CN105132439A - 改进的疫苗及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

公开了改进的抗-HIV免疫原以及编码它们的核酸分子。公开的免疫原包括：具有HIV亚型A包膜蛋白共有序列的免疫原，具有HIV亚型B包膜蛋白共有序列的免疫原，具有HIV亚型C包膜蛋白共有序列的免疫原，具有HIV亚型D包膜蛋白共有序列的免疫原，具有HIV亚型B共有Nef-Rev蛋白共有序列的免疫原，以及具有HIV？Gap蛋白亚型A、B、C和D共有序列的免疫原。公开了改进的抗-HPV免疫原以及编码它们的核酸分子；改进的抗-HCV免疫原以及编码它们的核酸分子；改进的hTERT免疫原以及编码它们的核酸分子；以及改进的抗-流感免疫原以及编码它们的核酸分子。还公开了包含活的减毒病原体的药物组合物、重组疫苗以及诱导个体产生抗HIV、HPV、HCV、hTERT和流感的免疫应答的方法。

Description

改进的疫苗及其使用方法
发明领域
本发明涉及改进的HIV、HPV、HCV、流感和癌症疫苗，诱导免疫应答的改进方法，以及对个体进行预防性和/或治疗性免疫以抵抗HIV、HPV、HCV、流感和癌症的改进方法。
发明背景
HIV基因组由于高突变率和功能补偿而高度可塑。这种高突变率受至少两种机制驱动：病毒逆转录酶(RT)的低保真性导致每轮复制至少产生一个突变，以及抗-逆转录病毒细胞因子APOBEC3G基因和病毒感染性因子Vif附加基因的双重作用。每轮复制中会产生含各种可能的突变和许多双重突变的基因组，从而导致巨大的抗原多样性。因此，已经争论过衍生自单个分离物的候选疫苗可能不能引发充足的交叉反应以抵御各种循环HIV病毒。最近的研究显示，共有免疫原(Gao，F.等2005.Antigenicityandimmunogenicityofasynthetichumanimmunodeficiencyvirustype1groupmconsensusenvelopeglycoprotein(合成的人免疫缺陷病毒1型m群共有包膜糖蛋白的抗原性和免疫原性).JVirol79:1154-63.；Scriba，T.J.等2005.衍生自亚萨哈拉亚型C人免疫缺陷病毒1型共有序列的功能灭活和免疫原性Tat、Rev和NefDNA疫苗(Functionally-inactiveandimmunogenicTat,RevandNefDNAvaccinesderivedfromsub-SaharansubtypeChumanimmunodeficiencyvirustype1consensussequences).Vaccine23:1158-69)或祖先免疫原(Doria-Rose，N.A.等2005.人免疫缺陷病毒1型亚型B祖先包膜蛋白在家兔中具有功能并引发类似于循环亚型B包膜所引发抗体的中和抗体(HumanImmunodeficiencyVirusType1subtypeBAncestralEnvelopeProteinIsFunctionalandElicitsNeutralizingAntibodiesinRabbitsSimilartoThoseElicitedbyaCirculatingSubtypeBEnvelope).J.Virol.79:11214-11224；Gao，F.等2004.集中的免疫原作为克服HIV-1多样性的疫苗策略(CentralizedimmunogensasavaccinestrategytoovercomeHIV-1diversity).ExpertRev.疫苗3:S161-S168；Mullins，J.I.等2004.免疫原序列：第四代AIDS疫苗的设计(Immunogensequence:thefourthtierofAIDSvaccinedesign).ExpertRev.疫苗3:S151-S159；Nickle，D.C.等2003.共有和祖先状态HIV疫苗(ConsensusandancestralstateHIVvaccines).Science299:1515-1517)能用于这一方面。然而，这些方法的初步研究显示，这些免疫原诱导的细胞免疫增强相对较低。
最近，Derdeyn等分析了八种非洲异性传播对的HIV-1亚型C包膜糖蛋白序列，发现V1、V2和V4长度较短和聚糖较少是从早期递质获得的序列的共有特征(Derdeyn，C.A.等2004.异性传播后的包膜约束中和敏感性HIV-1(Envelope-constrainedneutralization-sensitiveHIV-1afterheterosexualtransmission).Science303:2019-2022.)。这些数据提示，模拟这种病毒的抗原可能与早期传播病毒有关。然而未在所有亚型中观察到这种早期递质结构(Chohan，B.等2005.选择某些遗传亚型传播期间出现的并和影响病毒RNA水平的具有较短V1-V2环序列的1型人免疫缺陷病毒包膜糖基化变体(SelectionforHumanImmunodeficiencyVirusType1envelopeglycosylationvariantswithshorterV1-V2loopsequencesoccursduringtransmissionofcertaingeneticsubtypesandmayimpactviralRNAlevels)J.Virol.79:6528-6531)。然而，在包膜免疫原中掺入较短V环可能有其他益处，如增强可溶性CD4的敏感性(Pickora，C.等2005.鉴定在除去之后能增强可溶性CD4敏感性的猿免疫缺陷病毒糖蛋白核心内的两个N-连接糖基化位点(IdentificationoftwoN-linkedglycosylationsiteswithinthecoreoftheSimianImmunodificiencyvirusglycoproteinwhoseremovalenhancessensitivitytosolubleCD4).J.Virol.79:12575-12583)，是应该考虑的。
研究显示，HIV-1特异性CTL应答对于控制急性和无症状感染期间的病毒载量以及AIDS发生是重要的。然而，还不清楚目前基于包膜的DNA疫苗是否如所需那么有效。已采用一些方法来提高HIV-1免疫原的表达水平，所述方法如密码子优化(Andre，S.等1998.用采用优化密码子的合成gp120序列增强接种DNA疫苗引发的免疫应答(IncreasedimmuneresponseelicitedbyDNAvaccinationwithasyntheticgp120sequencewithoptimizedcodonusage).JVirol72:1497-503；Deml，L.等A.2001.密码子优化对于编码人免疫缺陷病毒1型gag蛋白的DNA候选疫苗的表达和免疫原性的多重功效(MultipleeffectsofcodonusageoptimizationonexpressionandimmunogenicityofDNAcandidatevaccinesencodingthehumanimmunodeficiencyvirustype1gagprotein).J.Virol.75:10991-11001)，RNA优化(Muthumani，K.等2003.新的基因工程HIV-1东非进化支-Agp160质粒构建物在体内诱导强体液免疫应答和细胞介导的免疫应答(NovelengineeredHIV-1EastAfricanClade-Agp160plasmidconstructinducesstronghumoralandcell-mediatedimmuneresponsesinvivo).Virology314:134-46；Schneider，R.，M.等1997.灭活人免疫缺陷病毒1型抑制元件造成Gag和Gag/蛋白酶不依赖于Rev表达和颗粒形成(Inactivationofthehumanimmunodeficiencyvirustype1inhibitoryelementsallowsRev-independentexpressionofGagandGag/proteaseandparticleformation)J.Virol.71:4892-4903)以及能削弱RNA二级结构的免疫球蛋白前导序列的加入(Yang，J.S.等.2001.诱导新型DNA疫苗对西尼罗病毒纽约分离株(WNV-NY1999)的有效Th1-型免疫应答(InductionofpotentTh1-TypeimmuneresponsesfromanovelDNAvaccineforWestNileVirusNewYorkIsolate(WNV-NY1999)).J.InfectDiseases184:809-816)。
人乳头瘤病毒(HPV)具有循环dsDNA基因组(7,000-8,000碱基对)。最多有200种不同基因型。在系统发生上HPV是高度保守的。粘膜HPV可归类为“高风险”或“低风险”。低风险群包括6、11、42型和其他类型。相关疾病包括：生殖器疣；低级宫颈、直肠、外阴、阴道发育异常；和复发性呼吸道乳头状瘤病。高风险群包括16、18、31、33、45、52、58型和其他类型。相关疾病包括：宫颈癌、癌前发育异常的实质病因；直肠、外阴、阴道、扁桃体癌的主要病因；以及其他呼吸消化道癌症的辅因素。每天有800名妇女死于宫颈癌。
HPVE6和E7蛋白是肿瘤-特异性抗原，是肿瘤发生和维持肿瘤状态所必需的。宫颈癌患者没有E7-特异性免疫应答。E6和E7蛋白与人肿瘤细胞抑制基因产物特异性相互作用，E6与p53，E7与Rb(视网膜母细胞瘤肿瘤抑制基因)。E6和E7是理想的免疫疗法靶点。
hTERT是人端粒酶逆转录酶，它在端粒的末端合成TTAGGG标签从而防止因染色体缩短造成的细胞死亡。胚胎细胞和一些生殖谱系细胞通常表达hTERT来调节细胞群的内稳态。然而，癌细胞利用这一调节机制来破坏细胞群的内稳态。例如，超过85％的人类癌细胞过表达hTERT。因此，hTERT是理想的免疫治疗靶点。
hTERT还能增强免疫治疗以抵抗因HCV或HPV感染而表达hTERT的超增生性细胞。来自高风险HPV类型的E6癌蛋白在人角质形成细胞内激活人端粒酶逆转录酶(hTERT)的转录。肝脏内的发育异常区域和早期肿瘤形成区域也以异常高的水平表达hTERT。因此，通过靶向以异常水平表达hTERT的细胞能增强针对HPV和HCV的免疫疗法。同时采用hTERT和HPV或HCV蛋白或者编码这种蛋白质的核酸的联合免疫疗法是有吸引力的免疫疗法。
流感血凝素(HA)在流感病毒粒子表面表达并负责病毒与其宿主细胞的初次接触。HA是熟知的免疫原。甲型流感毒株H1N5(一种禽流感毒株)对人类的威胁尤其巨大，这是由于与病毒的其他毒株相比，它们的HA蛋白如果经天然突变而轻微遗传重配会大大增加对人类细胞的感染性。婴儿和老年人或免疫受损的成年人感染H1N5株病毒通常造成严重的临床后果。因此，HA和流感H1N5毒株的其他流感分子是理想的免疫治疗靶点。
发明内容
本发明涉及核酸构建物以及编码的蛋白，从而提供了改进的免疫原性靶，可产生针对该靶点的抗-HIV免疫应答。
本发明提供了HIV亚型A包膜蛋白的共有序列，HIV亚型B包膜蛋白的共有序列，HIV亚型C包膜蛋白的共有序列，HIV亚型D包膜蛋白的共有序列，HIV亚型B共有Nef-Rev蛋白的共有序列，以及HIVGag蛋白亚型A、B、C和D的共有序列。
本发明提供了编码这种蛋白质序列的构建物，包含这种蛋白质的疫苗和/或编码这种蛋白质的核酸分子，以及诱导抗-HIV免疫应答的方法。
本发明涉及包含选自下组的核苷酸序列的核酸分子：SEQIDNO:1；SEQIDNO:1的片段；与SEQIDNO:1具有至少90％同源性的序列；与SEQIDNO:1具有至少90％同源性的序列的片段；SEQIDNO:3；SEQIDNO:3的片段；与SEQIDNO:3具有至少90％同源性的序列；与SEQIDNO:3具有至少90％同源性的序列的片段；SEQIDNO:5；SEQIDNO:5的片段；与SEQIDNO:5具有至少90％同源性的序列；与SEQIDNO:5具有至少90％同源性的序列的片段；SEQIDNO:7；SEQIDNO:7的片段；与SEQIDNO:7具有至少90％同源性的序列；与SEQIDNO:7具有至少90％同源性的序列的片段；SEQIDNO:9；SEQIDNO:9的片段；与SEQIDNO:9具有至少90％同源性的序列；与SEQIDNO:9具有至少90％同源性的序列的片段；SEQIDNO:11；SEQIDNO:11的片段；与SEQIDNO:11具有至少90％同源性的序列；与SEQIDNO:11具有至少90％同源性的序列的片段。
本发明涉及编码选自下组的蛋白质的核酸分子：SEQIDNO:16；SEQIDNO:17；SEQIDNO:18；SEQIDNO:19；SEQIDNO:20和SEQIDNO:21。
本发明涉及包含选自下组的核苷酸序列的核酸分子：编码SEQIDNO:2的核苷酸序列；编码与SEQIDNO:2具有至少90％同源性的氨基酸序列的核苷酸序列；编码SEQIDNO:2的核苷酸序列的片段；编码与SEQIDNO:2具有至少90％同源性的氨基酸序列的核苷酸序列的片段；编码SEQIDNO:4的核苷酸序列；编码与SEQIDNO:4具有至少90％同源性的氨基酸序列的核苷酸序列；编码SEQIDNO:4的核苷酸序列的片段；编码与SEQIDNO:4具有至少90％同源性的氨基酸序列的核苷酸序列；编码SEQIDNO:6的核苷酸序列；编码与SEQIDNO:6具有至少90％同源性的氨基酸序列的核苷酸序列；编码SEQIDNO:6的核苷酸序列的片段；编码与SEQIDNO:6具有至少90％同源性的氨基酸序列的核苷酸序列的片段；编码SEQIDNO:8的核苷酸序列；编码与SEQIDNO:8具有至少90％同源性的氨基酸序列的核苷酸序列；编码SEQIDNO:8的核苷酸序列的片段；编码与SEQIDNO:8具有至少90％同源性的氨基酸序列的核苷酸序列；编码SEQIDNO:10的核苷酸序列；编码与SEQIDNO:10具有至少90％同源性的氨基酸序列的核苷酸序列；编码SEQIDNO:10的核苷酸序列的片段；编码与SEQIDNO:10具有至少90％同源性的氨基酸序列的核苷酸序列的片段；编码SEQIDNO:12的核苷酸序列；编码与SEQIDNO:12具有至少90％同源性的氨基酸序列的核苷酸序列；编码SEQIDNO:12的核苷酸序列的片段；编码与SEQIDNO:12具有至少90％同源性的氨基酸序列的核苷酸序列。
本发明还提供了包含这种核酸分子的药物组合物以及它们在诱导个体产生针对HIV的免疫应答的方法中的应用，该方法包括给予个体包含这种核酸分子的组合物。
本发明还提供了包含这种核酸分子的重组疫苗以及它们在诱导个体产生针对HIV的免疫应答的方法中的应用，该方法包括给予个体这种重组疫苗。
本发明还提供了包含这种核酸分子的活的减毒病原体以及它们在诱导个体产生针对HIV的免疫应答的方法中的应用，该方法包括给予个体这种活的减毒病原体。
活的减毒病原体
本发明还提供了包含选自下组的氨基酸序列的蛋白质：SEQIDNO:2；与SEQIDNO:2具有至少90％同源性的序列；SEQIDNO:2的片段；与SEQIDNO:2具有至少90％同源性的序列的片段；SEQIDNO:4；与SEQIDNO:4具有至少90％同源性的序列；SEQIDNO:的片段；与SEQIDNO:4具有至少90％同源性的序列的片段；SEQIDNO:6；与SEQIDNO:6具有至少90％同源性的序列；SEQIDNO:6的片段；与SEQIDNO:6具有至少90％同源性的序列的片段；SEQIDNO:8；与SEQIDNO:8具有至少90％同源性的序列；SEQIDNO:8的片段；与SEQIDNO:8具有至少90％同源性的序列的片段；SEQIDNO:10；与SEQIDNO:10具有至少90％同源性的序列；SEQIDNO:10的片段；与SEQIDNO:10具有至少90％同源性的序列的片段；SEQIDNO:12；与SEQIDNO:12具有至少90％同源性的序列；SEQIDNO:12的片段；以及与SEQIDNO:12具有至少90％同源性的序列的片段。
本发明还提供了包含选自下组的氨基酸序列的蛋白质：SEQIDNO:16；SEQIDNO:17；SEQIDNO:18；SEQIDNO:19；SEQIDNO:20和SEQIDNO:21。
本发明还提供了包含这种蛋白质的药物组合物以及它们在诱导个体产生针对HIV的免疫应答的方法中的应用，该方法包括给予个体包含这种蛋白质的组合物。
本发明还提供了包含这种蛋白质的重组疫苗以及它们在诱导个体产生针对HIV的免疫应答的方法中的应用，该方法包括给予个体这种重组疫苗。
本发明还提供了包含这种蛋白质的活的减毒病原体以及它们在诱导个体产生针对HIV的免疫应答的方法中的应用，该方法包括给予个体这种活的减毒病原体。
提供了包含HPV基因型16E6-E7共有氨基酸序列的蛋白质以及包含编码这种蛋白质的核苷酸序列的核酸分子。
本发明涉及包含选自下组的核苷酸序列的核酸分子：SEQIDNO:22；其片段；与SEQIDNO:22具有至少90％同源性的核苷酸序列；以及它们的片段。
本发明还涉及包含选自下组的核苷酸序列的核酸分子：编码SEQIDNO:23的核酸序列；编码SEQIDNO:24的核酸序列；编码SEQIDNO:25的核酸序列；编码SEQIDNO:26的核酸序列；和编码SEQIDNO:27的核酸序列。
本发明还涉及包含这种核酸分子的药物组合物以及诱导个体产生针对HPV的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体包含这种核酸分子的组合物。
本发明还涉及包含这种核酸分子的重组疫苗以及诱导个体产生针对HPV的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体这种重组疫苗。
本发明还涉及包含这种核酸分子的活的减毒病原体以及诱导个体产生针对HPV的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体这种活的减毒病原体。
本发明还涉及包含选自下组的核苷酸序列的核酸分子：包含选自下组的氨基酸序列的蛋白质：SEQIDNO:23；其片段；与SEQIDNO:23具有至少90％同源性的核苷酸序列；以及它们的片段。
本发明还涉及包含选自下组的氨基酸序列的蛋白质：SEQIDNO:23；SEQIDNO:24；SEQIDNO:25；SEQIDNO:26；和SEQIDNO:27。
本发明还涉及包含这种蛋白质的药物组合物以及诱导个体产生针对HPV的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体包含这种蛋白质的组合物。
本发明还涉及包含这种蛋白质的重组疫苗以及诱导个体产生针对HPV的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体这种重组疫苗。
本发明还涉及包含这种蛋白质的活的减毒病原体以及诱导个体产生针对HPV的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体这种活的减毒病原体。
提供了包含HPV基因型1a和1bE1-E2共有氨基酸序列的蛋白质以及包含编码这种蛋白质的核苷酸序列的核酸分子。
本发明涉及包含选自下组的核苷酸序列的核酸分子：SEQIDNO:30；其片段；与SEQIDNO:30具有至少90％同源性的核苷酸序列；以及它们的片段。
本发明还涉及包含选自下组的核苷酸序列的核酸分子：编码SEQIDNO:31的核酸序列。
本发明还涉及包含这种核酸分子的药物组合物以及诱导个体产生针对HCV的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体包含这种核酸分子的组合物。
本发明还涉及包含这种核酸分子的重组疫苗以及诱导个体产生针对HCV的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体这种重组疫苗。
本发明还涉及包含这种核酸分子的活的减毒病原体以及诱导个体产生针对HCV的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体这种活的减毒病原体。
本发明还涉及包含选自下组的核苷酸序列的核酸分子：包含选自下组的氨基酸序列的蛋白质：SEQIDNO:31；其片段；与SEQIDNO:31具有至少90％同源性的核苷酸序列；以及它们的片段。
本发明还涉及包含这种蛋白质的药物组合物以及诱导个体产生针对HCV的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体包含这种蛋白质的组合物。
本发明还涉及包含这种蛋白质的重组疫苗以及诱导个体产生针对HCV的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体这种重组疫苗。
本发明还涉及包含这种蛋白质的活的减毒病原体以及诱导个体产生针对HCV的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体这种活的减毒病原体。
提供了包含hTERT共有氨基酸序列的蛋白质以及包含编码这种蛋白质的核苷酸序列的核酸分子。
本发明还涉及包含选自下组的核苷酸序列的核酸分子：SEQIDNO:34；其片段；与SEQIDNO:34具有至少90％同源性的核苷酸序列；以及它们的片段。
本发明还涉及包含这种核酸分子的药物组合物以及诱导个体产生针对表达hTERT的超增生性细胞的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体包含这种核酸分子的组合物。
本发明还涉及包含这种核酸分子的重组疫苗以及诱导个体产生针对表达hTERT的超增生性细胞的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体这种重组疫苗。
本发明还涉及包含这种核酸分子的活的减毒病原体以及诱导个体产生针对表达hTERT的超增生性细胞的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体这种活的减毒病原体。
本发明还涉及包含选自下组的核苷酸序列的核酸分子：包含选自下组的氨基酸序列的蛋白质：SEQIDNO:35；其片段；与SEQIDNO:35具有至少90％同源性的核苷酸序列；以及它们的片段。
本发明还涉及包含这种蛋白质的药物组合物以及诱导个体产生针对表达hTERT的超增生性细胞的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体包含这种蛋白质的组合物。
本发明还涉及包含这种蛋白质的重组疫苗以及诱导个体产生针对表达hTERT的超增生性细胞的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体这种重组疫苗。
本发明还涉及包含这种蛋白质的活的减毒病原体以及诱导个体产生针对表达hTERT的超增生性细胞的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体这种活的减毒病原体。
提供了包含流感H5N1共有HA氨基酸序列、流感H1N1和H5N1共有NA氨基酸序列、流感H1N1和H5N1共有M1氨基酸序列、和流感H5N1共有M2E-NP氨基酸序列的蛋白质，以及包含编码这种蛋白质的核苷酸序列的核酸分子。
本发明还涉及包含选自下组的核苷酸序列的核酸分子：SEQIDNO:36；其片段；与SEQIDNO:36具有至少90％同源性的核苷酸序列；以及它们的片段。
本发明还涉及包含选自下组的核苷酸序列的核酸分子：SEQIDNO:38；其片段；与SEQIDNO:38具有至少90％同源性的核苷酸序列；以及它们的片段。
本发明还涉及包含选自下组的核苷酸序列的核酸分子：SEQIDNO:40；其片段；与SEQIDNO:40具有至少90％同源性的核苷酸序列；以及它们的片段。
本发明还涉及包含选自下组的核苷酸序列的核酸分子：SEQIDNO:42；其片段；与SEQIDNO:42具有至少90％同源性的核苷酸序列；以及它们的片段。
本发明还涉及包含这种核酸分子的药物组合物以及诱导个体产生针对HPV、HCV和流感病毒的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体包含这种核酸分子的组合物。
本发明还涉及包含这种核酸分子的重组疫苗以及诱导个体产生针对HPV、HCV和流感病毒的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体这种重组疫苗。
本发明还涉及包含这种核酸分子的活的减毒病原体以及诱导个体产生针对HPV、HCV和流感病毒的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体这种活的减毒病原体。
本发明还涉及包含这种核酸分子的药物组合物以及诱导个体产生针对HPV、HCV和流感病毒的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体包含这种核酸分子的组合物。
本发明还涉及包含这种核酸分子的重组疫苗以及诱导个体产生针对HPV、HCV和流感病毒的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体这种重组疫苗。
本发明还涉及包含这种核酸分子的活的减毒病原体以及诱导个体产生针对HPV、HCV和流感病毒的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体这种活的减毒病原体。
本发明还涉及包含选自下组的氨基酸序列的蛋白质分子：SEQIDNO:37；其片段；与SEQIDNO:37具有至少90％同源性的核苷酸序列；以及它们的片段。
本发明还涉及包含选自下组的氨基酸序列的蛋白质分子：SEQIDNO:39；其片段；与SEQIDNO:39具有至少90％同源性的核苷酸序列；以及它们的片段。
本发明还涉及包含选自下组的氨基酸序列的蛋白质分子：SEQIDNO:41；其片段；与SEQIDNO:41具有至少90％同源性的核苷酸序列；以及它们的片段。
本发明还涉及包含选自下组的氨基酸序列的蛋白质分子：SEQIDNO:43；其片段；与SEQIDNO:43具有至少90％同源性的核苷酸序列；以及它们的片段。
本发明还涉及包含这种蛋白质分子的药物组合物以及诱导个体产生针对流感病毒的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体包含这种蛋白质分子的组合物。
本发明还涉及包含这种蛋白质分子的重组疫苗以及诱导个体产生针对流感病毒的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体这种重组疫苗。
本发明还涉及包含这种蛋白质分子的活的减毒病原体以及诱导个体产生针对流感病毒的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体这种活的减毒病原体。
本发明还涉及包含这种蛋白质分子的药物组合物以及诱导个体产生针对流感病毒的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体包含这种蛋白质分子的组合物。
本发明还涉及包含这种蛋白质分子的重组疫苗以及诱导个体产生针对流感病毒的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体这种重组疫苗。
本发明还涉及包含这种蛋白质分子的活的减毒病原体以及诱导个体产生针对流感病毒的免疫应答的方法，该方法包括给予所述个体这种活的减毒病原体。
附图简述
图1比较了EY2E1-B和EK2P-B的氨基酸序列。IgE前导序列用下划线表示。框内区域表示可变区。*表示参与CCR5应用的6个重要残基。切割位点用箭头表示。跨膜区用虚线显示。
图2显示了两种HIV-1亚型B包膜序列的系统发生关系。系统发生分析涉及42种HIV-1亚型B包膜序列、EY2E1-B、EK2P-B、两种亚型D和两种亚型C序列(外类群)。代表宽样品多样性的亚型B包膜序列来自以下11个国家：阿根廷(1)；澳大利亚(6)；中国(1)；法国(4)；德国(1)；大不列颠(2)；意大利(1)；日本(1)；荷兰(4)；西班牙(1)；美国(20)。EY2E1-B和EK2P-B序列用黑框表示。
图3显示了包膜免疫原的表达。图A显示了EY2E1-B和EK2P-B基因的Western印迹分析结果。RD细胞用不同质粒转染。48小时后收集细胞裂解液。样品通过Western印迹分析并用HIV-1gp120单克隆抗体(2G12)探测。加样对照的印迹条带用单克隆抗-肌动蛋白抗体重新探测。图B显示了EY2E1-B和EK2P-B基因的免疫荧光测定结果。表达包膜蛋白的转染的RD细胞显示典型的红色荧光。HIV-1包膜-特异性单克隆抗体F105作为第一抗体来源。
图4显示了免疫小鼠血清的总IgG抗体效价。图A显示了亚型B包膜-特异性抗体应答的测量结果。图B显示了亚型A/E包膜-特异性抗体应答的测量结果。图C显示了亚型C包膜-特异性抗体应答的测量结果。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测用DNA构建物pEY2E1-B和pEK2P-B免疫后的体液免疫应答。每只小鼠以两周为间隔肌内免疫三次，每次100μgDNA。第三次免疫1周后采集各组小鼠(n＝3)的血样，用封闭缓冲液稀释等量混合的血清并按照“材料和方法”中的描述进行分析。用pVAX免疫小鼠的混合血清用作对照。测量450nm的吸光度(OD)。各数据点代表每组三只小鼠血清的三次平均OD值以及三次独立试验所得ELISA值的平均值。
图5显示了pEY2E1-B在BalB/C小鼠和HLA-A2转基因小鼠中诱导细胞介导的免疫应答。通过ELISpot试验在BalB/C小鼠(图A)和转基因小鼠(图C)中测定用pEY2E1-B和pEK2P-B进行DNA免疫接种后每百万个脾细胞中亚型B共有包膜-特异性IFN-γ斑点形成细胞(SFC)的频率。还在BalB/C小鼠(图B)和转基因小鼠(图D)中测定了用pEY2E1-B和pEK2P-B进行DNA免疫接种后每百万个脾细胞中耗尽CD8的、亚型B共有包膜-特异性IFN-γ斑点形成细胞的频率。脾细胞分离自每只接种过的小鼠(每组三只小鼠)并在体外用重叠共有亚型B包膜肽混合物刺激。基础pVAX免疫的小鼠作为阴性对照。数值为平均值+IFN-γSFC平均值的标准差。(图E)表征亚型B共有包膜-特异性优势表位。分别从pEY2E1-B和pEK2P-B免疫接种的BalB/C小鼠收集的脾细胞与29种HIV-1亚型B共有包膜肽混合物一起培育24小时。通过上述ELISpot试验测定分泌IFN-γ的细胞。
图6显示pEY2E1-B在BalB/C小鼠和HLA-A2转基因小鼠内诱导的交叉反应性。通过IFN-γELISpot试验测定用pEY2E1-B和pEK2P-B免疫接种BalB/C小鼠而诱导的针对四种独立肽混合物的附加T-细胞免疫应答：HIV-1MN包膜肽(图A)、HIV-1群M(图B)、亚型C共有包膜肽(图C)以及两种亚型C分离包膜肽(图D和E)。还测定了用pEY2E1-B和pEK2P-B免疫接种HLA-A2转基因小鼠而诱导的针对四种独立肽混合物的附加T-细胞免疫应答：HIV-1MN包膜肽(图F)、HIV-1群M(图G)、亚型C共有包膜肽(图H)和两种亚型C分离包膜肽(图I和J)。基础pVAX免疫的小鼠作为阴性对照。
图7显示了pEY2E1-B和pEK2P-B免疫接种的BalB/C小鼠(图A)和HLA-A2转基因小鼠(图B)中的亚型BMN包膜-特异性优势表位的表征。分别从pEY2E1-B和pEK2P-B免疫接种的BalB/C小鼠和转基因小鼠收集的脾细胞与29种HIV-1亚型BMN包膜肽混合物一起培育24小时。通过上述ELISpot试验测定分泌IFN-γ的细胞。
图8为E72E1-B功能域的示意图(约700+氨基酸)。
图9为E72E1-B构建物的图谱。
图10A和B显示了E72E1-B诱导的强细胞免疫应答。
图11A和B显示了E72E1-B诱导的强烈广谱交叉反应性细胞免疫应答。
图12图A-D显示了E72E1-B诱导的强烈交叉-进化支细胞免疫应答。
图13是为实施例2的研究所设计的免疫原。
图14显示了系统发生关系：该系统发生分析包括36种HIV-1亚型C包膜序列、EY3E1-C、EK3P-C、两种亚型B、一种亚型A和一种亚型D序列(外类群)。代表宽样品多样性的亚型C包膜序列来自12个国家。
图15A和B显示了pEY3E1-C所引发细胞应答的研究数据。
图16显示了pEY3E1-C所引发细胞应答的研究数据。
图17A-D显示了同一进化支内pEY3E1-C所引发的交叉反应性细胞应答的研究数据。
图18A和B显示了pEY3E1-C所引发的交叉反应性细胞应答的研究数据。图A显示了亚型C(乌拉圭)env-特异性IFN-γ的ELISpot数据。图B显示了亚型C(南非)env-特异性IFN-γ的ELISpot数据。
图19A-F显示了两种进化支之间pEY3E1-C所引发的交叉反应性细胞应答的研究数据。
图20A-X显示了HIV-1gag共有构建物所引发的免疫应答的研究数据。
图21为HPV在生殖道上皮中的生活周期。
图22显示了HPV-16基因组的组成图。
图23显示了免疫原的设计：*表示对于p53结合和降解重要的缺失或突变；Δ表示Rb结合位点内的突变。
图24显示了遗传构建物p1667，其中包括HPVE6和E7蛋白的编码序列，以及遗传构建物pVAX，其为缺乏HPV插入物的基础质粒并被用作阴性对照。
图25A-D显示了DNA免疫原p1667诱导的细胞免疫应答。
图26显示了优势免疫表位作图结果。
图27显示了利用E6/E7DNA疫苗研究在C57/BL6小鼠中的保护作用的预防性实验的结果。
图28显示了利用E6/E7DNA疫苗研究在C57/BL6小鼠中的保护作用的肿瘤消退实验的结果。
图29显示了检测脾中E7四聚体阳性淋巴细胞的实验数据。
图30显示了检测肿瘤中E7四聚体阳性淋巴细胞的实验数据。
图31显示了转基因小鼠中DNA疫苗保护研究的数据。
图32显示在电穿孔(EP)后IM共注射质粒编码的IL-12能增强对HIV-1共有免疫原的细胞免疫应答。IFNγELISpot在(a)首次免疫，(b)第二次免疫，和(c)第三次免疫两周后进行(与另三个进行比较)。对env的反应用黑色柱表示，对gag的反应用白色柱表示，数据表示为叠加的组平均值应答±SEM。
图33显示肌内电穿孔增强了交叉反应性细胞免疫应答。免疫三次后通过IFNγELISpot测定pEY2E1-B免疫猕猴体内针对HIV-1群M肽的四种肽混合物的总T-细胞免疫应答。数据表示为叠加的组平均值±SEM。
图34显示IM电穿孔和质粒IL-12能增强对HIV-1免疫原的记忆应答。最后一次免疫5个月后进行ELISpot试验以测定用和不用IL-12质粒共免疫的IM和EP免疫组对gag和env的抗原-特异性记忆应答。数据表示为叠加的组平均值±SEM。
优选实施方式详述
定义
文中，术语"严格杂交条件"或"严格条件"指核酸分子将与另一核酸分子杂交但不与其他序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性且在不同情况下有所不同。较长序列在较高温度下特异性杂交。通常，严格条件选择在比特定序列在规定的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃。Tm是平衡时有50％的靶序列互补探针与该靶序列杂交的温度(在规定的离子强度、pH和核酸浓度下)。由于靶序列通常是过量的，因此在Tm下平衡时有50％的探针被占据。通常，严格条件为pH7.0-8.3时盐浓度小于约1.0M钠离子，通常约0.01-1.0M钠离子(或其他盐)，对于短的探针、引物或寡核苷酸(如10-50个核苷酸)温度至少约30℃，对于较长探针、引物或寡核苷酸温度至少约60℃。也可加入去稳定剂如甲酰胺来实现严格条件。
核苷酸和氨基酸的序列同源性可采用FASTA、BLAST和空位BLAST(Altschul等，Nuc.AcidsRes.，1997，25，3389，将其全文纳入本文作为参考)和PAUP*4.0b10软件(D.L.Swofford，SinauerAssociates，马萨诸塞州)测定。计算“相似性百分比”时采用PAUP*4.0b10软件(D.L.Swofford，SinauerAssociates，马萨诸塞州)。计算共有序列的平均相似性时与系统发生树中的所有序列进行比较(见图2和14)。
简言之，BLAST(局部序列比对基本检索工具)算法适用于确定序列相似性(Altschul等，J.Mol.Biol.，1990，215，403-410，将其全文纳入本文作为参考)。公众可通过国立生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得进行BLAST分析的软件。该算法包括首先通过在查询序列中鉴定长度为W的短字符而鉴定高评分序列对(HSP)，所述字符与数据库序列内相同长度的字符比对时匹配或满足一些正值阈值评分T。T表示相邻字符评分阈值(Altschul等，同上)。这些最初相邻字符选中(hit)作为开始检索的种子以寻找含有它们的HSP。字符选中在两个方向上沿各序列延伸直到累积比对评分增加。当满足以下条件时字符选中在各方向上的延伸终止：1)累积比对评分从其最大值降低X；2)由于累加了一个或多个负评分残基比对，累积评分达到0或负值；或3)达到任一序列的终点。Blast算法的参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。Blast程序采用的缺省字符长度(W)为11，BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，89，10915-10919，将其全文纳入本文作为参考)比对(B)为50，预期值(E)为10，M＝5，N＝4，并对两条链进行比较。BLAST算法(Karlin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993，90，5873-5787，将其全文纳入本文作为参考)和空位BLAST对两个序列之间的相似性进行统计分析。BLAST算法提供的一种相似性量度是最小总和概率(P(N))，它用来表示两个核苷酸序列之间随机发生匹配的可能性。例如，如果待测核酸与其他核酸比较时的最小总和概率小于约1，优选小于约0.1，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则认为该核酸与另一核酸类似。
文中，术语“遗传构建物"指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。编码序列包括操作性连接于调控元件的起始和终止信号，所述调控元件包括能够指导核酸分子所施用的个体的细胞表达的启动子和聚腺苷化信号。
文中，术语"可表达形式"指含有操作性连接于编码蛋白质的编码序列的必需调控元件的基因构建物，从而当其存在于个体细胞内时该编码序列将被表达。
概述
本发明利用多阶段(multi-phase)策略提供改进的疫苗，从而增强免疫原诱导的细胞免疫应答。产生了经过修饰的免疫原的共有序列。还公开了遗传修饰，包括密码子优化，RNA优化，以及加入高效免疫球蛋白前导序列以提高构建物的免疫原性。已经设计出这种新型免疫原以引发相比对应的密码子优化免疫原更加强烈且范围广的细胞免疫应答。
本发明提供了改进的HIV、HPV、HCV、流感和癌症疫苗，方法是在蛋白质以及编码该蛋白质的遗传构建物上提供能使它们极其有效地作为可分别诱导出抗-HIV、抗-HPV、抗-HCV、抗-流感和抗-hTert的免疫应答的免疫原的表位。因此，可提供疫苗以诱导出治疗性或预防性免疫应答。一些实施方式中，递送免疫原的方式是DNA疫苗、重组疫苗、蛋白质亚单位疫苗、包含免疫原的组合物、减毒疫苗或死疫苗。一些实施方式中，所述疫苗包含选自下组的物质的组合：一种或多种DNA疫苗，一种或多种重组疫苗，一种或多种蛋白质亚单位疫苗，一种或多种包含免疫原的组合物，一种或多种减毒疫苗以及一种或多种死疫苗。
根据本发明的一些实施方式，本发明所述疫苗被递送到个体以调节个体免疫系统的活性从而增强针对HIV、HPV、HCV、流感或hTERT的免疫应答。当编码蛋白质的核酸分子被个体的细胞摄入后核苷酸序列在细胞内表达从而将蛋白质递送到个体。本发明的某些方面提供了利用核酸分子如质粒递送蛋白质编码序列的方法，其作为重组疫苗的一部分、作为减毒疫苗的一部分、作为分离的蛋白质或载体的蛋白质部分。
根据本发明的一些方面，提供了预防性和/或治疗性免疫个体以抵抗HIV、HIV、HPV、HCV、流感和癌症的组合物和方法。
本发明涉及递送核酸分子的组合物，所述核酸分子包含操作性连接于调控元件的编码本发明蛋白质的核苷酸序列。本发明的某些方面涉及包含编码本发明蛋白质的核苷酸序列的组合物和重组疫苗；编码本发明蛋白质和/或包含本发明蛋白质的活的减毒病原体；包含本发明蛋白质的死病原体；或包含本发明蛋白质的组合物，如脂质体或亚单位疫苗。本发明还涉及包含该组合物的可注射药物组合物。
HIV
本发明利用多阶段策略提供改进的抗-HIV疫苗从而增强HIV免疫原诱导的细胞免疫应答。产生了修饰的免疫原共有序列。还披露了遗传修饰，包括密码子优化、RNA优化、以及加入高效免疫球蛋白前导序列以提高构建物的免疫原性。已经设计出新型免疫原来引发比相应的密码子优化免疫原更强更广的细胞免疫应答。
SEQIDNO:1是亚型A共有包膜DNA序列构建物。SEQIDNO:1包含HIV疫苗序列的编码序列，所述HIV疫苗序列包含与亚型A包膜蛋白的共有序列相连的IgE前导序列。SEQIDNO:2包含HIV疫苗序列构建物的氨基酸序列，其包含与亚型A包膜蛋白的共有序列相连的IgE前导序列。IgE前导序列为SEQIDNO:15。SEQIDNO:16是亚型A共有包膜蛋白序列。
在一些实施方式中，本发明的疫苗优选包含SEQIDNO:16，其片段，编码SEQIDNO:16的核酸分子，或其片段。在一些实施方式中，本发明的疫苗优选包含SEQIDNO:2或编码它的核酸分子。在一些实施方式中，本发明的疫苗优选包含SEQIDNO:1。本发明的疫苗优选包含IgE前导序列SEQIDNO:15或编码它的核酸序列。
SEQIDNO:1的片段可包含90个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:1的片段可包含180个或更多核苷酸；在一些实施方式中为270个或更多核苷酸；在一些实施方式中为360个或更多核苷酸；在一些实施方式中为450个或更多核苷酸；在一些实施方式中为540个或更多核苷酸；在一些实施方式中为630个或更多核苷酸；在一些实施方式中为720个或更多核苷酸；在一些实施方式中为810个或更多核苷酸；在一些实施方式中为900个或更多核苷酸；在一些实施方式中为990个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1080个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1170个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1260个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1350个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1440个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1530个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1620个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1710个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1800个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1890个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1980个或更多核苷酸；而在一些实施方式中为2070个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:1的片段可包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:1的片段不包含IgE前导序列的编码序列。所述片段可包含少于180个核苷酸，在一些实施方式中为少于270个核苷酸，在一些实施方式中为少于360个核苷酸，在一些实施方式中为少于450个核苷酸，在一些实施方式中为少于540个核苷酸，在一些实施方式中为少于630个核苷酸，在一些实施方式中为少于720个核苷酸，在一些实施方式中为少于810个核苷酸，在一些实施方式中为少于900个核苷酸，在一些实施方式中为少于990个核苷酸，在一些实施方式中为少于1080个核苷酸，在一些实施方式中为少于1170个核苷酸，在一些实施方式中为少于1260个核苷酸，在一些实施方式中为少于1350个核苷酸，在一些实施方式中为少于1440个核苷酸，在一些实施方式中为少于1530个核苷酸，在一些实施方式中为少于1620个核苷酸，在一些实施方式中为少于1710个核苷酸，在一些实施方式中为少于1800个核苷酸，在一些实施方式中为少于1890个核苷酸，在一些实施方式中为少于1980个核苷酸，在一些实施方式中为少于1020个核苷酸，而在一些实施方式中为少于2070个核苷酸。
SEQIDNO:2的片段可包含30个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:2的片段可包含60个或更多氨基酸；在一些实施方式中为90个或更多氨基酸；在一些实施方式中为120个或更多氨基酸；在一些实施方式中为150个或更多氨基酸；在一些实施方式中为180个或更多氨基酸；在一些实施方式中为210个或更多氨基酸；在一些实施方式中为240个或更多氨基酸；在一些实施方式中为270个或更多氨基酸；在一些实施方式中为300个或更多氨基酸；在一些实施方式中为330个或更多氨基酸；在一些实施方式中为360个或更多氨基酸；在一些实施方式中为390个或更多氨基酸；在一些实施方式中为420个或更多氨基酸；在一些实施方式中为450个或更多氨基酸；在一些实施方式中为480个或更多氨基酸；在一些实施方式中为510个或更多氨基酸；在一些实施方式中为540个或更多氨基酸；在一些实施方式中为570个或更多氨基酸；在一些实施方式中为600个或更多氨基酸；在一些实施方式中为630个或更多氨基酸；在一些实施方式中为660个或更多氨基酸。而在一些实施方式中为690个或更多氨基酸。所述片段可包含少于90个氨基酸，在一些实施方式中为少于120个氨基酸，在一些实施方式中为少于150个氨基酸，在一些实施方式中为少于180个氨基酸，在一些实施方式中为少于210个氨基酸，在一些实施方式中为少于240个氨基酸，在一些实施方式中为少于270个氨基酸，在一些实施方式中为少于300个氨基酸，在一些实施方式中为少于330个氨基酸，在一些实施方式中为少于360个氨基酸，在一些实施方式中为少于390个氨基酸，在一些实施方式中为少于420个氨基酸，在一些实施方式中为少于450个氨基酸，在一些实施方式中为少于480个氨基酸，在一些实施方式中为少于540个氨基酸，在一些实施方式中为少于600个氨基酸，在一些实施方式中为少于660个氨基酸，而在一些实施方式中为少于690个氨基酸。
SEQIDNO:3是亚型B共有包膜DNA序列构建物。SEQIDNO:3包含HIV疫苗序列的编码序列，所述HIV疫苗序列包含与亚型B包膜蛋白的共有序列相连的IgE前导序列。SEQIDNO:4包含HIV疫苗序列构建物的氨基酸序列，其包含与亚型B包膜蛋白的共有序列相连的IgE前导序列。IgE前导序列为SEQIDNO:15。SEQIDNO:17是亚型B共有包膜蛋白质序列。
在一些实施方式中，本发明的疫苗优选包含SEQIDNO:17，其片段，编码SEQIDNO:17的核酸分子，或其片段。在一些实施方式中，本发明的疫苗优选包含SEQIDNO:4或编码它的核酸分子。在一些实施方式中，本发明的疫苗优选包含SEQIDNO:3。本发明的疫苗优选包含IgE前导序列SEQIDNO:15或编码它的核酸序列。
SEQIDNO:3的片段可包含90个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:3的片段可包含180个或更多核苷酸；在一些实施方式中为270个或更多核苷酸；在一些实施方式中为360个或更多核苷酸；在一些实施方式中为450个或更多核苷酸；在一些实施方式中为540个或更多核苷酸；在一些实施方式中为630个或更多核苷酸；在一些实施方式中为720个或更多核苷酸；在一些实施方式中为810个或更多核苷酸；在一些实施方式中为900个或更多核苷酸；在一些实施方式中为990个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1080个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1170个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1260个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1350个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1440个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1530个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1620个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1710个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1800个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1890个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1980个或更多核苷酸；在一些实施方式中为2070个或更多核苷酸；在一些实施方式中为2160个或更多核苷酸；在一些实施方式中为2250个或更多核苷酸；在一些实施方式中为2340个或更多核苷酸；在一些实施方式中为2430个或更多核苷酸；在一些实施方式中为2520个或更多核苷酸；在一些实施方式中为2620个或更多核苷酸；而在一些实施方式中为2700个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:3的片段可包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:3的片段不包含IgE前导序列的编码序列。所述片段可包含少于180个核苷酸，在一些实施方式中为少于270个核苷酸，在一些实施方式中为少于360个核苷酸，在一些实施方式中为少于450个核苷酸，在一些实施方式中为少于540个核苷酸，在一些实施方式中为少于630个核苷酸，在一些实施方式中为少于720个核苷酸，在一些实施方式中为少于810个核苷酸，在一些实施方式中为少于900个核苷酸，在一些实施方式中为少于990个核苷酸，在一些实施方式中为少于1080个核苷酸，在一些实施方式中为少于1170个核苷酸，在一些实施方式中为少于1260个核苷酸，在一些实施方式中为少于1350个核苷酸，在一些实施方式中为少于1440个核苷酸，在一些实施方式中为少于1530个核苷酸，在一些实施方式中为少于1620个核苷酸，在一些实施方式中为少于1710个核苷酸，在一些实施方式中为少于1800个核苷酸，在一些实施方式中为少于1890个核苷酸，在一些实施方式中为少于1980个核苷酸，在一些实施方式中为少于1020个核苷酸，在一些实施方式中为少于2070个核苷酸，在一些实施方式中为少于2160个核苷酸，在一些实施方式中为少于2250个核苷酸，在一些实施方式中为少于2340个核苷酸，在一些实施方式中为少于2430个核苷酸，在一些实施方式中为少于2520个核苷酸，在一些实施方式中为少于2610个核苷酸，而在一些实施方式中为少于2700个核苷酸。
SEQIDNO:4的片段可包含30个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:4的片段可包含60个或更多氨基酸；在一些实施方式中为90个或更多氨基酸；在一些实施方式中为120个或更多氨基酸；在一些实施方式中为150个或更多氨基酸；在一些实施方式中为180个或更多氨基酸；在一些实施方式中为210个或更多氨基酸；在一些实施方式中为240个或更多氨基酸；在一些实施方式中为270个或更多氨基酸；在一些实施方式中为300个或更多氨基酸；在一些实施方式中为330个或更多氨基酸；在一些实施方式中为360个或更多氨基酸；在一些实施方式中为390个或更多氨基酸；在一些实施方式中为420个或更多氨基酸；在一些实施方式中为450个或更多氨基酸；在一些实施方式中为480个或更多氨基酸；在一些实施方式中为510个或更多氨基酸；在一些实施方式中为540个或更多氨基酸；在一些实施方式中为570个或更多氨基酸；在一些实施方式中为600个或更多氨基酸；在一些实施方式中为630个或更多氨基酸；在一些实施方式中为660个或更多氨基酸。而在一些实施方式中为690个或更多氨基酸。所述片段可包含少于90个氨基酸，在一些实施方式中为少于120个氨基酸，在一些实施方式中为少于150个氨基酸，在一些实施方式中为少于180个氨基酸，在一些实施方式中为少于210个氨基酸，在一些实施方式中为少于240个氨基酸，在一些实施方式中为少于270个氨基酸，在一些实施方式中为少于300个氨基酸，在一些实施方式中为少于330个氨基酸，在一些实施方式中为少于360个氨基酸，在一些实施方式中为少于390个氨基酸，在一些实施方式中为少于420个氨基酸，在一些实施方式中为少于450个氨基酸，在一些实施方式中为少于480个氨基酸，在一些实施方式中为少于540个氨基酸，在一些实施方式中为少于600个氨基酸，在一些实施方式中为少于660个氨基酸，而在一些实施方式中为少于690个氨基酸。
SEQIDNO:5是亚型C共有包膜DNA序列构建物。SEQIDNO:5包含HIV疫苗序列的编码序列，所述HIV疫苗序列包含与亚型C包膜蛋白的共有序列相连的IgE前导序列。SEQIDNO:6包含HIV疫苗序列构建物的氨基酸序列，其包含与亚型C包膜蛋白的共有序列相连的IgE前导序列。IgE前导序列为SEQIDNO:15。SEQIDNO:18是亚型C共有包膜蛋白质序列。
在一些实施方式中，本发明的疫苗优选包含SEQIDNO:18，其片段，编码SEQIDNO:18的核酸分子，或其片段。在一些实施方式中，本发明的疫苗优选包含SEQIDNO:6或编码它的核酸分子。在一些实施方式中，本发明的疫苗优选包含SEQIDNO:5。本发明的疫苗优选包含IgE前导序列SEQIDNO:15或编码它的核酸序列。
SEQIDNO:5的片段可包含90个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:5的片段可包含180个或更多核苷酸；在一些实施方式中为270个或更多核苷酸；在一些实施方式中为360个或更多核苷酸；在一些实施方式中为450个或更多核苷酸；在一些实施方式中为540个或更多核苷酸；在一些实施方式中为630个或更多核苷酸；在一些实施方式中为720个或更多核苷酸；在一些实施方式中为810个或更多核苷酸；在一些实施方式中为900个或更多核苷酸；在一些实施方式中为990个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1080个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1170个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1260个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1350个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1440个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1530个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1620个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1710个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1800个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1890个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1980个或更多核苷酸；而在一些实施方式中为2070个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:5的片段可包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:5的片段不包含IgE前导序列的编码序列。所述片段可包含少于180个核苷酸，在一些实施方式中为少于270个核苷酸，在一些实施方式中为少于360个核苷酸，在一些实施方式中为少于450个核苷酸，在一些实施方式中为少于540个核苷酸，在一些实施方式中为少于630个核苷酸，在一些实施方式中为少于720个核苷酸，在一些实施方式中为少于810个核苷酸，在一些实施方式中为少于900个核苷酸，在一些实施方式中为少于990个核苷酸，在一些实施方式中为少于1080个核苷酸，在一些实施方式中为少于1170个核苷酸，在一些实施方式中为少于1260个核苷酸，在一些实施方式中为少于1350个核苷酸，在一些实施方式中为少于1440个核苷酸，在一些实施方式中为少于1530个核苷酸，在一些实施方式中为少于1620个核苷酸，在一些实施方式中为少于1710个核苷酸，在一些实施方式中为少于1800个核苷酸，在一些实施方式中为少于1890个核苷酸，在一些实施方式中为少于1980个核苷酸，在一些实施方式中为少于1020个核苷酸，而在一些实施方式中为少于2070个核苷酸。
SEQIDNO:6的片段可包含30个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:6的片段可包含60个或更多氨基酸；在一些实施方式中为90个或更多氨基酸；在一些实施方式中为120个或更多氨基酸；在一些实施方式中为150个或更多氨基酸；在一些实施方式中为180个或更多氨基酸；在一些实施方式中为210个或更多氨基酸；在一些实施方式中为240个或更多氨基酸；在一些实施方式中为270个或更多氨基酸；在一些实施方式中为300个或更多氨基酸；在一些实施方式中为330个或更多氨基酸；在一些实施方式中为360个或更多氨基酸；在一些实施方式中为390个或更多氨基酸；在一些实施方式中为420个或更多氨基酸；在一些实施方式中为450个或更多氨基酸；在一些实施方式中为480个或更多氨基酸；在一些实施方式中为510个或更多氨基酸；在一些实施方式中为540个或更多氨基酸；在一些实施方式中为570个或更多氨基酸；在一些实施方式中为600个或更多氨基酸；在一些实施方式中为630个或更多氨基酸；在一些实施方式中为660个或更多氨基酸。而在一些实施方式中为690个或更多氨基酸。所述片段可包含少于90个氨基酸，在一些实施方式中为少于120个氨基酸，在一些实施方式中为少于150个氨基酸，在一些实施方式中为少于180个氨基酸，在一些实施方式中为少于210个氨基酸，在一些实施方式中为少于240个氨基酸，在一些实施方式中为少于270个氨基酸，在一些实施方式中为少于300个氨基酸，在一些实施方式中为少于330个氨基酸，在一些实施方式中为少于360个氨基酸，在一些实施方式中为少于390个氨基酸，在一些实施方式中为少于420个氨基酸，在一些实施方式中为少于450个氨基酸，在一些实施方式中为少于480个氨基酸，在一些实施方式中为少于540个氨基酸，在一些实施方式中为少于600个氨基酸，在一些实施方式中为少于660个氨基酸，而在一些实施方式中为少于690个氨基酸。
SEQIDNO:7是亚型D共有包膜DNA序列构建物。SEQIDNO:7包含HIV疫苗序列的编码序列，所述HIV疫苗序列包含与亚型D包膜蛋白的共有序列相连的IgE前导序列。SEQIDNO:8包含HIV疫苗序列构建物的氨基酸序列，其包含与亚型D包膜蛋白的共有序列相连的IgE前导序列。IgE前导序列为SEQIDNO:15。SEQIDNO:19是亚型D共有包膜蛋白质序列。
在一些实施方式中，本发明的疫苗优选包含SEQIDNO:19，其片段，编码SEQIDNO:19的核酸分子，或其片段。在一些实施方式中，本发明的疫苗优选包含SEQIDNO:8或编码它的核酸分子。在一些实施方式中，本发明的疫苗优选包含SEQIDNO:7。本发明的疫苗优选包含IgE前导序列SEQIDNO:15或编码它的核酸序列。
SEQIDNO:7的片段可包含90个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:7的片段可包含180个或更多核苷酸；在一些实施方式中为270个或更多核苷酸；在一些实施方式中为360个或更多核苷酸；在一些实施方式中为450个或更多核苷酸；在一些实施方式中为540个或更多核苷酸；在一些实施方式中为630个或更多核苷酸；在一些实施方式中为720个或更多核苷酸；在一些实施方式中为810个或更多核苷酸；在一些实施方式中为900个或更多核苷酸；在一些实施方式中为990个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1080个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1170个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1260个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1350个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1440个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1530个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1620个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1710个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1800个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1890个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1980个或更多核苷酸；而在一些实施方式中为2070个或更多核苷酸；而在一些实施方式中为2140个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:7的片段可包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:7的片段不包含IgE前导序列的编码序列。所述片段可包含少于180个核苷酸，在一些实施方式中为少于270个核苷酸，在一些实施方式中为少于360个核苷酸，在一些实施方式中为少于450个核苷酸，在一些实施方式中为少于540个核苷酸，在一些实施方式中为少于630个核苷酸，在一些实施方式中为少于720个核苷酸，在一些实施方式中为少于810个核苷酸，在一些实施方式中为少于900个核苷酸，在一些实施方式中为少于990个核苷酸，在一些实施方式中为少于1080个核苷酸，在一些实施方式中为少于1170个核苷酸，在一些实施方式中为少于1260个核苷酸，在一些实施方式中为少于1350个核苷酸，在一些实施方式中为少于1440个核苷酸，在一些实施方式中为少于1530个核苷酸，在一些实施方式中为少于1620个核苷酸，在一些实施方式中为少于1710个核苷酸，在一些实施方式中为少于1800个核苷酸，在一些实施方式中为少于1890个核苷酸，在一些实施方式中为少于1980个核苷酸，在一些实施方式中为少于1020个核苷酸，在一些实施方式中为少于2070个核苷酸；在一些实施方式中为少于2140个核苷酸。
SEQIDNO:8的片段可包含30个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:8的片段可包含60个或更多氨基酸；在一些实施方式中为90个或更多氨基酸；在一些实施方式中为120个或更多氨基酸；在一些实施方式中为150个或更多氨基酸；在一些实施方式中为180个或更多氨基酸；在一些实施方式中为210个或更多氨基酸；在一些实施方式中为240个或更多氨基酸；在一些实施方式中为270个或更多氨基酸；在一些实施方式中为300个或更多氨基酸；在一些实施方式中为330个或更多氨基酸；在一些实施方式中为360个或更多氨基酸；在一些实施方式中为390个或更多氨基酸；在一些实施方式中为420个或更多氨基酸；在一些实施方式中为450个或更多氨基酸；在一些实施方式中为480个或更多氨基酸；在一些实施方式中为510个或更多氨基酸；在一些实施方式中为540个或更多氨基酸；在一些实施方式中为570个或更多氨基酸；在一些实施方式中为600个或更多氨基酸；在一些实施方式中为630个或更多氨基酸；在一些实施方式中为660个或更多氨基酸。而在一些实施方式中为690个或更多氨基酸。所述片段可包含少于90个氨基酸，在一些实施方式中为少于120个氨基酸，在一些实施方式中为少于150个氨基酸，在一些实施方式中为少于180个氨基酸，在一些实施方式中为少于210个氨基酸，在一些实施方式中为少于240个氨基酸，在一些实施方式中为少于270个氨基酸，在一些实施方式中为少于300个氨基酸，在一些实施方式中为少于330个氨基酸，在一些实施方式中为少于360个氨基酸，在一些实施方式中为少于390个氨基酸，在一些实施方式中为少于420个氨基酸，在一些实施方式中为少于450个氨基酸，在一些实施方式中为少于480个氨基酸，在一些实施方式中为少于540个氨基酸，在一些实施方式中为少于600个氨基酸，在一些实施方式中为少于660个氨基酸，而在一些实施方式中为少于690个氨基酸。
SEQIDNO:9是亚型BNef-Rev共有包膜DNA序列构建物。SEQIDNO:9包含HIV疫苗序列的编码序列，所述HIV疫苗序列包含与亚型BNef-Rev蛋白的共有序列相连的IgE前导序列。SEQIDNO:10包含HIV疫苗序列构建物的氨基酸序列，其包含与亚型BNef-Rev蛋白的共有序列相连的IgE前导序列。IgE前导序列为SEQIDNO:15。SEQIDNO:20是亚型BNef-Rev共有蛋白质序列。
在一些实施方式中，本发明的疫苗优选包含SEQIDNO:20，其片段，编码SEQIDNO:20的核酸分子，或其片段。在一些实施方式中，本发明的疫苗优选包含SEQIDNO:10或编码它的核酸分子。在一些实施方式中，本发明的疫苗优选包含SEQIDNO:9。本发明的疫苗优选包含IgE前导序列SEQIDNO:15或编码它的核酸序列。
SEQIDNO:9的片段可包含90个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:9的片段可包含180个或更多核苷酸；在一些实施方式中为270个或更多核苷酸；在一些实施方式中为360个或更多核苷酸；在一些实施方式中为450个或更多核苷酸；在一些实施方式中为540个或更多核苷酸；在一些实施方式中为630个或更多核苷酸；在一些实施方式中为720个或更多核苷酸；在一些实施方式中为810个或更多核苷酸；在一些实施方式中为900个或更多核苷酸；而在一些实施方式中为990个或更多核苷酸；在一些实施方式中。在一些实施方式中，SEQIDNO:9的片段可包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:9的片段不包含IgE前导序列的编码序列。所述片段可包含少于180个核苷酸，在一些实施方式中为少于270个核苷酸，在一些实施方式中为少于360个核苷酸，在一些实施方式中为少于450个核苷酸，在一些实施方式中为少于540个核苷酸，在一些实施方式中为少于630个核苷酸，在一些实施方式中为少于720个核苷酸，在一些实施方式中为少于810个核苷酸，在一些实施方式中为少于900个核苷酸，而在一些实施方式中为少于990个核苷酸。
SEQIDNO:2的片段可包含30个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:2的片段可包含60个或更多氨基酸；在一些实施方式中为90个或更多氨基酸；在一些实施方式中为120个或更多氨基酸；在一些实施方式中为150个或更多氨基酸；在一些实施方式中为180个或更多氨基酸；在一些实施方式中为210个或更多氨基酸；在一些实施方式中为240个或更多氨基酸；在一些实施方式中为270个或更多氨基酸；在一些实施方式中为300个或更多氨基酸；而在一些实施方式中为330个或更多氨基酸。
SEQIDNO:11是亚型A、B、C和D的Gag共有DNA序列的DNA序列构建物。SEQIDNO:11包含HIV疫苗序列的编码序列，所述HIV疫苗序列包含与Gag共有亚型A、B、C和D蛋白的共有序列相连的IgE前导序列。SEQIDNO:12包含HIV疫苗序列构建物的氨基酸序列，其包含与Gag亚型A、B、C和D蛋白的共有序列相连的IgE前导序列。IgE前导序列为SEQIDNO:15。SEQIDNO:21是Gag亚型A、B、C和D共有蛋白质序列。
在一些实施方式中，本发明的疫苗优选包含SEQIDNO:21，其片段，编码SEQIDNO:21的核酸分子，或其片段。在一些实施方式中，本发明的疫苗优选包含SEQIDNO:12或编码它的核酸分子。在一些实施方式中，本发明的疫苗优选包含SEQIDNO:11。本发明的疫苗优选包含IgE前导序列SEQIDNO:15或编码它的核酸序列。
SEQIDNO:11的片段可包含90个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:11的片段可包含180个或更多核苷酸；在一些实施方式中为270个或更多核苷酸；在一些实施方式中为360个或更多核苷酸；在一些实施方式中为450个或更多核苷酸；在一些实施方式中为540个或更多核苷酸；在一些实施方式中为630个或更多核苷酸；在一些实施方式中为720个或更多核苷酸；在一些实施方式中为810个或更多核苷酸；在一些实施方式中为900个或更多核苷酸；在一些实施方式中为990个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1080个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1170个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1260个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1350个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1440个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1530个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1620个或更多核苷酸；在一些实施方式中为1710个或更多核苷酸；而在一些实施方式中为1800个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:11的片段可包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:11的片段不包含IgE前导序列的编码序列。所述片段可包含少于180个核苷酸，在一些实施方式中为少于270个核苷酸，在一些实施方式中为少于360个核苷酸，在一些实施方式中为少于450个核苷酸，在一些实施方式中为少于540个核苷酸，在一些实施方式中为少于630个核苷酸，在一些实施方式中为少于720个核苷酸，在一些实施方式中为少于810个核苷酸，在一些实施方式中为少于900个核苷酸，在一些实施方式中为少于990个核苷酸，在一些实施方式中为少于1080个核苷酸，在一些实施方式中为少于1170个核苷酸，在一些实施方式中为少于1260个核苷酸，在一些实施方式中为少于1350个核苷酸，在一些实施方式中为少于1440个核苷酸，在一些实施方式中为少于1530个核苷酸，在一些实施方式中为少于1620个核苷酸，在一些实施方式中为少于1710个核苷酸，而在一些实施方式中为少于1800个核苷酸。
SEQIDNO:12的片段可包含30个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:12的片段可包含60个或更多氨基酸；在一些实施方式中为90个或更多氨基酸；在一些实施方式中为120个或更多氨基酸；在一些实施方式中为150个或更多氨基酸；在一些实施方式中为180个或更多氨基酸；在一些实施方式中为210个或更多氨基酸；在一些实施方式中为240个或更多氨基酸；在一些实施方式中为270个或更多氨基酸；在一些实施方式中为300个或更多氨基酸；在一些实施方式中为330个或更多氨基酸；在一些实施方式中为360个或更多氨基酸；在一些实施方式中为390个或更多氨基酸；在一些实施方式中为420个或更多氨基酸；在一些实施方式中为450个或更多氨基酸；在一些实施方式中为480个或更多氨基酸；而在一些实施方式中为510个或更多氨基酸。所述片段可包含少于90个氨基酸，在一些实施方式中为少于120个氨基酸，在一些实施方式中为少于150个氨基酸，在一些实施方式中为少于180个氨基酸，在一些实施方式中为少于210个氨基酸，在一些实施方式中为少于240个氨基酸，在一些实施方式中为少于270个氨基酸，在一些实施方式中为少于300个氨基酸，在一些实施方式中为少于330个氨基酸，在一些实施方式中为少于360个氨基酸，在一些实施方式中为少于390个氨基酸，在一些实施方式中为少于420个氨基酸，在一些实施方式中为少于450个氨基酸，在一些实施方式中为少于480个氨基酸，而在一些实施方式中为少于510个氨基酸。
HPV
SEQIDNO:22包含HPV疫苗序列的编码序列，其包含IgE前导序列，HPVE6共有序列，通过蛋白水解切割序列与HPVE7共有序列相连。HPVE6共有序列包括SEQIDNO:24中列出的优势免疫表位。HPVE7共有序列包括SEQIDNO:25中列出的优势免疫表位。HPVE6共有序列为SEQIDNO:26。HPVE6共有序列为SEQIDNO:27。IgE前导序列为SEQIDNO:28。用于连接两个共有序列的蛋白水解切割序列是SEQIDNO:29。
在一些实施方式中，本发明的疫苗优选包含SEQIDNO:24和/或SEQIDNO:25，或编码它们之一或两者的核酸序列。本发明的疫苗优选包含SEQIDNO:27和/或SEQIDNO:28，或编码它们之一或两者的核酸序列。本发明的疫苗优选包含通过蛋白水解切割序列如SEQIDNO:29连接到SEQIDNO:28的SEQIDNO:27，或者编码该融合蛋白的核酸序列。本发明的疫苗优选包含IgE前导序列SEQIDNO:28或编码它的核酸序列。本发明的疫苗优选包含SEQIDNO:23或SEQIDNO:22所示核酸序列。
在一些实施方式中，蛋白质包含SEQIDNO:23的片段。在一些实施方式中，蛋白质由SEQIDNO:23的片段构成。在一些实施方式中，核酸包含SEQIDNO:22的片段。在一些实施方式中，核酸由SEQIDNO:22的片段构成。
SEQIDNO:22的片段可包含30个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:22的片段可包含45个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:22的片段可包含60个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:22的片段可包含75个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:22的片段可包含90个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:22的片段可包含120个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:22的片段可包含150个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:22的片段可包含180个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:22的片段可包含210个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:22的片段可包含240个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:22的片段可包含270个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:22的片段可包含300个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:22的片段可包含360个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:22的片段可包含420个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:22的片段可包含480个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:22的片段可包含540个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:22的片段可包含600个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:22的片段可包含300个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:22的片段可包含660个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:22的片段可包含720个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:22的片段可包含780个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:22的片段可包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:22的片段不包含IgE前导序列的编码序列。所述片段可包含少于60个核苷酸，在一些实施方式中为少于75个核苷酸，在一些实施方式中为少于90个核苷酸，在一些实施方式中为少于120个核苷酸，在一些实施方式中为少于150个核苷酸，在一些实施方式中为少于180个核苷酸，在一些实施方式中为少于210个核苷酸，在一些实施方式中为少于240个核苷酸，在一些实施方式中为少于270个核苷酸，在一些实施方式中为少于300个核苷酸，在一些实施方式中为少于360个核苷酸，在一些实施方式中为少于420个核苷酸，在一些实施方式中为少于480个核苷酸，在一些实施方式中为少于540个核苷酸，在一些实施方式中为少于600个核苷酸，在一些实施方式中为少于660个核苷酸，在一些实施方式中为少于720个核苷酸，而在一些实施方式中为少于780个核苷酸。
SEQIDNO:23的片段可包含15个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:23的片段可包含18个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:23的片段可包含21个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:23的片段可包含24个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:23的片段可包含30个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:23的片段可包含36个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:23的片段可包含42个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:23的片段可包含48个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:23的片段可包含54个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:23的片段可包含60个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:23的片段可包含18个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:23的片段可包含72个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:23的片段可包含90个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:23的片段可包含120个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:23的片段可包含150个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:23的片段可包含180个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:23的片段可包含210个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:23的片段可包含240个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:23的片段可包含260个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:23的片段可包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:23的片段不包含IgE前导序列的编码序列。所述片段可包含少于24个氨基酸，在一些实施方式中为少于30个氨基酸，在一些实施方式中为少于36个氨基酸，在一些实施方式中为少于42个氨基酸，在一些实施方式中为少于48个氨基酸，在一些实施方式中为少于54个氨基酸，在一些实施方式中为少于60个氨基酸，在一些实施方式中为少于72个氨基酸，在一些实施方式中为少于90个氨基酸，在一些实施方式中为少于120个氨基酸，在一些实施方式中为少于150个氨基酸，在一些实施方式中为少于180个氨基酸，在一些实施方式中为少于210个氨基酸，在一些实施方式中为少于240个氨基酸，而在一些实施方式中为少于260个氨基酸。
HCV
SEQIDNO:30包含HCV疫苗序列的编码序列，所述HCV疫苗序列包含IgE前导序列，HCVE1共有序列，通过蛋白水解切割序列与HCVE2共有序列相连。HCVE1共有序列为SEQIDNO:32。HCVE2共有序列为SEQIDNO:33。
在一些实施方式中，本发明的疫苗优选包含SEQIDNO:32和/或SEQIDNO:33，或编码它们之一或两者的核酸序列。本发明的疫苗优选包含通过蛋白水解切割序列如SEQIDNO:29连接到SEQIDNO:33的SEQIDNO:32，或者编码该融合蛋白的核酸序列。本发明的疫苗优选包含IgE前导序列SEQIDNO:28或编码它的核酸序列。本发明的疫苗优选包含SEQIDNO:31或SEQIDNO:30所示核酸序列。
在本发明的一些实施方式中，本发明的疫苗包含SEQIDNO:30以及核酸序列或由其核酸序列编码的氨基酸序列，所述序列选自下组：SEQIDNO:34、SEQIDNO:35以及它们的任意组合。
SEQIDNO:30的片段可包含30个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含45个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含60个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含75个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含90个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含120个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含150个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含180个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含210个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含240个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含270个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含300个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含360个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含420个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含480个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含540个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含600个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含660个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含720个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含780个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含840个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含900个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含960个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含1020个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含1080个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含1140个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含1200个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含1260个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含1320个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含1380个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含1440个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含1500个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含1560个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含1620个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含1680个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含1740个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段可包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:30的片段不包含IgE前导序列的编码序列。所述片段可包含少于60个核苷酸，在一些实施方式中为少于75个核苷酸，在一些实施方式中为少于90个核苷酸，在一些实施方式中为少于120个核苷酸，在一些实施方式中为少于150个核苷酸，在一些实施方式中为少于180个核苷酸，在一些实施方式中为少于210个核苷酸，在一些实施方式中为少于240个核苷酸，在一些实施方式中为少于270个核苷酸，在一些实施方式中为少于300个核苷酸，在一些实施方式中为少于360个核苷酸，在一些实施方式中为少于420个核苷酸，在一些实施方式中为少于480个核苷酸，在一些实施方式中为少于540个核苷酸，在一些实施方式中为少于600个核苷酸，在一些实施方式中为少于660个核苷酸，在一些实施方式中为少于720个核苷酸，在一些实施方式中为少于780个核苷酸，在一些实施方式中为少于840个核苷酸，在一些实施方式中为少于900个核苷酸，在一些实施方式中为少于960个核苷酸，在一些实施方式中为少于1020个核苷酸，在一些实施方式中为少于1080个核苷酸，在一些实施方式中为少于1140个核苷酸，在一些实施方式中为少于1200个核苷酸，在一些实施方式中为少于1260个核苷酸，在一些实施方式中为少于1320个核苷酸，在一些实施方式中为少于1380个核苷酸，在一些实施方式中为少于1440个核苷酸，在一些实施方式中为少于1500个核苷酸，在一些实施方式中为少于1560个核苷酸，在一些实施方式中为少于1620个核苷酸，在一些实施方式中为少于1680个核苷酸，而在一些实施方式中为少于1740个核苷酸。
SEQIDNO:31的片段可包含15个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:31的片段可包含30个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:31的片段可包含45个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:31的片段可包含60个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:31的片段可包含75个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:31的片段可包含90个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:31的片段可包含105个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:31的片段可包含120个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:31的片段可包含150个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:31的片段可包含180个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:31的片段可包含210个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:31的片段可包含240个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:31的片段可包含270个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:31的片段可包含300个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:31的片段可包含360个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:31的片段可包含420个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:31的片段可包含480个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:31的片段可包含540个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:31的片段可包含575个或更多氨基酸。所述片段可包含少于30个氨基酸，在一些实施方式中为少于45个氨基酸，在一些实施方式中为少于60个氨基酸，在一些实施方式中为少于75个氨基酸，在一些实施方式中为少于90个氨基酸，在一些实施方式中为少于120个氨基酸，在一些实施方式中为少于150个氨基酸，在一些实施方式中为少于180个氨基酸，在一些实施方式中为少于210个氨基酸，在一些实施方式中为少于240个氨基酸，在一些实施方式中为少于270个氨基酸，在一些实施方式中为少于300个氨基酸，在一些实施方式中为少于360个氨基酸，在一些实施方式中为少于420个氨基酸，在一些实施方式中为少于480个氨基酸，在一些实施方式中为少于540个氨基酸，而在一些实施方式中为少于575个氨基酸。
hTERT
hTERT是人端粒酶逆转录酶，它在端粒酶末端合成TTAGGG标签以防止染色体缩短造成的细胞死亡。通过免疫疗法可靶定hTERT异常高表达的超增生性细胞。最近的研究也支持受HCV和HPV感染的超增生性细胞上hTERT表达异常。因此，通过靶定以异常水平表达hTERT的细胞可以增强HPV和HCV的免疫治疗效果。
最近的研究证实，hTERT基因转染的树突细胞中hTERT的表达能够以抗原特异性方式诱导CD8+细胞毒T细胞并引发CD4+T细胞。因此，在抗原呈递细胞(APC)内采用hTERT表达以延缓细胞衰老并维持它们呈递所选抗原的能力对于开发新的免疫疗法很有吸引力。
根据本发明的一些实施方式，诱导个体产生针对免疫原的免疫应答的方法包括，组合给予所述个体hTERT蛋白及其功能片段或其可表达的编码序列与编码本发明蛋白质的分离核酸分子和/或编码本发明蛋白质的重组疫苗和/或本发明蛋白质的亚单位疫苗和/或活的减毒疫苗和/或死疫苗。
在本发明的一些实施方式中，本发明的疫苗包含SEQIDNO:30以及核酸序列或由其核酸序列编码的氨基酸序列，所述序列选自下组：SEQIDNO:34、SEQIDNO:35以及它们的任意组合。在本发明的一些实施方式中，本发明的疫苗包含SEQIDNO:34或SEQIDNO:35。SEQIDNO:34包含编码hTERT的核酸序列。SEQIDNO:35包含hTERT的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方式中，本发明的疫苗包含SEQIDNO:22和SEQIDNO:34或SEQIDNO:35。联用编码hTERT的核酸序列和/或hTERT蛋白与HPV免疫原的组合能增强细胞介导的针对HPV-感染细胞的免疫应答。
SEQIDNO:34的片段可包含30个或更多核苷酸,优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含45个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含60个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:1的片段可包含75个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含90个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含120个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含150个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含180个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含210个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含240个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含270个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含300个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含360个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含420个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含480个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含540个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含600个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含300个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含660个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含720个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含780个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含840个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含900个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含960个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含1020个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含1080个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含1140个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含1200个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含1260个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含1320个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含1380个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含1440个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含1500个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含1560个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含1620个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含1680个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含1740个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含1800个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含1860个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含1920个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含1980个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含2040个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含2100个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含2160个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含2220个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含2280个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含2340个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含2400个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含2460个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含2520个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含2580个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含2640个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含2700个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含2760个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含2820个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含2880个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含2940个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含3000个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含3060个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含3120个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含3180个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含3240个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含3300个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含3360个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含3420个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含3480个或更多核苷酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段可包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:34的片段不包含IgE前导序列的编码序列。所述片段可包含少于60个核苷酸，在一些实施方式中为少于75个核苷酸，在一些实施方式中为少于90个核苷酸，在一些实施方式中为少于120个核苷酸，在一些实施方式中为少于150个核苷酸，在一些实施方式中为少于180个核苷酸，在一些实施方式中为少于210个核苷酸，在一些实施方式中为少于240个核苷酸，在一些实施方式中为少于270个核苷酸，在一些实施方式中为少于300个核苷酸，在一些实施方式中为少于360个核苷酸，在一些实施方式中为少于420个核苷酸，在一些实施方式中为少于480个核苷酸，在一些实施方式中为少于540个核苷酸，在一些实施方式中为少于600个核苷酸，在一些实施方式中为少于660个核苷酸，在一些实施方式中为少于720个核苷酸，在一些实施方式中为少于780个核苷酸，在一些实施方式中为少于840个核苷酸，在一些实施方式中为少于900个核苷酸，在一些实施方式中为少于960个核苷酸，在一些实施方式中为少于1020个核苷酸，在一些实施方式中为少于1080个核苷酸，在一些实施方式中为少于1140个核苷酸，在一些实施方式中为少于1200个核苷酸，在一些实施方式中为少于1260个核苷酸，在一些实施方式中为少于1320个核苷酸，在一些实施方式中为少于1380个核苷酸，在一些实施方式中为少于1440个核苷酸，在一些实施方式中为少于1500个核苷酸，在一些实施方式中为少于1560个核苷酸，在一些实施方式中为少于1620个核苷酸，在一些实施方式中为少于1680个核苷酸，在一些实施方式中为少于1740个核苷酸，在一些实施方式中为少于1800个核苷酸，在一些实施方式中为少于1860个核苷酸，在一些实施方式中为少于1920个核苷酸，在一些实施方式中为少于1980个核苷酸，在一些实施方式中为少于2040个核苷酸，在一些实施方式中为少于2100个核苷酸，在一些实施方式中为少于2160个核苷酸，在一些实施方式中为少于2220个核苷酸，在一些实施方式中为少于2280个核苷酸，在一些实施方式中为少于2340个核苷酸，在一些实施方式中为少于2400个核苷酸，在一些实施方式中为少于2460个核苷酸，在一些实施方式中为少于2520个核苷酸，在一些实施方式中为少于2580个核苷酸，在一些实施方式中为少于2640个核苷酸，在一些实施方式中为少于2700个核苷酸，在一些实施方式中为少于2760个核苷酸，在一些实施方式中为少于2820个核苷酸，在一些实施方式中为少于2860个核苷酸，在一些实施方式中为少于2940个核苷酸，在一些实施方式中为少于3000个核苷酸，在一些实施方式中为少于3060个核苷酸，在一些实施方式中为少于3120个核苷酸，在一些实施方式中为少于3180个核苷酸，在一些实施方式中为少于3240个核苷酸，在一些实施方式中为少于3300个核苷酸，在一些实施方式中为少于3360个核苷酸，在一些实施方式中为少于3420个核苷酸，在一些实施方式中为少于3480个核苷酸，而在一些实施方式中为少于3510个核苷酸。
SEQIDNO:35的片段可包含15个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含18个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含21个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含24个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含30个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含36个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含42个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含48个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含54个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含60个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含66个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含72个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含90个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含120个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含150个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含180个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含210个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含240个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含270个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含300个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含330个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含360个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含390个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含420个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含450个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含480个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含510个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含540个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含570个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含600个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含630个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含660个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含690个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含720个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含750个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含780个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含810个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含840个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含870个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含900个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含930个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含960个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含990个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含1020个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含1050个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含1080个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含1110个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含1140个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含1170个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含1200个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含1230个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含1260个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含1290个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含1320个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含1350个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含1380个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含1410个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含1440个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含1470个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含1500个或更多氨基酸，优选包括编码优势免疫表位的序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段可包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:35的片段不包含IgE前导序列的编码序列。所述片段可包含少于24个氨基酸，在一些实施方式中为少于30个氨基酸，在一些实施方式中为少于36个氨基酸，在一些实施方式中为少于42个氨基酸，在一些实施方式中为少于48个氨基酸，在一些实施方式中为少于54个氨基酸，在一些实施方式中为少于60个氨基酸，在一些实施方式中为少于72个氨基酸，在一些实施方式中为少于90个氨基酸，在一些实施方式中为少于120个氨基酸，在一些实施方式中为少于150个氨基酸，在一些实施方式中为少于180个氨基酸，在一些实施方式中为少于210个氨基酸，在一些实施方式中为少于240个氨基酸，在一些实施方式中为少于260个氨基酸，在一些实施方式中为少于290个氨基酸，在一些实施方式中为少于320个氨基酸，在一些实施方式中为少于350个氨基酸，在一些实施方式中为少于380个氨基酸，在一些实施方式中为少于410个氨基酸，在一些实施方式中为少于440个氨基酸，在一些实施方式中为少于470个氨基酸，在一些实施方式中为少于500个氨基酸，在一些实施方式中为少于530个氨基酸，在一些实施方式中为少于560个氨基酸，在一些实施方式中为少于590个氨基酸，在一些实施方式中为少于620个氨基酸，在一些实施方式中为少于650个氨基酸，在一些实施方式中为少于680个氨基酸，在一些实施方式中为少于710个氨基酸，在一些实施方式中为少于740个氨基酸，在一些实施方式中为少于770个氨基酸，在一些实施方式中为少于800个氨基酸，在一些实施方式中为少于830个氨基酸，在一些实施方式中为少于860个氨基酸，在一些实施方式中为少于890个氨基酸，在一些实施方式中为少于920个氨基酸，在一些实施方式中为少于950个氨基酸，在一些实施方式中为少于980个氨基酸，在一些实施方式中为少于1010个氨基酸，在一些实施方式中为少于1040个氨基酸，在一些实施方式中为少于1070个氨基酸，在一些实施方式中为少于1200个氨基酸，在一些实施方式中为少于1230个氨基酸，在一些实施方式中为少于1260个氨基酸，在一些实施方式中为少于1290个氨基酸，在一些实施方式中为少于1320个氨基酸，在一些实施方式中为少于1350个氨基酸，在一些实施方式中为少于1380个氨基酸，在一些实施方式中为少于1410个氨基酸，在一些实施方式中为少于1440个氨基酸，在一些实施方式中为少于1470个氨基酸，而在一些实施方式中为少于1500个氨基酸。
流感
根据本发明的一些实施方式，诱导个体产生针对免疫原的免疫应答的方法包括，组合给予所述个体流感H5N1毒株血凝素(HA)蛋白及其功能片段或其可表达的编码序列与编码本发明蛋白质的分离核酸分子和/或编码本发明蛋白质的重组疫苗和/或本发明蛋白质的亚单位疫苗和/或活的减毒疫苗和/或死疫苗。在一些实施方式中，所述流感疫苗组合物和方法包括使用编码各种流感病毒HA蛋白的核酸序列。在一些实施方式中，所述流感疫苗组合物和方法包括使用编码流感病毒株H1N5的HA的核酸序列以及编码选自下组的流感蛋白的核酸序列：SEQIDNO:38、SEQIDNO:40和SEQIDNO:42。在本发明的一些实施方式中，本发明的疫苗包含SEQIDNO:36或SEQIDNO:37。SEQIDNO:36包含编码流感病毒H1N5HA的核酸序列。SEQIDNO:37包含流感病毒H1N5HA的氨基酸序列。在本发明的一些实施方式中，本发明的疫苗包含SEQIDNO:38或SEQIDNO:39。SEQIDNO:38包含编码流感H1N1和H5N1NA共有序列的核酸序列。SEQIDNO:39包含流感H1N1和H5N1NA共有序列的氨基酸序列。在本发明的一些实施方式中，本发明的疫苗包含SEQIDNO:40或SEQIDNO:41。SEQIDNO:40包含编码流感H1N1和H5N1M1共有序列的核酸序列。SEQIDNO:41包含流感H1N1和H5N1M1共有序列的氨基酸序列。在本发明的一些实施方式中，本发明的疫苗包含SEQIDNO:42或SEQIDNO:43。SEQIDNO:42包含编码流感H5N1M2E-NP共有序列的核酸序列。SEQIDNO:43包含流感H5N1M2E-NP共有序列的氨基酸序列。在本发明的一些实施方式中，本发明的疫苗优选包含SEQIDNO:36和选自下组的序列：SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43，以及它们的任意组合。流感病毒株H5N1HA的共有序列包括SEQIDNO:36中列出的优势免疫表位。由SEQIDNO:36编码的流感病毒H5N1HA氨基酸序列是SEQIDNO:37。流感病毒H1N1/H5N1NA的共有序列包括SEQIDNO:38中列出的优势免疫表位。由SEQIDNO:38编码的流感病毒株H1N1/H5N1NA氨基酸序列是SEQIDNO:39。流感病毒株H1N1/H5N1M1的共有序列包括SEQIDNO:40中列出的优势免疫表位。由SEQIDNO:40编码的流感病毒H1N1/H5N1M1氨基酸序列是SEQIDNO:41。流感病毒H5N1M2E-NP的共有序列包括SEQIDNO:42中列出的优势免疫表位。由SEQIDNO:42编码的流感病毒H5N1M2E-NP氨基酸序列是SEQIDNO:43。本发明的疫苗可包括由上文定义的核酸分子编码的蛋白质产物或蛋白质的任何片段。
SEQIDNO:36的片段可包含30个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含45个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含60个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含75个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含90个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含120个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含150个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含180个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含210个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含240个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含270个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含300个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含360个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含420个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含480个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含540个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含600个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含660个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含720个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含780个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含840个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含900个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含960个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含1020个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含1080个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含1140个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含1200个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含1260个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含1320个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含1380个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含1440个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含1500个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含1560个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含1620个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含1680个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含1740个或更多核苷酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段可包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施方式中，SEQIDNO:36的片段不包含IgE前导序列的编码序列。SEQIDNO:36的片段可包含少于60个核苷酸,在一些实施方式中为少于75个核苷酸，在一些实施方式中为少于90个核苷酸，在一些实施方式中为少于120个核苷酸，在一些实施方式中为少于150个核苷酸，在一些实施方式中为少于180个核苷酸，在一些实施方式中为少于210个核苷酸，在一些实施方式中为少于240个核苷酸，在一些实施方式中为少于270个核苷酸，在一些实施方式中为少于300个核苷酸，在一些实施方式中为少于360个核苷酸，在一些实施方式中为少于420个核苷酸，在一些实施方式中为少于480个核苷酸，在一些实施方式中为少于540个核苷酸，在一些实施方式中为少于600个核苷酸，在一些实施方式中为少于660个核苷酸，在一些实施方式中为少于720个核苷酸，在一些实施方式中为少于780个核苷酸，在一些实施方式中为少于840个核苷酸，在一些实施方式中为少于900个核苷酸，在一些实施方式中为少于960个核苷酸，在一些实施方式中为少于1020个核苷酸，在一些实施方式中为少于1080个核苷酸，在一些实施方式中为少于1140个核苷酸，在一些实施方式中为少于1200个核苷酸，在一些实施方式中为少于1260个核苷酸，在一些实施方式中为少于1320个核苷酸，在一些实施方式中为少于1380个核苷酸，在一些实施方式中为少于1440个核苷酸，在一些实施方式中为少于1500个核苷酸，在一些实施方式中为少于1560个核苷酸，在一些实施方式中为少于1620个核苷酸，在一些实施方式中为少于1680个核苷酸，而在一些实施方式中为少于1740个核苷酸。
SEQIDNO:37的片段可包含15个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:37的片段可包含30个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:37的片段可包含45个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:37的片段可包含60个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:37的片段可包含75个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:37的片段可包含90个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:37的片段可包含105个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:37的片段可包含120个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:37的片段可包含150个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:37的片段可包含180个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:37的片段可包含210个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:37的片段可包含240个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:37的片段可包含270个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:37的片段可包含300个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:37的片段可包含360个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:37的片段可包含420个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:37的片段可包含480个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:37的片段可包含540个或更多氨基酸。在一些实施方式中，SEQIDNO:37的片段可包含565个或更多氨基酸。SEQIDNO:37的片段可包含少于30个氨基酸，在一些实施方式中为少于45个氨基酸，在一些实施方式中为少于60个氨基酸，在一些实施方式中为少于75个氨基酸，在一些实施方式中为少于90个氨基酸，在一些实施方式中为少于120个氨基酸，在一些实施方式中为少于150个氨基酸，在一些实施方式中为少于180个氨基酸，在一些实施方式中为少于210个氨基酸，在一些实施方式中为少于240个氨基酸，在一些实施方式中为少于270个氨基酸，在一些实施方式中为少于300个氨基酸，在一些实施方式中为少于360个氨基酸，在一些实施方式中为少于420个氨基酸，在一些实施方式中为少于480个氨基酸，在一些实施方式中为少于540个氨基酸，而在一些实施方式中为少于565个氨基酸。
根据本发明的一些实施方式，诱导个体产生针对免疫原的免疫应答的方法包括，组合给予所述个体流感毒株H1N1和流感毒株H5N1NA蛋白及其功能片段或其可表达的编码序列与编码本发明蛋白质的分离核酸分子和/或编码本发明蛋白质的重组疫苗和/或本发明蛋白质的亚单位疫苗和/或活的减毒疫苗和/或死疫苗。
根据本发明的一些实施方式，诱导个体产生针对免疫原的免疫应答的方法包括，组合给予所述个体流感毒株H1N1和流感毒株H5N1M1蛋白及其功能片段或其可表达的编码序列与编码本发明蛋白质的分离核酸分子和/或编码本发明蛋白质的重组疫苗和/或本发明蛋白质的亚单位疫苗和/或活的减毒疫苗和/或死疫苗。
根据本发明的一些实施方式，诱导个体产生针对免疫原的免疫应答的方法包括，组合给予所述个体流感毒株H5N1M2E-NP蛋白及其功能片段或其可表达的编码序列与编码本发明蛋白质的分离核酸分子和/或编码本发明蛋白质的重组疫苗和/或本发明蛋白质的亚单位疫苗和/或活的减毒疫苗和/或死疫苗。
疫苗
本发明提供了蛋白质和编码蛋白质的遗传构建物从而提供了改进的疫苗，所述蛋白质上的表位使它们成为能诱导针对它们的免疫应答的特别有效的免疫原。因此，可提供疫苗以诱导治疗性或预防性免疫应答。一些实施方式中，递送免疫原的方式是DNA疫苗、重组疫苗、蛋白质亚单位疫苗、包含免疫原的组合物、减毒疫苗或死疫苗。一些实施方式中，所述疫苗包含选自下组的组合：一种或多种DNA疫苗，一种或多种重组疫苗，一种或多种蛋白质亚单位疫苗，一种或多种包含免疫原的组合物，一种或多种减毒疫苗和一种或多种死疫苗。
根据本发明的一些实施方式，本发明所述疫苗被递送给个体以调节个体免疫系统的活性从而增强免疫应答。当编码蛋白质的核酸分子被个体细胞摄取后核苷酸序列在细胞内表达从而将蛋白质递送到该个体。本发明的某些方面提供了利用核酸分子如质粒递送蛋白质编码序列的方法，其作为其作为重组疫苗的一部分、作为减毒疫苗的一部分、作为分离的蛋白质或载体的蛋白质部分。
根据本发明的一些方面，提供了预防性和/或治疗性免疫个体的组合物和方法。
DNA疫苗描述于美国专利号5,593,972，5,739,118，5,817,637，5,830,876，5,962,428，5,981,505，5,580,859，5,703,055，5,676,594及其引用的优先权申请，各份专利通过引用纳入本文。除了那些申请中描述的递送方法，递送DNA的其他方法描述于美国专利号4,945,050和5,036,006，它们通过引用纳入本文。
本发明涉及利用重组载体来递送编码抗原的外源基因的改进的减毒活疫苗、改进的死疫苗和改进的疫苗、以及亚单位疫苗和糖蛋白疫苗。利用重组载体递送外源抗原的减毒活疫苗、亚单位疫苗和糖蛋白疫苗的例子描述于以下美国专利：4,510,245；4,797,368；4,722,848；4,790,987；4,920,209；5,017,487；5,077,044；5,110,587；5,112,749；5,174,993；5,223,424；5,225,336；5,240,703；5,242,829；5,294,441；5,294,548；5,310,668；5,387,744；5,389,368；5,424,065；5,451,499；5,453,364；5,462,734；5,470,734；5,474,935；5,482,713；5,591,439；5,643,579；5,650,309；5,698,202；5,955,088；6,034,298；6,042,836；6,156,319和6,589,529，它们通过引用纳入本文。
当遗传构建物被细胞摄取时它可存留在细胞内作为功能性染色体外分子和/或整合入细胞的染色体DNA。DNA可被引入细胞并在其中作为一个或多个质粒形式的单独遗传物质。或者，可将能整合入染色体的线形DNA引入细胞。当将DNA引入细胞时可加入促进DNA整合入染色体的试剂。DNA分子中还可包含能有效促进整合的DNA序列。或者，可将RNA给予细胞。还考虑提供遗传构建物作为包含着丝点、端粒和复制起点的线形微染色体。基因构建物可作为生活在细胞内的减毒活微生物或重组微生物载体的遗传物质的一部分。基因构建物可作为重组病毒疫苗的基因组的一部分，所述疫苗的遗传物质整合入细胞的染色体或保留在染色体外。遗传构建物包含核酸分子基因表达所必需的调控元件。所述元件包括：启动子、起始密码子、终止密码子和聚腺苷化信号。此外，靶蛋白或免疫调节蛋白的编码序列的基因表达通常需要增强子。这些元件必须可操作地连接于编码所需蛋白质的序列，且调控元件在给予它们的个体内必须可操作。
起始密码子和终止密码子通常被认为是编码所需蛋白质的核苷酸序列的一部分。然而，这些元件在给予基因构建物的个体内必须有功能。起始和终止密码子必须和编码序列在同一框内。
采用的启动子和聚腺苷化信号在个体细胞内必须有功能。
用于实施本发明，尤其用于制造人用遗传疫苗的启动子的例子包括但不限于：猿病毒40(SV40)启动子，小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子，人免疫缺陷病毒(MV)如BIV长末端重复(LTR)启动子，莫洛尼病毒、ALV、巨细胞病毒(CMV)如CMV立即早期启动子，EB病毒(EBV)，劳斯肉瘤病毒(RSV)以及来自人基因如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和人金属硫蛋白的启动子。
用于实施本发明，尤其用于制造人用遗传疫苗的聚腺苷化信号的例子包括但不限于SV40聚腺苷化信号和LTR聚腺苷化信号。具体地说，使用的是称为SV40聚腺苷化信号的pCEP4质粒的SV40聚腺苷化信号(加州圣地亚哥英杰公司(Invitrogen，SanDiegoCA))。
除了DNA表达所需的调控元件，DNA分子中也可包含其他元件。这种其他元件包括增强子。增强子可选自下组，但不限于此：人肌动蛋白，人肌球蛋白，人血红蛋白，人肌肉肌酸，以及病毒增强子如来自CMV、RSV和EBV的增强子。
可给遗传构建物提供哺乳动物复制起点以维持构建物在染色体外并在细胞内制造多个构建物的拷贝。英杰公司(圣地亚哥，CA)的质粒pVAX1、pCEP4和pREP4含有EB病毒复制起点和核抗原EBNA-1编码区，其产生高拷贝附加型复制(highcopyepisomalreplication)且没有整合。
在一些涉及免疫应用的优选实施方式中，递送的是核酸分子，包括编码本发明蛋白质的核苷酸序列，此外，还包括进一步增强针对这种靶蛋白的免疫应答的蛋白质的基因。这种基因的例子是编码下述其他细胞因子和淋巴因子的基因：α-干扰素，γ-干扰素，血小板衍生生长因子(PDGF)，TNFα，TNFβ，GM-CSF，表皮生长因子(EGF)，IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12，IL-18，MHC，CD80，CD86和IL-15，包括删除了信号序列并任选包含IgE信号肽的IL-15。可能有用的其他基因包括以下因子的编码基因：MCP-1，MIP-lα，MIP-1p，IL-8，RANTES，L-选择蛋白，P-选择蛋白，E-选择蛋白，CD34，GlyCAM-1，MadCAM-1，LFA-1，VLA-1，Mac-1，pl50.95，PECAM，ICAM-1，ICAM-2，ICAM-3，CD2，LFA-3，M-CSF，G-CSF，IL-4，突变形式的IL-18，CD40，CD40L，血管生长因子，IL-7，神经生长因子，血管内皮生长因子，Fas，TNF受体，Flt，Apo-1，p55，WSL-1，DR3，TRAMP，Apo-3，AIR，LARD，NGRF，DR4，DR5，KILLER，TRAIL-R2，TRICK2，DR6，胱冬酶ICE，Fos，c-jun，Sp-1，Ap-1，Ap-2，p38，p65Rel，MyD88，IRAK，TRAF6，IkB，灭活的NIK，SAPK，SAP-1，JNK，干扰素反应基因，NFkB，Bax，TRAIL，TRAILrec，TRAILrecDRC5，TRAIL-R3，TRAIL-R4，RANK，RANKLIGAND，Ox40，Ox40LIGAND，NKG2D，MICA，MICB，NKG2A，NKG2B，NKG2C，NKG2E，NKG2F，TAP1，TAP2以及它们的功能片段。
如果在任何情况下都不希望细胞接受遗传构建物则可加入其他元件作为破坏细胞的靶点。遗传构建物中可包含可表达形式的疱疹胸苷激酶(tk)基因。可在个体内引入药物刚昔洛韦(gangcyclovir)，该药物将选择性杀死任何产生tk的细胞，从而提供选择性破坏具有遗传构建物的细胞的方法。
为使蛋白质产生最大化，可选择最适合在给予构建物的细胞内进行基因表达的调控序列。此外，可选择在细胞内最有效转录的密码子。本领域一般技术人员能够制造在细胞内有功能的DNA构建物。
一些实施方式中，可提供其中的本文所述蛋白质编码序列与IgE信号肽相连的基因构建物。一些实施方式中，本文所述蛋白质连接于IgE信号肽。
在使用蛋白质的一些实施方式中，例如，本领域一般技术人员能够利用熟知的技术制造和分离本发明的蛋白质。在使用蛋白质的一些实施方式中，例如，本领域一般技术人员能够利用熟知的技术将编码本发明蛋白质的DNA分子插入市售的熟知表达系统使用的表达载体。例如，市售质粒pSE420(英杰公司，圣地亚哥，加州)可用来在大肠杆菌内制造蛋白质。市售质粒pYES2(英杰公司，圣地亚哥，加州)可用于，例如，在酿酒酵母(S.cerevisiae)中进行制造。市售MAXBACTM完全杆状病毒表达系统(英杰公司，圣地亚哥，加州)可用于，例如，在昆虫细胞内进行制造。市售质粒pcDNAI或pcDNA3(英杰公司，圣地亚哥，加州)可用于，例如，在哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞内进行制造。本领域一般技术人员可利用这些市售表达载体和表达系统或者其他载体和系统通过常规技术和容易获得的原料来制造蛋白质。(参见例如，Sambrook等，MolecularCloningaLaboratoryManual(分子克隆实验室手册)，第二版，冷泉港出版社(ColdSpringHarborPress)(1989)通过引用将其纳入本文。)因此，可在真核和原核系统内制备所需蛋白质，从而得到众多经过加工的蛋白质形式。
本领域一般技术人员可采用其他市售表达载体和系统或者采用熟知方法以及市售原料制造载体。含有必需的控制序列，如启动子和聚腺苷化信号并优选含有的增强子的表达系统容易得到并且现有技术中已知可用于各种宿主。参见例如，Sambrook等，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港出版社(1989)。遗传构建物包括操作性连接于在被构建物转染的细胞系内有功能的启动子的蛋白质编码序列。组成型启动子的例子包括来自巨细胞病毒或SV40的启动子。诱导型启动子的例子包括小鼠乳房白血病病毒或金属硫蛋白启动子。本领域一般技术人员能够从市售原料方便地制造用于用编码本发明蛋白质的DNA转染细胞的遗传构建物。包含编码蛋白质的DNA的表达载体可用于转化相容宿主，然后在外源DNA能够表达的条件下进行培育和维持。
从培养物中回收制得的蛋白质，可如本领域技术人员认为合适和已知的那样，通过裂解细胞或从培养基中回收。本领域一般技术人员可采用熟知的技术分离用这种表达系统制造的蛋白质。如上所述的用特异性结合特定蛋白质的抗体从天然来源纯化蛋白质的方法也可应用于纯化通过重组DNA法制造的蛋白质。
除了通过重组技术制造蛋白质，自动肽合成仪也可用于制造分离的、基本纯的蛋白质。这种技术是本领域一般技术人员熟知的，并且如果衍生物中具有DNA编码蛋白质产物中没有的取代则是有用的。
核酸分子可采用任何一种熟知技术来递送，其中包括DNA注射(也称为DNA接种)、重组载体如重组腺病毒、重组腺伴随病毒和重组牛痘。
给药途径包括，但不限于，肌内、鼻内、腹膜内、真皮内、皮下、静脉内、动脉内、眼内和口服途径，以及局部、透皮、通过吸入或栓剂或递送到粘膜组织，如通过灌洗递送到阴道、直肠、尿道、颊和舌下组织。优选的给药途径包括肌内、腹膜内、真皮内和皮下注射。施用遗传构建物的方法包括，但不限于，传统注射、无针注射装置、或“微粒轰击基因枪”。
一些实施方式中，在将核酸分子递送到细胞的同时给予多核苷酸功能增强子或遗传疫苗易化剂(facilitatoragent)。多核苷酸功能增强子描述于美国序列号5,593,972，5,962,428和1994/1/26提交的国际申请序列号PCT/US94/00899，它们通过引用纳入本文。遗传疫苗易化剂描述于1994/4/1提交的美国序列号021,579，通过引用将其纳入本文。与核酸分子联合给予的共试剂(co-agent)可作为与核酸分子的混合物给予或者可在的同时、之前或之后单独给予。此外，所述试剂可作为转染剂和/或复制剂和/或炎性剂并且可与GVF共同给予的其他试剂包括生长因子、细胞因子和淋巴因子如a-干扰素，γ-干扰素，GM-CSF，血小板衍生生长因子(PDGF)，TNF，表皮生长因子(EGF)，IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，IL-12和IL-15以及成纤维细胞生长因子，表面活性剂如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物包括单磷脂酰脂质A(WL)，胞壁酰肽，醌类似物和囊泡如鲨烯，透明质酸也可与遗传构建物联合给予。一些实施方式中，免疫调节蛋白质可用作GVF。一些实施方式中，将核酸分子和PLG同时提供以增强递送/摄取。
本发明所述药物组合物包含约1纳克至约2000微克DNA。在一些优选实施方式中，本发明所述药物组合物包含约5纳克至约1000微克DNA。在一些优选实施方式中，所述药物组合物含有约10纳克至约800微克DNA。在一些优选实施方式中，所述药物组合物含有约0.1-500微克DNA。在一些优选实施方式中，所述药物组合物含有约1-350微克DNA。在一些优选实施方式中，所述药物组合物含有约25-250微克DNA。在一些优选实施方式中，所述药物组合物含有约100-200微克DNA。
本发明所述药物组合物按照用于给药的模式配制。当药物组合物是可注射的药物组合物时，它们是无菌、无热原和无颗粒的。优选采用等渗配方。通常，等渗添加剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。一些情况下，等渗溶液如磷酸缓冲盐水是优选的。稳定剂包括明胶和白蛋白。一些实施方式中，在制剂中加入了血管收缩剂。
根据本发明的一些实施方式，提供了诱导免疫应答的方法。所述疫苗可以是基于蛋白质的活的减毒疫苗，细胞疫苗，重组疫苗或者核酸或DNA疫苗。一些实施方式中，诱导个体产生抵抗免疫原的免疫应答(包括诱导粘膜免疫应答)的方法包括组合给予个体CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白质以及它们的功能片段或者它们的可表达的编码序列中的一种或多种与编码本发明蛋白质的分离核酸分子和/或编码本发明蛋白质的重组疫苗和/或本发明蛋白质的亚单位疫苗和/或活的减毒疫苗和/或死疫苗。CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白质以及它们的功能片段中的一种或多种可在施用编码免疫原的分离核酸分子和/或编码免疫原的重组疫苗和/或包含免疫原的亚单位疫苗和/或活的减毒疫苗和/或死疫苗之前、同时或之后施用。一些实施方式中，编码一种或多种选自下组的蛋白质的分离核酸分子被施用于个体：CTACK、TECK、MEC以及它们的功能片段。
实施例
实施例1
材料和方法
HIV-1亚型B包膜序列。为产生HIV-1亚型B共有包膜序列，从GenBank中选出42种从11个国家收集的亚型B包膜基因序列以避免抽样偏差。各序列对应于不同的患者。所有序列都以非重组状态使用。
多重比对。应用于系统发生研究的比对过程包括采用ClustalX(版本1.81)(Thompson，J.D.等1997，TheClustalXwindowsinterface:flexiblestrategiesformultiplesequencealignmentaidedbyqualityanalysistools(ClustalX窗口界面：定性分析工具辅助的多系列比对的弹性策略).NucleicAcidsResearch25:4876-4882)。成对比对参数的设置遵照动态“慢-精确(slow-accurate)”程序，采用10作为空位开放罚分，0.1作为空位延伸罚分。多重比对参数包括空位延伸罚分为0.2。
HIV-1亚型B包膜共有序列的构建。HIV-1亚型B包膜共有核苷酸序列是在进行多重比对和较小最终手动调节后获得的。用推出的氨基酸序列来指导比对空位的引入从而将它们插入密码子之间。通过翻译共有核苷酸序列获得共有氨基酸序列。
系统发生树。采用程序PAUP*4.0b10(Swofford，D.L.1999.PAUP*4.0：采用简约原则的系统发生分析(*以及其他方法)，版本4.0b2a.马萨诸塞州森德兰SA公司(SinauerAssociates，Inc.,，Sunderland，Mass.))利用相邻相接(NJ)法建立氨基酸的系统发生树。亚型D的两个额外序列(K03454和AAA44873)和亚型C的两个序列(AAD12103和AAD12112)用作寻根(rooting)的外类群(Kuiken，C.，B.T.Korber和R.W.Shafer.2003.HIVsequencedatabases(HIV序列数据库).AIDSRev.5:52-61)。
HIV-1亚型B包膜共有序列的修饰。在获得HIV-1亚型B共有包膜序列后进行一些修饰：将超变的V1和V2区缩短，V3环设计成可供CCR5利用，除去C端的胞质尾区域，在N端加入前导序列和上游Kozak序列，用GeneOptimizerTM(基因艺术公司(GENEART)，德国)进行密码子优化和RNA优化。
包膜免疫原。编码修饰的HIV-1亚型B早期递质共有包膜糖蛋白(EY2E1-B)的基因由基因艺术公司合成和进行序列检验。合成的EY2E1-B用BamHI和NotI消化，克隆入巨细胞病毒立即早期启动子控制下的表达载体pVAX(英杰公司)，该构建物被命名为pEY2E1-B。
基本亚型B免疫原(EK2P-B)从人偏好密码子产生，基本亚型B分离物6101gp140包膜基因由M.Sidhm(惠氏(Wyeth))惠赠。基本上，通过除去天然前导序列和胞质尾使优化的6101包膜基因突变。然后设计正向和反向特异性引物来引入IgE-前导序列和Kozak序列：Env-F:5’-GTCGCTCCGCTAGCTTGTGGGTCACAGTCTATTATGGGGTACC-3’(SEQIDNO:13)Env-R:5’-GGTCGGATCCTTACTCCACCACTCTCCTTTTTGCC-3’(SEQIDNO:14)。将纯化的PCR产物克隆入pVAX质粒载体，其也用EcoR1和XbaI线性化。该构建物命名为pEK2P-B。
体内表达和EY2E1-B与单克隆抗体的反应性。在60mm平皿中使用FuGENE6转染试剂(罗氏(Roche)，德国)分别用3□gpEY2E1-B和pEK2P-B质粒转染人横纹肌肉瘤(RD)细胞(2x106)。转染48小时后细胞用1xPBS洗涤三次并用150μl裂解缓冲液(细胞信号传导技术公司(CellSignalingTechnology))裂解。总蛋白质裂解物(50μg)用SDS-PAGE凝胶分级，转移到PVDF膜(爱默生公司(Amersham))。用包膜-特异性单克隆抗体2G12(美国马里兰州洛可维尔NARRRP公司(NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram，Rockville，MD，USA))和单克隆抗-肌动蛋白抗体(西格玛奥尔德里奇公司(Sigma-Aldrich))进行免疫印迹分析并采用ECLTMWestern印迹分析系统(爱默生公司)用HRP-偶联的羊抗人IgG(西格玛奥尔德里奇公司)显像。肌动蛋白用作Western印迹的加样对照。
为检测EY2E1-B与单克隆抗体的反应性，转染得到的总蛋白质裂解物(100μg)用5μg包括2G12、4G10和ID6在内的包膜-特异性单克隆抗体(美国马里兰州洛可维尔NARRRP公司)免疫沉淀。相同量的空载体pVAX转染细胞的总蛋白质裂解物用作阴性对照。免疫沉淀的蛋白质用SDS-PAGE凝胶分级并按上述通过Western印迹检测。
间接免疫荧光试验。进行间接免疫荧光试验以证实EY2E1-B和EK2P-B基因的表达。将人横纹肌肉瘤(RD)细胞铺于有隔室的组织培养载玻片(BD生物科技公司(BDBiosciences))，密度为在含10％FBS(吉比可公司(GIBCO))的完全DMEM培养基中于第二天达到60-70％汇合，并使其贴壁过夜。第二天用pEY2E1-B、pEK2P-B和对照质粒pVAX(1μg/孔)转染细胞，转染采用FuGENE6转染试剂(罗氏)按照制造商的说明进行。转染48小时后，细胞用冷的1XPBS洗涤两次并用甲醇在载玻片上固定15分钟。除去载玻片上的残余溶剂，将细胞与抗-小鼠HIV-1env单克隆F105(美国马里兰州洛可维尔NARRRP公司)一起培育90分钟。载玻片然后用TRITC-偶联的第二抗体(西格玛奥尔德里奇公司)培育45分钟。在第二抗体溶液中加入4',6-二氨基-2-苯基吲哚盐酸盐(西格玛奥尔德里奇公司)复染细胞核以显示预定视野中看到的所有细胞的细胞核。载玻片用含有抗衰减剂(分子探针公司(MolecularProbes))的固定培养基固定。图像利用荧光显微术的Phase3Pro程序(MC公司(MediaCybernetics))进行分析。
包膜-特异性抗体的测定。在免疫小鼠和对照小鼠中通过ELISA(酶联免疫吸附试验)测定包膜特异性IgG抗体。Nunc-ImmunoTM平板(纽约罗彻斯特NNI公司(NalgeNuncInternational，Rochester，NY))分别用1μg/ml进化支B重组HIV-1IIIB糖蛋白可溶性gp160(免疫诊断公司(ImmunoDiagnostics)，马萨诸塞州)、进化支A/E基本包膜蛋白HIV-193TH975gp120和进化支C基本包膜蛋白HIV-196ZM651gp120(美国马里兰州洛可维尔NARRRP公司)包被，然后室温培育过夜。将平板洗涤之后用3％BSA的PBST溶液(1xPBS+0.05％吐温-20)在37℃封闭1小时。然后再次洗涤平板并用3％BSA的PBST溶液稀释的小鼠特异性血清在4℃培育过夜，然后用1/10,000稀释的HRP-偶联的羊抗-小鼠IgG(宾西法尼亚州西格鲁弗杰克逊免疫研究公司)JacksonImmunoResearch，WestGrove，PA))在37℃培育1小时。反应用底物TMB(3,3□,5,5□-四甲基联苯胺)(西格玛奥尔德里奇公司)显色。在每孔加入100μl2.5M硫酸终止反应并在450nmOD下在EL808平板阅读器(生物技术仪器公司(BiotechInstrumentInc.))上阅读平板。
小鼠的免疫。雌性4-6周龄BALB/c小鼠购自缅因州巴港的杰克逊实验室(TheJacksonLaboratory，BarHarbor，ME))。转基因B6.Cg-Tg(HLA-A/H2-D)2Enge/J小鼠繁殖对购自杰克逊实验室并在我们的实验室内由MichelleKutzler博士饲养。这些转基因小鼠表达种间杂交I类MHC基因，AAD，其含有人HLA-A2.1基因的α-1和α-2区和小鼠H-2Dd基因的α-3跨膜区和胞质区，并受人HLA-A2.1启动子指导。小鼠α-3区的表达增强了该系统的免疫应答。与未修饰的HLA-A2.1相比，嵌合的HLA-A2.1/H2-DdMHCI类分子介导小鼠T细胞的有效正选择以提供能够识别HLA-A2.1I类分子呈递的肽的更加完全的T细胞组分。就HLA-A2.1I类分子而言，呈递并被小鼠T细胞识别的肽表位与HLA-A2.1+人上呈递的那些表位相同。雌性4-6周龄转基因小鼠用于下述进一步的研究。按照国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)和宾西法尼亚大学护理和应用委员会(UniversityofPennsylvaniaInstitutionalCareandUseCommittee)(IACUC)的指导方针进行动物护理。各小鼠以两周为间隔肌内免疫三次，每次100μgDNA。每组3只小鼠，对照组接种pVAXDNA。第三次免疫接种1周后杀死小鼠并在无菌条件下取出脾脏。收集脾细胞并重悬于RBC裂解缓冲液以除去红细胞。裂解之后将同一组的脾细胞汇集在一起并重悬于含10％FBS的RPMI1640培养基。对细胞计数并准备进行分析。
IFN-γELISpot试验。采用高-蛋白质结合IP96孔MultiscreenTM平板(美国马萨诸塞州贝德福德Millipore公司)。平板在4℃用稀释于1XPBS的小鼠IFN-γ的mAb(明尼苏达州明尼阿波利斯R&D系统公司(R&DSystems，Minneapolis，MN))包被过夜。平板用PBS洗涤三次，然后室温下用添加了1％BSA和5％蔗糖的1XPBS封闭2小时。在加样孔中一式三份加入小鼠脾细胞，每孔2x105个细胞，重悬于完全培养基(添加了10％FBS和抗生素的RPMI1640)。从NARRRP公司获得六组肽，每个肽含15个氨基酸残基，其中有11个氨基酸重叠，代表了HIV-1亚型B、亚型C、M组以及HIV-1MN(亚型B分离物)、HIV-1C.UY.01.TRA3011和C.ZA.01.J54Ma(两种亚型C分离物)包膜完整蛋白质序列的所有蛋白质共有序列。每组env肽作为特异性刺激IFN-γ释放的抗原以2μg/ml/肽的浓度集中到4个库。5g/ml的伴刀豆球蛋白A(ConcavalinA)(西格玛奥尔德里奇公司，圣路易斯，密苏里州)以及完全培养基分别用作阳性和阴性对照。平板在37℃、5％CO2气氛培养箱内孵育24小时，然后洗涤四次。然后加入生物素化的抗-小鼠IFN-γ检测抗体并将平板在4℃培育过夜。洗涤平板，然后按照制造商的说明(ELISPOT蓝色模块(ELISPOTBlueColorModule)，R&D系统公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州)显色。将平板空气干燥并用ELISPOT自动阅读系统(俄亥俄州克利夫兰CTL分析仪公司(CTLAnalyzers，Cleveland，OH))和软件对斑点计数。斑点形成细胞(SFC)的平均数目调节为1x106脾细胞以供数据展示。ELISpot试验通过三次独立试验重复三次。
CD8+T-细胞耗尽研究。按照制造商的说明，用CD8抗体包被的免疫磁珠(纽约州成功湖戴纳生物科技有限公司(DynalBiotechInc.，LakeSuccess，NY))耗尽脾细胞中的CD8淋巴细胞。耗尽CD8+T-细胞后按照上述进行IFN-γELISpot试验。
表位绘图研究。为绘制反应性表位图谱，将两组肽集中到29个库，每个库分别有14-15各肽，其中每个肽含15个氨基酸残基，有11个氨基酸重叠，代表了HIV-1共有亚型B和HIV-1MN所有包膜蛋白，并按照上述进行IFN-γELISpot试验。29组种不同的集中刺激物用于有助于表位绘图的矩阵试验(matrixassay)。
统计学分析。采用斯氏成对t检验比较用pEY2E1-B和pEK2P-B免疫的小鼠之间的细胞免疫应答。在该研究中，p<0.05被认为在统计学上显著的。
结果
新的基于亚型B早期递质共有序列的包膜基因的构建和设计。HIV-1亚型B的共有序列产生自从GenBank获得的42种亚型B序列。如图1中所总结的，产生共有序列之后进行了一些修饰。简言之，为制造模拟粘膜传递病毒的HIV-1包膜的CCR5-趋向形式，根据早期递质分离物的序列设计出了V3环内的6个重要氨基酸。此外，V1环内的10个氨基酸和V2环内的1个氨基酸也被从共有序列中删除。在起始密码子上游的框内融合入高度有效的前导序列以助于表达。保持跨膜区完整以易于表面表达并保持切割位点完整以获得正确的折叠以及宿主蛋白酶对包膜蛋白的切割。除去胞质尾以防止包膜再循环以及促进更加稳定且更高的表面表达(Berlioz-Torrent，C.等1999.人和猿逆转录病毒跨膜蛋白的胞质区与网格蛋白连接复合体的相互作用能调节包膜糖蛋白在细胞内和细胞表面的表达(Interactionsofthecytoplasmicdomainsofhumanandsimianretroviraltransmembraneproteinswithcomponentsoftheclathrinadaptorcomplexesmodulateintracellularandcellsurfaceexpressionofenvelopeglycoproteins).J.Virol.73:1350-1359；Bultmann，A.等.2001.人免疫缺陷病毒1型包膜糖蛋白胞质尾内的抑制细胞表面表达的两个序列的鉴定(Identificationoftwosequencesinthecytoplamictailofthehumanimmunodeficiencyvirustype1envelopeglycoproteinthatinhibitcellsurfaceexpression).J.Virol.75:5263-5276)。此外，为以较高水平表达，该基因采用的密码子符合智人基因的密码子偏好(Andre，S.等B.1998.采用使用优化密码子的合成gp120序列的DNA疫苗能引发增强的免疫应答(IncreasedimmuneresponseelicitedbyDNAvaccinationwithasyntheticgp120sequencewithoptimizedcodonusage).JVirol72:1497-503；Deml，L.等2001.密码子优化对编码人免疫缺陷病毒1型gag蛋白的候选DNA疫苗的表达和免疫原性的多重影响(MultipleeffectsofcodonusageoptimizationonexpressionandimmunogenicityofDNAcandidatevaccinesencodingthehumanimmunodeficiencyvirustype1gagprotein).J.Virol.75:10991-11001)。此外，还进行了RNA优化(Schneider，R.等.1997.人免疫缺陷病毒1型抑制元件的失活导致Gag和Gag/蛋白酶不依赖于Rev表达和颗粒形成(Inactivationofthehumanimmunodeficiencyvirustype1inhibitoryelementsallowsRev-independentexpressionofGagandGag/proteaseandparticleformation).J.Virol.71:4892-4903)：避免GC含量非常高(>80％)或非常低(<30％)的区域以及顺式作用序列基序，如内部TATA盒、chi位点和核糖体进入位点。构建了合成的工程改造EY2E1-B基因，其长度为2734。将EY2E1-B基因亚克隆入pVAX的BamHI和NotI位点供进一步研究。
系统发生分析。为评估随机取样的包膜亚型B序列与EY2E1-B序列的距离分布，进行了系统发生分析。如图2所示，观察到EY2E1-B序列与所有取样序列都相对靠近。与基本分离物EK2P-B序列相比，EY2E1-B序列具有相当的相似性评分分布(表1)。EY2E1-B的平均相似性百分比评分为85.7％，EK2P-B为79.4％。
表1
平均相似性百分比评分 相似性百分比评分范围
EY2E1-B 85.7 92.1-79.6
EK2P-B 79.4 86.3-73.9
表1。潜在候选包膜疫苗与亚型B包膜序列的排列对比的相似性百分比评分平均值和范围。
EY2E1-B的体内表达和抗原测定。为检测pEY2E1-B和pEK2P-B的体内表达，按照材料和方法部分所述用这些质粒转染RD细胞。转染后提取细胞裂解物的总蛋白并用材料和方法部分提到的包膜-特异性单克隆抗体2G12进行免疫印迹以检测pEY2E1-B的表达。Western印迹结果表明，这两种构建物表达包膜蛋白(图3A)。检出的包膜蛋白约120KD。表2显示了pEY2E1-B和pEK2P-B的比较。
表2
共有/基本 早期递质 密码子优化 RNA优化 IgELS 胞质尾
EY2E1-B 共有 是 是 是 是 否
EK2P-B 基本 否 是 是 是 否
为测定抗原表位，用三种不同gp120-特异性抗体2G12、4G10和ID6免疫沉淀来自RD细胞裂解物的表达的包膜蛋白。免疫沉淀之后进行Western印迹以检测免疫沉淀的蛋白质。我们的结果显示，合成的免疫原能够结合抗体2G12和ID6，但不结合4G10。由于抗体2G12中和许多基本分离物并与构象和依赖于碳水化合物的gp120表位反应，且抗体ID6结合gp120和gp160并直接针对gp120的前204个氨基酸，我们的结果提示，合成的工程改造免疫原EY2E1-B有可能折叠成相对天然的构象并保存一些天然抗原表位表位。此外，由于抗体4G10是识别LAIgp160(一种T细胞系适应株)的HIV-1LAI/BRUV3单克隆抗体，我们的数据提示，这种合成包膜不利用共同受体CXCR4。
为进一步证实表达和测定抗原表位，采用转染的RD细胞进行了间接免疫荧光试验。在荧光显微镜下观察到pEY2E1-B和pEK2P-B转染细胞内有高特异性表达。该试验采用与不连续的或构象gp120表位反应的HIV-1env单克隆F105。如图3B所示，表达Env蛋白的转染细胞显示出典型的罗丹明荧光，再次提示合成蛋白被表达并具有相对天然的构象。作为对照，在pVAX转染的RD细胞内未检测到这种表达。
体液应答的诱导。为检测合成的免疫原能否引发高效价包膜-特异性抗体反应，收集pVAX、pEY2E1-B和pEK2P-B免疫的BalB/C小鼠的血清并进行ELISA。如图4所示，我们观察到与pEK2P-B免疫小鼠相比，从pEY2E1-B免疫小鼠收集的血清具有相对较高水平的进化支B包膜-特异性抗体应答。相反，仅用载体免疫的小鼠未产生特异性抗体应答。然而，在注射pEY2E1-B和pEK2P-B的小鼠中未观察到针对进化支A/E和进化支C蛋白质的任何可检测抗体应答(图4B和4C)，表明尽管基于合成共有序列的免疫原具有相对天然的构象并保存了天然抗原表位，但它可能不能诱导较宽的进化支间抗体免疫应答。
通过ELISpot检测强且宽的细胞免疫应答。BalB/C小鼠用pEY2E1-B和pEK2P-B免疫并进行ELISpot分析以测定响应来自HIV-1共有亚型B蛋白质的四种肽库的抗原特异性IFN-γ分泌细胞的数目(图5A)。通过每百万细胞中斑点形成单位(SFU)的数目测得的pEY2E1-B免疫小鼠的反应幅度在27.5和520之间。相比，pEK2P-B接种小鼠的脾细胞显示出的幅度仅为2-237.5(p<0.05)。所有四种肽库在pEY2E1-B免疫小鼠中的SFU数/百万脾细胞的加和频率为1976.25+260，而pEK2P-B免疫小鼠的SFU数/百万细胞为519+45。pVAX载体免疫小鼠的细胞被用作阴性对照，共有包膜B肽集合仅显示有60+5SFU/百万脾细胞(p<0.05)。我们在三项独立研究中观察到类似的结果。因此，pEY2E1-B构建物在驱动细胞介导的免疫应答方面的功效最多达到4倍。我们还检测了CD8+淋巴细胞是否负责在pEY2E1-B免疫的BalB/C小鼠中检测到的IFN-γ分泌。如图5B所述，耗尽CD8+后SFU数/百万细胞降至127.5+11，表明通过耗尽CD8+T-细胞的ELISpot观察到的IFN-γ生成细胞的频率降低了约90％。pEY2E1-B诱导的IFN-γ生成主要由CD8+T-细胞介导。
此外，为建立人T细胞对HLA-A2呈递抗原的免疫应答模型以及鉴定那些抗原，我们用转基因HLA-A2.1/H2-Dd小鼠进行了与上述相同的ELISpot试验。如图5C所示，所有四种肽库在pEY2E1-B免疫转基因小鼠中的SFU/百万脾细胞加和频率为2362+257，而pEK2P-B免疫转基因小鼠的SFU数/百万细胞仅为493+57。这些结果表明，pEY2E1-B构建物在驱动转基因小鼠细胞介导的免疫应答方面的功效最多达到4倍。耗尽CD8后得到的ELISpot数据提示，pEY2E1-B诱导的IFN-γ生成主要由CD8+T-细胞介导(图5D)。
此外，我们感兴趣的是进一步详细了解在ELISpot试验中观察到的细胞免疫应答。因此，针对跨越共有亚型B包膜蛋白的肽文库进行另一组ELISpot试验。该绘图研究采用完整的一组15聚肽，其中有11个氨基酸重叠，包含亚型B共有包膜蛋白。该研究表明，合成包膜未诱导出明显的优势表位。然而，对pEY2E1-B-免疫BalB/C小鼠所衍生出的脾细胞进行IFN-γELISpot分析显示，有29个库中有18个显示出斑点超过50，而pEK2P-B免疫BalB/C小鼠仅有6个库(图5E)。这些结果表明，EY2E1-B免疫原诱导的细胞免疫应答的宽度(breadth)和幅度(magnitude)明显增加。
pEY2E1-B诱导的强交叉反应性细胞免疫应答。为测定EY2E1-B免疫原是否能诱导宽的和交叉反应性细胞免疫应答，用HIV-1群M、共有亚型C、HIV-1MN(亚型B分离物)、HIV-1C.UY.01.TRA3011和C.ZA.01.J54Ma(两种亚型C分离物)包膜肽对BalB/C和HLA-A2转基因小鼠进行IFN-γELISpot。这些试验可进一步测定5A、C和E中观察到的结果是否仅与肽靶相关或者实际上是由于免疫宽度的增加。如图6A所示，pEY2E1-B免疫BalB/C小鼠中HIV-1MN包膜肽四种集合的SFU数/百万脾细胞总和为1855+215.8，该值约为pEK2P-B免疫BalB/C小鼠的两倍(SFU/百万脾细胞为700+168.2)，表明在亚型B内pEY2E1-B比pEK2P-B有更强的交叉反应性。pEY2E1-B免疫BalB/C小鼠中，对HIV群M(图6B)和亚型C(图6C)共有包膜肽四种库刺激起反应的IFN-γ斑点数目分别为1150+191.3和715+116.1。而pEK2P-B免疫BalB/C小鼠中针对群M和亚型C肽的斑点数目为635+152.3和345+82.3，这些数据表明，在BalB/C小鼠内，pEY2E1-B引发的进化支交叉免疫应答比pEK2P-B诱导的免疫应答强约45％。
重要的是，我们在转基因小鼠内观察到由pEY2E1-B诱导的更强的交叉反应性细胞免疫应答(图6F-J)。pEY2E1-B免疫转基因小鼠中针对四种HIV-1MN包膜肽库的SFU数/百万脾细胞总和为1087+153，该值是pEK2P-B免疫HLA-A2小鼠的约三倍(SFU/百万脾细胞为316+63)(图6F)，表明在转基因小鼠中pEY2E1-B也能引发比亚型B内的pEK2P-B更强的交叉反应性。pEY2E1-B免疫转基因小鼠中，对用四种HIV群M(图6G)和亚型C(图6H)共有包膜肽库刺激起反应的IFN-γ斑点数目分别为2116+216和893+154。而pEK2P-B免疫转基因小鼠中针对群M和亚型C肽的斑点数目为473+50和266+55，这些数据表明，在转基因小鼠内，pEY2E1-B引发的进化支交叉免疫应答比pEK2P-B诱导的免疫应答强约3-4倍。此外，可作为严格对照以评价其他肽组得到的宽度和交叉反应性的两种亚型C分离物肽组被用来进一步测定交叉进化支C免疫应答。尽管pEY2E1-B和pEK2P-B在BalB/C小鼠内引发的针对这两种亚型C分离物组的交叉反应性没有太大差异(图6D和E)，但pEY2E1-B诱导的针对这两种亚型C分离物组的交叉进化支反应性比pEK2P-B约强三倍(图6I和J)。在pEY2E1-B免疫转基因小鼠中，针对C.ZA.01.J54Ma和C.UY.01.TRA3011肽的斑点数为1080+206和890+150，而在pEK2P-B免疫转基因小鼠中仅为305+38和310+62。
最后，我们通过详细了解在BalB/C和HLA-A2转基因小鼠中观察到的针对HIV-1MN的细胞免疫应答测定了EY2E1-B免疫原诱导的针对亚型特异性靶的交叉反应性细胞免疫应答的宽度是否也有增加。对跨越亚型BMN包膜蛋白的肽文库进行表位绘图试验。结果提示，合成包膜在两种小鼠品系中均未诱导显著的优势表位。然而，对pEY2E1-B-免疫BalB/C小鼠衍生出的脾细胞进行IFN-γELISpot分析显示，29个库中有14个显示出斑点超过50，而pEK2P-B免疫BalB/C小鼠仅有9个库(图7A)。类似地，在转基因小鼠内，pEY2E1-B免疫转基因小鼠中，29个库中有18个库显示出斑点超过50，而pEY2P-B免疫转基因小鼠仅有6个库(图7B)。这些数据表明，在BalB/C和HLA-A2转基因小鼠中，EY2E1-B免疫原诱导的交叉反应性细胞免疫应答的宽度和幅度明显增加。
讨论
世界范围内HIV-1DNA疫苗研究的指导原则是HIV-特异性T-细胞应答一定程度上有助于保护免于感染或控制感染后复制。DNA疫苗可影响病毒复制，尽管它们的免疫诱导功能通常不如减毒的活病毒载体(Almond，N.等.1995.用减毒的猿免疫缺陷病毒免疫猕猴以抵抗病毒感染细胞的攻击(Protectionbyattenuatedsimianimmunodeficiencyvirusinmacaquesagainstchallengewithvirus-infectedcells).Lancet345:1342-1344；Berman，P.W.等1996.用MN-rgp120免疫黑猩猩以抵御人免疫缺陷病毒1型基本分离物的异源感染(ProtectionofMN-rgp120-immunizedchimpanzeesfromheterologousinfectionwithaprimaryisolateofhumanimmunodeficiencyvirustype1).JInfectDis173:52-9；Boyer，J.等1997.用DNA疫苗保护黑猩猩抵御高剂量异源HIV-1攻击(Protectionofchimpanzeesfromhigh-doseheterologousHIV-1challengebyDNAvaccination).NatMed3:526-532；Daniel，M.C.等1992.nef基因缺失的活的减毒SIV疫苗的保护作用(ProtectiveeffectsofaliveattenuatedSIVvaccinewithadeletioninthenefgene).Science258:1938-1941)。因此以提高细胞免疫应答宽度和幅度为目的的方法是重要的。本发明提供了一种采用免疫原若干特征的新型抗原，所述特征已作为单独研究在文献中报道过，但之前从未将其与一种疫苗模态组合。为证实这一观点，开发了基于合成的工程改造共有序列的包膜免疫原，并与优化的基本序列免疫原比较了诱导细胞介导的免疫应答的能力。表达数据显示，这种工程改造的新包膜基因可在哺乳动物细胞系内有效表达，尽管这两种免疫原的表达水平非常类似(图3A)。我们在免疫原性研究中观察到，这种功能性免疫原诱导的细胞免疫应答与基本包膜疫苗相比显示多样性和幅度提高。从BalB/C和HLA-A2转基因小鼠获得的表位绘图数据都证实，这种多样性和幅度的提升在这些单元型之间得以维持。为进一步证实该发现，我们还开发了基于共有序列的亚型C包膜免疫原并将其与基本亚型C免疫原进行比较，基于合成的共有序列的亚型C包膜免疫原相比基本亚型C免疫原再次显示细胞免疫应答多样性和幅度提高(未公布数据)。
从疫苗设计策略观点来看，候选疫苗与感染或竞争病毒之间的序列同源性可能是需要着重考虑的。尽可能降低疫苗株与对应循环病毒之间的序列不相似性程度的有效方法是产生作为这些病毒“核心”的人工序列。设计这种序列的一种方法是使用衍生自在比对的每个位置都最常见的氨基酸的共有序列。在该研究中，我们开发了一种基于共有序列的亚型B包膜疫苗并认为该合成免疫原将具有较高交叉反应性。我们的结果的确显示pEY2E1-B疫苗诱导的细胞免疫应答存在多样性。Balb/c和转基因小鼠的肽绘图结果也都显示，EY2E1-B免疫原使免疫应答变宽。此外，交叉反应性细胞免疫应答研究结果显示，pEY2E1-B能引发明显较强且较宽的交叉反应性细胞免疫应答。因此，人工共有包膜免疫原含有比任何天然单个分离物中的表位更加保守的表位并能诱导较宽的进化支间CTL反应。
理论上共有序列具有优点和缺点。由于共有序列是基于同期分离物生成的，因此与任何给定的天然病毒分离物相比它在遗传上可能更接近目前的循环病毒株。然而，由于通常对慢性感染期间取样的病毒而不是急性感染期间取样的病毒进行全局测序，开发对于大多数曾经避开部分的表位的共有疫苗应答可能是一种缺点。为尽可能减少这一缺点，一种有用的疫苗设计方法可能会考虑早期递质序列。由于HIV-1包膜基因超变区是通过快速插入和删除而非点突变产生的，因此包膜蛋白是最难人工构建的HIV蛋白之一。超变区长度的差异使得难以从这些区域产生共有序列。最近，Gao等(Gao，F.，E等.2005.合成的人免疫缺陷病毒1型群M共有包膜糖蛋白的抗原性和免疫原性(Antigenicityandimmunogenicityofasynthetichumanimmunodeficiencyvirustype1groupmconsensusenvelopeglycoprotein).JVirol79:1154-63)产生了群M共有包膜序列，然而，来自CRF08BC重组株相应区域的非共有序列被用于这些可变区。研究已经证实，编码具有较短V1、V2和V4区的包膜糖蛋白的亚型C病毒传递到受者的频率明显高于预期的偶然频率。早期感染得到的亚型A包膜序列也具有明显较短的V1和V2环序列和较少的潜在的N-连接的糖基化位点(Chohan，B.，D.等2005.选择某些遗传亚型传递期间出现的并和影响病毒RNA水平的具有较短V1-V2环序列的人免疫缺陷病毒1型包膜糖基化变体(SelectionforHumanImmunodeficiencyVirusType1envelopeglycosylationvariantswithshorterV1-V2loopsequencesoccursduringtransmissionofcertaingeneticsubtypesandmayimpactviralRNAlevels).J.Virol.79:6528-6531)。相反，最近传递的亚型B变体不具有较短的V1和V2环。然而，要注意亚型B感染病例主要是同性传递或药物注射的结果，这可能是重要的。此外，研究提示，具有紧凑V1、V2区的可能的功能后果是提高CD4结合区接触，从而增强对中和的易感性(Edwards，T.G.等2001.人免疫缺陷病毒1型包膜蛋白中CD4独立性、中和作用敏感性以及接触CD4-诱导表位之间的关系(RelationshipsbetweenCD4independence,neutralizationsensitivity,andexposureofaCD4-inducedepitopeinaHumanImmunodeficiencyVirustype1envelopeprotein).J.Virol.75:5230-5239；Kolchinsky，P.等2001.不依赖于CD4的人免疫缺陷病毒变体的中和作用敏感性提高(IncreasedneutralizationsensitivityofCD4-independentHumanImmnuodeficiencyVirusvariants).J.Virol.75:2041-2050；Pickora，C.等2005.鉴定在除去之后能增强可溶性CD4敏感性的猿免疫缺陷病毒糖蛋白核心内的N-连接糖基化位点(IdentificationoftwoN-linkedglycosylationsiteswithinthecoreoftheSimianImmunodificiencyvirusglycoproteinwhoseremovalenhancessensitivitytosolubleCD4).J.Virol.79:12575-12583；Puffer，B.A.等.2002.猿免疫缺陷病毒Envs的CD4独立性与巨噬细胞向性、中和作用敏感性和减毒的病原性相关(CD4independentofSimianImmunodeficiencyVirusEnvsisassociatedwithmacrophagetropism,neutralizationsensitivity,andattenuatedpathogenicity).J.Virol.76:2595-2605)。当制造亚型B共有序列时我们截短了V1和V2区。
HIV-1感染的早期阶段受非-合胞体-诱导(NSI)病毒控制，该病毒缓慢复制并使用CCR5作为它们的主要共同受体。合胞体-诱导(SI)病毒在CD4细胞衰退加速和感染的进行性临床进程前出现在约50％的受感染个体中，其使用CXCR4作为主要共同受体。已证实所有亚型都存在HIV变体对共同受体的差异应用。亚型C病毒似乎不同于大多数其他亚型，因为常有报道称亚型C中使用CXCR4的HIV变体较少。因此，CCR5的利用应成为疫苗设计中一个非常关键的考虑因素。之前的报道显示，gp120的V3区在共同受体利用中扮演重要角色。V3环内的6个残基已被鉴定为CCR5相互作用的关键残基：精氨酸307，赖氨酸314，异亮氨酸316，精氨酸322，苯丙氨酸324和丙氨酸337。然而，基于亚型C早期递质的序列，第322位的残基应是谷氨酰胺而非精氨酸。总之，之前的研究显示CCR5利用重要残基和早期递质序列，基于此，我们设计出了能驱动理论上以CCR5利用为目标的免疫应答的亚型B共有包膜免疫原。
为最大化潜在交叉反应性，已经产生了HIV-1群M共有包膜序列。然而，与循环病毒相比，亚型-特异性包膜共有疫苗可能至少在细胞免疫应答水平上损害了疫苗抗原的整体序列相似性。研究已经显示在亚型B和C包膜蛋白的不同区域内鉴定到的高选择率。其原因可能是对亚型B和C包膜蛋白不同区域的不同免疫压力。因此，使用亚型-特异性包膜疫苗可能是有利的，这是由于对疫苗和循环病毒的免疫应答将共享抗原性区域。需要进行更多实验来比较群M和亚型-特异性包膜疫苗以进一步阐明这一观点。
有关使用共有序列的另一个重要内容是，其序列可能与任何天然病毒中未发现的组合多态性有关，从而可能导致不正确的蛋白质构象。之前的研究显示，群M共有免疫原可折叠成天然构象，保留包膜抗原表位并引发弱中和抗体反应。基于合成蛋白质能够结合抗体2G12、ID6和F105的事实，我们认为pEY2E1-B可能在一定程度上具有天然结构构象。重要的是，我们的数据也证实，EY2E1-B免疫原可诱导较高效价的亚型B包膜-特异性抗体，表明这种合成免疫原也可保留更多II类表位。该领域需要进行更多研究。
随着新HIV-1疫苗方法的产生，用临床前模型预测这些疫苗在人类中的功效的需求也不断增加。在我们的研究中，采用HLA-A2转基因小鼠来研究这种合成免疫原引发的细胞免疫应答。研究显示，这种转基因品系是涉及最佳刺激人CD8+溶细胞T细胞的感染性疾病疫苗的设计和检测的重要临床前模型。该模型的结果表明，EY2E1-B比EK2P-B能引发更宽、更强的细胞免疫应答，提示这种新的疫苗能更有效的诱导HLA-A2-限制性细胞应答。正在计划在非人灵长类中进一步研究这种免疫原中。
总之，我们的结果提示，EY2E1-B可作为免疫原，它能作为DNA疫苗盒同时提高CTL应答的幅度和宽度。更全面的说，这种构建物可用于其他平台，从而在非DNA载体方案中诱导更强且更宽的抗HIV毒株的细胞免疫应答。
实施例2能增强引发的细胞免疫应答的多样性和宽度的新型工程改造
HIV-1进化支C包膜DNA疫苗的开发
强HIV-1特异性CTL应答的一个重要作用是管理急性和无症状感染期间的病毒载量。然而，进来对共有免疫原的研究无法显著证实改进的细胞免疫应答。这里，我们测试了用于改进的细胞免疫应答的基于新型工程改造进化支C共有序列的包膜免疫原。这种新型疫苗(pEY3E1-C)产生自HIV-1进化支C共有包膜序列。进行的一些修饰包括缩短基于早期递质序列的高变V1和V2区，保留供CCR5使用的V3环，除去C末端的胞质尾区域以防止包膜再循环，以及保留切割位点和TMD以供正确折叠。同时在N末端加入IgE前导序列。这种共有DNA疫苗也经过RNA优化和密码子优化。通过ELISpot和表位绘图试验研究BalB/C小鼠的细胞免疫应答。当作为DNA疫苗研究时，与pEK3P-C(衍生自进化支Cenv的基本分离物)相比，我们的构建物(pEY3E1-C)能更加有效地驱动细胞免疫应答。当用共有进化支C肽刺激时pEY3E1-C引发的细胞免疫应答幅度大于pEK3P-C。此外，当用同样来自于进化支C的其他两组基本分离物肽刺激时，共有免疫原引发细胞免疫应答幅度增加。除了幅度增加，在对两组基本分离物肽的反应中，pEY3E1-C能够在29个库中诱导至少15个强反应性肽库(具有超过50个斑点/百万脾细胞)，而pEK3P-C仅在29个库中诱导3个和9个有强反应性的库(根据它们的唯一性和作为评价宽度的严格对照的能力进行选择)也支持CTL反应宽度增加。此外，当用进化支B肽刺激时pEY3E1-C引发较强的交叉进化支细胞免疫应答。共有免疫原pEY3E1-C作为DNA疫苗盒能同时增强的CTL反应的幅度和宽度，提示共有免疫原作为HIV疫苗混合物中一种组分的潜能值得进一步检验。
由于现有毒株的宽遗传多样性、快速突变和重组，产生有效疫苗的难度非常大。衍生自单个分离物的候选DNA疫苗不能保护抵御各种HIV-1循环毒株所需的交叉反应性。此外，已经报道表达HIV-1包膜糖蛋白的DNA疫苗免疫原性不是非常强。
我们已经采用多阶段策略来提高DNA疫苗引发的CTL反应的效力以便尽可能提供针对病毒循环毒株的保护。
最近的研究已显示，共有免疫原能克服HIV-1病毒快速进化产生的多样性障碍。
Derdeyn等发现，V1-V4区较短是早期传递亚型C病毒的特征，我们的构建物设计成具有这一特征，这可能有助于产生早期传递病毒导致的免疫应答。
此外，我们的DNA疫苗的表达水平通过密码子优化、RNA优化以及免疫球蛋白前导序列的加入得到增强。
已显示HIV-1特异性CTL反应对于控制急性和无症状感染期间的病毒载量以及AIDS的发展是重要的，因此下面的数据关注的是我们的新型免疫原引发的CTL反应。
图13描绘了免疫原设计，其用于开发能增强引发的细胞免疫应答的多样性和宽度的新型工程改造HIV-1进化支C包膜DNA疫苗。
图14显示了系统发生关系：该系统发生分析中包括36种HIV-1亚型C包膜序列、EY3E1-C、EK3P-C、两种亚型B、一种亚型A和一种亚型D序列(外类群。代表宽样品多样性的亚型C包膜序列来自12个国家。
表3显示了可能的包膜候选疫苗与亚型C包膜序列比对之间相似性百分比评分的平均值和范围。
表3
％相似性评分平均值 ％相似性评分范围
pEY3E1-C 85.3 82.7-93.1
pEK3P-C 87.4 83.6-90.2
三组Balb/C小鼠用100μgDNA免疫三次，每次免疫接种间隔两周。在第7周收获脾脏进行细胞研究。
如图15A和B所示，pEY3E1-C引发强烈的细胞应答。
图16显示了pEY3E1-C引发的强且宽的细胞应答。当用29种共有Cenv肽库刺激时：pEY3E1-C免疫的小鼠引发超过50点/百万脾细胞的库有23个；pEK3P-C免疫的小鼠引发超过50点/百万脾细胞的库有2个。
图17A-D显示了pEY3E1-C在相同进化支内引发的强交叉反应性细胞应答。
图18A和B显示了pEY3E1-C引发的强且宽的交叉反应性细胞应答。图A显示了亚型C(乌拉圭)env-特异性IFN-γELISpot的数据。当用29种进化支C(乌拉圭)env肽库刺激时：pEY3E1-C免疫的小鼠引发超过50点/百万脾细胞的库有12个；pEK3P-C免疫的小鼠引发超过50点/百万脾细胞的库有3个。图B显示了亚型C(南非)env-特异性IFN-γELISpot的数据。当用29种进化支C(南非)env肽库刺激时：pEY3E1-C免疫的小鼠引发超过50点/百万脾细胞的库有13个；pEK3P-C免疫的小鼠引发超过50点/百万脾细胞的库有5个。
图19图A-f显示pEY3E1-C在进化支之间引发的强交叉反应性细胞应答。
EOC免疫原诱导的细胞免疫应答的宽度和幅度都显著增加。较宽的交叉进化支反应性是这种免疫原的额外好处。
实施例3:编码E6/E7融合蛋白的新型工程改造HPV-16DNA疫苗的效力
已经设计出了作为多蛋白表达的免疫原，其中的E6和E7序列被蛋白水解切割位点分隔。该多蛋白还与IgE前导序列一起表达。多蛋白设计包括E6序列内的缺失或突变，这对于p53结合和降解以及E7蛋白上Rb结合位点内的突变是重要的。图23提供了免疫原设计的示意图。
编码多蛋白的编码序列被插入载体pVAX以制造质粒p1667。图24显示了pVax和p1667的图谱。
TC1肿瘤细胞用HPV-16E7永生化并用c-Ha-ras癌基因转化。这些细胞表达低水平E7并且是极具致瘤性。
在小鼠的免疫原性研究中，每组3只C57BL6小鼠被给予100μgDNA/每只小鼠。各组包括：1)对照，给予pVAX-对照载体，和2)测试，给予p1667。在第0、14和28天免疫小鼠。在第35天杀死小鼠并进行ELISPOT(关注CMI)。
DNA免疫原p1667诱导的细胞免疫应答数据显示于图25。HPV16共有E6和E7肽(37-聚体和15-聚体，有9个氨基酸重叠)被用于两个库：库1为18肽；库2为19肽。图A和C显示总脾细胞的数据。图B和D显示了CD8缺失样品的数据。
图26显示了优势免疫表位绘图结果。标出了两个序列。
在小鼠的预防性实验中，每组5只C57BL6小鼠被给予100μgDNA/每只小鼠。各组包括：1)原初(注射PBS)，2)对照，给予pVAX-对照载体，和3)测试，给予p1667。在第0、14和28天免疫小鼠。在第35天用TC-1细胞攻击小鼠并在这之后测量肿瘤大小。结果显示于图27。还显示了共给予IL-15构建物的一组的数据。
在小鼠的肿瘤消退实验中，每组5只C57BL6小鼠被给予100μgDNA/每只小鼠。各组包括：1)原初(注射PBS)，2)对照，给予pVAX-对照载体，和3)测试，给予p1667。在第0天用5x104TC-1细胞攻击小鼠。在第3、10和17天给予小鼠DNA疫苗。从第8天开始测量肿瘤。结果显示于图28。还显示了共给予IL-15构建物的一组的数据。
测定了脾脏中E7四聚体阳性淋巴细胞的水平。图29显示的数据为E7四聚体阳性淋巴细胞的百分比。DNA疫苗p1667诱导E7-特异性CD8+T细胞活化，其为脾内的CD62Llo。
测定了肿瘤中E7四聚体阳性淋巴细胞的水平。图30显示的数据为E7四聚体阳性淋巴细胞的百分比。DNA疫苗p1667诱导E7-特异性CD8+T细胞活化，其为肿瘤内的CD62Llo。
在转基因小鼠中研究E6/E7DNA疫苗保护作用。将原初、pVAX、p1667、p1667+IL-15和E7/HisB之间进行比较。数据显示于图31。p1667和p1667+IL-15完全保护。
这里展示的数据支持以下结论。p1667构建物诱导强细胞免疫应答，这种免疫应答能够诱导介导升高的IFN-g反应的E7-特异性CD8+淋巴细胞。我们同时鉴定了优势HPV-16表位和新的亚优势(sub-dominant)HPV-16表位，在给予DNA构建物之后产生了针对上述表位的抗原-特异性CTL。p1667构建物在C57/BL6和转基因小鼠中都能够预防肿瘤生长以及造成肿瘤消退。DNA疫苗p1667显示极有可能是靶向显微HPV-相关癌症的新型治疗方法。
实施例4
可采用例如电穿孔技术进行肌内注射或真皮内注射将编码HIVEnv共有序列的核酸序列与编码各种其他HIV蛋白如Gag、Pol、Gag/Pol、Nef、Vif和Vpr的核酸序列作为DNA疫苗组合给予。多价(multivalent/polyvalent)HIV疫苗构建物可提供增强的免疫应答且特别有用。一些实施方式中，额外提供了IL-12编码序列。通过引用纳入本文的美国专利申请公布号20070106062披露了HIVVifDNA疫苗。通过引用纳入本文的美国专利申请公布号20040106100披露了包含HIV辅助蛋白质的HIV疫苗，同时披露了这种蛋白质的序列，它可用于制备其他的疫苗构建物。通过引用纳入本文的美国专利6,468,982、5,817,637和5,593,972披露了包含HIVgag、HIVpol和HIVgag/pol构建物的DNA疫苗。电穿孔描述于美国专利7,245,963，其通过引用纳入本文。通过引用纳入本文的PCT申请PCT/US97/19502披露了IL-12构建物。通过引用纳入本文的美国申请公布号20070041941披露了编码IL-15的构建物。
实施例5
两组猕猴用含或不含质粒IL-12的优化质粒gag和env构建物IM免疫三次。对另外两组采取相同的免疫方法，但采用或不采用体内电穿孔递送质粒。
每次免疫后通过IFNγELISpot测定细胞应答并在5个月后测定记忆应答。研究过程中通过重组p24和gp160ELISA评价体液反应。抗原-特异性T细胞的增殖能力通过CFSE染色确定。进行胞内细胞因子染色以进一步表征诱导出的T-细胞应答的功能特性。
质粒IL-12增强了对我们的优化构建物的细胞应答。然而，与用质粒IL-12进行IM免疫相比，使用电穿孔增强质粒的递送能够同时提高细胞应答和体液应答。从各种参数测得，对于基础应答和记忆应答而言，质粒IL-12和电穿孔组合都得到了最佳免疫应答。
在存在或不存在质粒IL-12作为DNA佐剂时在猕猴中比较了优化的编码HIVgag和env的DNA构建物。在定量ELISpot模式中IL-12能够使T细胞应答实质性提高5倍，从而导致实质性更好的记忆T细胞应答。然而，EP递送的DNA在产生T细胞应答和记忆效应时更加有效，比IL-12IMDNA佐剂疫苗高两倍。在EP+IL-12佐剂的组合分支(arm)中观察到最佳反应。该分支中的记忆应答比单独的IMDNA高10倍，比单独的EP几乎高两倍。我们还通过CFSE观察到，与单独EP相比，EP+IL-12分支中的免疫扩增好4倍。存在多功能T细胞还提示，DNA+细胞因子+EP分支是最有效的。
材料和方法
动物:
按照美国实验动物护理委员会(AmericanAssociationforAccreditationofLaboratoryAnimalCare)的标准，由BIOQUAL有限公司(洛可维尔(Rockville)，马里兰州)饲养猕猴(Macacamulatta)。任何实验之前让动物适应隔离检疫至少30天。
免疫：
在第0、4和11周用1.0mgpGag4Y和pEY2E1-B免疫5只猕猴。在各免疫时间点将DNA递送到两个注射部位，每个部位在各四头肌内。3只猕猴在IM注射后进行电穿孔。另一组5只猕猴在第0、4和8周用1.0mgpGag4Y、pEY2E1-B和WLV104免疫。5只动物中，2只动物接受IM注射免疫，3只动物在IM注射后进行电穿孔。所有电穿孔过程采用恒流CellectraTM装置(VGX制药有限公司的VGX免疫治疗分公司(VGXImmuneTherapeuticsDivisionofVGXPharmaceuticals)，伍德兰(TheWoodlands)，得克萨斯州)进行。电穿孔条件为0.5安培，3次脉冲，52毫秒脉冲长度，两次脉冲之间间隔1秒。将该软件控制装置设计成先测量组织抵抗力然后立即进行质粒递送和产生恒流方波脉冲，从而消除了肌肉组织外递送和潜在质粒流失的风险。
采血：
在研究期间每两周采集一次动物血样。将10mL血液收集到EDTA管。通过标准菲可哈帕克(Ficoll-hypaque)离心分离PBMC，然后将其重悬于完全培养基(RPMI1640+2mM/LL-谷氨酰胺，添加10％热灭活胎牛血清胎牛血清、100IU/mL青霉素，100μg/mL链霉素和55μM/Lβ-巯基乙醇)。RBC用ACK裂解缓冲液(凯氏生物科技公司(CambrexBioScience)，东卢瑟福(EastRutherford)，新泽西州(NJ))裂解。
质粒和质粒产物：
Gag4Y所含表达盒编码HIV进化支A、B、C和D的gag蛋白的共有序列，具有以下一些修饰：添加kozak序列，取代的IgE前导序列，对密码子和RNA进行优化以在哺乳动物细胞内表达(SEQIDNO:11公开了HIVGag共有序列)。将Gag4Y基因亚克隆入表达载体pVax供进一步研究。pEY-2E1-B所含表达盒编码HIV进化支B的包膜的共有序列(SEQIDNO:3公开了HIVEnv共有序列)。WLV104M是编码猕猴IL-12基因的质粒。质粒由艾德弗隆公司(Aldevron)(法戈(Fargo)，北达科他州)制造，并由VGX免疫治疗公司(伍德兰，得克萨斯州)用无菌水重配以便与低分子量0.1％聚-L-谷氨酸钠一起注射。
冷冻保存的PBMC的CFSE
冷冻保存的PBMC在37℃水浴中快速解冻并用完全培养基洗涤。细胞在37℃培养箱内温育过夜并在第二天获得细胞计数。将细胞沉淀并重悬于PBS配制的1mlCFDASE(分子探针公司，尤金(Eugene)，俄勒冈州)(1:2000稀释)。细胞在37℃下温育10分钟。细胞用完全培养基洗涤并重悬至1x106细胞/100ul的浓度，将细胞接种于含100ul2μg/ml重组HIV-1p24或gp120(免疫诊断公司(ImmunoDiagnostics)，沃本(Woburn)，马萨诸塞州)+肽库的96孔圆底平板内。5μg/ml伴刀豆球蛋白A(阳性)和完全培养基(阴性)用作对照。将培养物培育5天。细胞先用Vivid染料紫罗兰(一种活/死细胞标记物)在冰上染色15分钟。细胞用PBS洗涤一次。然后细胞用抗-人CD3-PE(克隆SP34-2)(BD药厂(BDPharmingen))和抗-人CD4-PerCP(克隆L200)、抗-人CD8-APC(SK1)在4℃染色1小时。细胞然后用PBS洗涤两次并用1％低聚甲醛固定。数据使用LSRII流式细胞仪(LSRIIflowcytometer)(BD生物科技公司，富兰克林湖(FranklinLakes)，新泽西州)收集。流式细胞术数据采用FlowJo软件(树星公司(TreeStar)，阿什兰(Ashland)，俄勒冈州)分析，在CD3+淋巴细胞上进行门控。每份样品收集3-5万个CD3+淋巴细胞。
酶联免疫吸附试验(ELISA)：
96孔平板用100ng/孔的重组HIV-1IIIBp24orgp120(免疫诊断公司)包被过夜以分别检测HIVgag和env反应。包被有100ng/孔牛血清白蛋白的平板作为阴性对照。平板用3％BSA-PBST在37℃封闭1小时。平板然后用4倍连续稀释血清在37℃培育1小时。然后在平板中加入1:10,000稀释的羊抗猴IgG辣根过氧化物酶偶联的抗体(MP生物医学公司(MPBiomedicals)，奥罗拉(Aurora)，俄亥俄州)并在37℃培育1小时。用四甲基联苯胺(R&D系统公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州)使平板显色，用2NH2SO4终止反应。然后测量光密度(OD)。
IgG终点效价定义为导致OD值为BSA孔平均OD值两倍以上的血清稀释度的倒数。
酶联免疫斑点试验(ELISpot)
测定抗原特异性反应时将含有肽的孔的斑点数减去阴性对照孔的斑点数。显示的结果是三复孔的平均值(斑点/百万脾细胞)。
胞内细胞因子染色
抗体试剂
从BD生物科技公司(圣何塞(SanJose)，加州)获得直接偶联的抗体：IL-2(PE)、CD3(PacificBlue)、IFN-γ(PE-Cy7)、以及TNF-α(AlexaFluor700)、CD8(APC)和CD4(PerCP)。
细胞刺激和染色
将PBMC重悬于完全RPMI至1x106细胞/100ul，然后接种于含100ul作1:200稀释的刺激肽的96孔平板。每个试验包括未刺激的阳性对照(葡萄球菌肠毒素B，1μg/mL；西格玛奥尔德里奇公司)。细胞在37℃温育5小时。温育之后将细胞洗涤(PBS)并用表面抗体染色。将细胞洗涤并用Cytofix/Cytoperm试剂盒(BDPM公司(BDPharMingen)，圣地亚哥，加州)按照说明书固定。固定之后细胞用透化缓冲液(permbuffer)洗涤两次并用抗胞内标记物抗体染色。染色后将细胞洗涤、固定(含1％低聚甲醛的PBS)并储存于4℃直到分析。
流式细胞术
用改进的LSRII流式细胞仪(BD免疫细胞计数系统公司(BDImmunocytometrySystems)，圣何塞，加州)分析细胞。从每个样品收集到50000个CD3+事件。采用FlowJo版本8.4.1(树星公司，圣卡洛斯(SanCarlos)，加州)进行数据分析。初级门控采用前向散射面积(forwardscatterarea)(FSC-A)与高度(FSC-H)的曲线以除去双峰。通过FSC-A与SSC曲线对事件进行淋巴细胞门控。之后，依次根据IFN-γ对CD3+、CD8+和CD4-事件进行门控以解释下调。鉴定CD8+T细胞之后使用提供最佳分离的组合对各个单独功能进行门控。在各个功能的门控都形成之后，我们采用Boolean门控平台产生可能组合的全部阵列，即测试3种功能时有8种反应模式。进行背景校正之后报道数据。各反应的阈值为10次事件或0.05％。
统计学分析
数据采用PrismGraphpad软件分析并表示为平均值±SEM。
结果
ELISpot分析
每次免疫之后通过IFNγELISpot评价对细胞免疫应答的诱导作用。单次免疫之后(图1)，仅通过IM注射接受质粒DNA的组显示出弱细胞应答(74±29SFU/106PBMC)。用猕猴IL-12质粒共免疫得到较高应答(136±51.4SFU/106PBMC)。电穿孔(EP)组的平均应答是IM组的6倍以上(482±181SFU/106PBMC)。IL-12共免疫与EP组合进一步使IFNγ-生成细胞的数目加倍(1030±494SFU/106PBMC)。
两次免疫后(图1)，IM和IM+IL-12组的ELISpot计数增加不多(分别为104±67.9SFU/106PBMC和223±76.6SFU/106PBMC)。EP组的反应几乎是前次免疫的4倍(1924±417SFU/106PBMC)，而EP+IL-12组的IFNγ-生成细胞的数目相比单用EP再次加倍(2819±872SFU/106PBMC)。
第三次免疫之后(图1)，EP组中抗原特异性细胞的数目高出IM组一个对数级(分别为5300±3781和370±110SFU/106PBMC)。IM+IL-12组的细胞应答也急剧升高，其ELISpot计数几乎比前次免疫高一个对数级(2042±311SFU/106PBMC)。对于另外两种免疫方法，EP+IL-12组是所有免疫组中最强的一组(7228±2227SFU/106PBMC)。
交叉反应性包膜反应的诱导
成功的HIV疫苗需要能诱导交叉反应性免疫应答，在这点上，如果EP+IL-12能提高对各种肽文库的交叉反应性的幅度则是令人感兴趣。我们采用共有群M的肽文库比较env抗原诱导的交叉反应性CTL反应。在所有组内观察到交叉反应性。然而结果显示，在亚型BELISpot分析中观察到了相同的幅度差异(图2)。免疫3次之后，IM组对群M包膜肽的反应最弱(222±SEMSFU/106PBMC)。加入IL-12使反应加倍(540±SEMSFU/106PBMC)。EP诱导了较高的群M包膜反应(830±SEMSFU/106PBMC)，IL-12共注射进一步增强了这种反应(1238±SEMSFU/106PBMC)。
1.记忆T细胞应答
一个重要的结果是用DNA平台能够促进记忆应答的产生。我们在最后一次DNA免疫5个月后进行了ELISpot分析(图3)。在IM组内，加入质粒IL-12导致记忆细胞增加近10倍(751±11.1和78.6±16.9SFU/106PBMC)。显然，IL-12对于这种重要的T细胞表型有积极影响。EP组中也有实质数目的抗原-特异性IFNγ生成细胞，但IL-12佐剂+EP导致了最强的记忆应答(分别为1231±523.5和3795±1336SFU/106PBMC)，这种应答反应显示组合技术能驱动非常强的T细胞记忆应答。
对DNA疫苗的体液免疫应答
IMDNA疫苗技术的缺点在于它不能在非人灵长类和人临床研究中诱导明确的抗体应答。我们通过ELISA模式评价了各组诱导针对重组p24和gp160抗原的HIV-1gag和env特异性抗体效价的能力。对这两种抗原，IM和IM+IL-12组未显示显著的抗体效价(<1:50终点效价)。电穿孔组显示出明显较高的能够结合重组p24的gag抗体效价。尽管EP和EP+IL-12组在第12周都有类似的终点效价(分别为22,400和12,800)，但EP+IL-12组产生更加有效的抗体反应。该反应在所述免疫方案中出现得较早且最快升至最高水平。env抗体应答也反映了我们用gag抗原观察到的结果，尽管其终点效价较低。
CD4+和CD8+T细胞增殖
在观察到实质性ELISpot反应之后我们接下来检测了细胞免疫力的其他参数。我们检测了不同免疫组之间gag特异性CD4+和CD8+T细胞在肽刺激后体外增殖的能力。对在最后一次免疫两周后收集的冷冻保存样品进行刺激并通过CFSE试验分析。平均CD4+反应增加类似于ELISpot试验中观察到的。通过比较，CD8增殖诱导幅度惊人得多。我们观察到IL-12使CD8+T细胞增殖高于单独的IM，而EP则显著更高。EP+IL-12组中体外刺激后能够增殖的CD8+细胞百分比最高(分别为2.51±SEM％和4.88±SEM％)。在EP+IL-12分支中观察到明显的CD8T细胞增殖条带，证明了这种组合免疫的强增殖潜能。
多功能CD8+T细胞反应
尽管我们明确观察到EP和IL-12共免疫后诱导出了强IFNγ效应物反应，我们希望进一步表征抗原特异性CD8+T细胞应答在不同分支中的功能。最后一次免疫3个月后获得的样品用gag肽刺激并为胞内产生IFNγ、TNFα和IL-2细胞因子而作染色。所有组中，仅IM+IL-12组的一个动物和EP组的一个动物具有可检测的IFNγ反应。然而，EP+IL-12免疫组三只动物中的两只具有产生gag-特异性IFNγ的CD8+T细胞。IM+IL-12反应细胞具有一小部分多功能细胞(对所有三种细胞因子都被染色)以及已经丧失产生IL-2能力的群体。EP反应细胞的多功能反应略高，其中包括四种不同群体。在第二EP+IL-12动物中观察到最令人吃惊的反应。超过2％的其CD8+T细胞能够产生所有三种细胞因子，且2％能够同时产生IFNγ和TNFα。显然，每组中动物数较少并需要其他灵长类研究来证实这些结果，但总的来说观察到的趋势是清楚和令人鼓舞的。
讨论
IL-12作为DNA疫苗佐剂使ELISpot反应比单独的质粒提高数倍。此外还明显增强了增殖。EP组显示平均反应高于单独IM组或IM+IL-12分支，其显示出的组合ELISpot反应是IM+IL-12组的三倍。在EP+IL-12分支中观察到最佳ELISpot反应，其为IM+IL-12分支的4倍、单独IM的19倍。
在每次免疫之后通过IFNγELISpot测定抗原-特异性反应的幅度。单次免疫后EP和EP+IL-12组中所有动物不仅有可检测的反应，而且它们的平均值高于三次免疫后IM组的值。两次免疫后，EP和EP+IL-12组的IFNγ反应与采用病毒载体的研究中曾报道的反应相当。最后一次免疫5个月后在IM+IL-12组和EP组中都观察到实质性记忆应答。
用或不用IL-12的IM免疫不产生显著量的抗体。如之前所报道，电穿孔能够增强体液免疫应答。电穿孔组的所有动物发生血清转化。尽管EP和EP+IL-12组在三次免疫后有类似的终点效价，但EP+IL-12组的抗体诱导动力学略快。
EP和质粒IL-12看来能增强CD8T细胞的增殖能力。该数据支持ELISpot试验中观察到的记忆扩增效应，该试验中，抗原特异性T细胞的扩增可能是由于EP+IL-12分支的增殖潜能增强所致。

Claims (26)

1.一种包含选自下组的核苷酸序列的核酸分子：SEQIDNO:34；SEQIDNO:34的片段；与SEQIDNO:34具有至少90％同源性的序列；与SEQIDNO:34具有至少90％同源性的序列的片段。
2.如权利要求1所述的核酸分子，其包含核苷酸序列SEQIDNO:34。
3.如权利要求1所述的核酸分子，其包含与核苷酸序列SEQIDNO:34有至少95％同源性的序列。
4.如权利要求1所述的核酸分子，其包含与核苷酸序列SEQIDNO:34有至少98％同源性的序列。
5.如权利要求1所述的核酸分子，其包含与核苷酸序列SEQIDNO:34有至少99％同源性的序列。
6.如权利要求1所述的核酸分子，其包含编码具有氨基酸序列SEQIDNO:35的蛋白质的核苷酸序列。
7.一种包含选自下组的核苷酸序列的核酸分子：编码SEQIDNO:35的核苷酸序列；编码与SEQIDNO:35具有至少90％同源性的氨基酸序列的核苷酸序列；编码SEQIDNO:35的核苷酸序列的片段；编码与SEQIDNO:35具有至少90％同源性的氨基酸序列的核苷酸序列的片段。
8.如权利要求7所述的核酸分子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQIDNO:35的氨基酸序列的蛋白质。
9.包含权利要求1-8中任一项所述的核酸分子的质粒。
10.包含如权利要求1-8中任一项所述核酸分子的药物组合物。
11.包含如权利要求1-8中任一项所述核酸分子的可注射药物组合物。
12.包含如权利要求1-8中任一项所述核酸分子的重组疫苗。
13.如权利要求12所述的重组疫苗，其特征在于，所述重组疫苗是重组牛痘疫苗。
14.包含如权利要求1-8中任一项所述核酸分子的活的减毒病原体。
15.一种包含选自下组的氨基酸序列的蛋白质：SEQIDNO:35；与SEQIDNO:35具有至少90％同源性的序列；SEQIDNO:35的片段；与SEQIDNO:35具有至少90％同源性的序列的片段。
16.如权利要求15所述的蛋白质，其包含SEQIDNO:35的氨基酸序列。
17.如权利要求15所述的蛋白质，其包含与SEQIDNO:35的氨基酸序列有至少95％同源性的序列。
18.如权利要求15所述的蛋白质，其包含与SEQIDNO:35氨基酸序列有至少98％同源性的序列。
19.如权利要求15所述的蛋白质，其包含与SEQIDNO:35的氨基酸序列有至少99％同源性的序列。
20.包含如权利要求15-19中任一项所述蛋白质的药物组合物。
21.包含如权利要求15-19中任一项所述蛋白质的可注射药物组合物。
22.包含如权利要求15-19中任一项所述蛋白质的重组疫苗。
23.如权利要求22所述的重组疫苗，其特征在于，所述重组疫苗是重组牛痘疫苗。
24.包含如权利要求15-19中任一项所述蛋白质的活的减毒病原体。
25.权利要求1－8中任一项所述的核酸分子、权利要求9所述的质粒、权利要求15－19中任一项所述的蛋白质、权利要求10或20所述的药物组合物、权利要求11或21所述的可注射药物组合物、权利要求12－13和22-23中任一项所述的重组疫苗或权利要求14或24所述的活的减毒病原体在制备在个体内诱导针对hTERT的免疫应答的药物中的用途。
26.权利要求1－8中任一项所述的核酸分子、权利要求9所述的质粒、权利要求15－19中任一项所述的蛋白质、权利要求10或20所述的药物组合物、权利要求11或21所述的可注射药物组合物、权利要求12－13和22-23中任一项所述的重组疫苗或权利要求14或24所述的活的减毒病原体在制备治疗或预防癌症的药物中的用途。
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