CN102388064A - 用于筛选与使用拮抗孢子-表面交互作用的化合物的组合物与方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供编码介导微生物孢子附着于表面的新颖微生物蛋白质的基因(亦即例如孢子外膜基因及蛋白质)。所述微生物孢子蛋白质的特定片段可用于抑制微生物孢子附着于表面，从而提供感染控制剂。本发明提供包含编码孢子外膜蛋白质的基因的重组表达载体以及含有所述表达载体的宿主细胞。本文进一步提供鉴别包含抑制细菌孢子附着于身体组织或固体表面的孢子外膜蛋白质的感染控制组合物的筛选方法。另外，本发明提供孢子外膜蛋白质表达的核酸抑制剂的用途，其通过与编码孢子外膜蛋白质的核酸序列以及与孢子外膜mRNA杂交。本发明进一步描述对孢子外膜蛋白质具有亲和力的单克隆及多克隆抗体。
Description
技术领域
本发明是关于感染控制领域。特定言之，本发明是关于维持无菌条件、去除细菌污染和/或预防细菌暴露的组合物与方法。在一个具体实例中，本发明预期抑制微生物孢子与基质表面结合的感染控制组合物。举例而言，该抑制破坏和/或置换微生物孢子与基质表面的交互作用、附着和/或稳定。
背景技术
产孢细菌可能会造成污染，包括(但不限于)医院感染、食物腐败和/或食物传染疾病问题。随着最低限度加工的冷藏产品的制造变得更有效率且无菌，背景微生物区系被去除，且产孢生物体最终可能限制所述产品的储存期限。怀疑产孢细菌造成罐头食品、面包、真空包装肉、巴氏杀菌乳制品(pasteurizeddairy product)及果汁腐败。进入任何所述类型的产品的成分中高含量细菌孢子的存在可能会增加最终产品腐败的可能性。
在卫生保健环境中，产孢细菌时常引起感染，包括医院性腹泻、破伤风及坏疽。艰难梭菌(Clostridium difficile)为引起抗生素相关性腹泻及假膜性结肠炎的产孢厌氧细菌。最近出现的会导致发病率及死亡率增加的高度致病性流行菌株已进一步增强该医院病原体的重要性。预期降低医院工作人员与患者之间的感染传播会显著改善恢复时间，从而导致加快患者出院。自患者健康与社会成本观点看，此为有益的。虽然医疗界努力增加消毒剂的使用来阻止微生物传播，但患者感染及再感染的发生导致不必要的发病率及死亡率。
细菌形成孢子，所述孢子在发芽之前可以休眠形式(dormant form)在宿主细胞中驻留数十年且可能造成与食品工业相关的出乎意料的污染或在医学实践中造成出乎意料的污染。此外，细菌孢子内壁对皮肤及表面消毒剂有抗性，且因此当前抗微生物措施大多无效。对筛选消除和/或阻止微生物孢子附着于宿主及后续宿主感染的感染控制组合物的方法存在需要。
发明内容
本发明是关于感染控制领域。特定言之，本发明是关于维持无菌条件、去除细菌污染和/或预防细菌暴露的组合物与方法。在一个具体实例中，本发明预期抑制微生物孢子与基质表面结合的感染控制组合物。举例而言，该抑制拮抗、破坏和/或置换微生物孢子与基质表面的交互作用、附着和/或稳定。
在一个具体实例中，本发明预期能够阻断和/或抑制微生物孢子与基质表面结合的感染控制组合物。在一个具体实例中，组合物包含有机小分子。在一个具体实例中，组合物包含蛋白质。在一个具体实例中，肽包含孢子表面肽。在一个具体实例中，肽来源于梭菌属(Clostridia)孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，梭菌属孢子表面蛋白质包含艰难梭菌(Clostridia difficile)孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，肽来源于芽孢杆菌属(Bacillus)孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，芽孢杆菌属孢子表面蛋白质包含炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，艰难梭菌孢子表面肽包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的同源物(homologue)。在一个具体实例中，孢子表面肽选自包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：15的群组。在一个具体实例中，组合物包含抗体。在一个具体实例中，抗体为多克隆抗体。在一个具体实例中，抗体为单克隆抗体。在一个具体实例中，组合物包含合成肽。在一个具体实例中，组合物包含无机离子复合物。在一个具体实例中，组合物包含蛋白质模拟物。在一个具体实例中，基质表面包含无生命表面。在一个具体实例中，包含有生命表面。在一个具体实例中，有生命表面包含身体组织表面。在一个具体实例中，身体组织表面包含上皮表面。在一个具体实例中，上皮表面包含哺乳动物皮肤表面。在一个具体实例中，无生命表面包含不锈钢。在一个具体实例中，无生命表面包含陶瓷。在一个具体实例中，无生命表面包含乙烯树脂(vinyl)。在一个具体实例中，无生命表面包含瓷砖。在一个具体实例中，组合物进一步包含至少一种抗微生物药物。在一个具体实例中，组合物进一步包含载剂。在一个具体实例中，载剂进一步包含清洁剂(detergent)。在一个具体实例中，载剂为无菌的且适于人类给药。在一个具体实例中，载剂包含抗微生物皮肤清洁剂(skin cleaner)。在一个具体实例中，皮肤清洁剂包含手洗清洁剂(handwash cleaner)。在一个具体实例中，载剂包含抗微生物表面清洁剂。
在一个具体实例中，本发明预期包含能够阻断和/或抑制微生物孢子与基质表面结合的氨基酸序列的感染控制组合物，其中该氨基酸序列与微生物孢子表面蛋白质具有实质同源性。在一个具体实例中，实质同源性包含约75％同源性，较佳85％同源性，且最佳90％或95％同源性。在一个具体实例中，表面蛋白质包含孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，孢子表面蛋白质为梭菌属孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，梭菌属孢子表面蛋白质为艰难梭菌(C.difficile)孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，孢子表面蛋白质为芽孢杆菌属孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，芽孢杆菌属孢子表面蛋白质为炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，孢子表面蛋白质包含孢子表面肽。在一个具体实例中，肽来源于梭菌属表面蛋白质。在一个具体实例中，梭菌属表面蛋白质包含艰难梭菌表面蛋白质。在一个具体实例中，肽来源于芽孢杆菌属表面蛋白质。在一个具体实例中，芽孢杆菌属表面蛋白质包含炭疽芽孢杆菌表面蛋白质。在一个具体实例中，艰难梭菌(Clostridia difficile)孢子表面肽包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的同源物。在一个具体实例中，孢子表面肽选自包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7及SEQ IDNO：15的群组。在一个具体实例中，氨基酸序列来源于孢子表面蛋白质的C末端。在一个具体实例中，氨基酸序列来源于孢子表面蛋白质的N末端。在一个具体实例中，组合物进一步包含载剂。在一个具体实例中，载剂包含清洁剂。在一个具体实例中，组合物进一步包含至少一种抗微生物药物。在一个具体实例中，载剂适于人类给药。在一个具体实例中，组合物进一步包含抗微生物皮肤清洁剂。在一个具体实例中，皮肤清洁剂为手洗清洁剂。在一个具体实例中，组合物进一步包含抗微生物表面清洁剂。在一个具体实例中，组合物进一步包含皮肤屏障(skin barrier)。在一个具体实例中，组合物进一步包含表面屏障(surface barrier)。
在一个具体实例中，本发明预期包含拮抗化合物的感染控制组合物，其中该化合物对微生物孢子表面蛋白质氨基酸序列具有亲和力。在一个具体实例中，该亲和力针对基质表面特异性结合位点区。在一个具体实例中，化合物包含抗体。在一个具体实例中，化合物包含有机小分子。在一个具体实例中，孢子表面蛋白质氨基酸序列包含肽片段。在一个具体实例中，肽片段来源于孢子表面蛋白质的C末端。在一个具体实例中，肽片段来源于孢子表面蛋白质的N末端。在一个具体实例中，孢子表面蛋白质为梭菌属孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，梭菌属孢子表面蛋白质为艰难梭菌孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，孢子表面蛋白质为芽孢杆菌属孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，芽孢杆菌属孢子表面蛋白质为炭疽芽孢杆菌孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，组合物进一步包含至少一种抗微生物药物。在一个具体实例中，组合物进一步包含载剂。在一个具体实例中，载剂适于人类给药。在一个具体实例中，组合物进一步包含抗微生物手部清洁剂。在一个具体实例中，组合物进一步包含抗微生物表面清洁剂。
在一个具体实例中，本发明预期方法，该方法包含：a)提供：i)处于暴露于微生物的风险中的个体，其中该暴露可能导致微生物感染；及ii)感染控制组合物；b)在微生物暴露之前在使得形成微生物感染屏障的条件下向个体给予组合物。在一个具体实例中，微生物感染屏障减少微生物感染。在一个具体实例中，微生物感染屏障阻止微生物感染。在一个具体实例中，微生物包含细菌。在一个具体实例中，细菌选自包含梭菌属(Clostridia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum)、芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus)、芽孢八叠球菌属(Sporosarcina)或高温放线菌属(Thermoactinomyces)的群组。在一个具体实例中，细菌包含细菌孢子。在一个具体实例中，细菌孢子包含至少一种孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，梭菌属孢子表面蛋白质为艰难梭菌孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，芽孢杆菌属孢子表面蛋白质为炭疽芽孢杆菌孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，感染控制组合物包含氨基酸序列。在一个具体实例中，氨基酸序列来源于微生物孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，氨基酸序列与微生物孢子表面蛋白质具有实质同源性。在一个具体实例中，感染控制组合物包含能够抑制、拮抗、破坏、置换和/或阻断微生物孢子与基质表面的结合。在一个具体实例中，感染控制组合物进一步包含拮抗化合物，其中该化合物对微生物孢子表面蛋白质氨基酸序列具有亲和力。在一个具体实例中，组合物进一步包含载剂。在一个具体实例中，感染控制组合物进一步包含至少一种抗微生物药物。在一个具体实例中，处于风险中的个体为卫生保健工作人员。在一个具体实例中，处于风险中的个体为医疗第一反应者(medical first responder)。在一个具体实例中，处于风险中的个体为医疗患者。在一个具体实例中，患者处于卫生保健环境中。在一个具体实例中，已对医疗患者给予至少一种抗生素。在一个具体实例中，处于风险中的个体为消防员。在一个具体实例中，处于风险中的个体为警察。在一个具体实例中，处于风险中的个体为军事人员。在一个具体实例中，处于风险中的个体为食物操作员(food handler)。在一个具体实例中，处于风险中的个体为无生命表面和/或物体。在一个具体实例中，给药选自包含局部给药、经口给药、肠胃外给药、肺部给药、肛门给药、阴道给药、经眼给药或鼻内的群组。
在一个具体实例中，本发明预期方法，该方法包含：a)提供：i)已暴露于微生物的个体，其中该暴露导致微生物感染；ii)感染控制组合物；b)在微生物暴露之后在使得微生物感染减少的条件下向个体给予组合物。在一个具体实例中，微生物包含细菌。在一个具体实例中，细菌选自包含梭菌属、芽孢杆菌属、脱硫肠状菌属、芽孢乳杆菌属、芽孢八叠球菌属或高温放线菌属的群组。在一个具体实例中，细菌包含细菌孢子。在一个具体实例中，细菌孢子包含至少一种孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，梭菌属孢子表面蛋白质为艰难梭菌孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，芽孢杆菌属孢子表面蛋白质为炭疽芽孢杆菌孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，感染控制组合物包含氨基酸序列。在一个具体实例中，氨基酸序列来源于微生物孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，氨基酸序列与微生物孢子表面蛋白质具有实质同源性。在一个具体实例中，感染控制组合物能够抑制、拮抗、破坏、置换和/或阻断微生物孢子与基质表面的结合。在一个具体实例中，感染控制组合物进一步包含拮抗化合物，其中该化合物对微生物孢子表面蛋白质氨基酸序列具有亲和力。在一个具体实例中，组合物进一步包含载剂。在一个具体实例中，感染控制组合物进一步包含至少一种抗微生物药物。在一个具体实例中，暴露的个体为卫生保健工作人员。在一个具体实例中，暴露的个体为医疗第一反应者。在一个具体实例中，暴露的个体为消防员。在一个具体实例中，暴露的个体为警察。在一个具体实例中，暴露的个体为军事人员。在一个具体实例中，给药选自包含局部给药、经口给药、肠胃外给药、肺部给药、肛门给药、阴道给药、经眼给药或鼻内给药的群组。在一个具体实例中，暴露的个体为无生命表面和/或物体。
在一个具体实例中，本发明预期筛选方法，该方法包含：a)提供：i)经分离的肽，其中该肽来源于微生物孢子表面蛋白质；及ii)怀疑与肽具有交互作用的感染控制测试化合物；b)使肽与感染控制测试化合物接触；及c)检测肽与感染控制测试化合物的交互作用。在一个具体实例中，该方法进一步包含能够附着经分离的肽的基质。在一个具体实例中，基质表面包含猪皮。在一个具体实例中，肽来源于梭菌属孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，梭菌属孢子表面蛋白质包含艰难梭菌孢子外膜。在一个具体实例中，肽来源于芽孢杆菌属孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，芽孢杆菌属孢子外膜包含炭疽芽孢杆菌孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，肽包含孢子表面肽。在一个具体实例中，艰难梭菌孢子表面肽包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的同源物。在一个具体实例中，孢子表面肽选自包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：7及SEQ ID NO：15的群组。在一个具体实例中，感染控制测试化合物包含有机小分子。在一个具体实例中，感染控制测试化合物包含合成肽。在一个具体实例中，感染控制测试化合物包含蛋白质模拟物。在一个具体实例中，感染控制测试化合物包含抗体。
在一个具体实例中，本发明预期方法，该方法包含：a)提供：i)经分离的经标记微生物孢子表面肽，其中该肽产生第一荧光强度模式(pattern)；及ii)能够与该肽交互作用的感染控制测试化合物；b)使该肽与该化合物接触以产生具有第二荧光强度模式的接触肽；c)比较该第一荧光强度模式与该第二荧光强度模式。在一个具体实例中，该方法进一步包含步骤d)检测第一强度模式与第二强度模式之间的差异。在一个具体实例中，该差异表示该化合物结合该肽。在一个具体实例中，肽来源于细菌孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，细菌孢子表面蛋白质来源于梭菌属孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，梭菌属孢子表面蛋白质包含艰难梭菌孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，细菌孢子表面蛋白质来源于芽孢杆菌属孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，芽孢杆菌属孢子表面蛋白质包含炭疽芽孢杆菌孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，孢子表面蛋白质包含肽片段。在一个具体实例中，肽选自包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9的群组。在一个具体实例中，标记选自由4′-6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、苯氨基萘磺酸酯(ANS)、双-ANS(双-苯氨基萘磺酸酯)、N-苯基-1-萘(NPN)、钌红(ruthenium red)、甲酚紫(cresol violet)及4-(二氰基乙烯基)久洛尼定(4-(dicyanovinyl)julolidine，DCVJ)组成的群组。
在一个具体实例中，本发明预期筛选化合物的方法，该方法包含：a)提供：i)包含重组表达载体的细菌，其中该载体包含孢子表面寡核苷酸序列的至少一部分；及ii)怀疑具感染控制活性的化合物；b)表达该载体以使孢子表面蛋白质呈现于细菌膜上；c)使该细菌与该化合物接触；及d)检测该化合物的感染控制活性。在一个具体实例中，感染控制活性包含形成该化合物与该所呈现蛋白质的结合对。在一个具体实例中，寡核苷酸序列包含SEQ ID NO：2。在一个具体实例中，寡核苷酸序列选自包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：16的群组。在一个具体实例中，重组表达载体进一步包含融合序列，其中该融合序列包含报导序列。在一个具体实例中，报导序列为β-半乳糖苷酶序列。
在一个具体实例中，本发明预期检测样品中编码微生物孢子表面蛋白质基因的至少一部分的多核苷酸序列存在的方法，该方法包含：a)提供：i)SEQID NO：2的至少一部分；及ii)怀疑含有孢子表面寡核苷酸序列的样品；b)在使得在SEQ ID NO：2部分与孢子表面寡核苷酸序列之间形成杂交复合物的条件下合并SEQ ID NO：2部分与样品；及c)检测杂交复合物。在一个具体实例中，孢子表面寡核苷酸来源于微生物孢子。在一个具体实例中，孢子来源于梭菌属物种。在一个具体实例中，孢子来源于芽孢杆菌属物种。在一个具体实例中，寡核苷酸序列为RNA。在一个具体实例中，寡核苷酸序列为DNA。
在一个具体实例中，本发明预期方法，该方法包含：提供感染控制组合物及包含细菌孢子的基质表面；将组合物施用于该表面，其中自表面移除至少50％、较佳60％、更佳70％、甚至更佳80％、最佳90％或100％的孢子。在一个具体实例中，表面可选自由皮肤、身体组织、无机表面(亦即例如不锈钢、花岗岩、塑料、瓷砖、陶瓷等)、手套、实验服或医疗仪器组成的群组。
在一个具体实例中，本发明预期方法，该方法包含：提供感染控制组合物及处于高细菌孢子结合风险的基质表面；将组合物施用于该表面，其中阻止至少50％、较佳60％、更佳70％、甚至更佳80％、最佳90％或100％的细菌孢子结合。在一个具体实例中，表面可选自由皮肤、身体组织、无机表面(亦即例如不锈钢、花岗岩、塑料、瓷砖、陶瓷等)或医疗仪器组成的群组。
在一个具体实例中，本发明预期筛选与微生物孢子蛋白质结合的多种感染控制组合物的方法，该方法包含：a)提供包含载有该微生物孢子蛋白质的珠粒的层析柱；b)在使得至少一种该感染控制组合物与该珠粒形成结合对的条件下使该多种感染控制组合物与该珠粒接触；c)自该珠粒可控性释放该至少一种结合的感染控制组合物；d)检测该至少一种结合的感染控制组合物。在一个具体实例中，该结合对包含微生物孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，检测至少一种结合的感染控制组合物包含产生荧光信号。在一个具体实例中，检测至少一种结合的感染控制组合物包含形成酶-基质产物。在一个具体实例中，可控性释放步骤包含使珠粒暴露于释放剂。在一个具体实例中，释放剂选自由光、酸及碱组成的群组。
在一个具体实例中，本发明预期包含蛋白质模拟化合物及载剂的感染控制组合物，其中该蛋白质模拟化合物在基质表面上具有第一特异性结合位点模式，其中该第一结合模式与氨基酸序列的第二特异性结合位点模式具有至少50％一致性，较佳60％一致性，更佳70％一致性，甚至更佳80％一致性，最佳90％一致性或100％一致性，其中该序列与微生物孢子表面蛋白质具有实质同源性。在一个具体实例中，蛋白质模拟化合物包含有机小分子。在一个具体实例中，蛋白质模拟化合物包含合成肽。在一个具体实例中，蛋白质模拟化合物包含无机离子复合物。在一个具体实例中，表面蛋白质包含孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，微生物孢子表面蛋白质来源于梭菌属孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，梭菌属孢子表面蛋白质为艰难梭菌孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，孢子表面蛋白质来源于芽孢杆菌属孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，芽孢杆菌属孢子表面蛋白质为炭疽芽孢杆菌孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，氨基酸序列来源于微生物孢子表面蛋白质的C末端。在一个具体实例中，氨基酸序列来源于微生物孢子表面蛋白质的N末端。在一个具体实例中，基质表面包含有生命表面。在一个具体实例中，基质表面包含无生命表面。在一个具体实例中，有生命表面包含身体组织表面。在一个具体实例中，身体组织表面包含哺乳动物皮肤表面。在一个具体实例中，无生命表面包含不锈钢。在一个具体实例中，无生命表面包含陶瓷。在一个具体实例中，无生命表面包含乙烯树脂。在一个具体实例中，无生命表面包含瓷砖。在一个具体实例中，载剂包含清洁剂。在一个具体实例中，组合物进一步包含至少一种抗微生物药物。在一个具体实例中，载剂为无菌的且适于人类给药。在一个具体实例中，组合物进一步包含抗微生物皮肤清洁剂。在一个具体实例中，组合物进一步包含抗微生物表面清洁剂。
定义
如本文所使用的术语“医药上(pharmaceutically)”或“药理上可接受(pharmacologically acceptable)”指当向动物或人类给药时不产生不利、过敏性或其它不良反应的分子实体及组合物。
如本文所使用的术语“医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptablecarrier)”包括任何及所有溶剂或分散介质，包括(但不限于)水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液态聚乙二醇及其类似物)、其适合混合物、及植物油、涂料、等张剂及吸收延迟剂、脂质体、商业上可获得的清洁剂及其类似物。亦可向所述载剂中并入补充生物活性成分。
如本文所使用的术语“经纯化的(purified)”或“经分离的(isolated)”可指肽组合物，其已经受处理(亦即例如分级分离)而移除各种其它组分，且该组合物实质上保留其所表达的生物活性。当使用术语“实质上经纯化的(substantially purified)”时，该表述将指其中的蛋白质或肽构成组合物的主要组分，诸如构成组合物的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多(亦即例如重量/重量和/或重量/体积)的组合物。使用术语“纯化至均质(purified to homogeneity)”来包括已经纯化至“表观均质性(apparenthomogeneity)”以致仅存在单一蛋白质种类(亦即例如基于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或高效液相色谱(HPLC)分析)的组合物。经纯化的组合物不欲意谓可能余留一些微量杂质。
如本文所使用的术语“实质上经纯化的”是指分子(核酸或氨基酸序列)，其自其天然环境中移出、分离或分开，且无至少60％、较佳75％且更佳90％的与其天然缔合的其它组分掺杂。因此，“经分离的多核苷酸”为实质上经纯化的多核苷酸。
如本文所使用的“核酸序列”及“核苷酸序列”是指寡核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，且指基因组或合成来源的DNA或RNA，其可为单链或双链且表示正义链或反义链。
如本文所使用的术语“经分离的核酸”是指已自天然状态移出的任何核酸分子(例如自细胞移出且在一个较佳具体实例中，不含其它基因组核酸)。
如本文所使用的术语“功能等效密码子(functionally equivalent codon)”是指编码相同氨基酸的不同密码子。该现象通常称为遗传密码的“简并性(degeneracy)”。举例而言，6个不同密码子编码氨基酸精氨酸。
如本文所使用的术语“氨基酸序列”及“多肽序列”可互换且指氨基酸的序列。
如本文所使用的术语“孢子表面蛋白质”是指来源于任何细菌孢子外膜蛋白质或与任何细菌孢子外膜蛋白质具有实质相似性(亦即同源)的任何蛋白质或肽片段。认为微生物孢子表面蛋白质负责使微生物孢子附着及固定于无生命和/或有生命表面直至条件足以诱导发芽。
如本文所使用的术语“来源于”是指化合物或序列的来源。在一个方面中，化合物或序列可来源于生物体或特定物种。在另一方面中，化合物或序列可来源于较大复合物或序列。
如本文所使用的“BclA”或“BclA多肽”或“BclA蛋白质”或“BclA同源物”可互换使用来指自任何物种、尤其细菌物种(包括革兰氏阴性细菌(gram negative bacteria)、革兰氏阳性细菌(gram positive bacteria)、好氧细菌及厌氧细菌)获得及自任何来源(不论天然、合成、半合成或重组)获得的实质上经纯化的芽孢杆菌属样(Bacillus-like)蛋白质的氨基酸序列。举例而言，艰难梭菌BclA同源物将具有与炭疽芽孢杆菌BclA肽相同的功能及活性。
蛋白质的“变异体(variant)”定义为与多肽序列(亦即例如SEQ ID NO：1)或该多肽序列的任何同源物相差一或多个氨基酸的氨基酸序列。变异体可能具有“保守性(conservative)”变化，其中经取代的氨基酸具有类似结构或化学性质，例如亮氨酸经异亮氨酸置换。较少见的是，变异体可能具有“非保守性(nonconservative)”变化，例如甘氨酸经色氨酸置换。类似的微小变异亦可包括氨基酸缺失或插入(亦即添加)或两者。可使用计算机程序(包括但不限于DNAStar
软件)发现确定哪些及多少氨基酸残基可经取代、插入或缺失而不彻底破坏生物或免疫活性的指导原则。
核苷酸的“变异体”定义为与参考寡核苷酸相比因具有缺失、插入及取代而不同的新颖核苷酸序列。所述不同可使用多种方法(例如测序、杂交检定等)检测。该定义内包括编码梭菌属孢子表面蛋白质的基因组DNA序列的改变(亦即例如通过能够与SEQ ID NO：2杂交的限制酶片段的模式的改变(限制性内切酶多型性(RFLP)分析)、使所选SEQ ID NO：2片段在高严格度条件下不能与基因组DNA样品杂交(例如使用等位基因特异性寡核苷酸探针)、及不适当或出乎意料的杂交，诸如与除梭菌属孢子表面基因的正常染色体基因座以外的基因座杂交(例如使用荧光原位杂交(FISH))。
“缺失”定义为核苷酸或氨基酸序列中分别缺少一或多个核苷酸或氨基酸残基的变化。
“插入”或“添加”为核苷酸或氨基酸序列中与例如天然存在的梭菌属孢子表面蛋白质相比分别导致添加一或多个核苷酸或氨基酸残基的变化。
“取代”由一或多个核苷酸或氨基酸分别经不同核苷酸或氨基酸置换而引起。
如本文所使用的术语“衍生物”是指核酸或氨基酸的任何化学修饰。所述修饰的例证可为用烷基、酰基或氨基置换氢。举例而言，核酸衍生物将编码保留基本生物学特征的多肽。
如本文所使用的术语“部分”当提及蛋白质(如“指定蛋白质的部分”)时是指该蛋白质的片段。片段的大小可在四个氨基酸残基至整个氨基酸序列减去一个氨基酸范围内。举例而言，“包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的至少一部分”的蛋白质涵盖全长梭菌属孢子表面蛋白质及其含四(4)个或更多个氨基酸的片段。
术语“部分”当提及核苷酸序列使用时是指该核苷酸序列的片段。所述片段的大小可在5个核苷酸残基至整个核苷酸序列减去一个核酸残基范围内。
术语“生物活性”指任何具结构、调控或生物化学功能的分子。举例而言，可例如通过恢复缺乏孢子表面蛋白质活性的细胞(亦即例如孢子表面蛋白质裸细胞(null cell)和/或“敲除(knock out)”细胞)的野生型生长来测定孢子表面蛋白质生物活性。缺乏孢子表面蛋白质活性的细胞可利用许多方法(亦即例如点突变及移码突变(frame-shift mutation))产生。通过用表达孢子表面蛋白质、其衍生物或其部分的表达载体转染缺乏孢子表面蛋白质活性的细胞来达成互补。
术语“免疫活性(immunologically active)”定义天然、重组或合成肽(亦即例如孢子表面蛋白质)或其任何寡肽在适当动物或细胞中诱导特异性免疫反应和/或与特异性抗体结合的能力。
如本文所使用的术语“抗原性决定子(antigenic determinant)”是指分子中由特定抗体识别的部分(亦即抗原决定基)。当使用蛋白质或蛋白质片段免疫宿主动物时，蛋白质的许多区域可诱导产生与蛋白质上的指定区域或三维结构特异性结合的抗体；所述区域或结构称为抗原性决定子。抗原性决定子可与完整抗原(亦即用于引发免疫反应的免疫原)竞争以结合抗体。
术语“免疫原”、“抗原”、“免疫原性”及“抗原性”是指当引入动物中时能够产生抗体的任何物质。根据定义，免疫原必须含有至少一个抗原决定基(能够引起免疫反应的特定生物化学单元)，且一般含有更多。虽然最常使用蛋白质作为免疫原，但与蛋白质复合的脂质及核酸部分亦可充当免疫原。当具有少数抗原决定基的较小分子本身不能激发令人满意的免疫反应时，后者复合物通常适用。
术语“抗体”是指免疫原(抗原)在动物中引起的免疫球蛋白。希望抗体显示针对免疫原中所含的抗原决定基的特异性。术语“多克隆抗体”是指由单个以上浆细胞纯系产生的免疫球蛋白质；相比之下，“单克隆抗体”是指由单个浆细胞纯系产生的免疫球蛋白。
术语“特异性结合(specific binding)或(specifically binding)”当提及抗体与蛋白质或肽的交互作用使用时，意谓交互作用视蛋白质上特定结构(亦即例如抗原性决定子或抗原决定基)的存在而定；换言之，抗体识别及结合特定蛋白质结构而非一般蛋白质。举例而言，若抗体对抗原决定基“A”具有特异性，则在含经标记“A”及该抗体的反应中含抗原决定基A的蛋白质(或自由的未经标记的A)的存在将减少与该抗体结合的经标记A的量。
如本文所使用的术语“重组DNA分子”是指包含借助于分子生物学技术连接在一起的DNA区段的DNA分子。
如本文所使用的术语“重组蛋白质”或“重组多肽”是指使用重组DNA分子表达的蛋白质分子。
如本文所使用的术语“载体(vector)”及“运载体(vehicle)”当提及将DNA区段自一个细胞转移至另一个细胞的核酸分子时，可互换使用。
如本文所使用的术语“表达载体”或“表达盒(expression cassette)”是指含有所要编码序列及在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所必需的适当核酸序列的重组DNA分子。在原核生物中表达所必需的核酸序列通常包括启动子(promoter)、操纵子(operator)(视情况)及核糖体结合位点，通常同时存在其它序列。已知真核生物细胞使用启动子、增强子(enhancer)及终止与聚腺苷酸化信号。
如本文所使用的术语“可操作合并”、“可操作顺序”及“可操作地连接”是指核酸序列以使得产生能够指导指定基因转录和/或所要蛋白质分子合成的核酸分子的方式连接。该术语亦指氨基酸序列以使得产生功能性蛋白质的方式连接。
如本文所使用的术语“转染”是指将外源DNA引入细胞中。转染可通过此项技术已知的多种方式达成，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺(polybrene)介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质体转染(lipofection)、原生质体融合、反转录病毒感染、基因枪法(biolistics)(亦即粒子轰击)及其类似方式。
如本文所使用的术语“互补”或“互补性”用于指根据碱基配对规则而相关的“多核苷酸”及“寡核苷酸”(所述术语可互换，指核苷酸序列)。举例而言，序列“C-A-G-T”与序列“G-T-C-A”互补。互补性可为“部分”或“整体”。“部分”互补性系根据碱基配对规则，一或多个核酸碱基不匹配。核酸之间的“整体”或“完全”互补性系于碱基配对规则下，每个核酸碱基均与另一碱基匹配。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间的杂交效率及强度具有显著影响。此在扩增反应以及依赖于核酸之间的结合的检测方法中尤其重要。
本文所使用的术语“同源性(homology)”及“同源(homologous)”在提及核苷酸序列时是指与其它核苷酸序列的互补性程度。可能存在部分同源性或完全同源性(亦即一致性)。与核酸序列部分互补(亦即“实质上同源”)的核苷酸序列为至少部分抑制完全互补序列与目标核酸序列杂交的核苷酸序列。对完全互补序列与目标序列杂交的抑制可在低严格度条件下使用杂交检定(DNA印迹(Southern blot)或RNA印迹(Northern blot)、溶液杂交及其类似方法)检查。实质上同源的序列或探针将在低严格度条件下与完全同源的序列竞争与目标序列的结合(亦即杂交)且抑制完全同源的序列与目标序列的结合(亦即杂交)。此并不意谓低严格度条件为以致允许非特异性结合；低严格度条件要求两个序列彼此间的结合为特异性(亦即选择性)交互作用。可通过使用甚至缺乏部分程度的互补性(例如低于约30％的一致性)的第二目标序列来测试无非特异性结合存在；在无非特异性结合存在下，探针不会与第二非互补目标杂交。
如本文所使用的术语“同源性”及“同源”在提及氨基酸序列时是指两个氨基酸序列之间一级结构的一致性程度。该一致性程度可针对各氨基酸序列的部分或针对氨基酸序列的整个长度。两个或更多个“实质上同源”的氨基酸序列可具有至少50％一致性，较佳至少75％一致性，更佳至少85％一致性，最佳至少95％或100％一致性。
为梭菌属孢子表面蛋白质核酸序列(亦即例如SEQ ID NO：2)的“同源物”的寡核苷酸序列在本文中定义为当比较具有长度为100bp或更长的序列时，展现与SEQ ID NO：2序列的一致性大于或等于50％的寡核苷酸序列。或者，SEQ ID NO：2的同源物定义为编码生物活性梭菌属孢子表面蛋白质氨基酸序列的寡核苷酸序列。举例而言，梭菌属孢子表面蛋白质同源物可包含编码孢子表面蛋白质的寡核苷酸序列的部分。
低严格度条件包含与如下条件等效的条件：当使用长度为约500个核苷酸的探针时，在42℃下在由5×SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4·H2O及1.85g/l乙二胺四乙酸(EDTA)，pH值用NaOH调整至7.4)、0.1％SDS、5×邓哈特试剂(Denhardt′s reagent){每500ml 50×邓哈特试剂含有：5g菲柯尔(Ficoll)(Type 400，法玛西亚(Pharmacia))、5g牛血清清蛋白(BSA)(Fraction V；西格玛(Sigma))}及100μg/ml变性鲑鱼精子DNA组成的溶液中结合或杂交，接着在42℃下在包含5×SSPE、0.1％SDS的溶液中洗涤。亦可使用许多等效条件来包含低严格度条件；可改变因素来产生与以上所列的条件不同但等效的低严格度杂交条件，所述因素为诸如探针的长度及性质(DNA、RNA、碱基组成)及目标的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或为固定等)及盐及其它组分的浓度(例如是否存在甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇)以及杂交溶液的组分。另外，亦可使用在高严格度条件下(例如增加杂交和/或洗涤步骤的温度、在杂交溶液中使用甲酰胺等)促进杂交的条件。
如本文所使用的术语“杂交”用于指使用使核酸链与互补链经由碱基配对连接以形成杂交复合物的任何方法使互补核酸配对。杂交及杂交强度(亦即核酸之间的缔合强度)受以下因素影响：诸如核酸之间的互补性程度、所涉及条件的严格度、所形成杂交体(hybrid)的Tm及核酸内的G∶C比率。
如本文所使用的术语“杂交复合物”是指两个核酸序列之间通过在互补G与C碱基之间及互补A与T碱基之间形成氢键的功效所形成的复合物；所述氢键可经由碱基堆积交互作用而进一步稳定。两个互补核酸序列氢键呈反平行构形。杂交复合物可在溶液中形成(例如C0 t或R0 t分析)或在存在于溶液中的一个核酸序列与固定于固体支撑物(例如DNA印迹及RNA印迹、点印迹法中所采用的尼龙膜(nylon membrane)或硝化纤维素滤纸，或用于原位杂交包括FISH(荧光原位杂交)中所采用的玻璃载玻片)的另一核酸序列之间形成。
如本文所使用的术语“Tm”用于指“熔融温度(melting temperature)”。熔融温度为双链核酸分子群变成半分离成单链的温度。如标准参考文献所指示，当核酸处于1M NaCl水溶液中时，可由等式Tm＝81.5+0.41(G+C％)计算出Tm值的简单估算值。Anderson等人，“定量过滤杂交(Quantitative FilterHybridization)”In：核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)(1985)。更精准计算在计算Tm时考虑结构以及序列特征。
如本文所使用的术语“严格度”用于指执行核酸杂交的温度、离子强度及存在其它化合物(诸如有机溶剂)的条件。“严格度”典型地存在于约Tm至低于Tm约20℃至25℃的范围内。“严格杂交”可用于鉴别或检测相同多核苷酸序列或鉴别或检测类似或相关多核苷酸序列。举例而言，当SEQ ID NO：2的片段在严格条件下用于杂交反应中时，含独特序列(亦即不与SEQ ID NO：2同源或与SEQ ID NO：2的同源性或互补性小于约50％的区域)的SEQ ID NO：2的片段的杂交较好。或者，当使用“弱(weak)”或“低(low)”严格度条件时，来源于遗传上多样的生物体(亦即例如在所述生物体之间互补序列出现频率通常较低)的核酸可能发生杂交。
如本文所使用的术语“可扩增核酸”用于指可利用任何扩增方法扩增的核酸。预期“可扩增核酸”通常包含“样品模板”。
如本文所使用的术语“样品模板”是指来源于分析有兴趣的目标序列的存在的样品的核酸。相比之下，“背景模板”用于指样品中可能存在或可能不存在的除样品模板以外的核酸。背景模板最常被疏忽。其可能为留存物的结果，或其可能归因于存在本应设法自样品中纯化除去的核酸污染物。举例而言，来自生物体的除待检测核酸以外的核酸均可能存在作为测试样品中的背景。
“扩增(Amplification)”定义为产生核酸序列的额外复制体且一般使用聚合酶链反应进行。Dieffenbach C.W.及G.S.Dveksler(1995)，In：PCR引物(PCRPrimer)，实验室手册(a Laboratory Manual)，冷泉港出版社(Cold Spring HarborPress)，普莱恩维尤，纽约(Plainview，N.Y)。
如本文所使用的术语“聚合酶链反应”(“PCR”)是指K.B.Mullis美国专利案第4,683,195号及第4,683,202号的方法，所述专利以引用的方式并入本文中，所述专利描述不经克隆化或纯化而增加基因组DNA混合物中目标序列区段的浓度的方法。所要目标序列的所扩增区段的长度由两个寡核苷酸引物彼此间的相对位置决定，且因此该长度为可控制参数。根据方法的重复态样的功效，该方法称为“聚合酶链反应”(下文称为“PCR”)。因为目标序列的所要扩增区段成为混合物中的优势序列(就浓度而言)，所以称其为经“PCR扩增”。利用PCR，可将基因组DNA中特定目标序列的单个复制体扩增至可用数种不同方法(例如与经标记的探针杂交；并入经生物素标记的引物，接着检测抗生物素蛋白-酶共轭物；将经32P标记的三磷酸脱氧核苷酸(诸如dCTP或dATP)并入所扩增的区段中)检测的含量。除基因组DNA以外，任何寡核苷酸序列亦均可用适当引物分子组扩增。特定言之，PCR方法自身产生的扩增区段本身即为后续PCR扩增的有效模板。
如本文所使用的术语“引物(primer)”是指寡核苷酸(不论天然存在于经纯化的限制消化产物中或合成产生)，当将其置于诱导合成与核酸链互补的引物延长产物的条件(亦即在核苷酸及诸如DNA聚合酶的诱导剂存在下且在适合温度及pH值下)下时，其能够充当合成起点。虽然为达成扩增的最高效率，引物较佳为单链，但或者亦可为双链。若为双链，则在使用引物制备延长产物之前，首先将其处理以使其各链分离。引物较佳为寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在诱导剂存在下引发延长产物的合成。引物的确切长度将视许多因素而定，包括温度、引物来源及方法的使用。
如本文所使用的术语“探针”是指寡核苷酸(亦即核苷酸序列)(不论天然存在于经纯化限制的消化产物中或合成、重组或利用PCR扩增产生)，其能够与另一有兴趣的寡核苷酸杂交。探针可为单链或双链。探针适用于检测、鉴别及分离特定基因序列。预期本发明所使用的任何探针将经任何“报导分子”标记以便可在任何检测系统中检测，该检测系统包括(但不限于)酶(例如ELISA以及基于酶的组织化学检定)、荧光、放射性及发光系统。不希望本发明局限于任何特定检测系统或标记。
如本文所使用的术语“限制核酸内切酶(restriction endonuclease)”及“限制酶(restriction enzyme)”是指各自在特定核苷酸序列处或附近切割双链DNA的细菌酶。
认为DNA分子具有“5′末端(5′end)”及“3′末端(3′end)”，因为单核苷酸以使一个单核苷酸戊糖环的5′磷酸经由磷酸二酯键沿一个方向附着至其相邻单核苷酸戊糖环的3′氧的方式反应而得到寡核苷酸。因此，若寡核苷酸的5′磷酸未连接于单核苷酸戊糖环的3′氧，则寡核苷酸的该末端称为“5′末端”。若寡核苷酸的3′氧未连接于另一单核苷酸戊糖环的5′磷酸，则寡核苷酸的该末端称为“3′末端”。即使本文所使用的核酸序列位于较大寡核苷酸内部，亦可认为其具有5′末端及3′末端。在线性或环状DNA分子中，离散的组件(discreteelement)称为位于“上游(upstream)”或“下游(downstream)”的5′或3′组件。该术语反映转录沿DNA链以5′至3′的方式进行的事实。指导所连接基因的转录的启动子及增强子组件一般位于编码区的5′或上游。然而，增强子组件甚至在位于启动子组件及编码区的3′时，亦可发挥作用。转录终止及聚腺苷酸化信号位于编码区的3′或下游。
如本文所使用的术语“具有编码基因的核苷酸序列的寡核苷酸”意谓包含基因的编码区的核酸序列，亦即编码基因产物的核酸序列。编码区可以cDNA、基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA形式存在时，寡核苷酸可为单链(亦即正义链)或双链。若需要允许适当启始转录和/或正确处理初级RNA转录物，则可紧密接近基因的编码区放置适合的控制组件(诸如增强子/启动子、剪接点(splice junction)、聚腺苷酸化信号等)。或者，本发明表达载体中所用的编码区可含有内源性增强子/启动子、剪接点、介入序列(intervening sequence)、聚腺苷酸化信号等或内源性与外源性控制组件两者的组合。
如本文所使用的术语“调控组件(regulatory element)”是指控制核酸序列表达的一些方面的遗传组件。举例而言，启动子为促进可操作地连接的编码区转录启始的调控组件。其它调控组件为剪接信号、聚腺苷酸化信号、终止信号等。
真核生物中的转录控制信号包含“启动子”及“增强子”组件。启动子及增强子由与参与转录的细胞蛋白质特异性交互作用的DNA序列阵列(array)组成。Maniatis，T.等人，Science 236：1237(1987)。已自多种真核生物来源分离启动子及增强子组件，所述来源包括植物、酵母、昆虫及哺乳动物细胞及病毒的基因(原核生物中亦发现类似控制组件，亦即启动子)。特定启动子及增强子的选择视何种细胞类型用于表达有兴趣的蛋白质而定。
表达载体上存在“剪接信号(splicing signal)”通常导致较高程度的重组转录物的表达。剪接信号介导自初级RNA转录物移除内含子(intron)，且由剪接供体及受体位点组成。Sambrook，J.等人，分子克隆实验指南(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第2版，Cold Spring Harbor laboratory Press，New York(1989)第16.7-16.8页。常用剪接供体及受体位点为来自SV40的16SRNA的剪接点。
如本文所使用的术语“聚A位点(poly A site)”或“聚A序列(poly Asequence)”表示指导初生RNA转录物的终止与聚腺苷酸化的DNA序列。希望重组转录物有效聚腺苷酸化，因为缺乏聚A尾的转录物不稳定且快速降解。表达载体中所用的聚A信号可为“异源(heterologous)”或“内源(endogenous)”。内源聚A信号为天然发现于基因组中指定基因的编码区的3′末端者。异源聚A信号为自一个基因分离出来且置于另一基因的3′者。在真核生物细胞中有效表达重组DNA序列涉及表达指导所得转录物的有效终止及聚腺苷酸化的信号。转录终止信号一般可见于聚腺苷酸化信号的下游且长度为数百个核苷酸。
术语“转染(transfection或transfected)”是指将外源DNA引入细胞中。
如本文所使用的术语“编码……的核酸分子”、“编码……的DNA序列”及“编码……的DNA”是指沿脱氧核糖核酸链的脱氧核糖核苷酸的顺序或序列。所述脱氧核糖核苷酸的顺序决定沿多肽(蛋白质)链的氨基酸顺序。因此DNA序列编码氨基酸序列。
如本文所使用的术语“反义”用于指与特定RNA序列(例如mRNA)互补的RNA序列。反义RNA可通过任何方法产生，包括通过沿相反方向将有兴趣的基因剪接于允许合成编码链的病毒启动子来合成。一旦该所转录的链引入细胞中，其即与细胞产生的天然mRNA组合以形成双链。所述双链随后阻断mRNA的进一步转录或其转译。以此方式可产生突变表型。术语“反义链(antisense strand)”用于指与“正义”链互补的核酸链。符号(-)(亦即“负”)有时用于指反义链，而符号(+)有时用于指正义(亦即“正”)链。
术语“DNA印迹”是指在琼脂糖或丙烯酰胺凝胶上分析DNA以根据大小分级分离DNA，接着将DNA自凝胶转移至固体支撑物(诸如硝化纤维素或尼龙膜)并加以固定。随后用经标记的寡脱氧核糖核苷酸探针或DNA探针探测固定的DNA以检测与所用探针互补的DNA种类。在电泳之前，可用限制酶裂解DNA。电泳之后，在将DNA转移至固体支撑物之前或期间，可将DNA部分去嘌呤及变性。DNA印迹为分子生物学家的标准手段。J.Sambrook等人，(1989)In：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，NY，第9.31-9.58页。
如本文所使用的术语“RNA印迹”是指通过在琼脂糖凝胶上电泳RNA来分析RNA以根据大小分级分离RNA，接着将RNA自凝胶转移至固体支撑物(诸如硝化纤维素或尼龙膜)上。随后用经标记的寡脱氧核糖核苷酸探针或DNA探针探测固定的RNA以检测与所用探针互补的RNA种类。RNA印迹为分子生物学家的标准手段。J.Sambrook，J.等人，(1989)同上，第7.39-7.52页。
如本文所使用的术语“反向RNA印迹(reverse Northern blot)”是指通过在琼脂糖凝胶上电泳DNA来分析DNA以根据大小分级分离DNA，接着将经分级分离的DNA自凝胶转移至固体支撑物(诸如硝化纤维素或尼龙膜)上。随后用经标记的寡核糖核苷酸探针或RNA探针探测固定的DNA以检测与所用核糖探针互补的DNA种类。
如本文所使用的术语“编码区(coding region)”当提及结构基因使用时，是指编码由mRNA分子转译所产生的初生多肽中得到的氨基酸的核苷酸序列。编码区在真核生物中在5′侧以编码起始甲硫氨酸的核苷酸三联体“ATG”为边界，且在3′侧以三个表示终止密码子(亦即TAA、TAG、TGA)的三联体中的一个为边界。
如本文所使用的术语“结构基因”是指编码RNA或蛋白质的DNA序列。相比之下，“调控基因”为编码控制其它基因(例如转录因子)的表达的产物的结构基因。
如本文所使用的术语“基因(gene)”意谓脱氧核糖核苷酸序列，其包含结构基因的编码区且包括位在邻接编码区(在5′末端与3′末端相距任一末端约1kb的距离)的序列，使得基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区的5′且存在于mRNA上的序列称为5′非转译序列。位于编码区的3′或下游且存在于mRNA上的序列称为3′非转译序列。术语“基因”涵盖cDNA与基因的基因组形式。基因的基因组形式或纯系含有间杂有称为“内含子”或“介入区”或“介入序列”的非编码序列的编码区。内含子为转录成异质核RNA(heterogeneous nuclear RNA，hnRNA)的基因的区段；内含子可含有诸如增强子的调控组件。内含子自核或初级转录物中移除或“剪接出”；因此信使RNA(mRNA)转录物中不存在内含子。mRNA在转译期间用于指定初生多肽中氨基酸的序列或顺序。
除含有内含子以外，基因的基因组形式亦可包括位于存在于RNA转录物上的序列的5′与3′末端的序列。所述序列称为“侧接(flanking)”序列或区(所述侧接序列位于存在于mRNA转录物上的非转译序列的5′或3′)。5′侧接区可含有诸如启动子及增强子的调控序列，其控制或影响基因的转录。3′侧接区可含有指导转录终止、转录后裂解及聚腺苷酸化的序列。
如本文所使用的术语“样品”以其最广泛意义使用且包括环境及生物样品。环境样品包括来自诸如土壤及水的环境的物质。生物样品可为动物(包括人类)、流体(例如血液、血浆及血清)、固体(例如粪便)、组织、液态食品(例如牛乳)及固态食品(例如蔬菜)。怀疑含有编码孢子表面蛋白质的核酸的生物样品可包含细胞、组织提取物、体液、自细胞分离的染色体或染色体外组件、基因组DNA(于溶液中或结合于固体支撑物，诸如用于DNA印迹分析者)、RNA(于溶液中或结合于固体支撑物，诸如用于RNA印迹分析者)、cDNA(于溶液中或结合于固体支撑物)及其类似物。
术语“感染控制组合物”是指与无组合物存在下生物体(亦即例如微生物生物体，包括来源于微生物生物体的孢子)的生长速率相比，阻止和/或降低生物体的生长速率的任何化合物。感染控制组合物可为天然的(例如来源于微生物，诸如细菌、病毒、真菌、藻类、霉菌等)、合成的或重组的。感染控制组合物可为微生物孢子蛋白质和/或微生物孢子表面蛋白质的竞争性抑制剂。或者，感染控制组合物可与微生物孢子蛋白质和/或微生物孢子表面蛋白质形成稳定和/或短暂的结合对。“感染控制组合物”亦可包括抗细菌和/或抗微生物剂和/或药物(亦即例如抗生素)。因此，“感染控制活性”解释为意谓因向表面施用感染控制组合物所产生的对微生物生长的任何降低和/或阻止。
术语“抗细菌”及“抗微生物”可互换使用，指与无组合物存在下生物体的生长速率相比，阻止和/或降低生物体的生长速率的组合物。抗细菌和/或抗微生物组合物可具抑细菌性、杀细菌性、两者或两者均不。若抗细菌和/或抗微生物组合物在不影响受抑制细胞的生存力的情况下抑制细胞分裂，则其为抑细菌性。若抗细菌和/或抗微生物组合物引起细胞死亡，则其为杀细菌性。细胞死亡通常通过液体生长介质中不存在细胞生长(例如未出现混浊)或固体表面上不存在细胞生长(例如琼脂上无菌落形成)来检测。抗细菌和/或抗微生物组合物可有效降低病毒、霉菌及真菌的生长速率和/或引起其细胞死亡。在指定浓度下为抑细菌性的组合物在较高浓度下可能为杀细菌性，而其它某些抑细菌组合物在任何浓度下均不具杀细菌性。
术语“细菌(bacteria或bacterium)”是指所有原核生物体，包括属于原核生物界中所有门的原核生物体。意欲该术语涵盖所有视为细菌的微生物，包括(但不限于)梭菌属、芽孢杆菌属、支原体属(Mycoplasma)、衣原体属(Chlamydia)、放线菌属(Actinomyce)、链霉菌属(Streptomyce)及立克次体属(Rickettsia)。该定义内包括所有细菌形式，包括球菌、杆菌、螺旋体、球形质体、原生质体、孢子等。该术语亦包括为革兰氏阴性或革兰氏阳性的原核生物体。“革兰氏阴性”及“革兰氏阳性”是指采用革兰氏染色法(Gram-stainingprocess)获得的染色模式。Finegold及Martin，In：诊断微生物学(DiagnosticMicrobiology)，第6版(1982)，C.V.Mosby St.Louis，第13-15页。“革兰氏阳性细菌”为保留革兰氏染色中所使用的初染料的细菌，使得所染色的细胞在显微镜下呈现深蓝色至紫色。“革兰氏阴性细菌”不保留革兰氏染色中所使用的初染料，但经对比染色(counter stain)染色。因此，革兰氏阴性细菌呈现红色。
术语“测试试剂”是指待在本文所述的一种或多种检定中筛选的试剂。该试剂几乎可为任何化合物。其可呈单一经分离的化合物或可为化学(例如组合)库的成员。在一尤其较佳具体实例中，测试试剂将为有机小分子。
如本文所使用的术语“有机小分子(small organic molecule)”是指大小可与医药品中通常使用的有机分子相比的任何分子。该术语排除生物大分子(例如蛋白质、核酸等)。较佳有机小分子的大小在约10Da至约5000Da、更佳至2000Da且最佳至约1000Da范围内。
术语“标记”或“可检测标记”在本文中用于指可由光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法检测的任何组合物。所述标记包括可用经标记抗生蛋白链菌素(streptavidin)共轭物染色的生物素、磁性珠粒(例如Dynabeads
)、荧光染料(例如荧光素、得克萨斯红(texas red)、玫瑰红、绿色荧光蛋白质及其类似物)、放射性标记(例如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如辣根过氧化酶、碱性磷酸酶及酶联免疫吸附测定(ELISA)中常用的其它酶)，及热量标记，诸如胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠粒。教示使用所述标记的专利案包括(但不限于)美国专利案第3,817,837号、第3,850,752号、第3,939,350号、第3,996,345号、第4,277,437号、第4,275,149号及第4,366,241号(所有均以引用的方式并入本文中)。本发明中所预期的标记可利用许多方法检测。举例而言，可使用照相胶片或闪烁计数器检测放射性标记，可使用光检测器检测发射光来检测荧光标志。典型地通过提供酶及基质并检测在酶对基质的作用下所产生的反应产物来检测酶标记，而通过简单观测着色标记来检测热量标记。
如本文所使用的术语“主要界面活性剂(primary surfactant)”意谓作用于经取代酚或与经取代酚一起作用以进一步增强或至少不显著降低经取代酚的感染控制活性的任何界面活性剂。
如本文所使用的术语“抑制”、“破坏”、“置换”、“拮抗”或“阻断”是指自基质表面移除微生物孢子和/或微生物孢子表面蛋白质和/或阻止微生物孢子和/或微生物孢子表面蛋白质附着于基质表面的任何方式。
如本文所使用的术语“拮抗剂”是指能够阻止微生物(亦即例如细菌、病毒、霉菌、真菌等)和/或微生物的生殖组分(亦即例如孢子)附着于表面的任何化合物。“拮抗剂”可通过竞争性置换微生物和/或微生物的生殖组分或与的形成结合对(亦即例如稳定的或短暂的)来阻止附着。举例而言，拮抗剂可通过与孢子表面蛋白质结合来阻止细菌孢子附着于表面。
如本文所使用的术语“结合拮抗剂”是指能够与微生物孢子绒毛层蛋白质(亦即例如梭菌属孢子表面蛋白质)或基质表面形成结合对的任何化合物。结合对的形成阻止和/或置换微生物孢子附着于基质表面。
如本文所使用的术语“基质表面”是指包含供微生物孢子表面蛋白质附着的结合位点的任何材料。基质表面可包括(但不限于)有生命表面和/或无生命表面。
如本文所使用的术语“无生命表面”是指任何非活着的材料。举例而言，无生命表面可包括(但不限于)乙烯树脂、不锈钢、塑料、木料、陶瓷、玻璃、铬、瓷砖等。通常遇到的所述表面包括(但不限于)工作台面、椅子、桌子、手术设备、医疗装置、地面、墙壁、窗户、水槽、柜等。
如本文所使用的术语“有生命表面”指任何活的材料。举例而言，有生命表面可包括(但不限于)表皮表面、黏膜上皮组织表面和/或内脏表面。如本文所使用的术语“有生命表面”亦包含植物表面，包括(但不限于)水果表面(亦即例如草莓、苹果、甜橙、柑橘等)、蔬菜表面(茄子、南瓜、西红柿、马铃薯等)、豆科植物表面(亦即例如花生、腰果、豆等)、谷物表面(亦即例如小麦、大豆、稻米、裸麦等)、花表面、茎表面、柄表面、叶表面、树皮表面、大枝表面、分枝表面等。
如本文所使用的术语“交互作用拮抗剂”是指能够干扰微生物孢子绒毛层蛋白质/基质表面结合对形成的任何化合物。
如本文所使用的术语“结合”是指感染控制组合物与表面之间的任何交互作用。该表面定义为“结合表面”。结合可为可逆的或不可逆的。该结合可为(但不限于)非共价结合、共价键结、离子键结、范德华力(Van de Waal force)或摩擦力及其类似作用。若用感染控制组合物浸渍表面、将该组合物并入表面中、用该组合物涂布表面、将表面悬浮于该组合物中、将表面溶解于该组合物中、混合该组合物与表面等，则该组合物结合于表面。
如本文所使用的术语“感染控制测试组合物”是指待就阻止微生物孢子结合表面的能力筛选的化合物集合。所述测试组合物可包括(但不限于)多种不同化合物，包括化学化合物、化学化合物的混合物(例如多糖、小有机或无机分子、生物大分子(例如肽、蛋白质、核酸))或由生物材料(诸如细菌、植物、真菌或动物细胞或组织)制得的提取物、天然存在或合成的组合物。
如本文所使用的术语“处于风险中”指任何人员或无生命表面受微生物污染的机率超过平均机率(亦即大于50％)。以下职业中可能存在“处于风险中”暴露机率：诸如第一反应者，包括(但不限于)消防员、警察、应急医疗人员。以下职业中亦可能存在“处于风险中”暴露机率：诸如卫生保健工作人员，包括(但不限于)医生、护士、勤杂工、医院看门人员及其类似职业。以下职业中亦可能存在“处于风险中”暴露机率：诸如军事人员，包括(但不限于)陆军人员、海军人员、空军人员、海运人员、国家防卫人员(National Guardpersonnel)、海岸防卫人员(Coast Guard personnel)。医疗患者中亦可能存在“处于风险中”暴露机率，包括(但不限于)免疫受损患者、灼伤患者、弹创患者等。
如本文所使用的术语“特异性结合位点模式(specific binding site pattern)”是指身体表面或无生命表面上的任何一组可再现的结合位点。所述结合位点对组合物具有固有亲和力，所述组合物包括(但不限于)如本文所论述的微生物孢子、感染控制组合物或有机小分子。虽然不必要了解发明机制，但咸信该结合模式为在三维上与组合物兼容(亦即例如经由立体特异性化学基团交互作用)的表面化学基团和/或形貌的独特排列的结果。进一步咸信，特异性结合位点模式预测指定表面积内非特异性结合(亦即并非经由专用受体介导的结合)的排列。
附图说明
图1呈现具有长、蜿蜒或丝状孢子外膜突出物(箭头)的产芽孢梭菌孢子内壁(S)的例示性扫描电子显微照片。贴于表面的突出物形成黏滞接触(tenacious contact)。
图2呈现例示性电子显微照片，其显示活化之前表面光滑的椭圆形艰难梭菌43594孢子内壁(插图)及活化之后覆盖有孢子外突出物(箭头)的艰难梭菌43594孢子内壁。
图3呈现显示发芽进行时的艰难梭菌43594孢子的例示性电子显微照片，其中孢子外膜覆盖有低凸块及位于指定为尾(T)区的一极的厚锚定结构。
图4呈现显示SDS-PAGE凝胶的例示性资料，该凝胶鉴别18kDa带(参见箭头)中出现的总孢子蛋白质。该18kDa带与能够杂交艰难梭菌抗体的蛋白质印迹18kDa带对应。
图5呈现显示SDS-PAGE凝胶的例示性资料，该凝胶鉴别140、150及160kDa带(分别参见p1、p2及p3)中出现的总孢子蛋白质。所述140、150及160kDa带与能够杂交艰难梭菌抗体的蛋白质印迹140、150及160kDa带对应。
图6A呈现显示SDS-PAGE凝胶的例示性资料，该凝胶用于鉴别位于约300kDa(箭头1)、275kDa(箭头2)、250kDa(箭头3)、160kDa(箭头4)、150kDa(箭头5)、140kDa(箭头6)、35kDa(箭头7)、28kDa(箭头8)及15kDa(箭头9)处的艰难梭菌孢子外膜蛋白质。亦鉴别6个其它非杂交带(箭头10-15)以确定非免疫反应性孢子外膜蛋白质。
图6B及6C呈现显示蛋白质印迹的例示性资料，所述蛋白质印迹显示艰难梭菌抗体与对应于图6A中所示的带的300kDa(箭头1)、275kDa(箭头2)、250kDa(箭头3)、160kDa(箭头4)、150kDa(箭头5)、140kDa(箭头6)、35kDa(箭头7)、28kDa(箭头8)及15kDa(箭头9)带杂交。
图7呈现以下的结构的一个具体实例：分别为BclA(绿色)及C1q(紫红色)单体(A及B)及其迭置(C)。标记N末端及C末端及β链。
图8呈现BclA(A)及C1q(B)三聚体的自侧面及上面观看的一个具体实例。构成各三聚体的三个单体着以蓝色、绿色及红色。
图9A呈现显示孢子外膜的仙人掌杆菌(B.cereus)ATCC 10876孢子的例示性穿透式电子显微照片。
图9B呈现显示自孢子外膜突出的绒毛层(nap layer)的炭疽芽孢杆菌孢子的例示性穿透式电子显微照片。
图9C呈现显示BclA绒毛层及内部基底层的炭疽芽孢杆菌孢子外膜层的一例示性特写照。
图10呈现显示微生物孢子与表面基质(亦即例如皮肤表面)的交互作用的具体实例的图标。
图10A说明微生物孢子绒毛层(亦即例如孢子表面蛋白质突出物)附着于哺乳动物皮肤上皮层。
图10B说明微生物孢子表面蛋白质(亦即例如天然形式)附着于表面基质及能够破坏微生物孢子表面蛋白质附着于表面基质的各种感染控制组合物。
图11呈现包含孢子表面蛋白质基因的pET-19b质粒的一个具体实例的示意图。
图12呈现显示自pET-19b载体的重组CD1067(红色箭头)表达的SDS-PAGE电泳分离的例示性资料。泳道1：分子量标准物梯状电泳带。泳道2：1小时样品。泳道3：2小时样品。泳道4：3小时样品。泳道5：4小时样品。泳道6：5小时样品。泳道7：6小时样品。蛋白质染色：考马斯蓝(CoomassieBlue)。
图13呈现显示自pET-19b载体的重组CD1067(红色箭头)表达的蛋白质印迹分析的例示性资料。泳道1：分子量标准物梯状电泳带。泳道2：1小时样品。泳道3：2小时样品。泳道4：3小时样品。泳道5：4小时样品。泳道6：5小时样品。泳道7：6小时样品。
图13A：使用F1373抗艰难梭菌抗体的检测。
图13B：使用抗HIS抗体的检测。
图14呈现显示自pET-19b载体的重组CD3620(红色箭头)表达的SDS-PAGE电泳分离的例示性资料。泳道1：分子量标准物梯状电泳带。泳道2：0小时样品。泳道3：1小时样品。泳道4：2小时样品。泳道5：3小时样品。泳道6：4小时样品。泳道7：4.5小时样品。蛋白质染色：考马斯蓝。
图15呈现显示自pET-19b载体的重组CD3620(红色箭头)表达的蛋白质印迹分析的例示性资料。泳道1：分子量标准物梯状电泳带。泳道2：0小时样品。泳道3：1小时样品。泳道4：2小时样品。泳道5：3小时样品。泳道6：4小时样品。泳道7：4.5小时样品。
图15A：使用F1373抗艰难梭菌抗体的检测。
图15B：使用抗HIS抗体的检测。
图16呈现显示自pET-19b载体的重组CD3620(红色箭头)表达的抗体检测对照数据的例示性数据。泳道1：分子量标准物梯状电泳带。泳道2：6小时pJEB02样品。泳道3：4.5小时pJEB03样品。
图16A：鉴别重组CD1067(上红色箭头)及重组CD3620(下红色箭头)的SDS-PAGE考马斯蓝参考电泳分离。
图16B：使用免疫前F1373检测的蛋白质印迹分析。
图16C：使用免疫前F1997检测的蛋白质印迹分析。
图16D：使用F1997抗艰难梭菌抗体检测的蛋白质印迹分析。
图17说明移除艰难梭菌孢子外膜外壳的方法的数个具体实例(参见实施例IV)。
图18A描绘可用作起始物质的代表性艰难梭菌630孢子。
图18B描绘孢子外膜剥落后的代表性艰难梭菌630孢子。
图18C描绘剥落后的经纯化且经浓缩的代表性艰难梭菌630孢子外膜。
具体实施方式
本发明是关于感染控制领域。特定言之，本发明是关于维持无菌条件、去除细菌污染和/或预防细菌暴露的组合物与方法。在一个具体实例中，本发明预期抑制微生物孢子与基质表面结合的感染控制组合物。举例而言，该抑制破坏和/或置换微生物孢子与基质表面的交互作用、附着和/或稳定。
抗生素作为对抗细菌感染的第一线防御已历经约70年。在1940年代及1950年代，临床上使用第一种抗生素，且自那时以后，其使用显著增加。虽然抗生素及抗微生物疗法取得不可估量的进展，但亦遭遇诸多问题。首先，抗生素对孢子无效。其次，抗生素抗性的发展为在全世界都很重要的严重且危及生命的事件。举例而言，已知一些微生物菌株对大多数可用抗生素具免疫力。(Travis，Science 264：360-362(1994))。尤其，抗药性生物体包括：引起肺炎及脑膜炎的肺炎球菌(pneumococci)；引起腹泻的隐孢子虫(Cryptosporidium)及大肠杆菌(E.coli)；及引起血流、外科手术创伤及尿路感染的肠球菌(enterococci)。(Berkelman等人，J Infect Dis.170：272-277(1994))。本发明预期致力于解决关于微生物孢子的污染控制及微生物感染对习用抗生素给药的临床抗药性的问题的组合物与方法。
I.细菌孢子
一些微生物排出孢子，所述孢子当暴露于不利于生长及增殖的环境中时进入休眠期。当附着和/或粘附于固体表面时，孢子存活增强。当环境条件再次变得有利于生长及增殖时，微生物孢子发芽且进而污染周围区域。随后与增殖的新微生物生长接触的人员或动物自先前未知会污染的区域感染。在一些情况下，人员和/或动物可能与微生物孢子接触，其中在接触后，开始发芽及感染。或者，该未检测到的孢子发芽会导致食物腐败，从而起始食物传染疾病暴发。由于所述细菌的孢子相对耐化学及物理灭菌剂，因此使用其作为包括湿热及干热、紫外线照射及过氧化氢的处理的灭菌效率的指标。Ito等人，“使用无菌系统的包装材料的灭菌(Sterilization of packaging materials using asepticsystems)”食品技术(Food Technol).38：60-62(1984)。
了解细菌孢子的表面性质及其与无生命及有生命基质的交互作用对食品、医药剂及医药用品包装中所使用的包装材料的选择及表面灭菌程序的评估而言很重要。举例而言，公认疏水性交互作用在细菌(亦即营养细胞)与惰性材料表面的粘附中具有作用。然而，相对较少的研究已全面研究细菌孢子的表面疏水性或孢子与无生命基质的粘附。细菌孢子的疏水性可通过运用用于量测营养细胞疏水性的方法测定。量测表面疏水性的既定技术包括(但不限于)：i)对烃的粘附(Beck等人，“金黄色葡萄球菌在表面生长装量和疏水性的影响(Effect of growth on surface charge and hydrophobicity of Staphylococcusaureus)”Ann.Inst.Pasteur/Microbiol.(Paris)139：655-664(1988))；ii)疏水性交互作用层析(HIC)(Doyle等人，“芽孢杆菌属孢子疏水特性(Hydrophobiccharacteristics of Bacillus spores)”Curr.Microbiol.10：329-332(1984))；iii)盐聚集(Takubo等人，“巨大芽孢杆菌最外层缺陷突变体孢子的分离与表征(Isolation and characterization of outermost layer deficient mutant spores ofBacillus megaterium)”Microbiol.Immunol.9：973-979(1988))；iv)接触角量测(Minagi等人，“通过接触角和烃粘附方法测得的念珠菌属的种的细胞表面疏水性(Cell-surface hydrophobicity of Candida species as determined by thecontact-angle and hydrocarbon-adherence methods)”J.Gen.Microbiol.132：1111-1115(1986))；及v)细菌对十六烷的粘附(BATH)(Wienek等人，“芽孢杆菌属和梭菌属的孢子的疏水性(Hydrophobicity of Bacillus and Clostridiumspores)”Appl Environ Microbiol 56：2600-2605(1990))。
研究显示孢子疏水性随物种及菌株而变化。然而，咸信各生物体的孢子的疏水性均大于营养细胞疏水性。另外，适度热处理增加大多数芽孢杆菌属孢子的疏水性。一个假设提出热处理后孢子疏水性的增加可能因外层外壳或孢子外膜蛋白质遭破坏而引起。
虽然不必了解发明机制，但咸信细菌孢子的疏水性增加归因于与营养细胞上的肽聚糖相比，外层外壳及孢子外膜中的蛋白质相对丰富。Doyle等人，“芽孢杆菌孢子的疏水性特征(Hydrophobic characteristics of Bacillus spores)”Curr.Microbiol.10：329-332(1984)；Matz等人，“来自蜡状芽孢杆菌孢子的外壁的化学组合物(Chemical composition of exosporium from spores of Bacillus cereus)”J.Bacteriol.101：196-201(1970)；及Takumi等人，“来自A型肉毒梭菌高产孢突变体的孢子的外壁的分离和部分表征(Isolation and partial characterization ofexosporium from spores of a highly sporogenic mutant of Clostridium botulinumtype A)”Microbiol.Immunol.28：443-454(1979)。最近已报导数种芽孢杆菌属物种的孢子疏水性与存在孢子外膜之间有关联。Kjelleberg，S.“无生命表面粘附(Adhesion to inanimate surfaces)”微生物粘附与聚集(Microbial adhesion andaggregation)，第51-70页，K.C.Marshall(编)，Springer-Verlag KG，Berlin(1984)。当通过化学处理移除孢子表面时，观察到仙人掌杆菌(B.cereus)T孢子的孢子疏水性降低。Kutima等人，“仙人掌杆菌T孢子萌发中的孢子表面相关(Involvement of the spore surface in germination of Bacillus cereus Tspores)”Appl.Environ.Microbiol.53：47-52(1987)。亦发现巨大芽孢杆菌(B.megaterium)的“敲除”外层外壳阴性突变体(QMB1551：ATCC 12872)的孢子疏水性降低。Takubo等人，“巨大芽孢杆菌最外层缺陷突变体孢子的分离与表征(Isolation and characterization of outermost layer deficient mutant spores ofBacillus megaterium)”Microbiol.Immunol.9：973-979(1988)及Koshikawa等人，“芽孢杆菌属的种的孢子表面疏水性(Surface hydrophobicity of spores ofBacillus spp.)”J.Gen.Microbiol.135：2717-2722(1989)。所述观察结果表明孢子外膜的外层外壳在孢子疏水性中发挥作用。
在一个具体实例中，本发明预期改进医疗、医药和/或食品工业中所使用的设备和/或包装材料的表面卫生、灭菌的组合物与方法。在一个具体实例中，本发明预期改进皮肤卫生的组合物与方法。
A.艰难梭菌孢子表面蛋白质
认为梭菌属的细菌引发所述疾病，包括(但不限于)气性坏疽、创伤感染、肉毒杆菌中毒、破伤风、假膜性结肠炎、败血症或医院性腹泻。该属在不利条件下通过形成高度耐热、耐化学物质及耐辐射的脱水孢子内壁而良好存活。所述孢子可于土壤中发现、由风携带、自哺乳动物消化及尿殖道中回收，且能够保持极长时间休眠直至生长条件支持孢子活化及发芽。
艰难梭菌孢子在卫生保健及医院环境内盛行。艰难梭菌孢子在有生命和/或无生命表面上存活较长时间，对许多消毒剂及抗生素具抗性，且容易在患者间传播。了解艰难梭菌孢子与表面的附着以及孢子形成及发芽将有助于预防、控制及治疗艰难梭菌相关性疾病。举例而言，艰难梭菌缺乏数种参与触发芽孢杆菌属物种的孢子形成过程的磷酸中继系统(phospho-relay system)的基因；最近已回顾梭菌属物种(Clostridia spp.)中孢子形成系统的该态样及其它态样。Paredes等人，“梭菌属孢子形成和生理学的比较基因组观察(A comparativegenomic view of clostridial sporulation and physiology)”Nat.Rev.Microbiol.3：969-978(2005)。另外，艰难梭菌亦缺乏大多数芽孢杆菌属及梭菌属物种中通常存在的三顺反子ger操纵子。Moir等人，“孢子萌发(Spore germination)”CellMol Life Sci.59：403-409(2002)；及Broussolle等人，“肉毒杆菌和生孢梭菌中孢子萌发的分子和生理学表征(Molecular and physiological characterisation ofspore germination in Clostrdidium botulinum and C.sporogenes)”厌氧生物(Anaerobe)8：89-100(2002)。所述观察结果表明艰难梭菌发芽受体实质上不同于其它梭菌属物种及芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)且不应基于与其它梭菌属物种及芽孢杆菌属物种的序列相似性进行鉴别。
微生物孢子对热、溶剂、酶、清洁剂、紫外线及电离辐射、氢氧化钠、乙醇、过甲酸、酚、寒冷及大部分杀孢子剂的抗性以及其当条件最佳时侵袭性生长的能力使其成为动物且尤其人体健康的严重威胁。Tipper等人，“细菌孢子内壁的结构(Structure of the bacterial endospore)”Spores V，H.Halvorson，R.Hanson及L.Campbell.编Amer.Soc.for Microbiol.，Bethesda，Maryland，3-12(1972)；及Russell，A.，“细菌孢子和化学杀孢子剂(Bacterial spores and chemicalsporicidal agents)”临床微生物研究(Clin.Microbiol.Rev.)，3，99-119(1990)。在医院及疗养院中院内获得艰难梭菌感染成为严重的流行病学问题，因为孢子存在于健康设施的墙壁、地面、器具、床单及护理者的手上。孢子似乎容易感染以下个体，包括(但不限于)具有i)肠内菌群因抗生素疗法而改变；ii)免疫系统受损；或iii)因诊断测试或治疗而需要多次灌肠剂的个体。Zaleznik，D.“艰难梭菌：二十世纪九十年代重要的医院病原体(Clostridium difficile：animportant nosocomial pathogen for the 1990s)”临床微生物学通讯(Clin.Microbiol.Newsletter)13，145-152(1991)。
两类梭菌属孢子(亦即例如产芽孢梭菌(Clostridium sporogenes)ATCC3584及艰难梭菌ATCC 9689及ATCC 43594)的孢子外膜可能在附着、发芽和/或菌落丛生中发挥作用。Panessa-Warren等人，“产芽孢梭菌和艰难梭菌的孢子外膜膜可塑性(Exosporial membrane plasticity of Clostridium sporogens andClostridium difficile”)组织和细胞(Tissue & Cell)29：449-461(1997)。超微结构变化与双酶梭菌(C.bifermentans)孢子附属物的发芽及长出有关，但并未确定特定功能。Samsonoff等人，“与支撑附着物的梭菌芽孢萌发和向外生长相关的超微结构改变(Ultrastructural changes associated with germination andoutgrowth of an appendage-bearing clostridial spore)”J.Bacteriol.，101，1038-1045(1970)。利用薄切片穿透式电子显微术研究产芽孢梭菌孢子确实揭露孢子外外层具有发样突出物，但未提供关于与梭菌属菌落丛生有关的分布、功能或外观的论述。Hoeniger等人，“产芽孢梭菌中孢子萌发和向外生长的超微结构方位(Ultrastructural aspects of spore germination and outgrowth inClostridium sporogenes)”Can.J.Microbiol.，15，1061-1065(1969)。已知穿透式电子显微术薄切片重建当一次观察及解释许多孢子的孢子外形态时存在显著问题，且所述问题与获得所述小、纤细且未充分染色的孢子附着于营养基质的薄切片相关。
产芽孢梭菌孢子一旦打破休眠状态即可展现特定形态期，且孢子外膜似乎在成功发芽、长出、营养性增殖及基质表面结合位点的菌落丛生中发挥主动作用。Panessa-Warren等人，“产芽孢梭菌孢子内壁附着和萌发的电子显微镜检(Electron microscopy of C.sporogenes endospore attachment and germination)”Scanning 16，227-240(1994)。咸信梭菌属孢子外膜为孢子外部“膜性”层，已描述为在发芽的被动参与物。然而，产芽孢梭菌ATCC 3584孢子一旦打破休眠状态，似乎即产生扫描电子显微术(SEM)可见的极特定孢子外形态结构，其似乎有利于孢子与基质附着或与其它孢子附着(亦即例如孢子共聚集)。孢子外突出物随后经自孢子远程(亦即例如尾区)延伸的单柄置换，该柄似乎在营养细胞发育及长出的最后阶段期间锚定孢子。
产芽孢梭菌附着初期，孢子外膜的纤细丝状突出物向外延伸，其中一些较短突出物附着于表面。参见图1，白色箭头。孢子外膜的长丝状突出物通常起源于孢子的上表面或侧面，且延伸至表面或最邻近孢子，将孢子结合在一起(共聚集)。孢子外膜突出物出现在产芽孢梭菌活化孢子的整个外表面上，最终发育成延伸至表面的单个粗附着结构，似乎用于锚定孢子。
不同于产芽孢梭菌，艰难梭菌的附着孢子数目较少且需要较长培育时间来使附着发生。休眠艰难梭菌孢子较小(约长2.0gm×宽1.1gm)，呈椭圆形且基本上光滑。参见图2，插图。一旦活化开始，孢子即展现覆盖孢子外膜的低隆凸。参见图3。在附着早期，艰难梭菌43594长出覆盖伸长孢子的整个表面的孢子外凸块及圆丘。所述孢子在尾区长出更多伸长的孢子外突出物，所述突出物随后在发芽循环期间经变粗的附着结构置换。图3，黑色箭头。不同于产芽孢梭菌，艰难梭菌展现较少孢子外膜延伸，但产生在孢子尾端长出的变粗的孢子外膜延伸。
产芽孢梭菌及艰难梭菌孢子在水或缓冲液中剧烈搅拌(亦即例如300rpm离心)期间保持附着于琼脂表面的能力有力地表明所述孢子具有强大的粘附和/或附着于表面的手段。在理想条件下，观察到在接种后27分钟内发生产芽孢梭菌附着于琼脂表面。在预先还原的琼脂上在缺氧条件下，观察到在88至105分钟内发生最大程度的产芽孢梭菌孢子附着。艰难梭菌孢子附着需要显著较长的时间，例如艰难梭菌9689需要105分钟且艰难梭菌ATCC 43594需要180分钟。
孢子一旦附着，即可保持牢固锚定于固体表面。艰难梭菌43594显得较独特，因为孢子附着极慢。然而，艰难梭菌可具有在暴露于有生命表面后加速附着的适应性反应。举例而言，已报导在具有肠道运动增加的患者及经受多次灌肠剂的患者中艰难梭菌院内感染的发病率增加。Bartlett，J.“Introduction”In：艰难梭菌：其在肠道中的作用(Clostridium Difficile：Its Role in Intestinal Disease)，R.Rolfe及S.Finegold编.Academic Press，New York，第1-13页(1988)；Silva，J.Jr.，“艰难梭菌有关的肠道疾病的预防(Prevention of Clostridiumdifficile-associated intestinal disease)”In：Clostridium difficile：Its Role inIntestinal Disease，R.Rolfe及S.Finegold编，Academic Press，New York，第368-378页(1988)；及McFarland等人，“艰难梭菌感染医院采集(Nosocomialacquisition of Clostridium difficile infection.)New Engl.J.Med.，320：204-210(1989)。艰难梭菌孢子通常可见于健康无症状个体的消化道中。因此，起始附着于肠及开始感染过程的触发机制可能为正常菌群损失(亦即例如由抗生素、疾病或反复灌肠引起)和/或结肠活动性过高的组合。
梭菌属孢子的孢子外膜附着长出物典型具有直径为约7nm，且长度可在0.1nm与2.9nm之间变化。所述长出物包含原纤维，其长度通常小于200nm且可能极纤细。Hancock，I，“微生物细胞表面结构(Microbial cell surfacearchitecture)”微生物细胞表面分析(Microbial Cell Surface Analysis)，N.Mozes，P.Handley，H.Busscher及P.Rouxhet编，VCH Publishers，New York，第23-59页(1991)。产芽孢梭菌的孢子外膜长出物的宽度通常量测为85nm至1015nm，然而，一些长出物、尤其亦包含共聚集附着物的长出物的长度可长达2000nm。产芽孢梭菌孢子外膜的圆丘样突出物的直径可在68nm至75nm范围内，且发芽后期可见的肿胀突出物的直径可达180nm至240nm。
显然，总视为“发芽中的被动参与物”的孢子外膜似乎在产芽孢梭菌及艰难梭菌的孢子附着及菌落丛生中发挥主动作用。在一个具体实例中，艰难梭菌蛋白质来源于孢子外膜表面层，其中该孢子外膜层包含艰难梭菌孢子的最外蛋白质。在一个具体实例中，本发明预期包含艰难梭菌孢子的至少一种最外表面蛋白质的组合物。在一个具体实例中，表面蛋白质包含孢子表面蛋白质。虽然不必了解发明机制，但咸信所述孢子表面蛋白质提供细菌孢子与基质表面结合位点之间的界面。亦咸信所述蛋白质可用于界定分子附着交互作用，包括(但不限于)：i)孢子与有生命表面之间的交互作用；及ii)孢子与无生命表面之间的交互作用。艰难梭菌孢子外膜蛋白质的大小特征提供于表I中。
表I.代表性艰难梭菌孢子外膜蛋白质的大小特征
在一个具体实例中，艰难梭菌蛋白质可通过用针对经纯化的完整艰难梭菌孢子的抗体探测总孢子蛋白质制剂以产生杂交的蛋白质-抗体复合物来鉴别。在一个具体实例中，艰难梭菌孢子表面蛋白质包括(但不限于)CD1067、CD3620、CD 1581、CD 598或CD 2401。在一个具体实例中，艰难梭菌酶与艰难梭菌孢子表面蛋白质制剂相关。
在一个具体实例中，梭菌属假设性蛋白质(hypothetical protein)(CD 1581)可能分离成杂交的抗体-蛋白质复合物，其中该复合物包含的分子量包括(但不限于)18、140、150或160kDa。参见图4-6。在一个具体实例中，假设性蛋白质(约20kDa)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列(登录编号(accessionnumber)YP_001088081；GI：126699184)：
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151 HKCNCNCCRK
该氨基酸序列由梭菌属假设性核酸SEQ ID NO：2编码：
在一个具体实例中，梭菌属假设性蛋白质(CD 1067)可能分离成杂交的抗体-蛋白质复合物，其中该复合物包含的分子量包括(但不限于)140、150及160kDa。参见图5、6。在一个具体实例中，假设性蛋白质(约47kDa)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列(登录编号(accession number)YP_001087551；GI：126698654)：
该氨基酸序列由梭菌属假设性核酸SEQ ID NO：4编码：
在一个具体实例中，梭菌属假设性蛋白质(CD 3620)可能分离成杂交的抗体-蛋白质复合物，其中该复合物包含的分子量包括(但不限于)140kDa。参见图5及图6。在一个具体实例中，假设性蛋白质(约14kDa)包含SEQ IDNO：5的氨基酸序列(登录编号(accession number)YP_001090143；GI：126701246)：
1 MYDDYKYNKC NKCYNDYEEM THVHEYSESV KLAEECEDRH NHRAAGVTGE
51 AIPINGGTNH VHKINDNVDF LDHFHKICVT TGPAIRIPGT DKHIHLICGE
101 TTVNDGHCHK FLFTTQIEAP LV
该氨基酸序列由梭菌属假设性核酸SEQ ID NO：6编码：
在一个具体实例中，梭菌属假设性蛋白质(CD 1613)可能分离成杂交的抗体-蛋白质复合物。在一个具体实例中，假设性蛋白质包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列(登录编号(accession number)YP_001088114)：
该氨基酸序列由梭菌属假设性核酸SEQ ID NO：8编码：
在一个具体实例中，梭菌属假设性蛋白质(CD 1711)可能分离成杂交的抗体-蛋白质复合物。在一个具体实例中，假设性蛋白质包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列：
1 mlivttekve gkkiskvlgl vrgstirakh vgkdigasfk nlvggeltgy
51 nemltearqi aigrmvedae akganaviaf rlssasvmqg aaemlaygta
101 vvleddnsil ek：
该氨基酸序列由梭菌属假设性核酸SEQ ID NO：10编码：
在一个具体实例中，梭菌属假设性蛋白质(CD 0881)可能分离成杂交的抗体-蛋白质复合物。在一个具体实例中，假设性蛋白质包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列：
该氨基酸序列由梭菌属假设性核酸SEQ ID NO：12编码：
在一个具体实例中，梭菌属假设性蛋白质(CD 1511)可能分离成杂交的抗体-蛋白质复合物。在一个具体实例中，假设性蛋白质包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列：
该氨基酸序列由梭菌属假设性核酸SEQ ID NO：14编码：
B.艰难梭菌胶原蛋白样蛋白质
比较炭疽芽孢杆菌孢子外膜蛋白质BclA与艰难梭菌基因组，其中三个艰难梭菌基因组区域经鉴别与炭疽芽孢杆菌BclA(亦即例如孢子表面基因组区域)同源。
在一个具体实例中，梭菌属孢子表面同源蛋白质包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列(登录编号(accession number)CAJ67154)：
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该氨基酸序列由梭菌属孢子表面同源核酸SEQ ID NO：16编码：
atgagaaata ttatacttta tttaaatgat gatactttta tatctaaaaa atatccagat
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actttgacga tatttagaat agctgatact gttatgactt aa
在一个具体实例中，梭菌属孢子表面同源蛋白质包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列(登录编号(accession number)CAJ70248)：
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该氨基酸序列由梭菌属孢子表面同源核酸SEQ ID NO：18编码：
ttatatggca tactgtctgt ctggagtttg tgctgttgct gctatattta atcctgttac
aattccacta gaaattgaac caactgataa tatacctgta agtggtggag ctagtgtaac
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acctgatgca aaaggtatta ttgcactagc acctgttgct cctgttgctc ctgttgctcc
tgttgggcct gttgggcctg ttgctcctgt aactcctgtt gcccctgttg ctcctgttgg
acctgttgct ccatctgccc ctgttgctcc tgttgctcct gttggacctg ttgctccatc
tgctcctgtt gctcctgttg gacctgttgc tcctgttgct cctgccactc ctgttgctcc
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tgtcgctcct gttgcccctg ttgctcctgt tattcctact cctgttgggc ctgttgctcc
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tccatttgct cctgttgccc ctgttgctcc tgttggacct gttactcctg ttgctccgtc
tgctcctgtt gctcctgttg ctcctgttgc tcctgttact cctactcctg ttgggcctgt
tgctcctgtt ggacctgttg ctccaggtgt tcctgttgcc cctgttggac ctattaatcc
tgttgcccct gttatcccta ttcctgttgc tcctgttgga cctgttgggc ctgttattcc
tattcctgtt gctcctgttg ctcctgttgg gcctgttact ccatctgctc ctgttgcccc
tgttgggcct gttgggcctg ttactcctgt tgctccatct gcccctgttg ctcctgttgc
tcctgttgga cctgttattc ctattcctgt tgctcctatt gcccctgttg gacctgttgc
tccaggtgtt cctgtcgctc ctgttggacc tattaatcct gttgctcctg ttactcctac
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tcctgttgga cctgttattc catctgctcc tgttgctccc gttggacctg ttggacctgt
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在一个具体实例中，梭菌属孢子表面同源蛋白质包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列(登录编号(accession number)CAJ70128)：
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该氨基酸序列由梭菌属孢子表面同源核酸SEQ ID NO：20编码：
ctattgtatt ctataaactg atacatatcc agctgcagaa gtacctgtcg tgcctgaacc
aaatgtaaaa cttaaagtaa cagctgctgc tctagcatca actaaaaagc ttaaacttac
acttacatct gatgaagtaa gtgtatttac tgcttttgca ataaagttat tttgagttac
tccattaaag ttagtagtaa ttgacataaa tcctgcaagt gaaagtgtgg cacgtatacc
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tatattagtt ccatttataa atgatgaatt aaatgtcact aatgtattat tcactaaact
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tccggttgga cctgttgctc catttgctcc tgttgctcct gtcgcccctg ttgctcctgt
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tcctgttgct cctgctactc cattttctcc cgttggacct gttggaccta ttggacctgc
tactccattc gctcccgttg ctcctactgc tcccgttggg cctgttgctc catttgcccc
tgttgctcct gtcgctcctg ttggacctac tgctccatct gctcccgttg ggcctgttgc
tcctactgct cccgttggac ctattgcccc agctactcct gttgctcctg tcgctcctgt
tggacctacc aaaccatttg ctccggttgc tccggttggg cctgttgggc ctaccaaacc
atttgctccg gttgctccgg ttgggcctgt tgggcctgtt ggacctacca aaccatctgg
acctgttgct cctactgctc ctgttggacc tacctctcca tctgctcctg ttgctcctgt
tgctcctatt gggcctgttg ccccagttgt tcctgttgct ccagtcgctc ctatacttcc
tgttggacct gttgctcctg tatttcctgt tgggcctgta gcacctgtta ctccatttgc
tccggttgct cctgtatttc ctgttggtcc tgttattcca tttgctccgg ttgctcctgt
tgctcctgtt agtccggttg gacctgttgc tcctgttgct cctgtattcc ctgttggacc
tgttattcca tttgctccag tcgctcctgt atttcctgtt ggtcctgtag aacctgttat
tccatttgct ccggttgctc ctttgtttcc tgttggtcct gttattccat ttgctccggt
tgctcctgta ttccctgtcg gacctgttat tccattcgct ccagtcgctc ctgtatttcc
tgttggtcct gtagaacctg ttgttccatt tggtccagtc gctcccatat ttcctgttgg
acccgttatt ccattcgctc cagttgctcc tgtatttcct gttggtcctg ttattccatt
tgctccggtc gctccagttg cacctctagg ccccgtcggt cctgttggac cagtagcacc
tgttggccct gttggaccta catcttgata taaacttgga cctgaaatat cactcat
C.艰难梭菌孢子蛋白质
1.推定梭菌属孢子蛋白质
在一个具体实例中，梭菌属推定孢子蛋白质(CD 2401)可能分离成杂交的抗体-蛋白质复合物，该复合物包含的分子量包括(但不限于)140、150或160kDa。参见图5及图6。在一个具体实例中，假设性蛋白质(约22kDa)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列(登录编号(accession number)YP_001088913；GI：126700016)：
1 MWIYQKTIQH PVNIKTCDPR MAKFLITQFG GPNGELAASL RYLSQRYTMP
51 TGNMRALLTD IGTEELAHVE LICTMVYQLT SDASPEELKA AGLGSNYAQN
101 GYGIYPTDSN GVPFDVRPIA VMSNPVTDLH EDMAAEQKAL ATYYQLINLT
151 DDVDVIDVLK FLGQREIIHY QRFGEALMDA YELEESQKMF
该氨基酸序列由梭菌属推定孢子蛋白质核酸SEQ ID NO：22编码：
在一个具体实例中，梭菌属推定孢子表面蛋白质(CD 589)可能分离成杂交的抗体-蛋白质复合物，该复合物包含的分子量包括(但不限于)140、150或160kDa。参见图5及图6。在一个具体实例中，假设性蛋白质(约22kDa)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列(登录编号(accession number)YP_001087073；GI：126698176)：
1 MWIYQKTLEH PVNIRQADPR MAKYIMTQLG GPNGELAAAT RYLQQRYTMP
51 TGKSRALLTD IGTEEMAHVE IISSVLYQLI GNCTPEELKA AGLGSNYANF
101 GHGLQPVDSN GVNFTTSYIN VFGDSVTDLH EDMAAEQKAL ATYYQLINLT
151 DDPDLKDILR FLGEREVVHY QRFGEALMDV YEFTECKHQF
该氨基酸序列由梭菌属推定孢子蛋白质核酸SEQ ID NO：24编码：
2.丙酮酸-黄素氧化还原蛋白氧化还原酶
在一个具体实例中，梭菌属孢子蛋白质包含丙酮酸-黄素氧化还原蛋白氧化还原酶蛋白质(CD 2682)，该氧化还原酶蛋白质由SEQ ID NO：25的氨基酸序列(登录编号(accession number)YP_001089193；GI：126700296)描述：
该氨基酸序列由梭菌属丙酮酸-黄素氧化还原蛋白氧化还原酶核酸SEQID NO：26编码：
3.γ-氨基丁酸代谢脱水酶/异构酶
在一个具体实例中，梭菌属孢子蛋白质包含γ-氨基丁酸代谢脱水酶/异构酶蛋白质(CD 2341)，其由SEQ ID NO：27的氨基酸序列(登录编号(accessionnumber)YP_001088856；GI：126699959)描述：
该氨基酸序列由梭菌属γ-氨基丁酸代谢脱水酶/异构酶核酸SEQ ID NO：28编码：
4.丁酰基辅酶A去氢酶
在一个具体实例中，梭菌属孢子蛋白质包含丁酰基辅酶A去氢酶蛋白质(CD 1054)，其由SEQ ID NO：29的氨基酸序列(登录编号(accession number)YP_001087535；GI：126698638)描述：
该氨基酸序列由梭菌属丁酰基辅酶A去氢酶核酸SEQ ID NO：30编码：
5.氨基酸氨基转移酶
在一个具体实例中，梭菌属孢子蛋白质包含氨基酸氨基转移酶蛋白质(CD3664)，其由SEQ ID NO：31的氨基酸序列(登录编号(accession number)YP_001090189；GI：126701292)描述：
该氨基酸序列由梭菌属氨基酸氨基转移酶核酸SEQ ID NO：32编码：
6.琥珀酸半醛去氢酶
在一个具体实例中，梭菌属孢子蛋白质包含琥珀酸半醛去氢酶蛋白质(CD2342)，其由SEQ ID NO：33的氨基酸序列(登录编号(accession number)YP_001088857；GI：126699960)描述：
该氨基酸序列由梭菌属琥珀酸半醛去氢酶核酸SEQ ID NO：34编码：
7.红素氧还蛋白(rubrerythrin)
在一个具体实例中，梭菌属孢子蛋白质包含红素氧还蛋白蛋白质(CD1524)，其由SEQ ID NO：35的氨基酸序列(登录编号(accession number)YP_001088025；GI：126699128)描述：
1 MKKFVCTVCG YIHEGDAAPA QCPVCKVGAD KFEEMKGEMV WADEHRIGVA
51 QGVDAEIIEG LRANFTGECT EVGMYLAMSR QADREGYPEV AEAYKRIAFE
101 EAEHAAKFAE LLGEVVVADT KENLRVRVDA EYGATDGKLK LAKRAKELGL
151 DAIHDTVHEM CKDEARHGKA FLGLLNRHFG K
该氨基酸序列由梭菌属红素氧还蛋白核酸SEQ ID NO：36编码：
8.黄素蛋白α亚单位
在一个具体实例中，梭菌属孢子蛋白质包含黄素蛋白α亚单位蛋白质(CD1056)，其由SEQ ID NO：37的氨基酸序列(登录编号(accession number)YP_001087535；GI：126698640)描述：
该氨基酸序列由梭菌属黄素蛋白α亚单位核酸SEQ ID NO：38编码：
9.2-酮基异戊酸铁氧化还原蛋白还原酶
在一个具体实例中，梭菌属孢子蛋白质包含2-酮基异戊酸铁氧化还原蛋白还原酶蛋白质(CD 116)，其由SEQ ID NO：39的氨基酸序列(登录编号(accession number)YP_001086585；GI：126697688)描述：
该氨基酸序列由梭菌属黄素蛋白α亚单位核酸SEQ ID NO：40编码：
D.芽孢杆菌属BclA蛋白质及同源物
芽孢杆菌属包含土壤及水中广泛存在的棒状革兰氏阳性好氧或(在一些条件下)厌氧细菌。大部分芽孢杆菌属菌株对人类而言不具致病性，且仅当其作为土壤生物体时偶然会感染。然而，一个值得注意的例外为炭疽芽孢杆菌。咸信炭疽芽孢杆菌在人类及家畜中引起炭疽。除作为天然存在的病原体以外，炭疽芽孢杆菌亦可用作生物武器。炭疽芽孢杆菌的孢子形式为最有可能用作生物武器的生物体之一。熟知炭疽芽孢杆菌孢子对大多数消毒剂具高度抗性，其中有效杀死通常需要使用有毒且刺激的化学物质，诸如甲醛或次氯酸钠(亦即漂白剂)。因此，迫切需要改进用于民用与军用应用的当前去污染程序。本发明预期提供有效且无毒的芽孢杆菌属污染控制的方法与组合物，且尤其用于有生命与无生命表面的炭疽芽孢杆菌去污染程序。
1.BclA
在一个具体实例中，炭疽芽孢杆菌BclA孢子表面蛋白质包含氨基酸序列(登录编号(accession number)AAY15450；SEQ ID NO：41)：
msnnnysngl npdeslsasa fdpnlvgptl ppippftlpt gptgptgptg ptgptgptgp
tgptgptgpt gdtgttgptg ptgptgptgp tgdtgttgpt gptgptgptg ptgptgptgp
tgptgptgpt gptgptgptg ptgptgdtgt tgptgptgpt gptgptgptg ptgptgptgp
tgptgptgpt gdtgttgptg ptgptgptgp tgdtgttgpt gptgptgptg ptgptgptga
tgltgptgpt gpsglglpag lyafnsggis ldlgindpvp fntvgsqfgt aisqldadtf
visetgfyki tviantatas vlggltiqvn gvpvpgtgss lislgapivi qaitqitttp
slvevivtgl glslalgtsa siiiekva
该氨基酸序列由炭疽芽孢杆菌BclA核酸(登录编号(accession number)AY995120；SEQ ID NO：42)编码：
atgtcaaata ataattattc aaatggatta aaccccgatg aatctttatc agctagtgca
tttgacccta atcttgtagg acctacatta ccaccgatac caccatttac ccttcctacc
ggaccaactg ggccgactgg accgactggg ccgactgggc caactggaccaactgggccg
actgggccaa ctggaccaac tgggccaact ggagacactg gtactactgg accaactggg
ccgactgggc caactggacc aactgggcca actggagaca ctggtactac tggaccaact
gggccaactg gaccaactgg gccgactggg ccaactggac caactgggcc gactgggcca
actggaccaa ctgggccaac tggaccaact ggaccaactg ggccaactgg accaactgga
ccaactgggc caactggaga cactggtact actggaccaa ctgggccaac tggaccaact
ggaccaactg ggccgactgg accgactggg ccgactgggc caactggacc aactgggccg
actgggccaa ctggaccaac tgggccaact ggagacactg gtactactgg accaactggg
ccaactggac caactggacc aactgggcca actggagaca ctggtactac tggaccaact
gggccaactg gaccaactgg accaactggg ccaactggac caactgggcc aactggtgct
accggactga ctggaccgac tggaccgact gggccatccg gactaggact tccagcagga
ctatatgcat ttaactccgg tgggatttct ttagatttag gaattaatga tccagtacca
tttaatactg ttggatctca gtttggtaca gcaatttctc aattagatgc tgatactttc
gtaattagtg aaactggatt ctataaaatt actgttatcg ctaatactgc aacagcaagt
gtattaggag gtcttacaat ccaagtgaat ggagtacctg taccaggtac tggatcaagt
ttgatttcac tcggagcacc tatcgttatt caagcaatta cgcaaattac gacaactcca
tcattagttg aagtaattgt tacagggctt ggactatcac tagctcttgg cacgagtgca
tccattatta ttgaaaaagt tgcttaa
BclA蛋白质在中心区域中含有多个孢子表面GXX重复且似乎为通过分离孢子外膜蛋白质的主要免疫斑点印迹带(用小鼠抗孢子多克隆抗体)所鉴别的孢子外膜的发样绒毛的结构组分。Sylvestre等人，“胶原样表面糖蛋白是炭疽芽胞杆菌孢子外膜的结构成分(A collagen-like surface glycoprotein is astructural component of the Bacillus anthracis exosporium)”Mol.Microbiol.45：169-178(2002)。
咸信BclA蛋白质经高度糖基化且为提供孢子外膜长丝的结构组分的炭疽芽孢杆菌孢子表面的免疫显性抗原。Daubenspeck等人，J.Biol.Chem.279：30945-30953(2004)。炭疽芽孢杆菌菌株之间基因bcla的长度不同，从而编码不同大小的蛋白质。大多数BclA蛋白质具有可变长度的GXX重复(亦即例如约17至91个GXX重复)的内部孢子表面区(CLR)，其包括高比例的GPT三联体。已显示BclA孢子表面区的长度造成长丝长度不同。Boydston等人，“炭疽芽孢杆菌胶原样糖蛋白BclA的孢子外膜内定位和结构稳定性(Orientation within the exosporium and structural stability of the collagen-likeglycoprotein BclA of Bacillus anthracis)”J.Bacteriol.187，5310-5317(2005)。一个炭疽芽孢杆菌BclA包含70个GPT重复且具有重复六次的21个氨基酸序列((GPT)5GDTGTT；SEQ ID NO：43)。BclA多态性可能对应编码含17至91个不等的若干相续GXX三联体的CLR的序列。在一份报导中，bcla基因在具有不同CLR的菌株之间交换且利用电子显微术检查所产生的孢子外膜。数据支持BclA蛋白质CLR可控制绒毛长丝长度的结论。Sylvestre等人，“炭疽芽孢杆菌BclA蛋白的胶原区域中的多态现象导致孢子外膜丝长度的变化(Polymorphism in the collagen region of the Bacillus anthracis BclA proteinleads to variation in exosporium filament length)”J Bacteriol.185：1555-1563(2003)。
虽然CLR在微生物中罕见，但已在一些细菌及病毒中鉴别到。Rasmussen等人，(2003)J.Biol.Chem.278，32313-32316(2003)。虽然其功能普遍不清楚，但其可见于表面蛋白质中。与炭疽芽孢杆菌接近的物种仙人掌杆菌及苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)两者在其孢子外膜中均具有与BclA相关的蛋白质。Todd等人，J.Bacteriol.185，3373-3378(2003)。然而，BclA的C端部分与已知结构的蛋白质之间不存在序列相似性。
BclA蛋白质链的C端三分的二折叠成具胶卷拓扑结构(jelly roll topology)的全β结构。参见图7。TNF样蛋白质外异蛋白(ectodysplasin)Eda-A1(DALI；Z分数16.1)及C1q(DEJAVU；DALI Z分数14.6)的类似折叠表明强结构关系。Holm等人，J.Mol.Biol.233：123-138(1993)；及Kleywegt等人，In：晶体学国际表(International Tables for Crystallography)(Rossmann，M.G.及Arnold，E.编)第F卷，第353-356页，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，TheNetherlands(2001)。使根据TNF样协议依次编号为A、A″、A′、B′、B、C、D、E、F、G、G′及H的12条β链与希腊钥匙拓扑结构(Greek key topology)建立关联且形成两个β折叠(β-sheet)，各含有5条链，分别为A’AHCF及B’BGDE。与TNF样蛋白质的其它成员的主要区别在于存在额外的A″及G′链，该两链形成双链反平行β折叠，将AA’与GH环包装在一起。
因晶体学对称性而相关的三个单体形成直径为约的紧密球状三聚体。三聚体形成所内埋的总表面为每个单体
其中，中心处有两个填充有溶剂分子的小空穴。C端及N端会合于三聚体的底面，其中非胶原性部分的N端残基缠结且随后朝外。参见图8。圆偏光二色性光谱术显示除最N及C端残基以外的整个三聚体结构，其中对于C端残基，仅亲和标签的前两个His残基可见。每个单体7个残基具有两种交替构形；i)4个位于三聚体的靠近结晶学二次轴(2-fold axis)的表面上；及ii)3个位于三聚体的两个空穴的一内部的界面处。显然，BclA三聚体组装与其它TNF样三聚体非常类似。因为突出环较短，所以BclA三聚体的总体形状比TNF的形状稍微更球形，且稍小于C1q的球形头部(直径小了约
)。三聚体形成后，内埋表面小于C1q
或胶原蛋白VIII NC1
的等效表面积。此归因于其总体大小稍小，但主要归因于三聚体中心内存在溶剂填充的空穴。
在一个具体实例中，BclA蛋白质(BAS1130)包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列(登录编号(accession number)YP_027402)：
在一个具体实例中，经修饰的炭疽芽孢杆菌蛋白质(BclA)包含SEQ IDNO：45的氨基酸序列，其中该修饰包含SEQ ID NO：41片段：
MSNNNYSNGLNPDESLSASAFDPNLVGPTLPPIPPFTLPTGPTGPTGPTGPTGPTGDTGTTGPTGPTGPTGPTGATGLTGPTGPTGPSGLGLPAGLYAFNSGGISLDLGINDPVPFNTVGSQFGTAISQLDADTFVISETGFYKITVIANTATASVLGGLTIQVNGVPVPGTGSSLISLGAPIVIQAITQITTTPSLVEVIVTGLGLSLALGTSASIIIEKVA
2.BclB
在一个具体实例中，BclB蛋白质(BAS2281)包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列(登录编号(accession number)YP_028542)：
D.芽孢杆菌属孢子外膜蛋白质
芽孢杆菌属亦包括一组在去除必需营养素后形成孢子的多种革兰氏阳性棒状好氧细菌。Errington，“枯草杆菌孢子形成：基因表达的调节和形态建成的控制(Bacillus subtilis sporulation：regulation of gene expression and control ofmorphogenesis)”Microbiol.Rev.57：1-33(1993)；及Priest，F.G.，“芽孢杆菌的系统和生态学(Systemics and ecology of Bacillus)”枯草杆菌和其他革兰氏阳性菌(Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria).生物化学，生理学和分子遗传学(Biochemistry，physiology，and molecular genetics).第3-16页，A.L.Sonenshein，J.A.Hoch及R.Losick(编)，美国微生物协会(American Society forMicrobiology)，Washington，D.C.(1993)。在该过程中，饥饿营养细胞的不对称分隔产生一大与一小的含基因组间隔，分别称为母细胞及前孢子(forespore)。母细胞随后吞噬前孢子，由此其经两个相对的细胞膜包围。在两个膜之间合成厚经修饰肽聚糖层，称为皮层，且母细胞中合成的蛋白质形成多个覆盖皮层的孢子表面层。虽然对于一些物种(例如枯草杆菌(Bacillus subtilis))的孢子，外壳形成可检测到的最外层，但在其它物种(例如炭疽芽孢杆菌)中，孢子由称为孢子外膜的额外层包裹，该孢子外膜层为亦由母细胞合成的突出的宽松配合气球样层。Henriques等人，“细菌孢子内壁表面的结构和装配(Structure andassembly of the bacterial endospore surface)”Methods 20：95-110(2000)。
仙人掌杆菌、炭疽芽孢杆菌及苏云金杆菌代表咸信具有孢子外膜的芽孢杆菌属细菌。Ohye等人，“仙人掌杆菌T中孢子外膜和孢子表面的形成(Exosporium and spore surface formation in Bacillus cereus T)”J.Bacteriol.115：1179-1190(1973)；及Andersen G.，“将炭疽杆菌与仙人掌杆菌及苏云金杆菌区别开的基因组差异(Genome differences that distinguish Bacillus anthracisfrom Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis)”Appl.Environ.Microbiol.69：2755-2764(2003)。参见图9A、9B。然而，枯草杆菌缺乏独特的单独孢子外膜，但有报导称用脲-巯基乙醇自孢子提取一些外壳物质后可观察到孢子表面的最外层紧密配合层且可视为孢子外膜。Sousa等人，“枯草杆菌孢子中孢子外膜样外部层(An exosporium-like outer layer in Bacillus subtilis spores)”自然(Nature)263：53-54(1976)。首先观察到仙人掌杆菌的孢子外膜为母细胞细胞质中接近但不接触外层前孢子膜的小层状结构；其与孢子表面同时合成，但在成熟孢子内该两个结构明显分开。孢子外膜通常含有六方晶体样基底层，该基底层包含53％蛋白质、20％氨基及中性多糖、18％脂质及约4％灰分。孢子外膜占孢子干重的约2％。亦咸信巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)QMB1551孢子的疏水性质由孢子外膜决定，因为缺乏或不存在孢子外膜的孢子对十六烷的亲和力大大降低。Koshikawa等人，“芽孢杆菌属的种的孢子表明疏水性(Surface hydrophobicity of spores of Bacillus spp)”J.Gen.Microbiol.135：2717-2722(1989)。
最后成熟阶段后，母细胞溶解释放成熟孢子，该孢子呈休眠状态且能够持久存在于土壤中多年直至其遇到发芽信号。大多数芽孢杆菌属物种对人类不具致病性。最值得注意的例外为炭疽芽孢杆菌，其为炭疽的病原体。Mock等人，“炭疽(Anthrax)”Annu.Rev.Microbiol.55：647-671(2001)。由于在美国最近使用炭疽芽孢杆菌孢子作为恐怖主义武器且许多国家将所述孢子研发成大规模破坏性武器，因此迫切需要更了解可用于快速检测并旨在对炭疽进行去污染、治疗及预防的孢子组分。Inglesby等人，“炭疽作为生物武器，2002：处理的更新推荐(Anthrax as a biological weapon，2002：updated recommendations formanagement)”JAMA 287：2236-2252(2002)。
一种该组分为孢子外膜，其充当孢子的初级渗透屏障且充当孢子表面抗原的来源。Gerhardt，P.，“炭疽杆菌的细胞学(Cytology of Bacillus anthracis)”Fed.Proc.26：1504-1517(1967)。作为孢子的最外层表面，孢子外膜将与土壤环境、收集及检测装置、哺乳动物宿主中的孢子结合目标细胞及宿主防御交互作用。当前，关于孢子外膜结构及功能的详细信息有限。孢子外膜的先前研究集中于炭疽芽孢杆菌及机会性人类病原体仙人掌杆菌的孢子。所述物种以及苏云金杆菌(昆虫病原体)及蕈状杆菌(Bacillus mycoides)构成密切相关的仙人掌杆菌群。该群的所有成员产生具有由基底层及长度延伸长达600A°的外部发样绒毛构成的结构类似的孢子外膜的孢子。Gerhardt等人，“孢子外膜包装的仙人掌杆菌的孢子的超微结构(Ultrastructure of the exosporium enveloping spores ofBacillus cereus)”J.Bacteriol.88：1774-1789(1964)；及Hachisuka等人，“炭疽杆菌孢子的外生孢子膜的外面的细丝(Fine filaments on the outside of theexosporium of Bacillus anthracis spores)”J.Bacteriol.91：2382-2384(1966)。基底层含有四个准结晶(paracrystalline)次层，各展现六方穿孔晶格结构。发样绒毛的长度在物种之间且甚至在菌株之间不同。Beaman等人，“从仙人掌杆菌增溶的孢子外膜准结晶片(Paracrystalline sheets reaggregated from solubilizedexosporium of Bacillus cereus)”J.Bacteriol.107：320-324(1971)；及Kramer等人，“在炭疽芽孢杆菌的Sterne和Vollum菌株的孢子外壁中超微结构的差异(Ultrastructural differences in the exosporium of the Sterne and Vollum strains ofBacillus anthracis)”Can.J.Microbiol.14：1297-1299(1968)。
孢子外膜与似乎结合位于发样绒毛中的多糖的凝集素反应。Cole等人，“通过凝集素区分炭疽芽孢杆菌与其他芽孢杆菌属的种(Differentiation of Bacillusanthracis and other Bacillus species by lectins)”J.Clin.Microbiol.19：48-53(1984)；Matz等人，“仙人掌杆菌的孢子外膜包装孢子的化学超微结构(Chemical ultrastructure of the exosporium enveloping spores of Bacilluscereus)”Bacteriol.Proc.，第31页(1965)。孢子外膜占孢子质量的约2％且含有约50％蛋白质、20％脂质、20％中性多糖及10％其它组分。Matz等人，“来自仙人掌杆菌孢子的孢子外膜的化学组成(Chemical composition of exosporiumfrom spores of Bacillus cereus)”J.Bacteriol.101：196-201(1970)。
孢子外膜含有多种与皮质及外壳同时合成的蛋白质。Desrosier等人，“在仙人掌杆菌孢子形成期间合成孢子外膜(Synthesis of the exosporium duringsporulation of Bacillus cereus)”J.Gen.Microbiol.130：935-940(1984)；及Ohye等人，“仙人掌杆菌T孢子外膜和孢子表面形成(Exosporium and spore surfaceformation in Bacillus cereus T)”J.Bacteriol.115：1179-1190(1973)。更多最近研究已尝试鉴别个别孢子外膜蛋白质。表观72kDa糖蛋白经鉴别为苏云金杆菌孢子的孢子外膜或外壳的组分。García-Patrone等人，“来自苏云金杆菌孢子囊的糖蛋白多聚体：分离至亚单位和糖组成(A glycoprotein multimer from Bacillusthuringiensis sporangia：dissociation into subunits and sugar composition)”Mol.Cell.Biochem.145：29-37(1995)。发现三种其它蛋白质(GroEL及InA与RocA的同源物)与仙人掌杆菌孢子外膜相关，但可能不为其结构组分。Charlton等人，“仙人掌杆菌的孢子外膜的表征(Characterization of the exosporium ofBacillus cereus)”J.Appl.Microbiol.87：241-245(1999)。
咸信芽孢杆菌属孢子本身对环境刺激反应。在一份报导中，使用原子力显微术鉴别当暴露于干燥相对于潮湿环境时，孢子形态的物种特异性变化。举例而言，尺寸变化似乎视物种、生长状况及环境条件而定。一般而言，视所述因素的交互作用而定，孢子宽度可在500-3000nm之间波动。Plomp等人，“芽孢杆菌孢子的高分辨率构建和结构动力学(The high-resolution architecture andstructural dynamics of Bacillus spores)”Biophys J 88：603-608(2005)。另外，除BclA以外，亦咸信炭疽芽孢杆菌孢子外膜含有四种其它主要蛋白质：i)丙氨酸消旋酶；ii)铁/锰超氧化物岐化酶；iii)具未知功能的29,174Da蛋白质；及iv)具未知功能的17,331Da蛋白质。Steichen等人，“炭疽芽孢杆菌孢子外膜的免疫显性蛋白和其它蛋白的鉴定(Identification of the immunodominantprotein and other proteins of the Bacillus anthracis exosporium)”J Bacteriol.185：1903-1910(2003)。
作为成熟细菌孢子的外部表面层，孢子外膜可代表孢子、环境和/或宿主之间的接触表面。孢子外膜包含负责包括(但不限于)免疫原性、环境/宿主附着及稳定性或发芽反应的功能的蛋白质。Redmond等人，“炭疽芽孢杆菌孢子外膜中蛋白的鉴定(Identification of proteins in the exosporium of Bacillusanthracis)”Microbiol 150：355-363(2004)。
举例而言，细菌物种孢子外膜蛋白质可包括(但不限于)推定外壳蛋白质(亦即例如基因cotJC1或cotJC2)、假设性孢子外膜蛋白质、BclA蛋白质、BclB蛋白质、Bcl斯特恩(Sterne)蛋白质、经修饰的BclA或BclB蛋白质、ExsF蛋白质；CotB蛋白质；ExsY蛋白质；CotY蛋白质；ExsK蛋白质、肌苷水解酶、丙氨酸消旋酶、丙酮酸-黄素氧化还原蛋白氧化还原酶(亦即例如基因nifJ)、γ-氨基丁酸代谢脱水酶/异构酶(亦即例如基因abfD)、丁酰基辅酶A去氢酶(亦即例如基因bcd2)、氨基酸氨基转移酶、琥珀酸半醛去氢酶(亦即例如基因sucD)、红素氧还蛋白、黄素蛋白α-亚单位(亦即例如基因etfA2)或2-酮基异戊酸铁氧化还原蛋白还原酶。代表性孢子外膜蛋白质的大小特征概述于表II中：
表II：各种孢子外膜蛋白质的大小特征
| 蛋白质(替代名称) | 大小(Da) | BAS基因编号a |
| 丙氨酸消旋酶 | 43,662 | 238 |
| BclA | 36,836 | 1130 |
| BxpA | 27,702 | 2008 |
| BxpB(ExsF) | 17,331 | 1144 |
| BxpC(BA2332) | 14,379 | 2174 |
| CotB-1 | 19,422 | 340 |
| CotB-2 | 16,830 | 341 |
| CotY(CotZ-2) | 16,842 | 1145 |
| ExsK | 12,034 | 2377 |
| ExsY(CotZ，CotZ-1) | 16,146 | 1141 |
| 肌苷-尿苷核苷水解酶 | 36,276 | 2693 |
| 超氧化物歧化酶 | 36,162 | 1378 |
1.丙氨酸消旋酶
在一个具体实例中，苏云金杆菌库斯塔克血清型(Bacillus thuringiensisserovar kurstaki)菌株1.175丙氨酸消旋酶(亦即例如基因alrA)(登录编号(accession number)DQ402058)包含氨基酸序列(SEQ ID NO：47)：
MEEAPFYRDTWVEVDLDAIYNNVTHIKEFIPSNVEIFAVVKANAYGHDYVPVAKTALEAGATRLAVAFLDEALVLRRAGITEPILVLGPSPPRDVNVAAENDVALTVFQKEWVEEAIKLWDGSSVMKFHINFDSGMGRIGIRERKELKEFLKSLEGAPFLELEGVYTHFATADEVETSYFDKQYNTFLEQLSWLKEFGVDPKFVHTANSAATLRFQGITFNAVRIGIAMYGLSPSVEIRPFLPFELEPALSLHTKVAHIKQVIKGDGISYNVTYRTKAEEWIATVAIGYADGWLRRLQGFEVLINGKRVPIVGRVTMDQFMIHLPCEVPLGTKVTLIGRQGDEYISATEVAEYSGTINYEIIATISFRVPRIFIRNGKVVEIINYLNNI
该氨基酸序列由核酸序列(SEQ ID NO：48)编码：
2.斯特恩(Sterne)蛋白质
在一个具体实例中，炭疽芽孢杆菌斯特恩菌株(Bacillus anthracis str.Sterne)蛋白质(BAS3290)包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列(登录编号(accession number)YP_029547)：
1 msekyiilhg talepnligp tlppippftf pngptgitgp tgatgftgig itgptgvtgp
61 tgigitgptg atglgilpvf gtittdvgig fsvivntnin ftlpgpvsgt tlnpvdnsii
121 inttgvysvs fsivfviqai sssilnltin dsiqfaiesr igggpgvrat sartdllsln
181 qgdvlrvrir eatgdiiysn aslvvskvd
在一个具体实例中，炭疽芽孢杆菌斯特恩菌株蛋白质(BAS3557)包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列(登录编号(accession number)YP_029811)：
在一个具体实例中，具有胶原蛋白三重螺旋重复域的炭疽芽孢杆菌斯特恩菌株蛋白质包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列(登录编号(accession number)YP_030670)：
在一个具体实例中，具有胶原蛋白三重螺旋重复域的炭疽芽孢杆菌斯特恩菌株蛋白质包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列(登录编号(accession number)YP_030869)：
在一个具体实例中，炭疽芽孢杆菌斯特恩菌株蛋白质(BAS2280)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列(登录编号(accession number)YP_028541)：
1 mkkqknllsl aleiilpyrl tgptgitgpt gitgptgitg ptgftgpnit tnsmfanntl
61 ggpisvilgg tniplsnnqs lgnftvnasn diftipvtgr yyltyqvntt tallagtrll
121 lnsstplsgs ifspaistsn ynnnliinli agntislqlf gvlsivnlvg ggstgaslti
181 irid
3.经修饰的蛋白质
在一个具体实例中，经修饰的炭疽芽孢杆菌CEB菌株(Bacillus anthracisstr CEB)蛋白质包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列，其中修饰包含截短前导序列及添加His-6标签：
MAFDPNLVGPTLPPIPPFTLPTGPTGPTGPTGPTGPTGPTGPTGDTGTTGPTGPTGPTGPTGPTGATGLTGPTGPTGPSGLGLPAGLYAFNSGGISLDLGINDPVPFNTVGSQFGTAISQLDADTFVISETGFYKITVIANTATASVLGGLTIQVNGVPVPGTGSSLISLGAPIVIQAITQITTTPSLVEVIVTGLGLSLALGTSASIIIEKVA
4.ExsA蛋白质
在一个具体实例中，本发明预期包含芽孢杆菌属孢子表面蛋白质的组合物，其中该蛋白质包含ExsA蛋白质。ExsA蛋白质位于孢子外膜与细菌外壳中，且可能与枯草杆菌的SafA(SpoVID相关因子)蛋白质相关。在外壳组装早期阶段期间，SafA与SpoVID交互作用。Ozin等人，“SpoVID导向SafA到枯草杆菌中的孢子表面(SpoVID guides SafA to the spore surface in Bacillussubtilis)”J.Bacteriol.183：3041-3049(2001)。认为SpoIVA与SpoVID均用于SafA定位，且两者的同源物均在仙人掌杆菌基因组中编码。以此类推，将预测其亦可能有助于ExsA定位。ExsA在仙人掌杆菌中发挥的作用可能大于SafA在枯草杆菌中发挥的作用，因为已报导关于枯草杆菌safA检测突变体，较少极端的外壳组装缺陷。虽然如同exsA突变体，safA突变型孢子对溶菌酶敏感，但exsA孢子结构受到的干扰相当小。
ExsA蛋白质的氨基酸序列除N端区与C端区以外与SafA相差悬殊。鉴于SafA与ExsA之间的序列差异较大，局部保守区对SafA与ExsA中保留的功能而言很可能意义重大，且可通过在枯草杆菌中的定点突变来探究。虽然ExsA中的多个富含脯氨酸的串联重复序列很可能呈延伸构形，但其功能尚未知，其可为供其它外壳蛋白质结合的重复区域或可充当结合其它外壳蛋白质的区域之间的间隔物。推测此可能为提供包覆层之间一定距离的机制，但为何应存在三个各具有自身序列重复的所述区域尚不明了。虽然仙人掌杆菌/炭疽芽孢杆菌/苏云金杆菌丛集中不同物种及菌株的基因组序列的重复的数目稍有变化，但序列其它方面几乎相同。在嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)与伊汉氏海洋杆菌(Oceanobacillus iheyensis)基因组序列两者中，所编码的SafA同源物亦可含有多个短重复，虽然重复的序列在物种之间并不保守，但其并不如仙人掌杆菌中广泛，且同样其重要性尚不知。Bailey-Smith等人，“仙人掌杆菌的ExsA蛋白要求用于外膜和孢子表面上孢子外膜的装配(The ExsA protein ofBacillus cereus is required for assembly of coat and exosporium onto the sporesurface)”J.Bacteriol.187：3800-3806(2005)。
5.ExsF蛋白质
在一个具体实例中，本发明预期包含芽孢杆菌属孢子表面蛋白质的组合物，其中该蛋白质包含ExsF蛋白质。ExsF蛋白质(亦即例如ExsF、ExsFA及ExsFB)为认为参与BclA长丝适当位于芽孢杆菌属孢子表面且与孢子外膜结晶层的稳定性有关的孢子外膜组分。所述蛋白质可能与其它孢子外膜组分(包括BclA)一起组织于多聚复合物中。蛋白质ExsFA可与BclA交互作用且确保其位于孢子表面上。虽然ExsF的贡献不太清楚，但一个假设为ExsFB及ExsFA与结晶基底层的两个数组的组分交互作用且确保其稳定性。或者，突变ExsF敲除的菌株中缺乏两个孢子组分(35至37kDa)表明ExsF蛋白质可能参与孢子外膜结构组分的组装或与孢子的维持有关。Sylvestre等人，“ExsFA和ExsFB蛋白对BclA在孢子表面的定位和炭疽芽孢杆菌孢子外膜稳定性的贡献(Contribution of ExsFA and ExsFB proteins to the localization of BclAon the spore surface and to the stability of the Bacillus anthracis exosporium)”JBacteriol 187：5122-5128(2005)。该作用因此将类似于关于一些参与枯草杆菌外壳组装的形态形成外壳蛋白质(诸如SpoIVA及SpoVID)所述的作用。Driks A.，“最大保护：细菌孢子表面的装配和功能(Maximum shields：the assembly andfunction of the bacterial spore surface)”Trends Microbiol.10：251-254(2002)。
6.BxpB蛋白质
在一个具体实例中，本发明预期包含芽孢杆菌属孢子表面蛋白质的组合物，其中该蛋白质包含BxpB蛋白质。发现BxpB为存在于经纯化的孢子外膜样品(自炭疽芽孢杆菌斯特恩菌株分离)中的数种蛋白质中的一种。Steichen等人，“炭疽芽孢杆菌孢子外膜的免疫显性蛋白和其它蛋白的鉴定(Identificationof the immunodominant protein and other proteins of the Bacillus anthracisexosporium)”J.Bacteriol.185：1903-1910(2003)。特定言之，发现在化学去糖基化的孢子外膜样品中存在高含量的BxpB。该结果表明BxpB经糖基化或与糖基化物质缔合。然而，BxpB不为糖蛋白，而是与BclA糖蛋白及其它蛋白质形成高分子质量的复合物，所述其它蛋白质包括(但不限于)ExsY或CotY，两者均可见于芽孢杆菌属孢子外膜中。抗BxpB MAb研究表明BxpB可能为主体基底层蛋白质。举例而言，抗BxpB MAb与斯特恩孢子的结合比以缺乏BclA的Δbcla孢子所检测到的结合弱。MAb与斯特恩孢子的结合的减弱主要归因于BclA的蛋白质组分，可能反映出BxpB与BclA紧密交互作用。缺乏BxpB的孢子(亦即例如ΔbxpB突变体)由即使存在正常BclA含量亦缺乏发样绒毛的孢子外膜包裹。然而，极少该BclA与ΔbxpB孢子缔合(亦即例如，为斯特恩孢子上所发现含量的约2％)。Steichen等人，“炭疽芽孢杆菌孢子外膜基底层蛋白BxpB的表征(Characterization of the exosporium basal layer protein BxpB ofBacillus anthracis)”J Bacteriol 187：5868-5876(2005)。
因此，似乎BxpB可能介导BclA附着于基底孢子层及发样绒毛的组装。最近研究指出该附着发生于BclA的38个残基氨基端域(NTD)，而孢子表面BclA蛋白质的其余部分延伸远离孢子。Boydston等人，“炭疽芽孢杆菌胶原样糖蛋白BclA的孢子外膜内定位和结构稳定性(Orientation within theexosporium and structural stability of the collagen like glycoprotein BclA ofBacillus anthracis)”J.Bacteriol.187：5310-5317(2005)。显然，自孢子分离的成熟BclA中不存在该NTD的前19个氨基酸，此最可能归因于蛋白水解处理事件。Steichen等人，“炭疽芽孢杆菌孢子外膜的免疫显性蛋白和其它蛋白的鉴定(Identification of the immunodominant protein and other proteins of the Bacillusanthracis exosporium)”J.Bacteriol.185：1903-1910(2003)；及Sylvestre等人，“胶原样表面糖蛋白是炭疽芽胞杆菌孢子外膜的结构成分(A collagen-like surfaceglycoprotein is a structural component of the Bacillus anthracis exosporium)”Mol.Microbiol.45：169-178(2002)。虽然不必了解发明机制，但咸信该处理事件可能与BclA附着于孢子外膜的基底层(可能经由与BxpB直接共价键联)相关。
在一个具体实例中，BxpB孢子外膜蛋白质包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列：
mfssdceftkidceakpastlpafgfafnasapqfaslftplllpsvspnpnitvpvind
tvsvgdgirilragiyqisytltisldnspvapeagrfflslgtpaniipgsgtavrsnv
igtgevdvssgvilinlnpgdlirivpveligtvdiraaaltvaqis
7.ExsJ蛋白质
在一个具体实例中，ExsJ孢子外膜蛋白质(仙人掌杆菌)包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列(登录编号(accession number)AY 183116.1)：
MKHNDCFDHNNCNPIVFSADCCKNPQSVPITREQLSQLITLLNSLVSAISAFFANPSNANRLVLLDLFNQFLIFLNSLLPSPEVNFLKQLTQSIIVLLQSPAPNLGQLSTLLQQFYSALAQFFFALDLIPISCNSNVDSATLQLLFNLLIQLINATPGATGPTGPTGPTGPTGPAGTGAGPTGATGATGATGPTGATGPAGTGGATGATGATGVTGATGATGATGPTGPTGATGPTGATGATGATGPTGATGPTGATGLTGATGAAGGGAIIPFASGTTPSALVNALVANTGTLLGFGFSQPGVALTGGTSITLALGVGDYAFVAPRAGTITSLAGFFSATAALAPISPVQVQIQILTAPAASNTFTVQGAPLLLTPAFAAIAIGSTASGIIAEAIPVAAGDKILLYVSLTAASPIAAVAGFVSAGINIV
该氨基酸序列由核酸序列SEQ ID NO：57编码：
8.ExsH蛋白质
在一个具体实例中，ExsH孢子外膜蛋白质(仙人掌杆菌)包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列：
MKHNDCFDHNNCNPIVFSADCCKNPQSVPITREQLSQLITLLNSLVSAISAFFANPSNANRLVLLDLFNQFLIFLNSLLPSPEVNFLKQLTQSIIVLLQSPAPNLGQLSTLLQQFYSALAQFFFALDLIPISCNSNVDSATLQLLFNLLIQLINATPGATGPTGPTGPTGPTGPAGTGAGPTGATGATGATGPTGATGPAGTGGATGATGATGVTGATGATGATGPTGPTGATGPTGATGATGATGPTGATGPTGATGLTGATGAAGGGAIIPFASGTTPSALVNALVANTGTLLGFGFSQPGVALTGGTSITLALGVGDYAFVAPRAGTITSLAGFFSATAALAPISPVQVQIQILTAPAASNTFTVQGAPLLLTPAFAAIAIGSTASGIIAEAIPVAAGDKILLYVSLTAASPIAAVAGFVSAGINIV
该氨基酸序列由包含SEQ ID NO：59的核酸序列编码：
9.CotB蛋白质
在一个具体实例中，本发明预期CotB孢子外膜蛋白质(枯草杆菌；登录编号(accession number)AY186996)，其包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列：
MSKRRMKYHSNNEISYYNFLHSM
该氨基酸序列由SEQ ID NO：61的核酸序列编码：
1 gatcatttaa gtattttatg aatgcgtgaa aatgggtatt cgcggaaaaa gcgacaatta
61 ggctattgaa ttagttcaac aaataaatgt gacacgtata tatgcagtat gtttatcatc
121 tatgtataag tgactaggag gaatttgaat gagcaagagg agaatgaaat atcattcaaa
181 taatgaaata tcgtattata actttttgca ctcaatg.
10.CotY蛋白质
在一个具体实例中，本发明预期CotY孢子外膜蛋白质(仙人掌杆菌)，其包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列：
MSCNCNEDHQHECDFNCVSNVVRFIHELQECATTTCGSGCEVPFLGAHNNASVANTRPFILYTKTGEPFEAFAPSSSLTSCRSPIFRVESIDDDDCAVLRVLTVVLGDGTAVPPGDDPICTFLAVPNARLISTSTCITVDLSCFCAIQCLRDVSI
该氨基酸序列由SEQ ID NO：63的核酸序列编码：
11.ExsY蛋白质
在一个具体实例中，ExsY孢子外膜蛋白质(仙人掌杆菌)包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列(登录编号(accession number)AY121973)：
MSCNENKHHGSSHCVVDVVKFINELQDCSTTTCGSGCEIPFLGAHNTASVANTRPFILYTKTGEPFEAFAPSASLTSCRSPIFRVESVDDDSCAVLRVLTVVLGDSSPVPPGDDPICTFLAVPNARLISTTTCITVDLSCFCAIQCLRDVSIVK
该氨基酸序列由核酸序列SEQ ID NO：65编码：
在一个具体实例中，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringes)孢子表面同源蛋白质包含三重螺旋蛋白质，其包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列(登录编号(accession number)YP_695648)：
MIRKIYNPNRYYDDYNRYNCYDRYNCYDDEYCQDDYYCKEDCYCKDDCYLEINCNCCDCCKPGPRGPRGPQGPRGPQGPRGPMGCQGERGPIGPMGPMGPIGPQGPQGDQGLTGPQGPAGPQGEQGPQGDQGPVGPIGPQGPQGEQGLTGPQGPAGSQGPEGPTGPQGATGPQGPEGPTGAQGDQGPVGPQGAQGPQGPQGPQGATGPTGPQGPQGNQGPAGPQGPVGPQGPQGEPGVDFDDTLLVSYSSLTSQNVNANGIFTYNIQNPNGSTFTAITANIANGTFTINEPGRYLFMWSFNLDNTNNTTASAIVSLFRNGSRVFLSGTPRVAPGEIGVVNGSIAVNANAGDVFALVNNSTRNVLSQIISSPISVTPAILGESTGINSGIGSWVQIVRVSD
II.抗体对微生物孢子结合的抑制
在一个具体实例中，本发明预期使用抗体抑制微生物孢子结合和/或附着于无生命和/或有生命表面。在一个具体实例中，抗体抑制梭菌属孢子结合。所述抗体包括(但不限于)多克隆抗体及单克隆抗体。另外，可例如通过使小鼠抗体基因剪接于人类抗体基因来产生嵌合抗体。亦预期单链抗体以及通过胃蛋白酶消化抗体分子或通过还原Fab片段的二硫键所产生的抗体片段。
A.抗体产生方法
本发明提供经分离的抗体或其片段(亦即例如多克隆、单克隆和/或Fab′)。在一个具体实例中，本发明提供特异性抑制微生物孢子表面蛋白质与各种表面(亦即例如有生命表面和/或无生命表面)结合的单克隆抗体。
针对本发明蛋白质的抗体可为任何单克隆或多克隆抗体，只要其可识别蛋白质。可根据习用抗体或抗血清制备方法通过使用本发明蛋白质作为抗原来产生抗体。可使用任何适合的方法来产生本发明方法及组合物中所使用的抗体，包括(但不限于)本文所揭示的方法。举例而言，制备单克隆抗体时，在允许产生抗体的条件(亦即例如免疫)下，将蛋白质按原样或与适合载剂或稀释剂一起给予至动物(例如哺乳动物)。通常每2周至6周给予蛋白质一次，总计约2次至约10次。适合用于所述方法中的动物包括(但不限于)灵长类动物、兔、狗、天竺鼠(guinea pig)、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等，且可通过注射全长蛋白质或保留免疫原性性质的任何部分、片段或寡肽进行免疫。视宿主物种而定，可使用各种佐剂来增强免疫反应。为增强抗体产生能力，可给予完全或不完全的弗氏佐剂(Freund′s adjuvant)。所述佐剂包括(但不限于)弗氏佐剂、矿物凝胶(诸如氢氧化铝)及表面活性物质(诸如溶血磷脂、复合多元醇(pluronic polyols)、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔螺血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin)及二硝基酚)。BCG(卡介苗(Bacillus Calmette-Guefin))及短小棒状杆菌(Cornebacterium parrum)为可能适用的佐剂。
可使用任何提供在培养中由连续细胞株产生抗体分子的技术制备单克隆抗体。所述技术包括(但不限于)杂交瘤技术。Koehler等人，Nature256：495-497(1975)；Kosbor等人，Immunol Today 4：72(1983)；Cote等人，ProcNatl Acad Sci 80：2026.-2030(1983)；Cole等人，单克隆抗体和癌治疗(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，Alan R Liss Inc，New York，N.Y.，第77-96页(1985)(所有参考文献以引用的方式并入本文中)。
为制备单克隆抗体产生细胞，选择抗体效价已经证实的个别动物(例如小鼠)，且最终免疫后2天至5天，采集其脾或淋巴结且使其中所含的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合来制备所要单克隆抗体生产杂交瘤。可例如通过使如下文所描述的经标记的蛋白质与抗血清反应，随后量测结合于抗体的标记试剂的活性来进行量测抗血清中的抗体效价。可根据已知方法进行细胞融合，例如Koehler及Milstein(Nature 256：495[1975])描述的方法。使用例如聚乙二醇(PEG)或仙台病毒(Sendai virus，HVJ)，较佳使用PEG作为融合促进剂。
骨髓瘤细胞的实例包括NS-1、P3U1、SP2/0、AP-1及其类似物。抗体生产细胞(亦即例如脾细胞)的数目与欲使用的骨髓瘤细胞的数目的比例较佳为约1∶1至约20∶1。所添加PEG(较佳为PEG 1000-PEG 6000)的浓度较佳为约10％至约80％。可通过在约20℃至约40℃、较佳约30℃至约37℃下培育两种细胞的混合物约1分钟至10分钟来有效进行细胞融合。
可使用各种方法筛选产生抗体(例如针对本发明的肿瘤抗原或自体抗体)的杂交瘤。举例而言，其中直接或与载剂一起向抗体吸附的固相(例如微板)中添加杂交瘤上清液，并随后添加经放射性物质或酶标记的抗免疫球蛋白抗体(若细胞融合中使用小鼠细胞，则使用抗小鼠免疫球蛋白抗体)或蛋白质A以检测针对结合于固相的蛋白质的单克隆抗体。或者，向抗免疫球蛋白抗体或蛋白质A吸附的固相中添加杂交瘤上清液，并随后添加经放射性物质或酶标记的蛋白质以检测针对结合于固相的蛋白质的单克隆抗体。
可根据任何已知方法或其修饰进行选择单克隆抗体。通常采用添加HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)的用于动物细胞的培养基。可采用任何选择及生长培养基，只要杂交瘤可以生长。举例而言，可使用含1％至20％、较佳10％至20％胎牛血清的RPMI 1640培养基、含1％至10％胎牛血清的GIT培养基、用于培养杂交瘤的无血清培养基(SFM-101，Nissui Seiyaku)及其类似物。通常在20℃至40℃、较佳37℃下在约5％CO2气体下进行培养，持续约5天至3周，较佳1周至2周。可根据与以上关于抗血清中抗蛋白质的抗体效价所述相同的方式量测杂交瘤培养物上清液的抗体效价。
可根据与习用多克隆抗体的分离与纯化(诸如免疫球蛋白的分离与纯化)相同的方式进行单克隆抗体的分离与纯化，所述方式为例如盐析、醇沉淀(alcoholic precipitation)、等电点沉淀、电泳、使用离子交换剂(例如DEAE)进行吸附与解吸、超离心、凝胶过滤、或其中利用诸如抗原结合固相、蛋白质A或蛋白质G的主动吸附剂仅收集某一抗体并解离结合获得该抗体的特定纯化方法。
可利用任何已知方法或所述方法的修饰制备多克隆抗体，包括自患者获得抗体。举例而言，制备免疫原(针对蛋白质的抗原)与载体蛋白质的复合物且根据与关于上述单克隆抗体制剂所述相同的方式用该复合物免疫动物。再自经免疫的动物回收含该抗体的物质，且分离与纯化该抗体。
关于欲用于免疫动物的免疫原与载体蛋白质的复合物，可采用任何载体蛋白质及任何混合比的该载体与半抗原(hapten)，只要有效产生针对交联于载体上且用于免疫的半抗原的抗体。举例而言，可使牛血清白蛋白、牛环状球蛋白(bovine cycloglobulin)、匙孔螺血蓝蛋白等与半抗原偶合，其重量比为每1份半抗原约0.1份至约20份，较佳为约1份至约5份。
另外，可使用各种缩合剂来偶合半抗原与载体。举例而言，发现与本发明使用戊二醛、碳二亚胺、顺丁烯二酰亚胺活化的酯、含硫醇基或二硫代吡啶基(dithiopyridyl)的活化酯试剂及其类似物。将缩合产物按原样或与适合载剂或稀释剂一起给药至允许抗体产生的动物部位。为增强抗体产生能力，可给予完全或不完全弗氏佐剂。通常每2周至6周给予蛋白质一次，总计约3次至约10次。
自利用上述方法免疫的动物的血液、腹水及其类似物回收多克隆抗体。可根据与以上关于杂交瘤培养的上清液所述相同的方式量测抗血清中的抗体效价。可根据与关于上述单克隆抗体所述相同的免疫球蛋白分离与纯化方法进行抗体的分离与纯化。
本文中用作免疫原的蛋白质不限于任何特定类型的免疫原。举例而言，可使用因病毒感染所致而表达的蛋白质(另外包括具有核苷酸序列部分改变的基因)作为免疫原。另外，可使用蛋白质片段。可利用任何方法获得片段，所述方法包括(但不限于)表达基因片段、酶促处理蛋白质、化学合成及其类似方法。
为了在本发明的背景下产生抗体，本文预期的微生物孢子蛋白质氨基酸序列(亦即例如SEQ ID NO：1、3、5、7或9)的任何抗原性部分可单独使用或与另一蛋白质的氨基酸(亦即例如谷胱甘肽以产生针对嵌合分子的抗体)融合。所述抗体包括(但不限于)多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fab片段及Fab表达库产生的片段。对诊断及治疗而言，中和抗体(亦即抑制二聚体形成的抗体)尤其较佳。
用于抗体诱导的多肽不需要保留生物活性；然而，蛋白质片段或寡肽应具抗原性。用于诱导特异性抗体的肽可具有包含至少5个氨基酸、较佳至少10个氨基酸的氨基酸序列。其较佳应模拟天然蛋白质的氨基酸序列的部分且可含有天然存在的小分子的整个氨基酸序列。可使氨基酸序列的短延伸(stretch)与另一蛋白质的短延伸融合，该另一蛋白质包括(但不限于)匙孔螺血蓝蛋白及针对嵌合分子产生的抗体。
亦可利用包括(但不限于)酶联免疫吸附检定(ELISA)、放射免疫检定(RIA)及荧光活化细胞分类(FACS)的技术使用抗体检测样品(包括但不限于体液、细胞提取物、组织提取物或表面擦拭物)中的多肽。可将报导分子与多肽及抗体连接以有利于检测多肽-抗体结合。
B.抗体抑制微生物孢子表面蛋白质结合的方法
在一个具体实例中，本发明预期筛选方法，其包含对梭菌属孢子表面蛋白质具有亲和力的单克隆和/或多克隆抗体。
已报导用仙人掌杆菌T孢子与产芽孢梭菌PA3679孢子的1∶1混合物所免疫的小鼠导致产生397个杂交瘤，就其与107个仙人掌杆菌孢子的反应性及其与107个产芽孢梭菌孢子的反应性进行筛选。显然，9个杂交瘤产生对仙人掌杆菌T孢子具有特异性的抗体，而15个杂交瘤产生对产芽孢梭菌孢子具有特异性的抗体。7个杂交瘤产生与仙人掌杆菌T孢子及产芽孢梭菌孢子交叉反应的抗体。Quinlan等人，“用于杆菌和梭菌孢子检测的单克隆抗体(Monoclonalantibodies for use in detection of Bacillus and Clostridium spores)”Appl EnvironMicrobiol.63：482-487(1997)。亚克隆化两个对产芽孢梭菌孢子具有特异性的杂交瘤产生抗体，且将所得IgM抗体命名为C33及C225。
通过使用斑点印迹格式定性(目测)检查抗体与多种芽孢杆菌属、梭菌属及脱硫肠状菌属孢子的反应性。抗体C33与产芽孢梭菌孢子强烈反应，而与产气荚膜梭菌(C.perfringens)孢子微弱反应。抗体C225与巨大芽孢杆菌孢子微弱反应，而与嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、产气荚膜梭菌及产芽孢梭菌孢子强烈反应。抗原在产芽孢梭菌中的免疫细胞化学定位表明其存在于孢子的孢子外膜及外部皮层区上。
虽然关于产芽孢梭菌孢子抗原的可用信息不多，但已证明特定孢子抗原不同于植物抗原。Norris J.，“细菌孢子抗原：回顾(Bacterial spore antigens：areview)”J.Gen.Microbiol.28：393-408(1962)；及Princewell，T.，“产芽孢梭状芽孢杆菌的孢子抗原(Spore antigens of Clostridium sporogenes)”J.Med.Microbiol.12：29-41(1979)。虽然不必了解发明机制，但咸信针对梭菌属孢子抗原产生的多克隆抗体在超过一种特定梭菌属中通用。Foegeding等人，“检测细菌孢子的酶联免疫吸附测定(ELISA)中的多克隆抗体(Polyclonal antibodies inan enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)to detect bacterial spores)”J.Rapid Methods Automat.Microbiol.2：135-150(1993)。
在一个具体实例中，本发明预期使用对梭菌属孢子表面蛋白质(亦即例如CD 1581)具有亲和力的单克隆和/或多克隆抗体来破坏梭菌属孢子与表面的结合的方法。在一个具体实例中，表面可选自包括(但不限于)塑料、陶瓷、不锈钢、钢铁(iron steel)、乙烯树脂、瓷砖、层压木板、皮肤(亦即例如猪皮)、内部身体组织、衣物或环境防护服(environmental protection suit)的群组。
C.抗体对微生物孢子结合的抑制
使用修改的杯洗(cup scrub)法评估艰难梭菌孢子结合人类皮肤替代物(亦即例如猪皮)的能力。参见实施例X。首先使用非抗微生物肥皂洗涤猪皮30秒，接着用水冲洗30秒。洗涤猪皮后，在皮肤表面直径为20mm的区域中添加至多50μl孢子。使孢子干燥达1小时，且随后根据杯洗法移除。该实验测定艰难梭菌孢子结合皮肤替代物的能力。初步数据显示多达80％的孢子可自猪皮表面移除。在后续实验中，施用于皮肤表面之前，首先使孢子与艰难梭菌孢子表面抗体反应。再次使用杯洗法测定自皮肤移除孢子的能力。初步数据显示自猪皮移除超过80％的孢子的能力，表明抗体阻止孢子与皮肤结合。
III.微生物孢子表面蛋白质对微生物孢子结合的抑制
在一个具体实例中，本发明预期包含使用感染控制剂抑制微生物孢子结合的方法，其中该试剂包含微生物孢子蛋白质的至少一部分。虽然不必了解发明机制，但咸信感染控制剂竞争表面结合位点，其中微生物孢子对该位点具有类似亲和力。另外认为所产生的竞争性结合自表面附着位点置换先前结合的细菌孢子和/或由于存在微生物孢子表面蛋白质的至少一部分而在空间上阻止结合。
在一个具体实例中，孢子表面蛋白质可来源于选自包含细菌、病毒、真菌、藻类或霉菌的群组的微生物生物体。在一个具体实例中，该方法进一步包含利用孢子表面蛋白质阻止微生物孢子附着于表面。在一个具体实例中，将孢子表面蛋白质与选自包含小分子、蛋白质或核酸的群组的非孢子表面蛋白质化合物一起调配。在一个具体实例中，将孢子表面蛋白质与表面作用剂一起调配，所述表面作用剂可包括(但不限于)界面活性剂、肥皂、清洁剂、发泡剂、润湿剂及雾化剂。在一个具体实例中，化合物选自已知为溶剂的化合物类别。
A.全长孢子表面蛋白质
在一个具体实例中，微生物孢子表面蛋白质的至少一部分包含全长微生物孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，全长微生物孢子表面蛋白质包含梭菌属孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，梭菌属全长孢子表面蛋白质包含艰难梭菌全长孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，艰难梭菌全长孢子表面蛋白质可选自包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQID NO：9的群组。
在一个具体实例中，全长微生物孢子表面蛋白质包含芽孢杆菌属孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，芽孢杆菌属全长孢子表面蛋白质包含炭疽芽孢杆菌全长孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，炭疽芽孢杆菌全长孢子表面蛋白质可选自包含SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49的群组。
B.截短孢子表面蛋白质
在一个具体实例中，微生物孢子表面蛋白质的至少一部分包含截短微生物孢子表面蛋白质。虽然不必了解发明机制，但咸信可由重组蛋白质表达平台(见下文)构建所述截短微生物孢子表面蛋白质，其中使编码微生物孢子表面蛋白质的核酸序列的一部分整合于载体内且置于与兼容启动子可操作地组合之处。或者，所述截短微生物表面蛋白质可通过使用先前报导的任何一种或多种肽酶消化全长微生物孢子表面蛋白质而产生。所述肽酶可包含包括(但不限于)内肽酶、外肽酶、酰胺肽酶(amidopeptidase)和/或羧肽酶的酶。
在一个具体实例中，截短微生物孢子表面蛋白质来源于梭菌属孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，梭菌属截短孢子表面蛋白质包含艰难梭菌截短孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，艰难梭菌截短孢子表面蛋白质可来源于表III中所列的梭菌属假设性蛋白质(CD 1581)：
表III.艰难梭菌孢子表面蛋白质截短肽片段
| 肽片段 | 序列识别编号 |
| MENKKCYSED | SEQ ID NO：67 |
| WYERGESTAK | SEQ ID NO：68 |
| WFQNDREEYE | SEQ ID NO：69 |
| REAYDEDRER | SEQ ID NO：70 |
| RGSNCGCSDS | SEQ ID NO：71 |
| GENRPRNCER | SEQ ID NO：72 |
| FRREAEIRER | SEQ ID NO：73 |
| EAREAFCESS | SEQ ID NO：74 |
| EKKKEALAYE | SEQ ID NO：75 |
| CEARKLWEEA | SEQ ID NO：76 |
| EKYWDEYSKY | SEQ ID NO：77 |
| NYKGIEYLAE | SEQ ID NO：78 |
| AARLFDEGME | SEQ ID NO：79 |
| CEARRNGNNG | SEQ ID NO：80 |
| GNNNNCCHKC | SEQ ID NO：81 |
| HKCNCNCCRK | SEQ ID NO：82 |
在一个具体实例中，艰难梭菌截短孢子表面蛋白质可来源于表IV中所列的梭菌属假设性蛋白质(CD 1067)：
表IV.艰难梭菌孢子表面蛋白质截短肽片段
| 肽片段 | 序列识别编号 |
| MQDYKKNKRR | SEQ ID NO：83 |
| MMNQPMSTMN | SEQ ID NO：84 |
| EEEVYTDEIN | SEQ ID NO：85 |
| SEDMRGFKKS | SEQ ID NO：86 |
| HHHNGCNTDN | SEQ ID NO：87 |
| KCECHDDCNP | SEQ ID NO：88 |
| CNPCNPCKPN | SEQ ID NO：89 |
| PCNPCKPNPC | SEQ ID NO：90 |
| DDNCGCHDNC | SEQ ID NO：91 |
| KCDCEPCEMD | SEQ ID NO：92 |
| SDECFENKCG | SEQ ID NO：93 |
| PECCNPISPR | SEQ ID NO：94 |
| NFSVSNAVPF | SEQ ID NO：95 |
| AIEANRIFDT | SEQ ID NO：96 |
| MQFQTFTDAT | SEQ ID NO：97 |
| GPNGEPLTFE | SEQ ID NO：98 |
| TEVVEVFGSV | SEQ ID NO：99 |
| PSAGQASVTI | SEQ ID NO：100 |
| EKICLSNDGI | SEQ ID NO：101 |
| VIDTGMTTLE | SEQ ID NO：102 |
| DFDLDPLGDI | SEQ ID NO：103 |
| VGRNCETTFE | SEQ ID NO：104 |
| FAVCGERNSE | SEQ ID NO：105 |
| CCRQGKGKSV | SEQ ID NO：106 |
| AYKQRGLTVA | SEQ ID NO：107 |
| VRNLVLELRG | SEQ ID NO：108 |
| RCGCTEFVAL | SEQ ID NO：109 |
| AFPAVRAGGG | SEQ ID NO：110 |
| CKRRVDYVEF | SEQ ID NO：111 |
| TFNTLSAPIC | SEQ ID NO：112 |
| LPADGRAVTL | SEQ ID NO：113 |
| RQEYQTNLTV | SEQ ID NO：114 |
| DCIGKSILKL | SEQ ID NO：115 |
| ECNECCEPFY | SEQ ID NO：116 |
| ELIIPNDIDL | SEQ ID NO：117 |
| VLCLQETVST | SEQ ID NO：118 |
| LISEQIVVLA | SEQ ID NO：119 |
| SPNPIQPRLV | SEQ ID NO：120 |
| DTFSKVCDFS | SEQ ID NO：121 |
| QCGPNHGSGK | SEQ ID NO：122 |
| PSCHR | SEQ ID NO：123 |
在一个具体实例中，艰难梭菌截短孢子表面蛋白质可来源于表V中所列的梭菌属假设性蛋白质(CD 3620)：
表V.艰难梭菌孢子表面蛋白质截短肽片段
| 肽片段 | 序列识别编号 |
| MYDDYKYNKC | SEQ ID NO：124 |
| NKCYNDYEEM | SEQ ID NO：125 |
| THVHEYSESV | SEQ ID NO：126 |
| KLAEECEDRH | SEQ ID NO：127 |
| NHRAAGVTGE | SEQ ID NO：128 |
| AIPINGGTNH | SEQ ID NO：129 |
| VHKINDNVDF | SEQ ID NO：130 |
| LDHFHKICVT | SEQ ID NO：131 |
| TGPAIRIPGT | SEQ ID NO：132 |
| DKHIHLICGE | SEQ ID NO：133 |
| TTVNDGHCHK | SEQ ID NO：134 |
| FLFTTQIEAPLV | SEQ ID NO：135 |
在一个具体实例中，艰难梭菌截短孢子表面蛋白质可来源于表VI中所列的梭菌属假设性蛋白质(CD 1613)：
表VI.艰难梭菌孢子表面蛋白质截短肽片段
| 肽片段 | 序列识别编号 |
| MENNKCREDF | SEQ ID NO：136 |
| RFTQEYEEDY | SEQ ID NO：137 |
| PNTNERYYEN | SEQ ID NO：138 |
| YQVADRYYNY | SEQ ID NO：139 |
| PNKYKEPKIK | SEQ ID NO：140 |
| QCCCKKSMRE | SEQ ID NO：141 |
| ALELLRYDAL | SEQ ID NO：142 |
| RPFVNFNQFA | SEQ ID NO：143 |
| FISDFFIVGA | SEQ ID NO：144 |
| NLVGIDLSAP | SEQ ID NO：145 |
| PKDNLSGLDG | SEQ ID NO：146 |
| TFERFSACNC | SEQ ID NO：147 |
| DLIDIAGRVS | SEQ ID NO：148 |
| YPIPVPLTLE | SEQ ID NO：149 |
| GLINTIGTIP | SEQ ID NO：150 |
| GVAELIALID | SEQ ID NO：151 |
| AVIPPTIDLG | SEQ ID NO：152 |
| AILDAILAAI | SEQ ID NO：153 |
| IDFILAASTP | SEQ ID NO：154 |
| LANVDLASLC | SEQ ID NO：155 |
| NLKAVAFDIT | SEQ ID NO：156 |
| PADYEDFIAS | SEQ ID NO：157 |
| LGYYLDKKHY | SEQ ID NO：158 |
| KECNCNCDCD | SEQ ID NO：159 |
| DCCCNKGILD | SEQ ID NO：160 |
| NLYMSNINNQ | SEQ ID NO：161 |
| VTVVAGSLVL | SEQ ID NO：162 |
| TGVEVLGKKN | SEQ ID NO：163 |
| DVIVLGNSND | SEQ ID NO：164 |
| SRIYFVCVDS | SEQ ID NO：165 |
| IDYIA | SEQ ID NO：166 |
在一个具体实例中，梭菌属截短孢子表面蛋白质可来源于表VII中所列的假设性蛋白质(CD 1711)：
表VII.艰难梭菌孢子表面蛋白质截短肽片段
| 肽片段 | 序列识别编号 |
| MLIVTTEKVE | SEQ ID NO：167 |
| GKKISKVLGL | SEQ ID NO：168 |
| VRGSTIRAKH | SEQ ID NO：169 |
| VGKDIGASFK | SEQ ID NO：170 |
| NLVGGELTGY | SEQ ID NO：171 |
| NEMLTEARQI | SEQ ID NO：172 |
| AIGRMVEDAE | SEQ ID NO：173 |
| AKGANAVIAF | SEQ ID NO：174 |
| RLSSASVMQG | SEQ ID NO：175 |
| AAEMLAYGTA | SEQ ID NO：176 |
| VVLEDDNSILEK | SEQ ID NO：177 |
在一个具体实例中，梭菌属截短孢子表面蛋白质可来源于表VIII中所列的假设性蛋白质(CD 0881)：
表VIII.艰难梭菌孢子表面蛋白质截短肽片段
| 肽片段 | 序列识别编号 |
| MGTKIVLSIV | SEQ ID NO：178 |
| LIVVVVAISL | SEQ ID NO：179 |
| TCIRVIKQSK | SEQ ID NO：180 |
| VGIIMRLGKF | SEQ ID NO：181 |
| QKVAETGVHF | SEQ ID NO：182 |
| LIPFLDKMAY | SEQ ID NO：183 |
| VIDLREIVID | SEQ ID NO：184 |
| FPPQPVITKD | SEQ ID NO：185 |
| NVTMQIDTVV | SEQ ID NO：186 |
| YYKVTDPVRY | SEQ ID NO：187 |
| VFEIANPIAA | SEQ ID NO：188 |
| IENLTATTLR | SEQ ID NO：189 |
| NIIGELDLDE | SEQ ID NO：190 |
| TLTSRDIINV | SEQ ID NO：191 |
| KMRTILDEAT | SEQ ID NO：192 |
| DKWGIKVNRV | SEQ ID NO：193 |
| ELKNIMPPQD | SEQ ID NO：194 |
| IQVAMEKQMR | SEQ ID NO：195 |
| AERERREAIL | SEQ ID NO：196 |
| QAEGNKSAAI | SEQ ID NO：197 |
| LQAEGEKQSA | SEQ ID NO：198 |
| ILTAEAKKEA | SEQ ID NO：199 |
| MVRVAEGEKE | SEQ ID NO：200 |
| SAILVAEGEA | SEQ ID NO：201 |
| EAIRQTAIAK | SEQ ID NO：202 |
| AQGEAEMIKR | SEQ ID NO：203 |
| TQMATAEGLK | SEQ ID NO：204 |
| LVFSAMKEAD | SEQ ID NO：205 |
| IDNNILALKS | SEQ ID NO：206 |
| MEALEKMAEG | SEQ ID NO：207 |
| KSTKLVLPSE | SEQ ID NO：208 |
| AVNFLGTFKG | SEQ ID NO：209 |
| IKEVMSDDNK | SEQ ID NO：210 |
| EVLDIKEVLN | SEQ ID NO：211 |
| DNESLKK | SEQ ID NO：212 |
在一个具体实例中，梭菌属截短孢子表面蛋白质可来源于表IX中所列的假设性蛋白质(CD 1511)：
表IX.艰难梭菌孢子表面蛋白质截短肽片段
| 肽片段 | 序列识别编号 |
| MIDNQKYVIL | SEQ ID NO：213 |
| SLELHLFFSR | SEQ ID NO：214 |
| IMKEHALFLE | SEQ ID NO：215 |
| AGFTNKNYNL | SEQ ID NO：216 |
| AMEADHYKKQ | SEQ ID NO：217 |
| FEDLLSYTVS | SEQ ID NO：218 |
| ASNGIIRPDI | SEQ ID NO：219 |
| LYSEELVTTL | SEQ ID NO：220 |
| TSVAEQKTEE | SEQ ID NO：221 |
| FTGIEINKNI | SEQ ID NO：222 |
| TTRELNLQSG | SEQ ID NO：223 |
| VNPQVGQDLV | SEQ ID NO：224 |
| NYVAQLNSDA | SEQ ID NO：225 |
| IRLLDGLINF | SEQ ID NO：226 |
| KERVLDGVLS | SEQ ID NO：227 |
| CTIFTSNYPL | SEQ ID NO：228 |
| LLEHIIHEAN | SEQ ID NO：229 |
| LYRSYVVDLE | SEQ ID NO：230 |
| NKIDIESKNA | SEQ ID NO：231 |
| KEIELFWDHI | SEQ ID NO：232 |
| MMEHALFMRG | SEQ ID NO：233 |
| LLDPSEGELI | SEQ ID NO：234 |
| NTSNDFAIKF | SEQ ID NO：235 |
| NELIEKTNEM | SEQ ID NO：236 |
| TDSNIKNITE | SEQ ID NO：237 |
| ETLNETVEFK | SEQ ID NO：238 |
| DFKEAGASGI | SEQ ID NO：239 |
| EQCKIKSIIL | SEQ ID NO：240 |
| PLLADHVLRE | SEQ ID NO：241 |
| ANHYIRILES | SEQ ID NO：242 |
| YKNM | SEQ ID NO：243 |
在一个具体实例中，艰难梭菌截短孢子表面蛋白质可来源于表X中所列的胶原蛋白样蛋白质。
表X.艰难梭菌孢子表面蛋白质截短肽片段
| 肽片段 | 序列识别编号 |
| MRNIILYLND | SEQ ID NO：244 |
| DTFISKKYPD | SEQ ID NO：245 |
| KNFSNLDYCL | SEQ ID NO：246 |
| IGSKCSNSFV | SEQ ID NO：247 |
| KEKLITFFKV | SEQ ID NO：248 |
| RIPDILKDKS | SEQ ID NO：249 |
| ILKAELFIHI | SEQ ID NO：250 |
| DSNKNHIFKE | SEQ ID NO：251 |
| KVDIEIKRIS | SEQ ID NO：252 |
| EYYNLRTITW | SEQ ID NO：253 |
| NDRVSMENIR | SEQ ID NO：254 |
| GYLPIGISDT | SEQ ID NO：255 |
| SNYICLNITG | SEQ ID NO：256 |
| TIKAWAMNKY | SEQ ID NO：257 |
| PNYGLALSLN | SEQ ID NO：258 |
| YPYQIleftS | SEQ ID NO：259 |
| SRGCNKPYIL | SEQ ID NO：260 |
| VTFEDRIIDN | SEQ ID NO：261 |
| CYPKCECPPI | SEQ ID NO：262 |
| RITGPMGPRG | SEQ ID NO：263 |
| ATGSTGPMGV | SEQ ID NO：264 |
| TGPTGSTGAT | SEQ ID NO：265 |
| GSIGPTGPTG | SEQ ID NO：266 |
| NTGATGSIGP | SEQ ID NO：267 |
| TGVTGPTGST | SEQ ID NO：268 |
| GATGSIGPTG | SEQ ID NO：269 |
| VTGPTGNTGV | SEQ ID NO：270 |
| TGSIGPTGAT | SEQ ID NO：271 |
| GPTGNTGVTG | SEQ ID NO：272 |
| SIGPTGVTGP | SEQ ID NO：273 |
| TGNTGEIGPT | SEQ ID NO：274 |
| GATGPTGVTG | SEQ ID NO：275 |
| SIGPTGATGP | SEQ ID NO：276 |
| TGEIGPTGAT | SEQ ID NO：277 |
| ATGPTGATGV | SEQ ID NO：278 |
| TGEIGPTGEI | SEQ ID NO：279 |
| GPTGATGPTG | SEQ ID NO：280 |
| VTGEIGPTGA | SEQ ID NO：281 |
| TGPTGNTGVT | SEQ ID NO：282 |
| GEIGPTGATG | SEQ ID NO：283 |
| PTGNTGVTGE | SEQ ID NO：284 |
| IGPTGATGPT | SEQ ID NO：285 |
| GVTGEIGPTG | SEQ ID NO：286 |
| NTGATGSIGP | SEQ ID NO：287 |
| TGVTGPTGAT | SEQ ID NO：288 |
| GSIGPTGATG | SEQ ID NO：289 |
| ATGVTGPTGP | SEQ ID NO：290 |
| TGATGNSSQP | SEQ ID NO：291 |
| VANFLVNAPS | SEQ ID NO：292 |
| PQTLNNGDAI | SEQ ID NO：293 |
| TGWQTIIGNS | SEQ ID NO：294 |
| SSITVDTNGT | SEQ ID NO：295 |
| FTVQENGVYY | SEQ ID NO：296 |
| ISVSVALQPG | SEQ ID NO：297 |
| SSSINQYSFA | SEQ ID NO：298 |
| ILFPILGGKD | SEQ ID NO：299 |
| LAGLTTEPGG | SEQ ID NO：300 |
| GGVLSGYFAG | SEQ ID NO：301 |
| FLFGGTTFTI | SEQ ID NO：302 |
| NNFSSTTVGI | SEQ ID NO：303 |
| RNGQSAGTAA | SEQ ID NO：304 |
| TLTIFRIADTVMT | SEQ ID NO：305 |
在一个具体实例中，艰难梭菌截短孢子表面蛋白质可来源于表XI中所列的胶原蛋白样蛋白质。
表XI.艰难梭菌孢子表面蛋白质截短肽片段
| 肽片段 | 序列识别编号 |
| MLLIMSRNKY | SEQ ID NO：306 |
| FGPFDDNDYN | SEQ ID NO：307 |
| NGYDKYDDCN | SEQ ID NO：308 |
| NGRDDYNSCD | SEQ ID NO：309 |
| CHHCCPPSCV | SEQ ID NO：310 |
| GPTGPMGPRG | SEQ ID NO：311 |
| RTGPTGPTGP | SEQ ID NO：312 |
| TGPGVGATGP | SEQ ID NO：313 |
| TGPTGPTGPT | SEQ ID NO：314 |
| GNTGNTGATG | SEQ ID NO：315 |
| LRGPTGATGA | SEQ ID NO：316 |
| TGPTGATGAI | SEQ ID NO：317 |
| GFGVTGPTGP | SEQ ID NO：318 |
| TGATGATGAD | SEQ ID NO：319 |
| GVTGPTGPTG | SEQ ID NO：320 |
| ATGADGITGP | SEQ ID NO：321 |
| TGATGATGFG | SEQ ID NO：322 |
| VTGPTGPTGA | SEQ ID NO：323 |
| TGVGVTGATG | SEQ ID NO：324 |
| LIGPTGATGT | SEQ ID NO：325 |
| PGATGPTGAI | SEQ ID NO：326 |
| GATGIGITGP | SEQ ID NO：327 |
| TGATGATGAD | SEQ ID NO：328 |
| GATGVTGPTG | SEQ ID NO：329 |
| PTGATGADGV | SEQ ID NO：330 |
| TGPTGATGAT | SEQ ID NO：331 |
| GIGITGPTGP | SEQ ID NO：332 |
| TGATGIGITG | SEQ ID NO：333 |
| ATGLIGPTGA | SEQ ID NO：334 |
| TGTPGATGPT | SEQ ID NO：335 |
| GATGPTGVGV | SEQ ID NO：336 |
| TGATGATGAT | SEQ ID NO：337 |
| GADGATGVTG | SEQ ID NO：338 |
| PTGATGATGA | SEQ ID NO：339 |
| NGLVGPTGAT | SEQ ID NO：340 |
| GAAGTPGATG | SEQ ID NO：341 |
| PTGATGPTGV | SEQ ID NO：342 |
| GITGATGATG | SEQ ID NO：343 |
| ATGPTGADGA | SEQ ID NO：344 |
| TGPTGATGNT | SEQ ID NO：345 |
| GADGVAGPTG | SEQ ID NO：346 |
| ATGNTGADGA | SEQ ID NO：347 |
| TGPTGATGAT | SEQ ID NO：348 |
| GVTGATGPTG | SEQ ID NO：349 |
| PTGATGATGA | SEQ ID NO：350 |
| TGASAIIPFA | SEQ ID NO：351 |
| SGIPLSLTTI | SEQ ID NO：352 |
| AGGLVGTPGF | SEQ ID NO：353 |
| VGFGSSAPGL | SEQ ID NO：354 |
| SIVGGVIDLT | SEQ ID NO：355 |
| NAAGTLTNFA | SEQ ID NO：356 |
| FSMPRDGTIT | SEQ ID NO：357 |
| SISAYFSTTA | SEQ ID NO：358 |
| ALSLVGSTIT | SEQ ID NO：359 |
| ITATLYQSTA | SEQ ID NO：360 |
| PNNSFTAVPG | SEQ ID NO：361 |
| ATVTLAPPLT | SEQ ID NO：362 |
| GILSVGSISS | SEQ ID NO：363 |
| GIVTGLNIAA | SEQ ID NO：364 |
| TAQTPDRQYAI | SEQ ID NO：365 |
在一个具体实例中，艰难梭菌截短孢子表面蛋白质可来源于表XII中所列的胶原蛋白样蛋白质。
表XII.艰难梭菌孢子表面蛋白质截短肽片段
| 肽片段 | 序列识别编号 |
| MSDISGPSLY | SEQ ID NO：366 |
| QDVGPTGPTG | SEQ ID NO：367 |
| ATGPTGPTGP | SEQ ID NO：368 |
| RGATGATGAN | SEQ ID NO：369 |
| GITGPTGNTG | SEQ ID NO：370 |
| ATGANGITGP | SEQ ID NO：371 |
| TGNMGATGPN | SEQ ID NO：372 |
| GTTGSTGPTG | SEQ ID NO：373 |
| NTGATGANGI | SEQ ID NO：374 |
| TGPTGNTGAT | SEQ ID NO：375 |
| GANGITGPTG | SEQ ID NO：376 |
| NKGATGANGI | SEQ ID NO：377 |
| TGSTGPTGNT | SEQ ID NO：378 |
| GATGANGITG | SEQ ID NO：379 |
| PTGNTGATGA | SEQ ID NO：380 |
| TGPTGLTGAT | SEQ ID NO：381 |
| GATGANGITG | SEQ ID NO：382 |
| PTGNTGATGA | SEQ ID NO：383 |
| NGVTGATGPT | SEQ ID NO：384 |
| GNTGATGPTG | SEQ ID NO：385 |
| SIGATGATGT | SEQ ID NO：386 |
| TGATGPIGAT | SEQ ID NO：387 |
| GATGADGEVG | SEQ ID NO：388 |
| PTGAVGATGP | SEQ ID NO：389 |
| DGLVGPTGPT | SEQ ID NO：390 |
| GPTGATGANG | SEQ ID NO：391 |
| LVGPTGPTGA | SEQ ID NO：392 |
| TGANGLVGPT | SEQ ID NO：393 |
| GATGATGVAG | SEQ ID NO：394 |
| AIGPTGAVGA | SEQ ID NO：395 |
| TGPTGADGAV | SEQ ID NO：396 |
| GPTGATGATG | SEQ ID NO：397 |
| ANGATGPTGA | SEQ ID NO：398 |
| VGATGANGVA | SEQ ID NO：399 |
| GPIGPTGPTG | SEQ ID NO：400 |
| ENGVAGATGA | SEQ ID NO：401 |
| TGATGANGAT | SEQ ID NO：402 |
| GPTGAVGATG | SEQ ID NO：403 |
| ANGVAGAIGP | SEQ ID NO：404 |
| TGPTGANGAT | SEQ ID NO：405 |
| GATGATGATG | SEQ ID NO：406 |
| ANGATGPTGA | SEQ ID NO：407 |
| TGATGVLAAN | SEQ ID NO：408 |
| NAQFTVSSSS | SEQ ID NO：409 |
| LVNNTLVTFN | SEQ ID NO：410 |
| SSFINGTNIT | SEQ ID NO：411 |
| FPTSSTINLA | SEQ ID NO：412 |
| VGGIYNVSFG | SEQ ID NO：413 |
| IRATLSLAGF | SEQ ID NO：414 |
| MSITTNFNGV | SEQ ID NO：415 |
| TQNNFIAKAV | SEQ ID NO：416 |
| NTLTSSDVSV | SEQ ID NO：417 |
| SLSFLVDARA | SEQ ID NO：418 |
| AAVTLSFTFG | SEQ ID NO：419 |
| SGTTGTSAAG | SEQ ID NO：420 |
| YVSVYRIQ | SEQ ID NO：421 |
在一个具体实例中，截短微生物孢子表面蛋白质来源于芽孢杆菌属全长孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，芽孢杆菌属截短孢子表面蛋白质包含炭疽芽孢杆菌截短孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，炭疽芽孢杆菌截短孢子表面蛋白质可来源于表XIII中所列的BclA蛋白质。
表XIII.炭疽芽孢杆菌孢子表面蛋白质截短肽片段
| 肽片段 | 序列识别编号 |
| MSNNNYSNGL | SEQ ID NO：422 |
| NPDESLSASA | SEQ ID NO：423 |
| FDPNLVGPTL | SEQ ID NO：424 |
| PPIPPFTLPT | SEQ ID NO：425 |
| GPTGPTGPTG | SEQ ID NO：426 |
| PTGPTGPTGP | SEQ ID NO：427 |
| TGPTGPTGPT | SEQ ID NO：428 |
| GDTGTTGPTG | SEQ ID NO：429 |
| TGDTGTTGPT | SEQ ID NO：430 |
| PTGPTGDTGT | SEQ ID NO：431 |
| PTGPTGPTGA | SEQ ID NO：432 |
| TGLTGPTGPT | SEQ ID NO：433 |
| GPSGLGLPAG | SEQ ID NO：434 |
| LYAFNSGGIS | SEQ ID NO：435 |
| FNTVGSQFGT | SEQ ID NO：436 |
| AISQLDADTF | SEQ ID NO：437 |
| VISETGFYKI | SEQ ID NO：438 |
| TVIANTATAS | SEQ ID NO：439 |
| GVPVPGTGSS | SEQ ID NO：440 |
| LISLGAPIVI | SEQ ID NO：441 |
| QAITQITTTP | SEQ ID NO：442 |
| SLVEVIVTGL | SEQ ID NO：443 |
| GLSLALGTSA | SEQ ID NO：444 |
| SIIIEKVA | SEQ ID NO：445 |
C.孢子表面蛋白质模拟物
在一个具体实例中，本发明预期包含微生物孢子表面蛋白质模拟物的感染控制组合物与制备与使用该组合物的方法。在一个具体实例中，蛋白质模拟物包含氨基酸序列。在一个具体实例中，氨基酸序列包含环形三级结构。在一个具体实例中，蛋白质模拟物包含有机小分子。
本发明范畴内预期模拟识别及对接结合本发明肽的活性位点所必需的构形的有机小分子。举例而言，预期微生物孢子表面蛋白质和/或肽片段的模拟物。所述模拟物的多种设计系可能。举例而言，尤其预期环状和/或线性蛋白质和/或肽片段，其中结合所必需的构形由非肽来稳定。Lobl等人的美国专利第5,192,746号、Burke，Jr.等人的美国专利第5,169,862号、Bischoff等人的美国专利第5,539,085号、Aversa等人的美国专利第5,576,423号、Shashoua的美国专利第5,051,448号及Gaeta等人的美国专利第5,559,103号(所有均以引用的方式并入本文中)描述多种产生所述化合物的方法。
此技艺中亦已知模拟肽序列的非肽化合物的合成。举例而言，一些非肽拮抗剂模拟Arg-Gly-Asp序列。Eldred等人，(J.Med.Chem.37：3882(1994))。同样，Ku等人(J.Med.Chem.38：9(1995))进一步说明一系列所述化合物的合成。本发明尤其预期模拟微生物孢子表面蛋白质和/或肽片段的所述非肽化合物。
本发明亦预期合成的模拟化合物，其为重复相关肽序列的多聚化合物。如此技艺中所已知，可通过使氨基连接于通过与诸如二环己基碳二亚胺(DCC)的偶合剂反应而活化的羧基来合成肽。自由氨基攻击活化的羧基导致形成肽键并释放二环己脲。可能有必要保护除意欲反应的氨基及羧基以外的潜在反应性基团。举例而言，可用第三丁氧基羰基阻断含活化的羧基的组分的α-氨基。接着可通过将肽暴露于稀酸以移除该保护基，此举留下完整肽键。
利用该方法，可由固相方法通过向连接于不可溶基质(诸如聚苯乙烯珠粒)的生长肽链中逐步添加氨基酸容易地合成肽。首先将所要肽序列的羧基端氨基酸(具有氨基保护基)锚定于聚苯乙烯珠粒。随后移除氨基酸的保护基。利用偶合剂添加下一个氨基酸(具有保护基)。此后为洗涤循环。根据需要重复该循环。
在一个具体实例中，本发明的模拟物为与上述微生物孢子表面蛋白质和/或肽片段具有序列同源性的肽。一种评估序列同源性且更重要评估统计上显著的相似性的常见方法系使用蒙特卡罗分析法(Monte Carlo analysis)，该分析法利用里皮曼(Lipman)及皮尔森(Pearson)编写用以获得Z值的算法。根据该分析法，Z值大于6表明可能重要，且Z值大于10视为统计上显著。W.R.Pearson及D.J.Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，85：2444-2448(1988)；D.J.Lipman及W.R.Pearson，Science，227：1435-1441(1985)。在本发明中，适用于解决微生物去污染及微生物感染问题的合成多肽为具统计上显著的序列同源性及相似性的肽(蒙特卡罗分析法中里皮曼及皮尔森算法的Z值超过6)。
IV.筛选感染控制组合物
在一个具体实例中，本发明预期包含筛选抑制、拮抗、干扰、置换和/或破坏微生物孢子与无生命和/或有生命表面的结合的感染控制组合物的方法。
在一个具体实例中，本发明预期包含筛选抑制、拮抗、干扰、置换和/或破坏微生物孢子表面蛋白质与无生命和/或有生命表面的结合的感染控制组合物的方法。
在一个具体实例中，有生命表面可选自包含皮肤、人类身体组织和/或人类细胞的群组。在一个具体实例中，无生命表面可包含硬表面，包括(但不限于)陶瓷、瓷砖、花岗岩和/或不锈钢。在一个具体实例中，微生物孢子包含梭菌属孢子。在一个具体实例中，梭菌属孢子包含艰难梭菌孢子。在一个具体实例中，筛选的感染控制组合物能够结合微生物孢子表面蛋白质。虽然不必了解发明机制，但咸信感染控制组合物与表面结合，从而阻断微生物孢子表面蛋白质的结合。虽然不必了解发明机制，但咸信所述感染控制组合物可包括(但不限于)自病毒、细菌、真菌、植物及动物来源分离的天然化合物以及合成化合物。另外认为感染控制组合物的来源、化学结构或作用机制并非本发明本质所在。
A.检测微生物孢子与表面的结合的检定
1.标准生长检定
在一个具体实例中，本发明预期检测细菌孢子和/或微生物孢子蛋白质的方法，其包含：a)提供：i)怀疑污染有至少一种微生物孢子的基质表面；ii)包含多种能够附着至少一种微生物孢子的感染控制组合物的孢子收集装置；及iii)能够支持至少一种微生物孢子生长的孢子生长板；b)使孢子收集装置与基质表面接触，其中至少一种微生物孢子附着于装置；c)使微生物收集装置与孢子生长板接触；及d)检测孢子生长板上的至少一种微生物孢子。在一个具体实例中，感染控制组合物包含微生物孢子蛋白质肽片段。在一个具体实例中，微生物孢子蛋白质肽片段选自包含梭菌属孢子蛋白质肽片段或芽孢杆菌属孢子蛋白质肽片段的群组。在一个具体实例中，微生物孢子为艰难梭菌孢子。在一个具体实例中，微生物孢子为炭疽芽孢杆菌孢子。
虽然不必了解发明机制，但咸信可使用任何微生物孢子进行生长检定。举例而言，虽然下述方法中使用产芽孢梭菌孢子来检测自受污染表面收集后孢子的生长，但应了解可以任何能成功进行个别微生物孢子的收集及检测(亦即例如艰难梭菌抗体)的微生物孢子替代。
a.杯洗检定
一种所述技术适于自人类或动物皮肤回收常居及瞬时微生物。举例而言，可在临床方案中现场使用或在使用经分离的皮肤或皮肤等效物的研究中试管内使用该技术。ASTM国际(International)，“使用杯洗技术从皮肤回收微生物的标准测试方法(Standard Test Method for Recovery of Microorganisms FromSkin using the Cup Scrub Technique)”E1874-09(2009)。简言之，通过以足够的压力将刚性圆筒压在皮肤上以形成密封件且向圆筒中滴入回收液体，自部位回收常居微生物或瞬时微生物(亦即例如先前施用于测试部位的微生物)。随后用玻璃棒、橡胶淀帚(rubber policeman)或一些其它适合装置机械“擦洗”皮肤表面一段规定的时间。将流体自圆筒移至试管或其它适合容器中用于进一步分析。
可在本文所述的任何方法中并入杯洗程序来评估含意欲显著减少测试表面(亦即例如完整皮肤)上微生物孢子数目的感染控制组合物的测试物质。其亦可用于提供残余抗微生物活性的指示。
b.细胞培养检定
在35℃下在预还原(亦即例如移除氧)的BCDC、TCCFA及TSA上缺氧培育艰难梭菌孢子内壁悬浮液的等分试样。用孢子悬浮液同样接种对照及实验板，且培育一组对照板且在各实验整个时期使的不受干扰地生长。
如下进行附着实验：在填充琼脂的皮氏培养皿(Petri dish)底部置放圆圈(亦即例如目标区域)，及用5或10μl艰难梭菌孢子悬浮液直接接种于板的目标区域内，在缺氧橱(Forma Scientific，Marietta，Ohio)中在预还原板上培育所述孢子27分钟、99分钟、150分钟及360分钟。定时培育后，移除板，且向各培养板中添加4ml无菌蒸馏水。随后在300rpm下摇动板10分钟，此后将搅拌溶液无菌移离琼脂表面，且再缺氧培育板24、48及72小时。为确定板是否已经污染，自随机菌落在载玻片上制作光学显微术抹片且用照相显微镜拍照，且接种板并在有氧条件下培育以鉴别任何好氧污染物。
为确定孢子是否尚未附着于琼脂，且确定其是否可容易地自琼脂表面分离及洗除，亦测试水搅拌溶液(摇动板后移出)中孢子的存在。水等分试样为：(i)通过位相差显微镜筛选；及(ii)用于画线培养琼脂板；及(iii)注入BacTecNR6A肉汁(厌氧血液培养肉汁，BD Microbiology Systems Cockeyesville，MD)中且在24小时及48小时读取板及肉汁中细菌生长的存在。
2.抗孢子表面抗体检定
在一个具体实例中，本发明预期检测微生物孢子的方法，其包含：a)提供：i)怀疑污染有至少一种微生物孢子的基质表面；及ii)能够结合至少一种微生物孢子的抗孢子表面抗体；b)使抗孢子表面抗体与基质表面或孢子表面在使得抗体结合至少一种微生物孢子的条件下接触，其中产生抗体/孢子复合物；及c)检测抗体/孢子复合物。在一个具体实例中，抗体包含多克隆抗体(亦即例如F1997)。在一个具体实例中，抗孢子表面抗体包含标记。在一个具体实例中，标记包含荧光标记。在一个具体实例中，微生物孢子为艰难梭菌孢子。在一个具体实例中，微生物孢子为炭疽芽孢杆菌孢子。
在一个具体实例中，本发明预期检测细菌孢子的方法，其包含：a)提供：i)怀疑污染有至少一种微生物孢子的基质表面；ii)能够结合至少一种微生物孢子的抗孢子表面抗体；及iii)生长检定板；b)结合抗孢子表面抗体与抗体，其中产生抗体/孢子复合物；c)使抗体/孢子复合物与基质表面接触；d)自表面移除抗体/孢子复合物的样品(亦即例如利用杯洗法)；e)在生长检定板上用样品画线。在一个具体实例中，抗体包含多克隆抗体(亦即例如F1997)。在一个具体实例中，基质表面包含猪皮表面。在一个具体实例中，标记包含荧光标记。在一个具体实例中，微生物孢子为艰难梭菌孢子。在一个具体实例中，微生物孢子为炭疽芽孢杆菌孢子。
a.抗体显色(Antibody Development)
虽然不必了解发明机制，但咸信抗孢子表面抗体可针对孢子表面上的任何抗原决定基(亦即不论蛋白质或其它抗原性结构)。举例而言，虽然下述方法中使用产芽孢梭菌孢子产生抗孢子表面单克隆及多克隆抗体，但应了解可以任何能成功产生针对个别微生物孢子的抗体(亦即例如艰难梭菌抗体)的微生物孢子替代。
通过数次注射108个失活孢子(在37℃下在4％(v/v)甲醛中培育4小时)获得针对产芽孢梭菌孢子的小鼠多克隆抗血清及单克隆抗体。根据克勒(Kohler)及米勒斯坦(Milstein)(Kohler及Milstein，1975)的程序产生单克隆抗体。简言之，在第21天及第42天对小鼠进行增强免疫且在第50天放血以获得多克隆抗体，或在第50天进行增强免疫且在第53天处死进行融合以获得单克隆抗体。通过使产芽孢梭菌细胞在35℃下在熟肉培养基(cooked meatmedium)中生长及使产气荚膜梭菌细胞在37℃下在缺氧条件下在巯乙酸液体培养基(fluid thioglycolate medium)中生长来制备孢子储备溶液。
如通过相对比显微术所观察，通过上述福尔马林失活产芽孢梭菌PA3679孢子储备溶液所制备的抗原不含营养细胞物质。Phillips等人，“炭疽芽孢杆菌和仙人掌杆菌的孢子直接和间接测定中个别细菌的免疫荧光鉴定(Assessmentof immunofluorescence measurements of individual bacteria in direct and indirectassays for Bacillus anthracis and Bacillus cereus spores)”J.Appl.Bacteriol.53：223-231(1982)。使用总计1×107个产芽孢梭菌孢子作为抗原。
根据许多程序的一产生单克隆抗体。Kohler等人，“预先定义特异性的分泌型抗体的融合细胞的连续培养(Continuous cultures of fused cells secretingantibody of predefined specificity)”Nature 296：495-497(1975)(以全文引用的方式并入本文中)。就与产芽孢梭菌孢子的反应性筛选杂交瘤。亦就与营养细胞的反应性筛选发现具有反应性的杂交瘤。
通过使用点印迹免疫检定格式进行单克隆抗体的同型分析。将孢子施加于点印迹装置中的Immobilon-P膜(密理博公司(MilliporeCorp.)，贝德福德(Bedford)，马萨诸塞(Mass.))上。随后将孢子与100ml适当组织培养物上清液一起培育。通过使用自Bio-Rad
(Hercules，Calif.)所获得的兔抗小鼠子类特异性抗血清对结合于孢子的单克隆抗体进行同型分析。
随后将产芽孢梭菌孢子施加于Immobilon-P
膜上，接着与上述所产生的抗体一起培育。同样地，将106个梭菌属营养细胞施加于膜上，接着与指定抗体一起培育。用山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)-辣根过氧化酶共轭物(SigmaA4416)或山羊抗小鼠IgM-辣根过氧化酶共轭物(Sigma A8786)检测反应性。可用不可溶基质3-氨基-9-乙基-咔唑(Biomeda公司)进行显色。
随后用Tris缓冲生理盐水(TBS)(0.01M Tris、0.15M NaCl，pH 7.4)以1∶32及1∶128稀释培养物上清液。在48℃下，将经稀释培养物上清液等分试样与等体积的孢子抗原(4×109个孢子/毫升)通过平缓反转隔夜加以混合。与无菌蒸馏水混合的经稀释培养物上清液充当阳性对照组。通过离心(约4,0003g，10min)移去吸附于孢子的抗体。如上所详述，在免疫斑点印迹检定中使用该上清液。
通过利用硫酸铵使组织培养物上清液沉淀来浓缩抗体。Halow等人，“储藏和纯化抗体(Storing and purifying antibodies)”抗体：实验手册(Antibodies：ALaboratory Manual).第283-318页。E.Halow及D.Lane(编)，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988)。通过在室温下与N-羟基丁二酰亚氨基生物素(Sigma Chemical公司)(样品中每1毫克抗体约100毫克)一起培育4小时，用生物素标记经浓缩蛋白质。添加1摩尔浓度氯化铵(每250毫克生物素20毫升)以终止反应，且用磷酸盐缓冲生理盐水(0.1M磷酸钠、0.8％NaCl)(PBS)(pH 7.0)广泛透析经生物素标记的蛋白质。用于免疫细胞化学定位研究。
通过使用蛋白质A柱(Pierce Chemical Co.，Rockford，Ill.)根据制造商的说明书自组织培养物上清液中纯化出IgG抗体。通过使用山羊抗小鼠IgM抗体柱(Pierce Chemical Co.)自培养物上清液纯化IgM抗体。在PBS中以1∶1稀释组织培养物上清液，且施加于经PBS平衡的山羊抗小鼠IgM柱上。根据制造商的说明书自柱洗涤及洗脱出抗体。汇集含蛋白质的馏分且用Centricon10微量浓缩器(Amicon，Danvers，Mass.)浓缩，且在3,000 3g下离心30分钟。
3.抗孢子表面蛋白质抗体检定
在一个具体实例中，本发明预期检测微生物孢子的方法，其包含：a)提供：i)怀疑污染有至少一种微生物孢子的基质表面，该孢子包含至少一种表面蛋白质；及ii)能够结合至少一种表面蛋白质的抗表面蛋白质抗体；b)使抗表面蛋白质抗体与基质表面在使得抗体结合至少一种表面蛋白质的条件下接触，其中产生抗体/蛋白质复合物；及c)检测抗体/蛋白质复合物。在一个具体实例中，孢子表面蛋白质包括(但不限于)CD 1067、CD 1581、CD 3520、CD 0372或CD 1613。在一个具体实例中，抗表面蛋白质抗体包含标记。在一个具体实例中，标记包含荧光标记。在一个具体实例中，表面蛋白质为艰难梭菌表面蛋白质。在一个具体实例中，表面蛋白质为炭疽芽孢杆菌表面蛋白质。
虽然不必了解发明机制，但咸信微生物表面蛋白质抗体可针对孢子表面蛋白质上的特定抗原决定基(亦即不论氨基酸序列或其它抗原性结构)。举例而言，虽然下述方法中使用特定艰难梭菌孢子表面蛋白质来产生多克隆及单克隆抗体，但应了解可以任何能成功产生针对个别微生物孢子表面蛋白质的多克隆和/或单克隆抗体的微生物孢子表面蛋白质替代。
通过数次注射经分离的假设性蛋白质(亦即例如每次注射约108个蛋白质)获得针对艰难梭菌假设性蛋白质(SEQ ID NO：1)的小鼠多克隆抗血清及单克隆抗体。根据克勒(Kohler)及米勒斯坦(Milstein)(Kohler及Milstein，1975)的程序产生单克隆抗体。简言之，可在第21天及第42天对小鼠进行增强免疫且在第50天放血以获得多克隆抗体，或在第50天增强免疫且在第53天处死进行融合以获得单克隆抗体。可就与艰难梭菌孢子的反应性筛选杂交瘤。亦就与营养细胞的反应性筛选发现具有反应性的杂交瘤。
通过使用点印迹免疫检定格式进行单克隆抗体的同型分析。将孢子施加于点印迹装置的Immobilon-P膜(Millipore公司，Bedford，Mass.)上。随后将孢子与100ml适当组织培养物上清液一起培育。通过使用自Bio-Rad(Hercules，Calif.)所获得的兔抗小鼠子类特异性抗血清对结合于孢子的单克隆抗体进行同型分析。
在一个具体实例中，本发明预期检测微生物孢子的方法，其包含：a)提供：i)怀疑污染有至少一种微生物孢子的基质表面，该孢子包含至少一种表面蛋白质；及ii)能够结合至少一种表面蛋白质的抗表面蛋白质单克隆抗体；b)使抗表面蛋白质单克隆抗体与基质表面在使得单克隆抗体结合至少一种表面蛋白质的条件下接触，其中产生单克隆抗体/蛋白质复合物；及c)检测单克隆抗体/蛋白质复合物。在一个具体实例中，孢子表面蛋白质包括(但不限于)CD 1067、CD 1581、CD 3520、CD 0372或CD 1613。在一个具体实例中，抗表面蛋白质单克隆抗体包含标记。在一个具体实例中，标记包含荧光标记。在一个具体实例中，表面蛋白质为艰难梭菌表面蛋白质。在一个具体实例中，表面蛋白质为炭疽芽孢杆菌表面蛋白质。
B.检测微生物孢子表面蛋白质与表面的结合的检定
本文提供数种检测孢子表面蛋白质结合以筛选潜在感染控制组合物的方法。
为提供用于筛选供研发感染控制组合物的化合物的方法与装置，本发明一般合并模型试管内系统，所述系统模拟感染控制组合物所要针对的指定试管内微生物系统。筛选所述感染控制组合物可针对的系统的范围较广。举例而言，视情况就阻断、减缓或以其它方式抑制与感染微生物生物体相关的关键事件的效果筛选潜在感染控制组合物。举例而言，视情况就阻断至少部分造成孢子形成或孢子与表面(包括例如皮肤、身体组织、花岗岩、不锈钢陶瓷等)结合的系统的能力筛选潜在感染控制测试组合物。随后可对在所述筛选检定法中显示有前景结果的感染控制测试组合物进行进一步测试以鉴别治疗微生物感染疾病或症状的有效药理药剂。
1.结合筛选
在其最简单形式中，将就感染控制组合物与生物化学系统组分的交互作用(例如受体-配位体交互作用、酶-基质交互作用及其类似作用)筛选本发明方法与装置中所使用的感染控制组合物筛选模型。在此形式中，筛选模型典型地将包括系统的两种交互作用组分(亦即例如细菌孢子蛋白质与感染控制组合物，或微生物酶与感染控制组合物)。
在一个具体实例中，该方法包含通过使微生物孢子蛋白质与感染控制测试组合物接触确定感染控制测试组合物对微生物孢子蛋白质与表面的结合交互作用是否产生影响及检定微生物孢子与表面的残余结合。随后比较残余表面结合量与对照表面结合，例如在无感染控制组合物存在下进行的相同结合检定。所述结合检定典型地包括量测筛选系统的参数。“筛选系统的参数”意谓某些可量测迹象，例如是否存在经标记的基团或分子量变化(例如在结合反应、转运筛选中)、是否存在反应产物或基质(在基质周转量测中)或电泳迁移率的变化(典型地由经标记化合物的洗脱时间的变化检测)。
虽然上文已关于双组分筛选系统进行描述，但所述方法与装置亦可用于筛选复杂得多的系统的效应物，其中系统的结果或最终产物为已知的且可在一定层面上检定，例如酶促途径、孢子表面信号传导途径及其类似层面。或者，视情况使用本文所述的方法与装置筛选与生物化学系统的单个组分交互作用的化合物，例如特异性结合特定生物化学化合物(例如受体、配位体、酶、核酸、结构大分子等)的化合物。
在一些具体实例中，本发明检定可涉及两种或更多种组分的交互作用。涉及两种组分之间的交互作用的检定可视为“结合对(binding pair)”成员之间的结合的增强剂或抑制剂的检定。较佳结合对包括(但不限于)微生物孢子蛋白质/有机小分子、微生物孢子蛋白质/核酸、微生物孢子蛋白质/感染控制组合物(亦即例如梭菌属孢子表面蛋白质片段)。在一个具体实例中，结合对的任一成员可经固定(亦即例如附着于表面)，而另一成员处于与表面接触的溶液中。在另一具体实例中，两个成员可附着于不同表面，随后将所述表面并置以进行检定。
因此，在一个态样中，本发明将适用于筛选与受体分子形成结合对的感染控制组合物，其中该结合对影响受体分子与表面之间的交互作用。如本文所使用的术语“受体”泛指结合对的一个成员(亦即例如微生物孢子表面蛋白质)。结合对的另一成员称为“感染控制组合物”。因此，受体/配位体对可包括通常与膜相关的典型蛋白质受体及其天然配位体(例如另一蛋白质或小分子)。受体/配位体对亦可包括抗体/抗原结合对、互补核酸、与核酸相关的蛋白质及其核酸配位体。
传统上，筛选受体/配位体交互作用(亦即例如微生物孢子表面蛋白质/感染控制组合物交互作用)的效应物的方法已包括在测试化合物存在下培育受体/配位体结合对。随后将受体/配位体对的结合程度与阴性和/或阳性对照组作比较。当发现正常结合降低时，判定测试化合物为受体/配位体结合的抑制剂。当发现该结合增加时，判定测试化合物为交互作用的增强剂或诱导剂。然而，在本发明中，预期通过量测在感染控制组合物存在下受体与表面的残余结合的量来检定受体/配位体交互作用。
在一个具体实例中，高通量筛选检定可包含允许同时平行筛选大量潜在感染控制组合物的多孔反应板，例如多孔微板。
一组类似且可能重迭的生物化学系统可包括微生物酶与其基质之间的交互作用。如本文所使用的术语“酶”泛指充当催化剂以诱导其它化合物或“基质”中的化学变化的蛋白质。典型地通过在有与无待筛选化合物存在下且在检测酶活性变化的最佳条件下使酶与基质接触来筛选酶针对其基质的活性的效应物。一段设定反应时间后，检定混合物的反应产物的存在或基质量的减少。随后将已催化的基质量与对照组作比较，对照组亦即在无测试化合物存在下或在已知效应物存在下与基质接触的酶。如上所述，降低酶针对其基质的活性的化合物称为“抑制剂”，而增强该活性的化合物称为“诱导剂”。
视所实施的特定具体实例而定，于各种不同介质中提供感染控制测试组合物，包括(但不限于)注射液、于溶液中呈游离形式、附着于载体、附着于固体支撑物(亦即例如珠粒)。若干适合的固体支撑物用于固定测试化合物。适合的固体支撑物的实例包括琼脂糖、纤维素、葡聚糖(可自市面上购得，亦即Sephadex、Sepharose)、羧甲基纤维素、聚苯乙烯、聚乙二醇(PEG)、滤纸、硝化纤维素、离子交换树脂、塑料膜、玻璃珠粒、聚胺甲基乙烯醚顺丁烯二酸共聚物、氨基酸共聚物、乙烯-顺丁烯二酸共聚物、尼龙(nylon)、丝等。另外，对于本文所述的方法与装置，个别地或成群筛选测试化合物。当预期有效测试化合物的命中率较低以致对于指定群组不能预期一个以上的阳性结果时，群组筛选尤其适用。或者，当单个系统中差异性检测不同测试化合物的效应时，使用该群组筛选。
2.免疫检定
在一个具体实例中，本发明预期免疫测试，其中反应发生在两种或更多种相关免疫试剂(亦即例如抗原与抗体)之间。因此，例如当设法确定特定抗原或抗体是否驻留在样品中或样品中有多少特定抗原或抗体驻留时，必须试图使怀疑含有抗原的样品与其免疫结合对反应。虽然不必了解发明机制，但咸信若反应发生时，则观测到该反应即为最初测试的流体中存在抗原或抗体的证据。
在一个具体实例中，可使用指示剂或载体粒子观测抗体/抗原结合对。一种适合系统包含聚合粒子技术，其中已使用合成树脂粒子、表面或基质作为吸附适当抗原(亦即例如微生物孢子蛋白质片段)或抗体(亦即例如对微生物孢子蛋白质片段具有亲和力)的吸附剂。
免疫检定的格式包括(但不限于)竞争性检定(例如ELISA、半抗原抑制等)及非竞争性检定。已报导多种免疫检定格式。参见美国专利第4,366,241号、第4,376,110号、第4,517,288号及第4,837,168号；Asai(1993)细胞生物学方法(Methods in Cell Biology)第37卷：细胞生物学中的抗体(Antibodiesin Cell Biology)，Academic Press，Inc.New York，Stites及Terr编，(1991)基础和临床免疫学(Basic and Clinical Immunology)第7版等及其中引用的参考文献(所有参考文献以引用的方式并入本文中)。
3.核酸结合检定
在另一具体实例中，在核酸结合蛋白质检定中使用本发明的材料与方法固定组分。所述检定典型地由一种或多种结合蛋白质检测核酸的结合。所述检定一般用于利用一种或多种特定核酸结合蛋白质筛选提高(特异性或亲和力)或抑制核酸结合的试剂。核酸结合蛋白质包括(但不限于)核酸内切酶、聚合酶、核转录因子受体、API蛋白质(亦即例如fos及jun)。核酸结合检定通过附着于含有蛋白质结合位点的核酸的表面或结合蛋白质自身的表面而变得容易。
4.生理上相容的溶液中的结合检定
应了解，许多上述检定需要针对目标检定组分(例如酶)的特定条件以维持其所要活性。典型地，使所述检定最佳化以维持对组分活性而言关键的要素(例如pH值、离子组成)的生理上相容的条件。
一个显著的优势在于本发明感染控制组合物在大多数离子种类(例如Na+、Ca2+、Mg2+等)的生理浓度下为稳定。因此，检定可在标准生理上兼容的组合物(例如磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)、标准林格氏溶液及其类似物)中操作。
亦可使用本发明感染控制组合物来纯化与的形成结合对的部分(例如多肽)。特定言之，感染控制组合物可结合几乎任何阴离子或阳离子交换树脂使用。适合的阴离子及阳离子交换树脂可自市面上购得。阳离子交换树脂例如包括(但不限于)羧甲基纤维素，而阴离子交换树脂包括(但不限于)DEAE纤维素、DEAE SEPHAROSE凝胶过滤离子交换介质、肝素及其类似物。
在一个较佳具体实例中，可出于纯化的目的利用感染控制组合物与微生物孢子表面蛋白质的交互作用。此以类似于阳离子交换树脂的方式或类似于多组氨酸/镍分离系统的方式实现，其中用云母分别替代阳离子交换树脂或镍树脂。在一个具体实例中，云母系以样品流经的床的形式提供(云母碎片或粉末)。云母床安置于多种适合容器中的任一种中，包括可连接于注射器、层析柱及其类似物的滤筒。微生物孢子表面蛋白质结合于云母床，而样品的其它组分被洗除。可使用足以释放不想要组分而仅保留微生物孢子表面蛋白质的浓度的盐溶液洗脱除去非特异性结合组分。一旦感染控制组合物结合于微生物孢子表面蛋白质，则可按需要施用足够的盐浓度和/或其它适当溶剂混合物来释放感染控制组合物。
5.连续流动检定系统
在一个具体实例中，在利用连续流动检定系统来筛选感染控制测试组合物时使用本发明的方法与装置。所述连续流动检定系统的使用不限于筛选孢子表面蛋白质与表面的结合，而且亦可容易地用于筛选具酶促活性的抑制剂或诱导剂或受体-配位体结合的促效剂或拮抗剂。
简言之，连续流动检定系统涉及特定生物化学系统沿流体路径(亦即例如微数组、层析柱或微加工通道)的连续流动。如本文所使用的术语“连续”泛指连续流动的特定组合物的未中断或不间断流。举例而言，连续流动可包括具有设定速度的恒定流体流动，或者整个系统的流动速率中包括暂停以使该暂停不使流动流以其它方式中断的流体流动。
6.可检测标记
在一个具体实例中，功能筛选系统包含产生可检测事件或信号。所述可检测信号可包括(但不限于)光学可检测发色或荧光信号。对于酶系统，可由酶对例如显色或荧光基质的催化作用的产物产生所述信号。对于结合系统，例如受体配位体与表面的交互作用或微生物孢子表面与表面的结合，信号典型地会涉及经标记配位体与受体的缔合，或反之亦然。
在当前预期的本发明的具体实例中亦可使用多种其它可检测信号及标记。除上述显色及荧光标记外，亦便利地量测放射性衰变；电子密度；pH值、溶剂粘度、温度及盐浓度变化。
更一般而言，标记通常可利用光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学方法检测。举例而言，适用核酸标记包括32P、35S、荧光染料、高电子密度试剂(electron-dense reagent)、酶(例如ELISA中通常所使用)、生物素、地高辛(dioxigenin)或可获得抗血清或单克隆抗体的半抗原及蛋白质。已知多种适于标记生物组分的标记且广泛报导于科学与专利文献中，且一般适用于本发明来标记生物组分。适合标记包括(但不限于)放射性核苷酸、酶、基质、辅因子、抑制剂、荧光部分、化学发光部分、磁性粒子及其类似物。标记试剂视情况包括例如单克隆抗体、多克隆抗体、蛋白质或其它聚合物(诸如亲和力基质、碳水化合物或脂质)。
标记的检测可利用多种方法进行，包括(但不限于)放射性或荧光标记的分光光度或光学示踪法或基于尺寸、电荷或亲和力示踪分子的其它方法。可检测的部分可为任何具有可检测物理或化学性质的物质。所述可检测标记存在于凝胶电泳、柱层析、固体基质、光谱技术及其类似技术的领域中，且适用于所述方法的标记一般可应用于本发明。
因此，标记可包含可由光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电、光热或化学方法检测的任何组合物。在一些具体实例中，标记可包括(但不限于)荧光染料(例如异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate)、得克萨斯红(Texasred)、罗丹明(rhodamine)及其类似物)、放射性标记(例如3H、125I、35S、14C、32P或33P)、酶(例如LacZ、CAT、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶及常用作可检测酶的其它酶，作为标记产物或用于ELISA中)、核酸嵌入剂(例如溴化乙锭)及比色标记，诸如胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠粒。
在一个具体实例中，本发明预期典型地具一种或多种以下性质的特征的荧光标记：高敏感性、高稳定性、低背景值、低环境敏感性及高标记特异性。所述并入本发明标记中的荧光部分可包括(但不限于)1-氨基萘及2-氨基萘、p，p′-二氨基芪、芘、四级啡啶盐(quaternary phenanthridine salt)、9-氨基吖啶、p，p′-二氨基二苯甲酮亚胺、蒽、氧杂羰花青素(oxacarbocyanine)、部花青素(merocyanine)、3-氨基去氢马烯雌酮(3-aminoequilenin)、苝、双-苯并唑、双-对
唑基苯、1，2-苯并吩嗪(benzophenazin)、视黄醇、双-3-氨基吡啶
盐、嚏根苷配基(hellebrigenin)、四环素、甾酚(sterophenol)、苯并咪唑基苯基胺、2-侧氧基-3-苯并吡喃(2-oxo-3-chromen)、吲哚、呫吨(xanthen)、7-羟基香豆素、吩
嗪(phenoxazine)、水杨酸盐(calicylate)、毒毛旋花苷配基(strophanthidin)、卟啉(porphyrin)、三芳基甲烷及黄素。具有供连接于可由本发明具体实例检测的元素的官能基或可经改质以合并所述官能基的个别荧光化合物包括(但不限于)丹磺酰氯；荧光素，诸如3，6-二羟基-9-苯基呫吨氢醇(3，6-dihydroxy-9-phenylxanthhydrol)；异硫氰酸罗丹明(rhodamineisothiocyanate)；N-苯基1-氨基-8-磺酸根基萘；N-苯基2-氨基-6-磺酸根基萘；4-乙酰氨基-4-异硫氰基-芪-2，2′-二磺酸；芘-3-磺酸；2-甲苯氨基萘-6-磺酸酯；N-苯基-N-甲基-2-氨基萘-6-磺酸酯；溴化乙锭；stebrine；金胺-0，2-(9′-蒽酰基)棕榈酸酯；丹磺酰基磷脂酰乙醇胺；N，N′-二-十八烷基氧杂羰花青素；N，N′-二己基氧杂羰花青素；部花青素，4-(3′芘基)硬脂酸酯；d-3-氨基脱氧-去氢马烯雌酮；12-(9′-蒽酰基)硬脂酸酯；2-甲基蒽；9-乙烯基蒽；2，2′(次亚乙烯基-对-次苯基)双苯并
唑；对双(2-(4-甲基-5-苯基-
唑基))苯；6-二甲基氨基-1，2-苯并吩嗪；视黄醇；双(3′-氨基吡啶
)1，10-癸二基二碘；磺基萘基腙的嚏根苷配基(sulfonaphthylhydrazone of hellibrienin)；氯四环素；N-(7-二甲基氨基-4-甲基-2-侧氧基-3-苯并吡喃基)顺丁烯二酰亚胺；N-(对(2-苯并咪唑基)-苯基)顺丁烯二酰亚胺；N-(4-丙二烯合茀基)顺丁烯二酰亚胺(N-(4-fluoranthyl)maleimide)；双(高香草酸)(bis(homovanillic acid))；刃天青(resazarin)；4-氯-7-硝基-2，1，3-苯并
二唑；部花青素540；试卤灵(resorufin)；孟加拉国玫红(rose bengal)；及2，4-二苯基-3(2H)-呋喃酮。
可自市面上购得许多荧光标签，例如购自SIGMA chemical company(SaintLouis，Mo.)、Molecular Probes、R&D systems(Minneapolis，Minn.)、PharmaciaLKB Biotechnology(Piscataway，N.J.)、CLONTECH Laboratories，Inc.(Palo Alto，Calif.)、Chem Genes Corp.、Aldrich Chemical Company(Milwaukee，Wis.)、Glen Research Inc.、GIBCO BRL Life Technologies Inc.(Gaithersberg，Md.)、Fluka Chemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG，Buchs，Switzerland)及Applied Biosystems(Foster City，Calif.)。
合意地，荧光标记吸收大于约300nm、较佳约350nm且更佳大于约400nm的光，通常发射波长比所吸收光的波长大约10nm以上。应注意，结合标记的吸收及发射特征可能与未结合标记不同。因此，当提及各波长范围及标记的特征时，意欲指所使用的标记且不指未接合且在任意溶剂中特性化的标记。荧光标记可因通过用光照射荧光标记而可检测，可获得多个发射。因此，单个标记可提供多个可量测事件。亦可由化学发光源及生物发光源提供可检测信号。
化学发光源包括化合物，该化合物由化学反应使其电子受激发且随后可发射充当可检测信号或向荧光受体供给能量的光。已发现多种化合物家族在多种条件下提供化学发光。化合物之一为2，3-二氢-1，4-呔嗪二酮(phthalazinedione)。最常用化合物为流明诺(luminol)，其为5-氨基化合物。其它成员包括5-氨基-6，7，8-三甲氧基-及二甲基氨基[ca]苯类似物。可用碱性过氧化氢或次氯酸钙及碱使所述化合物发光。另一化合物为2，4，5-三苯基咪唑，母体产物的常用名为咯吩(lophine)。化学发光类似物包括对二甲基氨基及对甲氧基取代基。亦可在碱性条件下用草酸酯、通常草酰基活性酯(例如对硝基苯基)及过氧化物(例如过氧化氢)获得化学发光。亦已知且可获得其它适用化学发光化合物，包括-N-烷基吖锭酯(-N-alkyl acridinum ester)(碱性H2O2)及二氧杂环丁烷(dioxetane)。或者，可联合荧光素酶或亮光素(lucigenin)使用荧光素以提供生物发光。
标记可根据许多方法直接或间接偶合于欲检测的分子(产物、基质、酶或其类似物)。如上所指示，使用多种标记，其中标记的选择视所需敏感性、化合物接合的容易性、稳定性要求、可利用的仪器及处置条件(disposal provision)而定。非放射性标记通常通过间接方式连接。配位体分子(例如生物素)一般共价结合于聚合物。配位体随后结合于固有可检测或共价结合于信号系统(诸如可检测酶、荧光化合物或化学发光化合物)的抗配位体(例如抗生蛋白链菌素)分子。可使用多种配位体及抗配位体。当配位体具有天然抗配位体(例如生物素、甲状腺素及皮质醇)时，其可联合经标记的抗配位体使用。或者，可与抗体组合使用任何半抗原性或抗原性化合物。标记亦可直接接合至产生信号的化合物，例如与酶或荧光团接合。作为标记的有兴趣的酶主要可为水解酶，尤其磷酸酶、酯酶及糖苷酶，或氧化还原酶，尤其过氧化酶。荧光化合物包括荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰基(dansyl)、伞酮(umbelliferone)等。化学发光化合物包括荧光素及2，3-二氢呔嗪二酮，例如流明诺。
检测标记的方法视标记的类型而定。因此，例如当标记为放射性标记时，检测方法可包括(但不限于)闪烁计数器或自动放射照相术中的照相胶片。当标记为荧光标记时，检测方法可包括(但不限于)用适当波长的光激发荧光染料并检测所得荧光，例如利用显微术、目测检查、经由照相胶片、通过使用电子检测器(诸如数字摄影机、电荷耦合装置(CCD)或光电倍增管及光电管)及其类似方式检测。当使用荧光标记及检测技术时，通常将显微术及光谱技术整合于检测系统中。同样地，可通过提供酶的适当基质并检测所得反应产物来检测酶促标记。最后，通常通过观测与标记相关的颜色简单地检测简单比色标记。举例而言，所接合的金通常呈现粉红色，而各种接合的珠粒呈现珠粒的颜色。
在一个具体实例中，连续流动筛选系统产生恒定信号，其仅当引入影响系统的测试化合物时变化。特定言之，当系统组分流经系统时，其将在检测区内产生相对恒定的信号量。当向信道内周期性引入测试化合物(亦即例如感染控制组合物)且与系统组分混合时，测试化合物引起检测区内的恒定信号量偏移。该偏移则可能与所筛选的特定测试化合物相关。
D.检测微生物孢子表面蛋白质与表皮蛋白质的结合
在一个具体实例中，本发明预期一种检测微生物孢子表面蛋白质与表皮层的结合的方法。在一个具体实例中，表皮层来源于皮肤。在一个具体实例中，表皮层来源于内脏。在一个具体实例中，表皮层来源于黏膜。在一个具体实例中，表皮层包含皮肤蛋白质。在一个具体实例中，皮肤蛋白质包含包被素(involucrin)。在一个具体实例中，皮肤蛋白质包含兜甲蛋白(loricrin)。在一个具体实例中，皮肤蛋白质包含细胞角蛋白。参见图10。
在4℃下每孔用含5mg人类角蛋白的100μl PBS涂布酶联免疫吸附检定板隔夜。随后用PBS洗涤各孔三次，且随后在添加孢子之前用含1％牛血清白蛋白的PBS阻断1小时。用FITC标记之前以PBS稀释孢子(如上所述制备的艰难梭菌)至在600nm下吸光度为1.0的浓度(每毫升约5×107个孢子)。每孔添加100μl经标记孢子，且在37℃下培育板1小时。培育1小时后，使用Fluoroskan II荧光读取器(Labsystems，Beverly，MA)量测每孔的总荧光(Ftotal)，其中λex＝485nm及λem＝535nm。用PBS洗涤各孔三次以移除未结合孢子且量测剩余荧光(Ftest)。如下计算粘附：粘附＝Ftest/Ftotal。将无抗体或感染控制组合物存在下的经标记细胞的粘附正规化为100％。使用经牛血清白蛋白涂布的孔作为阴性对照组。对于抑制检定，将该混合物添加至经角蛋白涂布的孔中之前首先在37℃下将经FITC标记的孢子与抗孢子抗体或感染控制组合物一起培育1小时。
或者，添加孢子之前用含1％牛血清白蛋白的PBS阻断EpiDermTM皮肤模型板(24孔或96孔)1小时。用FITC标记之前以PBS稀释孢子(如上所述制备的艰难梭菌)至在600nm下吸光度为1.0的浓度(每毫升约5×107个孢子)。每孔添加100μl经标记孢子，且在37℃下培育板1小时。培育1小时后，使用Fluoroskan II荧光读取器(Labsystems，Beverly，MA)量测每孔的总荧光(Ftotal)，其中λex＝485nm及λem＝535nm。用PBS洗涤各孔三次以移除未结合孢子且量测剩余荧光(Ftest)。如下计算粘附：粘附＝Ftest/Ftotal。将无抗体或感染控制组合物存在下的经标记细胞的粘附正规化为100％。使用经牛血清白蛋白涂布的孔作为阴性对照组。对于抑制检定，将该混合物添加至EpiDermTM皮肤模型板中之前首先在37℃下将经FITC标记的孢子与抗孢子抗体一起培育1小时。
E.感染控制组合物的高通量筛选
在一个具体实例中，本发明预期包含筛选感染控制组合物的高通量检定的方法。举例而言，已发展蛋白质和/或核酸的高通量结合检定：i)用于蛋白质的高通量筛选法(美国专利第5,559,410号)；ii)用于核酸结合的高通量筛选法(亦即数组)(美国专利第5,585,639号)；及iii)用于配位体/抗体结合的高通量筛选法(美国专利第5,576,220号及第5,541,061号)(所有专利以引用的方式并入本文中)。另外，高通量筛选系统可自市面上购得(参见例如ZymarkCorp.，Hopkinton，Mass.；Air Technical Industries，Mentor，Ohio；BeckmanInstruments Inc.，Fullerton，Calif.；Precision Systems Inc.，Natick，Mass.等)。所述系统典型地整个程序均自动化，包括适于该检定的所有样品及试剂的移液、液体分配、定时培育及检测器中微板的最终读取。所述可组态系统提供高通量且快速的启动以及高程度的灵活性及定制性。所述系统的制造商提供各种高通量的详细方案。因此，例如Zymark Corp.提供描述检测基因转录、配位体结合及其类似方面的调节的筛选系统的技术公报。
按照惯例，通过鉴别具有某种所要性质或活性的化学化合物(称为“先导化合物(lead compound)”)、产生先导化合物的变异体、并评估所述变异体化合物的性质及活性来产生具有适用性质的新颖化学实体。然而，当前趋势为缩短药物发现的所有方面的时间规模。因为高通量筛选(HTS)方法能够快速且有效地测试较大数目，所以其正替代习用先导化合物鉴别方法。
在一个较佳具体实例中，高通量筛选法涉及提供含有大量潜在治疗化合物(候选化合物)的文库。随后在一或多个如本文所述的检定中筛选所述“组合化学文库”以鉴别显示所要特征活性的文库成员(特定化学物质或子类)。如此鉴别的化合物可充当习用的“先导化合物”或可自身用作潜在或实际治疗剂。
1.组合化学文库
最近，已关注使用组合化学文库来帮助产生新颖化合物前导分子。组合化学文库为通过合并多种化学“构建块(building block)”(诸如试剂)经化学合成或生物合成而产生的多样性化合物的集合。举例而言，通过以任何可能方式合并一组称为氨基酸的化学构建块以获得指定化合物长度(亦即多肽化合物中氨基酸的数目)来形成线性组合化学文库(诸如多肽文库)。通过化学构建块的该组合混合可合成数百万种化合物。举例而言，系统性组合混合100个可互换的化学构建块可导致理论上合成1亿种四聚体化合物或100亿种五聚体化合物。
组合化学文库包括(但不限于)肽文库。美国专利第5,010,175号；Furka等人，Int.J Pept.Prot.Res.，37：487-493(1991)；及Houghton等人，Nature354：84-88(1991)(所有参考文献以引用的方式并入本文中)。肽合成决不是预想且意欲供本发明使用的唯一方法。亦可使用产生化学多样性文库的其它化学。所述化学包括(但不限于)：类肽(PCT公开案第WO 91/19735号，1991年12月26日)；编码的肽(PCT公开案WO 93/20242，1993年10月14日)；无规生物寡聚物(PCT公开案WO 92/00091，1992年1月9日)、苯并二氮呯(美国专利第5,288,514号)(以引用的方式并入本文中)；变异对映体(diversomer)，诸如乙内酰脲、苯并二氮呯及二肽(Hobbs等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90：6909-6913(1993))；插烯多肽(vinylogous polypeptide)(Hagihara等人，J Amer.Chem.Soc.114：6568(1992))；具有β-D-葡萄糖骨架的非肽肽模拟物(Hirschmann等人，J.Amer.Chem.Soc.114：9217-9218(1992))；小化合物文库的类似有机合成(Chen等人，J.Amer.Chem.Soc.116：2661(1994))；寡聚胺甲酸酯(Cho等人，Science 261：1303(1993))；和/或肽基膦酸酯(Campbell等人，J.Org.Chem.59 658(1994))；核酸文库；肽核酸文库(美国专利第5,539,083号)；抗体文库(Vaughn等人，Nature Biotechnology 14(3)：309-314(1996)及PCT/US96/10287)；碳水化合物文库(Liang等人，Science 274：1520-1522(1996)及美国专利第5,593,853号)；及有机小分子文库-苯并二氮呯(Baum C&EN，1月18日，第33页(1993))；类异戊二烯(isoprenoid)(美国专利第5,569,588号)(以引用的方式并入本文中)；噻唑啶酮及间噻酮(metathiazanone)(美国专利第5,549,974号)；吡咯啶(美国专利第5,525,735号及第5,519,134号)；N-吗啉基(morpholino)化合物(美国专利第5,506,337号)；苯并二氮呯(5,288,514)及其类似物)(所有参考文献以引用的方式并入本文中)。
制备组合文库的装置可自市面上购得(参见例如357 NIPS、390 NTS，Advanced Chem Tech，Louisville Ky.；Symphony，Rainin，Woburn，Mass.；433AApplied Biosystems，Foster City，Calif.；9050 Plus，Millipore，Bedford，Mass.)。
关于液相化学亦已发展多种机器人系统。所述系统包括自动化工作站，如Takeda Chemical Industries LTD.，Osaka，Japan研发的自动化合成装置及许多利用模拟化学家进行的手动合成操作的机器人手臂的机器人系统(Zymate II，Zymark公司，Hopkinton，Mass.；Orca，Hewlett-Packard，Palo Alto，Calif.)。任何上述装置均适于本发明使用。另外，许多组合文库本身可自市面上购得。ComGenex，Princeton，N.J.；Asinex，Moscow，Ru；Tripos，Inc.，St.Louis，Mo.；ChemStar Ltd，Moscow，RU；3D Pharmaceuticals，Exton，Pa.；或MartekBiosciences，Columbia，Md.。
2.化学文库的高通量检定
关于抑制如本文所述的细菌孢子的附着的化合物的任何检定均可用于高通量筛选。如上所述，在一个较佳具体实例中，所述检定筛选与微生物孢子表面蛋白质交互作用的药剂。
可至多用检定格式的常规修改形式(例如出于与机器人机械手、大型板读取器及其类似物的兼容性)实行本文所述的检定高通量实施。各种高通量筛选系统(例如用于蛋白质结合、核酸结合等)已经描述。美国专利第5,559,410号、第5,585,639号、第5,576,220号及第5,541,061号(所有以引用的方式并入本文中)。
另外，高通量筛选系统可自市面上购得。Zymark Corp.，Hopkinton，Mass.；Air Technical Industries，Mentor，Ohio；Beckman Instruments Inc.，Fullerton，Calif.；或Precision Systems Inc.，Natick，Mass.。所述系统典型地自动化整个程序，包括适于该检定的所有样品及试剂的移液、液体分配、定时培育及检测器中微板的最终读取。所述可组态的系统提供高通量且快速的启动以及高程度的灵活性及定制性。所述系统的制造商提供各种高通量的详细方案。因此，例如Zymark Corp.提供描述检测基因转录、配位体结合及其类似方面的调节的筛选系统的技术公报。
V.检测感染控制测试化合物
在一个具体实例中，本发明预期检测和/或定量微生物孢子表面蛋白质与感染控制测试化合物之间的交互作用的量或速率的方法。在一些具体实例中，检测方法包括(但不限于)录像显微术(video microscopy)、二脒基苯基吲哚(DAPI)荧光变化、荧光共振能量转移或离心。
A.显微术
在一个具体实例中，利用显微术(亦即例如利用直接目测或使用录像或照相记录装置)检测感染控制测试化合物。涉及显微镜观测的检定可利用包含标记(例如荧光标记)的梭菌属孢子表面肽和/或另一微生物孢子表面蛋白质。在一个具体实例中，肽和/或蛋白质邻近固体支撑物(例如载玻片)置放且暴露于含感染控制测试化合物的溶液。可使用显微镜(亦即例如扫描电子显微镜)直接观测肽和/或蛋白质于固体支撑物上的附着。
显微镜可视情况配备有静态摄影机或录像摄影机，且可配备有影像撷取及分析软件以定量蛋白质和/或肽附着的相对丰度。
可在显微镜中观测的任何标记均可联合该类型检测使用。所述标记包括(但不限于)荧光标记(例如荧光素、罗丹明等)、热量标记及放射性标记(利用适当的闪烁屏)及其类似物。在本发明检定的一些具体实例中，微管可在无任何标记的情况下观测(例如经由差示干涉对比显微术)。
B.DAPI荧光变化
在另一具体实例中，可利用标记(包含DAPI)根据荧光变化确定感染控制测试化合物与梭菌属孢子表面肽和/或另一微生物孢子表面蛋白质的交互作用。DAPI荧光的速率或量的降低表明测试化合物与微生物孢子表面蛋白质之间有交互作用。比较测试化合物的荧光变化与阴性和/或阳性对照反应中所观测到的荧光变化。
可使用的其它标记包括(但不限于)苯氨基萘磺酸酯(ANS)(例如分子探针(Molecular Probes)目录号：A-47、A-50、T-53等)、双-ANS(MolecularProbes目录号：B-153)、N-苯基-1-萘(NPN)(Molecular Probes目录号：P65)、DCVJ(Molecular Probes目录号：D-3923)、钌红及甲酚紫。
C.荧光共振能量转移
亦可利用荧光共振能量转移(FRET)测定梭菌属孢子表面肽和/或另一微生物孢子表面蛋白质与感染控制测试化合物之间的交互作用程度。荧光共振能量转移为一种当两个具有重迭吸收及发射光谱的荧光团一起位于靠近位置(例如相隔小于7mm)时发生的现象。Stryer等人，Ann.Rev.Biochem.，47：819-846(1978)。在一个具体实例中，本发明预期使用FRET检测蛋白质-蛋白质交互作用。Taylor等人，J.Cell Biol.89：362-367(1981)。
在一个具体实例中，合并等摩尔比例的经不同标记的微生物孢子表面肽与感染控制测试肽化合物(例如分别经荧光素标记及罗丹明标记)。微生物孢子表面肽与肽测试化合物交互作用后，荧光可能猝灭，表明个别结合荧光染料的靠近程度足以发生能量转移。可比较与测试化合物及对照组的反应所产生的荧光的速率和/或量。
VI.重组表达微生物孢子表面蛋白质及肽
在一个具体实例中，使用重组DNA方法合成梭菌属孢子表面肽和/或另一微生物孢子表面蛋白质。此一般包括产生编码蛋白质的DNA序列，将DNA置放于受特定启动子控制的表达盒中，于宿主中表达蛋白质，分离所表达的蛋白质，及需要时，使蛋白质复性。可利用许多适合方法来制备本发明所预期的编码肽和/或蛋白质的DNA，所述方法包括例如克隆化及限制适当序列，或利用如下方法直接化学合成：诸如磷酸三酯法(Narang等人，Meth.Enzymol.68：90-99(1979))；磷酸二酯法(Brown等人，Meth.Enzymol.68：109-151(1979))；二乙基亚磷酰胺(diethylphosphoramidite)法(Beaucage等人，Tetra.Lett.，22：1859-1862(1981))；及固体支撑物法(美国专利第4,458,066号)(所有上述参考文献以全文引用的方式并入本文中)。
普通熟习此技艺者一般将了解下文使用的命名法及下文描述的细胞培养、分子遗传学及核酸化学及杂交的实验程序。重组核酸方法、多核苷酸合成及微生物培养及转形使用标准技术(例如电穿孔、脂质体转染)。一般根据与商业套组一起提供的制造商说明书进行酶促反应及纯化步骤。一般根据此技艺中的习知方法及各种一般参考文献执行所述技术及程序。Sambrook等人，In：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)；及分子生物学的现有技术(CurrentProtocols in Molecular Biology)John Wiley and Sons，Inc.，N.Y.(1996)，其以全文引用的方式并入本文中。
本发明预期编码孢子表面多肽序列或其变异体的任何核酸序列，所述核酸序列用于产生表达孢子表面蛋白质的重组分子。举例而言，遗传密码的冗余允许有许多编码孢子表面多肽的核酸序列。因此，可使用不同于SEQ ID NO：2、4、6或8的密码予以增加孢子表面核苷酸序列的表达率。另外，亦可在真核生物表达宿主中使用替代密码子以产生具有其它性质(亦即例如较长或较短的半衰期)的重组RNA转录物的剪接变异体。另外，出于改变限制酶位点或在真核生物表达宿主中改变所转译多肽的糖基化模式的目的，亦可能需要不同密码子。
微生物孢子表面蛋白质核苷酸序列(亦即例如梭菌属孢子表面蛋白质)的变异体亦包括在本发明的范畴内。所述变异体包括(但不限于)具有不同核苷酸或核苷酸类似物的缺失、插入或取代的核苷酸序列，只要维持核苷酸序列转译产物的生物活性即可。本发明不限于梭菌属孢子表面蛋白质核酸序列(亦即例如SEQ ID NO：2)，但尤其包括能够在不同杂交严格度度下与SEQ ID NO：2(亦即例如芽孢杆菌属同源物；SEQ ID NO：3、5及7)及其部分、变异体及衍生物杂交的核酸同源物。举例而言，较高严格度可降低或去除SEQ ID NO：2与其它核酸序列之间的非特异性结合。或者，较低严格度可用以检测较大数目的与SEQ ID NO：2具有不同同源性的核酸序列。SEQ ID NO：2的片段(亦即亦称为部分)亦尤其预期在本发明的范畴内。在一个具体实例中，片段的长度等于或大于10个核苷酸且显示大于50％的与SEQ ID NO：2的同源性。
本发明进一步预期反义分子，其包含与SEQ ID NO：2的多核苷酸的至少一部分或编码孢子表面蛋白质的多核苷酸的至少一部分互补的核酸序列。本发明进一步预期融合基因，其包含选自包含SEQ ID NO：2或编码连接于一或多个异源序列的孢子表面蛋白质的多核苷酸的群组的核酸的至少一部分、变异体、衍生物和/或同源物。虽然不必了解发明机制，但咸信该融合基因可用以检测核酸序列的表达。异源序列的实例包括(但不限于)编码酶(诸如β-半乳糖苷酶或荧光素酶)的报导序列。融合基因亦可促进表达蛋白质的纯化。举例而言，蛋白质A的异源序列允许在经固定的免疫球蛋白上纯化融合蛋白质。亦可利用其它亲和性收集器(affinity trap)来纯化所表达的融合蛋白质。举例而言，可使用pGEX载体(Promega，Madison，Wis.)表达孢子表面蛋白质与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白质。一般而言，所述融合蛋白质系可溶且可通过吸附于谷胱甘肽-琼脂糖珠粒上，接着在游离谷胱甘肽存在下洗脱而容易地自溶解的细胞中纯化。所述系统中制备的蛋白质经设计以包括肝素、凝血酶或XA因子蛋白酶裂解位点以便所克隆化的有兴趣的多肽可按意愿自GST部分释放。
A.代表性孢子表面蛋白质的重组表达
在一个具体实例中，本发明预期表达重组微生物孢子表面蛋白质的方法。在一个具体实例中，该方法包含构建编码微生物孢子表面蛋白质的至少一部分的质粒。在一个具体实例中，该方法包含用质粒转染适合生物体。在一个具体实例中，适合生物体为大肠杆菌。
本文提供的数据显示成功克隆化具有包含编码艰难梭菌孢子表面蛋白质的至少一部分的核酸的质粒的经转染大肠杆菌。在一个具体实例中，孢子表面蛋白质为CD1067。在一个具体实例中，孢子表面蛋白质为CD3620。以下实验仅意欲说明本发明具体实例而不欲限制本发明具体实例，因为可使用下文描述的基本技术用其它孢子表面蛋白质核酸构建体获得类似结果。
在大肠杆菌Rosetta-Gami表达菌株中经由具有含十(10)个氨基酸的His标签的pET-19b质粒(Novagen，产品编号69677-3)进行艰难梭菌疑似表面蛋白质的克隆化。特定言之，在包含大肠杆菌Rosetta-Gami细胞的隔夜培养物(亦即例如12小时)中培育pET-19b+CD1067(pJEB02)或pET-19b+CD3620(pJEB03)。参见图11。
将约2ml经转染大肠杆菌细胞培养物转移至包含50ml卢里亚肉汁(LB)+100μg/ml单磷酸腺苷(AMP)及34μg/ml氯霉素(chloramphenical)的表达培养基中。使培养物生长至OD625约达0.5-0.6后，用1mM IPTG诱导pET质粒表达。IPTG诱导后，以约1小时为间隔，取1ml培养基样品。离心样品(亦即例如约10,000×g，1分钟)，且将所得离心块再悬浮于100μl Novex溶液(45μl 2×SDS-PAGE样品缓冲液+45μl H2O+10μl 2M二硫苏糖醇)中且煮沸约5分钟。最初在4-12％Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶上电泳约20μl已煮离心块悬浮液，随后使用约10μl疑似经分离的重组蛋白质进行蛋白质印迹分析。
预期pJEB02质粒表达含405个氨基酸且分子量约为44kDa的蛋白质。SDS-PAGE凝胶电泳分离证实该预期，显示在IPTG诱导后1小时内出现约50kDa的蛋白质的表达且后续样品(亦即2-6小时样品)中的强度增加。参见图12。使用蛋白质印迹分析由F1373抗艰难梭菌抗体或抗His抗体检测证实该初步分离。分别参见图13A及图13B。
预期pJEB03质粒表达含122个氨基酸且分子量约为14kDa的蛋白质。SDS-PAGE凝胶电泳分离证实该预期，显示在IPTG诱导后1小时内出现约20kDa的蛋白质的表达且后续样品(亦即2-4.5小时样品)中的强度增加。参见图14。使用蛋白质印迹分析由F1373抗艰难梭菌抗体或抗His抗体检测证实该初步分离。分别参见图15A及图15B。
F1373抗艰难梭菌抗体或F1997抗艰难梭菌抗体(例如针对孢子表面的商业定制制剂；Strategic Diagnostics公司)的免疫前蛋白质印迹对照样品表明pJEB02与pJEB03表达概况中均缺少结合特异性。参见图16A-D。所述数据显示当将CD1067及CD3620克隆化于大肠杆菌中时，免疫前对照检测不与重组CD1067蛋白质或重组CD3620蛋白质反应。相比之下，艰难梭菌孢子表面抗体(亦即例如F1373或F1997)与重组CD 1067蛋白质及重组CD 3620蛋白质特异性反应。所述蛋白质的特异性表达已通过检测附着于对应于重组CD1067蛋白质与CD3620重组蛋白质的分子量的表达质粒构建体的His10标签得到证实。
B.核酸序列合成技术
亦可使用合成化学技术产生本发明预期的核酸序列。可在AppliedBioSystems寡核苷酸合成仪上根据制造商提供的说明书合成寡核苷酸。Sinha等人，Nucleic Acids Res.12：4539(1984)。合成后，可通过在含NaCl(200mM)的10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)溶液中加热互补寡核苷酸至90℃，并随后使的缓慢冷却至室温，使互补寡核苷酸黏接。对于结合及转化检定，自天然聚丙烯酰胺(15％w/v)凝胶纯化双螺旋DNA。切下对应于双链DNA的带且浸泡在含EDTA(1mM)的0.30M乙酸钠缓冲液(pH 5.0)中隔夜。浸泡后，用酚/氯仿(1/1v/v)提取上清液，且用乙醇使的沉淀。通过用32P-ATP及T4多核苷酸激酶处理对DNA基质的5′-OH基团作放射性标记。利用Sephadex G柱层析法移除盐及未合并的核苷酸。
可使用市售套组证实合成的核苷酸序列，所述套组包含酶，包括(但不限于)DNA聚合酶I的克列诺片段(Klenow fragment)，Sequenase、Taq DNA聚合酶或热稳定T7聚合酶。亦可使用毛细管电泳分析核酸序列尺寸及证实核酸合成产物序列。亦可通过如下扩增合成序列：i)聚合酶链反应(PCR)(Mullis等人，美国专利第4,683,195号；及Mullis等人，美国专利第4,683,202号)；连接酶链/扩增反应(LCR/LAR)(Barany等人，Proc.Natl.Acad.Sco.，88：189(1991)；Barany等人，PCR Methods and Applic.，1：5(1991)；及Wu等人，Genomics4：560(1989))。
可以多种方式使用本发明的孢子表面蛋白质核苷酸序列。举例而言，可使用至少约10bp、更通常至少约15bp且至多且包括整个(亦即全长)序列的序列片段作为自芽孢杆菌属、梭菌属以及其它细菌检测及分离互补基因组DNA序列的探针。通过用全部或部分的孢子表面蛋白质核酸序列筛选含细菌DNA的基因组文库来分离基因组序列。除筛选基因组文库以外，孢子表面蛋白质核酸序列亦可用于筛选使用细菌RNA制备的cDNA文库。孢子表面蛋白质核酸序列亦适用于指导孢子表面蛋白质的合成。孢子表面蛋白质抗体亦可用于拮抗孢子表面蛋白质与哺乳动物细胞、哺乳动物皮肤、硬表面等的交互作用。孢子表面蛋白质可用于产生用于诊断目的(诸如检测表达孢子表面蛋白质的细菌的感染)的孢子表面蛋白质抗体。孢子表面蛋白质核酸序列亦适用于筛选结合拮抗剂及检测含有孢子表面蛋白质的微生物。
化学合成通常产生单链寡核苷酸。通过与互补序列杂交或通过使用单链作为模板用DNA聚合酶聚合，可将其转化为双链DNA。虽然DNA的化学合成通常针对约100个碱基的序列进行，但通过连接较短序列可获得较长序列。
或者，可克隆化子序列且使用适当限制酶裂解适当子序列。随后，可连接所述片段以产生所要DNA序列。
在一个具体实例中，可使用DNA扩增法(诸如聚合酶链反应(PCR))克隆化微生物孢子表面蛋白质核酸。因此，例如使用含一个限制性位点(例如NdeI)的正义引物及含另一限制性位点(例如HindIII)的反义引物，PCR扩增核酸序列或子序列。此将产生编码包含末端限制性位点的所要蛋白质的核酸。随后可将该核酸容易地连接至含编码第二分子且具有适当相应限制性位点的核酸的载体中。
可使用本文提供的序列信息确定适合的PCR引物。亦可通过定点突变诱发向编码微管解聚或切割蛋白质的核酸中添加适当限制性位点。用适当限制性核酸内切酶裂解含编码微管解聚或切割蛋白质的核酸的质粒，并随后根据标准方法连接至编码第二分子的载体中。
编码梭菌属孢子表面肽和/或其它微生物孢子表面蛋白质的核酸序列可表达于多种宿主细胞中，包括大肠杆菌、其它细菌宿主、酵母菌及各种高级真核生物细胞，诸如COS、CHO及海拉细胞株(HeLa cells line)及骨髓瘤细胞系。重组蛋白质基因通常会可操作地连接于适合各宿主的表达控制序列。对于大肠杆菌，较佳启动子包括(但不限于)T7、trp或λ启动子。另外，核糖体结合位点及转录终止信号为表达载体的一部分。对于真核生物细胞，控制序列会包括启动子、及较佳来源于免疫球蛋白基因、SV40、巨细胞病毒等的增强子、及聚腺苷酸化序列，且可包括剪接供体及受体序列。
可利用包括(但不限于)氯化钙、磷酸钙或电穿孔的方法将本发明质粒转移至所选择的宿主细胞中。可根据质粒上所含的基因(诸如amp、gpt、neo及hyg基因)赋予的抗生素抗性选择经质粒转形的细胞。
一旦重组蛋白质经表达，即可根据标准程序纯化所述重组蛋白质，所述程序包括(但不限于)硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳及其类似程序。R.Scopes，Protein Purification，Springer-Verlag，N.Y.(1982)；及Deutscher等人，Methods in Enzymology第182卷(1990)。具有至少约90％至95％均质性的实质上纯组合物较佳，且均质性最佳为98％至99％或更高。按需要使多肽部分纯化或纯化至均质后，即可供使用(例如作为免疫原用于产生抗体)。
VII.梭菌属感染
艰难梭菌(一种革兰氏阳性厌氧菌)时常在位院患者中引发疾病，且咸认为其为抗生素相关腹泻及假膜性结肠炎的病原体。Borriello等人，“艰难梭菌的毒力因子(Virulence factors of Clostridium difficile)”Rev.Infect.Dis.12：S185-S191(1990)；Cerquetti等人，“来自不同的艰难梭菌分离群的表面层蛋白的表征(Characterization of surface layer proteins from different Clostridiumdifficile clinical isolates)”Microb.Pathog.28：363-372(2000)；及Kuipers等人，“乳酸细菌中其中传感控制基因的表达(Quorum sensing-controlled geneexpression in lactic acid bacteria)”J.Biotechnol.64：15-21(1998)。两个因素已经评估其参与所述病状的发病机制：i)给予抗生素对常居肠内菌群的抑制(Freeman等人，“抗生素和艰难梭菌(Antibiotics and Clostridium difficile)”Microbes Infect.1：377-384(1999)；及George W.，“与抗微生物剂相关的大肠炎和腹泻：历史背景和临床方面(Antimicrobial agent-associated colitis and diarrhea：historical background and clinical aspects)”Rev.Infect.Dis.6：S208-S213(1984))；及ii)细菌产生两种高分子量(MW)毒素(毒素A及B)(Pothoulakis等人，“微生物和微生物毒素：微生物-粘膜相互作用反例II.肠对艰难梭菌毒素的整体反应(Microbes and microbial toxins：paradigms for microbial-mucosalinteractions.II.The integrated response of the intestine to Clostridium difficiletoxins)”Am.J.Physiol.-Gastroint.Liver Physiol.280：G178-G183(2001)；及WrenB.，“艰难梭菌毒素A和B的分子表征(Molecular characterisation of Clostridiumdifficile toxins A and B)”Rev.Med.Microbiol.3：21-27(1992))。
如同其它产肠毒素病原体一样，毒素的传递随着肠中艰难梭菌的菌落丛生，此需要细菌粘附于黏膜。在氯林可霉素(clindamycin)诱发的疾病的叙利亚仓鼠(Syrian hamster)模型中，经报导不同艰难梭菌菌株的肠菌落丛生的可变效率与其缔合涵盖空肠至结肠的胃肠道区域的能力之间的相关性。表明至少部分变化归因于除毒素产生以外的因素。然而，给予粗毒素制剂会增强低毒力菌株粘附于小肠黏膜，此可能归因于细胞损伤后受体位点被暴露。
已显示艰难梭菌的两种毒性因子为外毒素，毒素A(TcdA)及毒素B(TcdB)3，关于参与粘附及菌落丛生过程的其它因子知之甚少。Voth等人，“艰难梭菌毒素：在疾病中的活动机制和作用(Clostridium difficile toxins：mechanism ofaction and role in disease)”Clin.Microbiol.Rev.18，247-263(2005)。此与其它肠道生物体不同，诸如大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)及志贺氏菌属物种(Shigella spp.)。可能此可能部分归因于缺乏用于研究艰难梭菌的发展完善的突变诱发系统。一种可能了解艰难梭菌的方法涉及鉴别参与致病性的潜在因子的基因组位置。已报导艰难梭菌菌株630(流行性X型；有毒力及多重抗药性)的完整基因组序列。Wust等人，“通过多种类型方法研究与抗生素相关的大肠炎的爆发(Investigation of an outbreak ofantibiotic-associated colitis by various typing methods)”Clin.Microbiol16：1096-1101(1982)。
艰难梭菌菌株630的基因组包含4,290,252bp的环状染色体及7,881bp的质粒pCD630。染色体编码3,776条预测的编码序列(CDS)；与其它低G+C含量革兰氏阳性细菌相同，染色体具有强编码偏向，其中82.1％的CDS编码于前导链上。质粒承载11条CDS，其中无一条具有任何明显的功能。针对四个已测序的梭菌基因组，丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、肉毒梭菌(C.botulinum)、产气荚膜梭菌及破伤风梭菌(C.tetani)的相互FASTA分析显示仅567条(15％)艰难梭菌CDS为所有已测序的梭菌属所共有，而1,893条(50％)为艰难梭菌所特有。保守梭菌CDS主要编码必需功能，而艰难梭菌独特的CDS编码许多附属功能及移动组件(mobile element)。Sebaihia等人，“多药耐药人病原体艰难梭菌具有高度变化的镶嵌式基因组(Themulti-drug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile，mosaic genome)”Nature Genetics 38：779-786(2006)。
已在人类上皮细胞与胃肠组织中观察到经纯化艰难梭菌表面层蛋白质(SLP)的结合。Calabi等人，“艰难梭菌表面层蛋白与胃肠组织的结合(Bindingof Clostridium difficile surface layer proteins to gastrointestinal tissues)”InfectImmun 70：5770-5778(2002)。以酸提取SLP及以可溶性重组高分子量亚单位观察到与细胞及组织的结合。相比之下，在与重组高分子量SLP亚单位相同的条件下以可溶性重组低分子量SLP亚单位观察到、表达及纯化低得多或不低的结合。因为抗高分子量亚单位血清部分阻断艰难梭菌粘附于HEp-2细胞，所以SLP有可能参与整个细菌粘附于上皮细胞。咸信所述蛋白质在粘附期间保留天然构形，因为：i)天然与重组SLP制剂均保留肽聚糖水解酶活性；ii)酸提取SLP在添加钙后能够聚合成较高级结构；及iii)针对该两种重组亚单位培养的抗血清在高效价下与整个艰难梭菌细胞反应。
怀疑产气荚膜梭菌引起气性坏疽且为坏疽的严重形态(组织死亡；亦称为坏死性皮下感染)。气性坏疽亦可由链球菌属物种(Streptococcus spp.)及创伤弧菌(Vibrio vulnificus)感染引起。
气性坏疽通常因感染产气荚膜梭菌细菌而发生，该细菌在缺氧(低氧)条件下产生引起组织死亡及相关症状的毒素。在美国，气性坏疽较罕见，每年仅1,000-3,000例。气性坏疽一般发生在外伤部位或最近外科手术创伤处，但亦可自发发生。自发发展气性坏疽的患者通常具有高风险因子，包括(但不限于)潜在血管疾病(亦即例如动脉粥样硬化或动脉硬化)、糖尿病或结肠癌。
气性坏疽的发作一般为突然且严重的。发炎自感染部位开始，呈浅红色至棕红色，且伴随极其疼痛的组织肿胀。当用手指按肿胀区域时，可在组织中感觉到气体，呈发出爆裂声的感觉。感染区域的边缘快速扩大以致几分钟内即可见到变化。所涉及的组织完全破坏。
产气荚膜梭菌细菌产生许多不同毒素，其中四种(亦即例如α、β、ε及ι)可能引起潜在致命的症候群。另外，其引起组织死亡(亦即例如坏死)、血液细胞破坏(亦即例如溶血)、循环局部减小(亦即例如血管收缩)及血管泄漏(亦即例如血管渗透性增加)。
产气荚膜梭菌毒素造成局部组织破坏与全身性症状(整个身体出现的其它症状)。全身性症状在气性坏疽感染早期出现且包括(但不限于)出汗、发烧及焦虑。若放任不加以处理，则个体发展休克样症候群，包括(但不限于)血压降低(亦即例如低血压)、肾衰竭、昏迷及最终死亡。其它气性坏疽症状可包括(但不限于)皮肤损伤周围的中度至重度疼痛、皮肤损伤周围的进行性肿胀、中度至高度发烧、皮肤颜色最初呈浅红色、随后由微暗的红色发展成暗红色或紫色、黄疸、囊泡形成、合生囊泡并成大脓疱、填充棕红色流体的脓疱、组织排液、难闻的棕红色或血红流体(亦即例如浆液血色分泌物)、心率增加(亦即例如心跳过速)、出汗、皮下气肿(亦即例如皮肤下含空气)或咿轧声(crepitus)(亦即例如组织中含空气)。
或者，个体可处于休克状态，包含全身苍白(general pallor)、肢端发冷、血压低或心率快。最终可能发展全身感染，包括整个身体(亦即例如全身毒性或败血症)。确定气性坏疽存在的其它方法包括(但不限于)：感染区域的流体的革兰氏染色可显示革兰氏阳性杆菌(Gram-positive rod)(亦即例如梭菌属物种)；培养物可生长引起感染的细菌；血液培养物可生长感染细菌；缺氧组织和/或流体培养可揭露至少一种梭菌属物种；或感染区域的X光、计算机化断层扫瞄或磁共振影像可显示组织中的气体。
气性坏疽的治疗一般包括实时外科手术移除死亡、损伤及感染组织(亦即例如清创术)。可指示截除臂或腿来控制感染传播。可初始可以快速给药形式静脉内给予习用抗生素(亦即例如青霉素)，接着为长期口服疗程。
VIII.芽孢杆菌属感染
炭疽为百年前已首次描述的疾病且为亦已确定微生物起因的首批疾病之的一。该感染由炭疽芽孢杆菌孢子传播，所述孢子可经由摄食、接种或吸入渗透至哺乳动物宿主中。后者感染模式最严重，疾病发展快速且伴随大多致命的后果。Dixon等人，N.Engl.J.Med.341，815-826(1999)。孢子为一些微生物的休眠细胞形式，其特征在于对化学物质及诸如热及干旱的环境因素性具有高抗性，此允许生物体在环境中持续存在数十年。渗透宿主组织后，炭疽芽孢杆菌孢子发芽成致命的营养形态。肺中炭疽芽孢杆菌感染的早期阶段及宿主防御系统的作用尚不清楚。共焦显微术研究显示孢子发芽在巨噬细胞内发生，该处芽孢杆菌属开始产生毒素(包括致死因子、保护性抗原及水肿因子)。Guidi-Rontani等人，Mol.Microbiol.31：9-17(1999)。产生所述毒素导致巨噬细胞凋亡且营养芽孢杆菌属释放至血流中，引起败血症及死亡。Dixon等人，Cell.Microbiol.2：453-463(2000)。
另一方面，巨噬细胞似乎通过去除孢子来保护动物以免其因吸入孢子而感染。Cote等人，Microb.Pathog.37：169-175(2004)。炭疽芽孢杆菌孢子被宿主吸入后遭遇到的另一保护屏障为涂布有肺界面活性剂薄层的肺泡上皮表面。肺界面活性剂为起两种作用的脂质-蛋白质复合物：i)机械性降低肺泡的表面张力(呼气期间防止其塌陷)；及ii)提供对抗感染的肺防御。McCormack等人，J.Clin.Invest.109：707-712(2002)。该免疫功能可归因于界面活性剂蛋白质(SP)，包括(但不限于)SP-A及SP-D。SP-A及SP-D为可与病原体表面交互作用、促进其破坏且因此防止感染的集合的亲水性成员。Crouch等人，Annu.Rev.Physiol.63：521-554(2001)。两种其它界面活性剂蛋白质SP-B及SP-C具有高度疏水性，已显示后者结合细菌脂多糖且调节其细胞作用。Augusto等人，J.Biol.Chem.277：23484-23492(2002)；及Augusto等人，Am.J.Respir.Crit.CareMed.168：335-341(2003)。
IX.预防性及治疗性用途
A.医院去污染
医院病原体(亦即例如艰难梭菌)造成医院工作人员与常居患者群体的绝大多数细菌感染。所述感染可能引起各种症状，包括(但不限于)严重腹泻，而且受损患者(亦即例如免疫受损患者)感染后，亦可能导致死亡。因此，维持医院设施与工作人员无菌的改进将有利于患者恢复且因住院期缩短而降低总卫生保健成本。
一些细菌(亦即例如艰难梭菌)产生已证明对常见皮肤及表面消毒剂具高度抗性的孢子。当前可用于医院设施表面及医院工作人员皮肤(亦即表皮层)的清洁剂对杀死和/或移除细菌孢子无效。厌氧细菌(亦即例如艰难梭菌)需要专用设备及处置技术来处理及操作。因此，当前并无容易的方式来发展厌氧细菌特异性“孢子移除洗手液”。
实际上，艰难梭菌造成所有抗生素相关腹泻病例的15-25％。该类型腹泻的复发为严重的、困难的且仍未解决的管理问题，且增加住院时间与总成本。大多数研究表明艰难梭菌感染的医院复发率在再感染相同或不同细菌亚型之间的比率为50∶50。所述类型的复发的充分控制视抗微生物程序质量而定，所述程序诸如洗手、环境去污染及肠分离(enteric isolation)。已在交叉感染中证明及牵涉环境污染及孢子续存。Barbut等人，“艰难梭菌相关的腹泻复发与再感染的流行病学(Epidemiology of recurrences or reinfections of Clostridiumdifficile-Associated diarrhea)”J Clin Microbiol 38：2386-2388(2000)。
在一个具体实例中，本发明预期包含厌氧细菌孢子的至少一种最外层蛋白质组分的组合物。在一个具体实例中，厌氧细菌包含艰难梭菌孢子。在一个具体实例中，蛋白质组分来源于孢子外膜层。在一个具体实例中，蛋白质组分包含孢子表面蛋白质。虽然不必了解发明机制，但咸信厌氧细菌孢子的最外层蛋白质组分引导孢子附着于生物体的组织(亦即例如皮肤或肠)或无生命硬表面(亦即例如不锈钢、花岗岩、皮革、乙烯树脂、陶瓷等)。
在一个具体实例中，本发明预期包含筛选能够破坏厌氧孢子蛋白质与组织或无生命表面之间的附着交互作用的组合物的方法。在一个具体实例中，厌氧细菌孢子的最外层蛋白质组分充当筛选所述组合物的分子目标。
可利用标准方法(同上)表达及纯化来源于艰难梭菌孢子外膜的孢子表面蛋白质。因此，使用经纯化及经分离的孢子表面蛋白质，可使用简单筛选检定来研发厌氧孢子移除产品(例如洗手液、无生命表面清洁剂、全身去污染溶液)而无需处理完整艰难梭菌生物体。此消除以上提及的对大规模缺氧设备的需要且有效简化筛选过程。
B.应急第一反应者
在一个具体实例中，本发明预期预防性及治疗性处理对微生物污染反应的应急人员(亦即例如第一反应者)。在一个具体实例中，应急第一反应者可包括(但不限于)应急医疗技术人员(EMT)、消防员、女消防员、警察、女警察、新闻工作者、警犬或警马。
收集及鉴别未知物质可为危险且一般耗时的程序。详言之，微生物分析典型地需要实验室专用设备。随着最近全球恐怖主义增加，此时遇到毒性物质(亦即例如炭疽)的高风险增加，对快速预防和/或治疗应急第一反应者污染存在需要。另外，筛选和/或测试方案应可在无专用设备下容易地获得。
随着最近世界范围内恐怖分子活动的加速，第一反应者需要包含提供针对微生物感染的特异性保护的化合物的容易获得的组合物。应急第一反应者对该保护的需要自恐怖分子袭击延伸至各种事件，包括(但不限于)自然灾害、卡车相撞及工业事故。所述事件可能分散微生物物质，且因所述微生物来源的书面描述、警告标记等被移除或破坏，几乎不可能实时鉴别。
在不知微生物的身分的情况下，应急第一反应者使自身、其家庭及其它人员以及其所治疗的人员置身于被污染的高风险下。第一反应者亦有必要知道其所治疗的人员暴露于何物，因为在不知何物引起人员病状的情况下，其不能适当治疗该人员，且若第一反应者不知人员暴露于何种物质，则其可能用将与未知物质以消极方式反应的药物治疗该人员。
应急第一反应者并非唯一需要对未知物质进行快速且有效的分析、保护及处理的人员。需要对未知物质进行预防、处理和/或快速分析的人员的其它实例包括(但不限于)清理工业场所的废弃物清扫人员、看到包装泄漏流体的邮件室办事员、在可疑车辆中发现未知物质的警官、及发现儿童无意识接近未作标记的化学物质瓶子的教师。
当前用于测试未知物质的方法通常仅在专用实验室中可用的时间。宝贵的时间浪费在等待样品运输、集结训练人员进行测试中。因此，本发明预期包含经标记微生物DNA数组、样品DNA提取溶液及能够定量标记的检测器的套组。该套组将允许现场测定微生物污染的类型。
非特异性去污染为劳动强度大且耗时的任务，若存在微生物孢子，则其可能并不有效。本发明预期容易获得的去污染组合物，其包含多种来源于至少一种孢子表面蛋白质的肽片段。所述片段将自固体表面(亦即例如建筑物墙壁、天花板、楼梯、办公室陈设等)以及自应急第一反应者的外部上皮层(亦即例如皮肤)置换细菌孢子。另外，适于人类和/或动物给药的肠胃外、鼻内、经肺或经口组合物将自身体组织(亦即例如口、咽喉、鼻道、肺、胃、肠、膀胱或结肠)置换细菌孢子。因此，本发明预期包含对孢子表面蛋白质具有亲和力的化合物的组合物，其中该蛋白质负责使微生物孢子附着于表面(亦即例如固体人工表面或皮肤表面)。
C.军事应用
在一个具体实例中，本发明预期预防性及治疗性处理对微生物污染反应的军事人员(亦即例如第一反应者)。在一个具体实例中，军事人员可包括(但不限于)步兵、飞行员、骑兵、海军、海军陆战队、特种部队、后勤、承包商或新闻工作者。
本发明预期容易获得的去污染组合物，其包含多种来源于至少一种孢子表面蛋白质的肽片段。所述片段将自固体表面(亦即例如帐篷、吉普车、坦克车、武器、制服等)以及自军事人员的外部上皮层(亦即例如皮肤)置换细菌孢子。另外，适于人类和/或动物给药的肠胃外、鼻内、经肺或经口组合物将自身体组织(亦即例如口、咽喉、鼻道、肺、胃、肠、膀胱或结肠)置换细菌孢子。因此，本发明预期包含对孢子表面蛋白质具有亲和力的化合物的组合物，其中该蛋白质负责使微生物孢子附着于表面(亦即例如固体人工表面或皮肤表面)。
在一个具体实例中，本发明预期常规防弹织物去污染的方法。目前，由防弹织物制成的衣服系用冷水及温和清洁剂手洗，充分清洗以移除所有微量清洁剂。适当清洗禁止积聚残余皂膜，该皂膜会吸水且降低某些类型的防弹织物的防弹性。虽然该方法耗时且费力，但为必需的，因为机洗或干燥会损坏织物，最终影响其防弹效能。此外，一些清洁剂、干洗溶剂、漂白剂及淀粉可能会降低衣服的防弹程度，且大多数制造商强烈推荐不要使用。此外，大多数防弹织物制造商强烈推荐决不要使防弹织物浸没于水中或在户外、甚至阴凉处晾干，因为紫外线光引起某些类型的防弹织物降级。
类似地，保护性服装(诸如军用出勤装备)及其它保护性物品(诸如护膝、护胫、肩垫及其类似物)的护理及清洁亦费力且耗时。重复清洁会降低所述衣服的有效寿命。
由防弹织物制成的防护装备与衣服面临的共同问题在于穿戴者的汗液。若汗液不移除，则随时间会导致真菌和/或细菌生长。该真菌和/或细菌生长最终使对象的防护性质降级，产生有害气味且甚至可能对穿戴者造成长期健康问题。尤其在军用出勤装备方面，制作军用防护服中所使用的所有织物及组件必须通过最低效能要求。因此，设计供有暴露于武器火和/或火焰及高温的危险的军事人员使用的防护服的内衬层通常由芳族聚酰胺纤维及纱线制成。
在一个具体实例中，本发明包含对防弹织物对象及其它军用保护装备进行去污染的方法，其中对象及装备包含如下组分，包括(但不限于)芳族聚酰胺、聚苯并唑或高效能聚乙烯纤维。在一个具体实例中，利用包含对孢子表面蛋白质具有亲和力的化合物的组合物对对象和/或装备进行去污染。组合物可容易且以成本有效的方式直接施用于对象或施用于纤维或作为织物整理剂施用。
X.抗微生物肽
现在感染控制研究包括搜寻新颖抗微生物肽以及抗微生物有机化学物质。已自植物、昆虫、鱼、两栖动物、鸟及哺乳动物分离出抗微生物肽。Gallo，J InvestDermatol.，111：739-743(1998)；及Ganz et al，Pharmac.Ther.，66：191-205(1998)。显然，所述肽为针对微生物发病机制的先天宿主保护的主要组分，其作用在于在微生物细胞质膜中产生孔。Oren等人，Biopolymers，47(6)：451-463(1998)。此外，抗微生物肽亦通过刺激动物细胞改变特性(诸如黏结蛋白聚糖(syndecan)表达、趋化性及氯离子分泌)而作用于动物细胞。Gallo，J InvestDermatol.，111：739-743(1998)。已报导脊椎动物皮肤、气管及舌上皮在与微生物接触后产生肽抗生素。Russell等人，Infect Immun，64(5)：1565-1568(1996)。然而，普遍未观察到抗微生物肽有效对抗细菌孢子。
高级真核生物的抗微生物肽长期以来视为先天免疫系统的组分，最初视为原始的且几乎无临床意义。然而，所述肽的相对简单性掩饰了其重要性，不仅在预防原发性微生物感染方面，而且亦在后续免疫调节方面。Bowman，“肽抗生素和它们在内生免疫性中的作用(Peptide antibiotics and their role in innateimmunity)”，Annu.Rev.Immunol.，13：61-92(1995)。另外，分子尺寸小表明对许多微生物抗性机制的敏感性较低。
抗微生物肽一般对细菌及一些真菌具有致死性。其对哺乳动物细胞展现不同毒性。虽然不必了解发明机制，但咸信抗微生物肽与脂质双层交互作用且因此可损害细菌膜的完整性。Hwang等人，Biochem Cell Biol，76：235-246(1998)。
SMAP 29为最初经由绵羊骨髓RNA的3′RACE分析鉴别出的导管素(cathelicidin)的绵羊抗微生物肽。Mahoney，FEBS Lett，377：519-522(1995)。RCAP 18为最初自颗粒细胞鉴别出的导管素的狼抗微生物肽。Hirata等人，Infect.Immun.62：421-1426(1994)。咸信SMAP 29及RCAP 18肽提供对抗一些抗药性细菌菌株的保护。举例而言，SMAP 29组合物能够控制绿脓杆菌、木糖氧化产碱菌(Alcaligenes xylosoxidans)及嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophila)的抗生素抗性感染。
显然，全长抗微生物肽的抗细菌效能与沿其主链的疏水性梯度直接相关，与其阴离子性残基的相对丰度反相关，但不与于三氟乙醇中螺旋形成的程度相关。
因此，本发明预期筛选及鉴别能够抑制微生物孢子与固体表面的交互作用、附着和/或稳定的组合物的方法。另外，预期所述筛选方法亦会鉴别能够抑制微生物孢子与宿主生物体(亦即例如人类、家畜、牲畜等)的交互作用、附着和/或稳定的化合物。
XI.组合营养细胞/孢子抗微生物组合物
本发明涵盖解决与对常见抗生素药物具抗微生物抗性相关的问题的方法。明显的抗微生物剂抗性的一个原因在于常见抗微生物剂对微生物孢子无效。因此，当用以习用抗微生物化合物“去污染”后微生物孢子仍存在时，孢子将转变成活性微生物生长。当微生物再现实际上归因于不完全的去污染技术时，此可能会(误)解释为“微生物抗性”。在一个具体实例中，本发明涵盖一种组合物，其包含对细菌孢子表面肽具有亲和力的化合物与一种或多种习用抗微生物剂或抗生素的组合。
虽然不必了解发明机制，但咸信包含对微生物表面孢子肽具有亲和力的化合物和/或一种或多种习用抗微生物剂或抗生素的组合物将不仅有效杀死活性微生物(亦即例如营养细胞)，而且亦可自固体表面和/或身体组织分离微生物孢子。另外认为该组合策略达成单独用抗微生物剂去污染不可能实现的消毒程度。
一系列已经鉴别具有抗性特征的菌株列于表XIV中。
表XIV：对抗微生物剂的细菌抗性的机制
Lorian，实验室医学中的抗生素(Antibiotics in Laboratory Medicine)，Satterfield(编)，Williams & Wilkins，费城(Philadelphia)，第558-559页(1991)。
在一个具体实例中，本发明涵盖包含对微生物孢子表面肽具有亲和力的化合物的组合物，其中该化合物对来源于不同细菌物种及菌株的肽具有亲和力。在一个具体实例中，不同细菌菌株对多种抗生素药物具抗性。在一个具体实例中，本发明组合物包含稳定医药调配物。在一个具体实例中，调配物可进一步包含医药学上可接受的载剂。另外预期调配物可给予至人类或动物，包括在食品制剂、医药制剂、医学及医药产品、化妆产品、卫生产品、清洁产品及清洁剂以及组合物可喷涂或粘附的任何物质中，其中希望抑制微生物孢子附着于该物质上及后续于该物质上生长。
阻止微生物附着及后续生长及增殖所必需的本发明组合物的适当施用量视许多因素而定，所述因素包括可能存在的细菌类型、组合物所引入的环境及预想组合物在指定区域中保留的时间。
另外预期本发明组合物可与其它抗微生物剂或抗生素组合使用以增强其活性。本发明组合物与其它药剂的组合可适用于归因于毒性问题而允许抗生素在较低剂量下使用，增强功效已降低的抗生素的活性，或实现组分之间的协同作用以使组合的功效大于各组分独立时的功效的和。
可在组合疗法中与本发明组合物组合的抗生素包括(但不限于)青霉素、安比西林、阿莫西林(amoxycillin)、万古霉素、环丝氨酸(cycloserine)、杆菌肽(bacitracin)、头孢菌素(cephalolsporin)、亚胺培南(imipenem)、黏菌素(colistin)、甲氧西林(methicillin)、链霉素(streptomycin)、康霉素(kanamycin)、妥布拉霉素(tobramycin)、建它霉素(gentamicin)、四环素、氯四环素(chlortetracycline)、多西环素(doxycycline)、氯霉素、林可霉素、氯林可霉素、红霉素、奥连霉素(oleandomycin)、多黏菌素萘啶酮酸(polymyxinnalidixic acid)、利福霉素(rifamycin)、利福平(rifampicin)、磺胺异
唑(gantrisin)、甲氧苄啶、异烟肼(isoniazid)、对氨基水杨酸及乙胺丁醇。
在一个具体实例中，本发明预期降低微生物对抗微生物剂的抗性，例如通过降低细菌对抗生素的抗性，或杀死微生物或细菌，一般通过使微生物或细菌与有效量的抗生素或抗微生物剂与有效抑制微生物或细菌的附着和/或后续生长的量的对微生物孢子表面肽具有亲和力的组合物的组合接触。为简便起见，使用术语“微生物(microorganism)”及“细菌(bacterium)”，且应了解本发明适于对抗微生物群体使用。
可试管内或活体内接触微生物(例如细菌)或其群体。活体内接触可如下达成：向已受微生物或细菌污染或怀疑已受微生物或细菌污染的动物(包括人类患者)单独给予治疗有效量的包含含有对微生物孢子表面肽具有亲和力的化合物的组合物的药理学上可接受的调配物，或与治疗量的药理学上可接受的抗生素剂调配物组合给予该调配物。因此，本发明可用于通过向大循环中引入药剂的组合或通过将组合例如局部施用于特定部位(诸如创伤或灼伤)或眼、耳或其它感染部位来治疗全身性与局部微生物及细菌感染。
当本发明组合物与其它抗微生物剂或抗生素组合使用时，“抗微生物剂或抗生素的有效量(effective amount of an antimicrobial agent or antibiotic)”意谓在通常指定或规定范围内的量或剂量。常规临床实践中已明确确立所述范围，且因此，应为熟习此项技术者所已知。本文进一步详述适当的剂量及治疗方案。参见表XV。无疑，在证实对微生物孢子表面肽具有亲和力的化合物的最佳治疗剂量时，如此项技术中按常规实践，将首先执行动物研究，并随后执行临床试验。参见实施例II。
表XV：常见抗生素及常用口服抗生素剂量
qid(每日4次)、tid(每日三次)、bid(每日两次)、qd(每日一次)、q4h(每4小时一次，昼夜不停)、q6h(每6小时一次，昼夜不停)及q8h(每8小时一次，昼夜不停)。
通过在实验动物中测定LD50(中值致死毒性剂量)及ED50(中值有效治疗剂量)来评估安全使用所提出的组合物和/或组合物与其它抗微生物剂的组合所需的LD50/ED50比率。随后通过在临床试验中细调范围来界定人类个体的最佳剂量。在LD50的情况下，通常以致死范围内的数个剂量(通常4-5个)向小鼠或大鼠给予(经口或腹膜内)抑制剂。将剂量(mg/kg)相对于死亡率％作图，且50％时的剂量表示LD50。以类似方式测定ED50。
在临床试验中，通过使对患者的益处最大同时使任何副作用或相关毒性最小来确定治疗剂量。在本文所揭示的范围内最佳化治疗剂量时，因患者异质性，在临床试验中不应使用该范围的上限作为起点。以较低或中值剂量起始，且随后增加剂量，将限制在任何指定患者或患者子集中引发毒性或不良反应的可能性。当然，存在一些副作用或某些毒性反应本身不会限制本发明的效用，众所周知大多数有益药物亦在某些患者中产生有限量的不良作用。
在用组合疗法治疗动物或人类患者时，存在各种可使用的适当调配物及治疗方案。举例而言，包含对孢子表面肽具有亲和力的化合物的组合物与至少一种其它抗微生物药物可例如以包括该化合物及其它药物的单一调配物形式或通过使用至少两种不同调配物同时给予动物。对孢子表面肽具有亲和力的化合物亦可在其它药物之前给予动物，或反之亦然。
本发明的其它具体实例包括治疗套组，所述套组在适合容器器具中包含含至少一种对孢子表面肽具有亲和力的化合物的医药组合物及至少一种其它抗微生物药物和/或抗生素。化合物、抗微生物剂和/或抗生素可容纳于单个容器器具中或可使用多个不同容器。
视环境而定，抗微生物剂可用于经口或肠胃外治疗方案中。达到适当剂量的方法描述于各种公开案中。Reese及Betts，感染性疾病的临床思路(APractical Approach to Infectious Diseases)(第3版)，Boston，Little Brown，(1993)。
XII.抗细菌清洁剂组合物
抗细菌清洁组合物典型地用于清洁使用者的臂及手且用于破坏可能存在于使用者臂或手上的细菌及任何其它微生物。所述组合物在卫生保健行业中被医院工作人员及其它卫生保健人员广泛用作手洗清洁剂以预防工作人员之间或工作人员与患者之间的感染。其尤其适合可能会与细菌及其类似物接触的卫生保健工作人员(诸如外科医生、护士及其它卫生保健专业人员)使用。其亦适合食品服务及肉类加工工业人员使用，且公众一般用于抗微生物性清洁手及臂。
当前有数种活性抗微生物剂可用于清洁组合物中。举例而言，许多抗微生物清洁组合物含有双胍(bisbiguanide)细菌物质，诸如二葡萄糖酸氯己定(chlorhexidine digluconate，CHG)。其它清洁组合物使用酚系化合物。然而，所述物质的抗微生物活性通常视界面活性剂或与其一同使用的其它成分的类型而定，且因此使用含所述抗微生物物质的相同成分不一定会产生相同结果。举例而言，当使用CHG作为活性抗微生物剂时，清洁组合物可包括(但不限于)烷基多糖苷(alkyl polyglucoside)及非离子性醇乙氧基化物(alcoholethoxylate)作为主要界面活性剂。然而，在含有经取代酚(诸如对氯-间二甲苯酚(PCMX；4-氯-3，5-二甲酚))作为活性抗微生物剂的组合物中，大多数非离子性醇乙氧基化物抑制而非增强PCMX抗细菌活性。PCMX最初可使革兰氏阳性及革兰氏阴性细菌以及真菌大大减少，且在洗手之间，提供持续数小时的良好残余活性。典型地，当清洁组合物中使用PCMX时，PCMX的使用浓度为约0.1重量％至4重量％。然而，大多数配方含有1重量％或更少。
含有经取代酚作为活性抗微生物剂的抗微生物清洁组合物亦包括阴离子清洁剂、肥皂、界面活性剂及其类似物以及可降低酚系化合物抗细菌活性的其它化合物(非离子性乙氧基化界面活性剂、聚乙二醇等)。于醇基及水基载剂中的经取代酚系化合物及阴离子表面活性清洁剂或肥皂亦适用。另外，可添加诸如乙二胺四乙酸(下文称为EDTA)的螯合剂。Winicov等人，美国专利第3,824,190号及RE 28,778(以引用的方式并入本文中)。
展现温和特征的抗微生物组合物可包括(但不限于)经取代的酚(即PCMX)、阴离子清洁剂、增稠剂(诸如乙二醇单硬脂酸酯)及发泡剂(foambuilder)(诸如脂肪酸烷醇酰胺)。怀疑增稠剂及脂肪酸烷醇酰胺以及阴离子界面活性剂阻碍酚系化合物的抗细菌活性。Garabedian等人美国专利第4,632,772号(以引用的方式并入本文中)。其它PCMX组合物包含于界面活性剂混合物中的无水掺合物。Corti等人，美国专利第5,114,978号(以引用的方式并入本文中)。
PCMX可溶解于高浓度含水或水性组合物中。PCMX组合物包括(但不限于)脂肪酸的二乙醇酰胺及烷基聚氧乙基硫酸的二乙醇铵盐类阴离子界面活性剂。
醇基抗微生物组合物可包括(但不限于)PCMX或CHG、羟丙基纤维素、醇、润肤剂及水。虽然不必了解发明机制，但咸信已知使用醇作为组合物中的溶剂或载剂以脱除皮肤油脂，其可能导致皮肤干燥及刺激。White等人，美国专利第5,288,486号(以引用的方式并入本文中)。
因此，PCMX与CHG及对抗微生物的其它经取代的酚的类似之处在于其功效高度依赖于抗微生物清洁剂组合物中的载剂与其它化学组分。虽然可通过添加螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)和/或钳合剂(sequestering agent)六偏磷酸钠增强PCMX对抗绿脓杆菌的抗微生物活性，但在一些有机物质和/或适当浓度的阴离子界面活性剂存在下，PCMX可能被还原。抗微生物活性亦可能因PCMX与非离子界面活性剂、聚乙二醇及聚乙二醇硬脂酸酯之间的可逆交互作用而损失。同样地，亦发现PCMX抗细菌功效的降低为其与多种大分子(亦即甲基纤维素、聚乙二醇6000及聚山梨醇酯80)交互作用的直接结果。
本发明不限于标准抗生素清洁剂组合物，诸如PCMX及CGH。在一个具体实例中，本发明预期一种含有经取代的酚的抗细菌组合物，其不包括习用阴离子界面活性剂或对经取代的酚抗微生物活性有害的其它化学成分。在一个具体实例中，抗微生物清洁组合物包含经取代的酚及至少一种主要界面活性剂。在一个具体实例中，组合物所包含经取代的酚的量在总组合物的约0.1重量％至约4重量％范围内，且较佳该量在总组合物的约0.3重量％至1重量％范围内。在一个具体实例中，组合物包含经取代的酚的量超过抗微生物剂的4重量％。虽然不必了解发明机制，但咸信抗微生物剂的量的上限与经取代的酚的量(认为对皮肤无毒及无刺激性)有关。
本发明组合物中可使用可溶于水或其它非烷醇溶剂(亦即例如三乙二醇、丙二醇、己二醇等)的任何经取代的酚。在一个具体实例中，经取代的酚可包括(但不限于)经烷基取代的酚、经卤素取代的酚、经酚取代的酚、经烷基卤基取代的酚、经苯甲基烷基取代的酚、经苯基乙基烷基取代的酚及经苯甲基卤基取代的酚、及经烷基取代的双酚、经卤素取代的双酚及经烷基卤基取代的双酚、双(羟基苯基)烷、经氨基取代的酚、间苯二酚衍生物、三元酚衍生物、萘酚衍生物及经羧酸取代的酚(例如水杨酸及酯)。在一个具体实例中，经取代的酚包含经氯取代的酚，亦即对氯-间二甲苯酚(PCMX)。虽然不必了解发明机制，但咸信PCMX的对抗广范围细菌可具有未经取代的酚的60倍的抗微生物活性且含量低于约3重量％时，亦认为对人类皮肤无毒且无刺激。Fendler，等人，“抗微生物的清洁组合物(Antimicrobial cleansing compositions)”美国专利第5,635,462号(以引用的方式并入本文中)。
在一个具体实例中，本发明的感染控制清洁剂组合物包含至少一种选自包括(但不限于)氧化胺、磷脂、部分中和羧酸及二酸、甜菜碱或乙氧基化甲基葡糖苷和/或其混合物的群组的主要界面活性剂。虽然不必了解发明机制，但咸信欲添加至本发明组合物中的主要界面活性剂的量在一定程度上取决于所添加主要界面活性剂的数目。在一个具体实例中，组合物包含多种主要界面活性剂，其中主要界面活性剂的组合量低于组合物的约20重量％。
在一个具体实例中，组合物包含主要界面活性剂，包括(但不限于)氧化胺或烷基胺氧化物。在一个具体实例中，添加至组合物中的氧化胺的量在约0(不存在)至约10重量％范围内，且更佳该量在约5重量％至7重量％范围内。在一个具体实例中，组合物包含氧化胺作为唯一的主要界面活性剂，其中氧化胺的添加量在约1重量％至约10重量％范围内。在一个具体实例中，氧化胺的烷基链长度为约C8至约C16，且链长度为C12至C14。
虽然不必了解发明机制，但咸信本发明所预期的氧化胺被视为两性界面活性剂。发现适于本发明的氧化胺的实例包括(但不限于)氧化月桂胺(lauramineoxide)(一种C12烷基胺氧化物)(Mackamine LO
)、及氧化椰油胺(cocamineoxide)(一种C12-C14烷基胺氧化物)(Mackamine CO
)(McIntyre Chemical Co.，Ltd.，Chicago，Ill.)、以及C14烷基胺氧化物(Barlox 14
)、及C12烷基胺氧化物(Barlox 12)(Lonza，Inc.，Fair Lawn，N.J)。或者，本文中所预期的组合物适于酰胺基丙基胺氧化物，包括(但不限于)Standamox LAO或Mackamine CAO
(Henkel Corp.，Hoboken，N.J.)。
另外，烷基酰胺(诸如椰油酰胺)可与氧化胺或其它主要界面活性剂联合使用以促进发泡及增加组合物粘度。粘度调节剂和/或泡沫稳定剂可包括(但不限于)Standamide CD
、Standamide SD
及Cocamide DEA
(Henkel Corp.，Hoboken，N.J.)。
虽然不必了解发明机制，但咸信氧化胺不显著降低经取代的酚的抗细菌活性且已发现与PCMX组合可有效杀死微生物。
在一个具体实例中，本发明预期感染控制组合物，其包含两性离子/两性界面活性剂(诸如磷脂及甜菜碱)作为主要界面活性剂。在一个具体实例中，磷脂和/或甜菜碱可替代氧化胺使用或与氧化胺联合使用。在一个具体实例中，组合物可包含至多约10重量％的量的磷脂及甜菜碱。
在一个具体实例中，感染控制清洁剂组合物包含磷脂，包括(但不限于)烷基磷脂酰基PG-二甲基氯化铵。在一个具体实例中，烷基磷脂酰基PG-二甲基氯化铵可选自包含以下的群组：椰油酰氨基丙基磷脂酰基PG-二甲基氯化铵(Phospholipid PTC
，MONA Industries，Inc.，Paterson，N.J.)、硬脂酰氨基丙基磷脂酰基PG-二甲基氯化铵(Phospholipid PTS
，MONA Industries，Inc.，Paterson，N.J.)、亚油酰氨基丙基磷脂酰基PG-二甲基氯化铵(PhospholipidEFA
，MONA Industries，Inc.，Paterson，N.J.)及硬脂酰氨基丙基磷脂酰基PG-二甲基氯化铵/鲸蜡醇(Phospholipid SV
，MONA Industries，Inc.，Paterson，N.J.)。在一个具体实例中，并入组合物中的烷基磷脂酰基PG-二甲基氯化铵的量在总组合物的0(不存在)至约10重量％范围内。
在一个具体实例中，本发明预期感染控制清洁剂组合物，其包含单独的甜菜碱脂质或包含甜菜碱脂质联合其它主要界面活性剂一起作为主要界面活性剂。在一个具体实例中，甜菜碱脂质包含8至18个碳原子范围内的烷基铵基羧酸酯(alkylammonio carboxylate)。在一个具体实例中，包含烷基铵基羧酸酯的组合物占总组合物的至多10重量％。在一个具体实例中，烷基铵基羧酸酯包含烷基酰胺甜菜碱(cocobetaine)(Mackam CB-35
，Mcintyre Chemical Co.，Chicago，Ill.)。
在一个具体实例中，本发明预期感染控制清洁剂组合物，其包含至少一种可用作主要界面活性剂的部分中和羧酸和/或二酸(亦即例如乳酸己酰酯钠)的混合物。在一个具体实例中，向清洁组合物中添加0(不存在)至约5重量％范围内的量的羧酸和/或二酸。虽然不必了解发明机制，但咸信虽然部分中和的羧酸及二酸可能含有一些阴离子界面活性剂，但其具有明显的质子化酸特征，且因此所述化合物明确排除在术语“习用阴离子界面活性剂”之外。
在一个具体实例中，本发明预期包含非离子性主要界面活性剂的感染控制清洁剂组合物。在一个具体实例中，非离子性主要界面活性剂包含乙氧基化非离子性甲基葡糖苷。在一个具体实例中，亦可向组合物中添加0(不存在)至约10重量％的量的乙氧基化非离子性甲基糖苷。
组合物亦可包括其它添加剂，诸如增稠剂、润肤剂、螯合剂及钳合剂、芳香剂、着色剂、乳浊剂、珠光剂、维生素及其类似物。举例而言，组合物可包括聚合物增黏剂或增稠剂(诸如羟基乙基纤维素)以使组合物更美观。其它适合聚合物增黏剂的实例包括(但不必限于)羟丙基纤维素、甲基纤维素及羧甲基纤维素。
可添加二醇以加快经取代的酚的溶解速率且作为润肤剂和/或保湿剂。二醇可包括(但不限于)丙二醇、三乙二醇及己二醇。添加至组合物中的二醇的量可在总组合物的0(不存在)至约10重量％范围内，但更佳该量为约3％。在一个具体实例中，可在溶液中添加其它成分之前将PCMX和/或第二经取代的酚溶解于至少部分的二醇中。在一个具体实例中，组合物包含的PCMX∶二醇的比率为25％/75％。
在一个具体实例中，本发明预期感染控制清洁剂组合物，其包含至多约1重量％范围内的螯合剂和/或钳合剂。虽然不必了解发明机制，但咸信可添加螯合剂和/或钳合剂来软化水基组合物。在一个具体实例中，适于本发明的螯合剂包含乙二胺四乙酸(EDTA)(亦即例如乙二胺四乙酸二钠)。
本发明组合物可进一步包含较小但有效量的其它习用添加剂，诸如芳香剂、颜色添加剂、乳浊剂、珠光剂、维生素等。特定珠光剂的实例包括(但不必限于)乙二醇二硬脂酸酯。所述添加剂一般以不影响组合物在感染控制性质方面的必需性质的量使用。
为获得最佳抗细菌功效，组合物的pH值应在4与8之间，且较佳在5.5与6.5之间。为调节组合物的pH值，可使用与组合物的组分兼容的任何酸。酸可包括(但不限于)乳酸、柠檬酸、乙酸、乙醇酸或葡萄糖酸。典型地使用少于1重量％的所述酸来达成适当的pH值平衡。
虽然组合物的余量典型地为水以提供100重量％的组合物，但其它水溶性化合物亦适合(亦即例如醇类)。
本文中指示的所有重量％均以活性组合物百分比计。因此，例如当使用5重量％氧化月桂胺且氧化月桂胺系自制造商获得或已稀释成溶液以便构成30％活性溶液时，为获得推荐的5重量％，将必须使用溶液的16.7％。
一般通过将经取代的酚(亦即PCMX)溶解于上文所述的二醇中并将该溶液添加至含上文所述的一种或多种主要界面活性剂的水中来制备本发明的感染控制清洁组合物。更特定言之，在搅拌下向溶液中添加一种或多种主要界面活性剂及其它成分(亦即例如芳香剂、螯合剂、珠光剂等)。用乳酸或类似酸调节组合物的pH值。随后较佳添加增稠剂/增黏剂且混合溶液直至其完全均质。必要时，再次检查及调节pH值。可根据需要在施加或不施加热的情况下使用该制程以增强增黏剂的水合。
XIII.检测包含孢子表面蛋白质核苷酸序列的微生物
本发明提供检测含有孢子表面蛋白质核苷酸序列(亦即例如SEQ ID NO：2)和/或孢子表面蛋白质核苷酸序列(亦即例如SEQ ID NO：4、6或8)的微生物的方法。可利用多种程序来鉴别含有核苷酸序列的微生物。所述程序包括(但不限于)使用DNA探针(例如寡核苷酸或寡聚物探针或扩增引物)、mRNA探针及有兴趣序列的片段的DNA-DNA或DNA-RNA杂交以及扩增(例如PCR)。所述探针及片段可使用多种技术制备，包括(但不限于)化学合成、限制消化及在表达载体中表达核苷酸序列或其任何部分。所合成或所表达的探针及核苷酸序列片段的标记可使用寡核苷酸标记、末端标记或使用经标记核苷酸进行PCR扩增来达成。
具有经产生标记的探针后，可使用经分离的质粒总细胞DNA的DNA或反向RNA分析或使用mRNA的RNA分析来检验生物样品中所存在的微生物中核苷酸序列的存在。可使微生物直接或培养隔夜后在滤纸上生长或点样于滤纸上。Moseley等人，J.Infect.Dis.142：892-898(1980)；Perine等人，J.Infect.Diseases 152(1)：59-63(1985)；及Gootz等人，Antimicrob.Agents and Chemother.28(1)：69-73(1985)。简言之，对诸如硝化纤维素纸或尼龙膜的固体支撑物接种怀疑含有细菌的临床试样或临床试样肉汁培养物。例如通过用NaOH处理使细胞溶解于硝化纤维素纸上并使DNA变性。用链蛋白酶及氯仿处理支撑物以降低DNA探针与菌落物质的背景非特异性结合。随后使用标准技术进行滤纸(亦即支撑物)与寡核苷酸、寡聚物或核苷酸序列的部分的预杂交及杂交。使用许多可利用方法中的任一种、诸如通过使用X光胶片使放射性探针成像(亦即自动放射摄影术)来检测杂交。
检测获自表面的样品中含有微生物孢子表面蛋白质核苷酸序列的细菌证实给予改变微生物孢子表面蛋白质与表面的结合的感染控制组合物为有益的。另外，该检测亦允许在给予感染控制组合物期间及之后监测表面上细菌的存在。
在一个具体实例中，可在固相中进行本发明所预期的筛选方法(亦即例如检定)，其中检定的一种或多种组分附着于固体表面。在固相检定中，检定的一种或多种组分附着于固体表面。几乎任何固体表面均适合，只要表面材料与检定试剂兼容且可使组分附着于表面而不会不当改变检定组分的反应性。虽然一些组分在固相中可能显示降低的活性，但此一般可接受，只要活性足以与感染控制测试化合物交互作用。
固体支撑物基本上包括分子可粘附的任何固体表面，包括(但不限于)玻璃珠粒、平坦玻璃、受控微孔玻璃、塑料、多孔塑料金属或树脂。固体支撑物可经官能基(例如羟基、胺、羧基、酯及硫氢基)衍生化以提供附着连接子或直接附着组分的反应位点。
检定组分(例如孢子表面蛋白质)粘附于固体支撑物可为直接的或间接的(亦即一种或多种特定化合物结合于支撑物且检定组分结合该或所述化合物而非固体支撑物)。组分可利用如下任一方法固定：i)共价(亦即例如通过利用半胱氨酸的单活性硫醇基来锚定蛋白质组分；Colliuod等人，BioconjugateChem.4：528-536(1993))；ii)非共价但特异性(亦即例如经由经固定的抗体或其它特异性结合蛋白质；Schuhmann等人，Adv.Mater.3：388-391(1991)；及Lu等人，Anal.Chem.67：83-87(1995))；iii)经由生物素/抗生蛋白链菌素系统；Iwane等人，Biophys.Biochem.Res.Comm.230：76-80(1997)；iv)通过使用金属螯合朗缪尔-布罗杰特膜(Langmuir-Blodgett film)；Ng等人，Langmuir11：4048-4055(1995)及Schmitt等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35：317-320(1996)；及v)用于多组氨酸融合蛋白质的结合的金属螯合自组装单层；Sigal等人，Analytical Chem.68：490-497(1996)。
XVI.检测包含孢子表面蛋白质的微生物
在一个具体实例中，本发明预期包含检测微生物孢子蛋白质和/或肽片段的方法。在一个具体实例中，微生物孢子蛋白质和/或肽片段包含微生物孢子表面蛋白质和/或肽片段。在一个具体实例中，微生物孢子表面蛋白质和/或肽片段包含梭菌属孢子表面蛋白质和/或肽片段。在一个具体实例中，梭菌属孢子表面蛋白质和/或肽片段包含艰难梭菌孢子表面蛋白质和/或肽片段。
可利用多种适合方法检测来自任何来源的蛋白质和/或肽片段。在一些具体实例中，利用免疫组织化学来检测蛋白质和/或肽片段。在其它具体实例中，利用蛋白质和/或肽片段与针对蛋白质产生的抗体的结合来检测所述蛋白质和/或肽片段。
可利用许多不同技术来检测抗体结合，包括(但不限于)例如放射免疫检定、ELISA(酶联免疫吸附检定)、“夹心”免疫检定、免疫放射测定检定、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散检定、原位免疫检定(例如使用例如胶体金、酶或放射性同位素标记)、蛋白质印迹、沉淀反应、凝集检定(例如凝胶凝集检定、血凝集检定等)、补体固定检定、免疫荧光检定、蛋白质A检定及免疫电泳检定等。
在一个具体实例中，通过检测一次抗体上的标记来检测抗体结合。在另一具体实例中，通过检测二次抗体或试剂与一次抗体的结合来检测一次抗体。在另一具体实例中，二次抗体经标记。
在一些具体实例中，利用自动检测检定。免疫检定自动操作的方法包括美国专利第5,885,530号、第4,981,785号、第6,159,750号及第5,358,691号中所述的方法，各专利以引用的方式并入本文中。在一些具体实例中，结果的分析及呈现亦为自动的。举例而言，在一些具体实例中，利用基于一系列对应于癌症标记的蛋白质的存在与否产生预后的软件。
在其它具体实例中，免疫检定描述于美国专利第5,599,677号及第5,672,480号中；各专利以引用的方式并入本文中。
在其它具体实例中，本发明提供检测及特性化蛋白质和/或核酸的套组。在一些具体实例中，除检测试剂及缓冲液外，套组亦含有对自有兴趣基因表达的蛋白质具有特异性的抗体。在其它具体实例中，套组含有对mRNA或cDNA检测具有特异性的试剂(例如寡核苷酸探针或引物)。在较佳具体实例中，套组合有执行检测检定所必需的所有组分，包括所有对照组、执行检定的说明书、及分析及呈现结果所必需的任何软件。
XV.医药调配物
本发明的活性组合物可包括传统医药调配物。本发明的所述调配物的给药将经由任何常见途径进行，只要经由该途径可到达目标组织。其包括局部、经口、经鼻、经颊、经直肠、经阴道或局部。或者，可经由正位、皮内、皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射给药。所述调配物通常将以医药学上可接受的组合物给予。
A.用于经口或肠胃外给药的溶液
本发明预期的调配物、组合物及其它药剂及药物可为亦可肠胃外或经口给予的活性化合物。可在适度混有诸如羟丙基纤维素的界面活性剂的水中制备呈游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液。亦可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物及油中制备分散液。在普通储存及使用下，所述制剂可含有防腐剂。
适于可注射使用的医药调配物包括(但不限于)无菌水溶液或分散液及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉剂。在一个具体实例中，调配物无菌。在一个具体实例中，调配物包含流体特征，使得调配物易于使用注射器操作。在一个具体实例中，调配物在制造和/或储存条件下稳定。在一个具体实例中，调配物可进一步包含载剂，诸如溶剂或分散介质，包括(但不限于)水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液体聚乙二醇及其类似物)、其适合混合物、及植物油。适当流动性可例如通过使用诸如卵磷脂的包衣，在分散液的情况下通过维持所需粒度、及通过使用界面活性剂来维持。微生物作用的阻止可利用各种抗细菌及抗真菌剂来达成，所述抗细菌及抗真菌剂为例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞及其类似物。在许多情况下，较佳包括等张剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用例如单硬脂酸铝及明胶的延迟吸收的试剂来达成。
可通过将于适当溶剂中的所需量的活性化合物根据需要与各种其它上述成分合并，接着灭菌(亦即例如通过过滤、辐射和/或环氧乙烷暴露)来制备无菌可注射溶液。通常可通过将各种经灭菌活性成分并入含有碱性分散介质及所需其它上述成分的无菌媒剂中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，较佳制备方法为真空干燥及冷冻干燥技术，其产生活性成分加任何来自其先前无菌过滤溶液的其它所要成分的粉剂。
对于经口给药，对本发明微生物孢子表面蛋白质具有亲和力的组合物可合并有赋形剂且以不可摄取型嗽口水及牙膏形式使用。可通过将所需量的活性成分并入适当溶剂(诸如硼酸钠溶液，亦即例如多贝尔氏溶液(Dobell′s Solution))中来制备嗽口水。或者，可将活性成分并入含硼酸钠、甘油及碳酸氢钾的无菌洗涤液中。亦可将活性成分分散于牙膏(包括：凝胶剂、糊剂、粉剂及浆液)中。可向可包括水、黏合剂、研磨剂、调味剂、发泡剂及保湿剂的糊剂牙膏中添加治疗有效量的活性成分。
本发明组合物可调配成中性或盐形式。医药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)且所述盐系与无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸及其类似物)形成。与游离羧基形成的盐亦可衍生自无机碱(诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)及有机碱(诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因(procaine)及其类似物)。
调配后，将以与剂量调配物兼容的方式及治疗上有效的量给予溶液。调配物可以多种诸如可注射溶液、药物释放胶囊及其类似物的剂型容易地给予。给药途径可选自静脉内、动脉内、颊内、腹膜内、肌肉内、皮下、经口、局部、经直肠、经阴道、经鼻及眼内。
对于以水溶液形式肠胃外给药，例如，必要时应适当缓冲溶液且首先用足够的生理盐水或葡萄糖使液体稀释剂变得等张。所述特定水溶液尤其适于静脉内、肌肉内、皮下及腹膜内给药。就此而论，根据本发明，熟习此项技术者会知道可采用的无菌水性介质。举例而言，可将一个剂量溶解于1ml等张氯化钠溶液中且添加至1000ml皮下灌注流体中或在所提出的输注部位注射。Remington′s Pharmaceutical Sciences第15版，第1035-1038及1570-1580页(以引用的方式并入本文中)。视所治疗个体的病状而定，剂量必然会发生一定的变化。在任何情况下，负责给药的人员将确定用于个别个体的适当剂量。此外，对于人类给药，制剂应符合FDA生物制品标准办公室(FDA Office of Biologicsstandards)规定的无菌性、发热性、一般安全性及纯度标准。
B.用于局部或肠胃外给药的脂质体
在一个具体实例中，本发明预期包含脂质体制剂的调配物，该脂质体制剂包含对微生物孢子表面蛋白质具有亲和力的化合物。在一个具体实例中，化合物系由脂质体囊封，其中当与习用药物传递系统相比时，囊封延长化合物半衰期。
“脂质体”一般用作通称术语，涵盖多种通过产生封闭脂质双层所形成的单一及多层脂质载体。举例而言，可使用磷脂来制备脂质体且磷脂可带净正电荷、净负电荷或为中性。可采用磷酸二鲸蜡醇酯(Dicetyl phosphate)赋予脂质体负电荷，且可使用硬脂胺赋予脂质体正电荷。脂质体的特征可在于磷脂双层膜及内部水性介质。多层脂质体具有多个由水性介质隔开的脂质层。当将磷脂悬浮于过量水溶液中时，脂质体通常自发形成。虽然不必了解发明机制，但咸信脂质组分在形成封闭结构之前进行自重排且截留水并使溶质溶解于脂质双层之间。Ghosh等人，Liver diseases，targeted diagnosis and therapy usingspecific receptors and ligands，Wu G.及C.Wu(编)，New York：Marcel Dekker，第87-104页，(1991)。亦预期阳离子脂质-核酸复合物，诸如脂染胺(lipofectamine)-核酸复合物。在本发明的某些具体实例中，脂质体可与血球凝集病毒(hemagglutinating virus，HVJ)复合。已显示HVJ有利于与细胞膜融合且促进细胞进入。Kaneda等人，J Biol Chem，.264：12126-12129(1989)。
适于制备本发明脂质体的脂质可自商业来源获得。举例而言，可自SigmaChemical Co.获得双十四烷基磷脂酰胆碱(“DMPC”)；自K&K Laboratories(Plainview，N.Y.)获得磷酸二鲸蜡醇酯(“DCP”)；自Calbiochem-Behring获得胆固醇(“Chol”)；可自Avanti Polar Lipids Inc.(Birmingham，Ala.)获得双十四烷基磷脂酰甘油(“DMPG”)及其它脂质。脂质于氯仿、氯仿/甲醇或第三丁醇中的储备溶液可储存在约-20℃下。较佳使用氯仿作为唯一溶剂，因为其比甲醇更容易蒸发。
较佳不使用来自天然来源的磷脂(诸如蛋或大豆磷脂酰胆碱、脑磷脂酸、脑或植物磷脂酰肌醇、心脏心磷脂及植物或细菌磷脂酰乙醇胺)作为主要磷脂，亦即占总磷脂组合物的50％或更多，因为所得脂质体不稳定且可漏泄。
可利用不同方法制备根据本发明使用的脂质体。脂质体的尺寸视合成方法而变化。悬浮于水溶液中的脂质体一般呈球形囊泡形状，具有一或多个脂质双层分子同心层。各层由平行的分子数组组成，该分子由式XY表示，其中X为亲水性部分且Y为疏水性部分。在水性悬浮液中，同心层经排列使得亲水性部分倾向于保持与水相接触，而疏水区倾向于自缔合。举例而言，当水相存在于脂质体内部与外部时，脂质分子将形成呈XY-YX排列的双层，称为片层。
本发明范畴内的脂质体可根据许多实验室技术制备。在一个具体实例中，通过在容器(例如梨形玻璃烧瓶)中混合脂质体脂质于溶剂中来制备脂质体。容器的体积应为脂质体预期悬浮液的体积的10倍。使用旋转蒸发器，在约40℃及负压下移除溶剂。通常视所要脂质体体积而定在约5分钟至2小时内移除溶剂。可在干燥器中在真空下进一步干燥组合物。一般在约1周后舍弃干燥的脂质，因为其随时间易变质。
可通过摇动直至所有脂质膜均再悬浮来使干燥的脂质在无菌无热原质水中水合成约25-50mM磷脂。随后可将水性脂质体分离成等分试样，各置放于小瓶中，冻干且在真空下密封。
在一替代方法中，可根据其它程序制备脂质体。Bangham等人，J.Mol.Biol.，13：238-252，(1965)；Gregoriadis(编)，生物学和药学中的药物载体(DrugCarriers in Biology and Medicine)，第287-341页(1979)；Deamer等人，“脂质体制备：方法和机制(Liposome Preparation：Methods and Mechanisms)”，Liposomes，M.Ostro(编)(1983)；及Szoka等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，75：4194-4198(1978)(所有内容以引用的方式并入本文中)。前述方法的个别截留水性物质的能力及个别水性空间与脂质的比率可能不同。
可将如上所述制备的干燥脂质或冻干脂质体在核酸溶液中复原且用适合溶剂(例如DPBS)稀释至适当浓度。随后在涡旋混合机中剧烈摇动混合物。通过在29,000×g下离心移除未囊封核酸且洗涤脂质体离心块。再悬浮经洗涤的脂质体成适当总磷脂浓度，例如约50-200mM。可根据标准方法测定囊封的核酸的量。测定囊封于脂质体制剂中的核酸的量后，可稀释脂质体至适当浓度且储存于4℃下直至使用。
在一个具体实例中，使用脂质二油酰基磷脂酰胆碱产生脂质体调配物。在一个具体实例中，在过量第三丁醇存在下混合对微生物孢子表面肽具有亲和力的组合物与脂质。在丙酮/干冰浴中冷冻之前涡旋混合物。冻干冷冻的混合物且用经HEPES缓冲的生理盐水(1mM HEPES、10mM NaCl，pH 7.5)水合隔夜，且随后在浴型音波处理器中音波处理脂质体10至15分钟。如次微米粒径分析仪autodilute 370型(Nicomp，Santa Barbara，Calif.)所测定，肽-脂质体的直径的尺寸典型地在200-300nm范围内。
包含对孢子表面肽具有亲和力的感染控制组合物的经纯化组合物可不经进一步改质即使用，或其可稀释于医药学上可接受的载剂中。感染控制组合物可独立地使用或与其它抗微生物药物组合使用。由于组合物的稳定性，因此预期本发明可给予至人类或动物，包括在食品制剂、医药制剂、医学及医药产品、化妆产品、卫生产品、清洁产品及清洁剂以及肽可喷涂或粘附的任何物质中，其中希望抑制微生物生长。
实验
包括以下实施例以示范本发明的较佳具体实例。所述实施例意欲说明能够实施本发明的特定具体实例的技术。然而，在不脱离本发明的精神及范畴的情况下，可对所揭示的特定具体实例进行许多改变且仍获得同样或类似的结果。
实施例I
孢子表面肽合成
可利用采用Applied Biosystems 433A型肽合成仪及Fastmoc策略的固相方法以0.1mM规模合成本发明所预期的孢子表面肽。可采用Vydac 218TP1022(22×250mm)柱通过在Waters Delta Prep上的逆相HPLC进行肽纯化。用0.1％三氟乙酸水溶液(溶剂A)及含0.085％三氟乙酸的100％乙腈(溶剂B)的梯度系统进行分离。经70分钟施用0至100％B的线性梯度，且每0.2分钟收集馏分。接着使用Vydac 218TP54(4.6×250mm)柱在Beckman Gold System上在等度洗脱条件下以0.5mL/min的流速通过分析级逆相HPLC监测馏分。汇集选择的馏分且冻干；利用质谱分析及毛细管电泳提供肽的进一步特征。用配备有电喷雾离子化源的Hewlett-Packard 1100型MSD在含0.05％三氟乙酸的64％乙腈中在0.1mL/min下通过流动注射进行质量量测。
在配备有长光程融熔硅酸盐柱75微米(ID)×80.5公分(总长)的Hewlett-Packard 3D仪器上进行毛细管电泳。在18℃下在100mM磷酸钠缓冲液(pH 2.9)在20,000伏特下执行毛细管电泳实验。通过在Beckman 6300氨基酸分析仪上进行定量氨基酸分析测定肽浓度。
实施例II
细菌菌株及孢子制备
使用以下艰难梭菌菌株：ATCC 700057、ATCC BAA-1382(菌株630)、ATCC 43594及ATCC 9689。通过在35℃下在布氏杆菌(Brucella)血琼脂脱氧酶板(BBAO)上缺氧生长2天产生孢子群，接着在BBAO上再画线。在35℃下生长4天后，将孢子采集于15ml 1×PBS及0.1％Tween-80(PBST)中。在4℃下在3000×g下离心孢子20分钟，用15ml(PBST)洗涤3次，且再悬浮于10ml HistoDenz(Sigma)中。悬浮液为位于15ml 50％HistoDenz溶液上的层，从而形成梯度。在4℃下在5000×g下离心梯度15分钟。以15ml先前描述的PBST洗涤离心块3次，且再悬浮于5ml PBST中。随后在0.5功率位准下音波处理样品两次历时5秒以溶解营养母细胞。随后重复先前描述的HistoDenz程序。将最终孢子悬浮液储存在4℃下。
实施例III
薄切片穿透式电子显微术
使用以下程序进行样品制备及电子显微术：
1.在室温下用2.5％戊二醛、2％三聚甲醛、0.01M磷酸盐缓冲液、2.5％DMSO固定样品2小时。
2.以0.1M磷酸盐缓冲液洗涤(经过15-30分钟的时间更换3次)。
3.在室温下用1％四氧化锇水溶液+1.5％亚铁氰化钾1小时。
4.在室温下以DDW洗涤(经过15-30分钟的时间更换3-4次)。
5.阻断染色：在4℃下用0.5％乙酸双氧铀水溶液隔夜。
6.脱水(亦即例如用乙醇)，每个步骤10-15分钟：a)30％；b)50％；c)70％(可能在4℃下隔夜)；d)80％；e)90％；f)95％；g)99％；及h)100％。
7.环氧丙烷(PO)：每个步骤15-30分钟
a)乙醇∶PO＝50∶50
b)乙醇∶PO＝25∶75
c)PO＝100％
8.Epon：每个步骤2小时
a)Epon∶PO＝30∶70
b)Epon∶PO＝50∶50
c)Epon∶PO＝75∶25
d)Epon＝100％
e)Epon＝100％
9.聚合，亦即例如通过在60℃至70℃下加热48小时。
10.切片
11.乙酸双氧铀及柠檬酸铅染色
12.碳涂布
13.EM观测(JEOL 1200EX或Zeiss 902)
实施例IV
艰难梭菌孢子外膜制备
在20,000lb/in2下一次使约109个孢子穿过冷(4℃)法式压碎机(Frenchpress)。参见图17。穿透式电子显微镜(TEM)检查证实该程序移除大孢子外膜片段且当与未处理的对照孢子外膜片段相比时未对孢子其余部分产生可检测的损害。照片比较剥离前后的孢子以及所附着的经纯化的孢子外膜。参见图18A与图18B。在9,000×g及4℃下离心自法式压碎机挤压的样品5分钟，且保存上清液。将离心块再悬浮于10ml冷TEP缓冲液中，且如上所述离心。将离心块再悬浮于10ml TEP缓冲液中且储存在-20℃下，同时合并上清液与先前离心的上清液且在9.500×g及4℃下离心15分钟。
随后通过在5000×g及4℃下使用Amicon超离心过滤装置(Millipore)离心约60分钟浓缩所得上清液，最终体积为500μl。该孢子外膜样品的电子显微镜检查证实几乎不存在孢子。参见图18C。
实施例V
孢子外膜溶解、蛋白质电泳及免疫斑点印迹法
通过在45μl 2×Novex Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液(Invitrogen)、35μl水及10μl 200mM二硫苏糖醇中煮5分钟溶解10μl孢子外膜样品。用4-12％Tris-甘氨酸凝胶通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离溶解的蛋白质。进行免疫斑点印迹法时，通过电泳将蛋白质自SDS-聚丙烯酰胺凝胶转移至聚偏二氟乙烯膜，且如Invitrogen Western Breeze检定套组的手册中所述处理。简言之，各斑点印迹经阻断，用一次单克隆抗体的1∶1000稀释液探测1小时，且洗涤。随后用碱性磷酸酶接合的山羊抗兔IgG二次抗体探测斑点印迹30分钟，洗涤，且用碱性磷酸酶显色剂溶液显色。
实施例VI
氨基端蛋白质测序及质谱分析
用水洗涤SDS-PAGE碎片且于乙腈中脱水。随后在凝胶内消化之前用碘乙酰胺使所述带烷基化。通过在室温下在胰蛋白酶(5μL 20ng/μl胰蛋白酶的碳酸氢铵(50mM)溶液)中培育隔夜以凝胶内消化所有带。于两个30μL 50％乙腈与5％甲酸的等分试样中自聚丙烯酰胺提取所形成的肽。合并所述提取物且在Speedvac中蒸发至小于10μl，随后再悬浮于1％乙酸中以补足至约30μl的最终体积，进行LC-MS分析。
LC-MS系统(Finnigan LTQ)含有自填充式9cm×75μm id PhenomenexJupiter C18逆相毛细管HPLC柱。注射10μl体积的提取物，且将洗脱的肽引入在线质谱仪的分析源中。使用仪器的数据相关多任务能力分析消化物，获得全扫描质谱从而确定在连续仪器扫描下肽分子量及产物离子光谱，以确定氨基酸序列。该分析模式产生数个数量级丰度范围内的离子的约2500个碰撞诱发解离(CID)光谱。
通过使用实验中所收集的所有CID光谱来分析数据以用使用哺乳动物分类学过滤器的搜寻程序Mascot搜寻NCBI非冗余数据库。通过人工解释验证所有匹配光谱。需要时，利用使用程序Sequest及Blast的其它搜寻辅助解释过程(克利夫兰诊所质谱和蛋白质测序(Cleveland Clinic for Mass Spectrometryand Protein Sequencing))。
实施例VII
CD光谱
可在25℃下在配备有热电温度控制器的AVIV 62 DS光谱仪(AVIVAssociates，Lakewood，N.J.)上进行圆偏光二色性(CD)光谱。样品含有0.11-0.24mg/mL肽的磷酸钠(50mM，pH 7.0)；一些样品亦含有40％三氟乙醇或0.1％(0.22mM)脂多糖(LPS)。使用0.1cm的路径长度以0.5nm为间隔收集光谱，每个数据点的平均时间为2秒。以每个光谱代表两次扫描的平均值绘图之前，以5个数据点为间隔对光谱进行一次平滑处理。在数据平滑处理之前，减去两次缓冲液扫描的平均值。由所观察的平均残基椭圆率(mean residueellipticity)与25℃下相同长度的100％螺旋肽的平均残基椭圆率的比率计算螺旋含量分数(Luo及Baldwin(1997))。
实施例VIII
计算肽疏水力矩及疏水性
使用正规化一致疏水性量表计算肽疏水性及疏水力矩。Eisenberg等人，JCell Biochem 31：11-7(1986)。
实施例XI
移除产芽孢梭菌孢子外膜
利用在布老恩(Braun)均质机中均质化自产芽孢梭菌孢子移除孢子外膜，以30秒为间隔，总计长达150秒，其中如由结晶紫染色及光学显微术所确定，孢子外膜的最佳移除需要120至150秒。Du等人，“苏云金杆菌HD-73孢子具有表面定位Cry 1Ac毒素：生理学和治病后果(Bacillus thuringiensis HD-73spores have surfaced localized Cry 1Ac toxin：physiological and pathogenicconsequences)”Appl.Environ.Microbiol.62：3722-3726(1996)。
提取孢子以移除孢子表面及孢子外膜组分。Aronson等人，“孢子表面的比较结果和功能方面(Comparative structural and functional aspects of sporesurfaces)”Spores VII.American Society for Microbiology，第54-61页。G.Chambliss及J.C.Vary(编)，Washington，D.C.(1978)。在378℃下将产芽孢梭菌孢子(1.1×109个)于5mM环己基氨基乙烷磺酸-8M脲-50mMβ-巯基乙醇-0.8％十二烷基硫酸钠(SDS)(pH 9.8)中提取。在12,000×g下离心孢子10分钟，且将上清液提取物煮沸5分钟。直接将提取物施加于含6M脲的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。测定分子量时，将凝胶转移至孔径为0.2mm的硝化纤维素上。用含3％牛血清白蛋白的TBS(pH 7.4)阻断斑点印迹。随后将斑点印迹与于含0.05％Tween 20的TBS中以1∶1,000稀释的适当经生物素标记的抗体(亦即例如对产芽孢梭菌而言，为C33和/或C225或D89)一起培育。使用于TBS-0.05％Tween 20中以1∶1,000稀释的经抗生物素标记的过氧化酶(Sigma A7419)以检测具不可溶基质4-萘酚(Bio-Rad)的抗原。
使用过碘酸希夫染色(periodic acid-Schiff staining)进行糖蛋白测定。固定凝胶隔夜，且用0.7％过碘酸处理2小时，并随后用0.2％偏亚硫酸氢盐处理2小时。随后将凝胶暴露于包含碱性品红、偏亚硫酸氢钠及盐酸的希夫试剂(Schiff reagent)(Fisher Scientific，Pittsburgh，Pa)。测定如同糖蛋白染色呈阳性的蛋白质自孢子提取物的迁移率且与蛋白质印迹测定的抗原迁移率作比较。
制备孢子的超薄(约100mm)冷冻切片以用胶体金免疫标记。Chang等人，“仙人掌杆菌T孢子中抗原的免疫细胞化学定位(Immunocytochemicallocalization of antigens in B.cereus T spores)”J.Rapid Methods Automat.Microbiol.2：229-233(1993)。使用来自与用于抗原的储备溶液相同的储备溶液的产芽孢梭菌PA3679孢子进行所述实验。将冷冻切片漂浮在含5％胎牛血清的PBS上，之后依次漂浮在PBS、含0.1M氯化铵的PBS及PBS上，各在室温下持续5至10分钟。将切片漂浮在数滴一次试剂(primary reagent)(1∶100稀释的适当单克隆抗体)上1至2小时，接着以PBS洗涤6次，每次5分钟。随后将切片漂浮在数滴二次试剂(secondary reagent)上20至30分钟。二次试剂为山羊抗小鼠IgG加与直径为10nm的胶体金接合的山羊抗小鼠IgM，以1∶10稀释后使用。再以PBS洗涤切片6次，接着用蒸馏水洗涤3次。通过将其漂浮在数滴2.3M含约20％(vol/vol)饱和乙酸双氧铀水溶液的甲基纤维素上对其进行染色且包埋于甲基纤维素中。将栅格卡在环中，排干且风干。在Philips EM 300电子显微镜中对其进行观察。阴性对照组为经不与细菌孢子反应的IgG1及IgM同型单克隆抗体处理的孢子。
实施例X
结合于表面的艰难梭菌孢子的杯洗检定(Cup-Scrub Assay)
该实施例描述可检定结合于表面的孢子的方法的一个具体实例。在该实施例中，艰难梭菌孢子结合于表面且由杯洗法检定。ATSM国际(International)，“使用杯洗技术从皮肤回收微生物的标准测试方法(Standard Test Method forRecovery of Microorganisms From Skin using the Cup Scrub Technique)”E1874-09(2009)。
材料
灭菌器—任何能够产生灭菌条件的适合蒸汽灭菌器。
洗杯—具适合组成的无菌圆筒，较佳具有棒状把手以有利于使之稳定，高度为约2.5公分，内径为适当尺寸。适用尺寸在约1.5至4.0cm范围内。
磨光玻璃棒或橡胶淀帚—可在实验室中制作或购买。
移液器—具有传递适当体积的抛弃式吸头(tip)。
容纳杯洗流体的无菌烧杯、试管或其它容器。
微生物培养物—该测试方法可用于以任何微生物培养物(亦即例如艰难梭菌微生物培养物)为目标的方案。
采样及稀释流体—无菌巴特菲尔德(Butterfield′s)磷酸盐缓冲的水或具适合组成的其它回收流体；其应含有对可能位于测试部位的任何抗微生物剂具有特异性的抗微生物失活剂；失活剂功效应由测试方法测定。
测试对照及基线皮肤部位
选择适于艰难梭菌生长的皮肤部位，从而提供对侧样品部位用作对照组。多个选用于检定的个体(人类或动物)视预期测试结果所需的统计置信度、研究中遇到的变化、及可评估的任何抗细菌剂的相对功效而定。个体上可能有多处部位可利用；需要随机化以降低样品偏差。区别作用所需的复本数目将部分视方案中对照组的适用性及设计而定。对经分离的皮肤或等效物使用该技术依赖于固定测试部位以有效进行该程序。
活体内样品收集
采样区域由无菌采样圆筒划定。采样期间，将圆筒紧紧压在皮肤表面上以确保采样流体不自采样部位泄漏。最少将1.5mL有或无产物中和剂的无菌采样流体等分试样移至圆筒中。随后在适当压力下使用无菌磨光玻璃棒或淀帚擦洗整个区域60±6秒。擦洗后，由移液管将采样流体转移至无菌样品管中。用新鲜采样流体等分试样再次重复该程序。汇集采样流体。在各采样部位重复该程序。虽然两次部位洗涤使用相同移液管、圆筒、玻璃棒及淀帚，但各部位使用新无菌设备。收集样品后，使用纸巾吸干该部位。该过程期间，必须小心以防采样流体溢至尚未采样的相邻部位。采样全部完成后，当使用标记生物体时，应依次使用70至90％异丙醇或等效物及4％氯己定(chlorhexidine)擦洗剂对采样部位去污。
经分离的皮肤或皮肤等效物样品收集
利用杯洗技术获得定量微生物计数。对测试样品及对照样品使用该程序。根据需要定位并固定样品以能够置放及有效使用采样圆筒。欲采样的区域由无菌采样圆筒划定。采样期间，将圆筒紧紧压在样品表面上以确保采样流体不自采样部位泄漏。最少将1.5mL有或无产物中和剂的无菌采样流体等分试样移至圆筒中。随后在适当压力下使用无菌磨光玻璃棒或淀帚擦洗整个区域60±6秒。擦洗后，由移液管将采样流体转移至无菌样品管中。用新鲜采样流体等分试样再次重复该程序。汇集采样流体。在各采样部位重复该程序。虽然两次部位洗涤使用相同移液管、圆筒、玻璃棒及淀帚，但各部位使用新无菌设备。若在同一片经分离组织上存在多个采样部位，则该过程期间，必须小心以防采样流体溢至尚未采样的相邻部位。
微生物计数
充分混合各样品。以稀释流体制备各样品的10倍连续稀释液。使用大豆-酪蛋白消化琼脂及适合中和剂制备一式双份定量浇注板或展布板。在适合生长温度62℃下培育涂铺样品24至72小时或直至板上可见菌落。
实施例XI
孢子粘附检定-皮肤蛋白质
该实施例提供检定孢子对皮肤蛋白质的粘附的一个具体实例。出于说明的目的，该实施例描述产生包被素皮肤蛋白质以研究艰难梭菌的粘附。
质粒
用于该检定的相容质粒可包括(但不限于)pIsdA IsdA过度表达载体、pMK4大肠杆菌-金黄色葡萄球菌穿梭载体、pSRC001 rIsdA互补载体、pNZ8148乳酸球菌(L.lactis)表达质粒、pLIsdA IsdA表达载体、pL_NEAT_IsdA_NEAT表达载体、pL_C IsdA_C表达载体、pQE30过度表达质粒(Qiagen)、pHumanK、pQE30人类细胞角蛋白10(cytokeratin 10)表达、pCMC-SPORT6-INV包被素cDNA纯系4749952(IMAGE consortium，MRC Geneservice)、pQE30-INV6 His标记的包被素或pET11a-LOR兜甲蛋白cDNA纯系。Clarke等人，“金黄色葡萄球菌的IsdA是一种广谱铁调节外源凝集素(IsdA of Staphylococcusaureus is a broad spectrum，iron-regulated adhesin)”Mol.Microbiol.51：1509-1519(2004)；Clarke等人，“金黄色葡萄球菌表面蛋白IsdA调节人皮肤的固有防御抗性(The Staphylococcus aureus surface protein IsdA mediates resistance to innatedefenses of human skin)”Cell Host Microbe 1：199-212(2007)；Sullivan等人，“新的枯草杆菌和大肠杆菌的穿梭载体其允许插入片段的快速检测(New shuttlevectors for Bacillus subtilis and Escherichia coli which allow rapid detection ofinserted fragments)”Gene 29：21-26(1984)；Kuipers，O.P.，P.G.G.A.de Ruyter，M.Kleerebezem及W.M.de Vos.1998.通过乳酸菌控制蛋白质的超量生产(Controlled overproduction of proteins by lactic acid bacteria).J.Biotechnol.64：15-21；Sullivan等人，“New shuttle vectors for Bacillus subtilis and Escherichiacoli which allow rapid detection of inserted fragments”Gene 29：21-26(1984)；及Walsh等人，“金黄色葡萄球菌的聚集因子B，纤维蛋白素原结合MSCRAMM(微生物表面组分识别粘附基质分子)外源凝集素还结合I型细胞角蛋白10的尾区域(Clumping factor B，a fibrinogen binding MSCRAMM(microbial surfacecomponent recognizing adhesive matrix molecules)adhesin of Staphylococcusaureus also binds the tail region of type I cytokeratin 10)”J.Biol.Chem.279：50691-50699(2004)。
艰难梭菌在卢里亚-伯坦尼培养基(Luria-Bertani medium)中生长，适当时用康霉素(kanamycin，50μg/ml)进行选择。艰难梭菌菌株在脑心浸液培养基(Oxoid)或化学成分明确的CL培养基中生长。Horsburgh等人，“在金黄色葡萄球菌中，Fur是与PerR相互作用的调节剂，对毒力有贡献，其对于通过过氧化物酶正调控对氧化压力的抗性和铁体内稳态是必需的(InStaphylococcus aureus，Fur is an interactive regulator with PerR，contributes tovirulence，and is necessary for oxidative stress resistance through positiveregulation of catalase and iron homeostasis)”J.Bacteriol.183：468-475(2001)。若包括抗生素，则其按以下浓度添加：红霉素，5μg/ml；林可霉素，25μg/ml；及四环素，2.5μg/ml。艰难梭菌培养物可在37℃下生长。
克隆化包被素基因
利用PCR使用Pfu聚合酶及合并有BamHI位点(加下划线)的顺向引物CGCGGATCCATGTCCCAGCAA CACACAC(SEQ ID NO：446)及合并有HindIII位点(加下划线)的反向引物CCCAAGCTTTATTTATGTTTGGGTGGCCAC(SEQ ID NO：447)自pCMV-SPORT6-INV扩增包被素的编码序列。将片段克隆化于用BamHI及HindIII切开的pQE30中，形成pQE30-INV。
表达及纯化重组蛋白质
通过添加100μM异丙基-β-D-硫代半乳糖哌喃糖苷(IPTG)至生长的细胞中诱导经六组氨酸标记的重组IsdA(rIsdA)、细胞角蛋白10及包被素表达。通过使用镍螯合层析使用Hi-Trap系统(Amersham Biosciences)达成纯化。可自溶解的大肠杆菌T4037亲和标记或纯化重组兜甲蛋白。
ELISA分析配位体结合
使用酶联免疫吸附检定(ELISA)分析rIsdA结合配位体的能力。Clarke等人，“Ebh，1.1兆道耳顿金黄色葡萄球菌细胞壁相关纤维结合蛋白结合的蛋白质的分析(Analysis of Ebh，a 1.1-megadalton cell wall-associatedfibronectin-binding protein of Staphylococcus aureus)”Infect.Immun70：6680-6687(2002)。简言之，在4℃下向96孔微量滴定板(Nunc)的孔中添加100μl含适当配位体或牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)(5μg/ml)隔夜。用PBST(含0.05％[vol/vol]Tween 20的PBS)洗涤板三次，且在室温下用含5％(wt/vol)BSA的PBS阻断剩余蛋白质结合位点2小时。再以PBST洗涤板三次，且添加不同浓度的于PBS-0.1％(wt/vol)BSA中稀释的经纯化rIsdA(亦即例如0至15μM)。洗涤三次之前再培育板1小时，且添加PBS-0.1％(wt/vol)BSA中的抗IsdA(以1∶1,000稀释)，接着培育1小时。
可根据所报导的方法产生用于检测结合的IsdA的小鼠抗体。Clarke等人，“金黄色葡萄球菌的IsdA是一种广谱铁调节外源凝集素(IsdA ofStaphylococcus aureus is a broad spectrum，iron-regulated adhesin)”Mol.Microbiol.51：1509-1519(2004)。再洗涤板三次，且添加于PBS-0.1％(wt/vol)BSA中以1∶30,000稀释的碱性磷酸酶接合的抗小鼠抗体，且培育板1小时。最后，通过使用Sigma Fast对硝基苯基磷酸盐系统(Sigma)检测结合的抗体。在Victor微量滴定板读取器(Wallac)中在405nm下读取板。
通过在室温下与各种浓度的抑制剂或BSA(0至10μM)在PBS-0.1％(wt/vol)BSA中将rIsdA培育1小时进行结合抑制的研究。随后向经配位体涂布的孔中添加反应混合物，且检测结合的蛋白质。
原子力显微术
如下用IsdA及兜甲蛋白分子将原子力显微术(AFM)针尖及支撑物官能化。使用电子束热蒸镀依次对AFM悬臂(Microlevers；Veeco Metrology Group，Santa Barbara，CA)及硅晶圆(Siltronix，France)涂布5nm厚铬层及30nm厚金层。使用之前，用乙醇冲洗金涂布表面，用柔和氮气流干燥，且通过UV/臭氧处理(Jelight Co.，Irvine，CA)清洁15分钟。将金针尖及金支撑物浸没在含0.05mM以次氮基三乙酸酯封端(5％)(Prochimia)及以三(乙二醇)[三(EG)]封端(95％)的烷硫醇的乙醇溶液中隔夜，且用乙醇冲洗。短暂应用音波处理以移除可吸附的烷硫醇聚集体。随后将涂布SAM(自组装单层)的表面浸没在40mM NiSO4水溶液(pH 7.2)中1小时且用PBS冲洗。最后，在PBS中与2μM经His标记的IsdA培育样品2小时，且再用PBS冲洗数次。对于兜甲蛋白及BSA，将金支撑物浸没在含20μM以寡(EG)(OEG)及OEG丙酸封端的烷硫醇的混合物(95∶5，mol/mol)的乙醇溶液中36小时。用乙醇冲洗后，短暂应用音波处理以移除可吸附的烷硫醇聚集体。将支撑物浸没在含20公克/公升N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(Aldrich)及50公克/公升1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)(Sigma)的MilliQ水(Millipore)中30分钟，用MilliQ水冲洗，与含10微克/公升兜甲蛋白或BSA(sigma)的PBS一起培育3小时，再冲洗，且随后立即使用。
在室温下使用Picoforce Multimode AFM(Veeco Metrology Group，SantaBarbara，CA)在PBS中获得AFM影像及力-距离曲线。使用一小片胶带将支撑物固定在钢样品圆盘(puck)上。将安置的样品立即转移至AFM液体池中，同时避免去润湿。记录所有力曲线，其中最高施加力为450pN。使用热噪声法(Picoforce；Veeco Metrology Group)、稍大于制造商宣告的屈服值(0.01N/m)的屈服值(0.011N/m)量测悬臂的弹簧常数。为说明生物分子的可挠性，通过将针头回缩速度(以奈米/秒计)乘以断裂峰值的斜率(以微微牛顿/奈米计)估算加载速率(以微微牛顿/秒计)。
与固定配位体的微生物交互作用
可使用先前描述的方法量测对数生长中期细胞与固定配位体的结合。NíEidhin等人，“凝聚因子B(ClfB)，一种新的表面定位的结合纤维蛋白原的外源凝集素(Clumping factor B(ClfB)，a new surface-located fibrinogenbindingadhesin of Staphylococcus aureus)”Mol.Microbiol.30：245-257(1998)。另外，可自健康供体前鼻孔采集鳞状细胞，且检定在无铁培养基中生长的艰难梭菌的结合。O’Brien等人，“金黄色葡萄球菌凝聚因子B(ClfB)促进细胞人I型角蛋白10粘附：关联鼻建群(Staphylococcus aureus clumping factor B(ClfB)promotesadherence to human type I cytokeratin 10：implications for nasal colonization)”Cell.Microbiol.4：759-770(2002)。使用学生t检验(Student′s t test)进行菌株之间的比较。
实施例XII
表达及纯化重组孢子外膜蛋白质
产生含有具N端多组氨酸标签的重组孢子外膜蛋白质的表达构建体且转形于大肠杆菌菌株中。通过用10ml上述表达构建体的隔夜培养物接种1公升卢里亚(Luria)肉汁(补充有100μg/ml安比西林(ampicillin))培养物产生重组蛋白质。在37℃下生长2.5小时后，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至最终浓度为0.2mM以诱导蛋白质表达，且使培养物再生长3小时。储存在-80℃下之前通过离心采集细菌，倾析上清液，且将细胞离心块再悬浮于PBS中。随后在周围温度水浴中解冻悬浮液30分钟，且使用法式压碎机溶解细胞。通过在28,000×g下离心20分钟，接着经由0.45mm膜过滤，来移除不可溶细胞碎片。随后使用金属螯合层析初始纯化重组孢子外膜蛋白质。将细菌溶解产物施加于5ml装填Ni2的HiTrap螯合柱(安发玛西亚生物技术公司(AmershamPharmacia Biotech))，且用含0-200mM咪唑的4mM Tris-HCl、100mM NaCl(pH 7.9)的200ml线性梯度以5mL/min的流速洗脱所结合的蛋白质。汇集如由SDS-PAGE所测定对应于重组孢子外膜蛋白质的馏分，且用25mMTris-HCl(pH 8.0)透析，之后用离子交换层析进一步纯化。将透析的蛋白质施加于5ml HiTrap Q柱(Amersham Pharmacia Biotech)，且用含0-0.5M NaCl的25mM Tris-HCl(pH 8.0)的200ml线性梯度以5mL/min的流速洗脱所结合的蛋白质。通过SDS-PAGE鉴别含经纯化的孢子外膜蛋白质的馏分且经估算纯度为90％。
实施例XIII
孢子外膜蛋白质粘附检定
基本上如上述实施例X及XI中所述进行孢子外膜蛋白质与人类皮肤蛋白质和/或EpiDerm分化人类角质细胞的结合，其中例外为用孢子外膜蛋白质替换FITC接合的孢子。使用荧光素接合的抗生蛋白链菌素(RocklandImmunochemicals)达成所结合蛋白质的检测。培育1小时后使用Fluoroskan II荧光读取器(Labsystems，Beverly，MA)量测每孔的总荧光(Ftotal)，其中λex＝495nm及λem＝528nm。
Claims (79)
1.一种感染控制组合物，其能够阻断和/或抑制微生物孢子与基质表面的结合。
2.根据权利要求1的组合物，其中，所述组合物包含有机小分子。
3.根据权利要求1的组合物，其中，所述组合物包含蛋白质。
4.根据权利要求3的组合物，其中，所述蛋白质包含孢子表面肽。
5.根据权利要求4的组合物，其中，所述肽来源于梭菌属孢子表面蛋白质。
6.根据权利要求5的组合物，其中，所述梭菌属表面蛋白质包含艰难梭菌孢子表面蛋白质。
7.根据权利要求4的组合物，其中，所述肽来源于芽孢杆菌属孢子表面蛋白质。
8.根据权利要求7的组合物，其中，所述芽孢杆菌属表面蛋白质包含炭疽芽孢杆菌孢子表面蛋白质。
9.根据权利要求6的组合物，其中，所述艰难梭菌孢子表面肽包含SEQID NO：1或SEQ ID NO：1的同源物。
10.根据权利要求6的组合物，该艰难梭菌孢子表面肽选自包含SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：15的群组。
11.根据权利要求1的组合物，其中，所述组合物包含抗体。
12.根据权利要求11的组合物，其中，所述抗体为多克隆抗体。
13.根据权利要求11的组合物，其中，所述抗体为单克隆抗体。
14.根据权利要求1的组合物，其中，所述组合物包含合成肽。
15.根据权利要求1的组合物，其中，所述组合物包含无机离子复合物。
16.根据权利要求1的组合物，其中，所述组合物包含蛋白质模拟物。
17.根据权利要求1的组合物，其中，所述基质表面包含无生命表面。
18.根据权利要求1的组合物，其中，所述基质表面包含有生命表面。
19.根据权利要求18的组合物，其中，所述有生命表面包含身体组织表面。
20.根据权利要求19的组合物，其中，所述身体组织表面包含上皮表面。
21.根据权利要求20的组合物，其中，所述上皮表面包含哺乳动物皮肤表面。
22.根据权利要求17的组合物，其中，所述无生命表面包含不锈钢。
23.根据权利要求17的组合物，其中，所述无生命表面包含陶瓷。
24.根据权利要求17的组合物，其中，所述无生命表面包含乙烯树脂。
25.根据权利要求17的组合物，其中，所述无生命表面包含瓷砖。
26.根据权利要求1的组合物，其中，所述组合物进一步包含至少一种抗微生物药物。
27.根据权利要求1的组合物，其中，所述组合物适于人类给药。
28.根据权利要求1的组合物，其中，所述组合物进一步包含抗微生物皮肤清洁剂。
29.根据权利要求28的组合物，其中，所述皮肤清洁剂包含手洗清洁剂。
30.根据权利要求1的组合物，其中，所述组合物进一步包含抗微生物表面清洁剂。
31.一种方法，其包含：a)提供：i)处于暴露于微生物的风险中的个体，其中，所述暴露可能导致微生物感染和/或菌落丛生；及ii)感染控制组合物；b)在该微生物暴露之前在使得形成微生物感染屏障的条件下向该个体给予该组合物。
32.根据权利要求31的方法，其中，所述微生物感染屏障减少该微生物感染。
33.根据权利要求31的方法，其中，所述微生物感染屏障阻止该微生物感染。
34.根据权利要求31的方法，其中，所述微生物包含细菌。
35.根据权利要求34的方法，其中，所述细菌选自包含梭菌属、芽孢杆菌属、脱硫肠状菌属、芽孢乳杆菌属、芽孢八叠球菌属或高温放线菌属(Thermoactinomyces)的群组。
36.根据权利要求34的方法，其中，所述细菌包含细菌孢子。
37.根据权利要求36的方法，其中，所述细菌孢子包含至少一种孢子表面蛋白质。
38.根据权利要求37的方法，其中，所述梭菌属孢子表面蛋白质为艰难梭菌孢子表面蛋白质。
39.根据权利要求37的方法，所述芽孢杆菌属孢子表面蛋白质为炭疽芽孢杆菌孢子表面蛋白质。
40.根据权利要求31的方法，其中，所述感染控制组合物包含氨基酸序列。
41.根据权利要求40的方法，其中，所述氨基酸序列来源于微生物孢子表面蛋白质。
42.根据权利要求40的方法，其中，所述氨基酸序列与微生物孢子表面蛋白质具有实质同源性。
43.根据权利要求31的方法，其中，所述感染控制组合物包含能够抑制、拮抗、破坏、置换和/或阻断微生物孢子与基质表面的结合。
44.根据权利要求31的方法，其中，所述感染控制组合物进一步包含拮抗化合物，其中，所述化合物对该微生物孢子表面蛋白质氨基酸序列具有亲和力。
45.根据权利要求31的方法，其中，所述组合物进一步包含载剂。
46.根据权利要求31的方法，其中，所述感染控制组合物进一步包含至少一种抗微生物药物。
47.根据权利要求31的方法，其中，所述处于风险中的个体为卫生保健工作人员。
48.根据权利要求31的方法，其中，所述处于风险中的个体为医疗第一反应者。
49.根据权利要求31的方法，其中，所述处于风险中的个体为医疗患者。
50.根据权利要求49的方法，其中，所述医疗患者处于卫生保健环境中。
51.根据权利要求49的方法，其中，所述医疗患者已给予至少一种抗生素。
52.根据权利要求31的方法，其中，所述处于风险中的个体为消防员。
53.根据权利要求31的方法，其中，所述处于风险中的个体为警察。
54.根据权利要求31的方法，其中，所述处于风险中的个体为军事人员。
55.根据权利要求31的方法，其中，所述处于风险中的个体为食物操作员。
56.根据权利要求31的方法，其中，所述处于风险中的个体为无生命表面和/或物体。
57.根据权利要求31的方法，其中，所述给药选自由局部给药、经口给药、肠胃外给药、肺部给药、肛门给药、阴道给药、经眼给药及鼻内给药组成的群组。
58.一种方法，其包含：a)提供：i)已暴露于微生物的个体，其中，所述暴露导致微生物感染；ii)感染控制组合物；b)在该微生物暴露之后在使得该微生物感染减少的条件下向该个体给予该组合物。
59.根据权利要求58的方法，其中，所述微生物包含细菌。
60.根据权利要求59的方法，其中，所述细菌包含细菌孢子。
61.根据权利要求60的方法，其中，所述细菌孢子包含至少一种孢子表面蛋白质。
62.根据权利要求61的方法，其中，所述细菌孢子表面蛋白质为艰难梭菌孢子表面蛋白质。
63.根据权利要求61的方法，其中，所述细菌孢子表面蛋白质为炭疽芽孢杆菌孢子表面蛋白质。
64.根据权利要求58的方法，其中，所述感染控制组合物包含能够抑制、拮抗、破坏、置换和/或阻断微生物孢子与基质表面的结合。
65.根据权利要求58的方法，其中，所述感染控制组合物进一步包含拮抗化合物，其中，所述化合物对该微生物孢子表面蛋白质氨基酸序列具有亲和力。
66.根据权利要求58的方法，其中，所述组合物进一步包含载剂。
67.根据权利要求58的方法，其中，所述感染控制组合物进一步包含至少一种抗微生物药物。
68.根据权利要求58的方法，其中，所述处于风险中的个体为卫生保健工作人员。
69.根据权利要求58的方法，其中，所述处于风险中的个体为医疗第一反应者。
70.一种筛选方法，其包含：a)提供：i)经分离的肽，其中，所述肽来源于微生物孢子表面蛋白质；及ii)怀疑与该肽具有交互作用的感染控制测试化合物；b)使该肽与该感染控制测试化合物接触；及c)检测该肽与该感染控制测试化合物的交互作用。
71.根据权利要求70的方法，其中，所述方法进一步包含能够附着该经分离的肽的基质表面。
72.根据权利要求71的方法，其中，所述基质表面包含猪皮。
73.根据权利要求70的方法，其中，所述肽来源于梭菌属孢子表面。
74.根据权利要求73的方法，其中，所述梭菌属孢子表面包含艰难梭菌孢子表面。
75.根据权利要求70的方法，其中，所述肽来源于芽孢杆菌属孢子表面。
76.根据权利要求75的方法，其中，所述芽孢杆菌属孢子表面包含炭疽芽孢杆菌孢子表面。
77.根据权利要求70的方法，其中，所述肽包含孢子表面肽。
76.根据权利要求77的方法，其中，所述孢子表面肽包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的同源物。
78.根据权利要求77的方法，其中，所述孢子表面肽选自包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：15的群组。
79.根据权利要求70的方法，其中，所述肽包含抗体。
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109706101A (zh) * | 2019-02-01 | 2019-05-03 | 东华大学 | 一种嗜冷芽孢八叠球菌及其应用 |
| CN110879209A (zh) * | 2019-12-09 | 2020-03-13 | 济南大学 | 一种γ-氨基丁酸的快速检测方法 |
| CN113247946A (zh) * | 2021-04-22 | 2021-08-13 | 哈尔滨工业大学 | 一种自主装纳米生物催化剂及其制备方法和在丁醇生产中的应用 |
| CN113278578A (zh) * | 2021-06-15 | 2021-08-20 | 广西大学 | 一种稻瘟病菌分生孢子的移植方法 |
| CN113308431A (zh) * | 2021-06-15 | 2021-08-27 | 广西大学 | 一种番茄灰霉病菌分生孢子的移植与分散方法 |
| CN114807194A (zh) * | 2020-08-31 | 2022-07-29 | 南京工业大学 | 一种提高梭菌中蛋白表达效率的方法 |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9133251B2 (en) | 2008-02-22 | 2015-09-15 | The Curators Of The University Of Missouri | Bacillus based delivery system and methods of use |
| US20130243794A1 (en) * | 2010-12-03 | 2013-09-19 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Methods for predicting and treating infection-induced illnesses and predicting the severity of infection-induced illnesses |
| CN103608464A (zh) * | 2010-12-29 | 2014-02-26 | 卡恩基因公司 | 艰难梭菌抗原 |
| GB2491117A (en) | 2011-05-20 | 2012-11-28 | Royal Holloway & Bedford New College | Coat proteins from Clostridium and Bacillus species |
| US9573980B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-02-21 | Spogen Biotech Inc. | Fusion proteins and methods for stimulating plant growth, protecting plants from pathogens, and immobilizing Bacillus spores on plant roots |
| WO2014193237A2 (en) * | 2013-05-30 | 2014-12-04 | Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc | C diff protease |
| US20160250283A1 (en) * | 2013-10-23 | 2016-09-01 | The Rockefeller University | Compositions and methods for prophylaxis and therapy of clostridium difficile infection |
| GB2525177A (en) * | 2014-04-14 | 2015-10-21 | New Royal Holloway & Bedford | Vaccine |
| BR122023020897A2 (pt) | 2014-09-17 | 2024-01-30 | Spogen Biotech Inc | Métodos para fornecimento de enzimas a uma planta |
| MY190858A (en) * | 2016-04-05 | 2022-05-12 | Nch Corp | Nutrient rich germinant composition and spore incubation method |
| WO2018129249A1 (en) * | 2017-01-05 | 2018-07-12 | The University Of Chicago | Inhibition of enteric infection through the modulation of microbiota |
| CN114585740A (zh) | 2019-06-05 | 2022-06-03 | 利夫加工有限公司 | 针对艰难梭菌的适配体 |
| US11898146B2 (en) * | 2020-12-03 | 2024-02-13 | Liv Process, Inc. | Aptamers against Clostridium difficile, compositions comprising aptamers against Clostridium difficile and methods of using the same |
| WO2022209994A1 (ja) * | 2021-03-30 | 2022-10-06 | 旭化成株式会社 | アシルＣｏＡ化合物還元活性を有する組換えポリペプチド |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007148065A2 (en) * | 2006-06-23 | 2007-12-27 | The Secretary Of State For Defence | Antibody for anthrax |
| CN101190946A (zh) * | 2006-12-01 | 2008-06-04 | 中国人民解放军第二军医大学 | 重组恶性疟原虫环子孢子表面蛋白及其制法和用途 |
Family Cites Families (56)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL7018669A (zh) * | 1969-12-23 | 1971-06-25 | ||
| USRE28778E (en) | 1969-12-23 | 1976-04-20 | West Laboratories, Inc. | Phenolic synthetic detergent-disinfectant |
| NL154598B (nl) * | 1970-11-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking. |
| US3817837A (en) | 1971-05-14 | 1974-06-18 | Syva Corp | Enzyme amplification assay |
| US3939350A (en) | 1974-04-29 | 1976-02-17 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation |
| US3996345A (en) * | 1974-08-12 | 1976-12-07 | Syva Company | Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays |
| US4275149A (en) * | 1978-11-24 | 1981-06-23 | Syva Company | Macromolecular environment control in specific receptor assays |
| US4277437A (en) * | 1978-04-05 | 1981-07-07 | Syva Company | Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay |
| US4458066A (en) * | 1980-02-29 | 1984-07-03 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
| US4376110A (en) | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
| US4366241A (en) | 1980-08-07 | 1982-12-28 | Syva Company | Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays |
| US4517288A (en) * | 1981-01-23 | 1985-05-14 | American Hospital Supply Corp. | Solid phase system for ligand assay |
| US4632772A (en) | 1982-02-22 | 1986-12-30 | Dexide, Inc. | Mild antimicrobial detergent composition |
| US5051448A (en) | 1984-07-24 | 1991-09-24 | The Mclean Hospital Corporation | GABA esters and GABA analog esters |
| US5506337A (en) * | 1985-03-15 | 1996-04-09 | Antivirals Inc. | Morpholino-subunit combinatorial library and method |
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US5288486A (en) | 1985-10-28 | 1994-02-22 | Calgon Corporation | Alcohol-based antimicrobial compositions |
| CA1291031C (en) * | 1985-12-23 | 1991-10-22 | Nikolaas C.J. De Jaeger | Method for the detection of specific binding agents and their correspondingbindable substances |
| US5010175A (en) | 1988-05-02 | 1991-04-23 | The Regents Of The University Of California | General method for producing and selecting peptides with specific properties |
| US4981785A (en) | 1988-06-06 | 1991-01-01 | Ventrex Laboratories, Inc. | Apparatus and method for performing immunoassays |
| US5169862A (en) | 1989-07-07 | 1992-12-08 | Peptide Technologies Corporation | Analogs of viscosin and their uses |
| IE66205B1 (en) | 1990-06-14 | 1995-12-13 | Paul A Bartlett | Polypeptide analogs |
| US5650489A (en) | 1990-07-02 | 1997-07-22 | The Arizona Board Of Regents | Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof |
| US5192746A (en) | 1990-07-09 | 1993-03-09 | Tanabe Seiyaku Co., Ltd. | Cyclic cell adhesion modulation compounds |
| US5114978A (en) | 1990-10-15 | 1992-05-19 | Rhone-Poulenc Surfactants And Specialties, L.P. | Anhydrous blends of p-chloro-m-xylenol in surfactant mixtures |
| US5376313A (en) | 1992-03-27 | 1994-12-27 | Abbott Laboratories | Injection molding a plastic assay cuvette having low birefringence |
| US5573905A (en) | 1992-03-30 | 1996-11-12 | The Scripps Research Institute | Encoded combinatorial chemical libraries |
| US5541061A (en) | 1992-04-29 | 1996-07-30 | Affymax Technologies N.V. | Methods for screening factorial chemical libraries |
| US5288514A (en) * | 1992-09-14 | 1994-02-22 | The Regents Of The University Of California | Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support |
| DE69314148T2 (de) | 1992-12-17 | 1998-01-15 | Valeo Systemes Dessuyage | Stromversorgungsverfahren und -vorrichtung für einen elektrischen Motor zum Antrieb eines Scheibenwischers eines Kraftfahrzeugs |
| US5576220A (en) * | 1993-02-19 | 1996-11-19 | Arris Pharmaceutical Corporation | Thin film HPMP matrix systems and methods for constructing and displaying ligands |
| US5559103A (en) | 1993-07-21 | 1996-09-24 | Cytel Corporation | Bivalent sialyl X saccharides |
| US5539085A (en) | 1993-08-20 | 1996-07-23 | Onyx Pharmaceuticals, Inc. | Bcl-2 and R-ras complex |
| US5599677A (en) | 1993-12-29 | 1997-02-04 | Abbott Laboratories | Immunoassays for prostate specific antigen |
| US5519134A (en) * | 1994-01-11 | 1996-05-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Pyrrolidine-containing monomers and oligomers |
| US5593853A (en) * | 1994-02-09 | 1997-01-14 | Martek Corporation | Generation and screening of synthetic drug libraries |
| US5539083A (en) | 1994-02-23 | 1996-07-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis |
| US5525735A (en) * | 1994-06-22 | 1996-06-11 | Affymax Technologies Nv | Methods for synthesizing diverse collections of pyrrolidine compounds |
| US5549974A (en) | 1994-06-23 | 1996-08-27 | Affymax Technologies Nv | Methods for the solid phase synthesis of thiazolidinones, metathiazanones, and derivatives thereof |
| US5635462A (en) * | 1994-07-08 | 1997-06-03 | Gojo Industries, Inc. | Antimicrobial cleansing compositions |
| US5576423A (en) | 1994-12-02 | 1996-11-19 | Schering Corporation | Antibodies to the slam protein expressed on activated T cells |
| US5585639A (en) * | 1995-07-27 | 1996-12-17 | Hewlett-Packard Company | Optical scanning apparatus |
| US5569588A (en) | 1995-08-09 | 1996-10-29 | The Regents Of The University Of California | Methods for drug screening |
| CA2239957A1 (en) | 1995-12-22 | 1997-07-03 | Abbott Laboratories | Fluorescence polarization immunoassay diagnostic method |
| US5885529A (en) | 1996-06-28 | 1999-03-23 | Dpc Cirrus, Inc. | Automated immunoassay analyzer |
| US7655252B2 (en) * | 1999-04-28 | 2010-02-02 | The Regents Of The University Of Michigan | Antimicrobial nanoemulsion compositions and methods |
| DE60112242T2 (de) * | 2000-02-01 | 2006-05-24 | Tiax Llc, Cambridge | Chemisches und biologisches dekontaminations-system |
| US6656919B1 (en) * | 2002-01-11 | 2003-12-02 | Clarence L. Baugh | Method and a product for the rapid decontamination and sterilization of bacterial endospores |
| US7192601B2 (en) * | 2002-01-18 | 2007-03-20 | Walker Edward B | Antimicrobial and sporicidal composition |
| EP1648388A4 (en) * | 2003-07-11 | 2009-04-01 | Vaxin Inc | NEW OBJECTIVES AND COMPOSITIONS FOR USE IN DECONTAMINATION, IMMUNOPROPHYLAXIS AND THERAPY AFTER EXPOSURE TO MILZBRAND |
| US7462361B2 (en) * | 2003-08-18 | 2008-12-09 | Novabay Pharmaceuticals, Inc. | N,N-dihalogenated amino acids and derivatives |
| GB0410958D0 (en) * | 2004-05-15 | 2004-06-16 | Haptogen Ltd | Methods for reducing biofilm formation in infectious bacteria |
| US7658706B2 (en) * | 2005-12-05 | 2010-02-09 | Rti Biologics, Inc. | Vascular graft sterilization and decellularization |
| BRPI0906060A2 (pt) * | 2008-02-28 | 2015-12-01 | 3M Innovative Properties Co | anticorpos isolados, métodos de preparo de um anticorpo anti-clostridium difficile, composição e método para a detecção da presença de um esporo de clostridium difficile em uma amostra |
| TWI552751B (zh) | 2011-06-20 | 2016-10-11 | Ｈ 朗德貝克公司 | 投予４－（（１ｒ，３ｓ）－６－氯－３－苯基－二氫茚－１－基）－１，２，２－三甲基－哌及其鹽用於治療精神分裂症的方法 |
-
2010
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- 2010-03-26 TW TW099109076A patent/TW201039841A/zh unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007148065A2 (en) * | 2006-06-23 | 2007-12-27 | The Secretary Of State For Defence | Antibody for anthrax |
| CN101190946A (zh) * | 2006-12-01 | 2008-06-04 | 中国人民解放军第二军医大学 | 重组恶性疟原虫环子孢子表面蛋白及其制法和用途 |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109706101A (zh) * | 2019-02-01 | 2019-05-03 | 东华大学 | 一种嗜冷芽孢八叠球菌及其应用 |
| CN110879209A (zh) * | 2019-12-09 | 2020-03-13 | 济南大学 | 一种γ-氨基丁酸的快速检测方法 |
| CN114807194A (zh) * | 2020-08-31 | 2022-07-29 | 南京工业大学 | 一种提高梭菌中蛋白表达效率的方法 |
| CN114807194B (zh) * | 2020-08-31 | 2023-05-12 | 南京工业大学 | 一种提高梭菌中蛋白表达效率的方法 |
| CN113247946A (zh) * | 2021-04-22 | 2021-08-13 | 哈尔滨工业大学 | 一种自主装纳米生物催化剂及其制备方法和在丁醇生产中的应用 |
| CN113247946B (zh) * | 2021-04-22 | 2022-07-05 | 哈尔滨工业大学 | 一种自组装纳米生物催化剂及其制备方法和在丁醇生产中的应用 |
| CN113278578A (zh) * | 2021-06-15 | 2021-08-20 | 广西大学 | 一种稻瘟病菌分生孢子的移植方法 |
| CN113308431A (zh) * | 2021-06-15 | 2021-08-27 | 广西大学 | 一种番茄灰霉病菌分生孢子的移植与分散方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PT2411410E (pt) | 2015-10-09 |
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