CN1049106A - 稳定化的fgf组合物及其制备方法 - Google Patents

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吉岡稔
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Abstract

公开了(1)一种稳定化的FGF蛋白质组合物， 该组合物包含FGF蛋白质和非水溶性羟丙基纤维 素；(2)一种制备稳定化FGF蛋白质组合物的方法， 该方法包括使FGF蛋白质与非水溶性羟丙基纤维 素混合，以及(3)一种稳定FGF蛋白质的方法，该方 法包括使FGF蛋白质与非水溶性羟丙基纤维素混 合，从而得到稳定化了的FGF蛋白质，以固态形式 得到的组合物具有改善的稳定性。

Description

本发明涉及稳定化的成纤维细胞生长因子（下文简称为FGF）蛋白质组合物，制备稳定化FGF蛋白质组合物的方法，以及稳定FGF蛋白质的方法。
FGF首先是作为对成纤维细胞（如BALB/C3T3细胞）有强烈生长促进作用的因子分离的〔D.Gospodarowicz，Nature  249  123（1974）〕。现已知道，FGF几乎对衍生于中胚层的所有细胞都有生长促进作用。根据其等电点的不同，可将FGF分为碱性FGF（下文简称为bFGF）和酸性FGF（下文简称为aFGF）。bFGF和aFGF两者对血管内皮细胞均有很强的生长促进作用和血纤维蛋白溶酶原激活剂诱导作用。这些作用加在一起，提示可将其作为促进血管形成、治疗创伤，以及预防和治疗血栓形成和动脉硬化等药物的潜在应用。
从前，已由动物器官如牛垂体中纯化了均一的FGF。但这些FGF的来源是有限的，而且由于来自于异种动物器官、故难免存在抗原性问题。近年来已建立了一种大量生产FGF的方法，包括使用重组DNA技术在微生物或动物细胞中表达已克隆的人FGF基因〔FEBS  Letters，213，189-194（1987）欧洲专利公开（下文简称为EP公开）No.237，966）〕。
在其他方面，为了稳定多肽生产因子，而提供了一种含水医药组合物、特征在于包含提供足以稳定生长因子量的水溶性多糖，据称该组合物可有效地阻止多肽生长因子之促细胞分裂剂活性的降低及生物活性的降低〔日本未审查专利公开No.63-152324/1988，相当于EP公开No.267，015〕。
因为大多数FGF蛋白质都很不稳定，所以，它们不仅在含水溶液中会很迅速地失活，而且既使在冻干条件下也很容易降低其生物活性。此外，一个主要问题是在FGF蛋白静脉滴注若干小时时，此给药期间将不可避免地出现FGF滴度降低。
上述含有水溶性多糖的含水医药组合物，特别是在纤维素链上的每一无水葡萄糖单位所含醚基的醚取代程度至少为0.35的纤维素衍生物的情况下，当碱是FGF蛋白时即很难形成粉末形式的固体医药组合物。在混合和干燥过程中，出现组合物滴度降低。
本发明人已发现，将FGF蛋白与非水溶性羟丙基纤维素混合，可显著地提高FGF蛋白的稳定性。
具体地说，本发明人已成功地获得了与上述含有FGF蛋白和水溶性多糖之含水医药组合物比较，大大改善了FGF蛋白稳定性的固体组合物。
依据本发明，其提供了（1）一种包含FGF蛋白质和非水溶性羟丙基纤维素的稳定化的FGF蛋白质组合物;（2）一种制备稳定化FGF蛋白质组合物的方法，该方法包括将FGF蛋白质与非水溶性羟丙基纤维素混合;以及（3）一种稳定FGF蛋白质的方法，该方法包括将FGF蛋白质与非水溶性羟丙基纤维素相混合。
用于本发明的FGF蛋白质包括碱性FGF（下文也称之为bFGF）和酸性FGF（下文也称之为aFGF）。用于本发明的FGF蛋白质包括得自于哺乳动物的FGF，所说的哺乳动物包括人、猴、猪、牛、羊和马。
FGF蛋白质包括那些由各种器官提取的FGF，已知这些器官如脑和垂体中存在有FGF。
此外，FGF蛋白质包括那些以重组DNA技术得到的FGF〔FEBS  Letters  213，189-194（1987）;EP公开No.237，966〕。
重组的人碱性FGF在下文中可简称为rhbFGF。
用于本发明的FGF蛋白质包括FGF突变蛋白。
用于本发明之FGF突变蛋白的例子包括在Biochemical  and  Biophysical  Research  Communications  151，701-708（1988）、日本专利申请No.1-15662/1989（相当于EP公开No.326，907Al）中公开的突变蛋白;且可包括日本专利申请No.109014/1990（申请日为1990年4月25日，相当于欧洲专利申请No.90107737.0和美国专利申请Ser.No.511，469）中公开的至少引入一个糖基化位点的突变蛋白。
例如，用于本发明的FGF突变蛋白基本上是基于原始肽或蛋白质之氨基酸顺序的变异而得到的。所说的变异包括氨基酸的加入、结构氨基酸的缺失以及结构氨基酸被不同的氨基酸取代。此外，这些变异中还包括引入糖基化位点的FGF突变蛋白。
所说的氨基酸的加入包括至少加入一个氨基酸。
结构氨基酸的缺失包括至少缺失一个FGF结构氨基酸。
结构氨基酸被不同的氨基酸取代包括至少一个FGF结构氨基酸被至少一个不同的氨基酸取代。
在已加入了至少一个氨基酸的FGF突变蛋白中，所说的至少一个氨基酸不包括衍生于用于肽表达的起始密码子和信号肽的蛋氨酸。
被加入之氨基酸的数目至少是一个，但只要不丧失FGF特性，也可以是任何数目。更可取的是氨基酸包括蛋白质的某些或所有氨基酸顺序。这些顺序与FGF有同源性，并表现具有与FGF的氨基酸顺序相似的活性。
就至少缺少一个FGF结构氨基酸的突变蛋白中缺失的FGF结构氨基酸的数目来说，只要不丧失FGF特性，其可以是任何数目。
缺失的结构氨基酸的例子包括人bFGF之氨基端上的10个残基：
Met-Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Asp-Gly-Gly-Ser，
人bFGF之氨基端上的14个残基：
l
Met-Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Asp-
14
Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Phe-Pro
人bFGF之氨基端上的41个残基：
1  2  3  4  41
Met-Pro-Ala-Leu-……-Val
人bFGF之羧基端上的61个残基：
87  88  146  147
Lys-Cys-……-Val-Ser
突变蛋白进一步包括在原始bFGF肽或蛋白质的羧基端上缺失7至46个氨基酸残基的突变蛋白。
这些缺失的优选实例包括有rhbFGF下列氨基酸顺序的缺失：
从氨基酸序号102开始的氨基酸顺序
从氨基酸序号105开始的氨基酸顺序
从氨基酸序号115开始的氨基酸顺序
从氨基酸序号119开始的氨基酸顺序
从氨基酸序号124开始的氨基酸顺序
从氨基酸序号130开始的氨基酸顺序
从氨基酸序号138开始的氨基酸顺序
就突变蛋白（其中至少一个FGF结构氨基酸被至少一个不同的氨基酸取代）中取代前FGF结构氨基酸的数目来说，只要不丧失FGF特性，其可以是任何数目。
取代前结构氨基酸的例子包括半胱氨酸和胱氨酸，但较好是半胱氨酸。除半胱氨酸外，取代前的结构氨基酸还包括天冬氨酸、精氨酸甘氨酸和缬氨酸。
当取代前的结构氨基酸为半胱氨酸时，较好以中性氨基酸作为被取代的氨基酸。中性氨基酸包括甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸和蛋氨酸。特别优选的是丝氨酸和苏氨酸。
当取代前的结构氨基酸为半胱氨酸以外的任何氨基酸时，则可选择其亲水性、疏水性和电荷不同于取代前之氨基酸的氨基酸作为取代氨基酸。具体地说，当取代前的氨基酸为天冬氨酸时，取代氨基酸包括天冬酰胺、苏氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和精氨酸。尤其可取的是天冬酰胺和精氨酸。
当取代前的氨基酸是精氨酸时，取代氨基酸包括谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸。尤其可取的是谷氨酰胺。
当取代前的氨基酸是甘氨酸时，取代氨基酸包括苏氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、谷氨酸和精氨酸。特别是苏氨酸。
当取代前的氨基酸是丝氨酸时，取代氨基酸包括蛋氨酸、丙氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺，精氨酸和天冬氨酸。特别可取的是蛋氨酸。
当取代前的氨基酸是缬氨酸时，取代氨基酸包括丝氨酸、亮氨酸、脯氨酸、甘氨酸、赖氨酸和天冬氨酸。特别可取的是丝氨酸。
作为取代前的原有结构氨基酸，较好选择天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸和缬氨酸。
作为取代氨基酸，较好选择天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、丝氨酸和亮氨酸。
最为可取的取代的突变蛋白包括其中结构氨基酸半胱氨酸被丝氨酸取代的突变蛋白。
在上述取代中，可同时进行至少两个结构氨基酸的取代。特别是取代两个或三个结构氨基酸。
可借助联合进行两种或三种上述加入、缺失和取代途径得到突变蛋白。
较好是其中至少一个人bFGF结构氨基酸被至少一个不同的氨基酸取代。具体地说，是其中70和88位上的半胱氨酸分别被丝氨酸残基取代的rhbFGF突变蛋白CS23。
FGF突变蛋白中已至少引入了一个糖基化位点。且该突变蛋白可另外具有糖链。
糖基化位点包括一个其中构成该位点的氨基酸顺序如下式所示的位点：
Asn-X-Y
（其中X可以是任何氨基酸残基，Y是Thr、Ser或Cys）。
X较好是Pro以外的氨基酸，较好是Gly、Tyr、Arg、Ser、Lys、Val或Ala，更好是Gly、Lys  Val或Ala。Y较好是Thr或Ser。
加到FGF突变蛋白中的糖可以是见于已知糖基化蛋白中的任何一种糖。这类糖的例子包括N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和氰酸（Cyalic  acid）。
糖基链中糖的数目至少为一个较好，更好是10至20个。
可利用定点诱变方法产生突变蛋白。这一技术是已知的，如参见R.F.Lather  and  J.P.Lecoq，Genetic  Engineering，pp，31-50，Academic  Press（1983）。在M.Smith  and  S.Gillam，Genetic  Engineering：Principles  and  Methods，Vol.3，pp.1-32，Plenum  Press（1981）中则描述了针对寡核苷酸的诱变。
例如可经下列步骤制得编码突变蛋白的结构基因：
（a）使含有单股FGF结构基因的单股DNA与诱变的寡核苷酸引物杂交（上述引物互补于一个区域，该区域含有被该单股取代的半胱氨酸密码子，或者在某些情况下包含一个与该密码子配对的反义三联子，条件是其不适用于与上述密码子不同的其他氨基酸密码子，或者在某些情况下不同的反义三联子），
（b）使用DNA聚合酶延长该引物，以形成突变的异源双链，以及
（c）复制该突变异源双链。
然后分离转化该已突变基因的噬菌体DNA并导入质粒中。
用如此得到的质粒转化适当的宿主，并在培养基中培养所得转化体，从而能够产生突变蛋白。
非水溶性羟丙基纤维素的例子包括低取代的羟丙基纤维素，其为纤维素的低取代的羟丙基醚。
低取代的羟丙基纤维素在105℃干燥1小时，含有不低于5.0%和不高于16.0%的羟丙基（参见美国药典，第21修订版，附录5180～5181页;和日本药典，第11修订版，D-773～D-780。
用于本发明之低取代羟丙基纤维素的例子包括低取代的羟丙基纤维素（LH-11，LH-20，LH-21，LH-22和LH-31，Shin-Etsu  Chemical，Japan）。
本发明中，FGF蛋白质对非水溶性羟丙基纤维素的重量比例可约为1∶0.01至1，000，000，较好约为1∶1至100，000，更好约为1∶500至20，000，最好约为1∶500至10，000。
此外，本发明的组合物可进一步含有选自糖、蛋白质、氨基酸、氯化钠和阿拉伯胶的一种或多种成分。
糖包括蔗糖、海藻糖、麦芽糖、果糖、肌醇和直链淀粉等。蛋白质包括酪蛋白、白蛋白、白明胶和蛋清等。氨基酸包括半胱氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和甘氨酸等。
本发明中，FGF蛋白质对糖、蛋白质、氨基酸、氯化钠和/或阿拉伯胶的重量比可约为1∶0.01至1，000，000，较好约为1∶1至100，000，更好约为1∶500至20，000，最好约为1∶500至10，000。
本发明的组合物是将FGF蛋白质与非水溶性羟丙基纤维素混合，例如将FGF蛋白质的水溶液加到非水溶性羟丙基纤维素粉末中，然后混合而得到的。较好将FGF蛋白质水溶液的pH调到约3至10，最好调到约5至9。
上述加入和混合过程可在约10至30℃下，较好在约10至20℃下进行。
可用一般常用的搅拌和成粒装置〔如研钵、Pony混合器（Hosokawa  Tekkosho，Japan）、Vertical粒化机（Fuji  Sangyo）和Super混合器（Hosokawa  Tekkosho）〕、流化成粒装置〔如Glad（Okawara  Seisakusho）〕和滚压成粒装置〔如CF（Freund）〕充分地进行混合。
例如可将如此混合的组合物于室温（约10～30℃）、减压（约10mmHg或更低）下干燥或冻干，从而可得到生物活性稳定的固体组合物。
可在非水溶性羟丙基纤维素与FGF蛋白质混合的同时加入糖、蛋白质、氨基酸、氯化钠和/或阿拉伯胶，或者将它们与非水溶性羟丙基纤维素混合后再加入FGF蛋白质。可按与生产含非水溶性羟丙基纤维素和FGF蛋白质的组合物之方法相似的方法生产同时含上述物质的组合物。
上述混合中，可使用以硫酸葡聚糖稳定的FGF蛋白质的水溶液。
硫酸葡聚糖的例子包括葡聚糖硫酸酯、环糊精硫酸酯及β-1，3-葡聚糖硫酸酯。这些都是D-葡萄糖聚合物的硫酸酯衍生物。萄聚糖硫酸酯中硫含量一般不超过约3%（重量），较好不超过12至20%（重量），更好不超过约16至20%（重量）。特别优选的是葡聚糖硫酸酯。
葡聚糖硫酸酯包括由蔗糖经微生物如肠膜明串珠菌（Leuconostoc  mesenteroides）的作用所产生之葡聚糖的硫酸酯。葡聚糖硫酸酯是主要含α（1→6）键之葡聚糖的部分硫酸酯，其中的硫含量一般至少约为12%（重量），较好约为16至20%（重量）。其平均分子量范围约为1，000至40，000，000优选分子量范围为3，000至500，000。葡聚糖硫酸酯很易溶于水，是一种用本领域内已知的方法制得的已知化合物。
环糊精硫酸酯中环糊精包括由淀粉经微生物如浸麻芽孢杆菌（Bacillus  macerans）作用所产生的环糊精。环糊精具有由α（1→4）键连接的D-葡萄糖分子的环结构，且包括α型（6分子）、β型（7分子）和γ型（8分子）。本发明中，上述任何形式的均可使用。
环糊精硫酸酯是由环糊精按本领域内已知的方法经硫化作用制得的有关硫化的方法可参见美国专利№.2，923，704和日本未审查专利公开No.50-36422/1975。
环糊精硫酸酯中硫含量一般至少约为3%（重量），较好约为12至24%（重量）。环糊精硫酸酯很易溶于水。
只要是硫含量至少为大约12%（重量），环糊精硫酸酯的硫化作用即可达到任何程度。特别是可优先使用硫含量约为16至21%（重量）的环糊精硫酸酯。可使用有不同硫化程度的硫酸酯混合物，或者是有单一硫化程度的纯化的硫酸酯。可按下述方法进行纯化，例如浓缩含β-环糊精硫酸酯之碱金属盐的反应溶液，将其蒸发至干，将该冷凝物溶解于水并使得所得水溶液与亲水溶剂混合，以分离所需产物。
β-1，3-葡聚糖硫酸酯中的β-1，3-葡聚糖包括由产碱杆菌属（Alcaligenes）和土壤杆菌属（Agrobacterium）微生物产生的直链β-1，3-葡聚糖。其可以是经水解直链β-1，3-葡聚糖得到的低分子量聚合物形式的，并且有直链β-1，3-葡聚糖的相似结构。
Curdlan（也称为加热可形成凝胶的多糖PS，并可由Wako  Pure  Chemical  Industries  Ltd.，Japan购得）是由产碱杆菌属或土壤杆菌属微生物产生的非水溶性、加热可形成凝胶的无支链葡聚糖，并且只有直链β-1，3-葡聚糖键〔日本专利公开号.43-7000/1968，48-32673/1973和48-32674/1976〕。
产生Curdlan的Alcaligenes  faecalis  Var.Myxogenes  NTK-U菌株、Agrobacterium  radiobacter菌株和Agrobacterium  radiobacter  U-19菌株均列在第15版American  Type  Culture  Collection，Catalogue  of  Strains（1982）中，分别为ATCC-21680、ATCC-6466和ATCC21679。
日本未审查专利公开号55-83798/1980中已详细描述了Curdlan之部分水解物的性质及其制备方法。
据此，直链β-1，3-葡聚糖是具有下列结构式的化合物：
其中n是4至大约1，000的整数。
只要其平均聚合度（ DP）不超过1，000，上述的任何β-1，3-葡聚糖均可使用。特别是可优先使用其平均聚合度（ DP）约为6至300，且更好约为15至200的部分水解产物。
式（Ⅰ）中的n与下列方程式代表的 DP有关：
DP-2＝n。
直链β-1，3葡聚糖的硫酸酯是由β-1，3-葡聚糖或其低聚物的中间体单糖单位的三个羟基及其两末端上单糖单位的羟基经磺化作用而产生的。一般使用每个单糖单位平均取代程度（ DS）为0.5至3的硫酸酯，但优先使用平均取代程度（ DS）为1至2的硫酸酯。
可按下述方法完成直链β-1，3-葡聚糖或其低分子量聚合物的硫酸盐化：使硫酸化剂如氯磺酸或硫酸酐对其进行作用，或用硫酸酐和有机碱如吡啶、二甲基甲酰胺、三甲胺或二甲基苯胺的复合物与之反应〔J.Biol.Chem.239，2986（1964）〕
β-1，3-葡聚糖硫酸酯很易溶于水，并且毒性很低。β-1，3-葡聚糖硫酸酯中的硫含量一般至少约为5%（重量），较好为10～24%（重量）。
葡聚糖硫酸酯对温血动物的毒性很小。因此可对温血动物经胃肠道外或口服途径给于含FGF蛋白和葡聚糖硫酸酯的稳定化组合物。
可使用游离状态或其盐形式的葡聚糖硫酸酯。这类盐例子包括钠盐、钾盐、铵盐和三甲铵盐。
当使葡聚糖硫酸酯与FGF蛋白质在水介质中接触时，游离葡聚糖硫酸酯即可加到其分子上，然后加入适当量的碱或酸以达到所需的pH。加入碱后，葡聚糖硫酸酯便以盐的形式或作为游离葡聚糖硫酸酯与其盐的混合物存在于含水介质中。
如果使FGF蛋白与葡聚糖硫酸酯在另外加有二价或三价羧酸的含水介质中接触，则FGF蛋白会更为稳定。
二价羧酸的例子包括酒石酸、马来酸、苹果酸和富马酸。
三价羧酸包括柠檬酸和异柠檬酸。
上述羧酸可以游离化合物或其盐的形式使用。盐的例子包括钠盐、钾盐和铵盐。
此外，可向其中加入游离羧酸，然后加入适当量的碱或酸，以达到所需的pH。在加入碱之后，羧酸即可以其盐或游离酸与其盐之混合物的形式存在于含水介质中。
当使FGF蛋白与葡聚糖硫酸酯在含水介质中接触时，所加入之葡聚糖硫酸酯的量较好为相对于每1mol  FGF蛋白约0.1至100mol，更好为大约0.5至4mol。
含水介质中葡聚糖硫酸酯的浓度较好为大约0.0005～5%（W/V），更好为大约0.01～1%（W/V）。
含水介质中FGF蛋白的浓度较好为大约0.0005～5%（W/V），更好为大约0.01～1%（W/V）。
含水介质中羧酸的浓度较好为大约1mM至1M，更好为大约10mM至500mM。
为使它们在含水介质中接触，可将FGF蛋白、葡聚糖硫酸酯和羧酸按彼此需要量在含水介质中混合。
含水介质可以是任何一种介质，如蒸馏水，较好是使用生理盐水和葡萄糖溶液。作为含水介质，也可使用缓冲液，如磷酸盐缓冲液和三（羟甲基）氨基甲烷-HCl缓冲液。
当FGF蛋白、葡萄糖硫酸酯和羧酸按所需量彼此混合时，可将它们分别作为水溶液混合，或者分别作为固体物混合，然后再溶解于含水介质中。混合时的温度一般约为0～40℃，pH较好约为3～10，更好约为5～9。混合所需时间一般约为1至30分钟。
从而得到了用葡聚糖硫酸酯稳定了的FGF蛋白水溶液。
本发明中，可用肠道聚合物（enteric  Polymer）包被含FGF蛋白和非水溶性羟丙基纤维素的上述组合物。
用于本发明的肠道聚合物的例子包括邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、羧甲基乙基纤维素、乙酸纤维素邻苯二甲酸酯、乙酸羟甲基纤维素琥珀酸酯以及丙烯酸聚合物〔如异丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物（Eudragit  L300-55和Eudragit  L100-55）异丁烯酸-丙烯酸甲酯共聚物（Eudragit  L-100）以及异丁烯酸-异丁烯酸甲酯共聚物（Eudragit  S100），Rohm，West  Germany〕。
可用已知方法进行包被。即使用盘涂法、流化涂层法或辊涂法等方法将在水或有机溶剂中分散或溶解包被基剂所得到的分散液或溶液喷布在片剂、颗粒或微细颗粒上。当用包衣剂包被组合物时，可望被包被之组合物的温度为大约25～70℃，较好为大约25～50℃包被涂层量为肠溶性聚合物约占组合物的20-300%，较好为50～100%。
此外，也可以加热并液化本发明的固体组合物（粉末）和聚甘油颗粒的脂肪酸酯，以得到颗粒。该颗粒中。本发明固体组合物的有效成分（FGF蛋白）可得以稳定地洗提和释放，并能长时间保持稳定。
当聚甘油的脂肪酸酯是一种混合物时，它并不会显示出清楚的熔点，而可在某一特定温度下软化。本说明书中，“熔点”包括混合物所能显示出的软化点。
只要是由聚甘油与脂肪酸结合形成的酯，上面使用的聚甘油脂肪酸酯可以是任何一种单酯、二酯和聚酯。与硬化油等不同，聚甘油的脂肪酸酯具有表现非晶体多态性的性质，并且很少与有效成分（如药物）相互作用。
聚甘油是一种在一个分子中结合有“n个（在环状聚甘油中）至n+2个（在直链或支链聚甘油中）羟基及n-1个（在直链或支链聚甘油中）至n个（在环状聚甘油中）醚的多元醇”〔Polyglycerin  Ester，P  12，Sakamoto  Yakuhin  Kogyo  Co.Ltd.，Japan（May  2，1986）编辑出版）。例如，可使用由下式代表的化合物：
其中n代表聚合度，且为2或2以上的整数。n一般为2至50，较好为2至20，更好为2至10。聚甘油是直链或支链的。
这类聚甘油的具体实例包括二甘油、三甘油、四甘油、五甘油、六甘油、七甘油、八甘油、九甘油、十甘油、十五甘油、二十甘油和三十甘油。这些聚甘油中，常用的是四甘油、六甘油和十甘油。
脂肪酸包括有8至40个碳原子，较好有12至22个碳原子的饱和和不饱和高级脂肪酸。这些脂肪酸的例子包括棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、豆蔻酸、月桂酸、蓖麻酸、辛酸、癸酸和山萮酸。这些脂肪酸中，优选的是硬脂酸、油酸，月桂酸和蓖麻酸。
聚甘油脂肪酸酯的具体实例包括辛酰一（十）甘油酯、辛酰二（三）甘油酯、月桂酰一（四）甘油酯、月桂酰一（六）甘油酯、月桂酰一（十）甘油酯、油酰一（四）甘油酯、油酰一（六）甘油酯、油酰一（十）甘油酯、油酰二（三）甘油酯、油酰二（四）甘油酯、油酰倍半（十）甘油酯、油酰七（四）甘油酯、油酰五（六）甘油酯油酰十（十）甘油酯、亚油酰一（七）甘油酯、亚麻酰二（三）甘油酯、亚麻酰二（四）甘油酯、亚麻酰二（六）甘油酯、硬脂酰一（四）甘油酯、硬脂酰一（六）甘油酯、硬脂酰一（十）甘油酯、硬脂酰三（四）甘油酯、硬脂酰三（六）甘油酰、硬脂酰倍半（六）甘油酯、硬脂酰五（四）甘油酯、硬脂酰五（六）甘油酯、硬脂酰十（十）甘油酯、棕榈酰一（四）甘油酯、棕榈酰一（六）甘油酯、棕榈酰一（十）甘油酯、棕榈酰三（四）甘油酯、棕榈酰三（六）甘油酯、棕榈酰倍半（六）甘油酯、棕榈酰五（四）甘油酯、棕榈酰五（六）甘油酯及棕榈酰十（十）甘油酯。优选的聚甘油脂肪酸酯的例子包括硬脂酰五（四）甘油酯（如PS-310，Sakamoto  Yakuhin  Co.，Japan）、硬脂酰一（四）甘油酯（如MS-310，Sakamoto  Yakuhin  Co.）、硬酯酰五（六）甘油酯（如PS-500，Sakamoto  Yakuhin  Co.）、硬脂酰倍半（六）甘油酯（如SS-500，Sakamoto  Yakuhin  Co.）和硬脂酰一（十）甘油酯。
这些聚甘油的脂肪酸酯可单独使用或作为其一种或多种的混合物使用。
聚甘油脂肪酸酯的熔点约为40至80℃，较好约40至60℃。
聚甘油脂肪酸酯的分子量一般为200至15，000，较好为300至2，000。其亲水-亲脂平衡值（HLB）为1至20，较好为1至15，可借助调节HLB来控制该粉末之有效成分的洗提率。也可借助二种或多种聚甘油脂肪酸酯的混合来调整HLB。
聚甘油的脂肪酸酯还可以与脂类一起使用。作为脂类的非水溶性材料可依据制备目的等因素来选用。脂类的优选软化点或熔点约为40至120℃，特别是大约40至90℃。
脂类的具体例子包括脂肪和油（如蓖麻油、棉籽油、大豆油、菜籽油和牛脂）的硬化产物;蜡如蜂蜡、巴西棕榈蜡、鲸蜡、Iecitin石蜡和微晶石蜡;脂肪酸如硬脂酸和棕榈酸，或脂肪酸盐如脂肪酸的钠盐和钾盐;脂肪醇如硬脂醇和鲸蜡醇;以及甘油酯。这些脂类中，较好是硬化棉籽油、硬化蓖麻油、硬化大豆油、巴西棕榈蜡、微晶石蜡、硬脂酸及硬脂醇。
脂对聚甘油脂肪酸酯的比例通常为每100份（重量）聚甘油脂脂酸酯对100份（重量）或较少些的脂类，并可在上述范围内适当选择具体比例。
在颗粒状组合物制备中，最好使用球形聚甘油脂肪酸酯颗粒，以使大量粉末（本发明的固体组合物）粘附到聚甘油的脂肪酸酯上，或使所说的酯含有大量粉末，并得到与聚甘油脂肪酸酯颗粒的形状和大小相适应的颗粒状组合物。当使用聚甘油脂肪酸酯的球形颗粒时，可向其中掺入大量粉末（本发明的固体组合物），如约占总颗粒状组合物重量80%的粉末。再者，可得到表面相当平滑且大小分布很窄的球形颗粒状组合物。在某些情况下，也可在其中掺入占颗粒状组合物80%以上，如约85%（重量）的粉末。
可用喷雾冷却，特别是喷雾冷凝方法制得聚甘油脂肪酸酯的球形颗粒。可借助旋转具有平滑表面的园盘如铝制园盘并在其上面滴注熔融的聚甘油脂肪酸酯进行喷雾冷凝。对旋转园盘的大小无特殊限制，但一般直径约为5～100cm，较好约为10～20cm。旋转盘的转速及熔融之聚甘油脂肪酸酯的滴速可依据对颗粒大小等的要求而定。旋转盘的转速一般为大约10至6，000rpm，较好约为900至6000rpm，更好约为1，000至3，000rpm。可按恒定速度（如2～200g/分钟、较好为5～100g/分钟）滴加熔融的聚甘油脂肪酸酯。
可根据所需的颗粒状组合物的大小选择所用聚甘油脂肪酸酯颗粒的大小，虽然对此无特殊限制，但一般约为10至150目，较好是约为25至100目。
本发明的固体组合物（粉末）可与粉末稀释剂一起使用。这类稀释剂的例子包括赋形剂如乳糖、玉米淀粉、Avicel（微晶纤维素：Asahi  Chemical  Industry，Japan）、糖粉和硬脂酸镁;粘合剂如淀粉、明胶、阿拉伯胶粉、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素及聚乙烯吡啶烷酮;崩解剂如羧甲基纤维素钙和低取代的羟丙基纤维素;着色剂;香味剂;吸收剂;防腐剂;润湿剂;抗静电剂及崩解延缓剂。
可根据颗粒状组合物的预期大小、药物活性成分的含量等因素确定粉末（本发明的固体组合物）对上述聚甘油之脂肪酸酯的比例，但一般为每100份（重量）聚甘油脂肪酸酯加10至1，000份（重量），较好为50至500份（重量）。
可按照常规流化床造粒方法，经加热和流化制成颗粒。造粒方法中使用的加热温度为接近于上述聚甘油脂肪酸酯的熔点，较好在聚甘油脂肪酸酯之熔点至比该熔点低5℃的温度范围内。如加热温度太高，聚甘油脂肪酸酯颗粒会趋向融合聚结，形成大小分布宽的颗粒状组合物，另一方面，如果加热温度太低，则难于使粉末（本发明的固体组合物）与聚甘油脂肪酸酯颗粒形成颗粒。
可经浮动聚甘油脂肪酸酯和粉末（本发明的固体组合物）形成流化床，然后于所需温度进行加热并流化而制成颗粒。可根据存在或不存在粉末粒子来证实是否已完全制成了颗粒。
当在显微镜下观察颗粒状的组合物时，可见它通常与具有与聚甘油脂肪酸酯颗粒相应的形状，且所说的粉末（本发明的固体组合物）至少部分地包埋在聚甘油的脂肪酸酯颗粒中，更好是粘结在其中。
如此得到的本发明的组合物是固态的。
本发明的组合物包括含有上述固体组合物的医药组合物（如软膏和栓剂）。即，作为软膏，本发明的固体组合物被分散在软膏基质中。作为栓剂，则本发明的固体组合物被分散在栓剂基质中。
因为本发明的FGF组合物是稳定化了的，所以很适于用作药物。
本发明的稳定化的FGF蛋白组合物本身或其与可药用添加剂（如载体、赋形剂和稀释剂）形成的医药组合物（如片剂、胶囊剂、颗粒、细颗粒、粉剂、软膏和栓剂），可以很安全地经胃肠道外或口服途径用于温血动物（如人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、狗和猫）。
可按已知方法将这种制剂配制成适于口服给药的剂型，如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒和细颗粒。在这些剂型中，所用的添加剂有赋形剂（如乳糖、玉米淀粉、轻硅石粉和微晶纤维素）、粘合剂（如α淀粉、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡啶烷酮）、崩解剂（如羧甲基纤维素钙、淀粉和低取代的羟丙基纤维素）、表面活性剂〔如吐温80（Kao  Atlas，Japan）、Pluronic  F68（Asahi  Denka  Kogyo，Japan）和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物〕、抗氧化剂（如L-半胱氨酸、亚硫酸钠和抗坏血酸钠）及润滑剂（如硬脂酸镁和滑石）。
对于片剂、颗粒和细颗粒剂，可以按照已知方法进行包被，以掩敝味道或赋予胃内溶解性、肠道溶解性或提高延迟释放。作为包衣剂，可使用羟甲基甲基纤维素、乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚亚氧乙基乙二醇、吐温80、Pluronic  F68、蓖麻油、醋酸纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯、丙烯酸聚合物（Eudrgit  L100-SS和L-100，Rohm，West  Germany）、羧甲基乙基纤维素、聚乙烯醇缩乙醛二乙氨基乙酸酯、蜡和色素如滑石、二氧化钛和氧化铁红。这些包衣剂可包被一层或多层，并可单独或以两种或两种以上联合使用。
按已知方法进行包被。即使用盘涂方法，流化涂层方法或辊涂方法，将在水或有机溶剂中分散或溶解包衣基质所得到的分散液或溶液喷洒在片剂、颗粒或细颗粒上。片剂、颗粒和细颗粒包被涂层可在约25至70℃下进行，较好在约25至50℃下进行。
可使用下列添加剂按已知方法制备软膏和栓剂。
用于制备软膏的添加剂的例子包括凡士林、蜂蜡、石蜡、液体石蜡、胆固醇、硬脂醇、含水羊毛脂、鲸蜡醇和聚乙二醇。
用于制备栓剂的添加剂的例子包括可可脂，氢化植物油、单酸甘油酯、三酸甘油酯、甘油基明胶和聚乙二醇。
本发明的FGF蛋白质组合物对成纤维细胞有生长促进作用，且有高稳定性和低毒性。因此，该FGF蛋白质组合物可用作烧伤、创伤、手术后组织损伤等的治疗促进药物，也可基于其动脉血管生成作用用作血栓形成、动脉硬化等的治疗药物。另外，还可用作加速细胞培养的试剂。
当将本发明的FGF蛋白质组合物作为上述药物使用时，可按适当量给予上述温血动物，给药剂量可根据给药途径及病征等因素而定，但一般为每天每公斤体重给1ng～100ng  FGF蛋白质。
下文实施例中使用的重组人bFGF突变蛋白CS23（以下简称rhbFGF突变蛋白CS23）是按照Biochemical  and  Biophysical  Research  Communications  151，701-708（1988）中所述方法或欧洲专利公开No.281，822  A2中所述方法制备的。使用重组体大肠杆菌MM294/pTB762（IFO14613，FERM  BP-1645，CCTCC  NO.M88005），按欧洲专利公开No.281，822  A2之实施例1、2、7和24中所述方法制备和纯化用于下文所述实施例中的rhbFGF突变蛋白CS23。
上述的重组体大肠杆菌MM294/pTB  762已保藏在Institute  for  Fermentation，Osaka（IFO）Japan和Fermentation  Research  Institute，Agency  of  Industrial  Science  and  Technology，Ministry  of  International  Trade  and  Industry（FRI），Japan。有关登记号和保藏日期示于表1中。就在FRI的保藏来说，最初是按照FERMP保藏登记号保藏的。所说的保藏样品已根据布达佩斯条约重新保藏并且该转化体已按FERM  BP登记号储存在FRI。
Figure 90103391X_IMG3
参考实施例1
用下述方法检测下述实施例中的FGF活性。
以两步法用含有10%小牛血清的DMEM培养基稀释样品，然后以每孔50μl的量加入Nunc 96孔微量滴定板（平底）中，各孔接入50μl（2×103个细胞）购自American Type Culture Collection的胎牛心肌内皮细胞（CRL 1395），并培养3天。然后用20μl MTT〔3-（4，5-二甲基吡咯-2-基）-2，5-二苯基四唑溴化物〕〔〔Journal of Immunological Method 93，157（1986）〕溶液（5mg/ml PBS，Sigma）。4.5小时后，向其中加入100μl 10%SDS-0.01NHCl，然后将滴定板放置过夜。过夜后用Titertek Multiscan测定590nm处吸光率〔Tada et al.，Journal of Immunological Method 93，157（1986）〕。
实施例1
将平均分子量为7，500的葡聚糖硫酸钠（Seikagaku  Kogyo，Japan）加到含rhbFGF突变蛋白CS23（浓度为450μg/ml）的50mM柠檬酸钠溶液（pH8.0）中，以使其浓度达到210μg/ml。然后将1ml所得溶液加到5g低取代的羟丙基纤维素（下文简称为L-HPC）（LH-20，羟丙基为13.0至16.0%，Shin-Etsu  Chemical）中，并充分搅拌。于室温（约20℃）及减压（约5mmHg）条件下将所得混合物干燥20小时，得到含rhbFGF突变蛋白CS23和L-HPC的粗制粉末组合物。
作为对照，按上述同样方法制备含rhbFGF突变蛋白CS23和乳糖的粉末状组合物，不同的是用5g乳糖代替L-HPC。
用参考实施例1中所述方法测定这些组合物的余留活性，结果示于表2中。
表  2
添加剂  余留FGF活性（%）
L-HPC  127
乳糖  8
实施例2
将平均分子量为7，500的葡聚糖硫酸钠加到含rhbFGF突变蛋白CS23（浓度为500μg/ml）的50mM柠檬酸钠溶液（pH8.0）中，以使其浓度达到233μg/ml。然后分别将各1ml所得溶液加到5g  L-HPC（LH-11，羟丙基为10.0～13.0%，Shin-Etsu  Chemical）和5g乳糖中，并充分搅拌。冻干如此得到的混合物，得到分别含有rhbFGF突变蛋白CS23和L-HPC，以及rhbFGF突变蛋白CS23和乳糖的粉末状组合物。
这些组合物的余留活性示于表3中。
表  3
添加剂  余留FGF活性（%）
L-HPC  85
乳糖  11
实施例3
使用实施例1中制得的含rhbFGF突变蛋白CS23和L-HPC的粉末组合物，按下述方法制备颗粒。
将85g  nonpareils（20至28月）置于mini  CF装置（Freund）内，并用具有下列组分的粉末包被涂层，喷淋速度为5g/分钟，转子的转速为400rpm，同时以2.5ml/分钟的速度喷洒50ml的1%（W/V）羟丙基纤维素（羟丙基基团为53.4至77.5%）。于40℃真空下将所得产物干燥16小时，然后通过园孔筛筛分，得到粒度为12至32目的球形颗粒。
〔粉末〕
实施例1中制得的含rhbGFG
突变蛋白CS23的粉末组合物  20g
细糖粉  20g
玉米淀粉  20g
然后，将如此制得的60g颗粒置于mini  CF装置（Freund）内，经喷洒有下列组分的肠溶性膜溶液进行包衣，喷淋速度为5ml/分钟，此时转子的转速为400rpm，调节空气温度至40℃，颗粒温度至35℃，得到肠溶性颗粒。
〔肠溶性膜溶液〕
羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯  20g
蓖麻油  2g
滑石  0.4g
丙酮  200ml
实施例4
将2ml含有rhbFGF突变蛋白CS23（浓度为1mg/ml）的50mM柠檬酸钠溶液（pH7.0）加到2g  L-HPC（LH-20，Shin-Etsu  Chemical）中，充分搅拌该混合物，然后于室温（约20℃）和减压（约5mmHg）下干燥20小时，得到粉末组合物。所得组合物的余留活性为100%。
实施例5
将2ml含有rhbFGF突变蛋白CS23（浓度为1mg/ml）的50mM柠檬酸钠溶液（pH7.0）加到1.6g  L-HPC（LH-20，Shin-Etsu  Chemical）和0.4g糖粉（粉末状蔗糖）的混合物中，充分搅拌所得混合物，然后于室温（约20℃）和减压（约5mmHg）下干燥20小时，得到粉末状组合物。如此制得的组合物在制备后即刻、40℃下2个月后、40℃下6个月后分别显示有下列的余留活性：
L-HPC+糖粉
制备后即刻  95%
40℃下2个月后  81%
40℃下6个月后  81%
实施例6
（1）将500g硬脂酰单（四）甘油酯（MS-310，Sakamoto  Yakuhin  Co.）加到500g硬脂酰五（四）甘油酯（PS-310，Sakamoto  Yakuhin  Co.）中，并将混合物于90℃加热熔融。所得熔融物以20g/分钟速率滴在以1，000rpm旋转的铝盘（直径15cm）上，以制备聚甘油脂肪酸酯的球形颗粒，所得颗粒可通过32目筛，但不能通过42目筛。
将100g如上制得的聚甘油脂肪酸酯球形颗粒、5g实施例4中制得的粉末组合物和95g  L-HPC（LH-20，Shin-Etsu  Chemical）置于流化造粒机（FD-3S型，Fuji  Sangyo）中。调整供气温度至54℃，加热该混合物并使之流化。之后证实浮动于流化床中的L-HPC粒子消失，停止加热并进行冷却，从而得到颗粒。
（2）将100g上述（1）中制得的rhbFGF突变蛋白CS23的颗粒置于流化造粒机（FD-3S型，Fuji  Sangyo）中，并以溶液给进速率为2g/分钟及输入空气温度为48℃的条件下，用包衣溶液〔即100g羟丙基纤维素邻苯二甲酸酯（Shin-Etsu  Chemical）在1升1∶1丙酮和乙醇混合物中制成的溶液〕进行包被涂层，得到含rhbFGF突变蛋白CS23的包衣的颗粒组合物。
实施例7
将2ml含rhbFGF突变蛋白CS23（浓度为1mg/ml）的50mM柠檬酸钠溶液（pH7.0）加到1.6g  L-HPC（LH-20，Shin-Etsu  Chemical）和0.4g人血清白蛋白（HSA）、酪蛋白或纯化明胶（作为蛋白质）的混合物中，充分搅拌所得混合物，然后于室温（约20℃）及减压（约5mmHg）条件下干燥20小时，得到不同的粉末状组合物。
实施例8
将2ml含rhbFGF突变蛋白CS23（浓度为1mg/ml）的50mM柠檬酸钠溶液（pH7.0）加到1.6g  L-HPC（LH-20，Shin-Ftsu  Chemical）和0.4g氯化钠的混合物中，并充分搅拌所得混合物，然后于减压（约5mmHg）下室温（约20℃）干燥20小时，得到粉末状组合物。
实施例9
将2ml含rhbFGF突变蛋白CS23（浓度为1mg/ml）的50mM柠檬酸钠溶液（pH7.0）加到1.6g  L-HPC（LH-20，Shin-Etsu  Chemical）和0.4g  L-半胱氨酸（作为氨基酸）的混合物中，并充分搅拌所得混合物，然后于减压下（约5mmHg）室温（约20）干燥20小时，得到粉末状组合物。
实施例10
将2ml含rhbFGF突变蛋白CS23（浓度为1mg/ml）的50mM柠檬酸钠溶液（pH7.0）加到1.2g  L-HPC（LH-20，Shin-Etsu  Chemical）、0.4g  L-半胱氨酸和0.4g氯化钠的混合物中，充分搅拌所得混合物，然后于减压（约5mmHg）下室温（约20℃）干燥20小时，得到粉末状组合物。
实施例11
将2ml含rhbFGF突变蛋白CS23（浓度为1mg/ml）的50mM柠檬酸钠溶液（pH7.0）加到1.2g  L-HPC（LH-20，Shin-Ftsu  Chemical）、0.4g  L-半胱氨酸和0.4g糖粉的混合物中。充分搅拌所得混合物后于减压（约5mmHg）下室温（约20℃）干燥20小时，得到粉末状组合物。
实施例12
将2ml含rhbFGF突变蛋白CS23（浓度为1mg/ml）的50mM柠檬酸钠溶液（pH7.0）加到1.6g  L-HPC（LH-20，Shin-Etsu  Chemical）和0.4g阿拉伯胶的混合物中，充分搅拌所得混合物后于减压（约5mmHg下室温（约20℃）干燥20小时，得到粉末状组合物。
实验实施例1
将平均分子量为7，500的葡聚糖硫酸钠加到含rhbFGF突变蛋白CS23（浓度为200μg/ml）的50mM柠檬酸钠溶液（pH8.0）中，从而使rhbFGF浓度变为93.2μg/ml。然后取1ml等份的所得溶液分别加到1g  L-HPC（LH-20）和1g羟丙基纤维素（羟丙基基团为61%）中。充分搅拌所得溶液。将如此得到的混合物于减压（约5mmHg）下室温（20℃）干燥20小时，得到分别含有rhbFGF突变蛋白CS23和L-HPC、rhbFGF突变蛋白CS23和羟丙基纤维素的粉末组合物。这些组合物的余留活性示于表4中。
表  4
添加剂  余留FGF活性（%）
L-HPC  100
羟丙基纤维素  44

Claims (12)

1、制备稳定化的FGF蛋白质组合物的方法，该方法包括使FGF蛋白质与非水溶性羟丙基纤维素混合。
2、根据权利要求1的方法，其中非水溶性羟丙基纤维素是低取代的羟丙基纤维素。
3、根据权利要求2的方法，其中低取代的羟丙基纤维素含有不低于5.0%和不高于16.0%的羟丙氧基基团。
4、根据权利要求1的方法，其中FGF蛋白质是FGF突变蛋白。
5、根据权利要求4的方法，其中FGF蛋白质是其至少一个人碱性FGF组成氨基酸被至少一个不同的氨基酸取代了的突变蛋白。
6、根据权利要求1的方法，该方法包括进一步用肠道聚合物对组合物进行包衣涂层。
7、稳定FGF蛋白质的方法，该方法包括使FGF蛋白质与非水溶性羟丙基纤维素混合。
8、根据权利要求7的方法，其中非水溶性羟丙基纤维素是低取代的羟丙基纤维素。
9、根据权利要求8的方法，其中低取代的羟丙基纤维素含有不低于5%和不高于16.0%的羟基丙氧基基团。
10、根据权利要求7的方法，其中FGF蛋白质是FGF突变蛋白。
11、根据权利要求10的方法，其中FGF蛋白质是其至少一个人碱性FGF组成氨基酸被至少一个不同的氨基酸取代了的突变蛋白。
12、根据权利要求7的方法，该方法包括进一步用肠道聚合物对组合物进行包衣涂层。
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