CN103025345A - Tfpi抑制剂及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供结合组织因子路径抑制剂(TFPI)的肽，包括TFPI抑制肽；及其组成物。该等肽可用于抑制TFPI、增强凝血因子不足的个体中的凝血酶形成、增加个体中的血凝块形成、治疗个体的凝血病症、纯化TFPI及鉴别TFPI结合化合物。

Description

TFPI抑制剂及使用方法
技术领域
本发明大体上系关于结合组织因子路径抑制剂(TFPI)的肽及其用途。
以引用方式并入
本申请案主张2010年3月19日申请的美国临时专利申请案第61/315,758号的优先权，该临时专利申请案据此以全文引用的方式并入本文中。以下申请案亦以全文引用的方式并入本文中：2008年12月19日申请的美国临时专利申请案第61/1 39,272号；及2009年12月21日申请的美国专利申请案第12/643,818号。
背景技术
止血依赖于复杂凝血级联，其中由凝血因子介导的一系列事件会导致凝血酶原(prothrombin)转化成凝血酶(thrombin)。因子X(FX)活化为凝血级联的内在路径与外在路径两者的中心事件。外在路径已经提出为凝血级联的主要活化因子(Mackman等人，Arterioscler.Thromb.Casc.Biol.，27，1687-1693(2007))。循环组织因子(TF)与经活化的因子VII(FVIIa)相互作用而形成介导FX活化的「外在错合物(extrinsic complex)」。凝血级联藉由内在路径放大，在此期间因子XII、XI、IX及VIII的连续活化导致形成「内在(intrinsic)」FIXa-FVIIIa错合物，其亦介导FX活化。经活化的FX促进凝血酶形成，此为身体产生纤维蛋白(fibrin)及有效抑制出血所需。
诸如血友病(hemophilia)的严重出血病症由凝血级联的破坏引起。作为最常见类型的血友病的A型血友病源自于因子VIII不足，而B型血友病与因子IX(FIX)不足相关。C型血友病由因子XI(FXI)不足引起(Cawthern等人，Blood，91(12)，4581-4592(1998))。目前无法治愈血友病及其他凝血疾病。因子替代疗法为用于凝血病症的最常见治疗。然而，凝血因子典型地在投药之后不久即自血流清除。为了达成疗效，患者必须接受频繁的静脉内输注血浆源性或重组因子浓缩物，此举令人不适；需要临床环境；代价昂贵；且耗费时间。此外，因子替代疗法的治疗功效会在形成抑制抗体后急速减弱。约30％患有严重A型血友病的患者会产生可中和因子VIII(FVIII)的抑制抗体(Peerlinck及Hermans，Haemophilia，12，579-590(2006))。存在少数可用于具有抗因子抗体的患者的治疗选项。
因此，此项技术中对用于治疗凝血病症的组成物及方法存有需要。本发明提供此等组成物及方法。
发明内容
【发明摘要】
本发明提供与组织因子路径抑制剂(TFPI)结合且能够调节凝血级联的肽，包括TFPI拮抗肽。举例而言，本发明提供包含氨基酸序列X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21(SEQ ID NO：3109)的肽，其中：
X7系选自由以下者所组成的群组：L、P、K、S、W、V、N及Q；
X8系选自由以下者所组成的群组：L、R、N、F及I；
X9系选自由以下者所组成的群组：Y、V、P及C；
X10系选自由以下者所组成的群组：F、L及G；
X11系选自由以下者所组成的群组：L、W、V、A、M、T及S；
X12系选自由以下者所组成的群组：T、F、V、R、A、D、L、E、S及Y；
X13系选自由以下者所组成的群组：I、M、G、Q、D及R；
X14系选自由以下者所组成的群组：G、W、Y、L、M及H；
X15系选自由以下者所组成的群组：N、P、F、H、K及Y；
X16系选自由以下者所组成的群组：M、D、E、V、G及K；
X17系选自由以下者所组成的群组：G、I、R、S、T及L；
X18系选自由以下者所组成的群组：M、K、L及I；
X19系选自由以下者所组成的群组：Y、G、R及S；
X20系选自由以下者所组成的群组：A、E、S、C及Y；且
X21系选自由以下者所组成的群组：A、V、K及E。
在一态样中，该肽包含一或多个直接与X7连接的N端氨基酸，其中该(等)N端氨基酸包含选自由以下者所组成的群组的氨基酸序列：
X6，
X5X6，
X4X5X6，
X3X4X5X6(SEQ ID NO：3110)，
X2X3X4X5X6(SEQ ID NO：3111)，及
X1X2X3X4X5X6(SEQ ID NO：3112)，其中X1系选自由T及G所组成的群组；X2系选自由F及V所组成的群组；X3系选自由V、W、Y及F所组成的群组；X4系选自由D、Q及S所组成的群组；X5系选自由E、T、N及S所组成的群组；且X6系选自由R、H、K及A所组成的群组。
或者或此外，该肽包含一或多个直接与X21连接的C端氨基酸，其中该(等)C端氨基酸包含选自由以下者所组成的群组的氨基酸序列：
X22，
X22X23，
X22X23X24，
X22X23X24X25(SEQ ID NO：3113)，
X22X23X24X25X26(SEQ ID NO：3114)，及
X22X23X24X25X26X27(SEQ ID NO：3115)，其中X22系选自由Q、I、E、W、R、L及N所组成的群组；X23系选自由L、V、M及R所组成的群组；X24系选自由K、L、A及Y所组成的群组；X25为F；X26为G；且X27为T。
在一态样中，本发明提供包含如SEQ ID NO：1-7所示的氨基酸序列的肽，其抑制凝血级联内的TFPI活性，诸如包含JBT0132、JBT0303、JBT0193、JBT0178、JBT0120及JBT0224中的任一者中所阐述的氨基酸序列的肽。本发明亦提供结合TFPI  的肽，其包含与序列Phe-Gln-Ser-Lys-Gly-Asn-Val-Phe-Val-Asp-Gly-Tyr-Phe-Glu-Arg-Leu-Arg-Ala-Lys-Leu(FQSKGNVFVDGYFERLRAKL)(SEQ ID NO：32)的一致性为至少60％的氨基酸序列。
此外，本发明提供结合TFPI的肽，其中该肽包含式(I)结构：X1001-X1002-X1003-X1004-X1005-X1006-X1007-X1008-X1009-X1010-X1011-X1012-X1013-X1014-X1015-X1016-X1017-X1018-X1019-X1020(SEQ ID NO：3116)。在式(I)中，
X1001为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Bhf、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Nmf、Q、R、T、V、W及Y；
X1002为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：G、K及Q；
X1003为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、Bhs、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；
X1004为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、Bhk、C、D、E、F、G、H、I、K、k、L、M、N、Nmk、P、Q、R、S、T、V、W及Y；
X1005为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：a、A、Aib、Bal、C、D、d、E、F、G、H、K、k、L、M、N、Nmg、p、Q、R、S、T、V、W及Y；
X1006为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、Btq、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、ST、V、W及Y；
X1007为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、F、G、I、K、L、Nmv、P、Q、S、V、W及Y；
X1008为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、H、K、W及Y；
X1009为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、f、I、K、S、T及V；
X1010为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Nmf、P、Q、R、S、T、V、W及Y；
X1011为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Aib、C、K、G及Nmg；
X1012为Y；
X1013为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、C、E、F、G、H、K、L、M、Q、R、W及Y；
X1014为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、Bhe、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；
X1015为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：(ω-甲基)-R、D、E、K及R；
X1016为L；
X1017为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：(ω-甲基)-R、A、Aib、Bhr、C、Cha、Cit、D、Dab、Dap、E、Eag、Eew、F、G、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、N、Nle、Nva、Opa、Orn、Q、R、S、T、V、W及Y；
X1018为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Bal、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；
X1019为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Bhk、K、R及V；且
X1020存在或不存在，其中倘若X1020存在，则其为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Aib、Bhl、C、F、G、H、I、K、L、Nml、Q、R、S、T、V、W及Y。
在一态样中，结合TFPI  的肽包含式(III)结构：X1001-Q-X1003-X1004-X1005-X1006-I/V-X1008-V-X1010-G-Y-C/F-X1014-R-L-X1017-X1018-K-K/L(III)(SEQ ID NO：3117)。在式(III)中，X1001、X1003、X1004、X1005、X1006、X1008、X1010、X1014、X1017及X1018各自独立地选自任何氨基酸。
本发明另外提供TFPI结合肽，其包含式(V)结构：X2001-X2002-X2003-X2004-X2005-X2006-[X2007-X2008-X2009-X2010-X2011-X2012-X2013-X2014-X2015-X2016-X2017-X2018]-X2019-X2020-X2021-X2022-X2023(V)(SEQ ID NO：3118)。在式(V)中，X2001、X2002及X2023独立地为存在或不存在。当存在时，X2001为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、E、F、G、H、I、K、L、P、R、S、T、V及W；且X2002为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、R、S、T、V及W。另外，
X2003为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、F、I、K、L、R、S、T、V、W及Y；
X2004为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V及W；
X2005为W；
X2006为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、H、I、K、L、R V及W；
X2007为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、Hcy、Dap及K，较佳选自由以下者所组成的群组：C及Hcy；
X2008为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、G、R、S及T；
X2009为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：a、A、I、K、L、M、m、Nle、p、R及V；
X2010为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、G、I、K、L、P、R、S、T及V；
X2011为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：D、E、G、S及T；
X2012为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、a、D、d、E、e、F、f、G、I、K、k、L、l、M、m、Nle、nle、P、p、R、r、S、s、T、t、V、v、W及w；
X2013为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、d、E、e、F、G、I、K、L、R、S、s、T、V及W；
X2014为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、M、R、S、T、V及W；
X2015为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、M、Nle、R、S、T、V及W；
X2016为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、E、F、I、K、L、M、Nle、R、S、T、V、W及Y；
X2017为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V、W及Y；
X2018为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C及D(X2018较佳为C)；
X2019为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、F、I、L、S、T、V及W；
X2020为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F及W；
X2021为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：I、L及V；且
X2022为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、P、R、S、T、V及W。
当X2023存在于肽中时，X2023为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V、W及Y。在一态样中，该肽包含由X2007与X2018之间的键联(在式(V)中用括号指示)产生的环状结构。
本发明亦提供结合TFPI的肽，其中该肽至少包含式(VI)结构：X2001-X2002-F/Y-K-W-F/H-[C-X2008-M/V-X2010-D-X2012-X2013-G-I/T-X2016-S/T-C]-A/V-W-V-X2022-X2023(VI)(SEQ ID NO：3119)的氨基酸3-22。在式(VI)中，X2001、X2002及X2023各自独立地为存在或不存在。X2008、X2010、X2012、X2013、X2016及X2022以及X2001、X2002及X2023当存在时，各自独立地选自任何氨基酸。该肽包含由X2007与X2018之间的键联(在式(VI)中用括号指示)产生的环状结构。
在一态样中，本发明提供结合TFPI的肽，其中该肽至少包含式(VIII)结构：X3001-X3002-X3003-X3004-X3005-X3006-X3007-X3008-X3009-X3010-X3011-X3012-X3013-X3014-X3015-X3016-X3017-X3018-X3019-X3020-X3021(VIII)(SEQ ID NO：3120)的氨基酸3-21(X3003-X3021)。在式(VIII)中，X3001及X3002各自独立地为存在或不存在。当存在时，X3001为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、E、H及Y；且X3002为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、F、H、K、M、N、P、R、S、T、W、Y、G、I及L。关于式(VIII)的其余部分，
X3003为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W及Y；
X3004为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y及P；
X3005为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W及Y；
X3006为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、W、C、K、P、R及H；
X3007为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Q、A、C、F、G、H、I、K、L、N、R、S、T、W及Y；
X3008为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y及I；
X3009为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、G、H、I、L、M、R、S、T、V、W、Y及K；
X3010为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；
X3011为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y、C、F及H；
X3012为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、H、I、K、L及R；
X3013为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、G、H、K、L、M、R、S、V、W、Y及I；
X3014为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、G、H、I、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y及K；
X3015为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、K及R；
X3016为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、F、K及R；
X3017为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W、Y、H、A及M；
X3018为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、I、K、L、M、Q、R、V、W及Y；
X3019为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、E、F、G、H、K、L、N、P、Q、R、V、W、Y及I；
X3020为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、V、W、Y、I及P；且
X3021为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、Y、F及G。
另外，本发明提供TFPI结合肽，其包含式(IX)结构：X3001-X3002-X3003-X3004-X3005-X3006-X3007-X3008-X3009-X3010-X3011-H-X3013-X3014-K/R-R-X3017-X3018-X3019-X3020-X3021(IX)(SEQ ID NO：3121)，其中X3001、X3002、X3003、X3004、X3005、X3006、X3007、X3008、X3009、X3010、X3011、X3013、X3014、X3017、X3018、X3019、X3020及X3021各自独立地选自任何氨基酸。此外，本发明包括结合TFPI的肽，其中该肽包含与式(X)序列：Ac-GYASFPWFVQLHVHKRSWEMA-NH2(SEQ IDNO：223)的一致性为至少60％的氨基酸序列。
本发明另外提供TFPI结合肽，其包含式(XI)结构：X4001-Q-X4003-X4004-X4005-X4006-X4007-X4008-X4009-X4010-X4011-X4012-X4013-X4014-R-X4016-X4017-X4018-X4019-X4020(XI)。关于式(XI)，
X4001为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、L、M、Y、1Ni、Thi、Bta及多巴(Dopa)；
X4003为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、D、E、M、Q、R、S、T、Ede(O)及Cmc；
X4004为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Aib、E、G、I、K、L、M、P、R、W及Y；
X4005为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：a、A、Aib、C、D、d、E、G、H、K、k、M、N、Nmg、p、Q、R、N丙基G(NpropylG)、aze、pip、tic、oic、hyp、nma、Ncg、Abg、Apg、thz及dtc；
X4006为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、C(NEM)、D、E、G、H、K、M、N、Q、R、S、V、Cit、C(Acm)、Nle、I、Ede(O)、Cmc、Ecl、Eea、Eec、Eef、Nif及Eew；
X4007为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：I、V、T、Chg、Phg及Tle；
X4008为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、H、1Ni、2Ni、Pmy及Y；
X4009为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Aib、V、Chhg、Phg、Abu、Cpg、Tle及L-2-胺基-4，4，4-三氟丁酸；
X4010为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、d、E、F、H、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、Nmd及C(NEM)；
X4011为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、a、G、p、Sar、c及hcy；
X4012为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Y、Tym、Pty、多巴及Pmy；
X4013为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、F、1Ni、Thi及Bta；
X4014为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、C、C(NEM)、D、E、K、L、M、N、Q、R、T、V及Hcy；
X4016为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：L、Hcy、Hle及Aml；
X4017为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、a、Aib、C、c、Cha、Dab、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、Nle、Nva、Opa、Orn、R、S、Deg、Ebc、Eca、Egz、Aic、Apc及Egt；
X4018为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、Hcy、hcy、C、c、L、Nle、M、N及R；
X4019为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：K、R及Har；且
X4020为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：K、L、Hcy及Aml。
式(XI)的TFPI结合肽不包含结构式(XII)：X5001-Q-X5003-X5004-X5005-X5006-I/V-X5008-Aib/V-X5010-G-Y-X5013-X5014-R-L-X5017-X5018-K-K/L(XII)。在式(XII)中，
X5001为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、L、M及Y；
X5003为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、D、E、M、Q、R、S及T；
X5004为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：E、G、I、K、L、M、P、R、W及Y；
X5005为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：a、A、Aib、C、D、d、E、G、H、K、k、M、N、Nmg、Q、R及p；
X5006为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、E、G、H、K、M、N、Q、R、S及V；
X5008为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、H及Y；
X5010为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、E、F、H、D、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；
X5013为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Aib、C及F；
X5014为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、C、D、E、K、L、M、N、Q、R、T及V；
X5017为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、C、Cha、Dab、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、Nle、Nve、Opa、Orn、R及S；且
X5018为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、L、M、N及R。
本发明亦包括由选自由以下者所组成的群组的氨基酸序列组成的肽：SEQID NO：4022、4024、4032、4036-4047、4049-4078、4086-4097、4100-4127、4129-4170、4173-4195、4200-4214、4217-4225、4228、4230、4231、4238及4239；以及由选自由以下者所组成的群组的氨基酸序列组成的肽：SEQ ID NO：1294-1336、4002、4013、4021、4023、4025-4031、4033-4035、4048、4079-4085、4098、4099、4128、4171、4172、4196-4199、4215、4216、4226、4277、4229、4232及4233。
在本发明的情形下，由式(I)至式(XI)中的任一者所涵盖的任何肽及本文所述的任何TFPI结合肽亦称为「本发明的肽」及「如本文所述的肽」。
在一些具体实例中，本发明的肽结合TFPI-1(例如TFPI-1α)且视情况改良在不存在FVIII、FIX及/或FXI下TFPI调控的凝血酶的产生。亦提供包含该肽的组成物(例如医药组成物)。
此外，本发明提供使用本发明的肽的方法。举例而言，本发明提供一种抑制TFPI的方法，其包含使该TFPI与如本文所述的肽接触。本发明亦提供一种增强凝血因子不足的个体中的凝血酶形成的方法；一种增加个体中的血凝块形成的方法；及一种治疗个体的凝血病症的方法。所有该等方法在本文中亦称为例如「本发明方法」。该等方法包含以可有效增强凝血酶形成的量、可有效增强血凝块形成的量或可有效治疗个体的凝血病症的量向个体投予如本文提供的肽。除非明确相反地指出，否则本文关于一种本发明的肽或本发明方法提供的描述分别适用于每一种本发明的肽及本发明方法。本发明的其他态样包括本发明的肽用于制造医药品的用途；一种靶向呈现TFPI的细胞的方法；一种治疗或诊断罹患疾病或处于罹患疾病的风险中的个体的方法；一种纯化TFPI的方法；及一种鉴别TFPI结合化合物的方法。
本发明亦包括一种鉴别TFPI结合化合物的方法，该方法包含(a)使包含TFPI库尼兹(Kunitz)域1(KD1)的肽与测试化合物接触，及(b)侦测该测试化合物与由对应于人类TFPI残基Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55的KD1氨基酸残基界定的TFPI结合位点的结合。亦提供一种抑制人类TFPI的方法，该方法包含使人类TFPI与在由氨基酸残基Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55界定的结合位点处结合人类TFPI的抑制剂接触。本发明另外提供一种具有电脑可执行指令的电脑储存媒体，当在电脑的处理器上执行时，该等指令实施一种模型化TFPI库尼兹域1(Kunitzdomain 1，KD1)蛋白中的所选三维(3D)点与测试化合物之间的相互作用的方法，以及一种比较测试化合物与TFPI库尼兹域1(KD1)蛋白中的所选三维点的方法。
所有前述方法在本文中亦称为例如「本发明方法」。
以下编号段落各自简明地定义本发明的一或多个例示性变化：
1.一种结合TFPI的肽，其包含式(XI)结构：X4001-Q-X4003-X4004-X4005-X4006-X4007-X4008-X4009-X4010-X4011-X4012-X4013-X4014-R-X4016-X4017-X4018-X4019-X4020(XI)，其中X4001为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、L、M、Y、1Ni、Thi、Bta及多巴；其中X4003为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、D、E、M、Q、R、S、T、Ede(O)及Cmc；其中X4004为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Aib、E、G、I、K、L、M、P、R、W及Y；其中X4005为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：a、A、Aib、C、D、d、E、G、H、K、k、M、N、Nmg、p、Q、R、N丙基G、aze、pip、tic、oic、hyp、nma、Ncg、Abg、Apg、thz及dtc；其中X4006为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、C(NEM)、D、E、G、H、K、M、N、Q、R、S、V、Cit、C(Acm)、Nle、I、Ede(O)、Cmc、Ecl、Eea、Eec、Eef、Nif及Eew；其中X4007为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：I、V、T、Chg、Phg及Tle；其中X4008为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、H、1Ni、2Ni、Pmy及Y；其中X4009为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Aib、V、Chg、Phg、Abu、Cpg、Tle及L-2-胺基-4，4，4-三氟丁酸；其中X4010为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、d、E、F、H、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、Nmd及C(NEM)；其中X4011为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、a、G、p、Sar、c及hcy；其中X4012为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Y、Tym、Pty、多巴及Pmy；其中X4013为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、F、1Ni、Thi及Bta；其中X4014为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、C、C(NEM)、D、E、K、L、M、N、Q、R、T、V及Hcy；其中X4016为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：L、Hcy、Hle及Aml；其中X4017为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、a、Aib、C、c、Cha、Dab、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、Nle、Nva、Opa、Orn、R、S、Deg、Ebc、Eca、Egz、Aic、Apc及Egt；其中X4018为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、Hcy、hcy、C、c、L、Nle、M、N及R；其中X4019为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：K、R及Har；且其中X4020为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：K、L、Hcy及Aml；且其中该肽不包含以下式(XII)结构：X5001-Q-X5003-X5004-X5005-X5006-I/V-X5008-Aib/V-X5010-G-Y-X5013-X5014-R-L-X5017-X5018-K-K/L(XII)，其中X5001为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、L、M及Y；其中X5003为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、D、E、M、Q、R、S及T；其中X5004为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：E、G、I、K、L、M、P、R、W及Y；其中X5005为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：a、A、Aib、C、D、d、E、G、H、K、k、M、N、Nmg、Q、R及p；其中X5006为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、E、G、H、K、M、N、Q、R、S及V；其中X5008为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、H及Y；其中X5010为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、E、F、H、D、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；其中X5013为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Aib、C及F；其中X5014为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、C、D、E、K、L、M、N、Q、R、T及V；其中X5017为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、C、Cha、Dab、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、Nle、Nve、Opa、Orn、R及S；且其中X5018为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、L、M、N及R。
2.如段落1的肽，其中X4001为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、Y、1Ni、Bta及多巴；其中X4003为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：D、E及S；其中X4004为K；其中X4005为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：p、Nmg、N丙基G、aze、pip、tic、oic及hyp；其中X4006为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、E、K、R、S、V、C(Acm)、Nle、C(NEM)、I及Cit；其中X4007为V或Tle；其中X4008为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：H、1Ni、2Ni及Pmy；其中X4009为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：V、Abu及Tle；其中X4010为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：D、P、C及T；其中X4011为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：G、a、c、hcy及Sar；其中X4012为Y；其中X4013为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、1Ni及Bta；其中X4014为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Aib、C、E及Hcy；其中X4016为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：L、Aml、Hle及Hcy；其中X4017为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、C、c、Aic、Eca及Deg；其中X4018为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、C、c、L及Hcy；其中X4019为K；且其中X4020为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：L、Aml及Hcy。
3.如段落1或段落2的肽，其进一步包含与X4001连接且选自由以下者所组成的群组的N端氨基酸及/或部分：FAM-Ttds、PE、Palm、2-苯基乙酰基、3-苯基丙酰基、2-(萘-2-基)乙酰基、己酰基、2-甲基丙酰基、3-甲基丁酰基、2-萘基磺酰基及1-萘基磺酰基。
4.如段落1-3中任一者的肽，其进一步包含与X4020连接的X4021，其中X4021包含选自由以下者所组成的群组的C端氨基酸及/或部分：C、c、C(NEM)、K(Ttds-顺丁烯二酰亚胺基丙酰基(EtSH))、FA19205、FA19204、FA19203、FA03202、K(Tdts-顺丁烯二酰亚胺)、K(AOA)及Cea。
5.如段落1-4中任一者的肽，其中该肽包含环状结构。
6.如段落5的肽，其中该环状结构系在X4018与X4021之间形成。
7.如段落6的肽，其中(a)X4018为C或c且(b)X4021为Cea。
8.如段落5的肽，其中该环状结构系在X4011与X4014之间形成。
9.如段落8的肽，其中(a)X4011为c或hcy且(b)X4014为C或Hcy。
10.如段落1-9中任一者的肽，其包含分子内双硫键。
11.如段落1-10中任一者的肽，其中该肽的IC50小于1000nM。
12.如段落1-10中任一者的肽，其中该肽的IC50小于250nM。
13.如段落1-10中任一者的肽，其中该肽的IC50小于50nM。
14.如段落1-10中任一者的肽，其中该肽的IC50小于10nM。
15.一种肽，其由选自由以下者所组成的群组的氨基酸序列组成：SEQ IDNO：4022、4024、4032、4036-4047、4049-4078、4086-4097、4100-4127、4129-4170、4173-4195、4200-4214、4217-4225、4228、4230、4231、4238及4239。
16.一种肽，其由选自由以下者所组成的群组的氨基酸序列组成：SEQ IDNO：1294-1336、4002、4013、4021、4023、4025-4031、4033-4035、4048、4079-4085、4098、4099、4128、4171、4172、4196-4199、4215、4216、4226、4277、4229、4232及4233。
17.一种TFPI结合肽，其包含两种或两种以上如段落1-16中任一者的肽的均二聚体或均多聚体。
18.一种TFPI结合肽，其包含两种或两种以上如段落1-16中任一者的肽的杂二聚体或杂多聚体。
19.如段落1-18中任一者的肽，其中该肽抑制TFPI活性且以小于10μM的解离常数与TFPI 1-α结合。
20.如段落1-19中任一者的肽，其中该肽与聚乙二醇(PEG)部分结合。
21.如段落1-20中任一者的肽，其中该肽与人类血清白蛋白(HSA)、抗体或其片段、羟乙基淀粉、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸多聚体(PAS化)、C12-C18脂肪酸或聚唾液酸(polysialic acid)结合。
22.如段落1-21中任一者的肽，其中该肽与选自由以下者所组成的群组的部分结合：光敏剂、染料、萤光染料、放射性核种、含有放射性核种的错合物、酶、毒素、抗体或其片段、及细胞毒性剂。
23.一种用于治疗个体的方法中的如段落1-22中任一者的肽。
24.如段落24的肽，其中该方法系用于治疗凝血病症。
25.一种如段落1-22中任一者的肽的用途，其系用于制造医药品。
26.一种如段落1-22中任一者的肽的用途，其系用于制造用以治疗凝血病症的医药品。
27.一种医药组成物，其包含如段落1-22中任一者的肽及医药学上可接受的载剂。
28.如段落28的医药组成物，其中该组成物包含另一医药学上有效的药剂。
29.如段落27或段落28的医药组成物，其中该医药组成物系用于治疗凝血病症的方法中。
30.一种靶向呈现TFPI的细胞的方法，该方法包含使该细胞与如段落1-22中任一者的肽接触。
31.如段落30的方法，其中该细胞处于哺乳动物中，且接触该细胞包含向该哺乳动物投予该肽。
32.如段落30或段落31的方法，其进一步包含侦测肽与呈现于该细胞上的TFPI的结合。
33.如段落32的方法，其中肽-TFPI结合系藉由侦测与该肽结合且选自由以下者所组成的群组的部分来侦测：光敏剂、染料、萤光染料、放射性核种、含有放射性核种的错合物、酶、毒素、抗体及细胞毒性剂。
34.如段落32或段落33的方法，其中肽-TFPI结合系藉由侦测与该肽错合的相互作用搭配物或与该肽结合的部分来侦测。
35.如段落34的方法，其中该相互作用搭配物系选自由以下者所组成的群组：抗体或其片段、抗运载蛋白(anticalin)、适体、抗生蛋白链菌素(streptavidin)、抗生物素蛋白(avidin)、中性链亲和素(neutravidin)及镜像体(spiegelmer)。
36.如段落34或段落35的方法，其中该相互作用搭配物包含侦测部分。
37.如段落36的方法，其中该侦测部分系选自由以下者所组成的群组：染料、萤光染料、放射性核种、含有放射性核种的错合物、及酶。
38.一种治疗罹患疾病或处于罹患疾病的风险中的个体的方法，该方法包含向该个体投予如段落1-22中任一者的肽，其中该肽与治疗剂结合。
39.一种治疗罹患疾病或处于罹患疾病的风险中的个体的方法，该方法包含向该个体投予如段落1-22中任一者的肽，及向该个体投予(a)结合该肽且(b)为治疗剂或与治疗剂结合的相互作用搭配物。
40.如段落39的方法，其中该治疗剂系选自由以下者所组成的群组：光敏剂、放射性核种、含有放射性核种的错合物、酶、毒素、抗体或其片段、及细胞毒性剂。
41.如段落39或段落40的方法，其中该相互作用搭配物系选自由以下者所组成的群组：抗体或其片段、抗运载蛋白、适体、抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白、中性链亲和素及镜像体。
42.一种诊断罹患疾病或处于罹患疾病的风险中的个体的方法，其包含(a)向该个体投予与可侦测部分结合的如段落1-22中任一者的肽及(b)侦测该可侦测部分。
43.一种诊断罹患疾病或处于罹患疾病的风险中的个体的方法，其包含(a)向该个体投予如段落1-22中任一者的肽，(b)向该个体投予与可侦测部分结合的相互作用搭配物，及(c)侦测该可侦测部分。
44.如段落43的方法，其中该相互作用搭配物系选自由以下者所组成的群组：抗体或其片段、抗运载蛋白、适体、抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白、中性链亲和素及镜像体。
45.如段落42-44中任一者的方法，其中该可侦测部分系选自由以下者所组成的群组：染料、萤光染料、放射性核种、含有放射性核种的错合物、酶、及抗体或其片段。
46.如段落38-45中任一者的方法，其中该疾病为凝血病症。
47.一种纯化TFPI的方法，其中该方法包含a)使含有TFPI的样本与如段落1-22中任一者的肽在适合于TFPI与该肽之间形成错合物的条件下接触；b)自该样本移出该错合物；及视情况而定，c)解离该错合物以释放TFPI。
48.如段落47的方法，其中该肽经固定于支撑物上。
49.如段落48的方法，其中该肽经固定于层析固定相上，且步骤(c)包含洗提与该经固定的肽结合的TFPI。
50.如段落48或段落49的方法，其中TFPI系经由亲和力层析法来纯化。
51.一种鉴别TFPI结合化合物的方法，该方法包含(a)使包含TFPI库尼兹域1(KD1)的肽与如段落1-22中任一者的TFPI结合肽及测试化合物在允许形成KD1-TFPI结合肽错合物的条件下接触，(b)量测步骤(a)中所形成的KD1-TFPI结合肽错合物，及(c)比较在该测试化合物存在下形成的KD1-TFPI结合肽错合物的数量与在不存在该测试化合物下形成的KD1-TFPI结合肽错合物的数量，其中相较于在不存在该测试化合物下形成的KD1-TFPI结合肽错合物的数量，在该测试化合物存在下形成的KD1-TFPI结合肽错合物的数量降低指示该测试化合物为TFPI结合化合物。
52.如段落51的方法，其中该TFPI结合肽包含会产生信号的标记；步骤(b)包含量测由KD1-TFPI结合肽错合物产生的信号；且步骤(c)包含比较步骤(b)中所量测的信号与由在不存在该测试化合物下形成的KD1-TFPI结合肽错合物产生的信号，其中相较于由在不存在该测试化合物下形成的KD1-TFPI结合肽错合物产生的信号，由在该测试化合物存在下形成的KD1-TFPI结合肽错合物产生的信号降低指示该测试化合物为TFPI结合化合物。
53.如段落51或段落52的方法，其中步骤(a)包含(a1)使该包含KD1的肽与该TFPI结合肽在允许形成KD1-肽错合物的条件下接触，及(a2)使步骤(a1)中所形成的KD1-TFPI结合肽错合物与该测试化合物接触。
54.一种鉴别TFPI结合化合物的方法，该方法包含(a)使包含TFPI库尼兹域1(KD1)的肽与测试化合物接触，及(b)侦测该测试化合物与由对应于人类TFPI残基Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55的KD1氨基酸残基界定的TFPI结合位点的结合。
55.如段落54的方法，其中该结合位点系由对应于人类TFPI残基Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ile38、Ile46、Phe47及Ile55的氨基酸残基界定。
56.如段落54或段落55的方法，其中该结合位点系由对应于人类TFPI残基Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47及Ile55的氨基酸残基界定。
57.如段落54-56中任一者的方法，其中步骤(b)包含确定该TFPI结合位点内存在或不存在核磁共振(NMR)化学位移。
58.如段落54-56中任一者的方法，其中步骤(a)包含在测试化合物存在下使该包含TFPI KD1的肽与FVIIa在允许KD1与FVIIa结合的条件下接触，且步骤(b)包含比较步骤(a)中的KD1-FVIIa结合与在不存在该测试化合物下的KD1-FVIIa结合，其中相较于在不存在该测试化合物下的KD1-FVIIa结合，在该测试化合物存在下的KD1-FVIIa结合减少指示该测试化合物为TFPI结合化合物。
59.如段落54-56中任一者的方法，其中步骤(a)包含在测试化合物存在下使该包含TFPI KD1的肽与FXa在允许KD1与FXa结合的条件下接触，且步骤(b)包含比较步骤(a)中的KD1-FXa结合与在不存在该测试化合物下的KD1-FXa结合，其中相较于在不存在该测试化合物下的KD1-FXa结合，在该测试化合物存在下的KD1-FXa结合减少指示该测试化合物为TFPI结合化合物。
60.如段落54-56中任一者的方法，其中该包含TFPI KD1的肽进一步包含库尼兹域2(KD2)，步骤(a)包含在测试化合物存在下使该包含TFPI KD1及TFPI KD2的肽与FXa在允许KD2与FXa结合的条件下接触，且步骤(b)包含比较步骤(a)中的KD2-FXa结合与在不存在该测试化合物下的KD2-FXa结合，其中相较于在不存在该测试化合物下的KD2-FXa结合，在该测试化合物存在下的KD2-FXa结合减少指示该测试化合物为TFPI结合化合物。
61.如段落54-56及58-60中任一者的方法，其中该测试化合物与该TFPI结合位点的结合系使用酶促检定来侦测。
62.如段落54-61中任一者的方法，其中该包含TFPI KD1的肽包含人类TFPI的氨基酸1-160。
63.如段落54-61中任一者的方法，其中该包含TFPI KD1的肽为全长人类TFPI。
64.一种组成物，其包含藉由如段落51-63中任一者的方法鉴别的TFPI抑制剂。
65.一种藉由如段落51-63中任一者的方法鉴别的TFPI抑制剂的用途，其系用于制造医药品。
66.一种藉由如段落51-63中任一者的方法鉴别的TFPI抑制剂的用途，其系用于制造用以治疗凝血病症的医药品。
67.一种治疗罹患疾病或处于罹患疾病的风险中的个体的方法，该方法包含向该个体投予藉由如段落51-63中任一者的方法鉴别的TFPI抑制剂。
68.一种抑制人类TFPI的方法，该方法包含使人类TFPI与在由氨基酸残基Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55界定的结合位点处结合人类TFPI的抑制剂接触。
69.一种治疗罹患疾病或处于罹患疾病的风险中的个体的方法，该方法包含向该个体投予在由氨基酸残基Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55界定的结合位点处结合人类TFPI的抑制剂。
70.如段落68或段落69的方法，其中该人类TFPI结合位点系由氨基酸残基Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ile38、Ile46、Phe47及Ile55界定。
71.如段落70的方法，其中该人类TFPI结合位点系由氨基酸残基Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47及Ile55界定。
72.一种纯化抑制FXa活性的化合物的方法，该方法包含(a)使包含TFPI库尼兹域1(KD1)的肽与化合物在允许形成化合物-KD1错合物的条件下接触，(b)移出未结合的化合物，及(c)解离该等化合物-KD1错合物以释放该化合物。
73.如段落72的方法，其中步骤(a)包含使该包含KD1的肽与一群测试化合物接触。
74.一种电脑储存媒体，其具有电脑可执行指令，该等指令当在电脑的处理器上执行时实施一种模型化TFPI库尼兹域1(KD1)蛋白中的所选三维(3D)点与测试化合物之间的相互作用的方法，该方法包含：获得该TFPI KD1蛋白的蛋白质结构3D模型；确定该蛋白质结构中的所选子集的氨基酸之间的3D关系，其中该所选氨基酸子集包含Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55；模型化由该所选氨基酸子集界定的表面；获得测试化合物的测试化合物3D模型；匹配该测试化合物3D模型与由该所选氨基酸子集界定的表面；及鉴别该表面的所选氨基酸子集与该测试化合物3D模型之间的接触点。
75.如段落74的电脑储存媒体，其中该所选氨基酸子集包含Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ile38、Ile46、Phe47及Ile55。
76.如段落74的电脑储存媒体，其中该所选氨基酸子集包含Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47及Ile55。
77.如段落74-76中任一者的电脑储存媒体，其进一步包含：确定该表面与该测试化合物3D模型之间的接触点的数目；及记录该测试化合物3D模型的对应于该接触点数目的亲和力等级。
78.如段落74-77中任一者的电脑储存媒体，其中该测试化合物为肽。
79.如段落74-78中任一者的电脑储存媒体，其进一步包含：确定该表面与该测试化合物3D模型之间的各接触点的结合型式(bond type)；及基于该表面与该测试化合物3D模型之间的各接触点的结合型式的集合更新该亲和力等级。
80.如段落74-79中任一者的电脑储存媒体，其进一步包含：获得基于第二测试化合物的更新的测试化合物3D模型；匹配该更新的测试化合物3D模型与由该所选氨基酸子集界定的表面；及在该电脑的显示器上鉴别该表面的所选氨基酸子集与该更新的测试化合物3D模型之间的该等经鉴别的接触点。
81.如段落80的电脑储存媒体，其进一步包含：确定该表面与该更新的测试化合物3D模型之间的该等接触点的数目；确定该表面与该更新的测试化合物3D模型之间的各接触点的结合型式；及基于该接触点数目及该表面与该更新的测试化合物3D模型之间的各接触点的结合型式的集合记录新亲和力等级。
82.如段落81的电脑储存媒体，其进一步包含：比较该更新的亲和力等级与该新亲和力等级以确定该测试化合物或该第二测试化合物是否具有较高亲和力等级。
83.如段落80-82中任一者的电脑储存媒体，其中该第二测试化合物为该测试化合物的变异体。
84.如段落74-83中任一者的电脑储存媒体，其进一步包含在该电脑的显示器上显示该等接触点。
85.如段落78-84中任一者的电脑储存媒体，其进一步包含修饰该肽以增加与该所选氨基酸子集的接触点数目或增加该肽的氨基酸与该所选氨基酸子集之间的结合强度(bond strength)。
86.一种比较测试化合物与TFPI库尼兹域1(KD1)蛋白中的所选三维点的方法，该方法包含：在电脑的记忆体中产生该KD1蛋白的蛋白质结构；在该电脑的处理器处确定该KD1蛋白中的所选氨基酸子集的三维模型，其中该所选氨基酸子集包含Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55；在该电脑的处理器处确定测试化合物的三维模型；在该电脑的处理器处将该测试化合物的3D模型与该所选氨基酸子集的3D模型拟合；及在该电脑的处理器处产生该测试化合物对该所选氨基酸子集的亲和力，其中该亲和力系基于该子集中与该测试化合物接触的氨基酸的数目及各接触点处的结合强度。
87.如段落86的方法，其中该所选氨基酸子集包含Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ile38、Ile46、Phe47及Ile55。
88.如段落86的方法，其中该所选氨基酸子集包含Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47及Ile55。
89.如段落86-88中任一者的方法，其进一步包含：显示该测试化合物与该所选氨基酸子集的3D模型之间的拟合的3D图像。
90.如段落86-89中任一者的方法，其进一步包含：对复数种测试化合物重复如段落86的步骤；及储存该复数种测试化合物各自的各别亲和力。
91.一种电脑储存媒体，其具有电脑可执行指令，该等指令当在电脑的处理器上执行时实施一种比较肽与TFPI库尼兹域1(KD1)蛋白中的所选三维点(3D)的方法，该方法包含：产生该KD1蛋白的蛋白质结构；确定该KD1蛋白中的所选氨基酸子集的三维模型，其中该氨基酸子集包含Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55；确定肽的三维模型；将该肽的3D模型与该所选氨基酸子集的3D模型拟合；及产生该肽对该所选氨基酸子集的亲和力，其中该亲和力系基于该子集中与该肽接触的氨基酸的数目及各接触点处的结合强度。
92.如段落91的电脑储存媒体，其中该所选氨基酸子集包含Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ile38、Ile46、Phe47及Ile55。
93.如段落91的电脑储存媒体，其中该所选氨基酸子集包含Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47及Ile55。
附图说明
图1为凝血级联的图解。
图2为组织因子路径抑制剂-1的二级结构的图解。
图3为包含组织因子、因子Xa(FXa)、因子VIIa(FVIIa)及TFPI的四级错合物的形成的图解。
图4为各种TFPI抑制肽的氨基酸序列列表，其以肽JBT0293为参照指出氨基酸取代(粗体且加下划线)。
图5为TFPI抑制肽的mRNA呈现选择的图解。
图6A为EC50结合ELISA的图解且图6B为实施例1中所述的IC50ELISA的图解。
图7为经生物素标记的肽JBT0132的结合ELISA曲线，其比较OD％(y轴)与浓度[nM](x轴)。
图8A-8D为本发明的例示性肽的竞争ELISA曲线，其比较OD％(y轴)与浓度[nM](x轴)。
图9A及9B为肽JBT0120及JBT0132的感测器图谱，其绘示RU(y轴)与时间(以秒计)(x轴)的关系。
图10A及10B为肽JBT0120与组织因子路径抑制剂-1及组织因子路径抑制剂-2的相互作用的感测器图谱，其绘示RU(y轴)与时间(以秒计)(x轴)的关系。
图11A及11B为比较基于血浆的检定中肽JBT0120及肽JBT0132的所产生凝血酶量(nM)(y轴)与时间(以分钟计)(x轴)的图。
图12-18为列出各种TFPI抑制肽的氨基酸序列、FXa抑制检定中观测的EC50及TFPI的抑制百分比、外在因子X酶抑制检定中观测的EC50及TFPI的抑制百分比、以及基于血浆的检定中的FEIBA、因子VIII(FVIII)Immunate或因子IX(FIX)等效活性(mU/mL)的表。「*」表示阴性对照。
图19-21为列出关于若干TFPI结合肽的BIAcore分析结果的表。「*」表示阴性对照。
图22-30为列出各种TFPI结合肽的氨基酸序列、FXa抑制检定中观测的EC50及TFPI的抑制百分比、外在因子X酶抑制检定中观测的EC50及TFPI的抑制百分比、以及基于血浆的检定中的FEIBA、FVIII Immunate或FIX等效活性(mU/mL)的表。「*」表示阴性对照。
图31为比较聚乙二醇化TFPI结合肽的药物动力学特性(肽的浓度(y轴)对比投药后的时间(x轴))与缺乏PEG的相同肽的药物动力学特性的图。以10mg/kg的剂量向C57Bl6小鼠静脉内投予该等肽。分析3个生物样本中在各时间点时的肽的存在。
图32-39为列出本发明的各种肽的氨基酸序列及IC50或EC50值的表。「*」表示阴性对照。
图40为说明在以10mg/kg的剂量向小鼠皮下投药之后，聚乙二醇化TFPI结合肽的药物动力学特性(肽的浓度(nM)(y轴)对比投药后的时间(分钟)(x轴))的图。
图41为显示肽JBT1855在A型血友病患者血浆的基于血浆的检定中的所产生凝血酶量(nM)(y轴)与时间(分钟)(x轴)的关系的图。
图42为说明经JBT-1855(静脉内或皮下投药)、抗TFPI抗体(静脉内投药)或媒剂(静脉内投药)(x轴)处理的小鼠中在爪甲修剪之后观测的失血量(μl；y轴)的图。
图43为绘示TFPI160氨基酸残基(x轴)与自由TFPI160及与JBT0303结合的TFPI160的HSQC信号的化学位移差异(y轴)的关系的图。
图44为TFPI的二级结构的带状模型，其说明相较于未错合(自由)的TFPI160，当TFPI160与JBT0303错合时，HSQC信号的化学位移变化的区域。
图45为绘示TFPI160氨基酸残基(x轴)与自由TFPI160及与JBT0122结合的TFPI160的HSQC信号的化学位移差异(y轴)的关系的图。
图46为TFPI蛋白的二级结构的带状模型，其说明相较于未错合(自由)的TFPI160，当TFPI160与JBT0122错合时，HSQC信号的化学位移变化的区域。
图47为列出JBT0788的羰基碳(C)、α碳(CA)、β碳(CB)、酰胺质子(H)及酰胺氮(N)基于HSQC、HNCACB、HNCA、HNCO及HNN光谱的赋值的表。
图48为自由JBT0788的二级结构的带状模型。
图49为列出与TFPI160错合的JBT0788的羰基碳(C)、α碳(CA)、β碳(CB)、酰胺质子(H)及酰胺氮(N)基于HSQC、HNCACB、HNCA、HCCOCA及HNCO光谱的赋值的表。
图50为JBT0788当与TFPI160错合时的二级结构的带状模型。
图51为列出JBT0616的羰基碳(C)、α碳(CA)、β碳(CB)、酰胺质子(H)及酰胺氮(N)基于HSQC、HNCACB及HNN光谱的赋值的表。
图52为自由JBT0616的二级结构的带状模型。
图53为列出与TFPI错合的JBT0616的羰基碳(C)、α碳(CA)、β碳(CB)、酰胺质子(H)及酰胺氮(N)基于HSQC、HNCO、HNCA及HNCOCA光谱的赋值的表。
图54为JBT0616当与TFPI160错合时的二级结构的带状模型。
图55为与JBT0303的错合物中的KD1(残基22-79)的能量最小化最佳模型的带状结构，其中经提出驱动蛋白质-蛋白质相互作用的残基以棒形式显示。用斜体表示且加下划线的残基属于JBT0303；其余残基属于TFPI的KD1。
图56为显示JBT2317的样本弹性(mm)与时间(秒(s))的关系的旋转凝血弹性描记图(rotational thromboelastogram)。
图57为显示JBT2329的样本弹性(mm)与时间(秒(s))的关系的旋转凝血弹性描记图。
图58为计算装置的图解。
图59为KD1蛋白的三维(3D)模型的图解。
图60为TFPI结合肽的3D模型的图解。
图61为模型化蛋白质与肽的相互作用的方法的图解。
图62为列出本发明的各种肽的氨基酸序列及IC50或EC50值的表。符号「n.a.」为「未分析出(not analyzed)」。使用实施例3中所描述的FXa抑制检定以及重组人类全长TFPI获得进展曲线资料。进展曲线检定的检定浓度为0.0025％(于肽稀释缓冲液中使用的0.1％吐温80)。
图63为显示肽JBT2325-JBT2329的浓度(nM)(y轴)与静脉内投药后的时间(小时)(x轴)的关系的图。包含较高重量PEG部分的肽在小鼠中展现延长的活体内半衰期。各时间点皆由藉由ELISA定量的3个独立样本的平均值表示。
图64A-64C为显示肽JBT2401、JBT2404及JBT2410的浓度(nM)(y轴)与静脉内投药后的时间(小时)(x轴)的关系的图。各时间点皆由藉由ELISA定量的3个独立样本的平均值表示。实心圆圈代表静脉内资料，实心三角代表皮下资料。
图65为列出本发明的各种肽的氨基酸序列的表。
具体实施方式
【发明细节描述】
本发明提供结合组织因子路径抑制剂-1且在一些情况下阻断凝血级联内的组织因子路径抑制剂-1(在本文中称为TFPI)的抑制活性的肽。在血管损伤后，组织因子(TF)与因子Vlla错合以形成「外在错合物」或「外在因子X酶(tenase)错合物」，其可活化因子IX及X(图1)。TFPI为TF/FVIIa外在错合物活性的主要天然调控剂，且广义而言，其在控制凝血酶产生方面起作用(Panteleev等人，Eur.J.Biochem.，249，2016-2031(2002))。TFPI为一种包含3个库尼兹型抑制域的43kDa丝氨酸蛋白酶抑制剂(图2)。TFPI的库尼兹域1结合FVIIa且库尼兹域2结合FXa，从而使抑制剂能够形成四级FXa-TFPI-FVIIa-TF错合物，其可阻断TF/FVIIa外在错合物的活性(图3)。TFPI与FXa结合亦会下调凝血级联的共用路径，在此期间，FXa将凝血酶原转化成凝血酶(Audu等人，Anesth.Analg.，103(4)，841-845(2006))。本发明提供例如阻断TFPI对凝血级联的抑制作用，藉此增强凝血酶形成的TFPI抑制肽。
本文提供若干TFPI结合肽的氨基酸序列。习知氨基酸系根据其如表1中所述的标准1字母或3字母码加以鉴别。
表1
非习知氨基酸及其他肽构筑嵌段的实例系根据见于表2中的3字母码(Ttds及多巴除外，其为常见4字母缩写)加以鉴别。由含3、4或7个数字/字母的名称或缩写表示的其他构筑嵌段亦列于表2中。一些构筑嵌段的结构经展示有用于将构筑嵌段引入肽中的例示性试剂(例如关于2-萘基磺酰基提供的结构包含氯化物)。
表2
Figure BPA00001610528800281
Figure BPA00001610528800291
Figure BPA00001610528800301
Figure BPA00001610528800311
Figure BPA00001610528800321
Figure BPA00001610528800331
Figure BPA00001610528800341
Figure BPA00001610528800351
Figure BPA00001610528800361
Figure BPA00001610528800371
Figure BPA00001610528800381
Figure BPA00001610528800391
Figure BPA00001610528800401
本文提供的肽的氨基酸序列系以如将由一般技术者所了解的典型肽序列格式展示。举例而言，习知氨基酸的3字母码或1字母码或其他构筑嵌段的3、4或7数字/字母码指示在肽序列内的指定位置处存在该氨基酸或构筑嵌段。各非习知氨基酸或构筑嵌段的代码以连字符与序列中的下一及/或前一氨基酸或构筑嵌段的代码连接。邻近氨基酸以化学键(典型地为酰胺键)连接。当化学键位于邻近氨基酸左侧时(例如Hle-邻近氨基酸)，该化学键的形成自氨基酸的1-羧基移除羟基，且当化学键位于邻近氨基酸右侧时(例如邻近氨基酸-Hle)，该化学键的形成自氨基酸的胺基移除氢。应了解，两种修饰可适用于同一氨基酸且适用于存在于氨基酸序列中未以连字符明确示出的邻近习知氨基酸。当氨基酸在氨基酸侧链中含有1个以上胺基及/或羧基时，2-胺基或3-胺基及/或1-羧基通常用于形成肽键。对于非习知氨基酸，使用3字母码，其中第一字母指示C-α-原子的立体化学。举例而言，大写第一字母指示L型氨基酸存在于肽序列中，而小写第一字母指示D型相应氨基酸存在于肽序列中。当使用1字母码时，小写字母表示D-氨基酸，而大写字母表示L-氨基酸。除非有相反指示，否则氨基酸序列系以N端至C端方向呈现于本文中。
本文所述的若干TFPI结合肽序列的C端系藉由包括OH、NH2或经由连字符与C端氨基酸码连接的特定端接胺的缩写来明确示出。本文所述的若干肽的N端系藉由包括氢(对于自由N端而言)或经由连字符与N端氨基酸码连接的特定端接羧酸或其他化学基团的缩写来明确示出。
本发明提供包含氨基酸序列X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21(SEQ ID NO：3109)的肽，其中(使用氨基酸的单字母码)：
X7系选自由以下者所组成的群组：L、P、K、S、W、V、N及Q；
X8系选自由以下者所组成的群组：L、R、N、F及I；
X9系选自由以下者所组成的群组：Y、V、P及C；
X10系选自由以下者所组成的群组：F、L及G；
X11系选自由以下者所组成的群组：L、W、V、A、M、T及S；
X12系选自由以下者所组成的群组：T、F、V、R、A、D、L、E、S及Y；
X13系选自由以下者所组成的群组：I、M、G、Q、D及R；
X14系选自由以下者所组成的群组：G、W、Y、L、M及H；
X15系选自由以下者所组成的群组：N、P、F、H、K及Y；
X16系选自由以下者所组成的群组：M、D、E、V、G及K；
X17系选自由以下者所组成的群组：G、I、R、S、T及L；
X18系选自由以下者所组成的群组：M、K、L及I；
X19系选自由以下者所组成的群组：Y、G、R及S；
X20系选自由以下者所组成的群组：A、E、S、C及Y；且
X21系选自由以下者所组成的群组：A、V、K及E。
除上述核心结构X7-X21的外，特定涵盖的其他结构为一或多个其他氨基酸与核心结构连接(例如与氨基酸序列X7-X21的N端或C端连接)的结构。因此，本发明包括包含核心结构且进一步包含一或多个N端氨基酸的肽，该一或多个N端氨基酸包含选自由以下者所组成的群组的氨基酸序列：
X6，
X5X6，
X4X5X6，
X3X4X5X6(SEQ ID NO：3110)，
X2X3X4X5X6(SEQ ID NO：3111)，及
X1X2X3X4X5X6(SEQ ID NO：3112)；
其中X6直接与核心结构氨基酸序列的X7连接，且
X1系选自由以下者所组成的群组：T及G；
X2系选自由以下者所组成的群组：F及V；
X3系选自由以下者所组成的群组：V、W、Y及F；
X4系选自由以下者所组成的群组：D、Q及S；
X5系选自由以下者所组成的群组：E、T、N及S；且
X6系选自由以下者所组成的群组：R、H、K及A。
在一态样中，本发明的肽包含氨基酸序列QSKKNVFVFGYFERLRAK(SEQ ID NO：1)或由该氨基酸序列组成。
在另一具体实例中，包含核心结构的本发明的肽包含一或多个C端氨基酸，其包含选自由以下者所组成的群组的氨基酸序列：
X22，
X22X23，
X22X23X24，
X22X23X24X25(SEQ ID NO：3113)，
X22X23X24X25X26(SEQ ID NO：3114)，及
X22X23X24X25X26X27(SEQ ID NO：3115)，
其中X22直接与核心结构氨基酸序列的X21连接，且
X22系选自由以下者所组成的群组：Q、I、E、W、R、L及N；
X23系选自由以下者所组成的群组：L、V、M及R；
X24系选自由以下者所组成的群组：K、L、A及Y；
X25为F；
X26为G；且
X27为T。
在一态样中，本发明的肽包含氨基酸序列VIVFTFRHNKLIGYERRY(SEQID NO：4)或由该氨基酸序列组成。亦预期本发明的肽在核心结构的N端与C端两者处包含其他氨基酸。在此态样中，该肽包含氨基酸序列TFVDERLLYFLTIGNMGMYAAQLKF(SEQ ID NO：3)、GVWQTHPRYFWTMWPDIKGEVIVLFGT(SEQ ID NO：5)、KWFCGMRDMKGTMSCVWVKF(SEQ ID NO：6)或ASFPLAVQLHVSKRSKEMA(SEQ ID NO：7)或由该氨基酸序列组成。
本发明另外包括包含氨基酸序列X3X4X5-F-X7-NVF-X11X12-GY-X15X16-RLRAK-X22(SEQ ID NO：2)的肽，其中X3为Y或F；X4为Q或S；X5为N或S；X7为K、N或Q；X11为V、A、S或T；X12为F、A、D、L、Q、S或Y；X15为F、K或Y；X16为E或D；且X22为L或N。
此外，本发明提供结合TFPI的肽，其中该肽包含式(I)结构：X1001-X1002-X1003-X1004-X1005-X1006-X1007-X1008-X1009-X1010-X1011-X1012-X1013-X1014-X1015-X1016-X1017-X1018-X1019-X1020(SEQ ID NO：3116)。在式(I)中，
X1001为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Bhf、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Nmf、Q、R、T、V、W及Y；
X1002为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：G、K及Q；
X1003为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、Bhs、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；
X1004为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、Bhk、C、D、E、F、G、H、I、K、k、L、M、N、Nmk、P、Q、R、S、T、V、W及Y；
X1005为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：a、A、Aib、Bal、C、D、d、E、F、G、H、K、k、L、M、N、Nmg、p、Q、R、S、T、V、W及Y；
X1006为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、Btq、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S T、V、W及Y；
X1007为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、F、G、I、K、L、Nmv、P、Q、S、V、W及Y；
X1008为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、H、K、W及Y；
X1009为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、f、I、K、S、T及V；
X1010为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Nmf、P、Q、R、S、T、V、W及Y；
X1011为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Aib、C、K、G及Nmg；
X1012为Y；
X1013为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、C、E、F、G、H、K、L、M、Q、R、W及Y；
X1014为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、Bhe、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；
X1015为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：(ω-甲基)-R、D、E、K及R；
X1016为L；
X1017为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：(ω-甲基)-R、A、Aib、Bhr、C、Cha、Cit、D、Dab、Dap、E、Eag、Eew、F、G、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、N、Nle、Nva、Opa、Orn、Q、R、S、T、V、W及Y；
X1018为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Bal、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；且
X1019为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Bhk、K、R及V。
X1020存在或不存在于式(I)中(亦即在一些情况下，本发明的肽包含结构X1001-X1002-X1003-X1004-X1005-X1006-X1007-X1008-X1010-X1011-X1012-X1013-X1014-X1015-X1016-X1017-X1018-X1019(SEQ ID NO：3116))。当X1020存在时，其为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Aib、Bhl、C、F、G、H、I、K、L、Nml、Q、R、S、T、V、W及Y。
举例而言，本发明的肽包含式(I)结构，其中X1001为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、F、I、K、L、Nmf、V、M、W及Y；X1002为Q；X1003为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、E、H、K、M、I、N、Q、R、S、T及V；X1004为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、C、D、E、G、H、F、I、K、k、L、M、N、Nmk、P、Q、R、S、V、W及Y；X1005为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：a、A、Aib、Bal、C、d、E、D、F、G、H、K、k、L、M、N、Nmg、p、Q、R、S、T及Y；X1006为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Btq、C、D、G、I、K、H、L、M、N、Q、R、S、V及Y；X1007为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：I、K、L、Q、V及Y；X1008为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、H及Y；X1009为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：f、I及V；X1010为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X1011为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：G及Nmg；X1012为Y；X1013为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Aib、C、F、H、L、W及Y；X1014为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、Bhe、C、D、E、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X1015为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：E及R；X1016为L；X1017为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：(ω-甲基)-R、A、Aib、Bhr、C、Cha、Cit、Dab、Dap、Eag、Eew、F、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、N、Nle、Nva、Opa、Orn、R、S、T、V及Y；X1018为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、E、F、I、K、L、M、N、Q、R、V及W；X1019为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：K及R；且X1020为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Aib、Bhl、F、K、L、R及W(当X1020存在于肽中时)。
在一态样中，本发明的肽包含式(I)结构，其中X1001为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、L、Y及M；X1002为Q；X1003为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：M、Q、R、S、T及C；X1004为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Aib、K、L、P、R、E、G、I、Y、M及W；X1005为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：a、Aib、D、d、G、H、K、k、N、Nmg、p、Q、R、A、E、C及M；X1006为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、G、H、K、N、Q、R、S及M；X1007为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：I及V；X1008为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、H及Y；X1009为V；X1010为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、E、K、M、N、Q、R、F、H、P、S、V、W及Y；X1011为G；X1012为Y；X1013为C或F；X1014为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、E、K、L、M、N、Q、R、T、V及Aib；X1015为R；X1016为L；X1017为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、C、Cha、Dab、Dap、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、K、Nle、Nva、Opa、Orn、R、I、L、S及M；X1018为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、L、N、M及R；X1019为K；且X1020为K或L。
当氨基酸X1020不存在于式(I)中时，在一态样中，本发明的肽另外在式(I)的N端处包含氨基酸X1000，以至于该肽包含以下式(II)结构或由以下式(II)结构组成：X1000-X1001-X1002-X1003-X1004-X1005-X1006-X1007-X1008-X1009-X1010-X1011-X1012-X1013-X1014-X1015-X1016-X1017-X1018-X1019(II)(SEQ IDNO：3122)。当X1000存在于肽中时，X1000为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、E及P，而X1001-X1019的氨基酸系如上所定义。
在另一态样中，本发明的TFPI结合肽包含式(III)结构：X1001-Q-X1003-X1004-X1005-X1006-I/V-X1008-V-X1010-G-Y-C/F-X1014-R-L-X1017-X1018-K-K/L(III)(SEQ ID NO：3117)。如本文所用，用「/」分隔的氨基酸名称系指在指定位置处的替代氨基酸残基。举例而言，关于式(III)，在位置7处的氨基酸残基为异白氨酸或缬氨酸。式(III)中的X1001、X1003、X1004、X1005、X1006、X1008、X1010、X1014、X1017及X1018各自独立地选自任何氨基酸。举例而言，在式(III)中，
X1001视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Bhf、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Nmf、Q、R、T、V、W及Y，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、F、I、K、L、Nmf、V、M、W及Y(例如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、L、Y及M)；
X1003视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、Bhs、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、E、H、K、M、I、N、Q、R、S、T及V(例如氨基酸为M、Q、R、S、T或C)；
X1004视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、Bhk、C、D、E、F、G、H、I、K、k、L、M、N、Nmk、P、Q、R、S、T、V、W及Y，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、C、D、E、G、H、F、I、K、k、L、M、N、Nmk、P、Q、R、S、V、W及Y(例如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Aib、K、L、P、R、E、G、I、Y、M及W)；
X1005视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：a、A、Aib、Bal、C、D、d、E、F、G、H、K、k、L、M、N、Nmg、p、Q、R、S、T、V、W及Y，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：a、A、Aib、Bal、C、d、E、D、F、G、H、K、k、L、M、N、Nmg、p、Q、R、S、T及Y(例如氨基酸为a、Aib、D、d、G、H、K、k、N、Nmg、p、Q、R、A、E、C或M)；
X1006视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、Btq、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Btq、C、D、G、I、K、H、L、M、N、Q、R、S、V及Y(例如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、G、H、K、N、Q、R、S及M)；
X1008视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、H、K、W及Y，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、H及Y；
X1010视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Nmf、P、Q、R、S、T、V、W及Y，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y(例如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、E、K、M、N、Q、R、F、H、P、S、V、W及Y)；
X1014视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、Bhe、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、Bhe、C、D、E、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y(例如A、C、D、E、K、L、M、N、Q、R、T、V或Aib)；
X1017视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：(ω-甲基)-R、A、Aib、Bhr、C、Cha、Cit、D、Dab、Dap、E、Eag、Eew、F、G、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、N、Nle、Nva、Opa、Orn、Q、R、S、T、V、W及Y，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：(ω-甲基)-R、A、Aib、Bhr、C、Cha、Cit、Dab、Dap、Eag、Eew、F、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、N、Nle、Nva、Opa、Orn、R、S、T、V及Y(例如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、C、Cha、Dab、Dap、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、K、Nle、Nva、Opa、Orn、R、I、L、S及M)；及/或
X1018视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Bal、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、E、F、I、K、L、M、N、Q、R、V及W(例如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、L、N、M及R)。
在一些具体实例中，本发明的肽包含一或多个与氨基酸序列的N端或C端连接的其他氨基酸残基。举例而言，在一些具体实例中，包含式(I)-式(III)中的任一者的结构的肽另外包含一或多个直接与X1001连接的N端氨基酸，其中该(等)N端氨基酸包含选自由以下者所组成的群组的氨基酸序列：
X1000，
X999-X1000，
X998-X999-X1000，
X997-X998-X999-X1000(SEQ ID NO：3123)，
X996-X997-X998-X999-X1000(SEQ ID NO：3124)，
X995-X996-X997-X998-X999-X1000(SEQ ID NO：3125)，
X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000(SEQ ID NO：3126)，
X993-X994-X995-X996-X997-X998-X999-X 1000(SEQ ID NO：3127)，
X992-X993-X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000(SEQ ID NO：3128)，
X991-X992-X993-X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000(SEQ ID NO：3129)，及
X990-X991-X992-X993-X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000(SEQID NO：3130)。
当肽包含一或多个N端氨基酸时，X1000为A或K；X999为V或K；X998为Q或K；X997为L或K；X996为R或K；X995为G或K；X994为V或K；X993为G或K；X992为S或K；X991为K；且X990为K。
除式(I)-式(III)中阐述的核心结构的外，特定涵盖的其他结构亦为一或多个其他氨基酸与直接与X1020连接的核心结构的C端连接的结构。举例而言，C端添加视情况包含选自由以下者所组成的群组的氨基酸序列：X1021、X1021-X1022、X1021-X1022-X1023及X1021-X1022-X1023-X1024(SEQ IDNO：3131)，其中X1021为T或K；X1022为S或K；且X1023及X1024为K。
本发明另外包括包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的TFPI结合肽：与氨基酸序列Ac-FQSK-Nmg-NVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2(式IV)(SEQ ID NO：164)的一致性为至少60％(例如一致性为至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％)的氨基酸序列。在一些情况下，该肽包含如本文所述的式(I)-式(III)中的任一者的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。本发明亦包括包含选自由SEQ ID NO：8-978所组成的群组的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的肽(例如包含选自由SEQID NO：8-741及962-972所组成的群组(诸如SEQ ID NO：8-741、962-968、971或972)及/或选自由742-961所组成的群组(诸如SEQ ID NO：744-961)及/或选自由SEQ ID NO：973-978所组成的群组的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的肽)。
本发明包括包含环状结构的肽。就此而言，本发明包括在肽内包含环状结构(例如一或多个藉由氨基酸(N端及C端氨基酸除外)之间的键联形成的环)的肽、包含藉由末端氨基酸与肽序列内的氨基酸相互作用而形成的环状结构的肽及头尾相接环化的肽。肽亦可为藉由围绕其他氨基酸或化学取代基而形成的较大环状结构的一部分。在一些情况下，本发明的肽包含分子内双硫键。在一些具体实例中，分子内双硫键系由半胱氨酸残基形成。亦提供包含由非半胱氨酸残基、或非半胱氨酸残基及半胱氨酸残基形成的环状结构的肽。举例而言，在一具体实例中，本发明的肽包含介导环化的至少1个非习知氨基酸或化学部分。适合非习知氨基酸或化学部分包括(但不限于)FA19205、FA19204、FA19203、FA03202、Hcy、hcy、Cea及c。负责环化的氨基酸或部分被充分隔开以允许形成环结构，例如氨基酸或部分由2、3、4、5、6、7、8或8个以上残基隔开。
在一态样中，包含式(I)-式(III)的结构的肽含有至少2个由至少3个氨基酸残基隔开以便半胱氨酸形成分子内双硫键的半胱氨酸残基(例如肽含有2个半胱氨酸残基)。在一些情况下，半胱氨酸由3个以上氨基酸残基隔开。举例而言，在包含式(I)、式(II)或式(III)的结构的肽中，X1000、X1001、X1003、X1004、X1005、X1006、X1010、X1011、X1013、X1014、X1017、X1018、X1020及X1021中的任何两者视情况为能够形成二硫桥键的半胱氨酸。因此，在一些态样中，肽含有2个半胱氨酸残基：X1000、X1005、X1010及X1014的一为半胱氨酸，且X1006、X1010、X1017及X1021的一为半胱氨酸。本发明涵盖所有可能的半胱氨酸对组合，例如X1000及X1006为C；X1000及X1010为C；X1000及X1017为C；X1005及X1017为C；X1010及X1017为C；X1010及X1021为C；或X1014及X1021为C。本发明的其他例示性环状肽包括例如JBT2441、JBT2450、JBT2466-JBT2469、JBT2489-JBT2495、JBT2497-JBT2499及JBT2513-JBT2518(分别为SEQ ID NO：4159、4167、4181-4184、4204-4210、4212-4214及4228-4233)。
本发明另外提供结合TFPI的肽，该肽包含式(V)结构：X2001-X2002-X2003-X2004-X2005-X2006-[X2007-X2008-X2009-X2010-X2011-X2012-X2013-X2014-X2015-X2016-X2017-X2018]-X2019-X2020-X2021-X2022-X2023(V)(SEQ ID NO：3118)，其中该肽形成藉由X2007与X2018之间的键联(例如双硫键)(在式(V)内以括号形式表示)产生的环状结构。在式(V)中，X2001、X2002及X2023独立地为存在或不存在。当存在时，X2001为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、E、F、G、H、I、K、L、P、R、S、T、V及W；X2002为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、R、S、T、V及W；且X2023为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V、W及Y。此外，
X2003为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、F、I、K、L、R、S、T、V、W及Y；
X2004为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V及W；
X2005为W；
X2006为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、H、I、K、L、R、V及W；
X2007为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、Hcy、Dap及K(例如C或Hcy)；
X2008为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、G、R、S及T；
X2009为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：a、A、I、K、L、M、m、Nle、p、R、Sem及V；
X2010为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、G、I、K、L、P、R、S、T及V；
X2011为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：D、E、G、S及T；
X2012为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、a、D、d、E、e、F、f、G、I、K、k、L、l、M、m、Nle、nle、P、p、R、r、S、s、Sem、T、t、V、v、W及w；
X2013为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、d、E、e、F、G、I、K、L、R、S、s、T、V及W；
X2014为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、M、R、S、T、V及W；
X2015为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、M、Nle、R、S、T、V及W；
X2016为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、E、F、I、K、L、M、Nle、R、S、Sem、T、V、W及Y；
X2017为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V、W及Y；
X2018为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C及D(例如X2018为C)；
X2019为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、F、I、L、S、T、V及W；
X2020为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F及W；
X2021为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：I、L及V；且
X2022为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、P、R、S、T、V及W。
在一些情况下，在包含式(V)结构的本发明的肽中，
X2001视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、F、G、H、K、L、P及S，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、F、G、H、K、L及S(当X2001存在时)；
X2002视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、F、G、H、K、L、P、R及S，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、F、H、K、L、M、R及S(例如H、F、M或R)(当X2002存在时)；
X2003视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、F、K、L、S及Y，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、S及Y(例如F或Y)；
X2004视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、F、G、K、L及S(例如K)；
X2005视情况为W；
X2006视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、H、K及L(例如F或H)；
X2007视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C及HcY(例如X2007为C)；
X2008视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、G及S；
X2009视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：a、A、K、L、V、M、m、Nle、Sem及p，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：M、Nle、p及V(例如M、Sem或V)；
X2010视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、G、K、L、P、R及S，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、K、L、P、R及S(例如K、P或R)；
X2011视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：D、G及S(例如D或S)；
X2012视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、a、D、d、F、f、G、K、k、L、l、M、m、Nle、P、S及s，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：D、d、F、f、G、K、k、L、l、M、Nle、P、S及Sem(例如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、L、l、Sem及M)；
X2013视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、d、F、G、K、L、S及s，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、F、G、K、L及S(例如D、G、K或S)；
X2014视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：D、F、G、K、L及S(例如D或G)；
X2015视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、F、G、I、K、L、M、Nle、S及T(例如I或T)；
X2016视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：D、F、K、L、M、Nle、S及Y，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：D、F、K、L、M、Nle、S、Sem及Y(例如D、F、M、Sem或Y)；
X2017视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、F、G、K、L、S、T及Y(例如S或T)；
X2018视情况为C；
X2019视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、F、L、S及V(例如A或V)；
X2020视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F及W(例如W)；
X2021视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：L及V(例如V)；
X2022视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、F、G、K、L、P、R、S及W，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、F、G、K、L、P、R、S及W(例如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、L、K、R、P及W)；且
X2023视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、F、G、K、L、M、S及Y，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、F、G、LM、S及Y(例如选自由以下者所组成的群组的氨基酸序列：A、D、F、M、S及Y)(当X2023存在时)。
本发明另外包括结合TFPI的肽，其中该肽包含式(VI)结构：X2001-X2002-F/Y-K-W-F/H-[C-X2008-M/V-X2010-D-X2012-X2013-G-I/T-X2016-S/T-C]-A/V-W-V-X2022-X2023(VI)(SEQ ID NO：3119)。在包含式(VI)结构的肽中，X2001、X2002及X2023各自独立地为存在或不存在。若X2001、X2002及/或X2023存在，则X2001、X2002及X2023中的任一者独立地选自任何氨基酸。此外，X2008、X2010、X2012、X2013、X2016及X2022各自独立地选自任何氨基酸。
在一些态样中，在式(VI)的肽中，
X2001视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、E、F、G、H、I、K、L、P、R、S、T、V及W，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、F、G、H、K、L、P及S(例如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、F、G、H、K、L及S)(当X2001存在时)；
X2002视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、R、S、T、V及W，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、F、G、H、K、L、M、P、R及S(例如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、F、H、K、L、M、R及S，诸如H、F、M或R)(当X2002存在时)；
X2008视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、G、R、S及T，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、G及S；
X2010视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、G、I、K、L、P、R、S、T及V，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、G、K、L、P、R及S(例如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、K、L、P、R及S，诸如K、P或R)；
X2012视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、a、D、d、E、e、F、f、G、I、I、K、k、L、l、M、m、Nle、nle、P、p、R、r、S、s、Sem、T、t、V、v、W及w，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、a、D、d、F、f、G、K、k、L、l、M、m、Nle、P、S、s及Sem(例如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：D、d、F、f、G、K、k、L、l、M、Nle、P、S及Sem，诸如F、L、l、Sem或M)；
X2013视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、d、E、e、F、G、I、K、L、R、S、s、T、V及W，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、d、F、G、K、L、S及s(例如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、F、G、K、L及S，诸如D、G、K或S)；
X2016视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、E、F、I、K、L、M、Nle、R、S、Sem、T、V、W及Y，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：D、F、K、L、M、Nle、S、Sem及Y(例如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：D、F、K、L、M、Nle、S及Sem，诸如F、Sem或M)；
X2022视情况为选自由以下对成的群的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、P、R、S、T、V及W，诸如选自由以下对成的群的氨基酸：A、D、F、G、K、L、P、R、S及W(例如选自由以下对成的群的氨基酸：A、F、G、K、L、P、R、S及W，诸如F、L、K、R、P或W)；及/或
X2023视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、R、M、S、T、V、W及Y，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、F、G、K、L、M、S及Y(例如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、D、F、G、L M、S及Y，诸如A、D、F、M、S或Y)(当X2023存在时)。
在一态样中，本发明的TFPI结合肽包含与式VII序列：Ac-FYYKWH[CGMRDMKGTMSC]AWVKF-NH2(VII)(SEQ ID NO：1040)的一致性为至少60％(例如一致性为至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％)的氨基酸序列。视情况而定，该肽包含如本文定义的式(V)-式(VII)的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。本发明亦包括包含选自由SEQ ID NO：1001-1293所组成的群组的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的肽(例如包含选自由SEQ ID NO：1001-1212及1290-1291所组成的群组(诸如SEQ ID NO：1001-120、1290或1291)及/或选自由SEQ ID NO：1213-1289所组成的群组及/或选自由1292及1293所组成的群组的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的肽)。
本发明另外提供TFPI结合肽，其至少包含式(VIII)结构：X3001-X3002-X3003-X3004-X3005-X3006-X3007-X3008-X3009-X3010-X3011-X3012-X3013-X3014-X3015-X3016-X3017-X3018-X3019-X3020-X3021(VIII)(SEQ ID NO：3120)的氨基酸3-21(X3003-X3021)。在式(VIII)中，X3001及X3002独立地存在或不存在于该肽中。若存在，则X3001为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、E、H及Y；且X3002为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、F、H、K、M、N、P、R、S、T、W、Y、G、I及L。此外，
X3003为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W及Y；
X3004为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y及P；
X3005为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W及Y；
X3006为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、W、C、K、P、R及H；
X3007为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Q、A、C、F、G、H、I、K、L、N、R、S、T、W及Y；
X3008为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y及I；
X3009为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、G、H、I、L、M、R、S、T、V、W、Y及K；
X3010为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；
X3011为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y、C、F及H；
X3012为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、H、I、K、L及R；
X3013为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、G、H、K、L、M、R、S、V、W、Y及I；
X3014为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、G、H、I、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y及K；
X3015为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、K及R；
X3016为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、F、K及R；
X3017为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W、Y、H、A及M；
X3018为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、I、K、L、M、Q、R、V、W及Y；
X3019为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、E、F、G、H、K、L、N、P、Q、R、V、W、Y及I；
X3020为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、V、W、Y、I及P；且
X3021为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、Y、F及G。
在本发明的一些态样中，该肽包含式(VIII)序列，其中：
X3001视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、E、H及Y，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、G、K、L、M、N、P、R、S、T、E、H及Y(当X3001存在时)；
X3002视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、F、H、K、R、S、W、Y、G、I及L，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、K、R、W、Y、G、I及L(当X3002存在时)；
X3003视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T及W，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、G、H、I、K、L、M、R、S、T及W；
X3004视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、G、H、I、K、L、M、N、R、S、T、V及P，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、G、H、I、K、L、M、N、R、S、T及P；
X3005视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、F、H、I、K、M、R、T、W及Y，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、F、H、K、R及W；
X3006视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：P、H及A；
X3007视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、G、R、W、A及L，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：L、C、R及W；
X3008视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、Y及I，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、H、K、R、V、W、Y及I；
X3009视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、I、R、V及K，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、R、V及K；
X3010视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、G、H、I、K、L、M、Q、R、S及T，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、K、L、Q、R及S；
X3011视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、I、K、L、M、R、S、V、W、C、F及H，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：I、K、L、M、R、V、W、C、F及H；
X3012视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：H及R(例如H)；
X3013视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、F、K、L、M、R、V及I，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、K、R、V及I；
X3014视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、M、C、F、H、I、L、N、R、S、V、W及K，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、S、C、F、H、I、R及K；
X3015视情况为K或R；
X3016视情况为K或R；
X3017视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W、H、A及M，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、H、A及M；
X3018视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、K、C、I、L、R及W(例如K、C、I、R或W)；
X3019视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、E、H、K、N、Q、R及I，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、E、H、K、R及I；
X3020视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、H、L、M、R、V、I及P(例如C、M、I或P)；且
X3021视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、H、I、K、L、M、N、Q、R、V、W、Y、F及G，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、H、I、K、L、M、N、Q、R、V、W、F及G。
本发明另外提供结合TFPI且至少包含式(IX)结构：X3001-X3002-X3003-X3004-X3005-X3006-X3007-X3008-X3009-X3010-X3011-H-X3013-X3014-K/R-R-X3017-X3018-X3019-X3020-X3021(IX)(SEQ ID NO：3121)的氨基酸3-21(X3003-X3021)的肽。在式(IX)中，X3001及X3002独立地存在或不存在于肽中。若存在，则X3001及/或X3002独立地选自任何氨基酸。同样，X3003、X3004、X3005、X3006、X3007、X3008、X3009、X3010、X3011、X3013、X3014、X3017、X3018、X3019、X3020及X3021各自独立地选自任何氨基酸。当存在时，X3001视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、E、H及Y，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、E、H及Y(例如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、G、K、L、M、N、P、R、S、T、E、H及Y)。同样，当存在时，X3002视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、F、H、K、M、N、P、R、S、T、W、Y、G、I及L，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、F、H、K、R、S、W、Y、G、I及L(例如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、K、R、W、Y、G、I及L)。此外，关于式(IX)，
X3003视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W及Y，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T及W(例如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、G、H、I、K、L、M、R、S、T及W)；
X3004视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y及P，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、G、H、I、K、L、M、N、R、S、T、V及P(例如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、G、H、I、K、L、M、N、R、S、T及P)；
X3005视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W及Y，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、F、H、I、K、M、R、T、W及Y(例如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、F、H、K、R及W)；
X3006视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、W、C、K、P、R及H，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：P、H及A；
X3007视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Q、A、C、F、G、H、I、K、L、N、R、S、T、W及Y，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、G、R、W、A及L(例如L、C、R或W)；
X3008视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y及I，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、Y及I(例如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、H、K、R、V、W、Y及I)；
X3009视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、G、H、I、L、M、R、S、T、V、W、Y及K，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、I、R、V及K(例如C、R、V或K)；
X3010视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、G、H、I、K、L、M、Q、R、S及T(例如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、K、L、Q、R及S)；
X3011视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y、C、F及H，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、I、K、L、M、R、S、V、W、C、F及H(例如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：I、K、L、M、R、V、W、C、F及H)；
X3013视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、G、H、K、L、M、R、S、V、W、Y及I，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、F、K、L、M、R、V及I(例如C、K、R、V或I)；
X3014视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、G、H、I、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y及K，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、M、C、F、H、I、L、N、R、S、V、W及K(例如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、S、C、F、H、I、R及K)；
X3017视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W、Y、H、A及M，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W、H、A及M(例如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、H、A及M)；
X3018视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、I、K、L、M、Q、R、V、W及Y，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、K、C、I、L、R及W(例如K、C、I、R或W)；
X3019视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、E、F、G、H、K、L、N、P、Q、R、V、W、Y及I，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、E、H、K、N、Q、R及I(例如C、E、H、K、R或I)；
X3020视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、V、W、Y、I及P，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、H、L、M、R、V、I及P(例如C、M、I或P)；及/或
X3021视情况为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、Y、F及G，诸如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、H、I、K、L、M、N、Q、R、V、W、Y、F及G(例如选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、H、I、K、L、M、N、Q、R、V、W、F及G)。
在一些态样中，本发明的TFPI结合肽包含与式(X)序列：Ac-GYASFPWFVQLHVHKRSWEMA-NH2(X)(SEQ ID NO：223)的一致性为至少60％(例如一致性为至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％)的氨基酸序列。视情况而定，该肽包含如本文定义的式(VIII)-式(IX)的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。如本文所用，「至少60％一致性(at least 60％identity))」及类似术语涵盖自例如60％至100％的任何整数，诸如60％、61％、62％及其类似整数。此外，术语「至少[百分比]一致性(at least[percentage]identity)」涵盖大于或等于相同氨基酸的数目除以本发明的肽的氨基酸总数目所得值的任何百分比([至少百分比一致性]≥[相同氨基酸的数目]/[本发明的肽的氨基酸总数目])。
本发明亦包括包含选自由SEQ ID NO：2001-2498所组成的群组的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的肽(例如包含选自由SEQ ID NO：2001-2296及2498所组成的群组(诸如SEQ ID NO：2001-2126、2128-2296、或2498)及/或选自由SEQ ID NO：2297-2497所组成的群组(诸如SEQ ID NO：2298-2497)的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的肽)。本发明另外提供包含选自由SEQID NO：3001-3108所组成的群组的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的肽(例如包含选自由SEQ ID NO：3001-3064所组成的群组(诸如SEQ ID NO：3001-3048、3051-3053、3055、或3057-3064)及/或选自由SEQ ID NO：3065-3084所组成的群组(诸如SEQ ID NO：3066-3084)及/或选自由SEQ ID NO：3085-3108所组成的群组的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的肽)。
在一些态样中，SEQ ID NO：1-7的肽亦包含一或多个连接于SEQ ID NO：1-7的N端或C端处的氨基酸。举例而言，本发明包括包含JBT0047、JBT0051、JBT0055、JBT0131、JBT0132、JBT0133、JBT0155、JBT0158、JBT0162、JBT0163、JBT0164、JBT0166、JBT0169、JBT0170、JBT0171、JBT0174、JBT0175或JBT0293的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的肽，以上所有氨基酸序列皆包含SEQID NO：1的氨基酸序列。包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的例示性肽包括包含JBT0294、JBT0295、JBT0296、JBT0297、JBT0298、JBT0299、JBT0300、JBT0301、JBT0302、JBT0303、JBT0304、JBT0305、JBT0306、JBT0307、JBT0308、JBT0309、JBT0310或JBT0311的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的肽。包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的例示性肽包含JBT0049、JBT0053、JBT0057、JBT0190、JBT0193或JBT0197的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。本发明另外包括包含JBT0050、JBT0054、JBT0058、JBT0129、JBT0130、JBT0205、JBT0208、JBT0211、JBT0212、JBT0217、JBT0218或JBT0219的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的肽，以上所有氨基酸序列皆包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列。包含SEQ ID NO：5的例示性肽包括包含JBT0101、JBT0052、JBT0103、JBT0178或JBT0182的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的肽。本发明另外包括包含JBT0120、JBT0124、JBT0247、JBT0248、JBT0251或JBT0252的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的肽，以上氨基酸序列的各者皆包括SEQID NO：6的氨基酸序列。本发明亦提供包括SEQ ID NO：7的氨基酸序列的肽，例如包含JBT0122、JBT0126、JBT0221、JBT0224、JBT0225、JBT0226、JBT0228、JBT0232或JBT0233的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的肽。本文所述的肽阐述于实施例1的表5中及图12-18中。
本发明另外包括TFPI结合肽，其包含式(XI)结构：X4001-Q-X4003-X4004-X4005-X4006-X4007-X4008-X4009-X4010-X4011-X4012-X4013-X4014-R-X4016-X4017-X4018-X4019-X4020(XI)。关于式(XI)，
X4001为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、L、M、Y、1Ni、Thi、Bta及多巴(例如F、Y、1Ni、Bta或多巴)；
X4003为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、D、E、M、Q、R、S、T、Ede(O)及Cmc(例如D、E或S)；
X4004为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Aib、E、G、I、K、L、M、P、R、W及Y(例如K)；
X4005为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：a、A、Aib、C、D、d、E、G、H、K、k、M、N、Nmg、p、Q、R、N丙基G、aze、pip、tic、oic、hyp、nma、Ncg、Abg、Apg、thz及dtc(例如p、Nmg、N丙基G、aze、pip、tic、oic或hyp)；
X4006为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、C(NEM)、D、E、G、H、K、M、N、Q、R、S、V、Cit、C(Acm)、Nle、I、Ede(O)、Cmc、Ecl、Eea、Eec、Eef、Nif及Eew(例如C、E、K、R、S、V、C(Acm)、Nle、C(NEM)、I或Cit)；
X4007为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：I、V、T、Chg、Phg及Tle(例如V或Tle)；
X4008为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、H、1Ni、2Ni、Pmy及Y(例如H、1Ni、2Ni或Pmy)；
X4009为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Aib、V、Chg、Phg、Abu、Cpg、Tle及L-2-胺基-4，4，4-三氟丁酸(例如V、Abu或Tle)；
X4010为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、d、E、F、H、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、Nmd及C(NEM)(例如D、P、C或T)；
X4011为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、a、G、p、Sar、c及hcy(例如G、a、c、hcy或Sar)；
X4012为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Y、Tym、Pty、多巴及Pmy(例如Y)；
X4013为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、F、1Ni、Thi及Bta(例如F、1Ni或Bta)；
X4014为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、C、C(NEM)、D、E、K、L、M、N、Q、R、T、V及Hcy(例如Aib、C、E或Hcy)；
X4016为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：L、Hcy、Hle及Aml；
X4017为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、a、Aib、C、c、Cha、Dab、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、Nle、Nva、Opa、Orn、R、S、Deg、Ebc、Eca、Egz、Aic、Apc及Egt(例如A、Aib、C、c、Aic、Eca或Deg)；
X4018为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、Hcy、hcy、C、c、L、Nle、M、N及R(例如A、Aib、C、c、L或Hcy)；
X4019为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：K、R及Har(例如K)；且
X4020为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：K、L、Hcy及Aml(例如L、Aml及Hcy)。
式(XI)的TFPI  结合肽不包含式(XII)结构：X5001-Q-X5003-X5004-X5005-X5006-I/V-X5008-Aib/V-X5010-G-Y-X5013-X5014-R-L-X5017-X5018-K-K/L(XII)。在式(XII)中，
X5001为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、L、M及Y；
X5003为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、D、E、M、Q、R、S及T；
X5004为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：E、G、I、K、L、M、P、R、W及Y；
X5005为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：a、A、Aib、C、D、d、E、G、H、K、k、M、N、Nmg、Q、R及p；
X5006为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、E、G、H、K、M、N、Q、R、S及V；
X5008为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、H及Y；
X5010为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、E、F、H、D、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；
X5013为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Aib、C及F；
X5014为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、C、D、E、K、L、M、N、Q、R、T及V；
X5017为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、C、Cha、Dab、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、Nle、Nve、Opa、Orn、R及S；且
X5018为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、L、M、N及R。
在一态样中，式(XI)的TFPI结合肽另外包含与X4001连接的N端氨基酸及/或部分。N端氨基酸及/或部分视情况选自由以下者所组成的群组：FAM-Ttds、脯氨酸-麸氨酸标签(「PE」)、Palm、2-苯基乙酰基、3-苯基丙酰基、2-(萘-2-基)乙酰基、己酰基、2-甲基丙酰基、3-甲基丁酰基、2-萘基磺酰基及1-萘基磺酰基。或者或此外，式(XI)的TFPI结合肽另外包含一或多个与X4020连接的氨基酸及/或部分。C端氨基酸及/或部分在本文中表示为X4021且视情况选自由以下者所组成的群组：C、c、C(NEM)、K(Ttds-顺丁烯二酰亚胺基丙酰基(EtSH))、FA19205、FA19204、FA19203、FA03202、K(Tdts-顺丁烯二酰亚胺)、K(AOA)及Cea。
在一具体实例中，该肽包含在X4018与X4021之间形成的环状结构。就此而言，X4018视情况为C或c，且X4021视情况为Cea。在另一具体实例中，该肽包含在X4011与X4014之间形成的环状结构。就此而言，X4011视情况为c或hcy，且X4014视情况为C或Hcy。
本发明亦包括由选自由以下者所组成的群组的氨基酸序列组成的肽：SEQID NO：4022、4024、4032、4036-4047、4049-4078、4086-4097、4100-4127、4129-4170、4173-4195、4200-4214、4217-4225、4228、4230、4231、4238及4239，以及由选自由以下者所组成的群组的氨基酸序列组成的肽：SEQ ID NO：1294-1336、4002、4013、4021、4023、4025-4031、4033-4035、4048、4079-4085、4098、4099、4128、4171、4172、4196-4199、4215、4216、4226、4277、4229、4232及4233。
在某些具体实例中，本发明的肽包含JBT0047、JBT0049、JBT0101、JBT0120或JBT0122或任何本文所述的本发明的肽(例如包含SEQ ID NO：1-3108中的任一者的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的肽，诸如包含SEQID NO：8-741、744-968、971-978、1001-1210、1213-1289、1290-1293、2001-2126、2128-2296、2298-2498、3001-3048、3051-3053、3055、3057-3064及3067-3108中的任一者的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的肽；包含SEQ ID NO：4022、4024、4032、4036-4047、4049-4078、4086-4097、4100-4127、4129-4170、4173-4195、4200-4214、4217-4225、4228、4230、4231、4238及4239中的任一者的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的肽；或包含选自由SEQ ID NO：1294-1336、4002、4013、4021、4023、4025-4031、4033-4035、4048、4079-4085、4098、4099、4128、4171、4172、4196-4199、4215、4216、4226、4277、4229、4232及4233所组成的群组的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的肽)或任何前述者的变异体的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。「变异体(variant)」意谓相对于亲本氨基酸序列，包含一或多个氨基酸取代、氨基酸缺失或氨基酸添加的肽。变异体包括(但不限于)氨基酸序列与本文提供的氨基酸序列中的任一者的一致性为至少60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同时保留结合TFPI及/或抑制TFPI活性的能力的肽。在一具体实例中，该肽包含JBT0132、JBT0303、JBT0193、JBT0178、JBT0120或JBT0224的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。
在一态样中，本发明的肽由40个或40个以下氨基酸，诸如35个或35个以下氨基酸组成。视情况而定，本发明的肽由25个或25个以下氨基酸、或10个或10个以下氨基酸组成。在各种具体实例中，该肽包含15-35个氨基酸残基(例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸残基)。然而，亦预期本文所述的包含一或多个缺失的肽适于本发明的情形中，只要该肽结合TFPI且视情况阻断TFPI抑制凝血级联即可。在一些态样中，移除氨基酸序列内、N端处及/或C端处的氨基酸。此等肽片段可包含3-14个氨基酸残基(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸残基)。
视情况而定，本发明的肽包含一或多个不会破坏该肽结合及/或抑制TFPI的能力的氨基酸取代(以本文提供的氨基酸序列中的任一者为参照)。举例而言，包含选自由JBT0294、JBT0295、JBT0296、JBT0297、JBT0298、JBT0299、JBT0300、JBT0301、JBT0302、JBT0303、JBT0304、JBT0305、JBT0306、JBT0307、JBT0308、JBT0309、JBT0310或JBT0311所组成的群组的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的肽为JBT0293的氨基酸序列(在N端处直接与苯丙氨酸残基连接且在C端处直接与离氨酸残基连接的SEQ ID NO：1的氨基酸序列)的取代突变体(参见图4)。
氨基酸取代包括(但不限于)以下取代：(1)降低对蛋白水解的敏感性的取代，(2)降低对氧化的敏感性的取代，(3)改变结合亲和力的取代，及/或(4)赋予或改进肽的其他生理化学或功能性质的取代。在一态样中，取代为保受取代，其中氨基酸残基经具有类似侧链的氨基酸残基置换。具有类似侧链的氨基酸的家族在此项技术内已被定义，且包括具有碱性侧链的氨基酸(例如离氨酸、精氨酸及组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸及麸氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、麸酰氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸及半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、白氨酸、异白氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸及色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸及异白氨酸)及具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及组氨酸)。然而，应了解专业人员不限于产生保受取代，只要所得肽保留完全或部分下调TFPI活性的能力即可。本发明亦包括包含此项技术中熟知的非典型、非天然存在的氨基酸的TFPI抑制肽。例示性非天然存在的氨基酸包括鸟氨酸、瓜氨酸、羟基脯氨酸、高丝氨酸、苯基甘氨酸、牛磺酸、碘酪氨酸、2，4-二胺基丁酸、α-胺基异丁酸、4-胺基丁酸、2-胺基丁酸、y-胺基丁酸、2-胺基异丁酸、3-胺基丙酸、正白氨酸、正缬氨酸、肌氨酸(sarcosine)、高瓜氨酸、氧化半胱氨酸、第三丁基甘氨酸、第三丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟-氨基酸、3-甲基氨基酸、α-C-甲基氨基酸、N-甲基氨基酸、2-胺基-异丁酸、β-高麸氨酸、β-高苯丙氨酸、β-高离氨酸、β-高白氨酸、β-高天冬酰胺、β-高麸酰氨酸、β-高精氨酸、β-高丝氨酸、β-高酪氨酸、β-高天冬氨酸、β-高缬氨酸、β-高天冬酰胺、(S)-环己基丙氨酸、(S)-瓜氨酸、(S)-2，4-二胺基丁酸、(S)-2，4-二胺基丁酸、(S)-二胺基丙酸、(S)-2-炔丙基甘氨酸、(S)-N(ω)-硝基-精氨酸、L-高苯丙氨酸、(S)-高-精氨酸、(S)-高-瓜氨酸、(S)-高-半胱氨酸、(S)-2-胺基-5-甲基-己酸、(S)-高-离氨酸、(S)-正白氨酸、(S)-N-甲基丙氨酸、(S)-N-甲基-天冬氨酸、(S)-N-甲基-麸氨酸、(S)-N-甲基-苯丙氨酸、N-甲基-甘氨酸、(S)-N-甲基-离氨酸、(S)-N-甲基-白氨酸、(S)-N-甲基-精氨酸、(S)-N-甲基-丝氨酸、(S)-N-甲基-缬氨酸、(S)-N-甲基-酪氨酸、(S)-2-胺基-戊酸、(S)-2-吡啶基-丙氨酸、(S)-鸟氨酸、L-苯基甘氨酸、4-苯基-丁酸及硒甲硫氨酸。适当时，个别氨基酸可具有L或D立体化学，但L立体化学典型地用于肽中的所有氨基酸。
本发明另外包括TFPI抑制肽变异体，其包含一或多个插入在本文提供的氨基酸序列内及/或与N端或C端连接的氨基酸。在一态样中，肽另外包含一或多个有助于合成、处理或使用肽的氨基酸，包括(但不限于)一或两个在N端及/或C端处的离氨酸以增加肽的溶解性。适合融合蛋白包括(但不限于)包含与一或多个多肽、多肽片段、或通常未被识别为蛋白质序列的一部分的氨基酸连接的TFPI抑制肽的蛋白质。在一态样中，融合肽包含两种或两种以上肽的全部氨基酸序列，或者包含两种或两种以上肽的部分(片段)。除本文所述的TFPI抑制肽的全部或一部分的外，融合蛋白亦视情况包括具有所要生物活性/功能的任何适合肽的全部或一部分。实际上，在一些态样中，TFPI抑制肽可操作地与例如以下一或多者连接：具有长循环半衰期的肽、标记蛋白、有助于纯化TFPI抑制肽的肽、促进形成多聚蛋白质的肽序列或任何前述者的片段。适合融合搭配物包括(但不限于)His标签、FLAG标签、strep标签及myc标签。视情况而定，TFPI抑制剂肽与一或多个提高肽的半衰期的实体融合。半衰期可藉由例如增加TFPI结合肽的分子量以避免肾清除及/或并入nFc受体介导的再循环路径的配位体来增加。在一具体实例中，TFPI结合肽与白蛋白多肽或其片段(例如人类血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA))融合或化学结合(如以下进一步描述)。白蛋白片段包含全长白蛋白蛋白的10％、25％、50％或75％。或者或此外，TFPI结合肽包含在活体内投予时会结合白蛋白的白蛋白结合域或脂肪酸。其他适合融合搭配物包括(但不限于)脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸多聚体(PAS化)及抗体或其片段(例如抗体的Fc部分)。
在一具体实例中，两种或两种以上TFPI抑制肽融合在一起、经多聚化域连接、或经由化学键连接以产生TFPI抑制肽错合物。TFPI抑制剂肽可相同或不同。因此，本发明提供包含本文所述的肽中的任一者或由本文所述的肽中的任一者组成、视情况经一或多个连接子连接的均二聚体(亦即包含两种相同TFPI结合肽的二聚体)、均多聚体(亦即包含三种或三种以上相同TFPI结合肽的错合物)、杂二聚体(亦即包含两种不同TFPI结合肽的二聚体)及杂多聚体(亦即包含三种或三种以上TFPI结合肽的错合物，其中TFPI结合肽的至少两者不同)。一种例示性TFPI结合肽二聚体为JBT2496(SEQ ID NO：4211)。
「衍生物」包括在本发明中且包括已以不同于氨基酸的添加、缺失或取代的某一方式经化学修饰的TFPI抑制肽。就此而言，本文提供的本发明的肽与聚合物、脂质、其他有机部分及/或无机部分化学键结。肽及蛋白质修饰的实例于Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，(1996)中给出。本文所述的TFPI结合肽视情况包含有助于与另一部分(例如肽部分)结合的官能基。例示性官能基包括(但不限于)异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰迭氮、NHS酯、磺酰氯、醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸酯、芳基化剂、亚胺基酯、碳化二亚胺、酸酐、烷基卤化物衍生物(例如卤乙酰基衍生物)、顺丁烯二酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰基衍生物、芳基化剂、硫醇-二硫化物交换试剂(例如吡啶基二硫化物或TNB硫醇)、重氮烃、羰基二咪唑、N，N′-二琥珀酰基碳酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺基氯甲酸酯及肼衍生物。顺丁烯二酰亚胺适用于例如产生活体内与白蛋白结合的TFPI结合肽。
在一些情形中制备衍生物以增加溶解性、稳定性、吸收或循环半衰期。各种化学修饰可消除或减弱药剂的任何非所要的副作用。在一态样中，本发明包括经共价修饰以包括一或多个水溶性聚合物连接的TFPI结合肽。水溶性聚合物(或其他化学部分)与任何氨基酸残基连接，但在一些具体实例中，与N端或C端连接较佳。视情况而定，聚合物经由一或多个提供有助于聚合物连接的官能基的氨基酸或构筑嵌段与肽连接。举例而言，JBT2315包含C端半胱氨酸(关于式(XI)为位置X4021)，其有助于添加例如顺丁烯二酰亚胺聚乙二醇(PEG)。适用聚合物包括(但不限于)PEG(例如大小为约40kD、30kD、20kD、10kD、5kD或1kD的PEG)、聚氧乙二醇、聚丙二醇、单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、羟乙基淀粉、纤维素、聚-(N-乙烯基吡咯啶酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚唾液酸(PSA)、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)及聚乙烯醇，以及任何前述者的混合物。在一态样中，本发明的肽为聚乙二醇化肽。PEG部分可以不同形状，例如直链或分支链加以利用。关于水溶性聚合物连接的进一步论述，参见美国专利第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号；及第4,179,337号。适用于改良肽半衰期或稳定性的其他部分在本文中有描述且包括例如白蛋白(视情况经修饰以允许与本发明的肽结合)、脂肪酸链(例如C12-C18脂肪酸，诸如C14脂肪酸)、抗体或其片段(例如抗体的Fc部分)及脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸多聚体。
在另一态样中，肽衍生物包括对特定细胞类型、组织及/或器官具有特异性的靶向部分。或者，肽与一或多个有助于纯化、侦测、多聚化、与相互作用搭配物结合及特性化肽活性的化学部分连接。一种例示性化学部分为生物素。适于与本发明的TFPI结合肽结合的其他部分包括(但不限于)光敏剂、染料、萤光染料、放射性核种、含有放射性核种的错合物、酶、毒素及细胞毒性剂。光敏剂包括例如光卟啉(Photofrin)、维速达尔(Visudyne)、聚左旋糖(Levulan)、Foscan、5-胺基酮戊酸甲酯(Metvix)、Hexvix
Figure BPA00001610528800701
CysviewTM、Laserphyrin、Antrin、Photochlor、Photosens、Photrex、Lumacan、Cevira、Visonac、BF-200ALA及Amphinex。必要时，His标签、FLAG标签、strep标签或myc标签与肽结合。
此外，在一态样中，本发明的肽在肽的N端氨基酸处经酰化。在另一态样中，本发明的肽在肽的C端氨基酸处经酰胺化。在另一态样中，本发明的肽在肽的N端氨基酸处经酰化且在肽的C端氨基酸处经酰胺化。
衍生物亦包括包含经修饰或非蛋白原性氨基酸或经修饰连接子基团的肽(参见例如Grant，Synthetic Peptides：A User′s Guide，Oxford University Press(1992))。经修饰氨基酸包括例如胺基及/或羧基经另一基团置换的氨基酸。非限制性实例包括经修饰氨基酸，其并有硫酰胺、脲、硫脲、酰基酰肼、酯、烯烃、磺酰胺、磷酰胺、酮、醇、硼酸酰胺、苯并二氮呯及其他芳族或非芳族杂环(参见Estiarte等人，Burgers Medicinal Chemistry，第6版，第1卷，第4部分，John Wiley&Sons，NewYork(2002))。经修饰氨基酸常以至少1个以上提及的官能基替代酰胺键与肽连接。非蛋白原性氨基酸包括(但不限于)P-丙氨酸(Bal)、正缬氨酸(Nva)、正白氨酸(Nle)、4-胺基丁酸(y-Abu)、2-胺基异丁酸(Aib)、6-胺基己酸(s-Ahx)、鸟氨酸(Orn)、羟基脯氨酸(Hyp)、牛磺酸、肌氨酸、瓜氨酸(Cit)、氧化半胱氨酸(cysteic acid)(Coh)、环己基丙氨酸(Cha)、甲硫氨酸亚砜(Meo)、甲硫氨酸砜(Moo)、高丝氨酸甲酯(Hsm)、炔丙基甘氨酸(Eag)、5-氟色氨酸(5Fw)、6-氟色氨酸(6Fw)、3′，4′-二甲氧基苯基-丙氨酸(Ear)、3′，4′-二氟苯丙氨酸(Dff)、4′-氟苯基-丙氨酸(Pff)、1-萘基-丙氨酸(1Ni)、1-甲基色氨酸(1Mw)、青霉胺(Pen)、高丝氨酸(Hse)、第三丁基甘氨酸、第三丁基丙氨酸、苯基甘氨酸(Phg)、苯并噻吩基丙氨酸(Bta)、L-高-半胱氨酸(Hcy)、N-甲基-苯丙氨酸(Nmf)、2-噻吩基丙氨酸(Thi)、3，3-二苯丙氨酸(Ebw)、高苯丙氨酸(Hfe)及S-苯甲基-L-半胱氨酸(Ece)。许多非蛋白原性氨基酸的结构提供于表2中。此等及其他非蛋白原性氨基酸可以D-异构体或L-异构体形式存在。经修饰连接子的实例包括(但不限于)可挠性连接子4，7，10-三氧-1，13-十三烷二胺(Ttds)、甘氨酸、6-胺基己酸、β-丙氨酸(Bal)、戊炔酸(Pyn)以及Ttds、甘氨酸、6-胺基己酸及Bal的组合。
构成本发明的肽的氨基酸的同系物可如表3中所示。在任何具体实例中，TFPI结合肽的一或多个氨基酸经同系物取代。
表3
Figure BPA00001610528800711
Figure BPA00001610528800721
衍生物亦包括包含具有经修饰取代基的氨基酸(诸如藉由用例如氟、氯、碘或溴卤化而修饰的氨基酸)的肽。在一些具体实例中，TFPI结合肽包含卤化芳族氨基酸，诸如苯丙氨酸。
在一些具体实例中，联接本发明的肽内的氨基酸的肽(CO-NH)键联经逆转以产生「经逆向修饰的(retro-modified)」肽，亦即相较于参照肽，包含按相反方向(NH-CO键)装配的氨基酸残基的肽。经逆向修饰的肽包含与参照肽相同的氨基酸手性。「经反转修饰的(inverso-modified)」肽为包含按与参照肽相同的方向装配的氨基酸残基，但氨基酸的手性反转的本发明的肽。因此，当参照肽包含L-氨基酸时，「经反转修饰的」肽包含D-氨基酸，反的亦然。经反转修饰的肽包含CO-NH肽键。「经逆向-反转修饰的(retro-inversomodified)」肽系指包含按相反方向装配且具有反转手性的氨基酸残基的肽。逆向-反转类似物具有肽键的逆转端及逆转方向(亦即NH-CO)，同时大致维持见于参照肽中的侧链拓扑结构。逆向-反转肽模拟物系使用标准方法，包括Meziere等人，J.Immunol.，159，3230-3237(1997)中描述的方法制备，该文献以引用的方式并入本文中。部分逆向-反转肽为仅一部分氨基酸序列经逆转且经对映异构氨基酸残基置换的肽。
本发明的TFPI结合肽(包括TFPI抑制剂肽)系以多种方式制备。在一态样中，肽系藉由固相合成技术合成，该等固相合成技术包括描述于以下中的技术：Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85，2149(1963)；Davis等人，Biochem.Intl.，10，394-414(1985)；Larsen等人，J.Am.Chem.Soc.，115，6247(1993)；Smith等人，J.Peptide Protein Res.，44，183(1994)；O′Donnell等人，J.Am.Chem.Soc.，118，6070(1996)；Stewart及Young，Solid Phase Peptide Synthesis，Freeman(1969)；Finn等人，The Proteins，第3版，第2卷，第105-253页(1976)；及Erickson等人，The Proteins，第3版，第2卷，第257-527页(1976)。或者，TFPI结合肽(例如TFPI抑制肽)系藉由将编码TFPI结合肽(例如TFPI抑制肽)的核酸引入经培养以表现该肽的宿主细胞中来重组表现。此等肽系使用标准蛋白质纯化技术自细胞培养物纯化而得。
本发明亦涵盖包含编码本发明的TFPI抑制肽的核酸序列的核酸。制备DNA及/或RNA分子的方法在此项技术中为熟知的。在一态样中，编码本文提供的肽的DNA/RNA分子系使用化学合成技术及/或使用聚合酶链反应(PCR)来产生。必要时，将TFPI抑制肽编码序列并入表现载体中。一般技术者应了解此项技术中已知的任何许多表现载体皆适于本发明的情形中，该等表现载体诸如(但不限于)质体、质体-脂质体错合物及病毒载体。使用描述于例如以下中的标准重组DNA技术制备任何此等表现载体：Sambrook等人，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1989)及Ausubel等人，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons，New York，N.Y.(1994)。视情况而定，核酸可操作地与一或多种调控序列(诸如启动子、活化子、增强子、帽信号、聚腺苷酸化信号或涉及控制转录或转译的其他信号)连接。
任何本发明的TFPI抑制肽或编码该等肽的核酸亦以组成物(例如医药组成物)形式提供。就此而言，肽与如本文中另外描述的生理学上可接受的(亦即药理学上可接受的)载剂、缓冲剂、赋形剂或稀释剂一起调配。视情况而定，肽呈由本发明涵盖的生理学上可接受的盐形式。「生理学上可接受的盐(Physiologically acceptable salts)」意谓医药学上可接受的任何盐。适当盐的一些实例包括乙酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、羟乙酸盐及草酸盐。必要时，组成物包含一或多种其他医药学上有效的药剂。
本文提供的肽视情况抑制至少一种TFPI-1(TFPI-1α或TFPI-1β)活性，诸如(但不限于)下调凝血级联的活性。在不受任何特定的作用机制束缚的情况下，一种提出的抑制机制可涉及防止形成四级TF-FVIIA-FXA-TFPI错合物。该肽可抑制TFPI与FXa(例如抑制TFPI库尼兹域2与因子Xa结合或阻断TFPI库尼兹域1与因子Xa的外部位点结合)、TF/FVIIa错合物(例如抑制TFPI库尼兹域1与TF/FVIIa错合物结合)、单独TF、及/或单独FVIIa结合(竞争性或别位性)。随着TFPI活性减弱，TF及FVIIa可随意活化FX，此又会增强凝血酶原转化成凝血酶。惊人地，在一具体实例中，结合库尼兹域1的本发明的肽会干扰FXa的TFPI介导的抑制。因此，本发明提供一种例如藉由向个体投予本文所述的结合库尼兹域1的肽来抑制凝血级联的外在及/或共用路径的TFPI介导的下调，及/或增强FXa介导的凝血酶原向凝血酶转化的过程的方法。
在一态样中，本发明的肽在模型及/或原生质系统中展现TFPI拮抗活性。一种用于测定TFPI抑制活性的例示性模型系统为外在因子X酶检定，其测试候选肽在TFPI(其为FX活化反应的一种天然抑制剂)存在下恢复外在错合物介导的FX活化的能力(参见例如Lindhout等人，Thromb.Haemost.，74，910-915(1995))。另一种用于特性化TFPI抑制活性的模型系统为FXa抑制检定，其中在TFPI存在下量测FXa活性(参见Sprecher等人，PNAS，91，3353-3357(1994))。外在因子X酶检定及FXa抑制检定进一步描述于实施例3中。视情况而定，本发明的肽在TFPI存在下增强FX活化的半数最大有效浓度(EC50)小于或等于1×10-4M、小于或等于1×10-5M、小于或等于1×10-6M、或小于或等于1×10-7M。
在一态样中，在基于血浆的检定中特性化TFPI拮抗剂活性。在候选肽存在下，在实质上缺乏FVIII或FIX活性(例如残余凝血因子活性低于1％)的血浆中触发凝血酶形成。凝血酶形成可使用萤光受质或显色受质来侦测，如实施例4中所述。一种量测凝血酶活性的系统由Thrombinoscope BV(Maastricht，The Netherlands)提供。凝血酶原转化系使用例如ThrombographTM(ThermoScientific，Waltham，MA)量测，且将所得资料编译于由可获自ThrombinoscopeBV的ThrombinoscopeTM软体产生的经校正的自动凝血酶生成图(Thrombogram)中。在某些具体实例中，TFPI抑制肽增加在检定期间产生的峰值凝血酶的量及/或减少为达成峰值凝血酶形成所需的时间。举例而言，该肽改良在不存在FVIII下(例如在缺乏FVIII的血浆中)受TFPI调控的凝血酶产生达至正常血浆中TFPI依赖性凝血酶产生的程度的至少1％。一般而言，正常(未患病)血浆含有约0.5U/mL至约2U/mL的因子VIII。因此，在一些情况下，TFPI抑制剂肽将增强在不存在FVIII下的凝血酶形成达至在0.5U/mL至2U/mL的FVIII存在下所观测的凝血酶形成程度的至少约1％。在其他具体实例中，该肽增强在不存在因子VIII下的凝血酶形成达至在正常血浆中，亦即在生理含量的因子VIII存在下凝血酶形成的程度的至少约2％、至少约3％、至少约5％、至少约7％、或至少约10％。在各种态样中，向凝血酶不足或血友病的动物模型投予该肽以特性化活体内TFPI抑制活性。此等活体内模型在此项技术中为已知的且包括例如经投予抗FVIII抗体以诱发A型血友病的小鼠(Tranholm等人，Blood，102，3615-3620(2003))；凝血因子基因剔除模型，诸如(但不限于)FVIII基因剔除小鼠(Bi等人，Nat.Genet.，10(1)，119-121(1995))及FIX基因剔除小鼠(Wang等人，PNAS，94(21)，11563-66(1997))；诱发有A型血友病的兔(Shen等人，Blood，42(4)，509-521(1973))；及Chapel Hill HA犬(Lozier等人，PNAS，99，12991-12996(2002))。
各种肽结合来自任何来源(包括(但不限于)小鼠、大鼠、兔、犬、猫、母牛、马、猪、天竺鼠(guinea pig)及灵长类动物)的TFPI。在一具体实例中，该肽结合人类TFPI。视情况而定，TFPI抑制肽结合来自一种以上物种的TFPI(亦即该肽在多个物种中具有交叉反应性)。在某些态样中，该肽结合TFPI的解离常数(KD)小于或等于1×10-4M、小于或等于1×10-5M、小于或等于1×10-6M、或小于或等于1×10-7M。亲和力可使用例如且不限于多种技术中的任一者、任两者、或任两者以上来测定，该等技术诸如有亲和力ELISA检定、竞争性ELISA检定及/或表面电浆子共振(BIAcoreTM)检定。当使用竞争性(IC50)ELISA检定来特性化时，本发明的肽视情况显示小于或等于约50,000nM的IC50。举例而言，该肽显示小于或等于约10,000nM的IC50，诸如小于或等于约5,000nM、小于或等于约1,000nM、或小于或等于约500nM的IC50。在一态样中，该肽显示小于或等于约250nM、小于或等于约100nM、小于或等于约50nM、或小于或等于约10nM的IC50。例示性肽及其IC50值提供于图32-39中；在一些情况下，该等肽基于其IC50值分成A、B、C、D、E、F及G组(参见实施例1中的表4)。在各种态样中，本发明提供属于如表4中定义的A、B、C、D、E、F及/或G组的肽。亲和力亦可藉由动力学方法或平衡/溶解方法测定。此等方法进一步详述于本文中或在此项技术中为已知的。
另一种适用于特性化本发明的肽的检定为koff检定，其检验肽自TFPI的释放。koff检定结果不为解离速率常数，而为在与TFPI一起培育一段时期之后由测试肽阻断与TFPI结合的竞争剂肽的百分比。一种例示性koff检定包括以下步骤：1)与一定量的测试肽一起培育经TFPI涂铺的微量滴定板，从而产生约90％TFPI占有率；2)移出未结合的测试肽；3)添加可与测试肽竞争结合于TFPI的经生物素标记的示踪剂(亦即竞争剂)肽；4)培育一段时间，在此期间由测试肽释放的结合位点由示踪剂占有；5)移出未结合的示踪剂及测试肽；及6)藉由使用抗生蛋白链菌素-辣根过氧化酶(horseradish peroxidase)结合物进行显色反应来侦测结合的示踪剂。所得信号指示结合位点由测试肽释放。相较于完全解离的分析物，在培育期期间不自TFPI解离的测试肽产生较弱信号。
如同所有结合剂及结合检定一般，熟习此项技术者认识到结合剂不应以可侦测方式结合以达成生物学(例如治疗学)有效性的各种部分将不能穷尽且完全地列出。因此，术语「特异性结合(specifically binds)」系指肽结合TFPI的亲和力能够比其与不为TFPI的无关对照蛋白质结合的亲和力大。举例而言，肽与TFPI结合的亲和力可为针对对照蛋白质的亲和力的至少5、10、15、25、50、100、250、500、1000或10,000倍。在一些具体实例中，肽结合TFPI的亲和力大于其与「抗目标(anti-target)」结合的亲和力，该抗目标为肽与的结合可能导致不良反应的人类中的蛋白质或其他天然存在的物质。若干种类的肽或蛋白质为潜在抗目标。因为TFPI抑制肽在血流中及/或在内皮处显现其活性，所以血浆蛋白为潜在抗目标。含有库尼兹域(KD)的蛋白质为潜在抗目标，因为不同蛋白质的KD共有显着类似性。组织因子路径抑制剂-2(TFPI-2)高度类似于TFPI-1α，且与TFPI-1α类似，其含有KD(Sprecher等人，PNAS，91，3353-3357(1994))。因此，在一态样中，本发明的肽与TFPI结合的亲和力为针对抗目标(诸如TFPI-2)的亲和力的至少5、10、15、25或50倍。
视情况而定，TFPI结合肽显示一或多种本文所述的所要特性，且必要时，肽的氨基酸序列可经修饰以使结合、稳定性及/或活性最佳化。一种例示性TFPI结合肽结合TFPI的KD小于或等于20nM及/或展现对TFPI的结合亲和力为针对抗目标的结合亲和力的至少100倍。或者或此外，TFPI结合肽在TFPI存在下增强FX活化的EC50小于或等于50nM(如使用任何适合检定，诸如此处所述的检定所量测)及/或增强在不存在因子VIII下的凝血酶形成达至含有生理含量的因子VIII的血浆中凝血酶形成的程度的至少约20％(例如40％)。或者或此外，TFPI结合肽达成所要程度的血浆稳定性(例如在12小时之后50％或50％以上的剂量保留在血浆中)及/或显示所要活体内半衰期(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9或10小时)。或者或此外，TFPI结合肽展现所要程度的生体可用性，诸如在皮下投药之后的所要程度的生体可用性(例如大于或等于5％、10％、15％、20％、25％、30％或50％)及/或显示在既定剂量下的所要程度的活体内TFPI抑制活性。
本发明另外包括一种抑制TFPI-1的方法。该方法包含使TFPI与如本文所述的TFPI结合肽接触。涵盖任何程度的TFPI活性抑制。举例而言，TFPI抑制肽使外在路径的TFPI抑制减低至少约5％(例如至少约10％、至少约25％、或至少约30％)。在一些具体实例中，相较于在不存在肽下的TFPI活性，TFPI抑制肽使外在路径内的TFPI活性降低至少约50％、至少约75％、或至少约90％。
在本发明的一态样中，TFPI结合肽用于活体内或试管内侦测及/或定量TFPI。一种侦测及/或定量样本中的TFPI的例示性方法包含(a)使样本与本发明的TFPI结合肽接触，及(b)侦测该TFPI结合肽与TFPI的结合。
本发明另外包括一种靶向TFPI所位于的生物结构(包括(但不限于)细胞表面及内皮内衬(endotheliallining))的方法。该方法包含使生物结构(例如包括(但不限于)于细胞表面上呈现TFPI的细胞)与视情况与赋予肽额外功能性的部分结合的本文所述的TFPI结合肽接触。该部分可为染料(诸如萤光染料)、放射性核种或含有放射性核种的错合物、蛋白质(例如酶、毒素或抗体)或细胞毒性剂。举例而言，该肽与有助于肽侦测及/或纯化及/或具有治疗性质的效应部分连接或结合。在一态样中，向哺乳动物投予TFPI结合肽或肽结合物以靶向该哺乳动物内的TFPI呈现细胞。视情况而定，该方法另外包含侦测TFPI结合肽与TFPI的结合。该方法适用于治疗及诊断TFPI为适合诊断标记或TFPI表现细胞为治疗方法的目标的疾病。
直接或间接侦测肽-TFPI错合物。侦测部分在此项技术中广泛用于鉴别生物物质且包括例如染料(例如萤光染料)、放射性核种及含有放射性核种的错合物、及酶。在一些态样中，间接侦测肽-TFPI结合。就此而言，肽视情况与结合本发明的肽而不显着干扰肽-TFPI结合的相互作用搭配物接触，且侦测该相互作用搭配物。例示性相互作用搭配物包括(但不限于)抗体、抗原结合抗体片段、抗运载蛋白(anticalin)及抗体模拟物、适体、抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白、中性链亲和素及镜像体。视情况而定，相互作用搭配物包含侦测部分以有助于侦测相互作用搭配物-肽错合物。在一些具体实例中，TFPI结合肽经修饰以有助于结合相互作用搭配物。举例而言，在一态样中，TFPI结合肽与经包含抗生蛋白链菌素的相互作用搭配物结合的生物素结合。一种例示性相互作用搭配物包含与辣根过氧化酶融合的抗生蛋白链菌素，该辣根过氧化酶系在例如ELISA样检定中侦测。或者，TFPI结合肽经修饰以包括抗体抗原决定基，且侦测相应抗体与肽-TFPI错合物的结合。侦测例如抗体及其片段的方法在此项技术中已被充分了解。
肽-TFPI错合物及相互作用搭配物-肽错合物系使用任何许多方法来鉴别，该等方法诸如有(但不限于)生物化学检定(例如酶促检定)、光谱分析(例如基于光密度、萤光、FRET、BRET、TR-FRET、萤光偏振、电化学发光或NMR的侦测)、正电子发射断层摄影术(PET)及单光子放射电脑断层摄影术(SPECT)。有助于萤光侦测肽-TFPI错合物或相互作用搭配物-肽错合物的可侦测部分包括(但不限于)萤光素、Alexa Fluor
Figure BPA00001610528800781
350、Marina BlueTM、CascadeYellowTM、Alexa Fluor
Figure BPA00001610528800782
405、Pacific BlueTM、Pacific OrangeTM、Alexa Fluor
Figure BPA00001610528800783
430、Alexa Fluor
Figure BPA00001610528800784
488、Oregon Green
Figure BPA00001610528800785
488、Alexa Fluor
Figure BPA00001610528800786
500、Oregon Green
Figure BPA00001610528800787
514、Alexa Fluor
Figure BPA00001610528800791
514、Alexa Fluor
Figure BPA00001610528800792
532、Alexa Fluor
Figure BPA00001610528800793
555、四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)、Alexa Fluor
Figure BPA00001610528800794
546、若丹明B(Rhodamine B)、Rhodamine Red
Figure BPA00001610528800795
-X、Alexa Fluor
Figure BPA00001610528800796
568、Alexa Fluor
Figure BPA00001610528800797
594、Texas Red
Figure BPA00001610528800798
TexasRed
Figure BPA00001610528800799
-X、Alexa Fluor
Figure BPA000016105288007910
610、Alexa Fluor
Figure BPA000016105288007911
633、Alexa Fluor635、Alexa Fluor
Figure BPA000016105288007913
647、Alexa Fluor
Figure BPA000016105288007914
660、Alexa Fluor
Figure BPA000016105288007915
680、Alexa Fluor？700、Alexa Fluor
Figure BPA000016105288007916
750、B-藻红素(B-Phycoerythrin)、R-藻红素、别藻蓝蛋白(Allophycocyanin)、BODIPY
Figure BPA000016105288007917
Cy3、Cy5、TAMRA及萤光蛋白(GFP及其衍生物)。包含萤光侦测部分的TFPI结合肽的一实例为JBT2454(FAM-Ttds-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKL-NH2(SEQ ID NO：4171))，其经5，6-羧基萤光素标记。
放射性标记亦用于侦测生物物质(例如TFPI、TFPI结合肽或TFPI结合肽-TFPI错合物)，且在一些情况下，使用螯合剂与肽或相互作用搭配物连接，该螯合剂诸如有(但不限于)EDTA(乙二胺四乙酸)、DTPA(二伸乙三胺五乙酸)、CDTA(环己基-1，2-二胺四乙酸)、EGTA(乙二醇-O，O′-双(2-胺乙基)-N，N，N′，N′-四乙酸)、HBED(N，N-双(羟基苯甲基)-乙二胺-N，N′-二乙酸)、TTHA(三伸乙四胺六乙酸)、DOTA(1，4，7，10-四氮环十二烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸)、HEDTA(羟乙基二胺三乙酸)或TETA(1，4，8，11-四氮环十四烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸)。放射性标记的实例包括99mTc、203Pb、66Ga、67Ga、68Ga、72As、111In、113mIn、114mIn、97Ru、62Cu、64Cu、52Fe、52mMn、51Cr、186Re、188Re、77As、90Y、67Cu、169Er、117mSn、121Sn、127Te、142Pr、143Pr、198Au、199Au、149Tb、161Tb、109Pd、165Dy、149Pm、151Pm、153Sm、157Gd、166Ho、172Tm、169Yb、175Yb、177Lu、105Rh及111Ag。顺磁性金属亦为适于与TFPI结合肽或相互作用搭配物视情况经由螯合剂错合物连接的可侦测部分。顺磁性金属的实例包括例如Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Pr、Nd、Sm、Yb、Gd、Tb、Dy、Ho及Er。
在一些态样中，TFPI结合肽本身经修饰以包括一或多个具有可侦测取代基或核种的氨基酸。就此而言，在一具体实例中，TFPI结合肽包含至少1个包含可侦测同位素(例如13C、14C、35S、3H、18O或15N)的氨基酸及/或经例如123I、124I、125I、131I、75Br、76Br、77Br或82Br卤化的氨基酸。适于卤化的氨基酸包括(但不限于)酪氨酸及色氨酸。
本发明亦提供一种诊断罹患疾病或病症或处于罹患疾病或病症的风险中的个体的方法，其中该疾病或病症与异常TFPI活性相关或由异常TFPI活性引起。该方法包含向该个体投予TFPI结合肽且侦测TFPI-肽错合物。在一些情况下，该肽与可侦测部分结合，且该方法包含侦测该可侦测部分。例示性可侦测部分在本文中有描述。在其他情况下，该方法包含向该个体投予结合TFPI结合肽的TFPI结合肽相互作用搭配物且侦测该相互作用搭配物。必要时，相互作用搭配物包含可侦测部分或与可侦测部分结合，且侦测该可侦测部分。可侦测部分的存在指示TFPI的存在，从而允许诊断与TFPI相关的疾病或病症(例如(i)可藉由抑制TFPI来治疗或(ii)包含可藉由抑制TFPI来改善或预防的症状的疾病或病症)。若不需要向该个体投予肽，则自该个体获得生物样本，使其与如本文所述的TFPI结合肽接触，且侦测TFPI-肽错合物。
本发明的肽结合TFPI且因此适用于自生物样本(例如生物流体，诸如血清)、酸酵萃取物、组织制备物、培养基及其类似物纯化出TFPI或重组TFPI。本发明包括在商业化生产TFPI中或在特性化TFPI分子的方法中使用TFPI结合肽的方法。举例而言，本发明包括一种纯化TFPI的方法。该方法包含使含有TFPI的样本与如本文所定义的肽在适合于在TFPI与该肽之间形成错合物的条件下接触；自该样本移出该错合物；及视情况解离该错合物以释放TFPI。适合于在TFPI与肽之间形成错合物的例示性条件揭示于实施例中，且此等条件可容易修改以解离TFPI-肽错合物。在一些具体实例中，肽固定于支撑物(例如固体支撑物)上以有助于回收TFPI。举例而言，在一具体实例中，肽固定于层析固定相(例如二氧化硅、亲和力层析珠粒或层析树脂)上，向固定相施加包含TFPI的样本以便形成TFPI-肽错合物，自固定相移出样本剩余部分，且自固定相洗提TFPI。就此而言，在一态样中，本发明的肽适用于亲和力层析技术中。
亦提供一种增强凝血因子不足的个体中的凝血酶形成的方法。该方法包含在有效于抑制TFPI的条件下向该个体投予本文提供的肽。就此而言，TFPI抑制肽系以一定量且在有效于增强该个体中的凝血酶形成的条件下投予。「凝血因子不足(clotting factor-deficient)」意谓该个体罹患为凝血酶形成所需的一或多种血液因子(诸如FVIII、FIX或FXI)不足的症状。实际上，在一具体实例中，该个体的FVIII不足。或者或此外，该个体的因子IX不足。凝血因子不足系藉由检查临床样本中的因子的量来鉴别。专业人员根据凝血因子不足的幅度对血友病分类。罹患轻度血友病的个体的因子VIII或因子IX为正常量(1U/ml)的约5％至30％。中度血友病特征在于因子VIII、因子IX或因子XI为正常含量的约1％至5％，而罹患重度血友病的个体的因子VIII、因子IX或因子XI小于正常量的1％。不足可藉由活化部分凝血活酶时间(activated partialthromboplastin time，APTT)测试来间接鉴别。APTT测试量测为形成血凝块所需的持续时间，相较于凝血因子含量正常的患者，该持续时间对于患有因子VIII不足(A型血友病)、因子IX不足(B型血友病)及因子XI不足(C型血友病)的患者而言较长。几乎100％的患有重度及中度因子VIII不足的患者可用APTT诊断。本发明另外包括增强未罹患凝血因子不足的个体中的凝血酶形成。该方法包含在有效于增强凝血酶形成的条件下向个体(例如包含正常生理含量的凝血因子的个体)投予本文提供的肽。
在一态样中，TFPI抑制肽用于增加个体中的血凝块形成。增加血凝块形成的方法包含以一定量且在有效于增加血凝块形成的条件下向该个体投予本文所述的肽。应了解该方法无需完全恢复凝血级联以达成有益(例如治疗)效应。涵盖凝血酶或血凝块形成的使与凝血因子不足相关的症状的发作或严重性减低的任何增强或增加。测定该方法在促进凝血酶形成及凝血方面的功效的方法在此项技术中为已知的且在本文中有描述。
本发明另外包括一种治疗个体的凝血病症的方法，该方法包含以一定量且在有效于治疗该个体的该凝血病症的条件下向该个体投予一或多种TFPI抑制肽，诸如本文所述的肽中的任何一或多者。在一态样中，该肽为可抑制TFPI活性的重组或合成肽。「凝血病症(Coagulation disorders)」包括由凝血因子活性不足及血小板活性不足引起的出血病症。凝血因子包括(但不限于)因子V(FV)、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXIII、FII(引起低凝血酶原血症(hypoprothrombinemia))及冯威里氏因子(von Willebrand′s factor)。因子不足系由例如因子的活体内半衰期缩短、因子的结合性质改变、因子的遗传缺陷及因子的血浆浓度降低引起。凝血病症可为先天性或后天性的。潜在遗传缺陷包括编码凝血因子的核苷酸序列内的缺失、添加及/或取代，其各自的不存在、存在及/或取代对该凝血因子的活性具有负面影响。凝血病症亦源于产生针对凝血因子的抑制剂或自体免疫性(例如抗体)。在一实例中，凝血病症为A型血友病。或者，凝血病症为B型血友病或C型血友病。
血小板病症系由血小板功能不足或循环中的血小板数异常低所引起。低血小板计数可能归因于例如产生不足、血小板螯合或不受控制的血小板破坏。血小板减少(Thrombocytopenia)(血小板不足)可因各种原因而存在，该等原因包括化学疗法及其他药物疗法、放射疗法、手术、偶然的失血及其他疾病状况。涉及血小板减少的例示性疾病状况为：再生不能性贫血(aplastic anemia)；特发性或免疫血小板减少症(ITP)，包括与乳癌相关的特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura)；HIV相关的ITP及HIV相关的栓塞性血小板减少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura)；导致血小板减少的转移性肿瘤；全身性红斑狼疮症(systemic lupus erythematosus)，包括新生儿狼疮症候群脾肿大；范可尼氏症候群(Fanconi′s syndrome)；维生素B12不足；叶酸不足；梅-海格林异常(May-Hegglin anomaly)；伟-尔二氏症候群(Wiskott-Aldrich syndrome)；慢性肝病；与血小板减少相关的骨髓发育不良症候群；阵发性夜间血红素尿(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria)；在C7E3 Fab(阿昔单抗(Abciximab))疗法之后的急性深度血小板减少症；同种免疫血小板减少症，包括母体同种免疫血小板减少症；与抗磷脂抗体及栓塞相关的血小板减少症；自体免疫血小板减少症(autoimmune thrombocytopenia)；药物诱发的免疫血小板减少症，包括卡铂(carboplatin)诱发的血小板减少症及肝素(heparin)诱发的血小板减少症；胎儿血小板减少症；妊娠性血小板减少症；休斯症候群(Hughes′syndrome)；类狼疮血小板减少症(lupoidthrombocytopenia)；偶发性及/或大量失血；脊髓增生病症；患有恶性疾病的患者的血小板减少症；栓塞性血小板减少性紫癜，包括在癌症患者中表现为栓塞性血小板减少性紫癜/溶血性尿中毒症候群(hemolytic uremic syndrome)的栓塞性微血管病变；输血后紫癜(PTP)；自体免疫溶血性贫血；潜隐性空肠憩室穿破(occult jejunal diverticulum perforation)；纯红血球发育不全；自体免疫血小板减少症；流行性肾病(nephropathia epidemica)；利福平(rifampicin)相关的急性肾衰竭；帕里斯-特啰索血小板减少症(Paris-Trousseauthrombocytopenia)；新生儿同种免疫血小板减少症；阵发性夜间血红素尿；胃癌中的血液学变化；溶血性尿中毒症候群(例如儿童中的尿毒症病状)；及与病毒感染相关的血液学表现，包括肝炎A型病毒及CMV相关的血小板减少症。血小板病症亦包括(但不限于)冯威里病、副肿瘤血小板功能障碍、葛兰曼氏血小板无力症(Glanzman’s thrombasthenia)及伯纳德-索里尔病(Bernard-Soulierdisease)。可用TFPI抑制肽治疗的其他出血病症包括(但不限于)由损伤诱发的出血性病状；一或多种接触因子(诸如FXI、FXII、胰舒血管素原(prekallikrein)及高分子量激肽原(kininogen)(HMWK))不足；维生素K不足；血纤维蛋白原(fibrinogen)病症，包括无纤维素原血症(afibrinogenemia)、低纤维素原血症(hypofibrinogenemia)及纤维蛋白原不良血症(dysfibrinogenemia)；及α2-抗血纤维蛋白溶酶(antiplasmin)不足。在一具体实例中，TFPI抑制肽用于治疗过度出血，诸如由手术、损伤、脑内出血、肝病、肾病、血小板减少、血小板功能障碍、血肿、内出血、关节积血(hemarthroses)、体温过低、月经、妊娠及登革出血热(Dengue hemorrhagic fever)引起的过度出血。所有以上疾病在本发明的情形下皆视为「凝血病症(bloodcoagulation disorders)」。
在一态样中，本发明的TFPI抑制肽用于逆转一或多种抗凝血剂在个体中的效应(完全或部分)。众多抗凝血剂在此项技术中为已知的且包括例如肝素；香豆素(coumarin)衍生物，诸如华法林(warfarin)或败坏翘摇素(dicumarol)；TFPI；AT III；狼疮抗凝血剂；线虫抗凝血剂肽(NAPc2)；FVIIa抑制剂；活性位点经阻断的FVIIa(FVIIai)；活性位点经阻断的FIXa(FIXai)；FIXa抑制剂；FXa抑制剂，包括磺达肝素(fondaparinux)、伊群帕努(idraparinux)、DX-9065a及拉扎沙班(razaxaban)(DPC906)；活性位点经阻断的FXa(FXai)；FVa或FVIIIa的抑制剂，包括经活化的蛋白C(APC)及可溶性血栓调节蛋白(thrombomodulin)；凝血酶抑制剂，包括水蛭素(hirudin)、比伐芦汀(bivalirudin)、阿加曲班(argatroban)及希美加群(ximelagatran)；及结合凝血因子(例如FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXIII、FII、FXI、FXII、冯威里因子、胰舒血管素原或高分子量激肽原(HMWK))的抗体或抗体片段。
如本文所用，「治疗(treating/treatment)」系指与凝血病症相关的症状的严重性及/或发作程度的任何减轻。因此，「治疗」包括治疗性及预防性措施。一般技术者应了解对凝血病症或与其相关的症状任何程度的预防或改善皆有益于个体，诸如人类患者。患者的生活品质藉由在任何程度上降低个体的症状的严重性及/或延迟症状出现来改良。因此，在一态样中，方法在已确定个体处于显现凝血病症(例如侦测到凝血因子(例如FVIII、FIX或FXI)不足)的风险中之后尽快或在侦测到凝血病症(例如A型血友病、B型血友病或C型血友病)之后尽快执行。在另一态样中，投予肽以完全或部分防止在损伤或手术期间过度失血。
鉴于以上，本发明提供一种用于治疗个体的方法中的肽，该方法诸如有用于治疗抑制TFPI为有益的疾病的方法。在一态样中，该疾病或病症为凝血病症。该个体正罹患疾病或病症或处于罹患疾病或病症(或不利生物事件，诸如过度失血)的风险中。该方法包含以一定量且在可完全或部分有效治疗或预防疾病或病症的条件下向该个体投予本发明的肽。本发明另外提供一种用于制造医药品的肽。举例而言，该肽可用于制造用以治疗如本文详述的凝血病症的医药品。
在一些具体实例中，宜向个体投予包含编码本发明的TFPI结合肽(例如TFPI抑制肽)的核酸序列的核酸。在一态样中，替代TFPI抑制肽或除TFPI抑制肽的外，提供该种核酸。表现载体、核酸调控序列、投药方法及其类似内容在本文中及美国专利公开案第20030045498号中有进一步描述。
用于特定个体的特定投药摄生法应部分视所用的本发明的TFPI抑制肽、所投予的TFPI结合肽(例如TFPI抑制肽)的量、投药途径、所治疗的特定病痛、与接受者相关的考虑因素以及任何副作用的起因及程度而定。向个体(例如哺乳动物，诸如人类)投予的肽的量及投药条件(例如投药时序、投药途径、给药摄生法)足以在合理时间范围内影响所要生物反应。剂量典型地视多种因素而定，该等因素包括所用的特定TFPI抑制肽、个体的年龄及体重以及个体的任何疾病或病症的存在及严重性。剂量大小亦将由投药的途径、时序及频率决定。因此，临床医师可确定剂量的效价且修改投药途径以获得最佳治疗效应，且习知范围确定技术为一般技术者所知。仅举例而言，在一态样中，方法包含投予例如约0.1μg/kg至约100mg/kg或100mg/kg以上，此视以上提及的因素而定。在其他具体实例中，剂量可在1μg/kg直至约75mg/kg；或5μg/kg直至约50mg/kg；或10μg/kg直至约20mg/kg的范围内。在某些具体实例中，剂量包含约0.5mg/kg至约20mg/kg(例如约1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.3mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、4.5mg/kg、5mg/kg、5.5mg/kg、6mg/kg、6.5mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、或10mg/kg)的肽。鉴于许多凝血病症具有慢性特质，则可设想个体接受TFPI抑制肽治疗的过程将持续数周、数月或数年，且可能需要每日或每周一或多次剂量。在其他具体实例中，投予TFPI抑制肽以在相对较短的治疗时期(例如1至14天)内来治疗急性病状(例如由手术或损伤引起的出血、或接受凝血替代疗法的个体中的因子抑制剂/自体免疫发作)。
投予包含本文所述的肽的生理学上可接受的组成物(诸如医药组成物)的适合方法在此项技术中为熟知的。尽管1种以上途径可用于投予肽，但特定途径可提供比另一途径更即刻且更有效的反应。视情况而定，医药组成物被施加或滴注入体腔中、经由皮肤或黏膜吸收、经摄入、经吸入及/或经引入循环中。在一态样中，静脉内、动脉内或腹膜内投予包含TFPI抑制肽的组成物以将本发明的肽引入循环中。非静脉内投药亦为适当的，尤其是关于低分子量治疗剂。在某些情况下，需要经口、局部、舌下、经阴道、经直肠、经肺；经由脑内(实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、门脉内、病灶内、髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、鼻内、尿道注射或经肠方式；藉由持续释放系统；或藉由植入装置来传递包含TFPI抑制肽的医药组成物。必要时，TFPI抑制肽经由馈药于相关区域的动脉内或静脉内投药，例如经由股动脉以传递至腿来区域性投予。在一具体实例中，将该肽并入如例如以下所述的微粒中：美国专利5,439,686及5,498,421以及美国专利公开案2003/0059474、2003/0064033、2004/0043077、2005/0048127、2005/0170005、2005/0142205、2005/142201、2005/0233945、2005/0147689.2005/0142206、2006/0024379、2006/0260777、2007/0207210、2007/0092452、2007/0281031及2008/0026068。或者，经由植入已吸附有或囊封有所要分子的膜、海绵或另一适当材料来投予组成物。当使用植入装置时，在一态样中，将该装置植入任何适合组织中，且在各种态样中，所要分子的传递系经由扩散、定时释放团注或连续投药来达成。在其他态样中，在手术程序或治疗损伤期间直接向暴露组织投予TFPI抑制肽，或经由输血程序投予TFPI抑制肽。治疗性传递方法为熟习此项技术者所熟知，其中一些方法进一步描述于例如美国专利第5,399,363号中。
为了有助于投药，在一具体实例中，TFPI结合肽(例如TFPI抑制肽)调配成包含载剂(亦即媒剂、佐剂、缓冲剂或稀释剂)的生理学上可接受的组成物。所用特定载剂仅受化学物理考虑因素(诸如溶解性及缺乏与肽的反应性)及投药途径限制。生理学上可接受的载剂在此项技术中为熟知的。适于可注射使用的说明性医药形式包括(但不限于)无菌水溶液或分散液及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌散剂(例如参见美国专利第5,466,468号)。可注射调配物进一步描述于例如以下中：Pharmaceutics and Pharmacy Practice，J.B.Lippincott公司，Philadelphia.Pa.，Banker及Chalmers.编，第238-250页(1982)、及ASHP Handbook on Injectable Drugs，Toissel，第4版，第622-630页(1986)。包含本文提供的肽的医药组成物视情况连同提供关于此等医药组成物的使用的说明书的包装材料一起置放在容器内。一般而言，此等说明书包括描述试剂浓度的明确表述，以及在某些具体实例中，包括可能为复原医药组成物所必需的赋形剂成分或稀释剂的相对量。
适当时，本发明的TFPI结合肽(例如TFPI抑制肽)与其他物质及/或其他治疗性医疗器械(modality)组合投予以达成另一或增强的生物效应。共治疗剂包括(但不限于)血浆源性或重组凝血因子、血友病预防治疗剂、免疫抑制剂、血浆因子抑制抗体拮抗剂(亦即抗抑制剂)、抗纤维蛋白分解药、抗生素、激素疗法、消炎剂(例如非类固醇消炎药(NSAID)或类固醇消炎物质)、促凝剂(procoagulant)及疼痛舒解剂。在一态样中，方法为传统替代因子治疗摄生法的辅助疗法，其涉及向个体投予例如FXIII、FXII、FXI(例如HEMOLEVEN
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(Laboratoire francais du Fractionnement et des Biotechnologies，Les Ulis，France)及FXI浓缩物(BioProducts Laboratory Elstree，Hertfordshire，UK))、FX、FIX(例如BENEFIX凝血因子IX(Wyeth，Madison，NJ)；ALPHANINE
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SD(Grifols，Los Angeles，CA)；MONONINE
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(CSL Behring，King of Prussia，PA)；BEBULIN-VHTM(Baxter，Deerfield，IL)；PROFILNINE
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SD(Grifols，Los Angeles，CA)；或PROPLEX TTM(Baxter，Deerfield，IL))、FVIII(例如ADVATETM(Baxter，Deerfield，IL)；HELIXATE
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FS(CSL Behring，Kingof Prussia，PA)；REFACTO
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(Wyeth，Madison，NJ)、XYNTHATM(Wyeth，Madison，NJ)、KOGENATE
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及KOGENATE
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FS(Bayer，Pittsburgh，PA)；ALPHANATE
Figure BPA00001610528800875
(Grifols，Los Angeles，CA)；HEMOPHIL MTM(Baxter，Deerfield，IL)；KOATE-DVI(Talecris Biotherapeutics-USA，Research Triangle Park，NC)；或MONARC-MTM(Baxter，Deerfield，IL))、FVIIa(例如NOVOSEVEN
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FVIIa(Novo Nordisk，Princeton，NJ)及FVII浓缩物(Baxter Bioscience、Vienna、Austria、或BioProducts Laboratory，Elstree，Hertfordshire，UK))、FV、FVa、FII、及/或FIII。在一些情况下，个体亦接受FEIBA VH ImmunoTM(Baxter BioScience，Vienna，Austria)，其为一种具有因子VIII抑制剂旁路活性的冷冻干燥无菌人类血浆部分。FEIBA VH Immuno含有近似相等单位的因子VIII抑制剂旁路活性及凝血酶原错合物因子(因子II、VII、IX、及X及蛋白C)。其他例示性共治疗剂包括(但不限于)胰舒血管素原、高分子量激肽原(HMWK)、冯威里氏因子、组织因子、及凝血酶。或者或此外，TFPI抑制肽与一或多种不同TFPI抑制肽一起共调配。在一态样中，投予TFPI结合肽可使为达成所要生物反应所需的共治疗剂的剂量降低。
因此，本发明包括向个体投予本发明的TFPI结合肽(例如TFPI抑制肽)(多种TFPI抑制肽)与一或多种另外适合的物质的组合，各者皆根据适于彼医药品的摄生法投予。投药策略包括并行投予(亦即实质上同时投予)及非并行投予(亦即在不同时间以任何顺序投予，无论重迭或不重迭)TFPI抑制肽及一或多种另外适合的药剂。应了解不同组分视情况以同一组成物或以各别组成物形式且藉由相同或不同投药途径来投予。
在一些具体实例中，本发明的肽与某一部分，例如治疗或诊断部分，诸如上述侦测部分及共治疗剂结合。或者或此外，肽与(a)结合该肽且(b)具有治疗活性及/或与向相互作用搭配物提供额外功能性的部分(例如治疗剂、诊断剂或侦测剂)连接的相互作用搭配物(例如抗体、抗体片段、抗运载蛋白、适体或镜像体)组合投予。适合部分包括(但不限于)光敏剂、染料、放射性核种、含有放射性核种的错合物、酶、毒素、抗体、抗体片段及细胞毒性剂，且在一些情况下，部分具有治疗活性(亦即会达成有利或所要生物效应)。肽结合物或肽-相互作用搭配物对适用于本文所述的任何方法中，该等方法诸如有治疗罹患疾病或病症或处于罹患疾病或病症的风险中的个体的方法。
本发明另外提供一种鉴别TFPI结合化合物(诸如TFPI结合肽)的方法。在一态样中，该方法包含(a)使包含TFPI库尼兹域1(KD1)的肽与本文所述的TFPI结合肽及测试化合物在允许形成KD1-TFPI结合肽错合物的条件下接触。该方法另外包含(b)量测步骤(a)中所形成的KD1-TFPI结合肽错合物，及(c)比较在该测试化合物存在下形成的KD1-TFPI结合肽错合物的数量与在不存在该测试化合物下形成的KD1-TFPI结合肽错合物的数量。相较于在不存在该测试化合物下形成的KD1-TFPI结合肽错合物的数量，在该测试化合物存在下形成的KD1-TFPI结合肽错合物的数量降低指示该测试化合物为TFPI结合化合物。在一态样中，该方法另外包含在不存在该测试化合物下形成KD1-TFPI结合错合物以达成步骤(c)中的比较，但此并非必需，因为资讯可单独获得(例如自先前制备的参照标准物获得)。
KD1、TFPI结合肽及测试化合物同时或依序组合，视情况在添加TFPI结合肽及/或测试化合物之前及/或之后进行洗涤步骤。在一具体实例中，使包含KD1的肽与本文所述的TFPI结合肽在允许形成KD1-TFPI结合肽错合物的条件下接触，移出未结合的TFPI结合肽，且使剩余KD-肽错合物与测试化合物接触。TFPI结合肽自TFPI-肽错合物的置换经侦测到，且指示测试化合物为TFPI结合化合物。置换系藉由例如量测暴露于测试化合物之前及之后KD1-TFPI结合肽错合物的数量来侦测。
KD1-TFPI结合肽错合物系使用任何适合侦测手段，包括此项技术中已知的用于侦测样本中的肽的侦测手段加以侦测及/或量测(定量)。举例而言，在本发明的一具体实例中，TFPI结合肽包含会产生信号的标记。例示性标记在本文中加以描述且包括例如放射性核种、萤光染料、同位素、酶受质及酶。方法包含量测由KD1-TFPI结合肽错合物产生的信号及比较由在测试化合物存在下形成的KD1-TFPI结合肽错合物产生的信号与由在不存在测试化合物下形成的KD1-TFPI结合肽错合物产生的信号。来自包含暴露于测试化合物的KD1-TFPI结合肽错合物的样本的信号的降低(相较于由未暴露于测试化合物的KD1-TFPI结合肽错合物的类似样本产生的信号)指示错合物形成已经抑制或破坏，且测试化合物为TFPI结合化合物。
本发明亦提供一种鉴别干扰TFPI-FXa相互作用的TFPI结合化合物的方法。该方法至少部分基于TFPI KD1与FXa的外部位点结合且有助于TFPI抑制FXa活性的惊人发现。在一态样中，该方法包含在测试化合物存在下使基本上由KD1组成的肽(亦即在不存在KD2下包含KD1的肽)与FXa在允许KD1与FXa结合的条件下接触。该方法另外包含比较在该测试化合物存在下的KD1-FXa结合与在不存在该测试化合物下的KD1-FXa结合。相较于在不存在该测试化合物下的KD1-FXa结合，在该测试化合物存在下的KD1-FXa结合减少指示该测试化合物为TFPI结合化合物。KD1-FXa结合可使用任何方法，诸如本文所述的方法加以侦测及/或定量。举例而言，对KD1或FXa进行标记，且比较由暴露于测试化合物的KD1-FXa错合物产生的信号与由未暴露于测试化合物的KD1-FXa错合物产生的信号。
鉴别TFPI结合化合物的本发明方法特定言的可经受此项技术中已知的各种高产量筛检技术检验。任何「测试化合物(test compound)」(例如小分子、肽、蛋白质(诸如抗体或其片段)、肽模拟物、或聚核苷酸(DNA或RNA))皆适于使用本文所述的方法进行筛检。必要时，使用本文所述的方法针对TFPI结合(及视情况抗TFPI活性)来筛检测试化合物的集合、群体或文库。存在用于鉴别TFPI抑制剂的许多不同文库，包括(但不限于)化学文库、天然产物文库、及包含肽及/或有机分子的组合文库。在一些态样中，化学文库由已知化合物或经由其他筛检方法鉴别为「匹配物(hit)」或「先导物(lead)」的化合物的结构类似物组成。天然产物文库为自微生物、动物、植物或海洋有机体分离或由微生物、动物、植物或海洋有机体产生的物质的集合。组合文库由大量肽或有机化合物(典型地呈混合物形式)构成。本文所述的方法亦适用于筛检呈现或核酸文库，诸如酵母呈现文库、细菌呈现文库、噬菌体呈现文库、核糖体呈现文库、mRNA呈现文库、RNA文库或DNA文库。一种筛检呈现文库的方法例示于实施例1中。本发明所涵盖的高产量筛检方法包括允许筛检数万至数十万种测试化合物的自动程序。
在另一态样中，用于鉴别TFPI结合化合物的本发明方法包含使包含KD1(或由KD1组成)的肽与测试化合物接触，及侦测该测试化合物与由对应于人类TFPI残基Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55的KD1氨基酸残基界定的TFPI结合位点(诸如由人类TFPI残基Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ile38、Ile46、Phe47及Ile55界定的结合位点)的结合。在一具体实例中，结合位点系由对应于人类TFPI残基Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47及Ile55的氨基酸残基界定。结合位点对应于JBT1857的TFPI结合位点，JBT1857为一种在许多功能性检定中抑制TFPI活性的TFPI结合肽。
本文所述的TFPI结合位点氨基酸残基系依据人类TFPI氨基酸序列，且编号系指所述氨基酸相对于人类TFPI的N端的位置。仅出于说明TFPI结合位点的位置的目的，包含KD1的人类TFPI的片段的氨基酸序列提供为SEQ IDNO：4234(DSEEDEEHTIITDTELPPLKLMHSF
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TRDNA(编码KD1的氨基酸26-75用粗体指示))。例如藉由比对多肽的氨基酸序列与SEQ IDNO：4234来鉴别其他TFPI多肽(诸如来自不同有机体的TFPI多肽、或TFPI多肽片段)的相应氨基酸。尽管在一具体实例中，包含TFPI KD1的肽不包含TFPI蛋白的负责TFPI活性的其他区域，但其他具体实例需要使用包含人类TFPI的氨基酸1-160(包含KD1及KD2)或包含全长人类TFPI(含有KD1-KD3)的肽。
测试化合物与本文定义的TFPI结合位点的结合系使用任何许多方法，包括本文所述的侦测方法来侦测。一种用于侦测结合的例示性方法采用核磁共振(NMR)来识别TFPI结合位点内的氨基酸残基处的化学位移。在TFPI氨基酸位置28-30、32、46、47及55、及视情况位置27、31、36-38及44处的化学位移表示测试化合物与TFPI上的此等氨基酸接触点有相互作用。为了确定特定氨基酸处存在或不存在由测试化合物结合引起的化学位移，比较自KD1-测试化合物错合物获得的NMR资料与自自由KD1肽获得的NMR资料。使用NMR来侦测测试化合物与TFPI KD1之间的结合进一步描述于实施例中。
或者，测试化合物与本文定义的TFPI结合位点的结合系藉由侦测TFPIKD1与其天然结合搭配物(例如FVIIa或FXa)的相互作用的能力的改变来间接测定。就此而言，方法包含在测试化合物存在下使包含TFPI KD1的肽与FVIIa在允许KD1与FVIIa结合的条件下接触，且比较KD1-FVIIa结合与在不存在测试化合物下的KD1-FVIIa结合。或者或此外，方法包含在测试化合物存在下使包含TFPI KD1的肽与FXa在允许KD1与FXa结合的条件下接触，且比较在测试化合物存在下的KD1-FXa结合与在不存在测试化合物下的KD1-FXa结合。视情况而定，包含KD1的肽亦包含KD2，且方法包含在测试化合物存在下使肽与FXa在允许KD2与FXa结合的条件下接触，且比较KD2-FXa结合与在不存在测试化合物下的KD2-FXa结合。在测试化合物存在下的KD1-FVIIa结合、KD1-FXa结合、或KD2-FXa结合的减小(相较于在不存在测试化合物下的KD1-FVIIa结合、KD1-FXa结合、或KD2-FXa结合)指示测试化合物为TFPI结合化合物。方法视情况包含在不存在测试化合物下使KD1及/或KD2与FVIIa及/或FXa接触来作为用于比较在测试化合物存在下的结合的参照。
KD与FVIIa或FXa的结合系使用任何适用于侦测蛋白质-蛋白质相互作用的方法，诸如本文所述的使用可侦测标记的方法加以测定及/或定量。或者，使用酶促检定来侦测测试化合物与TFPI结合位点的结合。FVIIa或FXa酶促活性为适用于评估蛋白质与TFPI KD1或KD2结合的代用物(surrogate)；结合本文定义的TFPI结合位点的测试化合物抑制TFPI活性，从而导致FVIIa及FXa活性增加。用于评估FVIIa或FXa活性的酶促检定详述于本文中。
本发明另外包括在本发明方法中鉴别为TFPI结合化合物的化合物、以及包含一或多种鉴别的化合物的组成物。用于分离或纯化化合物，诸如如本文所述鉴别的TFPI结合化合物(例如TFPI结合肽)的方法在此项技术中为已知的且在上文中加以描述。在一些态样中，如本文所述鉴别的TFPI结合化合物为会下调或除去一或多种TFPI活性的TFPI抑制剂。在一具体实例中，本发明包括一种用于纯化抑制FXa活性的化合物的方法。该方法包含使包含TFPIKD1的肽与化合物在允许形成化合物-KD1错合物的条件下接触，移出未结合的化合物，及解离化合物-KD1错合物以释放结合TFPI的化合物。提供如本文所述鉴别及/或纯化的TFPI抑制剂用于制造医药品，诸如用于治疗凝血病症的医药品的用途；以及一种用于治疗罹患疾病或处于罹患疾病的风险中的个体的方法，其包含向该个体投予该TFPI抑制剂。
此外，提供一种抑制人类TFPI的方法，其中该方法包含使人类TFPI与在由氨基酸残基Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55界定的结合位点处结合人类TFPI的抑制剂接触。本发明的另一态样包括一种治疗罹患疾病或处于罹患疾病的风险中的个体的方法。该方法包含向该个体投予在由氨基酸残基Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55界定的结合位点处结合人类TFPI的抑制剂。在一态样中，人类TFPI结合位点系由氨基酸残基Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ile38、Ile46、Phe47及Ile55界定，诸如由氨基酸残基Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47及Ile55界定的结合位点。接触本文定义的TFPI结合位点且抑制(下调或除去)一或多种TFPI活性的任何抑制剂皆适用于该方法的情形中。TFPI抑制剂视情况为TFPI结合肽，诸如具有本文所述的特性的TFPI结合肽。
本发明另外包括电脑储存媒体及用于模型化本文定义的TFPI结合位点中的候选TFPI-化合物的方法。蛋白质的三维(3D)模型化可连同各种测试TFPI结合化合物(例如肽或小分子)的3D模型一起使用来确定化合物与TFPI中的靶向氨基酸之间的拟合。因为若化合物不保持与TFPI连接持续一段足以实现生物反应的时期，则测试化合物抑制TFPI的效用可受限制，所以可预测两者保持偶合的趋势以产生亲和力等级。
藉由鉴于亲和力等级分析TFPI蛋白的3D表面及相应化合物与表面的拟合，可产生对化合物(例如肽)的修饰以改良表面与化合物之间的接触点的数目与接触点处的键的强度两者。基于化合物的候选者及基于肽的TFPI抑制剂的效用可使用此技术类似地加以模型化，此有助于合理设计TFPI结合化合物。KD1的三维(3D)表面的电脑模型允许测试各种肽或化合物与界定TFPI结合位点且抑制KD1的鉴别的氨基酸子集连接的能力。KD1蛋白的表面系在电脑上于3D空间中加以模型化，特定言的由KD1中的靶向氨基酸界定的表面。各种肽的3D模型例如可与表面匹配以确定有多少个目标TFPI氨基酸由肽接触且亦以产生预测肽将保持与目标表面连接多久的亲和力等级。
藉由更换肽模型及重复电脑模型化，可快速产生某一肽家族的亲和力等级。必要时，最有希望的肽变异体(例如在亲本肽的氨基酸序列内包含一或多个取代的第二肽)可拣选出以供进一步物理测试。
本发明提供一种具有电脑可执行指令的电脑储存媒体，当在电脑的处理器上执行时，该等指令实施一种模型化TFPI KD1蛋白中的所选三维(3D)点与测试化合物之间的相互作用的方法。该方法包含获得该TFPI KD1蛋白的蛋白质结构3D模型；确定该蛋白质结构中的所选子集的氨基酸之间的3D关系，其中该所选氨基酸子集包含Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55；模型化由该所选氨基酸子集界定的表面；获得测试化合物的测试化合物3D模型；匹配该测试化合物3D模型与由该所选氨基酸子集界定的表面；及鉴别该表面的所选氨基酸子集与该测试化合物3D模型之间的接触点。视情况而定，该方法另外包含确定该表面与该测试化合物3D模型之间的接触点的数目；及记录该测试化合物3D模型的对应于该接触点数目的亲和力等级。在一态样中，该所选氨基酸子集包含Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47及Ile55(或由该等氨基酸组成)。该方法另外视情况包含获得基于第二测试化合物的更新的测试化合物3D模型；匹配该更新的测试化合物3D模型与由该所选氨基酸子集界定的表面；及在该电脑的显示器上鉴别该表面的所选氨基酸子集与该更新的测试化合物3D模型之间的该等经鉴别的接触点。在一具体实例中，该方法另外包含确定该表面与该更新的测试化合物3D模型之间的该等接触点的数目；确定该表面与该更新的测试化合物3D模型之间的各接触点的结合型式；及基于该接触点数目及该表面与该更新的测试化合物3D模型之间的各接触点的结合型式的集合记录新亲和力等级。必要时，接着比较该更新的亲和力等级与该新亲和力等级以确定该测试化合物或该第二测试化合物是否具有较高亲和力等级。接触点可在电脑上显示，藉此有助于最佳化或设计TFPI结合化合物。
在另一具体实例中，电脑储存媒体具有当在电脑的处理器上执行时实施一种比较肽与TFPI库尼兹域1蛋白(KD1)中的所选三维点(3D)的方法的电脑可执行指令，该方法包含产生该KD1蛋白的蛋白质结构；确定该KD1蛋白中的所选氨基酸子集的三维模型，其中该氨基酸子集包含Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55；确定肽的三维模型；将该肽的3D模型与该所选氨基酸子集的3D模型拟合；及产生该肽对该所选氨基酸子集的亲和力，其中该亲和力系基于该子集中与该肽接触的氨基酸的数目及各接触点处的结合强度。
此外，提供一种比较测试化合物与TFPI KD1蛋白中的所选三维点的方法。该方法包含在电脑的记忆体中产生该KD1蛋白的蛋白质结构；在该电脑的处理器处确定该KD1蛋白中的所选氨基酸子集的三维模型，其中该所选氨基酸子集包含Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55；在该电脑的处理器处确定测试化合物的三维模型；在该电脑的处理器处将该测试化合物的3D模型与该所选氨基酸子集的3D模型拟合；及在该电脑的处理器处产生该测试化合物对该所选氨基酸子集的亲和力，其中该亲和力系基于该子集中与该测试化合物接触的氨基酸的数目及各接触点处的结合强度。在一些具体实例中，该方法另外包含显示该测试化合物与该所选氨基酸子集的3D模型之间的拟合的3D图像，且视情况对复数种测试化合物重复本文所述的步骤及储存该复数种测试化合物各自的各别亲和力。
参考图58，一种用于实施所主张的方法及设备的例示性系统包括呈电脑110的形式的通用计算装置。用虚线轮廓显示的组件在技术上不为电脑110的一部分，而是用于说明图58的例示性具体实例。电脑110的组件可包括(但不限于)处理器120、系统记忆体130、记忆体/图形介面121及I/O介面122。系统记忆体130及图形处理器190可耦接至记忆体/图形介面121。监视器191或其他图形输出装置可耦接至图形处理器190。
一系列系统汇流排可耦接各种系统组件，该等组件包括在处理器120、记忆体/图形介面121及I/O介面122之间的高速系统汇流排123、在记忆体/图形介面121与系统记忆体130之间的前侧汇流排124以及在记忆体/图形介面121与图形处理器190之间的高级图形处理(AGP)汇流排125。系统汇流排123可为若干类型的汇流排结构中的任一者，举例而言(但不限于)，此等架构包括工业标准架构(ISA)汇流排、微通道架构(MCA)汇流排及增强型ISA(EISA)汇流排。随着系统架构发展，其他汇流排架构及晶片组可加以使用但一般常遵循此样式。举例而言，诸如Intel及AMD的公司分别支持英特尔集线器架构(Intel Hub Architecture，IHA)及HypertransportTM架构。
电脑110典型地包括多种电脑可读媒体。电脑可读媒体可为可由电脑110存取的任何可用媒体且包括挥发性媒体与非挥发性媒体、抽取式媒体与非抽取式媒体。举例而言(但不限于)，电脑可读媒体可包含电脑储存媒体。电脑储存媒体包括在用于储存资讯(诸如电脑可执行指令、资料结构、程式模组或其他资料)的任何方法或技术中实施的挥发性媒体与非挥发性媒体、抽取式媒体与非抽取式媒体。电脑储存媒体包括RAM、ROM、EEPROM、快闪记忆体或其他记忆体技术、CD-ROM、数位多功能光碟(DVD)或其他光碟储存器、磁卡(magnetic cassette)、磁带、磁碟储存器或其他磁储存装置或实体体现电子资料的其他实体储存元件且排除任何传播媒体，诸如无线电波或调变载波信号。
系统记忆体130包括呈挥发性及/或非挥发性记忆体(诸如唯读记忆体(ROM)131及随机存取记忆体(RAM)132)形式的电脑储存媒体。系统ROM131可含有永久性系统资料143，诸如电脑特定构型资料。RAM 132典型地含有可由处理器120即刻存取及/或马上操作的资料及/或程式模组。举例而言(但不限于)，图58说明操作系统134、应用程式135、其他程式模组136及程式资料137。
I/O介面122可耦接系统汇流排123与将多种内部及外部装置耦接至电脑110的许多其他汇流排126、127及128。串列周边介面(SPI)汇流排126可与含有基本常式的基本输入/输出系统(BIOS)记忆体133连接，该等常式有助于诸如在起动期间在电脑110内的元件之间转移资讯。
超级输入/输出晶片160可用于与许多『旧式(legacy)』周边装置(诸如软磁碟152、键盘/鼠标162及列印机196)连接。在一些具体实例中，超级I/O晶片160可用汇流排127(诸如低接脚计数(LPC)汇流排)与I/O介面122连接。超级I/O晶片160的各种具体实例可在商业市场上广泛获得。在一具体实例中，汇流排128可为周边组件互连(PCI)汇流排。
电脑110亦可包括其他抽取式/非抽取式、挥发性/非挥发性电脑储存媒体。仅举例而言，图58说明自非抽取式、非挥发性磁性媒体读取或向非抽取式、非挥发性磁性媒体写入的硬磁碟驱动机140。硬磁碟驱动机140可为习知硬磁碟驱动机。
诸如通用串列汇流排(USB)记忆体153、火线(firewire)(IEEE 1394)或CD/DVD驱动机156的抽取式媒体可直接或经由介面150与PCI汇流排128连接。可用于例示性操作环境中的其他抽取式/非抽取式、挥发性/非挥发性电脑储存媒体包括(但不限于)卡式磁带、快闪记忆卡、数位多功能光碟、数位录影带、固态RAM、固态ROM及其类似物。
以上论述且于图58中所示的驱动机及其相关电脑储存媒体提供电脑可读指令、资料结构、程式模组及电脑110的其他资料的储存。在图58中，举例而言，硬磁碟驱动机140经图示为储存操作系统144、应用程式145、其他程式模组146及程式资料147。应注意此等组分可与操作系统134、应用程式135、其他程式模组136及程式资料137相同或不同。操作系统144、应用程式145、其他程式模组146及程式资料147在此处被给予不同编号以说明至少其为不同复本。使用者可经由输入装置，诸如鼠标/键盘162或其他输入装置组合向电脑20中输入命令及资讯。其他输入装置(图中未示)可包括微音器、操纵杆、游戏板、圆盘式卫星电视天线、扫描器或其类似物。此等及其他输入装置常经由I/O介面汇流排(诸如SPI 126、LPC 127或PCI 128)的一与处理器120连接，但可使用其他汇流排。在一些具体实例中，其他装置可经由超级I/O晶片160耦接至平行埠、红外介面、游戏埠及其类似物(未示出)。
电脑110可在经由网路介面控制器(NIC)170使用逻辑通信埠通向一或多个远程电脑(诸如远程电脑180)的网路环境中操作。远程电脑180可为个人电脑、伺服器、路由器、网路PC、对等装置或其他公用网路节点，且典型地包括以上关于电脑110所述的许多或所有元件。图58中所示的NIC 170与远程电脑180之间的逻辑连接可包括区域网路(LAN)、广域网路(WAN)或两者，但亦可包括其他网路。此等网络连结环境在办公室、全企业电脑网路、内部网路及网际网路中为平常的。
图59说明TFPI蛋白200的3D模型，其显示构成TFPI蛋白的代表性氨基酸202、204、206。相关TFPI蛋白的特定区域为未明确示出的KD1。所示表面系藉由置放构成蛋白质的氨基酸所形成。当研究或产生TFPI抑制剂时，由KD1区域中的特定氨基酸形成的表面为人所关注。如本文中更详细论述，KD1的生物效应藉由结合KD1区域内的某些氨基酸而受到抑制。详言的，此等目标氨基酸包括Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47及Ile55。
图60说明与以上所列目标氨基酸的至少一部分结合的肽300。
图61为一种模型化KD1与肽的相互作用的方法的图解。
可获得蛋白质的3D模型(方框302)且储存在电脑110的记忆体140上。该模型可使用已知工具局部产生或可自公共来源获得。在一具体实例中，蛋白质为TFPI KD1 200。
可确定蛋白质结构中所选子集的氨基酸之间的3D关系(方框304)。在一具体实例中，所选氨基酸子集包含Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55；且视情况另外包含Ala27、Asp31、Lys36及Ile38；且视情况另外包含Ala37及Phe44，但并非此处所列的每一氨基酸皆为结合以具有抑制(例如治疗)效应所需。亦即此组的其他子集亦可具有相关性质。
对于相关氨基酸的特定子集，由所选氨基酸子集界定的表面可经模型化。外部周边可由在各侧上不具有其他相关氨基酸的彼等氨基酸界定。表面的纹理可由子集中的各氨基酸的3D位置界定(方框306)。
可产生相关候选TFPI结合化合物(例如肽)的3D模型且储存在电脑110的记忆体140处(方框308)。
肽3D模型与由所选氨基酸子集界定的表面匹配或相拟合(方框310)。两者之间的最佳拟合可在相关点处，亦即在KD1的所选氨基酸上产生。若干电脑工具可用于此3D模型化及拟合且可用于产生3D模型并使一者与另一者匹配。一个实例为描述于以下的HADDOCK工具：「de Vries，S.J.，van Dijk，A.D.J.，Krzeminski，M.，van Dijk，M.，Thureau，A.，Hsu，V.，Wassenaar，T.及Bonvin，A.M.J.J.(2007)，HADDOCK versus HADDOCK：New features and performance ofHADDOCK2.0 on the CAPRI targets.Proteins：Structure，Function，andBioinformatics，69：726-733.doi：10.1002/prot.21723」。
表面的所选氨基酸子集的表面的模型与测试化合物(例如肽)3D模型之间的接触点可被鉴别，储存，且视情况在电脑110的监视器191上显示(方框312)。化合物(例如肽)可被修饰以增加接触点的数目或接触点处的键的强度。为了有助于模型化此效应，可开发以下进一步描述的度量标准来衡量化合物与相关蛋白质(在吾人的实例中为KD1)结合的亲和力。
此外，表面与化合物3D模型之间的接触点可被计数(方框314)且化合物3D模型的亲和力等级可对应于接触点的数目加以记录(方框316)。举例而言，若所有14个以上所列氨基酸被靶向且14者中的12者由化合物3D模型实际上接触或结合，则12/14或0.86的亲和力等级可被计算且记录。
然而，作为候选化合物偶合得多紧密及因此其可保持与KD1偶合多久的量度的亲和力等级可不仅用相关键的数目而且可用键的类型来更准确地加以描述。亦可确定各接触点的结合型式(方框318)。关于TFPI结合肽，分子间距离≤4埃(angstrom)的疏水键可与分子间距离为2.6-3.2埃的键相区别。在一具体实例中，小于3.2埃的键可经指定权重为1.5，且大于3.2埃的键可经指定权重为1.25。亲和力等级可使用此种加权法或另一加权法鉴于结合型式来更新或再计算(方框320)。举例而言，在先前实例中，若5个键为短键且7个键为长键，则新亲和力等级可为(5×1.5+7×1.25)/14＝1.16。
若仅靶向KD1的7个氨基酸且4个以短键连接，则亲和力等级可为(4×1.5)/7＝0.86。然而，在此情况下，当与其他亲和力等级进行比较时，将考虑较少所靶向的氨基酸。举例而言，所有等级皆可基于所要目标位点总数相对于标准进行校正。
若不欲再进行迭代，则不可采用方框322的分支且结果可被储存以供将来分析及决策(方框324)。若欲分析其他肽或先前测试的肽的变异体，则可采用方框322的是(yes)分支且相关肽的新或更新模型可被生成或以别的方式获得并储存(方框326)。可重复方框310至320处的步骤且当前操作的结果可与先前操作的结果比较以确定哪些肽/变异体具有较高亲和力等级且值得进行更多研究，包括可能的物理测试。
用3D模型化靶向特定位点及产生比较等级的能力允许相对容易地处理若非数千亦有数百个的样本并作出比较，从而避免x射线结晶术的时间及成本。此技术可尤其适用于与TFPI KD1的Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47、Ile55、Ala27、Asp31、Lys36、Ile38、Phe2、Ala37及Phe44氨基酸相关的模型化。
本说明书中引用的所有公开案、专利及专利申请案皆以引用的方式并入本文中，该引用的程度就如同已特定地及个别地指示将各个别公开案或专利申请案以引用的方式并入一般。此外，整个文件意欲以统一揭示内容形式来陈述，且应了解，涵盖本文所述的特征的所有组合，即使特征的组合并不一起见于本文件的同一语句或段落或章节中亦如此。举例而言，当描述蛋白质疗法时，明确涵盖涉及聚核苷酸疗法(使用编码蛋白质的聚核苷酸/载体)的具体实例，且相反亦成立。尽管已出于理解清晰性的目的而藉由图解及举例的方式相当详细地描述了前述发明，但一般技术者将根据本发明的教示而易于显而易知：可在不脱离随附申请专利范围的精神或范畴的情况下对本发明作出某些变化及修改。本发明包括例如在任何情况下范畴皆小于以上明确提及的变化形式的本发明的所有具体实例。关于按属描述的本发明的态样，所有个别种类皆个别地视为本发明的各别态样。关于以「一(个/种)」描述或主张的本发明的态样，应了解，除非上下文明确需要更具限制性的含义，否则此等术语意谓「一或多(个/种)」。关于经描述成某一组内的一或多者的要素，应了解，涵盖该组内的所有组合。最后，除非藉由陈述词「装置(means)」及功能而不陈述任何结构来定义申请专利范围要素，否则任何申请专利范围要素的范畴不意欲基于35U.S.C.§112第6段的运用来解释。
实施例
藉由参考以下实施例可更容易地理解如此大体描述的本发明，该等实施例系为了说明而提供，而不意欲限制本发明。
实施例1
以下实施例描述适于与TFPI结合的肽的产生、鉴别及筛检。
自商业供应商(例如PolyPeptide Laboratories SAS(Strasbourg，France)及JPT Peptide Technologies GmbH(Berlin，Germany))获得肽候选者。以上提供合成候选肽的方法。候选肽以三氟乙酸(TFA)盐形式合成，纯度为＞90％或＞60％。所有肽皆溶解于DMSO中以获得10mM的储备浓度。使用mRNA呈现文库鉴别TFPI结合肽序列。mRNA呈现技术因为允许起始池内具有1014种不同序列的多样性且避免例如为噬菌体呈现所需的活体内步骤而优于其他文库筛检技术。简而言的，该技术涉及经由嘌呤霉素(puromycin)分子直接连接mRNA至其编码的候选肽(图5)。mRNA呈现方法进一步描述于国际专利公开案第WO 2005/051985号及Liu等人，Methods in Enzymology，318，268-293(2000)中。TFPI经由生物素固定至固体支撑物上且暴露于候选肽-RNA错合物。分离TFPI结合的候选肽-RNA错合物，且RNA经逆转录以获得编码DNA。在使用竞争性洗提策略进行6至10轮选择之后获得高亲和力结合剂。许多候选肽的长度为31个氨基酸(27个随机化氨基酸及2个侧接两端的氨基酸)。
合成所选肽且对其使用基于微阵列的扫描分析进行肽最佳化以鉴别保留TFPI结合亲和力的肽片段。举例而言，使用肽的一系列的20个氨基酸的片段进行JBT0047的基于微阵列的扫描，该等片段的序列与19个氨基酸重迭。简而言的，N端经胺氧基乙酸酯修饰的肽印迹在Corning环氧化物玻璃载片上。在洗涤并干燥之后，载片在TECAN HS400TM培育站中加以处理。载片于含有0.1％TWEEN 20(TBST)的Tris缓冲盐水中洗涤2分钟，且于基于Tris的T-20SuperBlockTM缓冲液(5mM CaCl2)(Pierce)中阻断30分钟。在阻断之后，载片于TBST中洗涤2.5分钟。载片随后与DYLIGHTTM 649标记的TFPI(1μg/ml于基于Tris的T-20SuperBlockTM缓冲液(5mM CaCl2)中)一起培育45分钟，且用连续流动的TBST持续10分钟洗涤2次。对载片用盐水-柠檬酸钠缓冲液作最终洗涤持续2分钟，且空气干燥4分钟。将载片在Axon GenePix
Figure BPA00001610528801002
4000B扫描器中作扫描，且使用GenePix
Figure BPA00001610528801003
Pro软体分析扫描图。N端及C端截短分析补充扫描分析。微阵列扫描结果证明肽JBT0293以最高亲和力结合TFPI。产生基于JBT0293的氨基酸序列的一系列取代突变体且测试其TFPI结合性质。
经由用经生物素标记的肽进行的酶联免疫吸附检定(ELISA)样检定(结合(EC50)ELISA)证明一子集的肽对TFPI的亲和力。96孔MaxiSorp板(Nunc)经含3μg/mL TFPI的涂铺缓冲液(15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH 9.6)涂铺隔夜。板用350μl洗涤缓冲液(HNaT：175mMNaCl，25mM HEPES，5mM CaCl2，0.1％吐温80(Tween 80)，pH 7.35)洗涤3次，且随后用200μl含2％酵母抽提物的HNaT阻断2小时。板接着用350μl HNaT洗涤3次。经生物素标记的候选肽自DMSO储备溶液开始以200倍稀释于HNaT中。若在200倍稀释10mM肽储备溶液期间无沈淀出现，则初始肽浓度为50μM。若形成沈淀，则对肽于DMSO中的储备溶液进行预稀释。经稀释的肽施加至Maxisorp板上，产生连续稀释液(1/3)，且在室温下培育稀释液1.5小时。在培育之后，进行3步洗涤(350μl HNaT)。结合肽藉由与辣根过氧化酶结合的抗生蛋白链菌素一起培育(1小时)加以侦测，随后用HNaT进行3步洗涤且随后进行所添加TMB(3，3′5，5′-四甲基联苯胺)的显色转化。检定结果展示于图6A中。
一般而言，与经固定TFPI结合的肽显着在背景以上。经生物素标记的肽的EC50值在图32-39中给出。一种TFPI结合肽JBT0132的结合曲线描述于图7中。JBT0132的EC50经计算为约2.2nM。
此外，使用作为「示踪剂(tracers)」的经生物素标记的TFPI结合肽与未经生物素标记的候选肽竞争结合TFPI来进行竞争(IC50)ELISA。检定原理描述于图6B中。96孔MaxiSorp板(Nunc)经含3μg/mL TFPI的涂铺缓冲液(15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH 9.6)涂铺隔夜。TFPI的浓度可视特定检定条件而改变；在本文参考的其他IC50ELISA检定中，涂铺缓冲液含有0.05μg/mlTFPI。板用350μl洗涤缓冲液(HNaT：175mMNaCl，25mM HEPES，5mMCaCl2，0.1％吐温80，pH 7.35)洗涤3次，且用200μl含2％酵母抽提物的HNaT阻断2小时。板接着用350μl HNaT洗涤3次。经生物素标记的示踪肽以对应于其在结合ELISA中测定的各别EC90值的浓度(若n＞2，则取中值)加以施用。肽的竞争剂储备溶液(10mM)以33.3倍稀释于不含HSA的HNaT中，且用含3％DMSO的HNaT制备连续3倍稀释液。用于特定检定中的稀释策略将视肽的亲和力而定。稀释液进一步用经生物素标记的示踪肽以1∶6的比率(20μl竞争剂稀释液与100μl示踪肽)稀释。竞争剂与示踪肽的混合物施加至经TFPI涂铺的微量滴定板上且培育1.5小时。板用350μl HNaT洗涤3次。肽-TFPI结合藉由以下加以侦测：向微量滴定板施加HRP结合的抗生蛋白链菌素，培育混合物1小时，用350μl HNaT将板洗涤3次，施加TMB(3，3′5，5′-四甲基联苯胺)，且侦测随后由HRP对TMB进行的显色转化。代表性未经生物素标记的肽的IC50图提供于图8A-8D中。肽JBT0303、JBT0120及JBT0224的IC50量测结果阐述于表3中。
表3
  肽   IC50[μM]   n   SD   示踪肽   示踪剂浓度[μM]
  JBT0303   0.119   2   0.064   JBT0131   0.0409
  JBT0120   0.0189   3   0.0044   JBT0124   0.0718
  JBT0224   n.a.   1   JBT0126   0.240
除竞争ELISA(IC50)检定的外，亦采用筛检检定来平行量测更多数目的肽。筛检ELISA类似于竞争IC50ELISA，例外的处为仅采用3种不同浓度的竞争剂(对于JBT0047种类而言为300nM、100nM及33.3nM，且对于JBT0122种类而言为50000nM、16667nM及5556nM)。在一些情况下，筛检结果表示为示踪信号相对于竞争肽(对于JBT0047家族而言为竞争肽JBT0477，且对于JBT0122家族而言为竞争肽JBT1697)的抑制百分比。根据本文阐述的方法制备且筛检的肽的竞争IC50检定结果及筛检检定结果提供于图32-39中。图32-39中呈现的平均IC50值系基于数目大于表3中呈现的值的检定数目的检定，且因此值可能略微不同。筛检ELISA的结果呈现为示踪肽JBT0131结合的抑制百分比。使用IC50ELISA分析的若干肽根据其如表4中所阐述的结合亲和力在图32-39中加以分类。
表4
  TFPI竞争ELISA IC50[nM]   组
  ＜50nM   A
  50≤x＜100nM   B
  100≤x＜250nM   C
  250≤x＜1000nM   D
  1000≤x＜5000nM   E
  5000≤x＜10000nM   F
  10000≤x＜50000nM   G
使用本文所述的方法鉴别的例示性TFPI结合肽呈现于表5中。一些肽经生物素标记，且许多包含N端及C端离氨酸以促进溶解性。如下所述，若干肽在模型及/或原生质检定系统中展现TFPI抑制活性。
表5
Figure BPA00001610528801041
此实施例提供产生及特性化TFPI抑制肽的例示性方法。发现表5中的所有肽皆结合人类TFPI-1α。突变分析证明TFPI结合肽中的至少1个氨基酸可经取代，同时该肽保留对TFPI的亲和力。表5的于ELISA检定中测试的肽结合TFPI-1α的EC50小于10μM(1×10-5M)且IC50小于50μM。
实施例2
进一步在「抗目标(anti-target)」结合方面特性化所选TFPI结合肽。此实施例证明TFPI抑制肽展现对非TFPI-1蛋白的亲和力降低。
TFPI-2由于其与TFPI-1的类似性而被选作抗目标。使用BIAcore 3000TM表面电浆子共振检定(GE Healthcare，Chalfont St.Giles，UK)研究TFPI结合肽对人类TFPI-1(在C端，残基29-282与含10个His的标签融合；MW 41kDa(R&D Systems，Minneapolis，MN；目录号2974-PI))、鼠类TFPI-1(在C端，残基29-289与含10个His的标签融合；MW 41kDa(R&D Systems；目录号2975-PI))、及TFPI-2(R&D Systems，Minneapolis，MN)的结合动力学。TFPI蛋白系藉由胺偶合化学以500RU为目标固定在C1晶片(GE Healthcare，订购码：BR-1005-40)上。若干TFPI结合肽用作用于与固定的TFPI蛋白相互作用的分析物。利用30μl/min的流速。在180秒之后，以在3.84nM至656.25nM的范围内的6种不同浓度注射180μl肽溶液，随后解离480秒的时间。晶片用45μl 10mM NaOH再生。各结合实验皆先前进行且随后用HBS-P缓冲液(10mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl，0.005％P20)外加1％DMSO及0.8％P80进行4次量测。BIAevaluation
Figure BPA00001610528801051
第4.1版软体(GE Healthcare)用于分析资料。相对于1∶1朗缪尔(Langmuir)结合曲线拟合感测器图谱(sensorgram)以确定kon及koff且计算KD。
某些经测试的肽(例如JBT0050、JBT0121、JBT0205及JBT0211)与空白细胞结合且彼等感测器图谱的结合常数不可确定。JBT0133显示与TFPI-1结合微弱。其他肽的感测器图谱给出可靠结合常数。若干TFPI抑制肽的BIAcore分析结果提供于表6及图19-21中。表6中列出的各肽皆呈现小于10μM的KD。除以下所列的肽的外，JBT0293在氨基酸位置5处(JBT0375)或氨基酸位置5及10处(JBT0477)经取代的突变体JBT0375及JBT0477亦展现小于10μM的KD。图9A及9B提供两种肽的感测器图谱。
表6
  肽   kon(1/Ms)   koff(1/s)   KD(M)
  JBT0047   4.0×105   1.9×10-2   4.7×10-8
  JBT0120   1.17×106   4.78×10-2   4.08×10-8
  JBT0131   1.4×105   6.0×10-2   4.31×10-7
  JBT0132   3.55×104   3.26×10-2   9.17×10-7
  JBT0224   6.39×104   1.95×10-2   3.05×10-7
  JBT0293   6.0×105   5.6×10-2   9.5×10-8
  JBT0297   5.0×105   1.4×10-2   2.9×10-8
  JBT0303   8.13×105   2.75×10-2   3.4×10-8
  JBT0305   7.5×105   3.1×10-2   6.1×10-8
亦检查与TFPI-2抗目标的相互作用。由候选肽与人类TFPI-2相互作用所产生的最大信号比用TFPI-1作为相互作用搭配物所获得的信号低得多。低TFPI-2结合信号的动力学分析易于出错；因此，感测器图谱的目视比较用于估计结合亲和力。说明JBT0120与TFPI-1及TFPI-2结合的感测器图谱以图10A及10B形式提供。相较于JBT0120对TFPI-1的结合亲和力，其结合TFPI-2的亲和力低10倍。亦发现JBT0132展现对TFPI-1的亲和力比对TFPI-2的亲和力大至少10倍。
由此实施例提供的资料证实TFPI抑制肽特异性结合TFPI-1。
实施例3
以下实施例描述使用FXa抑制及外在因子X酶抑制检定来特性化实施例1中鉴别的所选肽的TFPI抑制活性。两种检定均预测原生质系统中的活性。外在因子X酶检定给出对肽对(a)FXa与TFPI的相互作用及(b)FXa-TFPI错合物与TF-FVIIa错合物的相互作用的影响的理解。FXa抑制检定仅量测肽对FXa与TFPI的相互作用的影响。
外在因子X酶错合物负责在起始凝血过程后活化FX及FIX。外在错合物由FVIIa、组织因子(TF)及FX受质构成。为了确定肽对外在因子X酶错合物的TFPI介导的抑制的影响，建立偶合酶检定。肽自10mM储备溶液(于DMSO中)起始稀释6.25倍且进一步以连续4倍稀释度于缓冲液或DMSO中加以稀释以防止不合需要的沈淀。TFPI于HNaCa-HSA或BSA(25mM HEPES；175mM NaCl；5mM CaCl2；0.1％HSA或BSA；pH 7.35)中稀释。添加皆于HNaCa-HSA中稀释的FVIIa、脂质化TF、磷脂小泡(DOPC/POPS 80/20)及对FXa具有特异性的显色受质(S-2222(可得自DiaPharma，West Chester，OH))至96孔板中。在一段培育期之后，添加TFPI及肽稀释液，从而产生2.5％DMSO(若存在于肽储备溶液中)的最终浓度。藉由添加FX至孔中来起始FX活化。藉由使用微板读取器观测吸光度的增加来测定FXa介导的显色受质转化。在某些时间点产生的FXa的量根据OD读数来计算。在反应开始之后20分钟时产生的FXa经考虑用于根据肽浓度相对于TFPI的抑制(％)的曲线来计算EC50。
亦使用FXa抑制检定检查TFPI的功能性抑制。添加均于HNaCa-HSA中稀释的FXa特异性显色受质(S-2222)及TFPI至96孔板中。肽自10mM储备溶液(于DMSO或Aqua-Dest中)起始稀释6.25倍且进一步以连续4倍稀释度于缓冲液或DMSO中加以稀释以防止不合需要的沈淀。添加肽稀释液(2.5μl)至96孔板中，从而产生2.5％DMSO(若存在于肽储备溶液中)的最终浓度。显色受质的转化藉由添加FXa来触发，且于微板读取器中量测转化的动力学。因为TFPI缓慢抑制FXa，所以在115分钟之后的OD读数经考虑用于根据肽浓度相对于TFPI的抑制(％)的曲线来计算EC50。
外在因子X酶检定及FXa抑制检定的结果提供于表7及图22-27中。
表7
Figure BPA00001610528801071
参考表7，JBT0120、JBT0132及JBT0224以＜2μM的EC50恢复在TFPI-1存在下的外在错合物介导的FX活化，从而导致抑制介于约20％至约60％之间的TFPI活性。JBT0047(EC50＝1.4μM)、JBT0131(EC50＝2.2μM)及JBT0293(EC50＝2.9μM)亦恢复在TFPI-1存在下的外在错合物活性。此外，JBT0120、JBT0132、JBT0224及JBT0303以＜5μM的EC50恢复FXa抑制检定中在TFPI-1存在下的FXa活性，从而导致抑制介于约5％至约50％之间的TFPI活性。JBT0047(EC50＝0.7μM)、JBT0131(EC50＝8.2μM)、JBT0293(EC50＝1.3μM)、JBT0297(EC50＝0.6μM)及JBT0305(EC50＝2.3μM)亦恢复FXa抑制检定中在TFPI-1存在下的FXa活性。此实施例证实本发明的肽为TFPI拮抗剂。
实施例4
在此实施例中，使用基于血浆的检定测定肽的TFPI抑制活性。
在凝血酶特异性萤光受质Z-Gly-Gly-Arg-AMC缓慢裂解之后，一式两份在Fluoroskan Ascent
Figure BPA00001610528801081
读取器(Thermo Labsystems，Helsinki，Finland；滤波器为390nm激发及460nm发射)中经由校正自动血拴图像(calibrated automatedthrombography)量测肽对凝血酶产生的影响(Hemker，Pathophysiol.Haemost.Thromb.，33，4-15(2003))。获得患有FVIII或FIX不足的患者的血浆(GeorgeKing Bio-Medical公司，Overland Park，KN)以用于测试。各血浆的残余凝血因子活性皆低于1％。作为抗体介导的FVIII不足的模型，冷冻汇合的正常血浆(George King Bio-Medical公司，Overland Park，KN)与添加后获得50BU/mL的于山羊中产生的高效价热不活化抗人类FVIII血浆(4490BU/ml；BaxterBioScience，Vienna，Austria)一起培育。血浆与玉米胰蛋白酶抑制剂(CTI)(Hematologic Technologies公司，Essex Junction，VT)混合以抑制因子XIIa污染，从而产生40μg/mL的最终浓度。
添加预先温热(37℃)的血浆(80μL)至96孔微板(Immulon 2HB，透明U形底部；Thermo Electron，Waltham，MA)的各孔中。为了触发由组织因子产生凝血酶，添加10μL含有低量(12pM)重组人类组织因子的低PPP试剂及由磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱及磷脂酰乙醇胺构成的磷脂小泡(48μM)(Thrombinoscope BV，Maastricht，The Netherlands)。肽自10mM储备溶液起始用DMSO稀释7.5倍，且进一步用Aqua-Dest稀释8.33倍，从而产生12％的DMSO浓度，提供最终检定混合物中0.5％的DMSO浓度。仅在将板放入预加温(37℃)的读取器之前，添加5μL含5mg/mL人类血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司，St.Louis，Missouri，USA)的HEPES缓冲盐水或含12％DMSO的Aqua-Dest，随后添加肽稀释液或参照蛋白质(FVIII Immunate参照标准物(Baxter BioScience，Vienna，Austria)；因子VIII抑制剂旁路活性(FEIBA)参照标准物(Baxter BioScience，Vienna，Austria)；NovoSeven(Novo Nordisk，Denmark)；及纯化人类血浆FIX(Enzyme Research Laboratories，South Bend，IL))。凝血酶产生系藉由将20μL含有萤光受质的FluCa试剂(ThrombinoscopeBV，Maastricht，The Netherlands)及经HEPES缓冲的CaCl2(100mM)分配入各孔中来起始。在37℃下记录萤光强度。
使用ThrombinoscopeTM软体(Thrombinoscope BV，Maastricht，TheNetherlands)及修正内部滤波器影响及受质消耗影响的凝血酶校正剂来计算所得凝血酶产生曲线的参数(Hemker，Pathophysiol.Haemost.Thromb.，33，4-15(2003))。为了计算与参照蛋白质(例如FVIII Immunate
Figure BPA00001610528801091
参照标准物、FEIBA参照标准物)等效的某些肽浓度的凝血酶产生活性，各凝血酶产生曲线的峰值凝血酶量(峰值凝血酶，nM)相对于标准浓度进行绘图，且藉由非线性演算法进行拟合。基于此校正，计算FVIII Immunate、FIX、FEIBA或NovoSeven的等效活性。各种肽的结果提供于图12-18及28-30中。代表性结果提供于表8中(*表示FVIII不足血浆系自不同供体获得)。
表8
Figure BPA00001610528801092
参考表8，JBT0120、JBT0132、JBT0224及JBT0303改良缺乏FVIII的血浆中的TFPI依赖性凝血酶产生至超过含有FVIII的血浆中的凝血酶产生程度的1％程度(FVIII等效活性％)。测试的肽在FVIII不足血浆中展现约5％-40％的FVIII等效活性。JBT0120及JBT0132以剂量依赖性方式改良峰值凝血酶及峰值时间，如图11A及11B中所示。
基于JBT0293的氨基酸序列的取代突变体亦在基于血浆的检定以及实施例3中描述的FXa抑制及外在因子X酶抑制检定中加以测试。代表性结果提供于表9中。
表9
Figure BPA00001610528801101
另外，包含JBT0293的氨基酸序列但在JBT0293序列的氨基酸位置5及10处经取代的JBT0477改良FVIII不足血浆中的凝血酶产生等效于413mU/mlFVIII(在1μM肽下)。JBT0293的取代突变产生就对TFPI的亲和力而言经高度最佳化的肽且改良FXa抑制检定、外在因子X酶抑制检定及基于血浆的检定中的活性。
实施例5
以下实施例证明本发明的肽可藉由添加会增强该等肽的物理化学或药物动力学性质的部分加以修饰。如以下所说明，向本文所述的肽中添加40kDaPEG显着改良该等肽的药物动力学特性。该实施例亦描述TFPI结合肽JBT1857的最佳化以降低对蛋白水解的敏感性。
使化学或生物部分与肽结合的方法在此项技术中为已知的。为了向本文所述的肽中添加PEG(聚乙二醇)，添加官能基(AOA＝胺氧基乙酸酯)至肽的N端中以达成与醛及酮偶合。或者，添加半胱氨酸至肽的C端部分中以达成与顺丁烯二酰亚胺偶合(Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press(1996))。肽(JBT1586)AOA-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2(SEQ IDNO：166)及(JBT1587)Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKLC-NH2(SEQ IDNO：167)分别用于以PEG进行的N端修饰及C端修饰。AOA-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2(SEQ ID NO：166)及Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKLC-NH2(SEQ ID NO：167)分别与过量40kDa mPEG-丙醛(SUNBRIGHT ME-400AL2，NOF，Japan)及40kDa mPEG-顺丁烯二酰亚胺(SUNBRIGHT ME-400MA，NOF，Japan)一起培育。相较于起始结构Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2(JBT0740)(SEQ ID NO：66)，所得聚乙二醇化肽JBT1852及JBT1855显示类似亲和力。
所得聚乙二醇化肽在小鼠中显示显着增加的血浆稳定性及延长的血浆半衰期。图31说明在向小鼠静脉内投药之后，相较于C端聚乙二醇化肽JBT1855(Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKLC(PEG(40kD))-NH2)(SEQ ID NO：252)，自由肽JBT0740(Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2)(SEQ IDNO：66)的药物动力学分析结果。与未聚乙二醇化肽相反，在投药后100分钟时，聚乙二醇化肽以高浓度存在于小鼠血浆中。未聚乙二醇化肽快速自血浆清除。图40说明在皮下注射之后，JBT1855的药物动力学分析结果。JBT1855亦强烈改良实施例4中描述的检定中的凝血酶产生(图41)。
JBT1852及JBT1855肽亦在实施例1-4中描述的检定中加以特性化且与JBT0740及JBT0047家族中的其他肽进行比较。代表性结果提供于以下阐述的表10中。
表10
Figure BPA00001610528801111
*调配于25mm HEPES(pH 7.35)、175mM NaCl中
亦检定表10中列出的肽与TFPI-2抗目标的相互作用，且产生的信号对于可靠亲和力量测而言过低。资料表明聚乙二醇化不除去本发明的肽的抑制活性或负面影响对TFPI-1的选择性。
基于细胞的外在因子X酶检定
上述TFPI结合肽恢复外在因子X酶错合物介导的转化FX至FXa的能力亦使用基于细胞的外在因子X酶检定加以确定。基于细胞的外在因子X酶检定亦采用来研究聚乙二醇化对本发明的例示性TFPI结合肽JBT0740的影响。人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)经计数且以每孔1.5×10个细胞的密度接种于96孔板(黑色扁平状，具有透明底部)中的完全生长培养基中。使细胞生长隔夜(约16至18小时)，用预加温的基本培养基洗涤2次，在37℃下用1ng/ml重组TNFα(Sigma Aldrich(目录号T6674))于200μl基本培养基中刺激4小时，且用200μl预加温的细胞培养缓冲液洗涤2次。含有FVIIa(EnzymeResearch Laboratories)的缓冲液(50μl)、TFPI结合肽(溶解于DMSO或有或无0.1％吐温80的Hepes缓冲盐水中)或αTFPI抗体施加至细胞中，且在37℃下培育20分钟，从而允许FVIIa/TF错合物形成及TFPI拮抗剂与TFPI结合。在培育期之后，50μl含有FX及FXa特异性受质(Fluophen FXa(HYPHENBioMed))的细胞培养缓冲液施加于细胞上，从而产生最终体积100μl的细胞培养缓冲液混合物。最终浓度为：39pM FVIIa；170nM FX；250μM FluophenFXa及2.5％DMSO(当肽溶解于DMSO中时)。
将96孔板转移至预加温(37℃)的萤光读取器中以用于侦测由FXa进行的FXa特异性萤光受质转化，FXa系由TF/FVIIa错合物在经刺激的HUVEC的表面上产生。在培育9分钟之后获取的读数用于计算TFPI结合肽或抗体的TFPI抑制效应。在以下肽(属于JBT0047家族)的各种浓度下观测的TFPI的近似抑制百分比阐述于表11中：JBT0717(Ac-FQSK-Nmg-NVFVDGYFERLRAKL-NH2)(SEQ ID NO：61)、JBT0740(Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2)(SEQ ID NO：66)、JBT 1584(Ac-FQSK-Nmg-NVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2)(SEQ ID NO：164)及JBT1857(Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKL-NH2)(SEQ ID NO：178)。
表11
Figure BPA00001610528801121
亦使用基于细胞的外在因子X酶检定测试聚乙二醇化肽。JBT0740(SEQID NO：66)在N端处与1kD PEG部分结合以产生JBT1853或在C端处结合以产生JBT1854。JBT1853及JBT1854抑制TFPI 20％或20％以下，视检定中使用的肽的量而定。在C端处包含40kD PEG部分的JBT1855(亲本肽JBT0740)在基于细胞的检定中表现优于在N端处包含40kD PEG部分的JBT1852。JBT1855介导20-30％TFPI抑制，而JBT1852抑制TFPI活性达10％或10％以下。
JBT0120家族的肽JBT0120、JBT0415、JBT0444、JBT1426及JBT1837亦在基于细胞的外在因子X酶检定中加以测试且发现其相较于JBT0047家族的肽，在较小程度上抑制TFPI。降低或部分抑制活性可为本发明的一些具体实例中所需。与JBT0047家族的肽类似，肽最佳化使JBT0120家族肽的TFPI抑制剂活性增加。
在检查JBT1857的稳定性及抑制活性的过程中，确定肽的氨基酸序列在Val9与Asp10之间含有蛋白酶裂解位点。位置9处的Tle的取代(产生JBT2431)及位置10处的Pro的取代(产生JBT2432)阻断肽的裂解且使肽的血浆稳定性增强约3倍，即自27％(JBT1857)至82％(JBT2431)及76％(JBT2432)。在Gly11与Tyr12之间鉴别出另一推定裂解位点。G11a取代(产生JBT2414)进一步使肽的稳定性改良至100％。所有稳定性皆在于人类血浆中培育24小时之后藉由定量ELISA测定。
上述结果证明利用非习知氨基酸进行本文所述的TFPI结合肽的最佳化改良TFPI抑制及血浆稳定性。另外，本发明的聚乙二醇化肽在基于细胞的外在因子X酶检定中抑制TFPI活性，其中C端聚乙二醇化肽表现优于N端聚乙二醇化肽。本发明的TFPI结合肽抑制自由TFPI与细胞结合的TFPI两者的活性。
实施例6
以下实施例说明本文所述的肽降低动物模型中出血的能力。
10周龄的C57Bl/6NCrl小鼠在研究之前经舍养(housed)2周。在爪甲修剪之前30分钟，向动物投予(a)JBT1855(10mg/kg)，经由尾静脉静脉内(i.v.)或在颈区中皮下(s.c.)，(b)抗TFPI抗体(18mg/kg；i.v.)，或(c)媒剂(175mMNaCl，25mM HEPES(pH 7.35)；10ml/kg；i.v.)。在爪甲修剪之前10分钟用80mg/kg戊巴比妥(pentobarbital)麻醉动物。为了达成出血，移除右后爪的小趾的爪甲。将爪浸没于0.9％NaCl溶液中以用于收集血液持续60分钟的时期。在溶解之后藉由分光光度法对失血进行定量。温度在整个实验过程中保持恒定于37℃。研究结果说明于图42中且概述于表11中。
表11
  JBT1855i.v.   JBT1855s.c.   α-TFPIi.v.   媒剂i.v.
  平均值(以μl计)(SD)   29.9(71.4)   31.7(31.5)   1.9(1.4)   74.9(74.6)
  小鼠的数目   12   12   12   12
  p值   0.07   0.04   0.001
相较于用单独媒剂处理，静脉内或皮下投予本发明的聚乙二醇化肽JBT1855减少小鼠中的失血。
实施例7
以下实施例描述经由核磁共振及x射线结晶学对TFPI-肽相互作用进行特性化。特定言的，在分子层面上使用2D 15N-杂核单量子相干(HSQC)光谱研究拮抗肽JBT0303、JBT0122及JBT0415的TFPI结合位点；JBT0303、JBT0122及JBT0415的与TFPI160相互作用的残基；及错合及自由JBT0303、JBT0122及JBT0415的二级结构。使用x射线结晶学检查JBT1857与TFPI的KD1的相互作用，且定位TFPI KD1的介导JBT1857结合的残基。
鉴别TFPI160上的JBT0303结合位点
15N-标记的TFPI160制备物用于以JBT0303进行的TFPI160的滴定实验。在30℃下在Varian 600MHz光谱仪上记录不含及含递增量的肽的约500μM15N-TFPI160样本的HSQC光谱。肽-蛋白质相互作用显示缓慢交换特性(kex＜＜Δω)，意味各TFPI残基对自由蛋白质及蛋白质-肽错合物产生有限的信号。不同于混合物仅产生1个根据物种群体的具有平均位置的峰的快速交换特性(kex＞＞Δω)，缓慢交换特性不允许在肽结合后追踪信号。因此，为了定位结合位点，需要赋值TFPI160-JBT0303错合物的移位峰(shifted peak)。此需要制备13C/15N-TFPI160及JBT0303的样本。
最初，用992μM 13C/15N-TFPI160及1190μM JBT0303制备样本。然而，NMR样本产生不允许赋值错合物的不良品质光谱。样本发生胶化，可能由于形成高分子量聚集体。因此，所得NMR资料主要显示由经同位素标记的TFPI160的最具可挠性部分产生的信号。因此，再研究样本条件以用于进一步实验。根据对TFPI160-JBT0303错合物进行的一系列15N-HSQC实验，推断凝胶形成可藉由样本稀释及在高温下获取资料加以避免。13C/15N-TFPI160的最终浓度为331μM且JBT0303的最终浓度为397μM。光谱品质得以改良。归因于较低浓度及降低的杂讯比，必须基于HNCA、HNCO及HNCOCA实验进行赋值。
除4个先前赋值的残基以外，脱辅基TFPI160(apo-TFPI160)中可赋值的所有残基皆可在TFPI160-JBT0303错合物中赋值。一些残基的赋值由于3D光谱中缺乏峰而不明确。此外，3个残基的峰仅在来自原始滴定实验的HSQC光谱中可见。然而，附近的所有峰皆经明确赋值，且因此此等残基的赋值可能为正确的。
相较于自由TFPI160，与JBT0303结合的15N-TFPI160的HSQC信号的化学位移变化说明于图43中。经受最强化学位移的残基仅在库尼兹域1上。残基F25、F28、D32、A37、T48及Y56的化学位移移位最大(＞2ppm)。残基I38、I46、F47及F54亦移位超过1.5ppm。不明确是否F25的残基N端涉及与JBT0303的相互作用，因为残基20-24未经赋值。L19显示化学位移总计变化约0.6ppm。因此，与先前咸信TFPI的残基1-18内的氨基酸涉及于肽结合中相反，本资料表明即使有亦仅有少许肽与TFPI的N端尾部结合。图44中阐述TFPI蛋白的二级结构的带状模型，其说明相较于自由TFPI160，与JBT0303结合的TFPI160的HSQC信号的化学位移变化的区域。
为了更特定鉴别TFPI160上的JBT0303结合位点，测定15N-TFPI160及15N-TFPI160+JBT0303的酰胺交换速率。酰胺交换实验主要藉由量测酰胺基的H交换来侦测肽骨架的环境中的变化。用足够高以致不因松弛而消散的能量来照射H2O频率，从而导致H2O信号的完全饱和及抑制。H2O信号抑制的此方法的副作用在于抑制转移至与溶剂交换(H/H交换)的可交换酰胺NH。饱和转移取决于半定量的H/H交换速率。对于经更多保护的NH基团而言，该作用降低(亦即未经保护的NH比经保护的NH衰减更多)。若经保护的NH处于配位体的H-α附近，则相较于脱辅基形式，较高交换速率被观测到。类似地，H交换可由Ser、Thr或Tyr的OH基团介导。
记录脱辅基15N-TFPI160及15N-TFPI160-JBT0303错合物的无及有水抑制的HSQC光谱。藉由计算有及无水抑制的HSQC光谱中的峰强度的比率来确定TFPI160的各残基的相对交换速率。15N-TFPI160的资料集与15N-TFPI160+JBT0303的资料集的比较揭示TFPI残基25、26、36、62、63、127、132及152在错合物中展现降低大于10％的酰胺交换速率，而残基29、30、42、45、49、50、56、66及98展现增加超过10％的交换速率。
包括以下源于酰胺交换实验的约束来计算改进的HADDOCK模型：(a)扭转角系取自JBT0303的K4、K5、V7、F8、Y12-A18的TALOS的计算值(化学位移实验)；(b)KD1的化学位移变化超过1.5ppm的以下残基涉及于结合JBT0303中：F25、F28、D32、A37、I38、I46、F47、T48、F54及Y56(化学位移实验)；(c)JBT0303的两性螺旋的疏水侧与KD1结合：JBT0303的Y12或L16或L20与KD1的D32或A37或I38或F54或Y56结合(化学位移实验)；(d)JBT0303的R15或K19与KD1的D31或D32或E60结合(化学位移实验)；(e)JBT0303的F8或V9与KD1的F25或F28结合(化学位移实验)；(f)JBT0303的Y12或F13与KD1的I46或F47或T48结合(化学位移实验)；(g)JBT0303的Q2与KD1的Y56结合(化学位移实验)；(h)JBT0303的F1与KD1的M39或F66结合(酰胺交换实验)；(i)JBT0303的S3或K4或K5与F66结合(酰胺交换实验)；(j)JBT0303的V7或F8或V9与KD1的F25或C26或N62或Q63结合(酰胺交换实验)；(k)JBT0303的V9或D10或G11或R15与KD1的F28或K29或A30结合(酰胺交换实验)；(l)JBT0303的Y12或F13与KD1的N45结合(酰胺交换实验)；(m)Y12或F13或E14或R15与KD1的R49或Q50结合(酰胺交换实验)；及(n)JBT0303的L20与KD1的K36结合(酰胺交换实验)。资料汇集成KD1+JBT0303错合物的基本上1个模型。
鉴别TFPI160上的JBT0122结合位点
如同13C/15N-TFPI160+JBT0303错合物一样，13C/15N-TFPI160+JBT0122NMR样本由于形成凝胶而产生品质不良的光谱。723μM 13C/15N-TFPI160+JBT0122的浓度导致形成高次(higher order)聚集体。样本稀释至361.5μM且在37℃下记录光谱，从而产生改良的光谱品质。获得HNCO、HNCA及HNCOCA光谱。除5个残基以外，脱辅基TFPI160的所有先前赋值的峰可在TFPI160-JBT0122错合物中加以赋值。经受最强化学位移变化且可能与肽相互作用的残基常不在3D光谱中产生峰。然而，库尼兹域1(KD1)与库尼兹域2(KD2)之间的连接区域中的峰亦展现较低强度。因此，此等峰的赋值不明确。一些峰仅在原始滴定实验的HSQC中可见。在大多数情况下，其赋值为确定的，因为在TFPI160及TFPI160+JBT0122HSCQ光谱中峰重迭。
与JBT0122结合的15N-TFPI160相较于自由TFPI160的HSQC信号的化学位移变化展示于图45中。仅发现KD2的残基的显着化学位移变化。一般而言，由JBT0122与TFPI160结合引起的化学位移变化的程度比JBT0303与TFPI160结合由引起的化学位移变化的程度不明显。具有最强化学位移扰动的残基为F96、G128、G129、G132、N133及N136。C97、E101、T111、F114、N135及F137经扰动，展现超过0.5ppm的化学位移变化。图46中阐述TFPI蛋白的二级结构的带状模型，其说明相较于自由TFPI160，与JBT0122结合的TFPI160的HSQC信号的化学位移变化的区域。
鉴别JBT0122的与TFPI160相互作用的残基
为了对JBT0122进行依序骨架信号赋值，重组产生经13C/15N标记的肽。简而言的，在大肠杆菌(E.coli)中以与硫氧还蛋白(thioredoxin)的融合蛋白形式表现肽。使用含有3.0g/l 13C-葡萄糖及1.0g/l 15NH4Cl的M9培养基制备经13C/15N标记的肽。使用Ni螯合管柱及聚组氨酸标签对融合蛋白进行亲和力纯化。肽系由凝血酶裂解。分别使用Ni螯合管柱及苯甲脒管柱移除硫氧还蛋白/His标签及凝血酶。接着藉由逆相层析纯化肽。藉由SDS-PAGE、RP-HPLC及质谱验证纯度、完整性及身分。重组JBT0122命名为JBT0788且在其N端处具有2个额外残基甘氨酸及丝氨酸，其表示凝血酶裂解位点的残留物。
JBT0788的赋值系基于在10℃下在Varian 600MHz光谱仪上记录的HSQC、HNCACB、HNCA、HNCO及HNN光谱来进行且使用SPARKY软体加以赋值。相较于用TFPI160进行的NMR实验，降低温度以改良光谱品质。根据记录的光谱，赋值大多数残基的羰基碳(C)、α碳(CA)、β碳(CB)、酰胺质子(H)及酰胺氮(N)。残基H13及R17的赋值不明确。HNCOCA导致对此等残基的明确赋值。
JBT0788的赋值表提供于图47中。在JBT0788的光谱中观测到残基4-12的两组信号。因为JBT0788的一级结构未兼顾，所以两组信号可能由F6与P7之间的肽键的顺/反异构化引起。基于HSQC光谱中的相应信号的强度的主要：次要构形的比率确定为76∶24。如根据脯氨酸的Cα位移所判断，主要构形可能为反式，因为其63.16ppm的Cα值高于次要构形(62.49ppm)。
赋值的1个目的在于根据Cα化学位移撷取肽的二级结构。Cα化学位移受角
Figure BPA00001610528801181
及ψ且因此受肽的二级结构影响。在β股中，Cα通常以较小ppm移位；在α螺旋中，Cα通常以较大ppm移位。藉由自表列无规卷曲值减去量测的Cα值，计算得到β股中的残基的负值及α螺旋中的残基的正值。因此，一批连续负值指示β股而一批连续正值指示α螺旋。
JBT0788展现一大块增加的Cα值(Δδ(Cα)＝Cα量测-Cα无规卷曲)，其指示包含残基8至26的α螺旋。天然蛋白质的三级结构内的稳定α螺旋的Δδ(Cα)值典型介于3-4ppm之间。JBT0788的α螺旋的Δδ(Cα)值上升至约1.7ppm，指示可挠性大于蛋白质内的一般螺旋。JBT0788的另一特征为位置处7的N端指向α螺旋的脯氨酸，其配合良好，因为蛋白质中的α螺旋常以N端处的脯氨酸终止。残基6具有较强负值，其由已知迫使其N端相邻氨基酸成为β股样构形的相邻脯氨酸引起。C端残基31的较强正值对于无C端相邻氨基酸的残基而言亦为典型的。JBT0788中F6与P7之间的肽键采用2种构形，即反式(76％)及顺式构形(24％)。此位置处的构形会影响连续残基的构形。在反式同功异构物中，α螺旋紧接P7之后开始；顺式同功异构物的α螺旋直至残基L12才开始。图48中阐述说明自由JBT0788的二级结构的带状模型。
JBT0788内的化学位移亦可用来使用TALOS软体计算扭转角。TALOS为一种用于使用既定蛋白质或肽序列的5种(HA、CA、CB、CO、N)化学位移赋值的组合来经验预测
Figure BPA00001610528801191
及ψ骨架扭转角的资料库系统。TALOS方法为许多种二级化学位移(亦即化学位移与其相应无规卷曲值之间的差异)与蛋白质二级结构的态样相关的观测的延伸。TALOS的目标在于使用二级位移及序列资讯来定量预测蛋白质骨架角
Figure BPA00001610528801192
及ψ，且提供此等预测的不确定性的量度。TALOS使用既定残基的二级位移来预测彼残基的
Figure BPA00001610528801193
及ψ角。当对既定残基作预测时，TALOS亦包括来自下一及前一残基的资讯。潜于TALOS之后的想法为若可发现已知结构的蛋白质中的残基的三联体具有与目标蛋白中的三联体类似的二级位移及序列，则已知结构中的
Figure BPA00001610528801194
及ψ角将为目标中的角的适用预测物。在实践中，TALOS搜寻资料库中与目标蛋白中的既定三联体的10个最佳匹配。
为了赋值与TFPI160错合的JBT0788的HSQC光谱，制备由400μM13C/15N-JBT0788及400μM TFPI160组成的样本。如同肽及TFPI160的先前NMR样本一样，样本发生胶化。稀释样本且将丸粒溶解于氘化DMSO中，从而产生约300μM 13C/15N-JBT0788+TFPI160及5％DMSO的最终浓度。在40℃下进行量测。此改良所得光谱的品质。在考虑部分聚集的样本的松弛性质的TROS Y模式中获得实验结果。归因于样本中的蛋白质-肽错合物的低浓度，采用Varian 600MHz光谱仪上的冰冻探针技术。当利用冰冻探针技术且一式两份获得三重共振实验结果时，所得资料品质足以获得JBT0788的骨架位移。基于HNCA、HNCOCA及HNCO光谱进行与TFPI160的错合物中的JBT0788的赋值。根据记录的光谱，赋值大多数残基的羰基碳(C)、α碳(CA)、酰胺质子(H)及酰胺氮(N)。与TFPI160错合的JBT0788的赋值表提供于图49中。
脱辅基JBT0788的一特征为存在氨基酸残基4-12的两组信号，可能由F6与P7之间的肽键的顺/反异构化引起。在JBT0788-TFPI160错合物中，仅观测到1组峰，意味仅1种构形与TFPI160结合。脱辅基JBT0788亦展现一大块增加的Cα值(Δδ(Cα)＝Cα量测-Cα无规卷曲＝正数)，指示α螺旋自残基8延伸至残基26。如上所提及，天然蛋白质的三级结构内的稳定α螺旋的Δδ(Cα)值典型地介于3-4ppm之间。脱辅基JBT0788的α螺旋的Δδ(Cα)值增加至约1.7ppm，指示可挠性大于蛋白质内的一般螺旋。当与TFPI错合时，残基8至26展现介于3-5ppm之间的值，指示形成一或多个稳定α螺旋。图50中阐述说明JBT0788在与TFPI160错合时的二级结构的带状模型。由与TFPI160结合引起的JBT0788内的较大化学位移变化均匀分布于肽的整个长度上。经受最强化学位移扰动的残基为化学位移超过4ppm的残基S5、A9、Q11、Y28及K29。残基Y3、A4、V10、L12、S15、M21、A22、L23及A24扰动超过3ppm。
鉴别JBT0303的与TFPI160相互作用的残基
使用与以上关于JBT0122所述相同的程序重组产生JBT0303且用13C及15N进行同位素标记。重组JBT0303命名为JBT0616且在其N端处具有另一甘氨酸及丝氨酸。基于在10℃下在Varian 500MHz光谱仪上记录的HSQC、HNCACB及HNN光谱进行JBT0616的赋值，且使用SPARKY软体加以赋值。JBT0616的光谱的品质优于JBT0788的光谱的品质，但关于缓冲液、温度、NMR管及NMR参数的实验条件为相同的。赋值大多数残基的α碳(CA)、β碳(CB)、酰胺质子(H)及酰胺氮(N)。赋值主要基于敏感性较小但资讯性更大的HNCACB而非HNCA。与HNN光谱组合，此导致对所有源于JBT0303的残基进行明确赋值。
JBT0616的赋值表提供于图51中。二级结构系撷取自Cα化学位移且藉由使用H、CA、CB、CO及N的赋值进行TALOS加以确定。与JBT0788类似，JBT0616展现指示α螺旋构形的一块正Δδ(Cα)值。螺旋位于肽的C端部分且包含残基10-18。就JBT0788而言，计算Δδ(Cα)值多达约1.8ppm，从而鉴定此螺旋对于该种短肽而言相对稳定。图52中阐述说明JBT0616的二级结构的带状模型。与JBT0788中的残基31类似，C端残基20的较强正值对于无C端相邻氨基酸的残基而言为典型的。JBT0616的N端残基1-9展现略微正Δγ(Cα)值，表明偏向于α螺旋结构。
使用经13C/15N标记的肽样本及过量未标记TFPI160进行与TFPI160的错合物中的JBT0616的赋值。在Varian 800MHz光谱仪上记录HSQC、HNCA、HNCOCA及HNCO光谱且使用SPARKY软体加以赋值。在30℃下记录光谱。使用此等光谱，赋值大多数残基的α碳(CA)、β碳(CO)、酰胺质子(H)及酰胺氮(N)，如图53中的表中所阐述。与TFPI160的错合物中的JBT0616的二级结构撷取自Cα化学位移且由TALOS计算。与自由肽类似，与TFPI160的错合物中的JBT0616展现指示α螺旋构形的一块C端正Δδ(Cα)值。在错合物形成后，α螺旋的稳定性增加。此研究结果表明JBT0616的C端区为核心结合基元。N端残基的Δδ(Cα)值亦变化，但程度较小。JBT0616在与TFPI错合时的二级结构说明于图54中的带状模型中。
在错合物形成后，观测到JBT0616的残基Q2、K5、F8、V9及A18的化学位移变化的最显着，超过7ppm。残基F13、R17、K19及L20亦经扰动且显示化学位移变化超过4ppm。在N端处的残基的强化学位移变化指示并不仅仅只有两性C端α螺旋驱动肽与TFPI 160结合。
NMR实验结果与JBT0477取代的分析的组合用于使用HADDOCK(高不明确性驱动的蛋白质-蛋白质对接(High Ambiguity Driven protein-proteinDOCKing))软体产生与JBT0303的错合物中的KD1的模型。HADDOCK为一种用于模型化生物分子错合物的资讯驱动的可挠性对接方法。HADDOCK用以下事实将自身与从头开始(ab-initio)的对接方法相区别：其用不明确相互作用限制(ambiguous interaction restraint，AIR)编码来自鉴别或预测的蛋白质界面的资讯以驱动对接过程。如藉由化学位移资料揭示的TFPI160及肽上的结合位点的鉴别、如藉由软体TALOS确定的肽的扭转角、及JBT0477的取代分析为模型计算提供限制。
对于计算KD1-JBT0303HADDOCK模型，采用以下限制：(a)扭转角系取自JBT0303的K4、K5、V7、F8、Y12-A18的TALOS的计算值；(b)KD1的化学位移变化超过1.5ppm的以下残基涉及于与JBT0303的结合中：F25、F28、D32、A37、I38、I46、F47、T48、F54及Y56；(c)JBT0303的两性螺旋的疏水侧与KD1结合：JBT0303的Y12或L16或L20与KD1的D32或A37或I38或F54或Y56结合；(d)JBT0303的R15或K19与KD1的D31或D32或E60结合；(e)JBT0303的F8或V9与KD1的F25或F28结合；(f)JBT0303的Y12或F13与KD1的I46或F47或T48结合；及(g)JBT0303的Q2与KD1的Y56结合。Q2JBT0303-Y56KD1相互作用亦视为模型计算的限制。
观测到JBT0303的K5在错合物形成后的强化学位移变化。对于JBT0303的经考虑驱动肽-蛋白质相互作用的其余残基，模型与资料良好相符。KD1-JBT0303的能量最低的模型将JBT0303的F8置放在TFPI的F25及F28附近，从而解释观测的化学位移变化及来自取代分析的资料。JBT0303的V9与KD1的疏水块(包括F54)相互作用。JBT0303的Y12、F13、L16及L20亦面对KD1的疏水块。Y12与F28、I46、T48；F13与F47、T48；L16与F54；及L20与A37、I38邻近引起错合物中的彼等残基的NMR化学位移的所观测扰动；Y12及L16的保守可能归因于此等残基与蛋白质的广泛相互作用。JBT0303的K19处于允许与KD1的D32相互作用的位置中。JBT0303的R15的作用似乎为与KD1的疏水块以及与D32相互作用。此外，模型解释为何带负电荷的天冬氨酸在JBT0303的位置10处较佳；其可与KD1的带正电荷的K29相互作用。JBT0303的在位置11处的甘氨酸归因于在此位置处的立体及构形限制而存在。与JBT0303的错合物中的KD1(包含KD1的TFPI残基22-79)的HADDOCK模型提供于图55中。
与KD1结合的JBT0740及JBT1857的模型
肽JBT0740及JBT1857(FQSK-dP-NBHBDGYFERL-Aib-AKL(SEQ IDNO：178))，为JBT0303的两种衍生物，在FXa-TFPI抑制检定中显示显着增强的EC50值(分别为0.11μM及0.0023μM)及如藉由Biacore测定的较低Kd值。与TFPI KD1(TFPI160的残基22-79)的错合物中的JBT0740及JBT1857的模型系藉由使用与关于JBT0303类似的约束进行HADDOCK加以计算：(a)修正JBT0740及JBT1857的残基4及5的扭转角的约束以考虑在JBT0303衍生物的位置5处的取代；(b)扭转角系取自JBT0303的V7、F8、Y12-A18的TALOS的计算值，且与JBT0303相反，不对K4及NmetG5/dP5的
Figure BPA00001610528801221
及ψ给予固定值；(c)NmetG5及dP5系呈顺式构形；(d)KD1的化学位移变化超过1.5ppm的以下残基涉及于与JBT0303的结合中：F25、F28、D32、A37、I38、I46、F47、T48、F54及Y56；(e)JBT0303的两性螺旋的疏水侧与KD1结合；(f)JBT0303的Y12或L16或L20与KD1的D32或A37或I38或F54或Y56结合；(g)JBT0303的R15或K19与KD1的D31或D32或E60结合；(h)JBT0303的残基F8或V9与KD1的F25或F28结合；(i)JBT0303的残基Y12或F13与KD1的I46或F47或T48结合；及(j)JBT0303的残基Q2与KD1的Y56结合。
JBT0740及JBT1857的能量最有利的HADDOCK模型说明相较于JBT0303不同的结合模式。最明显差异在残基5至11的区域中。在肽的N端及C端处观测到显着性较小的偏差。然而，不同的端结合亦可能有助于JBT0303衍生物与TFPI的最佳化结合。
与KD1结合的JBT1857的X射线晶体结构
测定与KD1结合肽JBT1857的错合物中的KD1的晶体结构。TFPI重组表现于大肠杆菌中且自包涵体氧化再折迭。在联接KD1及KD2的TFPI连接子序列内包含凝血酶裂解位点的TFPI氨基酸1-150(TFPI1-150-凝血酶(MADSEEDEEHTIITDTELPPLKLMHSF
Figure BPA00001610528801231
Figure BPA00001610528801232
TRDNANRLVPRGSQQEKPDF
Figure BPA00001610528801233
Figure BPA00001610528801234
EDG(SEQ ID NO：4235)))选殖入大肠杆菌表现载体(pET19b)中。TFPI1-150-凝血酶序列在N端处包含作为重组表现的人工产物(artifact)且不为野生型TFPI氨基酸序列的一部分的2个氨基酸。编码库尼兹域1及2的序列用粗体显示。大肠杆菌(BL21(DE3)pLysS)在MagicMediaTM中培养且TFPI 1-150-凝血酶以不溶性包涵体形式表现。藉由与BugBuster Master混合物一起培育来溶解大肠杆菌以收集包涵体且在用50mM Tris/HCl(pH 8)、0.1％吐温20洗涤后加以纯化。将包涵体溶解于8M脲、50mM Tris/HCl(pH 8.0)中且TFPI 1-150-凝血酶在添加20mM DTT后经还原。藉由快速10倍稀释入含有50mMTris/HCl(pH 10)及1.1mM经氧化谷胱甘肽的缓冲液中，随后相对于20mMTris/HCl(pH 7)进行过度透析来进行氧化再折迭。再折迭的TFPI1-150-凝血酶藉由使用Q Sepharose FF阴离子交换及肽亲和力(JBT131)介质进行依序纯化方案加以纯化。经纯化的TFPI1-150-TFPI藉由与凝血酶(每毫克TFPI1-150-凝血酶1U凝血酶，裂解位点：LVPR/GS)一起培育而经蛋白水解消化，从而导致产生N端KD1-凝血酶(MADSEEDEEHTIITDTELPPLKLMHSF
Figure BPA00001610528801236
Figure BPA00001610528801241
TRDNANRLVPR(SEQ ID NO：4236))及KD2-凝血酶(GSQQEKPDF
Figure BPA00001610528801243
EDG(SEQ ID NO：4237))。N端KD1-凝血酶系依次使用欲移除凝血酶的苯甲脒琼脂糖、以及JBT131肽亲和力管柱而自消化混合物加以纯化。经纯化的N端KD1-凝血酶用于与JBT1857形成错合物且进一步进行结晶。
藉由固相合成制备拮抗肽JBT1857。在100mM MES(pH 6.5)、20％PEG4000、600mMNaCl下获得等莫耳错合物的成功共结晶。尽管具有一些非缺面形双晶，但晶体绕射优于
Figure BPA00001610528801244
解析度。绕射资料用来自CCP4程式包的iMosflm及SCALA处理，从而揭示具有以下单位晶胞大小的单斜晶体形式：
Figure BPA00001610528801245
Figure BPA00001610528801246
Figure BPA00001610528801247
α＝90.0°、β＝92.97°、γ＝90.0°、晶格群C2(Leslie，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr，62(Pt 1)，48-57(2006)；Evans，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr，62(Pt 1)，72-82(2006))。自身旋转计算值指示近似双重非结晶学对称性。与此一致，2个分子以170°旋转相关定位于不对称单元中。藉由使用程式PHASER及作为搜寻模型的可用库尼兹域2晶体结构的结构整体进行帕特生(Patterson)搜寻(McCoy等人，J Appl Crystallogr，40(Pt 4)，658-674(2007))。单位晶胞含有约64％溶剂。用Coot、Refmac、MAIN及CNS程式进行非结晶学电子密度平均化及模型构建及模型改进。当前模型对于JBT1857肽的复本及与蛋白质的相互作用两者而言为完全确定的，当前R＝0.257，R自由＝0.298，与理想几何结构的偏差
Figure BPA00001610528801248
rms(角)＝1.8°。
JBT1857结构：JBT1857的结构可区段成(i)由乙酰化Phe1AP-Gln2AP组成的N端锚(anchor)；(ii)包含Ser3AP-Asn6AP的Ω形环；(iii)自Val7AP及His8AP构建的中间区段；(iv)含有Val9AP-Gly11AP的紧密甘氨酸环；及(v)包含Tyr12AP-Leu20AP的C端α螺旋。如本文所用，下标AP指示「拮抗肽(antagonistic peptide)」JBT1857中的序列编号。α螺旋的构形由位于螺旋的中心处(位置17AP)的非天然α-甲基丙氨酸；完成α螺旋的1-4氢键结样式的C端酰胺；及His8AP、Tyr12AP及Phe13AP的芳族侧链形成的堆迭丛集加以稳定。此等作用协作以自发稳定溶液中的C端α螺旋，与肽的圆二色性资料一致。观测的芳族侧链堆迭(His8AP、Tyr12AP、Phe13AP)强制产生仅可由位置11AP处的甘氨酸达成的紧密转角(tight turn)。此结构约束由在用任何其他氨基酸置换Gly11AP后结合亲和力显着损失来反映。N端环区段的构形由已知会诱导紧密转角构形的D-脯氨酸、及由Ser3AP的羰基氧与Asn6AP的酰胺氮形成的1-4氢键部分稳定。所有环侧链(Tyr1AP、Pro5AP、His8AP、Tyr12AP、Phe13AP)点皆朝向同一方向，使其能够与TFPI的KD1域相互作用。
JBT1857与KD1的相互作用：测定JBT1857与KD1之间的相互作用。疏水性接触为分子间距离
Figure BPA00001610528801251
的相互作用，而氢键具有介于
Figure BPA00001610528801252
之间的距离。Phe1AP与TFPI非特异性相互作用，从而与Phe2及Ala27接触。相反，Gln2AP接触TFPI的深埋袋且与Phe28、Lys29、Ile46及Phe47进行疏水性相互作用。此外，Gln2AP的酰胺基与Phe28-CO、Phe44-CO及Ile46-NH形成H键。JBT1857的包含Ser3AP-Asn6AP的Ω环介导而非限制与蛋白质的疏水性相互作用；Ser3AP、Pro5AP及Asn6AP与Lys29及Phe47相互作用。JBT1857的中间区段的Val7AP亦与Lys29及Phe47结合。His8AP主要促使与Tyr12AP及部分与Phe13AP的分子内芳族堆迭相互作用，且展现与TFPI的Ala30的疏水性相互作用。类似地，甘氨酸环Val9AP-Gly11AP促使与库尼兹域的少数接触。Val9AP藉由与Ala30的羰基形成氢键及与Asp32的疏水性相互作用而直接与KD1相互作用。Tyr12AP介导经由其羟基与Ile55的酰胺氮形成的氢键及与Asp30的疏水性相互作用。Leu16AP为与Ile55的疏水性接触的一部分。除肽的C端螺旋与蛋白质的大部分疏水性相互作用的外，在Arg15AP与Asp32之间亦有静电相互作用。此外，Lys19AP藉由与Ala37的羰基形成氢键而有助于与TFPI结合且与Lys36及Ile38接触。TFPI接触表面具有包含一些图示热点(hot spot)的总体疏水性特性，且与JBT1857形成错合物的驱动力为立体表面互补性。
此实施例描述本发明的例示性肽的二级结构的特性化且将结构与肽的抑制功能关联。该实施例亦鉴别与JBT1857(一种抑制TFPI活性的TFPI结合肽)相互作用的TFPI氨基酸残基。
实施例8
以下实施例描述藉由添加会增强肽的物理化学或药物动力学性质的部分而修饰的其他TFPI结合肽。该实施例另外描述一种使用旋转血栓弹性描记术(thromboelastography)评估全血中凝块形成的方法。
JBT1857(JBT0047肽家族)与不同PEG部分结合，且检查聚乙二醇化肽的结合亲和力及TFPI抑制活性。JBT1857藉由添加C端半胱氨酸而经修饰以产生JBT2315(Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKLC-NH2(SEQ ID NO：4077))，使用实施例5中描述的方法使JBT2315在C端处与具有以下递增大小的线性顺丁烯二酰亚胺PEG部分结合：5kD、12kD、20kD、30kD及40kD。所得聚乙二醇化肽如下所示：
表12
  肽   PEG(kD)   序列   SEQ ID NO
  JBT1857   ---   Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKL-NH2   4020
  JBT2317   ---   Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKLC(NEM)-NH2   4078
  JBT2325   5.3   Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKLC(PEG)-NH2   4086
  JBT2326   12.1   Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKLC(PEG)-NH2   4087
  JBT2327   21.0   Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKLC(PEG)-NH2   4088
  JBT2328   29.1   Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKLC(PEG)-NH2   4089
  JBT2329   41.5   Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKLC(PEG)-NH2   4090
聚乙二醇化肽的稳定性、结合亲和力及TFPI抑制活性
聚乙二醇化肽在小鼠及人类血浆中显示显着增加的血浆稳定性。添加肽至小鼠或人类血浆的样本中，且在添加之后24小时剩余在血浆中的肽的初始量的百分比藉由在经0.05mg/ml TFPI涂铺的Maxisorp板上进行IC50ELISA(2.26nM示踪肽JBT2271)加以量测。小于约10％初始量的JBT1857及JBT2317剩余在血浆中，而在24小时之后剩余有40％或40％以上初始量的聚乙二醇化TFPI结合肽。侦测到约60％或60％以上的JBT2327及JBT2329。相较于未经修饰的肽，聚乙二醇化肽在人类血浆中亦显着更稳定。在24小时之后剩余有约60％或60％以上的聚乙二醇化肽。未经修饰的肽在人类血浆中比在小鼠血浆中更稳定；在培育24小时之后，剩余有约20％或20％以上的初始量。
亦在实施例1-4中描述的检定中对聚乙二醇化肽进行特性化且与JBT1857进行比较。代表性结果提供于以下阐述的表13中。如实施例4中所述进行凝血酶产生检定，且结果以对应于改良峰值凝血酶(nM)半数最大的肽浓度的EC50提供。
表13
Figure BPA00001610528801271
*用示踪剂JBT2271(1nM)及0.05μg/ml TFPI于涂铺缓冲液中进行竞争ELISA。
相较于JBT1857，添加用NEM阻断的C端半胱氨酸不显着影响FXa抑制、外在因子X酶检定或凝血酶产生检定中JBT2317的结合亲和力或肽的活性。PEG大小不显着影响TFPI结合肽恢复在TFPI-1存在下的FXa活性的能力。在实施例3的外在因子X酶检定中，抑制活性随PEG部分的分子量增大而增加(直至20kD PEG)。对于30kD或40kD PEG部分，活性不进一步改良。在使用人类血浆的实施例4的凝血酶产生检定中，EC50随PEG大小而减小，且TFPI的最大抑制(如藉由峰值FIIa(nM)所量度)随PEG大小而增加。在小鼠血浆中，40kD PEG与TFPI结合肽的连接增加TFPI的最大抑制。
聚乙二醇化TFPI结合肽恢复用于将FX转化成FXa的外在因子X酶错合物活性的能力亦使用利用实施例5的方法进行的基于细胞的外在因子X酶检定确定。相较于JBT1857，添加用NEM阻断的C端半胱氨酸不显着影响JBT2317在基于细胞的外在因子X酶检定中的活性。PEG部分(5kD、20kD、30kD或40kD)与JBT2317结合使TFPI抑制活性增加5-20％。
旋转血栓弹性描记术
藉由在存在或不存在肽下用全血制备物进行旋转血栓弹性描记术来进行人类全血凝块形成及坚实度(firmness)的连续黏弹性评估。将来自健康个体的血液样本吸入含柠檬酸盐的Sarstedt Mono S(0.106M或3.2％(w/v)柠檬酸钠)(5ml)中，混合1份柠檬酸盐与9份血液，使用第21号蝴蝶针(butterflyneedle)。一部分血液样本与添加后获得51BU/mL的于山羊中产生的高效价热不活化抗人类FVIII抗血清(3876BU/ml；Baxter BioScience，Vienna，Austria)一起培育。测试样本藉由溶解大量肽于DMSO或HEPES缓冲盐水(有或无0.1％吐温80)中制备。
在37℃下使用ROTEM血栓弹性描记凝血分析器(Pentapharm，Munich，Germany)进行记录。简而言的，添加血液至于经加热的比色管固持器中的抛弃式比色管中。抛弃式插脚(感测器)固定于旋转轴顶端。轴由高精度球轴承系统引导且往返旋转。轴与用于量测弹性的弹簧连接。轴的精确位置由光在于轴上的小镜上的反射侦测。当样本凝结时，弹性损失导致轴的旋转发生变化。所得资料经电脑分析且于凝血弹性描记图中加以观测。凝血弹性描记图显示相对于时间(s)的弹性(mm)。在开始形成凝块之前，观测到弹性为约0。在零线以上及以下的镜像迹线指示凝块形成对轴的旋转的影响。
在开始各实验之前，含柠檬酸盐的全血与玉米胰蛋白酶抑制剂(CTI)(Hematologic Technologies公司，Essex Junction，VT，USA)混合(从而提供用于特异性抑制FXIIa最终浓度62μg/mL)以抑制FXIIa介导的接触活化。分析方案如下：向20μL测试样本或对照中添加300μL预加温(37℃)的经CTI处理的含柠檬酸盐的全血，随后添加20μL含有重组人类组织因子(rTF，3pM)(TS40，Thrombinoscope BV，Maastricht，The Netherlands)的TF PRP试剂的1∶15稀释液。凝血藉由添加20μL 200mM CaCl2(star-TEM
Figure BPA00001610528801281
Pentapharm，Munich，Germany)起始且允许进行记录至少120分钟。检定中的rTF的最终浓度为11或44fM。
根据制造商说明书记录血栓弹性描记参数凝血时间(CT)、凝块形成时间(CFT)及最大凝块坚实度(MCF)。CT定义为自开始量测至开始形成凝块的时间。CFT定义为自开始形成凝块直至达到20mm的振幅的时间。MCF为检定期间两个迹线之间的最大振幅差异。绘制凝血弹性描记图的资料的一阶导数以获得速度(mm/s)相对于时间(s)的图。根据此图，确定最大速度(maxV)。亦确定获得最大速度的时间(maxV-t)。
例示性结果说明于图56及57中。JBT1857及JBT2317恢复Hem A血液中的凝血参数。聚乙二醇化(40kD)TFPI结合肽JBT2329亦恢复Hem A血液中的延长的凝血的参数，如图57中所说明。JBT2317的聚乙二醇化降低凝结时间及凝块形成时间。
爪甲修剪研究
亦研究JBT2329对纯原始小鼠中失血的影响。在爪甲修剪之前30分钟，以10ml/kg向C57BL6小鼠静脉内投予媒剂、1mg/kg JBT2329、或0.1mg/kgJBT2329(N＝各组19或20)。在爪甲修剪之前10分钟用80mg/kg戊巴比妥(腹膜内(i.p.))使动物麻醉。在时间＝0分钟时，切割右后爪的小趾的就在爪床(nail bed)之前的爪甲。爪转移至用0.9％NaCl溶液预填充的小瓶中。在爪甲修剪之后之前30分钟及此后接着30分钟期间收集血液样本用于分析，且计算并比较各组的平均收集体积。经媒剂处理的小鼠中的平均失血为历时前30分钟约30.5μl，历时第二30分钟时期52.1μl，从而导致历时60分钟失血约82.6μl。相反，投予0.1mg/kg JBT2329使失血降低历时前30分钟约50％(16.0μl)及历时第二30分钟时期约64％(18.7μl)，从而导致相较于经媒剂处理的小鼠，历时60分钟总失血降低约60％(34.7μl)。增加JBT2329的剂量至1.0mg/kg进一步使失血降低至少约10％；历时前30分钟收集12.2μl，历时第二30分钟时期收集10.6μl，从而导致历时整个60分钟收集时期收集22.8μl。相较于经媒剂处理的纯原始小鼠，当皮下投予时，JBT2329亦有效降低出血；相较于经媒剂处理的个体，皮下注射10mg/kg JBT2329使爪甲修剪之后60分钟期间的失血降低约58％。
上述结果系使用包含线性PEG部分与肽的C端连接的JBT1857衍生物及在N端处包含PEG部分的JBT1586衍生物产生。亦产生包含替代结合位点或替代化学部分的肽。40kD线性PEG部分与JBT1857的残基14结合以产生JBT2404。JBT2329的线性40kD PEG部分经40kD分支PEG部分置换以产生JBT2401。JBT1857亦经修饰以在C端处包含K(Ttds-顺丁烯二酰亚胺基丙酰基)(JBT2374)。JBT2374用于产生JBT2410，即JBT2374的一种HSA结合物。JBT2375，即JBT1857的包含K(AOA)的衍生物，用于将PSA醛与肽JBT1857偶合，从而产生JBT2430。使用上述检定对JBT2401、JBT2404、JBT2410及JBT2430进行特性化。代表性结果概述于表14中：
表14
Figure BPA00001610528801301
此实施例证明本发明的例示性TFPI结合肽JBT1857为TFPI的强力抑制剂且可经官能基化并与PEG结合而不损失活性。聚乙二醇化使若干功能检定中的TFPI抑制活性增加。惊人地，与较高重量PEG部分结合的肽显示增强的TFPI抑制活性。包含40kD线性PEG部分的JBT2329显着降低临床相关动物模型中的失血。在JBT1857的氨基酸序列内的PEG结合、分支PEG部分的使用、及HSA与PSA的连接不破坏肽的活性。
实施例9
以下实施例描述本发明的两种TFPI结合肽JBT1837及JBT1857的特性化。JBT1837(Ac-SYYKWH[CAMRDMKGTMTC]VWVKF-NH)(SEQ ID NO：1044)为JBT0120家族的结合TFPI的KD1及KD2的环状肽。JBT1857(Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKL-NH2)(SEQ ID NO：178)为JBT0047家族的结合TFPI的KD1的线性肽。使用实施例1-4中描述的检定来检查JBT1837及JBT1857的亲和力及TFPI抑制活性，其结果概述于表15中。
表15
Figure BPA00001610528801302
经由BiaCore量测的肽与人类TFPI的亲和力小于1nM。JBT1837及JBT1857的藉由ELISA量测的亲和力(IC50)分别为4.8nM及2.5nM。JBT1837自人类TFPI的解离比JBT1857更缓慢(亦即相较于JBT1857，JBT1837持续较长时期保持与人类TFPI结合)。使用全长人类TFPI(「f1TFPI」)与截短人类TFPI(254个氨基酸「R&D TFPI」)两者进行FXa抑制检定(0.1nM FXa，0.5nM TFPI，0.25％DMSO)。在0.5nM TFPI下，截短TFPI的活性由JBT1837与JBT1857两者完全抑制，而全长TFPI由JBT1857及JBT1837分别抑制85％及95％。在较高浓度的flTFPI(例如10nM f1TFPI)下，JBT1837完全抑制TFPI活性，而JBT1857部分抑制TFPI活性。当flTFPI用于FXa抑制研究中时，EC50亦较高。
在外在因子X酶检定中，约85％的截短TFPI由两种肽抑制。全长TFPI活性由JBT1837及JBT1857分别抑制约56％及48％。惊人地，在基于细胞的外在因子X酶检定中，JBT1837抑制细胞相关的TFPI活性约50％，而JBT1857几乎完全抑制细胞结合的TFPI的活性。在基于血浆的功能检定中，JBT1837在人类FVIII受抑制的血浆及FIX不足的血浆中比JBT1857更有效抑制TFPI。JBT1837修正实施例8中描述的ROTEM检定中FVIII受抑制的血液中的凝血参数JBT1857亦正面影响凝血参数，但在检定中表现的有效性低于JBT1837。
此实施例比较靶向TFPI蛋白的不同区域的环状及线性TFPI结合肽的亲和力及TFPI抑制活性。JBT1837(属于家族JBT0120的环状肽)及JBT1857(属于家族JBT0047的线性肽)以小于1nM的亲和力有效结合人类TFPI且为强力抑制剂。在低TFPI浓度下，FXa-TFPI相互作用完全由两种肽阻断，而在较高浓度的TFPI存在下，JBT1857对TFPI的抑制降低。两种肽均部分抑制外在因子X酶检定中的全长TFPI的活性，且相较于JBT1837，JBT1857在较大程度上抑制基于细胞的外在因子X酶检定中的TFPI活性。相较于JBT1857，JBT1837在FVIII不足的血浆中更有效抑制TFPI。两种肽均藉由降低凝结时间来改良FVIII受抑制的人类全血的凝血参数，而相较于JBT1837，JBT1857在较小程度上改良凝块形成速度。
实施例10
此实施例说明本发明的TFPI结合肽在临床相关动物模型中的活体内活性。如下所述，当以FVIII及FIX的次最佳剂量时，例示性TFPI结合肽显着降低动物中的失血。
在基因剔除小鼠及FIX基因剔除小鼠中，在尾尖出血模型中测试与人类及鼠类TFPI交叉反应的JBT2329，一种聚乙二醇化(40kD)TFPI结合肽(JBT0047家族)。FVIII基因剔除小鼠密切反映A型血友病患者的病状，且尾尖出血模型广泛用于藉由量测例如出血时间、失血或存活来评估药物功效的研究中。ADVATE，一种市售rFVIII，充当参照，且经ADVATE缓冲液处理的动物充当阴性对照。各组皆含有16个FVIII基因剔除小鼠(8个雌性+8个雄性)。在切割尾尖之前30分钟投予JBT2329(1mg/kg或0.1mg/kg)或抗TFPI抗体(maTFPI；18mg/kg)。在切除尾部之前5分钟投予ADVATE(10IU/kg或50IUmg/kg)或ADVATE缓冲液。经由侧尾静脉注射以静脉团注形式投予测试及对照物质。藉由腹膜内注射100mg/kg氯胺酮及10mg/kg甲苯噻使动物麻醉。约10分钟后，切除2mm尾尖。将尾尖置放于温热盐水(约37℃)中且历时60分钟的观测期收集血液。以重量分析方式测定血液的量。在60分钟的观测期结束时，动物在自麻醉恢复之前藉由颈椎脱位术(cervical dislocation)人道杀死。
经缓冲液处理的动物中的中值总失血为930mg。经鼠类抗TFPI抗体(maTFPI)处理的个体中的中值总失血为724mg。当与ADVATE一起向个体投予maTFPI时，中值总失血的降低更明显。maTFPI+10IU/kg ADVATE的组合导致136mg的中值总失血，经maTFPI+50IU/kg ADVATE处理的动物经历13mg的中值总失血。经单独10或50IU/kg ADVATE处理的动物的中值失血分别经历798及364mg的中值失血。对于maTFPI+50IU/kg ADVATE相对于50IU/kg ADVATE而言，maTFPI+ADVATE的组合处理超越单独ADVATE的优越性以统计方式显示(p＝0.0010)。尽管不为统计学上显着优越的，但经maTFPI+10IU/kg ADVATE处理的动物中的失血有区别地低于经单独10IU/kg ADVATE处理的动物中的失血。
展示以1mg/kg与10及50IU/kg ADVATE组合给药以及以0.1mg/kg与50IU/kg ADVATE组合给药的JBT2329的功效，即定义为超越2.5％含量下的缓冲液的统计显着优越性(p＜0.0004)。经JBT2329与ADVATE的组合处理的动物展示失血的临床相关降低，但结果不统计显着(p≥0.0506)。在不存在ADVATE下投予1mg/kg JBT2329不会使中值总失血降低超过经缓冲液处理的动物中观测到的中值总失血(930mg)。
亦在FIX基因剔除尾尖出血小鼠模型中测试JBT2329，该模型为B型血友病人类患者的一种临床相关模型。方法实质上类似于以上关于FVIII基因剔除模型所述的方法。替代ADVATE，重组FIX(rFIX)充当参照。经缓冲液处理的动物中的中值总失血为935mg。经鼠类抗TFPI抗体(maTFPI)处理的动物中的中值总失血为774mg。当动物接受maTFPI与rFIX的组合治疗时，中值总失血进一步降低。maTFPI+10IU/kg rFIX的组合导致25mg的中值总失血，而经maTFPI+50IU/kg rFIX处理的动物展现10mg的中值总失血。经单独10或25IU/kg rFIX处理的动物的中值失血分别经历888及774mg的中值失血。
展示当以1mg/kg与10IU/kg rFIX组合给药以及以0.1mg/kg与10IU/kgrFIX组合给药时JBT2329的功效，即定义为超越2.5％含量下的缓冲液的统计显着优越性。观测到JBT2329与rFIX组合超越单独投予rFIX的优越性(p＜0.0172)，而相较于经缓冲液处理的动物，用单独1mg/kg JBT2329处理不导致中值总失血显着降低(p＝0.321)。
总而言的，在所有经测试的剂量下，当与次最佳剂量的FVIII及rFIX共投予时，JBT2329促进失血的临床相关降低。此外，静脉内投予JBT2329在跨越所有处理组的所有个体中皆耐受良好而无任何急性毒性征象。
实施例11
本文所述的TFPI结合肽适于侦测样本，诸如生物样本中的TFPI。此实施例描述一种使用本发明的肽在ELISA样检定形式中侦测TFPI的方法。
JBT1857的肽序列系藉由添加生物素基-Ttds部分而经N端修饰以产生JBT2271(生物素基-Ttds-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKL-NH2(SEQ ID NO：4033))。在室温下，96孔微量滴定板(Maxisorp，Nunc)经每孔50μl含有一定范围的TFPI浓度(0-3μg/ml，人类重组TFPI，R&D Systems)的涂铺缓冲液(15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH 9.3)涂铺1小时。板用每孔350μl洗涤缓冲液(175mM NaCl，5mM CaCl2，25mM HEPES，0.1％吐温80，pH 7.35)洗涤3次。板接着在室温下用100μl阻断缓冲液(2％酵母抽提物，175mMNaCl，5mM CaCl2，25mM HEPES，0.1％吐温80，pH 7.35)阻断1小时。板接着用350μl洗涤缓冲液洗涤3次。添加50μl含不同浓度JBT2271的洗涤缓冲液溶液(100-0nM)至各孔中。将板培育1小时且用350μl洗涤缓冲液洗涤3次。向各孔中添加50μl抗生蛋白链菌素-辣根过氧化酶结合物(R&D Systems，1∶200于洗涤缓冲液中)。在室温下培育1小时的时期之后，板用洗涤缓冲液洗涤3次。添加50μl TMB溶液(SeramunBlau fast，Seramun)至各孔中。在室温下培育1.5分钟之后，藉由添加每孔50μl 1M H2SO4来终止反应。在450及620nm下，在光度计(Molecular Devices Spectramax M5)中量测吸光度。
JBT2271允许侦测每孔少至4.1×10-14莫耳的TFPI。上述检定的结果说明本发明的肽为鉴别及/或定量样本中的TFPI的强力工具。
实施例12
此实施例描述用于特性化TFPI结合肽的例示性koff检定的条件。
在室温下，微量滴定板(96孔，Maxisorp，Nunc)的各孔经含1.6nM TFPI的涂铺缓冲液(15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH 9.3)涂铺2小时。板接着用350μl洗涤缓冲液(175mM NaCl，5mM CaCl2，25mM HEPES，0.1％吐温80，pH 7.35)洗涤3次，且各孔用100μl阻断缓冲液(2％酵母抽提物，175mMNaCl，5mM CaCl2，25mM HEPES，0.1％吐温80，pH7.35)阻断。若采用24小时的培育期，则各孔经阻断至少1小时。用于15分钟培育期的对照孔再经阻断23.5小时。
在24小时培育期中，各孔用350μl洗涤缓冲液洗涤3次且与50μl含测试肽的洗涤缓冲液一起培育。测试肽的浓度视于例如本文所述的TFPI IC50ELISA检定中确定的个别IC90浓度而定。经TFPI涂铺的各孔暴露于测试肽中约15分钟。各孔随后用350μl洗涤缓冲液洗涤3次且添加50μl示踪肽(竞争剂)。一种例示性示踪肽为JBT2271(1.13nM于洗涤缓冲液中)。对照孔(最大信号)仅与示踪剂一起培育。缺乏TFPI的空白孔仅与示踪剂一起培育。示踪肽的添加使24小时培育期开始。
若测试肽的IC90浓度导致最大信号降低90％，则采用15分钟培育期作为对照。再阻断23.5小时的各孔用350μl洗涤缓冲液洗涤3次以移除阻断缓冲液。随后，添加50μl含分析物的洗涤缓冲液且培育各孔15分钟。所用测试肽的浓度视使用例如TFPI IC50ELISA检定确定的肽的IC90浓度而定。在培育15分钟后，用350μl洗涤缓冲液洗涤3次且添加50μl示踪肽。对照孔(最大信号)仅与示踪剂一起培育。缺乏TFPI的空白孔亦仅与示踪剂一起培育。
板用350μl洗涤缓冲液洗涤3次，且添加50μl抗生蛋白链菌素-辣根过氧化酶结合物(R&D Systems，1∶200于洗涤缓冲液中)至各孔中。在室温下培育1小时的时期之后，板用洗涤缓冲液洗涤3次。添加TMB溶液(每孔50μl；SeramunBlau fast，Seramun)。在室温下培育1.5分钟之后，藉由添加每孔50μl1M H2SO4来终止反应。在450及620nm下，使用光度计(Spectramax M5，Molecular Devices)量测吸光度。检定结果呈现为暴露于测试肽及示踪肽中的各孔相对于仅暴露于示踪剂中的经TFPI涂铺的各孔的修正光密度(OD450-OD620)的百分比。
实施例13
TFPI藉由经由库尼兹域1(KD1)与FVIIa结合来抑制FVIIa/TF活性。此实施例描述一种评估TFPI结合肽对FVIIa/TF的TFPI抑制的影响的例示性方法。
在25℃下在96孔微量滴定板中于25mM HEPES、175mM NaCl、5mMCaCl2、0.1％BSA(pH 7.3)中进行动力学量测。混合最终浓度分别为100nM及5nM的20μl可溶性组织因子(残基33-251；Creative Biomart)及20μlFVIIa(ERL)且培育15分钟。添加20μl最终浓度变化(0-2μM)的TFPI结合肽至混合物中且再培育15分钟。为了量测FVIIa/sTF错合物的残余活性，反应混合物与20μl TFPI(200nM)一起培育60分钟。反应藉由添加显色受质Chromozym-tPA(Roche)(1mM)起始。藉由使用Labsystems iEMS ELISA读取器持续30分钟监测405nm下的吸光度变化。在不存在TFPI下量测的FVIIa/sTF活性视为在检定的情形下的「100％活性(100％activity)」。藉由绘制肽浓度相对于残余活性的关系图来确定EC50值。
相对于TFPI160、TFPI1-150-凝血酶、NTermKD1、KD1及KD2(阴性对照)筛检JBT1857及JBT1837。JBT1857显示对TFPI160、TFPI1-150-凝血酶、NTermKD1及KD1的EC50为约0.21-0.23μM。结合KD1及KD2的JBT1837显示对TFPI160及TFPI1-150-凝血酶的EC50为约0.17-0.19μM，而在涉及NTermKD1及KD1的检定中的活性约为背景值。
上述结果证明TFPI结合肽有效抑制TFPI-FVIIa/TF相互作用。JBT1857有效抑制含有KD1作为最小功能实体的TFPI片段。因此，此酶促检定证实将JBT1857的结合位点置放在KD1内的X射线结晶学资料。JBT1837抑制含有前2个库尼兹域的TFPI片段，表明JBT1837结合位点位于TFPI的KD1-连接子-KD2区内。库尼兹域与凝血酶裂解的TFPI的片段(1-150)的组合不恢复显色检定中JBT1837的抑制活性。本文所述的酶促检定为适用于侦测TFPI结合肽(或测试化合物)与TFPI结合的代用物，且适用于检查TFPI结合化合物的TFPI抑制效应。
实施例14
此实施例描述PEG及HSA结合对例示性TFPI结合肽的活体内影响。
在药物动力学分析中，C57Bl6小鼠用与不同分子量PEG及HSA结合的各种TFPI结合肽处理。肽-PEG及肽-HSA结合物的剂量校正至1mg/kg(肽含量)。校正保证不同分子量的结合物之间的可比较性。将肽结合物溶解于175mM NaCl、25mM HEPES(pH 7.35)中且经由尾静脉静脉内或在颈区中皮下投予。在投药之后若干时间点时自3个动物(后延髓)获取血液抽取物且收集在肝素化小瓶中。离心样本，且藉由ELISA对血浆中的肽-结合物含量进行定量。
图63说明在投药之后在若干时间点时于血浆中侦测的聚乙二醇化TFPI肽的浓度，且表16提供关于JBT2325-JBT2329、JBT2401、JBT2404及JBT2410的终末半衰期及生体可用性的详细资讯。
表16
Figure BPA00001610528801371
JBT2329、JBT2401及JBT2404为与40kDa线性PEG(JBT2329及JBT2404)或40kDa分支PEG(JBT2401)结合的肽。相较于与较小PEG结合的肽，在静脉内投药之后，40kDa结合物展现较长终末半衰期(HLλz)。由皮下投予肽产生的浓度-时间曲线的曲线下面积(AUC)与在静脉内投药之后产生的AUC进行比较以计算肽的生体可用性。结果展示于表16中。资料证明TFPI结合肽与较高分子量分子的结合提供超过30％的皮下生体可用性。
图64A-C说明由向小鼠皮下及静脉内投予肽所产生的JBT2401、JBT2404及JBT2410的药物动力学特征。JBT2404包含与在关于式(XI)的位置X4014中的半胱氨酸结合的PEG。JBT2401包含分支PEG，且JBT2410与HSA结合。图64A证明较高分子量分子与TFPI结合肽在内部位置处融合会增加半衰期。若使用相较于具有较小大小的PEG的结合物(例如JBT2325)或自由肽，使JBT2410的活体内半衰期增加(参见图31)的分支PEG(JBT2401)及HSA，则半衰期亦增加。
此实施例说明本文所述的各种肽的活体内性质可藉由与较高分子量分子(如PEG)及/或nFcR配位体(如HSA)结合而加以改良。

Claims (107)

1.一种结合TFPI的肽，其包含式(XI)结构：
X4001-Q-X4003-X4004-X4005-X4006-X4007-X4008-X4009-X4010-X4011-X4012-X4013-X4014-R-X4016-X4017-X4018-X4019-X4020(XI)，
其中X4001为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、L、M、Y、1Ni、Thi、Bta及多巴(Dopa)；
其中X4003为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、D、E、M、Q、R、S、T、Ede(O)及Cmc；
其中X4004为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Aib、E、G、I、K、L、M、P、R、W及Y；
其中X4005为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：a、A、Aib、C、D、d、E、G、H、K、k、M、N、Nmg、p、Q、R、N丙基G、aze、pip、tic、oic、hyp、nma、Ncg、Abg、Apg、thz及dtc；
其中X4006为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、C(NEM)、D、E、G、H、K、M、N、Q、R、S、V、Cit、C(Acm)、Nle、I、Ede(O)、Cmc、Ecl、Eea、Eec、Eef、Nif及Eew；
其中X4007为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：I、V、T、Chg、Phg及Tle；
其中X4008为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、H、1Ni、2Ni、Pmy及Y；
其中X4009为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Aib、V、Chg、Phg、Abu、Cpg、Tle及L-2-胺基-4，4，4-三氟丁酸；
其中X4010为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、d、E、F、H、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、Nmd及C(NEM)；
其中X4011为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、a、G、p、Sar、c及hcy；
其中X4012为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Y、Tym、Pty、多巴及Pmy；
其中X4013为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、F、1Ni、Thi及Bta；
其中X4014为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、C、C(NEM)、D、E、K、L、M、N、Q、R、T、V及Hcy；
其中X4016为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：L、Hcy、Hle及Aml；
其中X4017为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、a、Aib、C、c、Cha、Dab、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、Nle、Nva、Opa、Orn、R、S、Deg、Ebc、Eca、Egz、Aic、Apc及Egt；
其中X4018为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、Hcy、hcy、C、c、L、Nle、M、N及R；
其中X4019为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：K、R及Har；且
其中X4020为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：K、L、Hcy及Aml；且
其中该肽不包含以下式(XII)结构：
X5001-Q-X5003-X5004-X5005-X5006-I/V-X5008-Aib/V-X5010-G-Y-X5013-X5014-R-L-X5017-X5018-K-K/L(XII)，
其中X5001为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、L、M及Y；
其中X5003为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、D、E、M、Q、R、S及T；
其中X5004为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：E、G、I、K、L、M、P、R、W及Y；
其中X5005为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：a、A、Aib、C、D、d、E、G、H、K、k、M、N、Nmg、Q、R及p；
其中X5006为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、E、G、H、K、M、N、Q、R、S及V；
其中X5008为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、H及Y；
其中X5010为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、D、E、F、H、D、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；
其中X5013为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Aib、C及F；
其中X5014为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、C、D、E、K、L、M、N、Q、R、T及V；
其中X5017为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、C、Cha、Dab、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、Nle、Nve、Opa、Orn、R及S；且
其中X5018为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、C、L、M、N及R。
2.如权利要求1所述的肽，
其中X4001为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、Y、1Ni、Bta及多巴；
其中X4003为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：D、E及S；
其中X4004为K；
其中X4005为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：p、Nmg、N丙基G、aze、pip、tic、oic及hyp；
其中X4006为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：C、E、K、R、S、V、C(Acm)、Nle、C(NEM)、I及Cit；
其中X4007为V或Tle；
其中X4008为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：H、1Ni、2Ni及Pmy；
其中X4009为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：V、Abu及Tle；
其中X4010为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：D、P、C及T；
其中X4011为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：G、a、c、hcy及Sar；
其中X4012为Y；
其中X4013为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：F、1Ni及Bta；
其中X4014为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：Aib、C、E及Hcy；
其中X4016为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：L、Aml、Hle及Hcy；
其中X4017为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、C、c、Aic、Eca及Deg；
其中X4018为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：A、Aib、C、c、L及Hcy；
其中X4019为K；且
其中X4020为选自由以下者所组成的群组的氨基酸：L、Aml及Hcy。
3.如权利要求1所述的肽，其进一步包含与X4001连接且选自由以下者所组成的群组的N端氨基酸及/或部分：FAM-Ttds、PE、Palm、2-苯基乙酰基、3-苯基丙酰基、2-(萘-2-基)乙酰基、己酰基、2-甲基丙酰基、3-甲基丁酰基、2-萘基磺酰基及1-萘基磺酰基。
4.如权利要求1所述的肽，其进一步包含与X4020连接的X4021，其中X4021包含选自由以下者所组成的群组的C端氨基酸及/或部分：C、c、C(NEM)、K(Ttds-顺丁烯二酰亚胺基丙酰基(EtSH))、FA19205、FA19204、FA19203、FA03202、K(Tdts-顺丁烯二酰亚胺)、K(AOA)及Cea。
5.如申请专利范围第3项的肽，其进一步包含与X4020连接的X4021，其中X4021包含选自由以下者所组成的群组的C端氨基酸及/或部分：C、c、C(NEM)、K(Ttds-顺丁烯二酰亚胺基丙酰基(EtSH))、FA19205、FA19204、FA19203、FA03202、K(Tdts-顺丁烯二酰亚胺)、K(AOA)及Cea。
6.如权利要求1至5中任一项的肽，其中该肽包含环状结构。
7.如权利要求6所述的肽，其中该环状结构系在X4018与X4021之间形成。
8.如权利要求7所述的肽，其中(a)X4018为C或c且(b)X4021为Cea。
9.如权利要求6所述的肽，其中该环状结构系在X4011与X4014之间形成。
10.如权利要求9所述的肽，其中(a)X4011为c或hcy且(b)X4014为C或Hcy。
11.如权利要求1至5中任一项的肽，其包含分子内双硫键。
12.如权利要求1至5中任一项的肽，其中该肽的IC50小于1000nM。
13.如权利要求1至5中任一项的肽，其中该肽的IC50小于250nM。
14.如权利要求1至5中任一项的肽，其中该肽的IC50小于50nM。
15.如权利要求1至5中任一项的肽，其中该肽的IC50小于10nM。
16.一种肽，其由选自由以下者所组成的群组的氨基酸序列组成：SEQ IDNO：4022、4024、4032、4036-4047、4049-4078、4086-4097、4100-4127、4129-4170、4173-4195、4200-4214、4217-4225、4228、4230、4231、4238及4239。
17.一种肽，其由选自由以下者所组成的群组的氨基酸序列组成：SEQ IDNO：1294-1336、4002、4013、4021、4023、4025-4031、4033-4035、4048、4079-4085、4098、4099、4128、4171、4172、4196-4199、4215、4216、4226、4277、4229、4232及4233。
18.一种TFPI结合肽，其包含两种或两种以上如权利要求1至5、16或17中任一项的肽的均二聚体或均多聚体。
19.一种TFPI结合肽，其包含两种或两种以上如权利要求1至5、16或17中任一项的肽的杂二聚体或杂多聚体。
20.如权利要求1至5、16或17中任一项的肽，其中该肽抑制TFPI活性且以小于10μM的解离常数与TFPI 1-α结合。
21.如权利要求1至5、16或17中任一项的肽，其中该肽与聚乙二醇(PEG)部分结合。
22.如权利要求1至5、16或17中任一项的肽，其中该肽与人类血清白蛋白(HSA)、抗体或其片段、羟乙基淀粉、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸多聚体(PAS化)、C12-C18脂肪酸或聚唾液酸(polysialic acid)结合。
23.如权利要求1至5、16或17中任一项的肽，其中该肽与选自由以下者所组成的群组的部分结合：光敏剂、染料、萤光染料、放射性核种、含有放射性核种的错合物、酶、毒素、抗体或其片段、及细胞毒性剂。
24.一种用于治疗个体的方法中的如权利要求1至5、16或17中任一项的肽。
25.如权利要求24所述的肽，其中该方法系用于治疗凝血病症。
26.一种如权利要求1至5、16或17中任一项的肽的用途，其系用于制造医药品。
27.一种如权利要求1至5、16或17中任一项的肽的用途，其系用于制造用以治疗凝血病症的医药品。
28.一种医药组成物，其包含如权利要求1至5、16或17中任一项的肽及医药学上可接受的载剂。
29.如权利要求28所述的医药组成物，其中该组成物包含另一医药学上有效的药剂。
30.如权利要求28所述的医药组成物，其中该医药组成物系用于治疗凝血病症的方法中。
31.一种靶向呈现TFPI的细胞的方法，该方法包含使该细胞与如权利要求1至5、16或17中任一项的肽接触。
32.如权利要求31所述的方法，其中该细胞处于哺乳动物中，且接触该细胞包含向该哺乳动物投予该肽。
33.如权利要求31所述的方法，其进一步包含侦测肽与呈现于该细胞上的TFPI的结合。
34.如权利要求33所述的方法，其中肽-TFPI结合系藉由侦测与该肽结合且选自由以下者所组成的群组的部分来侦测：染料、萤光染料、放射性核种、含有放射性核种的错合物、酶、毒素、抗体及细胞毒性剂。
35.如权利要求33所述的方法，其中肽-TFPI结合系藉由侦测与该肽错合的相互作用搭配物或与该肽结合的部分来侦测。
36.如权利要求35所述的方法，其中该相互作用搭配物系选自由以下者所组成的群组：抗体或其片段、抗运载蛋白(anticalin)、适体、抗生蛋白链菌素(streptavidin)、抗生物素蛋白(avidin)、中性链亲和素(neutravidin)及镜像体(spiegelmer)。
37.如权利要求35所述的方法，其中该相互作用搭配物包含侦测部分。
38.如权利要求37所述的方法，其中该侦测部分系选自由以下者所组成的群组：染料、萤光染料、放射性核种、含有放射性核种的错合物、及酶。
39.一种治疗罹患疾病或处于罹患疾病的风险中的个体的方法，该方法包含向该个体投予如权利要求1至5、16或17中任一项的肽，其中该肽与治疗剂结合。
40.如权利要求39所述的方法，其中该疾病为凝血病症。
41.一种治疗罹患疾病或处于罹患疾病的风险中的个体的方法，该方法包含向该个体投予如权利要求1至5、16或17中任一项的肽，及向该个体投予(a)结合该肽且(b)为治疗剂或与治疗剂结合的相互作用搭配物。
42.如权利要求41所述的方法，其中该治疗剂系选自由以下者所组成的群组：光敏剂、放射性核种、含有放射性核种的错合物、酶、毒素、抗体或其片段、及细胞毒性剂。
43.如权利要求42所述的方法，其中该疾病为凝血病症。
44.如权利要求41所述的方法，其中该相互作用搭配物系选自由以下者所组成的群组：抗体或其片段、抗运载蛋白、适体、抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白、中性链亲和素及镜像体。
45.如权利要求44所述的方法，其中该治疗剂系选自由以下者所组成的群组：光敏剂、放射性核种、含有放射性核种的错合物、酶、毒素、抗体或其片段、及细胞毒性剂。
46.如权利要求41所述的方法，其中该疾病为凝血病症。
47.一种诊断罹患疾病或处于罹患疾病的风险中的个体的方法，其包含：
(a)向该个体投予与可侦测部分结合的如权利要求1至5、16或17中任一项的肽及
(b)侦测该可侦测部分。
48.如权利要求47所述的方法，其中该可侦测部分系选自由以下者所组成的群组：染料、萤光染料、放射性核种、含有放射性核种的错合物、酶、及抗体或其片段。
49.如权利要求47所述的方法，其中该疾病为凝血病症。
50.一种诊断罹患疾病或处于罹患疾病的风险中的个体的方法，其包含：
(a)向该个体投予如权利要求1至5、16或17中任一项的肽，
(b)向该个体投予与可侦测部分结合的相互作用搭配物，及
(c)侦测该可侦测部分。
51.如权利要求50所述的方法，其中该相互作用搭配物系选自由以下者所组成的群组：抗体或其片段、抗运载蛋白、适体、抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白、中性链亲和素及镜像体。
52.如权利要求50所述的方法，其中该可侦测部分系选自由以下者所组成的群组：染料、萤光染料、放射性核种、含有放射性核种的错合物、酶、及抗体或其片段。
53.如权利要求50所述的方法，其中该疾病为凝血病症。
54.一种纯化TFPI的方法，其中该方法包含：
a)使含有TFPI的样本与如权利要求1至5、16或17中任一项的肽在适合于TFPI与该肽之间形成错合物的条件下接触；
b)自该样本移出该错合物；及视情况而定，
c)解离该错合物以释放TFPI。
55.如权利要求54所述的方法，其中该肽经固定于支撑物上。
56.如权利要求55所述的方法，其中该肽经固定于层析固定相上，且步骤(c)包含洗提与该经固定的肽结合的TFPI。
57.如权利要求56所述的方法，其中TFPI系经由亲和力层析法来纯化。
58.一种鉴别TFPI结合化合物的方法，该方法包含：
(a)使包含TFPI库尼兹域1(Kunitz domain 1，KD1)的肽与如权利要求1至5、16或17中任一项的TFPI结合肽及测试化合物在允许形成KD1-TFPI结合肽错合物的条件下接触，
(b)量测步骤(a)中所形成的KD1-TFPI结合肽错合物，及
(c)比较在该测试化合物存在下形成的KD1-TFPI结合肽错合物的数量与在不存在该测试化合物下形成的KD1-TFPI结合肽错合物的数量，
其中相较于在不存在该测试化合物下形成的KD1-TFPI结合肽错合物的数量，在该测试化合物存在下形成的KD1-TFPI结合肽错合物的数量降低指示该测试化合物为TFPI结合化合物。
59.如权利要求58所述的方法，其中该TFPI结合肽包含会产生信号的标记；步骤(b)包含量测由KD1-TFPI结合肽错合物产生的信号；且步骤(c)包含比较步骤(b)中所量测的信号与由在不存在该测试化合物下形成的KD1-TFPI结合肽错合物产生的信号，
其中相较于由在不存在该测试化合物下形成的KD1-TFPI结合肽错合物产生的信号，由在该测试化合物存在下形成的KD1-TFPI结合肽错合物产生的信号降低指示该测试化合物为TFPI结合化合物。
60.如权利要求58或59所述的方法，其中步骤(a)包含：
(a1)使该包含KD1的肽与该TFPI结合肽在允许形成KD1-肽错合物的条件下接触，及
(a2)使步骤(a1)中所形成的KD1-TFPI结合肽错合物与该测试化合物接触。
61.一种鉴别TFPI结合化合物的方法，该方法包含(a)使包含TFPI库尼兹域1(KD1)的肽与测试化合物接触，及(b)侦测该测试化合物与由对应于人类TFPI残基Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55的KD1氨基酸残基界定的TFPI结合位点的结合。
62.如权利要求61所述的方法，其中该结合位点系由对应于人类TFPI残基Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ile38、Ile46、Phe47及Ile55的氨基酸残基界定。
63.如权利要求62所述的方法，其中该结合位点系由对应于人类TFPI残基Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47及Ile55的氨基酸残基界定。
64.如权利要求61至63中任一项的方法，其中步骤(b)包含确定该TFPI结合位点内存在或不存在核磁共振(NMR)化学位移。
65.如权利要求61至63中任一项的方法，其中步骤(a)包含在测试化合物存在下使该包含TFPI KD1的肽与FVIIa在允许KD1与FVIIa结合的条件下接触，且步骤(b)包含比较步骤(a)中的KD1-FVIIa结合与在不存在该测试化合物下的KD1-FVIIa结合，
其中相较于在不存在该测试化合物下的KD1-FVIIa结合，在该测试化合物存在下的KD1-FVIIa结合减少指示该测试化合物为TFPI结合化合物。
66.如权利要求65的方法，其中该测试化合物与该TFPI结合位点的结合系使用酶促检定来侦测。
67.如权利要求61至63中任一项的方法，其中步骤(a)包含在测试化合物存在下使该包含TFPI KD1的肽与FXa在允许KD1与FXa结合的条件下接触，且步骤(b)包含比较步骤(a)中的KD1-FXa结合与在不存在该测试化合物下的KD1-FXa结合，
其中相较于在不存在该测试化合物下的KD1-FXa结合，在该测试化合物存在下的KD1-FXa结合减少指示该测试化合物为TFPI结合化合物。
68.如权利要求67所述的方法，其中该测试化合物与该TFPI结合位点的结合系使用酶促检定来侦测。
69.如权利要求61至63中任一项的方法，其中该包含TFPI KD1的肽进一步包含库尼兹域2(KD2)，步骤(a)包含在测试化合物存在下使该包含TFPIKD1及TFPI KD2的肽与FXa在允许KD2与FXa结合的条件下接触，且步骤(b)包含比较步骤(a)中的KD2-FXa结合与在不存在该测试化合物下的KD2-FXa结合，
其中相较于在不存在该测试化合物下的KD2-FXa结合，在该测试化合物存在下的KD2-FXa结合减少指示该测试化合物为TFPI结合化合物。
70.如权利要求69所述的方法，其中该测试化合物与该TFPI结合位点的结合系使用酶促检定来侦测。
71.如权利要求61所述的方法，其中该包含TFPI KD1的肽包含人类TFPI的氨基酸1-160。
72.如权利要求61所述的方法，其中该包含TFPI KD1的肽为全长人类TFPI。
73.一种鉴别TFPI抑制剂的方法，该方法包含(a)在测试化合物存在下使基本上由TFPI库尼兹域1(KD1)组成的肽与FXa在允许KD1与FXa结合的条件下接触，及(b)比较步骤(a)中的KD1-FXa结合与在不存在该测试化合物下的KD1-FXa结合，
其中相较于在不存在该测试化合物下的KD1-FXa结合，在该测试化合物存在下的KD1-FXa结合减少指示该测试化合物为TFPI抑制剂。
74.一种组成物，其包含藉由如权利要求58所述的方法鉴别的TFPI抑制剂。
75.一种藉由如权利要求58所述的方法鉴别的TFPI抑制剂的用途，其系用于制造医药品。
76.一种藉由如权利要求58所述的方法鉴别的TFPI抑制剂的用途，其系用于制造用以治疗凝血病症的医药品。
77.一种组成物，其包含藉由如权利要求61所述的方法鉴别的TFPI抑制剂。
78.一种藉由如权利要求61所述的方法鉴别的TFPI抑制剂的用途，其系用于制造医药品。
79.一种藉由如权利要求61所述的方法鉴别的TFPI抑制剂的用途，其系用于制造用以治疗凝血病症的医药品。
80.一种治疗罹患疾病或处于罹患疾病的风险中的个体的方法，该方法包含向该个体投予藉由如权利要求58所述的方法鉴别的TFPI抑制剂。
81.一种治疗罹患疾病或处于罹患疾病的风险中的个体的方法，该方法包含向该个体投予藉由如权利要求61所述的方法鉴别的TFPI抑制剂。
82.一种抑制人类TFPI的方法，该方法包含使人类TFPI与在由氨基酸残基Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55界定的结合位点处结合人类TFPI的抑制剂接触。
83.一种治疗罹患疾病或处于罹患疾病的风险中的个体的方法，该方法包含向该个体投予在由氨基酸残基Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55界定的结合位点处结合人类TFPI的抑制剂。
84.如权利要求82或83所述的方法，其中该人类TFPI结合位点系由氨基酸残基Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ile38、Ile46、Phe47及Ile55界定。
85.如权利要求84所述的方法，其中该人类TFPI结合位点系由氨基酸残基Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47及Ile55界定。
86.一种纯化抑制FXa活性的化合物的方法，该方法包含：
(a)使包含TFPI库尼兹域1(KD1)的肽与化合物在允许形成化合物-KD1错合物的条件下接触，
(b)移出未结合的化合物，及
(c)解离该等化合物-KD1错合物以释放该化合物。
87.如权利要求86所述的方法，其中步骤(a)包含使该包含KD1的肽与一群化合物接触。
88.一种电脑储存媒体，其具有电脑可执行指令，该等指令当在电脑的处理器上执行时实施一种模型化TFPI库尼兹域1(KD1)蛋白中的所选三维(3D)点与测试化合物之间的相互作用的方法，该方法包含：
获得该TFPI KD1蛋白的蛋白质结构3D模型；
确定该蛋白质结构中的所选子集的氨基酸之间的3D关系，其中该所选氨基酸子集包含Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55；
模型化由该所选氨基酸子集界定的表面；
获得测试化合物的测试化合物3D模型；
匹配该测试化合物3D模型与由该所选氨基酸子集界定的表面；及
鉴别该表面的所选氨基酸子集与该测试化合物3D模型之间的接触点。
89.如权利要求88所述的电脑储存媒体，其中该所选氨基酸子集包含Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ile38、Ile46、Phe47及Ile55。
90.如权利要求88所述的电脑储存媒体，其中该所选氨基酸子集包含Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47及Ile55。
91.如权利要求88所述的电脑储存媒体，其进一步包含：
确定该表面与该测试化合物3D模型之间的接触点的数目；及
记录该测试化合物3D模型的对应于该接触点数目的亲和力等级。
92.如权利要求88所述的电脑储存媒体，其中该测试化合物为肽。
93.如权利要求92所述的电脑储存媒体，其进一步包含：
确定该表面与该测试化合物3D模型之间的各接触点的结合型式；及
基于该表面与该测试化合物3D模型之间的各接触点的结合型式的集合更新该亲和力等级。
94.如权利要求93所述的电脑储存媒体，其进一步包含：
获得基于第二测试化合物的更新的测试化合物3D模型；
匹配该更新的测试化合物3D模型与由该所选氨基酸子集界定的表面；及
在该电脑的显示器上鉴别该表面的所选氨基酸子集与该更新的测试化合物3D模型之间的该等经鉴别的接触点。
95.如权利要求94所述的电脑储存媒体，其进一步包含：
确定该表面与该更新的测试化合物3D模型之间的该等接触点的数目；
确定该表面与该更新的测试化合物3D模型之间的各接触点的结合型式；及
基于该接触点数目及该表面与该更新的测试化合物3D模型之间的各接触点的结合型式的集合记录新亲和力等级。
96.如权利要求95所述的电脑储存媒体，其进一步包含：
比较该更新的亲和力等级与该新亲和力等级以确定该测试化合物或该第二测试化合物是否具有较高亲和力等级。
97.如权利要求96所述的电脑储存媒体，其中该第二测试化合物为该测试化合物的变异体。
98.如权利要求92所述的电脑储存媒体，其进一步包含在该电脑的显示器上显示该等接触点。
99.如权利要求92所述的电脑储存媒体，其进一步包含修饰该肽以增加与该所选氨基酸子集的接触点数目或增加该肽的氨基酸与该所选氨基酸子集之间的结合强度。
100.一种比较测试化合物与TFPI库尼兹域1(KD1)蛋白中的所选三维点的方法，该方法包含：
在电脑的记忆体中产生该KD1蛋白的蛋白质结构；
在该电脑的处理器处确定该KD1蛋白中的所选氨基酸子集的三维模型，其中该所选氨基酸子集包含Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55；
在该电脑的处理器处确定测试化合物的三维模型；
在该电脑的处理器处将该测试化合物的3D模型与该所选氨基酸子集的3D模型拟合；及
在该电脑的处理器处产生该测试化合物对该所选氨基酸子集的亲和力，其中该亲和力系基于该子集中与该测试化合物接触的氨基酸的数目及各接触点处的结合强度。
101.如权利要求100所述的方法，其中该所选氨基酸子集包含Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ile38、Ile46、Phe47及Ile55。
102.如权利要求100所述的方法，其中该所选氨基酸子集包含Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47及Ile55。
103.如权利要求100所述的方法，其进一步包含：
显示该测试化合物与该所选氨基酸子集的3D模型之间的拟合的3D图像。
104.如权利要求103所述的方法，其进一步包含：
对复数种测试化合物重复如权利要求100所述的步骤；及储存该复数种测试化合物各自的各别亲和力。
105.一种电脑储存媒体，其具有电脑可执行指令，该等指令当在电脑的处理器上执行时实施一种比较肽与TFPI库尼兹域1(KD1)蛋白中的所选三维点(3D)的方法，该方法包含：
产生该KD1蛋白的蛋白质结构；
确定该KD1蛋白中的所选氨基酸子集的三维模型，其中该氨基酸子集包含Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55；
确定肽的三维模型；
将该肽的3D模型与该所选氨基酸子集的3D模型拟合；及
产生该肽对该所选氨基酸子集的亲和力，其中该亲和力系基于该子集中与该肽接触的氨基酸的数目及各接触点处的结合强度。
106.如权利要求105所述的电脑储存媒体，其中该所选氨基酸子集包含Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ile38、Ile46、Phe47及Ile55。
107.如权利要求105所述的电脑储存媒体，其中该所选氨基酸子集包含Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47及Ile55。
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