CN104039342A

CN104039342A - 拟肽大环化合物

Info

Publication number: CN104039342A
Application number: CN201280062579.3A
Authority: CN
Inventors: N·卡瓦哈塔; V·格拉维斯; M·萨曼特
Original assignee: Aileron Therapeutics Inc
Current assignee: Aileron Therapeutics Inc
Priority date: 2011-10-18
Filing date: 2012-10-18
Publication date: 2014-09-10
Also published as: US20160137710A1; US10308699B2; TW201326200A; CN108929375A; JP6342808B2; US9522947B2; MX358886B; MX2014004644A; KR20140100937A; TW201806968A; AR088392A1; AU2012326026A1; US20130123169A1; RU2639523C2; RU2014119673A; JP2014530868A; AU2012326026B2; TWI643868B; EP2768518A1; AU2017204332A1

Abstract

本发明提供了能够调节生长激素水平的拟肽大环化合物，以及使用这类大环化合物治疗疾病的方法。

Description

拟肽大环化合物

交叉引用

本申请要求2011年10月18日提交的美国临时申请系列号61/548,690的优先权，该临时申请通过引用整体并入本文。

发明背景

人GHRH(生长激素释放激素)是一种44个氨基酸的肽，其全部生物活性存在于其前29个氨基酸(“GHRH1-29”)中。GHRH与GHRH受体结合，并激活GH[生长激素]的脉冲式分泌，通过这种作用机制，GHRH成为具有完整脑垂体的患者中的GH疗法的替代疗法，其可最小化与长期GH给药相关的副作用。因为由GHRH诱导的GH释放量受到发挥负反馈效应的IGF-1水平的限制，所以采用GHRH疗法时与过量GH分泌有关的副作用的风险也可能比采用GH疗法时更低。此外，用GHRH治疗可导致一组更广泛的GH蛋白质的垂体分泌，而不只是由重组人GH提供的22-kDa形式，该形式也可具有有益效果。在临床上，GHRH已被证明在提高成人和儿童的GH水平上是安全而有效的，并且GHRH的促生长作用与给药剂量和频率相关联。然而，GHRH在静脉内注射后的半衰期只有10-12min，这显著限制了其作为治疗剂的应用。因此，对于具有延长的体内半衰期的GHRH类似物存在临床需求，其可以用改进(较不频繁)的给药方案提供更大的治疗益处。

发明内容

本发明提供了GHRH衍生的拟肽大环化合物，其被设计成具有相对于GHRH改善的药学性质。这些改善的性质包括增强的化学稳定性、延长的体内半衰期、增加的功效和降低的免疫原性。这些拟肽大环化合物对提高GH的循环水平是有用的，作为针对肌肉萎缩病、脂质营养不良、生长激素紊乱、胃轻瘫/短肠综合征以及GH的升高将提供治疗益处的其它状况的治疗。

下面描述了由GHRH肽衍生的稳定交联的肽。这些交联的肽含有至少两个修饰的氨基酸，这些氨基酸一起形成分子内交联，该分子内交联可帮助稳定被认为对于GHRH受体处的激动剂活性至关重要的GHRH一部分的α螺旋二级结构。相对于野生型肽的氨基酸序列，任何对于该肽的生长激素释放活性而言非必需的氨基酸可被其它任何氨基酸所取代，而对于该肽的生长激素释放活性而言必需的氨基酸只可被基本上不降低所述活性的氨基酸类似物所取代。

因此，本文描述的交联多肽可具有相对于对应的非交联多肽改善的生物活性。不受理论所束缚，GHRH拟肽大环化合物被认为可激活GHRH受体，从而刺激生长激素的产生和释放，这可以增加瘦肌质量或减少脂肪组织(如腹部脂肪组织)。例如，可减少患有肥胖症(包括腹部肥胖症)的受试者的脂肪组织。本文描述的GHRH拟肽大环化合物可治疗性地使用，例如，用于治疗包括食欲缺乏、恶病质(如癌症恶病质、慢性心力衰竭恶病质、慢性阻塞性肺疾病恶病质、类风湿性关节炎恶病质)和少肌症在内的肌肉萎缩病，治疗包括HIV脂质营养不良在内的脂质营养不良，治疗包括成人和儿童生长激素缺乏在内的生长激素紊乱，或者治疗胃轻瘫或短肠综合征。例如，儿童生长激素缺乏可能与特发性身材矮小症、SGA(小于胎龄儿)、慢性肾病、普拉德-威利综合征(Prader-Willisyndrome)、特纳综合征、身材矮小同源框(SHOX)基因缺乏或原发性IGF-1缺乏相联系或相关联。

在一个方面，本发明提供一种拟肽大环化合物，其包含与GHRH1-44、GHRH1-29和/或选自表1、2或4中氨基酸序列的氨基酸序列至少约60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。或者，所述拟肽大环化合物的氨基酸序列选自表1、2或4中的氨基酸序列。该拟肽大环化合物可包含一个、两个、三个、四个、五个或更多个大环形成连接体，其中各个大环形成连接体将该拟肽大环化合物内的一个氨基酸连接至另一个氨基酸。例如，拟肽大环化合物包含至少两个大环形成连接体，其中所述至少两个大环形成连接体中的第一个将第一氨基酸连接至第二氨基酸，而所述至少两个大环形成连接体中的第二个将第三氨基酸连接至第四氨基酸。在一些实施方案中，该拟肽大环化合物恰好包含两个大环形成连接体。在其它实施方案中，该拟肽大环化合物恰好包含一个大环形成连接体。

大环形成连接体连接任意两个可被交联的氨基酸，而不损害拟肽大环化合物的活性。在一些实施方案中，大环形成连接体连接以下氨基酸对(参考与GHRH1-29对齐的任何序列编号)之一：4和8；5和12；8和12；8和15；9和16；12和16；12和19；15和22；18和25；21和25；21和28；22和29；25和29。例如，大环形成连接体连接以下氨基酸对之一：4和8；5和12；12和19；15和22；18和25；21和25；21和28。在一些实施方案中，第一大环形成连接体连接氨基酸对4和8；5和12；8和12；8和15；9和16；12和16；或12和19；而第二大环形成连接体连接氨基酸对15和22；18和25；21和25；21和28；22和29；或25和29。例如，第一大环形成连接体连接氨基酸对4和8；5和12；或12和19；而第二大环形成连接体连接氨基酸对15和22；18和25；21和25；或21和28。在一些实施方案中，第一大环形成连接体连接氨基酸对4和8，而第二大环形成连接体连接氨基酸对21和25。

在一些实施方案中，拟肽大环化合物包含与GHRH1-44、GHRH1-29和/或选自表1、2或4中氨基酸序列的氨基酸序列至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，并且进一步包含将第一氨基酸连接至第二氨基酸的大环形成连接体，其中该第一和第二氨基酸选自以下氨基酸对：4和8；5和12；8和12；8和15；9和16；12和16；12和19；15和22；18和25；21和25；21和28；22和29。例如，大环形成连接体连接氨基酸12和19。

在一些实施方案中，拟肽大环化合物包含选自表1、2或4中的氨基酸序列的序列，或者该拟肽大环化合物的氨基酸序列选自表1、2或4中的氨基酸序列。

在一些实施方案中，该拟肽大环化合物包含螺旋，如α-螺旋或3₁₀螺旋。在其它实施方案中，该拟肽大环化合物包含α,α-二取代的氨基酸。例如，通过大环形成连接体连接的至少一个氨基酸或各个氨基酸为α,α-二取代的氨基酸。

在一些实施方案中，本发明的拟肽大环化合物包含连接至少两个氨基酸的α-位点的交联体(crosslinker)。

在一些实施方案中，所述拟肽大环化合物具有下式：

其中：

A、C、D和E各自独立地为氨基酸；

B为氨基酸、[-NH-L₃-CO-]、[-NH-L₃-SO₂-]或[-NH-L₃-]；

R₁和R₂独立地为–H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素–取代的；

R₃为氢、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、环烷基烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选地被R₅取代；

L为式–L₁–L₂–的大环形成连接体；

并且其中A、B、C、D和E，连同通过大环形成连接体L连接的交联氨基酸一起，形成该拟肽大环化合物的氨基酸序列，该氨基酸序列与GHRH1-44、GHRH1-29和/或选自表1、2或4中氨基酸序列的氨基酸序列至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同；

L₁和L₂独立地为亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基、亚杂环芳基或[-R₄-K-R₄-]_n，它们各自任选地被R₅取代；

各个R₄为亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基；

各个K为O、S、SO、SO₂、CO、CO₂或CONR₃；

各个R₅独立地为卤素、烷基、-OR₆、-N(R₆)₂、-SR₆、-SOR₆、-SO₂R₆、-CO₂R₆、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；

各个R₆独立地为–H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；

R₇为–H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选地被R₅取代，或是与D残基形成的环状结构的一部分；

R₈为–H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选地被R₅取代，或是与E残基形成的环状结构的一部分；

v和w独立地为1-1000的整数，例如1-500、1-200、1-100、1-50、1-40、1-25、1-20、1-15或1-10；

u、x、y和z独立地为0-10的整数，例如u为1、2或3；且

n为1-5的整数。例如，u为2。在一些实施方案中，x+y+z的总和为2、3或6，例如3或6。

在一些实施方案中，式(I)的拟肽大环化合物具有下式：

其中A、C、D和E各自独立地为氨基酸；

B为氨基酸、[-NH-L₃-CO-]、[-NH-L₃-SO₂-]或[-NH-L₃-]；

L’为式–L₁’–L₂’–的大环形成连接体；

并且其中A、B、C、D和E，连同通过大环形成连接体L和L’连接的交联氨基酸一起，形成该拟肽大环化合物的氨基酸序列；

R₁’和R₂’独立地为–H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素–取代的；

L₁’和L₂’独立地为亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基、亚杂环芳基或[-R₄-K-R₄-]_n，它们各自任选地被R₅取代；

各个K独立地为O、S、SO、SO₂、CO、CO₂或CONR₃；

R₇’为–H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选地被R₅取代，或是与D残基形成的环状结构的一部分；

R₈’为–H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选地被R₅取代，或是与E残基形成的环状结构的一部分；

v’和w’独立地为1-1000的整数，例如1-500、1-200、1-100、1-50、1-40、1-25、1-20、1-15或1-10；

x’、y’和z’独立地为0-10的整数；且

n为1-5的整数。在一些实施方案中，x’+y’+z’的总和为2、3或6，例如3或6。

在任意本文描述的拟肽大环化合物的一些实施方案中，各个K为O、S、SO、SO₂、CO或CO₂。

在其它实施方案中，所述拟肽大环化合物可包含将该拟肽大环化合物内的第一氨基酸的骨架氨基连接至第二氨基酸的交联体。例如，本发明提供式(II)或(IIa)的拟肽大环化合物：

其中：

A、C、D和E各自独立地为氨基酸；

B为氨基酸、[-NH-L₃-CO-]、[-NH-L₃-SO₂-]或[-NH-L₃-]；

R₁和R₂独立地为–H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素–取代的，或是与E残基形成的环状结构的一部分；

并且其中A、B、C、D和E，连同通过大环形成连接体-L₁-L₂-连接的交联氨基酸一起，形成该拟肽大环化合物的氨基酸序列，该氨基酸序列与GHRH1-44、GHRH1-29和/或选自表1、2或4中氨基酸序列的氨基酸序列至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同；

各个K为O、S、SO、SO₂、CO、CO₂或CONR₃；

R₇为–H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选地被R₅取代；

u、x、y和z独立地为0-10的整数，例如u为1-3；且

n为1-5的整数。

本文还提供了包含下式的氨基酸序列的拟肽大环化合物：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-X25-X26-X27-X28-X29

其中：

X1为Tyr或His；

X2为Ala、D-Ala或Val；

X3为Asp；

X4为Ala或交联氨基酸；

X5为Ile；

X6为Phe；

X7为Thr；

X8为Gln、Asn或交联氨基酸；

X9为Ser或交联氨基酸；

X10为Tyr；

X11为Arg、Ala或Gln；

X12为Lys、Ala、Gln或交联氨基酸；

X13为Val或Ile；

X14为Leu；

X15为Gly、Ala或交联氨基酸；

X16为Gln、Glu或交联氨基酸；

X17为Leu；

X18为Ser、Tyr或交联氨基酸；

X19为Ala或交联氨基酸；

X20为Arg或Gln；

X21为Lys、Gln或交联氨基酸；

X22为Leu、Ala或交联氨基酸；

X23为Leu；

X24为Gln、Glu或His；

X25为Asp、Glu或交联氨基酸；

X26为Ile；

X27为Met、Ile、Leu或Nle；

X28为Ser或交联氨基酸；

X29为Arg、Ala、Gln或交联氨基酸；

其中该拟肽大环化合物包含至少一个连接至少一对选自X1-X29的氨基酸的大环形成连接体；

L为式–L₁–L₂–的大环形成连接体；

各个K为O、S、SO、SO₂、CO或CO₂；

各个R₅独立地为卤素、烷基、-OR₆、-N(R₆)₂、-SR₆、-SOR₆、-SO₂R₆、-CO₂R₆、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；且

各个R₆独立地为–H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂。

例如，所述多肽包含至少一个或至少两个大环形成连接体，该大环形成连接体连接以下氨基酸对之一：X4和X8；X5和X12；X8和X12；X8和X15；X9和X16；X12和X16；X12和X19；X15和X22；X18和X25；X21和X25；X21和X28；X22和X29；X25和X29。例如，各个大环形成连接体连接以下氨基酸对之一：X4和X8；X5和X12；X12和X19；X15和X22；X18和X25；X21和X25；X21和X28。

在一些实施方案中，拟肽大环化合物包含式–L₁-L₂-的大环形成连接体，其中L₁和L₂独立地为亚烷基、亚烯基或亚炔基。例如，L₁和L₂独立地为C₃-C₁₀亚烷基或亚烯基或C₃-C₆亚烷基或亚烯基。

在一些实施方案中，R₁和R₂独立地为H或烷基，例如甲基。

此外，本发明提供了一种提高受试者中的生长激素(GH)循环水平的方法，一种增加受试者中的瘦肌质量的方法，以及一种减少受试者中的脂肪组织(如腹部脂肪组织)的方法，该方法包括向受试者施用本发明的拟肽大环化合物。例如，使用本发明的拟肽大环化合物来治疗患有肥胖症(包括腹部肥胖症)的患者。本发明还提供了一种治疗包括食欲缺乏、恶病质(如癌症恶病质、慢性心力衰竭恶病质、慢性阻塞性肺疾病恶病质、类风湿性关节炎恶病质)和少肌症在内的肌肉萎缩病的方法，一种治疗包括HIV脂质营养不良在内的脂质营养不良的方法，一种治疗包括成人和儿童生长激素缺乏在内的生长激素紊乱的方法，或者一种治疗胃轻瘫或短肠综合征的方法。例如，儿童生长激素缺乏可能与特发性身材矮小症、SGA(小于胎龄儿)、慢性肾病、普拉德-威利综合征、特纳综合征、身材矮小同源框(SHOX)基因缺乏或原发性IGF-1缺乏相联系或相关联。本发明还提供了一种通过施用GHRH受体激动剂(如GHRH类似物)来治疗受试者中的肌肉萎缩病、脂质营养不良、生长激素紊乱或胃轻瘫/短肠综合征的方法，其中该激动剂以不超过每天一次的频率、不超过隔天一次的频率、不超过每周两次的频率、不超过每周一次的频率或不超过隔周一次的频率施用。本发明还提供了一种通过施用GHRH受体激动剂(如GHRH类似物)来提高受试者中的生长激素(GH)循环水平的方法，其中该激动剂以不超过每天一次的频率、不超过隔天一次的频率、不超过每周两次的频率、不超过每周一次的频率或不超过隔周一次的频率施用。

援引并入

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，如同明确地和分别地指出各个单独的出版物、专利或专利申请通过引用并入本文。

附图说明

在所附的权利要求书中详细地阐述了本发明的新特征。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细说明和附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在这些附图中：

图1A和1B显示了本发明的拟肽大环化合物对于胰蛋白酶蛋白水解的提高的稳定性。

图2显示了本发明拟肽大环化合物的增强的血清稳定性。

图3和3a显示了通过本发明拟肽大环化合物的cAMP释放和胰蛋白酶半衰期测量的GHRH受体激动剂活性。对于cAMP值，“+”表示大于50nM的值；“++”表示10-50nM的值；“+++”表示1-10nM的值；“++++”表示低于1nM的值。对于胰蛋白酶半衰期，“+”表示低于50min的值；“++”表示50-100min的值；“+++”表示100-200min的值；“++++”表示大于200min的值；而“NT”表示“未检测”。

图4显示了用拟肽大环化合物SP-1进行的血浆药代动力学(PK)研究的结果。

图5显示了用拟肽大环化合物SP-8进行的血浆药代动力学研究的结果。

图6显示了用拟肽大环化合物SP-6进行的血浆药代动力学研究的结果。

图7显示了用拟肽大环化合物SP-21进行的血浆药代动力学研究的结果。

图8显示了用拟肽大环化合物SP-32进行的血浆药代动力学研究的结果。

图9显示了用拟肽大环化合物SP-1、SP-6、SP-8、SP-21和SP-32进行的血浆药代动力学研究的结果。

图10显示了拟肽大环化合物SP-8对生长激素产生的刺激。

图11显示了与拟肽大环化合物SP-1、SP-6、SP-8、SP-21和SP-32相比，由舍莫瑞林诱导的生长激素释放(AUC)。

发明详述

如本文所用的，术语“大环化合物”是指这样一种分子，该分子具有包括由至少9个共价键合的原子形成的环或环形的化学结构。

如本文所用的，术语“拟肽大环化合物”或“交联的多肽”是指包含通过多个肽键连接的多个氨基酸残基和至少一个大环形成连接体的化合物，所述大环形成连接体在第一天然存在的或非天然存在的氨基酸残基(或类似物)与同一分子内的第二天然存在的或非天然存在的氨基酸残基(或类似物)之间形成大环。拟肽大环化合物包括其中大环形成连接体将第一氨基酸残基(或类似物)的α碳连接至第二氨基酸残基(或类似物)的α碳的实施方案。拟肽大环化合物任选地包含处于一个或多个氨基酸残基和/或氨基酸类似物残基之间的一个或多个非肽键，且除了形成大环化合物的任意残基外，任选地还包含一个或多个非天然存在的氨基酸残基或氨基酸类似物残基。当在拟肽大环化合物的背景下提及时，“相应的非交联多肽”被理解为涉及与该大环化合物长度相同并且包含对应于该大环化合物的野生型序列的等同天然氨基酸的多肽。

如本文所用的，术语“稳定性”是指如通过圆二色性、NMR或另一种生物物理测量法测量的，本发明的拟肽大环化合物在溶液中维持确定的二级结构，或在体外或体内对蛋白水解降解作用的抗性。本发明所预期的二级结构的非限制性例子是α-螺旋、3₁₀螺旋、β-转角和β-折叠。

如本文所用的，术语“螺旋稳定性”是指如通过圆二色性或NMR测量的，本发明的拟肽大环化合物维持α-螺旋结构。例如，在一些实施方案中，与相应的非交联的大环化合物相比，如通过圆二色性确定的，本发明的拟肽大环化合物在α-螺旋度上表现出至少1.25、1.5、1.75或2倍的增加。

术语“氨基酸”是指同时含有氨基和羧基的分子。合适的氨基酸包括但不限于天然存在的氨基酸的D-和L-异构体，以及通过有机合成或其它代谢途径制备的非天然存在的氨基酸。本文所用的术语氨基酸包括但不限于α-氨基酸、天然氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物。

术语“α-氨基酸”是指含有的氨基和羧基都结合到被指定为α-碳的碳上的分子。

术语“β-氨基酸”是指含有均为β构型的氨基和羧基的分子。

术语“天然存在的氨基酸”是指在自然界合成的肽中通常发现的20种氨基酸中的任一种，已知其单字母缩写为A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V。

下表示出了天然氨基酸的性质一览：

“疏水性氨基酸”包括小疏水性氨基酸和大疏水性氨基酸。“小疏水性氨基酸”为甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸及其类似物。“大疏水性氨基酸”为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸及其类似物。“极性氨基酸”为丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、酪氨酸及其类似物。“带电氨基酸”为赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸及其类似物。

术语“氨基酸类似物”是指在结构上类似于氨基酸并且在拟肽大环化合物的形成中可代替氨基酸的分子。氨基酸类似物包括但不限于β-氨基酸和其中氨基或羧基被相似反应性的基团取代(例如，用仲胺或叔胺取代伯胺，或用酯取代羧基)的氨基酸。

术语“非天然氨基酸”是指并非在自然界合成的肽中通常发现的二十种氨基酸(已知其单字母缩写为A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V)之一的氨基酸。非天然氨基酸或氨基酸类似物包括但不限于根据以下的结构：

氨基酸类似物包括β-氨基酸类似物。β-氨基酸类似物的实例包括但不限以下：环状β-氨基酸类似物；β-丙氨酸；(R)-β-苯丙氨酸；(R)-1,2,3,4-四氢-异喹啉-3-乙酸；(R)-3-氨基-4-(1-萘基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2,4-二氯苯基)丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-氯苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-氰基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-氟苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-呋喃基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-甲苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-萘基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-噻吩基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-三氟甲苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3,4-二氯苯基)丁酸；(R)-3-氨基-4-(3,4-二氟苯基)丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-苯并噻吩基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-氯苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-氰基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-氟苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-甲苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-吡啶基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-噻吩基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-三氟甲苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-溴苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-氯苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-氰基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-氟苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-碘苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-甲苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-硝基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-吡啶基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-三氟甲苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-五氟-苯基丁酸；(R)-3-氨基-5-己烯酸；(R)-3-氨基-5-己炔酸；(R)-3-氨基-5-苯基戊酸；(R)-3-氨基-6-苯基-5-己烯酸；(S)-1,2,3,4-四氢-异喹啉-3-乙酸；(S)-3-氨基-4-(1-萘基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2,4-二氯苯基)丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-氯苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-氰基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-氟苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-呋喃基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-甲苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-萘基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-噻吩基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-三氟甲苯基)-丁酸；

(S)-3-氨基-4-(3,4-二氯苯基)丁酸；(S)-3-氨基-4-(3,4-二氟苯基)丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-苯并噻吩基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-氯苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-氰基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-氟苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-甲苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-吡啶基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-噻吩基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-三氟甲苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-溴苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-氯苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-氰基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-氟苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-碘苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-甲苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-硝基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-吡啶基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-三氟甲苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-五氟-苯基丁酸；(S)-3-氨基-5-己烯酸；(S)-3-氨基-5-己炔酸；(S)-3-氨基-5-苯基戊酸；(S)-3-氨基-6-苯基-5-己烯酸；1,2,5,6-四氢吡啶-3-甲酸；1,2,5,6-四氢吡啶-4-甲酸；3-氨基-3-(2-氯苯基)-丙酸；3-氨基-3-(2-噻吩基)-丙酸；3-氨基-3-(3-溴苯基)-丙酸；3-氨基-3-(4-氯苯基)-丙酸；3-氨基-3-(4-甲氧苯基)-丙酸；3-氨基-4,4,4-三氟-丁酸；3-氨基己二酸；D-β-苯丙氨酸；β-亮氨酸；L-β-高丙氨酸；L-β-高天冬氨酸γ-苄酯；L-β-高谷氨酸δ-苄酯；L-β-高异亮氨酸；L-β-高亮氨酸；L-β-高甲硫氨酸；L-β-高苯丙氨酸；L-β-高脯氨酸；L-β-高色氨酸；L-β-高缬氨酸；L-Nω-苄氧羰基-β-高赖氨酸；Nω-L-β-高精氨酸；O-苄基-L-β-高羟脯氨酸；O-苄基-L-β-高丝氨酸；O-苄基-L-β-高苏氨酸；O-苄基-L-β-高酪氨酸；γ-三苯甲基-L-β-高天冬酰胺；(R)-β-苯丙氨酸；L-β-高天冬氨酸γ-叔丁酯；L-β-高谷氨酸δ-叔丁酯；L-Nω-β-高赖氨酸；Nδ-三苯甲基-L-β-高谷氨酰胺；Nω-2,2,4,6,7-五甲基-二氢苯并呋喃-5-磺酰基-L-β-高精氨酸；O-叔丁基-L-β-高羟基-脯氨酸；O-叔丁基-L-β-高丝氨酸；O-叔丁基-L-β-高苏氨酸；O-叔丁基-L-β-高酪氨酸；2-氨基环戊烷羧酸；和2-氨基环己烷羧酸。

氨基酸类似物包括丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸或亮氨酸的类似物。丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸或亮氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于以下：α-甲氧基甘氨酸；α-烯丙基-L-丙氨酸；α-氨基异丁酸；α-甲基-亮氨酸；β-(1-萘基)-D-丙氨酸；β-(1-萘基)-L-丙氨酸；β-(2-萘基)-D-丙氨酸；β-(2-萘基)-L-丙氨酸；β-(2-吡啶基)-D-丙氨酸；β-(2-吡啶基)-L-丙氨酸；β-(2-噻吩基)-D-丙氨酸；β-(2-噻吩基)-L-丙氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-D-丙氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-L-丙氨酸；β-(3-吡啶基)-D-丙氨酸；β-(3-吡啶基)-L-丙氨酸；β-(4-吡啶基)-D-丙氨酸；β-(4-吡啶基)-L-丙氨酸；β-氯-L-丙氨酸；β-氰基-L-丙氨酸；β-环己基-D-丙氨酸；β-环己基-L-丙氨酸；β-环戊烯-1-基-丙氨酸；β-环戊基-丙氨酸；β-环丙基-L-Ala-OH·二环己基铵盐；β-叔丁基-D-丙氨酸；β-叔丁基-L-丙氨酸；γ-氨基丁酸；L-α,β-二氨基丙酸；2,4-二硝基-苯基甘氨酸；2,5-二氢-D-苯基甘氨酸；2-氨基-4,4,4-三氟丁酸；2-氟-苯基甘氨酸；3-氨基-4,4,4-三氟-丁酸；3-氟-缬氨酸；4,4,4-三氟-缬氨酸；4,5-脱氢-L-leu-OH·二环己基铵盐；4-氟-D-苯基甘氨酸；4-氟-L-苯基甘氨酸；4-羟基-D-苯基甘氨酸；5,5,5-三氟-亮氨酸；6-氨基己酸；环戊基-D-Gly-OH·二环己基铵盐；环戊基-Gly-OH·二环己基铵盐；D-α,β-二氨基丙酸；D-α-氨基丁酸；D-α-叔丁基甘氨酸；D-(2-噻吩基)甘氨酸；D-(3-噻吩基)甘氨酸；D-2-氨基己酸；D-2-茚满基甘氨酸；D-烯丙基甘氨酸·二环己基铵盐；D-环己基甘氨酸；D-正缬氨酸；D-苯基甘氨酸；β-氨基丁酸；β-氨基异丁酸；(2-溴苯基)甘氨酸；(2-甲氧基苯基)甘氨酸；(2-甲苯基)甘氨酸；(2-噻唑基)甘氨酸；(2-噻吩基)甘氨酸；2-氨基-3-(二甲氨基)-丙酸；L-α,β-二氨基丙酸；L-α-氨基丁酸；L-α-叔丁基甘氨酸；L-(3-噻吩基)甘氨酸；L-2-氨基-3-(二甲氨基)-丙酸；L-2-氨基己酸二环己基-铵盐；L-2-茚满基甘氨酸；L-烯丙基甘氨酸·二环己基铵盐；L-环己基甘氨酸；L-苯基甘氨酸；L-炔丙基甘氨酸；L-正缬氨酸；N-α-氨基甲基-L-丙氨酸；D-α,γ-二氨基丁酸；L-α,γ-二氨基丁酸；β-环丙基-L-丙氨酸；(N-β-(2,4-二硝基苯基))-L-α,β-二氨基丙酸；(N-β-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己-1-基)乙基)-D-α,β-二氨基丙酸；(N-β-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧环己-1-亚基)乙基)-L-α,β-二氨基丙酸；(N-β-4-甲基三苯甲基)-L-α,β-二氨基丙酸；(N-β-烯丙氧羰基)-L-α,β-二氨基丙酸；(N-γ-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基)-D-α,γ-二氨基丁酸；(N-γ-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基)-L-α,γ-二氨基丁酸；(N-γ-4-甲基三苯甲基)-D-α,γ-二氨基丁酸；(N-γ-4-甲基三苯甲基)-L-α,γ-二氨基丁酸；(N-γ-烯丙氧羰基)-L-α,γ-二氨基丁酸；D-α,γ-二氨基丁酸；4,5-脱氢-L-亮氨酸；环戊基-D-Gly-OH；环戊基-Gly-OH；D-烯丙基甘氨酸；D-环己基高丙氨酸；L-1-芘基丙氨酸；L-2-氨基己酸；L-烯丙基甘氨酸；L-环己基高丙氨酸；和N-(2-羟基-4-甲氧基-Bzl)-Gly-OH。

氨基酸类似物包括精氨酸或赖氨酸的类似物。精氨酸和赖氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于以下：瓜氨酸；L-2-氨基-3-胍基丙酸；L-2-氨基-3-脲基丙酸；L-瓜氨酸；Lys(Me)₂-OH；Lys(N₃)-OH；Nδ-苄氧羰基-L-鸟氨酸；Nω-硝基-D-精氨酸；Nω-硝基-L-精氨酸；α-甲基-鸟氨酸；2,6-二氨基庚二酸；L-鸟氨酸；(Nδ-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代-环己-1-亚基)乙基)-D-鸟氨酸；(Nδ-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧-环己-1-亚基)乙基)-L-鸟氨酸；(Nδ-4-甲基三苯甲基)-D-鸟氨酸；(Nδ-4-甲基三苯甲基)-L-鸟氨酸；D-鸟氨酸；L-鸟氨酸；Arg(Me)(Pbf)-OH；Arg(Me)₂-OH(不对称的)；Arg(Me)₂-OH(对称的)；Lys(ivDde)-OH；Lys(Me)₂-OH·HCl；Lys(Me)₃-OH氯化物；Nω-硝基-D-精氨酸；和Nω-硝基-L-精氨酸。

氨基酸类似物包括天冬氨酸或谷氨酸的类似物。天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于以下：α-甲基-D-天冬氨酸；α-甲基-谷氨酸；α-甲基-L-天冬氨酸；γ-亚甲基-谷氨酸；(N-γ-乙基)-L-谷氨酰胺；[N-α-(4-氨基苯甲酰基)]-L-谷氨酸；2,6-二氨基庚二酸；L-α-氨基辛二酸；D-2-氨基己二酸；D-α-氨基辛二酸；α-氨基庚二酸；亚氨基二乙酸；L-2-氨基己二酸；苏-β-甲基-天冬氨酸；γ-羧基-D-谷氨酸γ,γ-二-叔丁酯；γ-羧基-L-谷氨酸γ,γ-二-叔丁酯；Glu(OAll)-OH；L-Asu(OtBu)-OH；和焦谷氨酸。

氨基酸类似物包括半胱氨酸和甲硫氨酸的类似物。半胱氨酸和甲硫氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于Cys(法呢基)-OH,Cys(法呢基)-OMe、α-甲基-甲硫氨酸、Cys(2-羟乙基)-OH、Cys(3-氨丙基)-OH、2-氨基-4-(乙硫基)丁酸、丁硫氨酸、丁硫氨酸亚砜胺、乙硫氨酸、甲硫氨酸甲基锍氯化物、硒代甲硫氨酸、磺丙氨酸、[2-(4-吡啶基)乙基]-DL-青霉胺、[2-(4-吡啶基)乙基]-L-半胱氨酸、4-甲氧苄基-D-青霉胺、4-甲氧苄基-L-青霉胺、4-甲基苄基-D-青霉胺、4-甲基苄基-L-青霉胺、苄基-D-半胱氨酸、苄基-L-半胱氨酸、苄基-DL-高半胱氨酸、氨甲酰基-L-半胱氨酸、羧乙基-L-半胱氨酸、羧甲基-L-半胱氨酸、二苯基甲基-L-半胱氨酸、乙基-L-半胱氨酸、甲基-L-半胱氨酸、叔丁基-D-半胱氨酸、三苯甲基-L-高半胱氨酸、三苯甲基-D-青霉胺、胱硫醚、高胱氨酸、L-高胱氨酸、(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸、硒代-L-胱氨酸、胱硫醚、Cys(StBu)-OH和乙酰氨甲基-D-青霉胺。

氨基酸类似物包括苯丙氨酸和酪氨酸的类似物。苯丙氨酸和酪氨酸的氨基酸类似物的实例包括β-甲基-苯丙氨酸、β-羟基苯丙氨酸、α-甲基-3-甲氧基-DL-苯丙氨酸、α-甲基-D-苯丙氨酸、α-甲基-L-苯丙氨酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸、2,4-二氯-苯丙氨酸、2-(三氟甲基)-D-苯丙氨酸、2-(三氟甲基)-L-苯丙氨酸、2-溴-D-苯丙氨酸、2-溴-L-苯丙氨酸、2-氯-D-苯丙氨酸、2-氯-L-苯丙氨酸、2-氰基-D-苯丙氨酸、2-氰基-L-苯丙氨酸、2-氟-D-苯丙氨酸、2-氟-L-苯丙氨酸、2-甲基-D-苯丙氨酸、2-甲基-L-苯丙氨酸、2-硝基-D-苯丙氨酸、2-硝基-L-苯丙氨酸、2,4,5-三羟基-苯丙氨酸、3,4,5-三氟-D-苯丙氨酸、3,4,5-三氟-L-苯丙氨酸、3,4-二氯-D-苯丙氨酸、3,4-二氯-L-苯丙氨酸、3,4-二氟-D-苯丙氨酸、3,4-二氟-L-苯丙氨酸、3,4-二羟基-L-苯丙氨酸、3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸、3,5,3’-三碘-L-甲状腺原氨酸、3,5-二碘-D-酪氨酸、3,5-二碘-L-酪氨酸、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸、3-(三氟甲基)-D-苯丙氨酸、3-(三氟甲基)-L-苯丙氨酸、3-氨基-L-酪氨酸、3-溴-D-苯丙氨酸、3-溴-L-苯丙氨酸、3-氯-D-苯丙氨酸、3-氯-L-苯丙氨酸、3-氯-L-酪氨酸、3-氰基-D-苯丙氨酸、3-氰基-L-苯丙氨酸、3-氟-D-苯丙氨酸、3-氟-L-苯丙氨酸、3-氟-酪氨酸、3-碘-D-苯丙氨酸、3-碘-L-苯丙氨酸、3-碘-L-酪氨酸、3-甲氧基-L-酪氨酸、3-甲基-D-苯丙氨酸、3-甲基-L-苯丙氨酸、3-硝基-D-苯丙氨酸、3-硝基-L-苯丙氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、4-(三氟甲基)-D-苯丙氨酸、4-(三氟甲基)-L-苯丙氨酸、4-氨基-D-苯丙氨酸、4-氨基-L-苯丙氨酸、4-苯甲酰基-D-苯丙氨酸、4-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、4-双(2-氯乙基)氨基-L-苯丙氨酸、4-溴-D-苯丙氨酸、4-溴-L-苯丙氨酸、4-氯-D-苯丙氨酸、4-氯-L-苯丙氨酸、4-氰基-D-苯丙氨酸、4-氰基-L-苯丙氨酸、4-氟-D-苯丙氨酸、4-氟-L-苯丙氨酸、4-碘-D-苯丙氨酸、4-碘-L-苯丙氨酸、高苯丙氨酸、甲状腺氨酸、3,3-二苯丙氨酸、甲状腺原氨酸、乙基-酪氨酸和甲基-酪氨酸。

氨基酸类似物包括脯氨酸的类似物。脯氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于3,4-脱氢-脯氨酸、4-氟-脯氨酸、顺-4-羟基-脯氨酸、噻唑烷-2-甲酸和反-4-氟-脯氨酸。

氨基酸类似物包括丝氨酸和苏氨酸的类似物。丝氨酸和苏氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于3-氨基-2-羟基-5-甲基己酸、2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、2-氨基-3-乙氧丁酸、2-氨基-3-甲氧丁酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-氨基-3-苄氧丙酸、2-氨基-3-苄氧丙酸、2-氨基-3-乙氧丙酸、4-氨基-3-羟基丁酸和α-甲基丝氨酸。

氨基酸类似物包括色氨酸的类似物。色氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于以下：α-甲基-色氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-D-丙氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-L-丙氨酸；1-甲基-色氨酸；4-甲基-色氨酸；5-苄氧基-色氨酸；5-溴-色氨酸；5-氯-色氨酸；5-氟-色氨酸；5-羟基-色氨酸；5-羟基-L-色氨酸；5-甲氧基-色氨酸；5-甲氧基-L-色氨酸；5-甲基-色氨酸；6-溴-色氨酸；6-氯-D-色氨酸；6-氯-色氨酸；6-氟-色氨酸；6-甲基-色氨酸；7-苄氧基-色氨酸；7-溴-色氨酸；7-甲基-色氨酸；D-1,2,3,4-四氢-去甲哈尔满-3-甲酸；6-甲氧基-1,2,3,4-四氢去甲哈尔满-1-甲酸；7-氮杂色氨酸；L-1,2,3,4-四氢-去甲哈尔满-3-甲酸；5-甲氧基-2-甲基-色氨酸；和6-氯-L-色氨酸。

在一些实施方案中，氨基酸类似物是外消旋的。在一些实施方案中，使用氨基酸类似物的D型异构体。在一些实施方案中，使用氨基酸类似物的L型异构体。在其它实施方案中，氨基酸类似物包含为R或S构型的手性中心。在又一些其它实施方案中，β-氨基酸类似物的氨基基团被诸如叔丁氧羰基(BOC基团)、9-芴甲氧羰基(FMOC)、甲苯磺酰基等保护基团取代。在再一些其它实施方案中，β-氨基酸类似物的羧酸官能团例如作为其酯衍生物被保护。在一些实施方案中，使用氨基酸类似物的盐。

“非必需”氨基酸残基是相对于多肽的野生型序列可能发生改变而不消除或基本不消除其基本生物学或生物化学活性(例如，受体结合或激活)的残基。“必需”氨基酸残基是当相对于多肽的野生型序列发生改变时导致多肽的基本生物学或生物化学活性消除或基本消除的残基。

“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所替代的氨基酸置换。本领域中已定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，K、R、H)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，D、E)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，G、N、Q、S、T、Y、C)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，A、V、L、I、P、F、M、W)、具有β分支的侧链的氨基酸(例如，T、V、I)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，Y、F、W、H)。因此，多肽中预测的非必需氨基酸残基例如被来自同一侧链家族的另一种氨基酸残基所替代。可接受的置换的其它例子是基于电子等排考虑(例如，正亮氨酸取代甲硫氨酸)或其它性质(如2-噻吩丙氨酸取代苯丙氨酸)的置换。

术语“封端基团”是指出现在本发明拟肽大环化合物的多肽链的羧基末端或氨基末端的化学部分。羧基末端的封端基团包括未修饰的羧酸(即-COOH)或具有取代基的羧酸。例如，羧基末端可被氨基取代，从而在C末端产生羧酰胺。各种取代基包括但不限于伯胺和仲胺，仲胺包括聚乙二醇化的仲胺。用于C末端的代表性的仲胺封端基团包括：

氨基末端的封端基团包括未修饰的胺(即-NH₂)或具有取代基的胺。例如，氨基末端可被酰基取代，从而在N-末端生成羧酰胺。各种取代基包括但不限于取代的酰基，包括C₁-C₆羰基、C₇-C₃₀羰基和聚乙二醇化的氨基甲酸酯。用于N-末端的代表性封端基团包括：

在本文中与大环化合物或大环形成连接体一起使用的术语“元”是指形成或可以形成大环的原子，并且不包括取代基或侧链原子。以此类推，环癸烷、1,2-二氟-癸烷和1,3-二甲基环癸烷都被认为是十元大环化合物，因为氢或氟取代基或甲基侧链都没有参与形成大环。

当用作分子结构的一部分时，符号是指单键或者反式或顺式双键。

术语“氨基酸侧链”是指连接到氨基酸中的α-碳(或另一个骨架原子)上的部分。例如，丙氨酸的氨基酸侧链是甲基，苯丙氨酸的氨基酸侧链是苯甲基，半胱氨酸的氨基酸侧链是硫甲基，天冬氨酸的氨基酸侧链是羧甲基，酪氨酸的氨基酸侧链是4-羟基苯甲基，等等。也包括其它非天然存在的氨基酸侧链，例如，自然产生的氨基酸侧链(例如，氨基酸代谢物)或合成制备的氨基酸侧链(例如，α,α-二取代的氨基酸)。

术语“α,α-二取代的氨基酸”是指包含的氨基和羧基都结合到碳(α-碳)上而该碳(α-碳)连接到两个天然或非天然氨基酸侧链上的分子或部分。

术语“多肽”包括通过共价键(例如，酰胺键)连接的两个或更多个天然或非天然存在的氨基酸。本文所述的多肽包括全长蛋白质(例如，完全加工的蛋白质)以及较短的氨基酸序列(例如，天然存在的蛋白质的片段或合成的多肽片段)。

本文所用的术语“大环化试剂”或“大环形成试剂”是指任何可以用来通过介导两个反应性基团之间的反应而制备本发明的拟肽大环化合物的试剂。该反应性基团可以是，例如，叠氮和炔，在这种情况下，大环化试剂包括但不限于Cu试剂，如提供反应性Cu(I)物质的试剂，如CuBr、CuI或CuOTf，以及通过加入诸如抗坏血酸或抗坏血酸钠的还原剂可以原位转化为活性Cu(I)试剂的Cu(II)盐，如Cu(CO₂CH₃)₂、CuSO₄和CuCl₂。大环化试剂另外还可以包括，例如，本领域已知的Ru试剂，如Cp*RuCl(PPh₃)₂、[Cp*RuCl]₄，或其它可以提供反应性Ru(II)物质的Ru试剂。在其它情况下，反应性基团为末端烯烃。在这样的实施方案中，大环化试剂或大环形成试剂为复分解催化剂，包括但不限于稳定的后过渡金属卡宾络合物催化剂，如VIII族过渡金属卡宾催化剂。例如，这样的催化剂为具有+2氧化态、电子计数为16且五配位的Ru和Os金属中心。在其它实例中，催化剂具有W或Mo中心。各种催化剂在Grubbs等人,"Ring Closing Metathesis and Related Processes in Organic Synthesis"Acc.Chem.Res.1995,28,446-452和美国专利号5,811,515；美国专利号7,932,397；美国申请号2011/0065915；美国申请号2011/0245477；Yu等人，"Synthesis of Macrocyclic Natural Products by Catalyst-ControlledStereoselective Ring-Closing Metathesis,"Nature2011,479,88；和Peryshkov等人，"Z-Selective Olefin Metathesis Reactions Promoted byTungsten Oxo Alkylidene Complexes,"J.Am.Chem.Soc.2011,133,20754中公开。在另外其它的情况下，反应性基团为巯基。在这样的实施方案中，大环化试剂为，例如，用两个巯基反应性基团如卤素基团官能化的连接体。

术语“卤代”或“卤素”是指氟、氯、溴或碘或其基团。

术语“烷基”是指含有指定数目的碳原子的直链或支链烃链。例如，C₁-C₁₀表示该基团中具有1-10(含端值)个碳原子。在没有指定任何数值时，“烷基”是其中具有1-20(含端值)个碳原子的链(直链或支链)。

术语“亚烷基”是指二价烷基(即，-R-)。

术语“烯基”是指具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链烃链。烯基部分含有指定数目的碳原子。例如，C₂-C₁₀表示该基团中具有2-10(含端值)个碳原子。术语“低级烯基”是指C₂-C₆烯基链。在没有指定任何数值时，“烯基”是其中具有2-20(含端值)个碳原子的链(直链或支链)。

术语“炔基”是指具有一个或多个碳-碳叁键的直链或支链烃链。炔基部分含有指定数目的碳原子。例如，C₂-C₁₀表示该基团中具有2-10(含端值)个碳原子。术语“低级炔基”是指C₂-C₆炔基链。在没有指定任何数值时，“炔基”是其中具有2-20(含端值)个碳原子的链(直链或支链)。

术语“芳基”是指6碳单环或10碳双环的芳香环体系，其中各环的0、1、2、3或4个原子被取代基取代。芳基的例子包括苯基、萘基等。术语“芳基烷氧基”是指被芳基取代的烷氧基。

“烷基芳基(arylalkyl)”是指其中芳基的氢原子中的一个被如上定义的C₁-C₅烷基取代的如上定义的芳基。烷基芳基的代表性例子包括但不限于：2-甲基苯基、3-甲基苯基、4-甲基苯基、2-乙基苯基、3-乙基苯基、4-乙基苯基、2-丙基苯基、3-丙基苯基、4-丙基苯基、2-丁基苯基、3-丁基苯基、4-丁基苯基、2-戊基苯基、3-戊基苯基、4-戊基苯基、2-异丙基苯基、3-异丙基苯基、4-异丙基苯基、2-异丁基苯基、3-异丁基苯基、4-异丁基苯基、2-仲丁基苯基、3-仲丁基苯基、4-仲丁基苯基、2-叔丁基苯基、3-叔丁基苯基和4-叔丁基苯基。

“酰胺基芳基(arylamido)”是指其中芳基的氢原子中的一个被一个或多个-C(O)NH₂基团取代的如上定义的芳基。酰胺基芳基的代表性例子包括：2-C(O)NH₂-苯基、3-C(O)NH₂-苯基、4-C(O)NH₂-苯基、2-C(O)NH₂-吡啶基、3-C(O)NH₂-吡啶基和4-C(O)NH₂-吡啶基。

“杂环基烷基(alkylheterocycle)”是指其中C₁-C₅烷基的氢原子中的一个被杂环取代的如上定义的C₁-C₅烷基。杂环基烷基的代表性例子包括但不限于：-CH₂CH₂-吗啉、-CH₂CH₂-哌啶、-CH₂CH₂CH₂-吗啉和-CH₂CH₂CH₂-咪唑。

“酰胺基烷基(alkylamido)”是指其中C₁-C₅烷基的氢原子中的一个被-C(O)NH₂基团取代的如上定义的C₁-C₅烷基。酰胺基烷基的代表性例子包括但不限于：-CH₂-C(O)NH₂、-CH₂CH₂-C(O)NH₂、-CH₂CH₂CH₂C(O)NH₂、-CH₂CH₂CH₂CH₂C(O)NH₂、-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂C(O)NH₂、-CH₂CH(C(O)NH₂)CH₃、-CH₂CH(C(O)NH₂)CH₂CH₃、-CH(C(O)NH₂)CH₂CH₃、-C(CH₃)₂CH₂C(O)NH₂、-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₃、-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₃-CH₃和-CH₂-CH₂–NH-C(O)-CH＝CH₂。

“羟烷基(alkanol)”是指其中C₁-C₅烷基的氢原子中的一个被羟基取代的如上定义的C₁-C₅烷基。羟烷基的代表性例子包括但不限于：-CH₂OH、-CH₂CH₂OH、-CH₂CH₂CH₂OH、-CH₂CH₂CH₂CH₂OH、-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂OH、-CH₂CH(OH)CH₃、-CH₂CH(OH)CH₂CH₃、-CH(OH)CH₃和-C(CH₃)₂CH₂OH。

“羧基烷基(alkylcarboxy)”是指其中C₁-C₅烷基的氢原子中的一个被-COOH基团取代的如上定义的C₁-C₅烷基。羧基烷基的代表性例子包括但不限于：-CH₂COOH、-CH₂CH₂COOH、-CH₂CH₂CH₂COOH、-CH₂CH₂CH₂CH₂COOH、-CH₂CH(COOH)CH₃、-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH、-CH₂CH(COOH)CH₂CH₃、-CH(COOH)CH₂CH₃和-C(CH₃)₂CH₂COOH。

本文使用的术语“环烷基”包括具有3-12个碳、优选3-8个碳、更优选3-6个碳的饱和的和部分不饱和的环烃基团，其中环烷基另外任选地被取代。一些环烷基包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基和环辛基。

术语“杂芳基”是指芳香族的5-8元单环、8-12元双环或11-14元三环的环体系，其如果是单环则具有1-3个杂原子，如果是双环则具有1-6个杂原子，或者如果是三环则具有1-9个杂原子，所述杂原子选自O、N或S(例如，如果是单环、双环或三环，分别为碳原子和1-3、1-6或1-9个O、N或S杂原子)，其中各个环的0、1、2、3或4个原子被取代基取代。杂芳基的例子包括吡啶基、呋喃基(furyl或furanyl)、咪唑基、苯并咪唑基、嘧啶基、噻吩基(thiophenyl或thienyl)、喹啉基(quinolinyl)、吲哚基、噻唑基等。

术语“杂芳基烷基”或术语“杂芳烷基”是指被杂芳基取代的烷基。术语“杂芳基烷氧基”是指被杂芳基取代的烷氧基。

术语“杂环基”是指非芳香族的5-8元单环、8-12元双环或11-14元三环的环体系，其如果是单环则具有1-3个杂原子，如果是双环则具有1-6个杂原子，或者如果是三环则具有1-9个杂原子，所述杂原子选自O、N或S(例如，如果是单环、双环或三环，分别为碳原子和1-3、1-6或1-9个O、N或S杂原子)，其中各个环的0、1、2或3个原子被取代基取代。杂环基的例子包括哌嗪基、吡咯烷基、二氧杂环己基、吗啉基、四氢呋喃基等。

术语“取代基”是指取代任何分子、化合物或部分上的第二原子或基团如氢原子的基团。合适的取代基包括但不限于卤素、羟基、巯基、氧代、硝基、卤代烷基、烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、烷氧基、硫代烷氧基、芳氧基、氨基、烷氧羰基、酰胺基、羧基、链烷磺酰基、烷基羰基和氰基。

在一些实施方案中，本发明的化合物包含一个或多个不对称中心，因而作为外消旋体或外消旋混合物、单一对映异构体、单独的非对映异构体和非对映体混合物存在。除非另外明确地指出，本发明包括这些化合物的所有这些异构体形式。在一些实施方案中，本发明的化合物也呈现为多种互变异构形式，在这些情况下，本发明包括本文所述化合物的所有互变异构形式(例如，如果环体系的烷基化作用导致在多个位置发生烷基化，那么本发明包括所有这些反应产物)。除非另外明确地指出，本发明包括这些化合物的所有这些异构体形式。除非另外明确地指出，本发明包括本文所述化合物的所有晶形。

如本文所用的，术语“增加”和“减少”分别意味着导致至少5％的统计学显著的(即，p<0.1)增加或减少。

如本文所用的，提及变量的数值范围旨在表示该变量等于该范围内的任意值。因此，对于本身不连续的变量，该变量等于该数值范围内的任意整数值，包括该范围的端点。类似地，对于本身连续的变量，该变量等于该数值范围内的任意实值，包括该范围的端点。作为例子，而不是限制，如果变量本身是不连续的，描述为具有0-2之间的值的变量取0、1或2的值；而如果变量本身是连续的，则取0.0、0.1、0.01、0.001的值或≥0且≤2的其它任何实值。

如本文所用的，除非另外特别指出，单词“或”以“和/或”的包含性含义使用，而非“任一/或”的排它性的含义。

术语“平均”表示对于每个数据点通过进行至少3次独立的重复而获得的平均值。

术语“生物活性”包括本发明的大环化合物的结构和功能性质。生物活性是，例如，结构稳定性、α-螺旋性、对靶标的亲和性、对蛋白水解降解的抗性、细胞渗透性、细胞内稳定性、体内稳定性或其任意组合。

在下面的附图和描述中阐述了本发明的一个或多个具体实施方案的细节。从说明书、附图和权利要求书可以明显看出本发明的其它特征、目的和优势。

在一些实施方案中，所述肽序列来源于GHRH肽。例如，该肽序列来源于人GHRH(1-29)或人GHRH(1-44)。

用于本发明的合适的GHRH肽的非限制性的示例性列表在以下的表1和表2中给出。在表1和表2中，所有肽具有游离的氨基末端(显示为H-)，并且所有肽具有羧酰胺末端(显示为–NH2)。X残基与另一个X残基形成交联，Z残基与另一个Z残基形成交联，并且XX残基与另两个X残基形成交联。在表1和表2中，氨基酸A2为L-Ala或D-Ala，A8为L-Asn或L-Gln，A15为L-Ala或Gly，并且A27为L-Nle或L-Leu。

表1

表2

本发明的拟肽大环化合物

在一些实施方案中，本发明的拟肽大环化合物具有式(I)：

其中：

A、C、D和E各自独立地为氨基酸(包括天然或非天然氨基酸和氨基酸类似物)，且末端D和E独立地任选地包括封端基团；

B为氨基酸(包括天然或非天然氨基酸和氨基酸类似物)、[-NH-L₃-CO-]、[-NH-L₃-SO₂-]或[-NH-L₃-]；

L为式–L₁–L₂–的大环形成连接体；

各个K为O、S、SO、SO₂、CO、CO₂或CONR₃；

u、x、y和z独立地为0-10的整数，例如u为1、2或3；且

n为1-5的整数，例如1。例如，u为2。在一些实施方案中，x+y+z的总和为2、3或6，例如3或6。

在一些实施方案中，式(I)的拟肽大环化合物具有下式：

其中A、C、D和E各自独立地为氨基酸；

B为氨基酸、[-NH-L₃-CO-]、[-NH-L₃-SO₂-]或[-NH-L₃-]；

L’为式–L₁’–L₂’–的大环形成连接体；

各个K独立地为O、S、SO、SO₂、CO、CO₂或CONR₃；

x’、y’和z’独立地为0-10的整数；且

在一个实例中，R₁和R₂中的至少一个是未取代的或被卤素–取代的烷基。在另一个实例中，R₁和R₂二者均独立地为未取代的或被卤素–取代的烷基。在一些实施方案中，R₁和R₂中的至少一个为甲基。在其它实施方案中，R₁和R₂为甲基。

在本发明的一些实施方案中，x+y+z的总和至少为3，和/或x’+y’+z’的总和至少为3。在本发明的其它实施方案中，x+y+z的总和为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10(例如，2、3或6)，和/或x’+y’+z’的总和为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10(例如，2、3或6)。

本发明的大环化合物或大环化合物前体中每次出现的A、B、C、D或E独立地选择。例如，由式[A]_x表示的序列，当x为3时，包括其中氨基酸不相同的实施方案，例如Gln–Asp–Ala，以及其中氨基酸相同的实施方案，例如Gln–Gln–Gln。这适用于x、y或z在指定范围内的任意值。类似地，当u大于1时，本发明的各个化合物可包含相同或不同的拟肽大环化合物。例如，本发明的化合物可以包含含有不同连接体长度或化学组成的拟肽大环化合物。

在一些实施方案中，本发明的拟肽大环化合物包含为α-螺旋的二级结构且R₈为–H，从而允许螺旋内氢键键合。在一些实施方案中，A、B、C、D或E中的至少一个为α,α-二取代的氨基酸。在一个实例中，B为α,α-二取代的氨基酸。例如，A、B、C、D或E中的至少一个为2-氨基异丁酸。在其它实施方案中，A、B、C、D或E中的至少一个为

在其它实施方案中，选择从第一Cα到第二Cα测量的大环形成连接体L的长度，以稳定希望的二级肽结构，例如由拟肽大环化合物的残基(包括但不是必须限于第一Cα到第二Cα之间的残基)形成的α-螺旋。

在一个实施方案中，式(I)的拟肽大环化合物为：

其中R₁和R₂各自独立地为–H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素–取代的。

在相关的实施方案中，该拟肽大环化合物包含式(I)的结构，其为：

或

在其它实施方案中，式(I)的拟肽大环化合物是以下所示通式中的任一个的化合物：

其中“AA”表示任何天然或非天然氨基酸侧链，且为如上定义的[D]_v，[E]_w，且n为0至20、50、100、200、300、400或500的整数。在一些实施方案中，上一段中所示的取代基“n”为0。在其它实施方案中，上一段中所示的取代基“n”小于50、40、30、20、10或5。

大环形成连接体L的示例性实施方案如下所示。

在其它实施方案中，为了促进细胞摄取，进一步修饰式I化合物中的D和/或E。在一些实施方案中，将拟肽大环化合物脂质化(lipidating)或PEG化有利于细胞摄取、提高生物利用度、增强血液循环、改变药代动力学、降低免疫原性和/或降低所需的给药频率。

在其它实施方案中，式I化合物中的[D]和[E]中的至少一个代表包含另外的大环形成连接体的部分，使得该拟肽大环化合物包含至少两个大环形成连接体。在特定实施方案中，拟肽大环化合物包含两个大环形成连接体。

在本发明的拟肽大环化合物中，本文所述的任何大环形成连接体可以与表1-3中所示的任何序列任意组合使用，也可以与本文所述的任何R–取代基任意组合使用。

在一些实施方案中，拟肽大环化合物包含至少一个α-螺旋基序。例如，式I化合物中的A、B和/或C包含一个或多个α-螺旋。一般来说，α-螺旋每圈包含3至4个氨基酸残基。在一些实施方案中，拟肽大环化合物的α-螺旋包括1至5圈，因此包含3至20个氨基酸残基。在特定实施方案中，α-螺旋包括1圈、2圈、3圈、4圈或5圈。在一些实施方案中，大环形成连接体稳定化在拟肽大环化合物内包含的α-螺旋基序。因此，在一些实施方案中，选择大环形成连接体L从第一Cα到第二Cα的长度，以提高α-螺旋的稳定性。在一些实施方案中，大环形成连接体跨越α-螺旋的1圈至5圈。在一些实施方案中，大环形成连接体跨越α-螺旋的大约1圈、2圈、3圈、4圈或5圈。在一些实施方案中，大环形成连接体的长度为每圈α-螺旋大约至或每圈α-螺旋大约至当大环形成连接体跨越大约1圈α-螺旋时，长度等于大约5个碳-碳键至13个碳-碳键，大约7个碳-碳键至11个碳-碳键，或大约9个碳-碳键。当大环形成连接体跨越大约2圈α-螺旋时，长度等于大约8个碳-碳键至16个碳-碳键，大约10个碳-碳键至14个碳-碳键，或大约12个碳-碳键。当大环形成连接体跨越大约3圈α-螺旋时，长度等于大约14个碳-碳键至22个碳-碳键，大约16个碳-碳键至20个碳-碳键，或大约18个碳-碳键。当大环形成连接体跨越大约4圈α-螺旋时，长度等于大约20个碳-碳键至28个碳-碳键，大约22个碳-碳键至26个碳-碳键，或大约24个碳-碳键。当大环形成连接体跨越大约5圈α-螺旋时，长度等于大约26个碳-碳键至34个碳-碳键，大约28个碳-碳键至32个碳-碳键，或大约30个碳-碳键。当大环形成连接体跨越大约1圈α-螺旋时，连接含有大约4个原子至12个原子，大约6个原子至10个原子，或大约8个原子。当大环形成连接体跨越大约2圈α-螺旋时，连接含有大约7个原子至15个原子，大约9个原子至13个原子，或大约11个原子。当大环形成连接体跨越大约3圈α-螺旋时，连接含有大约13个原子至21个原子，大约15个原子至19个原子，或大约17个原子。当大环形成连接体跨越大约4圈α-螺旋时，连接含有大约19个原子至27个原子，大约21个原子至25个原子，或大约23个原子。当大环形成连接体跨越大约5圈α-螺旋时，连接含有大约25个原子至33个原子，大约27个原子至31个原子，或大约29个原子。当大环形成连接体跨越大约1圈α-螺旋时，得到的大环形成含有大约17元至25元、大约19元至23元或大约21元的环。当大环形成连接体跨越大约2圈α-螺旋时，得到的大环形成含有大约29元至37元、大约31元至35元或大约33元的环。当大环形成连接体跨越大约3圈α-螺旋时，得到的大环形成含有大约44元至52元、大约46元至50元或大约48元的环。当大环形成连接体跨越大约4圈α-螺旋时，得到的大环形成含有大约59元至67元、大约61元至65元或大约63元的环。当大环形成连接体跨越大约5圈α-螺旋时，得到的大环形成含有大约74元至82元、大约76元至80元或大约78元的环。

在一些实施方案中，L为下式的大环形成连接体

此类大环形成连接体L的示例性实施方案如下所示。

在其它实施方案中，本发明提供了式(II)或(IIa)的拟肽大环化合物：

其中：

A、C、D和E各自独立地为氨基酸；

B为氨基酸、[-NH-L₃-CO-]、[-NH-L₃-SO₂-]或[-NH-L₃-]；

各个K为O、S、SO、SO₂、CO、CO₂或CONR₃；

v和w独立地为1-1000的整数，例如1-100；

u、x、y和z独立地为0-10的整数，例如u为1-3；和

n为1-5的整数。

在一个实例中，R₁和R₂中的至少一个是未取代的或被卤素–取代的烷基。在另一个实例中，R₁和R₂均独立地为未取代的或被卤素–取代的烷基。在一些实施方案中，R₁和R₂中的至少一个为甲基。在其它实施方案中，R₁和R₂为甲基。

在本发明的一些实施方案中，x+y+z的总和至少为1。在本发明的其它实施方案中，x+y+z的总和至少为2。在本发明的其它实施方案中，x+y+z的总和为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。本发明的大环化合物或大环化合物前体中每次出现的A、B、C、D或E独立地选择。例如，由式[A]_x表示的序列，当x为3时，包括其中氨基酸不相同的实施方案，例如Gln–Asp–Ala，以及其中氨基酸相同的实施方案，例如Gln–Gln–Gln。这适用于x、y或z在指定范围内的任意值。

在其它实施方案中，选择从第一Cα到第二Cα测量的大环形成连接体-L₁-L₂-的长度，以稳定希望的二级肽结构，例如由拟肽大环化合物的残基(包括但不是必须限于第一Cα到第二Cα之间的残基)形成的α-螺旋。

大环形成连接体-L₁-L₂-的示例性实施方案如下所示。

式(II)的拟肽大环化合物的实例在表4中示出，并且包括SP-85、SP-86、SP-87、SP-88、SP-91和SP-92。

拟肽大环化合物的制备

本发明的拟肽大环化合物可以通过本领域已知的众多方法中的任意方法来制备。例如，表1、2或4中由“X”、“Z”或“XX”表示的任何残基可以被替换为能够与同一分子中的第二残基形成交联体的残基或这样的残基的前体。

各种实现拟肽大环化合物制备的方法是本领域已知的。例如，Schafmeister等人,J.Am.Chem.Soc.122:5891-5892(2000)；Schafmeister和Verdine,J.Am.Chem.Soc.122:5891(2005)；Walensky等人,Science305:1466-1470(2004)；美国专利号7,192,713和PCT申请WO2008/121767中描述了式I的拟肽大环化合物的制备。在所引用的参考文献中公开的α,α-二取代的氨基酸和氨基酸前体可以用于拟肽大环化合物前体多肽的合成。例如，“S5-烯烃氨基酸”是(S)-α-(2’-戊烯基)丙氨酸，且“R8-烯烃氨基酸”是(R)-α-(2’-辛烯基)丙氨酸。在将这样的氨基酸掺入前体多肽中之后，末端烯烃与复分解反应催化剂反应，从而导致拟肽大环化合物的形成。在各种实施方案中，下列氨基酸可用于合成拟肽大环化合物。

在一些实施方案中，x+y+z为3，并且A、B和C独立地是天然或非天然氨基酸。在其它实施方案中，x+y+z为6，且A、B和C独立地是天然或非天然氨基酸。

在一些实施方案中，接触步骤在选自质子溶剂、水性溶剂、有机溶剂及其混合物的溶剂中进行。例如，溶剂可以选自H₂O、THF、THF/H₂O、tBuOH/H₂O、DMF、DIPEA、CH₃CN或CH₂Cl₂、ClCH₂CH₂Cl或其混合物。溶剂可以是有利于螺旋形成的溶剂。

将备选的但等效的保护基团、离去基团或试剂替换，并按照替代的序列或顺序进行特定的合成步骤，以产生希望的化合物。用于合成本文所述的化合物的合成化学转化和保护基团方法(保护和脱保护)包括，例如，如以下文献中所述的方法：Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers(1989)；Greene和Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,第2版,John Wiley and Sons(1991)；Fieser和Fieser,Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis,John Wileyand Sons(1994)；和Paquette编著，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1995)及其后续版本。

本文公开的拟肽大环化合物例如通过化学合成方法制备，如Fields等人,Synthetic Peptides:A User's Guide中的第3章，Grant,W.H.编著，Freeman&Co.,New York,N.Y.,1992,第77页中所述的方法。因此，例如，采用具有被tBoc或Fmoc化学部分保护的胺的自动化Merrifield固相合成技术，在例如自动化肽合成仪(例如，Applied Biosystems(FosterCity,CA),430A、431或433型)上使用侧链保护的氨基酸合成肽。

一种产生本文所述的拟肽前体和拟肽大环化合物的方式使用固相肽合成法(SPPS)。将C-末端氨基酸经由与连接体分子的酸不稳定的键连接到交联的聚苯乙烯树脂上。这种树脂不溶于用于合成的溶剂，从而使得洗去过量的试剂和副产物相对简单和快速。N-末端用在酸中稳定、但可用碱去除的Fmoc基团保护。必要时，用碱稳定的、酸不稳定的基团保护侧链官能团。

例如，通过使用天然的化学连接结合单个的合成肽来产生较长的拟肽前体。或者，通过公知的重组DNA和蛋白质表达技术生物合成较长的合成肽。这些技术在公知的标准手册中提供了详细方案。为了构建编码本发明的拟肽前体的基因，逆向翻译氨基酸序列以获得编码该氨基酸序列的核酸序列，优选地使用对于将表达该基因的生物体为最佳的密码子。然后，通常通过合成编码该肽的寡核苷酸和在必要时合成任何调节元件来制备合成的基因。将合成的基因插入合适的克隆载体中，并转染到宿主细胞内。然后在适合选择的表达系统和宿主的合适条件下表达该肽。通过标准方法纯化并表征该肽。

例如，使用例如高通量多通道组合合成仪(例如，来自CreoSalus,Louisville,KY的Thuramed TETRAS多通道肽合成仪或来自AAPPTEC,Inc.,Louisville,KY的Apex396型多通道肽合成仪)以高通量的组合方式制备拟肽前体。

在一些实施方案中，本发明的拟肽大环化合物包含三唑大环形成连接体。例如，这类拟肽大环化合物的合成包括多步骤的过程，该过程的特征在于：合成含有叠氮部分和炔部分的拟肽前体；然后将该拟肽前体与大环化试剂接触以产生三唑连接的拟肽大环化合物。这样的方法例如在2008年2月25日提交的美国申请12/037,041中描述。大环化合物或大环化合物前体例如通过溶液相或固相方法合成，并且可以包含天然存在的和非天然存在的氨基酸两者。参见，例如，Hunt,"The Non-ProteinAmino Acids"，Chemistry and Biochemistry of the Amino Acids，G.C.Barrett编著,Chapman and Hall,1985。

在一些实施方案中，叠氮连接到残基的α-碳上，炔连接到另一个残基的α-碳上。在一些实施方案中，叠氮部分是氨基酸L-赖氨酸、D-赖氨酸、α-甲基-L-赖氨酸、α-甲基-D-赖氨酸、L-鸟氨酸、D-鸟氨酸、α-甲基-L-鸟氨酸或α-甲基-D-鸟氨酸的叠氮基类似物。在另一个实施方案中，炔部分是L-炔丙基甘氨酸。在另外其它的实施方案中，炔部分是选自下组的氨基酸：L-炔丙基甘氨酸、D-炔丙基甘氨酸、(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-5-己炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-5-己炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-7-辛炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-7-辛炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-8-壬炔酸和(R)-2-氨基-2-甲基-8-壬炔酸。

提供以下合成方案只是为了说明本发明，而并非意在限制如本文所述的本发明的范围。为了简化图片，说明性的方案显示了叠氮基氨基酸类似物ε-叠氮基-α-甲基-L-赖氨酸和ε-叠氮基-α-甲基-D-赖氨酸，以及炔氨基酸类似物L-炔丙基甘氨酸、(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸和(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸。因此，在下面的合成方案中，R₁、R₂、R₇和R₈各自为-H；各个L₁为-(CH₂)₄-；且各个L₂为-(CH₂)-。但是，如以上整个发明详述部分所指出的，可以采用许多其它的氨基酸类似物，其中R₁、R₂、R₇、R₈、L₁和L₂可以独立地选自本文公开的各种结构。

合成方案1：

合成方案1描述了本发明的几种化合物的制备。如Belokon等人(1998),Tetrahedron Asymm.9:4249-4252所述制备由手性辅剂(S)-2-[N-(N’-苄基脯氨酰)氨基]苯甲酮(BPB)衍生的席夫碱和诸如甘氨酸或丙氨酸的氨基酸的Ni(II)络合物。产生的络合物随后与包含叠氮部分或炔部分的烷基化试剂反应，以产生对映体富集的本发明的化合物。如需要，可以对产生的化合物进行保护以用于肽合成。

合成方案2：

在如合成方案2所示的用于合成拟肽大环化合物的一般方法中，拟肽前体包含叠氮部分和炔部分，并且通过溶液相或固相肽合成法(SPPS)，使用可商购的氨基酸N-α-Fmoc-L-炔丙基甘氨酸以及氨基酸(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(S)-2-氨基-6-庚炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、N-甲基-ε-叠氮基-L-赖氨酸和N-甲基-ε-叠氮基-D-赖氨酸的N-α-Fmoc保护的形式合成。然后通过标准条件(例如，强酸如95％TFA)将拟肽前体脱保护并从固相树脂上切下。拟肽前体作为粗制混合物进行反应，或者在与大环化试剂如Cu(I)在有机溶液或水性溶液中反应之前进行纯化(Rostovtsev等人(2002),Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599；Tornoe等人(2002),J.Org.Chem.67:3057-3064；Deiters等人(2003),J.Am.Chem.Soc.125:11782-11783；Punna等人(2005),Angew.Chem.Int.Ed.44:2215-2220)。在一个实施方案中，在有利于α-螺旋形成的条件下进行三唑形成反应。在一个实施方案中，在选自H₂O、THF、CH₃CN、DMF、DIPEA、tBuOH或其混合物的溶剂中进行大环化步骤。在另一个实施方案中，在DMF中进行大环化步骤。在一些实施方案中，在经缓冲的水性溶剂或部分水性溶剂中进行大环化步骤。

合成方案3：

在如合成方案3所示的用于合成拟肽大环化合物的一般方法中，拟肽前体包含叠氮部分和炔部分，并且通过固相肽合成法(SPPS)，使用可商购的氨基酸N-α-Fmoc-L-炔丙基甘氨酸以及氨基酸(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(S)-2-氨基-6-庚炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、N-甲基-ε-叠氮基-L-赖氨酸和N-甲基-ε-叠氮基-D-赖氨酸的N-α-Fmoc保护的形式合成。拟肽前体作为粗制混合物与大环化试剂如Cu(I)试剂在树脂上反应(Rostovtsev等人(2002),Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599；Tornoe等人(2002),J.Org.Chem.67:3057-3064；Deiters等人(2003),J.Am.Chem.Soc.125:11782-11783；Punna等人(2005),Angew.Chem.Int.Ed.44:2215-2220)。然后通过标准条件(例如，强酸如95％TFA)将得到的含三唑的拟肽大环化合物脱保护并从固相树脂上切下。在某些实施方案中，在选自CH₂Cl₂、ClCH₂CH₂Cl、DMF、THF、NMP、DIPEA、2,6-二甲基吡啶、吡啶、DMSO、H₂O或其混合物的溶剂中进行大环化步骤。在一些实施方案中，在经缓冲的水性溶剂或部分水性溶剂中进行大环化步骤。

合成方案4：

在如合成方案4所示的用于合成拟肽大环化合物的一般方法中，拟肽前体包含叠氮部分和炔部分，并且通过溶液相或固相肽合成法(SPPS)，使用可商购的氨基酸N-α-Fmoc-L-炔丙基甘氨酸以及氨基酸(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(S)-2-氨基-6-庚炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、N-甲基-ε-叠氮基-L-赖氨酸和N-甲基-ε-叠氮基-D-赖氨酸的N-α-Fmoc保护的形式合成。然后通过标准条件(例如，强酸如95％TFA)将拟肽前体脱保护并从固相树脂上切下。拟肽前体作为粗制混合物进行反应，或者在与大环化试剂如Cu(II)试剂例如Cp*RuCl(PPh₃)₂或[Cp*RuCl]₄反应之前进行纯化(Rasmussen等人(2007),Org.Lett.9:5337-5339；Zhang等人(2005),J.Am.Chem.Soc.127:15998-15999)。在一些实施方案中，在选自DMF、CH₃CN和THF的溶剂中进行大环化步骤。

合成方案5：

在如合成方案5所示的用于合成拟肽大环化合物的一般方法中，拟肽前体包含叠氮部分和炔部分，并且通过固相肽合成法(SPPS)，使用可商购的氨基酸N-α-Fmoc-L-炔丙基甘氨酸以及氨基酸(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(S)-2-氨基-6-庚炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、N-甲基-ε-叠氮基-L-赖氨酸和N-甲基-ε-叠氮基-D-赖氨酸的N-α-Fmoc保护的形式合成。拟肽前体作为粗制混合物与大环化试剂如Ru(II)试剂在树脂上反应。例如，该试剂可以是Cp*RuCl(PPh₃)₂或[Cp*RuCl]₄(Rasmussen等人(2007),Org.Lett.9:5337-5339；Zhang等人(2005),J.Am.Chem.Soc.127:15998-15999)。在一些实施方案中，在选自CH₂Cl₂、ClCH₂CH₂Cl、CH₃CN、DMF和THF的溶剂中进行大环化步骤。

本发明涉及在本文所述的拟肽大环化合物的合成中使用非天然存在的氨基酸和氨基酸类似物。任何适合于用来合成稳定的含三唑拟肽大环化合物的合成方法的氨基酸或氨基酸类似物都可以用于本发明。例如，预计L-炔丙基甘氨酸是本发明中有用的氨基酸。但是，含有不同氨基酸侧链的其它含炔的氨基酸也可用于本发明。例如，L-炔丙基甘氨酸在氨基酸的α-碳和氨基酸侧链的炔之间含有一个亚甲基单元。本发明也涉及使用在α-碳和炔之间具有多个亚甲基单元的氨基酸。另外，也预计氨基酸L-赖氨酸、D-赖氨酸、α-甲基-L-赖氨酸和α-甲基-D-赖氨酸的叠氮类似物是本发明的有用的氨基酸。但是，含有不同的氨基酸侧链的其它末端叠氮氨基酸也可以用于本发明。例如，L-赖氨酸的叠氮类似物在氨基酸的α-碳和氨基酸侧链的末端叠氮基之间含有4个亚甲基单元。本发明也涉及使用在α-碳和末端叠氮基之间具有少于或多于4个亚甲基单元的氨基酸。表3显示了一些可用于制备本文公开的拟肽大环化合物的氨基酸。

表3

表3显示用于制备本文公开的拟肽大环化合物的示例性氨基酸。

在一些实施方案中，氨基酸和氨基酸类似物是D-构型。在其它实施方案中，它们是L-构型。在某些实施方案中，拟肽中包含的某些氨基酸和氨基酸类似物是D-构型，而某些氨基酸和氨基酸类似物是L-构型。在一些实施方案中，氨基酸类似物是α,α-二取代的，如α-甲基-L-炔丙基甘氨酸、α-甲基-D-炔丙基甘氨酸、ε-叠氮基-α-甲基-L-赖氨酸和ε-叠氮基-α-甲基-D-赖氨酸。在一些实施方案中，氨基酸类似物是N-烷基化的，例如，N-甲基-L-炔丙基甘氨酸、N-甲基-D-炔丙基甘氨酸、N-甲基-ε-叠氮基-L-赖氨酸和N-甲基-ε-叠氮基-D-赖氨酸。

在一些实施方案中，使用包括但不限于-Fmoc和-Boc的保护基团保护氨基酸的-NH部分。在其它实施方案中，在合成拟肽大环化合物之前不保护氨基酸。

预计适用于实施本发明的形成拟肽大环化合物的另外的方法包括以下文献中公开的方法：Mustapa,M.Firouz Mohd等人,J.Org.Chem(2003),68,第8193-8198页；Yang,Bin等人Bioorg Med.Chem.Lett.(2004),14,第1403-1406页；美国专利5,364,851；美国专利5,446,128；美国专利5,824,483；美国专利6,713,280和美国专利7,202,332。在这样的实施方案中，使用在α-位含有另外的取代基R-的氨基酸前体。这样的氨基酸在希望的位置并入大环化合物前体中，其可以处于交联体被取代的位置，或者，备选地，在大环化合物前体序列中的其它位置。然后根据指定的方法进行前体的环化。

例如，式(II)的拟肽大环化合物如以下所示制备：

其中AA₁、AA₂、AA₃各自独立地为氨基酸侧链。

在其它实施方案中，式(II)的拟肽大环化合物如下所示制备：

其中AA₁、AA₂、AA₃各自独立地为氨基酸侧链。

在一些实施方案中，拟肽大环化合物以超过一种异构体获得，例如这是由于交联体结构中双键的构型(E与Z)。此类异构体能够或不能通过常规的色谱方法分离。在一些实施方案中，一种异构体相对于其它异构体具有改善的生物学性质。在一个实施方案中，拟肽大环化合物的E交联体烯烃异构体相对于其Z对应物具有更好的溶解性、更好的靶标亲和性、更好的体内或体外功效、更高的螺旋度或提高的细胞渗透性。在一个实施方案中，拟肽大环化合物的Z交联体烯烃异构体相对于其E对应物具有更好的溶解性、更好的靶标亲和性、更好的体内或体外功效、更高的螺旋度或提高的细胞渗透性。

试验

例如，本发明的拟肽大环化合物的性质通过使用下面所述的方法进行分析。在一些实施方案中，本发明的拟肽大环化合相对于缺乏本文所述的取代基的相应多肽具有改善的生物学性质。

用于测定α-螺旋度的试验

在溶液中，具有α-螺旋结构域的多肽的二级结构在随机卷曲结构和α-螺旋结构之间达到动态平衡，这通常被称为“百分螺旋度”。因此，例如，α-螺旋结构域在溶液中主要是随机卷曲，α-螺旋含量通常低于25％。另一方面，具有优化的连接体的拟肽大环化合物具有例如至少为相应的非交联多肽的2倍的α-螺旋度。在一些实施方案中，本发明的大环化合物具有高于50％的α-螺旋度。为了测定本发明的拟肽大环化合物的螺旋度，将化合物溶解于水溶液(例如，pH7的50mM磷酸钾溶液或蒸馏水，达到25-50μM的浓度)。使用标准测量参数(例如，温度，20℃；波长，190-260nm；步分辨率(step resolution)，0.5nm；速度，20nm/sec；累积，10；响应，1秒；带宽，1nm；路径长度，0.1cm)在分光偏振计(例如，Jasco J-710)上获得圆二色性(CD)谱。通过将平均残基椭圆率(例如，[Φ]222obs)除以模型螺旋十肽的报道值(Yang等人(1986),MethodsEnzymol.130:208)来计算各个肽的α-螺旋含量。

用于测量解链温度(Tm)的试验

含有二级结构如α-螺旋的本发明的拟肽大环化合物显示出例如比相应的非交联多肽更高的解链温度。通常，本发明的拟肽大环化合物显示出>60℃的Tm，表明在水溶液中高度稳定的结构。为了分析大环形成对解链温度的影响，将拟肽大环化合物或未修饰的肽溶于蒸馏水中(例如，以50μM的终浓度)，并且通过使用标准参数(例如，波长，222nm；步分辨率，0.5nm；速度，20nm/sec；累积，10；响应，1秒；带宽，1nm；温度上升速度，1℃/分钟；路径长度，0.1cm)在分光偏振计(例如，Jasco J-710)上测量椭圆率在一定温度范围(例如，4-95℃)内的变化来确定Tm。

蛋白酶抗性试验

肽骨架的酰胺键易受到蛋白酶的水解，从而致使肽化合物在体内易于快速降解。但是，肽螺旋的形成通常包埋酰胺骨架，因此可以保护其免于蛋白水解裂解。本发明的拟肽大环化合物可以经历体外胰蛋白酶的蛋白水解，以评价与相应的非交联多肽相比其降解速率的任何变化。例如，拟肽大环化合物和相应的非交联多肽与胰蛋白酶琼脂糖一起温育，并在各个时间点通过离心猝灭反应，随后进行HPLC注入以根据280nm处的紫外吸收对残留的底物进行定量。简单来说，拟肽大环化合物和拟肽前体(5mcg)与胰蛋白酶琼脂糖(Pierce)(S/E～125)温育0、10、20、90和180分钟。通过台式离心机高速离心猝灭反应；通过基于HPLC的在280nm处的峰检测对分离的上清液中残余的底物进行定量。蛋白水解反应显示出一级动力学，且速率常数k由ln[S]相对于时间的曲线确定(k＝-1X斜率)。

体外稳定性试验

具有优化的连接体的拟肽大环化合物具有例如至少为相应的非交联多肽的2倍的体外半衰期，且具有12小时或更长的体外半衰期。对于体外血清稳定性研究，可以使用多种试验。例如，将拟肽大环化合物和相应的非交联多肽(2mcg)与新鲜的小鼠、大鼠和/或人血清(2mL)一起在37℃下温育0、1、2、4、8和24小时。为了测定完整化合物的水平，可以使用下面的程序：通过将100μl的血清转移到2ml离心管中，接着加入10μL的50％甲酸和500μL乙腈并在4±2℃下以14,000RPM离心10分钟来提取样品。然后将上清液转移到新的2ml管中，并在N₂<10psi、37℃下在Turbovap上蒸发。样品在100μL的50:50乙腈:水中重建，并进行LC-MS/MS分析。

体外结合试验

为了评价拟肽大环化合物和拟肽前体与受体蛋白质的结合和亲和力，例如使用荧光偏振试验(FPA)。FPA技术使用偏振光和荧光示踪剂测量分子取向和分子迁移率。当用偏振光激发时，由于附着在具有高表观分子量的分子(例如，与大蛋白质结合的FITC标记的肽)上的荧光示踪剂(例如，FITC)与附着在较小分子(例如，在溶液中游离的FITC标记的肽)上的荧光示踪剂相比具有较慢的旋转速度，附着在具有高表观分子量的分子上的荧光示踪剂发射较高水平的偏振荧光。

例如，荧光标记的(fluoresceinated)拟肽大环化合物(25nM)与接受体蛋白质(25-1000nM)在结合缓冲液(140mM NaCl、50mM Tris-HCL，pH7.4)中在室温下温育30分钟。例如，用发光分光光度计(例如，Perkin-Elmer LS50B)通过荧光偏振测定结合活性。可以使用例如Graphpad Prism软件(GraphPad Software,Inc.,San Diego,CA)通过非线性回归分析来确定Kd值。在某些情况下，本发明的拟肽大环化合物显示出与相应的非交联多肽类似的或更低的Kd。

用于表征肽-蛋白质相互作用的拮抗剂的体外置换试验

为了评价拮抗肽与接受体蛋白质之间相互作用的化合物的结合和亲和力，例如，使用利用来源于拟肽前体序列的荧光标记的拟肽大环化合物的荧光偏振试验(FPA)。FPA技术使用偏振光和荧光示踪剂测量分子取向和分子迁移率。当用偏振光激发时，由于附着在具有高表观分子量的分子(例如，与大蛋白质结合的FITC标记的肽)上的荧光示踪剂(例如，FITC)与附着在较小分子(例如，在溶液中游离的FITC标记的肽)上的荧光示踪剂相比具有较低的旋转速度，附着在具有高表观分子量的分子上的荧光示踪剂发射较高水平的偏振荧光。拮抗荧光标记的拟肽大环化合物与接受体蛋白质之间相互作用的化合物将在竞争性结合FPA实验中进行检测。

例如，推定的拮抗剂化合物(1nM至1mM)和荧光标记的拟肽大环化合物(25nM)与接受体蛋白质(50nM)一起在结合缓冲液(140mMNaCl、50mM Tris-HCL，pH7.4)中在室温下温育30分钟。例如，用发光分光光度计(例如，Perkin-Elmer LS50B)通过荧光偏振测定拮抗剂的结合活性。可以使用例如Graphpad Prism软件(GraphPad Software,Inc.,SanDiego,CA)通过非线性回归分析来确定Kd值。

任一类分子，如有机小分子、肽、寡核苷酸或蛋白质，可以在该试验中作为推定的拮抗剂进行检测。

通过亲和选择-质谱法对蛋白质-配体结合的分析

为了评估测试化合物对蛋白质的结合和亲和力，例如采用亲和选择-质谱分析试验。按照以下对全系统对照实验概述的代表性程序，使用1μM拟肽大环化合物加5μM靶蛋白进行蛋白质-配体结合实验。将40μM拟肽大环化合物储备溶液的1μL DMSO等份溶解在19μL PBS(磷酸盐缓冲盐水：含有150mM NaCl的50mM,pH7.5磷酸盐缓冲液)中。得到的溶液通过反复吸液进行混合并通过在10000g下离心10分钟进行澄清。向4μL等份得到的上清液中加入4μL10μM靶蛋白的PBS溶液。每个8.0μL实验样品因此含有在PBS中的浓度为5.0μM的40pmol(1.5μg)蛋白质，加1μM拟肽大环化合物和2.5％DMSO。针对每个浓度点如此制备的双份样品在室温下温育60分钟，然后冷却至4℃，之后进行5.0μL注入液的大小排阻层析-LC-MS分析。将含有靶蛋白、蛋白质-配体复合体和未结合的化合物的样品注入到SEC柱上，通过快速SEC步骤将复合体与未结合的成分在该柱上分离。采用UV检测器监测SEC柱洗脱液，以证实在SEC柱的外水体积中洗脱的早期洗脱的蛋白质级分从保留在柱上的未结合的成分中良好地分离出来。在含有蛋白质和蛋白质-配体复合体的峰从主UV检测器洗脱后，它进入样品环路，在其中从SEC阶段的流上截下，并通过阀门机构直接转移到LC-MS。通过ESI-MS以预期的m/z观察拟肽大环化合物的(M+3H)³⁺离子，证实检测到蛋白质-配体复合体。

用于蛋白质-配体Kd滴定实验的分析

为了评估测试化合物对蛋白质的结合和亲和力，例如，进行蛋白质-配体Kd滴定实验。蛋白质-配体K_d滴定实验如下进行：制备连续稀释的滴定剂拟肽大环化合物储备溶液(5,2.5,...,0.098mM)的2μLDMSO等份，然后溶解在38μL PBS中。得到的溶液通过反复吸液进行混合并通过在10000g下离心10分钟进行澄清。向4.0μL等份得到的上清液中加入4.0μL10μM靶蛋白的PBS溶液。每个8.0μL实验样品因此含有在PBS中的浓度为5.0μM的40pmol(1.5μg)蛋白质，不同浓度(125,62.5,...,0.24μM)的滴定肽和2.5％DMSO。针对每个浓度点如此制备的双份样品在室温下温育30分钟，然后冷却至4℃，之后进行2.0μL注入液的SEC-LC-MS分析。通过ESI-MS观察(M+H)¹⁺、(M+2H)²⁺、(M+3H)³⁺和/或(M+Na)¹⁺离子；对提取的离子色谱图进行定量，然后与方程拟合，以推导出结合亲和力K_d，如以下文献所述：“A GeneralTechnique to Rank Protein-Ligand Binding Affinities and DetermineAllosteric vs.Direct Binding Site Competition in Compound Mixtures.”Annis,D.A.；Nazef,N.；Chuang,C.C.；Scott,M.P.；Nash,H.M.J.Am.Chem.Soc.2004,126,15495-15503，以及“ALIS:An Affinity Selection-MassSpectrometry System for the Discovery and Characterization ofProtein-Ligand Interactions”D.A.Annis,C.-C.Chuang,and N.Nazef.InMass Spectrometry in Medicinal Chemistry.Wanner K,G:Wiley-VCH编著；2007:121-184.Mannhold R,Kubinyi H,Folkers G(系列编者):Methods and Principles in Medicinal Chemistry。

通过亲和选择-质谱法进行竞争性结合实验的分析

为了确定测试化合物竞争性结合蛋白质的能力，例如，进行亲和选择-质谱分析试验。通过将三种化合物中每一种的2μL等份400μM储备液与14μL DMSO混合制备每种成分40μM的配体混合物。然后，将1μL等份的该每种成分40μM的混合物与滴定剂拟肽大环化合物连续稀释储备溶液(10,5,2.5,...,0.078mM)的1μL DMSO等份混合。将这些2μL样品溶解在38μL PBS中。得到的溶液通过反复吸液进行混合并通过在10000g下离心10分钟进行澄清。向4.0μL等份得到的上清液中加入4.0μL10μM靶蛋白的PBS溶液。每个8.0μL实验样品因此含有在PBS中的浓度为5.0μM的40pmol(1.5μg)蛋白质，加0.5μM配体、2.5％DMSO和不同浓度(125,62.5,...,0.98μM)的滴定剂拟肽大环化合物。针对每个浓度点如此制备的双份样品在室温下温育60分钟，然后冷却至4℃，之后进行2.0μL注入液的SEC-LC-MS分析。这些和其它方法的另外的细节在以下文献中提供：“A General Technique to RankProtein-Ligand Binding Affinities and Determine Allosteric vs.DirectBinding Site Competition in Compound Mixtures.”Annis,D.A.；Nazef,N.；Chuang,C.C.；Scott,M.P.；Nash,H.M.J.Am.Chem.Soc.2004,126,15495-15503；以及“ALIS:An Affinity Selection-Mass Spectrometry Systemfor the Discovery and Characterization of Protein-Ligand Interactions”D.A.Annis,C.-C.Chuang,and N.Nazef.In Mass Spectrometry in MedicinalChemistry.Wanner K,G:Wiley-VCH编著；2007:121-184.Mannhold R,Kubinyi H,Folkers G(系列编者):Methods and Principles inMedicinal Chemistry。

在完整细胞中的结合分析

有可能通过免疫沉淀实验测定肽或拟肽大环化合物与其天然受体在完整细胞中的结合。例如，完整的细胞与荧光标记的(FITC-标记的)化合物在无血清的情况下温育4小时，接着进行血清置换并进一步温育4-18小时。然后使细胞沉淀，并在4℃下在裂解缓冲液(50mM Tris[pH7.6]、150mM NaCl、1％的CHAPS和蛋白酶抑制剂混合物)中温育10分钟。以14,000rpm离心提取物15分钟，收集上清液，并与10μl山羊抗-FITC抗体一起温育2小时，在4℃下旋转，接着进一步在4℃下与蛋白A/G Sepharose(50μl的50％微珠浆)温育2小时。快速离心之后，将沉淀物在含有渐增的盐浓度(例如，150、300、500mM)的裂解缓冲液中洗涤。随后以150mM NaCl再平衡微珠，之后加入含有SDS的样品缓冲液并煮沸。离心之后，任选地使用4％-12％梯度的Bis-Tris凝胶对上清液进行电泳，接着转移到Immobilon-P膜上。封闭后，任选地将印迹与检测FITC的抗体一起温育，也与一种或多种检测与拟肽大环化合物结合的蛋白质的抗体一起温育。

细胞渗透性分析

为了测量拟肽大环化合物和相应的非交联大环化合物的细胞渗透性，将完整的细胞与荧光标记的拟肽大环化合物或相应的非交联大环化合物(10μM)一起在不含血清的培养基中37℃温育4小时，用培养基洗涤2次，并与胰蛋白酶(0.25％)在37℃下温育10分钟。再次洗涤细胞并将其重悬浮于PBS中。例如，通过使用FACSCalibur流式细胞仪或Cellomics’HCS读数仪分析细胞荧光。

体内稳定性分析

为了研究拟肽大环化合物的体内稳定性，例如，向小鼠和/或大鼠通过静脉内、腹膜内、口服或吸入途径以0.1-50mg/kg的浓度施用化合物，并在注射后0'、5'、15'、30'、1小时、4小时、8小时和24小时抽取血样。然后如上所述通过LC-MS/MS测定25μL新鲜血清中的完整化合物的水平。

临床试验

为了确定本发明的拟肽大环化合物对于人类治疗的适用性，进行了临床试验。例如，选择出被诊断为患有肌肉萎缩病或脂质营养不良并且需要治疗的患者并将他们分成治疗组和一个或多个对照组，其中，对治疗组施用本发明的拟肽大环化合物，而对照组接受安慰剂或已知的GHRH或GH药物。这样，可以通过对患者组就诸如生存率和生活质量的因素进行比较来评价本发明的拟肽大环化合物的治疗安全性和有效性。在本实施例中，相比于用安慰剂治疗的患者对照组，用拟肽大环化合物治疗的患者组显示出提高的长期生存率。

药物组合物和给药途径

本发明的拟肽大环化合物也包括其药学上可接受的衍生物或前药。“药学上可接受的衍生物”意指本发明的化合物的任何药学上可接受的盐、酯、酯的盐、前药或其它衍生物，其在向接受者施用后能够(直接或间接地)提供本发明的化合物。尤其有利的药学上可接受的衍生物是当向哺乳动物施用时可以提高本发明的化合物的生物利用度(例如，通过提高口服施用的化合物进入血液的吸收)，或相对于母体物质增加活性化合物向生物区室(例如，脑或淋巴系统)的递送的那些衍生物。一些药学上可接受的衍生物包含提高水溶性或跨过胃肠粘膜的主动转运的化学基团。

在一些实施方案中，本发明的拟肽大环化合物通过共价或非共价地连接的合适的官能团进行修饰，以提高选择性的生物学性质。这样的修饰包括那些提高进入给定生物区室(例如，血液、淋巴系统、中枢神经系统)的生物学渗透性、提高口服利用度、增加溶解性以允许注射施用、改变代谢以及改变排泄率的修饰。

本发明的化合物的药学上可接受的盐包括那些由药学上可接受的无机和有机的酸和碱衍生的盐。合适的酸式盐的例子包括乙酸盐、己二酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、乙醇酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、棕榈酸盐(palmoate)、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和十一酸盐(undecanoate)。由合适的碱衍生的盐包括碱金属盐(例如，钠盐)、碱土金属盐(例如，镁盐)、铵盐和N-(烷基)₄ ⁺盐。

为了由本发明的化合物制备药物组合物，药学上可接受的载体包括固体或液体载体。固体形式的制剂包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂和分散颗粒剂。固体载体可以是一种或多种物质，其也可以作为稀释剂、调味剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包封材料发挥作用。在科学文献和专利文献中详细描述了配制和给药技术的细节，参见，例如，最新版本的Remington's Pharmaceutical Sciences,MaackPublishing Co,Easton PA。

在粉剂中，载体是细碎的固体，其与细碎的活性成分混合。在片剂中，活性成分与具有必要粘合性质的载体按照适当的比例混合，并压制成需要的形状和大小。

合适的固体赋形剂是碳水化合物或蛋白质填料，包括但不限于：糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；来自玉米、小麦、水稻、马铃薯或其它植物的淀粉；纤维素，如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；和树胶，包括阿拉伯树胶和黄蓍胶；以及蛋白质，如明胶和胶原蛋白。如果需要的话，加入崩解剂或增溶剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐如海藻酸钠。

液体形式的制剂包括溶液、悬浮液和乳液，例如，水或水/丙二醇溶液。对于肠胃外注射，液体制剂可以在聚乙二醇水溶液中配制成溶液。

药物制剂优选为单位剂型。在这样的形式中，制剂细分为含有适量活性成分的单位剂量。单位剂型可以是包装制剂，该包装包含不连续量的制剂，如包装的片剂、胶囊和小瓶或安瓿中的粉末。另外，单位剂型也可以是胶囊、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或者可以是包装形式的适当数目的这些剂型中的任一种。

当本发明的组合物包含拟肽大环化合物和一种或多种另外的治疗剂或预防剂的组合时，该化合物和另外的药剂都应该以通常在单一治疗方案中施用的剂量的大约1-100％的剂量水平，更优选大约5-95％的剂量水平存在。在一些实施方案中，另外的药剂作为多剂量方案的一部分与本发明的化合物分开施用。或者，这些药剂是单一剂型的一部分，在单一组合物中与本发明的化合物混合在一起。

在一些实施方案中，该组合物以单位剂型存在，该单位剂型可递送例如约0.0001mg至约1,000mg的拟肽大环化合物、其盐、其前药、其衍生物或这些的任意组合。因此，在一些实施方案中，该单位剂型可以递送例如约1mg至约900mg、约1mg至约800mg、约1mg至约700mg、约1mg至约600mg、约1mg至约500mg、约1mg至约400mg、约1mg至约300mg、约1mg至约200mg、约1mg至约100mg、约1mg至约10mg、约1mg至约5mg、约0.1mg至约10mg、约0.1mg至约5mg、约10mg至约1,000mg、约50mg至约1,000mg、约100mg至约1,000mg、约200mg至约1,000mg、约300mg至约1,000mg、约400mg至约1,000mg、约500mg至约1,000mg、约600mg至约1,000mg、约700mg至约1,000mg、约800mg至约1,000mg、约900mg至约1,000mg、约10mg至约900mg、约100mg至约800mg、约200mg至约700mg或约300mg至约600mg的拟肽大环化合物、其盐、其前药、其衍生物或这些的任意组合。

在一些实施方案中，该组合物以单位剂型存在，该单位剂型可递送例如约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约20mg、约30mg、约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约150mg、约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg或约800mg的拟肽大环化合物、其盐、其前药、其衍生物或这些的任意组合。

合适的给药途径包括但不限于口服、静脉内、经直肠、气雾剂、肠胃外、经眼、经肺、经粘膜、经皮、经阴道、经耳、经鼻和局部给药。此外，仅举例来说，肠胃外递送包括肌肉内、皮下、静脉内、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、腹膜内、淋巴管内和鼻内注射。

在某些实施方案中，本文所描述的组合物以局部而不是全身的方式施用，例如，通过将化合物直接注入器官中。在具体的实施方案中，通过(例如皮下或肌肉内)植入或通过肌肉注射来施用长效制剂。此外，在其它实施方案中，药物在靶向药物递送系统中递送，例如，在包被有器官特异性抗体的脂质体中。在此类实施方案中，脂质体靶向器官，并被器官选择性地吸收。在再一些其它实施方案中，本文所描述的化合物以快速释放制剂的形式提供，以延长释放制剂的形式提供，或以直接释放制剂的形式提供。在再一些其它实施方案中，局部施用本文所描述的化合物。

在另一个实施方案中，本文所描述的组合物被配制成用于口服给药。本文所描述的组合物通过将拟肽大环化合物与例如药学上可接受的载体或赋形剂结合而配制。在各种实施方案中，本文所描述的化合物被配制成口服剂型，其包括，仅举例来说，片剂、粉剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、酏剂、浆剂、悬浮剂等。

在某些实施方案中，用于口服的药物制品通过以下步骤获得：将一种或多种固体赋形剂与一种或多种本文描述的拟肽大环化合物混合，任选地研磨所得混合物，并在加入合适的助剂(如果需要的话)后加工该颗粒混合物，从而得到片剂或锭剂芯。合适的赋形剂为，特别是，填料，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制品，如：例如，玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、微晶纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；或其它，如：聚乙烯吡咯烷酮(PVP或聚维酮)或磷酸钙。在具体的实施方案中，任选加入崩解剂。崩解剂包括，仅举例来说，交联羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐如海藻酸钠。

在一个实施方案中，诸如锭剂芯和片剂的剂型具有一层或多层合适的包衣。在具体的实施方案中，浓缩的糖溶液用于包覆剂型。该糖溶液任选地含有其它组分，仅举例来说，例如阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇，和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。出于辨识目的，还任选地将染料和/或色素加入包衣中。此外，任选地利用染料和/或色素来表征活性化合物剂量的不同组合。

在某些实施方案中，将治疗有效量的至少一种本文描述的拟肽大环化合物配制成其它口服剂型。口服剂型包括由明胶制成的推入配合式胶囊，以及由明胶和诸如甘油或山梨醇的塑化剂制成的软密封胶囊。在具体的实施方案中，推入配合式胶囊含有与一种或多种填料混合的活性成分。填料包括，仅举例来说，乳糖，粘合剂如淀粉，和/或润滑剂如滑石或硬脂酸镁，以及任选的稳定剂。在其它实施方案中，软胶囊含有溶解或悬浮在合适的液体中的一种或多种活性化合物。合适的液体包括，仅举例来说，一种或多种脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，任选地加入稳定剂。

在其它实施方案中，将治疗有效量的至少一种本文描述的拟肽大环化合物配制成用于颊部或舌下给药。适合于颊部或舌下给药的制剂包括，仅以举例来说，片剂、锭剂或凝胶。在又一些其它实施方案中，将本文描述的拟肽大环化合物配制成用于肠胃外注射，包括适合于快速浓注或连续输注的制剂。在具体的实施方案中，用于注射的制剂以单位剂型(例如，在安瓿中)或在多剂量容器中提供。注射制剂中任选地加入防腐剂。在又一些其它实施方案中，将药物组合物配制成适用于肠胃外注射的形式，作为在油性或水性载体中的无菌悬浮液、溶液或乳液。肠胃外注射制剂任选地含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。在具体的实施方案中，用于肠胃外给药的药物制剂包括水溶形式的活性化合物的水溶液。在另外的实施方案中，将活性化合物的悬浮液制备成合适的油性注射悬浮液。在本文描述的药物组合物中所用的合适的亲脂性溶剂或载体包括，仅举例来说，脂肪油，如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三脂，或脂质体。在某些具体的实施方案中，水性注射悬浮液含有增加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液含有合适的稳定剂或增加化合物的溶解度、从而允许制备高度浓缩的溶液的试剂。或者，在其它实施方案中，活性成分以粉末形式存在，以供在使用前用合适的载体例如灭菌无热原水重建。

本文的药物组合物可以例如每天施用一次或两次或三次或四次或五次或六次，或者每周施用一次或两次或三次或四次或五次或六次，并且可以施用例如一天、一周、一个月、3个月、六个月、一年、五年或例如十年。

使用方法

在一个方面，本发明提供了新的拟肽大环化合物，其可在竞争性结合试验中用于鉴别可与拟肽大环化合物所模拟的蛋白质或肽的天然配体相结合的物质。例如，在GHRH系统中，基于GHRH的标记的拟肽大环化合物可以与竞争性结合GHRH受体的小分子一起在结合试验中使用。竞争结合研究允许在体外快速评价并确定对于GHRH系统特异性的候选药物。可以使用本文公开的任何拟肽大环化合物及其结合配偶体进行这类结合研究。

本发明进一步提供了抗拟肽大环化合物的抗体的生成。在一些实施方案中，这些抗体特异性地结合拟肽大环化合物和拟肽大环化合物相关的前体肽，如GHRH。例如，这样的抗体破坏天然的蛋白质-蛋白质相互作用，例如GHRH与GHRH受体之间的相互作用。

另一方面，本发明提供了激活GHRH受体、从而刺激生长激素的生成和释放的方法，该生长激素转而可增加瘦肌质量或减少脂肪组织，例如内脏和/或腹部脂肪组织。在一些实施方案中，使用本发明的药物组合物治疗患有肥胖症例如腹部肥胖症的受试者。参见例如Makimura等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.2009,94(12):5131-5138，其特此通过引用而并入。

在再一个方面，本发明提供了用于治疗包括食欲缺乏、恶病质(如癌症恶病质、慢性心力衰竭恶病质、慢性阻塞性肺疾病恶病质、类风湿性关节炎恶病质)和少肌症在内的肌肉萎缩病的方法，用于治疗包括HIV脂质营养不良在内的脂质营养不良的方法，用于治疗包括成人和儿童生长激素缺乏在内的生长激素紊乱的方法，或用于治疗胃轻瘫或短肠综合征的方法。这些方法包括向包括人类在内的温血动物施用有效量的本发明的化合物。在一些实施方案中，本文提供的用于肌肉萎缩病治疗的药物组合物以不超过每天一次的频率、不超过隔天一次的频率、不超过每周两次的频率、不超过每周一次的频率或不超过隔周一次的频率施用。

在一些实施方案中，本文提供了用于治疗成人生长激素缺乏的方法。此类缺乏可能是由例如垂体或下丘脑受损或受伤导致的。经常地，成人发作型生长激素缺乏是由垂体肿瘤或对此类肿瘤的治疗(例如通过颅脑照射)引起的。成人生长激素缺乏还可由垂体血液供应减少引起。在一些实施方案中，本文提供的用于成人生长激素缺乏治疗的药物组合物以不超过每天一次的频率、不超过隔天一次的频率、不超过每周两次的频率、不超过每周一次的频率或不超过隔周一次的频率施用。

在一些实施方案中，本文提供了用于治疗儿童生长激素缺乏的方法。儿童中的生长激素缺乏通常是特发性的。然而，可能的原因包括基因(包括GHRHR或GH1)突变、涉及垂体的先天畸形(如透明隔-视神经发育不良或垂体后叶素异位)、慢性肾病、颅内肿瘤(例如位于或接近蝶鞍，如颅咽管瘤)、(针对诸如白血病或脑瘤的癌症的)颅脑放射治疗引起的垂体损伤、手术、创伤或颅内疾病(例如脑积水)、自身免疫性炎症(垂体炎)、低血压引起的缺血性或出血性梗塞形成(席汉综合征)或出血性垂体卒中。在先天性疾病如普拉德-威利综合征、特纳综合征或身材矮小同源框基因(SHOX)缺乏、特发性身材矮小症或小于胎龄儿中观察到生长激素缺乏。在一些实施方案中，用于治疗儿童生长激素缺乏的本发明组合物以不超过每天一次的频率、不超过隔天一次的频率、不超过每周两次的频率、不超过每周一次的频率或不超过隔周一次的频率施用。

如本文所用的，术语“治疗”被定义为向患者应用或施用治疗剂，或者向从患者分离的组织或细胞系应用或施用治疗剂，所述患者患有疾病、疾病症状或具有患病倾向，其目的是治愈、恢复、减轻、解除、改变、矫正、缓解、改善或影响疾病、疾病症状或患病倾向。

在一些实施方案中，本发明提供了如以下各项所述的拟肽大环化合物和使用方法。

项目1.一种拟肽大环化合物，其包含与选自表1、2或4中氨基酸序列的氨基酸序列至少约60％相同的氨基酸序列。

项目2.如项目1所述的拟肽大环化合物，其中所述拟肽大环化合物的氨基酸序列与选自表1、2或4中氨基酸序列的氨基酸序列至少约80％相同。

项目3.如项目1所述的拟肽大环化合物，其中所述拟肽大环化合物的氨基酸序列与选自表1、2或4中氨基酸序列的氨基酸序列至少约90％相同。

项目4.如项目1所述的拟肽大环化合物，其中所述拟肽大环化合物的氨基酸序列选自表1、2或4中的氨基酸序列。

项目5.如项目1所述的拟肽大环化合物，其中该拟肽大环化合物包含螺旋。

项目6.如项目1所述的拟肽大环化合物，其中该拟肽大环化合物包含α-螺旋。

项目7.如项目1所述的拟肽大环化合物，其中该拟肽大环化合物包含α,α-二取代的氨基酸。

项目8.如项目1所述的拟肽大环化合物，其中该拟肽大环化合物包含连接至少两个氨基酸的α-位点的交联体。

项目9.如项目8所述的拟肽大环化合物，其中所述两个氨基酸中的至少一个为α,α-二取代的氨基酸。

项目10.如项目8所述的拟肽大环化合物，其中该拟肽大环化合物具有下式：

其中：

A、C、D和E各自独立地为天然或非天然氨基酸；

B为天然或非天然氨基酸、氨基酸类似物、[-NH-L₃-CO-]、[-NH-L₃-SO₂-]或[-NH-L₃-]；

L为式–L₁–L₂–的大环形成连接体；

各个K为O、S、SO、SO₂、CO、CO₂或CONR₃；

v和w独立地为1-1000的整数；

u、x、y和z独立地为0-10的整数；且

n为1-5的整数。

项目11.如项目1所述的拟肽大环化合物，其中该拟肽大环化合物包含将该拟肽大环化合物内的第一氨基酸的骨架氨基连接至第二氨基酸的交联体。

项目12.如项目11所述的拟肽大环化合物，其中该拟肽大环化合物具有式(II)或(IIa)：

其中：

A、C、D和E各自独立地为天然或非天然氨基酸；

各个K为O、S、SO、SO₂、CO、CO₂或CONR₃；

v和w独立地为1-1000的整数；

u、x、y和z独立地为0-10的整数；且

n为1-5的整数。

项目13.一种提高受试者中的生长激素(GH)循环水平的方法，其包括向受试者施用如项目1所述的拟肽大环化合物。

项目14.一种增加受试者中的瘦肌质量的方法，其包括向受试者施用如项目1所述的拟肽大环化合物。

项目15.一种减少受试者中的脂肪组织的方法，其包括向受试者施用如项目1所述的拟肽大环化合物。

项目16.一种治疗受试者中的肌肉萎缩病的方法，该肌肉萎缩病包括食欲缺乏、恶病质(如癌症恶病质、慢性心力衰竭恶病质、慢性阻塞性肺疾病恶病质、类风湿性关节炎恶病质)或少肌症，该方法包括向受试者施用如项目1所述的拟肽大环化合物。

项目17.一种治疗受试者中的脂质营养不良的方法，该脂质营养不良包括HIV脂质营养不良，该方法包括向受试者施用如项目1所述的拟肽大环化合物。

项目18.一种治疗受试者中的生长激素紊乱的方法，该生长激素紊乱包括成人生长激素缺乏和儿童生长激素缺乏，该方法包括向受试者施用如项目1所述的拟肽大环化合物。

项目19.一种治疗受试者中的胃轻瘫或短肠综合征的方法，其包括向受试者施用如项目1所述的拟肽大环化合物。

项目20.一种通过施用GHRH受体的激动剂来治疗受试者中的肌肉萎缩病、脂质营养不良、生长激素紊乱或胃轻瘫/短肠综合征的方法，其中该激动剂以不超过每天一次的频率、不超过隔天一次的频率、不超过每周两次的频率、不超过每周一次的频率或不超过隔周一次的频率施用。

项目21.一种通过施用GHRH类似物来治疗受试者中的肌肉萎缩病、脂质营养不良、生长激素紊乱或胃轻瘫/短肠综合征的方法，其中该GHRH类似物以不超过每天一次的频率、不超过隔天一次的频率、不超过每周两次的频率、不超过每周一次的频率或不超过隔周一次的频率施用。

项目22.一种通过施用GHRH受体的激动剂来提高受试者中的生长激素(GH)循环水平的方法，其中该激动剂以不超过每天一次的频率、不超过隔天一次的频率、不超过每周两次的频率、不超过每周一次的频率或不超过隔周一次的频率施用。

项目23.一种通过施用GHRH类似物来提高受试者中生长激素(GH)循环水平的方法，其中该GHRH类似物以不超过每天一次的频率、不超过隔天一次的频率、不超过每周两次的频率、不超过每周一次的频率或不超过隔周一次的频率施用。

项目24.如项目10所述的拟肽大环化合物，其中L₁和L₂独立地为亚烷基、亚烯基或亚炔基。

项目25.如项目24所述的拟肽大环化合物，其中L₁和L₂独立地为C₃-C₁₀亚烷基或亚烯基。

项目26.如项目24所述的拟肽大环化合物，其中L₁和L₂独立地为C₃-C₆亚烷基或亚烯基。

项目27.如项目10所述的拟肽大环化合物，其中R₁和R₂为H。

项目28.如项目10所述的拟肽大环化合物，其中R₁和R₂独立地为烷基。

项目29.如项目10所述的拟肽大环化合物，其中R₁和R₂为甲基。

虽然本文已显示和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域的技术人员显而易见的是，这些实施方案只是以举例的方式提供的。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员将会想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实施本发明时，可以采用本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案。旨在用下列权利要求限定本发明的范围，并且这些权利要求范围内的方法和结构及其等效物也涵盖在本发明内。

实施例

实施例1：本发明的拟肽大环化合物

如以前所述以及如下所述合成、纯化和分析拟肽大环化合物(Schafmeister等人，J.Am.Chem.Soc.122:5891-5892(2000)；Schafmeister和Verdine，J.Am.Chem.Soc.122:5891(2005)；Walensky等人，Science305:1466-1470(2004)；和美国专利号7,192,713)。通过用相对应的合成氨基酸替代两个或多个天然存在的氨基酸来设计拟肽大环化合物。替代发生在i和i+4以及i和i+7位。使用固相条件、rink amide AM树脂(Novabiochem)和Fmoc主链保护基团化学方法人工地或在自动化肽合成仪(Applied Biosystems，433A型)上进行肽合成。对于天然Fmoc保护的氨基酸(Novabiochem)的偶联，使用10当量的氨基酸和1:1:2摩尔比的偶联试剂HBTU/HOBt(Novabiochem)/DIEA。非天然氨基酸(4当量)与1:1:2摩尔比的HATU(Applied Biosystems)/HOBt/DIEA偶联。合成肽的N末端被乙酰化，而C末端被酰胺化。

通过高效液相色谱法(HPLC)(Varian ProStar)在反相C18柱(Varian)上完成交联化合物的纯化，从而获得纯化合物。通过LC/MS质谱法(与Agilent1100HPLC系统接口连接的Micromass LCT)和氨基酸分析(Applied Biosystems，420A型)确认纯产物的化学组成。

表4显示了制备的本发明拟肽大环化合物的列表。

表4

在上文和别处显示的序列中，使用了以下缩写：由“$”表示的氨基酸是通过包含一个双键的全碳i至i+4交联体连接的α-Me S5-戊烯基-丙氨酸烯烃氨基酸。“％”是通过不含双键的全碳i至i+4交联体(完全饱和的烯烃交联体)连接的α-Me S5-戊烯基-丙氨酸烯烃氨基酸。由“$r8”表示的氨基酸是通过包含一个双键的全碳i至i+7交联体连接的α-Me R8-辛烯基-丙氨酸烯烃氨基酸。由“％r8”表示的氨基酸是通过不含双键的全碳i至i+7交联体(完全饱和的烯烃交联体)连接的α-Me R8-辛烯基-丙氨酸烯烃氨基酸。标号“iso1”或“iso2”表明该拟肽大环化合物为单一的异构体。标有下标“a”的氨基酸表示D-丙氨酸。

用于形成三唑交联体的氨基酸根据如下所示的图例表示。除非另有指明，各个氨基酸在α位点上的立体化学为S。对于叠氮氨基酸，所示碳原子的数目是指α碳与末端叠氮之间的亚甲基单位的数目。对于炔烃氨基酸，所示碳原子的数目是α位点与三唑部分之间的亚甲基单位的数目加上来源于炔烃的三唑基团内的两个碳原子。

$5a5 α-Me炔烃1,5三唑(5碳)

$5n3 α-Me叠氮1,5三唑(3碳)

$4rn6 α-Me R-叠氮1,4三唑(6碳)

$4a5 α-Me炔烃1,4三唑(5碳)

几种拟肽大环化合物的示例性结构在表5中示出。

表5

实施例2：被纯化蛋白酶的代谢

通过将每种肽以10μM浓度溶解在200μL100mM NH₄OAc(pH7.5)中，来检测线性肽和交联拟肽大环化合物对胰蛋白酶(MPBiomedicals,Solon OH)蛋白水解的稳定性。通过加入3.5μl胰蛋白酶(每500μL反应12.5μg蛋白酶)启动反应，并且在室温(22±2℃)下温育的同时在密封小瓶中连续震摇。酶/底物比为1:102(w/w)。在0、5、30、60和135min的温育时间之后，通过加入等体积的0.2％三氟乙酸终止反应。然后，立即通过LC-MS在正检测模式下分析该溶液。通过未定标的MS响应与酶温育时间的非线性拟合来在GraphPad Prism中计算每种肽的反应半衰期。结果在图1A和1B中示出。

实施例3：通过cAMP测定的GHRHR激动

检测GHRH(1-29)和交联拟肽大环化合物在不同浓度下在人GHRH受体(hGHRHR)处的激动。用维尔烯(Lifetechnologies)使瞬时或稳定表达hGHRHR的人293细胞从细胞培养瓶中脱离，悬浮于无血清培养基中(50000个细胞/试验点)，并于室温下用GHRH(1-29)(Bachem)或交联拟肽大环化合物刺激30min。采用基于的试验(CisBio)根据制造商说明书来对cAMP进行定量。通过响应与剂量的非线性拟合(GraphPad Prism)计算每种激动剂的EC50％。最大响应通过用10μMGHRH(1-29)刺激来确定。结果在图3中示出。

实施例4：大鼠中的血浆PK/PD研究。

对五种本发明的拟肽大环化合物(SP-1、SP-6、SP-8、SP-21、SP-32)以及舍莫瑞林进行研究，以确定大鼠中的药代动力学和药效学参数。使用雄性Sprague-Dawley大鼠(300g，不禁食，插管)。该研究具有三个组：静脉内给药、皮下给药和皮下给药(载体对照)。对于使用舍莫瑞林的实验，采用3mg/kg静脉内/皮下快速浓注的剂量水平(剂量体积为3mL/kg剂量，剂量浓度为1mg/mL)。使用的载体为：注射用水中的10wt％N,N-二甲基乙酰胺、10wt％DMSO、2wt％Solutol HS15，该注射用水中含有45mg/mL(4.5wt％)甘露醇和25mM(0.38wt％)组氨酸(pH7.5；320mOsm/kg)。肽首先以高浓度溶解在DMA和DMSO中，然后在Solutol载体中第二次稀释。

对于使用拟肽大环化合物的实验，用0.1mL的DMA和0.1mL的DMSO来与每毫克大环化合物(各个实验中使用～4.3-4.5mg的大环化合物)组合。利用超声处理以确保完全溶解。DMA/DMSO中每毫克大环化合物使用0.8mL Solutol载体。通过吸液或轻轻涡旋来轻柔混合溶液。给药的每一天都使用新的小瓶，并且大环化合物在配制之前于-20℃以固体贮存。

对于各研究组，在特定的时间点(5min、15min、30min、1h、2h、4h、8h、24h和48h)对2只大鼠进行放血(350μL)，并且就在给药之前进行150μL的放血。采集后最多30分钟内，通过在4℃以2000G离心20分钟将血浆制备到K2EDTA管中。从每350μL血中转移120μL到一个试管中用于PK研究，转移50μL到另一个试管中用于PD研究，并且立刻冷冻。从150μL血中转移70μL到一个试管中用于PD研究，并且立刻冷冻。

结果在图4-11中示出。

Claims

1.一种拟肽大环化合物，其包含与GHRH1-29至少约60％相同的氨基酸序列，进一步包含至少两个大环形成连接体，其中所述两个大环形成连接体中的第一个将第一氨基酸连接至第二氨基酸，并且所述两个大环形成连接体中的第二个将第三氨基酸连接至第四氨基酸。

2.如权利要求1所述的拟肽大环化合物，其包含两个大环形成连接体。

3.如任一前述权利要求所述的拟肽大环化合物，其中所述大环形成连接体中的每一个连接以下氨基酸对中的一个：4和8；5和12；8和12；8和15；9和16；12和16；12和19；15和22；18和25；21和25；21和28；22和29；25和29。

4.如权利要求3所述的拟肽大环化合物，其中所述大环形成连接体中的每一个连接以下氨基酸对：4和8；5和12；12和19；15和22；18和25；21和25；21和28。

5.如权利要求3所述的拟肽大环化合物，其中所述第一大环形成连接体连接氨基酸对4和8；5和12；8和12；8和15；9和16；12和16；或12和19；并且所述第二大环形成连接体连接氨基酸对15和22；18和25；21和25；21和28；22和29；或25和29。

6.如权利要求3所述的拟肽大环化合物，其中所述第一大环形成连接体连接氨基酸对4和8；5和12；或12和19；并且所述第二大环形成连接体连接氨基酸对15和22；18和25；21和25；或21和28。

7.如权利要求3所述的拟肽大环化合物，其中所述第一大环形成连接体连接氨基酸对4和8，并且所述第二大环形成连接体连接氨基酸对21和25。

8.一种拟肽大环化合物，其包含与GHRH1-29至少约60％相同的氨基酸序列，进一步包含将第一氨基酸连接至第二氨基酸的大环形成连接体，其中所述第一和第二氨基酸选自以下氨基酸对：4和8；5和12；8和12；8和15；9和16；12和16；12和19；15和22；18和25；21和25；21和28；22和29。

9.如权利要求8所述的拟肽大环化合物，其中所述大环形成连接体连接氨基酸12和19。

10.如任一前述权利要求所述的拟肽大环化合物，其包含与选自表1、2或4中氨基酸序列的氨基酸序列至少约60％相同的氨基酸序列。

11.如任一前述权利要求所述的拟肽大环化合物，其中所述拟肽大环化合物的氨基酸序列与选自表1、2或4中氨基酸序列的氨基酸序列至少约80％相同。

12.如任一前述权利要求所述的拟肽大环化合物，其中所述拟肽大环化合物的氨基酸序列与选自表1、2或4中氨基酸序列的氨基酸序列至少约90％相同。

13.如权利要求1所述的拟肽大环化合物，其中所述拟肽大环化合物的氨基酸序列选自表1、2或4中的氨基酸序列。

14.如任一前述权利要求所述的拟肽大环化合物，其中所述拟肽大环化合物包含螺旋。

15.如任一前述权利要求所述的拟肽大环化合物，其中所述拟肽大环化合物包含α-螺旋。

16.如权利要求1所述的拟肽大环化合物，其中所述拟肽大环化合物包含α,α-二取代的氨基酸。

17.如权利要求16所述的拟肽大环化合物，其中由大环形成连接体连接的各个氨基酸为α,α-二取代的氨基酸。

18.如任一前述权利要求所述的拟肽大环化合物，其具有下式：

其中：

A、C、D和E各自独立地为氨基酸；

B为氨基酸、[-NH-L₃-CO-]、[-NH-L₃-SO₂-]或[-NH-L₃-]；

L为式–L₁–L₂–的大环形成连接体；

并且其中A、B、C、D和E，连同通过大环形成连接体L连接的交联氨基酸一起，形成该拟肽大环化合物的氨基酸序列；

各个K为O、S、SO、SO₂、CO、CO₂或CONR₃；

v和w独立地为1-100的整数；

u为1-3的整数；

x、y和z独立地为0-10的整数；且

n为1-5的整数。

19.如权利要求18所述的拟肽大环化合物，其中u为2。

20.如权利要求19所述的拟肽大环化合物，其具有下式：

其中A、C、D和E各自独立地为氨基酸；

B为氨基酸、[-NH-L₃-CO-]、[-NH-L₃-SO₂-]或[-NH-L₃-]；

L’为式–L₁’–L₂’–的大环形成连接体；

各个K独立地为O、S、SO、SO₂、CO、CO₂或CONR₃；

v’和w’独立地为1-100的整数；

x’、y’和z’独立地为0-10的整数；且

n为1-5的整数。

21.如权利要求18-20所述的拟肽大环化合物，其中x+y+z的总和为2、3或6，例如3或6。

22.如权利要求20所述的拟肽大环化合物，其中x’+y’+z’的总和为2、3或6，例如3或6。

23.如权利要求18-21中的任一项所述的拟肽大环化合物，其中v和w各自独立地为1至10、1至15、1至20或1至25的整数。

24.如权利要求1-16中的任一项所述的拟肽大环化合物，其中所述拟肽大环化合物包含将所述拟肽大环化合物内的第一氨基酸的骨架氨基连接至第二氨基酸的交联体。

25.如权利要求24所述的拟肽大环化合物，其中所述拟肽大环化合物具有式(II)或(IIa)：

其中：

A、C、D和E各自独立地为氨基酸；

B为氨基酸、[-NH-L₃-CO-]、[-NH-L₃-SO₂-]或[-NH-L₃-]；

并且其中A、B、C、D和E，连同通过大环形成连接体-L₁-L₂-连接的交联氨基酸一起，形成所述拟肽大环化合物的氨基酸序列，该氨基酸序列与GHRH1-44、GHRH1-29和/或选自表1、2或4中氨基酸序列的氨基酸序列至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同；

各个K为O、S、SO、SO₂、CO、CO₂或CONR₃；

v和w独立地为1-100的整数；

u为1-3的整数；

x、y和z独立地为0-10的整数；且

n为1-5的整数。

26.如任一前述权利要求所述的拟肽大环化合物，其具有下式：

其中：

A、C、D和E各自独立地为氨基酸；

B为氨基酸、[-NH-L₃-CO-]、[-NH-L₃-SO₂-]或[-NH-L₃-]；

L为式–L₁–L₂–的大环形成连接体；

并且其中A、B、C、D和E，连同通过大环形成连接体L连接的交联氨基酸一起，形成与GHRH1-29至少约60％相同的氨基酸序列；

各个K为O、S、SO、SO₂、CO或CO₂；

v和w独立地为1-100的整数；

u为1-3的整数；

x、y和z独立地为0-10的整数；且

n为1-5的整数。

27.如权利要求26所述的拟肽大环化合物，其中A、B、C、D和E连同通过大环形成连接体L连接的交联氨基酸一起形成与表1、2或3的氨基酸序列至少约60％、70％、80％、90％相同的氨基酸序列。

28.一种拟肽大环化合物，其包含下式的氨基酸序列：

其中：

X1为Tyr或His；

X2为Ala、D-Ala或Val；

X3为Asp；

X4为Ala或交联氨基酸；

X5为Ile；

X6为Phe；

X7为Thr；

X8为Gln、Asn或交联氨基酸；

X9为Ser或交联氨基酸；

X10为Tyr；

X11为Arg、Ala或Gln；

X12为Lys、Ala、Gln或交联氨基酸；

X13为Val或Ile；

X14为Leu；

X15为Gly、Ala或交联氨基酸；

X16为Gln、Glu或交联氨基酸；

X17为Leu；

X18为Ser、Tyr或交联氨基酸；

X19为Ala或交联氨基酸；

X20为Arg或Gln；

X21为Lys、Gln或交联氨基酸；

X22为Leu、Ala或交联氨基酸；

X23为Leu；

X24为Gln、Glu或His；

X25为Asp、Glu或交联氨基酸；

X26为Ile；

X27为Met、Ile、Leu或Nle；

X28为Ser或交联氨基酸；

X29为Arg、Ala、Gln或交联氨基酸；

其中所述拟肽大环化合物包含至少一个连接至少一对选自X1-X29的氨基酸的大环形成连接体；

L为式–L₁–L₂–的大环形成连接体；

各个K为O、S、SO、SO₂、CO或CO₂；

29.如权利要求28所述的拟肽大环化合物，其中各个大环形成连接体连接以下氨基酸对中的一个：X4和X8；X5和X12；X8和X12；X8和X15；X9和X16；X12和X16；X12和X19；X15和X22；X18和X25；X21和X25；X21和X28；X22和X29；X25和X29。

30.如权利要求29所述的拟肽大环化合物，其中各个大环形成连接体连接以下氨基酸对中的一个：X4和X8；X5和X12；X12和X19；X15和X22；X18和X25；X21和X25；X21和X28。

31.如权利要求18-30中的任一项所述的拟肽大环化合物，其中L₁和L₂独立地为亚烷基、亚烯基或亚炔基。

32.如权利要求31所述的拟肽大环化合物，其中L₁和L₂独立地为C₃-C₁₀亚烷基或亚烯基。

33.如权利要求31所述的拟肽大环化合物，其中L₁和L₂独立地为C₃-C₆亚烷基或亚烯基。

34.如权利要求18-30中的任一项所述的拟肽大环化合物，其中R₁和R₂为H。

35.如权利要求18-30中的任一项所述的拟肽大环化合物，其中R₁和R₂独立地为烷基。

36.如权利要求18-30中的任一项所述的拟肽大环化合物，其中R₁和R₂为甲基。

37.一种提高受试者中的生长激素(GH)循环水平的方法，其包括向受试者施用如任一前述权利要求所述的拟肽大环化合物。

38.一种增加受试者中的瘦肌质量的方法，其包括向受试者施用如任一前述权利要求所述的拟肽大环化合物。

39.一种减少受试者中的脂肪组织的方法，其包括向受试者施用如任一前述权利要求所述的拟肽大环化合物。

40.如权利要求39所述的方法，其中所述脂肪组织为腹部组织。

41.如权利要求39所述的方法，其中所述受试者患有肥胖症，例如腹部肥胖症。

42.一种治疗受试者中的肌肉萎缩病的方法，该肌肉萎缩病包括食欲缺乏、恶病质(如癌症恶病质、慢性心力衰竭恶病质、慢性阻塞性肺疾病恶病质、类风湿性关节炎恶病质)或少肌症，该方法包括向受试者施用如任一前述权利要求所述的拟肽大环化合物。

43.一种治疗受试者中的脂质营养不良的方法，该脂质营养不良包括HIV脂质营养不良，该方法包括向受试者施用如任一前述权利要求所述的拟肽大环化合物。

44.一种治疗受试者中的生长激素紊乱的方法，其包括向受试者施用如任一前述权利要求所述的拟肽大环化合物。

45.如权利要求44所述的方法，其中所述紊乱是成人生长激素缺乏。

46.如权利要求44所述的方法，其中所述紊乱是儿童生长激素缺乏。

47.如权利要求46所述的方法，其中所述儿童生长激素缺乏与特发性身材矮小症、SGA(小于胎龄儿)、慢性肾病、普拉德-威利综合征、特纳综合征、身材矮小同源框(SHOX)基因缺乏或原发性IGF-1缺乏相关。

48.一种治疗受试者中的胃轻瘫或短肠综合征的方法，其包括向受试者施用如任一前述权利要求所述的拟肽大环化合物。

49.一种通过施用GHRH受体的激动剂来治疗受试者中的肌肉萎缩病、脂质营养不良、生长激素紊乱或胃轻瘫/短肠综合征的方法，其中所述激动剂以不超过每天一次的频率、不超过隔天一次的频率、不超过每周两次的频率、不超过每周一次的频率或不超过隔周一次的频率施用。

50.一种通过施用GHRH类似物来治疗受试者中的肌肉萎缩病、脂质营养不良、生长激素紊乱或胃轻瘫/短肠综合征的方法，其中所述GHRH类似物以不超过每天一次的频率、不超过隔天一次的频率、不超过每周两次的频率、不超过每周一次的频率或不超过隔周一次的频率施用。

51.一种通过施用GHRH受体的激动剂来提高受试者中的生长激素(GH)循环水平的方法，其中所述激动剂以不超过每天一次的频率、不超过隔天一次的频率、不超过每周两次的频率、不超过每周一次的频率或不超过隔周一次的频率施用。

52.一种通过施用GHRH类似物来提高受试者中的生长激素(GH)循环水平的方法，其中所述GHRH类似物以不超过每天一次的频率、不超过隔天一次的频率、不超过每周两次的频率、不超过每周一次的频率或不超过隔周一次的频率施用。