CN1040793A - 尿烷保护的氨基酸-n-羧酸酐类的制备方法 - Google Patents

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Abstract

制备具有式(I)的尿烷保护的氨基酸N-羧酸酐或氨基酸N-硫代羧酸酐的方法；式(I)中R和R′为氢、烷基、环烷基取代的环烷基、芳基或取代的芳基；R″为烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基；Z为氧或硫；n为0、1或2；该方法包括：使氨基酸N-羧酸酐或氨基酸N-硫代羧酸酐与卤代甲酸脂在惰性稀释剂中，在无水条件及有叔胺碱存在的条件下反应。

Description

本发明涉及一类新的N-保护的氨基酸-N-羧酸酐及硫代羧酸酐类化合物（即N-尿烷保护的氨基酸-N-羧酸酐类及N-尿烷保护的N-硫代羧酸酐类）、其制备方法及其在肽、多肽及蛋白质合成领域中的用途。
传统上的制备具有给定序列的多肽的各种方法都是非常费事的-每加上一个氨基酸基团后，都要分离出所得到的中间体。这使得合成复杂化了，并且由于产率低，发生外消旋和/或其它副反应，使制备长链多肽和蛋白质几乎成为不可能。1963年，Merrifield（J.Am.Chem.Soc，85，2149）和Letsinger与Kornet（J.Am.Chem.Soc.，85，2045）提出采用不溶性聚合物载体使肽链生长。用此方法（统称为固相肽合成法）可以在不分离出中间体的情况下“纯化”生长中的肽链。
迄今为止，广泛使用的多肽合成方法-无论是传统的液相法还是固相法，都要求用偶联剂或活化剂与一种其氨基已另外保护起来的氨基酸的羧基反应，得到羧基活化的N-保护的氨基酸。然后可以按若干种方法利用这种活化的氨基酸促使肽链形成。例如，使已活化的保护的氨基酸直接与氨基酸、氨基酸酯或氨基酸的酰胺的游离氨基反应而形成肽链。这是许多年来肽制备中所选用的方法。活化一步可以伴随多种可能的副反应。例如，使用二环己基碳化二亚胺（DCC）作活化剂时，活化分子可能会“重排”为无活性的N-酰基脲。
碳化二亚胺法的另一缺点是有不溶性脲类生成。这对于固相合成是特别麻烦的，并且对固相流系统（Solid        Phase        flow        systems）来说实际上是不能接受的。在溶液相反应中，这些脲类还造成难以解决的纯化问题。
研究人员采用下述方法，已经部分地解决了就地活化所造成的某些问题，即，先使DCC活化的N-保护的氨基酸与醇或酚（例如对硝基苯酚、五氯苯酚、N-羟基琥珀酰亚胺等）反应，生成“活泼酯”，分离出“活泼酯”，纯化，再使之与下一个氨基酸的游离氨基偶联。但是此方法并非没有缺点，因为释放出的醇或酚可能参与或促进其它副反应，并且活泼酯的偶联进行缓慢，因而需要较长的反应时间。
另一个常用方法是制成“对称酸酐”，即，使两当量N-保护的氨基酸与一当量DCC反应，滤出生成的DCU，然后使该“对称酸酐”与下一个氨基酸的游离氨基偶联。此法除需使用两倍量的昂贵的N-保护的氨基酸外，也有因产生脲类而带来的问题。
有些研究人员近来开始使用偶联后产生可溶性脲类的碳化二亚胺，但这类碳化二亚胺仍可引起生成N-酰基脲的重排反应。
人们已经提出了各种N-保护基用于肽合成，但应用最广的一类N-保护基是尿烷类。人们普遍认为，尿烷类的保护作用强，引起的外消旋少，制备容易，并且储存时稳定。可以制得对弱酸（即叔丁氧羰基）、强酸（即苄氧羰基）、极弱酸（2-（对联苯基）异丙氧羰基）、无水碱（即9-芴基甲氧羰基）等不稳定的（labile）尿烷保护基。
尿烷保护的氨基酸常是这样制备：使烷基、芳基或芳烷基氯甲酸酯（或其它适宜地活化的甲酸酯或碳酸酯）与氨基酸反应;反应在碱金属氢氧化物或碳酸盐存在下，在水/有机溶剂混合体系（即Schotten-Baumann条件）中进行。将反应混合物酸化后，用有机溶剂萃取尿烷保护的氨基酸，而所有副产物都留在水相中。结晶后，可按上文所述将这些化合物用于形成肽键。
用于形成肽链的一类人们特别感兴趣的易反应氨基酸衍生物是所谓N-羧酸酐类或N-硫代羧酸酐类，例如：
式中R、R′通常是氢或普通氨基酸的侧链（或保护起来的侧链），而Z是氧或硫。
氨基酸-N-羧酸酐（应当理解，本说明书及所附权利要求书中所谓“N-羧酸酐”包括N-硫代羧酸酐）是众所周知的，并且易于与大多数游离氨基反应。用于形成肽键的N-羧酸酐（NCA），甚至保护起来的NCA的主要优点是，它们是很强的酰化剂（见Peptides，Vol.9，P83）。与DCC或N-羟基琥珀酰亚胺（OSu）酯偶联法相比，通过NCA一般能得到更高产率的肽，但NCA在肽合成上并未得到广泛应用，原因是它缺乏控制或限制偶联反应的能力。NCA一旦与氨基酸的游离氨基反应，马上放出二氧化碳，形成也含有游离氨基的二肽。此游离氨基随后与另一个NCA反应，生成三肽，等等。此反应使得氨基酸N-羧酸酐类可以广泛用于生成聚α-氨基酸，却在实际上使它们不能用于形成序列多肽。Hirschmann等（The        Controlled        Synthesis        of        Peptides        in        Aqueous        Medium，Ⅷ;The        Preparation        and        Use        of        Novel        α-Amino        Acid        N-Car，boxyanhydrides.J.A.C.S.，93∶11，1971，P.2746-2774）已成功地利用氨基酸N-羧酸酐在水-有机溶剂体系中，在小心地控制反应混合物的温度、PH值、盐分以及有机溶剂的情况下制成二肽和三肽。然而由于如上所述的NCA的化学反应性质，此方法仅适用于小肽的合成。此外，在使用由这些溶液相得到的产物制备较大的肽之前，必须充分地提纯这些产物。
文献中已经报道了多种N-取代的氨基酸N-羧酸酐类，例如N-甲基、N-苄基、N-乙酰基、N-硝基苯硫基、N-咕吨基、N-4，4′-二甲基二苯甲基、N-三苯甲基等取代的氨基酸-N-羧酸酐类。已有人提出将这些取代的NCA的某一些用于序列肽的合成，尤其是用于固相肽合成，但其中没有一种被肽化学家接受而一般地用于肽合成。
Kricheldorf（Angew.Chem.Acta        85，86-87，（1988））提出采用邻硝基苯硫基（NPS）（o-nitrophenylsulfenyl）取代的NCA合成序列肽。这些取代的NCA是这样制备的：使邻硝基苯硫基氯与一种N-羧酸酐在三乙胺存在下反应。此后有人证明，三乙胺能促使NPS-NCA发生外消旋。另外，由于三乙胺具有使NCA发生寡聚的作用，因此必须在NPS-NCA合成中采用非常严格的反应条件（即，温度低于0℃，三乙胺必须非常缓慢地加到反应混合物中）。Halstrom等人（Z.Physiol.Chem.355，82-84，（1974））因而提出通过使碳酰氯与NPS-氨基酸反应来合成NPS-NCA，但产率却很低（约20%）。NPS-NCA制得后难以贮存，它在缩合时易于脱去保护基，从而引起多重偶联及其它副反应。所得NPS保护的肽的氮还具有较大的亲核性，可能发生其它缩合反应。
Block和Cox（“Peptides，Proc.of        the        5        th        Europ.Symp.，Oxford，September        1962”。Pergamon        Press        1963，Ed.G.T.Young，PP.84-87）提出用N-三苯甲基氨基酸-N-羧酸酐类来合成肽，但是他们只能制成最简单的N-三苯甲基氨基酸NCA（即甘氨酸和丙氨酸）。这些化合物是用N-三苯甲基氨基酸与碳酰氯反应制得的。按照此法，他们还能制成N-乙酰-甘氨酸-NCA。这些研究者意识到叔丁氧羰基甘氨酸N-羧酸酐和苄氧羰基甘氨酸N-羧酸酐的潜在用途，但他们在尝试制备这些化合物时未获成功，并且，他们还得出了尿烷保护的氨基酸N-羧酸酐类不可能制成的结论！即使所有的N-三苯甲基-NCA都能制成，然而人们熟知的是，由于三苯甲基产生相当大的空间阻碍作用，各种使用三苯甲基保护的氨基酸的缩合方法的产率都很低。三苯甲基还对酸极为敏感，这样就不易制得三苯甲基-NCA，并且在一般的固相操作中三苯甲基易于“脱落”。
Halstroem和Kovacs（Acta        Chemica        Scandin-avica.Ser.B        1986，BYO（6），462-465和美国专利4，267，344）也认识到N-保护的氨氨酸N-羧酸酐类的优点及潜在用途，并且他们能制成几种N-取代的NCA。他们觉得这几种N-取代的NCA能满足肽合成的所有要求。他们能制得若干种9-呫吨基（以及相关基团）取代的氨基酸N-羧酸酐。这些化合物据称可以这样制备：使呫吨氢醇在回流条件下，在苯甲苯、二甲苯或其它烃基苯中直接与适宜的NCA缩合;缩合中生成的水共沸除去。由于NCA对热与水是不稳定的，因此该法产率低并且产物中杂质很多。这些化合物还可以通过使碳酰氯（或其等价物）与相应的9-呫吨基-氨基酸反应而制得;事实上，按此法已经制成了大多数这类取代的NCA。
使用9-呫吨基-NCA合成肽时，发现它们反应缓慢。在溶液中，反应时间在50℃长达5小时;而在固相合成中，反应时间在25℃长达24小时。这可能是由于9-呫吨基的空间阻碍作用和/或减活效应。用9-呫吨基保护氨基所带来的另一个问题是，偶联反应后生成的9-呫吨基氨基酸的氮原子仍然有亲核性，它能随后进行缩合反应。这些基团在操作过程中也容易脱落。所以，到现在为止，这类及任何其它类型取代的氨基酸N-羧酸酐在肽合成中，尤其是在固相肽合成中还没有得到广泛应用。
Kiecheldorf（Makromol，Chem.Vol.178，PP905-939，1977）介绍了一种制备甲氧羰基甘氨酸NCA和乙氧羰基甘氨酸NCA的方法。但Kricheldorf也说，由于空间阻碍，按此法不能制得侧链不是氢的氨基酸的尿烷保护的NCA。
因此，本发明目的是提供迄今不能制得的高级氨基酸的尿烷保护的N-羧酸酐和N-硫代羧酸酐。
本发明另一目的是提供制备纯质、晶形、稳定的尿烷保护的氨基酸N-羧酸酐类和尿烷保护的N-硫代羧酸酐类的方法。
本发明还有一个目的，即提供利用纯质、晶形的尿烷保护的氨基酸-N-羧酸酐类来合成多肽的方法。与常规肽合成法相比，本发明方法的主要优点如下：
1）无需预先使羧基活化，因此没有常规的活化分子产生副产物的问题。
2）无需使用添加剂如N-羟基苯并三唑来抑制外消旋化。
3）偶联反应仅有的伴随产物是二氧化碳。
4）这些N-保护的羧基活化的氨基酸是稳定、易储存、结晶形的物质。使用这种物质便于进行，并且能够简化固相和液相肽合成，尤其是在自动肽合成器中进行的肽合成工艺，这是因为肽键形成前的活化、过滤和偶联等操作都可以省去。由于偶联剂不产生副产物，使用这些新化合物大大有助于溶液中制得的肽的纯化。
5）由本发明方法，可以在偶联完成后，在生长的肽链的氨基官能团上形成尿烷保护基，然后可用常规方法对其进行处理。
利用具有下列结构式的尿烷保护的氨基酸-N-羧酸酐可达到本发明的上述目的：
其中R和R′或氢原子、烷基、环烷基、取代的烷基、取代的环烷基、芳基或取代的芳基，且R和R′中至少有一个不是氢原子;R″为烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基;Z为氢或硫;n为0，1，或2。
优选的R、R′及R″基团为具有1-12个碳原子或更多个碳原子的烷基（包括环烷基）、具有6-20个碳原子或更多个碳原子的芳基（包括具有7-20个碳原子或更多个碳原子的芳烷基和烷芳基）。合适的烷基例如有：甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、丁基、叔丁基、己基、环戊基、环己基、庚基、辛基等。合适的芳基例如有苯基、甲基苯基、乙基苯基、萘基、甲基萘基、蒽基等。合适的芳烷基例如有苄基、对甲氧苄基、9-芴基甲基、苯乙基等。合适的烷芳基例如有甲苯基、乙苯基、异丙苯基等。R、R′及R″也可被氟、用氧基、叔丁氧基、羧基、酰氨基、苄氧基、羟基、取代的氨基、取代的羟基、硫、取代的硫、氯、溴等非干扰基团取代。R和R′一般是连接在氨基酸或其类似物的α-碳原子上的保护或非保护的基团（侧链）。
在大多数情况下，R及R′中的一个是氢原子，而另一个是氨基酸的α-碳原子上的侧链，这些氨基酸包括赖氨酸、亮氨酸、精氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、天冬酰氨、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、甲硫氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、苯基丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、β-丙氨酸、高丝氨酸等，侧链的例子有：
如果需要的话，可采用本领域技术人员所熟知的常规技术及保护基（如氨基、羟基、硫羟基及羧基保护基）保护这些侧链。
本发明的化合物也包括这样一些化合物，即其中R和R′均为连接在氨氨羧的α-碳原子上的侧链。例如在异缬氨酸的情况下，R和R′中一个为-CH2CH3，另一个为甲基。
本发明的化合物也包括这样一些化合物，即其中R和R′均为环状结构的一部分，例如1-氨基-环己烷羧酸的情况。
本发明的化合物也包括例如邻氨基苯甲酸或1-氨基-2-羧基环己烷，其中R及R′的碳原子为环状结构的一部分。
另一方面，本发明也涉及对多肽链的合成进行改进。在肽链合成中，是对N-保护的氨基酸成分去保护，让该去保护的氨基酸成分与另一个类似或不类似的活化的N-保护的氨基酸成分反应，重复这一过程，直至得到所需多肽。本发明的改进包括：在至少一个所说的反应中使用具有下式结构的化合物作为活化的N-保护的氨基酸成分：
式中，R、R′、Z和n的含义同上所述。
再一方面，本发明也涉及对在不溶固体支持物上的多肽链的固相合成法进行改进。在这种固相多肽链合成法中，N-保护的氨基酸成分通过缩合反应被偶联至一不溶固体支持物上，该支持物含有能与所说氨基酸成分的羧基末端反应的取代基，将偶联后的N-保护氨基酸成分去保护，再将另一个类似或不类似的活化N-保护氨基酸成分偶联至所说的去保护氨基酸成分上，重复该过程直至得到所需多肽。所说的改进包括：在至少一个所说的反应中使用具有下式结构的化合物作为活化的N-保护的氨基酸成分：
其中R、R′、Z和n如上所定义。
本发明还涉及一种制备本发明的尿烷保护的氨基酸-羧酸酐的方法，该方法包括：使具有下式结构
Figure 891013334_IMG12
的氨基酸N-羧酸酐（其中R、R′、Z和n的定义均同上）与具有下式结构
（其中X为氯、溴、氟、叠氮基等，R″为烷基、芳基或芳烷基）的卤代甲酸酯（或其它合适的易反应的甲酸酯，如叠氮基甲酸酯）在无水及存在N-甲基吗啉的条件下于惰性稀释剂中反应。我们意外地发现，在此反应中利用惰性稀释剂、无水条件且选择N-甲基吗啉作为碱可以避免N-羧酸酐发生聚合，而且能够生产出到目前为止尚不能得到的高级氨基酸的尿烷保护的NCA和NTA（N-硫代羧酸酐）。
作为本发明N-尿烷保护的NCA和NTA的起始物的氨基酸N-羧酸酐（NCA）和N-硫代羧酸酐（NTA）可采用本领域熟练技术人员所熟知多种方法进行制备。如见;Euller等Biopo        ymers        15，№.9，1869-1871（1976）;Kricheldorf，Chem.Ber.104，87-91（1971）;及Halstrom        &        Kovacs，Acta        Chemica        Scandinavica，B40，462-465（1986）。
尽管一般地说尿烷类可以用作亲核原子的保护基，但仅发现其中只有几种尿烷在肽合成中具有广泛用途，例如叔-丁氧羰基（Boc）;苄氧羰基（Cbz）及9-芴基、甲氧羰基（FMOC），因此，人们尤其对被这些保护基团取代的氨基酸N-羧酸酐或N-硫代羧酸酐感兴趣。所以，用于肽合成的非常有用的分子是被上述保护基团之一所保护的L-α-氨基酸的NCA，如：
Figure 891013334_IMG14
其中R是α-氨基酸的侧链，Z为O或S，X为甲氧基、氯等等。
如上所述，按照Block及Cox所述的方法（“Peptides        Proc.of        the        5th        Europ.Symp.，Oxford，September        1962”，Pergamon        Press        1963，Ed.G.T.Yong，PP84-87），使碳酰氯与N-尿烷保护的氨基酸反应，不能得到本发明的N-尿烷保护的NCA;同这，利用Kricheldorf所述的合成法（Makromol.Chem.，Vol.176，PP905-939，1977）也不能得到N-尿烷保护的高级氨基酸的NCA。而我们发现，通过使预先合成的NCA或NTA与合适的卤代甲酸酯在无水的非干扰溶剂中（并使用叔胺作为碱）反应，就可以制备出尿烷保护的NCA和NTA。反应最好在低于室温的温度下进行。反应可使用四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲酚、苯、二噁烷等作为溶剂。
例如，本发明的新型尿烷保护的氨基酸N-羧酸酐和N-硫代羧酸酐可以这样制得：将NCA溶解于非干扰溶剂（如甲苯），并边搅拌边冷却所得的溶液。然后立即加入满足要求的卤代甲酸酯（如氯甲酸苄酯），再向混合物中加入叔胺碱（如三乙胺、二异丙基乙胺、N-甲基吗啉等），它能够促进缩合反应和清除反应过程中产生的盐酸。我们意外地发现，某些叔胺碱（如N-用基吗啉和N-乙基吗啉啉）并不促使NCA聚合。这种优选的碱是那些其pK低至不足以促使NCA聚合，但又高至足以催化NCA与卤代甲酸酯反应的碱。因此，当将这些优选的碱之一用于缩合反应时，并不能引起聚合反应。既然不必担心发生聚合反应，可过量使用这些碱，通过结晶可很容易地分离出生成的尿烷保护的NCA。
由于这些发现，实际上任何尿烷保护的NCA（或NTA）均可以高产率容易地制得，仅需为除水而采取极简单的措施。该方法可以容易地扩大规模进行且能提供结晶程度很高的产物;该产物易于通过简单技术（即结晶）提纯，且能够稳定地保存（在25℃至少完全稳定6个月或更长时间）。因此，这些物质可经称重、运输和储存再用于肽合成，而不用担心分解。
尿烷保护的NCA与N-取代的NCA相比，其优越之处主要在于使用它们形成肽键后，所产生的肽的N-末端被一个普遍接受常用于肽合成的尿烷保护基所保护。这些保护基是本领域熟练技术人员所熟知的，它们能为正在加长的肽链提供最佳保护。
总之，使用尿烷保护的N-羧酸酐具有未取代NCA的所有优点（高反应性，没有不需要的重排产物生成，CO2为唯一的副产物），而没有未取代NCA的缺点（即不稳定性，聚合以及多重缩合），而这些缺点使未取代的NCA只能在严格控制下的有水条件下使用。因此，本发明提供了一种耐储存、高反应性、预先活化的试剂，它在肽键形成的过程中仅产生极少的副产物。本发明也为缩合反应后所得肽的N-末端氮原子提供了普遍接受的、很好理解的尿烷保护。
尽管本发明的尿烷保护的氨基酸N-羧酸酐可以按照传统方法用于多肽合成（即采用一系列的去保护和偶联反应），但它们无疑还会在固相多肽合成中得到更广泛的应用。在本说明书及所附权利要求书中使用的术语“多肽”应理解为包括肽和蛋白质。还应理解，本发明所企望的是一种序列肽合成法，其中使用不是尿烷保护的氨基酸-N-羧酸酐的N-保护的氨基酸，也至少使用一个本发明的尿烷保护的NCA。但实际上用于每一序列的N-保护的氨基酸成分最好是本发明的尿烷保护的NCA。
在固相多肽合成中，使用一种不溶固体支持物或基质，最好是小球状的。这种固体支持物可以是任何一种常用于多肽合成的固相聚合基质，这种聚合树脂的例子有交联聚苯乙烯树脂、玻璃珠、粘土、硅藻土、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、聚酰胺树脂及类似的不溶固体支持物，它们或者本身含有与氨基酸成分偶联的反应位点，或是可被提供以这些反应位点。
如果需要，本发明的固相多肽合成法可在流动反应器中加压进行行，如美国专利4，192，798所述（在此引用以作参考），但是超大气压并不是必需的。
在开始固相多肽的合成之前必须进行几个预备操作。首先，必须制备含有所需肽链的C-末端氨基酸成分的支持树脂，这可以采用本领域技术人员所熟知的多种方法中的任何一种来完成。许多连接在各种固体支持物上的这些N-保护的氨基酸都是商品，可按需要购买。
其余的合成所需多肽序列的操作可按下述进行。在另一个氨基酸残基的偶联得以进行之前，已在支持物上的残基必须去保护。通过使保护的氨基酸残基与一合适的脱保护剂接触，可以将已在树脂上的氨基酸残基以及每一个后来偶联上去的氨基酸残基脱保护。用于此目的的脱保护剂为肽合成领域普通技术人员所熟知。当然，每一具体情况下所使用的具体脱保护剂将根据氨基酸/树脂上的保护基而定。例如，如果保护基为叔丁氧羰基，则可使用在二氯甲烷中的三氟乙酸或在合适溶剂（如二噁烷）中的盐酸。另一方面，如果保护基为9-芴基甲氧羰基，则采用碱性条件（如DMF中的哌啶）较好。具体的脱保护剂在溶剂中的浓度也是视所使用的具体保护剂而定，但一般在约5-50%（体积）的范围内。
脱保护之后，用合适溶剂洗涤树脂，以除去过量的脱保护剂。如果脱保护剂是一种酸，则必须用一合适碱（如在二氯甲烷等溶剂中的三乙胺）洗涤，以中和树脂上的多肽。任何过量的三乙胺和形成的三乙基氯化铵或三氟乙酸盐都可用一合适溶剂（如二氯甲烷或二甲基甲酰胺）反复冲洗而除去。如此制得的游离胺就可以备用于与下一个N-保护的氨基酸偶联了。
如果下一个N-保护的氨基酸是本发明的尿烷保护的氨基酸N-羧酸酐，则它无需经过活化即可直接与含有未保护的与树脂相连的氨基酸的支持物反应。但是，如果采用更常规的方法将N-保护的氨基酸成分偶联，则必须首先进行活化，即将其转变成易反应的形式。例如如，将该氨基酸转变成酸酐，或用二环己基碳化二亚胺、羰基二咪唑或其它活化剂将其活化。通常，在反应中活化的N-保护的氨基酸成分是过量使用的。
被保护的第二氨基酸成分与第一氨基酸成分偶联之后，将连接在支持物上的保护的二肽去保护，需要时进行中和，并在下一个氨基酸衍生物偶联之前按前述方法冲洗。重复上述过程，直至将所需氨基酸序列全部组装在不溶支持物上。
由于在尿烷保护的NCA偶联过程中没有不良的副反应和副产物（CO2是唯一的副产物），且由于尿烷保护的NCA很稳定，偶联反应中所用过量的尿烷保护的NCA很容易回收，重结晶及重复利用，从而显著地提高了这些物质的效用。
所获多肽可采用任何标准方法使之与不溶支持物分开，如用氟化氢裂解，进行酯基交换（transesterification）、氨解等。
解离之后，发现所产生的肽非常均一，无需纯化，或仅需最低限度的纯化。由于副产物污染很少，发现产率之高惊人;即使需要纯化，纯化也可以相对容易地完成。所用纯化方法最好是分配色谱法，离子交换色谱法，或者是二者的结合，对多肽合成领域的熟练技术人员来说，这些方法是熟知的。
实施例1
在碱作用下N-羧酸酐的分解
A.将缬氨酸N-羧酸酐（72mg）溶于干燥的、蒸馏过的四氢呋喃（2ml）中，加入三乙胺（30μl）。用红外光谱测定NCA已消失。
B.将缬氨酸-N-羧酸酐（72mg）溶于四氢呋喃（2ml），加入N-甲基吗啉（25μl）。用红外光谱测定NCA已消失。
A和B的结果示于附图1的曲线。
实施例2
N-（9-芴基甲氧羰基）-L-丙氨酸-N-羧酸酐
A.在62-64℃下，将由L-丙氨酸（40.3g，0.45mol）和碳酰氯（275ml3M的四氢呋喃溶液，0.90mol）组成的混合物搅拌4小时。将得到的溶液冷却至室温，过滤，减压蒸去挥发性组分。搅拌下，将得到的油状物溶于100ml四氢呋喃，加入300ml己烷，再冷却至-20℃。L-丙氨酸-N-羧酸酐的产量为35.79g（69%）。
B.将由N-甲基吗啉（8.15g，80.5mmol）和甲苯（50ml）组成的溶液加到温度为0℃的由L-丙氨酸-N-羧酸酐（8.84g，76.8mmol）、9-芴基甲氧羰基氯（19.9g，76.8mmol）和甲苯（200ml）组成的混合物中。在0℃下将反应混合物搅拌2小时，过滤。溶液的体积减至20ml，加入100ml己烷后结晶，得到21.4g（82%）9-芴基甲氧羰基-L-丙氨酸-N-羧酸酐粗产物。通过与冷的异丙醚研磨将该粗产物提纯，再从乙酸乙酯/己烷中重结晶。mp106-107℃;1R（CH2Cl2）1870，1801，1740cm-1;NMR（CDCl3）δ6.90-7.80（m，8H），3.95-4.55（m，4H），1.35（d，J＝7Hz，3H），元素分析：C19H15NO5计算值：C，67.65;H，4.48;N，4.15。实测值：C，67.73;H，4.65;N，4.19。
实施例3
N-（9-芴基甲氧羰基）-L-亮氨酸-N-羧酸酐
A.按实施例2A所述的方法从L-亮氨酸制备L-亮氨酸-N-羧基酐，产率为78%。
B.将由L-亮氨酸-N-羧酸酐（9.2g，58.4mmol）、9-芴基甲氧羰基氯（15.1g，58.4mmol）和甲苯（125ml）组成的混合物冷却至0℃，滴加由N-甲基吗啉（6.5g，64mmol）和20ml甲苯组成的溶液。在0℃下将反应混合物搅拌2.5小时，过滤，溶液的体积减至20ml。加入己烷（480ml），将混合物通霄冷却至-20℃，得到18.8g（85%）N-（9-芴基甲氧羰基）-L-亮氨酸-N-羧酸酐。从乙醚/二氯甲烷/己烷中重结晶，得到分析用试样。mp118-120℃;NMR（CCl4）δ7.35-7.91（m，8H）;4.72（t，J＝7Hz，2H）;4.58（m，3H）;4.37（t，J＝7Hz，1H）;2.05（m，2H）;1.09（t，J＝6Hz，6H）。元素分析：C22H21NO5计算值：C，69.64;H，5.58;N，3.69。实测值：C，69.08;H，5.97;N，3.70。
实施例4
N-α-（9-芴基甲氧羰基）-N-ε-叔-丁氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸酐
A.将由N-ε-叔-丁氧羰基-L-赖氨酸（1.23g，5.0mmol）、三甲基氯硅烷（1.08g，10.0mmol）和四氢呋喃（50ml）组成的混合物冷却至0℃，滴加由三乙胺（1.01g，10.0mmol）和5ml四氢呋喃组成的溶液。在0℃下将混合物搅拌2.5小时，过滤，再加到由碳酰氯（10mmol）和15ml四氢呋喃组成的溶液中。将溶液的温度升高至60℃，搅拌2.0小时，然后在室温下过夜。旋转蒸发除去挥发性组分，得到0.79g（58%（N-ε-叔-丁氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸酐。
B.将由N-ε-叔-丁氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸酐（0.79g，2.90mmol）、9-芴基甲氧羰基氯（0.75g，2.90mmol）和甲苯（25ml）组成的混合物冷却至0℃，滴加由N-甲基吗啉（0.32g，3.2mmol）和甲苯（5ml）组成的溶液。按实施例3B所述的方法进行反应，得到0.88g（66%）N-α-（9-芴基甲氧羰基）-N-ε-叔-丁氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸酐。乙酸乙酯/己烷;NMR（CDCl3）δ7.3-7.7（m，8H），4.11-4.58（m，5H），2.95-3.20（m，2H）;1.90-1.98（m，2H）;0.9-1.4（m，13H）。元素分析：C27H30N2O7计算值：C，65.57;H，6.11;N，5.67。实测值：C，66.33;H，6.38;N，5.67。
实施例5
N-苄氧羰基-L-丙氨酸-N-羧酸酐
在0℃下，将由N-甲基吗啉（1.06g，10.5mmol）和乙酸乙酯（20ml）组成的溶液滴加到由L-丙氨酸-N-羧酸酐（实施例2A制备）（0.81g，7.0mmol）、苄氧羰基氯（1.89g，10.5mmol）和乙酸乙酯（80ml）组成的混合物中。在0℃搅拌此反应混合物1.5小时，过滤，将溶液的体积减至75ml。在搅拌下加入己烷（75ml），然后冷却至-20℃，得到1.20g（71%）N-苄氧羰基-L-丙氨酸-N-羧酸酐。mp101-104℃;NMR（CDCl3）δ7.33（s，5H），5.27（s，2H），4.60（q，J＝7Hz，1H），1.61（d，J＝7Hz，3H）。元素分析：C12H11NO5计算值：C，57.83;H，4.45;N，5.62。实测值：C，57.60;H，4.50;N，5.53。
实施例6
N-苄氧羰基-L-亮氨酸-N-羧酸酐
在0℃下，将由N-甲基吗啉（0.76g，7.50mmol）和乙酸乙酯（10ml）组成的溶液滴加到由L-亮氨酸-N-羧酸酐（0.79g，5.0mmol）（实施例3A制备）、苄氧羰基氯（1.35g，7.50mmol）和乙酸乙酯（50ml）组成的溶液中。在0℃下搅拌反应混合物1.25小时，过滤，将溶液的体积减至5ml。加入己烷（50ml），然后冷却至-20℃，得到0.89g（61%）N-苄氧羰基-L-亮氨酸-N-羧酸酐。mp72-73.5℃（乙醚/己烷）;NMR（CDCl3）δ7.40（s，5H），5.33（s，2H），4.71（t，J＝6Hz，1H），1.80-2.04（m，3H），0.91（m，6H）。元素分析：C15H17NO5计算值：C，61.84;H，5.88;N，4.81。实测值：C，61.64;H，6.02;N，4.90。
实施例7
N-苯氧羰基-L-缬氨酸-N-羧酸酐
A.按实施例2A所述的方法从L-缬氨酸制备L-缬氨酸-N-羧酸酐，产率为75%。
B.重复实施例5的操作，所不同的是用苯基氯甲酸酯代替苄基氯甲酸酯，用缬氨酸-N-羧酸酐代替亮氨酸-N-羧酸酐。结果得到N-苯氧羰基-L-缬氨酸-N-羧酸酐（产率78%），mp：105-106℃（氯仿/己烷）;NMR（CDCl3）δ7.30（m，5H），4.70（d，J＝3.5Hz，1H），2.60（m，1H），1.22（d，J＝7Hz，3H），1.07（d，J＝7Hz，3H），1.07（d，J＝7Hz，3H）。元素分析：C12H13NO5计算值：C，59.31，H，4.98;N，5.32。实测值：C，59.09;H，4.91;N，5.49。
实施例8
N-乙氧羰基-L-丙氨酸-N-羧酸酐
重复实施例5的操作，所不同的是用乙基氯甲酸酯代替苄基氯甲酸酯。结果得到N-乙氧羰基-L-丙氨酸-N-羧酸酐（产率62%）。mp：72-73.5℃（乙酸乙酯/己烷），NMR（CDCl3）δ4.73（q，J＝7Hz，2H），4.33（q，J＝7Hz，1H），1.70（d，J＝7Hx，3H），1.33（t，J＝7Hz，3H）。元素分析：C7H9NO5计算值：C，44.92;H，4.85;N，7.49。实测值：C，45.08;H，5.03;N，7.33。
实施例9
苄氧羰基-L-苯丙氨酸-N-羧酸酐
A.按实施例2A所述的方法从L-苯丙氨酸制备L-苯丙氨酸-N-羧酸酐，产率为53%。
B.在0℃下，向由L-苯丙氨酸-N-羧酸酐（2.5g，13mmol）、苄基氯甲酸酯（3.4g，20mmol）和乙酸乙酯（130ml）组成的溶液中滴加由N-甲基吗啉（2.0g，20mmol）和乙酸乙酯（10ml）组成的溶液。将得到的混合物在0℃下搅拌2.5小时，然后按实施例5的方法操作，得到2.0g（48%）N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸-N-羧酸酐。mp：108-109℃;NMR（CDCl3）δ7.35（s，5H，7.00（m，5H），5.31（s，2H），4.83（m，1H），3.28（m，2H）。元素分析C18H17NO5计算值：C，68.13;H，5.40;N，4.42。实测值：C，68.11;H，5.38;N，4.20。
实施例10
苯氧羰基-L-丙氨酸-N-硫代羧酸酐
A.O-乙基-S-黄原酸甲酯。
在4±1℃下，向由乙基黄原酸钾（16.0g，100mmol）和水（50ml）组成的溶液中滴加硫酸二甲酯（12.6g，100mmol）。全部加完后，用二氯甲烷（2×40ml）洗涤反应混合物，合并有机层，用硫酸镁干燥，浓缩。将油状残余物溶于甲醇，浓缩后得到O-乙基-S-黄原酸甲酯，其纯度足以直接在下一步中使用。
B.乙氧基硫代羰基-L-丙氨酸。
向上面制备的O-乙基-S-黄原酸甲酯中加入由L-丙氨酸（8.9g，100mmol）、氢氧化钠（4.0g，100mmol）和水（100ml）组成的溶液。将该溶液于45℃加热2.3小时。在氮气氛下，加入甲醇（50ml），再将混合物于45℃下搅拌0.7小时。将反应混合物冷却至室温，用二氯甲烷（3×25ml）洗涤，用浓盐酸酸化至pH＝2.5，再用乙酸乙酯（2×50ml）萃取。将合并的有机层用硫酸镁干燥，浓缩。向得到的油状物中加入己烷，得到9.5g（54%）乙氧基硫代羰基-L-丙氨酸，为无色固体，mp：74-78℃。通过于乙醚/己烷中重结晶，进一步提纯该产物。mp：77-79℃;IR（CCl4）3397，1716cm-1。
C.L-丙氨酸-N-硫代羧酸酐。
在20℃下，将PBr3（5.4g，20mmol）滴加到由乙氧基硫代羰基-L-丙氨酸（3.0g，17mmol）、咪唑（1.2g，17mmol）和四氢呋喃（20ml）组成的溶液中。连续搅拌，直至固体物质分散为细致的颗粒，形成悬浮液。将反应混合物倾入由饱和碳酸氢钠（200ml）和乙酸乙酯（150ml）组成的混合物中。分离出有机层，用1M盐酸（2×100ml）、饱和碳酸氢钠（100ml）和盐水（100ml）洗涤，用硫酸镁干燥，浓缩。将得到的油状物静置固化。固体重结晶后，得到0.75g（34%）L-丙氨酸-N-硫代羧酸酐。mp：91-92℃;IR（CCl4）1750，1695cm-1。
D.苯氧羰基-L-丙氨酸-N-硫代羧酸酐
在0℃下，向由L-丙氨酸-N-硫代羧酸酐（0.49g，3.8mmol）和50ml乙酸乙酯组成的溶液中加入苯基氯甲酸酯（0.95g，6.1mmol），然后在0℃滴加由N-甲基吗啉（0.57g，5.6mmol）和乙酸乙酯（10ml）组成的溶液。在0℃下搅拌得到的混合物3小时，过滤并浓缩，得到白色半固体。将该半固体溶于20ml乙酸乙酯中，加入己烷（150ml），将该混合物冷却至-20℃，得到0.55g（62%）苯氧羰基-L-丙氨酸-N-硫代羧酸酐。mp：110-111℃;NMR（CDCl3）δ7.18（m，5H），4.83（q，1H，J＝7Hz），1.71（d，3H，J＝7Hz）;IR（CH2Cl2）1810，1740（双峰），1715（肩峰）。元素分析：C11H9NO4S计算值：C，52.58;H，3.61;N，5.58;S，12.76。实测值：C，52.75;H，3.72;N，5.36;S，12.98。
实施例11
N-（9-芴基甲氧羰基）-O-叔丁基-L-苏氨酸-N-羧酸酐
A.按实施例4A所述的方法用三甲基氯甲硅烷从O-叔丁基-L-苏氨酸制备O-叔丁基-L-苏氨酸-N-羧酸酐，产率为57%。
B.在0℃下，将由N-甲基吗啉（0.49g，4.8mmol）和8ml甲苯组成的溶液滴加到由O-叔-丁基-L-苏氨酸-N-羧酸酐（0.80g，4.0mmol）、9-芴基甲氧羰基氯（1.0g，4.0mmol）和甲苯（50ml）组成的溶液中。将反应混合物在0℃搅拌3小时，过滤，减压蒸除挥发性组分。残余物从乙醚/己烷中结晶，得到1.0g（60%）N-（9-芴基甲氧羰基）-O-叔-丁基-L-苏氨酸-N-羧酸酐。mp124-127℃;NMR（CDCl3）δ7.08-7.78（m，8H），4.05-4.61（m，4H），1.18（s，9H），1.16（d，3H，J＝7Hz）。元素分析：C24H25NO6计算值：C，68.07;H，5.95;N，3.31。实测值：C，67.89;H，5.96;N，3.28。
实施例12
乙氧羰基-α-氨基异丁酸-N-羧酸酐
A.按实施例2A所述的方法制备α-氨基异丁酸-N-羧酸酐，产率为67%。
B.重复实施例8B的操作，所不同的是用α-氨基异丁酸-N-羧酸酐代替L-丙氨酸-N-羧酸酐，得到乙氧羰基-α-氨基异丁酸-N-羧酸酐（产率为16%）。mp68-70℃（氯仿/己烷）;NMR（CCl4）δ4.59（d，2H，J＝7Hz），2.00（s，6H），1.65（t，3H，J＝7Hz）。元素分析：C8H11NO5计算值：C，47.76;H，5.51;N，6.96。实测值：C，47.67;H，5.51;N，7.14。
实施例13
N-叔-丁氧羰基-L-丙氨酸-N-羧酸酐
于-50℃下，向由叔丁醇（1.25g，16.9mmol）、碳酰氯（3.4ml于二噁烷中的5M溶液，17mmol）和80ml乙酸乙酯组成的溶液中滴加N-甲基吗啉（3.4g，34mmol）。将反应混合物搅拌0.5小时。加入于乙酸乙酯（10ml）中的L-丙氨酸-N-羧酸酐（0.23g，2.0mmol），于-50℃下搅拌此混合物0.75小时。加入N-甲基吗啉（1.0g，10mmol），再于-50℃下继续搅拌0.75小时。滤去固体，浓缩溶液，与己烷研磨后得到产物。从甲苯中重结晶后得到0.28g（65%）N-叔-丁氧羰基-L-丙氨酸-N-羧酸酐。mp103-104.5℃;NMR（CDCl3）δ4.71（q，1H，J＝7Hz），1.80（d，3H，J＝7Hz），1.70（s，9H）。元素分析：C8H13NO5计算值：C，50.23;H，6.09;N，6.51。实测值：C，56.66;H，6.36;N，6.38。
实施例14
N-（叔丁氧羰基）-O-苄基-L-丝氨酸-N-羧酸酐
A.按实施例2A所述的方法制备O-苄基-L-丝氨酸-N-羧酸酸，产率为68%。
B。重复实施例13的操作，所不同的是用O-苄基-L-丝氨酸-N-羧酸酐代替L-丙氨酸-N-羧酸酐，得到N-（叔-丁氧羰基）-O-苄基-L-丝氨酸-N-羧酸酐，产率为52%。mp98-99.5℃;NMR（CCl4）δ7.30（m，5H），4.64（m，3H，苄基CH2和NCA环质子），4.09（dd，1H，J＝15，5Hz），3.88（dd，1H，J＝15，5Hz），1.65（s，9H）;元素分析：C15H19NO6计算值：C，59.80;H，5.96;N，4.36。实测值：C，59.71;H，6.25;N，4.05。
实施例15
1-氨基-1-环己烷羧酸-N-羧酸酐的苯氧羧基衍生物
A.按实施例2A所述的方法从1-氨基-1-环己烷羧酸制备1-氨基-1-环己烷羧酸-N-羧酸酐，产率为50%。
B。在0℃下，向由于A中制备的N-羧酸酐（0.85g，5.0mmol）、苯基氯甲酸酯（1.2g，7.5mmol）和乙酸乙酯（30ml）组成的溶液中加入由N-甲基吗啉（0.76g，7.5mmol）和8ml乙酸乙酯组成的溶液。在0℃下将此反应混合物搅拌2小时，过滤，浓缩。将得到的白色半固体从乙醚/二氯甲烷/己烷中重结晶，得到0.92g（66%）标题所示N-羧酸酐。mp156.5-158℃;NMR（CDCl3）δ7.28（m，5H），1.20-3.10（m，10H）。元素分析：C15H15NO5计算值：C，62.27;H，5.23;N，4.84。实测值：C，62.03;H，5.22;N，4.77。
实施例16
N-（9-芴基甲氧羰基）-L-亮氨酸-N-羧酸酐
A.按实施例2A所述的方法从L-亮氨酸制备L-亮氨酸-N-羧酸酐，产率为78%。
B.将由L-亮氨酸-N-羧酸酐（9.2g，58.4mmol）和干燥的、蒸馏过的乙酸乙酯（150ml）组成的混合物冷却至-10℃，然后用5分钟滴加由三乙胺（9ml，64mmpl）和20ml乙酸乙酯组成的溶液。停止冷却，搅拌反应混合物15分钟。加入少量于二烷中的氯化氢（4.4M，5ml）以保证所有的三乙胺被中和。过滤反应混合物，减压除去溶剂。将得到的粗产物用乙酸乙酯萃取，过滤，加入己烷后结晶，得到产物。
再经三次小心操作的结晶后，得到3.6g（16%）N-（9-芴基甲氧羰基）-L-亮氨酸-N-羧酸酐。分析数据与实施例3中所得化合物基本相同。
实施例17
L-亮氨酰-L-缬氨酸
将与对-烷氧苄基醇酯化的9-芴基甲氧羰基L-缬氨酸与2%高联聚苯乙烯衍生物（0.25g，0.13mmol缬氨酸）置于一个固相肽合成器中。加入5ml二甲基甲酰胺，将得到的浆状物振荡30分钟。除去二甲基甲酰胺，用10%的于二甲基甲酰胺中的哌啶溶液处理溶胀的树脂两次（用5ml处理5分钟，再用5ml处理15分钟），除去9-15芴基甲氧羰基保护基。用二甲基甲酰胺（4×5ml）洗涤树脂，再与于二甲基甲酰胺（6ml）中的9-芴基甲氧羰基-L-亮氨酸-N-羧酸酐（145mg，0.38mmol）反应45分钟。按上述方法除去芴基甲氧羰基保护基，用二甲基甲酰胺（3×5ml）和二氯甲烷（3×5ml）洗涤树脂。通过用二氯甲烷/三氟乙酸（6ml，1/1）处理45分钟将得到的二肽从树脂中除去。除去溶液，用二氯甲烷（3×5ml）和甲醇（2×5ml）洗涤树脂。减压蒸发合并的溶液和洗涤液，得半固体，将该半固体溶于蒸馏水中并过滤。冷冻干燥水溶液，将得到的固体与乙醚（3×        ）一起研磨以除去树脂污染物，减压干燥后得到L-亮氨酰-L-缬氨酸，产率大于90%。用高效液相色谱分析（流速：1.5ml/min，于215nm测定，30%甲醇于0.5M高氯酸中），通过与一已知标准品（保留时间8.49分钟）共洗脱确证该二肽。测定纯度大于97%，所有的杂质为树脂。没有检测到D-亮氨酰-L-缬氨酸（保留时间32分钟）（检测极限小于0.1%）。
实施例18
L-亮氨酰-L-缬氨酸
重复实施例17的操作，所不同的是以二氯甲烷（5ml）代替二甲基甲酰胺作溶剂，使9-芴基甲氧羰基-L-亮氨酸-N-羧酸酐与L-缬氨酸的游离胺在树脂上反应。结果与实施例17相似。
实施例19
L-亮氨酰-L-丙氨酰-L-缬氨酸（FMOC方法）
按实施例16的方法制备L-亮氨酰-L-丙氨酰-L-缬氨酸。从树脂上分离并用乙醚洗涤后，得到三肽白色固体，产率大于88%。采用实施例16所述的条件，通过该产物与已知标准品共洗脱（保留时间16.28分钟），用高效液相色谱分析确证产物。没有检测到L-亮氨酰-L-缬氨酸和L-丙氨酰-L-缬氨酸（检测极限小于0.1%）。
实施例20
L-亮氨酰-L-丙氨酰-L-缬氨酸（Boc方法）
将与甲基化的2%交联聚苯乙烯酯化的叔-丁氧羰基-L-缬氨酸（即Merryfield        resin）（0.50g，0.23mmol缬氨酸）放在一个固相肽合成器中。加入二氯甲烷（5ml），将浆状物振荡30分钟。除去溶剂，用二氯甲烷/三氟乙酸（1/1，6ml）处理树脂30分钟以除去叔-丁氧羰基保护基。用二氯甲烷（3×5ml）洗涤树脂，用于二氯甲烷中的10%三乙胺（5ml）中和，用二氯甲烷洗涤（3×5ml），然后与由叔-丁氧羰基-L-丙氨酸-N-羧酸酐（200mg，1.0mmol）与二氯甲烷（5ml）组成的溶液反应45分钟。用二氯甲烷（3×5ml）洗涤得到的保护的二肽树脂。树脂再次按上述方法解封，洗涤，中和并洗涤。向树脂中加入于二氯甲烷（6ml）中的叔-丁氧羰基-L-亮氨酸-N-羧酸酐（240mg，1.0mmol），将混合物振荡45分钟。除去溶液，用二氯甲烷（3×5ml）、甲醇（3×5ml）和二氯甲烷（3×5ml）洗涤树脂，在高真空下干燥。在0℃下，使叔-丁氧羰基保护的三肽树脂与液体氟化氢反应30分钟。除去氟化氢，在高真空下干燥残余物。将肽溶于水中，滤去树脂。冷冻干燥溶液，得到一定量纯净的L-亮氨酰-L-丙氨酰-L-缬氨酸。高效液相色谱分析结果与实施例18相似。
实施例21
L-丙氨酰-L-苯丙氨酸（完全保护法）
A。在0℃下，向于四氢呋喃（20ml）中的L-苯丙氨酸苄酯对甲苯磺酸盐（1.07g，2.5mmol）加入N-甲基吗啉（0.25g，2.5mmol）。在0℃下搅拌该混合物0.5小时，加入N-苄氧羰基-L-丙氨酸-N-羧酸酐（0.50g，2.0mmol）。在0℃将该反应混合物搅拌2小时，加入水（20ml）和二氯甲烷（50ml）。分离水层和有机层，用二氯甲烷（25ml）洗涤水层，合并有机层，用0.5MHCl（2×50ml）、10%碳酸氢钠（50ml）和水（2×50ml）洗涤，用MgSO4干燥，浓缩。加入己烷后出现结晶，得到0.66g（72%）N-苄氧羰基-L-丙氨酰-L-苯丙氨酸苄基酯。mp118.5-119℃;NMR（CDCl3）δ7.64（s，1H），6.82-7.39（m，6H），5.04（s，2H），5.00（s，2H），4.58-4.92（m，2H），3.07（d，j＝6Hz，2H）1.29（d，j＝7Hz，3H）。
B.在20℃下，将由N-苄氧羰基-L-丙氨酰-L-苯丙氨酸苄基酯（0.50g，1.1mmol）、10%披钯炭（0.1g）和乙醇（150ml）在Parr加氢器中振荡6.5小时。过滤反应混合物，用水（100ml）洗涤滤液。浓缩溶液，得到0.26g（100%）L-丙氨酰-L-苯丙氨酸。高效液相色谱证明，其纯度大于99%，且没有发现外消旋体。
实施例22
L-丙氨酰-L-苯丙氨酸（部分保护法）
A。在0℃下，向由L-苯丙氨酸（0.33g，2.0mmol）0.20M碳酸钾（20ml）和乙腈（30ml）组成的溶液中滴加由N-苄氧羰基-L-丙氨酸-N-羧酸酐（0.45g，1.8mmol）和乙腈（5ml）组成的溶液。在0℃下搅拌该混合物40分钟，用乙酸乙酯（50ml）和1M盐酸（10ml）稀释。分离水层和有机层，用乙酸乙酯（2×35ml）萃取水层。合并有机层，用盐水（30ml），0.5M盐酸（2×50ml）和水（2×50ml）洗涤，用MgSO4干燥，浓缩。残余物从氯仿/己烷中重结晶，得到0.26g（39%）N-苄氧羰基-L-丙氨酰-L-苯丙氨酸。mp121-122℃ NMR（DMSO-d6）δ12.71（s，1H），8.06（m，1H），7.30（m，5H），5.01（s，2H），4.43（m，1H），4.06（m，1H），2.99（m，2H），11.19（d，2H，j＝7Hz）。
B.在20℃下，将由N-苄氧羰基-L-丙氨酰-L-苯丙氨酸（0.208g，0.562mmol）、10%披钯炭（0.1g）和95%乙醇（50ml）组成的混合物于Parr加氢器中振荡16小时。过滤反应混合物，用水（100ml）洗涤滤液。浓缩合并的溶液，得到0.122g（92%）L-丙氨酰-L-苯丙氨酸，为白色固体。高效液相色谱分析表明，其纯度大于99.5%，没有发现外消旋体。

Claims (38)

1、制备具有下式结构的尿烷保护的氨基酸N-羧酸酐或氨基酸N-硫代羧酸酐的方法：
Figure 891013334_IMG2
式中：
R和R′为氢、烷基、环烷基取代的环烷基、芳基或取代的芳基，R″为烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基；Z为氧或硫，n为0、1或2，该方法包括：使具有下式结构的氨基酸N-羧酸酐或氨基酸N-硫代羧酸酐：
(式中R和R′的含义同上述)与具有下式结构的卤代甲酸酯：
Figure 891013334_IMG4
(式中X为卤素，R″的含义同上述)在惰性稀释剂中，在无水条件及有叔胺碱存在的条件下反应。
2、根据权利要求1的方法，其中R″为有1～20个碳原子的烷基。
3、根据权利要求2的方法，其中R″为低级烷基或取代的低级烷基。
4、根据权利要求3的方法，其中R″为叔丁基。
5、根据权利要求1的方法，其中R″为芳基或取代的芳基。
6、根据权利要求5的方法，其中R″为苯基或取代的苯基。
7、根据权利要求1的方法，其中R″为芳烷基或取代的芳烷基。
8、根据权利要求7的方法，其中R″为苄基或取代的苄基。
9、根据权利要求8的方法，其中对甲氧基苄基。
10、根据权利要求7的方法，其中R″为9-基甲基或取代的9-基甲基。
11、根据权利要求1～10中任一项的方法，其中R与R′中至少有一个是已保护或未保护的氨基酸的侧链。
12、根据权利要求11的方法，其中R或R′是丙氨酸侧链。
13、根据权利要求11的方法，其中R或R′是精氨酸或适当保护起来的精氨酸的侧链。
14、根据权利要求11的方法，其中R或R′是天冬氨酸或适当保护起来的天冬氨酸的侧链。
15、根据权利要求11的方法，其中R或R′是天冬酰胺或适当保护起来的天冬酰胺的侧链。
16、根据权利要求11的方法，其中R或R′是半胱氨酸或适当保护起来的半胱氨酸的侧链。
17、根据权利要求11的方法，其中R或R′是胱氨酸侧链。
18、根据权利要求11的方法，其中R或R′是谷氨酸或适当保护起来的谷氨酸的侧链。
19、根据权利要求11的方法，其中R或R′是谷氨酰胺或适当保护起来的谷氨酰胺的侧链。
20、根据权利要求11的方法，其中R或R′是组氨酸或适当保护起来的组氨酸的侧链。
21、根据权利要求11的方法，其中R或R′是异亮氨酸侧链。
22、根据权利要求11的方法，其中R或R′是适当保护起来的赖氨酸的侧链。
23、根据权利要求11的方法，其中R或R′是亮氨酸侧链。
24、根据权利要求11的方法，其中R或R′是甲硫氨酸侧链。
25、根据权利要求11的方法，其中R或R′是正亮氨酸侧链。
26、根据权利要求11的方法，其中R或R′是适当保护起来的鸟氨酸的侧链。
27、根据权利要求11的方法，其中R或R′是苯丙氨酸侧链。
28、根据权利要求11的方法，其中R或R′是丝氨酸或适当保护起来的丝氨酸的侧链。
29、根据权利要求11的方法，其中R或R′是苏氨酸或适当保护起来的苏氨酸的侧链。
30、如权利要求11所述方法，其中R或R′是色氨酸或适当保护的色氨酸的侧链。
31、如权利要求11所述方法，其中R或R′是酪氨酸或适当保护的酪氨酸的侧链。
32、如权利要求11所述方法，其中R或R′是缬氨酸侧链。
33、如权利要求11的方法，其中R或R′是高丝氨酸或适当保护的高丝氨酸的侧链。
34、一种合成多肽链的方法，其中是让被保护的氨基酸成分与相似或不相似的另一个氨基酸成分反应，重复这一过程直至获得所需多肽，其特征在于使用具有下列通式的化合物作为至少一个上述反应中的被保护的氨基酸成分：
其中R和R′为氢原子、烷基、芳基、取代烷基或取代芳基;R″为烷基、芳基、取代烷基或取代芳基;Z为氧原子或硫原子;n为0、1或2。
35、在可溶或不溶支持物上的多肽的固相合成法，其中被保护的氨基酸成分是通过缩合反应而被偶联至含有可与所说氨基酸成分的羧基末端反应的取代基团的支持物上;将偶联的被保护氨基酸成分去保护，如果需要，进行中和;将相似或不相似的另一个保护的氨基酸成分偶联至所说的去保护的氨基酸成分上;重复该过程，直至获得所需多肽，
其特征在于，在至少一个所说反应中使用具有下列通式的化合物作为被保护的氨基酸成分：
其中R和R′为氢原子、烷基、环烷基、取代的烷基、取代的环烷基、芳基或取代的芳基;R″为烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基;Z为氧原子或硫原子;n为0、1或2。
36、合成多肽链的方法，其中使被保护的氨基酸成分与相似的或不相似的另一个氨基酸成分反应，重复该过程，直至获得所需多肽，其特征在于：在至少一个上述反应中使用一种化合物作为被保护的氨基酸成分，而该化合物是按照权利要求1～33中任何一项所述的方法制备的。
37、如权利要求1～33中任一项所述的方法，其中叔胺碱为N-甲基吗啉。
38、如权利要求1～33中任一项及权利要求37所述的方法，其中尿烷保护的氨基酸N-羧酸酐反应产物是通过结晶来回收。
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