CN102391984A - 胚胎肺体外培养方法 - Google Patents

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本发明属于生物技术领域，涉及哺乳动物的胚胎肺的体外器官培养方法，特别是小鼠胚胎期肺的离体器官培养。本发明要解决的技术问题主要是现有培养方法需要特殊材料和占用空间大的缺陷。本发明技术方案是胚胎肺的体外器官培养方法，包括以下步骤：a、在多孔培养板的培养孔中放入尺寸与之适配的承载片，在培养孔底部构建出培养空间；b、将取得的哺乳动物胚胎肺或放置于承载片上，加入培养基，使肺处于培养基和空气的交界处；c、37℃培养箱中培养，然后每1到2天进行培养基换液。使用本发明方法能大量低成本地获得稳定发育且便于后继操作的体外培养肺器官，还能满足大规模药物筛选的需求。

Description

胚胎肺体外培养方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及哺乳动物的胚胎肺的体外器官培养方法，特别是小鼠胚胎期肺的离体器官培养。
背景技术
哺乳动物的器官发育研究能够在完整器官的背景下了解多个基本的细胞生物学过程。这在遗传学的时代特别重要，因为哺乳动物如小鼠等中的基因缺失或突变可直接与人类先天畸形相关联。
体外器官培养属于组织培养的一种高级形式，它能再现器官的发育过程，模拟器官在不同状态及条件下的功能状态，是是了解器官发育过程，研究疾病致病机制及药物筛选的重要技术手段。这对于通过分支形态发生机制培养的器官肺特别有用。小鼠胚胎肺的发育始于胚胎9.5天的前肠内胚层喉气管沟的外凸，然后形成芽基逐渐形成支气管分支。这时候每个芽基包含着三层，表皮，包绕的间充质和间皮层，最后形成呼吸系统的肺。而这些分支，分层和肺的器官形成需要例如表皮生长因子(EGF)成纤维生长因子(FGF)等细胞因子和信号通路的调控。为了确定哪些因子对这些过程有影响，早期胚胎肺的体外培养实验体系就应运而生。
目前比较通用的胚胎肺的体外培养体系是基于Trowell 1959年The culture of matureorgans in a synthetic medium.Exptl.CeZZ Res.16：118-147，1959.其后许多人对其做了改进，但其核心为利用大口径培养皿(35mm，60mm)，加入适量培养基，将孔径5um左右的聚碳酸脂滤膜漂在培养基上。然后将小鼠胚胎肺放置于滤膜上，置于气液交界处培养(图1、2、3、4)。但是上述方法的使用需要(1)使用聚碳酸脂滤膜等特殊材料，(2)浪费大量的培养皿空间，(3)胚胎肺与培养基的接触面积有限不利于进一步有效的实验干预，(4)并且不利于大规模胚胎肺培养的应用。
发明内容
本发明的目的是解决常规培养方法需要使用聚碳酸脂滤膜等特殊材料，浪费大量的培养皿空间等问题。
本方案解决方案是提供一种哺乳动物胚胎肺的体外器官培养方法，其特征在于包括以下步骤：
a、在多孔培养板的培养孔中放入尺寸与之适配的承载片，在培养孔底部构建出培养空间；
b、将取得的哺乳动物胚胎肺放置于承载片上，加入培养基，使胚胎肺处于培养基和空气的液-气交界面；
c、36℃～38℃培养箱中培养，然后每1到2天进行培养基换液。
其中，上述方法步骤a所述的多孔培养板为标准的24孔培养板(4X 6孔排列，孔直径15.6mm，孔底面积1.9m2)。
其中，上述方法步骤a所述的多孔培养板仅为液体培养基的承载容器，并不与胚胎肺直接接触，可以使用国产的灭菌的标准24孔培养板。
其中，上述方法步骤a中所述的承载片为透明玻璃圆片。与培养的胚胎肺直接接触，应进行相应的细胞生物学处理。承载片的大小略小于培养孔孔底面积，为培养孔的50-80％大小即可。
其中，上述方法步骤a中在在使用的多孔培养板的各孔间隙加入湿度平衡液，以减缓培养基挥发。
其中，上述方法中所述湿度平衡液为无菌的磷酸盐缓冲液或蒸馏水。
其中，上述方法步骤b中所述胚胎肺为分离的胚胎期10～13天的小鼠肺原基。
其中，上述方法步骤b中所述的肺放置方式为：将胚胎肺平放。使得胚胎肺处于培养基的液-气交界处。
其中，上述方法步骤b中加入培养基后调整承载片于培养孔的底部的中心，哺乳动物胚胎肺位于承载片的中部。
其中，上述方法c步骤中所述的培养基采用半量递增的方式换液，即每次换液时保留上次培养基体积的一半在原培养孔中，然后将比上次培养基体积的一半按体积分数还多增加4％-16％的新鲜培养基加入培养孔。优选多增加培养基体积一半的8％-13％，最优为10％-12％。
本发明方法的有益效果在于：克服了目前所有方法的占用空间大缺点，大大提高了空间利用率，同时也降低了成本，便于大规模培养。由于肺与培养基的接触较多，提高了实验干预的效率。小体积培养减少了培养基的用量，只需180ul左右的培养基培养即可。克服了现有技术需要无需昂贵的进口材料，进口滤膜，占用大的培养空间和资源才能取得好效果的偏见，成本大大降低。做实验干预时，也可以减少干预试剂的量就可达到预期的浓度或效果。组装和操作简单，只需将处理好的盖玻片放入培养孔，放置胚胎肺，加入培养基培养即可，简单易行。有更好的肺的培养形态，由于没有支撑膜的遮挡，便于观察肺的气管分支，如可以使用通用的细胞倒置显微镜观察肺在体外培养情况。而加入的盖玻片也方便了后续操作，如可进行原位杂交，免疫荧光等操作。本发明方法体外培养胚胎肺超过10天，且肺部支气管平滑肌可有节律的收缩运动，具有好的应用前景。
附图说明
图1、现有的胚胎肺培养方法的体系示意图。1、60mm培养皿；2、胚胎肺；3聚碳酸酯滤膜；4、培养基。
图2、现有的胚胎肺培养方法的体系示意图。1、60mm培养皿；2、胚胎肺；3聚碳酸酯滤膜；4、培养基。
图3、本发明胚胎肺培养方法的体系示意图。1、24孔培养板上的培养孔；2胚胎肺；3、培养基；4、承载片。
图4、本发明胚胎肺培养方法的体系示意图。1、24孔培养板上的培养孔；2胚胎肺；3、培养基；4、承载片。
图5、显示的是小鼠胚胎期12.5天的胚胎进行培养十天的生长情况。
图6为视频截图显示在胚胎肺培养的第五天，此后肺部支气管平滑肌出现有节律的收缩运动，其中箭头所指示的部位为运动幅度相当明显的部位，分别位于肺部大支气管和两个肺叶小的气管分支。
图7、更换培养基体积方案。
图8、标准24孔细胞培养板的图片，以示其各孔间存在的用于加湿度平衡液的空隙。每相邻4培养孔间围成一个间隙，标准24孔细胞培养板有15个可添加湿度平衡液的间隙。图中1为培养孔间的间隙，2为培养孔。
图9、标准24孔细胞培养板的照片，以示其各孔间存在的用于加湿度平衡液的空隙。每相邻4培养孔间围成一个间隙，标准24孔细胞培养板有15个可添加湿度平衡液的间隙。图中1为培养孔间的间隙，2为培养孔。
具体实施方式：
以下结合附图通过具体实施方式，对本发明进行详细说明。
本发明提供了一种哺乳动物胚胎肺的体外器官培养方法，包括以下步骤：
a、在多孔培养板的培养孔中放入尺寸与之适配的承载片，在培养孔底部构建出培养空间；
b、将取得的哺乳动物胚胎肺放置于承载片上，加入培养基，使胚胎肺处于培养基和空气的液-气交界面；
c、36℃～38℃培养箱中培养，然后每1到2天进行培养基换液。
其中，上述方法步骤a所述的多孔培养板为标准的24孔培养板(4X 6孔排列，孔直径15.6mm，孔底面积1.9m2)。
其中，上述方法步骤a所述的多孔培养板仅为液体培养基的承载容器，并不与胚胎肺直接接触，可以使用国产的灭菌的标准24孔培养板。
其中，上述方法步骤a中所述的承载片为透明玻璃圆片，与培养的胚胎肺直接接触，必需进行相应的通用细胞生物学处理。承载片尺寸应小于孔径大小，大小为培养孔的50-80％大小，形状匹配。最好与培养孔一样为圆形的透明玻璃圆片。承载片一般应贴在底部。
其中，上述方法中可以在使用的多孔培养板的各孔间隙加入湿度平衡液，以减缓培养基挥发。
其中，上述方法中所述湿度平衡液为无菌的磷酸盐缓冲液或蒸馏水。
其中，上述方法步骤b中所述胚胎肺为分离的胚胎期10～13天的小鼠胚胎肺。
其中，上述方法步骤b中所述的肺放置方式为：将胚胎肺平放。使得胚胎肺处于培养基的液-气交界面。
其中，上述方法步骤b中加入培养基后调整承载片于培养孔的底部的中心，哺乳动物胚胎肺位于承载片的中部。
其中，上述方法c步骤中所述的培养基采用半量递增的方式换液，即每次换液时保留上次培养基体积的一半在原培养孔中，然后将比上次培养基体积的一半按体积分数还多增加4％-16％的新鲜培养基加入培养孔。
本发明方法中使用的各种试剂和材料，按本领域常识都应为无菌的，操作也应在无菌条件下进行。
本发明方法使用的承载片可以是各种材质的适于组织细胞培养的薄片，最常用和最优的是透明玻璃圆片。承载片使用前应进行充分的清洗和灭菌处理，在需要的情况下，可以用合适的基质预处理，如多聚赖氨酸，明胶或者胶原等。
本发明方法中使用的多孔培养板可以是常规的能应用于细胞组织培养的普通24孔板，其孔最好是底面积在1～3平方厘米的平底圆孔。最常见的是标准的24孔平底细胞培养板，材质是玻璃或者塑料均可。标准规格为4X 6孔排列布，孔直径15.6mm，孔底面积1.9m2。
本发明方法中使用的湿度平衡液必须无菌，无毒。最好用无菌的磷酸盐缓冲液或蒸馏水，根据使用多孔培养板确定用量。多孔培养板孔间具有间隙(参见图8，图9)，在本发明中可用于添加湿度平衡液，一般的标准24孔平底细胞培养板每个孔间间隙使用的湿度平衡液体积应大于200ul，最好是500ul。
本发明方法中使用的胚胎肺来源为一般实验用的小鼠的胚胎。实验小鼠胚胎肺可以为胚胎期10～13天的肺原基(肺原基是本领域发育早期的胚胎肺的一种叫法，一般包括从食管分支出的气管和肺叶)。而每个承载片上最好仅培养1个小鼠胚胎肺。胚胎肺最好平放，即按横切面水平放置于承载片中央以便肺原基能发育成形态良好形态。而培养基加入后是使胚胎肺处于培养基和空气的液-气交界面，本领域的这种描述是指培养基不能完全淹没胚胎肺，但也不能使其直接暴露在空气中，而是要使其在上表面形成一层培养基的液膜，这就称之为处于培养基和空气的液-气交界面。
在获取胚胎肺时，一定要保证手术中胚胎肺的完整性(不要破坏胚胎肺气管分支，以免出现肺发育形态异常)。
本发明方法中使用培养基可为本领域通用的各种细胞培养基，比如dulbecco’s modifi edeagle’s medium(DMEM，通用的培养基，如商家Invitrogen货号11965的产品，或也可参考网上公开的：http://baike.baidu.com/view/3501452.htm记载的DMEM(H)细胞培养基(粉末型)成分配制)或者Eagle’s minimal essential medium(EMEM，通用的培养基，配方公知。然后在选择的培养基中加入体积分数为5-20％的FBS(胎牛血清)或者F12营养因子(Invitrogen公司产品，品名：营养因子混合物，货号：21700)，一般还可添加按终浓度0.1mg/ml添加抗生素penicillin和streptomycin(青霉素和链霉素)防止污染。
本发明方法中的培养条件为通用细胞培养条件。一般温度为36℃～38℃；最好在37℃下，体积分数为5％二氧化碳的环境中培养。
本发明方法中使用的培养基可每隔24～48小时，去掉旧培养基并加入等体积新培养基继续培养。还可以采用的优选的换液方式是采用半量递增的方式换液，即每次换液时保留上次培养基体积的一半在原培养孔中，然后将比上次培养基体积的一半还按体积分数多增加4％-16％的新鲜培养基加入培养孔。优选多增加培养基体积一半的8％-13％，最优为11％。若用标准24孔平底细胞培养板时，培养基体积可用每孔150-200ul，最佳的体积应为每孔180ul。换培养基时将比上次培养基体积的一半多5～15ul的新鲜培养基加入培养孔。优选8～12ul，最佳为10ul。
实施例一：使用本发明方法培养Balb/c小鼠胚胎期11.5天肺。
1、准备承载片：用直径12mm的玻璃圆盖片作为承载片，购买于海门市华凯实验玻璃仪器有限公司。首先，用蒸馏水配制体积分数为1％的盐酸溶液，在室温摇动清洗圆盖片一个小时。用蒸馏水清洗后，放入体积分数为70％的酒精溶液中，摇动清洗过夜。用10cm玻璃平皿盛放清洗后的圆盖片，沥干液体后放入高温蒸汽灭菌锅内，121℃灭菌40分钟。烘干后置于超净工作台备用。
2、组装培养装置：用无菌的镊子夹取处理好的圆盖片放置于无菌的24孔培养板的培养孔中。无菌的24孔培养板为购置于Costar(康宁公司，美国)的3524型组织培养板。
3、获得胚胎期11.5天小鼠肺：以受孕Balb/c母鼠，来源于四川大学华西医院基因工程小鼠中心SPF级(无特殊病原菌)动物房，检测到阴道栓当天记为E0.5天开始计算胚胎发育时间，在第E11.5天从动物饲养房取出孕鼠。引颈法处死孕鼠后，用酒精消毒孕鼠及解剖器械。取出小鼠胚胎后于冰上预冷的解剖液(1X PBS，HBSS或者DMEM)中解剖，体视镜下取出胚胎肺，用1mL吸头转移到装有培养基(DMEM+10％FBS)1.5ml的EP管中。
4、在超净工作台内，用1mL的移液器转移胚胎肺到培养孔，每孔一个。用移液器吸走培养孔中残余培养基并加入180ul培养基。用酒精灯高温灭菌尖镊子，待冷后调整胚胎肺至园盖片中部，并调整园盖片位置使得胚胎肺位于培养孔正中。培养体系的构建参见图3和图4的示意图。
5、小心将种好的胚胎肺放置于细胞培养箱于37℃，5％CO2中培养24小时。
6、用移液器将培养孔中保留原培养基90ul，并丢弃剩余培养基。
7、加入90+10ul的新鲜培养基到培养孔，混匀后于细胞培养箱中培养。
8、培养24小时后，然后同步骤6和7进行半量递增换液：留95ul原培养基+105ul新培养基。
9、每隔24小时换液。更换培养基体积方案如图7所示。
10、培养10天效果(见附图5)。
图5显示的是小鼠胚胎期12.5天的胚胎进行培养十天的生长情况。培养胚胎肺的时间可超过10天，且肺气管分支充分的分支并展开，获得了很好的形态。
图6为视频截图显示在胚胎肺培养的第五天，此后肺部支气管平滑肌出现有节律的收缩运动，其中箭头所指示的部位为运动幅度相当明显的部位，分别位于肺部大支气管和两个肺叶小的气管分支。说明培养肾脏接近体内情况，有一定的高级生理功能。
经多次试验，利用上述方法使用E12.5天的胚胎肺进行体外培养几乎是100％成功率，采用1个孔1个胚胎肺的方式，24孔平板所有孔可培养24个，最佳是使用8个内圈的孔进行培养。24孔板(13cmX8.5cmX2.5cm)培养24个胚胎肺。即约11立方厘米空间1个肺，而现有技术最小是一般3.5cmX3.5cmX2.5cm养一个，即约31立方厘米空间1个肺，另外本方案24个肺的培养在一起可联合起来作为相同环境的严格控制的操作，生长一致性更好，也更便于实现大规模药物筛选。

Claims (9)

1.哺乳动物胚胎肺的体外器官培养方法，其特征在于包括以下步骤：
a、在多孔培养板的培养孔中放入尺寸与之适配的承载片，在培养孔底部构建出培养空间；
b、将取得的哺乳动物胚胎肺放置于承载片上，加入培养基，使胚胎肺处于培养基和空气的液-气交界面；
c、36℃～38℃培养箱中培养，然后每1到2天进行培养基换液。
2.根据权利要求1所述的哺乳动物胚胎肺的体外器官培养方法，其特征在于：步骤a所述的多孔培养板为标准的24孔培养板。
3.根据权利要求1所述的哺乳动物胚胎肺的体外器官培养方法，其特征在于：在使用多孔培养板的各孔间隙加入湿度平衡液，以减缓培养基挥发。
4.根据权利要求1所述的哺乳动物胚胎肺的体外器官培养方法，其特征在于：步骤b中加入培养基后调整承载片于培养孔的底部的中心，哺乳动物胚胎肺位于承载片的中部。
5.根据权利要求1所述的哺乳动物胚胎肺的体外器官培养方法，其特征在于：步骤c中所述的培养基采用半量递增的方式换液，即每次换液时保留上次培养基体积的一半在原培养孔中，然后将比上次培养基体积的一半按体积分数还多增加4％-16％的新鲜培养基加入培养孔。
6.根据权利要求1所述的哺乳动物胚胎肺的体外器官培养方法，其特征在于：步骤a所述的承载片为透明玻璃圆片。
7.根据权利要求1所述的哺乳动物胚胎肺的体外器官培养方法，其特征在于：所述湿度平衡液为无菌的磷酸盐缓冲液或蒸馏水。
8.根据权利要求1所述的哺乳动物胚胎肺的体外器官培养方法，其特征在于：所述胚胎肺为分离的胚胎期10～13天的小鼠胚胎肺。
9.根据权利要求1所述的哺乳动物胚胎肺的体外器官培养方法，其特征在于：将胚胎肺平放。
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