CN103747693B - 可食用工程肉 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了成形为多个至少部分融合的层的工程肉产品，其中每个层包含至少部分融合的多细胞体，所述多细胞体包含非人肌细胞并且其中所述工程肉为可食用的。本发明还提供了包含多个彼此粘附和/或粘着的非人肌细胞的多细胞体，其中所述多细胞体相邻地布置在营养物可渗透的支承基底上并且维持培养以允许所述多细胞体至少部分融合以形成用于形成工程肉的基本上平坦的层。本发明进一步描述了利用所述层形成工程肉的方法。

Description

可食用工程肉
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年7月26日提交的美国临时申请号61/511,948的权益，所述临时申请以引用的方式整体并入本文。
发明背景
蛋白质是人体用于生长和维持所需要的营养物。除水之外，蛋白质是身体中最丰富的分子。根据美国和加拿大膳食参考摄入量准则，年龄为19至70岁的女性每天需要消耗46克的蛋白质，而年龄为19至70岁的男性每天需要消耗56克的蛋白质以避免缺乏。然而，这种建议是针对没有疾病的久坐人群而言。蛋白质缺乏可导致智力下降或精神发育迟缓以及促成疾病如夸希奥科病(kwashiorkor)流行。蛋白质缺乏是发展中国家中的严重问题，特别在受战争、饥荒和人口过剩影响的国家中。蛋白质的动物来源(如肉)常常是以合适比例完全补充所有必需氨基酸的来源。
肉的营养益处受潜在的相关环境退化制约。根据畜牧、环境和发展倡议的题为Livestock′s Long Shadow-Environmental Issues and Options(畜牧业巨大阴影-环境问题和选择)的2006年报告，畜牧业是全世界环境退化的最大促成者之一，并且饲养动物用于食物的现代实践广泛促成了空气和水污染、土地退化、气候变化以及生物多样性损失。肉和蛋白质的其它动物来源的生产和耗用也与热带雨林消失和物种灭绝相关。因此，存在对解决由活动物产生的肉的替代物的需求的需要。
发明概述
组织工程技术为生产食用动物蛋白质来源提供了新的机会，所述食用动物蛋白质来源与饲养家畜的环境退化无关。组织工程已被定义为跨学科领域，其针对开发生物替代品应用了工程和生命科学的原理，所述生物替代品修复、维持或改进了组织功能或整个器官。Langer R，Vacanti JP，Tissue Engineering，Science260(5110)：920-926(1993年5月)。虽然潜在应用组织工程技术满足生物的营养需要，但是还未开发出科学合理和工业可行的方法来生产可食用肉并且可食用工程肉产品是不可获得的。
本文公开了工程肉产品、包含多个用于生产所述肉的多细胞体的层以及生产工程肉产品的方法。在第一方面，本文公开了包括多个层的工程肉，其中每个层包含非人肌细胞并且其中工程肉为可食用的并且用于摄取。
本文还描述了工程肉产品，所述肉产品包括：具有一定体积的本体，其中本体包括多个堆叠的平坦层，其中所述层至少部分融合并且每个平坦层包含多个至少部分融合的包含肌细胞的非人多细胞体；另外其中本体不包括任何血管，并且其中工程肉产品为可食用的并且用于摄取。
本体体积可以大于一些最小体积(例如，大于0.1cm3、大于1cm3、大于10cm3、大于50cm3、大于100cm3、大于500cm3、大于1000cm3等，包括任何中间体积)。
当检验体积或肉时，工程肉的层状性质可为可见的。例如，所述肉可以具有其中肌细胞在层之间取向不同的平坦层。在一些变化中，通过观察细胞死亡的区域，工程肉的层状组织可以是清楚的。例如，肉产品的中间区域内的平坦层可以在工程肉的外层之前经历细胞死亡。如以下更详细地描述，通过依次将融合的(或部分融合的)平坦层堆叠在另一个层的顶上并且允许堆叠的层融合而形成工程肉可导致随着依次“更深的”层的细胞死亡的区域进一步与培养基中的新鲜营养物分开。这可产生细胞死亡的图案，其中进一步远离体积边缘的更深的区域(所述更深的区域可以层化为平坦层)在更多新敷放的层之前经历细胞死亡。细胞死亡按时间的层化图案可以通过检验细胞死亡进展的标记物(包括核碎片)和本领域中已知的其它代谢标记物来可视化。例如，可以使用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口端标记(TUNEL)。平坦层可以由具有额外非人细胞类型的多细胞体形成。例如，工程肉体积的每个平坦层可包含多个至少部分融合的多细胞体，所述多细胞体包含非人肌细胞和以下的一种或多种：非人内皮细胞、非人成纤维细胞和/或非人脂肪细胞或类似的细胞。
通常，工程肉不包括任何如可以在其它形式的工程组织中发现的填充体。例如，充当支架(例如，支承结构)的填充体是不必要的，并且可能对最终的可食用产品有害。填充体可以包括生物相容材料，所述生物相容材料抵抗细胞从多细胞体迁移和向内生长并且所述生物相容材料抵抗细胞粘附至其上。参见例如U.S.8,143.055，其以引用的方式整体并入本文。
如本文使用的术语“可食用的”意指食用的或适于人或非人动物食用。如本文使用的短语“用于摄取”意指适于和适应于人或非人动物经口消耗。在一些实施方案中，工程肉的每个层进一步包含非人内皮细胞。在一些实施方案中，工程肉的每个层进一步包含非人脂肪细胞。在一些实施方案中，每个层进一步包含非人成纤维细胞。在一些实施方案中，本文所公开的工程肉包括多个层，其中每个层包含非人肌细胞并且其中每个层的特征在于适配成允许扩散以足以支持培养的非人肌细胞的维持和生长的厚度。在各种实施方案中，工程肉包括多个层，其中每个层为约100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm或1000μm厚。当提及可测量的值时，本文所使用的术语“约”并且可以意指在给定值或范围的+/-2％、+/-5％或+/-10％内。在一些实施方案中，每个层的厚度为约100μm至约1000μm。在另外的实施方案中，每个层的厚度为约150μm至约900μm。在另外的实施方案中，每个层的厚度为约200μm至约800μm。在另外的实施方案中，每个层的厚度为约250μm至约700μm。在另外的实施方案中，每个层的厚度为约300μm至约600μm。在各种实施方案中，工程肉包括2、3、4、5、6、7、8、9或10个层。在其它各种实施方案中，工程肉包括10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个层。在一些实施方案中，本文所公开的工程肉包括约2至约100个层。在另外的实施方案中，工程肉包括约20至约80个层。在另外的实施方案中，工程肉包括约40至约60个层。在一些实施方案中，每个层包含直径为约100μm、200μm、300μm、400μm、500μm的多细胞体。在一些实施方案中，所述多细胞体的直径为约100μm至约500μm。在另外的实施方案中，所述多细胞体的直径为约200μm至约400μm。在另外的实施方案中，所述多细胞体的直径为约200μm至约300μm。在另外的实施方案中，所述多细胞体的直径为约250μm至约400μm。在另外的实施方案中，所述多细胞体的直径为约300μm至约400μm。通常，多细胞体的直径可以指延伸穿过从截面的多细胞体的一侧至相反侧穿过细长多细胞体的截面的中点的最长线的长度。
在一些实施方案中，本文所公开的工程肉的特征在于大致60％至80％水性流体、14％至35％蛋白质、1％至25％脂肪、1％至5％碳水化合物以及1％至5％其它物质的组成。在另外的实施方案中，工程肉相对于蛋白质、脂肪、碳水化合物以及类似物质的百分比具有基本上与牛肉、小牛肉、猪肉、鸡肉或鱼肉相同的组成。在一些实施方案中，工程肉包括多个层，其中每个层包含非人肌细胞和非人内皮细胞并且其中每个层被生物打印。在各种实施方案中，本文所公开的工程肉包括多个层，其中每个层包含肌细胞，并且可以包括内皮细胞、脂肪细胞和/或成纤维细胞中的一种或多种，其中所述细胞源自以下来源，包括但不限于哺乳动物、鸟、爬行动物、鱼、甲壳动物、软体动物以及头足动物或其组合。在一些实施方案中，工程肉包含非人肌细胞，所述非人肌细胞为骨骼肌细胞。在一些实施方案中，肌细胞是心肌细胞。在一些实施方案中，肌细胞为平滑肌细胞。在其它实施方案中，肌细胞是骨骼肌细胞、心肌细胞以及平滑肌细胞的组合。在一些实施方案中，工程肉包含内皮细胞，所述内皮细胞为微血管内皮细胞。在一些实施方案中，本文所公开的工程肉的特征在于约19∶1至约3∶1的非人肌细胞与非人内皮细胞的比率。在一些实施方案中，非人内皮细胞构成约5％至约15％的工程肉的总细胞群。在一些实施方案中，工程肉基本上不含未分化的肌细胞和/或未分化的内皮细胞。在一些实施方案中，肌细胞相对于彼此而对齐。在另外的实施方案中，肌细胞相对于肉的层而对齐。在各种实施方案中，本文所公开的工程肉进一步包含一种或多种增强肉的营养价值、肉的烹调吸引力或非人细胞的生长特征的物质。在一些实施方案中，工程肉进一步包含一种或多种营养补充剂。在另外的实施方案中，营养补充剂选自：维生素、矿物质、纤维、脂肪酸以及氨基酸。在一些实施方案中，工程肉进一步包含一种或多种调味剂和/或着色剂。在一些实施方案中，工程肉进一步包含以下的一种或多种：基质蛋白、蛋白聚糖、抗氧化剂、全氟化碳以及生长因子。在一些实施方案中，工程肉适合用于人耗用。在其它实施方案中，工程肉适合用于非人动物耗用。在又其它实施方案中，工程肉适合用于人和非人动物两者耗用。
在另一方面，本文公开了包含多个活的非人肌细胞的多个多细胞体，其中所述细胞彼此粘附和/或粘着；其中多细胞体被相邻布置在支承基底上以形成用于形成可食用工程肉的基本上平坦的层。在某些实施方案中，所述多细胞体的形状为大致球形。在某些实施方案中，所述多细胞体为大致圆柱形。在一些实施方案中，所述多细胞体具有大致圆形的截面。在一些实施方案中，所述多细胞体具有带正方形、矩形、三角形或其它非圆形截面形状的细长形状。在一些实施方案中，所述多细胞体具有非细长圆柱形形状或立方形形状。当提及布置多细胞体时，本文所使用的术语“相邻”意指相对于支承基底水平上或竖直上处于接触和在其顶上、在其之下或与其接近。
在另一方面，本文公开了包含多个活的非人肌细胞的多个多细胞体，其中所述细胞彼此粘附和/或粘着；其中多细胞体被相邻布置在支承基底上并且维持培养以允许多细胞体融合以形成用于形成可食用工程肉的基本上平坦的层。
在另一方面，本文公开了包含多个活的非人肌细胞的多个多细胞体，其中所述细胞彼此粘附和/或粘着；其中多细胞体被相邻布置在支承基底上并且维持培养以允许多细胞体融合以形成用于形成可食用工程肉的基本上平坦的层；其中支承基底可透过流体和营养物并且允许细胞培养基接触所述层的所有表面。在一些实施方案中，本文所公开的工程层进一步包含非人内皮细胞和/或非人脂肪细胞。在一些实施方案中，所述层进一步包含非人成纤维细胞。在一些实施方案中，工程层的特征在于约19∶1至约3∶1的非人肌细胞与非人内皮细胞的比率。在一些实施方案中，非人内皮细胞构成约5％至约15％的总细胞群。在一些实施方案中，本文所公开的工程层的特征在于适配成允许扩散以足以支持培养的所述非人肌细胞和非人内皮细胞的维持和生长的厚度。在各种实施方案中，工程层为约100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm或1000μm厚。在一些实施方案中，所述层的厚度为约100μm至约1000μm。在另外的实施方案中，所述层的厚度为约150μm至约900μm。在另外的实施方案中，所述层的厚度为约200μm至约800μm。在另外的实施方案中，所述层的厚度为约250μm至约700μm。在另外的实施方案中，所述层的厚度为约300μm至约600μm。在各种实施方案中，本文所公开的工程层进一步包含一种或多种增强营养价值、烹调吸引力或生长特征的物质。在一些实施方案中，工程层进一步包含以下的一种或多种：基质蛋白、蛋白聚糖、抗氧化剂、全氟化碳以及生长因子。在一些实施方案中，包含多个活的非人肌细胞和非人内皮细胞的多个多细胞体(其中所述细胞彼此粘附和/或粘着)被相邻布置在支承基底上以形成用于形成可食用工程肉的基本上平坦的层并且层被生物打印。在一些实施方案中，每个层包含直径为约100μm、200μm、300μm、400μm、500μm的多细胞体。在一些实施方案中，所述多细胞体的直径为约100μm至约500μm。在另外的实施方案中，所述多细胞体的直径为约200μm至约400μm。在另外的实施方案中，所述多细胞体的直径为约200μm至约300μm。在另外的实施方案中，所述多细胞体的直径为约250μm至约400μm。在另外的实施方案中，所述多细胞体的直径为约300μm至约400μm。
本文还描述了形成可食用工程肉产品的方法，所述方法包括：形成多个平坦层，其中每个层通过将多个多细胞体相邻设置在平面上而形成，另外其中每个多细胞体包含多个粘着的非人肌细胞；培养每个平坦层至少直到每个层内的多个多细胞体开始融合；堆叠多个层以形成层状体积的工程肉；以及培养所述体积的肉至少直到堆叠开始融合。
在一些变型中，所述方法还可以包括通过培养多个非人肌细胞和非人内皮细胞至少直到细胞彼此粘着来制备多个多细胞体的步骤。如上所提到，任何其它适当的非人细胞类型可以被包括作为形成层的一些或所有的多细胞体的部分，包括内皮细胞和/或脂肪细胞和/或成纤维细胞。
在形成工程肉产品的过程中，所述层可以被单独或集体地堆叠在其它层的顶上以产生所述体积的工程肉。在一些变化中，每个依次的层相对于一个或多个相邻的层而取向不同。例如，当它们被堆叠时，新的层可以相对于体积中的其它层旋转。在一些变化中，当每个层被堆叠时，它相对于其它层旋转大约90°。
在本文描述的任何工程肉中，所述层可在其形成时得到锻炼。如以下更详细地描述，锻炼层可以增强细胞外基质(ECM)的形成。这还可在层形成时定向层内的细胞(例如，肌细胞)。因此，在形成工程肉的方法的一些变型中可以包括施加机械力、电力或机电力以锻炼每个层中的肌细胞的步骤。
如所提到，可以包括任何适当数目的层。例如，堆叠层的步骤可以包括堆叠多于约10个层、多于约50个层、多于约100个层等等。
在另一方面，本文公开了形成工程肉的方法，其包括：制备包含多个活的非人肌细胞的多个多细胞体，其中所述细胞彼此粘附和/或粘着；将不止一个多细胞体相邻地铺放在支承基底上；允许所述多细胞体融合以形成层；将不止一个层相邻地铺放在所述层上；允许所述层融合以形成工程肉；以及任选地，冷冻所述肉；前提条件是工程肉为可食用的并且用于摄取。在一些实施方案中，本文公开了形成工程肉的方法，其包括：制备包含多个非人肌细胞的多个多细胞体，其中所述细胞彼此粘附和/或粘着；将不止一个多细胞体相邻地铺放在支承基底上；融合所述多细胞体以形成层；将不止一个层相邻地铺放在第一层上；以及融合所述层以形成工程肉；前提条件是工程肉为可食用的。在一些实施方案中，本文所提供的方法进一步包括冷冻所述肉。
在另一方面，本文公开了形成工程肉的方法，其包括：制备包含多个活的非人肌细胞的多个细长多细胞体，其中所述细胞彼此粘附和/或粘着；制备包含多个活的非人肌细胞的多个大致球形的多细胞体，其中所述细胞彼此粘附和/或粘着；将不止一个细长多细胞体和不止一个大致球形的多细胞体相邻地铺放在支承基底上；允许所述多细胞体融合以形成层；将不止一个层相邻地铺放(例如，堆叠)在第一层上；允许所述层融合以形成工程肉；以及任选地，冷冻所述肉；前提条件是工程肉为可食用的并且用于摄取。在一些实施方案中，本文公开了形成工程肉的方法，其包括：制备包含多个非人肌细胞的多个细长多细胞体，其中所述细胞彼此粘附和/或粘着；制备包含多个非人肌细胞的多个大致球形的多细胞体，其中所述细胞彼此粘附和/或粘着；将不止一个细长多细胞体和不止一个大致球形的多细胞体相邻地铺放在支承基底上；融合所述多细胞体以形成层；将不止一个层相邻地铺放在第一层上；以及融合所述层以形成一定体积的工程肉；前提条件是工程肉为可食用的并且用于摄取。在一些实施方案中，本文所提供的方法进一步包括冷冻所述肉。
在一些实施方案中，细长多细胞体与大致球形的多细胞体的比率为约0∶100、1∶100、2∶100、3∶100、4∶100、5∶100、6∶100、7∶100、8∶100、9∶100、1∶10、11∶100、12∶100、13∶100、14∶100、15∶100、16∶100、17∶100、18∶100、19∶100、1∶5、21∶100、22∶100、23∶100、24∶100、25∶100、26∶100、27∶100、28∶100、29∶100、3∶10、31∶100、32∶100、33∶100、34∶100、35∶100、36∶100、37∶100、38∶100、39∶100、2∶5、41∶100、42∶100、43∶100、44∶100、45∶100、46∶100、47∶100、48∶100、49∶100、1∶2、51∶100、52∶100、53∶100、54∶100、55∶100、56∶100、57∶100、58∶100、59∶100、3∶5、61∶100、62∶100、63∶100、64∶100、65∶100、66∶100、67∶100、68∶100、69∶100、7∶10、71∶100、72∶100、73∶100、74∶100、75∶100、76∶100、77∶100、78∶100、79∶100、4∶5、81∶100、82∶100、83∶100、84∶100、85∶100、86∶100、87∶100、88∶100、89∶100、9∶10、91∶100、92∶100、93∶100、94∶100、95∶100、96∶100、97∶100、98∶100、99∶100或1∶1。在一些实施方案中，大致球形的多细胞体与细长多细胞体的比率为约0∶100、1∶100、2∶100、3∶100、4∶100、5∶100、6∶100、7∶100、8∶100、9∶100、1∶10、11∶100、12∶100、13∶100、14∶100、15∶100、16∶100、17∶100、18∶100、19∶100、1∶5、21∶100、22∶100、23∶100、24∶100、25∶100、26∶100、27∶100、28∶100、29∶100、3∶10、31∶100、32∶100、33∶100、34∶100、35∶100、36∶100、37∶100、38∶100、39∶100、2∶5、41∶100、42∶100、43∶100、44∶100、45∶100、46∶100、47∶100、48∶100、49∶100、1∶2、51∶100、52∶100、53∶100、54∶100、55∶100、56∶100、57∶100、58∶100、59∶100、3∶5、61∶100、62∶100、63∶100、64∶100、65∶100、66∶100、67∶100、68∶100、69∶100、7∶10、71∶100、72∶100、73∶100、74∶100、75∶100、76∶100、77∶100、78∶100、79∶100、4∶5、81∶100、82∶100、83∶100、84∶100、85∶100、86∶100、87∶100、88∶100、89∶100、9∶10、91∶100、92∶100、93∶100、94∶100、95∶100、96∶100、97∶100、98∶100、99∶100或1∶1。
在另一方面，本文公开了形成工程肉的方法，其包括：制备包含多个活的非人肌细胞的多个大致球形的多细胞体，其中所述细胞彼此粘附和/或粘着；将不止一个大致球形的多细胞体相邻地铺放在支承基底上；允许所述大致球形的多细胞体融合以形成层；将不止一个层相邻地铺放在第一层上；允许层融合以形成一定体积的工程肉；以及任选地，冷冻所述肉；前提条件是工程肉为可食用的并且用于摄取。在一些实施方案中，本文公开了形成工程肉的方法，其包括：制备包含多个非人肌细胞的多个大致球形的多细胞体，其中所述细胞彼此粘附和/或粘着；将不止一个大致球形的多细胞体相邻地铺放在支承基底上；融合所述大致球形的多细胞体以形成层；将不止一个层相邻地铺放在第一层上；以及融合所述层以形成一定体积的工程肉；前提条件是工程肉为可食用的。在一些实施方案中，本文所提供的方法进一步包括冷冻所述肉。
在一些实施方案中，本文所公开的形成工程肉的方法包括制备包含多个活的非人肌细胞的多个多细胞体，其中所述细胞彼此粘附和/或粘着，其中多细胞体进一步包含活的非人脂肪细胞和/或内皮细胞。在一些实施方案中，所述多细胞体进一步包含活的非人成纤维细胞。在一些实施方案中，本文所公开的形成工程肉的方法包括将不止一个多细胞体相邻地铺放在支承基底上，其中多细胞体被水平相邻和/或竖直相邻地铺放。在一些实施方案中，本文所公开的形成工程肉的方法包括将不止一个层相邻地铺放在支承基底上，其中层被水平相邻和/或竖直相邻铺放。在一些实施方案中，支承基底可透过流体和营养物，并且允许细胞培养基接触所述多细胞体和/或层的所有表面。在一些实施方案中，本文所公开的形成工程肉的方法包括允许多细胞体融合以形成层，其中多细胞体在细胞培养环境中融合以形成层。在一些实施方案中，所述多细胞体的融合发生在约2小时至约36小时的时间内。在一些实施方案中，所述方法包括允许层融合以形成工程肉，其中层在细胞培养环境中融合以形成工程肉。在一些实施方案中，所述层的融合发生在约2小时至约36小时的时间内。在一些实施方案中，非人肌细胞和非人内皮细胞的细长多细胞体具有不同的长度。在各种实施方案中，细长多细胞体的长度为约1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm。在各种实施方案中，细长多细胞体的长度为约1cm、2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、9cm或10cm。在一些实施方案中，细长多细胞体具有在约1mm至约10cm范围内的长度。在另外的实施方案中，细长多细胞体具有在约1cm至约8cm范围内的长度。在另外的实施方案中，细长多细胞体具有在约2cm至约6cm范围内的长度。在一些实施方案中，本文所公开的形成工程肉的方法包括将不止一个层相邻地铺放在支承基底上并且允许层融合以形成工程肉。在各种实施方案中，所述肉包括约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个层。在一些实施方案中，所述肉包括约10至约100个层。在另外的实施方案中，所述肉包括约20至约80个层。在另外的实施方案中，所述肉包括约40至约60个层。在一些实施方案中，本文所公开的形成工程肉的方法包括制备包含多个活的非人肌细胞的多个多细胞体，其中所述细胞彼此粘附和/或粘着，其中多细胞体具有适配成允许扩散以足以支持培养的非人肌细胞和非人内皮细胞的维持和生长的直径。在各种实施方案中，所述多细胞体的直径为约100μm、200μm、300μm、400μm或500μm。在一些实施方案中，所述多细胞体的直径为约100μm至约500μm。在另外的实施方案中，所述多细胞体的直径为约200μm至约400μm。在一些实施方案中，直径适用于带有大致棒状或球形形状的多细胞体。在一些实施方案中，本文所公开的形成工程肉的方法包括制备包含多个活的非人肌细胞的多个多细胞体，其中所述细胞彼此粘附和/或粘着，其中多细胞体被生物打印。
附图简述
图1描绘了多细胞体的非限制性实例；在此情况下，多细胞体1具有大约等于高度H1的宽度W1和明显大于宽度W1或高度H1的长度L1。
图2描绘了大致球形的多细胞体的非限制性实例；在此情况下，大致球形的多细胞体2具有大约等于高度H1的宽度W1。
图3描绘了多细胞体的非限制性实例；在此情况下，多细胞体1在支承基底3上。
图4描绘了大致球形的多细胞体的非限制性实例；在此情况下，大致球形的多细胞体2在支承基底3上。
图5描绘了制备图1至4中图示的多细胞体的一种方法的非限制性实例；在此情况下，所述方法包括将混合的细胞沉淀物4转移到毛细管5中。
图6描绘了多个多细胞体的非限制性实例；在此情况下，多个多细胞体1相邻地铺放在支承基底3上以使得它们允许融合。
图7描绘了多个大致球形的多细胞体的非限制性实例；在此情况下，多个大致球形的多细胞体2相邻地铺放在支承基底3上以使得它们融合。
图8描绘了制备包含多个多细胞体的层的一种方法的非限制性实例；在此情况下，所述方法包括从包括毛细管5的压力操作的机械挤出机将多细胞体6挤出到支承基底3上。
图9描绘了制备工程肉的一种方法的非限制性实例；在此情况下，所述方法包括将包含多个多细胞体7、8的不止一个层相邻地铺放在支承基底3上。
图10描绘了制备工程肉的一种方法的非限制性实例；在此情况下，所述方法包括将包含多个多细胞体9和多个大致球形的多细胞体10的不止一个层相邻地铺放在支承基底3上。
图11描绘了制备工程肉的一种方法的非限制性实例；在此情况下，所述方法包括堆叠不止一个层，其中第一层随后的层相对于下面的层旋转90度。
发明详述
使用传统材料和方法制备的组织工程产品在尺寸上受限制，因为气体和营养物可以短距离扩散以给内部细胞提供营养。同样，现有技术不能提供大量生产工程产品的合适速度和通量。因此，用来生产肉产品的现有组织工程方法在商业不可行的规模上产生无吸引力的薄片和糊剂。
因此，本文所公开的可食用的肉产品、层、多细胞体以及其制备的方法的目的是为了提供商业上可行的和有吸引力的肉产品。另一个目的是为了提供可靠、准确以及再生产规模高达至商业水平的高通量方法。本文所公开的可食用的肉产品、层、多细胞体以及其制备方法的优点包括但不限于以再生产、高通量和容易规模化的方式同时对图案形成保持精确控制来生产定制的组织，具体是在多细胞类型的情况下，其可以产生具有吸引力风味、质地、厚度以及外观的工程肉产品。
在各种实施方案中，本文公开了包括多个层的工程肉，其中每个层包含非人肌细胞，其中工程肉为可食用的并且用于摄取。在各种实施方案中，本文还公开了包含多个活的非人肌细胞的多个多细胞体，其中所述细胞彼此粘附和/或粘着；其中多细胞体被相邻布置在支承基底上以形成用于形成可食用工程肉的基本上平坦的层。
在各种实施方案中，本文还公开了包含多个活的非人肌细胞的多个多细胞体，其中所述细胞彼此粘附和/或粘着；其中多细胞体被相邻布置在支承基底上并且维持培养以允许多细胞体融合以形成用于形成可食用工程肉的基本上平坦的层。
在各种实施方案中，本文还公开了包含多个活的非人肌细胞的多个多细胞体，其中所述细胞彼此粘附和/或粘着；其中多细胞体被相邻布置在支承基底上并且维持培养以允许多细胞体融合以形成用于形成可食用工程肉的基本上平坦的层；其中支承基底可透过流体和营养物并且允许细胞培养基接触所述层的所有表面。
在各种实施方案中，本文还公开了形成工程肉的方法，其包括：a)制备包含多个活的非人肌细胞的多个多细胞体，其中所述细胞彼此粘附和/或粘着；b)将不止一个多细胞体相邻地铺放在支承基底上；c)允许所述多细胞体融合以形成层；d)将不止一个层相邻堆叠在彼此之上；e)允许所述层融合以形成工程肉；以及f)任选地，冷冻所述肉；前提条件是工程肉为可食用的并且用于摄取。在各种实施方案中，本文还公开了形成工程肉的方法，其包括：a)制备包含多个非人肌细胞的多个多细胞体，其中所述细胞彼此粘附和/或粘着；b)将不止一个多细胞体相邻地铺放在支承基底上；c)融合所述多细胞体以形成层；d)将不止一个层相邻地铺放在第一层上；以及e)融合所述层以形成工程肉；其中工程肉为可食用的。在一些实施方案中，所述方法进一步包括冷冻所述肉。
在各种实施方案中，本文还公开了形成工程肉的方法，其包括：a)制备包含多个活的非人肌细胞的多个细长多细胞体和/或多个大致球形的多细胞体，其中所述细胞彼此粘附和/或粘着；b)将不止一个细长多细胞体和不止一个大致球形的多细胞体相邻地铺放在支承基底上；c)允许所述多细胞体融合以形成层；d)在支承基底上，将不止一个层相邻堆叠在彼此之上；e)允许所述层融合以形成工程肉；以及f)任选地，冷冻所述肉；前提条件是工程肉为可食用的并且用于摄取。在各种实施方案中，本文还公开了形成工程肉的方法，其包括：a)制备包含多个非人肌细胞的多个细长多细胞体和/或多个大致球形的多细胞体，其中所述细胞彼此粘附和/或粘着；b)将不止一个细长多细胞体和不止一个大致球形的多细胞体相邻地铺放在支承基底上；c)融合所述多细胞体以形成层；d)在支承基底上，将不止一个层相邻堆叠在彼此之上；以及e)融合所述层以形成一定体积的工程肉；前提条件是工程肉为可食用的。在一些实施方案中，所述方法包括以不同比率将不止一个细长多细胞体和不止一个大致球形的多细胞体相邻地铺放在支承基底上。在一些实施方案中，所述方法进一步包括冷冻所述肉。
在各种实施方案中，本文还公开了形成工程肉的方法，其包括：a)制备包含多个活的非人肌细胞的多个大致球形的多细胞体，其中所述细胞彼此粘附和/或粘着；b)将不止一个大致球形的多细胞体相邻地铺放在支承基底上；c)允许所述大致球形的多细胞体融合以形成层；d)在支承基底上，将不止一个层相邻堆叠在彼此之上；e)允许所述层融合以形成工程肉；以及f)任选地，冷冻所述肉；前提条件是工程肉为可食用的并且用于摄取。在各种实施方案中，本文还公开了形成工程肉的方法，其包括：a)制备包含多个非人肌细胞的多个大致球形的多细胞体，其中所述细胞彼此粘附和/或粘着；b)将不止一个大致球形的多细胞体相邻地铺放在支承基底上；c)融合所述大致球形的多细胞体以形成层；d)在支承基底上，将不止一个层相邻堆叠在彼此之上；以及e)融合所述层以形成工程肉；前提条件是工程肉为可食用的并且用于摄取。在一些实施方案中，所述方法进一步包括冷冻所述肉。
经典组织工程的基本思路是将活细胞种到生物相容和最终生物可降解的支架中，然后在生物反应器中培养体系以使得初始细胞群可以扩增为组织。经典组织工程具有若干个缺点，尤其当应用于肉产品的生产时。第一，种细胞的过程通常涉及使细胞的溶液与支架接触，这样使得细胞被捕获在支架的孔隙、纤维或其它微结构内。对于将细胞放置在支架内和相对于彼此放置细胞而言，此过程基本上是随机的。因此，被栽种的支架并不立即对三维构建体的产生有用，所述三维构建体展现出计划的或预定放置或细胞或细胞聚集体的图案。第二，为给定细胞类型选择理想的生物材料支架是有问题的并且常常通过试错法来完成。即使正确的生物材料是可获得的，支架也可干扰实现高细胞密度。此外，基于支架的组织工程不能简单地或可靠地规模放大至工业水平。
在一些实施方案中，工程肉产品、层以及多细胞体通过利用基于三维自动计算机辅助沉积多细胞体(例如，圆柱体和球体)的快速成型技术的方法和通过三维递送设备(例如，生物打印机)产生的生物相容支承结构(例如，由琼脂糖组成)来制备。术语“工程的”当用来指本文所描述的层和肉产品时，通常意指人造的或被布置的。工程肉的一个实例可以包括通过根据计算机脚本的计算机辅助设备(例如，生物打印机)来布置或放置多细胞体和/或层以形成工程肉产品。在另外的实施方案中，计算机脚本是例如一个或多个计算机程序、计算机应用或计算机模块。在另外的实施方案中，通过类似于早期形态形成中的自组装现象的多细胞体的打印后融合，三维组织结构形成。
与其它工程组织不同，本文所描述的工程肉如果通过堆叠层形成，则其具有至少部分融合的多细胞体的二维平坦薄片。因此，本文描述的用于形成即使大体积的工程肉的方法可以不要求同时的三维图案化，但可以通过培养(平行)可以后来被组装到三维组件或然后可以堆叠在一起的子组件中的多个二维层来进行。形成本文所描述的工程肉的这种有利方法可以容许形成所述体积的工程肉，而不要求对支架或三维支承结构如填充物本体的需要。另外，可以在相对薄的厚度下平行形成二维层，所述相对薄的厚度允许营养物在培养过程中(例如，当组分多细胞体融合到层中时)从培养基扩散到平坦层中。仅在堆叠组分层以形成体积之后，营养物的扩散可以是限制的，从而造成细胞死亡。
因此，当许多方法可以用来将多细胞体布置在支承基底上以产生三维结构(包括手动放置，包括通过自动计算机辅助机器如生物打印机来设置)时，此类方法可以是有用的但并不被要求。用生物打印机技术递送多细胞体的优点包括快速、准确和可再生放置多细胞体以产生展现出各种组成的多细胞体和/或层的计划的或预定取向或图案的构建体。优点还包括确保的高细胞密度，而使细胞损伤最小化常常与其它集中在与水凝胶组合打印细胞的基于实体自由形状制备的沉积方法相关。
本文所公开的实施方案包括制备或制得工程肉的方法，并且还可以包括商业方法。在一些实施方案中，利用了本文所公开的技术和方法的速度和可规模化来设计、构造以及操作用于生产可食用的、工程肉产品的工业和/或商业的设施。在另外的实施方案中，工程肉产品被生产、包装、冷冻、储存、分发、销售、广告以及出售为例如用于人的食品、用于人的食品的组分或成分、用于非人动物的食品、或用于非人动物的食品的组分或成分。
细胞
许多自粘附细胞类型可用于形成本文所描述的多细胞体、层以及工程肉产品。在一些实施方案中，工程肉产品被设计为类似传统肉产品，并且选择细胞类型以接近在传统肉产品中发现的那些。在另外的实施方案中，工程肉产品、层以及多细胞体包括非人肌细胞。在另外的实施方案中，工程肉产品、层以及多细胞体包括非人肌细胞、和/或内皮细胞、和/或脂肪细胞、和/或成纤维细胞。
通常，本文所描述的工程肉可以通过缺乏血管并且还缺乏神经切除与天然的肉和其它工程肉不同。即使在其中内皮细胞被包括作为一个或多个多细胞体的组分的变化中，工程肉也将不包括能够传送血液的血管。因此，通过本文所描述的方法形成的即使大体积的工程肉也可以不具有任何血管。另外，本文所描述的工程肉可以缺乏任何神经组分(例如，轴突、树突、神经细胞体)，如它们可以生长而不具有此类组分。
人类传统上食用若干类型的动物肌肉组织。因此，在一些实施方案中，肌细胞是骨骼肌细胞。在一些实施方案中，肌细胞是心肌细胞。在一些实施方案中，肌细胞是平滑肌细胞。在一些实施方案中，内皮细胞是微血管内皮细胞。
在其它实施方案中，工程肉产品包括神经细胞、结缔组织(包括骨、软骨、分化为骨形成细胞和软骨细胞的细胞、以及淋巴组织)、上皮细胞(包括形成腔和血管或通道中的内层的内皮细胞、外分泌腺分泌上皮细胞、上皮吸收细胞、角质化上皮细胞以及细胞外基质分泌细胞)以及未分化的细胞(如胚胎细胞、干细胞以及其它前体细胞)等等。
在一些实施方案中，用来形成多细胞体的细胞从活动物获得并且培养作为原代细胞系。例如，在另外的实施方案中，通过活体组织检查和离体培养来获得细胞。在其它实施方案中，细胞从商业来源获得。
本文所公开的工程肉产品和包含多个用于生产所述肉的多细胞体的层是可食用的，并且用于人、非人动物或两者耗用。在一些实施方案中，工程肉产品是人食品。在其它实施方案中，工程肉产品是动物饲料，如用于家畜的饲料、用于水产养殖的饲料或用于家庭宠物的饲料。因此，鉴于本文提供的公开内容，本领域普通技术人员将认识到来自过多来源的非人细胞适合用于生产此类产品并且连同本文所公开的方法一起。在各种实施方案中，多细胞体、包含多细胞体的层以及工程肉产品包含源自(作为非限制性实例)哺乳动物、鸟、爬行动物、鱼、甲壳动物、软体动物、头足动物、昆虫、非节肢动物的无脊椎动物以及其组合的非人细胞。
在一些实施方案中，适合的细胞源自哺乳动物，如羚羊、熊、海狸、野牛、野猪、骆驼、驯鹿、牛、鹿、大象、麋鹿、狐狸、长颈鹿、山羊、野兔、马、野山羊、袋鼠、狮子、大羊驼、驼鹿、美洲野猪、猪、兔、海豹、绵羊、松鼠、老虎、鲸鱼、牦牛以及斑马或其组合。在一些实施方案中，适合的细胞源自鸟类，如鸡、鸭、鸸鹋、鹅、松鸡、鸵鸟、野鸡、鸽子、鹌鹑以及火鸡或其组合。在一些实施方案中，适合的细胞源自爬行动物，如龟、蛇、鳄鱼以及短嘴鳄或其组合。在一些实施方案中，适合的细胞源自鱼，如凤尾鱼、鲈鱼、鲶鱼、鲤鱼、鳕鱼、鳗鱼、比目鱼、河豚、石斑鱼、黑线鳕、大比目鱼、鲱鱼、鲭鱼、蜞鳅、枪鱼、橙连鳍鲑、鲈鱼、河鲈鱼、梭子鱼、狭鳕鱼、鲑鱼、沙丁鱼、鲨鱼、鲷鱼、鲽鱼、剑鱼、罗非鱼、鳟鱼、金枪鱼以及梭鲈鱼或其组合。在一些实施方案中，适合的细胞源自甲壳动物，如螃蟹、小龙虾、龙虾、对虾以及小虾或其组合。在一些实施方案中，适合的细胞源自软体动物，如鲍鱼、蛤蜊、海螺、蚌、牡蛎、扇贝以及蜗牛或其组合。在一些实施方案中，适合的细胞源自头足动物，如乌贼、章鱼以及鱿鱼或其组合。在一些实施方案中，适合的细胞源自昆虫，如蚂蚁、蜜蜂、甲壳虫、蝴蝶、蟑螂、蟋蟀、豆娘蜓、蜻蜓、蠼螋、跳蚤、苍蝇、蚱蜢、蟑螂、蜉蝣、飞蛾、蠹虫、白蚁、黄蜂或其组合。在一些实施方案中，适合的细胞源自非节肢动物的无脊椎动物(例如，蠕虫)，如扁形虫、绦虫、吸虫、线虫、蛔虫、钩虫、环节蠕虫(例如，蚯蚓、毛足虫等)或其组合。
多细胞体
本文公开了包括多个活的非人细胞的多细胞体，其中所述细胞彼此粘附和/或粘着。本文还公开了方法，所述方法包括：制备包含多个活的非人肌细胞的多个多细胞体，其中所述细胞彼此粘附和/或粘着；将不止一个多细胞体相邻地铺放在支承基底上；以及允许多细胞体融合以形成用于形成工程肉的基本上平坦的层。在一些实施方案中，所述多细胞体包含多个以所需的三维形状粘附和/或粘着在一起的细胞，这些细胞具有粘弹一致性和足够的完整性以易于生物工程过程如组织工程的过程期间的操纵和处理。在一些实施方案中，足够的完整性意指随后处理过程中的多细胞体能够保持其物理形状并且维持细胞的生命力，所述多细胞体不是坚硬的但具有粘弹一致性。
在一些实施方案中，所述多细胞体为同型细胞。在其它实施方案中，所述多细胞体为异型细胞。在同型细胞的多细胞体中，多个活细胞包括多个单一细胞类型的活细胞。同型细胞的多细胞体中的基本上所有的活细胞为基本上单一细胞类型的细胞。相比之下，异型细胞的多细胞体包括多于一种细胞类型的相当数目的细胞。异型细胞本体中的活细胞可以保持未分选或可以在融合过程期间“分选出”(例如，自组装)以形成用于工程组织的具体内部结构。细胞的分选与差别粘附假设(DAH)的预测一致。DAH解释了依据通过组分细胞之间的粘附和粘着相互作用而产生的组织表面张力和界面张力的细胞群的液体样行为。通常，细胞可以基于细胞的粘附强度的差异分选。例如，分选至异型细胞的多细胞体的内部的细胞类型通常具有比分选至多细胞体的外部的细胞更强的粘附强度(且因此具有更高的表面张力)。
在一些实施方案中，本文所公开的多细胞体还包括除了多个细胞之外的一种或多种细胞外基质(ECM)组分或一种或多种ECM组分的一种或多种衍生物。例如，多细胞体可以包含(作为非限制性实例)各种ECM蛋白，包括明胶、纤维蛋白原、纤维蛋白、胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白以及蛋白聚糖。ECM组分或ECM组分的衍生物可以被添加至用来形成多细胞体的细胞糊剂。添加至细胞糊剂的ECM组分或ECM组分的衍生物可以从动物来源纯化，或通过本领域中已知的重组方法产生。或者，ECM组分或ECM组分的衍生物可以由多细胞体中的细胞天然分泌。
在一些实施方案中，所述多细胞体包括组织培养基。在另外的实施方案中，组织培养基可以是任何生理学上可相容的基质，并且将通常根据本领域中已知的所涉及的(多种)细胞类型而选择。在一些情况下，适合的组织培养基包含例如基本营养物，如糖和氨基酸、生长因子、抗生素(以使污染最小化)等。
多细胞体中的细胞的粘附和/或粘着适合地为足够强以允许多细胞体保持三维形状同时将其自身支承在平面上。例如，在一些情况下，将其自身支承在扁平基底上的多细胞体可以展现出一些微小的变形(例如，其中多细胞体接触表面)，然而，多细胞体足够粘着以保持其宽度的至少一半、并且在一些情况下约等于宽度的高度。在一些实施方案中，相对于彼此在扁平的基底上并排接合放置的两个或更多个多细胞体在其侧面之下和工作表面之上形成空隙空间。参见，例如图3和图4。在另外的实施方案中，当多细胞体被组装在其中多细胞体堆叠在另一个顶上的构建体中时，多细胞体中的细胞的粘着是足够强以允许多细胞体支承至少一个类似尺寸和形状的多细胞体的重量。参见，例如图9和图10。在另外的实施方案中，所述多细胞体中的细胞的粘附和/或粘着还适合地为足够强以允许多细胞体被器具(例如，毛细微量吸管)拾起。
鉴于本文所提供的公开内容，本领域普通技术人员将认识到具有不同尺寸和形状的多细胞体处于本文所提供的实施方案的范围内。在一些实施方案中，所述多细胞体为大致圆柱形并且具有大致圆形的截面。例如，在各种实施方案中，所述多细胞体具有带正方形、矩形、三角形或其它非圆形截面形状的细长形状(例如，圆柱形形状)。同样，在各种实施方案中，所述多细胞体具有通常球形的形状、非细长圆柱形形状或立方形形状。
在各种实施方案中，所述多细胞体的直径为约50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm、1000μm或其中可量化的增量。在一些实施方案中，所述多细胞体被构造为限制由氧气和/或营养物不能够扩散到多细胞体的中心部分中而引起的细胞坏死。例如，多细胞体被适当构造以使得其中没有活细胞距距离多细胞体的外表面大于约250μm，并且更适合地因此其中没有活细胞距离多细胞体的外部大于约200μm。
在一些实施方案中，所述多细胞体具有不同的长度。在其它实施方案中，所述多细胞体具有基本上类似的长度。在各种实施方案中，所述多细胞体的长度为约0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm、4.5mm、5.0mm、5.5mm、6.0mm、6.5mm、7.0mm、7.5mm、8.0mm、8.5mm、9.0mm、9.5mm或10mm或其中可量化的增量。在其它各种实施方案中，所述多细胞体的长度为约1.0cm、1.5cm、2.0cm、2.5cm、3.0cm、3.5cm、4.0cm、4.5cm、5.0cm、5.5cm、6.0cm、6.5cm、7.0cm、7.5cm、8.0cm、8.5cm、9.0cm、9.5cm或10cm或其中可量化的增量。在一些实施方案中，选择多细胞体的长度以产生接近传统肉产品(例如，一条熏肉、汉堡肉饼、鱼片、鸡胸肉或牛排)的形状和/或尺寸的工程肉产品的形状和/或尺寸。
参考图1，在一些实施方案中，所述多细胞体1为大致圆柱形并且具有大致圆形的截面，其中宽度W1粗略等于高度H1。在另外的实施方案中，所述多细胞体1为细长，其中长度为L1。在另外的实施方案中，W1和H1适合地为约300μm至约600μm，并且L1适合地为约2cm至约6cm。
参考图2，在一些实施方案中，所述多细胞体2为大致球形，其中宽度W1粗略等于高度H1。在另外的实施方案中，W1和H1适合地为约300μm至约600μm。
层
本文所公开的工程肉包括多个层。在一些实施方案中，所述层包含多个多细胞体，所述多细胞体包含多个活的非人细胞，其中所述细胞彼此粘附和/或粘着。本文还公开了包括以下步骤的方法：将多细胞体相邻地铺放在支承基底上和允许多细胞体融合以形成用于形成可食用工程肉产品的基本上平坦的层。在一些实施方案中，使用本文描述的技术生物打印每个层。
在一些实施方案中，所述层包含同型细胞的多细胞体。在其它实施方案中，所述层包含异型细胞的多细胞体。在又其它实施方案中，所述层包含同型细胞的多细胞体和异型细胞的多细胞体两者。在另外的实施方案中，所述层包含非人肌细胞。在另外的实施方案中，所述层包含非人肌细胞、非人内皮细胞以及脂肪细胞和/或成纤维细胞。在另外的实施方案中，所述层包含非人肌细胞、非人内皮细胞以及本文公开的其它细胞类型。
在包括非人肌细胞和非人内皮细胞两者的实施方案中，所述层可包含比率为约30∶1、29∶1、28∶1、27∶1、26∶1、25∶1、24∶1、23∶1、22∶1、21∶1、20∶1、19∶1、18∶1、17∶1、16∶1、15∶1、14∶1、13∶1、12∶1、11∶1、10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1以及1∶1或其中增量的的非人肌细胞和非人内皮细胞。在一些实施方案中，所述层包含比率为约19∶1至约3∶1的的非人肌细胞非人内皮细胞。在各种实施方案中，所述层包含非人内皮细胞，所述非人内皮细胞构成总细胞群的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％以及25％或其中的增量。在一些实施方案中，所述层包含非人内皮细胞，所述非人内皮细胞构成总细胞群的约5％至约15％。在另外的实施方案中，内皮细胞的存在促成本文进一步描述的内皮化。
在各种实施方案中，每个层的厚度为约10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm、1000μm、2000μm、3000μm、4000μm或5000μm或其中可量化的增量。在一些实施方案中，选择每个层的厚度以允许扩散以足够支持培养的层中的基本上所有细胞的维持和生长。
在各种实施方案中，多个层包含约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450或500个层或其中增量。在一些实施方案中，选择层的数目以产生具有接近传统肉产品(例如，一条熏肉、汉堡肉饼、鱼片、鸡胸肉或牛排)的厚度的工程肉产品。
在一些实施方案中，工程层被设计为类似传统肉产品，并且选择设计参数(例如，细胞类型、添加剂、尺寸、形状等)以接近在传统肉产品中发现的那些。在另外的实施方案中，所述层的特征在于基本上类似于传统肉产品的营养组成。在另外的实施方案中，所述层的特征在于大致60％至80％水性流体、14％至35％蛋白质、1％至25％脂肪、1％至5％碳水化合物以及1％至5％其它物质的营养组成。在一些实施方案中，工程层或内皮化肉的肌细胞被对齐。在一些实施方案中，通过施加本领域中已知的电场来使肌细胞对齐。在一些实施方案中，通过施加本领域中已知的机械刺激如循环性拉伸和松弛底层来使肌细胞对齐。在另外的实施方案中，如在许多动物肌肉组织中所发现，对齐的(例如，电取向和机械取向的)肌细胞基本上具有关于彼此相同的取向。在一些实施方案中，本文提供的多细胞体的层被暴露于电和/或机械刺激，以促进肌肉细胞的生理学布置的形成。
添加剂
在一些实施方案中，工程肉产品、工程层和/或多细胞体包括一种或多种营养补充剂。在另外的实施方案中，一种或多种营养补充剂选自：维生素、矿物质、纤维、脂肪酸以及氨基酸。在一些实施方案中，工程肉产品、层和/或多细胞体包括一种或多种添加剂以增强商业吸引力(例如，外观、口味、颜色、气味等)。在另外的实施方案中，工程肉产品、层和/或多细胞体包括一种或多种调味剂、一种或多种着色剂和/或一种或多种增味剂。
在一些实施方案中，工程肉产品、工程层和/或多细胞体包括以下的一种或多种：基质蛋白、蛋白聚糖、抗氧化剂、全氟化碳以及生长因子。本文所使用的术语“生长因子”指蛋白质、多肽或多肽的复合体，包括由细胞产生的细胞因子，并且所述生长因子可以影响其自身和/或各种其它邻近或远距离的细胞。通常生长因子发展地或响应于许多生理刺激或环境刺激而影响特定类型的细胞的生长和/或分化。一些(但不是所有)生长因子为激素。示例性生长因子为胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)(包括碱性FGF(bFGF))、血小板来源的生长因子(PDGF)(包括PDGF-AA和PDGF-AB)、肝细胞生长因子(HGF)、α转化生长因子(TGF-α)、β转化生长因子(TGF-β)(包括TGFβ1和TGFβ3)、表皮生长因子(EGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-8以及类似物质。
在一些实施方案中，工程肉产品、工程层和/或多细胞体包括一种或多种本领域已知的食品防腐剂。在一些实施方案中，防腐剂是(作为非限制性实例)抗微生物防腐剂，包括丙酸钙、硝酸钠、亚硝酸钠、亚硫酸盐(例如，二氧化硫、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾等)以及乙二胺四乙酸二钠(EDTA)。在一些实施方案中，防腐剂是(作为非限制性实例)抗氧化防腐剂，包括丁羟茴醚(BHA)和丁羟甲苯(BHT)。
支承基底
在一些实施方案中，本文公开了被相邻布置在支承基底上的多个多细胞体，以形成用于形成可食用工程肉的基本上平坦的层。在一些实施方案中，本文还公开了方法，所述方法包括：将多细胞体相邻布置在支承基底上以形成基本上平坦的层，将不止一个层相邻地铺放在单个支承基底上以及允许层融合以形成工程肉。例如，多个层可以如上所述同时在不同基底上形成，然后当多细胞体已融合足以允许它们移除和在另一个层顶上或单个基底顶上堆叠时从它们的基底上移除。
通常，每个层包含非人肌细胞。此类构建体的中心部分中的细胞通常通过扩散被供应氧气和营养物；然而气体和营养物通常扩散大约200至300微米进入三维细胞构建体。
在一些实施方案中，本文所公开的多细胞体具有适配成允许扩散以足以支持培养的所述非人肌细胞的维持和生长的直径。因此，在另外的实施方案中，本文所公开的层具有适配成允许扩散以足以支持培养的所述非人肌细胞的维持和生长的厚度。
为了促进和增强扩散，在一些实施方案中，支承基底可透过流体、气体以及营养物，并且在例如生长、成熟以及融合过程中允许细胞培养基接触多细胞体和/或层的所有表面。在各种实施方案中，支承基底由天然生物材料、合成生物材料以及其组合制成。在一些实施方案中，天然生物材料包括(作为非限制性实例)胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白以及其它细胞外基质。在一些实施方案中，合成生物材料可以包括(作为非限制性实例)羟基磷灰石、藻酸盐、琼脂糖、聚乙醇酸、聚乳酸以及它们的共聚物。在一些实施方案中，支承基底是固体。在一些实施方案中，支承基底是半固体。在另外的实施方案中，支承基底是固体和半固体支承元件的组合。
在一些实施方案中，支承基底被抬高或升高在非渗透表面之上，如细胞培养环境(例如，陪替氏培养皿、细胞培养瓶等)或生物反应器的一部分。在另外的实施方案中，升高的支承基底进一步促进细胞培养基的循环并且增强与多细胞体和/或层的所有表面接触。
形成多细胞体的方法
存在各种方法来制备具有本文所描述的特征的多细胞体。在一些实施方案中，所述多细胞体可以由含有多个活细胞或具有所需的细胞密度和粘度的细胞糊剂制成。在另外的实施方案中，细胞糊剂可以被成形为所需的形状，并且通过成熟(例如，孵育)形成多细胞体。在具体的实施方案中，通过使包括多个活细胞的细胞糊剂成形为所需的形状(例如，圆柱体、球体)来产生多细胞体。在另外的实施方案中，将细胞糊剂孵育在受控制的环境中以允许细胞彼此粘附和/或粘着以形成多细胞体。在另一个具体的实施方案中，通过在保持细胞糊剂处于三维形状的设备中使包括多个活细胞的细胞糊剂成形来产生多细胞体。在另外的实施方案中，将细胞糊剂孵育在受控制的环境中同时保持它处于三维形状持续足够的时间，以产生如本文所描述的足够粘着以将其自身支承在平面上的本体。
在各种实施方案中，细胞糊剂通过以下而提供：(A)混合细胞或细胞集合体(具有一种或多种细胞类型)和细胞培养基(例如，以预定比率)以产生细胞悬液，和(B)压实细胞悬液以产生具有所需的细胞密度和粘度的细胞糊剂。在各种实施方案中，通过许多方法来实现压实，如通过浓缩由细胞培养物产生的具体细胞悬液以达到所所需的细胞浓度(密度)、粘度以及细胞糊剂要求的稠度。在具体的实施方案中，来自细胞培养物的相对稀释的细胞悬液被离心确定的时间，以达到允许在模具中成形的沉淀物中的细胞浓度。切向流过滤(“TFF”)是浓缩或压实细胞的另一种适合的方法。在一些实施方案中，化合物与细胞悬液组合以给予所要求的挤出性质。适合的化合物包括(作为非限制性实例)胶原、水凝胶、基质胶、纳米纤维、自组装纳米纤维、明胶、纤维蛋白源等。
在一些实施方案中，通过使多个活细胞与组织培养基混合并且压实活细胞(例如，通过离心)来产生细胞糊剂。通过将细胞沉淀物重悬在含有一种或多种ECM组分(或一种或多种ECM组分的一种或多种衍生物)的一种或多种生理上可接受的缓冲液中而任选包括一种或多种ECM组分(或ECM组分的衍生物)，并且再次离心所得细胞悬液以形成细胞糊剂。
在一些实施方案中，希望用于进一步加工的细胞糊剂的细胞密度可以随着细胞类型而改变。在另外的实施方案中，细胞之间的相互作用决定了细胞糊剂的性质，并且不同的细胞类型将具有不同的细胞密度与细胞-细胞相互作用之间的关系。在另外的实施方案中，可以预处理细胞以在使细胞糊剂成形之前增加细胞相互作用。例如，可以在离心之后在离心管内孵育细胞，以在使细胞糊剂成形前增强细胞-细胞相互作用。
在各种实施方案中，许多方法被用来使细胞糊剂成形。例如，在具体实施方案中，手动模塑或按压细胞糊剂(例如，在浓缩/压实之后)以实现所需的形状。作为另外的实例，细胞糊剂可以被接纳(例如，吸入)到预形成的仪器如微量吸管(例如，毛细吸管)中，所述预形成的仪器使细胞糊剂成形以符合仪器的内表面。微量吸管(例如，毛细吸管)的截面形状可选地为圆形、正方形、矩形、三角形或其它非圆形的截面形状。在一些实施方案中，通过将它沉积到预形成的模具如塑料模具、金属模具或凝胶模具中而使细胞糊剂成形。在一些实施方案中，离心铸造或连续铸造被用来使细胞糊剂成形。
参考图5，在具体的实例中，成形包括将细胞糊剂4保持在成形设备5(例如，毛细吸管)中，以允许细胞在成形设备中彼此部分粘附和/或粘着。作为另外的实例，可以将细胞糊剂吸入到成形设备中并且容纳在成形设备中持续成熟期(本文又称为孵育期)，以允许细胞彼此至少部分粘附和/或粘着。在一些实施方案中，成形设备(例如，毛细吸管)是生物打印机的打印头的部分或可操作以自动将多细胞体放置在三维构建体中的类似装置。然而，存在对细胞可以保留在成形设备如毛细吸管中的时间量的限制，所述限制在细胞的成活力被影响之前仅提供细胞至多受限的取用氧气和/或营养物。
在一些实施方案中，部分粘附和/或粘着的细胞糊剂从成形设备(例如，毛细吸管)转移至允许营养物和/或氧气供应至细胞的第二成形设备(例如，模具)，同时所述细胞被保留在第二成形设备持续额外的成熟期。允许用营养物和氧气供应细胞的适合的成形设备的一个实例是用于产生多个多细胞体(例如，基本上相同的多细胞体)的模具。作为另外的实例，此类模具包括生物相容的基底，所述基底由抵抗细胞迁移和向内生长到基底中和抵抗细胞粘附至基底的材料制成。在各种实施方案中，基底可以适合地由、(PTFE)、不锈钢、琼脂糖、聚乙二醇、玻璃、金属、塑料或凝胶材料(例如，琼脂糖凝胶或其它水凝胶)以及类似的材料制成。在一些实施方案中，模具还适合地被配置成允许将组织培养基供应至细胞糊剂(例如，通过使组织培养基分散到模具的顶部)。
在具体的实施方案中，在基底中形成多个细长凹槽。在另外的具体实施方案中，每个凹槽的深度在约500微米至约1000微米的范围内，并且每个凹槽的底部具有用于形成细长圆柱形多细胞体的半圆形截面形状，所述细长圆柱形多细胞体具有大致圆形的截面形状。在另外的具体实施方案中，凹槽的宽度适合地略微大于在模具中待产生的多细胞体的宽度。例如，凹槽的宽度适合地处于约300微米至约1000微米的范围内。
因此，在其中使用了第二成形设备的实施方案中，部分粘附和/或粘着的细胞糊剂从第一成形设备(例如，毛细吸管)转移至第二成形设备(例如，模具)。在另外的实施方案中，部分粘附和/或粘着的细胞糊剂可以通过第一成形设备(例如，毛细吸管)转移到模具的凹槽中。在另外的实施方案中，在其中模具连同保留在其中的细胞糊剂一起在受控制的环境中孵育以允许细胞糊剂中的细胞进一步彼此粘附和/或粘着以形成多细胞体的成熟期之后，细胞的粘着将足够强以允许所得多细胞体被器具(例如，毛细吸管)拾起。在另外的实施方案中，毛细吸管适合地为生物打印机的打印头的部分或可操作以自动将多细胞体放置在三维构建体中的类似装置。
在一些实施方案中，所述多细胞体的截面形状和尺寸将基本上对应于第一成形设备和任选地用来制备多细胞体的第二成形设备的截面形状和尺寸，并且熟练的技术人员将能够选择适合的成形设备，所述适合的成形设备具有适合用于产生具有以上所讨论的截面形状、截面面积、直径以及长度的多细胞体的适合的截面形状、截面面积、直径以及长度。
如本文所讨论，各种各样的细胞类型可用于产生本实施方案的多细胞体。因此，可以采用一种或多种类型的细胞或细胞集合体(包括例如本文列出的所有细胞类型)作为起始材料来产生细胞糊剂。例如，任选采用如非人肌细胞、内皮细胞、脂肪细胞以及成纤维细胞的细胞。如本文所描述，多细胞体为同型细胞或异型细胞。对于制备同型细胞的多细胞体而言，细胞糊剂适合地为同型细胞，即它包括多个单一细胞类型的活细胞。在另一方面，对于制备异型细胞的多细胞体而言，细胞糊剂将适合地包括多于一种细胞类型的相当数目的细胞(即，细胞糊剂将为异型细胞的)。如本文所描述，当异型细胞的细胞糊剂被用来产生多细胞体时，活细胞可以基于细胞的粘附强度的差异，在成熟和粘着过程期间“分选出”，并且可以恢复它们的生理构象。
在一些实施方案中，如本文所指出，除了多个活细胞之外，一种或多种ECM组分或一种或多种ECM组分的一种或多种衍生物(例如，明胶、纤维蛋白原、胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白和/或蛋白聚糖)可以适合地被包括在细胞糊剂中以将这些物质并入到多细胞体中。在另外的实施方案中，将ECM组分或ECM组分的衍生物添加至细胞糊剂可以促进多细胞体中的细胞的粘着。例如，明胶和/或纤维蛋白原任选地被添加至细胞糊剂。更具体地说，任选地使10％至30％明胶溶液和10mg/ml至80mg/ml纤维蛋白原溶液与多个活细胞混合，以形成含有明胶和纤维蛋白原的细胞悬液。
各种方法适合于促进另外的成熟过程。在一个实施方案中，可以在约37℃下将细胞糊剂孵育一段时间(所述一段时间可为细胞类型依赖的)以促进粘附和/或粘着。可选地或另外地，可以在含有因子和/或离子的细胞培养基的存在下保持细胞糊剂以促进粘附和/或粘着。
将多细胞体布置在支承基底上以形成层
许多方法适合于将多细胞体布置在支承基底上以产生所需的三维结构(例如，基本上平坦的层)。例如，在一些实施方案中，所述多细胞体被手动放置成彼此接触、通过从吸管、喷嘴或针挤出而沉积在适当的位置上或通过自动机器(如生物打印机)而接触设置。
如本文所描述，在一些实施方案中，支承基底可透过流体、气体以及营养物，并且允许细胞培养基在布置和随后的融合过程中接触多细胞体和/或层的所有表面。如本文进一步描述，在一些实施方案中，支承基底由天然生物材料如胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白以及其它细胞外基质制成。在一些实施方案中，支承基底由合成生物材料如羟基磷灰石、藻酸盐、琼脂糖、聚乙醇酸、聚乳酸以及它们的共聚物制成。在一些实施方案中，支承基底是固体。在一些实施方案中，支承基底是半固体。在另外的实施方案中，支承基底是固体和半固体支承元件的组合。在另外的实施方案中，支承基底是平坦的以促进平坦层的产生。在一些实施方案中，支承基底被抬高或升高在非渗透表面之上，如细胞培养环境(例如，陪替氏培养皿、细胞培养瓶等)或生物反应器的一部分。因此，在一些实施方案中，可渗透的、升高的支承基底促成防止细胞过早死亡、促成细胞生长增强以及促进多细胞体融合以形成层。
如本文所描述，在各种实施方案中，所述多细胞体具有许多形状和尺寸。在一些实施方案中，所述多细胞体为细长的并且呈圆柱形的形状。参见，例如图1和图3。在一些实施方案中，本文提供的多细胞体具有类似的长度和/或直径。在其它实施方案中，本文提供的多细胞体具有不同的长度和/或直径。在一些实施方案中，所述多细胞体为大致球形。参见，例如图2和图4。在一些实施方案中，所述层包含尺寸上基本上类似的大致球形的多细胞体。在其它实施方案中，所述层包含具有不同尺寸的大致球形的多细胞体。
参考图6，在一些实施方案中，所述多细胞体1水平相邻于一个或多个其它多细胞体并且与所述一个或多个其它多细胞体接触而布置在支承基底3上以形成基本上平坦的层。
参考图7，在一些实施方案中，大致球形的多细胞体2水平相邻于一个或多个其它大致球形的多细胞体并且与所述一个或多个其它大致球形的多细胞体接触而布置在支承基底3上。在另外的实施方案中，重复此过程以建成大致球形的多细胞体的图案如格网，以形成基本上平坦的层。
参考图8，在具体的实施方案中，多细胞体6经由器具如毛细吸管5被铺放在支承基底3上，以使得它水平相邻于一个或多个其它多细胞体并且与所述一个或多个其它多细胞体接触。在其它实施方案中，所述多细胞体被铺放在支承基底上以使得它与多个其它多细胞体平行。
参考图9，在一些实施方案中，随后一系列多细胞体8相邻于前面一系列多细胞体9并且与所述前面一系列多细胞体9接触竖直布置在支承基底3上以形成更厚的层。
在其它实施方案中，具有不同形状和尺寸的层通过布置具有各种形状和尺寸的多细胞体而形成。在一些实施方案中，具有各种形状、尺寸、密度、细胞组成和/或添加剂组成的多细胞体被合并在层中并且促成例如所得层的外观、口味以及质地。
参考图10，在一些实施方案中，细长多细胞体9相邻于大致球形的多细胞体10并且与所述大致球形的多细胞体10接触而布置在支承基底3上以形成复合层。
在一些实施方案中，一旦层的组装完全，将组织培养基倾倒在构建体的顶部。在另外的实施方案中，组织培养基进入多细胞体之间的间隔以支承多细胞体中的细胞。允许多维构建体中的多细胞体彼此融合，以产生用于形成可食用工程肉的基本上平坦的层。所谓“融合”意指邻接的多细胞体的细胞直接通过细胞表面蛋白之间的相互作用或间接通过细胞与细胞外基质(ECM)组分或ECM组分的衍生物的相互作用而变为彼此粘附和/或粘着。在一些实施方案中，所述多细胞体内的细胞产生它们自身细胞特异性的ECM(例如，胶原)，所述ECM提供了多细胞体和可食用肉产品的机械完整性。在一些实施方案中，融合的层被完全融合并且多细胞体已变为基本上邻接的。在一些实施方案中，融合的层被基本上融合或部分融合，并且多细胞体的细胞已变为粘附和/或粘着至允许完整移动和操纵层所必要的程度。
在一些实施方案中，所述多细胞体在细胞培养环境(例如，陪替氏培养皿、细胞培养瓶、生物反应器等)中融合以形成层。在另外的实施方案中，所述多细胞体在具有适合于促进多细胞体中所包括的细胞类型生长的条件的环境中融合以形成层。在各种实施方案中，融合发生在约15、20、25、30、35、40、45、50、55和60分钟以及其中增量的时间内。在其它各种实施方案中，融合发生在约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48小时以及其中增量的时间内。在其它各种实施方案中，融合发生在约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12和14天以及其中增量的时间内。在另外的实施方案中，融合发生在约2小时至约36小时的时间内。若干因素影响所要求的融合时间，包括(作为非限制性实例)细胞类型、细胞类型比率、培养条件以及添加剂如生长因子的存在。
在一些实施方案中，一旦层的融合完全，层与支承基底分开。在其它实施方案中，当层的融合基本上完全或部分完全时，层与支承基底分开，但是层的细胞彼此粘附和/或粘着至允许移动、操纵以及堆叠层而没有将它拆开所必要的程度。在另外的实施方案中，经由用于融化、溶解或降解支承基底的标准程序使层与支承基底分开。在另外的实施方案中，例如通过温度变化、光或其它不会不利影响层的刺激来溶解支承基底。在具体的实施方案中，支承基底由柔性材料制成并且从层上剥离。
在一些实施方案中，将所分开的层转移至生物反应器以供进一步成熟。在一些实施方案中，所分开的层在并入工程肉产品之后成熟和进一步融合。
在其它实施方案中，所述层未与支承基底分开。在另外的实施方案中，在包装、冷冻、出售或消费组装的工程肉产品之前使支承基底降解或生物降解。
将层布置在支承基底上以形成工程肉
许多方法适合于将层布置在支承基底上以生产工程肉。例如，在一些实施方案中，所述层被手动放置成彼此接触或通过自动计算机辅助机器(如生物打印机)根据计算机脚本而沉积在适当的位置上。在另外的实施方案中，堆叠基本上平坦的层以形成工程肉。
在各种实施方案中，堆叠约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450或500个层或其中增量。在一些实施方案中，堆叠约10至约100个层。在一些实施方案中，堆叠约20至约80个层。在一些实施方案中，堆叠约40至约60个层。在另外的实施方案中，重复堆叠以形成接近传统肉产品(如生牛肉片(Carpaccio)、熏肉条、汉堡肉饼、鱼片、鸡胸肉或牛排)的厚度。在各种实施方案中，堆叠的层构成厚度为约1mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm或50mm或其中增量的工程肉产品。
在一些实施方案中，层具有通过多细胞体的放置、图案或取向而限定的取向。在另外的实施方案中，用相对于支承基底和/或一个或多个其它层的具体取向堆叠每个层。在各种实施方案中，用包括相对于支承基底和/或下面的层旋转的取向堆叠一个或多个层，其中旋转为约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175以及180度或其中增量。在其它实施方案中，基本上类似地取向所有层。
参考图11，在具体的实施方案中，层具有通过平行放置用来形成层的多细胞体而限定的取向。在另外的具体实施方案中，用包括相对于下面的层旋转90度的取向堆叠层以形成工程肉。
在一些实施方案中，一旦层的堆叠完全，允许三维构建体中的层彼此融合以产生工程肉。在一些实施方案中，所述层在细胞培养环境(例如，陪替氏培养皿、细胞培养瓶、生物反应器等)中融合以形成工程肉。在各种实施方案中，融合发生在约15、20、25、30、35、40、45、50、55和60分钟以及其中增量的时间内。在其它各种实施方案中，融合发生在约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48小时以及其中增量的时间内。在另外的实施方案中，融合发生在约2小时至约36小时的时间内。
在一些实施方案中，一旦堆叠，多细胞体和层的细胞开始死亡，由于气体、流体以及营养物不能够扩散到或以另外的方式到达构建体的内部部分。在另外的实施方案中，细胞的逐渐死亡类似于发生在死后有机体的组织中的自然细胞死亡。在一些实施方案中，随着细胞的逐渐死亡，工程肉构建体的层同时彼此融合。在一些实施方案中，随着细胞的逐渐死亡，层的多细胞体同时继续彼此融合。在另外的实施方案中，在构建体的大多数细胞死亡之前，层内和层间的融合完全或基本上完全。在另外的实施方案中，在构建体的所有细胞死亡之前，层内和层间的融合完全或基本上完全。
在一些实施方案中，一旦工程肉的组装完全，肉与支承基底分开。在另外的实施方案中，经由用于融化、溶解或降解支承基底的标准程序使肉与支承基底分开。在另外的实施方案中，例如通过温度变化、光或其它不会不利影响肉的刺激来溶解支承基底。在具体的实施方案中，支承基底由柔性材料制成并且从肉上剥离。在一些实施方案中，将所分开的肉转移至生物反应器用于进一步成熟。在其它实施方案中，所述肉没有与支承基底分开。在另外的实施方案中，在出售或耗用之前使支承基底降解或生物降解。
在一些实施方案中，所述肉经辐照。在一些实施方案中，在分发、出售和耗用之前，肉被冷冻以防止分解或降解。在另外的实施方案中，冷冻的肉被真空包装。
工程肉
在一些实施方案中，本文公开了工程肉产品。在各种实施方案中，本文还公开了多个多细胞体，所述多细胞体被相邻布置在支承基底上以形成用于形成工程肉的基本上平坦的层。
在一些实施方案中，工程肉产品为新鲜的。在其它实施方案中，保藏工程肉产品。在另外的实施方案中，通过例如烹饪、干燥、烟熏、装罐、酸洗、盐腌或冷冻来保藏肉。
在一些实施方案中，工程肉产品基本上不含病原微生物。在另外的实施方案中，细胞制备、细胞培养、多细胞体制备、层制备以及工程肉制备的受控基本上无菌的方法产生基本上不含病原微生物的产品。在另外的实施方案中，此类产品的额外优点是实用性和安全性提高。
在一些实施方案中，使工程肉产品成形。在另外的实施方案中，通过例如控制用来构建肉的多细胞体和/或层的数目、尺寸以及布置来使肉成形。在其它实施方案中，通过例如切削、按压、模塑或冲压来使肉成形。在一些实施方案中，所述肉产品的形状被选择类似传统肉产品，如熏肉条、香肠串、香肠肉饼、汉堡肉饼、热狗、鱼片、鸡胸肉、鸡肉条、鸡块、烘肉卷或牛排。在其它实施方案中，研磨工程肉产品。
实施例
以下说明性实例代表本文描述的实施方案并且并不意图以任何方式进行限制。
实例1-制备支承基底
为了制备2％琼脂糖溶液，将2g的超纯低融点(LMP)琼脂糖溶解在100mL超纯水/缓冲溶液(1∶1，v/v)中。缓冲溶液任选为PBS(杜氏磷酸盐缓冲盐水1×)或HBSS(汉克斯氏平衡盐溶液1×)。将琼脂糖溶液放置在含有温水(超过80℃)的烧杯中，并且保持在热板上直到琼脂糖完全溶解。只要温度超过36℃，琼脂糖溶液保持液态。低于36℃，发生相转变，粘度增加并且最后琼脂糖形成凝胶。
为了制备琼脂糖支承基底，将10mL的液态2％琼脂糖(温度＞40℃)放在10cm直径陪替氏培养皿中并且均匀散开以形成均匀的层。在4℃下，在冰箱中允许琼脂糖形成凝胶。
实例2-培养猪主动脉平滑肌细胞
使新鲜分离的猪主动脉平滑肌细胞(PASMC)在具有10％胎牛血清(HycloneLaboratories，UT)、10％猪血清(Invitrogen)、L-抗坏血酸、硫酸铜、HEPES、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-甘胺酸以及青霉素G(所有前述补充剂购自Sigma，St.Louis，MO)的低葡萄糖DMEM中生长。在0.5％明胶(猪皮明胶；Sigma)涂敷的皿(Techno Plastic Products，St.Louis，MO)上培养细胞系，并且在含有5％CO2的湿润环境中维持在37℃下。在用来形成多细胞体之前，将PASMC继代培养最多第7代。
实例3-制备多细胞球体和圆柱体
用磷酸盐缓冲的盐水溶液(PBS，Invitrogen)洗涤细胞培养物两次，并且用0.1％胰蛋白酶(Invitrogen)处理10min并且以1500RPM离心5min。将细胞重悬在4mL的细胞类型特异性的介质中并且在回转振荡器(New Brunswick Scientific，Edison，NJ)上，在37℃和5％CO2下在10-mL组织培养瓶(Bellco Glass，Vineland，NJ)中孵育一小时，以进行粘附回收并且以3500RPM离心。将所得沉淀物转移到300μm(Sutter Instrument，CA)或500μm(Drummond Scientific Company，Broomall，PA)直径的毛细微量吸管中，并且在37℃和5％CO2下孵育15min。对于球形多细胞体而言，挤出的圆柱体被切成相等的片段，让所述片段在回转振荡器上旋绕过夜。取决于微量吸管的直径，这个程序提供了限定尺寸和细胞数目的规则球体。对于圆柱形多细胞体而言，使用生物打印机机械地将圆柱体挤出到特定制备的非粘附的或琼脂糖模具中。在模具中成熟过夜之后，细胞圆柱体为足够粘着可被沉积。
将多细胞体包装到柱体(300μm至500μm内径的微量吸管)中。将柱体插入到生物打印机中，并且根据编码待打印的结构的形状的计算机脚本递送至支承基底上。
实例4-制备工程肉
如在实例3中所描述制备圆柱形多细胞体。多细胞体为异型细胞的并且由实例2的PASMC和猪冠状动脉内皮细胞(PCAEC，Genlantis，San Diego，CA，产品号PP30005)组成。多细胞体中的肌细胞与内皮细胞的比率为约6∶1。多细胞体的截面直径为300μm并且长度为2cm、3cm、4cm或5cm。将成熟的多细胞体包装到柱体(300μm内径的微量吸管)中，所述柱体然后被插入到生物打印机中。
如在实例1中所描述制备琼脂糖支承基底。通过细网架将支承基底抬高至大的陪替氏培养皿的底部之上，以使得细胞培养基可以接触被沉积在基底上的多细胞体和层的所有表面。
生物打印机根据计算机脚本的指令将多细胞体递送至支承基底上。脚本编码圆柱形多细胞体的放置以形成具有约10cm平均宽度和约10cm平均长度的大致正方形单层。多细胞体被彼此平行放置，其中端对端放置具有不同长度的本体以形成编码的形状。
将培养基倾倒在层的顶部，并且允许构建体在含有5％CO2的湿润环境中，在37℃下在约12小时的过程中部分融合。在这段时间过程中，所述多细胞体的细胞粘附和/或粘着至允许移动和操纵层而没有将它拆开所必要的程度。
将部分融合的层从支承物上剥离并且堆叠。堆叠六十五个层以形成工程肉，所述工程肉的总体宽度和高度为约2cm并且总体长度和宽度为约10cm。每个层相对于下面的层旋转90度。一旦堆叠，细胞由于丧失氧气而开始死亡，因为培养基没有变化。细胞死亡开始于堆叠的内部，因为这些堆叠首先丧失氧气，并且逐步地到达外部细胞，因为周围的培养基变得逐渐耗尽氧气。与细胞死亡的同时，部分融合的层继续融合，虽然它们也在竖直方向上开始融合。因为融合过程要花约6小时，所以当细胞死亡消耗约20小时的时候，死后构建体完全融合并且呈现出类似于正方形猪肉汉堡肉饼的形状。
虽然经由说明和实例已在本文详细描述了工程肉及其制备的方法，但是这种说明和实例仅出于清楚理解的目的。鉴于本文的教导，对于本领域普通技术人员而言显而易见的是可在不脱离本发明的精神和范围的情况下对本发明作出某些改变和修改。

Claims (27)

1.一种工程肉产品，所述肉产品包括：
具有一定体积的本体；
其中所述本体包括20个至80个堆叠的平坦层，其中所述层至少部分融合并且每个平坦层包含多个至少部分融合的多细胞体，所述多细胞体包含非人肌细胞，其中所述体积内部区域的所述非人肌细胞大多数是死亡的；
其中所述本体不包括任何血管，并且进一步地，其中所述工程肉产品为可食用的并且用于摄取。
2.如权利要求1所述的工程肉，其中所述本体的体积大于10cm3。
3.如权利要求1所述的工程肉，其中所述肉产品的中间区域内的平坦层在所述工程肉的外层之前已经历了细胞死亡。
4.如权利要求1所述的工程肉，其中每个平坦层包含多个至少部分融合的多细胞体，所述多细胞体包含非人肌细胞和非人内皮细胞。
5.如权利要求1所述的工程肉，其中所述本体的所述堆叠的平坦层完全融合。
6.如权利要求1所述的工程肉，其中所述肌细胞源自哺乳动物、鸟、爬行动物、鱼、甲壳动物、软体动物或头足动物。
7.如权利要求1所述的工程肉，其中所述肌细胞为骨骼肌细胞。
8.如权利要求1所述的工程肉，其中所述肌细胞为心肌细胞。
9.如权利要求1所述的工程肉，其中所述肌细胞为平滑肌细胞。
10.如权利要求1所述的工程肉，其中所述肌细胞被对齐。
11.一种工程肉，其包括：
包括20个至80个堆叠的层的体积，其中每个层包含多个至少部分融合的多细胞体，所述多细胞体包含非人肌细胞，其中所述体积内部区域的所述非人肌细胞大多数是死亡的，其中每个层中的所述多细胞体彼此相邻布置；以及
其中所述工程肉为可食用的并且用于摄取。
12.如权利要求11所述的工程肉，其中所述体积大于10cm3。
13.如权利要求11所述的工程肉，其中所述体积不包括任何血管。
14.如权利要求11所述的工程肉，其中每个所述层的厚度为300μm至600μm。
15.一种形成工程肉的方法，所述方法包括：
制备多个多细胞体，所述多细胞体包含多个彼此粘着的非人肌细胞；
将不止一个多细胞体相邻地铺放在平坦支承基底上；
融合所述多细胞体以形成第一平坦层；
将20个至80个附加平坦层堆叠在所述第一平坦层上；以及
随着细胞的逐渐死亡，工程肉构建体的层同时彼此融合，融合所述层以形成一定体积的工程肉，以便当所述层融合至少部分完成后所述体积中大部分细胞已经死亡；
其中所述工程肉为可食用的。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述多个多细胞体的制备包括培养多个非人肌细胞和多个非人内皮细胞至少直到所述细胞彼此粘着。
17.如权利要求15所述的方法，其中堆叠包括在所述平坦支承基底上依次将所述平坦层堆叠在所述第一平坦层的顶上。
18.如权利要求15所述的方法，其中培养所述堆叠的平坦层包含施加机械力、电力或机电力以锻炼每个层中的所述肌细胞。
19.如权利要求15所述的方法，其进一步包括冷冻所述体积的工程肉。
20.如权利要求15所述的方法，其中制备所述多个多细胞体包括制备包含多个彼此粘着的非人肌细胞的多个细长多细胞体和制备包含多个彼此粘着的非人肌细胞的多个大致球形的多细胞体；并且进一步地，其中铺放不止一个多细胞体包括将不止一个细长多细胞体和不止一个大致球形的多细胞体相邻地铺放在平坦支承基底上。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述细长多细胞体的长度范围为1mm至10cm。
22.如权利要求15所述的方法，其中制备所述多个多细胞体包括制备多个大致球形的多细胞体，所述多细胞体包含多个彼此粘着的非人肌细胞；并且进一步地，其中铺放不止一个多细胞体包括将不止一个大致球形的多细胞体相邻地铺放在支承基底上。
23.如权利要求15所述的方法，其中所述平坦支承基底可透过流体和营养物并且允许细胞培养基接触所述多细胞体的所有表面。
24.如权利要求15所述的方法，其中所述多细胞体具有适配成允许扩散以足以支持培养的所述非人肌细胞的维持和生长的直径。
25.如权利要求15所述的方法，其中所述多细胞体的直径为100μm至500μm。
26.一种形成可食用工程肉产品的方法，所述方法包括：
通过将多个多细胞体相邻设置在平面上而形成多个平坦层，其中每个多细胞体包含多个粘着的非人肌细胞；
培养每个所述平坦层至少直到每个层内的所述多个多细胞体已经至少部分地融合；
堆叠多于50个所述至少部分地融合的平坦层以形成层状体积的工程肉；并且
随着细胞的逐渐死亡，工程肉构建体的层同时彼此融合，以便当所述层融合至少部分完成后所述体积中大部分细胞已经死亡。
27.一种工程肉，所述工程肉包括：
具有多于50个至少部分融合的平坦层的层状体积；
其中每个平坦层包含多个彼此相邻和至少部分融合的多细胞体；
其中每个多细胞体包含多个粘着的非人肌细胞，以及所述层状体积内部区域的大多数非人肌细胞是死亡的。
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