CN1043741A - 新的受体、其鉴定、定性、制备和应用 - Google Patents

新的受体、其鉴定、定性、制备和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN1043741A
CN1043741A CN89109772A CN89109772A CN1043741A CN 1043741 A CN1043741 A CN 1043741A CN 89109772 A CN89109772 A CN 89109772A CN 89109772 A CN89109772 A CN 89109772A CN 1043741 A CN1043741 A CN 1043741A
Authority
CN
China
Prior art keywords
acceptor
dna
superactivation
hormone
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN89109772A
Other languages
English (en)
Inventor
罗纳德·马克·埃文斯
斯坦利·马克·霍伦堡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Salk Institute for Biological Studies
Original Assignee
Salk Institute for Biological Studies
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Salk Institute for Biological Studies filed Critical Salk Institute for Biological Studies
Publication of CN1043741A publication Critical patent/CN1043741A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C07K14/721—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/743—Steroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/71—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16
    • C07K2319/715—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16 containing a domain for ligand dependent transcriptional activation, e.g. containing a steroid receptor domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
    • C07K2319/81—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor containing a Zn-finger domain for DNA binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/723—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Abstract

本发明公开了新的激素和类激素受体，其中超活化转录区从位置和/或拷贝数上说是被修饰了的，或者与亲代受体相比这些新的受体具有高得多的超活化转录激活特性。另外还公开了制备这些受体的重组方法及工具，以及基于使用这些受体以筛选和鉴定假定材料的检测法，所说的假定材料可影响这些受体和/或通过诱导了异源基因或DAN产物的转录来影响其表达。

Description

参考文献为专利合作条约国际申请WO88/03168号和欧洲专利申请EP0325849号。这些已公开的申请涉及各种激素受体及其组合物、其制备和应用，特别是在新的检测系统中的应用。这些已公开申请的完整说明书均列为本文参考文献。
本发明总地涉及某些具有转录超活化区（transcription        trans-activation        domains）功能的多肽顺序的鉴定和定性、其制备及应用，特别是涉及其在制备新的细胞内激素或类激素受体如类固醇受体多肽、甲状腺素多肽和类视黄素（retinoid）多肽（包括人的）中的应用，其优点是通过提高该区域的影响来提供超活化转录起始活性。
具体地说，本发明涉及这样一些新的受体多肽，其中转录超活化区的作用已得以提高，从而可产生比亲代分子有高得多的转录起始活性的新分子。
就有关这类转录超活化分子的制备来说，包括编码该分子的新的DNA分离物和转录超活化区，以可操作方式携带这些DNA顺序的表达载体以及用该载体转染的宿主，均包括在本发明的范围之内。
更具体地说，本发明涉及用本发明的新型转录超活化激素或类激素受体筛选各种假定存在的、对本发明之新型激素或类激素受体有结合亲和性的物质。在一优选实施方案中，本发明提供了在一个增强了的超活化系统中筛选这些假定存在之物质如类固醇受体拮抗剂和对抗物的方法。
上面引述的专利申请公开了各种激素和类激素受体的特性及制备，它们包括以糖皮质激素、盐皮质激素、甲状腺素、相关类视黄素等为代表的类固醇、甲状腺素和类视黄素受体，特别是糖皮质激素、雌激素、醛固酮及视黄酸受体。这些特异受体已成为许多研究工作的课题，并构成了这些专利申请之主题内容的基础。同样，现有科技文献也将报导的重点转向上述各种特异性受体。
众所周知，糖皮质激素受体属于配基依赖性转录因子的一个大族，本身对于体内平衡、生长和发育有着不同的作用。比较编码这些受体的互补DNA并对它们的编码顺序作突变分析，已鉴定了分子内某些分别与DNA结合，激素结合及核定位有关的功能性区域（参见Evans        et        al.，Science，240，889（1988））。就糖皮质激素来说。所谓DNA结合区约跨越66个氨基酸，该区域在各种属间是高度保守的，而且发现其对于活化转录过程是不可缺少的（Hollenberg，et        al.，Cell，49，39（1987）;Miesfeld        et        al.，Science        236，423（1987）;Danielsen，et        al.，Mol.Endo.1，816（1987）;Kumar，et        al.，Cell        51，941（1987）;Gronemeyer，EMBO        J.6，3985（1987）;and        Waterman，et        al.，Mol.Endo.2，14（1988））。已发现该区域包含9个不变的半胱氨酸残基，虽然尚不知道各半胱氨酸残基对总体功能的贡献，但已有人报导这些半胱氨酸残基可与两个锌离子配位形成两个可与DNA结合的所谓指纹区，该区域可产生据信与其定位及同必需DNA位点结合有关的三元结构（Klug，et        al.，Tr.Biochem.Sci.12，464（1987）;Bens，et        al.，Cell        52，1（1988）及Evans，上述文献）。
业已证明，在远离DNA结合区的羧基末端附近是所谓配基结合区，其能够在没有激素存在的情况下阻断受体的活性。因此，必要激素的存在可解除受体对活性的抑制。已发现删除这个区域可产生非激素依赖性转录激活因子（Godowski，et        al.，Nature        325，365（1987）;Hollenberg，et        al.，上述文献;Kumar，et        al.，上述文献;Danielsen        et        al.，上述文献;Adler        et        al.，Cell        52，685（1988））。
与这两个区域相反，对于接近DNA结合区氨基末端区域顺序的结构，特别是功能还了解甚少。在各种受体中，这个区域的大小和组成是变化很大的（见Evans，上述文献），它可能对受体功能的异质性有贡献（Kumar        et        al.，文献同上;Tora        et        al.，333，185（1988））。
尽管作了深入的分析（其中有些已在科技文献中报导），但对于决定转录起始之超活化作用的区域仍不甚明确。可将超活化区定义为这样的多肽区域，即当其与DNA结合功能性区合并时，可通过RNA聚合酶提高有效转录起始作用（Sigler，Nature        333，210（1988）;Brent        et        al.，Cell        43，729（1985）;Hope        et        al.，Cell        46，885（1986）;Ma        et        al.，Cell        48，847（1987）;Ma        et        al.，Cell        51，113（1987）;Lech        et        al.，Cell        52，179（1988）;Hope        et        al.，Nature        333，635（1988））。
以前通过连接子扫描诱变（Iinker scanning muta-genesis）对人糖皮质激素受体所作研究，已鉴定了两个有转录活化作用的DNA结合区以外的区域，并分别定名为T1和T2（Giguere et al.，Cell 46，645（1986））。这些实验室所作的进一步研究还表明超活化和DNA结合功能的共定位（Hollenberg et al.，上述文献;Miesfeld et al.，上述文献;Danielsen et al.，上述文献;Waterman et al.，上述文献）。总之，关于这个课题的研究工作给人这样一个印象，即作为有不同区域的典型分子，其各有关区域分别与已鉴定的配基结合、DNA结合及超活化转录作用有关。然而，迄今对决定超活化活性的区域尚未充分认识。因此，现有研究工作的缺欠即在于没有对类固醇受体的动力学性质以及各个区域如何通过配基结合来发动并通过启动子特异性超活化作用来完成该级联过程给予足够的重视。
另外，虽然以前已鉴定了功能性“区域”，但对于哪些氨基酸决定分子本身的特异活性问题却没有作深入研究。以前对类固醇受体超活化区的鉴定只是根据在删除或插入诱变后失去活性而证明的，而没通过反映功能优势的检测来进一步证实这些区域本身所具有的特性。
Godowski等人（Science        241，812（1988）报导的结果显示，糖皮质激素受体除了含有与糖皮质激素反应元件交迭的结合区和第二个占据受体氨基末端附近的区域外，还至少含有一个“增强区”。另外Webster等人（Cell        54，199（1988））报导了雌激素和糖皮质激素受体的可诱导的转录活化功能，他们推测这些激素区域（即配基和DNA结合区）的相关位置对于受体的转录诱导活性并不是很重要的。这些研究者承认，他们没有确定他们称作激素可诱导之活化区的确切定位和性质，对于这些区域的特征及在超活化潜能中的作用也未作进一步探讨。
作为本发明的起始点，Giguere等人（上述文献）通过检测转录活性证明，当在分子的几个位置上完成随机位点特异性诱变时，即出现糖皮质激素受体活性的丧失。进而Hollenberg等人再次证明当缺失这些区域，即从分子中除去这段氨基酸时可使转录活性完全丧失。
本发明的目的是鉴定和定性这些与超活化转录活性有关的区域，确定这些区域的氨基酸组成和顺序，进而弄清这些区域与给定受体之DNA结合和配基结合区间的相互关系，最后通过操作这些已被鉴定和定性的超活化转录区获得有关知识，从而得以提高给定受体的整个转录活性。
因此，本发明基于对超活化转录活性区的深入了解，提供了经过修饰的新的激素或类激素受体，从而可产生较亲代分子有更强活性的新的导源受体。本发明的一个目的就是提供增加了超活化转录活性，同时具有从各不同受体“借用”之DNA结合和配基结合区的新的异源或杂合受体。本发明的另一个目的是提供新的检测法，借以筛选假想的受体拮抗剂或对抗物，并估计其潜在的商业价值（参见Ptashne，Nature        335，683（1988））。
本发明是基于鉴定分离和定性细胞内激素或类激素受体多肽的超活化转录区，得以从物理性质和生物学功能及其各区域的作用来区别受体本身的特性。而这些资料本身则可产生经操作的重组系统，用于制备提高了转录活化性能的新的受体。
基于本文提供的数据，已测得受体含有位置上独立且功能上自主的超活化转录区。因此，本发明所提供的新的激素或类激素受体中存在具有可提高活化转录过程之能力的超活化转录区。本发明的这类新的受体含有亲代分子所没有的超活化转录区，其位置正好适于进一步提高转录活性。这些新的受体可以是杂合的，即其中的DNA结合区和配基结合区可以来自相同或不同类和/或种的受体。
本发明还涉及使用这些新的受体，以在体外生物检测假想的受体或激素或类激素材料的功能特性。就生物检测系统来说，其可以用一组或多组试验材料来攻击其新的受体，这些材料可具有假设的激素或类激素活性，可潜在地调节所说受体的生物学功能，并在体外监测所说材料对所说受体的影响。
本发明还涉及通过重组DNA技术制备这类新受体的各个相关方面，包括由编码所说受体或其超活化转录区的顺序构成的重组DNA分子或cDNA分子，携带这些DNA分子（包括可在适于表达的选择的表达宿主内工作的表达控制元件）的必要表达载体，以及用这些功能性表达载体转化了的重组宿主细胞。
本发明还涉及诱导编码受体分子及其他想要的异源多肽之DNA表达的方法，其包括借助一个由新的受体和能结合所说受体的相应配基所形成的复合物，在体外诱导编码所说多肽之DNA的转录，其中所说的受体和所说的编码多肽的DNA是通过在转染的细胞宿主系统中重组表达而产生的。
因此本发明包括作为多肽的激素或类激素受体，该受体借助其可与所说启动子之DNA顺序反应元件结合的固有能力，或借助其能与结合所说DNA顺序反应元件之其他多肽相联系的能力，而得以具有比其相应亲代受体更大的超活化转录活性。
本发明涉及重组DNA技术中与利用激素或类激素受体的特性生产DNA分离物相关的所有方面，包括生产可交叉杂交的DNA分离物、设计其表达载体、转染相关宿主等，本发明还涉及利用上述资料设计携带足以使细胞或细胞系产生受体之遗传信息的细胞或细胞系的方法，从而可将它们用于表达系统或体外分析法中，以检测相应的假定配基的活性。
图1显示已对其亲代分子超活化转录区（tau1）进行了修饰的各种人糖皮质激素受体（hGR），其鉴定及转录活性。图解以野生型hGR（Wt）和taul突变型为代表。功能性区域分别用影线（tau1）、点刻线（DNA结合区）或“DEX”（激素结合区）表示。所给上述每个受体数字用于限定氨基酸位置。粗直条用于鉴定插入片段的边界。除活性后面标有“C”的受体（其为结构上有活性的）外，均使用10-7M地塞米松（相应的类固醇）以MTV-LUC测定相关的荧光素酶报导分子活性。
图2显示了各种tau2受体的荧光素酶活性。顶上是野生型hGR。用实心矩形表示由氨基酸526到556的tau2区域。用实心矩形（tau2）表示取代的tau1区域并用影线矩形表示两亲性α螺旋（“aah”）。当不依赖于激素时，在10-7地塞米松存在下用MTV-LUC测得的相对荧光素酶活性后面标有“C”。星号指示被剪切分子之氨基酸末端部位。
图3显示因加入tau1区而增加了超活化转录活性的糖皮质激素-甲状腺激素受体之杂合类固醇受体的构建。编码氨基酸77到262（tau1编码区）之人糖皮质激素受体cDNA的片段在相当于氨基酸21的位置上（以一个或多个拷贝）被插入到大鼠α甲状腺激素受体cDNA中。亲代受体是rTRα，其具有一个在氨基端的唯一BstEⅡ位点插入的BamHⅠ连接子。用TRE-CAT将构建体转染成CV-1细胞并在有或没有T3的情况下检测CAT活性。
图4显示对hGR        DNA结合区的点突变分析。其中给出了hGR        DNA结合区的氨基酸顺序。各条线代表由分离的外显子编码的信息。在hGR顺序下面标示出类固醇激素受体家族的相符顺序（Con），其中分别标示了未突变的（黑体）、保守的（标准体）和非保守的（点线）氨基酸。顶上加有园圈的是转化成赖氨酸的氨基酸。用MTV-CAT检测突变型的转录活性并与hGR-SV相比较，结果分别为大于10%（实心圈）、1%至10%（半实心圈）和小于1%（空心圈）
用一或三字母表示的氨基酸分别是：
ASP        D        天冬氨酸        Ile        I        异亮氨酸
Thr        T        苏氨酸        Leu        L        亮氨酸
Ser        S        丝氨酸        Tyr        Y        酪氨酸
Glu        E        谷氨酸        Phe        F        苯丙氨酸
Pro        P        脯氨酸        His        H        组氨酸
Gly        G        甘氨酸        Lys        K        赖氨酸
Ala        A        丙氨酸        Arg        R        精氨酸
Cys        C        半胱氨酸        TrP        W        色氨酸
Val        V        缬氨酸        Gln        Q        谷氨酰胺
Met        M        蛋氨酸        Asn        N        天冬酰胺
所制得的类固醇受体1）以蛋氨酸作为第一个氨基酸（借助结构基因前面的ATG起始信号密码子插入而给出的），或2）蛋氨酸在有其普通第一个氨基酸的细胞内或细胞外被裂解，或3）与其信号多肽或连接的蛋白质而不是其通常信号多肽在一起，该信号多肽或连接物可在细胞内或细胞外环境中被特异地切断。所有这些情况下产生的受体均有其不同的形式，然后即可回收并根据使用目的纯化之（见上述文献）。
本发明的“激素和类激素受体”包括已公开的可在种间进行交互杂交的受体，特别是哺乳动物受体以及同种或可杂交之不同种的相关（如同一基因族）受体，种间杂交可借助对DNA的分离与定性并使用交互杂交技术由所说的特异受体得到，或可用已知方法借助与抗决定基抗体之间的交叉免疫反应性鉴定得到。本发明的受体还包括所有与上述者有等同功能的受体，包括种间或种内受体，其中DNA结合和/或配基结合区已彼此交换，或有一个或多个氨基酸与相应亲代分子不同，或者呈糖基化和/或磷酸化型式，或呈结合的构象结构。
“表达载体”包括能表达其中所含DNA顺序的载体，这些顺序可操作地连接到能影响其表达的其他顺序上。虽然没有明确指出，但不言而喻，这些表达载体可在宿主生物体内作为游离基因或染色体DNA的整合部分进行复制。“可操作的”或类似提法，是指各相关DNA顺序是适用的，即可为达到其目的而工作的。总之，“表达载体”给出了一个功能性的定义，且包括任何能影响其所包括之特定DNA顺序表达的DNA顺序。一般说来，重组DNA技术中适用的表达载体常常是呈“质粒”形式的，即呈环形双链DNA形式的，当其作为载体时是不与染色体结合的。本说明书中，术语“质粒”或“载体”可以互相代替，因为质粒是最常用的载体形式。但本发明还意欲包括功能上等同的其他形式的已知表达载体。
本发明的新颖性除包括用重新定位或放大的方法来操作亲本类固醇受体的超活化转录区之外，本发明的新的类固醇受体还在一个或多个氨基酸上与亲本类固醇受体有所不同，而这种差异并不会导致基本类固醇受体活性或生物学功能的破坏。
“重组宿主细胞”是指已用重组DNA技术构建的载体转染的细胞。
“外在支持培养基”包括维持细胞生长或维持细胞存活从而使之完成其新功能的已知或新设计的培养基（如参见ATCC        Media        Handbook，Ed.Cote        et        al.，American        Type        Culture        Collection        Rockville，MD（1984））。适用于哺乳动物细胞的生长支持培养基最好含有血清添加物（如胎牛血清）或其他通常利于细胞生长和分化的添加成分。如动物肉或乳的水解物、组织或器官提取物，浸渍的凝血块或其提取物等。其他适用的培养基成分包括转铁蛋白、胰岛素及各种金属元素。
本文公开的载体和方法适用于各种原核和真核生物宿主细胞。
除了上面讨论的和已有文献中的各种参考资料外，为完成本发明的基本技术操作还可参阅分子生物学的教科书，如Maniatis等，Molecular        Cloning：A        Laboratory        Manual（Cold        Spring        Harbor        Laboratory，New        York，1982）及其中列出各种参考文献，特别是Colowick等人的Mothods        in        Enzymology        Vol.152，Academic        Press，Inc.（1987）。本文引用的所有出版物均列为本文参考文献。
上面的描述和下列的实验细节均具体介绍了本发明人在鉴定、定性和制备特定受体中最先使用的方法学。本领域技术人员将会理解到，由于本发明所提供的有关特定受体的定位和超活化转录区的构建，以及如何用于产生新的受体等信息，将使他们不必再去重复进行这些方面的工作，而可以选用其他适用、可靠和已知的方法，利用与本发明相似的或其他适用的表达载体及培养系统，合成编码特定新受体的基本DNA顺序。因此，除了提供实际使用的具体细节外，本发明还可使人们利用本领域内已知的方法再生产那些已公开的特异受体，其他受体和其片段。所有这些方法均包括在本发明的范围之内。
本发明拟以糖皮质激素受体作典型实例，并以其作为基础制备包括糖皮质激素受体与其他受体如甲状腺素受体之杂合体在内的新的经过修饰的实体，其中特别是利用了DNA结合区与配基结合区的交换来制备这些杂合体。在每个例子中，本发明实质，即重新定位和/或放大超活化转录区以制得较亲代分子提高了超活化转录活性的新受体，均是使用糖皮质激素受体作为亲代或其杂合分子通过比较这些新的超活化转录区修饰的变体而加以说明的。
因此，本领域内已知的这些受体，不管是野生型的、杂合的、或其功能等同物，均可作为起始材料用于本发明对超活化转录区的修饰。
实施例
下列实施例中使用的实验材料和方法：
定点诱变和转录活化
为了系统地限定DNA结合区在受体功能中的作用，对该保守区进行了广泛的位点特异性诱变研究。基于试验个别氨基酸的作用，所以这种方法有可能确定是否影响超活化的突变型与影响DNA结合的突变型无关。
图4中给出了hGR        DNA结合区的顺序，其后是类固醇激素受体家族的相符顺序。在该家族的成员中，这个区域含有20个不变的和12个保守的残基。所有未变异的氨基酸，以及8个保守的和8个非保守的残基均可变为赖氨酸。检测了刺激由GR-反应性MTV启动子开始之转录过程的能力，以及体外与糖皮质激素反应元件（GRE）DNA片段形成特异结合的能力。
表1中给出了用MTV-CAT测得的各突变型的类固醇依赖性转录增加作用，并在图4中标示了上述各改变的氨基酸。所有活性均是相对于野生型受体hGR-SB的活性，其产生的平均诱导作用约为1，000倍。因此，即使1%的残留活性也是有意义的。列于表1中的缺失突变型△420-451和△450-487，分别除去了第一和第2等分部份的DNA结合区，破拆线相当于人盐皮质激素和鸡黄体酮受体cDNA内的外显子-外显子边界区。两者均没有可测知活性表明，单用每个“指纹”都不足以活化。
甘氨酸定点突变型中，改变了9个未变异半胱氨酸残基之一时均可破坏活性，这与它们对于功能极为重要的观点是一致的。在431位上的一个附加的、非保守的半胱氨酸对于功能则不是必需的。令人惊异的是，其余24个甘氨酸突变型中只有5个是完全无活性的。这5个非功能性等位基因都是未变异的残基，此提示它们参予了总的DNA结合，而没有参予决定顺序特异性。但并不是所有未变异的残基对功能都很重要。例如，当天冬氨酸426转化成甘氨酸时就几乎没有失去活性。8个变成甘氨酸之带有保守氨基酸的突变型中，有7个是功能性的，而且其中有一半仍保留40%以上的活性。相似地，在DNA结合区内非保守氨基酸的突变并没有产生小于10%活性的受体，而且一般都几乎没有降低功能。因此，尽管有某些明显的例外，但当转化成甘氨酸时，氨基酸的保守性和功能丧失的程度之间仍存在密切的相互关系，同时所有未变异的半胱氨酸对功能均起着重要作用。
表1hGR甘氨酸突变型之转录活性
与DNA结合的比较
hGR突变型 相对CAT活性a体外相对DNA结合b
hGR-SB        100        100
△420-451        ＜1        1
△450-487        ＜1        1
G421        ＜1        ＜1
G423        ＜1        ＜1
G424        ＜1        1
G426        75        75
G431        80        10
G432        10        30
G433        2        1
G437        20        8
G438        ＜1        ＜1
G441        ＜1        ＜1
G442        ＜1        60
G444        ＜1        1
G445        ＜1        ＜1
G446        40        6
表1（续）
hGR突变型 相对CAT活性a体外相对DNA结合b
G447        ＜1        2
G450        60        50
G453        90        60
G455        80        6
G457        ＜1        2
G460        55        90
G462        80        40
G463        ＜1        1
G465        1        1
G467        40        6
G470        3        4
G471        10        6
G473        ＜1        ＜1
G474        60        95
G476        ＜1        ＜1
G477        ＜1        1
G479        65        40
G480        90        50
G481        ＜1        3
G486        10        1
a.在CV-1细胞中用MTV-CAT检测活性;
b.DNA结合的检测法如Hollenberg等人（1987）所述，其给出的数值是由总免疫沉淀数得到的，但其反映了用凝胶电泳法测得的特异性结合量。
点突变型的体外DNA结合
在转录检测法中测得的CAT活性是多种特殊功能的总合，这些功能包括核定位、DNA结合二聚合和可能的变构过程以及最终导致活化的蛋白质-蛋白质相互作用。如果一个以上的基本功能是由DNA结合区编码的，则某些非功能性点突变仍可保留其结合DNA的能力，但没有活化。为了探讨这种可能性，通过将相应的表达载体转录到COS-1细胞中以产生各种突变型蛋白质，并检测其在粗提物中与放射标记的DNA形成特异性DNA-蛋白质复合物的能力。表1中给出了各突变型在这种免疫沉淀DNA结合检测中的活性;所示数值代表GRE片段的特异性结合。总的说来，体外活化转录过程的能力与结合DNA的能力之间具有密切关联。那些DNA结合活性明显低于转录活性的突变型，如G446、G445、G467和G486在体外可能是不稳定的。就这些突变型测得的转录活化在细胞内与DNA发生特异性相互作用的结果，因为由MTV启动子删除GRE可消除它们的活性。
只有一个突变型，即G442，其直接跟在第一个假定指纹后面的赖氨酸转化成了甘氨酸，从而失去了有效地刺激转录作用的能力，而保留着体外对DNA的亲和性。对与非特异性顺序有关之GRE的结合特异性只受到了很小的影响，此表明其活性的急剧丢失并不是由于在体内无能力结合启动子顺序。这是一个值得注意的突变型，因为它提示DNA结合对于活化作用是不够的。也许G442能防止在初级蛋白质-DNA相互作用之后发生次级作用，如变构改变。尽管这是一个例外，但这些结果证明富半胱氨酸的66氨基酸区域包含了DNA结合区。实际上，虽然DNA结合对于超活化作用是不可缺少的，但这一功能必须定位在受体的其他区域中。
就实用性来说，G442具有特殊的重要性，因为它是唯一已制得的没有产生活性但仍显示有DNA结合能力的突变型。可以期望设计一种检测法，以利用G442和I550＊的特性。I550＊完全没有配基结合区，因此对是否存在激素均没有反应。针对特异性配基结合位点的激素可解除对作为超活化转录因子之分子的抑制作用。缺少该区域即意味着I550＊在有或没有类固醇的检测系统中总是能产生活性。另外，G442在有或没有类固醇的同一检测系统中将总是无活性的。如果设计一个既有受体G442还存在受体I550＊的适当检测系统，则单单由于I550＊的贡献，最初活性将是100%。当向系统内加入一种适当类固醇时，活性将逐步趋于零。如将假定的拮抗物和适当的类固醇一起加入，则将由于拮抗物干扰类固醇的作用而恢复活性，从而降低总活性并将看到活性回跳。
GAL4/hGR嵌合体
如果DNA结合和T功能是真正可分离的，则有可能用非受体DNA结合区取代hGR        DNA结合区，以产生具有新的启动子特异性的杂合激活因子蛋白质。为检验这种可能性，用酵母GAL4的前74个氨基酸取代hGR富半胱氨酸区域。这些GAL4氨基酸对于顺序特异性DNA识别是足够的，但是没有转录活化能力。超活化能力有赖于DNA结合区以外的部分，并且是在蛋白质的两个分离区域内编码的。因此，为了产生功能性转录因子，GAL4        DNA结合区与hGR之间的融合必须包含由hGR贡献的超活化功能。
为检测hGR-GAL4杂合体的功能，须由MTV-CAT构建-GAL4反应性启动子，即△MTV′-GAL-CAT。用合成的GAL4结合位点置换GRE顺序，可使该融合基因成为GR非反应性的和GAL4可诱导的。当检测hGR和GAL4对该启动子的活化作用时，hGR不能对该启动子产生可测知的刺激作用，而GAL4则能使CAT表达相对于对照表达载体增加约20倍。这一结果与以前关于GAL4能在较高等真核细胞内发挥功能的报导是一致的。GAL4的刺激作用显然是通过GAL4合成结合位点介导的;删除这个位点将使启动子对GAL4没有反应。
检测了GAL4        DNA结合区和潜在hGR活化区之间的融合，以了解这些融合是否有刺激GAL4反应性受体的能力。为了证明hGR        DNA结合区对于该杂合体的活性是不必要的，用GAL4        DNA结合区置换hGR        DNA结合区，以产生杂合体GgalG（hGR，包括氨基末端（G-）、DNA结合区（G）和羧基末端（G），即分别表示为G-G-G，用GAL4的DNA结合区取代hGR的DNA结合区即产生G-gal-G）。所得到的激素依赖性杂合体显然可在没有hGR        DNA结合区存在的情况下发挥功能，并可在该检测系统中真正用作比GAL4能力更强的转录因子，当加入激素时可使CAT活性增加500倍。意想不到的是，GgalG也能刺激没有GAL4结合位点的△MTV-CAT，但活性只有对△MTV-GAL-CAT所测活性的5%。质粒△MTV-AT可含有一个隐蔽的GAL4识别位点，只有用较强的GgalG活化因子而不是较弱的GAL4才能展示之，实际上，活化作用并不依赖于GAL4        DNA结合区;GgalG对△MTV-CAT是有功能活性的，而GGG则没有。
因为单单GAL4        DNA结合区是无活性的，所以必须用hGR的氨基或羧基末端区域测定GgalG的超活化能力。因此，须对每个hGR区分别试验其对补体GAL4        DNA结合功能的能力。两种杂合体均因有Ggal（△）所展示的结构活性而成为功能性的，而（△）galG则须完全依赖于激素。可见，hGR的N末端和C末端中包函了自主的超活化功能，尽管也受到了不同的限制。
重排和部分复制的hGR突变型
与GAL4 DNA结合区的融合证明了hGR氨基端420个氨氨基酸和羧基端300个氨基酸中存在不同的超活化性能。用MTV-CAT的荧光素酶衍生物，即MTV-LUC检测具有tau1复制之hGR的突变型。用MTV-荧光素酶融合基因和MTV-CAT测得的活性值对以前描述的缺失突变型是等同的。图1显示了一系列T1突变衍生物及它们相对于野生型受体的荧光素酶活性。没有T1将使活性降低到5%，而作为“超”受体的随机复制突变型GR11则具有310%活性。突变型GR12、GR14、GR17和GR18显示τ1在DNA和激素结合区域之间，以及在DNA结合区的氨基端可发挥功能，在各种情况下均能产生激素依赖性活化因子（图1）。这一事实表明了受体结构的显著柔曲性。正如图1中以GR13和GR14衍生物，以及GR15与I515＊和GR16相比较所显示的，T1增加活性的能力与氨基和羧基末端无关。鉴于GR18相对于GR14活性大4倍，故可认为氨基末端中的所有超活化能力不是由T1区导致的。另外GR15中缺失T1和羧基末端后只剩余1%活性，缺失大部分氨基末端可消除10倍诱导作用（见图2，GR15与GR26的比较），这些现象均支持上述看法。
具有潜在超活化特性的第二个区域是T2，定位在激素结合区的近氨基末端处（氨基酸526-556）。该区域的18氨基酸部分中有5个带负电荷的残基并与受体活性有关，剪短突变型I550＊和I515＊的活性差2倍（图3）。为了确定是否T2构成活化因子区，而将其导入T1位置或与之相邻的位置。图3显示当该区域被导入与T1无关的氨基末端时，活性增加3倍（GR20与“Wt”比较，GR21与△77-262比较）。第二个拷贝又使活性增加2倍，从而一对T2总的使活性增加6倍（GR22）可见，同T1一样，受体中T2的位置是可变的，其活性是累加的，而且其功能是由其结构特征决定的（如GR25）。
使用含有20%酸性残基的合成的两亲性α螺旋（“aah”）构建了与T2突变型GR21和GR22相似的构建体，并证明在酵母GAL4的相关顺序中具有超活化特性（Giniger et al.，Nature 330，670（1987））。“aah”顺序的大小和带电特性与T2区相似，这就促使我们进一步去研究其在hGR结构中的潜在活性。结果确实观察到具有单个或多个T2与aah拷贝的突变型在活性上有相似的增加（图3，GR21与GR23、GR22与GR24比较），从而提示这些区域可能执行等同的功能。这些结果支持并扩展了关于超活化区之调制性质的看法。
超活化（T）区
我们按照下述两条标准限定了个别的hGR超活化区，缺失降低活性和复制增加活性。根据这些标准，受体分子中200和30氨基酸的两区域编码超活化功能。这两个区域的定位并不排除hGR内附加活化因子顺序的作用。除了这两个区域都有酸性氨基酸外，检查T1和T2的一级结构没有显示任何明显的同源性。这个性质是值得注意的，因为酵母转录因子GAL4和GCN4中的活化区虽然没有明显的顺序同一性，但两者都富含酸性残基。这种明显的相似性并不证明GAL4、GCN4中已被鉴定的任何活化区域，或者糖皮质激素受体是通过一个共同机制起作用的，尽管看起来有这种可能性。由于观察到合成的两亲性α螺旋（“aah”）顺序可从功能上取代T2并在一定程度上取代T1，故进一步支持了有共同机制的可能性。由于T1、T2和酵母活化顺序缺乏明显的顺序和大小相关性，故认为超活化功能可能包函于DNA结合之蛋白质表面上带负电荷残基的“净结构”中。
hGR调制性
hGR的调制性质不仅仅是根据比较类固醇受体家族内各成员的一级结构，而且还根据交换功能区以产生新的嵌合活化子的能力而认识的。已用人雌激素受体的DNA结合区（Green et al.，Nature 325，75和Chambon，（1987））以及与GAL4的无关DNA结合区取代了hGR的DNA结合区。因为它能够在氨基末端发挥作用，所以其位置并不是很严格的。此外，可用T1和T2的氨基或羧基末端取代DNA结合区而不损害这些区域的功能。与调制性质相符，T1和T2的位置是不严格的，而且它们的多聚化可提高受体功能。从而，我们便能够产生活性比野生型受体高4倍，或改变了DNA结合特异性的受体。杂合受体仍是可用激素诱导的，这表明存在着一种非特异性机制，从而使激素结合区对分子的其余部分施加配基依赖性影响。有关实验细节和讨论如下：
质粒和定点突变型的构建
使衔接子扫描突变型I532和I403S之间在ClaI位点处进行重组，以产生质粒hGR-SB（Giguere et al.，Cell 46，645（1986））。1403S是通过将SstI连接子5′GATCGAGCTCGC 3′导入BamHI位点而得到的。该hGR衍生物是得到所有点突变型的母体，并可在DNA结合和转录活化功能上区别于野生型受体。为了使hGR-SB的所需密码子转化成编码甘氨酸的密码子，首先将质粒hGR-SB的400核苷酸SsTI/BamHI片段导入M13mp18，以产生单链模板。之后按标准技术用合成的13-15碱基寡核苷酸使所需的密码子改变成GGN，再将改变了的SstI/BamHI片段重新导入hGR-SB中。用较长的寡核苷酸（20mers）产生缺失△420-451和△450-487;给出的氨基酸位置限定了缺失接合点上的未缺失的残基。使用碱变性方法（Hattori et al.，Anal.Biochem.152，232（1986））由双链质粒DNA直接测定突变型顺序，然后进行合成hGR引物的链终止。
可按下述方法制得报导质粒MTV-CAT及其缺失衍生物△MTV-CAT。首先破坏pBLCAT 2（Luckow et al.，Nucl.Acids Res.15，5490（1987））以产生pTkCAT-H。然后用BamHI/Bg1Ⅱ消化，切断pTKCAT-H的HSV-胸苷-激酶，并用PMTV-TK（Kuhnel et al，J.Mol.Biol.，190，367（1986））的BamHI、MTV-LTR片段取代pLS-190/-181或pLS-96/-88（Buetti et al.，J.Mol.Biol.190，379（1986））以分别得到MTV-CAT、-190/-181 MTV-CAT或-96/-88MTV-CAT。在这些突变型的HindⅢ位点间重组，由-190/-181-和-90/-88MTV-CAT构建△MTV-CAT。将合成的GAL4结合位点“17MX”（Webster et al.，Cell 52，169（1988））插入单一的HindⅢ位点而使△MTV-CAT转化为MTV-GAL-CAT。将pSVOA/L-A△5′（de Wet et al.，Mol.Cell.Biol.7，725（1987））的HindⅢ位点转化成XhoI并将该衍生物（经BamHI消化、Klenow聚合酶Ⅰ未端充填和XhoI消化而制得）的荧光素酶编码和SV40聚腺苷酸化顺序导入XhoⅠ/SmaⅠ消化的MTV-CAT中，以构建成质粒MTV-LUC。
由pG525（Laughon et al.，Mol.Cell.Biol.4，260（1984））中得到GgalG。用引物定向诱变法分别在编码顺序核苷酸-10至-3和+223至+228处导入NotⅠ和XhoⅠ位点。经用NotⅠ消化由该衍生物中切掉GAL4 DNA结合区，并插入pRShGRNX（Giguere et al.，Nature 330，624（1987））中代替内源性DNA结合区。用XhoⅠ分别消化GgalG和△galG，然后进行末端充填并连接，分别得到Ggal△和△gal△。引入含有相符核糖体结合位点的合成的寡核苷酸双链（△AN，5′GTACCACCATGGGGC3′）（Kozak，Nucl.Acid.Res.12，857（1984））以代替GgalG
Asp718/NotⅠ片段氨基末端编码顺序，构建成△galG。
按Hollenberg等人（Cell 49，39（1987））所述方法产生突变型△77-262、I515＊和△9-385。使用I262（Giguere et al.，Cell 46，645（1986））中编码hGR之氨基酸77-262的BglⅡ/BamHⅠ片段构建T1v突变型。将该片段插入hGR衔接子扫描突变型I2622和I515的BamHⅠ位点，分别得到GR11和GR12。GR13是用上述△AN连接物取代氨基末端编码顺序，由pRShGRNX得到的。GR17是将预先由衔接子扫描突变型I9和I341（Giguere et al.，上述文献）之间重组所得到的编码氨基末端的BamHⅠ片段插入I515的BamHⅠ位点而产生的。突变型I550＊是通过突变型I550和I696的BamHⅠ位点间的重组，从而在氨基酸550之后移码产生的。以前的报导（Hollenberg et al.，上述文献）中，将该突变型错误地描述为δ532-697。为了产生T2衍生物，先用寡核苷酸定向诱变法将hGR核苷酸1704-1709和1800-1805（Hollenberg et al.，Nature 318，635（1985））分别转化成BamHⅠ和BglⅡ位点。然后将编码T2的顺序导入I262的BamHⅠ位点以产生GR20，或代替I262的BglⅡ/BamHⅠ片段以产生GR21。用编码“aah”顺序的合成的寡核苷酸双链（5′GATCT GGAAT TACAA GAGCT GCAGG AACTA CAAGC ATTGT TACAA CAGCA AGAG 3′）取代I262的BglⅡ/BamHⅠ片段，得到GR23。用标准技术（Rosenfeld and Kelly，1986）制得带有该顺序之串联拷贝和T2的突变型（GR24和GR22）。使上述突变型在ClaⅠ位点重组，以产生双突变的衍生物：GR14得自GR12和GR13;GR15得自△77-262和I515＊;GR16得自GR11和I515＊;GR18得自GR13和GR17;GR25得自GR22和I515＊;GR26得自△9-385和I515＊。
免疫沉淀DNA结合
按前述方法检测DNA结合（Hollenberg        et        al.，上述文献）。转染后在COS-1细胞粗提物中得到突变受体，然后与含有GREs的放射标记之DNA片段混合物一起保温。用受体特异性抗血清和Staph        A（无蛋白质的，计算的Cerenkov）免疫沉淀受体-DNA复合物，然后通过变性的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析，以确定特异性结合。比较总的免疫沉淀量。用Western印迹分析法进一步证实各COS-1细胞提取物中突变hGR蛋白的存在。
转染和荧光素酶检测
按前述方法（Giguere        et        al.，and        Hollenberg        et        al.，上述文献），在10cm平皿中用每种质粒各5μg转染CV-1和COS-1细胞。按de        Wet等人（上述文献）所述方法进行荧光素酶检测。
细胞培养和转染
CV-1（非洲绿猴肾）细胞的生长和转染条件如前所述（Giguere        et        al.，Cell        46，645（1986））不同的是将磷酸钙沉淀物在细胞上放置4-8小时，同时将培养基换成含5%无牛血清T3（±10-7M T3（Sigma））的DMEM培养基。加入T3后36小时收获细胞，并按前述方法（Gorman et al.，Mol.Cell.Biol.2，1044（1982）;Hollenberg et al.，Cell 49，39（1987））进行CAT检测。通常用5μg受体和1μg表达载体共转染，同时用2.5μg RSV-βgal作为检查转染效率的对照。用薄层层析法分离乙酰化和非乙酰化形式的〔14C〕氯霉素、切断、并在加有5%DMSO的Econofluor（DuPont）中经液体闪烁计数法进行定量分析。按已述方法（Herbomel et al.，Cell 39，653（1984））进行β-半乳糖苷酶的检测。用百分转化率除以β-半乳糖苷酶活性表示CAT活性。
报导和表达质粒的构建
将相当于大鼠生长激素基因的-169至-200的合成寡核苷酸或回文TRE（TCAGGTCATGACCTGA）（Glass等人，Cell        54，313（1988））插入在-190/181位（Buetti        et        al.，J.Mol.Biol.190，379（1986））具有HindⅢ位点或在-190/-88位具有取代-88和-190之间核苷酸的HindⅢ位点的连接子扫描突变型MTV-CAT中，通过在pRS载体（Giguere        et        al.，Cell        46，645（1986）and        Nature        330，124（1987））的KpnI和BamHI位点之间插入pheA12（Weinberger        et        al.，Nature        324，641（1986））和rbeA12（Thompson        et        al.，Science        237，1610（1987））的全长度cDNA来构建甲状腺激素受体的表达载体。
嵌合受体的构建
hGRNX的构建方法如Giguere（Nature，上述文献）所述。为了构建hTRβNX，在M13MP19的KpnI和BamHI位点之间再克隆pheA12（Weinberger，Nature，出处同上）的cDNA插入段，并按Kunkel（PNAS82，488（1985））所述的方法诱变之。用以产生NotI位点的寡核苷酸改变了三个氨基酸：Asp97变为Arg，Lys98变为Pro，Asp99变为Pro。用以产生XhoⅠ位点的寡核苷酸改变了两个氨基酸：Thr171变为Leu，Asp172变为Gly。然后将突变的受体cDNA转移到表达载体pRS（Giguere，Cell;Nature，出处同上）上;在RshGRNX和RShTRβNX之间交换KpnⅠ-NotⅠ、KpnⅠ-XhoⅠ或NotⅠ-XhoⅠ限制性片段以构建杂合体。RShGRNX活性约为野生型活性的75%，RShTRNX约有野生型活性的60%。为了将T1加到rTRα上，通过插入一个编码侧接BstEⅡ末端之BamHⅠ位点的寡核苷酸连接子，以将21位氨基酸处的唯一BstEⅡ位点改变为BamHⅠ位点。从而可以在读码中将编码hGR之氨基酸77-262的BamHⅠ-BglⅡ片段插入该位点。通过分别删除RShTRNX和RShGRNX的Asp718-NotI片段并用一相符核糖体结合位点的寡核苷酸连接子（Kozak，Nucl.Acids Res.12，857（1984））取代之。
将称为T1的hGR的氨基酸77至262以一个或多个拷贝在rTRα的氨基酸21之后插入读码中，并检测所得杂合受体的超活化作用。表1显示加入一个T1区使活性至少增加4倍，而存在多个这样的区域时还可进一步增加活性。这一结果与该区域的调制性质是相符合的，并且证明了通过加入来自不同受体的超活化区可放大甲状腺激素受体的活性。
表1甲状腺激素受体的活性/T1杂合体
受体 T1区的拷贝数 相对CAT活性＊
RShGR        1        0
RSrTRα-Bm+0 100
RSrTR-T1-11 1430
RSrTRT1-22 1140
RSrTR-T1-33 1960
RSrTR-T1-44 820
＊CAT活性是相对于经诱导的RSrTR-Bm+活性而言的，后者是在氨基酸21处改变为BamHⅠ位点之BstEⅡ位点的大鼠α甲状腺激素受体。
在某些实验中，将受体表达载体的量由1μg增加到5μg，结果相对CAT活性增加了几倍。
可用上面详细描述的方法实现本发明。首先是用这些已具体规定的方法来鉴定、分离、定性、制备和使用受体，进一步则公开了特定实体及其顺序，本领域内的技术人员将知道怎样设计可代用的可靠方法以获得同样的信息并将这些信息扩展到其他种内和种间相关受体。因此不能认为上述的详细内容是为了限制本发明总的范围;相反，本发明的范围只是由对待批权利要求的法律上的解释决定的。

Claims (19)

1、一种适于筛选和鉴定假定有与激素或类激素受体结合能力之材料的检测法，其包括以下步骤：
(a)提供一种有改善了超活化转录活性形式的激素或类激素受体，
(b)用一组或多组假定有与激素或类激素受体结合能力的材料攻击呈所说形式的受体，
(c)检测由所说受体诱导的转录量以监测所说试验材料的效能，以及
(d)从这组能对所说受体之所说超活化转录活性发挥效应的试验材料中选择候选物。
2、根据权利要求1的检测法，其在步骤（d）之后还包括步骤：
（e）应用所说的候选物制备以所说候选物作为主要组分的组合物，所说的组合物当在体内与所说的受体接触时可将其生物功能特性赋予相应的受体。
3、根据权利要求2的检测法，其在步骤（e）之后还包括步骤：
（f）使所说的组合物与人试验对象接触。
4、一种作为多肽的激素或类激素受体，借助其结合某种启动子之DNA顺序反应元件的固有能力，或借助与其他能结合所说DNA顺序反应元件之多肽相联系的能力，所说的受体提高了与之联的所说启动子的超活化转录活性，其中所说的受体分子内含有多个位于其DNA结合和配基结合区之外的超活化转录区及其功能性片
5、根据权利要求4的受体，其中所说的受体是以人糖皮质激素受体为基础的。
6、根据权利要求4的受体，其中所说的超活化转录区是T1区。
7、根据权利要求6的受体，其中所说的受体含有两个所说的T1区。
8、根据权利要求7的受体，其中第二个所说的T1区与第一个相邻。
9、根据权利要求7的受体，其中第二个所说的T1区位于远离第一个T1顺序之位置的C末端。
10、根据前述权利要求中任一项的受体，其缺少配基结合区。
11、根据权利要求1的受体，其为人G442糖皮质激素受体。
12、一种具有附加于亲代受体的、独立于亲代受体DNA结合区和配基结合区的超活化转录区的激素或类激素受体，所说的附加超活化转录区位于各所说的DNA结合区和配基结合区之外的位置上，并可能具有结合DNA的生物功能特性。
13、一种DNA分子，其为编码权利要求12之受体的重组DNA分子或cDNA分子。
14、一种表达载体、其可操作地包含编码权利要求13之受体的DNA。
15、一种用权利要求14的表达载体转化的重组宿主细胞。
16、一种含有根据权利要求15之细胞的细胞培养物，以及确保所说细胞存活的外在支持培养基。
17、一种制备权利要求12之人受体的方法，其包括在已被转染的重组宿主细胞内表达编码所说受体的转染DNA。
18、一种包括回收和纯化权利要求12之受体的方法，该方法使受体在质量和数量上均足可用于检测所说受体在外因诱导下而产生之生物功能的检测法中。
19、一种用于测定激素或类激素受体之功能度的生物检测法，其包括：
（a）用一个或多个携带可操作的激素反应性启动子/增强子的表达载体转染受体阴性细胞，其中所说的启动子/增强子在功能上是与可操作的报导DNA或其他所需DNA及编码所说受体的可操作的DNA顺序相连接的。
（b）在存在或不存在外加材料的情况下培养步骤（a）所说的被转染的细胞。其中所说的外加材料具有假定的活化所说激素反应性启动子/增强子的能力，
（c）监测所说细胞中所说受体或所需DNA顺序之产物的诱导作用，以及
（d）检测所说细胞中报导DNA或其他所需DNA的表达，所作改进在于其中所说的激素或类激素受体与亲代受体相比，具有增强了的超活化转录活性，所说的活性是借助定位于分子内所说受体之各DNA结合和配基结合区以外位置上的区域或其功能性片段而附加于亲代受体的。
CN89109772A 1988-11-30 1989-11-29 新的受体、其鉴定、定性、制备和应用 Pending CN1043741A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US278,614 1988-11-30
US07/278,614 US5217867A (en) 1988-11-30 1988-11-30 Receptors: their identification, characterization, preparation and use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1043741A true CN1043741A (zh) 1990-07-11

Family

ID=23065666

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN89109772A Pending CN1043741A (zh) 1988-11-30 1989-11-29 新的受体、其鉴定、定性、制备和应用

Country Status (13)

Country Link
US (2) US5217867A (zh)
EP (2) EP0716145A1 (zh)
JP (1) JPH04501955A (zh)
CN (1) CN1043741A (zh)
AT (1) ATE140964T1 (zh)
AU (1) AU635726B2 (zh)
CA (1) CA2004339A1 (zh)
DE (1) DE68926905T2 (zh)
DK (1) DK102191A (zh)
ES (1) ES2090041T3 (zh)
GR (1) GR3020702T3 (zh)
PT (1) PT92478B (zh)
WO (1) WO1990006318A1 (zh)

Families Citing this family (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6150328A (en) * 1986-07-01 2000-11-21 Genetics Institute, Inc. BMP products
AU625534B2 (en) * 1987-11-25 1992-07-16 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
AU665039B2 (en) * 1987-12-02 1995-12-14 Salk Institute For Biological Studies, The Chimeric receptors and methods for identification
US5217867A (en) * 1988-11-30 1993-06-08 The Salk Institute For Biological Studies Receptors: their identification, characterization, preparation and use
JPH04504654A (ja) * 1988-12-23 1992-08-20 ザ　ソーク　インスティテュート　フォア　バイオロジカル　スタディーズ レセプターの転写抑制活性組成物および方法
ATE212059T1 (de) * 1990-02-15 2002-02-15 Methoden zur identifizierung heterofunktionaler fusionsproteine
US5747334A (en) * 1990-02-15 1998-05-05 The University Of North Carolina At Chapel Hill Random peptide library
US5498538A (en) * 1990-02-15 1996-03-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Totally synthetic affinity reagents
US5641652A (en) * 1990-03-22 1997-06-24 The Salk Institute For Biological Studies Insect retinoid-like receptor compositions and methods
IE20020110A1 (en) 1990-09-13 2003-05-28 Univ Duke Expression of G Protein Coupled Receptors in Yeast
CA2098838C (en) * 1990-12-21 2002-11-26 Frances M. Sladek Liver enriched transcription factor
US20080070842A1 (en) * 1991-11-04 2008-03-20 David Israel Recombinant bone morphogenetic protein heterodimers, compositions and methods of use
WO1993009229A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 Genetics Institute, Inc. Recombinant bone morphogenetic protein heterodimers, compositions and methods of use
US5756448A (en) * 1992-02-26 1998-05-26 The General Hospital Corporation Constitute activator of retinoid (CAR) receptor polypeptides
US6989242B1 (en) 1992-02-26 2006-01-24 The General Hospital Coporation Car receptors and related molecules and methods
DE69334150T2 (de) * 1992-05-14 2008-03-13 Baylor College Of Medicine, Houston Mutierte steroidhormonrezeptoren, methoden für ihre benutzung und molekularer schalter für gentherapie
US6416998B1 (en) 1992-09-02 2002-07-09 Baylor College Of Medicine Plasmid encoding a modified steroid hormone
WO1998018925A2 (en) * 1996-10-29 1998-05-07 Valentis, Inc. Modified glucocorticoid receptors, glucocorticoid receptors/progesterone receptors hybrids
US5707798A (en) * 1993-07-13 1998-01-13 Novo Nordisk A/S Identification of ligands by selective amplification of cells transfected with receptors
US6291206B1 (en) 1993-09-17 2001-09-18 Genetics Institute, Inc. BMP receptor proteins
PT733109E (pt) * 1993-12-07 2006-07-31 Genetics Inst Llc Proteinas morfogeneticas dos 0ss0s pmo-12 e pmo-13 e as suas composicoes para inducao de tendao
US5854202A (en) * 1995-01-24 1998-12-29 Dedhar; Shoukat Peptide fragments of calreticulin, peptide mimetics thereof, and pharmaceutical compostions comprising same
US6518397B1 (en) 1997-07-24 2003-02-11 Shoukat Dedhar Pharmaceuticals for modulating hormone responsiveness
US7429646B1 (en) 1995-06-05 2008-09-30 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to human tumor necrosis factor receptor-like 2
US7427492B1 (en) * 1995-06-05 2008-09-23 Human Genome Sciences, Inc. Polynucleotides encoding human tumor necrosis factor receptor-like2
WO1997004810A1 (en) 1995-07-28 1997-02-13 The Regents Of The University Of California Dax-1 protein, methods for production and use thereof
US5776699A (en) * 1995-09-01 1998-07-07 Allergan, Inc. Method of identifying negative hormone and/or antagonist activities
US6218128B1 (en) 1997-09-12 2001-04-17 Allergan Sales, Inc. Methods of identifying compounds having nuclear receptor negative hormone and/or antagonist activities
US6942980B1 (en) 1995-09-01 2005-09-13 Allergan, Inc. Methods of identifying compounds having nuclear receptor negative hormone and/or antagonist activities
US5952345A (en) * 1995-09-01 1999-09-14 Allergan Sales, Inc. Synthesis and use of retinoid compounds having negative hormone and/or antagonist activities
US5958954A (en) * 1995-09-01 1999-09-28 Allergan Sales, Inc. Synthesis and use of retinoid compounds having negative hormone and/or antagonist activities
US6008204A (en) * 1995-09-01 1999-12-28 Allergan Sales, Inc. Synthesis and use of retinoid compounds having negative hormone and/or antagonist activities
CA2201098C (en) * 1995-09-08 2001-03-27 George G.J.M. Kuiper Orphan receptor
US20030219832A1 (en) * 1996-03-11 2003-11-27 Klein Elliott S. Synthesis and use of retinoid compounds having negative hormone and/or antagonist activities
CA2200423C (en) 1996-03-26 2006-12-19 Sietse Mosselman Novel estrogen receptor
WO1998027986A1 (en) * 1996-12-24 1998-07-02 Zymogenetics, Inc. Treatment agents and methods for treating type ii diabetes and symptoms of type ii diabetes
US6037488A (en) 1997-04-19 2000-03-14 Allergan Sales, Inc. Trisubstituted phenyl derivatives having retinoid agonist, antagonist or inverse agonist type biological activity
AU7383298A (en) * 1997-05-13 1998-12-08 Regents Of The University Of California, The Novel antiangiogenic peptide agents and their therapeutic and diagnostic use
AU7705098A (en) * 1997-05-29 1998-12-30 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptor-like protein 8
US6222015B1 (en) 1997-09-08 2001-04-24 Merck & Co., Inc. Estrogen receptor
DE19750702A1 (de) * 1997-11-15 1999-05-27 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Antisense Oligonucleotide gegen Tenascin zur Behandlung von Vitiligo
AR021484A1 (es) * 1998-09-10 2002-07-24 Pioneer Hi Bred Int Nuevos receptores de ecdisona y metodos de uso de los mismos
US6727224B1 (en) * 1999-02-01 2004-04-27 Genetics Institute, Llc. Methods and compositions for healing and repair of articular cartilage
US6548739B2 (en) * 1999-06-18 2003-04-15 City Of Hope Method for activating peroxisome proliferator activated receptor-γ
US6586189B2 (en) 1999-06-18 2003-07-01 City Of Hope Screening method for PPAR-γ ligands
US20050148018A1 (en) 1999-10-07 2005-07-07 David Weiner Methods of identifying inverse agonists of the serotonin 2A receptor
DK1223990T3 (da) 1999-10-15 2004-11-29 Inst Genetics Llc Formuleringer af hyaluronsyre til tilförsel af osteogene proteiner
US7329728B1 (en) * 1999-10-25 2008-02-12 The Scripps Research Institute Ligand activated transcriptional regulator proteins
WO2001072837A2 (en) * 2000-03-24 2001-10-04 City Of Hope Methods of modulating drug clearance mechanisms by altering sxr activity
US20030082233A1 (en) * 2000-12-01 2003-05-01 Lyons Karen M. Method and composition for modulating bone growth
DK1399023T3 (da) * 2001-06-01 2008-08-18 Wyeth Corp Sammensætninger til systemisk indgivelse af sekvenser, der koder for knoglemorfogenese-proteiner
TWI267378B (en) * 2001-06-08 2006-12-01 Wyeth Corp Calcium phosphate delivery vehicles for osteoinductive proteins
EP1318400A1 (fr) * 2001-12-06 2003-06-11 Unisensor S.A. Procédé pour effectuer un diagnostic in vitro au moyen de mécanismes de régulation génétique et trousse de diagnostic correspondante
WO2003099992A2 (en) * 2002-05-17 2003-12-04 Wyeth Injectable solid hyaluronic acid carriers for delivery of osteogenic proteins
US20050026950A1 (en) * 2003-07-30 2005-02-03 Allergan, Inc. Methods of therapeutic treatment using retinoids to achieve consistent bioavailability
US20050026957A1 (en) * 2003-07-30 2005-02-03 Allergan, Inc. Methods of treating nodulocystic acne
US20050026949A1 (en) * 2003-07-30 2005-02-03 Allergan, Inc. Methods of therapeutic treatment using amounts of retinoids without regard to body weight
ATE357244T1 (de) * 2003-09-12 2007-04-15 Wyeth Corp Injizierbare feste calciumphosphat-stäbe zur abgabe von osteogenen proteinen
EP1637885A1 (en) * 2004-09-16 2006-03-22 Vivalis Method of screening by using conformation sensitive peptides
BRPI0609504A2 (pt) * 2005-03-30 2010-04-13 Wyeth Corp métodos para estimular o crescimento capilar administrando proteìnas morfogenéticas ósseas (bmps)

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4870009A (en) * 1982-11-22 1989-09-26 The Salk Institute For Biological Studies Method of obtaining gene product through the generation of transgenic animals
US4738922A (en) * 1984-05-25 1988-04-19 Dana Farber Cancer Institute Trans-acting transcriptional factors
US4761371A (en) * 1985-02-12 1988-08-02 Genentech, Inc. Insulin receptor
US4859609A (en) * 1986-04-30 1989-08-22 Genentech, Inc. Novel receptors for efficient determination of ligands and their antagonists or agonists
US5071773A (en) * 1986-10-24 1991-12-10 The Salk Institute For Biological Studies Hormone receptor-related bioassays
US5171671A (en) * 1987-12-02 1992-12-15 The Salk Institute For Biological Studies Retinoic acid receptor composition
US4981784A (en) 1987-12-02 1991-01-01 The Salk Institute For Biological Studies Retinoic acid receptor method
US5217867A (en) * 1988-11-30 1993-06-08 The Salk Institute For Biological Studies Receptors: their identification, characterization, preparation and use

Also Published As

Publication number Publication date
EP0371820B1 (en) 1996-07-31
US5217867A (en) 1993-06-08
PT92478B (pt) 1995-07-18
ES2090041T3 (es) 1996-10-16
CA2004339A1 (en) 1990-05-31
JPH04501955A (ja) 1992-04-09
DE68926905D1 (de) 1996-09-05
DK102191D0 (da) 1991-05-29
GR3020702T3 (en) 1996-11-30
EP0371820A2 (en) 1990-06-06
EP0371820A3 (en) 1991-08-21
EP0716145A1 (en) 1996-06-12
PT92478A (pt) 1990-05-31
AU4751290A (en) 1990-06-26
WO1990006318A1 (en) 1990-06-14
DK102191A (da) 1991-05-29
US5310662A (en) 1994-05-10
AU635726B2 (en) 1993-04-01
DE68926905T2 (de) 1997-01-02
ATE140964T1 (de) 1996-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1043741A (zh) 新的受体、其鉴定、定性、制备和应用
Ogawa et al. PEBP2/PEA2 represents a family of transcription factors homologous to the products of the Drosophila runt gene and the human AML1 gene.
JPH09117285A (ja) リガンド、そのアンタゴニストまたはアゴニストの効率的な測定のためのハイブリッドリセプターをコードする核酸
JPH04505012A (ja) ホルモン応答要素組成物およびアッセイ
US5262300A (en) Receptors: their identification, characterization, preparation and use
JP2002510051A (ja) リガンド依存性核内受容体とコアクチベーターの相互作用を検出するための組成物および方法
Kallijärvi et al. The TRIM37 gene encodes a peroxisomal RING-B-box-coiled-coil protein: classification of mulibrey nanism as a new peroxisomal disorder
US5756448A (en) Constitute activator of retinoid (CAR) receptor polypeptides
D'Agostino et al. Ligand of Numb proteins LNX1p80 and LNX2 interact with the human glycoprotein CD8α and promote its ubiquitylation and endocytosis
CA2343839A1 (en) Cytokine receptor zalpha11
EP0801657B1 (en) Retinoid x receptor-interacting polypeptides and related molecules and methods
JPH04506073A (ja) ステロイド／サイロイドスーパーファミリーのレセプターの優性の負のメンバー
van Dijk et al. A functional assay in yeast for the human estrogen receptor displays wild-type and variant estrogen receptor messenger RNAs present in breast carcinoma
Maitra et al. Differentiation-induced cleavage of Cutl1/CDP generates a novel dominant-negative isoform that regulates mammary gene expression
JP2019037197A (ja) ロースト様香料素材のスクリーニング方法
Stump et al. Isoform-specific dominant-negative effects associated with hERG1 G628S mutation in long QT syndrome
JP2003513670A (ja) ジフテリア毒素構築体を用いるスクリーニングのための方法および組成物
JPWO2002036823A1 (ja) 核移行蛋白質をコードする遺伝子の検索法
Matre et al. The human neuroendocrine thyrotropin-releasing hormone receptor promoter is activated by the haematopoietic transcription factor c-Myb
CN1411556A (zh) Rel蛋白和类固醇受体对调节元件的协同激活作用
CN104059141A (zh) 一种小鼠rankl突变体及其表达载体的构建、表达及应用
Yanago et al. Isolation of Chinese hamster ovary cell pex mutants: two PEX7-defective mutants
CN1248324A (zh) 鉴别在g蛋白偶联体系中起作用的植物蛋白的方法和组合物
JP4351952B2 (ja) 神経発達障害に及ぼす効果を評価するための細胞および方法
WO2011036812A1 (ja) アリルハイドロカーボンレセプター転写活性化量を測定するための細胞、方法およびアッセイキット

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C01 Deemed withdrawal of patent application (patent law 1993)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication