CN104768567B - 用于伤口愈合的联合治疗和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于促进和/或改善伤口愈合和/或组织修复，以及用于抗瘢痕形成、抗炎、抗纤维化和抗粘连适应症的病毒VEGF和病毒抗炎细胞因子的组合物，使用它们的治疗方法，以及包含它们的药盒。

Description

用于伤口愈合的联合治疗和组合物
技术领域
本发明涉及包含病毒和其它蛋白(例如病毒血管内皮生长因子和抗炎细胞因子)的组合的组合物和方法。这些发明可用于多种情况，包括促进伤口愈合及治疗伤口，特别是急性伤口以及未按期望速率愈合的伤口，例如延期愈合伤口、不完全愈合伤口、慢性伤口和开裂伤口。本发明也可用于减少纤维化、粘连、炎症和瘢痕形成。
背景
下文包含可用于理解本发明的信息。这不是承认本文中提供的任何信息为现在描述的或请求保护的发明的现有技术，或与其相关，或者任何明确地或隐含地引用的出版物或文件为现有技术。
在人和其它哺乳动物中，伤口病损触发系统复杂的细胞和生化反应级联，这在大多数情况下会生成愈合的伤口。理想地愈合的伤口是在细胞、组织、器官和生物体水平上恢复正常的解剖结构、功能以及外观的那些。不论是否由创伤、微生物或异物引起，伤口愈合通过复杂的过程进行，所述过程涵盖许多重叠的阶段，包括发炎、上皮形成、血管发生以及基质沉积。通常，这些过程生成成熟的伤口和特定程度的瘢痕形成。虽然炎症和修复通常按预定的病程发生，其过程的敏感性取决于多种伤口愈合分子的平衡，所述伤口愈合分子包括例如调节性细胞因子和生长因子网络。
未按正常或期望速率愈合的伤口(包括慢性伤口，如糖尿病性足溃疡、压力性溃疡以及下肢静脉性溃疡(VLU)，是增长的世界性问题。据估计，例如西方国家中1-2％的人口在他们生命过程中会出现慢性伤口。慢性伤口代表了医疗保健服务上的重大的经济负担，仅在美国估计每年的支出高达250亿美元。Kuehn BM，Chronic wound care guidelines发表于JAMA 297：938-939，2007。估计130万到300万美国个体被认为患有压力性溃疡；并且2000万患有糖尿病的个体中多达10-15％有产生慢性溃疡的风险。更多的有静脉性溃疡或动脉疾病导致的伤口。随着人口中增长的老年人和糖尿病患者的数目，预计该支出数字在未来几年里将上升。不幸的是，对于这些使人虚弱的伤口几乎没有有效的治疗选择，并且仍然存在对新的有效治疗的显著需求。尽管多年来，基础和临床研究已经揭示很多关于伤口愈合中涉及的单个分子的和细胞的过程，通过增强、抑制或改变伤口愈合过程的单个方面来加速和/或改善伤口愈合的尝试仅取得有限的成功。
瘢痕是已经愈合的伤口、由于疾病或外科手术的病损的结果。当组织响应与正常的修复和愈合所需的瘢痕组织的量不成比例时产生肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩。身体的特定部位(包括背、肩、胸骨和耳垂)特别易于产生异常的瘢痕，将其称作肥厚性瘢痕或瘢痕疙瘩。这些瘢痕为表现为增加的胶原纤维沉积的大块病损。它们有相同的临床表现：它们是红色的、隆起的并且坚硬的，并具有光滑的、有光泽的表面。虽然肥厚性瘢痕可以在一到数年的过程中自发地变平，但瘢痕疙瘩持续存在并延伸到原始损伤的部位之外。作为超出损伤边界并且可生长持续很长时间的增厚的红色瘢痕，瘢痕疙瘩是在某些敏感个体中最通常在创伤后于真皮和相邻的皮下组织中产生的增生结缔组织团块。在局部皮肤成纤维细胞响应于局部刺激而进行旺盛的增生和增殖时形成瘢痕疙瘩病损。瘢痕大小的增加是由于增加量的胶原沉积入组织。遗传上，非洲裔美国人易于产生瘢痕疙瘩。瘢痕疙瘩的产生与不同类型的皮肤损伤(包括外科手术、穿耳孔、撕裂、烧伤、疫苗接种或炎症性过程)有关。肥厚性瘢痕是可由烧伤或其它皮肤损伤导致的团块。这样的瘢痕通常为永久的并且对已知的治疗方法有抗性。遭受肥厚性瘢痕或瘢痕疙瘩的患者抱怨局部疼痛、发痒以及局部敏感，所有上述危害他们的生活品质并且影响个体的体象。
对于瘢痕疙瘩的多种疗法仅取得有限的成功。现有的处理肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩的尝试包括外科手术、机械压迫、类固醇、X射线照射和冷冻疗法。已报道与这些方法中各个相关的缺点。例如，外科手术移除瘢痕组织可能经常是不完全的并且可能导致在切口和缝合点处产生肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩，即在瘢痕疙瘩被外科手术移除后瘢痕形成经常复发，并且类固醇治疗可能是不可预测的，并经常导致皮肤色素脱失。简单的瘢痕疙瘩外科切除的复发风险为50％-80％。外科手术与病灶内皮质类固醇注射或放射疗法的组合使代表性的治疗。然而，病灶内皮质类固醇注射易于出现并发症(脂肪萎缩、皮肤变薄和色素改变)。
由炎症发作引起的萎缩性瘢痕或凹陷瘢痕的特征在于皮肤收缩，并且留下美容角度上不美观的并且永久的瘢痕。最常见的实例是在炎症性痤疮或水痘后发生的瘢痕形成。作为伤口愈合的正常结果产生凹陷，并且导致所述凹陷的瘢痕组织主要包含由成纤维细胞增殖和代谢产生的胶原。一些痤疮患者通过使用病灶内注射的类固醇、局部施用液氮或皮肤磨削术成功地被治疗。然而在许多病例中没有改善，或者所述治疗导致其它并发症。
跨越关节或成直角的皮纹(skin crease)的瘢痕易于产生缩短或挛缩。在瘢痕不完全成熟时产生瘢痕挛缩，其经常会是肥厚性的，并且通常是无能力和功能失调的。它们常见于跨越关节或皮肤凹面的烧伤之后。对于瘢痕挛缩，可能需要用夹板疗法、丙烯酸铸模(acrylic casting)及加压疗法的外科松解(release)。全层(full thickness)皮肤移植和裂层或断层(split or partial)皮肤移植以及可能更有效的局部和游离皮瓣用于难对付和大面积瘢痕和挛缩的重构。
粘连形成是其中正常情况下分离的身体组织被瘢痕组织连接的过程。粘连最常由外科切口、擦伤或创伤导致。粘连可在基本上任何类型的外科手术后形成，但是在普通腹部外科、妇产科、矫形外科和心脏外科手术后产生频率最高。据报道，在腹部外科手术后腹膜粘连形成的发病率可高达90％。参见美国专利第6,613,325号。在经历了多次外科手术的患者中，粘连形成的发病率也被认为高达90％。手术后腹膜内和骨盆粘连代表了在从腹腔外科手术恢复的患者中的主要问题，其中在受影响的组织之间有形成粘连的趋势。参见美国专利第5,002,551号。该问题的普遍性也有严重的经济后果。
虽然粘连最常在外科手术后发生，除了外科手术，粘连也可由于组织损伤而发生，其包括外伤性损伤、炎症性疾病、腹膜内化学疗法和放射治疗。在其它并发症中，外科手术粘连的存在可与疼痛、不适以及由妇科外科手术导致的女性不孕症有关。例如肠梗阻(Intestinal obstruction)是由外科手术粘连导致的并发症。据报道，粘连还是肠梗阻(bowel obstruction)和不育的主要原因，并且相关的并发症包括慢性骨盆痛、尿道梗阻和排泄功能障碍。参见美国专利第6,689,803号。粘连形成可由腹膜的损伤导致，所述损伤进而可导致损伤或创伤部位发炎。虽然炎症是愈合过程的一部分，但是它可通过有助于瘢痕组织的纤维带的产生来促进粘连形成。通过称作纤维蛋白溶解的过程，纤维蛋白带最终溶解。然而在纤维蛋白带不溶解的部位，它们可变成连接并结合至正常情况下分离的器官和组织的增殖性粘连。据报道，细胞外基质的过量产生和沉积可能是全身发生组织纤维化(包括产生腹膜粘连)的关键因素(参见美国专利第6,841,153号)。
已报道多种防止粘连形成的方法。参见Dizerega,G.S.&Rodgers,K.E.,“Prevention of Postoperative Adhesions,”在“The Peritoneum”中,Dizerega,G.S.&Rodgers,K.E.,eds.,Springer-Verlang,New York,pp.307-369(1992)。已报道的用于粘连的治疗的一般分类包括：1)防止腹膜渗出液中的纤维蛋白沉积，2)减少局部组织炎症；和3)移除纤维蛋白沉积。参见同上(Id.)。然而据报道，尽管研究多年，所得到的用于防止手术后粘连的产品非常少。Johns,A.,Human Reproductive Update,7(6):577-579(2001)。同时，与外科手术粘连相关的医学问题变得更加严重，因为对于许多病症，反复外科手术普遍增加。因此，对于用于防止外科手术粘连和减轻其导致的并发症的化合物和方法的研发有重要的需求。
纤维增生疾病(包括肺纤维化、系统性硬化病、肝硬化、心血管疾病、进行性肾脏疾病和黄斑变性)是发病率和死亡率的主要原因，并且可影响所有组织和器官系统。纤维化组织重塑也可影响癌症转移并且加速在移植接受者中的慢性移植物排斥。然而尽管其对人的健康有巨大影响，目前没有批准的直接针对纤维化的机制的治疗。
纤维化是纤维组织的异常蓄积，其可作为在损伤的组织中伤口愈合过程的一部分发生。纤维化的实例包括肝纤维化、肺纤维化(例如硅肺病、石棉肺、特发性肺纤维化)、口纤维化、心内膜心肌纤维化、腹膜后纤维化、三角肌纤维化、肾纤维化(包括糖尿病肾病)和肾小球硬化症。例如肝纤维化作为慢性肝损伤的伤口-愈合响应的一部分发生。纤维化可作为血色病、威尔森氏病、酒精中毒、血吸虫病、病毒性肝炎、胆管梗阻、毒素暴露和代谢紊乱的并发症发生。据认为这种纤维化组织的形成代表了身体包裹损伤组织的尝试。肝纤维化的特征在于细胞外基质的蓄积，其可与正常肝脏中的定性地区别。不加以抑制(unchecked)，肝纤维化可进展为肝硬化(通过存在包裹的小结来定义)、肝功能衰竭和死亡。心内膜心肌纤维化为特发性的病症，其特征在于限制型心肌病的发生。在心内膜心肌纤维化中，潜在的过程使心脏的心内膜表面产生斑片状的纤维化，导致降低的血管顺度(compliance)，并且随着心内膜心肌的表面变得更广泛地累及，最终产生限制型生理。心内膜纤维化主要涉及右心室和左心室的输入道，并可影响房室瓣，导致三尖瓣返流和二尖瓣返流。口腔粘膜下纤维化为口腔的慢性、使人虚弱的疾病，其特征在于粘膜下层的组织(固有层组织和更深的结缔组织)的炎症和进行性纤维化。它导致明显的僵化和最后的张口困难。颊粘膜为最常累及的部位，但是口腔任何部位均可被累及，甚至咽部。腹膜后纤维化特征在于遍及腹膜后腔(通常集中在第四和第五腰椎的前面)的广泛的纤维化的产生。这种纤维化导致腹膜后结构(特别是输尿管)的包埋和梗阻。在大多数情况下，病因是未知的。然而，其与自身免疫病的偶然关联及其对皮质类固醇和免疫抑制治疗的响应表明其可能为免疫介导的。三角肌纤维化为以三角肌的实体内的肌内纤维带为标志的肌肉病症。这些带导致影响肩关节功能的继发性挛缩。翼状肩胛(scapular winging)和继发性脊柱侧弯也可能与该病况有关。三角肌纤维化与臀部肌肉和四头肌的纤维性挛缩相关，并且可能是相似的过程。
近年来对引起肝纤维化的细胞和生化机制的理解有所进展(由Li和Friedman综述,J.Gastroenterol.Hepatol.14:618-633,1999)。星形细胞被认为是肝脏中细胞外基质的主要来源。星形细胞对存在于肝脏中的多种细胞因子有响应，它们也产生其中的一些(Friedman,Seminars in Liver Disease19:129-140,1999)。如由Li和Friedman所总结，对于肝纤维化的实际的和提议的治疗策略包括移除引起的原因(例如毒素或传染原)、抑制炎症(使用例如皮质类固醇、IL-1受体拮抗剂或其它可抑制炎症的物质)、下调星形细胞激活(使用例如γ干扰素或抗氧化剂)、促进基质降解或促进星形细胞凋亡。尽管有近期的进展，但这些策略中的许多仍处于实验阶段，并且现有的治疗以抑制炎症为目标，而不是解决潜在的生化过程。因此，本领域仍需要用于治疗纤维化(包括肝纤维化)的材料和方法。
羊传染性口疮病毒(副痘病毒属的模式种)在有蹄类动物和人中导致局部增生皮肤病损(Haig和Mercer,Vet Res 29,311-26,1998)，在免疫缺陷个体中报道有过度增生的和持久性病损(Gurel等人,Eur J Dermatol 12,183-5,2002；Hunskaar,Br J Dermatol114,631-4,1986；Savage等人,Proc R Soc Med 65,766-8,1972,Tan等人,Br JPlast Surg44,465-7,1991)。羊传染性口疮病毒感染起始于伤口形成的皮肤的再生表皮，并且病损通过红斑、丘疹、小疱、脓疱以及然后结疤形成的阶段进展(Haig和Mercer,Vet Res 29,311-26,1998；Jenkinson等人,Vet Dermatol 1,189-95,1990)。已记载的羊传染性口疮病毒病损令人想起持续的伤口愈合响应，因为它们特征在于广泛的血管增殖和扩张以及表皮的增生(Groves等人,J Am Acad Dermatol 12,706-11,1991,Savory等人,J Virol 74,10699-706,2000)。
血管内皮生长因子(VEGF)为正常生理过程和疾病过程(如伤口愈合)期间血管发生的关键的调节剂(Carmeliet和Jain,Nature 473,298-307,2011,Ferrara,Endocr Rev25,581-611,2004,McColl等人,Apmis 112,463-80,2004)。VEGF家族(其包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盘生长因子(PIGF))与高亲和性VEGF受体(VEGFR)(VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3)相互作用(Koch等人,Biochem J 437,169-83,2011；Olsson等人,Nat Rev Molcell Biol,7,359-71,2006)。VEGF-A与VEGFR-1和VEGFR-2二者结合，而PIGF和VEGF-B只与VEGFR-1结合。VEGF-C和VEGF-D与VEGFR-2和VEGFR-3二者相互作用。VEGF也结合共受体跨膜蛋白(NRP)-1和NRP-2，其增强与VEGFR的结合(Soker等人,J Cell Biochem 85,357-68,2002；Vadasz等人,Autoimmun Rev 9,825-829,2010)。已证明VEGF-A主要经由VEGFR-2通过刺激内皮细胞增殖、迁移和存活并提高血管通透性来促进血管发生(Holmes等人,cellSignal 19,2003-2012,2007)。然而VEGFR-1似乎在内皮细胞分化和迁移中起作用，其可能通过用作配体结合分子，使VEGF-A与VEGFR-2信号转导隔离(Shibuya,Angiogenesis 9,225-230,2006)。在皮肤组织修复期间，VEGF-A被角质形成细胞高度表达，并刺激在创面中新血管的形成，提供皮肤再生所需的营养和氧气(Barrientos等人,Wound Repair Regen16,585-601,2008；Brown等人,J Exp Med 176,1375-1379,1992；Nissen等人,Am J Pathol152,1445-1452,1998)。此外，许多研究表明VEGF-A还通过促进伤口的表皮再生来增强愈合(Brem等人,J Invest Dermatol 129,2275-2287,2009；Li等人,Diabetes 56,656-665,2007；Michaels等人,Wound Repair Regen 13,506-512,2005；Romano Di Peppe等人,GeneTher 9,1271-1277,2002)。VEGF-A还增加血管渗漏并促进杂乱的血管形成(Carmeliet,NatMed 6,1102-1103,2000)。数种其它皮肤病症与高度存在的VEGF-A相关，所述病症如银屑病(Detmar,J Invest Dermatol 122,xiv-xv,2004)、皮肤癌(Weninger等人,Lab Invest 75,647-657,1996)、疱疹样皮炎和多形性红斑(Brown等人,J Immunol 154,2801-2807,1995)。VEGF-A在带有表皮创伤的转基因小鼠中过表达，其诱导以明显的血管发生、炎症和表皮增生为特征的银屑病样病损(Canavese等人,Histol Histopathol 26,285-296,2011；Elias等人,Am J Pathol 173,689-699,2008；Xia等人,Blood102,161-168,2003)。
据报道，在羊传染性口疮病毒病损下发现的广泛的血管变化部分地(如果不是单独地)是由于由该病毒编码的VEGF同系物的表达。在没有功能性病毒VEGF的存在下，受感染的病损不仅缺少明显的血管增殖和皮肤水肿，还缺少野生型感染中所见的表皮增生和表皮突形成的特征性的模式(Savory等人,J Virol 74,10699-10706,2000；Wise等人,VirusRes 128,115-125,2007)。也已报道，纯化的羊传染性口疮病毒VEGF(已指明为VEGF-E)通过其与VEGFR-2的相互作用促进血管发生和表皮再生，但是由于其不能结合VEGFR-1，其表现出可忽略的血管渗漏和组织炎症(Inder等人,Febs J 275,207-217,2008；Inoue等人,Arterioscler Thromb Vasc Biol 27,99-105,2007；Kiba等人,Biochem Biophys ResCommun 301,371-377,2003；Wise等人,J Biol Chem 278,38004-38014,2003；Wise等人,Cellular Microbiology 14(9)1376-1390,2012；Zheng等人,Arterioscler Thromb VascBiol 26,2019-2026,2006；Zheng等人,Arterioscler Thromb Vasc Biol 27,503-511,2007)。
白细胞介素-10(IL-10)(也称作人细胞因子合成抑制因子(CSIF))为抗炎细胞因子。人IL-10由IL10基因编码。该细胞因子主要由单核细胞产生，在较小程度上由淋巴细胞和角质形成细胞产生。其在免疫调节和炎症中具有多效性(pleiotropic)作用。它下调Th1细胞因子、MHC II类抗原和巨噬细胞上辅刺激分子的表达。它还提高B细胞存活、增殖和抗体产生。IL-10可阻滞NF-κB活性，并参与JAK-STAT信号转导通路的调节。IL-10能够抑制促炎细胞因子(如IFN-γ、IL-2、IL-3、TNFα以及由细胞(如巨噬细胞和调节性T-细胞)产生的GM-CSF)的合成。它还表现有效抑制抗原呈递细胞的抗原呈递的能力。然而，它也对特定T细胞和肥大细胞有刺激性，并刺激B细胞成熟和抗体产生。IL-10主要在单核细胞和2型T辅助细胞(TH2)、肥大细胞、CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞中表达，并且也在激活的T细胞和B细胞的特定亚类中表达。它由细胞毒性T细胞释放以在对病毒感染的免疫响应期间抑制NK细胞的作用。
许多病毒利用使用细胞的细胞因子或细胞因子受体的同系物的策略以使被病毒感染的细胞避开免疫防御并增强病毒在宿主中的存活。人巨细胞病毒(HCMV)为种特异性的β疱疹病毒，其感染了大部分的世界人口。HCMV在原髓样谱系细胞中建立和保持终生的潜在性感染。在这些细胞向髓样树突状细胞(DC)和巨噬细胞的最终细胞分化后，潜伏性病毒有再活化的能力，导致新的、传染性的病毒体产生，并且在免疫受损的个体中经常导致严重的疾病。仅一亚类的病毒基因在潜伏期中具有转录活性，包括HCMV UL111A，其为编码有效的免疫调制的细胞因子人白细胞介素-10(hIL-10)的同系物的基因。UL111A在感染的产生和潜伏期均具有转录活性，并且编码数种病毒IL-10蛋白，所述蛋白发挥多种免疫调制功能，包括抑制细胞因子合成和由骨髓细胞的主要组织相容性复合体(MHC)的表达、刺激B细胞和抑制DC成熟以及细胞滋养层功能。参见Avdic,S等人，Viral Interleukin-10Expressed byHuman Cytomegalovirus during the Latent Phase of Infection Modulates LatentlyInfected Myeloid Cell Differentiation,J.Virol.2011年7月85:7465-7471。许多疱疹病毒也包含IL-10的同系物。Epstein-Barr病毒(EBV)编码的IL-10(ebvIL-10)(鉴定的第一个IL-10的病毒同系物)具有许多但不是全部细胞IL-10的生物活性，并可在宿主-病毒的相互作用起重要作用。除了EBV，可感染人的羊传染性口疮痘病毒(orf poxvirus,OV)具有其自身的IL-10同系物(ovIL-10)。参见Kotenko,SV等人,Human cytomegalovirus harborsits own unique IL-10homolog(cmvIL-10),PNAS 97:1695-1700(2000)。ORFV-IL-10功能上与细胞的IL-10相似，因为其能够抑制人、羊和鼠的单核细胞的细胞因子的合成(Wise等人,J Gen Virol88,1677-1682,2007；Fleming等人,J Virol 71,4857-4861,1997；Haig等人,Virus Res 88,3-16,2002；Imlach等人,J Gen Virol 83,1049-1058,2002)，损害鼠和人的树突状细胞的成熟(Chan等人,J Gen Virol 87,3177-3181,2006,Lateef等人,J GenVirol 84,1101-1109,2003)，但是也共刺激肥大细胞和胸腺细胞(Fleming等人,J Virol71,4857-4861,1997；Haig等人,Virus Res 88,3-16,2002；Imlach等人,J Gen Virol 83,1049-1058,2002)。
虽有对引起伤口愈合过程的原理的理解上的进展，但仍然有对于伤口护理和组织修复以及改善和/或促进伤口愈合的适合的治疗选择的显著的未满足的需求，所述伤口包括未按期望速率愈合的伤口，如延期愈合伤口、不完全愈合伤口和受损的伤口愈合(如在慢性伤口、瘢痕形成和异常的或过度的瘢痕形成(包括瘢痕疙瘩和肥厚性瘢痕形成)、萎缩性瘢痕形成、广泛性瘢痕形成和瘢痕挛缩，以及粘连(包括外科手术粘连)中所见)。本领域中有对于用于治疗如由急性和慢性伤口、炎症、纤维化、瘢痕形成和粘连引起的病况的改善的方法和组合物的需求。
简要概述
本文中所述和请求保护的发明有许多属性和实施方案，其包括但不限于在该简要概述中说明或描述或引用的那些。其不意图是详尽的，并且本文中所述和请求保护的发明不限于在该简要概述中认定的特征或实施方案，或者受其限制，包含其仅是为了说明的目的，并不是为了限制。
本发明一般性地涉及病毒血管内皮生长因子和抗炎细胞因子的组合，所述抗炎细胞因子包括例如抗炎白细胞介素。
在一个实施方案中，本发明包括将病毒血管内皮生长因子和抗炎细胞因子一起或联合给药。在另一实施方案中，本发明提供包含病毒血管内皮生长因子和抗炎细胞因子以及药学上可接受的载体的组合物。在一个实施方案中，联合或用于分开给药的病毒血管内皮生长因子和抗炎细胞因子的量可有效促进伤口愈合以及治疗伤口，特别是急性伤口和未按期望速率愈合的伤口，如延期愈合伤口、不完全愈合伤口、慢性伤口和开裂伤口。在其它实施方案中，联合或用于分开给药的病毒血管内皮生长因子和抗炎细胞因子的量可有效减少纤维化、粘连、炎症或瘢痕形成。
在一个实施方案中，本发明包括病毒血管内皮生长因子和哺乳动物抗炎细胞因子。在另一实施方案中，本发明包括病毒血管内皮生长因子和哺乳动物抗炎白细胞介素。在另一实施方案中，本发明包括病毒血管内皮生长因子和哺乳动物IL-10。
在一个实施方案中，本发明包括病毒血管内皮生长因子和病毒抗炎细胞因子。在另一实施方案中，本发明包括病毒血管内皮生长因子和病毒抗炎白细胞介素。在另一实施方案中，本发明包括病毒血管内皮生长因子和病毒IL-10。在另一实施方案中，本发明包括病毒血管内皮生长因子和副痘病毒IL-10。在另一实施方案中，本发明包括病毒血管内皮生长因子和羊传染性口疮病毒IL-10。
在一个实施方案中，所述病毒血管内皮生长因子为VEGF-E。在另一实施方案中，所述病毒血管内皮生长因子为副痘病毒VEGF，例如副痘病毒VEGF-E。在另一实施方案中，所述病毒血管内皮生长因子为羊传染性口疮病毒VEGF，例如羊传染性口疮病毒VEGF-E。
因此，本发明的一个实例包括VEGF-E和病毒IL-10，并且在一个实施方案中，所述VEGF-E和所述病毒IL-10中的一个或二者来自羊传染性口疮病毒。
在一个实施方案中，所述病毒血管内皮生长因子和病毒白细胞介素可以组合的形式使用。在另一实施方案中，所述病毒血管内皮生长因子和病毒白细胞介素可在组合中分开使用。
在另一方面中，本发明包括与药物载体组合的病毒血管内皮生长因子和病毒白细胞介素。在一个实施方案中，本发明包括与药物载体组合的VEGF-E和病毒IL-10。在一个实施方案中，所述VEGF-E和所述病毒IL-10中的一个或二者来自羊传染性口疮病毒。
在另一方面中，本发明包括药盒，其包含与药物载体组合的病毒血管内皮生长因子和抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)，以及对于向个体治疗施用的说明。在一个实施方案中，所述病毒血管内皮生长因子为VEGF-E，并且所述病毒白细胞介素为病毒IL-10。在另一实施方案中，所述VEGF-E和所述病毒IL-10中的一个或二者来自副痘病毒，例如羊传染性口疮病毒。
在另一方面中，本发明包括药盒，其包含与药物载体组合的病毒血管内皮生长因子和与药物载体组合的抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)，以及对于向个体治疗施用的说明。在一个实施方案中，所述病毒血管内皮生长因子为VEGF-E，并且所述病毒白细胞介素为病毒IL-10。在另一实施方案中，所述VEGF-E和所述病毒IL-10中的一个或二者来自副痘病毒，例如羊传染性口疮病毒。
本发明还涉及病毒血管内皮生长因子和抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)在急性伤口、延期愈合伤口、受损愈合伤口以及缓慢愈合伤口、慢性伤口和开裂伤口的治疗中的用途。在一个实施方案中，VEGF-E和病毒IL-10用于治疗。在另一实施方案中，所述VEGF-E和所述病毒IL-10中的一个或二者来自副痘病毒，例如羊传染性口疮病毒。
本发明还涉及病毒血管内皮生长因子和抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)用于减少个体中纤维化的用途。在一个实施方案中，VEGF-E和病毒IL-10用于减少纤维化。在另一实施方案中，所述VEGF-E和所述病毒IL-10中的一个或二者来自副痘病毒，例如羊传染性口疮病毒。
本发明还涉及病毒血管内皮生长因子和抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)用于减少个体中粘连或粘连形成的用途。在一个实施方案中，VEGF-E和病毒IL-10用于减少粘连或粘连形成。在另一实施方案中，所述VEGF-E和所述病毒IL-10中的一个或二者来自副痘病毒，例如羊传染性口疮病毒。
本发明还涉及病毒血管内皮生长因子和抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)用于减少个体中炎症的用途。在一个实施方案中，VEGF-E和病毒IL-10用于减少炎症。在另一实施方案中，所述VEGF-E和所述病毒IL-10中的一个或二者来自副痘病毒，例如羊传染性口疮病毒。
本发明还涉及病毒血管内皮生长因子和抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)用于减少个体中瘢痕形成的用途。在一个实施方案中，VEGF-E和病毒IL-10用于减少瘢痕形成。在另一实施方案中，所述VEGF-E和所述病毒IL-10中的一个或二者来自副痘病毒，例如羊传染性口疮病毒。
在一个方面中，将病毒血管内皮生长因子和抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)向个体共同给药。在该方面的一个实施方案中，所述病毒血管内皮生长因子为VEGF-E，并且病毒白细胞介素为病毒IL-10。在本发明该方面的另一实施方案中，所述VEGF-E和所述病毒IL-10中的一个或二者来自副痘病毒，例如羊传染性口疮病毒。
在另一方面中，将VEGF-E和病毒IL-10向个体分开给药。在该方面的一个实施方案中，所述病毒血管内皮生长因子为VEGF-E，并且所述病毒白细胞介素为病毒IL-10。在本发明该方面的另一实施方案中，所述VEGF-E和所述病毒IL-10中的一个或二者来自副痘病毒，例如羊传染性口疮病毒。
本发明还涉及病毒血管内皮生长因子和抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)与一种或多种可用于伤口愈合或减少炎症、粘连、纤维化和/或瘢痕形成的其它药剂组合的用途。
此类其它药剂的实例包括抗连接蛋白剂，例如抗连接蛋白多核苷酸(例如连接蛋白抑制剂，如α-l连接蛋白寡脱氧核苷酸)、抗连接蛋白肽(例如抗体和抗体结合片段)以及肽模拟物(例如α-l抗连接蛋白肽或肽模拟物)、缝隙连接关闭或阻滞化合物、半通道关闭或阻滞化合物，以及连接蛋白羧基端多肽(例如与骨桥蛋白或骨桥蛋白结合部位结合的多肽、抗骨桥蛋白多核苷酸以及抗骨桥蛋白剂，特别是抗骨桥蛋白多核苷酸)。抗骨桥蛋白肽模拟物可本身的形式给药，或与一种或多种其它药剂(例如antennapedia)复合，以促进膜转运。
描述并请求保护本发明的组合物和方法，其应用一种或多种病毒血管内皮生长因子和一种或多种抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)种类用于治疗例如急性伤口、延期愈合伤口和慢性伤口。在特定的实施方案中，组合物包含治疗上有用的组分，特别是可有效促进个体愈合或组织修复的量药用或兽用组分，其包含一种或多种病毒血管内皮生长因子和/或一种或多种抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)种类。因此，可起始和/或增强损伤或伤口的愈合，并且可减少炎症、粘连、纤维化和/或瘢痕形成。
在本发明的实施方案中，所述病毒血管内皮生长因子为副痘病毒VEGF。在特定的实施方案中，所述病毒血管内皮生长因子为羊传染性口疮病毒VEGF。
在本发明的实施方案中，所述病毒白细胞介素种类包括病毒IL-10。在其它实施方案中，所述病毒IL-10为副痘病毒IL-10。在一个实施方案中，所述病毒IL-10为羊传染性口疮病毒IL-10。
本发明的方法、组合物和药盒包括例如注射、局部或吸入递送的形式和制剂。这样的形式和制剂包括如本文中所述用于治疗个体的那些。
药物组合物也可以组合制剂的形式提供，例如，作为一种或多种病毒血管内皮生长因子和一种或多种抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)种类单独地、联合地或组合地与一种或多种治疗剂(例如一种或多种抗连接蛋白或抗骨桥蛋白剂，包括抗连接蛋白和抗骨桥蛋白多核苷酸、肽和/或肽模拟物种类)的混合物。
术语“组合制剂”在以下意义上包括“药盒”：如本文中定义的组合部分(partner)可单独给药或通过使用含不同量的两种或更多种药剂种类的不同的固定组合给药，即同时、分开或顺序给药。则例如可将药盒的部分同时给药，或在相等的或不同的时间间隔下按时间顺序交错(即在不同的时间点)给药，和/或对于药盒的任意部分，以相同或不同的给药次数给药。
在一些实施方案中，给药组合制剂，其中将两种或更多种分开的组分向个体给药，其中第一组分包含治疗有效量的一种或多种病毒血管内皮生长因子，并且第二组分包含治疗有效量的一种或多种抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)种类。在其它实施方案中，给药包含一种或多种抗连接蛋白或抗骨桥蛋白多核苷酸、肽或肽模拟物的第三组分。在一个实施方案中，所述抗连接蛋白剂为抗连接蛋白43剂。
提供药物组合物用于联合、同时、分开、顺序或持续给药。在一些实施方案中，会包含一种或多种病毒血管内皮生长因子和/或一种或多种抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)种类的组合物在与一种或多种抗连接蛋白剂和/或抗骨桥蛋白剂相同或约相同的时间给药。在一个实施方案中，会包含一种或多种病毒血管内皮生长因子和/或一种或多种抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)种类的组合物在一种或多种抗连接蛋白剂和/或抗骨桥蛋白剂的至少约30、60、90或120分钟，或者约3、4、5、6、8、12、24、48或168小时内给药。
在一个方面中，本发明包括药物组合物，其包括可注射的、局部的、全身的和吸入的递送形式和制剂，所述药物组合物包含单独的药学上可接受的载体和治疗有效量的一种或多种病毒血管内皮生长因子和/或一种或多种抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)种类，或者其连同或与一种或多种其它治疗剂种类组合，所述其它治疗剂种类例如第一抗连接蛋白剂种类、第二抗连接蛋白剂种类、第一抗骨桥蛋白剂种类和/或第二抗骨桥蛋白剂种类。这样的组合物可用于例如伤口愈合以及如本文中所述的其它应用。
病毒血管内皮生长因子的实例包括副痘病毒VEGF，以及来自编码VEGF-E(例如NZ2、NZ10、NZ7、D1701等)的所有羊传染性口疮病毒株的VEGF。副痘病毒VEGF包括来自副痘病毒株BPSV、PVNZ和PCPV，以及所有其它编码VEGF-E的毒株的VEGF。来自其它病毒种的VEGF包括在本发明的范围内。在其它实施方案中，所述病毒VEGF可为任意分子，不论是天然存在的或非天然存在的(包括指定的或发现的(例如通过随机或定向诱变)天然存在的分子的衍生物或变体)，与VEGFR-1相比，所述分子更多地激活VEGFR-2。在其它实施方案中，所述病毒VEGF可为任意分子，不论是天然存在的或非天然存在的(包括指定的或发现的(例如通过随机或定向诱变)天然存在的分子的衍生物或变体)，所述分子激活VEGFR-2，但不明显结合或激活VEGFR-1。
病毒白细胞介素种类的实例包括来自羊传染性口疮病毒、EBV、CMV的病毒白细胞介素，其包括来自这些和其它病毒的IL-10。病毒白细胞介素包括痘病毒IL-17同系物、EBVCXCR同系物和KSHV Il-6同系物和IL-8R同系物。具有抗炎活性的这些及所有其它病毒白细胞介素在本发明的范围内。痘病毒还具有抗炎趋化因子模拟物、白细胞介素/TNF/趋化因子结合蛋白和其它IL-119/20/22样蛋白。所有这样的具有抗炎活性的蛋白在本发明的范围内。
抗连接蛋白和抗骨桥蛋白剂的实例为多核苷酸，包括反义寡脱氧核苷酸。抗连接蛋白和抗骨桥蛋白多核苷酸的实例包括抗连接蛋白和抗骨桥蛋白寡脱氧核苷酸，其包括反义物(antisense)(包括修饰的和未修饰的主链反义物)、RNAi和miRNA以及siRNA。适合的抗连接蛋白肽包括例如与连接蛋白细胞外结构域结合的肽，或与连接蛋白细胞内结构域结合的肽。为了促进膜转运以结合至细胞内连接蛋白区域和结构域，肽模拟物可与一种或多种其它药剂(例如antennapedia)复合。
本发明通过使用同时、分开或顺序给药，或者联合给药的至少一种病毒血管内皮生长因子和至少一种抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)(单独或与一种或多种治疗剂种类组合)，使伤口愈合的速率、程度和/或品质提高。
本发明通过使用同时、分开或顺序给药，或者联合给药的至少一种病毒血管内皮生长因子和至少一种抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)(单独或与一种或多种治疗剂种类组合)，使炎症减少。
本发明通过使用同时、分开或顺序给药，或者联合给药的至少一种病毒血管内皮生长因子和至少一种抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)(单独或与一种或多种治疗剂种类组合)，使瘢痕形成减少和/或瘢痕品质提高。
在特定的实施方案中，至少一种病毒血管内皮生长因子和至少一种抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)同时、分开或顺序或者联合给药的组合使用，会由于这样的组合使用具有更少的给药时间点和/或增加的给药之间的时间间隔。在其它这样的实施方案中，所述组合使用允许降低的给药频率。在其它实施方案中，与当单独给药所述药剂时可以有效的剂量相比，组合使用允许使用减少剂量的这样的药剂。
在特定的其它实施方案中，同时、分开或顺序给药，或者与一种或多种其它治疗剂(例如一种或多种抗连接蛋白多核苷酸、肽或肽模拟物和/或一种或多种抗骨桥蛋白多核苷酸、肽或肽模拟物)联合给药的至少一种病毒血管内皮生长因子和至少一种抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)的组合使用在促进期望的治疗结果(例如伤口愈合和用于减少炎症、纤维化、粘连形成和瘢痕形成)中具有累加效应、协同效应或超累加效应。在这些实施方案的一些中，由于这样的组合使用，组合制剂的给药会具有更少的给药时间点和/或增加的给药之间的时间间隔。在其它这样的实施方案中，所述组合使用允许降低的给药频率。在其它实施方案中，与当单独给药所述药剂时可以有效的剂量相比，组合使用允许使用减少剂量的这样的药剂。
在另一方面中，本发明包括用于给药治疗有效量的同时、分开或顺序，或者联合给药的至少一种病毒血管内皮生长因子和至少一种抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)的方法。在一些实施方案中，将所述组合物配制为例如适合用于向有伤口的个体给药的延迟释放制剂、缓释制剂、持续释放制剂、控释制剂和/或重复作用制剂，所述伤口包括慢性伤口以及整体或部分特征在于缓慢的、延期的或不完全的伤口愈合的伤口。慢性伤口包括糖尿病性溃疡(例如糖尿病性足溃疡)、静脉性溃疡、静脉瘀滞溃疡、压力性溃疡、褥疮溃疡、血管炎溃疡、动脉溃疡、感染性溃疡、烧伤溃疡、创伤诱导的溃疡、炎症性溃疡以及与坏疽性脓皮病相关的溃疡形成。慢性伤口还包括眼溃疡，其包括持续性上皮缺陷。在一些实施方案中，所述个体是糖尿病患者；在其它实施方案中，所述个体患有心血管疾病或病况，例如静脉高压、静脉功能不全和/或动脉功能不全。
在特定的其它方面，本发明涉及使用本发明的化合物和组合物以治疗患有多种与伤口相关的疾病、病症和病况或者有患有多种与伤口相关的疾病、病症和病况的风险的个体的方法，所述伤口包括急性伤口和未按期望速率愈合的伤口，其包括延期愈合伤口和慢性伤口。用一种或多种本发明的药物组合物治疗个体(例如治疗伤口或如本文中所指明的其它适应症)，可包括所述药物组合物的同时、分开、顺序或持续给药。
在另一方面中，本发明包括治疗个体的方法，所述个体患有或怀疑患有或易患有或有风险患有整体或部分特征在于需要修复的伤口或组织的任意疾病、病症和/或病况。这样的组合物包括例如局部和吸入递送形式和制剂。
在另一方面中，本发明提供治疗方法，其包括向个体给药一种或多种对于用于治疗伤口而言治疗有效量的本发明的药物组合物，所述伤口包括例如急性伤口以及未按期望速率愈合的伤口(包括延期愈合伤口和慢性伤口)。
在另一方面中，本发明提供治疗方法，其包括向需要其的个体单独给药包含治疗有效量的同时、分开或顺序或者联合给药的至少一种病毒血管内皮生长因子和至少一种抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)的组合物，或者将其与一种或多种抗连接蛋白剂和/或抗骨桥蛋白剂联合给药。外科手术前的预处理也在本发明的范围内。所述预处理会例如减少切口、切除或修正的点的局部损伤，以及用于愈合的主要(prime)细胞。
在另一方面中，本发明提供治疗方法，其包括向需要其的个体给药第一组分和至少一种其它治疗组分(例如第二组分、第二和第三组分等)，包含至少一种病毒血管内皮生长因子和至少一种抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)。在该方面的实施方案中，所述“第一”组分包含治疗有效量的同时、分开或顺序或者联合给药的至少一种病毒血管内皮生长因子和/或至少一种抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)，但这不意味着暗示这样的组分在其它治疗组分之前给药，更经常地，或者通过与它治疗组分不同的途径给药。换言之，在这些实施方案中的一些，先给药第一组分，而在其它中，先给药第二组分。在涉及三种不同的治疗组分的给药的实施方案中，这样的方法例如可包括根据相同或不同的用药或给药方案同时给药各组分。
在另一方面中，本发明提供改善或减少需要其的个体中瘢痕形成、改善或减少个体中纤维化，以及改善或减少个体中粘连形成的方法，其包括向所述个体单独给药治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含同时、分开或顺序或者联合给药的至少一种病毒血管内皮生长因子和至少一种抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)，或者将所述药物组合物与一种或多种其它治疗剂联合给药。
在特定的实施方案中，联合治疗的方法包括给药同时、分开或顺序或者联合给药的至少一种病毒血管内皮生长因子和至少一种抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)，其中的一些或全部以小于当药剂被完全地(physically)或在伤口或其它要改善的病况的治疗过程中单独给药时(即当未将它们联合给药时)使用的量或剂量提供。所给药的这样的较少量的药剂通常为当单独给药时的量的约二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、六分之一、八分之一、十分之一或约二十分之一。
在另一方面中，本发明包含能够粘在或者另外地与个体的皮肤相连的透皮贴、敷料、垫、包裹物、基质和绷带，所述制品能够向个体单独递送治疗有效量的同时、分开或顺序或者联合给药的至少一种病毒血管内皮生长因子和至少一种抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)，或者将其与一种或多种治疗剂向个体联合递送。
在另一方面中，本发明包括制品，其包含含有治疗有效量的同时、分开或顺序或者联合给药的至少一种病毒血管内皮生长因子和至少一种抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)(单独的或与一种或多种其它治疗剂组合)的一个或多个容器，及使用说明，包括用于个体治疗的说明。
本发明包括制品，其包含含有一种或多种剂型的包装材料，所述药剂型包含同时、分开或顺序或者联合给药的至少一种病毒血管内皮生长因子和至少一种抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)，所述药剂型为单独的或连同包含一种或多种其它治疗剂的剂型，其中所述包装材料有标签，其说明所述药剂型可用于患有或怀疑患有或易患有如本文中所述或所引用的任意疾病、病症和/或病况的个体，包括整体或部分特征在于急性、受损、延期或慢性伤口愈合、炎症、瘢痕形成、纤维化或粘连的疾病、病症和/或病况。这样的剂型包括例如局部递送形式和制剂、散剂递送形式和制剂、适合于注射或输注的递送形式和制剂(包括干燥的或粉状的组合物，在给药前必须将其用适合的稀释剂重构)以及适合于滴注的递送形式和制剂。适合的制剂递送适合实现期望的治疗效果的量的治疗剂。局部制剂的实例包括泡沫剂、喷雾剂和凝胶剂。凝胶剂的实例包括聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物系凝胶剂和羧甲基纤维素系和相关纤维素的凝胶剂，以及藻酸盐凝胶剂，普兰尼克(pluronic)凝胶剂是特别有用的。
本发明还包括使用治疗有效量的本发明的组合物来制备药物(包括例如局部递送形式和制剂)的方法。这样的药物包括用于治疗如本文中所述的个体的那些，包括用于治疗急性伤口、延期愈合、受损愈合和缓慢愈合伤口、慢性伤口和开裂伤口。
在另一方面中，本发明提供同时、分开或顺序或者联合给药的至少一种病毒血管内皮生长因子和至少一种抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)在制备药品中的用途，所述药品用于需要其的患者中的促进的伤口愈合、改善和/或减少的瘢痕形成、改善和/或减少的炎症、减少的纤维化或减少的粘连形成。在这些实施方案的一些中，所述药品包含伤口敷料或伤口愈合促进基质。例如，所述伤口敷料或基质以含组合物的固体基质的形式提供，所述组合物包含分散在固体基质上或固体基质中的至少一种病毒血管内皮生长因子和至少一种抗炎细胞因子(例如病毒白细胞介素)。
在另一实施方案中，本发明提供本发明的化合物和组合物与结缔组织生长因子(CTGF)抑制剂(例如CTGF反义化合物)结合或组合的用途。在另一实施方案中，本发明提供本发明的化合物和组合物与PDGF受体抑制剂结合或组合用于例如治疗纤维化和/或减少粘连和瘢痕形成的用途。PDGF受体抑制剂包括例如受体阻滞剂、受体拮抗剂。CTGF和PDGF受体抑制剂还包括单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(包括例如Fab、F(ab’)2和Fv片段)；单链抗体；单链Fv；以及单链结合分子，如包含例如结合结构域、铰链、CH2和CH3结构域的那些、重组抗体和抗体片段，其能够结合与特定抗体或其它结合分子接触的抗原决定簇(例如表位)，包括针对CTGF或PDGF受体的抗体和抗体结合片段。在另一实施方案中，本发明提供本发明的化合物和组合物与PDGF受体激动剂结合或组合用于例如治疗伤口的用途。
在另一实施方案中，本发明提供本发明的化合物和组合物与人造皮肤产品的施用结合或组合的用途，所述人造皮肤产品包括例如(单层冷冻保存的皮肤代用品，其包含人成纤维细胞、细胞外周围物质和生物可吸收框架)、(活的、双层皮肤构建体，其具有由人角质形成细胞形成的表皮层，以及含有在牛1型胶原网中的人成纤维细胞的真皮层)、(用于皮肤替代的两层膜系统，其包含由多孔的牛肌腱胶原和糖胺聚糖(软骨素-6-硫酸盐)纤维模板制成的真皮替代层，以及用于控制水分损失的由薄硅酮制成的表皮替代层)、(无细胞皮肤基质)、CyzactTM(通过纤维蛋白递送的人皮肤成纤维细胞)、ICX-SKN(成纤维细胞和纤维蛋白基质的组合，将其改造用于制备胶原基质)、KeragraftTM(源自人干细胞的产品，研发其作为自体表皮等价物用于伤口护理)、伤口基质(生物衍生的基于细胞外基质的伤口产品，其由源自猪的无细胞小肠粘膜下层生产)、OrCelTM(两层细胞模板，其中将人表皮角质形成细胞和皮肤成纤维细胞在牛胶原海绵上的在两个分开的层中培养)、(源自人成纤维细胞的临时皮肤替代物，其由多聚体膜和新生儿人成纤维细胞组成)等。本发明的化合物和组合物也可用于与促进伤口愈合的其它敷料(包括例如BioBrane)的施用结合或组合。本发明的化合物和组合物也可用于与促进伤口愈合的其它类型的支架或敷料的施用结合或组合，所述支架或敷料包括例如由HealthPoint研发的细胞喷雾剂(称作HP802-247的细胞治疗喷雾悬浮液，其由两种组分组成，在治疗时将其顺序地喷射在创面上：纤维蛋白原溶液以及包含生长停滞的、活的、同种异体的表皮角质形成细胞和皮肤成纤维细胞的混合物的细胞制备物)和培养的同种异体角质形成细胞。
本发明还涉及抗骨桥蛋白剂(包括肽和肽模拟物，例如抗骨桥蛋白多核苷酸种类)单独或与一种或多种其它药剂组合用于治疗急性伤口、延期愈合伤口和慢性伤口的用途。
下文提供本发明的这些和其它方面，其不限于该简要概述中的信息，或者不受其限制。
附图简要说明
下文提供各附图的简要概述。
图1.与单独治疗或它们的哺乳动物等价物相比，病毒VEGF-E和病毒IL-10的联合治疗在更大程度上加速皮肤组织修复。(A)在用不同的病毒因子和哺乳动物因子治疗期间标明的时间点时，4mm皮肤全层冲击伤口的愈合过程的照片。治疗时机在右侧标明。(B)在向伤口部位局部给药标明的病毒因子和哺乳动物因子下，小鼠组(n＝8只每组)中皮肤伤口闭合的动力学。通过星号标明与模拟治疗的伤口相比显著较小(P≤0.05)的值。用#标明在给定的时间点，比较治疗之间的显著性差异。
图2.与它们的哺乳动物等价物相比，病毒VEGF-E和病毒IL-10的联合治疗与单独治疗类似地在更大程度上加速伤口闭合。各治疗组(n＝8)闭合的平均天数用菱形标明。上四分位数和下四分位数分别用空心和实心框表明。异常值在上方和下方标明。通过星号标明与模拟治疗的伤口相比显著较小(P≤0.05)的值。用#标明特定治疗之间的显著性差异。
图3.与单独治疗相比，VEGF-E和IL-10的联合治疗在更大程度上增强表皮再生。(A)在用不同的病毒因子和哺乳动物因子治疗的有伤口的皮肤中检查表皮的再生。将在第3、6和9天取的皮肤活检物固定于锌盐溶液中，并用石蜡包埋，然后将4μm切片用MSB三色染色并照相。标明比例尺。(B)标记组织学特征的伤口切片的示意图。各切片中表皮再生以被如所标明的新生表皮覆盖的总伤口宽度的百分比计算。(C)使用ImageJ在来自4只小鼠中的每只的2个伤口的6张系列切片中进行伤口表皮再生率的定量，并以均值+/-SE的形式表示。(D)新生表皮的面积(2/切片)以均值+/-SE的形式表示。通过星号标明与未治疗的皮肤的值相比显著较大(P≤0.05)的值。用#标明单独哺乳动物治疗和病毒治疗之间，或者单独治疗和联合治疗之间，或者哺乳动物的联合治疗和病毒的联合治疗之间的显著性差异。
图4.与单独VEGF治疗相比，VEGF-E和IL-10的联合治疗在更大程度上促进表皮消退(resolution)。(A)在用不同的病毒因子和哺乳动物因子治疗的有伤口的皮肤中检查表皮消退。将锌固定、石蜡包埋的皮肤切片(来自第9天取的伤口活检物)用MSB三色染色并照相。比例尺在右下侧的图中标明，并且标记表皮突(RR)的实例。使用ImageJ在来自4只小鼠中的每只的2个伤口的6张系列切片中进行表皮突形成的变化的定量。(B)将从新生表皮突出的表皮突的长度以均值+/-SE的形式表示。分别通过星号或#标明与未治疗的皮肤或模拟治疗的皮肤的值相比显著较大(P<0.05)的值。
图5.病毒VEGF和IL-10的联合治疗通过改变表皮修复的关键调节剂的时机和水平来促进表皮消退。使用定量RT-PCR随时间检测在用不同的病毒因子和哺乳动物因子治疗的有伤口的皮肤中关键表皮调节剂的表达。通过总RNA的反转录制备cDNA(4个左侧伤口的联合治疗组)。对于所有治疗，(A)连接蛋白43、(C)BMP-6、(E)EGF和(G)KGF mRNA在伤口形成后3天的水平在左图中显示。对于联合治疗，(B)连接蛋白43、(D)BMP-6、(F)EGF和(H)KGF mRNA在愈合过程中的水平在右图中显示。所有的mRNA水平是相对于GAPDH和无伤口的皮肤的水平。值以均值±SE(n＝3)的形式表示，并且其与当用来自各治疗组的4个右侧伤口重复所述步骤测定的值一致。
图6.VEGF和IL-10的联合治疗减少炎症细胞向伤口的募集，其程度与单独的IL-10治疗相似。(A)将锌固定、石蜡包埋的皮肤切片(来自第6天取的伤口活检物)进行巨噬细胞标记物F4/80的染色(绿色染色；蓝色为核染色)。代表性图片显示用不同的病毒因子和哺乳动物因子治疗的有伤口的皮肤。比例尺在右下侧的图中标明，并且放大F4/80+ve细胞的实例。(B)对来自4只小鼠中的每只的2个伤口的伤口边缘0.57mm内的炎症细胞的数目定量。值以每1000mm2的F4/80+ve巨噬细胞均值±SE的形式表示。通过星号标明显著低于(P≤0.05)未治疗伤口的值。
图7.病毒VEGF和IL-10的联合治疗通过改变炎症细胞迁移和激活的关键调节剂的时机和水平来减少伤口炎症。使用定量RT-PCR随时间检测在用不同的病毒因子和哺乳动物因子治疗的有伤口的皮肤中关键的炎症调节剂的表达。通过总RNA的反转录制备cDNA(4个左侧伤口的联合治疗组)。显示对于所有治疗，(A)IL-1β、(B)IL-6、(C)CCL2/MCP-1、(D)CXCL2/MIP-2α、(E)IL-10和(F)骨桥蛋白/SPP-1mRNA在伤口形成后3天的水平。所有的mRNA水平是相对于GAPDH和无伤口的皮肤的水平。值以均值±SE(n＝3)的形式表示，并且其与当用来自各治疗组的4个右侧伤口重复所述步骤测定的值一致。
图8.VEGF和IL-10的联合治疗减少肌成纤维细胞分化。向其各自的IL-10中添加VEGF没有减小病毒IL-10或哺乳动物IL-10减少肌成纤维细胞分化的能力。(A)将锌固定、石蜡包埋的皮肤切片(来自第6天取的伤口活检物)进行成纤维细胞标记物波形蛋白(绿色染色)和肌成纤维细胞标记物αSMA(红色染色；蓝色为核染色)的染色。代表性图片显示用不同的病毒因子和哺乳动物因子治疗的有伤口的皮肤。标明比例尺，并且放大染色细胞的实例。(B)对来自4只小鼠中的每只的2个伤口在肉芽组织中红色αSMA染色的强度定量。值以总αSMA强度±SE的形式表示。通过星号标明显著低于(P≤0.05)未治疗伤口的值。
图9.VEGF和IL-10的联合治疗促进血管再生，其程度与单独的VEGF治疗相似。(A)在用不同的病毒因子和哺乳动物因子治疗的有伤口的皮肤中检测新生真皮的血管再生。将锌固定、石蜡包埋的皮肤切片(来自第9天取的伤口活检物)用MSB三色染色并照相。比例尺在右下侧的图中标明，并且标记血管(BV)的实例。(B)对来自4只小鼠中的每只的2个伤口的6张连续切片中皮肤血管形成的程度定量，其通过测定含有血的真皮的分数进行。值以平均面积分数±SE的形式表示。通过星号标明显著高于(P≤0.05)未治疗伤口的面积分数。
图10.VEGF和IL-10的联合治疗加速伤口中的血管成熟，其程度与单独的VEGF治疗相似。(A)锌固定、石蜡包埋的皮肤切片(来自第9天取的伤口活检物)进行内皮细胞标记物vWF和周细胞标记物αSMA(绿色为vWF染色；红色为αSMA染色；蓝色为核染色)的染色。代表性图片显示用不同的病毒因子和哺乳动物因子治疗的有伤口的皮肤。比例尺在右下侧的图中标明，并且放大并标记红细胞(自发荧光橙色/黄色)不成熟的vWF+ve内皮细胞(仅EC)和包含vWF+ve内皮细胞(被αSMA+ve周细胞(EC/周细胞)包围)的成熟的血管的实例。B.对来自4只小鼠中的每只的2个伤口在新生真皮中vWF+ve细胞的总数和与αSMA+ve细胞相关的比例定量。值以每1000μM2vWF+ve细胞均值±SE的形式表示。对于各治疗，在αSMA+ve细胞附近发现的总vWF+ve细胞的平均比例为有阴影的深灰色。通过星号标明显著高于(P≤0.05)未治疗伤口的值。(C)还对来自4只小鼠中的每只的两个伤口的新生真皮中红细胞的总数定量。值以每1000μM2红细胞均值±SE的形式表示。通过星号标明显著低于(P≤0.05)未治疗伤口的值。
图11.病毒VEGF和IL-10的联合治疗通过改变血管形成的关键调节剂的时机和水平来促进血管再生。使用定量RT-PCR随时间检测在用不同的病毒因子和哺乳动物因子治疗的有伤口的皮肤中关键血管调节剂的表达。通过总RNA的反转录制备cDNA(4个左侧伤口联合治疗组)。对于所有治疗，(A)VEGF-A、(B)PDGF-ββ、(C)CXCL4/PF4和(D)蛋白C mRNA在伤口形成后3天的水平在左图中显示。对于联合治疗，(E)VEGF-A、(F)PDGF-ββ、(G)CXCL4/PF4和(H)蛋白C mRNA在愈合过程中的水平在右图中显示。所有的mRNA水平是相对于GAPDH和无伤口的皮肤的水平。值以均值±SE(n＝3)的形式表示，并且其与当用来自各治疗组的4个右侧伤口重复所述步骤测定的值一致。
图12.与单独因子或哺乳动物因子组合相比，病毒VEGF和IL-10的联合治疗在更大程度上加速皮肤伤口闭合，但是与所有其它治疗相比，导致较少的肉芽组织形成。(A)在用不同的病毒因子和哺乳动物因子治疗的有伤口的皮肤中检测皮肤再生。将在第3、6和9天取的皮肤活检物固定于锌盐溶液中，并用石蜡包埋，然后将4μm切片用MSB三色染色并照相。比例尺在右下侧的图中标明。(B)标记组织学特征的伤口切片的示意图。皮肤覆盖以被如所标明的肉芽组织覆盖的创面面积的百分比计算。(C)使用ImageJ在来自4只小鼠中的每只的2个伤口的6张系列切片中进行皮肤覆盖的定量，并以均值+/-SE的形式表示。(D)肉芽组织的面积(2/切片)以均值+/-SE的形式表示。通过星号标明与未治疗的皮肤的值相比显著较大(P≤0.05)的值。用#标明单独哺乳动物治疗和病毒治疗之间，或者单独治疗和联合治疗之间，或者哺乳动物的联合治疗和病毒的联合治疗之间的显著性差异。
图13.与单独治疗和哺乳动物等价物相比，用病毒VEGF和IL-10的联合治疗在更大程度上加速肉芽组织重塑。以每像素蓝色染色的强度计算肉芽组织内的胶原含量(来自第9天取的皮肤活检物MSB三色染色切片)，并将其以均值+/-SE的形式表示。通过星号标明与未治疗的皮肤的值相比显著较大(P≤0.05)的值。用#标明治疗之间的显著性差异，或者说明P值。
图14.病毒VEGF和IL-10的联合治疗通过改变皮肤成熟的关键调节剂的时机和水平来增强肉芽组织重塑。使用定量RT-PCR随时间检测在用不同的病毒因子和哺乳动物因子治疗的有伤口的皮肤中关键的皮肤调节剂的表达。通过总RNA的反转录制备cDNA(4个左侧伤口的联合治疗组)。对于联合治疗，显示愈合过程中(A)αSMA、(B)TGF-β1、(C)TGF-β3、(D)p53、(E)III型胶原和(F)I型胶原mRNA的水平。所有的mRNA水平是相对于GAPDH和无伤口的皮肤的水平。值以均值±SE(n＝3)的形式表示，并且其与当用来自各治疗组的4个右侧伤口重复所述步骤测定的值一致。
图15.与单独治疗或哺乳动物等价物相比，病毒VEGF-E和IL-10的联合治疗在更大程度上增强瘢痕消退。(A)在用不同的病毒因子和哺乳动物因子治疗后，标明的时间点时，愈合的冲击伤口的照片。(B)在1:5的尺度下对外部伤口(第13天)进行目测评分，其中一代表完全消退的伤口，而五表示明显的瘢痕，并且以均值+/-SE(n＝8个伤口每组，由6位观察者评分)的形式呈现。(C)使用ImageJ测量内瘢痕的面积(第16天)，并以均值+/-SE(n＝8)的形式呈现。通过星号标明与模拟治疗的伤口的值相比显著较小(P≤0.05)的值。用#标明特定治疗之间的显著性差异。
发明详述
如简要概述中指出和本文中详细所述，本发明涉及具有再生性质的病毒VEGF和抗炎病毒白细胞介素联合用于加速/改善伤口愈合同时减少瘢痕形成和炎症的用途。在一个实施方案中，所述病毒VEGF为VEGF-E，并且病毒白细胞介素为IL-10。例如，可使用来自羊传染性口疮病毒的VEGF-E和病毒IL-10。多个实施例表明用具有再生性质的病毒VEGF和抗炎病毒白细胞介素的联合治疗的令人惊讶的特质。
在实施例2中，与单独病毒治疗或细胞组合相比，病毒VEGF-E和病毒IL-10的联合治疗在更大程度上减少伤口大小(参见图1)。它也证明与哺乳动物(也称作“细胞”)组合相比，病毒VEGF-E和病毒IL-10的联合治疗在更大程度上增强伤口闭合(参见图2)。如实施例3和5中所示，与单独治疗相比，病毒VEGF-E和病毒IL-10的联合治疗在更大程度上增强表皮再生(参见图3和5)。此外，实施例4和5证明病毒VEGF-E和病毒IL-10的联合治疗防止由单独的VEGF治疗诱导的表皮增生(参见图4和5)。
在实施例6和7中证明病毒VEGF-E和病毒IL-10的联合治疗减少伤口炎症，并且重要地，防止由单独的VEGF治疗诱导的炎症反应(参见图6和7)。实施例8证明病毒VEGF-E和病毒IL-10的联合治疗也减少肌成纤维细胞分化，并会限制伤口收缩(参见图8)。实施例9、10和11显示病毒VEGF-E和病毒IL-10的联合治疗可促进伤口血管再生(参见图9-11)。在实施例12-14中也显示与单独病毒治疗或哺乳动物/细胞组合相比，病毒VEGF-E和病毒IL-10的联合治疗在更大程度上增强皮肤再生和肉芽组织重塑(参见图12-14)。
实施例15证明与单独病毒治疗或哺乳动物/细胞组合相比，病毒VEGF-E和病毒IL-10的联合治疗在更大程度上于视觉上改善瘢痕消退，并且减少瘢痕大小(参见图15)。
总之，如实施例2和12-15以及相关的图1和12-15中所示，与单独病毒治疗或哺乳动物/细胞组合相比，将具有再生性质的病毒VEGF和抗炎病毒白细胞介素(如VEGF-E和病毒IL-10)进行组合在更大程度上增强伤口闭合和皮肤的再生/重塑，并且限制瘢痕形成。此外，如实施例3-5和图3-5中所示，与单独治疗相比，用具有再生性质的VEGF和来自病毒来源的抗炎白细胞介素的组合的治疗增强表皮的再生和消退。重要地，将病毒来源的VEGF和抗炎白细胞介素进行组合不损害白细胞介素(例如vIL-10)减少炎症和肌成纤维细胞分化以及防止VEGF治疗的炎症副作用的能力。这在实施例6-8(参见相关的图6-8)中证明。本发明另一个重要的方面是将病毒VEGF和病毒白细胞介素(如VEGF-E和vIL-10)进行组合不损害VEGF增强伤口血管再生的能力(参见实施例9-11和图9-11)。
定义
如本文中所使用，“病症”是伤口受益于药剂的任何病症、疾病或病况，所述药剂启动、加速、促进或增强伤口愈合(包括急性伤口、开裂伤口以及缓慢愈合、延期愈合和慢性伤口)、减少炎症、减少或减小瘢痕形成、改善瘢痕品质、减少纤维化和/或减少粘连。例如疾病、病症和病况包括急性伤口。疾病、病症和病况也包括开裂伤口以及缓慢愈合、延期愈合和慢性伤口。也包括特征在于纤维性物质的过量产生(包括细胞外基质中的纤维性物质的过量产生)的疾病、病症和病况。也包括特征在于正常组织组件被异常的、无功能的和/或过量蓄积的基质相关组分替代的疾病、病症和病况。也包括特征在于粘连形成的疾病、病症和病况。也包括伤口受益于药剂的任何疾病、病症和病况，所述药剂促进伤口愈合和/或减少肿胀、炎症和/或瘢痕形成(包括异常的和过量的瘢痕形成，其包括瘢痕疙瘩、肥厚性瘢痕、广泛的(拉伸的)瘢痕和萎缩的(凹陷的)瘢痕)。例如，包括外科手术或创伤造成的伤口、未按期望速率愈合的伤口(如延期愈合伤口、不完全愈合伤口、慢性伤口和开裂伤口)以及与神经病、缺血、微血管病理、骨面(bony area)(尾骨(骶骨)、髋(转子)、臀(坐骨)或脚后跟)上的压力、再灌注损伤和瓣膜反流的病因和病况相关的异常有关的伤口。也包括受益于如本文中描述的增强的细胞迁移、减少的细胞粘连、瘢痕形成和炎症的疾病、病症和病况。
如本文中所使用，“个体”指任何哺乳动物，包括人、家畜以及动物园的动物、运动类动物和宠物动物，如狗、马、猫、绵羊、猪、奶牛等。本文中优选的哺乳动物为人，包括成年人、儿童和老年人。个体也可为鸟，包括动物园的鸟、运动类鸟和宠物鸟。优选的运动类动物为马和狗。优选的宠物动物为狗和猫。
如本文中所使用，“防止”意指全部或部分防止，或者改善或控制，或者减少或停止要防止的事物或事件(例如疾病、病症或病况)的产生或发生。
如本文中所使用，指代本发明的化合物或组合物的“治疗有效量”或“有效量”指足以诱导期望的生物学的、药学的或治疗的结果的量。所述结果可为体征、症状，或者疾病或病症或病况的起因的减轻，或者任何其它期望的生物系统的改变。在本发明中，所述结果会包含防止纤维化。在本发明的另一方面中，所述结果会包含防止和/或减少粘连。在本发明的另一方面中，所述结果会包含防止和/或减少瘢痕形成和异常的瘢痕形成，以及防止和/或减少过量的瘢痕形成以及其它类型的组织的异常增殖(包括瘢痕疙瘩、肥厚性瘢痕、广泛性瘢痕和萎缩性瘢痕)。在本发明的另一方面中，所述结果会包含防止和/或减少任意组织或器官中的炎症。
根据另一方面，所述结果会包含伤口愈合和伤口的闭合的促进和/或改善(整体或部分)，包括愈合速率的改善。其它益处包括肿胀、炎症和/或瘢痕形成的减少(整体或部分)。
如本文中所使用，术语“治疗”(“treating”和“treatment”)指治疗性处理和预防或防止措施。需要治疗的个体包括已经患有疾病、病症或病况的那些，以及易于患有疾病、病症或病况，或者诊断患有疾病、病症或病况的那些，或者其中要防止的疾病、病症或病况的那些。因此以下均在本发明的范围内：例如伤口愈合的促进、炎症的减少、细胞迁移的促进、细胞粘连的减少、在纤维化或纤维化组织形成之前给药本发明的化合物和组合物和制剂的抗纤维化的应用，还包括在粘连形成之前给药本发明的化合物和组合物和制剂的抗粘连应用，以及在瘢痕形成(包括例如在减少瘢痕的外科手术或操作(或外科预处理))之前给药本发明的化合物和组合物和制剂的抗瘢痕形成应用。
如本文中所使用，“病毒VEGF”包括病毒来源的血管内皮生长因子，并且包括具有再生性质的病毒VEGF，以及模仿病毒来源的血管内皮生长因子(例如VEGF-E)的再生性质的天然存在的或非天然存在的分子。例如包括促进血管发生的病毒VEGF，还包括促进表皮再生的病毒VEGF。在一个实施方案中，所述病毒VEGF可为VEGF-E。在另一实施方案中，所述病毒VEGF为羊传染性口疮病毒VEGF。其它病毒血管内皮生长因子的实例包括副痘病毒VEGF，以及来自编码VEGF-E的所有羊传染性口疮病毒株的VEGF(例如NZ2、NZ10、NZ7、D1701等)。副痘病毒VEGF包括来自副痘病毒株BPSV、PVNZ和PCPV，以及所有其它编码VEGF-E的毒株的VEGF。包括来自其它病毒种的VEGF。在其它实施方案中，所述病毒VEGF可为任何分子，不论天然存在的或非天然存在的(包括指定的或发现的(例如通过随机或定向诱变)天然存在的分子的衍生物或变体)，与VEGFR-1相比，所述分子更多地激活VEGFR-2。在其它实施方案中，所述病毒VEGF可为任意分子，不论是天然存在的或非天然存在的(包括指定的或发现的(例如通过随机或定向诱变)天然存在的分子的衍生物或变体)，所述分子激活VEGFR-2，但不明显结合或激活VEGFR-1。
如本文中所使用，“抗炎细胞因子”是病毒或哺乳动物来源的细胞因子，所述细胞因子可用于控制或改善炎症。
如本文中所使用，“病毒抗炎细胞因子”是病毒来源的细胞因子，其可用于控制或改善炎症。类似地，“哺乳动物抗炎细胞因子”是哺乳动物来源的细胞因子，其可用于控制或改善炎症。
如本文中所使用，“哺乳动物抗炎白细胞介素”是哺乳动物来源的白细胞介素，其可用于控制或改善炎症。
如本文中所使用，在例如抗炎细胞因子或抗炎白细胞介素的上下文中的术语“哺乳动物”和”细胞”意图意指相同的事物，即(例如)细胞或哺乳动物来源的细胞因子或白细胞介素。
如本文中所使用，“抗炎病毒白细胞介素”是病毒来源的白细胞介素，其可用于控制或改善炎症。抗炎病毒白细胞介素包括病毒来源的IL-10。例如抗炎病毒白细胞介素包括来自羊传染性口疮病毒的IL-10。其它病毒白细胞介素种类的实例包括来自羊传染性口疮病毒、EBV、CMV的病毒白细胞介素，包括来自这些和其它病毒的IL-10。病毒白细胞介素包括痘病毒IL-17同系物、EBV CXCR同系物和KSHV IL-6同系物以及IL-8R同系物。这些及所有其它具有抗炎活性的病毒白细胞介素在本发明的范围内。痘病毒也有抗炎趋化因子模拟物、白细胞介素/TNF/趋化因子结合蛋白和其它IL-119/20/22样蛋白。所有这样的具有抗炎活性的蛋白均在本发明的范围内。
术语“肽模拟物”和”模拟物”包括天然存在的和合成的化合物，其可具有与它们模拟的蛋白区域基本上相同的结构和功能特性。在连接蛋白的情况中，它们可模拟例如连接蛋白的细胞外区域的连接蛋白-重复域的细胞外环，其参与连接蛋白重复结合、黏着连接形成和维持，以及细胞-细胞粘连)。
“肽类似物”指具有类似于模板肽的性质的化合物，并且其可为非肽药物。包括肽系化合物的“肽模拟物”(也被称作“模拟肽”)还包括这样的非肽系化合物，如肽类似物。与治疗上有用的肽的结构相似的肽模拟物可用于产生相当的或增强的治疗或预防效果。一般地，肽模拟物与范例多肽(即具有生物学或药理学功能或活性的多肽)结构相同或相似，但是还可具有任选地被选自下列的连接替代的一种或多种肽连接：例如-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-。所述模拟物可完全包含天然氨基酸，或氨基酸的非天然类似物，或者其为部分天然肽氨基酸和部分氨基酸的非天然类似物的嵌合分子。所述模拟物也可包含任意量的天然氨基酸保守置换，只要这样的置换也基本上不改变模拟的活性。例如，在一个实施方案中，模拟组合物可用作抗连接蛋白剂，如果其能够下调连接蛋白、连接蛋白复合物或黏着连接的生物作用或活性，例如，防止相邻细胞上相对的连接蛋白细胞外结构域的连接蛋白重复(repeats)的头对头连接、相同细胞中连接蛋白的连接、细胞中连接蛋白复合物的形成、连接蛋白复合物与肌动蛋白细胞骨架的连接和/或黏着连接的形成。
如本文中所使用的其多种形式，术语活性的“调节剂”和“调节”指整体或部分抑制化合物的表达或作用或活性，例如连接蛋白、连接蛋白复合物或黏着连接，并且可作为抗连接蛋白剂起作用。
一般地，术语“蛋白”指通过肽键连接的两个或更多个单个氨基酸(不论是否是天然存在的)的任意多聚物，所述肽键在当键合至一个氨基酸(或氨基酸残基)的α碳的羧酸基团的羧基碳原子共价结合至键合至邻近的氨基酸的α碳的氨基的氨基氮原子时产生。这些肽键连接和包含它们的原子(即α碳原子、羧基碳原子和它们的取代基氧原子)以及氨基氮原子(和它们的取代基氢原子))形成蛋白的“多肽主链”。此外，如本文中所使用，术语“蛋白”应理解为包括术语“多肽”和“肽”(其在本文中有时可互换地使用)。类似地，蛋白片段、类似物、衍生物和变体在本文中可被称作“蛋白”，并且除非另外说明，应认为是“蛋白”。术语蛋白的“片段”指包含少于蛋白的所有氨基酸残基的多肽。蛋白的“结构域”也是片段，并且包含经常对于赋予活性或功能所必须的蛋白的氨基酸残基。
如本文中所使用，“同时”用于意指本发明的一种或多种药剂(例如血管内皮生长因子和抗炎细胞因子)并行地给药，然而术语“组合/联合(in combination)”用于意指如果不是同时或以物理组合的形式给药，则它们在一时间窗内“顺序地”给药，使得它们均可起治疗作用。因此，“顺序地”给药可许可一种药剂在另一个之后数分钟(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、30分钟)内或数小时、天、周或月内给药，条件是二者均以有效量的形式存在。组分给药之间的时间延迟会根据所述组分的确切性质、它们之间的相互作用和它们各自的半衰期而变化。
术语“敷料”指局部施用于伤口(或组织或器官)的敷料，并且不包含适合于全身给药的组合物。例如，一种或多种病毒VEGF和/或抗炎病毒白细胞介素可分散于接触伤口的材料(如针织物或非针织物纺织材料)的薄片之中或之上，或可分散于泡沫层(如聚氨基甲酸酯泡沫)中，或于水凝胶如聚氨基甲酸酯水凝胶、聚丙烯酸酯水凝胶、明胶、羧甲基纤维素、果胶、藻酸盐和/或透明质酸水凝胶中，例如于凝胶剂或软膏剂中。在特定的实施方案中，所述一种或多种病毒VEGF和/或抗炎病毒白细胞介素分散于可生物降解的薄片材料之中或之上，其提供活性成分向伤口中的持续释放，所述薄片材料例如下列物质的薄片：冷冻干燥的胶原、冷冻干燥的胶原/藻酸盐混合物(可得自Johnson&Johnson Medical Limited，注册商标为FIBRACOL)或冷冻干燥的胶原/氧化的再生纤维素(可得自Johnson&Johnson MedicalLimited，注册商标为PROMOGRAN)。
如本文中所使用，“基质”包括例如基质(如胶原)、无细胞基质、交叉连接的生物支架分子、基于组织的基质(包括基于猪的伤口愈合基质)、培养的表皮自体移植物、培养的表皮的同种异体移植物、组织工程皮肤、移植有自体的成纤维细胞和角质形成细胞的胶原和糖胺聚糖皮肤基质、(带有完整的基底膜复合物的无生命的同种异体无细胞皮肤基质)、活的皮肤等价物(例如(生长于可降解支架上的活的同种异体的皮肤成纤维细胞)、(由同种异体的人皮肤成纤维细胞产生的细胞外基质)、(活的同种异体的双层构建体，其包含角质形成细胞、成纤维细胞和牛的I型胶原)、(用于皮肤替代的两层膜系统，其包含由多孔的牛肌腱胶原和糖胺聚糖(软骨素-6-硫酸盐)纤维模板制成的真皮替代层，以及用于控制水分损失的由薄硅酮制成的表皮替代层)、CyzactTM(通过纤维蛋白递送的人皮肤成纤维细胞)、ICX-SKN(成纤维细胞和纤维蛋白基质的组合，将其改造用于制备胶原基质)、KeragraftTM(源自人干细胞的产品，研发其作为自体表皮等价物用于伤口护理)、伤口基质(生物衍生的基于细胞外基质的伤口产品，其由源自猪的无细胞小肠粘膜下层生产)和OrCelTM(接种于牛胶原的双层基质的相对面的同种异体的成纤维细胞和角质形成细胞)、BioBrane、培养的同种异体角质形成细胞、动物来源的敷料(例如Oasis的猪小肠粘膜下层无细胞的胶原基质；和E-Z Derm的无细胞的异种基因胶原基质)、基于组织的生物工程的结构框架、支架、生物制造的生物假体和其它植入的或施用的结构，例如适合于细胞浸润和增殖的血管移植物，其可用于促进伤口愈合。基质也由称作HP802-247(由HealthPoint研发)的细胞治疗喷雾悬浮液提供，HP802-247由两种组分组成，在治疗时将其顺序地喷射在创面上：纤维蛋白原溶液以及包含生长停滞的、活的、同种异体的表皮角质形成细胞和皮肤成纤维细胞的混合物的细胞制备物。
其它适合的生物基质材料可包括化学修饰的胶原组织，以减少抗原性和免疫原性。其它适合的实例包括用于伤口敷料的胶原薄片、无抗原或减少抗原的无细胞基质(Wilson等人，Trans Am Soc Artif Intern 1990；36:340-343)，或其它生物基质，其被工程改造以减少对异种移植物材料的抗原反应。其它用于促进伤口愈合的基质可包括例如，处理过的牛心包蛋白，其包含不溶的胶原和弹性蛋白(Courtman等人,J Biomed Mater Res1994；28:655-666)以及其它无细胞组织，所述组织可用于为宿主细胞迁移提供自然的微环境，以加速组织再生(Malone等人，J Vasc Surg 1984；1:181-91)。在特定的实施方案中，所述基质材料可补充有一种或多种抗连接蛋白剂、抗骨桥蛋白剂、抗连接蛋白43剂和/或用于这样的药剂和/或病毒VEGF和/或抗炎病毒白细胞介素的部位特异性释放的一种或多种治疗剂。
伤口和伤口分类
慢性伤口、缓慢愈合伤口和不完全愈合伤口经常造成感染并可导致截肢或死亡。已发现使用特定化合物(包括本文中所述或所引用的那些)可阻滞、抑制或改变细胞通讯，其可促进慢性伤口、缓慢愈合伤口和不完全愈合伤口的闭合和愈合。
“伤口”意指任何组织的损伤，包括例如急性、延期、缓慢或愈合困难的伤口和慢性伤口。伤口的实例可包括开放的伤口和闭合的伤口二者。伤口包括例如烧伤、切口、切除、撕裂伤、擦伤、冲击或穿透的伤口、外科手术伤口、挫伤、血肿、压伤和溃疡。还包括未按期望速率愈合的伤口。
“未按期望速率愈合的伤口”意指任何组织的损伤，所述损伤未在预期的或通常的时间窗愈合，包括延期、缓慢或愈合困难的伤口(包括延期愈合伤口或不完全愈合伤口)和慢性伤口。未按期望速率愈合的伤口的实例包括糖尿病性溃疡、糖尿病性足溃疡、血管炎溃疡、动脉溃疡、静脉性溃疡、静脉瘀滞溃疡、压力性溃疡、褥疮溃疡、感染性溃疡、创伤-诱导的溃疡、烧伤溃疡、与坏疽性脓皮病相关的溃疡形成，以及混合溃疡。
如本文中所述，延期或愈合困难的伤口可包括例如至少部分地特征在于下列中的一种或多种的伤口：1)延长的炎症期，2)缓慢形成的细胞外基质，和3)上皮形成速率的停滞或降低。
本领域中，术语“慢性伤口”一般指约3个月内未愈合的伤口，但是可以是在约1个或2个月内未愈合的伤口。慢性皮肤伤口包括例如压力性溃疡、糖尿病性溃疡、静脉性溃疡、动脉溃疡、炎症性溃疡以及混合溃疡。所述慢性伤口可为动脉溃疡，其可包括由完全或部分的动脉阻塞引起的溃疡形成。所述慢性伤口可为静脉停滞溃疡，其可包括由静脉瓣功能失常和相关的血管疾病引起的溃疡形成。所述慢性伤口可为创伤-诱导的溃疡。
如本文中所使用，慢性伤口也可包括例如至少部分地特征在于以下所述的伤口：1)伤口炎症的慢性自身延续状态，2)伤口细胞外基质(ECM)的不足和缺陷，3)响应较差(衰老)的伤口细胞(例如成纤维细胞)，有限的ECM产生，和4)部分地由于必需的ECM编配(orchestration)的缺乏和用于迁移的支架的缺乏，表皮再生失败。
慢性伤口还可以特征在于例如1)延长的炎症和蛋白水解活性，导致溃疡病损，其包括例如糖尿病性、压力性(褥疮)、静脉性和动脉性溃疡，2)伤口中延长的纤维化导致瘢痕形成，3)在受累区域进行性的基质沉积，4)较长的修复时间，5)较少的伤口收缩，6)较慢的表皮再生，和7)增加的肉芽组织厚度。
示例性的慢性伤口还包括“压力性溃疡”。示例性的压力性溃疡可包括基于AHCPR(Agency for Health Care Policy and Research,U.S.Department of Health andHuman Services)指南的伤口分类的所有4期，包括例如，1期.1期压力性溃疡为可觉察到的压力相关的未受损的皮肤改变，与邻近的或身体对侧的区域相比，其指标可包括以下中的一个或多个的变化：皮肤温度(发热或发凉)、组织硬度(坚硬或沼泽样感觉(boggy feel))和/或感觉(疼痛、瘙痒)。所述溃疡以下列形式出现：在浅色皮肤中持久发红的轮廓分明的区域，然而在较深肤色中，溃疡可在持久的红色、蓝色或紫色色调下出现。1期溃疡可包括未受损的皮肤的不发白(nonblanchable)的红斑和预示皮肤溃疡的病损。在具有较深皮肤的个体，皮肤变色、发热、水肿、硬结或硬度也可为1期溃疡的指标。2期溃疡可特征在于涉及表皮、真皮或二者的断层皮肤丢失。所述溃疡为浅表的，且临床表现为擦伤、水疱或浅坑。3期溃疡可特征在于涉及皮下组织的损伤或坏死(可向下延伸到但是不穿透下面的筋膜)的全层皮肤丢失。所述溃疡临床表现为伴或不伴有邻近组织的皮下剥离的深坑。4期溃疡可特征在于具有广泛的破坏、组织坏死，或者肌肉、骨或支撑结构(例如腱、关节囊等)的损伤的全层皮肤丢失。
示例性的慢性伤口还包括“褥疮溃疡”。示例性的褥疮溃疡可作为导致缺血的骨突上延长的和不缓解的压力的结果出现。所述伤口常常发生在不能自己更换体位以卸载重量的患者，如瘫痪的、无意识的或严重虚弱的人。如U.S.Department of Health and HumanServices所定义，主要的防止措施包括鉴别高危患者；频繁的评估；和预防措施，如定期地更换体位、适当的减压垫、防潮层和充足的营养状况。治疗选择可包括例如减压、外科手术和酶促清创、潮湿伤口护理以及细菌负荷控制。本发明特定的实施方案包括治疗特征在于褥疮溃疡或由导致缺血的骨突上延长的、不缓解的压力导致的溃疡形成的慢性伤口。
示例性的慢性伤口还包括“动脉溃疡”。动脉溃疡包括特征在于完全或部分动脉阻滞的那些，所述动脉阻滞可导致组织坏死和/或溃疡形成。动脉溃疡的体征可包括例如肢体无脉；疼痛性溃疡形成；小、点状溃疡(其通常十分局限)；发凉或发冷的皮肤；延期的毛细血管返回时间(短暂地按住脚趾末端并松开，脚趾的正常颜色应在约3秒或更短内恢复)；萎缩样皮肤(例如有光泽、薄、干燥)；和手指和脚的毛发丢失。
示例性的慢性伤口还包括“静脉性溃疡”。示例性的静脉性溃疡包括最常见的影响下肢的溃疡类型，并可特征在于静脉瓣的功能失常。正常的静脉具有防止血液返流的瓣膜。当这些瓣膜变得功能不全时，静脉血返流导致静脉充血。来自红细胞的血红蛋白逸出并漏到血管外空间，导致通常注意到的褐色变色。已显示静脉性溃疡周围皮肤的经皮氧分压降低，这表明有妨碍该区域的正常血管供应的力。淋巴引流和流动也在这些溃疡中发挥作用。静脉性溃疡可在内踝附近出现，并且通常与水肿的和有硬结的下肢一起发生；其可为浅的，不太疼痛，并可存在从受累部位排出的漏液。
示例性的慢性伤口还包括“静脉瘀滞溃疡”。示例性的静脉淤滞溃疡特征在于下肢慢性被动的静脉充血(其导致局部缺氧)。这些伤口的一个可能的发病机制包括妨碍氧气穿过厚的血管周的纤维蛋白套囊扩散入组织。另一个机制为漏入血管周组织的大分子捕捉对于维持皮肤完整性所需的生长因子。此外，大白细胞的流动由于静脉充血而减慢，封闭毛细血管、被激活并损坏血管内皮以诱发溃疡形成。
示例性的慢性伤口还包括“糖尿病性足溃疡”。患有示例性的糖尿病性足溃疡的糖尿病患者由于神经和血管的并发症二者而易于形成足溃疡。周围性神经病可导致足和/或腿感觉改变或完全丢失。具有晚期神经病的糖尿病患者失去所有分辨锐-钝(sharp-dull)的能力。在患有神经病的患者中，足部任何切口或创伤可在数天或数周完全不被注意。患有晚期神经病的患者可失去感受持续压力伤害的能力，因此，可发生组织缺血和坏死，导致例如跖溃疡形成。此外，在足部的骨骼的微小骨折，如果未被注意且未被治疗，可导致损形、慢性肿胀和额外的骨突。微血管疾病是糖尿病显著的并发症之一，其也可导致溃疡形成。
示例性的慢性伤口可包括“创伤性溃疡”。示例性的创伤性溃疡的形成可由于对身体的创伤性损伤而发生。这些损伤包括例如对动脉、静脉或淋巴系统的损伤；骨骼的骨结构的变化；组织层-表皮、真皮、皮下软组织、肌肉或骨骼-丢失；身体部位或器官的损伤和身体部位或器官的失去。
示例性的慢性伤口可包括“烧伤溃疡”，其包括例如由于烧伤发生的溃疡，所述烧伤包括1度烧伤(即皮肤浅表的、变红的区域)；2度烧伤(起泡的损伤部位可在水疱液移除后自发地愈合)；3度烧伤(穿过整个皮肤的烧伤，并且通常需要外科手术干预用于伤口愈合)；烫伤(可由于滚烫的水、油脂或散热液而发生)；热烧伤(可由于火焰而发生，通常是深度烧伤)；化学烧伤(可来自酸和碱，通常是深度烧伤)；电烧伤(无论是家中的低电压还是工作中的高电压)；爆炸焰(通常是浅表的损伤)；以及接触烧伤(通常是深度的，且可由于消声器排气管、热熨斗和火炉而发生)。
如本文中所使用，延期或愈合困难的伤口可包括例如至少部分地特征在于以下的伤口：1)延长的炎症期，2)缓慢形成的细胞外基质(ECM)，和3)上皮形成速率降低。
如本文中所使用，“纤维化”疾病、病症或病况包括本文中提到的那些，并且还包括急性和慢性、临床或亚临床表现，其中纤维发生相关的生物学或病理学是明显的。纤维化疾病、病症或病况包括整体或部分特征在于纤维性物质过量产生(包括细胞外基质中纤维化物质的过量产生，或正常组织组件被异常的、无功能的所替代和/或过量的基质-相关组分的蓄积)的疾病、病症或病况。纤维化疾病、病症或病况包括例如特征在于纤维化的纤维发生相关的生物学或病理学。
示例性的纤维化疾病、病症和病况包括例如硬皮病(包括硬斑病、泛发性硬斑病或线状硬皮病)、肾纤维化(包括肾小球硬化、肾小管间质性纤维化、进行性的肾脏疾病或糖尿病肾病)、心脏纤维化(例如心肌纤维化)、肺纤维化(例如肾小球硬化症、肺纤维化、特发性肺纤维化、硅肺病、石棉肺、间质性肺疾病、间质性纤维化肺疾病和化学治疗/放射诱导的肺纤维化)、口纤维化、心内膜心肌纤维化、三角肌纤维化、胰腺炎、炎症性肠病、克罗恩氏病、结节性筋膜炎、嗜酸细胞性筋膜炎、特征在于正常的肌肉组织被纤维性组织在不同程度替代的广泛纤维化综合征、腹膜后纤维化、肝纤维化、肝硬化、慢性肾脏功能衰竭、骨髓纤维化、药物引起的麦角中毒、Li-Fraumeni综合征中的胶质母细胞瘤、散发性胶质母细胞瘤、骨髓性白血病、急性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生(myeloproferative)综合征、妇科癌症、卡波西肉瘤、Hansen’s疾病、胶原性结肠炎和急性纤维化。
纤维化疾病、病症和病况也可包括挛缩。挛缩包括手术后挛缩，其指永久的或长期的运动范围减少，所述运动范围减少是由于强直性痉挛或纤维化，或正常组织(例如肌肉、腱、韧带、筋膜、滑膜、关节囊、其它结缔组织或脂肪)顺应性、运动或平衡的丢失。一般地，挛缩的病况可涉及对炎症组分的纤维化响应(急性和慢性)。其中一些可能与外科手术有关，包括松解手术(release procedure)。还包括遗传性挛缩，如Dupytren’s挛缩、Peyronie’s疾病和Ledderhose’s疾病。
纤维化可为慢性或急性的。纤维化病况包括过量的纤维组织，包括组织内细胞外基质过量蓄积，形成引起功能障碍，并有可能器官衰竭的组织。慢性纤维化包括主要器官(最常见的为肺、肝、肾和/或心脏)的纤维化。急性纤维化(通常伴有突然的和严重的发病和短的持续时间)通常作为多种形式的创伤的共同响应发生，所述创伤包括损伤、缺血性疾病(例如心脏病发作后的心脏瘢痕形成)、环境污染物、酒精和其它类型的毒素、急性呼吸窘迫综合征、放射和化学治疗。所有由创伤损害的组织可纤维化，特别是当重复所述损害时。
对损伤的响应包括损伤之后组织中协调的和暂时调节模式的调节剂以及细胞活动的序列。开始的损伤触发凝血级联和急性局部炎症反应，随后为间充质细胞募集、增殖和基质的合成。不受控制的基质蓄积(经常涉及异常的细胞因子通路)可导致纤维化病况或病症。重要器官(如肺、肾、肝、心脏、脑和骨髓)中的进行性纤维化是疾病和死亡的主要原因。
粘连
在本发明的其它方面中，提供用于治疗、减少发病率或严重性和/或防止或延缓粘连、外科手术粘连和/或继发性外科手术粘连的方法，其通过向患者给药病毒VEGF和抗炎病毒白细胞介素。
粘连形成是其中正常为分离的身体组织长到一起的复杂过程。例如，据报道手术后粘连在约60％到90％的经历大型妇科手术的患者中发生。由于组织(例如上皮、结缔、肌肉和神经组织)干燥、缺血、热伤、感染、或异物的存在的外科手术创伤长期以来被认为是组织粘连形成的刺激物。这些粘连是外科手术治疗失败的主要原因，并且是肠梗阻和不育的主要原因。其它粘连治疗并发症包括慢性骨盆疼痛、尿道梗阻和排泄功能障碍。
一般地，粘连形成为其中释放因子，增加血管渗透性和导致纤维蛋白原流入和纤维蛋白沉积的炎症反应。该沉积形成桥接相邻组织的基质。成纤维细胞的蓄积粘住基质，使胶原沉积，并诱导血管发生。如果该事件级联可在外科手术后4到5天内防止，可抑制粘连形成。
继发性外科手术粘连也可由于设计用于矫正已有的粘连的矫正外科手术而发生。所述手术可为释放或分离手术。
多种动物模型可用于评估特定的治疗组合物或治疗方案的治疗潜能。简要地，已在施以严重损伤(通常涉及两个邻近的表面)的动物中观察到发生腹膜粘连。损伤可为机械的、由于缺血或由于异物的引入。机械损伤包括肠挤压以及剥离或擦掉肠壁的外层。肠袢的主要血管的分离诱导缺血。可引入所述区域的异物包括滑石、纱布海绵、有毒化学物质、细菌和粪便。
目前，用于评价防止粘连形成的典型的动物模型包括兔子宫角模型(其涉及兔子宫擦伤)、兔子宫角血行阻断修正模型(其涉及擦伤)、子宫血行阻断以及兔盲肠侧壁模型(其涉及一片壁腹膜的切除，加上盲肠的擦伤)。在本文中描述这些和其它报道的评价模型。
抗连接蛋白剂
本文中描述的本发明的抗连接蛋白剂能够调节(例如阻滞或抑制或下调)或者影响连接蛋白活性和功能，连接蛋白复合物形成和维持，黏着连接形成和维持，以及细胞-细胞粘连。因此，本文中描述的特定的抗连接蛋白剂调节细胞的粘连(即细胞与细胞的粘连)。特定的抗连接蛋白剂为黏着连接调节剂。这样的抗连接蛋白剂一般地针对信使RNA(mRNA)分子(或编码其的基因)，当所述mRNA被翻译，其可引起连接蛋白合成并定位于细胞膜，在这里其可用于黏着连接的形成。其它抗连接蛋白剂干扰连接蛋白复合物和/或黏着连接形成。因此，本文中提供的抗连接蛋白剂可直接地或间接地减少细胞之间的耦合和通讯，或减少或阻滞邻接的细胞之间的通讯(或分子的传递)。所述连接蛋白为例如N-连接蛋白。
任何能够诱发期望的连接蛋白活性、连接蛋白复合物形成和/或黏着连接形成的调节作用的抗连接蛋白剂可用于实施本发明。这样的化合物包括例如蛋白和多肽、多核苷酸和其它有机化合物，并且它们可例如整体或部分地阻滞黏着连接的功能或表达，或者整体或部分地下调一种或多种连接蛋白、连接蛋白复合物和/或黏着连接的产生。这样的药剂已在科学和专利文献中描述。
特定的抗连接蛋白剂提供连接蛋白表达的下调(例如通过mRNA转录或翻译的下调)，或者另外减少或抑制连接蛋白、连接蛋白复合物或黏着连接的活性。在下调的情况下，这会具有减少由黏着连接介导的直接细胞-细胞粘连的效应。
抗连接蛋白剂的实例包括减少或抑制连接蛋白mRNA和/或蛋白的表达或功能，或者减少连接蛋白种类、连接蛋白复合物或黏着连接的活性、表达或形成的药剂。抗连接蛋白剂包括抗连接蛋白多核苷酸(如反义多核苷酸和其它多核苷酸(如miRNA和具有siRNA或核酶功能的多核苷酸))，及其抗体和抗原结合片段，以及肽和多肽(包括调节连接蛋白或黏着连接的活性或功能的肽模拟物和肽类似物)和脱氧核酶。抗连接蛋白剂为例如抗N-连接蛋白剂。
反义多核苷酸和其它多核苷酸(其可用作抗连接蛋白多核苷酸，如miRNA、RNAi、siRNA和核酶多核苷酸以及具有修饰和混合的主链的多核苷酸)的合成是本领域技术人员已知的。参见例如Stein C.A.和Krieg A.M.(eds),Applied Antisense OligonucleotideTechnology,1998(Wiley-Liss)。合成期望的抗体和抗原结合片段以及期望的肽和多肽(包括肽模拟物和肽类似物)的方法是本领域技术人员已知的。参见例如Lihu Yang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1；95(18):10836-10841(1998年9月1日)；Harlow和Lane(1988)“Antibodies:A Laboratory Manuel”Cold Spring Harbor Publications,NewYork；Harlow and Lane(1999)“Using Antibodies”A Laboratory Manuel,Cold SpringHarbor Publications,New York。
连接蛋白结合蛋白(包括肽、肽模拟物、抗体、抗原结合抗体片段等)也是适合的黏着连接的调节剂。这样的药剂已在科学的和专利文献中描述。
抗连接蛋白剂包括含有氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列与来自连接蛋白(例如E-连接蛋白、N-连接蛋白等)的连接蛋白结构域基序相对应。其它的实施方案针对抗连接蛋白剂，其为具有氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列包含至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约20、至少约25或至少约30个由连接蛋白基因编码的连续氨基酸，例如，在下文的实施例1描述的N-连接蛋白基因。在本文中提供的特定抗连接蛋白剂中，N-连接蛋白细胞外结构域可用于产生特定的肽序列。所述肽不需要与那些天然存在的N-连接蛋白的部分具有相同的氨基酸序列，并且可进行使得所述肽保留结合活性或功能活性的保守的氨基酸变化。或者，肽可靶向细胞外结构域的其它区域。
本文中描述的特定的抗连接蛋白剂能够调节或影响(例如阻滞或抑制)细胞之间的粘连。因此，本文中描述的特定的黏着连接调节剂调节细胞粘连。如本文中所使用，“黏着连接调节剂”广泛地包括整体或部分地防止、减少或调节黏着连接的活性、功能、形成或稳定性的任意药剂或化合物。在特定的实施方案中，黏着连接调节剂整体或部分地防止或减少黏着连接的功能。示例性的黏着连接调节剂可包括但不限于多核苷酸、多肽(例如肽模拟物、抗体、其结合片段以及合成构建体)以及其它黏着连接调节剂。
剂型和制剂以及给药
可将治疗有效量的本发明的各药剂同时、分开或顺序地以及以任意顺序给药。可将所述药剂分开给药，或作为固定的组合给药。当不以固定的组合给药时，方法包括病毒VEGF和抗炎病毒白细胞介素的顺序给药。
在将病毒VEGF和抗炎病毒白细胞介素联合给药是，其中之一或二者可以比当将一种或多种药剂单独给药时(即当未将它们联合给药时)(无论是完全地还是在伤口的治疗过程中)少的量或剂量提供。这样所给药的药剂的较少的量通常为当单独给药时药剂的量的约二十分之一到约十分之一，并且可为当单独给药时的量的约八分之一的量、约六分之一的量、约五分之一的量、约四分之一的量、约三分之一的量和约二分之一的量。在特定的实施方案中，所述药剂在彼此至少约半小时内顺序地给药。所述药剂也可在彼此约1小时、彼此约1天到约1周或者以其它认为合适的时间给药。
可将本发明的药剂向需要治疗的个体给药，如患有本文中提到的任何疾病或病况的个体。所述个体的病况可由此改善。病毒VEGF和抗炎病毒白细胞介素由此可通过疗法用于个体身体的治疗。它们可用于制备治疗本文中提到的任何病况的药物。
本发明的病毒VEGF和抗炎病毒白细胞介素经常以基本上分离的形式在本发明的多种组合物和方法中使用。应理解，所述产物可与载体或稀释剂混合，所述载体或稀释剂不会干扰产物的预期目的，并仍认为是基本上分离的。本发明的产物也可为基本上纯化的形式，在所述情况下其一般会包含约例如至少约80％、85％或90％，例如至少约95％、至少约98％或至少约99％的蛋白或制剂的干重。
根据意图的给药途径，本发明的药物产品、药物组合物、组合制剂和药物可例如为溶液剂、混悬剂、滴注剂、软膏剂(salve)、乳膏剂、凝胶剂、泡沫剂、软膏剂(ointment)、乳剂、洗剂、涂剂、持续释放制剂或散剂的形式，并且通常包含例如约0.1％-95％的活性组分，并且更通常约0.2％-70％。其它适合的制剂包括普兰尼克凝胶系制剂、羧甲基纤维素(CMC)系制剂和羟基丙基甲基纤维素(HPMC)系制剂。适合的制剂包括普兰尼克凝胶剂，其含有例如约10％到约15％、约15-20％、约20-25％和约25-30％，适合地约22％的普兰尼克凝胶。其它有用的制剂包括缓慢释放制剂或延迟释放制剂和滴注剂。
凝胶剂或胶冻剂可使用适合的胶凝剂制备，所述胶凝剂包括但不限于明胶、黄蓍胶、藻酸盐或纤维素衍生物，并且可包含甘油作为保湿剂、软化剂和防腐剂。软膏剂为半固体制剂，其由掺入脂肪的、蜡质的或合成的基质的活性组分组成。适合的乳膏剂的实例包括但不限于油包水和水包油乳剂。油包水乳膏剂可使用适合的乳化剂(具有与脂肪醇(如鲸蜡醇或十六十八醇)和乳化蜡(但不限于此)类似的性质)配制。水包油乳膏剂可使用乳化剂(如聚西托醇乳化蜡)配制。适合的性质包括改变乳剂的粘度的能力，以及在宽的pH范围下的物理和化学稳定性。水溶的或可混合的乳膏剂基质可包含防腐剂系统，并也可被缓冲以维持可接受的生理pH。
可配制泡沫制剂以使用惰性抛射剂，通过适合的涂药器，由加压的气雾剂罐递送。用于配制泡沫剂基质的适合的赋形剂包括但不限于丙二醇、乳化蜡、鲸蜡醇和硬脂酸甘油酯。可能的防腐剂包括羟苯甲酯和羟苯丙酯。
在特定的实施方案中，将本发明的药剂与药学上可接受的载体或稀释剂组合以制备药物组合物。适合的载体和稀释剂包括等渗盐水溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。适合的稀释剂和赋形剂还包括例如水、盐水、葡萄糖、甘油等，及其组合物。此外如果期望，也可存在如湿润剂或乳化剂、稳定剂或pH缓冲剂的物质。
术语“药学上可接受的载体”指任意药物载体，其本身不诱导对接受组合物的个体有害的抗体的产生，并且其可在无不适当的毒性下给药。适合的载体可为大的、缓慢代谢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸和氨基酸共聚物。
也可存在药学上可接受的盐，例如无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。
适合的载体材料包括任意载体或媒介物，其通常用作用于局部给药的乳膏剂、洗剂、凝胶剂、乳剂、洗剂或涂剂的基质。实例包括乳化剂，惰性载体包括烃类基质、乳化基质、无毒溶剂或水溶性基质。特别适合的实例包括普兰尼克、HPMC、CMC和其它纤维素系组分、羊毛脂、硬石蜡、液体石蜡、软黄石蜡或软白石蜡、白蜂蜡、黄蜂蜡、十六十八醇、十六醇、二甲硅油、乳化蜡、肉豆蔻酸异丙酯、微晶蜡、油醇、蜂蜜(包括麦卢卡蜂蜜)以及硬脂醇。
在特定的实施方案中，所述药学上可接受的载体或媒介物是凝胶，适合地为非离子聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物凝胶，如普兰尼克凝胶，例如普兰尼克F-127(BASF Corp.)。该凝胶特别有用，因为其在低温下为液体，但是在生理温度下快速凝固，这限制药剂向施用部位或紧邻的部位释放。药物载体还包括脂质体、纳米颗粒(nanosome)等等。
本发明的制剂还可包含如酪蛋白、明胶、白蛋白、胶(glue)、海藻酸钠、羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素或聚乙烯醇的助剂。
其它适合的制剂包括普兰尼克凝胶系制剂、羧甲基纤维素(CMC)系制剂和羟丙甲纤维素(HPMC)系制剂。所述组合物可配制为用于任何期望的递送形式，包括局的、滴注、胃肠外、肌内、皮下或经皮给药。其它有用的制剂包括缓慢释放制剂或延迟释放制剂。
经皮递送可通过本领域中已知的或后来发现的方法实施，包括例如涉及下列的方法1)使用化学渗透促进剂或皮肤促进剂；2)脂质体介导的递送；3)电离子透入疗法；4)电穿孔；5)超声促渗；6)机械的(例如微穿孔(microporation))装置。适合于经皮递送本发明的药剂的示例性方法可包括例如涉及增强物质穿过皮肤毛孔(通过增加穿过现有毛孔运输的速率或通过制备人工毛孔以扩大可用的皮肤毛孔的数目)的运输的方法。
经皮递送可通过使用化学或渗透促进剂来实施，所述化学或渗透促进剂包括例如植物、坚果、合成的或动物来源的药学上可接受的油(包括鸸鹋油、乙氧基化物油、PEG、亚油酸、乙醇、1-甲醇和/或角质层脱脂(delipidize)剂)。适合的油包括绣线菊(meadowfoam)油、蓖麻油、霍霍巴油、玉米油、葵花籽油、芝麻油和鸸鹋油，所有上述可任选地被乙氧基化。范例包括在美国专利第7291591、7201919、7052715、7033998、6946144；6951658、6759056、6720001、6224853、5695779和6750291号中描述的那些。此外，透皮贴剂也可适用于干粉或冻干的药物的递送，并且范例包括在美国专利第5,983,135号中描述的那些。
经皮递送可通过脂质体介导的递送方法(例如通过亲脂性膜活性剂的施用促进递送)实施。适合的范例可包括在美国专利第5910306、5718914和5064655号中描述的那些。
经皮递送系统也可与多种电离子透入疗法或电转运系统结合或组合应用。示例性的电转运药物递送系统在美国专利第5,147,296、5,080,646、5,169,382和5,169383号中记载。
术语“电转运”一般指有益药剂(例如药物或药物前体)通过身体表面(如皮肤、粘膜、指甲等)的通道。药剂的转运通过施用电位诱导或增强，所述电位导致电流的施用，所述电流递送药剂或增强药剂的递送，或者对于“反向”电转运，对药剂取样或增强药剂的取样。药剂电转运入或出人体可以多种方式实现。
经皮递送可通过电离子透入疗法方法(例如通过随时间向皮肤施用低水平的电场促进递送)实施。适合的范例可包括在美国专利第6731987、6391015、6553255、4940456、5681580和6248349号中记载的那些。
经皮递送还可通过电穿孔方法(例如通过短暂地施用高电压脉冲以在皮肤中创造暂时的毛孔以促进递送)实施。适合的范例可包括美国专利第7008637、6706032、6692456、6587705、6512950、6041253、5968006和5749847号。
经皮递送可通过超声促渗方法(例如通过施用低频超声脉冲以增加皮肤渗透性来促进递送)实施。适合的范例可包括美国专利第7232431、7004933、6842641、6868286、6712805、6575956、6491657、6487447、623499和6190315号。
经皮递送可通过包括使用机械装置和/或创造人造微孔或微通道(例如显微投影)的方法实施，所述人造微孔或微通道的创造通过在结构组件、热稳定性质、膜流动性以及皮肤体系结构和子结构的完整性上诱导机械改变或破坏来进行。适合的范例可包括MicroPor(Altea Therapeutics)、MacroFlux(Alza Corporation)以及在美国专利第6893655、6730318、5484604、5362308、5320850和5279544号，以及美国复审证书RE35474中记载的那些。
其它适合的制剂为可吸入的制剂。其它适合的制剂为可注射的制剂。
用于给定个体或病况的有效剂量通常在对至少50％的人群的治疗有效剂量内，并且在该水平下表现很少或不表现毒性。
本发明的方法和组合物中应用的各病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)(和/或其它治疗剂，如果有)的有效剂量可根据许多因素变化，所述因素包括所应用的特定病毒VEGF和抗炎白细胞介素、组合部分(如果有)、给药方式、给药频率、要治疗的病况、要治疗的病况的严重性、给药途径，要治疗的患者亚群的需求或者单个患者的需求(其中不同的需求可由于年龄、性别、体重、患者特异的相关医学病况)。
向患者给药的病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)(和/或其它治疗剂，如果有)的剂量会取决于多种因素，如患者的年龄、体重和整体情况、要治疗的病况以及要给药的特定药剂。
病毒VEGF的适合的治疗有效剂量例如可为约1μg/cm2到约312.5μg/cm2或约0.2μMol到约40μMol。抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)的适合的治疗有效剂量可为约15ng/cm2到约80μg/cm2，或约2nMol到约10μMol。
可将剂量以任意形式给药，包括局部地和通过注射或滴注。如果通过注射或滴注给药，将剂量以大约每线性厘米的组织靶(例如伤口)1次用药。
可将剂量每天给药，或以其它方案给药，例如每天2次、每隔1天1次、每周1次等。也可每天给药或施用剂量持续约2天到约7天到14天，或在该范围内的任意天数。
本领域中发表抗连接蛋白剂(和/或其它治疗剂，如果有)的治疗有效剂量。
或者，组合物中各病毒VEGF和抗炎病毒细胞因子(例如白细胞介素)(和/或其它治疗剂组分，如果有)的剂量可通过参照组合物的浓度(相对于会适用其的区域的大小、长度、深度、面积或体积)来确定。例如，在特定的局部施用中，药物组合物的剂量可基于每施用区域的长度、深度、面积、或体积的药物组合物的重量(例如克)或浓度(例如μg/ul)来计算。有用的剂量为每平方厘米伤口大小约1微克到约10微克。特定的剂量会为每平方厘米伤口大小约1-2微克、约1-5微克、约2-4微克、约5-7微克和约8-10微克。其它有用的剂量大于每平方厘米伤口大小约10微克，包括每平方厘米伤口大小至少约15微克、每平方厘米伤口大小至少约20微克、每平方厘米伤口大小至少约25微克、每平方厘米伤口大小约30微克、每平方厘米伤口大小至少约35微克、每平方厘米伤口大小至少约40微克、每平方厘米伤口大小至少约50微克以及每平方厘米伤口大小至少约100微克到至少约150微克。其它剂量包括每平方厘米约150-200微克、每平方厘米约200-250微克、每平方厘米约250-300微克、每平方厘米约300-350微克、每平方厘米约350-400微克，和每平方厘米约400-500微克，以及每平方厘米500-1000微克，和每平方厘米至少约600-1000微克。
在特定的实施方案中，所述病毒VEGF和/或抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)组分(和/或其它治疗剂组分，如果有)可以治疗部位和/或治疗部位邻近的部位处约0.01微摩尔(μM)或0.05μM到约200μM，或至多300μM或至多400、500、600、700、800、900μM或至多1000μM或至多2000μM或至多3200μM或更高的终浓度，以及在这些剂量数值之内的任意剂量和剂量范围施用。在特定的实施方案中，病毒VEGF和/或抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)组分(和/或其它治疗剂组分，如果有)以约0.05μM到约100μM或更高的终浓度施用，更通常地，病毒VEGF和/或抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)组分(和/或其它治疗剂组分，如果有)以约1.0μM到约50μM的终浓度，更通常地，以约5-10μM到约30-50μM的终浓度施用。此外，病毒VEGF和/或抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)组分(和/或其它治疗剂组分，如果有)可以约8μM到约20μM的终浓度施用，或者病毒VEGF和/或抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)组分(和/或其它治疗剂组分，如果有)可以约10μM到约20μM的终浓度，或以约10μM到约15μM的终浓度施用。在特定其它实施方案中，病毒VEGF和/或抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)组分(和/或其它治疗剂组分，如果有)可以约10μM的终浓度施用。在另一实施方案中，病毒VEGF和/或抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)组分(和/或其它治疗剂组分，如果有)以约1-15μM的终浓度施用。在其它实施方案中，病毒VEGF和/或抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)组分(和/或其它治疗剂组分，如果有)以约20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、10-200μM、200-300μM、300-400μM、400-500μM、500-600μM、600-700μM、700-800μM、800-900μM、900-1000μM或1000-1500μM，或1500μM-2000μM或2000μM-3000μM或更高施用。
病毒VEGF和/或抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)剂量还包括例如约0.1-1、1-2、2-3、3-4或4-5微克(μg)，约5μg到约10μg、约10μg到约15μg、约15μg到约20μg、约20μg到约30μg、约30μg到约40μg、约40μg到约50μg、约50μg到约75μg、约75μg到约100μg、约100μg到约250μg和250μg到约500μg。如上所述，还提供0.5毫克到约1.0毫克或更高的剂量。剂量体积将取决于治疗部位的大小，并且可为例如约25-100μL到约100-200μL、约200-500μL到约500-1000μL。对于较大的治疗部位，毫升剂量也是适合的。
本文中描述的各药剂的其它剂量水平为约1纳克(ng)/kg到约1mg/kg体重每天。在特定的实施方案中，各主题化合物的剂量一般会为约1ng到约1微克每千克体重、约1ng到约0.1微克每千克体重、约1ng到约10ng每千克体重、约10ng到约0.1微克每千克体重、约0.1微克到约1微克每千克体重、约20ng到约100ng每千克体重、约0.001mg到约0.01mg每千克体重、约0.01mg到约0.1mg每千克体重，或约0.1mg到约1mg每千克体重。在特定的实施方案中，各主题化合物的剂量一般会为约0.001mg到约0.01mg每千克体重、约0.01mg到约0.1mg每千克体重、约0.1mg到约1mg每千克体重。如果使用一种以上的病毒VEGF和/或抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)，各病毒VEGF和/或抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)的剂量不需要与另一种在相同范围。例如，一种病毒VEGF和/或抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)的剂量可为约0.01mg到约10mg每千克体重，另一种病毒VEGF和/或抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)(或其它治疗剂)的剂量可为约0.1mg到约1mg每千克体重。
本文中提及的所有剂量和剂量范围可应用于例如本文中提及的病毒VEGF和/或抗炎病毒细胞因子(例如白细胞介素)，以及多核苷酸治疗剂，包括抗连接蛋白剂(包括寡核苷酸)。这些剂量范围也可应用于例如病毒VEGF和/或抗炎病毒细胞因子(例如白细胞介素)以及治疗剂，包括抗连接蛋白剂，其包括蛋白和肽，以及模拟肽和肽模拟物。
如本文中所述，联合给药时的病毒VEGF和/或抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)组分(和/或其它治疗剂组分，如果有)的剂量可由当单独给予时所给药的剂量向下调节。联合使用数种药剂可减少对于任意单个药剂所需的剂量，因为不同药剂作用的开始和持续时间可互补。在一实施方案中，两种或更多种病毒VEGF和/或抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)的联合使用具有累加效应、协同效应或超累加效应。在一些情况下，一种或多种病毒VEGF和/或一种或多种抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)各自或二者的组合具有累加效应。在其它情况下，所述组合可具有大于累加效应。这样的效应在本文中是指“超累加”效应，并且其可能是由于协同作用或者增强的相互作用。
术语“超累加”指通过给药各自或二者联合给药的一种或多种病毒VEGF和一种或多种抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)的组合所产生的伤口愈合的平均加速或者炎症、瘢痕形成、纤维化或粘连形成的减少统计学上显著高于通过单独给药各药剂引起的伤口愈合的加速或者炎症、瘢痕形成、纤维化或粘连形成的减少的总和。所述结果是否“统计学上显著高于”预计的单个化合物累加值可通过多种统计学方法(如本文中所述和/或本领域中普通技术人员已知)测定。术语“协同”是指一种类型的超累加抑制，例如其具有加速伤口愈合，或减少炎症、瘢痕形成、纤维化或粘连形成的能力。术语“增强(potentiated)”是指一种类型的超累加效应，其中单独的治疗剂联合给药具有增加的例如加速伤口愈合，或减少炎症、瘢痕形成、纤维化或粘连形成的能力。
一般地，增强作用可通过测定当分别与它们的治疗组中通过单独治疗产生平均减少(在加速伤口愈合，或者减少炎症、瘢痕形成、纤维化或粘连形成上)的总和相比，联合治疗是否产生统计学上显著超累加的平均的减少(例如治疗组中在加速伤口愈合或减少炎症、瘢痕形成、纤维化或粘连形成上)来评估。例如，伤口愈合的平均加速或增强或改善可以对照组和治疗组之间伤口愈合的平均加速或增强或改善上的差异来计算。伤口愈合的加速分数(fractional acceleration)(例如“受影响分数”(Fa))可通过将治疗组伤口愈合的平均加速除以对照组伤口愈合的平均加速或增强或改善来计算。统计学上显著的增强作用的检验需要计算各治疗组的Fa。对于联合治疗预计的累加Fa可取作得自接受组合的各组分的组的平均Fa的和。例如，双尾单样本T-检验(Two-Tailed One-Sample T-Test)可用于评估实验得到的结果只是由于偶然的可能性，如通过p值测量。小于0.05的值被认为是统计学上显著的，即不可能只是由于偶然。因此，联合治疗组的Fa必须统计学上显著高于对于单个组分治疗组预计的累加Fa，才认为组合导致增强的超累加效应。
联合治疗是否导致协同效应可通过半数效应/联合指数等效线图解法(Chou,T.和Talalay,P.(1984)Ad.Enzyme Reg.22:27-55)评估。该分析可使用计算机软件工具进行，如CalcuSyn，一种用于剂量效应分析的Windows软件(Biosoft(D,Cambridge UK)。考虑到本领域中已知的或后来开发的用于分析联合治疗是否存在超累加效应的任何方法，将其用于筛选对于本文所描述的联合使用适合的药剂。
在另一实施方案中，与当将所述药剂单独给药时的有效剂量相比，一种或多种病毒VEGF和一种或多种抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)的联合使用减少任何这样的药剂的有效剂量。在特定的实施方案中，当联合使用时，所述药剂的有效剂量为当单独使用时药剂剂量的约1/15到约1/2、约1/10到约1/3、约1/8到约1/6、约1/5、约1/4、约1/3或约1/2。
在另一实施方案中，与当将所述药剂单独给药时的频率相比，一种或多种病毒VEGF和一种或多种抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)的联合使用降低其中药剂给药的频率。因此，与之前实现期望的治疗目标所需的各药剂的剂量相比，这些组合允许使用较低的和/或较少剂量的各药剂。
可将剂量以单个或分开施用的形式给药。可将剂量给药一次，或可重复施用。如上所述，施用可每天或每周或更经常地重复直到例如促进了伤口愈合，或者可在例如伤口愈合缓慢或停止的情况中进行重复施用。施用的剂量可相隔1-7天或更久。例如在慢性伤口的情况下，例如如果或当例如伤口愈合缓慢或停止时可进行重复施用，例如每周，或每2周，或每天或以其它频率。对于一些适应症，如特定的眼部使用，可应用更频繁的给药，高达每小时进行。
在联合治疗中，所述病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)可通过相同或不同的途径给药。在治疗过程中，可将多种药剂在不同的时间分开给药，或以分开的或单个的组合形式并行给药。
在一些联合治疗的实施方案中，所述病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)在两种或更多种分开的组合物中给药。在这些实施方案中的一些中，第一组合物在第二组合物之前给药。在其它实施方案中，第一组合物在第二组合物之后给药。在另一实施方案中，第一组合物在第二组合物之前和之后给药。在其它实施方案中，第二组合物在第一组合物之前和之后给药。在其它这样的实施方案中，第一组合物与第二组合物约同时给药。
在一个实施方案中，将所述病毒VEGF和抗炎病毒白细胞介素通过注射递送(经外周或直接地到部位)。在一个方面中，在部位或伤口处或附近(例如到部位或伤口边缘1-10mm)进行注射。在其它实施方案中，在到部位或伤口边缘约1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3和1-2mm处进行注射。在其它实施方案中，在到部位或伤口边缘约2-8、2-7、2-6、2-5、2-4和2-3mm处进行注射。在一个实施方案中，在到部位或伤口边缘2-4或2-5mm处进行注射。在长度大于约1cm的给药部位(包括伤口)，约每线性厘米进行一次注射。在一个实施方案中，所述注射倾斜(in angled)朝向伤口或其它给药部位，在另一实施方案中，向伤口的真皮中进行注射，或通过真皮内、组织内、器官内注射。
在另一实施方案中，所述病毒VEGF和抗炎病毒白细胞介素通过局部给药递送(经外周或直接地到部位)，其包括但不限于使用固体支持物(如敷料和其它基质)和药用制剂(如凝胶剂、混合物、混悬剂和软膏剂)的局部给药。在一个实施方案中，所述固体支持物包含生物相容的膜或治疗部位插入物。在另一实施方案中，所述固体支持物包含敷料或基质。在本发明的一个实施方案中，固体支持组合物可为缓释固体支持组合物，其中单独的病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)或者与一种或多种其它治疗剂的混合物或组合分散于缓释固体基质，如藻酸盐、胶原或合成的生物可吸收聚合物的基质。在特定的实施方案中，所述固体支持组合物为无菌或低生物负荷量的。在一个实施方案中，可使用包含病毒VEGF和抗炎病毒哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)的洗涤溶液。
包含一种或多种活性成分的本发明的制剂在一段时间的递送(在一些情况中持续约1-2小时、约2-4小时、约4-6小时、约6-8或约12-24小时或更长)在更严重的损伤或病况中可能是特别有益的。
虽然递送时期会取决于要诱发加速伤口愈合，或减少炎症、瘢痕形成、纤维化或粘连形成的部位，但提供持续约0.5-1小时、约1-2小时、约2-4小时、约4-6小时、约6-8或约12-24小时或更长的连续或缓释递送。根据本发明，这通过将单独或组合的病毒VEGF和抗炎病毒白细胞介素以及药学上可接受的载体或媒介物包含于制剂(特别是以用于连续或缓释给药的制剂)来实现。
如所述，可将本发明的病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)在例如伤口形成之前、期间或之后立即给药，或者例如在可能或怀疑会导致炎症、瘢痕、粘连或纤维化的操作后，或者在伤口形成后或者在可能或怀疑会导致例如粘连的操作后约180天，或约120天，或约90天，或约60天，或约30天之内，但是通常例如在约10天、约9天、约8天、约7天、约6天、约5天、约4天、约3天或约2天或更短之内，且最通常在约24小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时之内或者在约60分钟、约45分钟、约30分钟、约15分钟、约10分钟、约5分钟、约4分钟、约3分钟、约2分钟、约1分钟之内。也可例如在可能或怀疑会导致粘连的操作之前和/期间给药本发明的一种或多种药剂。
可将本发明的药剂和药剂组合以实现期望的结果的任意方式给药。示例性的方法包括小管周给药(在外科手术时直接施用或者用内窥镜、超声、CT、MRI或透视导向)；“包被”外科手术植入物；以及在手术部位放置药物洗脱多聚体植入物。在一个实施方案中，以重量计，0.5％到20％的病毒VEGF和抗炎病毒白细胞介素负载至多聚体载体，并以“糊剂”、“膜剂”或“包裹物”的形式施用于小管周(肠系膜的)表面，在一段时间内释放药物使得外科手术粘连的发病率降低。在内窥镜操作中，多聚体制剂可以“喷雾剂”的形式通过内窥镜中的递送孔施用至在手术期间处理的腹部和骨盆器官的肠系膜。在另一实施方案中，以重量计，小管周的组合物为约0.1％到约5％的活性成分。在另一实施方案中，包含约0.1％到约20％或更多的活性剂的多聚体包衣被施用于外科植入物(例如乳房植入物、人造关节、血管移植物等)的表面以防止包裹/不适当的瘢痕形成(例如在移植物邻近)。在另一实施方案中，以重量计，包含约0.01％到约20％或更多的活性剂的多聚体植入物被直接地施用于外科手术部位(例如直接地进入窦腔、胸腔、腹腔或在神经外科手术中的手术部位)，从而例如防止或减少粘连形成。在一个实施方案中，一种或多种活性剂可通过透视导向的关节内注射进行给药。
在另一实施方案中，包含约1μg/cm2到约100μg/cm2(通常约10μg/cm2到约50μg/cm2)的病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)的灌洗液在外科手术时或外科手术后立即使用，并且由医师在外科手术期间或腹膜内给药。在所有的实施方案中，单独的这些药剂或其与其它治疗剂的组合以对于药剂的效能和耐受性调整的等价剂量进行给药。
本文中描述的给药途径和剂量仅意图用作指导，因为熟练的医师会确定最佳的给药途径，并可调整剂量以用于任何特定的患者和病况。
治疗患有本文中提及或描述的疾病、病症或病况的个体，并且在外科手术之前或之后治疗个体的任意药剂和方法可利用本文中描述的任何剂量、剂型、制剂和/或组合物的给药。
敷料和基质
在一个方面中，在敷料或基质的形式中提供一种或多种活性剂。在特定的实施方案中，在用于直接地施用的液体、半固体或固体组合物的形式中提供本发明的一种或多种药剂，或者将所述组合物涂在固体接触层(如敷料纱布或基质)表面或掺入其中。敷料组合物可以例如液体或凝胶的形式提供。一种或多种活性剂可与用于局部施用的药物赋形剂联合提供。适合的载体包括：普兰尼克凝胶、泊洛沙姆凝胶，水凝胶(包含纤维素衍生物，包括羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素及其混合物；以及包含聚丙烯酸的水凝胶(卡波姆)。适合的载体还包括用于局部药用制剂的乳膏/软膏，例如，基于聚西托醇乳化软膏的乳膏。上述载体可包括藻酸盐(作为增稠剂或刺激剂)、防腐剂(如苯甲醇)、控制pH的缓冲剂(如磷酸氢二钠/磷酸二氢钠)、调节渗量的物质(如氯化钠)，以及稳定剂(如EDTA)。
除了前面提到的生物基质，适合的敷料或基质可包括例如以下以及病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)(或单独给药或与其联合给药的其它活性剂)：
1)吸收剂：适合的吸收剂可包括例如可吸收的敷料，其可提供例如半粘附性质或非粘附层，将其与高吸收纤维(例如纤维素、棉或人造丝)层组合。或者，吸收剂可用作初级或次级敷料。
2)藻酸盐：适合的藻酸盐包括例如非针织的敷料、非粘合垫和带(包含天然的多糖纤维或提取自海藻的干凝胶)。适合的藻酸盐敷料可例如通过与渗出物接触时的离子交换过程形成湿凝胶。在特定的实施方案中，藻酸盐敷料被设计成柔软和舒适的，易于包装、卷起或施用于不规则形状的区域。在特定的实施方案中，藻酸盐敷料可与次级敷料使用。
3)抗微生物敷料：适合的抗微生物敷料可包括例如可促进生物活性剂(例如银和聚六亚甲基双胍(PHMB))的递送的敷料，以维持针对感染(在此其被需要或期望)的效力。在特定的实施方案中，适合的抗微生物敷料的可用形式为例如海绵、浸渍的针织纱布、膜敷料、可吸收产品、岛状(island)敷料、尼龙织物、非粘附屏障，或材料的组合。
4)生物的&生物合成的：适合的生物的敷料或生物合成的敷料可包括例如凝胶剂、溶液剂或提取于自然来源(例如猪或奶牛)的半渗透性薄片。在特定的实施方案中，将凝胶或溶液施用于治疗部位并用敷料(用于屏障保护)覆盖。在另一实施方案中，将生物系(例如猪肠粘膜或膀胱组织)或生物合成系薄片放置于原位，其可用作膜，在单次施用后保留在原位，或者生物的敷料或生物合成的敷料可提前制备为包含治疗剂。
5)胶原：适合的胶原敷料可包括例如凝胶剂、垫、颗粒剂、糊剂、散剂、薄片或溶液剂(源自例如牛的、猪的或鸟的来源或其它天然来源或供体)。在特定的实施方案中，所述胶原敷料可与治疗部位渗出物相互作用以形成凝胶。在特定的实施方案中，胶原敷料可与次级敷料组合使用。
6)复合材料：适合的复合材料敷料可包括例如将物理上不同的组分组合为单一产品的敷料，以提供多种功能，例如，细菌屏障、吸收和和粘连。在特定的实施方案中，所述复合材料敷料包含例如多层，并且掺入半或非粘附垫。在特定的实施方案中，所述复合材料还可包括例如，非针织织物带或透明膜的粘合边框。在特定其它实施方案中，所述复合材料敷料可用作例如初级或次级敷料，并且在另一实施方案中，所述敷料可与局部药物组合物联合使用。
7)接触层：适合的接触层敷料可包括例如薄的、非粘附的薄片，将其放置于一区域以保护组织免于例如与施用于治疗部位的其它药剂或敷料直接接触。在特定的实施方案中，可将接触层展开以符合所述治疗部位区域的形状，并且所述接触层为多孔的以允许渗出物通过上覆的次级敷料穿过以吸收。在另一实施方案中，所述接触层敷料可与局部的药物组合物联合使用。
8)弹性绷带：适合的弹性绷带可包括例如伸长并符合身体轮廓的敷料。在特定的实施方案中，所述织物组合物可包括例如棉、聚酯、人造丝或尼龙。在特定其它实施方案中，所述弹性绷带可例如作为次级层或敷料用于吸收、保持覆盖物于原位、施加压力或对治疗部位进行缓冲(cushion)。
9)泡沫剂：适合的泡沫剂敷料可包括例如薄片和其它形状的发泡多聚体溶液(包括聚氨基甲酸酯)，其含有小的、开放的能够保留液体的小室。示例性的泡沫剂可为例如用其它材料浸渍，或与其它材料分层组合。在特定的实施方案中，可基于泡沫剂的稠度和组分调整吸收能力。在特定其它实施方案中，与治疗部位接触的区域可为非粘合的以易于移除。在另一实施方案中，所述泡沫剂可与粘附边框和/或透明的涂膜包衣(可用作抗感染屏障)组合使用。
10)纱布&非针织敷料：适合的纱布敷料和针织敷料可包括例如具有不同程度吸收性的干针织或非针织海绵和包裹物。示例性的织物组合物可包括例如棉、聚酯或人造丝。在特定的实施方案中，纱布和非针织敷料的可用形式为无菌的或非无菌的散装的以及具有或不具有粘附边框。示例性的纱布敷料和针织敷料可用于清洁、包扎和覆盖多种治疗部位。
11)水胶体：适合的水胶体敷料可包括例如包含明胶、果胶或羧甲基纤维素的糯米纸(wafer)、散剂或糊剂。在特定的实施方案中，糯米纸为自粘附的，并且可用形式为具有或不具有粘附边框以及多种形状和大小。示例性的亲水胶体可用于需要外形修整的区域。在特定的实施方案中，散剂和糊剂水胶体可与次级敷料联合使用。
12)水凝胶(无定形)：适合的无定形水凝胶敷料可包括例如水、多聚体和其它无形状成分的制剂，其设计用于提供水分和维持湿润的愈合环境和/或将治疗部位再水化。在特定的实施方案中，水凝胶可与次级敷料覆盖物联合使用。
13)水凝胶：浸渍的敷料：适合的浸渍的水凝胶敷料可包括例如用无定形的水凝胶饱和的纱布和非针织海绵、绳和条带。无定形水凝胶可包括例如水、多聚体和其它无形状成分的制剂，其设计用于向干燥的治疗部位提供水分和维持湿润的愈合环境。
14)水凝胶薄片：适合的水凝胶薄片可包括例如交联亲水聚合物的三维网络，所述亲水聚合物不溶于水，并且通过溶胀与水溶液相互作用。示例性的水凝胶为高度舒适的和可渗透的，并且根据其组分，可吸收不同量的引流(drainage)。在特定的实施方案中，所述水凝胶对治疗部位是非粘合性的，或进行处理以易于移除。
15)浸渍的敷料：适合的浸渍的敷料可包括例如用溶液剂、乳剂、油、凝胶剂或一些其它药物活性化合物或载体剂(包括例如盐水、油、锌盐、矿脂、三溴酚铋和猩红以及本文中描述的化合物)饱和的纱布和非针织海绵、绳和条带。
16)硅酮凝胶薄片：适合的硅酮凝胶薄片敷料可包括例如包含用网状物或织物强化或联结的交联多聚体的柔软覆盖物。
17)溶液剂：适合的液体敷料可包括例如多蛋白材料和在细胞外基质中发现的其它组件的混合物。在特定的实施方案中，示例性的溶液剂可在清创术和清洁后施用于治疗部位，然后用吸收剂敷料或非粘合的垫覆盖。
18)透明膜：适合的透明膜敷料可包括一侧涂有粘合剂的不同厚度的多聚体膜。在特定的实施方案中，透明膜对于液体、水和细菌不可渗透，但是对于水蒸气和大气气体可渗透。在特定的实施方案中，透明性使得治疗部位可见。
19)填充剂：适合的填充剂敷料可包括例如小珠、乳膏剂、泡沫剂、凝胶剂、软膏剂、垫、糊剂、枕垫(pillow)、散剂、丝条(strand)或其它制剂。在特定的实施方案中，填充剂为非粘附的，并且可包括定时释放的抗菌剂。示例性的填充剂可用于维持潮湿环境、处理渗出物，以及用于例如断层和全层伤口、感染伤口、引流伤口和需要包扎的深伤口的治疗。
伤口治疗
一般方面
本发明涉及药物组合物和它们的使用方法，其中所述组合物包含治疗有效量的病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)(单独或与一种或多种治疗剂组合)。所述组合物可用于例如增强或促进伤口愈合，所述伤口包括例如急性伤口和未按期望速率愈合的伤口，如慢性伤口以及可能愈合缓慢或者常规伤口治疗或伤口愈合促进疗法难治的其它伤口，以及本文中描述的其它疾病、病症和病况，包括特征在于炎症或不必要的炎症的疾病、病症和病况。慢性伤口经常特征在于不必要的炎症。
同样地，在其它组织损伤(特别是伤口)的情况中，本发明的方法和组合物对于促进伤口愈合过程、减少肿胀和炎症以及使瘢痕形成最小化有效。这些制剂可用于治疗纤维化疾病、病症和病况，以及治疗、降低其发病率或严重性或防止或延缓粘连、外科手术粘连和/或继发性外科手术粘连。所述制剂在伤口(不论是外伤(包括烧伤)、内部创伤或是外科手术干预的结果，以及慢性伤口)治疗中具有明显的益处。
组合物
在一个方面中，本发明提供用于治疗性伤口处理的组合物，其包含病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)。在另一方面中，本发明提供用于治疗性伤口处理的组合物，其包含病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)和至少一种其它治疗剂，例如抗连接蛋白剂和/或抗骨桥蛋白剂。在特定的实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的载体或媒介物。
在一个实施方案中，抗连接蛋白剂选自：用于伤口治疗的抗连接蛋白多核苷酸、抗连接蛋白肽或肽模拟物、黏着连接调节剂和连接蛋白复合物调节剂。在另一实施方案中，抗骨桥蛋白剂选自：用于伤口治疗的抗骨桥蛋白多核苷酸、抗骨桥蛋白肽或肽模拟物。
在其它实施方案中，抗连接蛋白或抗骨桥蛋白多核苷酸为反义多核苷酸。在一种形式中，所述组合物包含仅一种连接蛋白或一种骨桥蛋白的mRNA的一种或多种反义多核苷酸。例如所述连接蛋白为连接蛋白43。在另一种形式中，所述组合物包含抗连接蛋白肽或肽模拟物，以及连接蛋白或骨桥蛋白的mRNA的反义多核苷酸。同样，所述连接蛋白为例如连接蛋白43。
因此，在一个方面中，本发明提供用于治疗伤口的组合物，包括慢性和缓慢或延期愈合伤口。在另一方面中，本发明提供用于治疗纤维化或纤维化疾病、病症或病况的组合物。在另一方面中，本发明提供用于防止和/或治疗异常或过量的瘢痕形成和/或过量的组织增殖以及相关的病症和病况的组合物。在另一方面中，本发明提供防止和/或减少粘连(包括外科手术粘连)的组合物和它们的使用方法。在另一方面中，本发明提供防止和/或减少炎症的组合物和它们的使用方法。
药盒、药物和制品
任选地，病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)(单独或与一种或多种其它治疗剂组合)还可用于制备药物。
在一个方面中，本发明提供包含所述一种或多种组合物或制剂的药盒。例如，所述药盒可包含一种或多种组合物，其包含有效量的病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)，其为单独的或连同，以及任选地与一种或多种其它治疗剂(例如抗连接蛋白剂种类和/或抗骨桥蛋白剂)组合。
还提供制品，其包含含有如本文中所述的本发明的组合物或制剂的容器以及用于治疗个体的使用说明。例如，在另一方面中，本发明包括制品，其包含含有治疗有效量的一种或多种抗连接蛋白剂(其为单独的或与一种或多种其它治疗剂组合)的容器，以及使用说明，包括用于个体治疗的使用说明。在一个实施方案中，病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)在分开的多个容器中提供。在另一实施方案中，病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)在同一容器中提供。
在一个方面中，本发明提供用于治疗伤口(包括慢性和缓慢或延期愈合伤口)的药盒。在另一方面中，本发明提供用于治疗纤维化或纤维化疾病、病症或病况的药盒。根据另一方面，本发明提供用于防止和/或治疗异常的或过量的瘢痕形成和/或过量的组织增殖和病况的药盒，并且其包含一种或多种所述的制剂。在另一方面中，本发明提供用于防止和/或减少粘连的药盒，其包含一种或多种所述组合物或制剂。在另一方面中，本发明提供用于防止和/或减少炎症的药盒，其包含一种或多种所述组合物或制剂。
提供制品用于防止和/或治疗伤口，包括慢性和缓慢或延期愈合伤口。在另一方面中，提供制品用于防止和/或治疗纤维化或纤维化疾病、病症或病况。还提供制品用于防止和/或治疗异常的或过量的瘢痕形成和/或过量的组织增殖和相关的病症和病况。提供其它制品用于防止和/或减少如本文中所述的粘连。提供其它制品用于防止和/或减少如本文中所述的炎症。
治疗
本发明的组合物和制剂可与例如用于促进伤口愈合的组合物结合或组合使用，并且也可用于减少肿胀、炎症和/或瘢痕形成。本发明的组合物和制剂也可与用于促进和/或改善急性或慢性伤口(包括缓慢愈合伤口和延期愈合伤口)的愈合的组合物结合或组合。在一个方面中，所述伤口会是外科手术或创伤或潜在的医学病况(例如糖尿病、外周性水肿、脉管炎或心血管疾病)的结果。
在一个方面中，本发明涉及促进或改善个体中伤口愈合的方法，其包括给药治疗有效量的病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)(其为单独的或彼此物理组合)。在特定的实施方案中，这样的给药有效减少炎症、促进细胞迁移以加速伤口闭合，或改善愈合和/或促进上皮生长和表面恢复。在特定的实施方案中，给药本发明的一种或多种组合物有效减少或防止瘢痕形成(包括异常的瘢痕形成)。
在一个方面中，本发明涉及促进或改善个体中伤口愈合的方法，其包括单独或共同给药病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)，并且任选地与一种或多种有效改善伤口愈合的量的其它治疗剂配合或联合。
在另一方面中，本发明提供在患有伤口(例如外科手术(如美容、瘢痕修整和其它外科手术)伤口)的患者中减少瘢痕形成和/或改善瘢痕外观的方法，其包括单独或共同给药病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)，并且任选地与一种或多种有效改善所述伤口部位处或与其紧邻处的愈合的量的其它治疗剂配合或联合的步骤。同样，所述伤口可为创伤或外科手术的结果，例如，在外科手术修复和/或伤口闭合之前将制剂施用于所述伤口。如本文中所述，在用于减少或改善瘢痕形成或外观，或者防止或减少炎症的方法中，可将病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)与适合量的另一种伤口愈合剂联合给药，或者在所述另一种伤口愈合剂之后或之前给药，所述另一种伤口愈合剂例如抗连接蛋白剂或抗骨桥蛋白剂。
在一个方面中，本发明涉及减少、防止或改善个体的组织损伤(包括炎症损伤)的方法，其包括单独或共同给药病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)，并且任选地与一种或多种有效减少、防止或改善组织损伤(包括炎症损伤)的量的其它治疗剂配合或联合。
在另一方面中，本发明涉及减少肿胀和/或炎症(例如作为治疗急性或慢性伤口和/或组织(包括遭受物理创伤的组织)的一部分)的方法，其包括将病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)，并且任选地与一种或多种的其它治疗剂配合或联合单独或共同给药至所述伤口或组织处或其附近的步骤。在一个实施方案中，所述伤口为对组织的物理创伤的结果，所述组织包括皮肤组织(例如导致压力性溃疡或糖尿病性溃疡或其它溃疡)和神经组织(如脑、脊髓或视神经)，或者皮肤或眼。
在一个方面中，本发明涉及病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)的单独持续给药，或者与一种或多种其它治疗剂(例如一种或多种抗连接蛋白剂和/或抗骨桥蛋白剂)联合给药。在一个实施方案中，所述一种或多种药剂给药持续至少约0.5小时、约1-24小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约11小时、至少约12小时或至少约24小时。根据一个实施方案，所述伤口为慢性伤口。适合的个体包括糖尿病个体。其它个体包括例如患有外周性水肿、脉管炎或心血管疾病的那些。其它个体包括例如患有静脉疾病(包括静脉功能不全)或动脉疾病(包括动脉功能不全)的那些。
在一个方面中，本发明提供治疗具有伤口的个体的方法，其包括将有效量的病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)向伤口单独持续给药，或者与一种或多种其它治疗剂(例如一种或多种抗连接蛋白剂和/或抗骨桥蛋白剂)联合给药。
在另一方面中，提供用于治疗具有慢性伤口的个体的方法。这样的方法包括将病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)向所述个体单独持续给药，或者与一种或多种其它治疗剂(例如一种或多种抗连接蛋白剂和/或抗骨桥蛋白剂)联合给药。
在一个方面中，本发明涉及治疗或预防慢性伤口的方法，其包括将有效量的病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)向需要其的个体单独给药，或者与一种或多种其它治疗剂(例如一种或多种抗连接蛋白剂和/或抗骨桥蛋白剂)联合给药。在一个实施方案中，所述慢性伤口为慢性皮肤伤口，并且将本发明的组合物向所述个体的皮肤或与所述皮肤相关的组织给药，持续有效的时间。适合治疗的慢性皮肤伤口可例如选自压力性溃疡、糖尿病性溃疡、静脉性溃疡、动脉溃疡、血管炎溃疡和混合溃疡，以及其它本文中所提到的。所述慢性伤口可为动脉溃疡，其包括由完全的或部分的动脉阻滞引起的溃疡形成。所述慢性伤口可为静脉淤滞溃疡，其包括由静脉瓣功能失常和相关的血管疾病引起的溃疡形成。所述慢性伤口可为创伤诱导的溃疡。所述慢性、缓慢或延期愈合伤口可为例如与另一器官组织(例如肾、肠、肝、肺)相关的皮肤或眼，或在CNS中。
当不以固定组合的形式给药时，特定的联合治疗方法包括顺序给药病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)，任选地与一种或多种其它治疗剂(例如一种或多种抗连接蛋白剂和/或抗骨桥蛋白剂)组合。例如，将所述药剂在彼此之间至少约半小时之内顺序给药。也可将所述药剂在彼此之间约1小时到12小时之内、彼此之间约12小时到24小时之内、彼此之间约1天到约1周之内或其它认为合适的进行给药。
在一个实施方案中，治疗或预防慢性伤口的方法包括病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)的单独持续给药，或者与一种或多种其它治疗剂(例如一种或多种抗连接蛋白剂和/或抗骨桥蛋白剂)联合给药。在一个实施方案中，所述一种或多种组合物以持续释放制剂的形式给药。在另一实施方案中，给药所述一种或多种组合物持续一段时间。可被治疗的个体包括糖尿病个体，和患有其它溃疡(包括静脉性溃疡和本文中所述和本领域中已知的其它溃疡)的患者。
在一个方面中，本发明涉及防止和/或治疗个体中纤维化或纤维化疾病、病症或病况的方法，其包括给药治疗有效量的本发明的组合物。在特定的实施方案中，所述给药有效减少纤维化。在特定的实施方案中，所述给药有效防止或减少挛缩。
在一个方面中，本发明涉及防止和/或治疗个体中纤维化或纤维化疾病、病症或病况的方法，其包括单独或联合给药治疗有效量的病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)，并且任选地与一种或多种有效减少纤维化的其它治疗剂(例如一种或多种抗连接蛋白剂和/或抗骨桥蛋白剂)联合。在一个实施方案中，单独或联合给药病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)，并且任选地与一种或多种其它治疗剂联合有效防止或减少挛缩。
根据所述方法的一个实施方案，所述个体患有选自下列的病症：硬皮病、肾纤维化(包括糖尿病肾病)、心脏纤维化(例如心肌纤维化)、肺纤维化(例如肾小球硬化症、肺纤维化、特发性肺纤维化、硅肺病、石棉肺、间质性肺疾病和纤维化肺疾病以及化学治疗/放射诱导的肺纤维化)、口纤维化、心内膜心肌纤维化、三角肌纤维化、胰腺炎、炎症性肠病、克罗恩氏病、结节性筋膜炎、嗜酸细胞性筋膜炎、特征在于正常的肌肉组织被纤维性组织在不同程度替代的广泛纤维化综合征、腹膜后纤维化、肝纤维化、肝硬化、慢性肾脏功能衰竭、骨髓纤维化、药物引起的麦角中毒、Li-Fraumeni综合征中的胶质母细胞瘤、散发性胶质母细胞瘤、骨髓性白血病、急性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生综合征、妇科癌症、卡波西肉瘤、Hansen’s疾病、胶原性结肠炎和急性纤维化。根据该实施方案，所述硬皮病可为硬斑病、泛发性硬斑病或线状硬皮病。也根据该实施方案，所述肾纤维化可为肾小球硬化、肾小管间质性纤维化或进行性肾脏疾病。关于该实施方案，所述肺纤维化可为弥漫性肺间质纤维化。
根据所述方法的另一实施方案，所述纤维化为急性纤维化。所述急性纤维化可为对多种形式的创伤(包括意外损伤、感染、放射或化疗治疗)的响应。
根据所述方法的另一实施方案，所述纤维化为慢性纤维化。本发明还包括整体或部分上治疗和/或防止多种疾病、病症和病况(包括例如包膜挛缩、Dupytren’s挛缩、Volkmann’s挛缩、Ledderhose’s挛缩、Peyronie’s挛缩或其复发)的方法，其包括单独或联合给药有效量的病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)，并且任选地与一种或多种其它治疗剂联合。在特定的实施方案中，所述组合物在松解手术(例如压力推拿、切开松解、关节镜松解或瘢痕切除)之前、期间和/或之后向所述损伤部位给药，以防止瘢痕和异常的组织和/或其它挛缩的复发。
在一个方面中，本发明涉及防止和/或治疗个体中异常的或过量的瘢痕形成和/或过量的组织增殖以及相关的病症和病况的方法，其包括单独或联合给药治疗有效量的病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)，并且任选地与一种或多种其它治疗剂联合。在特定的实施方案中，所述给药有效减少异常的或过量的瘢痕形成和/或过量的组织增殖以及相关病症和病况。
在一个方面中，本发明涉及防止和/或治疗个体中异常的或过量的瘢痕形成和/或过量的组织增殖以及相关病症和病况的方法，其包括单独或联合给药治疗有效量的病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)，并且任选地与一种或多种其它治疗剂联合。在一个实施方案中，单独或联合的病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)，并且任选地与一种或多种其它治疗剂联合有效减少异常的或过量的瘢痕形成和/或过量的组织增殖以及相关病症和病况。
在一个方面中，本发明涉及病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)单独或联合地持续共同给药，并且任选地与一种或多种其它治疗剂联合。
根据一个实施方案，所述个体有选自下列的异常的瘢痕：瘢痕疙瘩、肥厚性瘢痕、广泛性瘢痕和萎缩性瘢痕。
根据另一实施方案，被治疗的个体包括已经历创伤、外科手术干预、烧伤和其它类型的损伤的那些，所述损伤导致或可导致异常的或过量的瘢痕形成，以及过量的瘢痕形成和其它类型的异常的组织增殖，包括瘢痕疙瘩、肥厚性瘢痕、广泛性瘢痕和萎缩性瘢痕。
在特定的实施方案中，将单独或联合的病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)(并且任选地与一种或多种其它治疗剂联合)给药至上皮组织、结缔组织、肌肉组织和神经组织，或外科手术期间暴露或受伤的其它组织，或者作为创伤的结果。在一些实施方案中，可将所述病毒VEGF和抗炎病毒白细胞介素局部给药。在其它实施方案中，将所述病毒VEGF和抗炎哺乳动物或病毒细胞因子(例如白细胞介素)植入或滴注或注射。
在特定的实施方案中，本发明包括使用本文中所述的组合物治疗与异常的或不期望的连接蛋白活性相关的疾病或病况的方法，其中所述疾病或病况任选地选自：急性伤口、慢性伤口、炎症疾病、肺疾病(任选地哮喘)、肾脏疾病、肝疾病(任选地NASH)、关节炎(任选地少年型关节炎、骨关节炎和类风湿性关节炎)、炎症性肠病(任选地克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、皮肤病、感染、缺血(任选地再灌注损伤)和心脏病(任选地动脉粥样硬化)。
要理解，以下实施例仅为了说明而提供，并不构成对本发明的范围的限制。
实施例
实施例1
治疗蛋白的制备和实验方法
重组蛋白
如之前记载(Wise等人,J Biol Chem 278,38004-38014,2003,Imlach等人,J GenVirol 83,1049-1058,2002)，将重组FLAG-标记的VEGF-A和VEGF-E(ORFVNZ2VEGF)以及鼠的(m)IL-10和羊传染性口疮病毒IL-10(vIL-10)在293-EBNA细胞中表达、纯化和定量。
小鼠
无特异病原体雌性C57BL/6小鼠(6-8周龄)得自University of Otago AnimalFacility，并在研究机构伦理批准下使用。
伤口愈合测定
在第0天，将小鼠通过皮下(SC)注射氯胺酮/domitor/阿托品(分别为75/1/0.05mg/kg体重)进行麻醉，背部剃毛，用Veet乳膏剂(Reckitt Benckiser)脱毛，并用盐水清洁。使用无菌的、一次性的4mm直径活检穿孔器(Kruuse)在各动物上造成2个全层切除的伤口(每个侧面一个)。通过皮下注射给予小鼠布比卡因(2mg/kg体重)用于疼痛缓解，给予Strepsin以防止伤口感染。通过皮下注射Antisedan(5mg/kg体重)使小鼠苏醒，然后将其放回它们的笼中，并通过将笼子放在加热垫上保暖直到活动。以指明的时间间隔对各伤口进行数字式拍照。使用数字式测径器测量伤口中的变化(通过四个点的伤口直径)，并以占原始伤口的百分比的形式表示。当伤口完全被表皮覆盖时认为伤口闭合。在第2天，将小鼠分成8组。向7个治疗组给药VEGF-A或VEGF-E(1μg于50μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中)、mIL-10或vIL-10(100ng于50μL PBS中)、VEGF-A和mIL-10(分别为1μg和100ng，于50μL PBS中)、VEGF-A和mIL-10(分别为1μg和100ng，于50μL PBS中)，或仅PBS，其通过在各侧(2个伤口，每组4只小鼠)的伤口附近(约3mm远，并与伤口成角度)进行单次皮下注射。各组小鼠在第4、6和8天接受向各伤口的相同治疗的加强注射。最后1组未被治疗。各组的4只小鼠各自在第3、6、9和16天除以安乐死。
用锋利的剪刀切除各伤口周围1cm2的皮肤活检物，然后沿最窄的直径分为两半。在第16天清洁各伤口的内部，然后在其被切除后进行拍照。将各伤口的一半用0.5％锌盐溶液固定，并处理入石蜡。从固定块中大约相距50μM取6张4μM的连续切片。将来自各组的其余伤口合并为2个样本(4个左侧和4个右侧)，然后根据制造商的说明，将其储存于RNAlaterRNA Stabilization Reagent(Qiagen)中。
组织学分析
将连续切片用MSB三色染色，并对整个切片进行数字式拍照，并将照片使用Photoshop转换为全景图。
使用ImageJ测量新生表皮和肉芽组织(新生真皮)的面积，以及表皮突进入真皮的长度，和各切片中伤口的宽度和总面积。使用RGB测量法(单个像素的蓝色染色强度)评估胶原含量，并标准化至同时染色的无伤口的皮肤。表皮再生以被新生表皮覆盖的总伤口宽度的百分比计算。皮肤闭合以被肉芽组织覆盖的总伤口面积的百分比计算。使用来自4只不同的动物的2个伤口的6张连续切片的平均表皮或肉芽组织面积、表皮再生百分比、表皮突数目或长度进行分析。
使用放在新生真皮(避开腺体和毛囊)上面的网格来定量肉芽组织中的血管形成。所述网格被相距0.024mm的等距线分割。对染色的血管穿过网格的交叉点的点进行计数(各血管仅计数1次)，形成血管的新生真皮的面积分数(areal fraction)以染色细胞落在交叉点上的分数表示。由来自4只不同的动物的2个伤口的6张连续切片测定血管形成的平均面积分数。
免疫荧光分析
根据标准的方法进行免疫荧光染色。简要地，在室温(RT)下，将代表性的切片用一种或多种一级抗体(抗小鼠F4/80抗原488(PAB49,eBioscience,1:100稀释、抗α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)Cy3缀合物(PAB53,Sigma-Aldrich,稀释度1:400)、抗波形蛋白488缀合物(D21H3,Cell Signalling technology,稀释度1:100)或多克隆兔抗vonWillebrand因子(vWF,PAB52,DakoCytomation,稀释度1:200)于氨丁三醇缓冲盐水(TBS)中孵育2小时。抗体孵育后，将载玻片在TBS中洗涤15分钟。然后在室温下，将用抗vWF多克隆孵育的载玻片用山羊抗兔IgG488(SAB10,Invitrogen,1:500稀释度)于TBS中孵育2小时。在抗体孵育的最后30分钟，还向载玻片加入4’,6-二脒基-2-苯酚吲哚(DAPI,D3571,Invitrogen,75nM)。将载玻片用SlowFade Gold抗猝灭剂(anti-fade reagent)(S36936,Invitrogen)封固，然后使用荧光显微镜观察。在调节白平衡使背景荧光呈现黄色下，使用红色和绿色滤光器对整个切片进行数字拍照。随后使用Photoshop将图像合并和转换为全景图。
在伤口边缘的每一侧的皮肤和皮下区域0.57mm内，对每个伤口F4/80+ve巨噬细胞的数目定量。在新生真皮(避开腺体和毛囊)中，对肉芽组织区域中vWF+ve内皮细胞以及与αSMA+ve周细胞相关的那些的数目和红细胞的数目进行定量。结果表示为染色细胞的平均数目/1000μM2，并使用来自4只不同的动物的2个伤口的代表性的切片进行测定。使用AdobePhotoshop对肉芽组织中α-SMA染色的强度进行定量。结果表示为平均总α-SMA强度(平均红色像素强度X像素数目)，并使用来自4只不同的动物的2个伤口的代表性的切片进行测定。
定量RT-PCR
将小鼠皮肤置于液氮中，用研钵和研棒充分地研磨，然后使用针和注射器搅匀。然后通过Trizol纯化(Invitrogen)，随后用蛋白酶K消化，然后使用 Mini药盒(Qiagen)的进一步纯化步骤(在各情况下根据制造商的说明)，分离总RNA。根据制造商的说明，使用Superscript III(Invitrogen)用总RNA、oligo(dT)15和随机六聚物引物进行cDNA的合成。根据制造商的说明，使用 Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)在ABI PRISM 7700序列检测系统进行实时定量PCR。PCR引物集来自文献、qPrimerDepot(primerdepot.nci.nih.gov/)或使用LUXTMDesigner软件(来自Invitrogen)设计，以得到87-129bp的扩增子。如PE Applied Biosystems User Bulletin#2，1997中所述，测定引物效率并进行定量RT-PCR数据分析。
瘢痕消退的测量
将各小鼠有伤口侧的瘢痕在第13天拍照(每组8只)，然后由6位独立的观察者进行盲法评分。使用1到5的等级，其中1代表完全消退的伤口，而5代表遗留明显的瘢痕。外部瘢痕评分代表来自6个观察者对每个治疗组的8个伤口的平均评分。
还将各小鼠有伤口侧(在皮肤无毛的内侧，此处其最明显)的瘢痕在第16天拍照。然后由2个独立的观察者使用ImageJ软件盲法测量瘢痕面积。内部瘢痕面积代表来自每个治疗组4只动物的2个伤口的平均面积，并且在观察者之间是一致的。
统计学分析
使用方差分析(单因素ANOVA)对来自各测定的数据进行统计学分析，使用Bonferroni法测定显著性差异点(P≤0.05)。
实施例2
用病毒VEGF和病毒IL-10的治疗加速伤口闭合
与单独治疗或它们的哺乳动物等价物相比，病毒VEGF-E和病毒IL-10的组合的治疗在更大程度上加速伤口闭合。
在该实施例中检测，在皮肤伤口愈合的小鼠模型中病毒因子调节组织修复的能力。在第2、4、6和8天通过单独或联合皮下(SC)注射相等剂量的病毒和哺乳动物的VEGF或IL-10来治疗切除伤口，并与未治疗或模拟治疗的伤口比较。
伤口愈合期间的指明的时间点拍的照片和伤口大小的测得量揭示治疗组之间在愈合动力学和伤口闭合的时间上的差异(图1)。与未治疗的伤口相比，在第8天，用PBS皮下注射的模拟治疗伤口诱导伤口大小显著地减小，但是这没有转换为显著增加的至伤口闭合的时间(图2；第9.3天对比于第9.4天)。
与模拟治疗的伤口相比，在第6天，用哺乳动物VEGF或病毒VEGF的治疗诱导伤口大小显著地减少，而病毒VEGF(在此为VEGF-E)治疗在第8天继续诱导伤口面积显著地减少。与VEGF-A治疗的伤口相比，VEGF-E治疗的伤口闭合也显著地更快(图2；第8.0天对比于第9.25天)。
与模拟治疗的伤口相比，在第6天，用哺乳动物IL-10或病毒IL-10治疗也诱导伤口大小显著地减少，而病毒IL-10治疗在第8天继续诱导伤口面积显著地减少。与mIL-10治疗的伤口相比，病毒IL-10治疗的伤口闭合也显著地更快(图2；第8.5天对比于第8.75天)。
与用各因子单独治疗相比，用VEGF-A和mIL-10的伤口治疗未进一步减少伤口大小或加速伤口闭合。
然而，与单独治疗相比，用VEGF-E和vIL-10治疗伤口确实增强早期伤口闭合，伤口大小在第4天显著地减小。与模拟治疗的伤口相比，用VEGF-E和vIL-10治疗从第4天诱导伤口大小显著地减小。用所述病毒组合治疗的伤口从第4天起比用所述哺乳动物的等价物治疗的伤口小，在第8天具有显著性差异。此外，与用其哺乳动物的等价物治疗的伤口相比，用VEGF-E和vIL-10治疗的伤口闭合显著地更快(图2；第8.2天对比于第9.0天)。
这些结果证明用来自哺乳动物或病毒来源的VEGF或IL-10治疗伤口减少伤口大小。此外，用病毒因子治疗导致加速的伤口闭合。与单个因子的相比，将病毒VEGF和病毒IL-10组合增强早期伤口闭合。
实施例3
用病毒VEGF和病毒IL-10的治疗增强表皮再生
与用单独的因子治疗相比，用VEGF和IL-10的组合的治疗增强表皮再生。
实施该实施例以测定在用病毒因子治疗的伤口中观察到的加速的伤口闭合是否是由于增强的表皮再生。在伤口形成后的不同天，将各伤口周围的皮肤切除，并在组织学上或通过定量RT-PCR分析新生表皮。
通过来自在3、6和9天后的治疗和未治疗的伤口的切片的MSB三色染色来研究病毒或哺乳动物VEGF或IL-10(单独或组合)的单次治疗对伤口新生表皮的直接效应。图3A中显示的代表性的切片说明，与对照伤口相比，VEGF-E和VEGF-A治疗增加伤口表皮再生。然后如图3B中所示，通过测定被新生表皮覆盖的总伤口宽度的百分比来对表皮再生进行定量。到第3天，在用VEGF-E治疗的伤口中，表皮覆盖了53％的创面，其显著地大于在模拟治疗和未治疗的伤口所见的表皮再生百分比(分别为33％和31％，P≤0.05，图3C)。在第3天，VEGF-A治疗的伤口显示了与VEGF-E治疗的伤口相似的表皮再生水平(45％，图3C)。到第6天，与模拟治疗和未治疗的伤口相比(分别为81％和82％，P≤0.05，图3C)，用VEGF-E的伤口治疗继续显著增加伤口表皮再生，表皮覆盖了99％的创面。在第6天，与VEGF-E治疗的伤口相比，VEGF-A治疗的伤口显示了显著较少的表皮再生(86％，P≤0.05，图3C)。到第9天，所有的伤口显示100％的表皮再生(图3C)。整体上在第3天，用VEGF-E治疗的伤口的新生表皮具有5026μM2的面积，这显著大于模拟治疗和未治疗的伤口的面积(分别为2798μM2和2663μM2，P≤0.05，图3D)。在VEGF-E治疗的伤口中所见的新生表皮的面积也显著大于VEGF-A治疗的伤口的新生表皮的面积(4270μM2，P≤0.05，图3D)。到第6天，VEGF-E治疗的伤口的新生表皮的面积已增加到7795μM2，这显著大于模拟治疗和未治疗的伤口的面积(分别为5991μM2和6067μM2，P≤0.05，图3D)。在第6天，VEGF-A治疗的伤口的新生表皮的面积(8046μM2，P≤0.05，图3D)与VEGF-E治疗的伤口的新生表皮的面积相似。在第9天，用VEGF-E或VEGF-A治疗的伤口的新生表皮的面积的大小减少(分别为5231μM2和5619μM2，图3D)，但是仍显著大于模拟治疗和未治疗的伤口的面积(P≤0.05，分别为2815μM2和4252μM2，图3D)。
与对照伤口相比，在第3天，用任一IL-10治疗伤口显著增加伤口表皮再生，在用vIL-10和mIL-10治疗的伤口中，表皮分别覆盖46％和50％的创面(P<0.05，图3A、C)。到第6天，用任一IL-10治疗伤口继续显著增加伤口表皮再生，在用vIL-10和mIL-10治疗的伤口中，表皮分别覆盖97.0和98.1％的创面(P≤0.05，图3C)。在第3天，用vIL-10和mIL-10治疗的伤口的新生表皮的面积已显著分别地增加到4619μM2和4583μM2(P<0.05，图3D)。到第6天，在vIL-10和mIL-10治疗的伤口中新生表皮的面积已分别增加到5875μM2和5438μM2，但是此时与模拟治疗和未治疗的伤口的新生表皮的面积相似(图3D)。在第9天，在IL-10治疗的伤口中新生表皮的面积的大小减小，但是在mIL-10治疗的伤口中新生表皮的面积显著小于mIL-10治疗的伤口的面积(分别为2649μM2和5619μM2，图3D)。mIL-10治疗的伤口的新生表皮的面积与未治疗的皮肤的新生表皮的面积相似(2815μM2，图3D)，而vIL-10治疗的伤口的面积与模拟治疗的伤口的面积相似(4252μM2，图3D)。
在第3天，与对照伤口相比，用VEGF和IL-10的组合的伤口治疗也显著地增加伤口表皮再生，在用VEGF-E和vIL-10或者VEGF-A和mIL-10治疗的伤口中，表皮分别覆盖74％和70％的创面(P≤0.05，图3A、C)。在第3天，与用任一单独的VEGF或IL-10治疗的伤口相比，用任一VEGF和IL-10组合的治疗的伤口也显示显著更高水平的表皮再生(P≤0.05，图3C)。到第6天，用任一VEGF和IL-10的组合治疗的伤口继续显著地增加伤口的表皮再生，在用VEGF-E和vIL-10或者VEGF-A和mIL-10治疗的伤口中，表皮分别覆盖95.9％和98.2％的创面(P≤0.05，图3C)。在第6天，与用任一单独的VEGF或IL-10治疗的伤口相比，用任一VEGF和IL-10的组合治疗的伤口没有显著更高水平的表皮再生(图3C)。在第3天，用VEGF-E和vIL-10或者VEGF-A和mIL-10治疗的伤口的新生表皮的平均面积分别显著地增加到7950μM2和7988μM2(P≤0.05，图3D)。用任一VEGF和IL-10的组合治疗的伤口中所见的新生表皮的面积显著地大于用单独的VEGF或IL-10治疗的伤口的面积(P≤0.05，图3D)。到第6天，在VEGF-E和vIL-10或者VEGF-A和mIL-10治疗的伤口中，新生表皮的面积已分别减少至5515μM2和5663μM2，但是此时与模拟治疗和未治疗的伤口的面积相似(图3D)。在第9天，组合治疗的伤口中新生表皮的面积的大小减少，在VEGF-E和vIL-10或者VEGF-A和mIL-10治疗的伤口中，新生表皮的面积分别为2780μM2和3247μM2(图3D)。组合治疗的伤口的新生表皮的面积显著地小于模拟治疗的皮肤的新生表皮的面积(图3D)。
这些结果证明，用来自哺乳动物或病毒来源的VEGF或IL-10治疗的伤口增加新生表皮的面积以及伤口表皮再生的速率。用来自哺乳动物或病毒来源的VEGF继续治疗伤口导致表皮增生。然而将任一VEGF与其各自的IL-10组合减少该效应，并限制由单独VEGF治疗诱导的表皮增生。
实施例4
用病毒VEGF和病毒IL-10治疗增强表皮再生
与单独的VEGF治疗相比，用VEGF和IL-10的组合治疗在更大程度上增强表皮再生。
通过来自9天后的治疗和未治疗的伤口的切片的MSB三色染色来研究病毒或哺乳动物VEGF或IL-10(单独或组合)的重复治疗对伤口新生表皮的效应。图4A中所示的代表性的切片说明VEGF-治疗的伤口观察到表皮增生和表皮突形成增加。与模拟治疗和未治疗的伤口的表皮突(分别为25.9μM和21.36μM，P≤0.05，图4B)相比，VEGF治疗的伤口显示表皮突长度显著的增加(VEGF-E；37.1μM和VEGF-A，32.5μM，图4C)。
用vIL-10或mIL-10治疗的伤口未显示表皮突长度的增加(分别为23.1μM和23.2μM，图4B)。
用VEGF-E和vIL-10或者VEGF-A和mIL-10治疗的伤口的表皮突长度也与对照伤口的无差异(分别为23.1μM和24.4μM，图4B)。
这些结果证明用来自哺乳动物或病毒来源的VEGF重复治疗伤口增加表皮突突入真皮。然而将任一VEGF与其各自的IL-10组合减少该效应，由此限制由单独VEGF治疗诱导的表皮增生。
实施例5
用病毒VEGF和病毒IL-10的治疗改变表皮修复关键调节剂的时机
在该实施例中，检测用VEGF和IL-10的组合的治疗对伤口的表皮再生和消退的关键调节剂的效应。使用定量实时(RT)-PCR，在治疗和未治疗的伤口检测治疗对生长因子和间隙连接蛋白(已知其调节表皮的增殖、分化或通讯)的表达的效应。
连接蛋白43在有伤口的表皮表达，并参与角质形成细胞增殖和伤口闭合的控制(Goliger和Paul,Mol Biol Cell,6,1491-501,1995；Mori等人,J Cell Sci,119,5193-203,2006；Qiu等人Curr Biol,13,1697-703,2003)。到第3天和从第9-16天，连接蛋白43的表达在有伤口的皮肤中增加(图5A-B)。与模拟治疗的伤口相比，在第3天，用VEGF-A或VEGF-E治疗伤口对连接蛋白43的表达几乎没有作用，而连接蛋白43的表达在用mIL-10或vIL-10治疗的伤口中减少(图5A)。在第3天，用VEGF-E和vIL-10的伤口治疗也减少连接蛋白43的表达，但是然后从第9天增加其表达(图5A-B)。相反，与模拟治疗的伤口相比，用VEGF-A和mIL-10的治疗在所有的时间点增加连接蛋白43的表达(图5A-B)。
BMP-6促进角质形成细胞的分化，但抑制其增殖(Gosselet等人,Cell Signal 19,731-9,2007；Kaiser等人,J Invest Dermatol 111,1145-52,1998)。在第3天，BMP-6的表达在有伤口的皮肤中下调，但是从第6-9天增加(图5C-D)。在第3天，与模拟治疗的伤口相比，用哺乳动物或病毒VEGF或IL-10的伤口治疗减少BMP-6的表达(图5C)。在第3天，与模拟治疗的伤口相比，用VEGF和IL-10组合的伤口治疗减少BMP-6的表达，然后从第6天增加其表达(图5C-D)。
EGF促进角质形成细胞增殖和迁移，由此有助于早期伤口表皮再生(Ando等人,JInvest Dermatol,100,633-9,1993；Barrientos等人,Wound Repair Regen 16,585-601,2008；Rheinwald等人,Nature 265,421-424,1977)。在第3天，EGF的表达在有伤口的皮肤中减少，然后到第9天开始增加(图5E-F)。在第3天，与模拟治疗的伤口相比，用VEGF-A或VEGF-E治疗伤口轻微增加EGF的表达，而在用mIL-10或vIL-10治疗的伤口中，EGF表达轻微减少(图5E)。与哺乳动物的组合(其从第6天上调EGF表达)相比，用VEGF-E和vIL-10治疗伤口从第3天增强EGF的表达，使其超过模拟治疗的伤口(图5E-F)。
在晚期愈合期间，KGF促进角质形成细胞迁移和分化，由此有助于有伤口表皮的再生(Barrientos等人,Wound Repair Regen 16,585-601,2008；Niu等人,J Biol Chem 282,6001-6011,2007)。直到第6天，在有伤口的皮肤中KGF表达减少，然后增加到第9天(图5G-H)。在第3天，与模拟治疗的伤口相比，用VEGF-A、VEGF-E或vIL-10治疗伤口对KGF表达几乎没有作用，但是在用mIL-10治疗的伤口中，KGF表达减少(图5G)。在第3天，与模拟治疗的伤口相比，用VEGF-E和vIL-10治疗的伤口开始减少KGF的表达，然后从第6天增加其表达(图5G-H)。在第3天，与模拟治疗的伤口相比，用VEGF-A和mIL-10的治疗也减少KGF的表达，但是在之后的时间点基本上不增加其表达(图5G-H)。
这些结果证明病毒VEGF-E和病毒IL-10的组合增强并加速表皮再生和角质形成细胞分化的关键调节剂的表达，并支持下述观点：与用哺乳动物的组合或单个因子的治疗相比，病毒组合会在更大程度上促进有伤口的皮肤中的表皮再生和消退。
实施例6
用病毒VEGF和病毒IL-10治疗减少炎症细胞募集
VEGF和IL-10的组合的治疗将炎症细胞向伤口中的募集减少到与用单独的IL-10治疗相似的程度。
通过来自6天后治疗和未治疗的伤口的切片的F4/80+ve免疫荧光染色研究病毒和哺乳动物的VEGF或IL-10(单独或组合)的重复治疗对伤口炎症的效应。如图6A中所示的代表性的切片说明与用VEGF-E、IL-10或VEGF和IL-10的组合治疗的伤口相比，在模拟和VEGF-A治疗的伤口中观察到的炎症细胞的数目增加。
将伤口边缘附近的炎症细胞的数目定量。用VEGF-A治疗的伤口具有与模拟治疗和未治疗的伤口(分别为1.32和1.21F4/80+ve细胞/1000μM2，图6B)相似的巨噬细胞数目(1.05F4/80+ve细胞/1000μM2，图6B)。然而，当与对照伤口相比，用VEGF-E治疗的伤口显示伤口附近巨噬细胞的数目显著减少(0.79F4/80+ve细胞/1000μM2，P<0.05，图6B)。用vIL-10和mIL-10治疗的伤口也显示伤口巨噬细胞的数目显著减少(分别为0.42和0.49F4/80+ve细胞/1000μM2，P≤0.05，图6B)。与模拟治疗和未治疗的伤口(与单独IL-10治疗中所见的减少相似)相比，用VEGF-E和vIL-10或者VEGF-A和mIL-10治疗的伤口也显示巨噬细胞数目显著减少(分别为0.60和0.34F4/80+ve细胞/1000μM2，P≤0.05，图6B)。
这些结果证明用来自哺乳动物或病毒来源的IL-10的重复治疗伤口减少炎症细胞流入伤口。用VEGF-A治疗不影响巨噬细胞募集，而VEGF-E减少巨噬细胞到伤口的募集。重要地，将VEGF加入到其各自的IL-10不降低病毒和哺乳动物IL-10减少伤口炎症的能力。
实施例7
用病毒VEGF和病毒IL-10的治疗减少伤口炎症
用病毒VEGF和病毒IL-10的组合的治疗通过改变炎症细胞迁移和激活的关键调节剂的时机和水平来减少伤口炎症。
在该实施例中，检测用VEGF和IL-10的组合的治疗对炎症细胞迁移和激活的关键调节剂的效应。使用定量实时(RT)-PCR检测在治疗和未治疗的伤口中所述治疗对调节组织修复的炎症期的细胞因子和趋化因子的表达的效应。
促炎细胞因子白细胞介素(IL)-1β和IL-6由浸润的嗜中性粒细胞和巨噬细胞表达，并参与伤口表皮再生和血管再生的控制(在Barrientos等人,Wound Repair Regen 16,585-601,2008中综述)。在第3天，IL-10和IL-6表达在有伤口的皮肤中上调(图7A、B)。与模拟治疗的伤口相比，用VEGF-A或VEGF-E治疗伤口使2种促炎细胞因子的表达水平均为两倍以上，而在用mIL-10或vIL-10治疗的伤口中，所述细胞因子的表达实质上减少(图7A、B)。与模拟治疗的伤口相比，用VEGF-E和vIL-10治疗伤口减少IL-10和IL-6的表达，而用VEGF-A和mIL-10治疗增加其表达(图7A、B)。
促炎趋化因子CCL2(巨噬细胞化学引诱物蛋白(MCP)-1)和CXCL2(巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-2a)分别由有伤口的内皮和浸润的巨噬细胞以及巨噬细胞和嗜中性粒细胞募集的化学引诱物表达(DiPietro等人,Am J Pathol,146,868-75,1995；Seo等人,Am J PhysiolCell Physiol,281,C1568-78,2001)。在炎症期间，CCL2还募集成纤维细胞，并刺激它们在伤口中产生胶原纤维和结构组织(Gharee-Kermani等人,J Biol Chem 271,17779-84,1996)。趋化因子CXCL2有助于表皮再生并且促血管发生(Devalaraja,J Invest Dermatol115,234-44,2000)。在第3天，在有伤口的皮肤中，CCL2和CXCL2的表达上调(图7C、D)。与模拟治疗的伤口相比，用VEGF-A或VEGF-E治疗伤口使2种促炎趋化因子的表达水平均为两倍以上，而在用mIL-10或vIL-10治疗的伤口中，所述趋化因子的表达实质上减少(图7C、D)。用VEGF和IL-10的任一组合治疗伤口将CCL2和CXCL2的表达降低至用VEGF或IL-10单独治疗的伤口的表达的中间水平(图7C、D)。
抗炎细胞因子IL-10由有伤口的表皮和浸润的嗜中性粒细胞以及巨噬细胞表达，并参与瘢痕形成的控制(Peranteau等人,J Invest Dermatol,128,1852-60,2008)。在第3天，在有伤口的皮肤中IL-10的表达上调(图7E)。与模拟治疗的伤口相比，用VEGF-A或VEGF-E治疗伤口增加的IL-10的表达，而用mIL-10或vIL-10治疗的伤口观察到较小的差异(图7A、B)。与模拟治疗的伤口相比，用VEGF-E和vIL-10治疗伤口实质上增加IL-10的表达，而用VEGF-A和mIL-10治疗具有很少的效应(图7E)。
骨桥蛋白(分泌磷蛋白(SPP)-1)是参与与细胞外基质的粘连、调节炎症细胞以及成纤维细胞运输和存活的糖蛋白，并且被认为有助于瘢痕形成(Mori等人,J Exp,Med,205,43-51,2008)。在第3天，在有伤口的皮肤中骨桥蛋白的表达上调(图7F)。与模拟治疗的伤口相比，用VEGF-A或VEGF-E治疗伤口对骨桥蛋白的表达没有作用，而在用mIL-10或vIL-10治疗的伤口中骨桥蛋白的表达实质上减少(图7F)。用VEGF和IL-10的任一组合治疗将骨桥蛋白的表达降低至与用IL-10单独治疗的伤口相似的水平(图7F)。
这些结果证明，用来自哺乳动物的或病毒来源的IL-10重复治疗伤口降低促炎细胞因子、趋化因子和糖蛋白的表达水平。相反，用任一VEGF的治疗提高促炎基因的表达水平。然而，将VEGF加入到其各自的IL-10未降低病毒或哺乳动物IL-10限制促炎基因表达的能力。IL-10和组合治疗的伤口中改变的炎症性表达水平有助于减少炎症细胞流入。与用哺乳动物的联合治疗或单独治疗相比，病毒VEGF-E和病毒IL-10的联合治疗在更大程度上减少伤口中IL-6的表达并增加IL-10的表达。考虑到这些关键的调节剂在瘢痕形成中的作用，这些结果支持下述观点：与其它治疗相比，所述病毒组合在更大程度上限制瘢痕形成。
实施例8
用病毒VEGF和病毒IL-10的治疗减少肌成纤维细胞分化
VEGF和IL-10的组合治疗减少肌成纤维细胞分化。将VEGF加入到其各自的IL-10未降低所述病毒和哺乳动物IL-10减少肌成纤维细胞分化的能力。
通过对来自6天后治疗和未治疗的伤口的切片进行肉芽组织中波形蛋白和αSMA的免疫荧光染色来研究病毒或哺乳动物VEGF或IL-10(单独或组合)的重复治疗对肌成纤维细胞分化的效应。如图8A中所示的代表性的切片说明与用VEGF-E、IL-10或VEGF和IL-10的组合治疗的伤口相比，在模拟和VEGF-A治疗的伤口中观察到的由波形蛋白+ve成纤维细胞产生的αSMA的程度。
将肉芽组织中αSMA染色的强度定量。用VEGF-A治疗的伤口具有与模拟治疗和未治疗的伤口(分别为110x 107和109x 107总红色强度，图8B)相似的αSMA染色(99x 107总红色强度，图8B)。然而，当与对照伤口相比时，用VEGF-E治疗的伤口显示αSMA染色显著减少(54x107总红色强度，P<0.05，图8B)。用vIL-10和mIL-10治疗的伤口也显示伤口巨噬细胞数目的显著减少(分别为76x 107和64x 107总红色强度，P≤0.05，图8B)。与模拟治疗和未治疗的伤口(其与用单独IL-10治疗所见的减少相似)相比，用VEGF-E和vIL-10或者VEGF-A和mIL-10治疗的伤口也显示巨噬细胞数目的显著减少(分别为58x 107和55x 107总红色强度，P≤0.05，图8B)。
这些结果证明，用来自哺乳动物的或病毒来源的IL-10的重复治疗伤口减少伤口中肌成纤维细胞分化。用VEGF-A治疗不影响αSMA产生，而VEGF-E确实减少伤口中αSMA产生。然而，将VEGF加入到其各自的IL-10未降低病毒和哺乳动物IL-10减少肌成纤维细胞分化的能力。
实施例9
用病毒VEGF和病毒IL-10治疗增强伤口血管再生
VEGF和IL-10的组合的治疗增强伤口血管再生至与单独的VEGF治疗相似的程度。
通过对来自9天后治疗和未治疗的伤口的切片进行MSB三色染色来研究病毒或哺乳动物VEGF或IL-10(单独或组合)的重复治疗对伤口血管形成的效应。图9A中所示代表性的切片说明在用VEGF(单独或与IL-10联合)治疗的伤口中观察到皮肤血管增加。
皮肤血管形成的程度通过测定新生真皮中血管的面积分数定量，所述新生真皮中血管与各切片的新生真皮上的网格相交。与模拟治疗或未治疗的伤口(面积分数分别为0.067和0.044，P≤0.05，图9B)相比，用VEGF-E或VEGF-A治疗的伤口具有显著增加的血管形成(面积分数分别为0.111和0.098，图9B)。然而，当与对照伤口相比时，用vIL-10和mIL-10治疗的伤口(面积分数分别为0.038和0.054，图9B)在血管形成上未显示显著的变化。与模拟治疗和未治疗的伤口(其与用单独的VEGF治疗所见的增加相似)相比，用VEGF-E和vIL-10或者VEGF-A和mIL-10治疗的伤口(面积分数分别为0.091和0.098，P≤0.05，图9B)在皮肤血管形成上也显示显著的增加。
这些结果证明，用来自哺乳动物的或病毒来源的VEGF重复治疗伤口增加皮肤血管形成。用任一IL-10治疗未调节血管形成。重要地，将IL-10加入到其各自的VEGF未损害所述病毒或哺乳动物VEGF增强伤口血管再生的能力。
实施例10
用病毒VEGF和病毒IL-10治疗加速伤口血管再生
与单独的VEGF治疗相比，VEGF和IL-10的组合的治疗在更大程度上加速伤口血管再生。
通过对切片进行vWF和αSMA的免疫荧光染色以检测肉芽组织中血管的成熟状态来研究9天后，病毒或哺乳动物VEGF或IL-10(单独或组合)的重复治疗对伤口血管形成的效应。成熟的血管壁衬有vWF+ve内皮细胞，其被αSMA+ve周细胞包围，所述αSMA+ve周细胞提供结构支持并调节血管功能。受损的血管成熟与许多人的病症(包括肿瘤形成和糖尿病伤口)有关(Jain等人,Nat Med,9,685-93,2003)。图10A中所示的代表性的切片说明在用VEGF治疗的伤口中观察到增加的皮肤内皮细胞，但是显示在包含IL-10的治疗中血管成熟增加。
将肉芽组织区域内皮细胞的数目定量。与模拟治疗和未治疗的伤口相比(分别为0.42和0.50vWF+ve细胞/1000μM2，P≤0.05，图10B)，用VEGF-E或VEGF-A治疗的伤口(分别为0.68和0.72vWF+ve细胞/1000μM2，图10B)具有显著增加的内皮细胞。然而，当与对照伤口相比时，用vIL-10和mIL-10治疗的伤口(分别为0.51和0.58vWF+ve细胞/1000μM2，图10B)在内皮细胞数目上未显示显著的变化。与模拟治疗和未治疗的伤口(其与用单独的VEGF治疗所见的增加相似)相比，用VEGF-E和vIL-10或者VEGF-A和mIL-10治疗的伤口(分别为0.70和0.75vWF+ve细胞/1000μM2，图10B)在内皮细胞数目上也显示显著的增加。
也检测与周细胞相关的内皮细胞的比例。与模拟治疗和未治疗的伤口相比(分别为0.28和0.25vWF+ve/αSMA+ve细胞/1000μM2，图10B)，用VEGF-E或VEGF-A治疗的伤口(分别为0.34和0.24vWF+ve/αSMA+ve细胞/1000μM2，图10B)在与周细胞相关的内皮细胞上有较小的增加。用vIL-10和mIL-10治疗的伤口(分别为0.38和0.37vWF+ve/αSMA+ve细胞/1000μM2，图10B)在与周细胞相关的内皮细胞上还显示较大的增加。也在用VEGF-E和vIL-10或者VEGF-A和mIL-10治疗的伤口(分别为0.37和0.34vWF+ve/αSMA+ve细胞/1000μM2，图10B)中观察到增加的与周细胞相关的内皮细胞。
将肉芽组织区域内红细胞的数目定量。与模拟治疗和未治疗的伤口相比(分别为1.05和1.31红细胞/1000μM2，图10C)，用vIL-10或VEGF-A治疗的伤口(分别为0.94和0.72红细胞/1000μM2，图10C)在红细胞数目上未显示显著性差异。当与对照伤口相比时，用VEGF-E和mIL-10治疗的伤口(分别为0.46和0.45红细胞/1000μM2，图10C)，在红细胞数目上显示显著的减少。与模拟治疗和未治疗的伤口相比，用VEGF-E和vIL-10或者VEGF-A和mIL-10治疗的伤口(分别为0.46和0.36红细胞/1000μM2，图10C)在红细胞数目上也显示显著的减少。
这些结果进一步证明，用来自哺乳动物或病毒来源的VEGF的重复治疗伤口增加内皮细胞数目，而用IL-10治疗增加与周细胞相关的内皮细胞。将IL-10加入到其各自的VEGF增加内皮细胞数目及其与周细胞的关联，这说明用VEGF和IL-10的组合治疗促进血管成熟，从而加速伤口血管再生。所述结果也显示用VEGF和IL-10治疗伤口减少红细胞渗漏入肉芽组织，这说明组合治疗可限制伤口水肿。
实施例11
用病毒VEGF和病毒IL-10的治疗改变伤口血管再生关键调节剂的时机
用VEGF和IL-10组合治疗有伤口的皮肤改变伤口血管再生关键调节剂的时机。在该实施例中，检测用VEGF及其IL-10组合的治疗效果，以及这些治疗对伤口血管再生和成熟的关键调节剂的效果。在治疗和未治疗的伤口中检测所述治疗对已知调节伤口中血管形成的生长因子和趋化因子以及丝氨酸蛋白酶的表达的效应。
VEGF-A由有伤口的表皮和浸润的巨噬细胞表达。在有伤口的皮肤，VEGF-A的表达在第6天达峰，到第16天返回到无伤口的皮肤的水平(图11-B)。用VEGF-A或VEGF-E治疗伤口进一步增加其表达，而mIL-10和vIL-10减少其表达(图11A)。当用VEGF-A和mIL-10的组合治疗伤口时，在第3天，VEGF-A表达实质上增加。相反，在第3天，在用VEGF-E和vIL-10治疗的伤口中的VEGF-A表达水平低于模拟治疗的伤口，但是然后从第6天增加到高于模拟治疗的伤口(图11A-B)。
PDGF-ββ调节周细胞募集，从而促进血管成熟(Barrientos等人,Wound RepairRegen 16,585-601,2008)。在有伤口的皮肤，PDGF-ββ的表达在第6天达峰(图11C-D)。用VEGF-A或VEGF-E治疗伤口进一步增加PDGF-ββ表达，而mIL-10和vIL-10对其表达有小的到无作用(图11C)。当用VEGF-A和mIL-10的组合治疗伤口时，在任何所测试的时间点PDGF-ββ的表达都未增加，但是在用VEGF-E和vIL-10治疗的伤口中实质上增加，在第3天达峰(图11C-D)。
CXCL4是抗血管生成趋化因子，其通过与血管细胞上的硫酸肝素相互作用来干扰生长因子的作用(Aidoudi和Bikfalvi,Thromb Haemost,104,941-8,2010)。在有伤口的皮肤，CXCL4的表达在第3天增加，然后稳定(图11E-F)。用VEGF或IL-10治疗伤口导致CXCL4表达适度的增加(图11E)。从第3-9天，与模拟治疗的伤口以及VEGF-A和mIL-10治疗的伤口相比，用VEGF-E和vIL-10治疗伤口实质上增加CXCL4的表达(图11E-F)。
激活的蛋白C通过调节基质金属蛋白酶、血管生成素和VEGF表达，来促进血管形成和成熟(Jackson等人,Wound Repair Regen,13,284-94,2005；Minhas等人,FASEB J,24,873-81,2010)。在有伤口的皮肤，蛋白C表达在第3天增加，然后逐渐减少(图11G-H)。用VEGF或IL-10治疗伤口导致蛋白C表达小的到无变化(图11G)。然而，在所有时间点，用VEGF-E和vIL-10治疗伤口实质上增加蛋白C表达，在第3天达峰(图11G-H)。VEGF-A和mIL-10治疗也可在所有时间点增加蛋白C表达，但表达在第16天达峰(图11G-H)。
这些结果证明病毒VEGF-E和病毒IL-10的组合调节血管形成关键调节剂的表达，使得促-和抗血管生成因子的表达的时间线加速，并且，与哺乳动物的组合或单独治疗相比，用病毒组合治疗可在更大程度上增强在有伤口的皮肤中的血管再生和成熟。
实施例12
用病毒VEGF和病毒IL-10的治疗在较少的肉芽组织形成下加速皮肤伤口闭合
与哺乳动物的治疗相比，用病毒VEGF和病毒IL-10的组合的治疗加速皮肤伤口闭合，但是导致较少的肉芽组织形成，这预示瘢痕形成减少。
实施该实施例以证明在用病毒因子治疗的伤口观察到的加速的伤口闭合是否是由于加速的皮肤再生。通过来自在3、6和9天后的治疗和未治疗的伤口的切片的MSB三色染色来研究病毒或哺乳动物VEGF或IL-10(单独或组合)的单次治疗对伤口新生真皮的直接效应。图12A中所示的代表性的切片说明用病毒因子治疗的伤口比对照伤口有更多的皮肤覆盖，而用哺乳动物的因子治疗的伤口具有增加的肉芽组织沉积。
如图12B中所说明，我们通过测定总创面被肉芽组织覆盖的百分比对皮肤闭合定量。到第3天，在用VEGF-E治疗的伤口中，肉芽组织覆盖32％的创面，其显著大于在模拟治疗和未治疗的伤口所见皮肤闭合的百分比(分别为14％和9％，P≤0.05，图12C)。到第3天，与VEGF-A治疗的伤口相比，VEGF-E治疗的伤口还显示显著较高的皮肤闭合水平(16％，图12C)。到第6天，与模拟治疗和未治疗的伤口相比(分别为52％和43％，P≤0.05，图12C)，用VEGF-E治疗伤口继续显著增加皮肤闭合，肉芽组织覆盖74％的创面。在第6天，与VEGF-A治疗的伤口相比(65％，P≤0.05，图12C)，VEGF-E治疗的伤口还显示显著较高的皮肤闭合。到第9天，所有伤口显示100％的皮肤闭合(图2E)。
到第3天，在用vIL-10和mIL-10治疗的伤口中，肉芽组织分别覆盖25％和23％的创面，二者均显著大于在模拟治疗和未治疗的伤口所见的皮肤闭合百分比(P≤0.05，图12C)。到第6天，与模拟治疗和未治疗的伤口相比(分别为52％和43％，P≤0.05，图12C)，用vIL-10治疗伤口继续显著增加皮肤闭合，肉芽组织覆盖70％的创面。在第6天，vIL-10治疗的伤口显示与mIL-10治疗的伤口相当的皮肤闭合水平(66％，P≤0.05，图12C)。与对照伤口相比，用vIL-10和mIL-10二者治疗伤口也显著增加皮肤覆盖，肉芽组织分别覆盖69％和66％的创面(P<0.05，图12C)。
在第3天，与VEGF-A和mIL-10组合治疗的和模拟治疗的伤口相比(分别为28％和14％，P≤0.05，图12C)，VEGF-E和vIL-10的组合的治疗伤口显著增加皮肤的覆盖(46％)。到第6天，与模拟治疗的伤口相比，用VEGF和IL-10的组合治疗伤口显示皮肤覆盖上相似的显著增加，在用VEGF-E和vIL-10或者VEGF-A和mIL-10治疗的伤口中，肉芽组织分别覆盖72％和61％的创面(P≤0.05，图12C)。在第6天，与用哺乳动物的组合治疗的伤口相比，用病毒组合治疗的伤口显示显著更大的皮肤覆盖(P≤0.05，图12C)。整体的在第3天，在用VEGF-E治疗的伤口中肉芽组织的面积为13368μM2，其显著大于模拟治疗和未治疗的伤口的面积(分别为7852μM2和5016μM2，P≤0.05，图12D)。然而，在VEGF-E治疗的伤口中所见的肉芽组织的面积未显著大于VEGF-A治疗的伤口(13047μM2，图12D)。到第6天，VEGF-E治疗的伤口肉芽组织的面积已增加到21067μM2，其与模拟治疗和未治疗的伤口的面积(分别为20116μM2和18255μM2，图12D)相似。在第6天，在VEGF-A治疗的伤口肉芽组织的面积(26663μM2，P≤0.05，图12D)显著大于VEGF-E治疗的伤口。在第9天，在用VEGF-A治疗的伤口肉芽组织的面积的大小已继续增加(57712μM2，图12D)，如同模拟治疗和未治疗的伤口的面积(分别为52100μM2和42372μM2，图12D)。相反，在第9天，在VEGF-E治疗的伤口中肉芽组织的面积此时显著地小于对照和VEGF-A治疗的伤口(33927μM2，P≤0.05，图12D)。
在第3天，在用vIL-10治疗的伤口中的肉芽组织的面积为15419μM2，其显著大于模拟治疗和未治疗的伤口的面积(P≤0.05，图12D)。在vIL-10治疗的伤口中所见的肉芽组织的面积也显著大于mIL-10治疗的伤口(12408μM2，图12D)。到第6天，vIL-10治疗的伤口肉芽组织面积已增加到23986μM2，其与模拟治疗和未治疗的伤口的面积相似(图12D)，但是显著小于mIL-10治疗的伤口的面积(28012μM2，P≤0.05，图12D)。在第9天，用vIL-10和mIL-10治疗的伤口肉芽组织的面积的大小停止增加(分别为30362μM2和31482μM2，图12D)，并且其显著小于模拟治疗和未治疗的伤口的面积(图12D)。
在第3天在用VEGF-E和vIL-10的组合治疗的伤口中肉芽组织的面积(27962μM2，P≤0.05，图12D)显著大于用单个病毒因子或模拟治疗的伤口。相反，在第3天，用VEGF-A和mIL-10的组合治疗的伤口，肉芽组织面积(12004μM2，P≤0.05，图12D)显著地大于模拟治疗的伤口，但是不大于用单个哺乳动物的因子治疗的伤口。用病毒的组合治疗的伤口中肉芽组织的面积也显著地大于用哺乳动物的组合治疗的伤口(P≤0.05，图12D)。到第6天，在用VEGF-E和vIL-10治疗的伤口中肉芽组织的面积大小已减少(23121μM2，图12D)，并且在面积上与模拟治疗的伤口相似。用VEGF-A和VEGF-E治疗的伤口的肉芽组织面积的大小继续增加(24898μM2，图12D)，并且与模拟治疗的伤口相似。在第9天，与用VEGF-A和mIL-10治疗的伤口(分别为25070μM2和32078μM2，P≤0.05，图12D)相比，用VEGF-E和vIL-10治疗的伤口具有实质上较小的肉芽组织面积，但是与模拟治疗的伤口相比，两个组合均具有显著少的肉芽组织。
这些结果证明，用哺乳动物VEGF-A或IL-10(单独或联合)治疗伤口增加肉芽组织沉积和皮肤闭合。与哺乳动物的组合或单独治疗相比，用病毒VEGF-E和病毒IL-10治疗伤口开始在更大程度上增加肉芽组织沉积，然后实质上导致减小的肉芽组织面积，这表明加速皮肤愈合会最终限制瘢痕面积。
实施例13
用病毒VEGF和病毒IL-10的治疗加速肉芽组织重塑
与单独或哺乳动物的治疗相比，用病毒VEGF和病毒IL-10的组合治疗在更大程度上加速肉芽组织重塑(从纤维蛋白到胶原基质)。
实施该实施例以证明用用病毒因子治疗的伤口中观察到的减少的肉芽组织沉积和增强的皮肤闭合是否影响皮肤重塑。使用9天后的伤口的切片的MSB三色染色，对胶原含量定量。染色数据表明用病毒VEGF-E或IL-10治疗的伤口，在肉芽组织伤口中具有增加的蓝色像素染色强度(分别为162和160，图13)，其显著地大于模拟治疗和未治疗的伤口中的胶原染色(分别为156和157，P≤0.05，图13)。与对照伤口相比(72，P≤0.05，图13)，用VEGF-E和vIL-10的组合治疗也显著增加肉芽组织的胶原含量。然而，用VEGF-A或mIL-10治疗伤口几乎未导致胶原含量差异(分别为64和66，图13)，而与对照伤口(150，P≤0.05，图13)相比，所述组合治疗具有显著较小的胶原染色。与用等价的哺乳动物的因子或组合治疗的伤口相比，用各病毒因子或组合治疗的伤口显示胶原含量显著增加(P≤0.05，图13)。用病毒组合治疗的伤口中胶原含量也显著大于用病毒IL-10治疗的伤口(P≤0.05，图13)，并且也实质上大于只用VEGF-E治疗的伤口(P＝0.068，图13)。
这些结果证明，与其它治疗相比，用病毒VEGF-E和病毒IL-10联合治疗伤口在更大程度上增加胶原在肉芽组织中沉积，这支持病毒联合治疗会加速皮肤重塑的观点。
实施例14
用病毒VEGF和病毒IL-10的治疗通过改变皮肤成熟关键调节剂的时机增强肉芽组 织重塑
实施该实施例以评价用VEGF及其IL-10组合治疗对肉芽皮肤闭合和肉芽组织重塑的关键调节剂的效应。在治疗和未治疗的伤口中检测所述治疗对已知调节伤口收缩和肉芽组织更新的因子的表达的效应。
皮肤伤口闭合通过表达αSMA丝的肌成纤维细胞增强，所述αSMA丝紧抓伤口边缘，并自身收缩使伤口缩小(Werner等人,J Invest Dermatol,127,998-1008,2007)。在有伤口的皮肤，αSMA的表达在第6天达峰，并且在所有测试的时间点均保持在无伤口的皮肤的水平以上(图14A)。与模拟治疗的伤口相比，在第6天和第9天，当将伤口用VEGF-A和mIL-10或者VEGF-E和vIL-10的组合治疗时，αSMA的表达实质上减少(图14A)。
由伤口巨噬细胞产生TGF-β1促进成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，其协助伤口收缩和闭合(Chalmers,Int Wound J,8,218-23,2011；Shih等人,Wound Repair Regen,18,139-53,2010)。TGF-β1也可刺激由成纤维细胞的I型胶原合成，并防止其降解。增加的TGF-β1表达似乎与增加的纤维化和瘢痕形成相关。在有伤口的皮肤，TGF-β1的表达从第3-9天增加，并到第16天返回到无伤口皮肤的水平(图14B)。在用VEGF-A和mIL-10的哺乳动物组合治疗的伤口中，TGF-β1的表达开始增加高于模拟治疗的伤口(图14B)。相反，与模拟治疗的伤口相比，用VEGF-E和vIL-10的病毒组合治疗的伤口开始显示TGF-β1的表达减少(图14B)。
已将另一TGF-β亚型(TGF-β3)与减少的瘢痕形成相关联，并且可能用作受体拮抗剂，从而减少胶原沉积(Shih等人,Wound Repair Regen,18,139-53,2010)。在有伤口的皮肤，TGF-β3的表达在第6天达峰，并到第16天返回到无伤口皮肤的水平(图14C)。在用VEGF-A和mIL-10的哺乳动物组合治疗的伤口中，TGF-β3表达开始少于模拟治疗的伤口，但是到第9天实质上较高(图14C)。相反，与模拟治疗的伤口相比，用VEGF-E和vIL-10的病毒组合治疗的伤口中在所有检测的时间点显示TGF-β3表达增加(图14C)。
对于伤口愈合，凋亡是重要的方面，各细胞群(如巨噬细胞和成纤维细胞)一旦其任务完成，将其通过凋亡的方式从伤口部位移除(Shih等人,Wound Repair Regen,18,139-53,2010)。减少的凋亡导致的基质更新失调被认为有助于瘢痕形成。在组织修复期间，p53肿瘤抑制基因为关键的凋亡诱导物。在有伤口的皮肤，P53的表达在第3天减少，在第6天返回到无伤口皮肤的水平，然后到第9天再次减少(图14D)。在用VEGF-A和mIL-10的哺乳动物组合治疗的伤口，p53的表达开始像模拟治疗的伤口一样减少，但是然后在第6天和第9天增加(图14D)。用VEGF-E和vIL-10的病毒组合治疗的伤口也开始减少，但是然后在随后的时间点，与模拟治疗的伤口相比，显示了更实质性的p53的表达增加(图14D)。
随着伤口成熟，肉芽组织的基质从纤维蛋白更新为不成熟的III型胶原，其转化为强化瘢痕的成熟的I型胶原(Olivveira等人,Int Wound J,6,445-52,2009)。在有伤口的皮肤，III型和I型胶原的表达均在第6天达峰，然后到第16天返回到无伤口的皮肤的水平(图14E、F)。在第6天，用VEGF和IL-10的任一组合治疗伤口将III型和I型胶原的表达增加到高于模拟治疗的伤口的水平(图14E、F)。在用VEGF-E和vIL-10的病毒组合治疗的伤口，成熟的I型胶原的增加的表达被维持直到第9天，而在用VEGF-A和mIL-10的哺乳动物组合治疗的伤口中，不成熟的III型胶原的增加的表达被维持直到第9天(图14E、F)。
这些结果证明，用VEGF-E和vIL-10的病毒组合治疗伤口影响基质更新，具有增加的胶原和TGF-β3表达。用病毒VEGF-E/vIL-10组合治疗伤口也似乎增强细胞的凋亡，这表明加速的伤口成熟。哺乳动物组合还增加胶原、TGF-β3和p53在伤口中的表达，但不是用病毒组合所示的程度。病毒组合治疗的伤口似乎有加速的伤口闭合，但是这与αSMA和TGF-β1、参与肌成纤维细胞激活和伤口收缩的关键分子(其在愈合的早期达峰)的减少的表达不一致。然而，可能在组合治疗的伤口中，αSMA的表达可在早于在本研究中检测的时间点达到峰值，这会与加速的伤口收缩一致。
实施例15
用病毒VEGF和病毒IL-10的治疗增强瘢痕消退
与单独或哺乳动物的治疗相比，病毒VEGF-E和病毒IL-10的组合治疗在更大程度上增强瘢痕消退。
在该实例中，瘢痕得自于用病毒或哺乳动物的VEGF或IL-10(单独或联合)治疗的伤口，并将其与未治疗或模拟治疗的伤口的瘢痕比较。
对愈合的伤口拍的照片显示在治疗组之间瘢痕消退的差异，其通过对瘢痕严重性的目视评分以及通过测量内部瘢痕面积定量(图15A)。在第13天，与模拟治疗的伤口相比，用VEGF-E(单独或与vIL-10联合)治疗伤口导致显著减小的外部瘢痕评分(图15B)。在第16天，与模拟治疗的伤口相比，用vIL-10(单独或与VEGF-E联合)治疗伤口导致显著减少的内瘢痕面积(图15C)。用哺乳动物VEGF-A或IL-10(单独或联合)治疗对瘢痕评分或大小有小到无的积极作用。
***
本文中引用的或提到的所有专利、出版物、科学论文、万维网站以及其它文件和材料显示本发明所属领域技术人员的技术水平，且各个这样的引用的文件和材料在此援引加入，其程度如同所述文件和材料已被单独地以其整体援引加入，或在本文中对其完整说明。申请人保留以下权利：向本说明书中加入来自任何这样的专利、出版物、科学论文、万维网站、电子可用的信息以及其它引用的材料或文件的任何和所有材料和信息。
本文中描述的具体方法和组合物为实施方案的代表，并且为示例性的，且不意图作为本发明的范围的限制。在考虑本说明书时，本领域技术人员会想到其它目的、方面和实施方案，并且这包含在如通过权利要求的范围限定的本发明的精神内。以下对于本领域技术人员会是显而易见的：在不背离本发明的范围和精神下，可对本文中公开的发明进行多种取代和改变。本文中说明性地描述的发明可合适地在缺少本文中未明确公开为必须的一种或多种要素，或者一种或多种限制下实施。因此，例如，在本文的各情况下，在本发明的实施方案或实施例中，术语“包括/包含(comprising)”、“基本上由…组成(consistingessentially of)”和“由…组成consisting of”中的任一个在本说明书可用其它2个中的任一个术语替代。术语“包括/包含(comprising、including、containing等)”也理解为可扩展的并无限制地。本文中说明性地描述的方法和处理合适地可以不同的步骤顺序实施，并且它们不一定限制在本文中或权利要求书中说明的步骤顺序。另外，如本文中和所附权利要求书中所使用，单数形式“a”、“an”和“the”也包括复数指代，除非上下文另外明确说明。在任何情况下都不可将本专利解释为限于本文中具体公开的具体实施例或实施方案或方法。在任何情况下都不可将本专利解释为受任何审查员或者其他官员或政府专利部门的雇员作的任何陈述限制，除非这样的陈述被发明人或发明者的代表写的答复中具体地并无条件和保留清楚地采用。
已利用的术语和表述用作描述的术语，而不是限制的，并且不意图使用这样的术语和表述以排除所示和所描述的特征或其部分的任何等价物，但是认识到在请求保护的发明的范围内可进行多种修改。因此，应理解，虽然本发明已通过优选的实施方案和任选的特征进行具体公开，但是本领域技术人员可采用本文中公开的概念的修改和变体，并且认为这样的修改和变化在如通过所附权利要求书所限定的本发明的范围内。
已在本文中广泛地和一般地描述本发明。落入一般性公开内的各较窄的种类和亚类也形成本发明的部分。这包括具有从属中除去任何主题的条件或否定限制的本发明的一般描述，不管删除的材料是否在本文中具体记载。
其它实施方案在所附权利要求书内。此外，在本发明的特征或方面以马库什组的方式描述时，本领域技术人员会认识到本发明从而也以马库什组的成员的任何独立成员或亚组的方式描述。

Claims (27)

1.治疗有效量的血管内皮生长因子-E(VEGF-E)和病毒IL-10用于制备治疗有未按期望速率愈合的伤口的个体的药物的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述VEGF-E为副痘病毒VEGF-E。
3.权利要求1的用途，其中所述病毒IL-10为副痘病毒IL-10。
4.权利要求3的用途，其中所述副痘病毒IL-10为羊传染性口疮病毒IL-10。
5.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述个体遭受选自下列的伤口：急性伤口、延期愈合伤口、不完全愈合伤口、慢性伤口和开裂伤口，并且其中所述药物任选地用于在伤口修复或闭合之前施用。
6.权利要求5的用途，其中所述慢性伤口任选地为糖尿病性溃疡、静脉性溃疡、压力性溃疡、血管炎溃疡或动脉溃疡。
7.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述VEGF-E和病毒IL-10适合向所述个体联合给药或者适合在约相同的时间或顺序地向所述个体分开给药。
8.组合物，其包含有效促进伤口愈合的血管内皮生长因子-E(VEGF-E)和病毒IL-10以及药学上可接受的载体。
9.权利要求8的组合物，其中所述组合物配制为用于经选自局部给药和注射的途径给药。
10.权利要求8或权利要求9的组合物，其为乳膏剂、软膏剂、凝胶剂、乳剂、洗剂、泡沫剂或涂剂的形式，其中当所述组合物为凝胶剂时，所述凝胶剂任选地包含非离子聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物凝胶。
11.权利要求8或权利要求9的组合物，其中所述VEGF-E为副痘病毒VEGF-E。
12.权利要求11的组合物，其中所述病毒IL-10为副痘病毒IL-10。
13.权利要求12的组合物，其中所述副痘病毒IL-10为羊传染性口疮病毒IL-10。
14.制备药物的方法，其包括将单个容器量或分开的多个容器量的有效促进伤口愈合的血管内皮生长因子-E(VEGF-E)和病毒IL-10以及药学上可接受的载体合并。
15.权利要求14的方法，其中所述VEGF-E为副痘病毒VEGF-E。
16.权利要求14或权利要求15的方法，其中所述病毒IL-10为副痘病毒IL-10。
17.权利要求16的方法，其中所述副痘病毒IL-10为羊传染性口疮病毒IL-10。
18.制品，其包含含有治疗有效量的血管内皮生长因子-E(VEGF-E)和病毒IL-10的包装材料以及治疗个体中或个体上的伤口的使用说明。
19.权利要求18的制品，其中所述VEGF-E和所述病毒IL-10包含在单个容器中。
20.权利要求18的制品，其中所述VEGF-E和所述病毒IL-10包含在分开的多个容器中。
21.权利要求18-20中任一项的制品，其中所述VEGF-E为副痘病毒VEGF-E。
22.权利要求18-20中任一项的制品，其中所述病毒IL-10为副痘病毒IL-10。
23.权利要求22的制品，其中所述副痘病毒IL-10为羊传染性口疮病毒IL-10。
24.权利要求18-20中任一项的制品，其中所述个体遭受选自下列的伤口：急性伤口、延期愈合伤口、不完全愈合伤口、慢性伤口和开裂伤口，并且其中所述制品任选地用于在伤口修复或闭合之前施用。
25.权利要求24的制品，其中所述慢性伤口任选地为糖尿病性溃疡、静脉性溃疡、压力性溃疡、血管炎溃疡或动脉溃疡。
26.权利要求18-20中任一项的制品，其中所述VEGF-E和所述病毒IL-10配制用于通过注射给药。
27.权利要求18-20中任一项的制品，其中所述VEGF-E和所述病毒IL-10配制用于局部给药。
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