的任何层或者形成该组织的形状。作为非限制性的实例，在制造时或使用时，本发明的工程化肝组织不利用任何预形成的合成支架(例如聚合支架)、预形成的细胞外基质层或任何其他类型的预形成支架。在一些实施方案中，该工程化的肝组织基本不含任何预形成的支架。在进一步的实施方案中，该组织的细胞组分含有可检测到的但是痕量或微量的支架，例如，小于总组合物的2.0％、小于1.0％或小于0.5％的支架。在更进一步的实施方案中，痕量或微量的支架不足以影响该组织或其阵列的长期行为或者妨碍其主要生物功能。在另外的实施方案中，在打印之后，通过物理、化学或酶方法除去支架组分，从而产生不含或基本不含支架组分的工程化组织。

在一些实施方案中，本文公开的不含或基本不含预形成支架的工程化肝组织，与用某些其他组织工程方法开发的那些形成鲜明对比，后者中首先形成支架材料，然后将细胞接种到支架上，随后细胞增殖，以填充并呈现支架的形状。在一个方面，本文中描述的生物打印方法允许产生活的且有用的组织，其不含或基本不含预形成的支架。在另一方面，在一些实施方案中，利用限制材料将本发明的细胞保持在期望的三维形状中。该限制材料至少在以下事实上与支架是不同的：限制材料是暂时的和/或可以从细胞和/或组织除去。

阵列

在一些实施方案中，本文中公开了工程化肝组织/构建体的阵列。在一些实施方案中，“阵列”意指包括多个元件的关联的科学工具，其中多个元件被空间排列以允许在一个样品上进行多个试验、在多个样品上进行一个或多个试验或两者。在一些实施方案中，该阵列适于筛选方法和装置，或者与筛选方法和装置(包括与中或高通量筛选有关的那些)相容。在进一步的实施方案中，阵列允许同时进行多个试验。在进一步的实施方案中，阵列允许同时测试多个样品。在一些实施方案中，该阵列为细胞的微阵列。在进一步的实施方案中，细胞的微阵列为允许对固体支持体表面上的活细胞多路讯问(multiplexinterrogation)的实验室工具。在其他的实施方案中，该阵列为组织微阵列。在进一步的实施方案中，组织微阵列包括组装成一个阵列的多个分离的组织或组织样品，以允许进行多个生物化学的、代谢的、分子的或组织学的分析。

在一些实施方案中，该工程化肝组织/构建体各自存在于生物相容性多孔容器的孔中(例如，参见图16)。在一些实施方案中，每个组织被放入孔中。在其他的实施方案中，每个组织被生物打印入孔中。在进一步的实施方案中，该孔被包被。在各个进一步的实施方案中，该孔用如下物质中的一种或多种包被：生物相容性水凝胶、一种或多种蛋白质、一种或多种化学品、一种或多种肽、一种或多种抗体和一种或多种生长因子，包括它们的组合。在一些实施方案中，该孔用NovoGel^TM包被。在其他的实施方案中，该孔用琼脂糖包被。在一些实施方案中，每个组织存在于生物相容性多孔容器的孔内的多孔生物相容性膜上。在一些实施方案中，多孔容器的每个孔含有两个或更多个组织。

在一些实施方案中，工程化肝组织/构建体被固定在生物相容性表面的一个或多个侧面上。许多方法适于将组织固定到生物相容性表面。在各个实施方案中，组织被适当地固定在生物相容性表面，例如，沿着一个或多个整体侧面、只在一个或多个侧面的边缘或只在一个或多个侧面的中心。在各个进一步的实施方案中，将组织适当地固定在具有(整合到表面中的或者与表面相关联的)支持物或载体的生物相容性表面。在各个进一步的实施方案中，将组织适当地固定在具有(整合到表面中的或者与表面相关联的)一个或多个夹持夹或塑料补片的生物相容性表面。在一些实施方案中，通过细胞到多孔膜的附着，将组织适当地固定在生物相容性表面。在一些实施方案中，通过固定在生物相容性表面的一个或多个侧面上，将工程化肝组织/构建体保持在阵列结构中。在进一步的实施方案中，该组织在1、2、3、4或更多个侧面上被附着到生物相容性表面。在一些实施方案中，该生物相容性表面为任何对该组织或与该组织接触的有机体不产生显著伤害或毒性风险的表面。在进一步的实施方案中，该生物相容性表面为任何适合于传统组织培养方法的表面。作为非限制性的实例，合适的生物相容性表面包括：已处理的塑料、膜、多孔膜、涂覆的膜、涂覆的塑料、金属、涂覆的金属、玻璃、已处理的玻璃和涂覆的玻璃，其中合适的涂层包括水凝胶、ECM组分、化学品、蛋白质等，并且涂覆或处理提供了刺激或防止细胞和组织粘附到该生物相容性表面的手段。

在一些实施方案中，将工程化组织固定到生物相容性表面的一个或多个侧面上，有利于使该组织经受由流体流动引起的剪切力。在进一步的实施方案中，该工程化肝组织/构建体经受由流体流动引起的剪切力。在各个实施方案中，该工程化肝组织在1、2、3、4或更多个侧面上经受剪切力。在进一步的实施方案中，该工程化肝组织/构建体经历与一个或多个暴露表面上的组织接触的液体营养物的再循环、灌注或搅动。

在一些实施方案中，工程化组织(包括肝组织/构建体)的阵列包括两种或多种元件的结合。在各个实施方案中，该阵列包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500种元件(包括其间的任何量)的结合。在进一步的实施方案中，每个元件包括一个或多个细胞、多细胞聚集体、组织、器官或它们的组合。

在一些实施方案中，工程化组织(包括肝组织/构建体)的阵列包括以预先确定的图案空间排列的多个元件。在进一步的实施方案中，该图案为元件的任何合适的空间排列。在各个实施方案中，作为非限制性的实例，布置的图案包括二维网格、三维网格、一个或多个线、弧或圆、一系列的行或列等等。在进一步的实施方案中，选择该图案，以与中或高通量生物学分析或筛选方法或装置具有相容性。

在各个实施方案中，基于特定的研究目的或目标，选择用于制造在阵列中的一个或多个组织的细胞的细胞类型和/或来源。在进一步的各个实施方案中，基于特定的研究目的或目标，选择阵列中的特定组织。在一些实施方案中，在阵列中包括一种或多种特定的工程化肝组织，以促进特定疾病或状况的研究。在一些实施方案中，在阵列中包括一种或多种特定的工程化肝组织，以促进对特定受试者的疾病或状况的研究。在进一步的实施方案中，用来源于两个或更多个不同人类供体的一种或多种细胞类型来产生该阵列中的一种或多种特定的工程化肝组织。在一些实施方案中，阵列中的每个组织在细胞类型、细胞来源、细胞层、细胞比例、构建方法、尺寸、形状等方面是基本相似的。在其他的实施方案中，阵列中的一种或多种组织在细胞类型、细胞来源、细胞层、细胞比例、构建方法、尺寸、形状等方面是独特的。在各个实施方案中，阵列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300或更多个(包括其间的任何量)组织是独特的。在其他各个实施方案中，阵列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(包括其间的任何量)的组织是独特的。

在一些实施方案中，阵列中的每个组织被独立地培养维持。在进一步的实施方案中，阵列中每个组织的培养条件为使得它们与其他组织分离，并且不能交换培养基或溶解于培养基中的因子。在其他实施方案中，该阵列中的两个或更多个个体组织交换可溶性因子。在进一步的实施方案中，阵列中的两个或更多个个体组织的培养条件为使得它们与其他组织交换培养基或溶解于培养基中的因子。在各个实施方案中，阵列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300或更多个(包括其间的任何量)组织，交换培养基和/或可溶性因子。在其他各个实施方案中，阵列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(包括其间的任何量)的组织，交换培养基和/或可溶性因子。

体外分析

在一些实施方案中，本文中公开的工程化肝组织和及阵列用于体外分析。在一些实施方案中，“分析”是指测试或测量物质(例如化学品、分子、生物化学品、药物等)在有机或生物样品(例如细胞聚集体、组织、器官、有机体等)中的存在或活性的过程。在进一步的实施方案中，分析包括定性分析和定量分析。在更进一步的实施方案中，定量分析测量样品中物质的量。

在各个实施方案中，作为非限制性的实例，该工程化肝组织和阵列用于基于图像的分析、分泌的蛋白质的测量、标记物的表达和蛋白质的生产。在各个进一步的实施方案中，该工程化肝组织和阵列用于分析以检测或测量如下的一种或多种：分子结合(包括放射性配体结合)、分子吸收、活性(例如，酶活性和受体活性等)、基因表达、蛋白质表达、受体激动作用、受体拮抗、细胞信号传导、细胞凋亡、化学敏感性、转染、细胞迁移、趋化性、细胞活力、细胞增殖、安全性、有效性、代谢、毒性、传染性和滥用倾向。

在一些实施方案中，工程化肝组织和阵列用于免疫测定中。在进一步的实施方案中，免疫测定是竞争性的免疫测定或非竞争性的免疫测定。在竞争性的免疫测定中，例如样品中的抗原与和抗体结合的标记抗原竞争，随后测量结合到抗体位点的标记抗原的数量。在非竞争性的免疫测定(也称作"夹心法分析")中，例如将样品中的抗原结合到抗体位点；接着，将标记抗体结合到该抗原，并且随后测量在该位点上的标记抗体的数量。

在一些实施方案中，工程化肝组织和阵列用于酶联免疫吸附测定(ELISA)中。在进一步的实施方案中，ELISA是用于检测抗体或抗原在样品中的存在的生物化学技术。在ELISA中，例如，使用了至少一种对特定抗原具有特异性的抗体。进一步举例来说，将具有未知量的抗原的样品非特异性地(通过吸附到表面)或特异性地(在“夹心”ELISA中，通过对同样抗原具有特异性的另外的抗体进行捕获)固定在固体支持体(例如，聚苯乙烯微孔板)上。再进一步举例来说，在抗原固定之后，加入检测抗体，形成与抗原的复合物。该检测抗体例如被共价连接到酶，或者通过经生物偶联连接到酶的第二抗体进行自身检测。

例如，在一些实施方案中，细胞、多细胞聚集体或组织的阵列、微阵列或芯片用于药物筛选或药物发现。在进一步的实施方案中，组织的阵列、微阵列或芯片用作用于药物筛选或药物发现的试剂盒的一部分。在一些实施方案中，每个工程化肝组织/构建体存在于生物相容性多孔容器的孔中，其中容器适合于一个或多个自动药物筛选程序和/或装置。在进一步的实施方案中，自动药物筛选程序和/或装置包括计算机或自动机械辅助的任何合适的步骤或装置。

在进一步的实施方案中，用于药物筛选分析或药物发现分析的阵列用于研究或开发潜在可用于任何治疗领域的药物的药物。在更进一步的实施方案中，作为非限制性的实例，合适的治疗领域包括：传染病、血液病、肿瘤、儿科、心脏病、中枢神经系统疾病、神经病、肠胃病、肝脏病、泌尿科、不育症、眼科、肾脏、矫形外科、疼痛控制、精神病、肺、疫苗、伤口愈合、生理学、药理学、皮肤病、基因治疗、毒作用和免疫。

在一些实施方案中，工程化肝组织和阵列用于基于细胞的筛选。在进一步的实施方案中，该基于细胞的筛选是针对一种或多种传染病如病毒感染或寄生虫感染(例如，疟原虫感染等)。在进一步的实施方案中，该基于细胞的筛选是针对肝纤维化(例如，硬化)。在进一步的实施方案中，该基于细胞的筛选是针对肝癌。在进一步的实施方案中，该基于细胞的筛选是针对肝脂肪变性(例如，脂肪肝)。在进一步的实施方案中，该基于细胞的筛选是针对一种或多种代谢缺陷。在进一步的实施方案中，该基于细胞的筛选是针对一种或多种蛋白质缺乏。在其他实施方案中，工程化肝组织和阵列用于研究癌症起始、进展或转移。在更进一步的实施方案中，工程化肝组织和阵列用于研究诸如癌细胞、携带病原体的细胞、病原细胞、免疫细胞、源自血液的细胞或干细胞/祖细胞等其他细胞类型与肝组织以及包含肝组织的细胞的相互作用。

在一些实施方案中，所述构建体或其阵列用于评估包括抗体、哺乳动物细胞、细菌、生物活性蛋白质、激素等生物制品的性能。在一些实施方案中，该构建体或其阵列用于检测、定量和研究枯否细胞和星形细胞的免疫学取样，包括来自枯否细胞或星形细胞的革兰氏阴性或革兰氏阳性抗原刺激的信号传导对相邻肝细胞的影响(例如，对脂多糖(LPS)的响应)。在一些实施方案中，该构建体或其阵列对包括HBV和HCV在内的嗜肝性病毒的生产是有用的。在进一步的实施方案中，该构建体或其阵列被用作产生外红细胞形式的疟原虫(Plasmodiumspp.)(寄生虫)的载体。在更进一步的实施方案中，来自肝构建体的疟原虫被用于比较性的体外分析，以确定针对外红细胞形形式的疟原虫的有效疗法。在其他实施方案中，该构建体或其阵列被用作针对丙型肝炎病毒(HCV)或疟原虫的抗宿主疗法，包括进行抗宿主抗体研究。在其他实施方案中，该肝构建体或其阵列在癌症起始、进展或转移的研究中是有用的。在其他实施方案中，该肝构建体或其阵列在哺乳动物肝细胞/组织之间的细胞-细胞和细胞-组织相互作用的研究中是有用的，其中该组织包含该构建体和一种或多种另外的细胞类型，包括但不限于携带病原体的细胞、活的病原细胞、癌细胞、免疫细胞、血细胞、干细胞/祖细胞或基因操纵的细胞。

在一些实施方案中，所述阵列包含工程化肝组织构建体和另外的组织构建体。在进一步的实施方案中，该肝组织构建体与另外的组织构建体在一个或多个表面上直接接触。在更进一步的实施方案中，该肝组织通过流体路径或常见的储室与一种或多种另外的组织构建体或细胞连接。在更进一步的实施方案中，与工程化肝组织构建体接触的液体介质包含活的哺乳动物细胞如免疫细胞、源自血液的细胞或源自肿瘤的细胞。在其他实施方案中，与工程化肝组织构建体接触的液体介质包含细菌、病毒、寄生虫或其他病原体。在一些实施方案中，该工程化肝组织和阵列被用作载体，以繁殖嗜肝性病毒用于包括X射线或冷冻-EM在内的三维结构研究。

体外支持体

在一些实施方案中，所述工程化肝组织构建体包含多个层，每个层包含圆柱形的生物墨水，该生物墨水基本平行地轴向对齐，该生物墨水包含实质肝细胞；和任选地，在圆柱形生物墨水之间的非实质肝细胞；以及任选地，在圆柱形生物墨水之间的空隙空间或可灌注的通道。在进一步的实施方案中，工程化肝组织被用于为有需要的受试者提供体外支持体。在更进一步的实施方案中，血液经过或穿过该构建体以过滤该血液并对受试者肝功能进行补充。

参照图17，在特定的实施方案中，生物打印的肝结构被设计用于提供体外支持。在此实施方案中，生物打印的肝结构由多个实质细胞圆柱体组成。该结构还包含非实质细胞和填充体，以创建区室和/或通道，通过该通道可以实现灌注或流动。

参照图19，在特定的实施方案中，生物打印的肝结构被用作含有重复管状结构的体外肝装置，该管状结构具有均匀间隔的空隙空间(描绘为被临时填充体占据)，从而允许跨过和/或通过该工程化的肝组织灌注。

方法

在一些实施方案中，本文中公开了用于构建活的三维肝组织构建体的方法，该方法包括将包含至少一种肝细胞类型的生物墨水生物打印到形式中或形式上，并将生物墨水融合成活的三维组织肝构建体。在进一步的实施方案中，该组织构建体用于体外使用。

在一些实施方案中，本文中还公开了用于构建组织(包括工程化肝组织)的方法，该方法包括如下步骤：制备包含实质或实质和非实质细胞的凝聚的多细胞聚集体；将所述凝聚的多细胞聚集体放置在支持体上；并温育所述多细胞聚集体，以使所述多细胞聚集体凝聚并形成工程化肝组织；其中所述温育持续约1小时至约30天。在一些实施方案中，该方法使用生物打印。在进一步的实施方案中，该方法在使用时产生不含或基本上不含预形成的支架的工程化肝组织。

在一些实施方案中，本文中还公开了用于构建活的三维肝组织的方法，该方法包括如下步骤：制备一个或多个包含哺乳动物肝细胞的凝聚的多细胞聚集体；将所述一个或多个凝聚的多细胞聚集体放置在支持体上；将如下的一种或多种施加到所述一个或多个凝聚的多细胞聚集体：在一个或多个外表面上的第一种哺乳动物细胞层；在一个或多个外表面上的第二种哺乳动物细胞层；以及温育所述一个或多个多细胞聚集体，以使多细胞聚集体凝聚并形成组织；其中所述温育持续约1小时至约30天。在一些实施方案中，该方法使用生物打印。在进一步的实施方案中，该方法产生在使用时不含或基本上不含预形成的支架的工程化肝组织。

在一些实施方案中，本文中还公开了用于构建活的三维肝组织构建体的方法，该方法包括如下步骤：制备一个或多个包含哺乳动物细胞的凝聚的多细胞聚集体；将所述一个或多个凝聚的多细胞聚集体放置在支持体上，以形成如下的至少一种：至少一个包含多种细胞类型的层，该细胞类型相对于彼此空间排列，以创建平面几何形状，和/或多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其他层不同，以创建层状几何形状；以及温育所述一个或多个多细胞聚集体，以使多细胞聚集体凝聚并形成活的三维肝组织构建体。

制备凝聚的多细胞聚集体

在一些实施方案中，该方法包括制备包含一种或多种类型的哺乳动物细胞的凝聚的多细胞聚集体，其中至少一种细胞组分代表肝细胞。在一些实施方案中，该方法包括制备包含肝实质细胞的凝聚的多细胞聚集体。在一些实施方案中，该方法包括制备进一步包含非实质细胞的凝聚的多细胞聚集体。在一些实施方案中，该方法包括制备进一步包含一种或多种细胞类型的凝聚的多细胞聚集体，该细胞类型选自下组：内皮细胞、星形细胞、成纤维细胞、枯否细胞、免疫细胞、淋巴细胞、癌细胞、携带病毒的细胞、病原细胞、脂肪细胞、脂肪形成细胞、平滑肌细胞或源自干细胞/祖细胞的细胞。

存在多种制备具有本文所述特性的多细胞聚集体的方式。在一些实施方案中，从含有多个活细胞或具有所需细胞密度和粘性的细胞浆料制造多细胞聚集体。在进一步的实施方案中，将该细胞浆料成形为所需的形状和通过成熟(例如温育)形成的多细胞体。在一些实施方案中，多细胞体的形状由周围的模具或框架的形状确定。在进一步的实施方案中，该模具或框架通过自动化仪器以定义的几何形状制造。在更进一步的实施方案中，该模具或框架由生物墨水构成并包含源自肝脏的细胞。在进一步的实施方案中，该模具或框架包含源自肝脏的非实质细胞和用于填充该框架的浆料，并创建包含实质细胞的多细胞聚集体。在一些实施方案中，该多细胞聚集体基本是圆柱形的。在其他实施方案中，该多细胞聚集体是六边形的、正方形的、立方形的、矩形的、多面体的。在更进一步的实施方案中，多个多细胞聚集体通过以镶嵌图案的重复几何形状制造周围的模具或框架并随后或同时用细胞浆料填充该模具或框架而形成。在进一步的实施方案中，将细胞浆料在受控环境中温育，以使细胞彼此粘附和/或凝聚，以形成细长的多细胞体。在另一个具体实施方案中，通过在将细胞保持为三维形状的装置中，将包括多个活细胞的细胞浆料成形来制备多细胞体。在进一步的实施方案中，将细胞浆料在受控环境中温育，同时将其保持为三维形状充分的时间，以在平表面上产生具有足以支撑其自身的凝聚力的多细胞体。

在各个实施方案中，通过如下步骤来提供细胞浆料：1)收集(一种或多种细胞类型的)细胞或细胞聚集体和生物相容性凝胶或液体，例如细胞培养基(例如，以预先确定的比例)，以产生细胞悬浮液；和2)将该细胞悬浮液致密化，以产生具有所需细胞密度和粘度的细胞浆料。在各个实施方案中，通过多种方法来实现致密化，例如通过将由细胞培养获得的特定细胞悬浮液浓缩，以获得细胞浆料所需的合意的细胞浓度(密度)、粘度和稠度。在具体的实施方案中，将来自细胞培养的相对较稀的细胞悬浮液离心设定的时间，以获得在能够在模具中成形的细胞在沉淀物中的浓度。切向流过滤(“TFF”)是细胞浓缩或致密化的另一个合适的方法。在一些实施方案中，将化合物与细胞悬浮液合并，以提供所需的挤出性质。作为非限制的实例，合适的化合物包括：表面活性剂多元醇、胶原、水凝胶、肽水凝胶、基于氨基酸的凝胶、Matrigel^TM、纳米纤维、自组装纳米纤维、明胶、纤维蛋白原等。

在一些实施方案中，通过将多个活细胞与组织培养基混合并使活细胞致密化(例如通过离心)来产生细胞浆料。任选地通过如下步骤来纳入一种或多种ECM组分(或ECM组分的衍生物)：将细胞沉淀物重悬浮在一种或多种含有ECM组分(或ECM组分的衍生物)的生理学可接受的缓冲液中，并将所得细胞悬浮液再次离心以形成细胞浆料。

在一些实施方案中，进一步加工所需的细胞浆料的细胞密度随着细胞类型而改变。在进一步的实施方案中，细胞之间的相互作用决定了细胞浆料的性质，并且不同的细胞类型在细胞密度与细胞-细胞相互作用之间将具有不同的关系。在更进一步的实施方案中，在细胞浆料成形之前预处理该细胞，以增加细胞相互作用。例如，在一些情况下，为了在细胞浆料成形之前增强细胞-细胞相互作用，在离心之后在离心管内培养细胞。在一些实施方案中，该细胞浆料伴随着生物打印而成形；其中在生物打印期间或之后，个体细胞彼此凝聚以形成生物墨水。

在各个实施方案中，采用多种方法来使细胞浆料成形。例如，在特定实施方案中，将细胞浆料手工模塑或压制(例如，在浓缩/致密化之后)，以获得所需的形状。进一步举例来说，将细胞浆料吸收(例如，抽吸)到仪器如微量移液管或注射器(例如，毛细吸管或玻璃/塑料注射器)中，这使细胞浆料成形，以符合该仪器的内表面。微量移液管(例如毛细吸管)的横截面形状备选地是圆形的、正方形的、矩形的、三角形的或其他非圆形的横截面形状。在一些实施方案中，通过沉积，使细胞浆料在预形成的模具如塑料模具、金属模具或凝胶模具中成形。在一些实施方案中，采用离心浇铸或连续浇铸来使细胞浆料成形。在一些实施方案中，该生物墨水的成形伴随着生物打印而发生，或者在生物打印之后发生。在进一步的实施方案中，作为共打印模具的结果发生生物墨水的成形；其中该模具任选地通过生物打印而沉积；其中该模具包含如下的一种或多种：生物墨水、进一步包含挤出化合物的生物墨水、凝胶、水凝胶、合成聚合物、糖、蛋白质或哺乳动物细胞或其组合。在更进一步的实施方案中，该共打印的模具的一个或多个部分在生物打印后被去除；其中去除方法选自如下的一种：物理手段，用水性介质增溶；化学处理；酶处理；调整温度。在进一步的实施方案中，在制造后该共打印的模具与组织保持关联。在更进一步的实施方案中，在制造后该共打的印模具仅细胞组分与组织保持关联。

在一些实施方案中，限定形状的多细胞聚集体也适于建造本文中所述的工程化肝组织。任选通过多种方法形成球形多细胞聚集体，该方法包括但不限于：细胞自组装、使用模具和悬滴法。在进一步的实施方案中，产生基本为球形的多细胞聚集体的方法包括以下步骤：1)提供具有所需细胞密度和粘度的、含有多个预先选择的细胞或细胞聚集体的细胞浆料；2)将该细胞浆料处理成圆柱形状；3)将圆柱体切割成相等的片段；4)任选地将该片段在旋转摇床上放置过夜；和5)任选地经1小时到7天的时期使基本为球形的多细胞聚集体成熟。在进一步的实施方案中，通过声波聚焦工艺来形成多细胞聚集体。

在一些实施方案中，部分粘附和/或凝聚的细胞浆料用于生物打印；其中凝聚和生物墨水形成主要发生在打印后。在其他实施方案中，在生物打印之前的第一步骤中，使细胞浆料成形。在进一步的实施方案中，将细胞浆料从第一成形装置(例如，毛细吸管)转移到允许向细胞供应营养物和/或氧的第二成形装置(例如，模具)，同时它们在第二成形装置中保持额外的成熟时间。允许向细胞供应营养物和氧的合适的成形装置的一个例子是用于制造多个多细胞聚集体(例如，基本相同的多细胞聚集体)的模具。进一步举例来说，这样的模具包括由抵抗细胞向基质中的迁移或向内生长并且抵抗细胞对基质的粘着的材料制成的生物相容性基质。在各个实施方案中，该基质适当地由(PTFE)、不锈钢、NovoGel^TM、琼脂糖、聚乙二醇、玻璃、金属、塑料或凝胶材料(例如琼脂糖或其他水凝胶)和类似的材料制成。在一些实施方案中，还适当地配置模具，以允许向细胞浆料供应组织培养基(例如通过将组织培养基分配到模具的顶部上)。

因此，在使用第二成形装置的实施方案中，将部分粘附和/或凝聚的细胞浆料从第一成形装置(例如，毛细吸管)转移到第二成形装置(例如，模具)。在进一步的实施方案中，将部分粘附和/或凝聚的细胞浆料由第一成形装置(例如，毛细吸管)转移到模具的凹槽中。在更进一步的实施方案中，在成熟期(其中模具与保留于其中的细胞浆料一起在受控环境中温育，以使细胞浆料中的细胞进一步彼此粘附和/或凝聚，以形成多细胞聚集体)之后，细胞的凝聚力将足够强大，从而允许用工具(例如，毛细吸管)拾取所得的多细胞聚集体。在更进一步的实施方案中，该毛细吸管适宜地是生物打印机或类似装置的打印头的一部分，其可以操作，以自动地将多细胞聚集体放置在三维构建体中。

在一些实施方案中，多细胞聚集体的横截面形状和尺寸基本对应于第一成形装置和任选的用于制备该多细胞聚集体的第二成形装置的横截面形状和尺寸，并且本领域技术人员将能够选择具有适当横截面形状、横截面积、直径和长度的适当的成形装置，其适合于产生具有以上讨论的横截面形状、横截面积、直径和长度的多细胞聚集体。

将凝聚的多细胞聚集体放置在支持体上

许多方法适合于将多细胞聚集体放置在支持体上，以生产所需的三维结构。例如，在一些实施方案中，将该多细胞聚集体人工放置而使其彼此接触，通过从移液管、喷嘴或喷针挤出而沉积在适当的位置，或者通过自动的计算机辅助装置(例如生物打印机)来安置。

如本文所述，在各个实施方案中，多细胞聚集体具有许多合适的形状和尺寸。在一些实施方案中，多细胞聚集体是细长的，具有数种合适的横截面形状中的任一种，作为非限制性的实例，包括圆形、椭圆形、正方形、三角形、多边形和不规则形状。在进一步的实施方案中，多细胞聚集体是细长的，并且是圆柱体的形式。在一些实施方案中，细长的多细胞聚集体具有类似的长度和/或直径。在其他实施方案中，细长的多细胞聚集体具有不同的长度和/或直径。在一些实施方案中，多细胞聚集体基本上是球形的。在一些实施方案中，工程化的肝组织包括基本为球形的多细胞聚集体，其尺寸基本上是类似的。在其他实施方案中，工程化的肝组织包括基本为球形的多细胞聚集体，其具有不同的尺寸。在一些实施方案中，不同形状和尺寸的工程化肝组织是通过布置各种形状和尺寸的多细胞体而形成的。

在一些实施方案中，将凝聚的多细胞聚集体放置在支持体上。在各个实施方案中，该支持体是任何合适的生物相容性表面。在更进一步的实施方案中，作为非限制性的实例，合适的生物相容性表面包括聚合材料、多孔膜、塑料、玻璃、金属、水凝胶及其组合。在一些实施方案中，该支持体用生物相容性物质涂覆，作为非限制性的实例，该生物相容性物质包括水凝胶、蛋白质、化学品、肽、抗体、生长因子或它们的组合。在一个实施方案中，该支持体涂覆有NovoGel^TM。在另一个实施方案中，该支持体涂覆有琼脂糖。在一个实施方案中，该凝聚的多细胞聚集体被放置在生物相容性多孔容器的孔中。

在一些实施方案中，一旦完成对凝聚的多细胞聚集体的放置，就将组织培养基倒在该构建体的顶部。在进一步的实施方案中，组织培养基进入多细胞体之间的空间，以支持多细胞体中的细胞。

施加第一细胞类型的层和/或第二细胞类型的层

许多方法适合于将一个或多个细胞层施加到该凝聚的哺乳动物细胞结构的一个或多个外表面上。例如，在一些实施方案中，施加细胞层包括：用细胞的悬浮液、片、单层或融合的聚集体来涂覆所述凝聚的多细胞集合体的一个或多个表面。在各个实施方案中，涂覆该凝聚的哺乳动物细胞构建体的1、2、3、4或更多个表面。

在一些实施方案中，施加细胞层包括：生物打印融合的多细胞聚集体的附加层。在其他实施方案中，施加细胞层包括：生物打印、喷雾或墨水喷射细胞的溶液、悬浮液或液态浓缩物。在进一步的实施方案中，合适的细胞悬浮液包含约1x10⁴至约1x10⁶个细胞/μl。在更进一步的实施方案中，合适的细胞悬浮液包含约1x10⁵至约1.5x10⁵个细胞/μl。在进一步的实施方案中，施加细胞层包括：将细胞的悬浮液以空间分布小滴的形式直接分配到该凝聚的哺乳动物细胞结构的一个或多个表面上。在更进一步的实施方案中，施加细胞层包括：将细胞的悬浮液以喷雾的形式直接分配到该凝聚的哺乳动物细胞结构的一个或多个表面上。在各个实施方案中，在构建过程中的任何合适的时间施加细胞层。在一些实施方案中，在生物打印之后立即(例如，最多10分钟)将一个或多个细胞层施加到凝聚的哺乳动物细胞构建体的一个或多个外表面上。在其他实施方案中，在生物打印之后(例如，10分钟之后)，施加一个或多个层。在另外的其他实施方案中，在该结构成熟期间，施加一个或多个层。

在一些实施方案中，该方法进一步包括在支持体上培养细胞层的步骤。在这样的实施方案中，在某些情况下，施加细胞层包括：将工程化肝组织构建体的一个或多个表面放置为与制备的细胞培养基直接接触。在进一步的实施方案中，该构建体被直接生物打印在细胞的培养层上或细胞单层上。在生物相容性支持体上的任何类型的培养细胞层是合适的。在一些实施方案中，将多细胞聚集体生物打印到内皮细胞层上。在其他的实施方案中，将多细胞聚集体生物打印到非实质细胞层上。在进一步的实施方案中，细胞层与该生物打印构建体的多细胞聚集体粘附和/或凝聚。在一些实施方案中，多层结构的每个层都是生物打印的。在进一步的实施方案中，个体层包括可变形式的生物墨水，包括但不限于：凝聚的细胞聚集体、细胞浆料、与挤出化合物或其他添加剂组合的细胞浆料、细胞单层和细胞片。

用于制造区室化组织的共打印的模具

在一些实施方案中，所述方法包括制备一种或多种包含非实质细胞的生物墨水；制备一种或多种包含实质细胞如肝细胞或肝细胞样细胞的生物墨水；将该生物墨水沉积到支持体上；并温育该沉积的生物墨水持续约1小时到约30天，以形成包含至少一个区室的活的三维肝组织构建体，该区室包含由包含非实质细胞的边部限制的包含实质细胞的内部。

在一些实施方案中，所述方法包括制备一个或多个包含哺乳动物肝细胞的凝聚的多细胞聚集体；将该一个或多个凝聚的多细胞聚集体放置在支持体上，以形成如下的至少一种：至少一个包含多种细胞类型的层，该细胞类型相对于彼此空间排列，以创建平面几何形状；和多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其他层不同，以创建层状几何形状；并温育所述一个或多个多细胞聚集体持续约1小时至约30天，以使其凝聚并形成活的三维肝组织构建体。

参照图2，在特定的实施方案中，生物打印了含有HepaRG细胞的肝构建体，使其成熟并进行生物化学表征。首先，用含有内皮细胞和肝星形细胞的生物墨水打印具有4mmX4mmX1mm尺寸的周界盒。其次，将HepRG细胞沉积在周界盒的中央。随后在37℃下成熟96小时。第三，在打印后20小时观察生物打印的构建体的融合。在此实施方案中，生物打印的肝构建体是代谢活性的，其在96小时时产生白蛋白和胆固醇。

参照图3，在特定的实施方案中，采用各自由挤出化合物制成的非实质细胞边部和实质细胞填充物生物打印了肝构建体。

参照图4，在特定的实施方案中，采用包含内皮细胞和肝星形细胞的边部、包含初级肝细胞的填充物和作为空间分散的球状体引入的第三组成成分(包括在填充物内的内皮细胞和肝星形细胞)生物打印了肝构建体。

参照图5，在特定的实施方案中，采用由不含细胞的材料制造的共模具生物打印了肝构建体，该材料在水性介质(例如，PF-127)中溶解，仅留下填充物并建立负空间。

参照图6，在特定的实施方案中，采用由封装在水溶性挤出化合物(例如，PF-127)中的多种肝细胞类型组成、用以形成镶嵌功能单元图案的生物墨水，使用连续沉积技术生物打印了肝构建体。

参照图8，在特定的实施方案中，采用不含有用于使多细胞聚集体成型为六边形的细胞的共打印的模具生物打印了区室化的肝构建体。在此实施方案中，该无细胞材料在使用时消失以产生无支架的组织。

参照图10，在特定的实施方案中，采用用作填充有HepG2细胞的边部的共模具生物打印了区室化的肝构建体。

参照图11，在特定的实施方案中，含有细胞的共打印的模具被生物打印为边部，在该边部中实质细胞用作填充物，在这种情况下，为HepG2细胞。

参照图12，在特定的实施方案中，使用非实质细胞边部和实质细胞填充物生物打印了区室化的肝构建体，以实现高的、类似组织的密度。

温育多细胞聚集体

在一些实施方案中，温育多细胞聚集体。在进一步的实施方案中，温育允许多细胞聚集体粘附和/或凝聚以形成组织，例如肝组织。在一些实施方案中，在细胞培养环境(例如，培养皿、细胞培养瓶、生物反应器等)中，多细胞聚集体凝聚以形成组织。在进一步的实施方案中，在具有适合于促进包括在多细胞聚集体中的细胞类型生长的条件的环境中，多细胞聚集体凝聚以形成组织。在一个实施方案中，在约37℃下，在含有约5％CO₂的湿润气氛中，在含有促进粘附和/或凝聚的因子和/或离子的细胞培养基的存在下，温育多细胞聚集体。在其他实施方案中，将该多细胞聚集体保持在含有0.1％至21％O₂的环境中。

在各个实施方案中，温育具有任何合适的持续时间。在进一步的各个实施方案中，温育具有约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180或更多分钟的持续时间，包括其间的任何量。在进一步的各个实施方案中，温育具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、36、48或更多小时的持续时间，包括其间的任何量。在进一步的各个实施方案中，温育具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天的持续时间，包括其间的任何量。有几种因素影响多细胞聚集体凝聚以形成组织所需的时间，作为非限制性的实例，包括细胞类型、细胞类型的比例、培养条件和添加剂如生长因子的存在。

用于增加工程化组织存活力的额外步骤

在一些实施方案中，该方法进一步包括增加工程化组织的存活力的步骤。在进一步的实施方案中，这些步骤包括：通过限制材料的暂时或半永久性的网格，提供该组织与营养培养基之间的直接接触。在一些实施方案中，该组织被束缚在多孔或间隙材料中。该工程化组织的至少一些细胞直接接近营养物增加了该工程化组织的存活力。

在进一步的实施方案中，用于增加工程化组织的存活力的额外和任选的步骤包括：1)任选地在放置凝聚的多细胞聚集体之前，分配限制材料的基底层；2)任选地分配限制材料的周界；3)在限定的几何形状内生物打印该组织的细胞；和4)分配限制材料的细长体(例如，圆柱体、带状体等)，按照图案覆盖初生组织，该图案在限制材料中引入间隙，例如网格、网孔或格子。

许多限制材料适合用于本文描述的方法中。在一些实施方案中，水凝胶是示例性的限制材料，其具有一种或多种有利的性质，包括：非附着的、生物相容的、可挤出的、可生物打印的、非细胞的、具有合适的强度以及不溶于水性条件。在一些实施方案中，适宜的水凝胶是天然聚合物。在一个实施方案中，该限制材料由NovoGel^TM组成。在进一步的实施方案中，合适的水凝胶包括衍生自表面活性剂多元醇的水凝胶如PluronicF-127、胶原、透明质酸盐、纤维蛋白、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖、明胶和它们的衍生物或组合。在其他实施方案中，合适的水凝胶是合成聚合物。在进一步的实施方案中，合适的水凝胶包括衍生自聚(丙烯酸)或其衍生物、聚(环氧乙烷)及其共聚物、聚(乙烯醇)、聚磷腈及其组合的那些水凝胶。在各个具体实施方案中，该限制材料选自：水凝胶、NovoGel^TM、琼脂糖、藻酸盐、明胶、Matrigel^TM、透明质酸、泊洛沙姆、肽水凝胶、聚(异丙基正聚丙烯酰胺)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)、甲基丙烯酸羟乙酯、聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酰胺、聚(乳酸)、硅、丝和它们的组合。

在一些实施方案中，覆盖图案的间隙均匀地或基本均匀地围绕组织的表面分布。在其他实施方案中，该间隙不均匀地分布，从而使组织的细胞不均匀地暴露于营养物。在不均匀的实施方案中，任选地利用对营养物的差异获取来影响组织的一种或多种性质。例如，在某些情况下，理想的是在生物打印的组织的一个表面上的细胞比在该生物打印的组织的另一表面上的细胞增殖更快。在一些实施方案中，任选地在不同的时间改变该组织的各个部分对营养物的暴露，以影响该组织向期望的终点的发育。

在一些实施方案中，在任何合适的时间除去限制材料，包括但不限于：生物打印之后立即(例如，在10分钟内)、在生物打印之后(例如，10分钟后)、在细胞基本上彼此凝聚之前、在细胞基本上彼此凝聚之后、在细胞产生细胞外基质之前、在细胞产生细胞外基质之后、恰在使用之前，等等。在各个实施方案中，通过任何合适的方法除去限制材料。例如，在一些实施方案中，将限制材料切除、从细胞上扯下、消化或溶解。

在一些实施方案中，该方法进一步包括使工程化肝组织在一个或多个侧面上经受由流体流动、搅动或对流性再循环引起的剪切力的步骤。

生物学性质

本文所述的生物打印的肝组织包含类似人体组织的多细胞结构。像天然肝组织一样，生物打印的肝组织包含在特定区域富集的特定的细胞类型(例如，肝星形细胞、肝细胞、内皮细胞等)，从而产生图案化的、区室化的结构。

在一些实施方案中，本文所述的生物打印的肝组织包含天然肝脏的重要特征，包括高细胞密度，和ECM、脂质和糖原的产生。见图21。在一些实施方案中，本文所述的生物打印的肝组织具有至少30％的细胞密度。在各个进一步的实施方案中，本文所述的生物打印的肝组织具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的细胞密度。在各个进一步的实施方案中，本文所述的生物打印的肝组织具有约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％的细胞密度。

在一些实施方案中，三维生物打印的肝组织包含组织学特征，如紧密连接、至少一些静止肝星形细胞的保持和微血管结构的发展。在一些实施方案中，三维生物打印的肝组织包括在初始制造后良好持续的区室化。例如，在进一步的实施方案中，三维生物打印的肝组织包括持续至少7天、至少10天、至少20天、至少30天或至少40天的区室化。在各个进一步的实施方案中，三维生物打印的肝组织包括持续约7天、约10天、约20天、约30天或约40天的区室化。

在一些实施方案中，制造后可以确定被非实质“间质”围绕的肝细胞区域。见图22。出乎意料的是，该生物打印的肝组织显示出明显的自组织成小叶型结构，这非常接近地模拟了天然肝脏。观察到的结构支持功能和活力超过40天，从而使得能够长期测试，例如，低剂量、重复暴露和慢性病理学状况。

在一些实施方案中，在本文所述的三维生物打印的肝组织中，肝特异性的功能维持超过7、10、20、30或40天。例如，在一些实施方案中，本文所述的生物打印的肝组织显示出直至6周(42天)的白蛋白的连续产生，远超过了所发表的传统二维技术中初级肝细胞的时间进程。见图23。生物打印的肝组织还显示出其他肝细胞因子如胆固醇的持续产生。见图23。

三维生物打印的人肝组织展现出在现有二维方法中无法实现的其他相关代谢物(包括转铁蛋白和纤维蛋白原)的产生。见图24。在一些实施方案中，三维生物打印的人肝还展现出胆小管形成的标志物。见图25。

在一些实施方案中，相比于在数天后失去功能的二维初级肝细胞，本文所述的生物打印的三维肝组织构建体显示出活性CYP3A4酶的持续可诱导性，其中该可诱导性被维拉帕米抑制。见图26。在一些实施方案中，本文所述的三维生物打印的肝组织显示出对已知肝毒物的类似天然的响应，该毒物包括双氯芬酸、曲伐沙星和甲氨蝶呤。见图27-29。在一些实施方案中，本文所述的三维生物打印的肝组织显示出对生理学相关分子如维生素D的类似天然的响应。见图30。

在一些实施方案中，本文所述的三维人肝组织用实质细胞(肝细胞)和非实质细胞区域(内皮细胞(EC)和肝星形细胞(hSC))图案化。在进一步的实施方案中，作为初级肝细胞的替代，图案化的三维肝组织包括iPSC衍生的肝细胞样细胞(iPSC-HC)(如iCell肝细胞，CellularDynamicsInc.)。iPSC的使用允许开发患者特异性和/或疾病特异性体外系统，并可以提供产生难以分离或繁殖的细胞的手段。

实施例

下述具体实施例应理解为仅是说明性的，而不以任何方式对公开内容的其他部分进行限制。

实施例1-利用连续沉积和镶嵌功能单元结构生物打印的肝组织

使用NovoGenMMXBioprinter^TM(Organovo,Inc.,SanDiego,CA)，利用连续沉积机理来生物打印工程化的肝组织。该肝组织的三维结构是基于重复功能单元，在这种情况下是六边形。该生物墨水由包封在挤出化合物(表面活性剂多元醇-PF-127)中的肝星形细胞和内皮细胞组成。

30％PF-127的制备

利用PBS制备30％PF-127溶液(w/w)。利用保持在4℃下的磁力搅拌板，将PF-127粉末与冷却的PBS混合。完全溶解发生在大约48小时内。

细胞制备和生物打印

将由82％肝星形细胞(SC)和18％人主动脉内皮细胞(HAEC)和人成体皮肤成纤维细胞(HDFa)组成的细胞悬浮液分到15mL管中，以便在离心后获得三个细胞浓度：50x10⁶个细胞/ml、100x10⁶个细胞/mL和200x10⁶个细胞/ml。将每个细胞沉淀物重悬浮于30％PF-127中，并抽吸到生物打印机使用的3cc储库中。采用510μm分配末端，将包封的细胞生物打印到PDMS底板上成为单一六边形(参见图6A)或六边形镶嵌结构(参见图6B)。每个构建体接纳大约200μL的培养基，并在室温下温育20分钟，以评价构建体的完整性。

多层生物打印

对于六边形镶嵌实验，生物打印高达(4个)连续层，结果形成具有更多细胞材料存在的更高结构。制作后，每个构建体最初接纳大约200μL的完全培养基，以评价构建体的完整性。将构建体在室温下温育20分钟，之后浸入到20mL的完全培养基中。

结果

在含有10％胎牛血清的生长培养基(它溶解PF127)中培养18小时后，在生物打印的几何形状内含有的细胞彼此凝聚，足以产生组织的完整的组织邻接片，其保持了原始设计的几何图案(参见图6D)。图7中所示的是：在10％中性缓冲福尔马林中固定后，镶嵌构建体的单个节段的H&E染色。发现细胞是活的、完整的，并且局限于它们原始打印的几何形状。

实施例2-强制层化

以圆柱形生物墨水或细胞悬浮液的形式在PluronicF-127(Lutrol，BASF)中制备用于生物打印的细胞群体(均质的或异质的)。简言之，对于生物墨水的制备，利用重组人类胰蛋白酶(75μg/mL，Roche)或0.05％胰蛋白酶(Invitrogen)，从标准的组织培养塑料中释放出细胞。在酶释放之后，将细胞洗涤、收集、计数并以期望的比例(即，50:50的肝星形细胞(hSC)：内皮细胞(EC))组合，并通过离心进行沉淀。然后，从细胞沉淀物中除去上清液，并将细胞混合物吸入至所需直径(内径一般为500μm或250μm)的玻璃微毛细管中。随后将这个圆柱形细胞制备物挤出至模具中，该模具由具有用于生物墨水成熟的孔道的非细胞粘着水凝胶材料形成。随后，将所得生物墨水圆柱体在完全细胞培养基中培养凭经验确定的时间，一般为2至24小时。

简言之，对于水凝胶细胞悬浮液的制备，利用本文中描述的任何一种酶介导的方案，将细胞从标准细胞培养容器中释放出来。随后，将释放的细胞用含有血清的培养基洗涤、收集、计数并离心，以形成致密的细胞沉淀物。从所得细胞颗粒中除去上清液，随后以50至200x10⁶个细胞/mL的浓度(10-300x10⁶个细胞/mL的范围)，将细胞再悬浮于冷的PF-127(4℃)中。然后，使用NovoGenMMXBioprinter^TM生物打印机(Organovo,Inc.,SanDiego,CA)，将该细胞悬浮液吸入注射器中。

随后，利用生物打印机来完成具有强制的细胞图案化、层化或取向的组织构建体的制作。用圆柱形生物墨水、在水溶性凝胶中的细胞悬浮液或它们的组合，来进行三维组织构建体的生物打印。为了获得限定的细胞图案或层化，相关细胞群体的组合被包含在生物墨水或细胞悬浮液制备中，然后以使负载细胞溶液的凝胶材料溶解的方式，来进行生物打印，从而在沉积的生物墨水周围产生限定的细胞层化(参见图13)。也可以通过利用和并入限定的、离散的细胞群体(例如，hSC和EC)来获得细胞图案化、组织或层化，这导致在生物打印的组织内形成细胞和细胞结构的可预测且可重复的组织(参见图14)。

在一些试验中，在成熟或培养期之后，观察在生物打印的新组织中最终的细胞组织结构。将构建体维持在标准实验室培养箱中(37℃，补充有5％CO₂的加湿室)，并随着时间变化来评价。

结果

利用生物打印实现细胞图案化、层化或布置。通过含有异质的(即：多型的)细胞群体的生物墨水的生物打印，或者通过将生物墨水(均质的或异质的细胞群体)与高密度细胞凝胶或细胞悬浮液结合，观察不同的细胞组织结构。这些新组织构建体在加湿室(培养箱)中的成熟，导致进一步在这些生物打印的新组织中建立不同的细胞布置、结构和/或分离。

例如，在包括HepG2细胞的生物打印的生物墨水上装载PF-127的EC:hSC生物打印，导致具有不同细胞群体和离散组织形态的构建体的不同层的建立。在含有hSC和EC的生物墨水构建体的情况下，在完全培养基中成长超过3天的生物打印构建体，被发现在该构建体核心中的外围和组织微管网络含有不同的EC层。用包括血管平滑肌细胞的均质(即，单型的)群的生物墨水制造的生物打印构建体(高浓度EC溶液被生物打印在它上面)，被发现在该构建体外围含有不同的EC层。

实施例3-多孔板

制备用于使用多种生物墨水形式的生物打印的细胞群体(均质的或异质的)，包括圆柱形生物墨水聚集体、细胞聚集体的悬浮液或细胞悬浮液/浆料，任选含有挤出化合物。简言之，为制备圆柱形生物墨水，利用重组人胰蛋白酶(75μg/mL，Roche)或0.05％胰蛋白酶(Invitrogen)将细胞从标准组织培养塑料制品释放，在酶释放之后，接着将细胞洗涤、收集、计数并以需要的比例(即：50:50的肝星形细胞(hSC)：内皮细胞(EC))结合，并通过离心进行沉淀。随后，从细胞沉淀物除去上清液，并将细胞混合物吸入所需直径(内径一般为500μm或250μm)的玻璃微细管中。随后将这个圆柱形细胞制备物挤入模具中，该模具由具有用于生物墨水成熟的孔道的非细胞粘着水凝胶材料形成。随后，将所得生物墨水圆柱体在完全细胞培养基中培养凭经验确定的时间，一般为2至24小时。

为了制备细胞聚集体的细胞悬浮液或细胞浆料，遵循了本文中描述的细胞繁殖和释放方案。在产生细胞沉淀物时，从沉淀物除去上清液，并将沉淀物转移到常规的沉积注射器。然后，将这个注射器安装到用于将细胞聚集体溶液或浆料直接生物打印到多孔板中的生物打印机沉积头上。

然后，将复制组织构建体生物打印到多孔组织培养板(例如，6孔或24孔)的孔中或多孔细胞培养插入物(即：Transwell,BD)中，然后被放进合适的多孔板。在生物打印后，使三维构建体与相关的培养基成熟/调适(conditioned)一段时间，一般为3至14天。在成熟后，将构建体收获、固定并进行用于常规组织学和免疫组织化学的处理。

结果

在多孔培养板或多孔培养插入物(随后被插入到多孔板)中，成功制造了生物打印的组织。这个方法允许生成复制生物打印组织，其任选地被培养和处理，以形成相同或独特的培养条件。这个方法导致在生物打印过程的处理能力和样品形成中的显著增加(参见图16)。

实施例4-生物打印的新组织的刺激

制备包括相关的异质(即，多型)细胞群体的圆柱形生物墨水。以特定的比例将细胞生理上相关的群体(例如，肝星形细胞(hSC)和人主动脉内皮细胞(EC))结合，以产生合适的生物墨水。将细胞在标准实验室条件下保持并繁殖，并将细胞在以下培养基中培养：从与细胞相同的供应商处购买的培养基，或者包括在原始文献中一般发现的对那些特殊细胞类型的标准细胞培养实践有利的组分的培养基。用于生物墨水制备的细胞处理如下：简言之，通过无阳离子的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，将细胞从标准组织培养塑料制品中释放，然后将细胞暴露于0.1-0.05％的胰蛋白酶(Invitrogen)。然后，将释放的细胞用含有血清的培养基洗涤、收集、计数并(对于刺激分析或正在进行的实验)以合适的比例合并，通过离心进行沉淀。然后，除去上清液，并将细胞沉淀物吸入玻璃微细管中，随后将其浸入完全培养基中大约15至20分钟。随后，将该圆柱形生物墨水结构挤入非细胞粘着的水凝胶模具中(含有线性通道)，并保持2至18小时。然后，使用含有hSC:EC的圆柱形生物墨水制造生物打印的组织构建体并在加湿的腔室中保持和/或成熟。制造了初始尺寸为1.25mmx8mmx0.25mm(WxLxH)的组织区段。在打印后成熟期间，将一些构建体暴露于细胞因子TGF-β1以引发组织特异性响应(见图15)。

对于需要均质(即，单型)细胞层的组织构建体，受限于上表面，利用含有相关细胞类型来进行第二细胞制备。典型地，在高浓度细胞悬浮液中，制备血管内皮细胞或小气道上皮细胞(分别对于血管壁和人肺组织模型)。简言之，如上所述，将细胞释放、收集、计数并通过离心进行沉淀。除去上清液，并将细胞沉淀物再悬浮于小体积的完全培养基中，生产1x10⁵个细胞/μL的高浓度细胞团。随后，将该细胞悬浮液在4℃下储存，直至使用。

然后，将生物打印的新组织浸入含有血清的完全细胞培养基中，并放在补充有5％CO₂的标准加湿室中来成熟。随后，将该生物打印的新组织采用相关的细胞因子培养并刺激预定的时间，并进行福尔马林-固定、收获，以及进行用于常规组织性和免疫组织化学的处理。评价生物打印的组织的以下特征，例如但不限于：组织形态、细胞结构、细胞外基质的产生、细胞增殖、细胞活力和构建体完整性。

通过直接向培养基添加细胞因子，并采用添加的蛋白质培养生物打印的组织，来进行细胞因子刺激以提供细胞对合适刺激的直接且延长的通道。一般在0.1至100ng/mL的剂量下(取决于实验细胞因子的ED50)来进行剂量-反应实验。对于其中实施时间超过48小时的细胞因子刺激的实验，改变培养基，且每48小时加入新鲜的细胞因子。

结果

用先前已经显示在二维的体外系统中引起细胞反应的细胞因子成功刺激了含有生理上相关的细胞群体的生物打印的新组织。发现在生物打印的三维组织构建体中观察的反应依赖于剂量，并且仅限于该生物打印的构建体内的细胞(参见，例如，图15)。

实施例5-用连续沉积来生物打印共成型的功能性肝组织微观结构

30％PF-127的制备

利用PBS制备30％PF-127溶液(w/w)。利用维持在4℃的磁力搅拌板，将PF-127粉末与冷的PBS混合。完全溶解发生在大约48小时内。

细胞制备和模具的共打印及填充

利用生物打印机和采用510μm的分配末端将3mL的PF-127溶液吸入3cc储库中，将30％的PF-127溶液生物打印到6孔的Transwell中，并形成单个六边形及依次层化6次。

在1000g下将由7.8x10⁷个肝细胞(HepG2)构成的细胞悬浮液离心6分钟，以产生细胞浆料。通过510μm喷针，挤出5μL的细胞浆料，以填入每个三角形模具(参见图5A)。将六边形模具在室温下温育15分钟。将3mL培养基(补充有10％FBS和1X青霉素、链霉素和两性霉素B的DMEM)与如上负载的Transwell加入到孔中，之后在37℃和5％CO₂下温育。在45分钟内，将PF-127模具溶解在培养基中，留下完整的成型的肝生物墨水，以形成细胞和间隙的平面几何图形(参见图5B)。为从培养基中除去残留的PF-127，将Transwell转移到含有3mL培养基的新孔中，并温育两个小时。将这个操作额外重复两次，使得用超过6小时进行了总共9mL的培养基交换。

6小时后，将Transwell转移到没有培养基的新孔中，并以90％人主动脉内皮细胞和10％肝星形细胞的比例，将2x10⁶个细胞的细胞悬浮液分配，以填入由FP-127模具溶解形成的空白中。将肝构建体在室温下温育15分钟。在温育15分钟后，4mL培养基含有85％比例的培养基(补充有10％FBS和1X青霉素、链霉素和两性霉素B的DMEM，以负载肝细胞和肝星形细胞；和15％补充有2％LSGS、10％FBS、HEPES和1X青霉素、链霉素和两性霉素B的M199，以负载人主动脉内皮细胞)。将该构建体在37℃和5％CO₂下温育48小时，以形成连续的构建体，该构建体具有包括插入包括内皮细胞的组织的肝实质的小叶片(三角形)结构的平面几何形状。

实施例6-功能性肝组织的生物打印和表征

细胞培养

按照制造商的方案纯化冷冻保存的初级人肝细胞(LifeTechnologies)并在补充有青霉素100I.U./ml、链霉素0.25μg/ml和两性霉素85μg/ml(1XP/S/A)(LifeTechnologies)的肝细胞保持培养基(HepatocyteMaintenanceMedia)(LifeTechnologies)中温育。以下细胞在生物打印的组织的非实质细胞组分中使用：人脐静脉内皮细胞(HUVEC；BectonDickenson)和肝星形细胞(ScienCell)，并根据制造商的说明繁殖。HUVEC在EGM-2培养基(Lonza)中生长，而肝星形细胞在补充有10％FBS(LifeTechnologies)、青霉素100I.U./ml、链霉素0.25μg/ml和两性霉素85μg/ml(1XP/S/A；Corning)的DMEM(Corning)中生长。

在诱导分析中使用的化学品

下列试剂购自Sigma：利福平、双氯芬酸、维拉帕米、5-(和-6)-羧基-2',7'二氯荧光素二乙酸盐和维生素D3。

生物墨水制备

生物墨水基于本文所述的方案和技术制备。为了制备含有细胞的水凝胶，根据制造商的说明制备了NovoGel2.0(Organovo,Inc.)，并在生物打印前引入非实质细胞群体。

生物打印

使用标准Organovo生物打印方案和NovoGenMMXBioprinter或其改进型直接将所有组织制造到标准组织培养孔插入物(CorningTranswell)的膜上。生物打印的肝组织包括在Novogel2.0中含有非实质细胞(肝星形细胞，HUVEC)的边部。该边部限定包含内部的区室。该区室的内部填充有含有初级肝细胞的细胞浆料。该生物打印的肝组织还包括包含Novogel1.0的沟槽(moat)。图20示出了生物打印的人肝组织的具体实例。在实验期间，生物打印的肝组织保持在这些膜上。每天用90％初级肝细胞培养基和10％EGM-2的600μl混合物对构建体进行培养基更换，并在37℃下在补充有5％CO₂的加湿空气条件下温育。收集耗尽的培养基用于分析分泌的因子，并且收获肝组织用于终点分析(例如，基因表达、组织学、组织活力等)。

分泌蛋白质检测

收集耗尽的培养基并在-80℃下储存，然后通过可商购的ELISA试剂盒对以下肝代谢物进行分析：白蛋白(BethylLaboratories)、纤维蛋白原(GenWayLabs)和转铁蛋白(GenWayLabs)。使用荧光法(CaymanBiochemical)定量胆固醇生物合成。用可商购的试剂(Abcam)比色测量乳酸脱氢酶(LDH)活性。

用于转录谱分析的RNA分离和cDNA合成

使用Quick-RNAMiniPrep(Zymo)按照制造商的说明从三维肝构建体提取大量RNA。使用分光光度计(BeckmanCoulterDU640)对RNA进行定量。按照制造商的说明(CloneTech)在每个单独的cDNA合成SmartScribe反应中使用2μg输入RNA。按照制造商的指导(LifeTechnologies)，将FAM染料标记的针对CYP3A4的和VIC染料标记的针对18S的TaqMan(LifeTechnologies)探针和引物对在TaqManUniversalMasterMixUNG中使用。使用StepOnePlus系统(LifeTechnologies)检测转录扩增子。

组织学分析：肝组织的石蜡制备

在室温下将肝构建体在2％低聚甲醛溶液(PBS中的2％低聚甲醛、10mM氯化钙、50mM蔗糖)中原位固定24小时。24小时后，移除固定溶液并用70％乙醇替换。将附有Transwell膜的构建体浸没在塑料活检模具中的45℃液体Histogel(AmericanMasterTech,Lodi,CA,目录号EMHGECS)中，并使其在室温下固化。然后使用组织加工器对具有包埋的肝构建体的Histogel块进行针对石蜡包埋的加工。用石蜡渗透后，将肝构建体包埋在石蜡模具中，并且使用旋转切片机(JungBiocut2035,LeicaMicrosystems,BuffaloGrove,IL)产生5μm横截面。为了进行苏木精和曙红染色，将载片(slide)在二甲苯中脱蜡并通过100％、95％、70％和50％乙醇再水合并在蒸馏水中漂洗。将载片浸入Gill苏木精(FisherScientific,Pittsburgh,PA)中。用蒸馏水漂洗后，将载片短暂地浸入0.2％v/v氢氧化铵中。在用蒸馏水漂洗后，将载片浸入曙红水溶液(AmericanMasterTech)中。然后通过乙醇梯度使载片脱水，在二甲苯中清洗，并用树脂固定介质(resinousmountingmedia)(CytoSeal,FisherScientific)固定。

根据制造商的说明(Abcam,Cambridge,MA)进行高碘酸-Sciff染色。

为了进行免疫组织化学分析，将载片在二甲苯中脱蜡，并在蒸馏水最终洗涤前通过将其顺序地浸入100％、95％、70％和50％乙醇中再水合。使用标准的微波炉将溶液和载片加热至接近沸腾，随后缓慢冷却30分钟，使再水合的切片在10nM柠檬酸钠pH6.0中经历热介导的抗原恢复。然后将载片用在Tris缓冲盐水(TBS)中的10％山羊血清封闭1小时，随后在4℃下与第一抗体温育过夜。采用了以下第一抗体：兔抗E-钙粘蛋白(Abcam；1:50)；小鼠抗白蛋白(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO；1:200)；兔抗结蛋白(Abcam；1:200)；小鼠抗-CD31(Abcam；1:25)。然后将切片在含有0.1％Tween20的TBS中洗涤三次，并使其与在TBS中1:200稀释的AlexaFluor488或AlexaFluor568偶联的第二抗体(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)温育。然后将切片在TBS-0.1％Tween20中洗涤三次，用蒸馏水漂洗，并用含有DAPI的固定介质(VectorLabs,Burlingame,CA)进行固定。

用于冷冻切片的构建体的制备

将肝构建体用DPBS漂洗一次，浸入Tissue-TekOCT化合物(SakuraFinetekEuropeB.V.,Netherlands)中，并骤冻。然后在低温恒温器(LeicaCryocut1800,LeicaMicrosystems)上将含有肝构建体的冷冻块切成5μm的切片。将切成的切片在-20℃液态丙酮中迅速固定，并使其在室温下风干20分钟。对于油红O染色，将载片在蒸馏水中再水合并浸入60％异丙醇中2分钟。在室温下，用60％异丙醇中的0.3％w/v油红O(Sigma-Aldrich)将载片染色15分钟，随后用60％异丙醇漂洗1分钟。将载片短暂浸入Gill苏木精中以复染。载片用蒸馏水漂洗，并用水性介质(AmericanMasterTech)固定。

显微镜检查

使用ZeissAxioskop显微镜(Zeiss,Jena,Germany)对H&E、PAS和油红O染色的载片进行成像。用Insight2相机和Spot5.0软件(DiagnosticInstruments,Inc.,SterlingHeights,MI)获得图像。用ZeissAxioImager显微镜对荧光染色的载片进行成像，并且用ZeissICM-1相机和ZenPro软件获得图像。

S9部分的制备

从三维肝构建体中吸取介质，并将补充有1X蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)的400μl的磷酸盐缓冲盐水(Corning)添加至构建体，随后在-80℃下冷冻。将该构建体解冻并采用TissuRuptor(Qiagen)和一次性端头在3000rpm下90秒、接着中止90秒、随后在3000rpm下匀浆化90秒使其匀浆化。将匀浆化的上清液在4℃、20,000Xg下离心20分钟。将上清液转移到新的管中，随后进行蛋白质定量。

蛋白质定量

采用Bradford分析(Sigma)，以牛白蛋白为标准(Sigma)，完成了蛋白质定量。

CYP3A4分析

用蛋白质含量对S9部分进行归一化，并按照制造商的方案在Luciferin-IPA分析(CYPProGlo；Promega)中使用，并使用读板仪(Polarstar,BMG)读取发光。

统计学

用GraphPadPrism软件进行ANOVA和studentst-检验统计学分析。

结果

该生物打印的肝组织包含类似人体组织的多细胞结构。像天然肝组织一样，生物打印的肝组织包含在特定区域富集的特定的细胞类型(例如，肝星形细胞、肝细胞、内皮细胞等)，从而产生图案化的、区室化的结构。

生物打印的肝组织的组织学表征显示出天然肝脏的关键特征，包括高细胞密度，和ECM、脂质和糖原的产生。见图21(打印后第7天)。三维生物打印的肝组织显示出引人注目的组织学特征，包括紧密连接(通过E-钙粘蛋白、白蛋白和DAPI的可视化来观察)，和静止星形细胞以及微血管结构(通过结蛋白、CD31和DAPI的可视化来观察)。三维生物打印的肝组织显示出在初始制造后良好继续的区室化。在打印后第21天，确定被非实质“间质”围绕的肝细胞区域。见图22。出乎意料的是，该生物打印的肝组织显示出明显的自组织成小叶型结构，这非常接近地模拟了天然肝脏。

观察到的结构支持功能和活力持续超过40天，从而使得能够长期测试，例如，低剂量、重复暴露和慢性病理学状况。在三维生物打印的肝组织(初级肝细胞)中，肝特异性的功能维持超过40天。生物打印的肝组织显示出直至6周(42天)的白蛋白的连续产生，远超过了所发表的传统二维技术中初级肝细胞的时间进程。见图23。生物打印的肝组织还显示出其他肝细胞因子如胆固醇的持续产生。见图23。

三维生物打印的人肝组织展现出在现有二维方法中无法实现的其他相关代谢物(包括转铁蛋白和纤维蛋白原)的产生。见图24。

三维生物打印的人肝还展现出胆小管形成的标志物。胆汁盐输出蛋白(BSEP)是位于肝细胞的小管膜内的膜蛋白。BSEP的主要功能是从肝细胞中清除未缀合的和缀合的胆汁酸和盐。此外，BSEP表达指示天然组织内的极性。BSEP(针对BSEP蛋白用IHC染色)、白蛋白和DAPI的组织学可视化表明，BSEP在肝细胞白蛋白生产细胞中存在。图25示出了在打印后第10天两个生物打印的肝组织中BSEPmRNA相对于持家基因RNA(18sRNA)的相对量的计算。BSEP的可检测水平支持组织学发现。

相比于在数天后失去功能的二维初级肝细胞，生物打印的三维肝组织构建体显示出活性CYP3A4酶的持续可诱导性(可被维拉帕米抑制)。见图26。

三维生物打印的肝组织显示出对已知肝毒物的类似天然的响应，该毒物包括双氯芬酸、曲伐沙星和甲氨蝶呤。图27示出了在中度剂量双氯芬酸下CYP3A4的诱导，随后在较高剂量下损伤，如根据乳酸脱氢酶(LDH)所测量的。图28示出了在曲伐沙星相对于左氧氟沙星的多剂量研究中观察到的白蛋白的减少和LDH的增加(n＝3，在4天中2个剂量)。观察到曲伐沙星的作用较接近于临床C_max(约4μM)。这与没有观察到LDH诱导的传统二维初级肝细胞培养物形成对比。图29示出了在甲氨蝶呤的多剂量研究中观察到的活力(通过ATP-细胞滴度glo所测量的)和白蛋白的减少和LDH的增加(n＝3，每天给药持续7天)。

三维生物打印的肝组织显示出对生理学相关分子如维生素D的类似天然的响应。维生素D对保持体内稳态很重要。维生素D可以通过饮食摄入而获得或由皮肤内的细胞合成。肝将维生素D加工成对骨形成/维护很重要的代谢物，并加工成可以被肾脏排出的形式。维生素D还刺激肝脏中CYP3A4的表达，并可以潜在地影响药物的生物利用度。进行了用1、5、10μM的维生素D处理的生物打印的三维肝组织的转录谱分析。进行了CYP3A4转录物的相对表达的测量。图30示出，对于5和10μM维生素D处理，CYP3A4活性分别被刺激了约7倍和4倍。

实施例7-引入枯否细胞的功能性肝组织的生物打印

枯否细胞的引入使得能够研究Organovo的3D肝组织的免疫学方面。将枯否细胞以生理学相关的百分比引入到生物打印的肝构建体内。该构建体以剂量依赖性的方式响应于LPS刺激(LPS:大肠杆菌0127:B8；Sigma)。见图31。将枯否细胞以生理学相关的百分比(约12％)生物打印到生物打印的肝构建体中。该构建体以剂量依赖性的方式响应于LPS刺激。IL-10和TNF-α是相反的细胞因子。IL-10的表达降低TNF-α的表达。这在生物打印的3D肝组织内观察到，并且在100μg/ml剂量的LPS时最显著。见图32。

实施例8-引入肝窦内皮细胞的功能性肝组织的生物打印

肝窦内皮细胞的引入使得能够研究三维生物打印的肝组织的免疫学方面。肝窦内皮细胞(HSEC)是天然肝脏内皮细胞群体。图33示出了HSEC的二维单层。这些细胞具有独特的特征，包括用于免疫学应答的细胞信号传导。HSEC通过在2D培养物中产生IL-6而响应于LPS，在图34中示出。相反，当HUVEC受LPS刺激时，其不产生可检测量的IL-6。当引入生物打印过程中时，HSEC产生融合的3D肝组织。图35示出了含有HSEC的融合的三维肝组织。为产生该组织，将肝窦内皮细胞引入到非实质部分中，产生融合的结构。

实施例9-小分子渗透

进行实验以确定小分子是否能够贯穿三维生物打印的肝组织而渗透。将5-(和-6)-羧基-2',7'二氯荧光素二乙酸盐以1μM补充到3D肝组织的培养基中，持续24小时。用1ml的HBSS缓冲液漂洗构建体并吸出洗涤缓冲液。此过程重复3次。添加OCT包埋溶液，并将该构建体骤冻，并进行冷冻切片。用FITC通道在495nm处激发对5微米切片进行可视化。分子5-(和-6)-羧基-2',7'二氯荧光素二乙酸盐的荧光组分在此波长激发。该切片进入构建体内约150微米，并且到处都观察到荧光标记的化合物。5-(和-6)-羧基-2',7'二氯荧光素二乙酸盐的分子量为529.28。图36示出了冷冻切片的3D肝组织在5X下的FITC成像，显示出小分子渗透。

尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对本领域技术人员而言显而易见的是：这些实施方案仅仅是以示例的方式提供的。本领域技术人员在不偏离本发明下，现在将想到多种变化、改变和替代。应当理解，本文中描述的本发明实施方案的各种替代方案任选地用于实施本发明。

Claims (31)

1.一种工程化的、活的三维肝组织构建体，该构建体包含至少一个限定平面几何形状的区室，该区室包含由边部限定的内部，该内部包含实质细胞，该边部包含非实质细胞；所述细胞凝聚形成活的三维肝组织构建体；条件是该构建体的至少一个部分是生物打印的并且该构建体在使用时基本上不含预形成的支架。

2.根据权利要求1所述的构建体，其中所述实质细胞源自以下来源中的一种或多种：成年哺乳动物肝组织；胎儿哺乳动物肝组织；胚胎干细胞(ESC)；ESC衍生的肝细胞样细胞、诱导多能干细胞(iPSC)；iPSC衍生的肝细胞样细胞；源自肝脏的成体干细胞/祖细胞；和源自非肝脏的组织的成体干细胞/祖细胞。

3.根据权利要求1所述的构建体，其中所述非实质细胞包括以下一种或多种：血管细胞、内皮细胞、成纤维细胞、间充质细胞、免疫细胞、枯否细胞、星形细胞、胆管上皮细胞、胆管上皮样细胞、窦内皮细胞、源自肝脏的干细胞/祖细胞以及非源自肝脏的干细胞/祖细胞。

4.根据权利要求1所述的构建体，其包含多个层。

5.根据权利要求4所述的构建体，其中至少一个层在组成上或结构上与至少一个其他层不同，以创建层状几何形状。

6.根据权利要求1所述的构建体，其用于人体中的一种或多种肝功能的加强。

7.根据权利要求6所述的构建体，其用于植入受试者中的损伤、病变或退化部位处。

8.根据权利要求1所述的多个工程化的、活的三维肝组织构建体，该构建体排列成阵列以供体外分析使用。

9.根据权利要求8所述的阵列，其用于以下的一种或多种：药物发现；药物测试；临床前研究；毒性测试；吸收、分布、代谢和排泄试验(ADME)；药物代谢和药代动力学试验(DMPK)；疾病建模；传染病建模；宿主疾病建模；三维生物学研究；和基于细胞的筛选。

10.一种工程化的、活的三维肝组织构建体，其包含：一个或多个层，每个层包含一种或多种肝细胞类型，该一个或多个层凝聚以形成活的三维肝组织构建体，该构建体的特征在于具有如下的至少一种：

a.至少一个包含多种细胞类型的层，该细胞类型相对于彼此空间排列，以创建平面几何形状；和

b.多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其他层不同，以创建层状几何形状。

11.根据权利要求10所述的构建体，其中所述构建体的至少一个部分是生物打印的。

12.根据权利要求10所述的构建体，其中所述构建体在使用时基本不含预形成的支架。

13.根据权利要求10所述的构建体，其中所述肝细胞源自以下来源中的一种或多种：成年哺乳动物肝组织；胎儿哺乳动物肝组织；胚胎干细胞(ESC)；ESC衍生的肝细胞样细胞、诱导多能干细胞(iPSC)；iPSC衍生的肝细胞样细胞；源自肝脏的成体干细胞/祖细胞；和源自非肝脏的组织的成体干细胞/祖细胞。

14.根据权利要求10所述的构建体，其进一步包含以下细胞类型中的一种或多种：血管细胞、内皮细胞、实质细胞、非实质细胞、成纤维细胞、间充质细胞、免疫细胞、癌细胞、枯否细胞、星形细胞、胆管细胞、窦内皮细胞、源自肝脏的干细胞/祖细胞以及非源自肝脏的干细胞/祖细胞。

15.根据权利要求10所述的构建体，其用于人体中的一种或多种肝功能的加强。

16.根据权利要求15所述的构建体，其用于植入受试者中的损伤、病变或退化部位处。

17.根据权利要求10所述的多个工程化、活的三维肝组织构建体，该构建体排列成阵列以供体外分析使用。

18.根据权利要求17所述的阵列，其用于以下的一种或多种：药物发现；药物测试；临床前研究；毒性测试；吸收、分布、代谢和排泄试验(ADME)；药物代谢和药代动力学试验(DMPK)；疾病建模；传染病建模；宿主疾病建模；三维生物学研究；和基于细胞的筛选。

19.一种制造活的三维肝组织构建体的方法，其包括：

a.制备一种或多种包含非实质细胞的生物墨水；

b.制备一种或多种包含实质细胞的生物墨水；

c.将所述生物墨水沉积到支持体上；并且

d.温育该沉积的生物墨水约1小时到约30天，以形成包含至少一个区室的活的三维肝组织构建体，该区室包含由包含非实质细胞的边部限制的包含实质细胞的内部。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述非实质细胞包括以下一种或多种：血管细胞、内皮细胞、成纤维细胞、间充质细胞、免疫细胞、癌细胞、枯否细胞、星形细胞、胆管上皮细胞、胆管上皮样细胞、窦内皮细胞、源自肝脏的干细胞/祖细胞以及非源自肝脏的干细胞/祖细胞。

21.根据权利要求19所述的方法，其中所述实质细胞源自以下来源中的一种或多种：成年哺乳动物肝组织；胎儿哺乳动物肝组织；胚胎干细胞(ESC)；ESC衍生的肝细胞样细胞、诱导多能干细胞(iPSC)；iPSC衍生的肝细胞样细胞；源自肝脏的成体干细胞/祖细胞；和源自非肝脏的组织的成体干细胞/祖细胞。

22.根据权利要求19所述的方法，其中所述构建体的至少一个部分是生物打印的。

23.根据权利要求19所述的方法，其中所述构建体在使用时基本不含任何预形成的支架。

24.根据权利要求19所述的方法，其中所述构建体是不受神经支配的。

25.一种制造活的三维肝组织构建体的方法，其包括将沉积到支持体上的一种或多种包含非实质细胞的生物墨水和一种或多种包含实质细胞的生物墨水温育约1小时到约30天以形成活的三维肝组织构建体，该构建体包含至少一个区室，该区室包含由包含非实质细胞的边部限制的包含实质细胞的内部。

26.一种工程化的、活的三维肝组织构建体，其包含一个或多个层，至少一个层包含至少两种细胞类型，该至少两种细胞类型包含实质肝细胞类型和非实质肝细胞类型，该至少两种细胞类型相对于彼此空间排列以创建平面几何形状，该平面几何形状包含至少一个实质肝细胞区室和至少一个非实质肝细胞区室，该一个或多个层凝聚以形成活的三维肝组织构建体，条件是该活的三维肝组织构建体在体外培养中保持基本存活至少7天并具有以下肝特征中的至少两种：

a.合成胆固醇；

b.储存脂质；

c.储存糖原；

d.表达肝特异性蛋白质，该蛋白质包括以下的两种或更多种：白蛋白、纤维蛋白原、转铁蛋白、CYP450、α-1-抗胰蛋白酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、糖原合酶、因子VIII和因子IX；

e.对肝调节物有响应，该肝调节物包括以下的一种或多种：激素、诱导物、毒物、药物、抗体、干扰RNA、小RNA、锁定核酸、病毒、细菌、寄生虫和炎症诱导剂；

f.对肝毒物有响应，该肝毒物包括以下的一种或多种：醋氨酚、醇、曲伐沙星、甲氨蝶呤、双氯芬酸、曲格列酮、丙戊酸和胺碘酮；

g.表达转运蛋白，该转运蛋白包括以下的一种或多种：BSEP、OATP1B1、NTCP、PGP、BCRP、OATP1B3、ABCB4、ATP8B1、多药抗药性转运蛋白(MDR)；

h.制造后保持至少一些静止星形细胞；以及

i.包含微血管结构。

27.根据权利要求26所述的肝组织构建体，其中所述构建体在体外培养中保持基本存活至少14天。

28.根据权利要求27所述的肝组织构建体，其中所述构建体在体外培养中保持基本存活至少28天。

29.根据权利要求28所述的肝组织构建体，其中所述构建体在体外培养中保持基本存活至少40天。

30.根据权利要求26所述的肝组织构建体，其中所述至少两种细胞类型包括来源于诱导多能干细胞(iPSC)的细胞。

31.根据权利要求26所述的肝组织构建体，其中所述至少两种细胞类型包括来源于单核细胞或巨噬细胞的髓系细胞。