CN102505006A - 干细胞和祖细胞分化的调节、鉴定及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及调节哺乳动物干细胞和祖细胞分化的方法。本发明的方法可用于调节和控制哺乳动物，尤其是人干细胞沿着特定细胞和组织谱系的分化和成熟。本发明的方法涉及使用某些小的有机分子来调节干细胞或祖细胞群沿着特定细胞和组织谱系的分化，尤其是源于产后胎盘的胚胎样干细胞的分化或早期祖细胞向粒细胞谱系的分化。最后，本发明涉及这种分化的干细胞或祖细胞在移植和其他医学治疗中的应用。

Description

干细胞和祖细胞分化的调节、鉴定及其应用

本申请为分案申请，原申请的申请日为2003年4月13日，申请号为03813627.9(PCT/US03/11327)，发明名称为“干细胞和祖细胞分化的调节、鉴定及其应用”。

本申请要求2002年4月12日提交的美国临时申请60/372348，2002年12月31日提交的美国临时申请60/437348及2002年12月31日提交的美国临时申请60/437350的优先权，在此引用每一篇的全部内容。

1.介绍

本发明涉及调节哺乳动物干细胞和/或祖细胞分化的方法。本发明的方法可用于调节和控制哺乳动物，尤其是人的干细胞沿着特定细胞和组织谱系的分化和成熟。本发明的方法涉及使用某些小的有机分子来调节干细胞或祖细胞群沿着特定细胞和组织谱系的分化，尤其是源于产后胎盘的胚胎样干细胞的分化或沿着特定分化途径，特别是粒细胞分化途径的早期造血祖细胞的调节。本发明还涉及使用这些有机分子来调节特定谱系祖细胞，如CD34⁺，CD45⁺和CD133⁺祖细胞的分化。本发明还涉及祖细胞发育的时间方面，以及基于这些时间方面的体外模型。本发明进一步涉及这些得到调节的细胞在预防和治疗方法中，包括在这种细胞和/或小的有机化合物的药物组合物中的应用。最后，本发明涉及这种分化的细胞在移植和其他医学治疗中的应用。

2.发明背景

在人的干细胞和祖细胞的鉴定、分离和增殖上有重要的关注。干细胞是能产生多种成熟细胞谱系的全能或多能前体细胞，前体细胞是能产生特定细胞谱系细胞的细胞。这些能力作为对于器管和组织发育必需的细胞分化和特化的基础。

近来在移植干细胞和祖细胞上的成功已经提供了新的临床工具以用于因疾病、暴露于有毒化学物质和/或辐射的骨髓切除后的骨髓重建和/或补充。进一步证据的存在证明干细胞可用于重建许多，即使不是全部的组织以及修复生理状况和生理学和解剖学上的功能。干细胞在组织工程、基因治疗传送以及细胞疗法中的应用也正迅速地发展着。

许多不同类型的哺乳动物干细胞和祖干细胞已得到鉴定。例如，已知的有胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、成体干细胞、或定向干细胞或祖细胞。某些干细胞还未被分离和鉴定，但已经在允许向限定的范围分化的条件下得到培养。然而，剩下一个基本问题，就是，控制和调节干细胞和祖细胞，如造血祖细胞的分化是很困难的。目前，现有的调节这些细胞分化的方法是不成熟的和不可控制的，从而细胞在不需要的时间分化成不需要的细胞类型。而且，细胞产品的产率一般比较低。

此外，获得足够数量的用于治疗或研究目的的人干细胞尚有问题。部分地，由于在血或组织中找到的干细胞或祖细胞的有限数量以及与获得骨髓吸出物有关的显著不适，分离成体组织中正常存在的干细胞或祖细胞群体有技术上的困难，且费用昂贵。一般而言，从替代性来源收获足够数量用于治疗或研究目的的干细胞或祖细胞通常是很费力的，包括，例如，从供体或患者收获细胞或组织、体外培养和/或传播细胞、解离细胞等。至于干细胞尤其是从胚胎或胎儿组织，包括流产儿中获得这些细胞，已上升到宗教和伦理道德的顾虑。广泛认定的人胚胎或胎儿就构成独立生命的信念已促成在如此来源的细胞用于所有目的，包括医学研究的用途上政府的禁止。因而，不需要应用从胚胎或胎儿获得的细胞的替代性来源就期望在干细胞临床应用中的进一步发展。然而，很少有可用的干细胞或祖细胞，特别是人干细胞或祖细胞的替代性来源，因此，供给是有限的。

Hu等(WO 00/73421，题为“人羊膜上皮细胞的分离、深低温保藏的方法以及治疗用途”，公开于2000-12-07)公开了源于分娩时胎盘的人羊膜上皮细胞的分离、培养、为了将来使用的深低温保藏或诱导分化。按照Hu等所述，分娩后立即获得一胎盘并从绒毛膜分离羊膜，例如通过解剖。羊膜上皮细胞按照标准的细胞分离技术从羊膜分离。该公开的细胞可以在各种培养基中进行培养、在培养中增殖、冷藏或被诱导分化。Hu等公开了羊膜上皮细胞是全能造血干细胞(也可能是多能造血干细胞)，且能分化为上皮组织，如角膜表皮组织或阴道组织。然而，该方法的缺点是劳动密集，且干细胞的产率非常低。

现有的细胞群体的体外增殖方法也是劳动密集型的。例如，Emerson等(Emerson等，美国专利号6326198，题为“用于体内干细胞的复制、造血祖细胞培养的优化以及增强人基质细胞的代谢、GM-CSF分泌和/或IL-6分泌的方法和组分”，公布于2001-12-04)公开了人干细胞分裂和/或人造血祖细胞的优化的方法及体外培养的培养基条件。按照所公开的方法，源于骨髓的人干细胞或祖细胞在液体培养基中培养，其可被替换，优选灌注培养，连续地或周期性地，以每毫升培养物1毫升培养基的速率，每约24小时至48小时为周期。在生理上可接受的条件下维持培养时，除去代谢产物，补充消耗的养分。

Kraus等(Kraus等，美国专利号6338942，题为“靶细胞群体的选择性增殖”，公布于2002-01-15)公开了预定的靶细胞群体可选择性地增殖，通过在生长培养基中引进源于脐带血或外周血地起始标样细胞，致使靶细胞群体分裂，以及在生长培养基中用选择成分接触细胞，包括对预定的细胞群体(如CD34细胞)有特定亲和力的结合分子(例如CD34细胞的单集落抗体)，以在生长培养基中从其他细胞选择出预定的靶细胞群体。

Rodgers等(美国专利号6335195题为“促进造血和间充质细胞增殖和分化的方法”公布于2002-01-01)公开了造血和间充质细胞体外培养以及通过在有血管紧张素原、血管紧张素I(AI)、AI同功异质体、AI片段和其类似物，血管紧张素II(AII)、AII同功异质体、AII片段和其类似物或AII AT₂型2受体激动剂，单独或与其他生长因子和细胞因子联合存在下生长的谱系特异的细胞增殖和分化的诱导方法。该干细胞源于骨髓、外周血或脐带血。然而，如上面所讨论的，该方法的缺点是该体外诱导干细胞增殖和分化的方法耗时，也导致了干细胞的低产量。

干细胞和祖细胞具有用于治疗多种病症的潜能，包括恶性肿瘤、遗传性代谢缺陷、血红蛋白病及免疫缺陷。涉及源于脐带血或胎盘的干细胞的运用或研究的一个主要领域为使用这些细胞生产少量细胞用于骨髓及其他相关的移植术。然而，迄今为止，没人提出生产大量干细胞或祖细胞，如人CD34⁺或CD133⁺祖细胞的方法。尤其是，大量的后者细胞将使使用祖细胞的治疗方法变的容易。在此，本发明公开的方法涉及该需求。

视黄醛衍生物，如维生素A和视黄酸(RA)，已知可影响干细胞的分化。例如，视黄酸已被用于抑制不规则定向(慢性骨髓性白血病)造血干细胞的增殖(Nadkarni等，1984，Tumori 70：503-505)以及在前髓白血病细胞中诱导分化和自我更新潜能的丧失(Melchner等，1985，Blood 66(6)：1469-1472)。视黄酸还被用于诱导源于胚胎干细胞的神经元的分化以及抑制自发的中胚层分化(Slager等，Dev.Genet.1993，14(3)：212-24，Ray等，1997，J.Biol.Chem.272(30)：18702-18708)。视黄酸还进一步被用于诱导转化的生殖细胞前体(Damjanov等，1993，Labor.Investig，68(2)：220-232)、胎盘细胞前体(Yan等，2001，Devel.Biol.235：422-432)、及内皮细胞前体(Hatzopoulos等，1998，Development 125：1457-1468)的分化。然而，视黄醛衍生物在分化中的作用已十分了解，其可作为控制干细胞分化的调节手段而使用。

叶酸类似物，如氨基蝶呤和氨甲蝶呤(甲氨蝶呤)在造血干细胞分化中的作用已得到研究。叶酸类似物作为化学疗法试剂用于急性成淋巴细胞贫血和其他血增殖病症及癌症，且表明其通过杀光某类干细胞群体来影响干细胞的分化(DeLoia等，1998，Human Reproduction 13(4)：1063-1069)，因此，不能成为用于调节给药于患者的大量干细胞的分化的有效工具。

一些细胞因子，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL7、IL-11，与一些蛋白如促红细胞生成素、Kit配体、M-CSF及GM-CSF，也已被显示指导干细胞按造血谱系分化为特定细胞类型(Dushnik-Levinson等，1995，Biol.Neonate 67：77-83)，但是，这些过程没有得到充分了解并仍然太粗糙和不精确而不能作为控制干细胞分化的调节手段。

迄今为止，没人描述化合物，如下述的免疫调节剂化合物在干细胞或前体细胞分化中的应用。尤其是，没人证明这样的化组合物调节祖细胞，如CD34+祖细胞，远离树突细胞谱系分化的用途，这种分化是用于提高移植免疫耐受性的有益能力。而且，没人描述在此所述的化合物在为了生产含有该细胞的医药组合物而增殖祖细胞群体中的用途。该增殖的祖细胞培养物在治疗移植物抗宿主病和免疫耐受性的提高中是有用的。因为控制干细胞和前体细胞分化可生产在治疗上有效的细胞群体，因此，对于控制和调节髓样树突细胞谱系细胞，或早期祖细胞，如人CD34+或CD133+祖细胞的分化的能力有所需要，以控制树突细胞和/或粒细胞的产生。

3.发明概述

本发明提供了调节哺乳动物，特别是人干细胞或祖细胞分化的方法。具体地说，本发明的方法可用于调节和控制人干细胞沿着特定的细胞和组织谱系的分化和成熟。本发明包括影响该调节和控制的免疫调节小分子有机物，更优选氨基取代的异吲哚啉化合物，尤其是Actimid^TM或Revimid^TM化合物的用途。本发明进一步涉及在特定时段这些化合物的给药于祖细胞，以从特定途径调节分化。

本发明的方法包括干细胞或祖细胞分化成特定细胞谱系的调控，这些细胞谱系包括但不限于，间质的、造血的、生脂的、生肝的、生神经的、成胶质的、生软骨的、生血管的、生肌的、生软骨的或生骨的谱系。在特定的实施方案中，本发明的方法包括干细胞分化为造血谱系细胞的调控。

本发明还包括定向细胞成为特定细胞类型的调控，所述细胞类型是例如间充质细胞、造血细胞、脂肪细胞、肝细胞、成神经细胞、成胶质细胞、软骨细胞、内皮细胞(EC)祖细胞、肌细胞、软骨细胞或成骨细胞。在特定的实施方案中，本发明包括定向造血祖细胞分化成红细胞、血小板或白细胞(白血细胞)，如嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱细胞、肥大细胞、B细胞、T细胞或浆细胞的调控。

在另一个实施方案中，本发明的方法涉及调节干细胞向造血谱系细胞，尤其是，CD34⁺、CD133⁺和CD45⁺造血谱系的分化，以及生产含有该细胞的预防或治疗上有益的药物组合物的方法。在另一个实施方案中，本发明的方法涉及调节早期祖细胞向树突细胞谱系、或粒细胞谱系、内皮细胞谱系或心肌细胞谱系的分化。

在另一个实施方案中，本发明提供了调节祖细胞向造血细胞谱系，尤其是树突细胞谱系或粒细胞谱系、内皮细胞谱系、神经细胞谱系或心肌细胞谱系分化的方法。在具体的实施方案中，所述的祖细胞为CD34⁺或CD133⁺细胞。该调控通过在培养过程中用本发明的化合物接触祖细胞而完成。在一个实施方案中，所述化合物为TNF-α活性抑制因子。在更具体的实施方案中，所述化合物是本文所述的免疫调节剂化合物，或沙利度胺，或更优选地，为氨基取代的异吲哚啉化合物。在更进一步具体的实施方案中，所述化合物为Actimid^TM或Revimid^TM。

在另一个具体的实施方案中，本发明的方法包括祖细胞分化为树突细胞的抑制。在另一个具体的实施方案中，本发明提供了调节在起始六天培养过程中的祖细胞分化的方法，其培养用于生产该祖细胞的增殖培养物。在另一个实施方案中，本发明的方法包括对早期祖细胞发育成粒细胞的促进，该粒细胞可能对于抵抗感染是有效的。粒细胞谱系定向祖细胞(CD15⁺细胞)的增加在减轻中性白细胞减少症和其随后的感染并发症中具有潜在的用途，该病症代表了癌症化学疗法最普遍的剂量限制性毒性。在另一个实施方案中，本发明的方法可用于抑制树突细胞的分化，其对于缓和移植物抗宿主病的效应是有效的。

本发明的祖细胞，用本发明的化合物调节后，对于移植是有效的(即造血的恢复)，并可作为替代细胞和组织(如胰脏、心脏、肝脏、肾脏、肝、脑、肺、膀胱、肠或肌肉细胞)的可再生来源用于治疗正常的衰老、损伤或疾病如心脏病、中风、帕金森病和阿尔茨海默病中的再生药物。该细胞在测定介导本发明的化合物的作用的胞内生化途径中也是有用的。这些细胞对于筛选新的药物和毒素也是有用的，例如，用于确定抗癌药物的潜能，理解出生缺陷的起因等。

本发明的方法可用于特异性地抑制红血细胞或红细胞集落(BFU-E和CFU-E)的生成，同时增加白细胞和血小板集落形成(CFU-GM)的生成以及提高总的集落形成单位的产量。本发明的方法不仅可用于调节干细胞和祖细胞如CD34⁺祖细胞的分化，还可用于刺激集落形成率，通过提高骨髓移植物移入速度而给造血干细胞移植提供重要的帮助。

除人胚胎干细胞外的任何哺乳动物干细胞可按照本发明的方法而使用，包括但不限于，从脐带血、胎盘及除人胚胎外的其他来源分离的干细胞。干细胞可以从任何哺乳动物种类中分离，例如，大鼠、小鼠、兔、豚鼠、狗、猫、猪、羊、牛、马、猴等，更优选地，人。干细胞可包含多能细胞，即，具有完全的分化多样性、能自我更新以及在组织中维持休眠或静止的细胞。干细胞还可以包括多潜能性细胞或定向祖细胞。在一个优选的实施方案中，本发明利用活的、静止的、多能性的干细胞，其存在于或随后产生于足期的胎盘，就是说，该细胞可随着成功的分娩和胎盘娩出、放血和胎盘灌注而得到回收，致使多达十亿个有核细胞的产生和回收，其有核细胞产生50至100百万的多潜能性或多能性干细胞。该细胞在此被称为人胎盘干细胞或胚胎样干细胞。

在本发明的一个具体的实施方案中，细胞，例如骨髓或产后灌注的胎盘的内源性细胞，包括但不限于，胚胎样干细胞、祖细胞如CD34⁺或CD133⁺细胞、多能细胞或多潜能细胞，暴露于本发明的化合物并受到诱导分化。该内源性细胞可在体外繁殖。在另一个实施方案中，内源性细胞可从胎盘和培养基中收集得到，并在体外适当的条件下培养，且培养一段时间至足以按期望的细胞类型或谱系来诱导分化。

在本发明的另一个实施方案中，干细胞或祖细胞源自其它来源如脐带血、外周血或成人血，并暴露于本发明的化合物中被诱导分化。在一个优选的实施方案中，分化在体外合适的条件下进行一段时间，所述时间足以诱导向所期望的细胞系或细胞类型分化。本发明的化合物用于通过添加，在原位产生或其他任何允许干细胞或祖细胞与本发明的化合物接触的方式用于分化介质/培养基中。

已经发现本发明的化合物给药的时间对CD34⁺祖细胞的分化有极深的影响。因此，在本发明的一个实施方案中，CD34⁺祖细胞分化为树突细胞通过一种包括使祖细胞在第一天培养时接触本发明的化合物的方法而得到延迟或抑制。在另一个实施方案中，从CD34⁺祖细胞来的CD1a⁺细胞的发育通过一种包括使所述祖细胞在第一天培养时接触本发明的化合物的方法而得到降低或阻碍。在另一个实施方案中，源于CD34⁺祖细胞的CD1a⁺细胞群体的持久性通过在无本发明的化合物存在下培养所述祖细胞六天后接触该化合物而得到提高。

本发明还包括调节早期祖细胞如人CD34⁺和CD133⁺细胞分化的方法，包括使祖细胞在增殖和分化期间的不同时间与一种或多种本发明的化合物接触。因此，在一个实施方案中，本发明包括一种调节祖细胞分化的方法，包含使所述细胞仅在培养第一天与本发明的一种或多种化合物接触。在另一个实施方案中，所述细胞与所述化合物在培养的第一天至第12天中任何一天以一次剂量接触。在另一个实施方案中，所述细胞在0至12天，包括0天和12天的不同天数中至少和所述化合物接触两次。仍在另一个实施方案中，所述细胞在增殖和/或分化时期与一种或多种化合物接触一天两次、一天一次或隔一天一次。在另一个实施方案中，所述接触在体外进行。仍在另一个实施方案中，所述接触在受治疗者体内进行。在一个更具体的实施方案中，所述受治疗者是人、非人的哺乳动物、鸟类或爬行动物。

总而言之，可在产后灌注的胎盘中培养的内源性或外源性干细胞或祖细胞暴露于本发明的化合物可以在这些细胞被培养于产后灌注的胎盘发生，或优选地，可以将在体外细胞从胎盘中回收或移去后发生。

本发明包括具有TNF-α活性的化合物作为干细胞和/或祖细胞发育调节剂的用途。在一个具体的实施方案中，该化合物为免疫调节剂化合物，如已知的IMiDs^TM类的化合物，包括但不限于沙利度胺类似物、Actimid^TM(Celgene Corp.，Warren，NJ)及Revimid^TM(CelgeneCorp.，Warren，NJ)。

本发明还包括经预处理的干细胞或祖细胞用于治疗和预防疾病的移植。在一个实施方案中，一需要移植的患者在移植前、中间和/或移植后菌给予化合物的药物。

本发明进一步包括由本发明的方法产生的祖细胞或特定类型细胞的用途。换言之，本发明包括由造血祖细胞分化制得的白细胞、粒细胞或树突细胞的用途，其中所述祖细胞分化用本发明的化合物调节或调控。

在另一个实施方案中，本发明包括干细胞的控制或调控，通过在体内以干细胞和本发明的小分子化合物给药于其所需的患者。

在一个实施方案中，本发明提供了包含CD34⁺或CD133⁺祖细胞和可药用载体的药物组合物，其中所述祖细胞已经在培养的前6天在促进所述祖细胞增殖和分化的条件下与本发明的化合物，尤其是移植TNF-α活性的化合物接触。在一个具体的实施方案中，药物组合物包含六天培养后收集和深低温保藏的细胞。在另一具体的实施方案中，药物组合物中的细胞为CD34⁺CD38^-CD34^-或CD34⁺CD38^-CD34⁺细胞。在另一个具体的实施方案中，与细胞接触的化合物为本发明的免疫调节剂化合物，或沙利度胺或沙利度胺类似物。在另一个具体的实施方案中，与细胞接触的化合物为Actimid^TM或Revimid^TM。

在另一个实施方案中，本发明还提供了制备药物组合物的方法，包括用抑制TNF-α活性的化合物接触CD34⁺或CD133⁺祖细胞，其中所述祖细胞在允许增殖的培养条件下在培养基中培养了六天，其中所述祖细胞在允许所述祖细胞增殖和分化的培养条件下在培养基中培养了六天；在培养六天后收集所述细胞；以及将可药用的载体与所述细胞组合。在该方法的一个具体实施方案中，所述接触在培养第一天进行。在该方法的另一个具体实施方案中，所述接触在所述的六天培养中至少进行两次。在该方法的另一个具体实施方案中，所述化合物为本发明的小分子免疫调节剂化合物。在另一个具体实施方案中，与细胞接触的化合物为Actimid^TM或Revimid^TM。在仍是该方法的另一个具体实施方案中，所述祖细胞在所述培养前已从其他的血细胞中分离。在该方法的另一个具体实施方案中，所述培养基另外还包含GM-CSF和TNF-α。在该方法的另一个更具体实施方案中，所述Actimid^TM或Revimid^TM以0.1μM至10.0μM的浓度存在。在该方法的另一个更具体实施方案中，所述Actimid^TM或Revimid^TM以1.0μM的浓度存在。在该方法的另一个具体实施方案中，将所述细胞在收集后进行深低温保藏。

本发明进一步提供在哺乳动物受治疗者中增殖祖细胞群体的方法，包括给药以治疗上有效量的CD34⁺或CD133⁺祖细胞和Actimid^TM或Revimid^TM于所述受体哺乳动物受治疗者。在该方法的具体实施方案中，所述祖细胞在受体哺乳动物受治疗者中分化。在该方法的另一个具体实施方案中，所述祖细胞以基本上无红血细胞的细胞制备物形式给药于所述受治疗者。在该方法的另一个具体实施方案中，所述祖细胞以包含骨髓细胞、胎盘细胞、脐带血细胞或PBMC的细胞制备物形式给药于受体哺乳动物受治疗者。在该方法的另一个具体实施方案中，所述祖细胞以与载体联合的形式给药于受体哺乳动物受治疗者。在该方法的另一个具体实施方案中，所述祖细胞为CD34⁺CD133⁺祖细胞。在该方法的另一个具体实施方案中，所述祖细胞表达掺入的目的遗传材料。

本发明还提供由上述方法制备的作为药物组合物的细胞。

仍在另一个实施方案中，本发明包括在深低温保藏和融化后调节干细胞或祖细胞例如CD34⁺祖细胞，以消除深低温保藏和暴露于冷冻保藏剂对于干细胞的有害影响的方法。在某些实施方案中，本发明提供了在深低温保藏和融化后调节干细胞，以消除暴露于冷冻保藏剂(例如，DMSO)而对干细胞增殖和迁移能力的有害影响的方法。

3.1定义

如本文所用的，术语“生物反应器”是指用于繁殖细胞、生产或表达生物材料以及生长或培养细胞组织、类器官、病毒、蛋白、多核苷酸和微生物的体外系统。

如本文所用的，“DC细胞”是指树突细胞。

如本文所用的，“早期祖细胞”是指CD34⁺祖细胞、CD133⁺祖细胞或哺乳动物、禽类或爬行类中的任一等效物。

如本文所用的，术语“胚胎干细胞”是指源于囊胚泡(例如4-5天的人胚胎)内生细胞团的细胞，且具有多能性。

如本文所用的，术语“胚胎样干细胞”是指非源于囊胚泡内生细胞团的细胞。如本文所用的，“胚胎样干细胞”还可能是指“胎盘干细胞”。优选胚胎样干细胞是多能性的。然而，可以从胎盘获得的干细胞包括胚胎样干细胞、多潜能性细胞及定向祖细胞。按照本发明的方法，源于胎盘的胚胎样干细胞可从分离的胎盘中收集，其经过了一段时间的放血和灌注，足以除去残留细胞。优选地，胚胎样干细胞是人源的，虽然可来源于任何哺乳动物。

如本文所用的，术语“放血的”或“放血”，当与胎盘相关使用时，是指从胎盘除去和/或排出基本上所有的脐带血。按照本发明，胎盘放血可通过，例如，但并不由此限定，排出、重力诱导的流出、按摩、挤压、抽吸等等而完成。在一个优选的实施方案中，胎盘的放血可进一步通过灌注、漂洗或用含或不含试剂，如抗凝剂的液体冲洗胎盘，以助于胎盘的放血而完成。

如本文所用的，术语“灌注”或“灌注法”是指透过器官或组织流出或排出液体，优选地，透过器官或组织的液体的排出具有足够的力量或压力以除去任何残留细胞，即，源于器官或组织的非粘附细胞。如本文所用的，术语“灌注液”是指随着从器官或组织排出而收集的液体。在一个优选的实施方案中，灌注液包含一种或多种抗凝剂。

如本文所用的，术语“内源细胞”指一种“非外源”细胞，即，一种自身的或自体同源的细胞，它源于胎盘。

如本文所用的，术语“外源细胞”是指“外来的”细胞，即，异种细胞(即，源于非胎盘供体来源的“非自我”细胞)或源于非胎盘的器官或组织的自体同源细胞(即，源于胎盘供体的“自我细胞”)。

如本文所用的，术语“免疫调节剂化合物”是指下文5.3节公开的化合物。

如本文所用的，术语“类器官”是指以表面外观形式或如任何器官或哺乳动物体，优选人体的腺体的实际结构形式装配的一种或多种细胞类型的聚集体。

如本文所用的，术语“多潜能性细胞”是指具有生长为哺乳动物体约260种细胞类型任一亚类的能力的细胞。不同于多能性细胞，多潜能性细胞不具有形成所有细胞类型的能力。

如本文所用的，术语“多能性细胞”是指具有完全分化多样性的细胞，即，生长为哺乳动物体约260种细胞类型的能力。多能性细胞可自我更新，且能在组织中维持休眠或静止。不同于全能性细胞(例如，受精的二倍体卵细胞)，胚胎样干细胞通常不能形成新的囊胚泡。

如本文所用的，术语“祖细胞”是指定向分化为特定细胞类型或形成特定组织的细胞。

如本文所用的，术语“干细胞”是指能不确定地再生而形成组织和器官的限定细胞的标准细胞。干细胞是在发育上具有多能性或多潜能性的细胞。一个干细胞可分裂产生两个子代干细胞，或一个子代干细胞和一个祖(转变)细胞，其随后增殖为组织的成熟的、完全形态的细胞。

如本文所用的，术语“全能性细胞”是指能形成一个完整胚胎(例如，一个囊胚泡)的细胞。

4.附图简述

图1.柱状图显示了在沙利度胺(THD)、Actimid^TM和Revimid^TM以浓度1μg/ml和10μg/ml存在下培养脐带血CD34⁺细胞的结果。等体积的DMSO作为阴性对照。红细胞造血爆发集落形成单位(BFU-E)、红细胞集落形成单位(CFU-E)、粒巨噬系集落形成单位(CFU-GM)和集落总数(CFU-Total)在光学显微镜下记录。Y-轴：集落数。详见6.1节。

图2(A-F).流式细胞图。人脐带血CD45⁺细胞暴露于Actimid^TM和Revimid^TM抑制了红细胞的生成和CD34⁺CD38^-细胞的增殖。脐带血CD45⁺细胞在有细胞因子IL3、IL6、G-CSF、Epo和KL下培养14天。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞群体的百分比。A.对照，免疫球蛋白(Ig)。B.对照，不加化合物。C.DMSO(5μg/ml)。D.沙利度胺(“Thal”)(5μg/ml)。E.Actimid^TM(5μg/ml)。F.Revimid^TM(5μg/ml)。X-轴：Gly-A(FL1-H)染色的相对强度。Y-轴：CD34(FL2-H)染色的相对强度。详见6.1节。

图3(A-F).流式细胞图。人脐带血CD45⁺细胞暴露于Actimid^TM和Revimid^TM抑制了在有细胞因子IL3、KL和G^-CSF下培养14天的人脐带血CD34⁺细胞中CXCR4的表达。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞群体的百分比。A.对照，免疫球蛋白(Ig)。B.对照，CD45⁺细胞。C.DMSO(0.3μg/ml)。D.Thal(0.3μg/ml)。E.Actimid^TM(0.3μg/ml)。F.Revimid^TM(0.3μg/ml)。X-轴：CD34(FL1-H)染色的相对强度。Y-轴：CXCR4(FL2-H)染色的相对强度。详见6.2节。

图4(A-F).流式细胞图。人脐带血CD45⁺细胞暴露于Actimid^TM和Revimid^TM刺激了CD34⁺和/或CD34⁺CD38^-细胞群体的增殖。脐带血CD45⁺细胞在有细胞因子IL3、IL6、G-CSF、Epo和KL下培养14天。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞群体的百分比。A.对照，免疫球蛋白(Ig)。B.对照，不加化合物。C.DMSO(0.3μg/ml)。D.Thal(0.3μg/ml)。E.Actimid^TM(0.3μg/ml)。F.Revimid^TM(0.3μg/ml)。X-轴：CD38(FL1-H)染色的相对强度。Y-轴：CD34(FL2-H)染色的相对强度。详见6.2节。

图5(A-F).流式细胞图。人脐带血CD45⁺细胞暴露于Actimid^TM和Revimid^TM产生了人脐带血祖细胞的重要的保存。脐带血CD45⁺细胞在有细胞因子IL3、IL6、G-CSF、Epo和KL下培养14天。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞群体的百分比。A.对照，免疫球蛋白(Ig)。B.对照，不加化合物。C.DMSO(5μg/ml)。D.Thal(5μg/ml)。E.Actimid^TM(5μg/ml)。F.Revimid^TM(5μg/ml)。X-轴：CD38(FL1-H)染色的相对强度。Y-轴：CD34(FL2-H)染色的相对强度。详见6.2节。

图6(A-F).流式细胞图。人脐带血CD45⁺细胞暴露于Actimid^TM和Revimid^TM抑制了CD45⁺细胞的CXCR4的表达和增殖了CD45⁺细胞群体。脐带血CD45⁺细胞在有细胞因子IL3、IL6、G-CSF、Epo和KL下培养14天。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞群体的百分比。A.对照，免疫球蛋白(Ig)。B.对照，不加化合物。C.DMSO(5μg/ml)。D.Thal(5μg/ml)。E.Actimid^TM(5μg/ml)。F.Revimid^TM(5μg/ml)。X-轴：CD45(FL1-H)染色的相对强度。Y-轴：CXCR4(FL2-H)染色的相对强度。详见6.2节。

图7(A-F).流式细胞图。人脐带血CD45⁺细胞暴露于Actimid^TM和Revimid^TM产生了CD34⁺祖细胞数量上的增殖以及提高了粒细胞和单核细胞的产量。脐带血CD45⁺细胞在有细胞因子IL3、IL6、G-CSF、Epo和KL下培养14天。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞群体的百分比。A.对照，免疫球蛋白(Ig)。B.对照，不加化合物。C.DMSO(5μg/ml)。D.Thal(5μg/ml)。E.Actimid^TM(5μg/ml)。F.Revimid^TM(5μg/ml)。X-轴：CD11b(FL1-H)染色的相对强度。Y-轴：CD34(FL2-H)染色的相对强度。详见6.2节。

图8(A-F).流式细胞图。人脐带血CD45⁺细胞暴露于Actimid^TM和Revimid^TM增殖了CD34⁺祖细胞以及消除了DMSO介导的单核细胞产量的抑制。脐带血CD45⁺细胞在有细胞因子IL3、IL6、G-CSF、Epo和KL下培养14天。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞群体的百分比。A.对照，免疫球蛋白(Ig)。B.对照，不加化合物。C.DMSO(5μg/ml)。D.Thal(5μg/ml)。E.Actimid^TM(5μg/ml)。F.Revimid^TM(5μg/ml)。X-轴：CD14表达(FL1-H)染色的相对强度。Y-轴：CD34(FL2-H)染色的相对强度。详见6.3节。

图9(A-F).流式细胞图。人脐带血CD45⁺细胞暴露于Actimid^TM和Revimid^TM显示了在分化为B细胞上的较小的抑制效应。脐带血CD45⁺细胞在有细胞因子IL3、IL6、G-CSF、Epo和KL下培养14天。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞群体的百分比。A.对照，免疫球蛋白(Ig)。B.对照，不加化合物。C.DMSO(5μg/ml)。D.Thal(5μg/ml)。E.Actimid^TM(5μg/ml)。F.Revimid^TM(5μg/ml)。X-轴：CD38(FL1-H)染色的相对强度。Y-轴：CD19(FL2-H)染色的相对强度。详见6.3节。

图10(A-F).流式细胞图。人脐带血CD45⁺细胞暴露于Actimid^TM和Revimid^TM克服了由暴露于DMSO而产生的CXCR5的抑制。脐带血CD45⁺细胞在有细胞因子IL3、IL6、G-CSF、Epo和KL下培养14天。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞群体的百分比。A.对照，免疫球蛋白(Ig)。B.对照，不加化合物。C.DMSO(5μg/ml)。D.Thal(5μg/ml)。E.Actimid^TM(5μg/ml)。F.Revimid^TM(5μg/ml)。X-轴：CXCR5(FL1-H)染色的相对强度。Y-轴：CD34(FL2-H)染色的相对强度。详见6.3节。

图11(A-E).流式细胞图。人脐带血单核细胞(MNCs)暴露于Actimid^TM和Revimid^TM提高了CD34⁺CD38⁺细胞群体数。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞群体的百分比。A.对照，免疫球蛋白(Ig)。B.对照，不加化合物。C.DMSO(5μg/ml)。D.Actimid^TM(5μg/ml)。E.Revimid^TM(5μg/ml)。X-轴：CD38(FL1-H)染色的相对强度。Y-轴：CD34(FL2-H)染色的相对强度。详见6.3节。

图12(A-E).流式细胞图。MNCs暴露于Actimid^TM和Revimid^TM下调CXCR4⁺CD45⁺细胞群体数，但高了CXCR4⁺CD45^-细胞群体数。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞群体的百分比。A.对照，免疫球蛋白(Ig)。B.对照，不加化合物。C.DMSO(5μg/ml)。D.Actimid^TM(5μg/ml)。E.Revimid^TM(5μg/ml)。X-轴：CD45(FL1-H)染色的相对强度。Y-轴：CXCR4(FL2-H)染色的相对强度。详见6.3节。

图13(A-E).流式细胞图。沙利度胺、Actimid^TM和Revimid^TM在造血祖细胞向脐带血成分的有核细胞分化的谱系定向化上的影响。流式细胞图显示Actimid^TM和Revimid^TM与对照相比提高了单核谱系细胞的百分比，表明存在分化的调节，其转向引起淋巴样和髓样细胞的谱系。A.对照，免疫球蛋白(Ig)。B.DMSO(5μg/ml)。C.Thal(5μg/ml)。D.Actimid^TM(5μg/ml)。E.Revimid^TM(5μg/ml)。详见6.4节。

图14.Actimid^TM对CD34⁺细胞分化和成熟为DC细胞的影响的研究略图。在增殖和成熟期(第1天至第12天)或成熟期(第6天至第12天)，CD34⁺细胞在1.0μM Actimid^TM和DMSO(二甲基亚砜)存在或缺乏的条件下培养。在第6天或第12天用FITC和PE缀合的单克隆抗体对免疫组织化学标记进行测试。详见6.6节。

图15(A-D).流式细胞图显示了6天的CD34⁺细胞的表型特征，从第1天起暴露于Actimid^TM。Actimid^TM几乎完全抑制了CD86⁺CD1⁺细胞的发育。细胞用CD1aFITC和CD14PE或CD1aFITC和CD86PE双标记。A：用DMSO(对照)处理的CD34⁺细胞产生的CD86⁺CD1⁺细胞。B：用DMSO(对照)处理的CD34⁺细胞产生的CD14⁺CD1⁺细胞。C：用Actimid^TM处理的CD34⁺细胞产生的CD86⁺CD1⁺细胞。D：用Actimid^TM处理的CD34⁺细胞产生的CD14⁺CD1⁺细胞。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定定重组标记的细胞群体的百分比。详见6.6节。

图16(A-D).流式细胞图显示了在CD34⁺细胞增殖期(第1天至第6天)暴露于Actimid^TM在第6天的影响。暴露于Actimid^TM的CD34⁺CD38^-细胞在6天后分化为CD34⁺CD38^-CD33⁺细胞。细胞用CD33FITC和CD83PE或CD38PE和CD34PE双标记。A：细胞用DMSO处理，且对CD34和CD38标记。B：细胞用DMSO处理，且对CD83和CD33标记。C：细胞用Actimid^TM处理，且对CD34和CD38标记。D：细胞用处理。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞群体的百分比。详见6.6节。

图17.从培养的第0天至第6天Actimid^TM诱导CD34⁺细胞来源的细胞群体的转变。从第0天至第6天细胞在不同浓度Actimid^TM下培养，然后用CD34和CD38或CD1a和CD14双标记。Actimid^TM在CD34⁺CD38^-细胞中引起显著的提高，在CD1a⁺CD14^-细胞中引起降低。详见6.6节。

图18.在不同时间用Actimid^TM处理的CD34⁺细胞在第6天的表型改变。细胞接种于培养皿培养6天。用Actimid^TM仅从第0天至第1天、仅第0天至第2天、仅第0天至第3天、仅第0天至第4天、仅第0天至第5天或第0天至第6天处理细胞。对于少于6天的温育，Actimid^TM在指示的那天洗去，且细胞重悬于DMSO中。在第6天，细胞用CD34和CD38或CD1a和CD14标记。详见6.6节。

图19(A-B).用单剂量或多剂量的Actimid^TM处理的CD34⁺祖细胞在第6天的表型改变。图19A：条件1：在第0天单剂量Actimid^TM；条件2：在第0天和第4天给药Actimid^TM；条件3：在第0天、第2天和第4天给药Actimid^TM。Y轴表示表达特定标记或重组标记的细胞的百分比。图19B：条件1：在第0天单剂量Actimid^TM；条件2：在第0天、第4天、第6天、第8天给药Actimid^TM；条件3：在第0天、第2天、第4天、第6天、第8天给药Actimid^TM。细胞由CD11c和CD15的表达而估定，其为粒细胞标记。Y轴表示与Actimid^TM或DMSO(对照)接触的CD11c⁺CD15^-和CD11c^-CD15⁺细胞的百分比。详见6.6节。

图20(A-F).从第1天至第12天暴露于Actimid^TM(1μM)的CD34⁺细胞产生的树突细胞在第12天的流式细胞图。与对照相比Actimid^TM在第12天引起CD86和CD80分子共刺激的降低。细胞用CD1aFITC和CD86PE抗体、CD1aFITC和CD80PE抗体或CD1aFITC和CD14PE抗体双标记。A：细胞用DMSO处理，且在第12天对CD86和CD1a染色。B：细胞用DMSO处理，且在第12天对CD80和CD1a染色。C：细胞用DMSO处理，且在第12天对CD14和CD1a染色。D：细胞用Actimid^TM处理，且在第12天对CD86和CD1a染色。E：细胞用Actimid^TM处理，且在第12天对CD80和CD1a染色。F：细胞用Actimid^TM处理，且在第12天对CD14和CD1a染色。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞的百分比。详见6.6节。

图21(A-D).从第1天至第12天暴露于Actimid^TM(1μM)的CD34⁺细胞产生的树突细胞在第12天的流式细胞图。暴露于Actimid^TM导致CD54粘附分子表达的改变，相对于对照(与图21D中次屏板E和F比较)，引起CD54^bright表达的降低和CD54^dim表达的提高。A：细胞用DMSO处理，且用IgG1对HLA^-DR染色。B：细胞用DMSO处理，且对CD54和CD40染色。C：细胞用Actimid^TM处理，且用IgG1对HLA-DR染色。D：细胞用Actimid^TM处理，且对CD54和CD40染色。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞的百分比。详见6.6节。

图22(A-B).Actimid^TM促进从CD34⁺祖细胞的粒细胞分化。在DMSO(图22A)或Actimid^TM(图22B)下生长12天，然后用粒细胞分子标记CD15的抗体标记的CD34⁺细胞的流式细胞图。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞的百分比。详见6.6节。

图23(A-D).Actimid^TM并不诱导CD1a⁺或CD14⁺前体细胞的凋亡。CD1a⁺CD14^-和CD1a^-CD14⁺分离细胞(DC祖细胞)的流式细胞图。CD34⁺祖细胞在SCF、Flt^-3L、GM^-CSF和TNF-α下经过6天的培养。在第6天，通过磁性细胞分选器(Miltenyi)收集CD1a⁺CD14^-和CD1a^-CD14⁺细胞，在存在GM^-CSF和TNF^-α以及存在或不存在Actimid^TM(1μM)的条件下培养CD1a⁺CD14^-和CD1a^-CD14⁺细胞群额外2天。凋亡细胞随后用膜联蛋白V-FITC，一种凋亡的标记，染色，与碘化丙锭(PI)，一种活性探针，联合使用。每张细胞图上的百分比表示对膜联蛋白V-FITC和/或碘化丙锭染色阳性的细胞的百分比。对膜联蛋白V-FITC阳性的细胞数量与Actimid^TM处理的和对照的细胞(尤其与每张细胞图中的B3和B4比较)作比较。A：用DMSO处理的CD1a⁺CD14^-细胞。B：用Actimid^TM处理的CD1a⁺CD14^-细胞。C：用DMSO处理的CD1a^-CD14⁺细胞。D：用Actimid^TM处理的CD1a^-CD14⁺细胞。详见6.6节。

图24(A-D).在由Actimid^TM存在或缺乏下生长12天的CD34⁺细胞的流式细胞图。Actimid^TM引起甘露糖受体介导的胞饮作用的降低，其与DMSO对照比较，通过FITC标记的右旋糖酐摄取的降低而得到证明。A：DMSO和4℃。B：ActimidTM和4℃。C：DMSO和37℃。D：ActimidTM和37℃。每张细胞图上的百分比表示呈现胞饮作用的细胞分数。详见6.6节。

图25(A-D).培养12天的CD34⁺细胞的流式细胞图，且从第6天至第12天在存在或缺乏Actimid^TM下培养。在第1至5天Actimid^TM缺乏下培养后，在第6至12天Actimid^TM存在下培养，与DMSO对照相比，导致甘露糖受体介导的胞饮作用。每张细胞图上的百分比表示呈现胞饮作用的细胞分数。A：DMSO和4℃。B：ActimidTM和4℃。C：DMSO和37℃。D：ActimidTM和37℃。详见6.6节。

图26.Actimid^TM降低培养12天的CD34⁺细胞呈递抗原的能力。CD34⁺细胞在存在或缺乏Actimid^TM下培养12天；Actimid^TM处理的细胞，在第12天，与DMSO对照比较显示基本上降低的刺激作用指标。

图27.对从第6天至第12天在Actimid^TM存在下培养的CD34⁺细胞，Actimid^TM具有抗原呈递细胞(APC)减少的活性。CD34⁺细胞在存在或缺乏Actimid^TM下培养5天。处理过的细胞的抗原呈递能力与对照，DMSO处理的细胞作比较。详见6.6节。

图28.在GM-CSF和TNF-α存在下培养的CD34⁺造血祖细胞的分化途径。

图29.显示以Actimid^TM对于在GM-CSF和TNF-α存在下培养的CD34⁺造血祖细胞的分化途径的效果的总结图表。详见6.6节。

图30.显示鼠Sca⁺Lin^-造血祖细胞成熟条件的图表。细胞在存在干细胞因子(SCF)、Flt-3L、粒巨噬集落刺激因子(GM-CSF)和巨噬集落刺激因子(MCSF)及0.1％DMSO(对照)下生长9天，10μM Actimid^TM或10μM全反式视黄酸(ATRA)用以驱动细胞向DC前体细胞表型分化。细胞随后从第9天至第12天在GM-CSF和TNF-α存在下培养，加入DMSO、Actimid^TM或ATRA，以驱动鼠细胞向未成熟的树突细胞的分化。详见6.8节。

图31(A-E).鼠细胞在普通培养条件下第9天出现(见实施例1，材料和方法，图30的描述)。细胞用CD80的抗体(图31A)、CD11的抗体(图31B)、CD32/16的抗体(图31C)、MHC II(I-A^b)的抗体(图31D)、CD14的抗体(图31E)或Gr-1的抗体(图31F)标记。细胞在第9天呈现出被CD88、CD11或CD32/16分子标记的抗体标记上，被I-A^b分子标记的抗体少许标记上，未被CD14或Gr-1分子标记的抗体标记上。详见6.8节。

图32(A-I).用DMSO、Actimid^TM或ATRA处理的鼠细胞第12天的流式细胞图。细胞用CD86和CD11b的抗体标记。图32A-32C(顶行)：细胞图显示用DMSO(对照)、Actimid^TM或全反式视黄酸(ATRA)处理时表达CD86(Y-轴)的细胞百分数。图32D-32F(中间行)：在如顶行处理时，表达主要的组织相容性复合物II(MHC-II)的细胞百分数。图32G-32I(底行)：在如顶行处理时，表达CD11b的细胞百分数。详见6.8节。

5.发明详述

本发明部分基于意外的发现，即干细胞或祖细胞暴露于本发明的化合物致使产生一种控制干细胞或祖细胞向特定祖细胞群体分化或祖细胞向特定细胞类型，如树突细胞、粒细胞、内皮细胞或神经细胞分化的可调控的方法。尤其是，干细胞或祖细胞暴露于本发明的化合物致使产生造血细胞特定群体，包括CD34⁺、CD38⁺和CD133⁺细胞的可调控的分化和增殖。这种分化的调控在没有因细胞死亡或分化为不需要的细胞类型或细胞谱系而造成产量的显著损失的情况下完成；换言之，本发明的化合物没有引发一种或多种细胞群体的凋亡。进一步地，造血祖细胞暴露于本发明的化合物导致特定细胞类型的可调控的分化和增殖。

因此，本发明提供调节人干细胞分化的方法，特别是CD34⁺造血祖细胞和CD133⁺祖细胞的分化。尤其是，本发明提供使用抑制TNF^-α活性的小的有机分子调节祖细胞沿着特定细胞和组织谱系分化的方法。进一步地，本发明包括增殖早期祖细胞，如人CD133⁺或CD34⁺细胞，尤其是CD34⁺CD38^-细胞，以移植入哺乳动物、鸟类或爬行动物中的方法，包括将造血祖细胞暴露于TNF^-α抑制剂或拮抗剂，其中抑制剂或拮抗剂是小分子物质。本发明还提供了从这些早期祖细胞产生其他类型细胞的方法，包括但不限于脑细胞、肾细胞、肠道细胞和肌肉细胞。本发明的化合物还对抑制从早期祖细胞，如人CD34⁺祖细胞的树突细胞分化以及促进粒细胞的分化起作用。

与本发明相关地使用的小分子化合物的实例包括但不限于，抑制TNF^-α活性的化合物。在本发明的方法中使用的化合物在5.3节详细描述。在一个实施方案中，虽然也使用沙利度胺水解产物、代谢物和前体，优选的化合物为沙利度胺类似物。在特别优选的实施方案中，化合物为ImiDs^TM(Celgene)，如Actimid^TM和Revimid^TM。

本发明的方法包括干细胞或祖细胞向特定细胞谱系分化的调控，包括但不限于间充质的、造血的、生脂的、生肝的、生神经的、成胶质的、生软骨的、生血管的、生肌的、生软骨的或成骨的谱系，其包括优选在体外将干细胞或祖细胞和本发明的化合物温育足够的一段时期，致使细胞向期望的细胞谱系的细胞分化。在一个具体的实施方案中，干细胞或祖细胞向造血谱系细胞的分化受到调节。具体地说，本发明的方法可用于以一种剂量相关的方式调节由CD34⁺、CD133⁺和CD45⁺造血祖细胞生成血细胞集落的发生。

本发明的方法还包括CD34⁺祖细胞向树突细胞分化的调节，其包括优选在体外将祖细胞和本发明的化合物温育足够长的一段时期，致使细胞向期望的细胞谱系的细胞分化。在一个具体的实施方案中，该祖细胞向树突细胞谱系细胞的分化通过将所述细胞接触Actimid^TM或Revimid^TM或其类似物或前药而调节。在另一个具体的实施方案中，CD34⁺祖细胞的分化得到调节以抑制沿着髓样谱系的分化并支持沿着粒细胞谱系的分化。在一个更具体的实施方案中，CD34⁺祖细胞向粒细胞谱系细胞的分化通过包括将CD34⁺祖细胞和本发明的化合物在对祖细胞培养的第1天接触的方法而调节。

任何哺乳动物干细胞或祖细胞可以按照本发明的方法使用，包括但不限于，从脐带血(“CB”细胞)、胎盘和其他来源分离的干细胞。干细胞可包括多能性细胞，即，具有完全的分化多样性、能自我更新以及在组织中维持休眠或静止的细胞。干细胞还可包括多潜能性细胞和定向祖细胞。在一个优选的实施方案中，本发明利用活的、静止的、多能性的干细胞，其存在于足期的胎盘中，可随着导致多潜能性和多能性干细胞的回收的成功的分娩和胎盘娩出、放血和胎盘灌注而得以回收。

在另一个优选的实施方案中，祖细胞为早期祖细胞，尤其是CD34⁺或CD133⁺细胞。优选地，CD34⁺或CD133⁺祖细胞来源于人骨髓、胎盘或脐带血。从其他哺乳动物来源的这些细胞的等效物也可使用。例如，在小鼠中，Sca⁺祖细胞可在本发明的方法中使用。从鸟类或爬行动物来源的等效的早期祖细胞也可使用。

在本发明的一个具体的实施方案中，胎盘内生性的或通过产后灌注胎盘产生的细胞，包括但不限于，胚胎样干细胞、祖细胞、多能性细胞和多潜能性细胞，在分离的和灌注的胎盘中培养时暴露于本发明的化合物，且诱导分化。在产后灌注的胎盘中繁殖的内生性细胞可以进行回收，和/或生物活性分子可从灌注液、培养基或从胎盘细胞自身进行回收。

在本发明的另一个实施方案中，将源于除了后胎盘的其它来源的干细胞或祖细胞在体外培养时暴露于本发明的化合物并且进行诱导分化。因此，本发明包括使哺乳动物干细胞分化为特定祖细胞的方法，其包括使干细胞在适于期望的分化的条件和/或培养基的情况下以及在本发明的化合物存在的情况下将干细胞进行分化。

进一步地，本发明包括调节或调控特定祖细胞群体向特定细胞类型分化的方法，其包括使所述祖细胞在适合所述分化的条件下以及在一种或多种本发明的化合物存在下进行分化。可选择地，干细胞或祖细胞可暴露于本发明的化合物，随后用合适的条件进行分化。合适条件的实例包括用人血清和细胞培养基质补充的营养培养基制剂，如用生长因子补充的MATRIGEL

。

本发明的方法还涉及不同的细胞群体，其可通过用本发明的化合物在培养的不同时期，无论是增殖或分化期接触祖细胞而产生。参见5.4节，具体为下面的5.4.2节。

在一个具体的实施方案中，本发明提供了使用酰胺和酰亚胺小分子，尤其是沙利度胺的氨基结合物来调节和调控在造血祖细胞移植前调节时期的血细胞生成的方法。

本发明还提供了使用本发明的小分子物质来调节和调控在先体外后体内造血祖细胞调节时期的血细胞生成的方法。本发明的方法包括干细胞或祖细胞体外分化的调控，包括体外温育化合物和干细胞或祖细胞，随后向受治疗者直接移植分化的细胞。

本发明还包括通过将干细胞或祖细胞以及本发明的化合物给药于其有需求的患者而在体内对干细胞或祖细胞的控制和调控。

本发明进一步包括预处理的干细胞或祖细胞的移植以治疗或预防疾病。在一个实施方案中，对需要移植的患者在移植前、移植中和/或移植后给药以本发明的化合物。在另一个实施方案中，还对需要移植的患者给药未经处理的干细胞或祖细胞，例如脐带血细胞、成人血细胞、外周血细胞或骨髓细胞。在另一个实施方案中，本发明的方法包括对受治疗者给药以化合物，所述受治疗者为未调节的干细胞或祖细胞的受体，以诱发出对已移植的干细胞的调节效应。

在某些实施方案中，本发明包括骨髓移植，其包括移植脐带血(或从脐带血获得的干细胞)、外周(即，成体)血(或从外周血获得的干细胞)，其中所述脐带血或干细胞已用本发明的化合物预处理过。另外，本发明包括由在本发明的化合物存在下已分化的造血祖细胞制得的白细胞的用途。例如，通过分化造血祖细胞而产生的白细胞可用于移植或可在移植前与脐带血或脐带血干细胞混合。

在其它的实施方案中，本发明包括骨髓移植，其包括按照本发明的方法获得的早期祖细胞，如CD34⁺或CD133⁺祖细胞的移植，其中所述祖细胞已用本发明的化合物预处理过。在本发明的一个实施方案中，所述树突细胞的前体细胞为CD34⁺CD38^-CD33⁺或CD34⁺CD38^-CD33^-前体细胞。进一步地，本发明包括由已在本发明的化合物存在下分化的CD34⁺祖细胞制得的细胞的用途。例如，通过CD34⁺祖细胞的分化而用本发明的化合物产生的CD34⁺CD38^-CD33⁺前体细胞、CD34⁺CD38^-CD33^-前体细胞、粒细胞等，可用于移植中。用本发明的化合物从CD133⁺细胞分化来的细胞也为本发明所包括。

本发明进一步包括在深低温保藏和融化后调节干细胞，以消除深低温保藏和暴露于冷冻保藏剂对干细胞的有害影响的方法。在某些实施方案中，本发明提供跟随深低温保藏和融化的调节干细胞，以消除暴露于冷冻保藏剂(例如，DMSO)对干细胞的增殖和迁移能力的有害影响的方法。

5.1干细胞和CD34⁺或CD133⁺祖细胞的分化的调节

5.1.1干细胞

本发明提供调节人干细胞分化的方法。在某些实施方案中，本发明的方法包括在体外干细胞或祖细胞分化的调控，包括体外将干细胞与化合物一起温育，随后向受治疗者直接移植分化的细胞。在另一个实施方案中，本发明的方法包括体内干细胞或祖细胞分化的调控，包括向未调节的干细胞受体的受治疗者递送化合物，随后向受治疗者直接给药以化合物。

通过本发明的方法获得的胚胎样干细胞可诱导向特定细胞谱系的分化，这些细胞谱系包括但不限于间充质的、造血的、生脂的、生肝的、生神经的、成胶质的、生软骨的、生血管的、生肌的、生软骨的或成骨的谱系。

在某些实施方案中，将按照本发明的方法获得的胚胎样干细胞诱导分化，以用于移植和先体外后体内治疗的方案中。在某些实施方案中，通过本发明的方法获得的胚胎样干细胞向特殊的细胞类型诱导分化，且受到遗传操纵以提供基因治疗的产品。在一个具体的实施方案中，通过本发明的方法获得的胚胎样干细胞在体外与诱导其分化的化合物如小的有机分子一起温育，随后向受治疗者直接移植分化的细胞。在一个优选的实施方案中，用于控制和调控干细胞分化的化合物不是多肽、肽、蛋白、激素、细胞因子、寡核苷酸或核酸。

按照本发明而使用的干细胞包括但不限于，脐带血(CB)细胞、胎盘细胞、胚胎干(ES)细胞、胚胎样干细胞、滋养层干细胞、祖细胞、骨髓干细胞及多潜能性、多能性和全能性细胞。

尤其是，本发明的方法包括除间充质干细胞外的干细胞群体向特定组织谱系分化的调控。例如，通过促进特定肌肉骨骼的再生和修复、新血管的发生及特定肌肉组织，如心肌和骨骼肌，以及各种器官和组织的血运重建，所述器官和组织包括但不限于脑、脊髓、肝、肺、肾和胰脏，本发明的方法可用于调控多潜能性干细胞向生软骨的、生血管的、生肌肉的和成骨谱系细胞的分化。本发明的方法可用于调控多潜能性干细胞向生脂、生软骨、成骨、生神经或生肝的谱系的分化。

用于调节分化的试剂可导入产后灌注的胎盘以诱导在胎盘中培养的细胞的分化。选择性地，该试剂可用于从胎盘中收集或移除细胞后在体外调节分化。

本发明的方法包括祖细胞向造血谱系细胞分化的调控，包括在体外将祖细胞和化合物温育足够的一段时期，致使细胞向造血谱系的分化。尤其是，本发明的方法可用于以剂量相关方式调节由CD34⁺、CD133⁺和CD45⁺造血祖细胞生成血细胞集落的发生(关于剂量的讨论，见5.7节)。

优选地，本发明的方法可用于特异性地抑制红血细胞或红细胞集落(BFU-E和CFU-E)的生成，同时增加白细胞和血小板集落形成(CFU-GM)的生成以及提高总的集落形成单位的产量。本发明的方法不仅可用于调控干细胞的分化，还可刺激集落形成率，通过提高骨髓植入物的速度和白细胞和/或血小板产物的恢复而给造血干细胞移植提供显著的益处。

在其它的实施方案中，本发明的方法可用于调控例如神经元前体细胞或神经母细胞向特定的神经细胞类型如感觉神经元(例如，视觉细胞、嗅觉细胞、机械感应神经元、化学感应神经元等)、运动神经元、皮质神经元或中间神经元的分化。在其它的实施方案中，本发明的方法可用于调控包括但不限于胆碱能神经元、多巴胺能神经元、γ-氨基丁酸能神经元、神经胶质细胞(包括少突胶质细胞，其产生髓磷脂)和室管膜细胞(其排列于脑室系统)细胞类型的分化。仍在其它的实施方案中，本发明的方法可用于调控为器官组分的细胞的分化，包括但不限于，心脏的普尔基涅细胞、肝的胆管上皮细胞、胰脏的β胰岛细胞、肾皮质或髓细胞及眼睛的视觉感光细胞。

按照本发明的方法获得的干细胞分化状态的评价可通过细胞表面标记的存在而鉴定。例如，本发明的胚胎样干细胞，可通过下面的细胞表面标记：OCT-4⁺和ABC-pt而区分。进一步地，本发明包括具有下列标记：CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、SH2、SH3、SH4、OCT-4和ABC-p或者如前所描述的缺乏下列细胞表面标记：CD34、CD38、CD45、SSEA3和SSEA4的胚胎样干细胞。这样的细胞表面标记可按照本领域熟知的方法常规测定，例如，通过流式细胞计数法，伴随洗涤和用抗细胞表面标记的抗体染色。例如，为测定CD34或CD38的存在，细胞可在PBS中洗涤，然后用抗CD34的藻蓝蛋白和抗CD38的异硫氰酸荧光素(Becton Dickinson，Mountain View，CA)双染色。

5.1.2 CD34⁺和CD133⁺早期祖细胞

本发明还提供调节人CD34⁺或CD133⁺细胞分化的方法。在某些实施方案中，本发明的方法包括在体外干细胞或祖细胞的调控，包括体外温育干细胞和化合物，随后将分化的细胞直接移植入受治疗者。

通过本发明的方法获得的祖细胞可沿着特定细胞谱系诱导分化，包括但不限于，对于CD34⁺祖细胞，沿着髓样或粒细胞谱系，对于CD133⁺细胞，沿着内皮或神经细胞谱系。在某些实施方案中，祖细胞被诱导分化以用于移植和先体外后体内治疗方案。在某些实施方案中，祖细胞向特殊的细胞类型诱导分化，且受到遗传操纵以提供基因治疗的产品。在具体的实施方案中，将祖细胞在体外与诱导其分化的化合物，如小的有机分子一起温育，随后向受治疗者直接移植分化的细胞。在一个优选的实施方案中，用于控制和调控干细胞分化的化合物不是多肽、肽类、蛋白、激素、细胞因子、寡核苷酸或核酸。在另一个优选的实施方案中，祖细胞促成向CD34⁺CD38^-CD33⁺或CD34⁺CD38^-CD33^-祖细胞分化。

优选地，本发明的方法可用于特异性地抑制红血细胞或红细胞集落(BFU-E和CFU-E)的生成，同时增加白细胞和血小板集落形成(CFU-GM)的生成以及提高总的集落形成单位的产量。本发明的方法不仅可用于调控干细胞的分化，还可刺激集落形成率，通过提高骨髓植入物的速度和白细胞和/或血小板产物的恢复而给造血干细胞移植提供显著的益处。

在其它的实施方案中，本发明的方法可用于减少CD34⁺祖细胞向CD1a⁺细胞，尤其是CD86⁺CD1a⁺细胞的分化。在另一个实施方案中，本发明的方法可用于减少或防止CD34⁺祖细胞向CD14⁺CD1a^-细胞的分化。CD14⁺CD1a^-细胞为表皮树突细胞或单核/巨噬祖细胞。在另一个实施方案中，本发明的方法可用于减少在增殖的CD34⁺祖细胞上CD80和CD86共刺激分子的表达。在另一个实施方案中，本发明的方法可用于减少增殖的CD34⁺祖细胞向CD54^bright细胞的分化，且激励向CD54^dim细胞的分化。在另一个实施方案中，本发明的方法可用于增加CD133⁺细胞的数量，其为内皮细胞祖细胞。仍在另一个实施方案中，本发明的方法可用于减少增殖的CD34⁺细胞向CD11c^-CD15⁺细胞的分化，且增加向CD11c⁺CD15^-细胞的分化，由此分化从髓样树突细胞谱系转变为粒细胞谱系。

按照本发明的方法获得的干细胞分化状态的评价可通过细胞表面标记的存在而鉴定。例如，本发明的祖细胞，可通过CD34⁺或CD133⁺细胞表面标记而区分。进一步地，本发明包括拥有或显示相对于对照高表达如前所描述的一种或多种下列标记：CD15、CD34、CD33、CD133或CD54^dim的增殖的祖细胞。本发明进一步包括缺乏或显示相对于对照低表达一种或多种下列标记：HLA^-DR、CD1a、CD11c、CD38、CD80、CD86、CD54^bright或CD14的增殖的祖细胞。在一个优选的实施方案中，本发明的增殖的祖细胞呈现CD34⁺CD38^-CD33⁺或CD34⁺CD38^-CD33^-。这样的细胞表面标记可按照本领域熟知的方法常规测定，例如，通过洗涤和用抗细胞表面标记的抗体染色，随后经过流式细胞计数法测定。例如，为测定CD34或CD38的存在，细胞可在PBS中洗涤，然后用抗CD34的藻蓝蛋白和抗CD38的异硫氰酸荧光素(Becton Dickinson，MountainView，CA)双染色。

在某些实施方案中，分化的细胞可通过鉴定分化的细胞吞噬能力而表征。例如，可通过用FITC标记右旋糖酐及用已知的方法测定摄取量而评价已分化的或正在分化的细胞的吞噬作用。分化的或正分化的细胞刺激T细胞的能力可在混合淋巴细胞反应(MLR)中测定，其中假定的负载抗原的细胞与T细胞混合，然后测定T细胞的活性水平。

5.1.3细胞的鉴定和表征

在某些实施方案中，已分化的细胞可通过表现差异表达的基因而鉴定(例如，表现未分化的祖细胞来源的基因库与源于祖细胞的已分化的细胞的基因库的差别)。例如，核酸扩增方法如聚合酶链式反应(PCR)或基于转录的扩增方法(例如，体外转录(IVT))可用于展现在不同细胞群体中的基因表达，例如，通过使用多核苷酸微阵列。该用于展现差别基因表达的方法在本领域中是熟知的(见，例如，Wieland等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2720-2724(1990)；Lisitsyn等，Science 259：946-951(1993)；Lisitsyn等Meth.Enzymology254：291-304(1995)；美国专利号5,436,142；美国专利号5,501,964；Lisitsyn等，Nature Genetics 6：57-63(1994)；Hubank和Schatz，1994，Nucleic Acids Research 22：5640-5648；Zeng等，1994，Nucleic Acids Research 22：4381-4385；美国专利号5,525,471；Linsley等，美国专利号6,271,002，题为“RNA扩增方法”，公开于2001-08-07；Van Gelder等，美国专利号5,716,785，题为“使用启动子进行基因操作的过程”，公开于1998-02-10；Stoflet等，Science 239：491-494，1988；Sarkarand Sommer，1989，Science244：331-334；Mullis等，美国专利号4,683,195；Malek等，美国专利号5,130,238；Kacian和Fultz，美国专利号5,399,491；Burg等，美国专利号5,437,990；R.N Van Gelder等，(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，1663；D.J.Lockhart等，1996，NatureBiotechnol.14，1675；Shannon美国专利号6,132,997；Lindemann等，美国专利号6,235,503，题为“削减杂交和差异分析的方法”，公开于2001-05-22)。

商业上现有的试剂盒对于基因展现是有用的，例如，展示PROFILE^TM系列试剂盒(Qbiogene，Carlsbad，CA)，其使用基于凝胶的处理方法来展现基因表达。该试剂盒利用限制性片段差异显示PCR(RFDD-PCR)在真核细胞内比较基因表达模式。PCR-选择性削减试剂盒(Clontech)和PCR-选择性差示筛选试剂盒(Clontech)也可使用，其允许削减文库中差异表达克隆的鉴定。在用PCR^-选择性削减试剂盒产生差异表达基因库后，PCR^-选择性差示筛选试剂盒得到使用。用直接由检测和驱动子集群合成的探针与削减文库与杂交，一种产自削减cDNA的探针，以及一种制自反向削减cDNA(反向进行的第二次削减)的探针。与检测子而不是驱动子探针杂交的克隆得到差异表达；然而，未削减的探针对于检测微量信息不够灵敏。削减的探针为差异表达cDNA而得到大量富集，但可能给出假阳性的结果。按照制造商的(Clontech)指导使用削减的和未削减的探针来鉴定差异表达基因。

在另一个实施方案中，分化的干细胞或祖细胞通过集落形成单位测定法而得到鉴定和表征，其在本领域中是通常所知的，例如MesenCuIt^TM培养基(干细胞技术，Inc.，Vancouver British Columbia)。

干细胞或祖细胞已分化为特殊的细胞类型的测定可通过本领域熟知的方法完成，例如，使用如流式细胞计数法或免疫细胞化学(如，用组织特异性或细胞标记特异性抗体对细胞染色)测量形态学上的和细胞表面标记的变化，通过用光学或共聚焦显微镜对细胞形态学检查，或使用本领域熟知的技术，如PCR和基因表达展示，测量基因表达的变化。

5.2干细胞和祖细胞群体

本发明提供调节人干细胞分化的方法。任何哺乳动物干细胞可在本发明的方法中使用，包括但不限于，分离自脐带血(CB细胞)、外周血、成体血、骨髓、胎盘、间充质干细胞及其他来源的干细胞。在非优选的实施方案中，干细胞为胚胎干细胞或已从非胎盘的来源分离的细胞。

间充质干细胞的来源包括骨髓、胚胎卵黄囊、胎盘、脐带、胎儿和青少年皮肤和血液。例如，骨髓细胞可从髂骨嵴、腿节、胫节、肋骨或其他髓的空腔获得。

按照本发明的方法使用的干细胞可包括多能性细胞，即，具有完全的分化多样性、能自我更新以及在组织中维持休眠或静止的细胞。干细胞还可包括多潜能性细胞、定向祖细胞和成纤维细胞。在一个优选的实施方案中，本发明利用的干细胞为从足期的放血灌注的胎盘分离的活的、静止的、多能性的干细胞。

干细胞群体可以由通过商业服务获得的胎盘干细胞而组成，例如LifeBank美国(Cedar Knolls，NJ)、ViaCord(Boston MA)、CordBlood Registry(San Bruno，CA)和Cryocell(Clearwater，FL)。

干细胞群体还包括按照美国申请，公开号US20020123141，公布于2002-09-05，题为“收集胎盘干细胞的方法”和美国申请，公开号US20030032179，公布于2003-02-13，题为“产后哺乳动物胎盘，其应用及由此的胎盘干细胞”(在此，引用每一篇的全部内容作为参考)公开的方法收集的胎盘干细胞。

在一个实施方案中，可以使用来自脐带血的干细胞。来自胎盘的血的首次采集称为脐带血，其主要包含CD34⁺和CD38⁺造血祖细胞。在产后灌注的第一个24小时中，高浓度的CD34⁺CD38^-造血祖细胞可从胎盘中分离。在灌注约24小时后，高浓度的CD34^-CD38^-细胞可从胎盘中随着前述的细胞一同分离。本发明分离的灌注过的胎盘提供大量富集CD34⁺CD38^-和CD34^-CD38⁺干细胞的干细胞来源；已灌注过24小时或更长时间的分离的胎盘提供大量富集CD34^-和CD38^-干细胞的干细胞来源。

按照本发明的方法使用的优选细胞为源于放血灌注的胎盘的胚胎样干细胞，或从胚胎样胎盘干细胞得到的细胞。本发明的胚胎样干细胞可通过使用如流式细胞计数法和免疫细胞化学技术测量形态学和细胞表面标记的变化，和使用如PCR技术测量基因表达的变化而得到表征。在本发明的一个实施方案中，该胚胎样干细胞可通过下列细胞表面标记：CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、SH2、SH3、SH4、OCT-4和APC-p的存在或下列细胞表面标记：CD34、CD38、CD45、SSEA3和SSEA4的缺乏而得到表征。在一个优选的实施方案中，这样的胚胎样干细胞可通过细胞表面标记OCT-4和ABC-p的存在而得到表征。这样的细胞表面标记可按照本领域熟知的方法常规测定，例如，通过流式细胞计数法，之后洗涤和用抗细胞表面标记的抗体染色。例如，为测定CD34或CD38的存在，细胞可在PBS中洗涤，然后用抗CD34的藻蓝蛋白和抗CD38的异硫氰酸荧光素(Becton Dickinson，Mountain View，CA)双染色。

源自胎盘的胚胎样干细胞具有胚胎干细胞的特性但并非从胚胎得到。换言之，本发明包括OCT-4⁺和ABC-p⁺细胞的用途，其为从产后灌注的胎盘分离的未分化的干细胞。该细胞与人胚胎干细胞一样是万能的(例如，多能性)。如上所述，许多不同的多能性或多潜能性干细胞可在不同的时间点从灌注的胎盘分离，例如，CD34⁺CD38⁺、CD34⁺CD38^-和CD34^-CD38^-造血细胞。按照本发明的方法，人胎盘在产后用作胚胎样干细胞的来源。

例如，从子宫娩出后，胎盘被尽可能快地放血以预防或减少细胞凋亡。随后，胎盘在一放血后就尽快地灌注，以除去血液、残留的细胞、蛋白、因子和器官中存在的任何其他物质。物质碎片也从胎盘中除去。灌注法用适当的灌注液通常持续至少2小时至超过24小时。在某些另外的实施方案中，胎盘受到至少4、6、8、10、12、14、16、18、20、22小时的灌注。换言之，本发明至少部分基于产后胎盘中的细胞可通过放血和灌注足够的时间而活化的发现。因此，胎盘可易于用作胚胎样干细胞的富有的和丰富的来源，其细胞可用于研究，包括药物发现、疾病的治疗和预防，尤其是外科移植和疗法，以及用于定向细胞、组织或类器官的生成。见系列号10/004,942的待审申请，递交于2001-12-05，题为“收集胎盘干细胞的方法”和系列号10/076,180的申请，递交于2002-02-13，题为“产后哺乳动物胎盘，其应用及由此的胎盘干细胞”，此处引用每篇的全部内容作为参考。

胚胎样干细胞可从引流的胎盘中通过利用脐动脉和脐静脉的灌注技术的方法而提取。胎盘优选通过放血和收集残留的血而引流(例如残留的脐带血)。然后，引流的胎盘在建立一个先体外后体内的、天然的生物反应器环境的状态下处理，其中驻留于薄壁组织和血管外空腔的胚胎样干细胞得到招募。该胚胎样干细胞迁移入引流过的、空的微环境中，按照本发明的方法对其进行收集，优选通过灌注法而洗入收集管中。

作为本发明的部分尤其关注的是CD34⁺和CD133⁺祖细胞向髓样细胞，尤其是树突或粒细胞的调节。最近的报导表明该细胞是多能性的；因此，本发明还关注这些祖细胞向脑细胞、肾细胞、肠道细胞、肝细胞或肌细胞发育的调节。

任何哺乳动物、鸟类或爬行类CD34⁺或CD133⁺干细胞或祖细胞可随同本发明的方法而使用，包括但不限于，从脐带血(CB细胞)、外周血、成体血、骨髓、胎盘包括灌注的胎盘(见美国申请公开号US20030032179，公布于2003-02-13，题为“产后哺乳动物胎盘，其应用及由此的胎盘干细胞”，此处引用其全部内容作为参考)、间克质干细胞和其他来源分离的干细胞。在一个优选的实施方案中，干细胞为造血干细胞或已从骨髓中分离的细胞。该细胞可从其他器官或组织获得，但这些来源是较少优选的。

在一个实施方案中，可使用从脐带血或产后胎盘来的祖细胞。如上记载的，脐带血要包含CD34⁺和CD38⁺造血祖细胞。在产后灌注的第一个24小时中，高浓度的CD34⁺CD38^-造血祖细胞可从已分离的、灌注的胎盘中分离。在灌注约24小时后，高浓度的CD34^-CD38^-细胞可从胎盘中随着前述的细胞一同分离。在另一个实施方案中，祖细胞群体可通过商业服务获得，例如，LifeBank美国(Cedar Knolls，NJ)，ViaCord(Boston MA)，Cord Blood Registry(San Bruno，CA)和Cryocell(Clearwater，FL)。

5.3本发明的化合物

本发明使用的化合物在此作为“免疫调节剂化合物”而提及，且包括外消旋的、立体异构体富集的或纯的免疫调节剂化合物和药物可接受盐、溶剂化物、水化物、立体异构体、包合物和其前药。优选的在本发明使用的化合物为分子量小于约1000g/mol的小的有机分子，且不是蛋白、多肽、寡核苷酸、寡糖或其他大分子。

如此处所用的并且除非另外表明，术语“立体异构体纯的”表示一种化合物，其包含该化合物的一种异构体，且基本上无该化合物的其他异构体。例如，一种具有一个手性中心的化合物的立体异构体纯组分基本上无该化合物的对立的对映体。一种具有两个手性中心的化合物的立体异构体纯组分基本上无该化合物的其它非对映立体异构体。如此处所用的并且除非另外表明，术语“对映体纯的”表示一种具有一个手性中心的化合物的立体异构体纯组分。如此处所用的并且除非另外表明，术语“立体异构体富集的”表示一种包含超过约60％重量的该化合物的一种立体异构体，优选超过约70％重量，更优选超过约80％重量的该化合物的一种立体异构体。如此处所用的，术语“对映体纯的”表示具有一个手性中心的化合物的立体异构体纯合组分。同样地，术语“对映体富集的”表示具有一个手性中心的化合物的立体异构体富集组分。

如本文所用的且除非另外表明，术语“免疫调节剂化合物”或如此处所用的“IMiDs^TM”(Celgene公司)包括小的有机分子，其显著抑制TNF-α、LPS诱导的单核细胞的IL1β和IL12，以及部分抑制IL6的产生。本发明具体的免疫调节剂化合物在下面详述。该化合物可从例如Celgene商业获得，或者按照在此列出的专利或申请中描述的方法制备。

TNF-α是一种由巨噬细胞和单核细胞在急性炎症时产生的炎症细胞因子。在细胞中，TNF-α是形成信号事件不同范围的原因。TNF-α可能在癌症中起病理的作用。未受特殊理论的限制，由本发明的免疫调节剂化合物发挥的一种生物效应为TNF-α合成的减少。本发明的免疫调节剂化合物增强TNF-αmRNA的降解。

进一步地，未受特殊理论的限制，本发明使用的免疫调节剂化合物可能还是T细胞的有效的共刺激物，且以一种剂量依赖的方式显著地增强细胞的增殖。本发明的免疫调节剂化合物还对CD8⁺T细胞亚类比CD4⁺T细胞亚类由更强的共刺激效应。

本发明免疫调节剂化合物具体的实施例，包括但不限于，如那些在美国专利5,929,117中公开的取代的苯乙烯的氰基和羧基衍生物；如在美国专利5,874,448中描述的1-氧代-2-(2，6-二氧代-3-氟哌啶-3-基)异吲哚啉化合物和1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代-3-氟哌啶-3-基)异吲哚啉化合物；如在美国专利5,798,368中描述的四取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉化合物；1-氧代和1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉化合物(例如沙利度胺的4-甲基衍生物和EM-12)，包括但不限于在美国专利5,635,517中公开的那些；和在美国专利5,698,579和5,877,200中公开的一类非多肽环酰胺化合物。本文引用在此提及的每篇专利的全部内容作为参考。本发明的免疫调节剂化合物不包括沙利度胺。

本发明其他具体的免疫调节剂化合物包括但不限于，如在此结合引用的美国专利5,635,517所描述的在苯并环中被氨基或取代的氨基取代的1-氧代和1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉化合物。这些化合物具有结构I：

其中X和Y当中有一个是C＝O，X和Y当中另一个是C＝O或CH₂，R²是氢或低级烷基，特别是甲基。具体的免疫调节剂化合物包括但不限于：

1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-4-氨基异吲哚啉；

1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-氨基异吲哚啉；

1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-6-氨基异吲哚啉；

1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-7-氨基异吲哚啉；

1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-4-氨基异吲哚啉；和

1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-氨基异吲哚啉。

本发明其他具体的免疫调节剂化合物属于一类取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)邻苯二甲酰亚胺化合物和取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚化合物，例如在美国专利6,281,230；6,316,471；6,335,349；和6,476,052，和国际专利申请PCT/US97/13375(国际公开专利WO98/03502)中描述的那些，每篇在此进行引用。这类典型的化合物具有以下通式：

其中R¹是氢或甲基。在一个单独的实施方案中，本发明包括这些化合物的对映体纯的形式(例如旋光纯的(R)或(S)对映体)的用途。

尽管发明的其他具体免疫调节剂化合物属于在美国专利申请10/032,286和09/972,487，和国际专利申请PCT/US01/50401(国际公开专利WO02/059106)中公开的一类异吲哚酰亚胺化合物，本文引用每一篇作为参考。典型的化合物具有以下通式II：

及其可药用盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映体、非对映体、外消旋体和立体异构体混合物，其中：

X和Y当中有一个是C＝O，另一个是CH₂或C＝O；

R¹是H、(C₁-C₈)烷基、(C₃-C₇)环烷基、(C₂-C₈)烯基、(C₂-C₈)炔基、苄基、芳基、(C₀-C₄)烷基-(C₁-C₆)杂环烷基、(C₀-C₄)烷基-(C₂-C₅)杂芳基、C(O)R³、C(S)R³、C(O)OR⁴、(C₁-C₈)烷基-N(R⁶)₂、(C₁-C₈)烷基-OR⁵、(C₁-C₈)烷基-C(O)OR⁵、C(O)NHR³、C(S)NHR³、C(O)NR³R^3’、C(S)NR³R^3’或(C₁-C₈)烷基-O(CO)R⁵；

R²是H、F、苄基、(C₁-C₈)烷基、(C₂-C₈)烯基或(C₂-C₈)炔基；

R³和R^3’独立地为(C₁-C₈)烷基、(C₃-C₇)环烷基、(C₂-C₈)烯基、(C₂-C₈)炔基、苄基、芳基、(C₀-C₄)烷基-(C₁-C₆)杂环烷基、(C₀-C₄)烷基-(C₂-C₅)杂芳基、(C₀-C₈)烷基-N(R⁶)₂、(C₁-C₈)烷基-OR⁵、(C₁-C₈)烷基-C(O)OR⁵、(C₁-C₈)烷基-O(CO)R⁵或C(O)OR⁵；

R⁴是(C₁-C₈)烷基、(C₂-C₈)烯基、(C₂-C₈)炔基、(C₁-C₄)烷基-OR⁵、苄基、芳基、(C₀-C₄)烷基-(C₁-C₆)杂环烷基或(C₀-C₄)烷基-(C₂-C₅)杂芳基；

R⁵是(C₁-C₈)烷基、(C₂-C₈)烯基、(C₂-C₈)炔基、苄基、芳基或(C₂-C₅)杂芳基；

R⁶在每次出现时独立地为H、(C₁-C₈)烷基、(C₂-C₈)烯基、(C₂-C₈)炔基、苄基、芳基、(C₂-C₅)杂芳基或(C₀-C₈)烷基-C(O)O-R⁵，或者R⁶可以连接以形成杂环烷基；

n是0或1；且

*代表手性碳中心。

在具体的式II化合物中，当n是0时，则R¹是(C₃-C₇)环烷基、(C₂-C₈)烯基、(C₂-C₈)炔基、苄基、芳基、(C₀-C₄)烷基-(C₁-C₆)杂环烷基、(C₀-C₄)烷基-(C₂-C₅)杂芳基、C(O)R³、C(O)OR⁴、(C₁-C₈)烷基-N(R⁶)₂、(C₁-C₈)烷基-OR⁵、(C₁-C₈)烷基-C(O)OR⁵、C(S)NHR³或(C₁-C₈)烷基-O(CO)R⁵；

R²是H或(C₁-C₈)烷基；且

R³是(C₁-C₈)烷基、(C₃-C₇)环烷基、(C₂-C₈)烯基、(C₂-C₈)炔基、苄基、芳基、(C₀-C₄)烷基-(C₁-C₆)杂环烷基、(C₀-C₄)烷基-(C₂-C₅)杂芳基、(C₅-C₈)烷基-N(R⁶)₂；(C₀-C₈)烷基-NH-C(O)O-R⁵；(C₁-C₈)烷基-OR⁵、(C₁-C₈)烷基-C(O)OR⁵、(C₁-C₈)烷基-O(CO)R⁵或C(O)OR⁵；且其他变量具有与上相同的定义。

在其它具体的式II化合物中，R²是H或(C₁-C₄)烷基。

在其它具体的式II化合物中，R¹是(C₁-C₈)烷基或苄基。

在其它具体的式II化合物中，R¹是H、(C₁-C₈)烷基、苄基、CH₂OCH₃、CH₂CH₂OCH₃或

在式II化合物的另一个实施方案中，R¹是

其中Q是O或S，且R⁷在每次出现时独立地为H、(C₁-C₈)烷基、苄基、CH₂OCH₃或CH₂CH₂OCH₃。

在其它具体的式II化合物中，R¹是C(O)R³。

在其它具体的式II化合物中，R³是(C₀-C₄)烷基-(C₂-C₅)杂芳基、(C₁-C₈)烷基、芳基或(C₀-C₄)烷基-OR⁵。

在其它具体的式II化合物中，杂芳基是吡啶基、呋喃基或噻吩基。

在其它具体的式II化合物中，R¹是C(O)OR⁴。

在其它具体的式II化合物中，可用(C₁-C₄)烷基、芳基或苄基取代C(O)NHC(O)的H。

本发明的其他具体免疫调节剂化合物属于在美国专利申请09/781,179、国际公开专利WO98/54170和美国专利6,395,754中公开的一类异吲哚酰亚胺化合物，本文引用每一篇作为参考。典型的化合物具有以下通式III：

及其可药用盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映体、非对映体、外消旋体和立体异构体混合物，其中：

X和Y当中有一个是C＝O，且另一个是CH₂或C＝O；

R是H或CH₂OCOR’；

(i)每个R¹、R²、R³或R⁴彼此独立地为卤素、具有1-4个碳原子的烷基或具有1-4个碳原子的烷氧基；或(ii)R¹、R²、R³或R⁴当中有一个是硝基或-NHR⁵，其余R¹、R²、R³或R⁴是氢；

R⁵是氢或具有1-8个碳的烷基；

R⁶是氢、具有1-8个碳原子的烷基、苄基(benzo)、氯或氟；

R’是R⁷-CHR¹⁰-N(R⁸R⁹)；

R⁷是间亚苯基或对亚苯基或-(C_nH_2n)-，其中n具有0-4的值；

每个R⁸和R⁹彼此独立地为氢或具有1-8个碳原子的烷基，或者R⁸和R⁹一起是四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基或-CH₂CH₂[X]X₁CH₂CH₂-，其中[X]X₁是-O-、-S-或-NH-；

R¹⁰是氢、具有1-8个碳原子的烷基或苯基；且

*代表手性碳中心。

本发明的最优选的免疫调节剂化合物是4-(氨基)-2-(2，6-二氧代-(3-哌啶基))异吲哚啉-1，3-二酮和3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮。这些化合物可通过标准合成方法制得(例如参见美国专利5,635,517，在此引用作为参考)。这些化合物可从Celgene Corporation，Warren，NJ获得。4-(氨基)-2-(2，6-二氧代-(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮(ACTIMID^TM)具有下面的化学结构：

3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮(REVIMID^TM)有如下的化学结构：

5.4干细胞培养方法

在本发明的某些实施方案中，将干细胞或是祖细胞，包括但不限于胚胎干细胞、胚胎样干细胞、祖细胞、多能性细胞、全能细胞、多潜能细胞、产后灌注胎盘的内生细胞、脐带血细胞、来源于外周血或成体血的干细胞或祖细胞，或是骨髓细胞暴露于本发明的化合物且诱导分化。这些细胞可以在体外用本领域所公知的方法来增殖，或选择性地，也可在产后灌注的胎盘里增殖。

在某些实施方案中，产后灌注胎盘的内生细胞可以由胎盘或是培养基里收集，且在合适的条件下体外培养足够的时间，以向期望的细胞类型或谱系诱导分化。参见美国申请公开号US20030032179，公布于2003-02-13，题为“产后哺乳动物胎盘的使用与以后的胎盘干细胞”，这里引用其全部内容。

在本发明的另一个实施方案中，干细胞或祖细胞并不来源于产后灌注胎盘，而是相反地，从其他来源分离，例如脐带血、骨髓、外周血或成人血，将其暴露于本发明的化合物并进行诱导分化。在一个优选的实施方案中，分化是在合适的条件下在体外进行的，经过充分的时间，以向期望的细胞谱系或细胞类型诱导分化。本发明的化合物是通过添加，在原位产生，或使干细胞或祖细胞能够接触到本发明的化合物的任何其它方式而在分化介质/培养基中使用。

在另一个实施方案中，培养的干细胞，例如，在体外培养的干细胞或是在产后灌注的胎盘中培养的干细胞都在培养的过程中受刺激而增殖，例如，受到以下物质的刺激：红细胞生成素、细胞因子、淋巴因子、干扰素、集落刺激因子(CSF)、干扰素、化学因子、白介素、重组人血细胞生成因子包括配体、干细胞因子、血小板生成素(Tpo)、白介素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或其他的生长因子等。

培养的细胞在收集和/或分离后，可通过集落形成单位检测试验而得到鉴定，其在本领域是熟知的，如Mesen CuIt^TM培养基(干细胞技术，Inc.，Vancouver British Columbia)。.

体外培养干细胞或是祖细胞的方法在本领域是众所周知的，例如，参见Thomson等，1998，Blood，93(4)：1253-63，和Hatzopoulos等，1998，Development 125：1457-1468(内皮细胞祖细胞)；Slager等，1993，Dev.Genet.14(3)：212-24(神经细胞或肌肉细胞祖细胞)；Genbachev等，1995，Reprod.Toxicol.9(3)：245-55(细胞滋养层如胎盘上皮细胞祖细胞)；Nadkarni等.1984，Tumori70：503-505，Melchner等，1985，Blood 66(6)：1469-1472，国际PCT公布WO 00/27999 2000年5月18日出版，Himori等，1984，Intl.J.Cell Cloning 2：254-262，和Douay等，1995，Bone MarrowTransplantation 15：769-775(造血祖细胞)；Shamblott等.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726-31(精原细胞)；Yan等，2001，Devel.Biol.235：422-432(胚胎滋养层干细胞)。这些方法经过简单的改进可在本发明的方法中使用，只要祖细胞的培养是由培养细胞在本发明的化合物的作用下一步或多步培养起来的，在预定的时间，就可以产生所需的已分化细胞的群体。

5.4.1体外干细胞培养

本发明方法包括干细胞或祖细胞在体外分化的调节，包括将细胞与化合物，如本发明的小的有机化合物在体外一起温育，诱导它们分化成特定的期望的细胞谱系，然后将分化的细胞直接移植入受治疗者中。在一个优选的实施方案中，将细胞诱导分化为造血细胞谱系。

在某些实施方案中，将培养的目的干细胞在体外暴露于0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml或10μg/ml浓度的本发明的化合物中。优选地，目的细胞暴露于浓度大约为0.005pg/ml到5mg/ml的沙利度胺，0.005μg/ml到5mg/ml的Actimid^TM(Celgene Corp.，Warren，NJ)，0.005μg/ml到大约5mg/mlRevimid(Celgene Corp.，Warren，NJ)，0.005mg/ml到5mg/ml的Actimid^TM(Celgene Corp.，Warren，NJ)或是0.005μg/ml到5mg/ml的Revimid^TM(Celgene Corp.，Warren，NJ)中(还参见5.7节，“药物组合物”)。

在某些实施方案中，通过将一些营养物质、激素、维生素、生长因子、或其组合引入到灌注溶液中而将胚胎样干细胞在胎盘生物反应器里诱导增殖。血清和其他的生长因子也可加到增殖灌注溶液或培养基里。生长因子通常是蛋白质，包括但不限于：细胞因子、淋巴因子、干扰素、集落刺激因子(CSF)、干扰素、化学因子和白介素。也可以使用其他生长因子，包括重组人造血生长因子，其中有配体、干细胞因子、血小板生成素(Tpo)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白血病抑制因子、基底成纤维细胞生长因子、胎盘来源的生长因子和表皮生长因子。

加入灌注溶液中的生长因子可刺激未分化的胚胎样干细胞、定向祖细胞或已分化的细胞(例如分化的造血细胞)的增殖。生长因子可刺激生物物质和生物学活性的分子的产生，包括但不限于免疫球蛋白、激素、酶或前面已描述的一些生长因子。

培养的胎盘应该定期“补给”以移除已消耗的培养基，减少释放的细胞，补充新鲜培养基。培养胎盘应该在无菌的条件下存放以减少污染的可能性，且在间歇的、定期的增压条件下维持生长以创造这样的一个环境，其维持向胎盘细胞的充分的营养补给。应该认识到，胎盘的灌注和培养都可实现自动化和计算机化以获取高的效率和容量。

5.4.2体外祖细胞培养

本发明方法也包括祖细胞，尤其是CD34⁺和CD133⁺祖细胞发育的调节和调控。在本发明的一个实施方案中，将祖细胞诱导分化为一种造血细胞谱系。在一个具体的实施方案中，该细胞谱系是粒细胞谱系。在另一个实施方案中，CD133⁺细胞诱导分化成内皮细胞，脑细胞，肾细胞，肝细胞或肠道细胞。

祖细胞可通过上面提到的标准方法培养。另外，祖细胞的培养可能要在培养的多个时间或是设定的时间来处理细胞，以使祖细胞分化成不同的细胞谱系。

因此，在培养CD34⁺或CD133⁺祖细胞的一个方法中，细胞在0天时植入含干细胞因子(SCF)、Flt-3L、GM-CSF和TINT-α的培养基中，培养6天。在第六天的时候，细胞重新植入到含GM-CSF和TNF-α的培养基中，继续持续培养六天。该方法能够产生树突细胞。在该方法的变化方法中，细胞一开始植入到含GM-CSF和IL-4的培养基中，然后在第六天的时候换成单核细胞培养条件的培养基(参见Steinman等，国际公布号WO 97/29182)。为了产生CD34⁺CD38^-CD33⁺或CD34⁺CD38^-CD33^-祖细胞群，将祖细胞与本发明的化合物在第0天接触本发明化合物，并且在第六天收集CD34⁺CD38^-CD33⁺或CD34⁺CD38^-CD33^-祖细胞。

发明者已经发现添加本发明的化合物尤其是Actimid^TM或Revimid^TM的时间对于CD34⁺细胞向特定细胞谱系的分化途径，以及CD133⁺细胞的分化有着十分重要的影响。CD34⁺祖细胞，在标准条件下培养，是沿着骨髓发育的途径或谱系的，也就是，在开始植入后(也就是开始培养后)的12天内成为树突细胞。然而，在开始培养第一个六天内，在几个特定的时间中的一个时间添加本发明的化合物，基本上改变了该途径。例如，如果CD34⁺细胞尤其是来自骨髓的CD34⁺细胞在培养的第一天与本发明的化合物，尤其是Actimid^TM或Revimid^TM接触，那么沿着骨髓细胞谱系分化的通路就会被抑制，如相对于对照未暴露于本发明的化合物(也就是暴露于DMSO)在培养第六天CD34⁺CD38^-细胞数量的增加和CD1a⁺CD14^-细胞数量的减少所证明的。而且，与本发明的化合物接触可导致表达表面标记的细胞的发育受到抑制，表面标记是由树突细胞系，如CD80和CD86表达的。在培养的第一天或培养开始后三天内的任何时刻，让细胞与本发明的化合物接触，都会导致CD34⁺祖细胞的这种发育调节。如果在介于第0天和第6天之间给予本发明的化合物的多次服药，例如，在第0和第2天给药，第0和第4天给药，第3和第6天给药或第2、第4、第6天给药，会加剧CD34⁺细胞数量的增加。

在本发明一个尤其有用的方面，在CD34⁺祖细胞培养的第一天添加本发明的化合物，12天持续暴露，会导致独特的祖细胞的发育，这种祖细胞表达独特的重组细胞表面标记：CD34⁺CD38^-CD33⁺或CD34⁺CD38^-CD33^-。CD34⁺CD38^-CD33⁺或CD34⁺CD38^-CD33^-细胞群代表了分化的一个中间状态。这个细胞群作为祖细胞的可增殖群非常有用，它们可以很轻易的植入到需要快速增殖的造血细胞谱系的患者身上，例如粒细胞。在另一个实施方案中，CD34⁺可以在增殖期内(大约6天)在标准培养基(也就是没有加Actimid^TM、Revimid^TM或其他类似物)中植入并培养，然后将其转到包含Actimid^TM或类似物的相同或相似的培养基中，一直持续培养到第12天。在这个实施方案中，正在分化的细胞一般表现出CD80、CD86和CD14表达量的减少，但导致CD1a⁺细胞比对照却要持续增加。这种分化中的细胞不会被阻碍分化成树突细胞。在另一个实施方案中，CD34⁺细胞在增殖期(植入后1-6天)至少持续三天用ActimidTM、RevimidTM或本发明的其他化合物处理。仍在另一个实施方案中，CD34⁺或CD133⁺祖细胞在植入后的第一个六天内用两倍或更多倍数的Actimid^TM、Revimid^TM或本发明的其他化合物处理。该多种处理方法可增加CD34⁺和CD133⁺细胞群的增殖。用Actimid^TM或本发明的其他化合物多种方法处理，会引起CD34⁺祖细胞分化的转变，不分化为CD1c⁺CD15^-细胞谱系而是分化为CD1c^-CD15⁺细胞谱系，也就是不分化为骨髓树突细胞谱系，而变成粒细胞谱系(图6B)。

从培养的第0天处理祖细胞，尤其是在第0天和第六天中采用多次剂量，也可导致CD133⁺祖细胞数量的增加，尤其是CD34⁺CD133⁺祖细胞群的增加。CD 133是一个造血的标记，可以作为CD34分离物的替换物，因为CD133⁺细胞能够以CD34⁺子集同样的方式扩增，同时保留了多细胞谱系的能力(参见Kobariv等，J.Hematother.Stem Cell Res.10(2)：273-81(2001))。已经报道CD133⁺在人胎儿脑组织来源的CD34^-细胞中出现，并当其被注射入新生小鼠中时显示出潜在的移植、增殖、迁移和神经分化(参见Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.19：97(26)：14720-5(2000))。CD133⁺造血干细胞已显示富于祖细胞活性，具有由增强的集落形成能力和在NOD-SCID小鼠身上的更高的移植能力。

尽管以上，如果增殖中的CD34⁺祖细胞在培养三天后(也就是在开始培养的第3-6天中的任何时间)与本发明的化合物接触，已经开始表达细胞表面标记CD1a的增殖中的祖细胞相对用DMSO处理的对照而言能够持续增加表达这种标记。值得一提的是这种持续的增加并不会引起细胞毒性。换句话说，用Actimid^TM处理不会引起其他细胞群的凋亡。纯粹的效果就是已有免疫能力的保持和新的免疫能力的发展。

因此，在本发明方法的一个实施方案中，CD34⁺细胞分化成树突细胞是受调控的(也就是受抑制)，这是通过CD34⁺祖细胞在培养的第0天(也就是培养的第一天)用本发明的化合物处理来实现的。在另一个实施方案中，CD34⁺细胞分化成粒细胞通过CD34⁺祖细胞在培养的第0天(也就是培养的第一天)与本发明的化合物接触而增强。在另一个实施方案中，CD34⁺细胞分化成CD34⁺CD38^-CD33⁺或CD34⁺CD38^-CD33^-祖细胞群通过祖细胞在培养的第一个三天内与本发明的化合物接触而增强。在另一个实施方案中，CD34⁺CD133⁺群通过在培养第0天到第6天的过程中祖细胞与多次剂量的本发明的化合物接触而增强或增加。在另一个实施方案中，CD1a⁺细胞群通过在培养第六天的时候CD34⁺祖细胞与本发明的化合物接触而增强或增加，其中所说的CD34⁺细胞分化成呈现CD1a表面标记的细胞，其中所说的培养包括不用上述化合物处理最长达六天。

在上面的实施方案中，该Actimid^TM、Revimid^TM或相关化合物在体内对祖细胞的给药的不同是可以理解的，例如，在一个已移植或嫁接该细胞的患者中，就象在体外施用于祖细胞一样。

本发明的方法包括干细胞或祖细胞在体外分化的调节，包括在体外细胞与诱导细胞分化成特定的细胞谱系的化合物，如本发明的小有机分子一起温育，然后将分化的细胞直接移植入受治疗者。在一个优选的实施方案中，细胞被诱导分化成一种造血细胞谱系。在一个可选择的实施方案中，将CD133⁺细胞诱导分化成内皮细胞、脑细胞、肾细胞、肝细胞或肠道细胞。

值得一提的是，在此所述的方法在与自哺乳动物最好是人的CD133⁺祖细胞一起使用而受到关注，但在与鸟类或爬行类祖细胞一起使用也受到关注。但是，本发明的化合物也存在不同的效果，这依赖于祖细胞来源的物种。在培养方法方面存在着一些不同，尤其是关于所用的化合物的浓度，也受到关注。例如，鼠来源的祖细胞对本发明的化合物，例如Actimid^TM不怎么敏感，要求更高的浓度才能达到人源祖细胞在1μM下的效果。本领域技术人员可以理解这种优化是常规性的。

5.5干细胞和祖细胞的遗传工程

在本发明另一个实施方案中，使用，例如，病毒载体如腺病毒或反转录病毒载体，或通过使用机械方法如脂质体或化学介导的DNA摄取，将按照本发明的方法分化的干细胞或祖细胞在与本发明的化合物接触前或后进行了遗传工程化。在具体的实施方案中，CD34⁺祖细胞经遗传工程化，然后用本发明的化合物处理；在更多的具体实施方案中，所述化合物为Actimid^TM，Revimid^TM或其类似物。在另一个实施方案中，所述细胞用本发明的化合物处理，然后进行遗传工程化。

通过本领域公知的一些方法，例如转染、转化、电穿孔、感染、显微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质体、LIPOFECTIN^TM、溶酶体融合、合成的阳离子脂质、基因枪的使用或DNA载体转运子，可以将含有转基因的载体导入到目的细胞中，这样将转基因传递到子细胞中，如由胚胎样干细胞分裂的子代胚胎样干细胞或祖细胞。用于转化或转染哺乳动物细胞的不同方法，参见Keown等，1990，MethodsEnzymol.185：527-37；Sambrook等，2001，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第三版，冷泉港实验室出版，纽约。

优选地，利用任何技术来将转基因导入，只要不破坏细胞的核膜或其他已存在的细胞或遗传结构。在某些实施方案中，可以通过微注射将转基因插入到核内遗传物质中。细胞和细胞结构的微注射是本领域公知且熟练的。

对于稳定转染培养的哺乳动物细胞，如培养在胎盘中的细胞，只有一小部分细胞会将外源DNA整合到其基因组上。整合的效率依赖于载体和所用的转染技术。为鉴定和筛选出整合子，一般会将带有筛选标记(例如，抗生素抗性)的基因连同目的基因的序列一起转入胚胎样干细胞。优选的筛选标记包括那些具有抗药物抗性的，如G418、潮霉素和氨甲蝶呤。稳定转染了外源核酸的细胞能够通过药物筛选来鉴定(也就是整合有选择性标记基因的细胞能够存活，而其他细胞都死亡)。这种方法在重组哺乳动物细胞(例如胚胎样干细胞)导入或移植到主体或患者之前的同源重组时特别有用。

许多筛选系统可以用来筛选转化的宿主干细胞，如胚胎样干细胞或祖细胞，就象CD34⁺或CD133⁺祖细胞。尤其是，该载体可包含某些可观察的或可选择的标记。其他的选择方法包括但不限于筛选另一个标记如：单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977，Cell，11：223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska和Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci USA 48：2026)、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等，1980，Cell 22：817)，这些基因可以分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中使用。同样，抗代谢物抗性也能用作筛选以下基因的基础：dhfr，赋予氨甲蝶呤抗性(Wigler等，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：3567；O′Hare等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527)；gpt，赋予霉吩酸抗性(Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072)；neo，赋予氨基糖苷G-418抗性(Colberre-Garapin等，1981，J.Mol.Biol.150：1)；和hygro，赋予潮霉素抗性(Santerre等，1984，Gene 30：147)。

转基因可以整合到目的细胞的基因组上，优选通过随机整合。在其他的实施方案中，转基因可通过直接方法整合，如通过直接同源重组(也就是在目的细胞内“敲入”或”敲除”目的基因)，Chappel，美国.专利号5,272,071；PCT公开号WO91/06667，公布于1991-05-16；美国专利5,464,764，Capecchi等，公开于1995-11-07；美国专利5,627,059，Capecchi等，公开于1997-05-06；美国专利5,487,992，Capecchiet等，公开于1996-01-30)。

通过同源重组修饰靶基因将其转入细胞的方法在本领域是众所周知的。该构建体将包括至少经过遗传修饰的目的基因的一部分，并将包括与靶位点同源的区域，也就是在宿主基因组上内源性的目的基因的拷贝。随机整合的DNA构建体，相对于那些经同源重组的而言不必包括同源区以介导重组。标记可以包括在靶构建体或随机构建体中，以形成转基因插入的正筛选或是负筛选。

为产生同源重组的细胞，例如同源重组的胚胎样干细胞、内源的胎盘细胞或在胎盘内培养的外源细胞，制备一种同源重组的载体，其中目的基因位于靶细胞基因组内源的基因序列的5′和3′端，以使由载体携带的目的基因与靶细胞基因组内源基因之间发生同源重组。两侧其余的核酸要足够长，以使得与靶细胞基因组上的内源基因成功的同源重组。一般地，载体上两侧的DNA(在5′和3′端)有几千个碱基对。构建同源重组载体的以及由重组干细胞得到同源重组动物的方法在本领域是公知的。(参见，例如Thomas和Capecchi，1987，Cell 51：03；Bradley，1991，Curr.Opin.Bio/Technol.2：823-29；PCT公布号WO 90/11354，WO 91/01140，和WO 93/04169)。

在一个具体的实施方案中，利用Bonadio等的方法(美国专利号5,942,496，题为多基因转入骨细胞的方法和化合物，公开于1999-08-24；PCT WO95/22611，题为刺激骨细胞的方法和化合物，公开于1995-08-24)将核酸导入到目的细胞中，如干细胞，祖细胞或在胎盘中培养的外源细胞，例如骨祖细胞。

5.6.用于分化的受调整的干细胞和祖细胞的用途

5.6.1.一般用途

本发明的干细胞、CD34⁺和CD 133⁺祖细胞可进行诱导分化以用于移植和先体外后体内治疗方案中。在一个实施方案中，干细胞群分化成特定的细胞类型，且经遗传工程改造提供基因治疗产物。在另一个实施方案中，祖细胞群增殖为早期祖细胞，且经基因工程改造以提供基因治疗产物。在另一个实施方案中，祖细胞群分化成特定的细胞类型如粒细胞，且经基因工程改造以提供基因治疗产物。

本发明的化合物也已在临床上得到应用，目前移植已成为恢复骨髓白血细胞产生的一个基本目标，如由疾病和/或临床骨髓切除引起的嗜中性白血球减少症和白血球减少症的反转。这些化合物也用在早期祖细胞或粒细胞产生的恢复上，其由疾病，各种已知的治疗副作用或骨髓切除而引起。本发明的化合物在一些案例中也得到应用，其中优选对红血细胞生成的抑制，而不会抑制骨髓产生。

在某些实施方案中，用本发明的化合物处理的干细胞和未处理的细胞，如源于脐带血或外周血的干细胞共同给药于其所需的患者。在其他方案中，已用本发明的化合物处理的CD34⁺或CD133⁺细胞与未处理的细胞，如源于脐带血或外周血的干细胞共同给药于其所需的患者。在一个方案中，从培养的第一天用本发明的化合物处理的CD34⁺祖细胞与未处理的细胞共同给药于其所需的患者。在一个更具体的方案中，转移的祖细胞是CD34⁺CD38^-CD33⁺或CD34⁺CD38^-CD33^-祖细胞。

干细胞，例如胚胎样干细胞或造血干细胞，或祖细胞，其分化已按照本发明的方法受到调节，可制成可注射的制剂(参见PCT WO96/39101，此处引用其全部内容作为参考)。在另一个可选方案中，细胞和组织，其分化已按照本发明的方法受到调节，可如美国专利号5,709,854；5,516,532；或5,654,381描述的，用聚合的交联的水凝胶制成制剂，这里引用每一篇的全部内容作为参考。

胚胎样干细胞可用于替代在一般使用祖细胞的治疗或研究方法中的特定祖细胞类群(例如软骨细胞、肝细胞、造血细胞、胰腺实质细胞、成神经细胞、肌肉祖细胞等)。

5.6.2.组织替换或增加

干细胞，尤其是本发明的胚胎样干细胞，和祖细胞，其分化已按照本发明的方法受到调节，可以用于很多种治疗方法，所述方法指向所需细胞群体的移植或融合，如干细胞或祖细胞群。干细胞或祖细胞可用来替换或增加现有的组织、导入新的或替换的组织、或连接生物学的组织或结构。

在本发明的一个优选的实施方案中，干细胞，如从胎盘来的胚胎样干细胞，或祖细胞如造血祖细胞，其分化已按照本发明的方法受到调节，可自体同源或异源使用，包括匹配或不匹配的HLA类型，造血移植。与胚胎样干细胞作为异源造血移植的使用情况一致，它能更好地治疗宿主，减少对供体细胞的免疫排斥，正如美国专利号5,800,539，1998年9月1日公布；美国专利号5,806,529，1998年9月15日公布中所描述，这里引用每一篇作为参考。

例如，胚胎样干细胞，其分化已按照本发明的方法受到调控，可用于治疗的移植方案中，例如增加或替换肝脏、胰腺、肾脏、肺、神经系统、肌肉系统、骨骼、骨髓、胸腺、脾、粘膜组织、性腺或头发的干细胞或祖细胞。同样地，造血祖细胞，其分化已按照本发明的方法受到调控，可用于代替骨髓或内皮祖细胞。

干细胞，例如胚胎样干细胞，其分化已按照本发明的方法受到调控，可用于软骨、腱或韧带的增加，修复或替换。例如，在某个实施方案中，假器官(例如假臀)是在表面覆盖一层由本发明方法培养的胚胎样干细胞长成的替换软骨组织结构。在其他的实施方案中，关节(例如膝盖)可由胚胎样干细胞长成的软骨组织结构重新构成。软骨组织结构也可应用在不同类型关节的重建手术中(至于方案，参见如Resnick，D.，和Niwayama，G.，eels.，1988，骨骼和关节病症诊断，第二版，W.B.Saunders Co.)。

按照本发明方法处理的干细胞和祖细胞能够用于修复由疾病导致的组织和器官损伤。在该实施方案中，患者可通过给药以胚胎样干细胞而再生或修复由疾病所造成的组织或器官损伤，例如增强化疗或放疗后免疫系统的功能，修复心肌梗塞后的心脏组织。按照该方法并用本发明的免疫调节化合物处理的干细胞或祖细胞，或与本发明的免疫调节化合物一起给药的干细胞或祖细胞，可以植入需要的个体中，以修复或取代肝、胰腺或心脏组织。

按照本发明方法处理的干细胞和祖细胞也可在骨髓移植中用于增加或取代骨髓细胞。人自体同源和异源骨髓移植目前正应用于治疗如白血病、淋巴瘤和其他一些危害生命的病症疾病中。然而，这些方法的缺点在于需要大量的供体骨髓，以确保有足够的细胞用来移植。

按照本发明的方法收集的胚胎样干细胞能够提供干细胞和祖细胞，可减少大量骨髓捐赠的必要。当然，也可以按照本发明的方法，获取少量的捐赠骨髓，在注入或移植到受体之前，在胎盘中培养增殖，得到大量的干细胞和祖细胞，。

由本方法所获得的大量的胚胎样干细胞和/或祖细胞，在某些实施方案中，可减少大量骨髓捐赠的必要性。在骨髓移植中，大约需每千克患者体重1×10⁸到2×10⁸骨髓单核细胞用来移植(也就是，对于重70公斤的捐赠者来说需要大约70毫升的骨髓)。要获得70毫升的骨髓需要高密度的捐赠物，且在捐赠过程中有血的大量流失。在具体的实施方案中，由少量骨髓捐赠获得的细胞(例如7-10毫升)在注入到受体前，通过增殖可以得到扩大，例如在胎盘生物反应器中。干细胞和祖细胞特别是CD34⁺或CD133⁺祖细胞，其分化已按照本发明的方法受到调节，也能提供干细胞和/或祖细胞，以消除大量骨髓捐赠的必要性。

由胎盘分离的胚胎样干细胞也可用在具体的实施方案中，用同源或异源酶取代疗法治疗某些特殊疾病，包括但不限于溶酶体贮积症，如泰-萨二氏病(Tay-Sachs)、尼曼氏病(Niemarm-Pick)、法布莱氏病(Fabry’s)、高歇氏病(Gaucher’s)、亨特氏(Hunter’s)综合症、何勒氏(Hurler’s)综合症，以及其他的神经节糖苷沉积症、粘多糖贮积病和糖原贮积病。

在其他的实施方案中，细胞可在基因治疗中使用，作为同源或异源转基因携带者来纠正一些先天性代谢缺陷，如脑白质肾上腺萎缩症、胆囊纤维化、糖原贮积病、甲状腺机能减退、镰刀型细胞贫血症、佩尔森(Pearson)综合症、旁帕氏(Pompe’s)病、苯丙酮酸尿症(PKU)、泰-萨二氏病、卟啉症、槭糖尿病、高胱氨酸尿症、粘多糖贮积病、肉芽肿性疾病和酪氨酸血症，或是治疗癌症、肿瘤或其它病症。

在其他的实施方案中，细胞可以在同源或异源组织再生或取代疗法中使用，包括但不限于角膜上皮缺陷、软骨修复、面部去疤、粘膜、鼓膜、肠内层、神经组织(例如视网膜、基底膜处的听觉神经元、嗅觉上皮的嗅觉神经元)，也可用在皮肤外伤的烧伤和创伤修复中，头皮(头发)移植中，或其他受损、疾病的器官、组织的重建中。

而且，少量的干细胞和祖细胞是正常地在血流中循环的。在另外的实施方案中，外源性的干细胞或祖细胞通过分离性输血收集，在这个程序中，血液被抽出，一种或多种成分被选择性地分离，剩余的血液仍被重新注入供体体内。通过分离性输血获得的外源细胞用本发明方法进行扩增，可以完全排除捐赠骨髓的必要性。

在另一个实施方案中，以本发明方法扩增的造血祖细胞用于化疗后的补充疗法中。大部分化疗剂是靶向和破坏癌细胞的，可杀死所有增殖中的细胞，也就是处于细胞分裂中的细胞。由于骨髓是体内增殖最活跃的组织之一，造血干细胞就经常受到化疗剂的损伤和破坏，血细胞的产生因此而减少或停止。化疗需阶段性地终止以使患者的造血系统在再次化疗前能补给血细胞。这可能需要一个月或是更长的时间来使以前静止的干细胞增殖，使白细胞数达到再次化疗可接受的水平(当再次化疗时，骨髓细胞已受损伤)。

当血细胞在化疗间隔期再生时，当然肿瘤也有时间长大，且由于自然选择而对化疗药物变得更具抗性。因此，化疗的时间越长，间隔时间越短，杀死肿瘤的几率就越大。为缩短化疗的间隔期，按照本发明方法分化的胚胎样干细胞或祖细胞可注入到患者体内。这种疗法可减少患者处于低白细胞数量的时间，可因此更早的从化疗中恢复。

在另一个实施方案中，人胎盘干细胞可用来治疗或预防遗传疾病，如慢性肉芽肿疾病。

5.6.3.炎症改善

干细胞和祖细胞，其分化已按照本发明的方法受到调节，可用作普通的抗炎症制剂。发明者发现，从例如脐带血来源的干细胞和祖细胞当移植到患者体内时，可减少或完全消除炎症反应。因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括将其分化已受到本发明的一种或多种化合物调节的干细胞或祖细胞给药于一个产生炎症反应的患者，或是可能会发生炎症反应的患者中。在具体的实施方案中，干细胞是胚胎样干细胞，祖细胞是造血干细胞，特别是CD34⁺或CD133⁺祖细胞。

发明者还发现用本发明的化合物，也就是IMiDs治疗个体，刺激了那些调节、改善或减少炎症反应的细胞的发育与分化。因此，本发明的另一个实施方案包含治疗产生炎症反应的患者，或是可能会发生炎症反应的患者的方法，包括将一种或多种本发明的化合物的有效剂量给药于所述个体。在另一个实施方案中，该方法包括在给药于所述个体前用本发明的化合物接触干细胞或是祖细胞，然后将所述细胞的有效治疗剂量给药于所述个体。仍在另一个实施方案中，如此处理的细胞可以和一种或多种本发明的化合物的有效治疗剂量同时给药于所述个体。

在其他的实施方案中，将其他化合物与本发明的化合物和/或细胞结合给药也可减少炎症。例如，这些附加的化合物包括类固醇，如强的松，或其他的非类固醇抗炎症剂，如cox-1/cox-2抑制乙酰水杨酸(阿司匹林)、异丁苯丙酸、醋氨酚、cox-1特异的抑制剂，或任何这些化合物的衍生物。这些附加的抗炎症剂可通过标准的方法传递，如静脉、局部、皮内或通过吸入法，也可同时与本发明的化合物和/或细胞传递，或是在不同的时间。

以上的方法可以用来治疗那些与炎症相关、由其引起或导致的一些疾病。例如，该方法可用来治疗由外伤如意外损伤所导致的炎症，该法也可用于治疗与外科手术相关的尤其是血管相关的手术如正常组织移植、人工血管移植、心瓣膜或血管成形术所引起的炎症或损伤。该方法也可用于预防心瓣手术后的狭窄或再狭窄。该方法也可用于治疗任何疾病所导致的炎症，包括但不仅限于心脏疾病、动脉硬化症、敏感或超敏感症、免疫病症、自主免疫病症如关节炎，或由感染所引起的炎症。除了治疗已存在的炎症，本发明的细胞和/或化合物也可预防性地给药于个体，以减少炎症的发生。其作为手术前治疗的形式尤其有用，由此可减少手术后的炎症反应，提高患者成功恢复的机会，缩短住院时间和伤病期。

以上抗炎症治疗的效果的监测可由很多已知的方法来完成，如视觉检查MRI或CAT扫描，系统或局部温度测定等。由于一种名为C反应蛋白的蛋白质是炎症的一个标记，以上治疗方法的有效性就可以通过个体的C反应蛋白的量的减少来检测，特别是在炎症发生之前的部分。

5.6.4.树突细胞和粒细胞群体的产生

本发明的化合物可以进行特异性地给药，以调节干细胞和/或祖细胞相对于树突细胞的发育途径而沿着粒细胞的发育途径的分化。类似地，本发明的细胞也可在体内或体外调节以产生增殖的树突细胞或粒细胞群。

树突细胞能够用作基于免疫的治疗的药剂。例如，可将树突细胞与T淋巴细胞和抗原蛋白在体外共同培养，会引起活体外抗原特异的T细胞的激活。激活的T细胞随即进行自体给药以在体内引起抗原特异的免疫应答(WO97/24438)。在另一个实施例中，T细胞能够在体外被激活，通过T淋巴细胞与从重组构建体直接表达抗原蛋白的树突细胞相接触。激活的T细胞能够用作自体输注(WO97/29183)。

用特异性的多肽或蛋白质片段激活的T细胞成为抗蛋白、细胞或生物的免疫剂，而它们是特异的肽或蛋白的来源。例如，树突细胞可能具有肿瘤特异性的肽。源于树突细胞的体外T细胞激活的具体的应用以治疗前列腺癌在美国专利号5,788,963中被公开并进行了权利要求。Mayordomo等显示源自骨髓的树突细胞与合成的肿瘤肽一起进行脉冲诱发保护性和治疗性的抗肿瘤免疫性(Nature Medicine1：1297-1302(1995)；J.Exp.Med.，183：1357-1365(1996))。美国专利号5,698,679描述了在体内将抗原性肽传递给包括树突细胞的靶向抗原呈现细胞(APCs)的免疫球蛋白融合蛋白。这种相同的方法可以以源自病毒、细胞或寄生虫的肽或抗原使用以产生病毒的、细菌的或寄生虫的疫苗。

树突细胞也是对于在各种免疫介导疾病的治疗中的治疗性介入的靶。例如，树突细胞已被暗示为在艾滋病的发病机制和病理生理学中的一种重要因子(例如，作为HIV病毒的保有者)。参见Zoeteweij等，J.Biomed.Sci.5(4)：253-259(1998)；Grouard等，Curr.Opin.Immunol.9(4)：563-567(1997)；Weissman等，Clin.Microbiol.Rev.10(2)：358-367(1997)。在美国专利号5,627,025中描述了筛选消除树突细胞的HIV感染的候选物的体外方法。在另一个实施例中，可以使用树突细胞诱导T细胞对供体组织或器官在受体中的无反应性(参见美国专利号6,375,950)。

粒细胞可以在感染的治疗或预防中用于粒细胞输血，例如细菌性新生败血症、在癌症患者中的中性粒细胞相关的感染以及在接受骨髓移殖的患者中的潜在感染。粒细胞也能够用于过敏症的预防和治疗。例如，与IgE介导的炎症有关的粒细胞(即，以IgE抗体包被的粒细胞，其中一些对于过敏原具有特异性)可以进行灭活并用于缓和已经建立起来的针对过敏原的免疫反应的症状(参见美国专利号6,383,489)。

因而，在本发明的一个实施方案中，将在个体中的粒细胞种群通过一种方法由本发明的祖细胞进行增殖，该方法包括对所述个体给药治疗上有效量的本发明的化合物，其中所述量足以诱导所述个体由内源性CD34⁺细胞产生各种粒细胞。在另一个实施方案中，将粒细胞种群在个体中通过一种方法进行增殖，该方法包括对所述个体给药CD34⁺或CD133⁺祖细胞，其中所述细胞已与本发明的化合物接触至少3天，并且对所述个体给药所述细胞种群。在另一个实施例中，将粒细胞种群通过一种方法在个体内扩增，该方法包括以CD34⁺或CD133⁺祖细胞种群和本发明的化合物一起给药于上述个体，其中所述本发明的化合物的剂量足以引起各种所述细胞种群分化成粒细胞。在以上实施方案中的一个具体方案中，所述CD34⁺祖细胞为CD34⁺CD38^-CD33⁺细胞。

5.6.5.其他疾病和病症的治疗

本发明已分化的干细胞和祖细胞，或本发明的化合物，也可单独或联合应用到治疗或预防各种其他疾病中。在某些实施方案中，例如，疾病或病症包括但不限于血管或心血管疾病、动脉硬化症、糖尿病、再生障碍性贫血、脊髓发育不良、心肌梗塞、癫痫症、多发性硬化、中风、血压过低、心博停止、肌肉萎缩、炎症、与年龄相关的认知功能的丧失、放射性损伤，大脑性麻痹、神经退行性病变、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、莱福氏病、AIDS痴呆、记忆丧失、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、肾脏局部缺血、脑或脊索损伤、心肺旁路、青光眼、视网膜局部缺血、视网膜损伤、溶酶体贮积病如泰-萨二氏病、尼-皮二氏病、法布莱氏病、高歇氏病、亨特氏综合症、何勒氏综合症，就象其他的神经节糖苷沉积症、粘多糖贮积病，糖原贮积病、先天性代谢缺陷如脑白质肾上腺萎缩症、胆囊纤维化、糖原贮积病、甲状腺机能减退、镰刀型细胞贫血症、佩尔森综合症、旁帕氏病、苯丙酮酸尿症(PKU)、卟啉症、槭糖尿病、高胱氨酸尿症、粘多糖贮积病、慢性肉芽肿、酪氨酸血症、泰-萨二氏病、癌症、肿瘤或其他病理的或成瘤的状况。

在其他实施方案中，本发明的细胞(例如，暴露于本发明的化合物的细胞)可用来治疗任何由外伤特别是炎症的外伤所引起的创伤。这些与创伤相关的疾病包括中枢神经系统(CNS)损伤，包括大脑、脊索的损伤、CNS周围组织到外周神经系统(PNS)的损伤；或者是身体其余部分的损伤。这种创伤可能由意外引起，或可能是医疗方法如外科手术或血管成形术的正常的与不正常的结果。这种创伤可能与血管的破裂或闭塞有关，如中风或静脉炎。在具体的实施方案中，细胞可用于自体或异源组织再生或取代治疗或方案中，包括但不限于角膜上皮缺陷、软骨修复、面部去疤、粘膜、鼓膜、肠内层、神经组织(例如视网膜，基底膜处的听觉神经元，嗅觉上皮的嗅觉神经元)的治疗，也可用在皮肤外伤的烧伤和创伤修复中，或其他受损、病变的器官、组织的重建中。

在一个具体的实施方案中，疾病或病症为再生障碍性贫血、脊髓发育不良、白血病、骨髓病症或造血疾病或病症。在另一个具体实施方案中，受治疗者是人。

5.7.药物组合物

本发明包括药物组合物，其包括一剂和/或多剂本发明的一种或多种化合物，其中所述的一剂或多剂对于单个或多个给药方式是有效的，其在将调整过的或未调整的人CD34⁺或CD133⁺祖细胞或干细胞移植到个体中之前或之后，对抑制、调节和/或调控这些干细胞和/或祖细胞分化为特定的细胞类型，例如，造血谱系细胞，特别是骨髓谱系细胞能起到很好的效果。在此，就如本发明上下文的其他地方，“个体”表示药物或细胞给药的任何个体，例如，哺乳动物，鸟类或爬行动物。

因此，在具体的实施方案中，所述的给药于个体的本发明的化合物的一倍或多倍剂量，调节内源CD34⁺祖细胞分化成树突细胞。在更具体的方案中，一倍或多倍剂量提高了所述个体中粒细胞的数量，该个体用所述的一倍或多倍剂量给药。在另一个更具体的方案中，一倍或多倍剂量提高了哺乳动物中CD34⁺CD38^-CD33⁺或CD34⁺CD38^-CD33^-祖细胞的数量，该哺乳动物用所述的一倍或多倍剂量给药。

在其他的实施方案中，目的CD34⁺或CD133⁺祖细胞或干细胞移植入有此需要的人受治疗者或患者体内。移植后，本发明的化合物给药于人受治疗者或患者，以在体内调节植入的目的细胞的分化。在具体的实施方案中，这些细胞在体内分化成粒细胞。还有的实施方案，人受治疗者或患者体内的目的祖细胞或干细胞的分化在原位通过本发明的化合物的给药而受到调节。

仍然在其他的实施方案中，本发明提供药物组合物，其包括分离的脐带血干细胞或祖细胞群，它们与按照本发明的方法暴露于抑制TNF-α活性的化合物而已经分化的造血祖细胞一起得到扩增。在另一个实施方案中，本发明提供包含脐带血的药物组合物，所述脐带血被补充以本发明的化合物处理的干细胞或祖细胞；在一个具体的方案中，所述干细胞或祖细胞已由所述化合物分化。

在另一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包括一种或多种本发明的免疫调节剂化合物以及本发明的干细胞和/或祖细胞。该组合物可以在给药前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天制备，以调节干细胞和/或祖细胞沿着不同的发育/分化途径的分化。

仍然在另一个实施方案中，本发明药物组合物还包括干细胞或祖细胞自身，其中所述细胞已按照本文公开的方法得到分化。因此，本发明提供一个包括多个干细胞和/或祖细胞的药物组合物，其中所述的多个干细胞或祖细胞已与一种或多种本发明的免疫调节剂化合物接触，其浓度和持续时间对于所述化合物来调控所述细胞的分化是充分的。

因此，本发明的药物组合物包括给药于个体的本发明的化合物；与本发明的化合物一起或单独给药于个体的本发明的细胞；以及与本发明的化合物接触，给药于个体的本发明的细胞。

本发明提供了治疗和预防疾病或病症的方法，通过给药治疗有效量的本发明的化合物或组合物到哺乳动物，优选人，受治疗者，以能有效调节移植或驻留在受治疗者中的CD34⁺或CD133⁺祖细胞或干细胞的增殖和/或分化。在一个实施方案中，本发明提供了调节CD34⁺和CD133⁺祖细胞或干细胞分化，以增加哺乳动物体内的粒细胞的数量的方法。在另一个实施方案中，任何来源于CD34⁺和/或CD133⁺祖细胞或干细胞的细胞谱系，都可由给药于哺乳动物，尤其是人的本发明的化合物来调节。这里使用的术语“哺乳动物”包括任何哺乳动物。优选的哺乳动物需要这种治疗和预防。哺乳动物的实施例包括但不限于，牛、马、羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴等，更优选人。

本发明的化合物的给药可以是系统的或局部的。在大多数情况下，对哺乳动物给药将使本发明的化合物系统性地释放(即，进入血流)。给药的方法包括肠道途径，如经口、颊、舌下和直肠；局部给药，如经皮和皮内；还有胃肠外给药途径。适合的胃肠外途径包括经由皮下针或导管注射，如静脉内的、肌肉的、皮下的、皮内的、腹膜内的、动脉内的、心室内的、鞘内的、眼内的、前房内的注射，以及非注射途径，如阴道、直肠或鼻给药途径。优选的，本发明的化合物或组合物以口服给药。在具体的实施方案中，最好是将一种或多种本发明的化合物给药于局部需要治疗的区域。这能够达到，例如，通过手术中的局部输液，整体应用，例如，在手术后与创伤敷料联合使用，通过注射、导管、栓剂、植入的方式，所说的植入物为多孔的、无孔的或凝胶的材料，包括膜，如涎管扩张膜或纤维膜。

本发明的化合物能够通过一般的以及非标准的传递系统给药，例如用脂质体、微颗粒、微胶囊、胶囊等包裹。例如，本发明的化合物和组合物能够置于小囊，特别是脂质体内被传递(参见Langer，1990，Science 249：1527-1533；用脂质体来治疗传染性疾病与癌症，Lopez-Berestein和Fidler(编辑)Liss，New York，pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein，同前，317-327页；通常参见如前)。在另一个实例中，本发明的化合物和组合物在一受控制的释放系统内被传递。在一个实施方案中，可使用泵(参见Langer，supra；Sefton，1987，CRC Crit.Ref Biomed.Eng.14：201；Buchwald等，1980，Surgery 88：507 Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.3：574)。在另一实例中，可以使用聚合材料(参见，受控制的释放系统的医学应用，Langer和Wise(编辑)，CRC Press，Boca Raton，Florida(1974))；受控制的药物生物有效性，药物产品的设计和特性，Smolen和Ball(编辑)，Wiley，New York(1984)；Ranger和Peppas，1983，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61；还可见Levy等，1985，Science228：190；During等，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard等，1989，J.Neurosurg 71：105)。仍在另一个实例中，受控制的释放系统可置于接近需要治疗的靶区域，例如，肝脏，因此也就只需要部分的系统剂量(见，例如，Goodson，受控制的释放系统在医学中的应用，同上，卷2，115-138页(1984))。也可使用其他的在综述中讨论的释放系统(Langer，1990，Science 249：1527-1533)。当作为组合物给药时，本发明的化合物可以与适量的可药用的赋形剂或载体一起进行配制，以能够提供对于哺乳动物合适的给药方式。术语“可药用的”是指经联邦管理机构或州政府核准，或列在美国药典或其他适用哺乳动物尤其是人的公认药典中。术语“赋形剂”是指稀释剂、助剂、赋形剂或载体，本发明的化合物能够与他们一起制成而给药于哺乳动物。这些药学上的赋形剂可以是液体，如水和油，包括来源于石油、动物、植物或合成物的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等类似物。药物赋形剂可以是盐、阿拉伯树胶、凝胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶态二氧化硅、尿素等类似物。另外，辅助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂、着色剂等也可运用。优选地，当给药于哺乳动物时，本发明的化合物和组合物以及可药用的载体，赋形剂或稀释剂是无菌的。当本发明的化合物静脉内给药时，水介质是优选的赋形剂，如水、盐水溶液、葡萄糖水溶液和甘油溶液。

本发明的化合物可以做成胶囊、片剂、丸剂、小丸剂、锭剂、粉剂、颗粒剂、糖浆剂、酏剂、溶液、悬液、乳剂、栓剂或其持续释放制剂，或任何其他合适的给药于哺乳动物的形式。在一个优选的实施方案中，本发明的化合物和组合物以常规程序制备，就如制备人口服或静脉注射药物的程序一样。在一个实施方案中，可药用的赋形剂是硬明胶胶囊。合适的可药用的赋形剂和其制备方法的实施例如在Remington中描述的：药剂科学与实践，Alfonso R.Gennaro编辑，Mack出版公司.Easton，PA，第19版，1995，86，87，88，91，和92章，在此引用作为参考。

本发明的化合物与组合物所制备的口服药，优选做成胶囊、片剂、丸剂或任何压缩的药物形式。而且，在片剂或丸剂形式时，化合物和组合物可需要包衣以延迟它们在胃肠道的降解与吸收，从而能够超出或延长持续有活性的时间。选择性渗透膜周围的渗透活性驱动化合物也适合本发明的化合物和组合物的口服给药。在这些后面的平台中，在胶囊周围环境的液体通过推进化合物而得以吸收，所述化合物通过缝隙取代活性剂或活性剂的组合物。这些传递平台可以提供一种基本上无序的传递曲线与快速释放制备物的描述相反。时间延迟物质如甘油单硬脂酸酯或甘油硬脂酸酯也可使用。口服组合物包括标准赋形剂，赋形剂和稀释剂，如硬脂酸镁、糖精酸钠、纤维素、碳酸镁、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、糖浆和甲基纤维素，制剂还可包括润滑剂，如滑石、硬脂酸镁和矿物油，润湿剂，乳化剂和悬浮剂，防腐剂如羟基苯甲酸甲酯和丙酯。这些赋形剂优选药学级的。本发明的口服化合物和组合物可随意包括一种或多种甜味剂，如果糖、阿司帕坦或糖精；一种或多种调味剂如薄荷油、冬绿油或樱桃调味剂；或一种或多种着色剂，从而提供药学上可口的制剂。

对于治疗特殊病症或疾病的治疗有效剂量主要依赖于其特性及严重性，也能由依据执业医生所作出判断的标准临床技术来决定。另外，体外或体内检测可用来帮助鉴定出最理想的剂量。当然，可构成治疗上有效剂量的本发明的化合物的量也依赖于给药途径。一般来说，对于口服给药合适的剂量范围大约在每天每公斤体重约0.001mg到约20mg本发明的化合物，优选约0.7mg到约6mg，更优选约1.5mg到约4.5mg。在一个优选的实施方案中，哺乳动物特别是人口服本发明的化合物每天约0.01mg到约1000mg，更优选约0.1mg到约300mg，或者约1mg到约250mg，单独或分开服用。这里所描述的剂量指的是服药的总量；也就是说，如果服用的不止一种本发明的化合物，那么优选的服用剂量要与本发明的化合物服用的总量相当。口服组合物优选包含10％到95％重量的本发明的化合物。优选的口服单位剂型包括丸剂，片剂和胶囊，更优选胶囊。一般地这些单位剂型包括本发明的化合物大约0.01mg、0.1mg、1mg、5mg、10mg、15mg、20mg、50mg、100mg、250mg或500mg，优选地，每个剂量单位含本发明的化合物约5mg到约200mg。

在另一个实施方案中，本发明的化合物和组合物可以胃肠外给药(例如，通过肌肉内、鞘内、静脉内和动脉内途径)，优选静脉内。一般地，用于静脉内注射的本发明的化合物和组合物是溶解在无菌等渗的水溶液中，如水、盐溶液、林格液、葡萄糖溶液。若需要，组合物还可包括助解剂。静脉注射组合物可选择性的包括局部麻醉剂如利诺卡因来缓解注射部位的疼痛。对于静脉注射，本发明的化合物与组合物可以消毒的冻干粉或密闭容器中脱水的浓缩剂而提供，如一次用量的针剂或药囊，贮存器显示活性剂的量。粉末或浓缩剂在静脉注射前先用合适的水溶液溶解。一安瓿消毒水、盐水溶液或其他合适的水溶液可供粉末或浓缩剂在注射前溶解。或者组合物可以以预混合形式提供而给药。本发明的化合物或组合物要用做静脉注射的话，可把它用包含制药级水、盐水溶液或其他合适介质的注射瓶分装。

直肠给药会受栓剂的影响，栓剂由传统介质如可可脂、改性的植物油和其他脂肪碱制备而成。栓剂以以公知的形式由公知的方法制备，例如参见Remington：药剂科学与实践，Alfonso R.Gennaroed.，Mack出版公司.Easton，PA，第19版，1995，1591-1597页，在此作为参考引用。

要配制和投送局部用剂型，可以使用公知的经皮肤和皮内传送介质如洗液、乳膏、软膏以及经皮肤递送装置如贴剂。(Ghosh，T.K.；Pfister，W.R.；Yum，S.I.经皮肤和局部药物传递系统，InterpharmPress，Inc.p.249-297，在此作为参考引用)。例如，贮器型贴剂设计可由覆盖有一层粘合剂的衬底膜组成，包含有本发明的化合物或组合物的贮器隙，可通过半透膜与皮肤分隔(例如，美国专利号4,615,699，在此作为参考引用)。覆盖粘合剂的衬底层可沿贮器边缘延伸以提供一个与皮肤的同心封口，且保持贮器与皮肤相邻。

本发明也提供药学包装物或药盒，包括一或多种填充有一种或多种本发明的化合物的容器。优选与这种容器相关联的可以是一种以政府机构开出的形式的公告，这些公告规定药学或生物学产品的生产、使用或销售，该公告反映了对于人类给药的生产、使用或销售机构的认可。在一个实施方案中，药盒由多种本发明的化合物组成。在另一个方案中，药盒包含本发明的化合物和其他生物学活性剂。

本发明的化合物在用于人体之前，优选在体外和体内受到检测，以得到所需的治疗或预防活性。例如，体外检测可用来决定是否是本发明的化合物的特定给药还是本发明的化合物联合给药更有效。也可通过使用动物模型系统来测定本发明的化合物和药物是否有效。其他的方法为一些熟练的技术员所了解，并且也包含在本发明范围内。

5.8.使用本发明方法检测

上面所描述的方法学，也就是检查IMiDs如Actimid^TM对早期祖细胞如CD34⁺细胞分化的影响，能够应用于任何想要知道其对分化的影响的目的化合物。这可以通过多种方式完成。

在一个实施方案中，化合物可简单地替代Actimid^TM或任何本发明的其他化合物。这里，CD34⁺祖细胞和/或CD133⁺祖细胞可在允许祖细胞向定向的和/或完全分化的细胞增殖和/或分化的条件下与目的化合物以各种浓度接触。这里公开的培养方法，特别是在5.4节公开的培养方法，都可以使用。即便目的化合物的作用是通过评估由祖细胞分化来的细胞群的变化来决定的，这种变化是通过任何表型的变化监控的，但还是优选通过测定细胞表面标记的有或无来评估。象本发明方法，从一开始培养起的任何时间都可采用单一剂量的目的化合物给药以获得最终分化的细胞。可选择的是，目的化合物也可在增殖期，分化期或在两个时期给药。增殖/分化中祖细胞的表型变化优选与对照培养的细胞来比较，如用DMSO处理的细胞。特定的目的将会影响增殖与分化，如，但不限于：增殖比率的调节；分化比率的调节；祖细胞向特定的定向前体细胞分化的调节；阻抑向特定的细胞类型的分化；以及促进向特定细胞类型的分化。

在另一个实施方案中，培养、增殖和分化如上发生，但目的化合物与祖细胞连同Actimid^TM一起接触。在这种方式中，多化合物的可能是协同性的效果可得到测定。特别值得注意的是，任何化合物单独对增殖或分化的作用可能没有或仅有一点，但与Actimid^TM一起用时却具有了明显的效果。在另一个实施方案中，任何两种目的化合物都可在培养条件下与祖细胞接触，如上，该条件通常允许祖细胞增殖和分化。这里，优选一个实验，其中前体细胞与两种目的化合物接触，包含一个对照其中祖细胞与所述两种化合物中的一种接触；一个对照其中细胞与Actimid^TM接触；一个对照其中细胞不与化合物接触，而是与DMSO接触。再次，在剂量以及作用时间上的变化都如5.4节所述。

6.实施例

6.1.实施例1：沙利度胺、Actimid^TM和Revimid^TM对CD34⁺祖细胞分化的影响

在以下的实施例中，沙利度胺(Thal)，Actimid^TM(“Actimid^TM”)和Revimid^TM对CD34⁺(造血祖细胞)细胞分化以及集落形成单位的产生的影响已有研究。值得注意的是，结果显示Actimid^TM和Revimid^TM能够用来特异地抑制红血球集落(BFU-E和CFU-E)的形成，同时增加白细胞和血小板形成集落(CFU-GM)的产生并增强整个集落形成单位(CFU-Total)的产量。

本发明方法因此能用来调节干细胞的分化，也能用来刺激集落形成的比率，通过提高骨髓移植和白血球和/或血小板产物恢复的速度对造血干细胞移植产生提供重要的帮助。

脐带血CD34⁺祖细胞以每孔1000个细胞的密度植入到96孔培养皿中，在IMDM中补充20％胎牛血清和细胞因子(IL-3，G-CSF和kit-ligand(R & D Systems，Inc.)。细胞暴露于沙利度胺(Thal)，Actimid^TM和Revimid^TM，或DMSO(对照化合物)，然后培养6天。脐带血CD34⁺细胞以每孔1000个细胞的密度植入到96孔培养皿中，在IMDM中补充20％胎牛血清和细胞因子(IL-3，G-CSF和kit-ligand(KL)(R & D Systems，Inc.)。培养后，进行细胞染色，用荧光激活细胞分选仪(FACS)进行分选。收获400微升染色的细胞，用含1％胎牛血清的磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释到1.0ml。通过细胞计数来看测定干细胞分化调节的影响效果。获得的细胞计数值显示在图1中。

这些结果显示本发明的化合物在造血祖干细胞谱系定向化的调节中是有效的。因此Actimid^TM和Revimid^TM能用来特异地抑制红血细胞或红血球集落(BFU-E和CFU-E)的产生，而增加白血球和血小板形成集落(CFU-GM)的发生，增强总的集落形成单位的产量。本发明方法因此可以用来调控干细胞的分化，也可用来刺激特异集落形成的比率，还可通过提高骨髓移植和白血球和/或血小板产物恢复的速度对造血干细胞移植产生提供重要的帮助，它们是通过原始干细胞朝着想要移植的细胞谱系定向分化的而来。通过Actimid^TM和Revimid^TM对CD34⁺CD38-祖细胞群红血球生成和扩增的抑制在图2中有进一步描述。

6.2.实施例2：沙利度胺，Actimid^TM和Revimid^TM对人脐带血CD34⁺细胞增殖和分化的影响

在下面的实施例中，Actimid^TM和Revimid^TM对人脐带血(CB)单核细胞增殖和分化成CD34⁺(造血祖)细胞已有研究。脐带血单核细胞是个混合的细胞群包括一小群造血祖(CD34⁺)细胞。这个小的CD34⁺细胞群亚类包括一群(大约1％总CB单核细胞)CD34⁺CD38⁺细胞和甚至更小群(少于总CB单核细胞的1％)的CD34⁺CD38^-细胞。明显地，结果显示，与阳性和阴性对照相比，Actimid^TM和Revimid^TM能显著抑制或减缓造血干细胞或祖细胞的分化(图3-7)。

6.2.1.材料和方法

CB CD34⁺细胞以4x10⁴细胞每毫升植入到24孔板中，在20％FCSIMDM(小牛血清/Iscove改良Dulbecco培养基)中添加细胞因子(1L3，GCSF和Kit-ligand)(R & D Systems，Inc.)。沙利度胺(Thal)，Actimid^TM或Revimid^TM以三种不同的浓度包括在培养基中：5μg/ml，1μg/ml和0.3μg/ml。同样体积的DMSO作为对照使用。阴性对照没有添加任何化合物(在图3-7中用“无”表示)。细胞在37℃，5％CO₂培养箱中培养7天。然后收集每孔的细胞。

每孔细胞总数通过在CELL-DYN1700(艾博特诊断法)中计数以及用FACS(荧光激活细胞分选仪)染色分析CXCR4、CD45、CD34、CD38、CD11b的表达以及Gly-A的表达来测定(图3-7)。

来自两个不同供体的CB细胞(CB2276和CB2417)单独培养、测定和分析(表1)。

6.2.2.结果和讨论

沙利度胺、Actimid^TM或Revimid^TM对细胞因子刺激的CD34⁺细胞扩增的影响已进行了检测。如图4所示，沙利度胺、Actimid^TM和Revimid^TM对缺乏IL-3，Kit-ligand(KL)和G-CSF培养的CD34⁺细胞的增殖与阴性对照(″无″)相比较没有明显的影响。然而，沙利度胺、Actimid^TM和Revimid^TM与DMSO对照相比似乎能轻微地诱导细胞的生长。考虑到实验中DMSO对细胞的增殖一般有负作用，这些结果显示沙利度胺、Actimid^TM和Revimid^TM化合物对有IL-3，Kit-ligand(KL)和G-CSF培养的CD34⁺细胞的增殖具有刺激作用，由于是用等量的DMSO做载体。在这个方面，Actimid^TM和Revimid^TM要比沙利度胺具有更大的作用。

沙利度胺、Actimid^TM和Revimid^TM对细胞分化表达的影响通过FACS分析表面蛋白CXCR4和CD34(图3和4)来确定。Actimid^TM和Revimid^TM，但不是沙利度胺，显示出CXCR4表达的抑制作用。Actimid^TM比Revimid^TM由更强的作用。

至于表面蛋白CD34⁺，Actirnid^TM引起培养在CB2276和CB2417的CD34⁺细胞的上调(增加增殖)。然而，沙利度胺和Revimid^TM，只在一个而不在另一个供体中显示出相似的作用。有趣的是，用Actimid^TM和Revimid^TM一起处理的细胞中，大部分CD34⁺和CD34^-细胞是CD38^-，而用DMSO对照处理以及沙利度胺处理的细胞群则主要是CD38⁺。这表明Actimid^TM和Revimid^TM能够用来特异性地抑制红血细胞或红血球集落(BFU-E和CFU-E)的形成，而增加白血球和血小板形成集落(CFU-GM)的生成，增强总的集落形成单位的产量。因而本发明的方法可以用于调节干细胞的分化，并且也能够用来刺激集落形成率，通过提高骨髓移植和白血球和/或血小板产物恢复的速度对造血干细胞移植产生提供重要的帮助。参见下面表4。

沙利度胺、Actimid^TM和Revimid^TM对细胞分化表达的作用通过FACS分析细胞表面蛋白来确定，这些表面蛋白是CD34⁺CD38^-对CD34⁺CD38⁺或是CD1 1b⁺。结果置于表1中。

表1：在脐带血来源的造血祖细胞中对细胞分化和CD34、CD38和CD11b细胞表面标记表达的影响的实施例

在CD11 b⁺细胞群的大小上没有显著的变化，而对于Revimid^TM，在较低浓度下观察到较大的CD11b⁺细胞群。

然而，CD11b表达的水平在Actimid^TM和Revimid^TM双处理的细胞中下降，通过平均免疫荧光(MIF)来测定显示CD 11b表达受到抑制。这就提示CD11b⁺细胞在Actimid^TM和Revimid^TM存在而培养时，处在一个低分化状态。

6.3.实施例3：Actimid^TM和Revimid^TM对人脐带血MNC细胞的影响

在先前的实施例中，显示出在脐带血CD34⁺细胞中，Actimid^TM和Revimid^TM明显下调CXCR4的表达，增加CD34⁺CD38^-细胞群。在这个实施例中，显示出Actimid^TM和Revimid^TM在脐带血单核细胞(MNC)中具有相似的活性。

6.3.1.材料和方法

经标准方法冷冻保存和解冻的脐带血MNCs，通过标准Ficoll分离方法将其分离出来，并以0.5x10⁶细胞/ml在含有生长因子(IL6、KL和G-CSF各为10ng/ml)的20％FCS-IMDM中于24孔板内培养三份。实验组是None(只有细胞因子)，DMSO(1.7μl)，Actimid^TM(5.0μg在1.7μl DMSO中)，Revimid^TM(5μg在1.7μl DMSO中)。将培养一周后培养的细胞收集，通过FACS染色分析。结果总结在表2和图8-12中。数据以三个独立孔的平均值+/-SD表示。

表2

6.3.2.结果和讨论

如表2和图8-12所示，用DMSO、Actimid^TM或Revimid^TM培养的MNCs细胞总数要少于对照组(″None，″只有生长因子)。这可能归因于DMSO的作用。用MID1培养的细胞比其他组显示出更高的CD34⁺细胞比率，而CD34⁺细胞总数在所有组中是相似的。CD34⁺CD38^-细胞数明显高于用IMJD1和Revimid^TM处理的细胞，与用化合物处理纯化的CD34⁺细胞所得的结果一致。容易接受的是，CD34⁺CD38^-细胞是少分化的造血祖细胞，其在移植后以比CD34⁺CD38⁺细胞更高的效率移植与增殖(Dao等.1998，Blood 91(4)：1243-55；Huang等.1994，Blood 83(6)：1515-26)。

DMSO似乎能在脐带血MNCs中刺激CXCR4的表达。当与两个对照组相比较时，Actimid^TM和Reviniid^Tm在CD45⁺细胞中明显抑制了CXCR4的表达。

在用Actimid^TM和Revimid^TM处理培养的细胞中大部分的CXCR4⁺细胞为CD45阴性。在用Actimid^TM和Revimid^TM处理的细胞中，这种细胞群要明显地高。

结果显示Actimid^TM和Revimid^TM在调整干细胞以抵消深低温保藏、融化和/或暴露于冷冻保藏剂对干细胞的有害作用方面是有用的。结果进一步显示DMSO对CD34⁺和CD 14⁺细胞产物的抑制能够通过用Actimid^TM或Revimid^TM处理而抵消，其提高了CD34⁺和CD14⁺细胞的增殖能力。

6.4.实施例4：：沙利度胺、Actimid^TM和Revimid^TM对单核细胞产量的影响

6.4.1.材料与方法

纯化的人脐带血CD34⁺细胞(大于90％CD34⁺)以4x10⁴细胞/ml在添加了细胞因子(IL3、IL6、G-CSF、KL和Epo)的20％FCS IMDM培养基、37℃、5％CO2潮湿培养箱中培养14天。实验组由以下组组成，(i)没有添加DMSO或化合物(″None″)，(ii)仅有DMSO，(iii)沙利度胺溶解在DMSO中，(iv)Actimid^TM溶解在DMSO中，和(v)Revimid^TM溶解在DMSO中。收集部分细胞用结合单克隆抗体的CD34-PE和结合单克隆抗体的CD14-FITC进行染色。

6.4.2.结果与讨论

结果显示在″None″组中，全部细胞中仅有0.95％是CD34⁺。在DMSO处理组中，0.17％的细胞是CD34⁺，显示DMSO对CD34⁺扩增与保存具有负作用。在沙利度胺处理组中，0.24％的细胞是CD34⁺，其与DMSO处理的细胞并非显著不同。但是在Actimid^TM和Revimid^TM处理组，有较高的CD34⁺细胞的百分比(分别为18.7％和7.1％)。(也参见图13及所附图例中描述的实验结果)。

CD14是单核细胞的一个标记。在″None″组中，11.5％的细胞是CD14⁺，而在DMSO处理组中，3.7％是CD14⁺，显示单核细胞的产生减少。如上面CD34表达的实施例，沙利度胺处理组与DMSO处理组的结果是相似的。由于Actimid^TM和Revimid^TM处理组也暴露于DMSO，可推论出由DMSO抑制的单核细胞产量可通过用Actimid^TM或Revimid^TM处理而得以克服。

6.5.实施例5：用Actimid^TM预处理已移植的来源于脐带血和胎盘的有核细胞的作用

实验证明用Actimid^TM预处理增加了移植的胎盘有核细胞(PLNC)、脐带血有核细胞(UCBNC)和骨髓细胞(BMNC)的存活。

6.5.1.材料与方法

胎盘有核细胞(PLNC)、脐带血有核细胞(UCBNC)和骨髓细胞(BMNC)从人供体获得。PLNC和UCBNC用上面5.4节所描述的方法从胎盘和脐带血中获得。

通过在添加有2％人CB血清和10g/mlActimid^TM的DMEM中温育24小时来预处理细胞。然后洗涤细胞，将其悬浮在自体血浆中，静脉内给药于受体成熟SJL/L小鼠(Jackson实验室)，其患有根据标准方法通过致死放射(900cGy)而产生的骨髓切除。该放射要优于放射后50天90％的致死(Ende等，2001，Life Sciences 69(13)：1531-1539；Chen and Ende，2000，J.Med.31：21-30；Ende等，2000，LifeSci.67(1)：53-9；Ende and Chen，2000，Am.J.Clin.Pathol.114：89)。

6.5.2.结果与讨论

用Actimid^TM预处理已移植的PLNC、UCBNC和BMNC的作用显示在下面的表3中。如表3中所见，Actimid^TM预处理增加了已移植的胎盘有核细胞(PLNC)、脐带血有核细胞(UCBNC)和骨髓细胞(BMNC)的存活。

表3

缩写：

PLNC：胎盘有核细胞

UCBNC：脐带血有核细胞  BMNC：骨髓细胞

N/A：不适用的

6.6.CD34⁺祖细胞分化的调节

6.6.1.材料和方法

骨髓和脐带血CD34⁺祖细胞从Clonetics获得，在含有SCF、Flt-3L、GM-CSF和TNF-α的Iscove′s MDM与BIT95000(干细胞技术)中培养6天，然后在有GM-CSF和TNF-α下再培养6天。

细胞表面表型分析：在第6天和第12天用FITC和PE联合mAbs对细胞进行双染处理(30分钟，4℃)。使用的抗体来自BDPharmingen：CD34(PE)、CD38(FITC)、CD33(FITC)、CD1a(FITC)、CD86(PE)、CD14(PE)、CD83(PE)、CD54(PE)、CD11b(PE)、CD(PE)、HLA-DR(PE)、CD15(FITC)、和来自Miltenyi的CD 133(PE)。荧光分析在在获得10,000个结果(Coulter)后在FACS流动细胞计数器上进行。显示的结果为四个独立实验的代表。

凋亡检测：按照生产说明书，使用膜联蛋白V-FITC联合碘化丙锭(BD Pharmingen凋亡检测试剂盒I)染色可测定磷脂酰丝氨酸的暴露。

吞噬作用：细胞的内吞作用活性可通过测量FITC-葡聚糖摄取进行分析。细胞在1mg/ml葡聚糖-FITC(Sigma)的完全培养基中37℃温育1小时，4℃温育1小时作为阴性对照。显示的结果为两个独立实验的代表。

T细胞增殖检测：培养13天后，收集来源于CD34⁺的DC细胞，用丝裂霉素C(50μg/ml，Sigma)处理后，用作对异源成熟CD3⁺T细胞的刺激细胞，前者从健康志愿者的外周血单核细胞(PBMCs)纯化而来。CD3⁺T应答细胞以5×10⁴细胞/孔的浓度使用。刺激细胞以剂量梯度加入到在黑色96孔平皿内的T细胞中，这种清楚的底部组织培养盘可用于化学发光检测。培养是在添加了10％热灭活FBS、谷氨酸盐和青霉素-链霉素的RPMI1640培养基中进行。培养6天后，按照制造说明用BrdU化学发光检测法(Roche，Nutley NJ)来测量细胞的增殖。结果以从三次培养获得的平均值±SD显示。

6.6.2.结果与讨论

Actimid^TM经发现可明显改变来源于CD34祖细胞的DC的发育。为了研究Actimid^TM对DC生成的作用，CD34⁺祖细胞在有或没有Actimid^TM(1μM)下在扩增和成熟期(第1到第12天)培养12天的一周期，或在成熟期(第6到第12天)培养6天的一周期(图14)。从第1天到第12天添加Actimid^TM抑制了DC表型的获得(图15)，大量增加了CD34⁺CD38^-群，改变了CD34⁺CD38^-细胞向CD34⁺CD38⁺细胞的正常分化(图16)。然而，Actimid^TM处理的CD34⁺细胞确实获得了CD33骨髓样标记，这些细胞在第6天时呈现出CD34⁺CD38^-CD33⁺表型。Actimid^TM在第6天几乎完全阻碍了CD1a⁺细胞的产生，尤其是双阳性CD86⁺CD1a⁺细胞的产生。这种双阳性群被认为是表皮胰岛DC的前体。Actimid^TM也减少了CD14⁺CD1a细胞的产生，其能使真皮DC和单核细胞/巨噬细胞产生。早期祖细胞群(CD34⁺CD38^-细胞)的增加和骨髓DC祖细胞(CD1a⁺CD14^-和CD1a^-CD14⁺细胞)的阻滞是剂量依赖性的，在Actimid^TM为1μM时达到最大值(图17)。这种作用是可逆的，如果CD34⁺祖细胞用Actimid^TM培养至少3天，仅观察到阻碍了CD34分化通路(图18)。

在第0天到第6天多剂量的Actimid^TM加强了CD34⁺群的增加(图19A)。

在有Actimid^TM时培养的CD34⁺祖细胞在第12天同样显示共刺激分子(CD86、CD80)的降低的表达(图20)。CD54粘附分子随着CD54bright降低的表达和CD54^dim群增加的表达而改变(图21)。HLA-DR分子的表达在Actimid^TM处理的CD34⁺祖细胞中减少。

当在第0-6天不处理培养后，在第6天加入Actimid^TM以及当CD1a⁺群已经产生，Actimid^TM增强了CD1a⁺群的持续(表1)。在第12天用Actimid^TM处理的培养物比DMSO对照包括相对更多的CD1a⁺前体细胞。在6天的CD34⁺已分化的细胞中添加Actimid^TM相当多地减少了CD14⁺前体细胞的产生和共刺激分子(CD86、CD80)的表达。

表1.在第6天到第12天有Actimid^TM存在下，由CD34⁺祖细胞产生DC在第12天的表型特征

Actimid^TM促进粒细胞的分化：为测定DC产生阻滞是否与不同的骨髓分化通路变化相联系，我们检测了粒细胞标记CD15的表达。表面分子CD15在有Actimid^TM培养的CD34⁺祖细胞中的表达是增加的(图22)。在有能促进DC分化的细胞因子混合剂的情况下，添加Actimid^TM使祖细胞的扩增/成熟向更粒细胞样的表型转移。我们也研究了在骨髓分化中的偏离，通过检测两个标记的表达：CD11c，由骨髓DC祖细胞为胰岛细胞和间充质DC而表达，而CD15由粒祖细胞表达。CD11c⁺CD15^-群的减少与在CD11c^-CD15⁺粒细胞群中的同期增多相关联(图19B)。令人感兴趣地是，Actimid^TM的多次给药促进了向粒细胞谱系的转变。

DC生成阻滞不是由特异性的DC祖细胞致死而介导：为确定DC祖细胞减少是否由特异性致死而介导，CD34⁺祖细胞在有SCF、Flt-3L、GM-CSF和TNF-α的情况下培养6天的阶段。在第6天，用磁性细胞分选器(Miltenyi)分离CD1a⁺CD14和CD1a^-CD14⁺细胞(DC祖细胞)。纯化群在有GM-CSF和TNF^-α，有或没有Actimid^TM(1μM)时另外培养2天。Actimid^TM处理，在膜联蛋白V⁺-PI^-(早期凋亡)和膜联蛋白V⁺-PI⁺(晚期凋亡)群水平没有明显的增加(图23)。

产生于CD34⁺祖细胞的DC功能活性改变：来源于CD34⁺祖细胞的细胞用细胞因子和有或没有Actimid^TM培养，其吞噬能力通过在第12天甘露糖受体介导的葡聚糖^-FITC内吞作用来检测。当从第1天到第12天加入Actimid^TM，与DMSO对照组相比吞噬能力有很强的下降(图24)。当从第6天到第12天加入Actimid^TM，与DMSO对照细胞相比吞噬能力相当(图25)。

CD34⁺细胞用细胞因子和有或没有Actimid^TM培养，其抗原呈递能力(APC)通过在第12天用混合白血球反应(MLR)检测来测定他们诱导CD3⁺异源T细胞增殖的能力而评估。当第1天到第12天加入Actimid^TM，与DMSO对照相比，CD34⁺细胞表现出降低的刺激T细胞增殖的能力。相反，当第6天到第12天加入Actimid^TM，刺激T细胞增殖的能力与DMSO对照细胞的相当(图27)。CD34⁺细胞正常的分化途径在图28中描述。

这些结果显示，Actimid^TM显著地削弱了CD34⁺祖细胞分化成树突细胞。因而，Actimid^TM处理的细胞呈现出低的吞噬能力和降低的APC能力。更重要的是，Actimid^TM增加了早期造血祖细胞，CD34⁺CD38^-细胞。这些早期造血祖细胞已显示出在NOD-SCID老鼠模型中能更好的移植和重新构建(Tamaki等，J.Neurosci.Res.69(6)：976-86(2002))。而且，Actimid^TM通过骨髓分化向粒细胞谱系转换使CD34⁺细胞的分化发生偏离，即使当细胞因子压力有利于树突细胞分化时。另外，发现Actimid^TM对CD34⁺细胞没有毒性作用，不会削弱细胞增殖的能力。树突细胞功能的调节和粒细胞分化的促进可以以于各种癌症、免疫病症、传染性疾病、器官移植和再生性医学有显著的治疗作用。

参见图29对于以上的图形的总结。

6.7.Actimid^TM调节CD133⁺祖细胞分化

多剂量Actimid^TM，除了增强CD34⁺群增加，也增加CD133的表达，其通常由CD34^bright造血祖细胞和一些原始的CD34^-亚群表达(图19A，19B)。Actimid^TM，通过富集CD34⁺CD133⁺原始造血细胞，对干细胞移植后造血恢复具临床意义。另外，CD133⁺干细胞能够产生内皮细胞谱系，且对伤口愈合有贡献。多剂量Actimid^TM不会加剧胰岛DC前体细胞生成的阻滞。

6.8.源于骨髓(BM)Sca⁺造血干细胞的鼠树突细胞的生成

6.8.1.材料与方法

由近亲繁殖的C57BL/6小鼠而来的鼠骨髓从Clonetics获得。富集造血Sca⁺Lin^-祖细胞，使用SpinSep鼠祖细胞富集混合剂(干细胞技术)，在有BIT95000(干细胞技术)和有鼠生长因子SCF、Flt3L、GM-CSF和M-CSF的Iscove′s MDM中培养9天，来促进Sca⁺细胞扩增和DC前体表型，然后在有GM-CSF和TNF-α中另外培养3天来促使细胞为未成熟的DC表型。参见图30。富集的Sca⁺Lin^-细胞从第0天开始在有DMSO(0.1％)，Actimid^TM为10μM或全反式视黄酸(ATRA)(ICN生物医学)为10μM中培养。化合物在第0天和第9天加入细胞中。

鼠细胞表面表型分析：鼠细胞在第9天和第12天用FITC和PE联合mAbs双染处理(14分钟，室温)。使用的抗体来自BD Pharmingen；Sca(PE)、CD11b(FITC)、Gr-1(FITC)、CD86(PE)、CD14(PE)、CD80(PE)、I^-Ab(PE)、CD40(PE)和来自Miltenyi的CD32.1/16.1(FITC)。荧光分析在在获得10,000结果(Coulter)后在FACS流动细胞计数器上进行。

6.8.2结果和讨论

Actimid^TM经发现可改变来源于Sca⁺祖细胞的鼠DC的发育。在第9天细胞呈现出DC前体细胞表型，树突状/骨髓状标记CD32/16(Fc受体)、CD11b、CD80的高的表面表达，I-A^b和CD86的低表达，谱系标记如CD14和Gr-1(图31)的不表达。Actimid^TM显示到第9天对细胞表面标记表达没有明显影响，而ATRA显示出CD80、I-Ab和Sca⁺表达的明显下调(数据没有显示)。然而，到第12天，Actimid^TM显示出CD86和bright I-Ab表达的下调，CD11b表达的上调(图32)。ATRA显示出相似的但比Actimid^TM更显著的影响。另外，Actimid^TM显示对CD40和CD80的表达没有影响而ATRA显示明显下调这些分子(没有显示)。

这些结果提示Actimid^TM通过下调CD86和MHC II的表达来抑制DC祖细胞向未成熟DC的分化。化合物的作用不象在人造血祖细胞中所观察到的那么引人注目，这与Actimid^TM在小鼠体外和其他模型体内低的活性相类似。Actimid^TM的作用比ATRA更不明显，后者是小鼠的致畸剂。

6.9.对除IMiD以外化合物的分化检测的应用

以上所描述的方法论，也就是检查ImiD如Actimid^TM对早期祖细胞如CD34⁺细胞分化的影响，可适用对分化的影响想要了解的任何目的化合物。作为该检测方法延伸到其他化合物的例子，相对于对照(DMSO处理)细胞，我们比较了视黄酸(ATRA)和阿司匹林与Actimid^TM对CD34⁺细胞向DC谱系的分化的影响。研究视黄酸是因为其对细胞增殖与分化的作用、在一些肿瘤治疗上的使用是已知的，以及它已知的致畸效应。相反地，我们研究阿司匹林是因为它是通用的抗炎症药物，没有免疫调制剂特性。CD34⁺祖细胞在有SCF、Flt-3L、GM-CSF和TNF-α，有或没有化合物中培养6天的时期，第6天的结果呈现在以下表2中(向上的箭头表示细胞群的增加；下降的箭头表示减少)。

表2.Actimid^TM、视黄酸和阿司匹林对CD34⁺细胞分化影响的比较.

在文献中，其他的药物已显示能调节细胞的分化，例如，最近的文献报道皮质类固醇对从CD34⁺祖细胞生成的DC的调节。其描述不同于Actimid^TM伴随着CD1a⁺群的增加和CD 14⁺群的减少。

6.10.实施例10：分化成特定细胞类型的诱导

通过暴露于生长因子，脐带血细胞和/或胚胎样干细胞可诱导分化成特定细胞类型。用来诱导的生长因子包括但不限于：GM-CSF、IL-4、Flt3L、CD40L、IFN-α、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6、视黄酸、基本的成纤维生长因子、TGF-β-1、TGF-β-3、肝细胞生长因子、表皮生长因子、cardiotropin-1、血管紧缩素原、血管紧缩素I(AI)、血管紧缩素II(AII)、AII AT₂类型2受体拮抗剂，或类似物或其片段。

6.10.1.分化成神经元的诱导

这个实施例描述了诱导脐带血细胞和/或胚胎样干细胞分化成神经元。下面的方案应用于诱导神经分化：

1.胎盘干细胞生长在在诱导前的培养基中，由DMEM/20％FBS和1mMβ-巯基乙醇组成。

2.弃去诱导前的培养基，细胞用PBS清洗。

3.加入包含DMEM和1-10mMβ-巯基乙醇的神经诱导培养基。作为选择，包含DMEM/2％DMSO/200μM丁酸酯羟基甲氧基苯的诱导培养基可使用以增强神经分化的效率。

4.在某些实施方案中，形态的和分子的改变可发生于暴露在无血清培养基和β-巯基乙醇后60分钟。(Woodbury等，J.Neurosci.Res.61：364-370)。RT/PCR也可用来确定例如神经生长因子受体和神经纤维重链基因的表达。

6.10.2.分化成脂肪细胞的诱导

这个实施例描述了诱导脐带血细胞和/或胚胎样干细胞分化成脂肪细胞。使用下面的方案来诱导生脂分化：

1.胎盘干细胞生长在MSCGM(Bio Whittaker)或补充有15％脐带血血清的DMEM中。

2.使用三个周期的诱导/保持。每个周期由以下组成：向胎盘干细胞输送脂肪生成诱导培养基(Bio Whittaker)，培养细胞3天(在37℃，5％CO₂)，接着是1-3天培养在脂肪生成保持培养基(BioWhittaker)，所用的诱导培养基包含1μM地塞米松、0.2mM茚甲新、0.01mg/ml胰岛素、0.5mM IBMX、DMEM-高糖、FBS和抗生素。

3.在3个完全的诱导/保持周期后，细胞另外在脂肪生成保持培养基中培养7天，每2-3天更换培养基。

4.脂肪生成可通过多数胞浆内脂质小泡的生成来确定，这些小泡可使用亲脂性染料oil red 0很容易地观察到。可使用RT/PCR检测来检查脂肪酶和脂肪酸结合蛋白基因的表达。

6.10.3.分化成软骨细胞的诱导

这个实施例描述了脐带血细胞和/或胚胎样干细胞诱导分化成软骨细胞。使用下面的方案来诱导软骨形成分化：

1.胎盘干细胞保持在MSCGM(Bio Whittaker)或补充有15％脐带血血清的DMEM中。

2.胎盘干细胞等分到无菌的聚丙烯试管中。细胞进行离心(150×g，5分钟)，用不完全软骨形成培养基(Bio Whittaker)清洗两遍。

3.最后一遍洗后，细胞悬浮在包含0.01μg/ml TGF-β-3的完全软骨形成培养基(Bio Whittaker)中，以5×10(5)细胞/ml。

4.0.5ml细胞等分到15ml培养试管中。细胞以150×g沉淀5分钟。沉淀完好地留在培养基中。

5.宽松地盖上试管，37℃，5％CO₂培养24小时。

6.细胞沉淀每2-3天用新鲜配制的完全软骨形成培养基供给。

7.沉淀通过每天用低速涡流在培养基中保持悬浮。

8.在培养的14-28天后收集软骨形成细胞的沉淀物。

9.可通过如可观察的内生纤维基质的产生、确定细胞形态、和/或RT/PCR来检查胶原2和胶原9基因表达来鉴定软骨的形成。

6.10.4.分化成骨细胞的诱导

这个实施例描述了诱导脐带血细胞和/或胚胎样干细胞分化为骨细胞。使用下面的方案来诱导骨生成分化：

1.胎盘干细胞的粘附培养是在MSCGM(Bio Whittaker)或补充有15％脐带血血清的DMEM中进行。

2.培养物在组织培养瓶中保持24小时。

3.骨生成分化通过用骨生成诱导培养基(Bio Whittaker)替换MSCGM进行诱导，骨生成诱导培养基包含0.1μM地塞米松、0.05mM抗坏血酸-2-磷酸酯、10mMβ-甘油磷酸盐

4.细胞每3-4天用新鲜配制的骨生成诱导培养基供给，持续2-3周。

5.使用钙特异的染料和RT/PCR来检测碱性磷酸酶和骨生成素基因表达。

6.10.5.分化成肝细胞的诱导

这个实施例描述了诱导脐带血细胞和/或胚胎样干细胞分化成肝细胞。使用下面的方案来诱导肝原性的分化：

1.胎盘干细胞在补充有20ng/ml肝细胞生长因子、100ng/ml表皮生长因子的DMEM/20％CBS中培养。KnockOut血清替代物可用来替代FBS。

2.50ng/ml的IL-6添加到诱导瓶中。

6.10.6.分化成胰腺细胞的诱导

这个实施例描述了诱导脐带血细胞和/或胎盘样干细胞分化成胰腺细胞。使用下面的方案来诱导胰腺的分化：

1.胎盘干细胞在补充有10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和2ng/ml转化生长因子β-1的DMEM/20％CBS中培养。KnockOut血清替代物可用来替代CBS。

2.从nestin-阳性神经元细胞培养物来的调整的培养基以50/50浓度添加到培养基中。

3.将细胞培养14-28天，每3-4天重新换料。

4.通过检测胰岛素蛋白或通过RT/PCR检测胰岛素基因表达而鉴定分化。

6.10.7.分化成心脏细胞的诱导

这个实施例描述了诱导脐带血细胞和/或胚胎样干细胞分化成心脏细胞。使用下面的方案来诱导肌原性的分化：

1.胎盘干细胞在补充有1μM视黄酸、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、2ng/ml转化生长因子β-1和100ng/ml表皮生长因子的DMEM/20％CBS中培养。KnockOut血清替代物可用来替代FBS。

2.选择性地，胎盘干细胞在补充有50ng/ml心脏溴甲阿托品-1的DMEM/20％CBS中培养24小时。

4.选择性地，胎盘干细胞在无蛋白培养基中保持5-7天，然后用人心肌层提取物来刺激(逐级上升剂量分析)。心肌层提取物是由1gm人心肌层在补充有1％脐带血清的1％HEPES缓冲液中均质化产生。悬浮物培养60分钟，然后离心，收集上层清夜。

4.细胞培养10-14天，每3-4天重新补给。

5.通过心脏肌动蛋白RT/PCR基因表达检测而确定分化。

6.10.8.脐带血细胞和/胚胎样干细胞在分化前/或后的特征

胚胎样干细胞，脐带血细胞和/或用胚胎样干细胞抑制的脐带血细胞群在分化前/或后得到鉴定，其通过使用如流式细胞计数和免疫细胞化学等技术来测量其形态和细胞表面标记的变化，以及通过使用如PCR等技术来测量基因表达的变化。暴露于生长因子的细胞和/或已分化的细胞可通过存在或缺乏下列细胞表面标记而鉴定：CD10⁺、CD29⁺、CD34^-、CD38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、SSEA3^-、SSEA4^-、OCT-4⁺和ABC^-p⁺。优选地，胚胎样干细胞可在分化前通过细胞表面标记OCT^-4⁺、APC^-p⁺、CD34^-和CD38^-的存在而鉴定。具有这些标记的干细胞与人干细胞一样是万能的(例如多能性的)。脐带血细胞可在分化前通过细胞表面标记CD34⁺和CD38⁺的存在而鉴定。分化的细胞源自胚胎样干细胞、脐带血细胞和/或伴有优选不表达这些标记的胚胎样干细胞的脐带血细胞群。

本发明的范围不受本文所描述的具体实施方案的限制。事实上，除了本文所描述的，从前面的描述中，本发明的多种改进对于本领域技术人员而言是显而易见的。这些改进也考虑落入所附的权利要求的范围内。

7.文献

与本文为了所有目的而引用每一个个别的出版物、专利或专利申请的全部内容作为参考的程度一样，本文为了所有的目的引用所有参考文献的全部内容作为参考。

引用任何出版物都是由于其公开日早于本申请日并且不能解释为一种许可，即本发明并不能由于在先发明的作用而提早这种公开日期。

Claims (10)

1.一种调节哺乳动物干细胞分化的方法，其包括在合适的条件下和在抑制TNF-α活性的化合物存在下分化所述干细胞，其中所述化合物不是多肽、肽、蛋白、激素、细胞因子、寡核苷酸或核酸。

2.权利要求1的方法，其中所述干细胞分化为造血细胞。

3.权利要求1的方法，其中所述干细胞选自胚胎干细胞、胎盘干细胞、脐带血干细胞、外周血干细胞和骨髓干细胞。

4.权利要求1的方法，其中所述化合物是氨基取代的沙利度胺类似物或氨基取代的异吲哚啉化合物。

5.权利要求4的方法，其中所述氨基取代的沙利度胺类似物或氨基取代的异吲哚啉化合物选自Actimid^TM、Revimid^TM、Actimid^TM的类似物或前药、Revimid^TM的类似物或前药和具有以下通式的化合物：

其中，X和Y当中有一个是C＝O，另一个是C＝O或CH₂。

6.权利要求4的方法，其中所述氨基取代的沙利度胺选自1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-氨基异吲哚啉、1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-4-氨基异吲哚啉、1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-6-氨基异吲哚啉、1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-氨基异吲哚啉、1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-4-氨基异吲哚啉和1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-氨基异吲哚啉。

7.权利要求1的方法，其中接触步骤在细胞培养中进行。

8.权利要求1的方法，其中所述接触步骤在所述个体中进行。

9.权利要求1的方法，其中所述化合物浓度为约0.005μg/ml至约5mg/ml。

10.权利要求1的方法，其中所述干细胞为人干细胞。

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