CN102282252B - 羊膜来源的贴壁细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了来自羊膜的新型血管生成细胞，称为羊膜来源的贴壁细胞；和该细胞的群体以及包含该细胞的组合物。本发明进一步提供了获得所述细胞的方法和使用所述细胞治疗个体的方法。

Description

羊膜来源的贴壁细胞
本申请要求提交于2009年11月19日的美国临时专利申请号61/116,248的权益，其公开的内容全文引入作为参考。
1.技术领域
本发明提供了来自羊膜的新型血管生成细胞，及其细胞群，在此称为“羊膜来源的贴壁细胞”(AMDAC)。羊膜来源的贴壁细胞不同于以前描述的胎盘干细胞，包括组织培养塑料贴壁胎盘干细胞。
2.背景技术
细胞组合物，例如，干细胞组合物，已成为针对多种生理缺陷的有吸引力的治疗手段，例如，用于骨髓替代治疗。存在对于其它细胞群的需求，例如，具有血管生成的潜能和/或性质的干细胞或祖细胞。
3.发明概述
在一个方面，本发明提供了一种分离的羊膜来源的贴壁细胞，在此也称为AMDAC，其中所述细胞附着于组织培养塑料，且其中所述细胞是OCT-4-(OCT-4阴性，OCT-4也称为POU5F1或八聚体结合蛋白4)，或经逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)测定，例如，按照30个循环的RT-PCR的测定，与合适的对照细胞系进行对比，例如胚胎癌衍生的干细胞系(例如，NTERA-2，例如，来自美国模式培养物保藏所，ATCC编号CRL-1973)，所述细胞是OCT-4-。在一个具体的实施方式中，细胞经RT-PCR测定为OCT-4-，和经免疫定位测定为VEGFR1/Flt-1+(血管内皮生长因子受体1)和/或VEGFR2/KDR+(血管内皮生长因子受体2，也称为激酶插入域受体)。在另一个具体的实施方式中，细胞经RT-PCR测定为OCT-4-，和经免疫定位测定为CD49f+(整联蛋白-α6+)。在一个具体的实施方式中，所述细胞经RT-PCR测定为OCT-4-，和经RT-PCR测定为HLA-G-。在另一个具体的实施方式中，所述细胞经RT-PCR测定为OCT-4-，和经免疫定位测定为CD90+、CD105+、或CD117-。在一个更加具体的实施方式中，所述OCT-4-细胞是CD90+、CD105+、和CD117-。在另一个具体的实施方式中，细胞经例如30个循环的RT-PCR测定为OCT-4-，且不表达SOX2。
在另一个实施方式中，所述OCT-4-细胞经免疫定位测定为CD29+、CD73+、ABC-p+、和CD38-中的一种或多种。
在另一个具体的实施方式中，所述OCT-4-细胞经免疫定位测定还是CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+(血管生成素受体)、TEM-7+(肿瘤内皮细胞标志物7)、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-(血管紧张素I转换酶，ACE)、CD146-(黑色素瘤细胞粘附分子)、CXCR4(趋化因子(C-X-C基序)受体4)中的一种或多种。在一个更加具体的实施方式中，所述细胞经免疫定位测定为CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、和CXCR4-。在另一个更具体的实施方式中，在此提供的羊膜来源的贴壁细胞经RT-PCR测定为OCT-4-；经免疫定位测定为VEGFR1/Flt-1+和/或VEGFR2/KDR+；以及经免疫定位测定为CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、和/或Tie-2-中的一种或多种或全部。在一个具体的实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞或羊膜来源的贴壁细胞群在例如＞20个循环的PCR扩增下，比具有等价细胞数量的NTERA-2细胞或NTERA-2细胞群少表达至少2log的OCT-4mRNA。在另一个具体的实施方式中，所述OCT-4-细胞经免疫定位测定还是VE-钙粘蛋白-(CD144-)。在另一个具体的实施方式中，所述OCT-4-细胞还经免疫定位测定CD105+和CD200+呈阳性。在另一个具体的实施方式中，所述OCT-4-细胞在暴露于1-100ng/mL VEGF(血管内皮生长因子)4-21天后经免疫定位测定不表达CD34。
在另一个方面，本发明提供了一种分离的羊膜来源的贴壁细胞，其中所述细胞附着于组织培养塑料，且其中所述细胞经RT-PCR测定是OCT-4-和SOX-2-；以及经流式细胞术测定是CD90+、CD105+、和CD117。在一个具体的实施方式中，OCT-4-，SOX-2-细胞经流式细胞术测定还是HLA-G-或CD271-。在一个更加具体的实施方式中，所述细胞经RT-PCR测定为OCT-4-和SOX-2-；以及经流式细胞术测定为CD90+、CD105+、CD117-、CD271-和HLA-G-。
在另一个方面，本发明提供了一种分离的羊膜来源的贴壁细胞，其中所述细胞附着于组织培养塑料，且其中所述细胞对于CD309(也称为VEGFR2/KDR+)呈阳性。
在另一个方面，本发明提供了一种分离的羊膜来源的贴壁细胞，其中所述细胞附着于组织培养塑料，且其中所述细胞经RT-PCR测定是OCT-4-、和经免疫定位测定为VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、或VE-钙粘蛋白-中的一种或多种的。在一个具体的实施方式中，所述细胞经例如＞20个循环的RT-PCR测定为OCT-4-，和经免疫定位测定为VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、和VE-钙粘蛋白-。在另一个具体的实施方式中，细胞在暴露于1-100ng/mL的VEGF下4-21天后经免疫定位测定不表达CD34。
在另一个实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞是OCT-4-、CD49f+、HLA-G-、CD90+、CD105+、和CD117-。在一个更加具体的实施方式中，所述细胞经免疫定位或流式细胞术测定为CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-(黑色素瘤细胞粘附分子)、或CXCR4-中的一种或多种。在一个更加具体的实施方式中，所述细胞经免疫定位测定为CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、和CXCR4-。在另一个具体的实施方式中，所述细胞经免疫定位测定还为VEGFR1/Flt-1+和/或VEGFR2/KDR+；以及经免疫定位测定为CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、和/或Tie-2-中的一种或多种。在另一个具体的实施方式中，所述细胞经免疫定位测定还为VEGFR1/Flt-1+、VEGFR2/KDR+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、和Tie-2-。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种分离的羊膜来源的贴壁细胞，其中所述细胞经例如30个循环的RT-PCR测定不表达FGF4、IFNG、CXCL10、ANGPT4、ANGPTL3、FGA、LEP、PRL、PROK1、TNMD、FLT3、XLKD1、CDH5、LECT1、PLG、TERT、SOX2、NANOG、MMP-13、DLX5、或BGLAP的mRNA。在另一个实施方式中，本发明提供了一种分离的羊膜来源的贴壁细胞，其中所述细胞经流式细胞术测定不能组成性地表达不变链、HLA-DR-DP-DQ、CD6、CD271中的一种或多种。
本发明在此进一步提供了一种分离的细胞群，其包含一种羊膜来源的贴壁细胞。在一个具体的实施方式中，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的细胞是羊膜来源的贴壁细胞。在一个实施方式中，所述细胞经RT-PCR测定为OCT-4-，和经免疫定位测定为VEGFR1/Flt-1+和/或VEGFR2/KDR+，且其中所述分离的细胞群不是羊膜。在另一个实施方式中，本发明提供了一种分离的细胞群，包含一种羊膜来源的贴壁细胞，其经RT-PCR测定为OCT-4-和HLA-G-，和经免疫定位测定为VEGFR1/Flt-1+或VEGFR2/KDR+；且其中所述分离的细胞群不是羊膜。在一个具体的实施方式中，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的细胞是所述羊膜来源的贴壁细胞。在另一个实施方式中，本发明提供了一种分离的细胞群，包含一种羊膜来源的贴壁细胞，其中所述细胞附着于组织培养塑料，其中所述细胞经RT-PCR测定是OCT-4-，经免疫定位测定是VEGFR1/Flt-1+和VEGFR2/KDR+，其中所述细胞经免疫定位测定还是CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、或CXCR4-中的一种或多种，或经例如＞20个循环的RT-PCR测定是HLA-G-，且其中所述分离的细胞群不是羊膜。在一个具体的实施方式中，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的细胞是所述羊膜来源的贴壁细胞。在另一个实施方式中，本发明提供了一种分离的细胞群，包含一种羊膜来源的贴壁细胞，其中所述细胞附着于组织培养塑料，其中所述细胞经RT-PCR测定是OCT-4-，经免疫定位测定是VEGFR1/Flt-1+和/或VEGFR2/KDR+，其中所述细胞在暴露于1-100ng/mL的VEGF下4-21天后经免疫定位测定不表达CD34，且其中所述分离的细胞群不是羊膜。在一个具体的实施方式中，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的细胞是所述羊膜来源的贴壁细胞。在另一个实施方式中，当上述任何含有羊膜来源的贴壁细胞的细胞群在诸如血管内皮生长因子(VEGF)、上皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等血管生成因子存在下培养于底物，例如MATRIGELTM上的时候，形成芽或管状结构。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种细胞群，其中所述分离的细胞群中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的细胞是羊膜来源的贴壁细胞，其经RT-PCR测定为OCT-4-，且对于VEGFR2/KDR、CD9、CD54、CD105、或CD200呈阳性。在一个具体的实施方式中，所述分离的细胞群中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的细胞是羊膜来源的贴壁细胞，其经RT-PCR测定为OCT-4-，和经免疫定位测定为VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、和CD200+。在一个更加具体的实施方式中，所述羊膜来源的贴壁细胞在暴露于1-100ng/mL的VEGF下4-21天后经免疫定位测定不表达CD34。在一个具体的实施方式中，所述羊膜来源的贴壁细胞附着于组织培养塑料。在另一个具体的实施方式中，当所述细胞群在诸如血管内皮生长因子(VEGF)、上皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等血管生成因子存在下培养于底物，例如MATRIGELTM上的时候，形成芽或管状结构。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种细胞群，例如，人细胞，其中所述分离的细胞群中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的细胞是羊膜来源的贴壁细胞，其表达ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、CD44、CD200、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP1、NRP2、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAM1、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TIMP2、TIMP3、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIE2/TEK、TNF、TNNI1、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC、VEGFR1/FLT1、或VEGFR2/KDR的RNA中的一种或多种或全部。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种细胞群，例如，羊膜来源的贴壁细胞群；或一种细胞群，其中所述分离的细胞群中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的细胞是羊膜来源的贴壁细胞，其表达CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、β2-微球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳凝素-1、ADAM 17前体(脱整联蛋白及金属蛋白酶域17)(TNF-α转化酶)、血管紧张肽原前体、细丝蛋白A(α-细丝蛋白)(细丝蛋白1)(内皮肌动蛋白结合蛋白)(ABP-280)(非肌肉细丝蛋白)、α-辅肌动蛋白1(α-辅肌动蛋白细胞骨架亚型)(非肌肉α-辅肌动蛋白1)(F-肌动蛋白交联蛋白)、低密度脂蛋白受体相关的蛋白2前体(巨蛋白(Megalin))(糖蛋白330)(gp330)、I和II型巨噬细胞消除受体(巨噬细胞乙酰化的LDL受体I和II)、活化素受体II型B前体(ACTR-IIB)、Wnt-9蛋白、胶质原纤维酸性蛋白、星形细胞(GFAP)、肌浆球蛋白-结合蛋白C、心-型(心MyBP-C)(C-蛋白、心肌亚型)、或肌球蛋白重链，非肌A型(细胞肌球蛋白重链、A型)(非肌肉肌球蛋白重链-A)(NMMHC-A)中的一种或更多或全部。
在另一个方面，本发明提供了一种细胞群，例如，羊膜来源的贴壁细胞群；或一种细胞群，其中所述分离的细胞群中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的细胞是羊膜来源的贴壁细胞，其在例如细胞生长的培养基中分泌VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、或半乳凝素-1中的一种或多种或全部。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种细胞群，例如，羊膜来源的贴壁细胞群；或一种细胞群，其中所述分离的细胞群中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的细胞是羊膜来源的贴壁细胞，其表达血管生成的微RNA(miRNA)的水平高于骨髓来源的间质干细胞，其中所述miRNA包括miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、和/或miR-296中的一种或更多或全部。在另一个实施方式中，本发明提供了一种细胞群，例如，羊膜来源的贴壁细胞群；或一种细胞群，其中所述分离的细胞群中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的细胞是羊膜来源的贴壁细胞，其表达的血管生成微RNA(miRNA)的水平低于骨髓来源的间质干细胞，其中所述miRNA包括miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b、和/或miR-16中的一种或更多或全部。在某些实施方式中，AMDAC，或AMDAC群体，表达一种或更多或全部的血管生成miRNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、和/或miR-16。
在另一个具体的实施方式中，本发明提供了一种羊膜来源的血管生成细胞，或羊膜来源的血管生成细胞群，其在缺氧条件(例如，低于约5％O2)下以相对常氧条件(例如，约20％或约21％O2)下增加的水平表达CD202b、IL-8和/或VEGF。
在另一个具体的实施方式中，分离的羊膜来源的贴壁细胞群另外包含第二种细胞类型。在具体的实施方式中，AMDAC包含所述群体中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少98％的细胞。在一个具体的实施方式中，第二种细胞类型包含于或分离自胎盘血、脐带血、粗骨髓或其它组织。在一个更加具体的实施方式中、所述第二种细胞类型是胚胎干细胞、血细胞、分离自外周血的干细胞、分离自胎盘血的干细胞、分离自胎盘灌流液的干细胞、分离自胎盘组织的干细胞、分离自脐带血的干细胞、脐带干细胞、骨髓来源的间质干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、体干细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌细胞、内皮细胞、内皮祖细胞、周细胞、肌细胞、成心肌细胞、成肌细胞、成血管细胞、或心成肌细胞。在另一个具体的实施方式中，所述第二种细胞类型是造血干细胞或祖细胞，例如，CD34+细胞。在另一个更具体的实施方式中，所述第二种细胞类型包含所述群体中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少98％的细胞。
在另一个具体的实施方式中，任何上述细胞正在被或已经被培养增殖。在另一个具体的实施方式中，任何上述细胞都来自所述细胞培养物，其已被传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20次、或更多。在另一个具体的实施方式中，任何上述细胞都来自培养物，其在培养物中倍增至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或至少50次，或更多。
在另一个方面，本发明提供了一种组合物，例如，药物组合物，其包含在此提供的任何一种羊膜来源的贴壁细胞，或含有羊膜来源的贴壁细胞的细胞群。在一个具体的实施方式中，组合物是基质或支架，例如，天然组织基质或支架，例如，永久或可降解的去细胞化的组织基质或支架；或合成的基质或支架。在一个更加具体的实施方式中，所述基质或支架的形状为管状或其它器官状的三维形式。在另一个更具体的实施方式中，所述基质为去细胞化的组织基质。在另一个具体的实施方式中，组合物包含一种或多种在此提供的分离的羊膜来源的贴壁细胞，或含有羊膜来源的贴壁细胞的细胞群，其置于生理可接受的溶液中，例如，盐溶液、培养基等。
在另一个方面，本发明提供了治疗患有循环系统疾病或紊乱的个体的方法，包括对所述个体以足以明显改善所述疾病或紊乱的一种或更多症状的量和时间施用一种或多种在此描述的羊膜来源的贴壁细胞。在另一个实施方式中，本发明提供了治疗患有循环系统疾病或紊乱的个体的方法，包括对所述个体施用羊膜来源的贴壁细胞，其用药量和时间与羊膜来源的贴壁细胞施用前的该个体相比足以明显改善一种或更多心功能指标，其中所述心功能指标为胸腔心输出量(CO)、心指数(CI)、肺动脉楔压(PAWP)、心指数(CI)、％缩短分数(％FS)、射血分数(EF)、左心室射血分数(LVEF)、左心室舒张末内径(LVEDD)、左心室收缩末内径(LVESD)、收缩性(dP/dt)、心房或心室功能降低、泵效率增加、泵效率损失速率降低、血液动力学功能损失降低、或与心肌病相关的并发症减少。
在一个具体的实施方式中，所述疾病或紊乱是心肌梗塞。在另一个具体的实施方式中，所述疾病或紊乱是心肌病。在其它具体的实施方式中，所述疾病或紊乱是动脉瘤、心绞痛、主动脉瓣狭窄、主动脉炎、心率不齐、动脉硬化、动脉炎、非对称性心室间隔肥厚(ASH)、动脉粥样硬化、心房纤颤和扑动、细菌性心内膜炎、Barlow综合征(二尖瓣脱垂)、心动过缓、脉管炎病(血栓闭塞性脉管炎)、心肌肥厚、心脏炎、颈动脉疾病、主动脉缩窄、先天性心脏缺损、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、Eisenmenger综合征、栓塞、心内膜炎、红斑性肢痛病、肌纤维震颤、纤维肌肉发育不良、心传导阻滞、心脏杂音、高血压、低血压、特发性婴儿动脉钙化、川崎氏病(皮肤粘膜淋巴结综合征、皮肤粘膜淋巴结病、小儿多动脉炎)、代谢综合征、微血管心绞痛、心肌炎、阵发性房性心动过速(PAT)、结节性动脉周围炎(多动脉炎、结节性多动脉炎)、心包炎、周围血管疾病、严重肢体缺血、静脉炎、肺动脉瓣狭窄(肺动脉狭窄)、雷诺氏病、肾动脉狭窄、肾性高血压、风湿性心脏病、糖尿病血管病变、间隔缺损、无症状心肌缺血、综合征X、心动过速、高安氏动脉炎、Fallot四联症、大血管转位、三尖瓣闭锁、动脉干、心脏瓣膜病、曲张溃疡、静脉曲张、脉管炎、室间隔缺损、Wolff-Parkinson-White综合征、心内膜垫缺损、急性风湿热、急性风湿性心包炎、急性风湿性心内膜炎、急性风湿性心肌炎、慢性风湿性心脏病、二尖瓣疾病、二尖瓣狭窄、风湿性二尖瓣关闭不全、主动脉瓣疾病、其他心内膜结构疾病、缺血性心脏病(急性、亚急性)、心绞痛、急性肺心病、肺栓塞、慢性肺心病、脊柱后侧凸性心脏病、心肌炎、心内膜炎、心内膜心肌纤维化、心内膜纤维弹性组织增生症、房室传导阻滞、心律失常、心肌变性、脑血管疾病、动脉、小动脉和毛细血管疾病、或静脉和淋巴管疾病。
在其它具体的实施方式中，所述疾病或紊乱是脑前动脉闭塞和狭窄，或脑动脉闭塞。在一个方面，本发明提供了治疗脑内和脑部周边血流破坏的个体的方法，例如，由于该个体的脑或中枢神经系统(CNS)内部或周边血流破坏引发的症状或神经功能障碍，其包括对该个体施用治疗有效量的AMDAC。在某些实施方式中，血流破坏导致该个体的脑或CNS缺氧损伤或低氧损伤。
在其它具体的实施方式中，所述疾病或紊乱是周围动脉闭塞和狭窄。在一个方面，本发明提供了治疗肢体内部和周边血流破坏的个体的方法，例如，由于该个体的周围血管系统的内部或周边血流破坏引发的症状或血管缺陷，其包括对该个体施用治疗有效量的AMDAC。在某些实施方式中，血流破坏导致该个体的肢体和或手足缺氧损伤或低氧损伤。
在另一个方面，本发明提供了治疗患有创伤或精神损伤的个体的方法，其包括对所述个体施用一种或多种在此描述的羊膜来源的贴壁细胞，其用药量和时间足以明显改善所述创伤或精神损伤。
在另一个具体的治疗方法实施方式中，所述细胞注射施用至所述个体。在一个更加具体的实施方式中，所述注射为注射入个体心脏的缺血性区域。在另一个特别的治疗方法实施方式中，所述细胞静脉输液施用至所述个体。在另一个特别的治疗方法实施方式中，通过在所述个体中植入如上所述的含有羊膜来源的贴壁细胞的基质或支架，将所述细胞、或所述细胞的群体、或包含所述细胞的细胞群施用至所述个体。
在此提供的分离的羊膜来源的贴壁细胞和细胞群不是诸如描述于美国专利号7,255,879或美国专利申请公布号2007/0275362的分离的胎盘干细胞或细胞群。在此提供的分离的羊膜来源的贴壁细胞也不是内皮祖细胞、羊膜上皮细胞、滋养层、滋养层细胞、胚胎生殖细胞、胚胎干细胞、从胚胎内细胞团获得的细胞、或从胚胎性腺嵴获得的细胞。
在此使用的术语“约”表示，例如，在所述数字或数值10％的范围以内。
在此使用的关于在此描述的羊膜来源的贴壁细胞的术语“血管生成的(angiogenic)”，意为该细胞能够形成血管或血管样芽，或细胞能够促进在另一个细胞群中的血管生成(例如，形成血管或血管样结构)，例如，内皮细胞。
在此使用的术语“血管生成(angiogenesis)”表示血管形成的过程，其包括但不限于，内皮细胞的激活、迁移、增殖，基质重构和细胞稳定化。
在此使用的术语“干细胞”定义了任何给定细胞群的功能属性，其能够广泛增殖但不一定无限增殖，且有助于在胚胎发育或是出生后的组织替代和修复中形成多种组织。
在此使用的术语“祖细胞”定义了任何给定细胞群的功能属性，其能够广泛增殖但不一定无限增殖，且有助于在胚胎发育或是出生后的组织替代和修复中形成相对于干细胞数量有限的多种组织。
在此使用的术语“来源的(derived)”表示分离的或用其它方式纯化的。例如，羊膜来源的贴壁细胞分离自羊膜。术语“来源的”涵盖了培养于直接从诸如羊膜的组织中分离的细胞，以及培养或扩增自初级分离物的细胞。
在此使用的“免疫定位”表示在例如流式细胞术、荧光激活细胞分选、磁性细胞分选、原位杂交、免疫组织化学等中对诸如细胞标记的化合物进行检测，其中使用免疫蛋白，例如，抗体或其片段。
在此使用的术语“分离的细胞”表示一种细胞，其基本上分离自例如细胞从中来源的羊膜或胎盘的其它细胞或组织。如果在例如收集和/或培养细胞的过程中，至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或至少99％的干细胞天然关联的细胞被从该细胞中去除，则认为该细胞是“分离的”。
在此使用的术语“分离的细胞群”表示一种细胞群，其基本上分离自例如细胞群从中来源的羊膜或胎盘的其它细胞或组织。如果在例如收集和/或培养羊膜来源的贴壁细胞的过程中，至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或至少99％的所述细胞群天然关联的细胞或该细胞群从中来源的细胞被从该细胞群中去除，则认为该细胞群是“分离的”。
当一种特殊标记可以通过例如免疫定位或通过流式细胞术或通过RT-PCR被从背景中检出的时候，认为在此使用的细胞对于该特殊标记是“阳性的”。例如，如果可在细胞上检测出CD105明显高于背景的量(相对于，例如，同型对照)，则细胞被描述为对于CD105是阳性的。在例如抗体-介导检测的背景下，“阳性的”作为细胞的特定表面标记存在的一种暗示，意为该标记可用抗体检测，例如，标记特异性的荧光标记抗体；“阳性的”还表示细胞携带该标记，其含量可以在例如细胞计数器中产生信号，其能够在背景中检测到。例如，细胞是“CD105+”，则其中细胞被可检测地标记了CD105特异性抗体，且来自抗体的信号可检测得出高于对照(例如，背景)。相反，在相同语境下，“阴性的”意为相对于背景而言细胞表面标记使用其特异性抗体无法检测。例如，细胞是“CD34-”，则其中细胞不能用CD34特异性抗体标记检测。除非在此另有说明，否则分化抗原(“CD”)标记均使用抗体进行检测。例如，如果OCT-4的mRNA可使用例如30个循环的RT-PCR进行检测，则可以确定存在OCT-4，且细胞是OCT-4+。
4.附图简述
图1显示了羊膜来源的贴壁细胞和NTERA-2细胞的干细胞相关基因表达。
图2显示了羊膜来源的贴壁细胞(AMDAC)的细胞表面的TEM-7表达。
图3显示了羊膜来源的贴壁细胞分泌选定的血管生成蛋白。
图4显示了羊膜来源的贴壁细胞条件化培养基对人内皮细胞(HUVEC)管腔形成的血管生成效果。
图5显示了羊膜来源的贴壁细胞条件化培养基对人内皮细胞迁移的血管生成效果。
图6显示了羊膜来源的贴壁细胞条件化培养基对人内皮细胞增殖的效果。
图7显示了HUVEC和羊膜来源的贴壁细胞对乙酰化LDL的吸收。
图8显示了HUVEC和羊膜来源的贴壁细胞的管腔形成。
图9显示了在低氧和常氧条件下羊膜来源的贴壁细胞VEGF和IL-8的分泌。
图10显示了在常氧(约21％O2)和低氧(低于约5％O2)条件下细胞标记Tie2的表达。Y轴：经流式细胞术测定的Tie2阳性的细胞百分比。
图11显示了羊膜来源的贴壁细胞的成心肌细胞分化潜能，其中AM表示羊膜来源的贴壁细胞(AMDAC)，HD表示未处理的悬滴，HD IND表示暴露于诱导条件的悬滴，以及HD IND+5-AZA表示在5-氮杂胞苷存在或缺失的情况下的诱导。CTRL表示未处理的悬滴对照。
图12显示了在鸡胚绒膜尿囊血管生成模型中AMDAC对血管生成的正向效果。Lot1、Lot 2、Lot 3：来自三种不同的细胞制备物的AMDAC。bFGF：碱性成纤维细胞生长因子(阳性对照)。MDAMB231：血管生成性乳腺癌细胞系(阳性对照)。Y轴：血管形成度。
图13显示了在鸡胚绒膜尿囊血管生成模型中AMDAC-条件化培养基对血管生成的正向效果。Lot 1、Lot 2、Lot 3：来自三种不同的细胞制备物的AMDAC。bFGF：碱性成纤维细胞生长因子(阳性对照)。MDAMB231：血管生成性乳腺癌细胞系(阳性对照)。Y轴：血管形成度。
图14A、14B：存在于星形细胞培养物、星形细胞和骨髓来源的间质干细胞(BM-MSC)共培养物、或星形细胞和AMDAC共培养物的过氧化氢产生的活性氧。14A：AMDAC，Lot 1；14B：AMDAC，Lot 2。单独的HA(人星形细胞)、星形细胞+H2O2、和星形细胞+BM-MSC+H2O2的条件对于图14A和14B而言是相同的。RFU ROS活性：活性氧的相对荧光单位。
5.发明详述
5.1羊膜来源的贴壁细胞的特性
本发明提供了独特的贴壁血管生成细胞及该细胞的群体，其分离自羊膜，在此称为“羊膜来源的贴壁细胞”或AMDAC。羊膜来源的贴壁细胞在表观上与间质细胞有些相似，其具有大致为成纤维样的形状。该细胞附着于细胞培养物表面，例如，组织培养塑料。
AMDAC能展示将其区别于其它羊膜来源或胎盘来源的细胞的细胞标记。例如，在一个实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞经RT-PCR测定是OCT-4-(八聚体结合蛋白4)。在另一个具体的实施方式中，OCT-4-羊膜来源的贴壁细胞经免疫定位测定是CD49f+。在另一个具体的实施方式中，所述OCT-4-细胞经RT-PCR测定是HLA-G-。在另一个具体的实施方式中，OCT-4-细胞经免疫定位测定是VEGFR1/Flt-1+(血管内皮生长因子受体1)和/或VEGFR2/KDR+(血管内皮生长因子受体2)。在一个具体的实施方式中，OCT-4-羊膜来源的贴壁细胞或OCT-4-羊膜来源的贴壁细胞群，在例如＞20个循环的PCR-扩增下，比具有等价细胞数量和RNA扩增循环数的NTERA-2细胞或NTERA-2细胞群少表达至少2log的PCR扩增的OCT-4mRNA。在另一个具体的实施方式中，所述OCT-4-细胞是CD90+、CD105+、或CD117-。在一个更加具体的实施方式中，所述OCT-4-细胞是CD90+、CD105+、和CD117-。在一个更加具体的实施方式中，细胞是OCT-4-或HLA-G-，并且还是CD49f+、CD90+、CD105+、和CD117-。在一个更加具体的实施方式中，细胞是OCT-4-，HLA-G-、CD49f+、CD90+、CD105+、和CD117-。在另一个具体的实施方式中，OCT-4-细胞例如经30个循环的RT-PCR测定不表达SOX2。在一个具体的实施方式中，细胞经免疫定位或流式细胞术测定是OCT-4-、CD49f+、CD90+、CD105+、和CD117-，和经例如30个循环的的RT-PCR测定是SOX2-。
在另一个实施方式中，所述OCT-4-细胞经免疫定位测定是CD29+、CD73+，ABC-p+、和CD38-中的一种或多种。
在另一个具体的实施方式中，例如，OCT-4-AMDAC经免疫定位测定可以还是CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、TEM-7+(肿瘤内皮细胞标志物7)、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-(血管紧张素I转换酶，ACE)、CD146-(黑色素瘤细胞粘附分子)、或CXCR4-(趋化因子(C-X-C基序)受体4)中的一种或多种，或经RT-PCR测定是HLA-G-。在一个更加具体的实施方式中，所述细胞经免疫定位测定为CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、和CXCR4-，和经RT-PCR测定为HLA-G-。在一个实施方式中，在此提供的羊膜来源的贴壁细胞为CD31-、CD34-、CD45-、和/或CD133-中的一种或多种。在一个具体的实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞经RT-PCR测定是OCT-4-；经免疫定位测定是VEGFR1/Flt-1+和/或VEGFR2/KDR+；以及CD31-、CD34-、CD45-、和/或CD133-中的一种或多种或全部。
在另一个具体的实施方式中，所述细胞经免疫定位测定还为VE-钙粘蛋白-。在另一个具体的实施方式中，所述细胞经免疫定位测定还另外对CD105+和CD200+呈阳性。在另一个具体的实施方式中，所述细胞在暴露于1-100ng/mL的VEGF下4-21天后经免疫定位测定不表达CD34。在更加具体的实施方式中，所述细胞在暴露于25-75ng/mL的VEGF下4-21天、或50ng/mL的VEGF下4-21天后经免疫定位测定不表达CD34。在更加具体的实施方式中，所述细胞在暴露于1、2.5、5、10、25、50、75或100ng/mL VEGF下4-21天后经免疫定位测定不表达CD34。在更加具体的实施方式中，所述细胞在暴露于1-100ng/mL的VEGF下7-14天，例如，7天后，经免疫定位测定不表达CD34。
在具体的实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞经RT-PCR测定是OCT-4-，和经免疫定位测定是VE-钙粘蛋白-、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、和/或CD200+中的一种或多种。在一个具体的实施方式中，羊膜来源的细胞经RT-PCR测定是OCT-4-，和经免疫定位测定是VE-钙粘蛋白-、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、和CD200+。在另一个具体的实施方式中，所述细胞在例如暴露于1-100ng/mL的VEGF下4-21天后经免疫定位测定不表达CD34。
在另一个实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞是OCT-4-、CD49f+、HLA-G-、CD90+、CD105+、和CD117-。在一个更加具体的实施方式中，所述细胞经免疫定位测定为CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、或CXCR4-中的一种或多种。在一个更加具体的实施方式中，所述细胞经免疫定位测定为CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、和CXCR4-。在另一个具体的实施方式中，所述细胞经免疫定位测定还为VEGFR1/Flt-1+和/或VEGFR2/KDR+；以及经免疫定位测定为CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、和/或Tie-2-中的一种或多种。在另一个具体的实施方式中，所述细胞经免疫定位测定还为VEGFR1/Flt-1+、VEGFR2/KDR+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、和Tie-2-。
在另一个实施方式中，OCT-4-羊膜来源的贴壁细胞经免疫定位测定还是CD9+、CD10+、CD44+、CD49f+、CD54+、CD90+、CD98+、CD105+、CD200+、Tie-2+、TEM-7+、VEGFR1/Flt-1+、和/或VEGFR2/KDR+(CD309+)中的一种或多种或全部；或经免疫定位测定还是CD31-、CD34-、CD38-、CD45-、CD117-、CD133-、CD143-、CD144-、CD146-、CD271-、CXCR4-、HLA-G-、和/或VE-钙粘蛋白-中的一种或多种或全部，或经RT-PCR测定为SOX2-。
在某些实施方式中，附着于组织培养塑料的分离的羊膜来源的贴壁细胞是CD49f+。在一个具体的实施方式中，所述CD49f+细胞经免疫定位测定还是CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD90+、CD98+、CD105+、CD200+、Tie-2+、TEM-7+、VEGFR1/Flt-1+、和/或VEGFR2/KDR+(CD309+)中的一种或多种或全部；或经免疫定位测定还是CD31-、CD34-、CD38-、CD45-、CD117-、CD133-、CD143-、CD144-、CD146-、CD271-、CXCR4-、HLA-G-、OCT-4-和/或VE-钙粘蛋白-中的一种或多种或全部，或经RT-PCR测定为SOX2-。
在某些其它的实施方式中，分离的组织培养塑料附着的羊膜来源的贴壁细胞是HLA-G-、CD90+和CD117-。在一个具体的实施方式中，所述HLA-G-、CD90+和CD117-细胞经免疫定位测定还是CD9+、CD10+、CD44+、CD49f+、CD54+、CD98+、CD105+、CD200+、Tie-2+、TEM-7+、VEGFR1/Flt-1+、和/或VEGFR2/KDR+(CD309+)中的一种或多种或全部；或经免疫定位测定还是CD31-、CD34-、CD38-、CD45-、CD133-、CD143-、CD144-、CD146-、CD271-、CXCR4-、OCT-4-和/或VE-钙粘蛋白-中的一种或多种或全部，或经RT-PCR测定为SOX2-。
在另一个实施方式中，标准培养条件下经例如30个循环的RT-PCR测定，分离的羊膜来源的贴壁细胞或羊膜来源的血管生成细胞群不能组成型地表达以下的mRNA：成纤维细胞生长因子4(FGF4)、干扰素γ(IFNG)、趋化因子(C-X-C基序)配体10(CXCL10)、血管生成素4(ANGPT4)、血管生成素样3(ANGPTL3)、纤维蛋白原α链(FGA)、瘦素(LEP)、催乳素(PRL)、前动力蛋白1(PROK1)、腱调蛋白(TNMD)、FMS样酪氨酸激酶3(FLT3基因)、胞外连接域容纳1(XLKD1)、钙粘蛋白5、2型(CDH5)、白细胞衍生的趋化因子1(LECT1)、纤溶酶原(PLG)、端粒酶逆转录酶(TERT)、(性别决定区Y)-盒2(SOX2)、NANOG、基质金属蛋白酶13(MMP-13)、无远端同源(distal-less homeobox)5(DLX5)、和/或骨γ-羧基谷氨酸(GLA)蛋白(BGLAP)。在其它实施方式中，分离的羊膜来源的贴壁细胞或羊膜来源的血管生成细胞群表达以下的mRNA：(ARNT2)、神经生长因子(NGF)、脑衍生的神经营养因子(BDNF)、神经胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、神经营养因子3(NT-3)、NT-5、缺氧诱导因子1α(HIF1A)、缺氧诱导蛋白2(HIG2)、血红素氧化酶(脱环)1(HMOX1)、胞外超氧化物歧化酶[Cu-Zn](SOD3)、过氧化氢酶(CAT)、转化生长因子β1(TGFB1)、转化生长因子β1受体(TGFB1R)、和肝细胞生长因子受体(HGFR/c-met)。
在另一个方面，本发明提供了含有在此描述的羊膜来源的贴壁细胞的分离的细胞群。细胞群可以是同类群体，例如，细胞群中至少约90％、95％、98％或99％为羊膜来源的贴壁细胞。细胞群可以是混合的，例如，细胞群中最多约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的细胞是羊膜来源的贴壁细胞。然而，分离的细胞群不是组织，即，不是羊膜。
在一个实施方式中，本发明提供了一种含AMDAC的分离的细胞群，例如，基本上均匀的AMDAC细胞群，其中所述AMDAC附着于组织培养塑料，且其中所述AMDAC经RT-PCR测定是OCT-4-。在一个具体的实施方式中，AMDAC例如经免疫定位或RT-PCR测定是CD49f+或HLA-G+。在另一个具体的实施方式中，所述AMDAC群体经免疫定位测定是VEGFR1/Flt-1+和/或VEGFR2/KDR+，其中所述分离的细胞群不是羊膜(amnion/amniotic membrane)。在一个更加具体的实施方式中，AMDAC经RT-PCR测定是OCT-4-和/或HLA-G-，和经免疫定位测定是VEGFR1/Flt-1+和/或VEGFR2/KDR+。在一个具体的实施方式中，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的细胞是所述羊膜来源的贴壁细胞。在另一个具体的实施方式中，所述AMDAC是CD90+、CD105+、或CD117-。在一个更加具体的实施方式中，所述AMDAC是CD90+、CD105+、和CD117-。在一个更加具体的实施方式中，AMDAC是OCT-4-、CD49f+、CD90+、CD105+、和CD117-。在另一个具体的实施方式中，AMDAC例如经30个循环的RT-PCR测定不表达SOX2。在一个更加具体的实施方式中，该群体含有AMDAC，且其中所述AMDAC经免疫定位或流式细胞术测定是OCT-4-、HLA-G-、CD49f+、CD90+、CD105+和CD117-，以及例如经30个循环的RT-PCR测定是SOX2-。
在另一个具体的实施方式中，在所述细胞群中的所述AMDAC经免疫定位或流式细胞术测定是CD90+、CD105+、或CD117-。在一个更加具体的实施方式中，AMDAC经免疫定位或流式细胞术测定是CD90+、CD105+、和CD117-。在一个更加具体的实施方式中，AMDAC例如经RT-PCR测定是OCT-4-或HLA-G-，且经免疫定位或流式细胞术测定还是CD49f+、CD90+、CD105+、和CD117-。在一个更加具体的实施方式中，在所述细胞群中的AMDAC是OCT-4-、HLA-G-、CD49f+、CD90+、CD105+、和CD117-。在另一个具体的实施方式中，AMDAC例如经30个循环的RT-PCR测定不表达SOX2。在一个更加具体的实施方式中，细胞经免疫定位或流式细胞术测定是OCT-4-、CD49f+、CD90+、CD105+、和CD117-，和经例如30个循环的RT-PCR测定是SOX2-。在一个更加具体的实施方式中，AMDAC是OCT-4-或HLA-G-，和另外是CD49f+、CD90+、CD105+、和CD117-。在一个更加具体的实施方式中，AMDAC是OCT-4-、HLA-G-、CD49f+、CD90+、CD105+、和CD117-。
在另一个实施方式中，在所述细胞群中的羊膜来源的贴壁细胞附着于组织培养塑料，其经RT-PCR测定为OCT-4-，和免疫定位测定经VEGFR1/Flt-1+和/或VEGFR2/KDR+，且经免疫定位测定还为CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、或CXCR4-中的一种或多种，或经RT-PCR测定为HLA-G-，且其中所述分离的细胞群不是羊膜。在另一个实施方式中，本发明提供了一种分离的细胞群，包含一种羊膜来源的贴壁细胞，其中所述细胞附着于组织培养塑料，其中所述细胞经RT-PCR测定是OCT-4-，和经免疫定位测定是VEGFR1/Flt-1+和/或VEGFR2/KDR+，其中所述细胞在暴露于1-100ng/mL的VEGF下4-21天后经免疫定位测定不表达CD34，且其中所述分离的细胞群不是羊膜。在任一上述实施方式的具体的实施方式中，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的细胞是所述羊膜来源的贴壁细胞。
在另一个实施方式中，任何上述含有羊膜来源的贴壁细胞的细胞群在胞外基质蛋白或血管生成因子存在的条件下培养时都形成芽或管状结构，胞外基质蛋白为例如I和IV型胶原蛋白，血管生成因子为例如血管内皮生长因子(VEGF)、上皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，细胞群在例如胎盘胶原蛋白或例如MATRIGELTM的基质内或基质上培养至少4天到多至14天。
羊膜来源的贴壁细胞和羊膜来源的贴壁细胞群显示能够表达涉及血管生成相关或心肌生成相关基因的蛋白的特性。在某些实施方式中，本发明提供了一种细胞或一种细胞群，其中所述分离的细胞群中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的细胞是羊膜来源的贴壁细胞，其表达以下的RNA中的一种或更多或全部：ACTA2(肌动蛋白、α2、平滑肌、主动脉)、ADAMTS1(具有凝血酶致敏蛋白1型基序的ADAM金属肽酶)、AMOT(血管抑素结合蛋白)、ANG(血管生成素)、ANGPT1(促血管新生蛋白因子1)、ANGPT2、ANGPTL1(促血管新生蛋白因子样1)、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1(脑特异性血管生成抑制剂1)、CD44、CD200、CEACAM1(癌胚抗原相关的细胞粘附分子1)、CHGA(嗜铬粒蛋白A)、COL15A1(胶原蛋白，XV型，α1)、COL18A1(胶原蛋白，XVIII型，α1)、COL4A1(胶原蛋白，IV型，α1)、COL4A2(胶原蛋白，IV型，α2)、COL4A3(胶原蛋白，IV型，α3)、CSF3(菌落刺激因子3(粒细胞)、CTGF(结缔组织生长因子)、CXCL12(趋化因子(CXC基序)配体12(基质细胞衍生因子1))、CXCL2、DNMT3B(DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶3β)、ECGF1(胸腺嘧啶磷酸化酶)、EDG1(内皮细胞分化基因1)、EDIL3(EGF样重复和盘菌素I样域3)、ENPP2(外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶2)、EPHB2(EPH受体B2)、FBLN5(FIBULIN 5)、F2键(凝血因子II(凝血酶))、FGF1(酸性成纤维细胞生长因子)、FGF2(碱性成纤维细胞生长因子)、FIGF(c-fos诱导的生长因子(血管内皮生长因子D))、FLT4(fms-相关的酪氨酸激酶4)、FN1(纤维连接蛋白1)、FST(卵泡抑素)、FOXC2(叉头框C2(MFH-1、间质细胞叉头1))、GRN(颗粒体蛋白)、HGF(肝细胞生长因子)、HEY1(YRPW相关发状/分裂增强子基序1)、HSPG2(硫酸乙酰肝素蛋白多糖2)、IFNB1(干扰素，β1，成纤维细胞)、IL8(白细胞介素8)、IL12A、ITGA4(整联蛋白，α4；CD49d)、ITGAV(整联蛋白，αV)、ITGB3(整联蛋白，β3)、MDK(肝素结合细胞因子)、MMP2(基质金属蛋白酶2)、MYOZ2(myozenin 2)、NRP1(神经毡蛋白1)、NRP2、PDGFB(血小板衍生的生长因子β)、PDGFRA基因(血小板衍生的生长因子受体α)、PDGFRB、PECAM1(血小板/内皮细胞粘附分子)、PF4(血小板因子4)、PGK1(磷酸甘油酸激酶1)、PROX1(prospero同源异形盒1)、PTN(多效蛋白)、SEMA3F(semophorin 3F)、SERPINB5(丝氨酸蛋白酶抑制蛋白肽酶抑制剂，分支乙(卵清蛋白)，成员5)、SERPINC1、SERPINF1、TIMP2(组织金属蛋白酶2组织抑制剂)、TIMP3、TGFA(转化生长因子，α)、TGFB1、THBS1(凝血酶致敏蛋白1)、THBS2、TIE1(免疫球蛋白样酪氨酸激酶和EGF样域1)、TIE2/TEK、TNF(肿瘤坏死因子)、TNNI1(肌钙蛋白I，1型)、TNFSF15(肿瘤坏死因子(配体)超家族，成员15)、VASH1(血管抑制蛋白1)、VEGF(血管内皮生长因子)、VEGFB、VEGFC、VEGFR1/FLT1(血管内皮生长因子受体1)、和/或VEGFR2/KDR。
当使用人细胞时，全部的指定基因均表示人源序列，且如本领域技术人员熟知的，代表性的序列可以在文献或在GenBank中找到。这些序列的探针可以通过公共可获得的序列进行决定，或通过商业来源，例如，特异性探针或血管生成阵列(Applied Biosystems，商品号4378710)。
羊膜来源的贴壁细胞和羊膜来源的贴壁细胞群显示能够表达血管生成相关蛋白的特性。在某些实施方式中，本发明提供了一种细胞或一种细胞群，其中所述分离的细胞群中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的细胞是羊膜来源的贴壁细胞，其表达CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、β2-微球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳凝素-1、ADAM17前体(A脱整联蛋白及金属蛋白酶域17)(TNF-α转化酶)(TNF-α转化酶)、血管紧张肽原前体、细丝蛋白A(α-细丝蛋白)(细丝蛋白1)(内皮肌动蛋白结合蛋白)(ABP-280)(非肌肉细丝蛋白)、α-辅肌动蛋白1(α-辅肌动蛋白细胞骨架亚型)(非肌肉α-辅肌动蛋白1)(F-肌动蛋白交联蛋白)、低密度脂蛋白受体相关的蛋白2前体(巨蛋白)(糖蛋白330)(gp330)、I和II型巨噬细胞清道夫受体(巨噬细胞乙酰化的LDL受体I和II)、活化素受体IIB型前体(ACTR-IIB)、Wnt-9蛋白、胶质原纤维酸性蛋白、星形细胞(GFAP)、肌凝蛋白结合的蛋白C、心-型(心MyBP-C)(C-蛋白、心肌亚型)、和/或肌球蛋白重链、非肌肉A型(细胞肌球蛋白重链，A型)(非肌肉肌球蛋白重链-A)(NMMHC-A)。
在此提供的羊膜来源的贴壁细胞进一步在例如内皮细胞、内皮祖细胞等细胞内分泌促进血管生成的蛋白。在某些实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞、羊膜来源的贴壁细胞群、或含有羊膜来源的贴壁细胞的细胞群，例如，其中所述分离的细胞群中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的细胞是羊膜来源的贴壁细胞，向例如细胞或细胞群生长的培养基中分泌VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、半乳凝素-1中的一种或多种或全部。
在另一个实施方式中，任何上述含有羊膜来源的贴壁细胞的细胞群能够导致在与所述羊膜来源的贴壁细胞接触的内皮细胞群中形成芽或管样结构。在一个具体的实施方式中，例如在诸如I和IV型的胶原蛋白，和/或诸如血管内皮生长因子(VEGF)、上皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)胞外基质蛋白等血管生成因子的存在下，例如，在例如胎盘胶原蛋白的基质内或基质上或MATRIGELTM中培养至少4天和/或多至14天后，羊膜来源的血管生成细胞与人内皮细胞进行共培养形成芽或管样结构或支撑内皮细胞出芽。
在另一个实施方式中，任何上述含有羊膜来源的贴壁细胞的细胞群在诸如胶原蛋白I和IV型的胞外基质蛋白存在下，在例如胎盘胶原蛋白的基质内或基质上或MATRIGELTM中培养时，分泌诸如血管内皮生长因子(VEGF)、上皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、或白细胞介素-8(IL-8)等血管生成因子，并从而能够诱导人内皮细胞形成芽或管样结构。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种细胞群，例如，羊膜来源的贴壁细胞群；或一种细胞群，其中所述分离的细胞群中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的细胞是羊膜来源的贴壁细胞，其表达血管生成的微RNA(miRNA)的水平高于骨髓来源的间质干细胞，其中所述miRNA包括miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、和/或miR-296中的一种或更多或全部。在另一个实施方式中，本发明提供了一种细胞群，例如，羊膜来源的贴壁细胞群；或一种细胞群，其中所述分离的细胞群中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的细胞是羊膜来源的贴壁细胞，其表达一种或更多或全部血管生成微RNA(miRNA)的水平低于骨髓来源的间质干细胞，其中所述miRNA包括miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b、和/或miR-16中的一种或更多或全部。在某些实施方式中，AMDAC或AMDAC群体表达一种或多种或全部的血管生成miRNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、(血管生成miRNA簇17-92的成员)、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、和/或miR-16。
在一个实施方式中，本发明提供了一种分离的羊膜来源的贴壁细胞，其中所述细胞附着于组织培养塑料，且其中所述细胞经RT-PCR测定是OCT-4-，和经免疫定位测定是CD49f+、HLA-G-、CD90+、CD105+、和CD117-，且其中所述细胞：(a)经免疫定位测定表达CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1、或VEGFR2/KDR(CD309)中的一种或多种；(b)经免疫定位测定不表达CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G、或VE-钙粘蛋白，或经RT-PCR测定不表达SOX2；(c)表达以下的mRNA：ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、CD44、CD200、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP1、NRP2、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAM1、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TIMP2、TIMP3、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIE2/TEK、TNF、TNNI1、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC、VEGFR1/FLT1、或VEGFR2/KDR；(d)表达蛋白质CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、β2-微球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳凝素-1、ADAM 17、血管紧张肽原前体、细丝蛋白A、α-辅肌动蛋白1、巨蛋白、巨噬细胞乙酰化的LDL受体I和II、活化素受体IIB型前体、Wnt-9蛋白、胶质原纤维酸性蛋白、星形细胞、肌凝蛋白结合的蛋白C、或肌球蛋白重链，非肌肉A型中的一种或多种；(e)分泌VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、或半乳凝素-1至细胞生长的培养基中；(f)表达微RNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、或miR-296的水平高于数量相当的骨髓来源的间质干细胞；(g)表达微RNA：miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b、或miR-16的水平低于数量相当的骨髓来源的间质干细胞；(h)表达miRNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、或miR-16；和/或(i)较之在21％O2下表达CD202b、IL-8或VEGF而言，当培养于低于约5％O2时表达增加水平的CD202b、IL-8或VEGF。在一个具体的实施方式中，分离的羊膜来源的贴壁细胞经RT-PCR测定是OCT-4-，和经免疫定位测定是CD49f+、HLA-G-、CD90+、CD105+、和CD117-，和(a)经免疫定位测定表达CD9、CD10、CD44、CD54、CD90、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1、和/或VEGFR2/KDR(CD309)；(b)经免疫定位测定不表达CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G、和/或VE-钙粘蛋白，或经RT-PCR测定不表达SOX2；(c)表达以下的mRNA：ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、CD44、CD200、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP1、NRP2、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAM1、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TIMP2、TIMP3、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIE2/TEK、TNF、TNNI1、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC、VEGFR1/FLT1、和/或VEGFR2/KDR；(d)表达CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、β2-微球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳凝素-1、ADAM 17、血管紧张肽原前体、细丝蛋白A、α-辅肌动蛋白1、巨蛋白、巨噬细胞乙酰化的LDL受体I和II、活化素受体IIB型前体、Wnt-9蛋白、胶质原纤维酸性蛋白、星形细胞、肌凝蛋白结合的蛋白C、和/或肌球蛋白重链，非肌肉A型中的一种或多种；(e)分泌VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、和/或半乳凝素-1，例如至细胞生长的培养基中；(f)表达微RNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、和/或miR-296的水平高于数量相当的骨髓来源的间质干细胞；(g)表达微RNA：miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b、和/或miR-16的水平低于数量相当的骨髓来源的间质干细胞；(h)表达miRNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、和/或miR-16；和/或(i)较之在21％O2下表达CD202b、IL-8或VEGF而言，当培养于低于约5％O2时表达增加水平的CD202b、IL-8或VEGF。进一步本发明提供了包含AMDAC的细胞群，例如AMDAC群体，其具有一种或多种的上述特性。
在另一个实施方式中，任何上述含有羊膜来源的贴壁细胞的细胞群分泌血管生成因子。在具体的实施方式中，细胞群分泌血管内皮生长因子(VEGF)、上皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、和/或白细胞介素-8(IL-8)。在其它具体的实施方式中，含有羊膜来源的血管生成细胞的细胞群分泌一种或更多血管生成因子，从而诱导人内皮细胞在体外创伤愈合分析中进行迁移。在其它具体的实施方式中，含有羊膜来源的贴壁细胞的细胞群诱导人内皮细胞、内皮祖细胞、肌细胞或成肌细胞的成熟、分化或增殖。
在另一个实施方式中，任何上述含有羊膜来源的贴壁细胞的细胞群在诸如胶原蛋白I和IV型的胞外基质蛋白和/或一种或更多诸如VEGF、EGF、PDGF或bFGF等血管生成因子存在下，在例如胎盘胶原蛋白或MATRIGELTM的基质上培养时，吸收乙酰化低密脂蛋白(LDL)。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种含有羊膜来源的贴壁细胞的细胞群，其中所述细胞附着于组织培养塑料，且其中所述细胞经RT-PCR测定是OCT-4-，和经免疫定位测定是VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、或VE-钙粘蛋白-。在具体的实施方式中，在所述细胞群中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的细胞是羊膜来源的细胞，其经RT-PCR测定为OCT-4-，和经免疫定位测定为VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、或VE-钙粘蛋白-。在另一个具体的实施方式中，所述群体中的细胞中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％是羊膜来源的细胞，其经RT-PCR测定为OCT-4-，和经免疫定位测定为VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、和VE-钙粘蛋白-。在另一个具体的实施方式中，所述经RT-PCR测定是OCT-4-和经免疫定位测定是VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、或VE-钙粘蛋白-的细胞，在暴露于1-100ng/mL的VEGF下4-21天后经免疫定位测定不表达CD34。在另一个具体的实施方式中，所述细胞还为VE-钙粘蛋白-。
在此提供的细胞群，包含羊膜来源的贴壁细胞，能够形成芽或管样结构，类似于血管或脉管。在一个实施方式中，在诸如VEGF，EGF，PDGF或bFGF的血管生成部分(moiety)存在下培养时，含有羊膜来源的贴壁细胞的细胞群形成芽或管样结构。在一个更加具体的实施方式中，所述经RT-PCR测定OCT-4-和经免疫定位测定VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、或VE-钙粘蛋白-的羊膜来源的细胞，当所述细胞群在血管内皮生长因子(VEGF)存在下培养时形成芽或管样结构。
在此描述的羊膜来源的贴壁细胞在原代培养或在适合干细胞培养的培养基中增殖的过程中表现出上述特性，例如，细胞表面标记和/或基因表达谱，和/或血管生成能力和功能的组合。所述培养基包括，例如，含有1-100％DMEM-LG(Gibco)、1-100％MCDB-201(Sigma)、1-10％胎牛血清(FCS)(Hyclone Laboratories)、0.1-5×胰岛素-转铁因子-硒补充剂(ITS，Sigma)、0.1-5×亚油酸-牛血清白蛋白(LA-BSA，Sigma)、10-5-10-15M地塞米松(Sigma)、10-2-10-10M抗坏血酸2-磷酸盐(Sigma)、1-50ng/mL表皮生长因子(EGF)(R&DSYSTEMS)、1-50ng/mL血小板衍生的生长因子(PDGF-BB)(R&D SYSTEMS)、和100U青霉素/1000U链霉素的培养基。在一个具体的实施方式中，培养基含有60％DMEM-LG(Gibco)、40％MCDB-201(Sigma)、2％胎牛血清(FCS)(Hyclone Laboratories)、1×胰岛素-转铁因子-硒补充剂(ITS)、1×亚油酸牛血清白蛋白(LA-BSA)、10-9M地塞米松(Sigma)、10-4M抗坏血酸2-磷酸盐(Sigma)、表皮生长因子(EGF)10ng/ml(R&D SYSTEMS)、血小板衍生的生长因子(PDGF-BB)10ng/ml(R&D SYSTEMS)、和100U青霉素/1000U链霉素。其它合适的培养基如下详述。
在此提供的分离的羊膜来源的贴壁细胞群可以例如在一个容器中包含约、至少约、或不多于约1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011或更多羊膜来源的贴壁细胞。在不同的实施方式中，在此提供的分离的细胞群中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％的细胞为羊膜来源的贴壁细胞。即，分离的羊膜来源的贴壁细胞群可以包括，例如，多达1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的非干细胞。
在此提供的羊膜来源的贴壁细胞可在基质上培养。在不同的实施方式中，该基质可以是任何表面，其上可以进行羊膜来源的贴壁细胞的培养和/或筛选。一般，该基质是塑料，例如，组织培养皿或多孔板塑料。可使用生物分子或合成模拟试剂对组织培养塑料进行处理、包被或印迹，例如，CELLTARTTM、MESENCULTTM ACF-底物、鸟氨酸、或聚赖氨酸，或胞外基质蛋白，例如，胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、玻璃体粘连蛋白等。
羊膜来源的细胞，例如，在此提供的羊膜来源的贴壁细胞及该细胞群，可以分离自一种或更多的胎盘。例如，在此提供的分离的羊膜来源的细胞群可以是胎盘细胞群，包含那些来自于或包含于破碎的羊膜组织的细胞，例如，组织消化物(即，通过酶促消化羊膜收集细胞)，其中所述细胞群富集了羊膜来源的细胞，且其中组织来自于单一胎盘或来自两个或更多胎盘。分离的羊膜来源的细胞可被培养和扩增以产生所述细胞群。含有羊膜来源的贴壁细胞的胎盘细胞群也可被培养和扩增以产生羊膜来源的贴壁细胞群。
在某些实施方式中，展示任何上述标记和/或基因表达特性的AMDAC已被传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次，或更多。在某些其它的实施方式中，展示任何上述标记和/或基因表达特性的AMDAC已在培养物中传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或至少50次，或更多。
5.2含有其它细胞类型的羊膜来源的贴壁细胞群
含有在此描述的羊膜来源的贴壁细胞的分离的细胞群可以包含第二种细胞类型，例如，不是羊膜来源的贴壁细胞的胎盘细胞，或者，例如，不是胎盘细胞的细胞。例如，分离的羊膜来源的贴壁细胞群可以包含，例如，可以与第二种细胞类型的群体组合，其中所述第二种细胞类型为，例如，胚胎干细胞；血细胞(例如，胎盘血、胎盘血细胞、脐带血、脐带血细胞、周边血、周边血细胞，来自胎盘血、脐带血、或周边血的有核细胞、等等)；分离自血液的干细胞(例如，分离自胎盘血、脐带血或周边血的干细胞)；胎盘干细胞(例如，描述于美国专利号7,468,276和美国专利申请公布号2007/0275362的胎盘干细胞，其公开内容全文引入作为参考)；来自胎盘灌流液的有核细胞，例如，来自胎盘灌流液的总有核细胞；脐带血干细胞；血液来源的有核细胞群；骨髓来源的间质细胞；骨髓来源的间质干细胞；骨髓来源的造血干细胞；粗骨髓；成体(体)干细胞；组织中包含的干细胞群；培养的细胞，例如，培养的干细胞；全分化细胞群(例如，软骨细胞、成纤维细胞、羊膜细胞、格根包尔氏细胞、肌细胞、心肌细胞，等)；周边细胞，等等。在一个具体的实施方式中，含有羊膜来源的贴壁细胞的细胞群包含胎盘干细胞或来自脐带血的干细胞。在某些实施方式中，第二种细胞类型是血液或血细胞，其中红细胞已经从细胞群中移除。
在一个具体的实施方式中，第二种细胞类型是造血干细胞。该造血干细胞可以是存在于，例如，未加工的胎盘、脐带血或周边血中；来自胎盘血、脐带血或周边血的总有核细胞中；分离自胎盘血、脐带血或周边血的CD34+细胞群中；未加工的骨髓中；来自骨髓的总有核细胞中；分离自骨髓CD34+细胞群中，等。
在另一个实施方式中，分离的羊膜来源的贴壁细胞群与来自血管系统的多个成体细胞或祖细胞组合。在不同的实施方式中，所述细胞为内皮细胞、内皮祖细胞、肌细胞、成心肌细胞、周边细胞、成血管细胞、成肌细胞或心成肌细胞。
在另一个实施方式中，第二种细胞类型为培养中经处理的非胚胎细胞类型，以表达与胚胎干细胞相关的多能性和功能标记。
在上述分离的羊膜来源的贴壁细胞群的具体的实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞和第二种类型的细胞的其一或全部对于细胞的预定接受者而言为自体同源的或为异源的。
在此进一步提供了一种组合物，其包含羊膜来源的贴壁细胞和除羊膜来源的贴壁细胞外的多种干细胞。在一个具体的实施方式中，所述组合物包含一种干细胞，其来自胎盘，即，胎盘干细胞，例如，描述于美国专利号7,045,148、7,255,879、和7,311,905；和美国专利申请公布号2007/0275362的胎盘干细胞，任何上述文献公开的内容在此全文引入作为参考。在具体的实施方式中，所述胎盘干细胞是CD200+和HLA-G+；CD73+、CD105+和CD200+；CD200+和OCT-4+；CD73+、CD105+和HLA-G+；CD73+和CD105+，并且，当所述群体在允许形成拟胚体的条件下培养时有利于在含有所述干细胞的胎盘细胞群中形成一种或更多拟胚体；或OCT-4+，并且，当所述群体在允许形成拟胚体的条件下培养时有利于在含有所述干细胞的胎盘细胞群中形成一种或更多拟胚体；或其任意组合。在一个更加具体的实施方式中，所述CD200+、HLA-G+干细胞是CD34-、CD38-、CD45-、CD73+和CD 105+。在另一个更具体的实施方式中，所述CD73+、CD105+和CD200+干细胞是CD34-、CD38-、CD45-和HLA-G+。在另一个更具体的实施方式中，所述CD200+、OCT-4+干细胞是CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+和HLA-G+。在另一个更具体的实施方式中，所述CD73+、CD105+和HLA-G+干细胞是CD34-、CD45-、OCT-4+和CD200+。在另一个更具体的实施方式中，所述CD73+和CD105+干细胞是OCT-4+、CD34-、CD38-和CD45-。在另一个更具体的实施方式中，所述OCT-4+干细胞是CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-、和CD45-。在另一个更具体的实施方式中，胎盘干细胞是来源于母亲的(即，具有母亲的基因型)。在另一个更具体的实施方式中，胎盘干细胞是来源于父亲的(即，具有父亲的基因型)。
在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含羊膜来源的贴壁细胞和胚胎干细胞。在另一个具体的实施方式中，组合物包含羊膜来源的贴壁细胞和间质细胞或干细胞，例如，骨髓来源的间质细胞或干细胞。在另一个具体的实施方式中，组合物包含骨髓来源的造血干细胞。在另一个具体的实施方式中，组合物包含羊膜来源的贴壁细胞和造血祖细胞，例如，来自骨髓、胎血、脐带血、胎盘血、和/或周边血的造血祖细胞。在另一个具体的实施方式中，组合物包含羊膜来源的贴壁细胞和体干细胞。在一个更加具体的实施方式中，所述体干细胞是神经干细胞、肝干细胞、胰干细胞、内皮干细胞、心干细胞、或肌肉干细胞。
在其它具体的实施方式中，所述第二种细胞类型包括约、至少、或不多于10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％的所述群体中的细胞。在其它具体的实施方式中，在所述组合物中的AMDAC包括至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％的在所述组合物中的细胞。在其它具体的实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞包括约、至少、或不多于10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、或45％的所述群体中的细胞。
分离的羊膜来源的贴壁细胞群中的细胞可以与另一种类型的多个细胞进行组合，例如，与干细胞群组合，其与每个群体中的总有核细胞数量的比例为约100,000,000∶1、50,000,000∶1、20,000,000∶1、10,000,000∶1、5,000,000∶1、2,000,000∶1、1,000,000∶1、500,000∶1、200,000∶1、100,000∶1、50,000∶1、20,000∶1、10,000∶1、5,000∶1、2,000∶1、1,000∶1、500∶1、200∶1、100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶100、1∶200、1∶500、1∶1,000、1∶2,000、1∶5,000、1∶10,000、1∶20,000、1∶50,000、1∶100,000、1∶500,000、1∶1,000,000、1∶2,000,000、1∶5,000,000、1∶10,000,000、1∶20,000,000、1∶50,000,000、或约1∶100,000,000。分离的羊膜来源的贴壁细胞群中的细胞也可以与多种类型的多个细胞进行组合。
5.3生长培养
对于任何哺乳动物细胞而言，在此描述的羊膜来源的贴壁细胞的生长取决于选定用于生长的特殊培养基。在最优选条件下，羊膜来源的贴壁细胞一般约24小时后数量倍增。在培养过程中，在此描述的羊膜来源的贴壁细胞附着于培养基质，例如组织培养容器的表面(例如，组织培养皿塑料，纤维粘连蛋白-包被的塑料，等等)并形成单层。一般，细胞在羊膜消化后2-7天内在培养中稳定建立。其以每天约0.4-1.2个群体倍增的速度进行增殖，并可以经历至少30-50次群体倍增。细胞在半满(subconfluence)和扩增状态中表现为间质/成纤维细胞样表型，并在全满(confluence)状态表现为立方形/鹅卵石样外观，且培养增殖是强接触抑制的。在培养扩增中羊膜来源的血管生成细胞群可以形成胚状体。
5.4获得羊膜来源的血管生成细胞的方法
羊膜来源的贴壁细胞和含有羊膜来源的贴壁细胞的细胞群可通过以下方式制备，例如，分离自其它细胞或细胞群，例如，通过特殊的方法消化羊膜组织，并且可选地对得到的细胞或细胞群进行检测判断其是否存在标记或标记组合，羊膜来源的贴壁细胞的特性，或通过获得羊膜细胞并基于标记选择羊膜来源的贴壁细胞的特性。
在此提供的羊膜来源的贴壁细胞和分离的含有羊膜来源的贴壁细胞的细胞群，可以通过例如消化羊膜组织并进而选择贴壁细胞来制备。在一个实施方式中，例如，分离的羊膜来源的贴壁细胞或分离的含有羊膜来源的贴壁细胞的细胞群，可通过以下步骤制备：(1)用第一种酶消化羊膜组织，从羊膜间质层细胞上的羊膜表皮层解离细胞；(2)然后用第二种酶消化羊膜间质层形成单细胞悬液；(3)在例如组织培养塑料的组织培养表面上的所述单细胞悬液中培养细胞；以及(4)筛选在更换培养基后附着于所述表面的细胞，从而制备分离的含有羊膜来源的贴壁细胞的细胞群。在一个具体的实施方式中，所述第一种酶是胰蛋白酶。在一个更加具体的实施方式中，所述胰蛋白酶使用浓度为0.25％胰蛋白酶(w/v)，用于5-20毫升，例如，10毫升溶液每克要消化的羊膜组织中。在另一个更具体的实施方式中，所述胰蛋白酶消化在37℃下进行约15分钟并重复多达3次。在另一个具体的实施方式中，所述第二种酶为胶原蛋白酶。在一个更加具体的实施方式中，所述胶原蛋白酶的使用浓度为50-500U/L，用于5mL每克要消化的羊膜组织。在另一个更具体的实施方式中，所述用胶原蛋白酶消化在37℃下进行约45-60分钟。在另一个具体的实施方式中，胶原蛋白酶消化后形成的单细胞悬液在步骤(2)和步骤(3)之间使用例如75μM-150μM滤器进行过滤。在另一个具体的实施方式中，所述第一种酶是胰蛋白酶，且所述第二种酶是胶原蛋白酶。
在另一个实施方式中，分离的含有羊膜来源的贴壁细胞的细胞群能够通过从羊膜选择细胞获得，例如，通过本文其它部分描述的消化羊膜组织获得细胞，其表现出一种或更多的羊膜来源的贴壁细胞特性。在一个实施方式中，例如，细胞群通过以下方法制备，包括选择下述羊膜细胞：(a)经RT-PCR测定OCT-4呈阴性，和(b)经免疫定位测定为VEGFR2/KDR、CD9、CD54、CD105、CD200中的一种或多种呈阳性；以及从其它细胞中分离所述细胞形成细胞群。在一个具体的实施方式中，所述羊膜细胞还是VE-钙粘蛋白-。在一个具体的实施方式中，细胞群通过选择以下胎盘细胞制备：(a)经RT-PCR测定OCT-4呈阴性和经免疫定位测定VE-钙粘蛋白呈阴性，和(b)经免疫定位测定VEGFR2/KDR、CD9、CD54、CD105、CD200中的一种或多种呈阳性；以及从其它细胞中分离所述细胞形成细胞群。在某些实施方式中，在通过RT-PCR进行选择之前通过免疫定位进行选择。在另一个具体的实施方式中，所述选择包括选择在1-100ng/mL VEGF存在下培养4-21天后不表达细胞标记CD34的细胞。
在另一个实施方式中，例如，细胞群通过以下方法制备，包括选择附着于组织培养塑料并经RT-PCR测定为OCT-4-、和经免疫定位测定为VEGFR1/Flt-1+和VEGFR2/KDR+的羊膜细胞，以及从其它细胞中分离所述细胞形成的细胞群。在一个具体的实施方式中，细胞群通过以下方法制备，其包括选择经RT-PCR测定为OCT-4-，和经免疫定位测定为VEGFR1/Flt-1+、VEGFR2/KDR+和HLA-G-的羊膜细胞。在另一个具体的实施方式中，所述细胞群通过以下方法制备，其中选择经免疫定位测定还为CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、和/或CXCR4-(趋化因子(C-X-C基序)受体4)中的一种或多种或全部的羊膜细胞，并从没有表现出一种或多种的这些特性的细胞中分离所述细胞。在另一个具体的实施方式中，所述细胞群通过选择经免疫定位测定还是VE-钙粘蛋白的羊膜细胞，并从VE-钙粘蛋白+的细胞中分离所述细胞进行制备。在另一个具体的实施方式中，所述细胞群通过选择经免疫定位测定还是CD105+和CD200+的羊膜细胞，并从CD105-或CD200-的细胞中分离所述细胞。在另一个具体的实施方式中，所述细胞暴露于1-100ng/mL的VEGF下4-21天后经免疫定位测定不表达CD34。
在细胞选择中，没有必要检测整个细胞群的羊膜来源的贴壁细胞特性。相反，可以检测细胞群的一种或更多的部分细胞(例如，约0.5％-2％)的这些特性，并将结果用于计算群体中剩下的细胞。
选择的细胞可以通过下述方式被确认为在此提供的羊膜来源的贴壁细胞：在VEGF(例如，约50ng/mL)存在下，在基质例如MATRIGELTM上将细胞样品(例如，约104至约105细胞)培养4-14天，例如，7天，并肉眼观察细胞出芽和/或细胞网络的出现。
羊膜来源的贴壁细胞可使用细胞筛选领域已知的任何方法通过上述标记进行选择。例如，贴壁细胞可以在例如流式细胞术或FACS免疫定位中使用针对一种或更多细胞表面标记的抗体或多种抗体进行筛选。可以通过使用结合磁珠的抗体来进行选择。特异性针对某种标记的抗体是本领域已知的并可通过商购获得，例如，抗CD9(Abcam)、CD54(Abcam)、CD105(Abcam；BioDesign International，Saco，ME，等)、CD200(Abcam)细胞角蛋白(SigmaAldrich)抗体。抗其它标记的抗体也是可通过商购获得的，例如，CD34、CD38和CD45可购自，例如，StemCell Technologies或BioDesign International。适于RT-PCR的OCT-4序列的引物可购自，例如，Millipore或Invitrogen，或可以容易地衍生自GenBank登录号DQ486513的人序列。
获得胎盘和羊膜组织的方法以及为获得羊膜来源的贴壁细胞而对该组织进行处理的详细方法提供如下。
5.4.1细胞收集组合物
一般地，可以从哺乳动物胎盘的羊膜中获得细胞，例如，人胎盘，其中使用生理可接受的溶液，例如，细胞收集组合物。优选的，细胞收集组合物预防或抑制凋亡，预防或抑制细胞死亡、裂解、分解等等。细胞收集组合物详细描述于相关的美国专利申请公布号2007/0190042，标题为“Improved Medium for Collecting Placental Stem Cells andPreserving Organs，”其公开内容在此全文引入作为参考。
细胞收集组合物可以包括任何适于收集和/或培养羊膜来源的贴壁细胞的生理可接受的溶液，例如，盐溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水、Kreb溶液、修饰的Kreb溶液、Eagle溶液、0.9％NaCl等)、培养基(例如，DMEM、H.DMEM等)，等等，其中添加或不添加缓冲成分，例如，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)。
细胞收集组合物可以包含一种或更多保护细胞(例如，羊膜来源的贴壁细胞)的组分，即，从收集开始到培养的时间内防止细胞死亡，或延迟细胞死亡，减少死亡的细胞群中的细胞数量，等。该组分可以是，例如，凋亡抑制剂(例如，半胱天冬酶抑制剂或JNK抑制剂)；血管扩张剂(例如，硫酸镁、抗高血压药、心房利钠肽(ANP)、促肾上腺皮质激素、促肾上腺皮质激素释放激素、硝普钠、肼苯哒嗪、三磷酸腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸镁、磷酸二酯酶抑制剂等)；坏死抑制剂(例如，2-(1H-吲哚-3-基)-3-戊胺-马来酰亚胺、二硫代氨基甲酸吡咯烷或氯硝西泮)；TNF-α抑制剂；和/或携氧全氟化碳(例如，全氟溴辛烷、全氟溴癸烷等)。
细胞收集组合物可以包含一种或更多组织降解酶，例如，金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、RNA酶、或DNA酶等。这些酶包括但不限于胶原蛋白酶(例如，胶原蛋白酶I、II、III或IV，来自溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)的胶原蛋白酶等)；分散酶，嗜热菌蛋白酶，弹性蛋白酶，胰蛋白酶，LIBERASETM，透明质酸酶，等等。含有组织消化酶的细胞收集组合物的用途如下详述。
细胞收集组合物可以包含杀菌或抑菌有效量的抗生素。在一些非限制性的实施方式中，抗生素为大环内酯类(例如，妥布霉素)、头孢菌素(例如，头孢氨苄、头孢拉定、头孢呋辛、头孢丙烯、头孢克洛、头孢克肟或头孢羟氨苄)、克拉霉素、红霉素、青霉素(例如，青霉素V)或喹诺酮(例如，氧氟沙星、环丙沙星或诺氟沙星)、四环素、链霉素等。在一个特殊的实施方式中，抗生素活性针对Gram(+)和/或Gram(-)细菌，例如，绿脓假单胞菌(Pseudomonasaerugmosa)、金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，等等。
细胞收集组合物还可以包含一种或多种的下述化合物：腺苷(约1mM至约50mM)；D-葡萄糖(约20mM至约100mM)；镁离子(约1mM至约50mM)；分子量大于20,000道尔顿的大分子，在一个实施方式中，其含量足以维持内皮完整性和细胞生存(例如，合成的或天然产生的胶体、多糖例如葡聚糖或聚乙二醇，含量约25g/l至约100g/l，或约40g/l至约60g/l)；抗氧化剂(例如，丁基羟基苯甲醚、丁基羟基甲苯、谷胱甘肽、维生素C或维生素E，含量为约25M至约100M)；还原剂(例如，N-乙酰半胱氨酸，含量为约0.1mM至约5mM)；防止钙进入细胞的试剂(例如，异搏定，含量为约2M至约25M)；硝化甘油(例如，约0.05g/L至约0.2g/L)；抗凝血剂，在一个实施方式中，其含量足以帮助防止残血凝块(例如，肝磷脂或水蛭素，含量为浓度约1000单位/l至约100,000单位/l)；或含氨氯吡脒化合物(例如，氨氯吡脒、乙基异丙基氨氯吡脒、六甲撑氨氯吡脒、二甲基氨氯吡脒或异丁基氨氯吡脒，含量为约1.0M至约5M)。
在此描述的羊膜来源的贴壁细胞也可以在例如下述消化过程中以及消化后被收集到简单的生理可接受缓冲液中，例如，磷酸盐缓冲盐水、0.9％NaCl溶液、细胞培养基，等。
5.4.2收集和处理胎盘
一般地，人胎盘在其出生后排出体内的短时间内或在例如剖腹产之后进行收集。在优选的实施方式中，在对患者进行知会同意并获得该患者的完整病历且与胎盘关联后回收胎盘。优选的，在分娩后继续跟踪病历。该病历可用于调整从中获得的胎盘或细胞的后续应用。例如，人胎盘细胞，例如，羊膜来源的贴壁细胞，可以按照病历被用于婴儿、或与胎盘有关的近亲属、或父母、兄弟姐妹或婴儿的其它亲属的个体化用药。
在回收羊膜来源的贴壁细胞前移除脐带血和胎盘血。在某些实施方式中，分娩后回收胎盘中的脐带血。胎盘可被用于脐带血常规回收过程。一般使用针或套管，在重力作用下给胎盘抽血(参见，例如，Anderson，美国专利号5,372,581；Hessel等人，美国专利号5,415,665)。针或套管通常置于脐带静脉，胎盘可以被轻柔的挤压以帮助排空胎盘中的脐带血。该脐带血回收可以商业化地进行，例如，Life Bank USA，Cedar Knolls，N.J.，ViaCord，Cord Blood Registry and Cryocell。优选的，用重力排空胎盘而不进行进一步操作，从而使得脐带血回收中的组织破坏得以最小化。
一般地，将胎盘从分娩室或产房转移到另一位置，例如，实验室中，用于通过例如灌注或组织解离来回收脐带血并收集细胞。优选的将胎盘转移到无菌的、隔热的转移设备(保持胎盘温度20-28℃)中，例如，将胎盘与近端夹紧的脐带血置于无菌拉链塑料袋中，后者接着被置于隔热容器中。在另一个实施方式中，胎盘使用基本上按照描述于美国专利号7,147,626的脐带血收集试剂盒进行转移。优选的，胎盘在分娩后4-24小时转移到实验室。在某些实施方式中，优选的在脐带血回收前，在)脐带插入胎盘的4-5cm厘米处夹紧近端脐带。在其它实施方式中，在脐带血回收后和进一步处理胎盘之前，夹紧近端脐带。
在细胞收集之前可以将胎盘储藏在无菌条件以及例如4-25℃(摄氏度)的温度下，例如，室温下。在灌注胎盘除去任何残留的脐带血之前，可以储藏胎盘例如0-24小时、高达48小时、或多于48小时。在一个实施方式中，在排出后约0小时至约2小时收获胎盘。胎盘可以在例如4-25℃(摄氏度)的温度下储藏于抗凝血剂溶液中。合适的抗凝血剂溶液是本领域熟知的。例如，可以使用柠檬酸钠、肝磷脂或华法令钠溶液。在优选的实施方式中，抗凝血剂溶液包括肝磷脂溶液(例如，在1∶1000溶液中1％w/w)。优选的抽血胎盘在收集细胞前储藏不多于36小时。
5.4.3羊膜组织的物理破碎和酶促消化
在一个实施方式中，羊膜分离自剩余的胎盘，例如，通过钝器解剖，例如，使用手指。在酶促消化和贴壁细胞回收之前可以将羊膜切成例如小块或组织片段。羊膜来源的贴壁细胞可以获得自完整羊膜，或来自羊膜的小块部分，例如，面积为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或约1000平方毫米的羊膜的部分。
羊膜来源的贴壁细胞一般可以收集自胎盘羊膜或其部分，其可以在排出后约前3天内的任何时间进行，但优选排出后约0小时至48小时，或排出后约8小时至约18小时进行。
在一个实施方式中，通过使用一种或更多组织消化酶进行酶促消化将羊膜来源的贴壁细胞自羊膜组织分离。羊膜或其部分可以使用例如一种或更多酶进行消化，所述酶溶解或混合入如上所述的细胞收集组合物中。
在某些实施方式中，细胞收集组合物包含一种或更多组织破坏性酶。酶促消化优选使用酶的组合，例如，基质金属蛋白酶和中性蛋白酶的组合，例如，分散酶和胶原蛋白酶的组合，例如，相继使用。当使用多于一种蛋白酶时，所述蛋白酶可以同时使用或连续使用以消化羊膜组织。在一个实施方式中，例如，羊膜组织用胰蛋白酶消化3次，然后用胶原蛋白酶消化一次。
在一个实施方式中，羊膜组织使用一种或多种的基质金属蛋白酶、中性蛋白酶和粘液分解酶进行酶促消化。在一个具体的实施方式中，羊膜组织使用胶原蛋白酶、分散酶和透明质酸酶的组合进行消化。在另一个具体的实施方式中，羊膜组织使用LIBERASETM(Boehringer MannheimCorp.，Indianapolis，Ind.)和透明质酸酶的组合进行消化。其它可用于破坏羊膜组织的酶包括木瓜蛋白酶，脱氧核糖核酸酶，丝氨酸蛋白酶，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶或弹性蛋白酶。丝氨酸蛋白酶在血清中能够被α2微球蛋白抑制，从而用于消化的培养基在某些实施方式中可以是无血清的。在某些其它的实施方式中，EDTA和DNA酶被用于消化羊膜组织，例如，为了增加细胞回收效率。在某些其它的实施方式中，对消化物进行稀释从而避免细胞陷入粘性消化物中。
一般组织消化酶的浓度包括，例如，50-200U/mL的胶原蛋白酶I和胶原蛋白酶IV、1-10U/mL的分散酶、和10-100U/mL的弹性蛋白酶。蛋白酶可以组合使用，即，在相同消化反应中使用两种或更多蛋白酶，或可以相继使用以分离羊膜来源的贴壁细胞。例如，在一个实施方式中，羊膜组织或其部分首先使用合适量的胰蛋白酶在浓度约0.25％、37℃下消化例如15分钟，然后使用约1至约2mg/ml的胶原蛋白酶I消化例如45分钟。
在一个实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞可以按照如下方式获得。将羊膜切成0.1”×0.1”至约5”×5”，例如2”×2”大小的碎片。通过三次如下胰蛋白酶消化将上皮单层从羊膜的胚胎侧去除。将羊膜碎片置于装有温热的(例如，约20℃至约37℃)胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25％)的容器中。胰蛋白酶的体积可以是从约5mL每克羊膜至约50mL每克羊膜。将容器振荡约5分钟至约30分钟，例如，15分钟，并保持温度恒定。然后将羊膜碎片从胰蛋白酶溶液中分离，其中可以采用任何合适的方法，例如手工去除羊膜碎片，或通过过滤去除羊膜碎片。胰蛋白酶消化步骤可以重复至少一次以上。
在胰蛋白酶消化最终结束后，将羊膜碎片放回装有诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)/10％FBS、PBS/5％FBS或PBS/3％FBS的温热的胰蛋白酶中和溶液的容器中。将容器振荡约5秒至约30分钟，例如，5分钟。然后将羊膜碎片从如上所述的胰蛋白酶中和溶液中进行分离，并将羊膜碎片置于装有温热的pH 7.2PBS的容器中。将容器振荡约5秒至约30分钟，将羊膜碎片从如上所述PBS中进行分离。
然后将羊膜碎片置于装有温热的(例如，约20℃至约37℃)消化溶液的容器中。消化溶液的体积可以是从约5mL每克羊膜至约50mL每克羊膜。消化溶液包含在诸如DMEM的合适培养基中的消化酶。典型的消化溶液包括I型胶原蛋白酶(约50U/mL至约500U/mL)；I型胶原蛋白酶(约50U/mL至约500U/mL)加分散酶(约5U/mL至约100U/mL)；以及I型胶原蛋白酶(约50U/mL至约500U/mL)、分散酶(约2U/mL至约50U/mL)和透明质酸酶(约3U/mL至约10U/mL)。将容器在37℃下振荡，直至羊膜消化基本上完成(大约10分钟至约90分钟)。然后在容器中加入温热的PBS/5％FBS，比例为约1mL每克羊膜组织至约50mL每克羊膜组织。将容器振荡约2分钟至约5分钟。然后用40μm-100μm滤器过滤细胞悬液去除任何未消化的组织。将细胞悬浮于温热的PBS(约1mL至约500mL)，然后在200×g至约400×g下离心约5分钟至约30分钟，例如20℃下300×g离心约15分钟。离心后，去除上清液并将细胞重悬于合适的培养基。细胞悬液可以过滤(40μm-70μm滤器)去除任何剩余的未消化组织，产生单一细胞悬液。
在本实施方式中，将收集悬液中的细胞并按照本文其它部分所描述的方式培养，以产生分离的羊膜来源的贴壁细胞及其细胞群。在本实施方式中，可以丢弃剩余的未消化羊膜。可以通过例如离心进行收集从羊膜组织释放的细胞，并培养于标准细胞培养基中。
在本文任一消化流程中，可以将消化获得的细胞悬液进行过滤，例如，通过含有从约50μm至约150μm，例如，从约75μm至约125μm的孔的滤器进行过滤。在一个更加具体的实施方式中，细胞悬液可以通过两个或更多滤器进行过滤，例如，一个125μm滤器和一个75μm滤器。
与在此描述的任何方法一起，可以在消化过程中通过选择能够表达一种或更多AMDAC特性的细胞从释放的细胞中分离AMDAC，如上述5.1部分的描述。
AMDAC也可以使用例如特别的两步分离法进行分离，其包括胰蛋白酶消化然后胶原蛋白酶消化。从而，在另一个方面，本发明提供了一种分离羊膜来源的贴壁细胞的方法，包括胰蛋白酶消化羊膜或其部分，从而从所述羊膜中释放上皮细胞；从所述上皮细胞去除羊膜或其部分；进一步用胶原蛋白酶消化羊膜或其部分，从而从所述羊膜或其部分中释放羊膜来源的贴壁细胞；以及从所述羊膜中分离所述羊膜来源的贴壁细胞。在一个具体的实施方式中，羊膜或其部分的消化重复至少一次。在另一个具体的实施方式中，羊膜或其部分的胶原蛋白酶消化重复至少一次。在另一个具体的实施方式中，胰蛋白酶为约0.1％-1.0％(终浓度)。在一个更加具体的实施方式中，胰蛋白酶为约0.25％(终浓度)。在另一个具体的实施方式中，胶原蛋白酶为约50U/mL至约1000U/mL(终浓度)。在一个更加具体的实施方式中，胶原蛋白酶为约125U/mL(终浓度)。在另一个具体的实施方式中，分离方法还包括在细胞培养基中培养所述羊膜来源的贴壁细胞，并将所述培养物中的非贴壁细胞与所述羊膜来源的贴壁细胞进行分离以产生富集羊膜来源的贴壁细胞的群体。在更加具体的实施方式中，所述富集羊膜来源的贴壁细胞群中至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的细胞为所述羊膜来源的贴壁细胞。
在上述方法的一个更加具体的实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞经RT-PCR测定OCT-4呈阴性和经流式细胞术测定为HLA-G+、CD90+、CD105+和CD117-中的一种或多种。
5.4.4羊膜来源的贴壁细胞的分离、分类和表征
可以将细胞沉淀重悬于如上所述的新鲜细胞收集组合物中，或适于维持细胞的培养基中，例如，Dulbecco的改良Eagle培养基(DMEM)；Iscove的改良Dulbecco培养基(IMDM)，例如含有2U/mL肝磷脂和2mMEDTA(GibcoBRL，NY)的IMDM无血清培养基；缓冲液(例如PBS，HBSS)与FBS(例如2％v/v)混合物；等。
在例如组织培养塑料表面培养的羊膜来源的贴壁细胞，无论其是否有额外的胞外基质包被，例如纤维粘连蛋白，都可以通过差速贴壁法传代或分离。例如，获得按照上述5.4.3节的描述用胶原蛋白酶消化的羊膜组织的细胞悬液，可以在组织培养塑料上的培养基中培养例如3-7天。培养过程中，悬液中的多个细胞附着于培养表面，且在连续培养后，形成了羊膜来源的贴壁细胞。不形成羊膜来源贴壁细胞的非贴壁细胞在更换培养基时被去除。
可以进行监控从羊膜中收集的细胞数量和类型，例如，通过使用诸如免疫定位的标准细胞检测技术检测细胞形态和表面标记的变化来进行监控，其中检测技术例如流式细胞术、细胞分选、免疫细胞化学(例如、组织特异性或细胞标记特异性抗体染色)荧光激活细胞分选(FACS)、磁性激活细胞分选(MACS)、通过使用光学或共聚焦显微镜检查细胞形态、和/或通过使用诸如PCR和基因表达谱等本领域熟知的技术检测基因表达变化。这些技术也可以用于鉴定对于一种或更多特殊标记呈阳性的细胞。例如，使用一种或更多CD34抗体，人们可以使用上述技术以确定一种细胞是否包含可检测量的CD34；如果是这样的话，那么细胞是CD34+。
羊膜来源的细胞，例如，通过Ficoll分离、差速贴壁法或二者的组合分离的细胞可以使用荧光激活细胞分选仪(FACS)进行分选。荧光激活细胞分选(FACS)是一种公知的分离颗粒的方法，包括分离细胞，其基于颗粒的荧光特性(参见，例如，Kamarch，1987，MethodsEnzymol，151：150-165)。每个颗粒荧光部分的激光激发会导致微小的电荷，使得可以从混合物中进行电磁分离阳性和阴性的颗粒。在一个实施方式中，细胞表面标记特异性抗体或配体被标记了不同的荧光标签。通过细胞分选仪处理细胞，从而允许基于细胞结合所用抗体的能力对细胞进行分离。FACS分选的颗粒可以直接储存至96-孔或384-孔板的各个孔内，方便分离和克隆。
在一个分选方案中，来自胎盘的细胞，例如，羊膜来源的贴壁细胞，可以基于标记CD49f、VEGFR2/KDR和/或Flt-1/VEGFR1的表达进行分选。优选的细胞鉴定为OCT-4-，例如，通过RT-PCR检测OCT-4在细胞样品中的表达进行鉴定，其中如果样品中的细胞在30个循环后不能表现出可检测的OCT-4的mRNA合成，则细胞是OCT-4-。例如，来自羊膜的VEGFR2/KDR+和VEGFR1/Flt-1+细胞可以从具有VEGFR2/KDR-和VEGFR1/Flt-1+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+和/或VE-钙粘蛋白-中的一种或多种的细胞中进行分选。在一个具体的实施方式中，将羊膜来源的具有CD49f+、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+和/或VE-钙粘蛋白-中的一种或多种的组织培养塑料贴壁细胞，或将VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+和VE-钙粘蛋白-细胞，从不表达一种或多种这些标记的细胞中进行分选并选择。在另一个具体的实施方式中，将另外为CD31+、CD34+、CD45+、CD133-和/或Tie-2+的CD49f+、VEGFR2/KDR+、VEGFR1/Flt-1+中的一种或多种或全部的细胞，从未表现出一种或更多或任何这些性质的细胞中进行分选。在另一个具体的实施方式中，将另外为CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-和/或CXCR4-的一种或多种或全部的VEGFR2/KDR+、VEGFR1/Flt-1+细胞，从未表现出一种或更多或任何这些性质的细胞中进行分选。
羊膜来源的贴壁细胞的筛选可以针对消化产生的细胞悬液或从消化物收集的分离细胞来进行，例如，通过离心或使用流式细胞仪分离。通过表达标记的筛选可以单独完成，或者，例如，与基于细胞培养中的贴壁性质的细胞筛选流程联用。例如，可以在基于标记表达的分选之前或之后进行贴壁筛选。
对于抗体-介导的胎盘细胞检测和分选，可以使用任何特殊标记特异性的抗体，其结合任何荧光基团或适于细胞检测和分选(例如，荧光激活细胞分选)的其它标签。结合特异性标记的抗体/荧光基团包括但不限于，异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的抗CD105单克隆抗体(可购自R&DSYSTEMSInc.，Minneapolis，Minnesota)；藻红蛋白(PE)偶联的抗CD200单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen)；VEGFR2/KDR-生物素(CD309，Abcam)，等等。针对在此公开的任何标记的抗体都可以使用任何用于抗体的标准标签进行标记，后者有利于检测抗体，包括，例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶链霉亲和素/生物素、抗生物素蛋白/生物素、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、二氯三吖胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白(PE)、鲁米诺、荧光素酶、荧光素和水母蛋白，和合适的放射性材料的例子，包括125I、131I、35S或3H。
羊膜来源的贴壁细胞可以标记有单一标记的抗体，并基于该单一标记进行检测和分选；或者可以同时标记有多个不同标记的多个抗体，并基于多种标记进行分选。
在另一个实施方式中，可以使用磁珠分离细胞，例如，从其它羊膜细胞中分离在此描述的羊膜来源的贴壁细胞。细胞可以使用磁性激活细胞分选(MACS)技术进行分选，其为一种基于颗粒结合磁珠(0.5-100μm直径)的能力来分离颗粒的方法。可以对磁性微球进行多种有用的修饰，包括共价添加特异性识别特殊细胞表面分子或半抗原的抗体。然后将磁珠与细胞混合进行结合。然后将细胞通过磁场，分离具有特异性细胞表面标记的细胞。在一个实施方式中，随后可以将这些细胞进行分离并重新混合偶联有抗其它细胞表面标记的抗体的磁珠。再次将细胞通过磁场，分离结合有该两种抗体的细胞。然后可以将该细胞在诸如微滴盘的不同盘内进行稀释，用于克隆分离。
可以使用本领域已知的标准技术评价羊膜来源的贴壁细胞的活力、增殖潜力和寿命，例如台盼蓝拒染实验、荧光素二乙酸酯吸收分析、碘化丙锭吸收分析(评价活力)；以及胸腺嘧啶吸收分析或MTT细胞增殖分析(评价增殖)。细胞寿命可以通过本领域熟知的方法进行测定，例如通过检测延伸培养中的最大群体倍增数测定。
羊膜来源的贴壁细胞还可以使用其它本领域已知的技术从胎盘细胞中进行分离，例如，所需细胞的选择性生长(阳性筛选)，选择性破坏不需要的细胞(阴性筛选)；基于分化细胞在混合例如大豆凝集素的群体中的凝集作用进行分离；冻融过程；过滤；常规和区带离心；离心淘析(逆流离心)；单位重力分离；逆流分配；电泳；等等。
5.5羊膜来源的贴壁细胞的培养
5.5.1培养基
分离的羊膜来源的贴壁细胞或该细胞的群体，可用于启动细胞培养或接种细胞培养物。一般将细胞转移到无菌组织培养容器中，后者或者不包被、或者包被胞外基质或生物分子，例如层粘连蛋白、胶原蛋白(例如，天然或变性的)、明胶、纤维粘连蛋白、鸟氨酸、玻璃体粘连蛋白、和胞外膜蛋白(例如，MATRIGELTM(BD Discovery Labware，Bedford，Mass.))。
AMDAC可以，例如，在适合干细胞培养的培养基中进行培植。培植培养基可以，例如，含有EGM-2培养基(Lonza)、DMEM+10％FBS，或含有60％DMEM-LG(Gibco)、40％MCDB-201(Sigma)、2％胎牛血清(FCS)(Hyclone Laboratories)、1×胰岛素-转铁因子-硒补充剂(ITS)、1×亚油酸-牛血清白蛋白(LA-BSA)、10-9M地塞米松(Sigma)、10-4M抗坏血酸2-磷酸盐(Sigma)、表皮生长因子(EGF)10ng/ml(R&D SYSTEMS)、血小板衍生的生长因子(PDGF-BB)10ng/ml(R&D SYSTEMS)、和100U青霉素/1000U链霉素的培养基(在此称为“标准培养基”)。
羊膜来源的贴壁细胞可被培养于本领域认可的可用于例如贴壁胎盘干细胞的细胞培养的任何培养基，以及任何条件下。优选的，培养基含有血清。在不同的实施方式中，AMDAC的培养或传代培养的培养基包括(Invitrogen)、MSCM-sf(ScienCell、Carlsbad、CA)、-ACF培养基(StemCell Technologies、Vancouver、Canada)、标准培养基、缺少EGF的标准培养基、缺少PDGF的标准培养基、DMEM+10％FBS、EGM-2(Lonza)、EGM-2MV(Lonza)、2％、10％和20％的ES培养基、ES-SSR培养基或α-MEM-20％FBS。可用于培养羊膜来源的贴壁细胞的培养基包括，例如，DMEM、IMDM、DMEM(高或低葡萄糖)、Eagle基本培养基、Ham的F10培养基(F10)、Ham的F-12培养基(F12)、Iscove的改良Dulbecco培养基、间质干细胞生长的培养基(MSCGM Lonza)、ADVANCESTEMTM培养基(Hyclone)、KNOCKOUTTMDMEM(Invitrogen)、Leibovitz的L-15培养基、MCDB、DMEM/F12、RPMI 1640、改良DMEM(Gibco)、DMEM/MCDB201(Sigma)和CELL-GRO FREE等等。在不同的实施方式中，例如，DMEM-LG(Dulbecco的改良必需培养基，低葡萄糖)/MCDB 201(鸡成纤维细胞基本培养基)含有ITS(胰岛素-转铁因子-硒补充剂)、LA+BSA(亚油酸-牛血清白蛋白)、葡萄糖、L-抗坏血酸、PDGF、EGF、IGF-1、和青霉素/链霉素；DMEM-HG(高葡萄糖)包含约2至约20％胎牛血清，例如，约10％的胎牛血清(FBS；例如确定的胎牛血清，Hyclone，Logan Utah)；DMEM-HG包含约2至约20％FBS，例如，约15％的FBS；IMDM(Iscove的改良Dulbecco培养基)包含约2至约20％FBS，例如，约10％的FBS，约2至约20％马血清，例如，约10％的马血清，和氢化可的松；M199包含约2至约20％，例如，约10％的FBS、EGF和肝磷脂；α-MEM(最小必需培养基)包含约2至约20％，例如，约10％的FBS、GLUTAMAXTM和庆大霉素；DMEM包含10％FBS、GLUTAMAXTM和庆大霉素；DMEM-LG包含约2至约20％，例如，约15％(v/v)的胎牛血清(例如，确定的胎牛血清，Hyclone，LoganUtah)、抗生素/抗真菌药(例如，青霉素约100单位/微升、链霉素100微克/微升、和/或两性霉素B 0.25微克/微升(Invitrogen，Carlsbad，Calif))，和0.001％(v/v)β-巯基乙醇(Sigma，St.Louis Mo.)；补充2-20％FBS、非必需氨基酸(Invitrogen)、β-巯基乙醇的KNOCKOUTTM DMEM基本培养基，补充KNOCKOUTTM的血清替代品、含有2-20％FBS的α-MEM的KNOCKOUTTM基本培养基，补充EGF、VEGF、bFGF、R3-IGF-1、氢化可的松、肝磷脂、抗坏血酸、FBS、庆大霉素的EBM2TM基本培养基，等等。
培养基可以补充一种或更多组分，包括，例如，血清(例如，FCS或FBS，例如，约2-20％(v/v)；马血清(ES)；人血清(HS))；β-巯基乙醇(BME)，优选的约0.001％(v/v)；一种或更多生长因子，例如，血小板衍生的生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、白血病抑制因子(LIF)、血管内皮生长因子(VEGF)和促红细胞生成素(EPO)；氨基酸，包括L-缬氨酸；以及一种或更多抗生素和/或抗真菌剂以控制微生物污染，例如，青霉素G、硫酸链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素，其可单独或组合使用。
羊膜来源的贴壁细胞(AMDAC)可被培养于标准组织培养条件，例如，培养于组织培养皿或多孔板。细胞还可以使用悬滴方法进行培养。在该方法中，细胞在约5mL的培养基中悬浮于约1×104细胞每mL，且一滴或更多培养基置于组织培养容器的盖内，例如，在100mLPetri培养皿中。这些液滴可以是，例如，单一液滴，或来自例如多通道移液管的多个液滴。小心地将盖翻转并置于培养皿底部的顶上，其中含有一定体积的液体，例如，足够维持培养皿中潮湿环境的无菌PBS，并进而培养细胞。AMDAC也可以在标准或大体积或高产量培养系统中进行培养，例如T-摇瓶、CorningCell Factories(Nunc)、1-，2-，4-，10或40-Tray Cell stack，等等。
在一个实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞在能够维持细胞未分化表型的化合物的存在下进行培养。在一个具体的实施方式中，该化合物是取代的3，4-二氢吡啶酚[4，5-d]嘧啶。在一个更加具体的实施方式中，该化合物是具有下述化学结构的化合物：
该化合物可以与一种羊膜来源的贴壁细胞或该细胞群进行接触，其浓度为，例如，约1μM至约10μM。
5.5.2羊膜来源的贴壁细胞的扩增和增殖
一旦分离了羊膜来源的贴壁细胞或分离了该细胞群(例如，分离自至少50％的羊膜细胞的羊膜来源的贴壁细胞或该细胞群，该细胞或细胞群通常与其在体内相关联)，即可以在体外增殖和扩增细胞。例如，贴壁细胞或羊膜来源的贴壁细胞群可以在组织培养容器中进行培养，例如，培养皿、摇瓶、多孔板等，培养持续足够时间使得细胞增殖至40-70％汇合度(confluence)，即，直到细胞及其后代占据40-70％的组织培养容器的培养表面积。
可以在培养容器中接种羊膜来源的贴壁细胞，接种密度允许细胞生长。例如，可以在低密度(例如，约400至约6,000细胞/cm2)至高密度(例如，约20,000或更多细胞/cm2)下接种细胞。在优选的实施方式中，细胞培养于CO2为约0％至约5％的空气中。在一些优选的实施方式中，细胞培养于约0.1％至约25％O2的空气中，优选的约5％至约20％O2的空气中。细胞优选的培养于约25℃至约40℃，优选的约37℃。
细胞优选的培养于保温箱中。培养过程中，培养基可以是静止或进行搅拌的，例如，培养过程中使用生物反应器。羊膜来源的贴壁细胞优选的生长于低氧化压力下(例如，添加谷胱甘肽、抗坏血酸、过氧化氢酶、生育酚、N-乙酰半胱氨酸等)。
虽然羊膜来源的血管生成细胞可以生长至全满，但是细胞优选的不生长至全满。例如，一旦达到40％-70％的汇合度，即可以传代细胞。例如，细胞可以使用本领域熟知的技术进行酶处理，例如，胰蛋白酶化，将其从组织培养表面进行分离。吸走细胞并对其进行计数后，可以将约20,000-100,000细胞、优选的约50,000细胞、或约400至约6,000细胞/cm2传代至含有新鲜培养基的新培养容器。一般地，新培养基与去除细胞的培养基为相同类型。羊膜来源的贴壁细胞可以传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次，或更多。AMDAC可以在培养物中翻倍至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或至少50倍或更多。
5.6羊膜来源的贴壁细胞的保存
在例如收集过程或使用诸如在此描述的方法来生产在此描述的组合物之前，可以将羊膜来源的贴壁细胞保存于，即，置于允许长期存储的条件下，或抑制诸如凋亡或坏死的细胞死亡的条件下。
羊膜来源的贴壁细胞可以使用例如包含凋亡抑制剂、坏死抑制剂和/或携氧全氟化碳的组合物进行保存，如描述于美国申请公开号2007/0190042，其公开内容在此全文引入作为参考。在一个实施方式中，保存该细胞或该细胞群的方法包括将所述细胞或细胞群与细胞收集组合物接触，包括凋亡抑制剂和携氧全氟化碳，其中与不接触凋亡抑制剂的细胞群相比，所述凋亡抑制剂的用量和使用时间足以减少或防止细胞群中的凋亡。在一个具体的实施方式中，所述凋亡抑制剂为半胱天冬酶抑制剂。在另一个具体的实施方式中，所述凋亡抑制剂为JNK抑制剂。在一个更加具体的实施方式中，所述JNK抑制剂不调节羊膜来源的贴壁细胞的分化或增殖。在另一个实施方式中，所述细胞收集组合物包含所述凋亡抑制剂且所述携氧全氟化碳在不同的相中。在另一个实施方式中，所述细胞收集组合物在乳液中含有所述凋亡抑制剂和所述携氧全氟化碳。在另一个实施方式中，细胞收集组合物还包含乳化剂，例如，卵磷脂。在另一个实施方式中，在接触细胞时所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳为约0℃至约25℃。在另一个更具体的实施方式中，在接触细胞的时候所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳为约2℃至10℃、或约2℃至约5℃。在另一个更具体的实施方式中，所述接触在所述细胞群传递过程中进行。在另一个更具体的实施方式中，所述接触在所述细胞群冻融过程中进行。
羊膜来源的贴壁细胞群可以通过例如包括将所述细胞群与凋亡抑制剂和器官保存化合物进行接触的方法进行保存，其中与不接触凋亡抑制剂的细胞群相比，所述凋亡抑制剂的用量和使用时间足以减少或防止细胞群中的凋亡。在一个具体的实施方式中，器官保存化合物为UW溶液(描述于美国专利号4,798,824；也称为ViaSpan；还参见Southard等人，Transplantation 49(2)：251-257(1990))或描述于Stern等人，美国专利号5,552,267的溶液。在另一个实施方式中，所述器官保存化合物为羟乙基淀粉、乳糖酸、棉子糖、或其组合。在另一个实施方式中，细胞收集组合物还包含携氧全氟化碳，其存在于两相中或以乳液形式存在。
在所述方法的另一个实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞在灌注过程中与包含凋亡抑制剂和携氧全氟化碳的细胞收集组合物、器官保存化合物或其组合进行接触。在另一个实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞在组织粉碎过程中与细胞收集组合物接触，例如，在酶促消化羊膜组织过程中。在另一个实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞在通过例如酶促消化羊膜组织的组织破碎进行收集后与细胞收集组合物接触。
一般地，在收集、富集和分离羊膜来源的贴壁细胞过程中，优选最小化或消除由于低氧和机械压力造成的细胞压力。从而，在本方法的另一个实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞或含有羊膜来源的贴壁细胞的细胞群在收集、富集和分离时在所述保存过程中被暴露于低氧条件下少于6小时，其中低氧条件为氧浓度例如低于正常的大气氧浓度；低于正常血氧浓度等。在一个更加具体的实施方式中，所述细胞或所述细胞群在所述保存过程中暴露于所述低氧条件下少于2小时。在另一个更具体的实施方式中，所述细胞或所述细胞群在收集、富集或分离过程中暴露于所述低氧条件下少于1小时，或低于30分钟，或不暴露于低氧条件。在另一个具体的实施方式中，所述细胞群在收集、富集或分离过程中不暴露于剪切力。
羊膜来源的贴壁细胞可以通过一般方法或在此公开的特殊方法进行低温贮藏，例如，在诸如安瓶的小容器中的低温贮藏培养基内保存。合适的低温贮藏培养基包括但不限于以下培养基，包括，例如，生长培养基，或细胞冷冻培养基，例如商业可获得的细胞冷冻培养基，例如，根据SigmaAldrich产品目录号C2695、C2639(1×细胞冷冻无血清培养基，不含DMSO)或C6039(1×细胞冷冻甘油培养基，含有最小必需培养基、甘油、小牛血清和牛血清)的细胞冷冻培养基、Lonza PROFREEZETM 2×培养基、甲基纤维素、葡聚糖、人血清白蛋白、胎牛血清、胎牛血清、或Plasmalyte。低温贮藏培养基优选的包括DMSO(二甲亚砜)或甘油，其浓度为，例如，约1％至约20％，例如，约5％-10％(v/v)，可选的包含胎牛血清或人血清。低温贮藏培养基可以包含其它试剂，例如，甲基纤维素和/或甘油。分离的羊膜来源的贴壁细胞在低温贮藏中优选的以约1℃/min的速度冷冻。优选的低温贮藏温度为约-80℃至约-180℃，优选的约-125℃至约-140℃。低温贮藏细胞可以在解冻使用之前被转移至液氮的气相中。在一些实施方式中，例如，一旦安瓶达到约-80℃，其即被转移至液氮储存区内。低温贮藏也可以使用控制速率的冰箱。低温贮藏细胞优选的在温度为约25℃至约40℃下解冻，优选的解冻至温度为约37℃。
5.7制备羊膜来源的贴壁细胞库
羊膜来源的贴壁细胞可以使用多种不同方式培养，生产一系列的批次(lot)，例如，一系列可个体施用剂量(dose)的所述细胞。获自多个胎盘的一系列的血管生成羊膜细胞批次可置于一种细胞库内用于例如长期储存。一般地，羊膜来源的贴壁细胞来自于细胞的初代培养以形成种子培养，后者在控制条件下进行扩增，从大约相当数量的倍增中形成细胞群。细胞批次优选的衍生自单一胎盘的组织，但也可以衍生于多个胎盘的组织。
在一个非限制性实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞的批次或剂量按照以下方式获得。首先破碎羊膜组织，例如，按照描述于上述5.4.3节的使用系列胰蛋白酶和胶原蛋白酶消化过程进行消化。培养来自胶原蛋白酶消化组织的细胞，培养时间例如约1-3周，优选的约2周。在移除非贴壁细胞后，收集例如经胰蛋白酶消化所形成的高密度群落。将这些细胞收集并重悬于合适体积的培养基中，并定义为0代细胞。
然后可以将0代细胞用于接种扩增培养物。扩增培养可以是任意安排的分离的细胞培养设备，例如，NUNCTM的Cell Factory。0代培养细胞可以细分至任何程度用于接种扩增培养物，例如，1×103、2×103、3×103、4×103、5×103、6×103、7×103、8×103、9×103、1×104、1×104、2×104、3×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104、9×104、或10×104贴壁细胞。优选的，使用约1×103至约3×104的0代细胞接种各扩增培养物。扩增培养物数量可以取决于0代细胞的数量，也可以更多或更少，其取决于贴壁细胞来源的特定胎盘。
然后可以使扩增培养物生长至培养物中的细胞密度达到特定值，例如，约1×105细胞/cm2。在这个点上可以将细胞进行收集和低温贮藏，或传代至新的如上所述的扩增培养物。细胞在使用前可以传代例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。优选的在扩增培养中持续记录群体倍增累积数量。0代培养细胞可以扩增2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40倍，或高达60倍。然而，优选的，在将细胞群分为个体剂量前，群体倍增数量为约15至约30倍。细胞可以在扩增过程中连续培养，或可以在扩增过程中的一个或更多时间点进行冷冻。
用于个体剂量的细胞可以进行冷冻，例如，进行低温贮藏以待后用。个体剂量可以包括，例如，约1百万至约5千万细胞每mL，且可以包括约106至约1010细胞总量。
在一个实施方式中，含有羊膜来源的贴壁细胞的细胞库可以通过下述方法进行制备，包括：从人产后胎盘扩增原代培养羊膜来源的贴壁细胞作为第一次的多个群体倍增；低温贮藏细胞形成原始细胞库；可选的从原始细胞库扩增多个细胞用于第二次的多个群体倍增；低温贮藏扩增的细胞形成工作细胞库；可选的从工作细胞库扩增多个扩增的羊膜来源的贴壁细胞用于第三次的多个群体倍增；以及按照个体剂量低温贮藏得到的扩增细胞，其中所述个体剂量共同组成细胞库。细胞库可以含有单独的羊膜来源的贴壁细胞的剂量或批次，或可以含有羊膜来源的贴壁细胞的组合批次和另一种细胞的批次或剂量，例如，另一种干细胞或祖细胞。优选的，各个体剂量只含有羊膜来源的贴壁细胞。在另一个具体的实施方式中，在所述原代培养的所有所述细胞都来自于相同胎盘。在另一个具体的实施方式中，所述个体剂量含有约104至约105细胞。在另一个具体的实施方式中，所述个体剂量含有约105至约106细胞。在另一个具体的实施方式中，所述个体剂量含有约106至约107细胞。在另一个具体的实施方式中，所述个体剂量含有约107至约108细胞。在另一个具体的实施方式中，所述个体剂量含有约108至约109细胞。在另一个具体的实施方式中，所述个体剂量含有约109至约1010细胞。
在某些实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞可以从工作细胞库中解冻并培养多个群体倍增。当产生期望数量的细胞时，或发生期望数量的群体倍增时，可以通过例如离心来收集贴壁细胞，并重悬于溶液中，其含有，例如，葡聚糖，例如，5％葡聚糖。在某些实施方式中，葡聚糖为葡聚糖-40。在某些实施方式中，细胞被二次收集并重悬于含有葡聚糖和低温贮藏剂的溶液中，例如，含有10％HAS和2％-20％例如5％DMSO的5％葡聚糖(例如，葡聚糖-40)溶液，并进行低温贮藏。可以对低温贮藏的羊膜来源的贴壁细胞进行解冻，例如，在使用之前立刻解冻。
在优选的实施方式中，对胎盘的捐献人(例如，母亲)检测至少一种病原体。在某些实施方式中，如果母亲对病原体测试呈阳性，则丢弃来自胎盘的整个批次。该检测可以在羊膜来源的贴壁细胞批次生产的任何时间进行，包括在0代细胞培植前后，或扩增培养过程中。待检测的病原体可以包括但不限于，肝炎A、肝炎B、肝炎C、肝炎D、肝炎E、人免疫缺陷病毒(I和II型)、巨细胞病毒、疱疹病毒等等。
5.8羊膜来源的贴壁细胞的用途
本发明提供了包含羊膜来源的贴壁细胞的组合物。这些组合物的例子包括药物组合物(参见下述5.8.1节)；基质和支架(参见下述5.8.2节)，和羊膜来源的贴壁细胞条件化培养基(参见下述5.8.3节)。
5.8.1包含羊膜来源的贴壁细胞的组合物
在某些实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞包含于药物组合物或为其中的组分。可以按照利于对个体进行施用的方式制备细胞，例如，羊膜来源的贴壁细胞，其被置于一个适于进行医药用途的容器内。该容器可以是，例如，注射器、无菌塑料袋、烧瓶、罐、或其它容器，其中羊膜来源的血管生成细胞群可以很容易地进行分配。例如，容器可以是血袋或其它塑料的、适于液体静脉施用至受体的医学上可接受的袋子。在某些实施方式中，容器允许低温贮藏细胞。在此提供的组合物例如药物组合物中的细胞可以包括羊膜来源的贴壁细胞，后者衍生于单一供体或多个供体。细胞对于目标受体而言可以是完全的HLA-匹配，或部分或完全的HLA-不匹配。
从而，在一个实施方式中，在此提供的组合物中的羊膜来源的贴壁细胞以在容器中含有羊膜来源的贴壁细胞的组合物的形式施用至有需求的个体。在另一个具体的实施方式中，容器为袋子、烧瓶或罐。在更具体的实施方式中，所述袋子是无菌塑料袋。在一个更加具体的实施方式中，所述袋子适于，允许或有利于所述贴壁细胞的静脉施用，例如，通过静脉输液，弹丸注射等。袋子可以包括多个腔或隔间，其相互连通以允许在施用前或施用中混合细胞和一种或更多其它溶液，例如，一种药物。在另一个具体的实施方式中，低温贮藏前，含有羊膜来源的贴壁细胞的溶液包含一种或更多有利于低温贮藏细胞的化合物。在另一个具体的实施方式中，所述羊膜来源的贴壁细胞存在于生理可接受的水溶液中。在一个更加具体的实施方式中，所述生理可接受的水溶液为0.9％NaCl溶液。在另一个具体的实施方式中，所述羊膜来源的贴壁细胞包括对所述细胞的受体HLA-匹配的胎盘细胞。在另一个具体的实施方式中，所述羊膜来源的贴壁细胞包括对所述细胞的受体至少部分HLA-不匹配的细胞。在另一个具体的实施方式中，所述羊膜来源的贴壁细胞衍生于多个供体。在各个具体的实施方式中，所述容器包括约、至少、或最多1×106所述细胞、5×106所述细胞、1×107所述干细胞、5×107所述细胞、1×108所述细胞、5×108所述细胞、1×109所述细胞、5×109所述细胞、或1×1010所述细胞。在关于任何前述低温贮藏群体的其它具体的实施方式中，所述细胞已经传代约，至少，或不多于5次，不多于10次，不多于15次，或不多于20次。在关于任何前述低温贮藏细胞的另一个具体的实施方式中，所述细胞已经在所述容器中进行了扩增。在具体的实施方式中，单一单位剂量的羊膜来源的贴壁细胞可以包括，在不同的实施方式中，约，至少，或不多于1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011或更多的羊膜来源的贴壁细胞。
在某些实施方式中，在此提供的药物组合物包含羊膜来源的贴壁细胞群，其包括50％活细胞或更多(即，在群体中至少50％的细胞为有功能的或存活的)。优选的，在群体中至少60％的细胞是活细胞。更加优选的，在药物组合物的群体中至少70％、80％、90％、95％、或99％的细胞是活细胞。
5.8.2包含羊膜来源的贴壁细胞的基质
进一步在此提供的是组合物，其包含基质、水凝胶、支架，等等。该组合物可用于代替或辅助液体悬液中的该细胞。
基质可以是，例如，永久的或可降解的去细胞化的组织，例如，去细胞化的羊膜，或合成的基质。基质可以是三维支架。在一个更加具体的实施方式中，所述基质包含胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、果胶、鸟氨酸、或玻璃体粘连蛋白。在另一个更具体的实施方式中，基质为羊膜或羊膜来源的生物材料。在另一个更具体的实施方式中，所述基质包含胞外膜蛋白。在另一个更具体的实施方式中，所述基质包含合成的化合物。在另一个更具体的实施方式中，所述基质包含生物活性化合物。在另一个更具体的实施方式中，所述生物活性化合物为生长因子、细胞因子、抗体、或低于5,000道尔顿的有机分子。
在此描述的羊膜来源的贴壁细胞可被接种至天然基质上，例如，胎盘生物材料例如羊膜材料。该羊膜材料可以是，例如，直接切开哺乳动物胎盘得到的羊膜；固定的或热处理的羊膜、基本上干燥的(即，＜20％H2O)羊膜，绒膜、基本上干燥的绒膜、基本上干燥的羊膜和绒膜，等等。可以接种在此提供的羊膜来源的贴壁细胞的优选的胎盘生物材料描述于Hariri，美国申请公开号2004/0048796，其公开内容在此全文引入作为参考。
在另一个具体的实施方式中，基质为包含胞外基质的组合物。在一个更加具体的实施方式中，所述组合物为MATRIGELTM(BDBiosciences)。
在此描述的分离的羊膜来源的贴壁细胞可悬浮于例如适合注射的水凝胶溶液。水凝胶为例如有机聚合物(天然或合成的)，其通过共价键、离子键或氢键交联形成三维开放式晶格结构，包围水分子形成凝胶。适合该组合物的水凝胶包括自组装肽，例如RAD16。在一个实施方式中，含有细胞的水凝胶溶液可以允许例如在模子中硬化形成具有用于移植的分散细胞的基质。该基质中的羊膜来源的贴壁细胞在例如移植前也可以进行培养，从而细胞进行有丝分裂扩增。水凝胶形成材料包括例如海藻酸及其盐的多糖、多肽、含磷氮链聚合物和聚丙烯酸酯，其离子化交联；或嵌段共聚物，例如聚氧化乙烯-聚丙烯醇嵌段共聚物，其分别通过温度或pH进行交联。在一些实施方式中，水凝胶或基质是生物可降解的。
在某些实施方式中，在此提供的含有细胞的组合物，包含原位可聚合的凝胶(参见，例如，美国专利申请公开2002/0022676；Anseth等人，J.Control Release，78(1-3)：199-209(2002)；Wang等人，Biomaterials，24(22)：3969-80(2003)。在一些实施方式中，聚合物在诸如水、缓冲盐溶液、或具有荷电侧链基团的水性醇溶液、或其单价离子盐等的水性溶液中至少部分溶解。能与阳离子反应、具有酸性侧链基团的聚合物的例子有聚(磷氮基)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、聚(醋酸乙烯酯)、以及例如磺化聚苯乙烯的磺化聚合物。也可以使用具有酸性侧链基团的共聚物，其通过丙烯酸或甲基丙烯酸与乙烯醚单体或聚合物反应形成。酸性基团的例子有羧酸基团、磺酸基团、卤化(优选的氟化)醇基团、酚OH基团，和酸性OH基团。
在一个具体的实施方式中，基质为毡，其可以由诸如PGA、PLA、PCL共聚物或混纺或透明质酸等生物吸收材料制成的复丝纱线制成。纱线使用标准纺织工艺技术制成毡，包括卷边、剪裁、梳理和针织。在另一个优选的实施方式中，本发明的细胞接种到可以是复合结构的泡沫支架上。另外，三维框架可以模塑为可用的形状，例如需要修复、替换或扩张的特定身体结构。其它可用的支架例子包括非织毡、多孔泡沫或自组装多肽。可以使用含有合成的乙醇酸和乳酸共聚物(例如，PGA/PLA)(VICRYL，Ethicon，Inc.，Somerville，N.J.)的可吸收共聚物的纤维制成非织毡。通过诸如冷冻干燥或冻干的过程进行制备(参见，例如，美国专利号6,355,699)的聚(ε-己内酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物组成的泡沫也可以用作支架。
在此描述的羊膜来源的贴壁细胞可接种于三维框架或支架上，并植入体内。该框架可以与任何一种或更多的例如刺激组织形成的，例如骨骼形成或脉管形成的生长因子、细胞、药物或其它组分一起移植。
在另一个实施方式中，在此提供的胎盘羊膜来源的贴壁细胞可以接种于泡沫支架上，其可以是复合结构。该泡沫支架可以模塑为可用的形状，例如需要修复、替换或扩张的特定身体结构的部分。在一些实施方式中，框架使用例如0.1M乙酸进行处理，然后在细胞接种前在聚赖氨酸、PBS和/或胶原蛋白中孵育，以增强细胞吸附。基质外表面可以进行修饰以增强细胞吸附或生长以及组织分化，例如采用血浆包被基质，或添加一种或更多蛋白(例如，胶原蛋白，弹性纤维，网状纤维)、糖蛋白、粘多糖(例如，硫酸肝素、软骨素-4-硫酸盐、软骨素-6-硫酸盐、皮肤素硫酸盐、角质素硫酸盐，等)、细胞基质和/或其它材料，例如但不限于明胶、海藻酸、琼脂、琼脂糖、和植物胶，等等。
在一些实施方式中，基质包括使其不致栓塞的材料，或经其处理。这些处理和材料也可以促进和维持内皮生长、迁移和胞外基质沉积。这些材料和处理的例子包括但不限于天然材料，例如基膜蛋白，例如层粘连蛋白和IV型胶原蛋白；合成材料例如EPTFE；和切开的聚氨酯脲硅酮，例如PURSPANTM(The Polymer Technology Group，Inc.，Berkeley，Calif.)。基质也可以包括抗血栓剂例如肝磷脂；支架也可以在接种在此提供的贴壁细胞前进行处理改变表面电荷(例如，血浆包被)。
框架可以在接种在此提供的羊膜来源的贴壁细胞前进行处理以增强细胞吸附。例如，在接种本发明的细胞前，可以使用0.1摩尔乙酸处理尼龙基质并在聚赖氨酸、PBS和/或胶原蛋白中孵育以包被尼龙。可以使用硫酸对聚苯乙烯进行类似处理。
另外，三维框架外表面可以进行修饰以增强细胞吸附或生长以及组织分化，例如采用血浆包被框架，或添加一种或更多蛋白(例如，胶原蛋白、弹性纤维、网状纤维)、糖蛋白、粘多糖(例如，硫酸肝素、软骨素-4-硫酸盐、软骨素-6-硫酸盐、皮肤素硫酸盐、角质素硫酸盐)、细胞基质和/或其它材料，例如但不限于明胶、海藻酸、琼脂、琼脂糖、或植物胶。
在一些实施方式中，基质包括使其不致栓塞的材料，或经其处理，例如天然材料，例如基膜蛋白，例如层粘连蛋白和IV型胶原蛋白；和合成材料例如EPTFE或切开的聚氨酯脲硅酮，例如PURSPAN(The PolymerTechnology Group，Inc.，Berkeley，Calif)。该材料可以进一步处理使得支架不致栓塞，例如，使用肝磷脂处理，以及改变材料表面电荷的处理，例如血浆包被。
包括羊膜来源的贴壁细胞的治疗的细胞组合物还可以以基质-细胞复合物的形式提供。基质可以包括生物可相容的支架、点阵、自组装结构等等，不论其可生物吸收与否或是液体、凝胶或固体。本领域已知该基质可用于治疗细胞处理、手术恢复、组织工程和创伤愈合。在某些实施方式中，细胞附着于基质。在其它实施方式中，细胞包埋或包含在基质空间内。最优选的是那些细胞与基质紧密相连生长的基质-细胞复合物，且当医疗上使用时，其刺激并支撑受体细胞的向内生长，或刺激或支撑血管生成。基质-细胞组合物可用本领域已知的任何方法导入个体体内，包括但不限于植入、注射、手术附着、移植其它组织、注射等等。在一些实施方式中，基质形成于体内或原位。例如，可以使用原位可聚合凝胶配合本发明。该凝胶的例子是本领域已知的。
在一些实施方式中，在此提供的细胞接种至该三维基质上，例如支架，并植入体内，其中接种的细胞在框架上或框架内进行增殖或在体内帮助培植替换组织，其中可以有其它细胞的协同作用，也可以没有。羊膜来源的贴壁细胞或其共培养物在三维框架的生长优选的导致形成三维组织或其基础，其可以在体内进行利用，例如用于修复损坏的或患病的组织。例如，三维支架可用于形成管状结构，例如用于修复血管；或循环系统或冠状结构的方面。按照本发明的一个方面，羊膜来源的贴壁细胞或其共培养物被接种于三维框架或基质，例如支架、泡沫或水凝胶。框架可以设置为不同形状，例如基本为平的、基本为圆柱的或管状的，或可以完全是自由形态的，因为可能需要或要求其在考虑之中为可修正的结构。在一些实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞生长于三维结构，而在其它实施方式中，细胞只是勉强存活或甚至死亡，但刺激或促进了受体内的新组织向内生长或血管形成。
本发明的细胞可以在培养物中自由生长，从培养物中移出并接种至三维框架。用一定浓度细胞接种三维框架，例如，大约106至5×107细胞每微升，优选的导致三维支撑的培植以相对较短的时间进行。另外，在一些应用中可以优选的使用更多或更少的细胞数量，其取决于期望的效果。
在一个具体的实施方式中，可以将基质切成条状(例如，形状为矩形)，其宽度大约等于其最终将要插入的管状器官的内径。羊膜来源的贴壁细胞可以接种至支架并通过流动或悬浮于液体培养基中进行培养。当达到合适的汇合度阶段，可以通过将长边接在一起将支架卷入管中。然后可以使用合适材料、合适直径的纤维缝合两个边缘将缝隙封闭。为了防止细胞堵塞内腔，可以将管状框架的一个开口端固定在喷嘴上。可以将液体培养基从连接培养室的来源室进行挤压通过喷嘴，在管状框架内部形成流体。可以将另一个开口端固定于出液孔，其连接收集室，其中培养基可以通过来源室进行再循环。当培养完成后可以使管子脱离喷嘴和出液孔。参见，例如，国际申请号WO 94/25584。
一般而言，可以按照本发明使用任何下述方法将两个三维框架组合成一个管子。可以将两个或更多平面框架置于另一个顶部并进行缝合。然后可以将得到的双层片进行翻卷，并按照上述方法进行连接和密封。在某些实施方式中，可以用羊膜来源的贴壁细胞接种一个作为内层的管状支架并进行培养。可以将第二支架生长为扁平条带，其宽度略大于管状框架的外径。在获得合适的生长后，将扁平框架包在管状支架的外部，然后封闭扁平框架两端的缝隙并将扁平框架密封至内管。在另一个实施方式中，可以将两种或更多直径稍有不同的管状网络进行分别生长。可以将具有较小直径的框架插入较大的内部并进行密封。对于每种这样的方法，可以通过对双层管重复使用该方法在其中添加更多的层。可以在羊膜来源的贴壁细胞生长的任何阶段组合支架，且组合支架的培养可以在需要时继续进行。
与上述操作一起，在此提供的细胞和治疗组合物可与能够移植的设备一起使用。例如，羊膜来源的贴壁细胞可以与例如支架、人工瓣膜、心室辅助设备、电解可脱性弹簧圈等等一同施用。由于所述设备可能构成针对需要该治疗的个体的主要治疗手段，细胞等可以用作辅助性治疗剂或第二治疗剂使用，以辅助、刺激或促进植入设备区域的适当愈合。本发明的细胞和治疗组合物还可以用于预处理某些可移植设备，以最小化其在体内使用时的问题。该预处理的设备，包括包被的设备，可以更好地被移植它们的患者所接纳，降低了局部或系统性感染的风险，或例如血管重狭窄或进一步闭塞的风险。
5.8.3羊膜来源的贴壁细胞条件化培养基
在此进一步提供了羊膜来源的贴壁细胞条件化培养基，即，包含贴壁细胞分泌或排出的一种或更多生物分子的培养基。在不同的实施方式中，条件化培养基包括培养基中细胞生长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次群体倍增，或更多。在其它实施方式中，条件化培养基包括培养基中羊膜来源的贴壁细胞已经生长到至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％汇合度，或直至100％汇合度。该条件化培养基可用于支撑细胞群的培养，例如，干细胞，例如，胎盘干细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、成体干细胞等。在另一个实施方式中，条件化培养基包括培养基中羊膜来源的贴壁细胞和非羊膜来源的贴壁细胞被共同培养。
条件化培养基可以包括在此提供的贴壁细胞。从而，本发明提供了包括羊膜来源的贴壁细胞的细胞培养物。在一个具体的实施方式中，条件化培养基包括多个，例如，羊膜来源的贴壁细胞群。
5.9修饰的羊膜来源的贴壁细胞
5.9.1遗传修饰的羊膜来源的贴壁细胞
在另一个方面，在此描述的羊膜来源的贴壁细胞可以是遗传修饰的，例如，以制备目标核酸或多肽，或制备分化型细胞，例如成骨细胞、成心肌细胞、周细胞或血管生成细胞，其制备目标核酸或多肽。例如，羊膜来源的贴壁细胞可以进行修饰制备血管生成因子，诸如促血管生成分子、可溶性因子和受体或或促迁移分子例如趋化因子，例如，基质细胞衍生的因子1(SDF-1)或趋化因子受体。可以使用例如基于病毒的载体进行遗传修饰，包括但不限于，非整合型复制载体，例如，乳突瘤病毒载体，SV40载体、腺病毒载体；整合型病毒载体，例如，逆转录病毒载体或腺体相关的病毒载体；或复制-缺陷型病毒载体。将DNA导入细胞的其它方法包括使用脂质体、电穿孔、基因枪、直接DNA注射等。
在此提供的贴壁细胞可以，例如，转化或转染DNA，其被控制或可操作地连接一种或更多合适的表达调控元件，例如，启动子或增强子序列、转录终止子、多腺苷酸化位点、内部核酸进入位点。优选的，该DNA包括可选标记。在外源DNA导入后，工程化的贴壁细胞可以例如在富集培养基中生长并随后转移至选择培养基。在一个实施方式中，用于工程化羊膜来源的贴壁细胞的DNA包括编码目标多肽的核酸序列，例如，细胞因子、生长因子、分化剂或治疗多肽。
用于工程化贴壁细胞的DNA可以包括任何本领域已知的启动子以在哺乳动物细胞，例如，人细胞中驱动表达核苷酸序列。例如，启动子包括但不限于CMV启动子/增强子、SV40启动子、乳突瘤病毒启动子、Epstein-Barr病毒启动子、弹性蛋白基因启动子等等。在一个具体的实施方式中，启动子是可调节的，从而核苷酸序列只有在需要时才进行表达。启动子可以是诱导型(例如，与金属硫蛋白和热休克蛋白相关的)或组成型的。
在另一个具体的实施方式中，启动子为组织特异性或表现出组织特异性。该启动子的例子包括但不限于肌凝蛋白轻链-2基因控制区(Shani，1985，Nature 314：283)(骨骼肌)。
在此公开的羊膜来源的贴壁细胞可以进行工程化或用其他方式选择“敲除(knockout)”或“抑制(knock down)”一种或更多基因在该细胞中的表达。细胞自身基因的表达可以通过例如同源重组的方式使基因完全失活来进行抑制。在一个实施方式中，例如，通过诸如neo的阳性筛选标记打断编码蛋白重要区域的外显子或5’至该区域的外显子，防止从目标基因产生常规mRNA并导致该基因失活。还可以通过在基因的一部分创造缺口或缺失整个基因来使基因失活。通过使用具有在基因组上彼此远离的两个目标基因的同源区域的构建子，可以缺失介于该两个区域之间的序列(Mombaerts等人，1991，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.88：3084)。抑制目标基因表达的反义、吗啉(morpholinos)、DNA酶、干扰小RNA、短发卡样RNA和核酶分子也可以用于降低贴壁细胞中的目标基因活性。例如，已发现抑制主要的组织相容性基因复合物(HLA)表达的反义RNA分子对于免疫响应而言是最通用的。可以使用三螺旋分子降低目标基因活性水平。参见，例如，L.G.Davis等人(编辑)，1994，BASIC METHODS INMOLECULAR BIOLOGY，第2版，Appleton&Lange，Norwalk，Conn.，其在此引入作为参考。
在一个具体的实施方式中，在此公开的羊膜来源的贴壁细胞可以使用包括编码目标多肽的核苷酸序列的核酸分子进行遗传修饰，其中目标多肽的表达是可通过外源因子控制的，例如，多肽、有机小分子，等。目标多肽可以是治疗多肽。在一个更加具体的实施方式中，目标多肽是IL-12或白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)。在另一个更具体的实施方式中，目标多肽为白细胞介素-1受体拮抗剂与二氢叶酸还原酶(DHFR)融合物，且外源因子为抗叶酸素，例如，氨甲喋呤。该构建子通过接触氨甲喋呤可用于工程化羊膜来源的贴壁细胞，其表达IL-1Ra、或IL-1Ra和DHFR融合物。该构建子可用于，例如，治疗风湿性关节炎。在本实施方式中，在暴露于诸如氨甲喋呤的抗叶酸素时IL-1Ra和DHFR融合物转译上调。从而，在另一个具体的实施方式中，用于遗传工程化羊膜来源的贴壁细胞的核酸可以包括核苷酸序列，其编码第一多肽和第二多肽，其中所述第一和第二多肽作为融合蛋白进行表达，其在外源因子存在下转译上调。多肽可以短暂或长期(例如，经过数周或数月的时间)表达。该核酸分子可以另外包括编码多肽的核苷酸序列，其允许对工程化的细胞进行阳性筛选，或允许工程化细胞可视化。在另一个更具体的实施方式中，核苷酸序列编码多肽，其在例如荧光素酶(Luc)的适当可视化条件下发生荧光。在一个更加具体的实施方式中，该核酸分子可以包括IL-1Ra-DHFR-IRES-Luc，其中IL-1Ra为白细胞介素-1受体拮抗剂，IRES为核糖体内部进入位点，以及DHFR为二氢叶酸还原酶。
5.9.2永生化羊膜来源的贴壁细胞系
哺乳动物羊膜来源的贴壁细胞可以通过转染任何含有促生长基因的合适载体进行有条件的永生化，即，编码在适当条件下促进转染细胞生长的蛋白的基因，从而促生长蛋白的制备和/或活性可以由外部因子调节。在优选的实施方式中促生长基因为癌基因，例如但不限于，v-myc、N-myc、c-myc、p53、SV40大T抗原、多瘤病毒大T抗原、E1a腺病毒或人乳突瘤病毒E7蛋白。在另一个实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞可以使用cre-lox重组永生化，如Narushima，M.等人，(Nature Biotechnology，2005，23(10：1274-1282)中的针对人胰腺β-细胞系的例子所示。
促生长蛋白的外部调控可以通过将促生长基因置于外部可调节的启动子的控制下进行，例如，一种活性可以通过例如改变转染细胞或与细胞接触的培养基组合物的温度进行控制的启动子。在一个实施方式中，可以采用四环素(tet)控制的基因表达系统(参见Gossen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551，1992；Hoshimaru等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：1518-1523，1996)。在tet不存在的情况下，在该载体中的tet-控制的反式激活子(tTA)强烈激活来自的转录，后者是来自人巨细胞病毒的最小启动子，其与tet操纵子序列融合。tTA为转座子-10衍生的大肠杆菌(Escherichia coli)tet抗性操纵子抑制剂(tetR)与单纯疱疹病毒VP16的酸性区域的融合蛋白。低的、无毒性的tet浓度(例如，0.01-1.0μg/mL)被tTA几乎完全取消了反式激活。
在一个实施方式中，载体进一步包含编码可选标记的基因，例如，产生抗药性的蛋白。细菌新霉素抗性基因(neoR)是一种可用于本方法的标记。携带neoR的细胞可以通过本领域一般技术人员知晓的方法进行筛选，例如将100-200μg/mL G418添加至生长培养基中。
转染可以通过本领域一般技术人员知晓的方法进行，包括但不限于，逆转录病毒感染。一般而言，细胞培养物可以通过与收集自载体的生产细胞系的条件化培养基混合物和含有N2补充物的DMEM/F12一起孵育进行转染。例如，按照上述制备的胎盘细胞培养物可以在体外例如5天后通过与一体积的条件化培养基和两体积的含有N2补充物的DMEM/F12孵育约20小时进行转染。然后可以按照上述筛选携带可选标记的转染的细胞。
转染后，将培养物传代到允许增殖的表面，例如，允许至少30％的细胞在24小时的时间内倍增。优选的，基质为聚鸟氨酸/层粘连蛋白基质，包括包被有聚鸟氨酸(10μg/mL)和/或层粘连蛋白(10μg/mL)的组织培养塑料、聚赖氨酸/层粘连蛋白基质或用纤维粘连蛋白处理的表面。然后每3-4天给培养物补充生长培养基，其中可以或可以不补充一种或更多增殖-增强因子。增殖-增强因子可以在培养物低于50％汇合度状态下添加至生长培养基。
条件永生化的羊膜来源的贴壁细胞系可以使用标准技术传代，例如当80-95％汇合度时通过胰蛋白酶消化。在一些实施方式中，直至大约第20代才有利于维持筛选(例如通过在含有新霉素抗性基因的细胞中添加G418)。也可以将细胞冷冻在液氮中长时间保存。
可以从根据上述制备的条件永生化的贴壁细胞系中分离无性细胞系。一般而言，该无性细胞系可以使用标准技术进行分离，例如通过有限稀释或使用克隆环(cloningring)，并进行扩增。无性细胞系一般可以按照上述进行培养和传代。
条件永生化的人羊膜来源的贴壁细胞系，其可以是克隆的，但不是必需，一般可以通过在利于分化的培养条件下抑制促生长蛋白的制备和/或活性进行诱导分化。例如，如果编码促生长蛋白的基因在外部可调节的启动子的控制下，诸如温度或培养基组合物的条件可以进行改变以抑制促生长基因的转录。对于上述四环素控制的基因表达系统，可以通过添加四环素抑制促生长基因的转录进行分化。一般而言，4-5天的1μg/mL四环素足以启动分化。为了促进进一步分化，在生长培养基中可以还包含其它试剂。
5.10使用羊膜来源的贴壁细胞进行治疗的方法
5.10.1循环系统疾病
在此提供的羊膜来源的贴壁细胞、该细胞的群体和包含羊膜来源的贴壁细胞的细胞群，可用于治疗表现出多种血管生成可以改善的疾病状态或症状的个体。所述疾病状态或症状的例子包括心肌梗塞、中风、充血性心力衰竭、周围动脉疾病、左心发育不全综合症、糖尿病溃疡、褥疮溃疡、静脉溃疡、动脉溃疡、灼伤、骨折不愈合、肿瘤相关的骨质疏松、骨关节炎和口腔颌面骨修复。羊膜来源的贴壁细胞，和该细胞的群体，还可以用于促进表现出外伤组织缺损或防止形成伤疤的个体、或具有全关节置换或镶牙的个体的血管生成。
在一个更加具体的实施方式中，在此提供的羊膜来源的贴壁细胞和该细胞的群体，可用于治疗患有循环系统功能不全的个体，例如，患有周围血管疾病或冠状动脉疾病的个体。
在一个方面，本发明提供了用于治疗患有心脏病或心脏损伤的患者的方法，包括向患有心脏或循环系统疾病或损伤的患者施用治疗性细胞组合物，并评价患者心脏功能的改善，其中所述细胞组合物包含在此描述的羊膜来源的贴壁细胞。在一个实施方式中，心脏病为心肌病。在具体的实施方式中，心肌病是先天性的或具有已知原因的心肌病。在其它具体的实施方式中，心肌病本质上为缺血性的或非缺血性的。在另一个实施方式中，心脏或循环系统疾病包括一种或多种的血管成形术、动脉瘤、心绞痛(心绞痛症)、主动脉瓣狭窄、主动脉炎、心率不齐、动脉硬化、动脉炎、非对称性心室间隔肥厚(ASH)、动脉粥样硬化、心房纤颤和扑动、细菌性心内膜炎、Barlow综合征(二尖瓣脱垂)、心动过缓、Buerger疾病(血栓闭塞性脉管炎)、心脏肥大、心肌病、心脏炎、颈动脉疾病、主动脉缩窄、先天性心脏病(先天性心脏缺陷)、充血性心力衰竭(心脏衰竭)、冠状动脉疾病、Eisenmenger综合征、栓塞、心内膜炎、红斑性肢痛病、纤维性颤动、肌纤维发育不良、心传导阻滞、心杂音、高血压、低血压、先天性婴儿动脉钙化、川崎病(粘膜皮肤淋巴腺症候群、粘膜皮肤淋巴腺疾病、婴儿多动脉炎)、代谢综合征、微血管心绞痛、心肌梗塞(心脏病发作)、心肌炎、阵发性房性心动过速(PAT)、结节性动脉周围炎(多动脉炎、结节性多动脉炎)、心包炎、周围血管疾病、严重肢体缺血、糖尿病血管病变、静脉炎、肺动脉瓣狭窄(肺狭窄)、Raynaud病、肾动脉狭窄、肾血管性高血压、风湿性心脏病、隔膜缺陷、心肌缺血、综合征X、心动过速、高安氏动脉炎、法洛四联症、大血管移位、三尖瓣闭锁、动脉干、瓣膜性心脏病、曲张性溃疡、静脉曲张、血管炎、心室隔膜缺陷、Wolff-Parkinson-White综合征、或心内膜垫缺陷。
在其它实施方式中，心脏或循环系统疾病包括一种或多种的急性风湿性发烧、急性风湿性心包炎、急性风湿性心内膜炎、急性风湿性心肌炎、慢性风湿性心脏病、二尖瓣疾病、二尖瓣狭窄、风湿性二尖瓣机能不全、主动脉瓣疾病、其它心内膜结构疾病、缺血性心脏病(急性和亚急性)、心绞痛、肺循环疾病(急性肺心病、肺栓塞、慢性肺心病)、脊柱后侧凸性心脏病、心肌炎、心内膜炎、心内膜心肌纤维化、心内膜纤维弹性组织增生、房室传导阻滞、心节律异常、心肌变性、包括脑血管疾病的循环系统疾病、脑前动脉闭塞和狭窄、脑动脉闭塞、动脉疾病、小动脉和毛细血管疾病(动脉粥样硬化、动脉瘤)、或静脉和淋巴管疾病。
在一个实施方式中，治疗包括使用包含羊膜来源的贴壁细胞的治疗性细胞组合物治疗患有心肌病的患者，其中使用或不使用另一种细胞类型。在其它优选的实施方式中，患者从该治疗中受益，例如受益于所述羊膜来源的贴壁细胞支持其它细胞生长的能力，包括心脏中的干细胞或祖细胞，来自组织生长或血管化中的组织，和受益于有益细胞因子、趋化因子、细胞激素等等的存在，但是所述羊膜来源的贴壁细胞细胞不整合入患者体内或在其中扩增。在另一个实施方式中，患者从所述细胞治疗中受益，但是所述细胞在患者体内并不存活很久。在一个实施方式中，细胞的数量、活力或生化活性逐渐降低，在其它实施方式中，细胞的减少可以在一段活性周期之前，例如生长、分裂或生化活性。在其它实施方式中，衰老的、无活力的或者甚至是死亡的所述细胞都可能具有有益的治疗效果。
患有循环系统疾病或紊乱的个体的改善可以通过对循环系统疾病或紊乱的一种或更多的症状的可检测地改善进行评价或表现，其中个体被施用在此提供的羊膜来源的贴壁细胞或治疗组合物。
在另一个实施方式中，患有循环系统疾病或紊乱的个体的改善可以通过对一种或更多心功能指标的可检测地改善进行评价或表现，其中个体被施用在此提供的羊膜来源的贴壁细胞或治疗组合物，例如，与施用羊膜来源的贴壁细胞前的该个体相比，在以下一种或多种方面表现出可检测地改善：胸部心输出量(CO)、心指数(CI)、肺动脉楔压(PAWP)、和心指数(CI)、％缩短分数(％FS)、射血分数(EF)、左心室射血分数(LVEF)；左心室舒张末内径(LVEDD)、左心室收缩末内径(LVESD)、收缩性(例如dP/dt)、压力-容积环、心脏功能检测、心房或心室功能增强；泵效率增加、泵效率损失速率降低、血液动力学功能损失降低；以及与心肌病相关的并发症减少。
接受在此提供的治疗组合物的个体的改善也可以通过主观指标进行评价，例如，个体对他或她在施用后的健康状况的自我评价。
在某些实施方式中，细胞的成功施用并不取决于施用的羊膜来源的贴壁细胞在个体中的存活。相反，所述成功是基于心脏或循环健康的一种或更多改善的指标，如上所述。从而，所述细胞不需要整合并与患者的心脏一起跳动，或进入血管。
在某些实施方式中，在此提供的治疗方法包括诱导治疗性的羊膜来源的贴壁细胞按照间充质谱系进行分化，例如，分化成为心肌细胞样表型、血管生成表型或血管原性表型，或形成诸如肌细胞、成心肌细胞、内皮细胞、心内膜细胞、心外膜细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞(例如血管平滑肌细胞)的细胞。
对需要的个体施用羊膜来源的贴壁细胞或包含该细胞的治疗组合物，可以通过以下方式进行，例如，通过植入、移植(例如，细胞自身或作为基质-细胞组合的一部分的细胞)、注射(例如，直接至疾病或状况的位置，例如，直接至患有心肌梗塞的个体的心脏缺血位置)、融合、导管传输或任何其它本领域已知的用于提供细胞治疗的方法。
在一个实施方式中，治疗性细胞组合物通过例如在个体的一个或多个位置处进行注射来提供给有需求的个体。在一个具体的实施方式中，治疗性细胞组合物通过心内注射进行提供，例如，至缺血性的心脏区域。在其它具体的实施方式中，细胞注射到心脏表面、相邻区域或甚至更远的区域。在优选的实施方式中，可以将细胞锚定(home)至患病或受伤的区域。
患有冠状或血管系统疾病或状况的个体可以在细胞利于治疗的任何时间施用羊膜来源的贴壁细胞。在某些实施方式中，例如，本发明的细胞或治疗组合物在心肌梗塞的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天内施用。对于心肌梗塞，例如1-3或1-7天内的接近时间施用优于较晚施用，例如，心肌梗塞3或7天后。在其它实施方式中，本发明的细胞或治疗组合物在对疾病或状况初诊后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24小时，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30天内进行施用。
在此还提供了用于治疗心肌梗塞的试剂盒。试剂盒中提供治疗性细胞组合物，其可以制成药学上可接受的形式，例如通过混合药学上可接受的载体；和涂药器，以及使用说明。理想的，该试剂盒可用于例如在医师办公室中，或通过急救提供者应用给经诊断患有心肌梗塞或类似的心脏事件的患者。
在此提供的治疗方法的具体的实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞与干细胞(即，并非羊膜来源的贴壁细胞的干细胞)、成肌细胞、肌细胞、心成肌细胞、成心肌细胞，或成肌细胞、肌细胞、心成肌细胞、和/或成心肌细胞的祖细胞一起施用。
在一个具体的实施方式中，在此提供的治疗方法包括施用羊膜来源的贴壁细胞，例如，包含所述细胞的治疗组合物，至患有心脏或循环系统疾病的患者；以及评价患者心功能的改善，其中治疗性细胞组合物作为基质-细胞复合物进行施用。在某些实施方式中，基质为支架，优选的可生物吸收，其至少包含细胞。
为此，本发明提供了羊膜来源的贴壁细胞群，其在刺激干细胞或祖细胞向心原性、血管原性、血管生成或血管原等途径分化的一种或更多因子存在的条件下进行孵育。所述因子是本领域已知的；可以通过常规实验来确定适于分化的条件。所述因子包括但不限于因子，例如生长因子、趋化因子、细胞因子、细胞产物、去甲基化试剂和其它刺激物，其现在已知或以后确定为能够刺激例如干细胞向心原性、血管原性、血管生成或血管原等途径或谱系分化。
通过在包含至少一种的去甲基化试剂、BMP、FGF、Wnt因子蛋白、Hedgehog和/或抗Wnt因子等因子存在的情况下培养细胞，可以使得羊膜来源的贴壁细胞向心原性、血管原性、血管生成或血管原等途径或谱系分化。
含有去甲基化试剂允许细胞向心原性途径的间质系进行分化。分化可以通过下述方式进行测定，例如表达至少一种的心肌凝蛋白、骨肌凝蛋白或GATA4；或自发或用其他方式诱导获得心律；或能够至少部分整合至患者的心肌中而不会诱发心率不齐的能力。可用于启动所述分化的去甲基化试剂包括但不限于5-氮杂胞苷、5-氮杂-2’-脱氧胞苷、二甲亚砜、氯化白屈菜赤碱、类维生素A或其盐、2-氨基-4-(乙基硫)丁酸、普鲁卡因胺、和普鲁卡因。
在此的某些实施方式中，经上述鉴定使用一种或更多因子进行诱导的细胞可以成为心原性、血管原性、血管生成或血管原细胞或祖细胞。优选的至少一些细胞可以至少部分整合至受体的心血管系统，包括但不限于心肌、血管和心脏的其它结构，心血管或周边血管，等等。在某些其它的实施方式中，分化的羊膜来源的贴壁细胞分化为获得能够识别心原性细胞或其祖细胞的两种或更多标记的细胞，且能够部分或全部整合至受者的心脏或维管系统。在具体的实施方式中，给个体施用的细胞不会增加心率不齐、心脏缺陷、血管缺陷或个体循环系统或健康的其它异常。在某些实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞能够促进天然存在于患者心肌、血管、血液等等的干细胞的分化，其自身分化成例如成心肌细胞，或至少向心原性、血管原性、血管生成或血管原系分化。
羊膜来源的贴壁细胞和所述细胞的群体可以作为治疗或预防来提供给个体，例如，患有心脏或循环系统疾病、紊乱或症状、或感染的个体。所述疾病、紊乱或症状可以包括由动脉粥样硬化、心肌病或心损伤引起的充血性心力衰竭，例如，缺血性损伤，例如来自心肌梗塞或创伤(急性或慢性)。
在某些实施方式中，对个体施用治疗有效量的羊膜来源的贴壁细胞，例如，在包含羊膜来源的贴壁细胞的细胞群中。在一个具体的实施方式中，所述群体包含约50％的羊膜来源的贴壁细胞。在另一个具体的实施方式中，所述群体为基本上均匀的羊膜来源的贴壁细胞群。在其它实施方式中，所述群体包含至少约5％、10％、20％、25％、30％、33％、40％、60％、66％、70％、75％、80％、或90％的羊膜来源的贴壁细胞。
羊膜来源的贴壁细胞可以以包含该细胞和另一种下述治疗剂的治疗组合物的形式对个体施用，例如胰岛素样生长因子(IGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、IL-8、抗血栓形成剂(例如、肝磷脂、肝磷脂衍生物、尿激酶、和PPack(右旋苯丙氨酸脯氨酸精氨酸氯甲基酮)；抗凝血酶化合物、血小板受体拮抗剂、抗凝血酶抗体、抗血小板受体抗体、阿司匹林、双嘧达莫、鱼精蛋白、水蛭素、前列腺素抑制剂、和/或血小板抑制剂)、抗凋亡剂(例如，EPO、EPO衍生物和类似物及其盐、TPO、IGF-I、IGF-II、肝细胞生长因子(HGF)或半胱天冬酶抑制剂)、抗炎剂(例如，P38MAP激酶抑制剂、他汀、IL-6和IL-1抑制剂、吡嘧司特、曲尼司特、类克、西罗莫司，非类固醇类抗炎症化合物例如乙酰水杨酸、布洛芬、替泊沙林、托美丁、或舒洛芬)、免疫抑制剂或免疫调节剂(例如，钙神经素抑制剂，例如环孢菌素、他罗利姆，mTOR抑制剂例如西罗莫司或依维莫司；抗增生剂例如硫唑嘌呤和麦考酚酸吗乙酯；皮质类固醇，例如，泼尼松龙或氢化可的松；抗体，例如单克隆抗IL-2Rα受体抗体、巴利昔单抗、Daclizuma，多克隆抗T-细胞抗体例如抗胸腺细胞球蛋白(ATG)，抗淋巴细胞球蛋白(ALG)，和单克隆抗T细胞抗体OKT3，或描述于美国专利号7,468,276和美国专利申请公布号2007/0275362的贴壁胎盘干细胞，其公开内容全文引入作为参考)，和/或抗氧化剂(例如，普罗布可；维生素A、C和E，辅酶Q-10，谷胱甘肽，L半胱氨酸，N-乙酰半胱氨酸，或前述抗氧化剂的衍生物、类似物或盐)。在某些实施方式中，包含羊膜来源的贴壁细胞的治疗组合物进一步包含一种或更多另外的细胞类型，例如，成体细胞(例如，成纤维细胞或内胚层细胞)或干细胞或祖细胞。该治疗剂和/或一种或更多另外的细胞可分别施用至有需求的个体，或施用两种或更多的该化合物或试剂的组合。
在某些实施方式中，待治疗的个体为哺乳动物。在一个具体的实施方式中，待治疗的个体为人。在具体的实施方式中，个体为家畜类动物或家畜。在其它具体的实施方式中，待治疗的个体为马、羊、牛或阉公牛、猪、狗或猫。
5.10.2中风和其它缺血性疾病
在某些实施方式中，本发明提供了治疗患有例如在脑内或脑周围或在周围维管系统中血流破坏(disruption)的个体的方法，其包括施用至个体治疗有效量的AMDAC。在某些特定实施方式中，缺血为周围动脉疾病(PAD)，例如，严重肢体缺血(CLI)。在某些其它的实施方式中，缺血为中枢神经系统(CNS)缺血。在某些其它的实施方式中，缺血为周围动脉疾病、缺血性血管疾病、缺血性心脏病，缺血性脑部疾病或缺血性肾疾病。
在一个具体的实施方式中，所述血流破坏为中风。在一个更加具体的实施方式中，所述中风为缺血性的中风。在另一个更具体的实施方式中，所述中风为出血性中风，例如，颅内脑出血或自发性蛛网膜下腔出血。在另一个具体的实施方式中，所述破裂为血肿。在更加具体的实施方式中，血肿为硬脑膜血肿、硬膜下血肿或蛛网膜下腔血肿。在另一个具体的实施方式中，所述血肿由头盖骨受到外力所引起，例如，头部损伤。在另一个具体的实施方式中，所述破裂为短暂性脑缺血发作(TIA)，例如，再生性TIA。在另一个具体的实施方式中，所述破裂为血管痉挛，例如，出血性中风后的血管痉挛。
在本方法的另一个具体的实施方式中，所述治疗有效量为一定的AMDAC的数量，其消除、可检测地改善引起所述个体表现出的脑内或脑周围或CNS的血流破坏例如缺氧损伤或低氧损伤的一种或更多症状或神经性缺乏，或减轻上述一种或更多症状或神经性缺乏严重程度或减缓它们的进程。在另一个具体的实施方式中，所述治疗有效量的分离的AMDAC被预防性地施用至所述个体，例如，减少或消除由所述血流破坏之后在脑内或脑周围或CNS的二次或继发性血流破坏引起的神经损伤。
在另一个具体的实施方式中，所述脑内或脑周围的血流破坏症状，例如，中风，缺氧损伤或低氧损伤，是以下症状中的一种或多种：偏瘫(半身麻痹)；轻偏瘫(半身无力)；面部肌肉无力；麻木；感觉降低；嗅觉、味觉、听觉或视觉改变；嗅觉、味觉、听觉或视觉损失；眼睑下垂(下垂症)；可检测的眼球外肌无力；咽反射降低；吞咽能力降低；瞳孔光反应降低；面部感觉降低；平衡降低；眼球震颤；呼吸速率改变；心跳速率改变；胸锁乳突肌无力，难以或无法转动头部；舌头无力；失语症(不能说话或理解语言)；失用症(改变的随意运动)；视野缺陷；记忆缺失；半边忽略或半侧空间忽视(损伤另一侧的视野空间注意力缺乏)；思维瓦解；思维混乱；发展猥亵手势(hypersexual gestures)；病感失认(坚持拒绝承认存在缺陷)；行走困难；运动协调性改变；眩晕；平衡不稳；意识丧失；头疼；和/或呕吐。
在另一个具体的实施方式中，上述治疗方法包括对所述个体施用第二治疗剂。在一个更加具体的实施方式中，所述第二治疗剂为神经保护剂。在一个更加具体的实施方式中，所述第二治疗剂为NXY-059(一种苯基丁基硝酮的二磺酰基衍生物：二钠4-((叔-丁亚胺)-甲基)苯-1，3-二磺酸N-氧化物，或二钠4-((氧化-叔-丁基-胺亚基)-甲基)苯-1，3-二磺酸；也称为disufenton)。在另一个更具体的实施方式中，第二治疗剂为溶血栓剂。在一个更加具体的实施方式中，所述溶血栓剂为组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)。在脑内或脑周围的血流破坏为出血性的实施方式中，第二治疗剂可以是抗高血压药，例如，a、β阻断剂或利尿药物，利尿药物和保钾利尿药物的组合，a、β阻断剂和利尿药物的组合，血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂和利尿剂的组合，血管紧张肽-II拮抗剂和利尿药物，和/或钙通道阻断剂和ACE抑制剂。在另一个更具体的实施方式中，第二治疗剂为钙通道阻断剂，谷氨酸拮抗剂，γ氨基丁酸(GABA)激动剂，抗氧化剂或自由基清除剂。
在另一个具体的治疗方法实施方式中，所述分离的AMDAC在所述个体脑内或脑周围发展出血流破坏的一种或更多症状的21-30天内，例如，21天内施用至所述个体，例如，在发展出中风、缺氧损伤或低氧损伤的症状的21-30天内，例如，21天内。在另一个具体的治疗方法实施方式中，所述分离的AMDAC在所述个体脑内或脑周围发展出血流破坏的一种或更多症状的14天内施用至所述个体。在另一个具体的治疗方法实施方式中，所述分离的AMDAC在所述个体脑内或脑周围发展出血流破坏的一种或更多症状的7天内施用至所述个体。在另一个具体的治疗方法实施方式中，所述分离的AMDAC在所述个体脑内或脑周围发展出血流破坏的一种或更多症状的48小时内施用至所述个体。在另一个具体的实施方式中，所述分离的AMDAC在所述个体脑内或脑周围发展出血流破坏的一种或更多症状的24小时内施用至所述个体。在另一个具体的实施方式中，所述分离的AMDAC在所述个体脑内或脑周围发展出血流破坏的一种或更多症状的12小时内施用至所述个体。在另一个具体的实施方式中，所述分离的AMDAC在所述个体脑内或脑周围发展出血流破坏的一种或更多症状的3小时内施用至所述个体。
在一个具体的实施方式中，所述血流破坏为严重肢体缺血(CLI)。在另一个更具体的实施方式中，所述CLI为下肢动脉严重堵塞，其显著降低血流量。在另一个更具体的实施方式中，所述CLI的特征为缺血性的休息痛，当人不动的时候腿部和足部发生重度疼痛，腿部或足部未治愈的溃疡，足部疼痛或麻木，腿部或足部的有光泽的、光滑的、干枯的皮肤，脚趾甲变厚，腿部或足部脉搏不存在或消失，开放性溃疡，无法愈合的皮肤感染或溃疡，腿部或足部的干性坏疽(干燥、黑色皮肤)。在另一个具体的实施方式中，CLI可以引起指头或整个肢体的受损。在本方法的另一个具体的实施方式中，所述治疗有效量为一定的AMDAC的数量，其消除、可检测地改善所述个体脑内或脑周围或CNS的血流破坏例如缺氧损伤或低氧损伤引起的一种或更多肢体功能缺损或不供氧(氧不足/缺氧)的症状，减轻上述症状严重的程度或减缓进程。在另一个具体的实施方式中，所述治疗有效量的分离的AMDAC预防性地施用至所述个体，例如，减少或消除由所述血流破坏之后在肢体内或其周围的二次或继发性的血流破坏引起的组织损伤。
5.10.3施用剂量和途径
将AMDAC施用至有需求的个体时可以采用任何医学上可接受的与待治疗的疾病或状况相关的途径。在上述治疗方法的另一个具体的实施方式中，所述AMDAC通过弹丸注射施用。在另一个具体的实施方式中，所述分离的AMDAC通过静脉输液施用。在一个具体的实施方式中，所述静脉输液为静脉输液约1至约8小时。在另一个具体的实施方式中，所述分离的AMDAC通过颅内施用。在另一个具体的实施方式中，所述分离的AMDAC通过肌肉注射施用。在另一个具体的实施方式中，所述分离的AMDAC通过腹膜内施用。在另一个具体的实施方式中，所述分离的AMDAC通过动脉内施用。在一个更加具体的实施方式中，所述分离的AMDAC在缺血性区域内施用。在另一个更具体的实施方式中，所述分离的AMDAC施用至缺血性区域周围。在另一个特别的治疗方法实施方式中，所述分离的AMDAC通过肌肉注射、皮内或皮下施用。
在上述治疗方法的另一个具体的实施方式中，所述AMDAC对所述个体施用一次。在另一个具体的实施方式中，所述分离的AMDAC两次或更多次施用至所述个体。在另一个具体的实施方式中，所述施用包括施用约1×104至1×105分离的AMDAC，例如，AMDAC每千克所述个体。在另一个具体的实施方式中，所述施用包括施用约1×105至1×106分离的AMDAC每千克所述个体。在另一个具体的实施方式中，所述施用包括施用约1×106至1×107分离的AMDAC每千克所述个体。在另一个具体的实施方式中，所述施用包括施用约1×107至1×108分离的胎盘细胞每千克所述个体。在其它具体的实施方式中，所述施用包括施用约1×106至约2×106分离的胎盘细胞每千克所述个体；约2×106至约3×106分离的胎盘细胞每千克所述个体；约3×106至约4×106分离的胎盘细胞每千克所述个体；约4×106至约5×106分离的胎盘细胞每千克所述个体；约5×106至约6×106分离的胎盘细胞每千克所述个体；约6×106至约7×106分离的胎盘细胞每千克所述个体；约7×106至约8×106分离的胎盘细胞每千克所述个体；约8×106至约9×106分离的胎盘细胞每千克所述个体；或约9×106至约1×107分离的胎盘细胞每千克所述个体。在另一个具体的实施方式中，所述施用包括施用至所述个体约1×107至约2×107分离的胎盘细胞每千克所述个体。在另一个具体的实施方式中，所述施用包括施用至所述个体约1.3×107至约1.5×107分离的胎盘细胞每千克所述个体。在另一个具体的实施方式中，所述施用包括施用至所述个体多达约3×107分离的胎盘细胞每千克所述个体。在一个具体的实施方式中，所述施用包括施用至所述个体约5×106至约2×107分离的胎盘细胞。在另一个具体的实施方式中，所述施用包括在约20毫升溶液中施用约150×106分离的胎盘细胞至所述个体。
在一个具体的实施方式中，所述施用包括施用约5×106至约2×107分离的胎盘细胞至所述个体，其中所述细胞包含在包括10％葡聚糖，例如，葡聚糖-40，5％人血清白蛋白，和可选的免疫抑制剂的溶液中。在另一个具体的实施方式中，所述施用包括静脉注射施用约5×107至3×109分离的胎盘细胞。在更加具体的实施方式中，所述施用包括静脉注射施用约9×108分离的胎盘细胞或约1.8×109分离的胎盘细胞。在另一个具体的实施方式中，所述施用包括颅内施用约5×107至1×108分离的胎盘细胞。在一个更加具体的实施方式中，所述施用包括颅内施用约9×107分离的胎盘细胞。
5.11羊膜来源的贴壁细胞的分化
在此提供的羊膜来源的贴壁细胞可以是分化的。在一个实施方式中，通过例如使细胞接触血管内皮生长因子(VEGF)，或按照描述于下述5.11.2、6.3.3或6.3.4节的方法，细胞已经充分分化至能够表现出至少一种的内皮细胞、肌性细胞或周细胞的特性。在更加具体的实施方式中，所述内皮细胞、肌性细胞或周细胞的特性是表达CD9、CD31、CD54、CD102、NG2(神经/神经胶质抗原2)或α平滑肌肌动蛋白中的一种或多种，其相对于OCT-4-、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+，和VE-钙粘蛋白-羊膜细胞而言表达增强。在其它更加特殊的实施方式中，所述内皮细胞、肌性细胞或周细胞的特性是表达CD9、CD31、CD54、CD102、NG2(神经/神经胶质抗原2)或α平滑肌肌动蛋白中的一种或多种，其相对于OCT-4-、VEGFR2/KDR+，和VEGFR1/Flt-1+羊膜细胞而言表达增强。
5.11.1诱导血管生成
在此提供的羊膜来源的贴壁细胞导致的血管生成可以通过如下方式进行。例如在-2(Lonza)的内皮细胞培养基中，或下述培养基中培养羊膜来源的贴壁细胞至第3代，所述培养基含有60％DMEM-LG(Gibco)，40％MCDB-201(Sigma)；2％胎牛血清(HycloneLabs.)；1×胰岛素-转铁因子-硒补充剂(ITS)；1×亚油酸-牛血清白蛋白(LA-BSA)；5×10- 9M地塞米松(Sigma)；10-4M抗坏血酸2-磷酸盐(Sigma)；表皮生长因子10ng/mL(R&DSYSTEMS)；以及血小板衍生的生长因子(PDGF-BB)10ng/mL(R&D SYSTEMS)。然后将细胞置于MATRIGELTM或基质包括胶原蛋白-1上，例如，在96-孔板中，其密度为，例如，约1.5×104细胞每孔，其在相同培养基中或具有包含例如约10-50ng每微升的血管内皮生长因子(VEGF)的FBS(0-5％v/v)的DMEM中。培养基可以约一周两次进行更换。血管生成通过视觉观察细胞出芽管样结构和管腔形成进行证实，其可以在例如50×-100×放大倍数的显微镜下进行观察。
5.11.2诱导分化为心肌细胞
在此提供的羊膜来源的贴壁细胞的肌源性(心源性)分化可以通过例如将细胞置于诱导分化为成心肌细胞的培养条件下来实现。优选的成心肌细胞培养基包括补充1μM类维生素A的DMEM/20％CBS；碱性成纤维细胞生长因子，10ng/mL；以及转化生长因子β-1，2ng/mL；以及表皮生长因子，100ng/mL。KnockOut血清替代品(Invitrogen，Carlsbad，California)可用于替代CBS。可选的，羊膜来源的贴壁细胞培养于补充1-100的DMEM/20％CBS中24小时，例如，50ng/mL的心肌营养蛋白-1。在另一个实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞可以培养10-14天，其中在无蛋白培养基中培养5-7天，然后使用例如在补充1％脐带血血清的1％HEPES缓冲液中匀浆人心肌得到的人心肌提取物进行刺激。
可以通过例如RT/PCR显示基因表达或通过可观察的细胞博动(beating)来确认分化。当细胞表现出一种或多种的这些特性时可以认为贴壁细胞已经分化为心肌细胞。
6.实施例
6.1实施例1：来自羊膜的贴壁细胞的分离和扩增
本实施例显示羊膜来源的贴壁细胞的分离和扩增。
6.1.1分离
羊膜来源的贴壁细胞按照下述方法从羊膜中分离。从胎盘切下羊膜/绒毛膜，并将羊膜从绒毛膜中进行手工分离。用无菌PBS洗涤羊膜去除剩余的血液、血块和其它物质。使用无菌纱布去除洗涤未曾除去的血液、血块或其它物质，并用PBS再次洗涤羊膜。从膜上去除多余的PBS，并用手术刀将羊膜切成2”乘2”的碎片。为了释放上皮细胞，通过将无菌加套的玻璃加工容器与37℃循环水浴使用管路和连接器进行连接，并安装至搅拌盘上，来构建加工容器。将胰蛋白酶(0.25％，300mL)在加工容器中加热至37℃；加入羊膜碎片，搅拌羊膜/胰蛋白酶悬液，例如，在37℃下100RPM-150RPM搅拌15分钟。将无菌容器置于靠近加工容器的无菌区域内并在其中插入无菌的75μm-125μm筛选器(Millipore，Billerica，MA)，装配无菌筛选系统。搅拌羊膜碎片15分钟后，将加工容器的内容物转移至筛选器，并使用例如无菌镊子将羊膜碎片转移回加工容器；丢弃含有上皮细胞的胰蛋白酶溶液。将羊膜碎片与如上所述的300mL胰蛋白酶溶液(0.25％)进行再次搅拌。用大约100-150mL的PBS洗涤筛选器，并丢弃PBS溶液。搅拌羊膜碎片15分钟后，将加工容器的内容物转移至筛选器。然后将羊膜碎片转移回加工容器；丢弃含有上皮细胞的胰蛋白酶溶液。将羊膜碎片与如上所述的300mL胰蛋白酶溶液(0.25％)进行再次搅拌。用洗涤筛选器大约100-150mL的PBS，并丢弃PBS溶液。搅拌羊膜碎片15分钟后，将加工容器的内容物转移至筛选器。然后将羊膜碎片转移回加工容器，并丢弃含有上皮细胞的胰蛋白酶溶液。在37℃下将羊膜碎片在PBS/5％FBS(体积比1∶1比例的羊膜∶PBS/5％FBS溶液)中搅拌大约2-5分钟中和胰蛋白酶。装配新鲜的无菌筛选系统。中和胰蛋白酶后，将加工容器的内容物转移至新筛选器，并将羊膜碎片转移回加工容器。室温下，将无菌PBS(400mL)加至加工容器，并将加工容器内容物搅拌约2-5分钟。用约100-150mL的PBS洗涤筛选器。搅拌后，将加工容器的内容物转移至筛选器；用PBS洗涤加工的烧瓶，并丢弃PBS溶液。用300mL预热的DMEM填充加工容器，并将羊膜碎片转移至DMEM溶液。
为了释放羊膜来源的贴壁细胞，将上述处理的羊膜进一步用胶原蛋白酶进行如下处理。通过在DMEM中溶解适当数量的胶原蛋白酶粉末(随着供应商提供的胶原蛋白酶批次的活性而变化)制备无菌胶原蛋白酶储存液(500U/mL)。将溶液经0.22μm滤器过滤并分装至单独的无菌容器中。将CaCl2溶液(0.5mL，600mM)加至各100mL剂量，并冷冻各剂量。在加工容器中将胶原蛋白酶(100mL)加至羊膜碎片，并对加工容器进行搅拌30-50分钟，或直至通过视觉观察羊膜已经消化完成。羊膜消化完成后，将100mL的预热的无菌PBS/5％FBS加至加工容器，并另外搅拌加工容器2-3分钟。搅拌后，烧瓶的内容物被转移至一个无菌60μm筛选器中，并通过真空过滤收集液体。加工容器用400mL的PBS洗涤，并无菌过滤该PBS溶液。然后将过滤的细胞悬液在20℃下离心300xg 15分钟，并将细胞沉淀重悬于预热的PBS/2％FBS(共大约10mL)。
6.1.2培植
新鲜分离的血管生成羊膜细胞被加至含有60％DMEM-LG(Gibco)；40％MCBD-201(Sigma)；2％FBS(Hyclone Labs)，1×胰岛素-转铁因子-硒补充剂(ITS)；10ng/mL亚油酸-牛血清白蛋白(LA-BSA)；1n-地塞米松(Sigma)；100μM抗坏血酸2-磷酸盐(Sigma)；10ng/mL表皮生长因子(R&D系统)；以及10ng/mL血小板衍生的生长因子(PDGF-BB)(R&D系统)的生长培养基中，并以10,000细胞每cm2的接种密度接种于T-Flask中。然后在37℃，5％CO2和＞90％湿度下孵育培养设备。每天监控细胞的附着、生长和形态。及时去除非贴壁细胞和碎片在更换培养。培养基每周更换两次。具有典型的成纤维样/纺锤形态的贴壁细胞在最初接种的几天后出现。当汇合度达到40％-70％(最初接种后4-11天)，通过胰蛋白酶消化(0.25％胰蛋白酶-EDTA)5分钟在室温下(37℃)收获细胞。用PBS-5％FBS中和后，细胞在室温下200-400g离心5-15分钟，然后重悬于生长培养基。这时，可以认为AMDAC系已经成功地在初代进行了培植。在一些情况下，将初代羊膜来源的贴壁细胞进行低温贮藏或扩增。
6.1.3培养方法
羊膜来源的贴壁细胞培养于上述生长培养基中并在密度为2000-4000每cm2下接种于合适的组织培养处理的培养设备。然后在37℃，5％CO2和＞90％湿度下孵育培养设备。培养过程中，AMDAC将会贴壁并增殖。每天监控细胞的生长、形态和汇合度。如果培养延续至5天或更多则每周更换两次培养基补充新鲜营养物。当汇合度达到40％-70％(接种后3-7天)时，通过胰蛋白酶消化(0.05％-0.25％胰蛋白酶-EDTA)5分钟在室温下(37℃)收获细胞。用PBS-5％FBS中和后，细胞在室温下200-400g离心5-15分钟，然后重悬于生长培养基。
按照本方法分离并培养的AMDAC一般在接种的1×106细胞中产生33530+/-15090集落形成单位(成纤维细胞)(CFU-F)。
6.2实施例2：羊膜来源的贴壁细胞的表型特性
6.2.1基因和蛋白表达谱
本实施例描述了羊膜来源的贴壁细胞的表型特性，包括细胞表面标记、mRNA和蛋白质表达等特性。
样品制备：羊膜来源的贴壁细胞按照描述于实施例1的方法获得。第6代的细胞在描述于上述实施例1的生长培养基中生长至大约70％汇合度，进行胰蛋白酶化和PBS洗涤。将NTERA-2细胞(美国模式培养物保藏所，ATCC编号CRL-1973)生长于含有4.5g/L葡萄糖、2mM谷氨酰胺和10％FBS的DMEM。进行有核细胞计数以获得最少2×106-1x107细胞。然后使用Qiagen RNeasy试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)裂解细胞，使用QIAshredder得到裂解物。然后使用Qiagen RNeasy试剂盒分离RNA。使用Nanodrop ND1000分光光度计检测RNA的数量和质量，25ng/μL RNA/反应。使用Applied Biosystems(Foster City，CA)的High CapacitycDNAArchive试剂盒进行cDNA反应。使用Applied Biosystems的 UniversalPCR Master Mixes进行实时PCR反应。在Applied Biosystems7300实时PCR系统中以标准模式进行40个循环的反应。
样品分析和结果：使用实时PCR方法和特定的基因表达探针和/或人血管生成阵列(Applied Biosystems)，表征了细胞的干细胞相关的血管生成性和心原性标记的表达。结果或者显示为与有关细胞对照相比目标基因的相对表达，或者与普遍存在的看家基因(例如，GAPDH、18S或GUSB)相比目标基因的相对表达(δCt)。
羊膜来源的贴壁细胞表达不同的干细胞相关性血管生成性和心原性基因，并且，与NTERA-2细胞相比，表现出相对缺失的OCT-4表达。表1总结了选定的血管生成、心原性和干细胞基因的表达。
表1：经RT-PCR测定羊膜来源的贴壁细胞基因表达谱。
“mRNA”栏表示在每个例子中测定特定标记的mRNA是否存在。
在一个单独的实验中，还发现AMDAC表达下述基因：芳基碳氢化合物受体核转运蛋白2(ARNT2)、神经生长因子(NGF)、脑衍生的神经营养因子(BDNF)、神经胶质衍生的神经营养因子(GDNF)、神经营养蛋白3(NT-3)、NT-5、低氧诱导的因子1α(HIF1A)、低氧诱导的蛋白2(HIG2)、血红素加氧酶(脱环)1(HMOX1)、胞外超氧化物歧化酶[Cu-Zn](SOD3)、过氧化氢酶(CAT)、转化生长因子β1(TGFB1)、转化生长因子β1受体(TGFB1R)和肝细胞生长因子受体(HGFR/c-met)。
6.2.2使用流式细胞术评价羊膜来源的贴壁细胞的血管生成能力
使用流式细胞术作为定量羊膜来源的贴壁细胞表型标记的方法来定义细胞同一性。细胞样品来自冷冻储存。解冻前和试剂制备过程中，将细胞瓶维持在干冰上。然后，使用37℃水浴快速解冻样品。使用预冰冻的细胞计数(count)来计算初始解冻后基于数量的细胞稀释液。将冷冻管在37℃水浴中短暂解冻大约30秒并轻轻搅拌。解冻后马上将大约100-200μL的冷的(2-8℃)解冻溶液(添加2.5％白蛋白和5％Gentran 40的PBS)加至冷冻管并混合。轻柔混合后，将冷冻管的内容物全部转移到含有相等体积的冷的(2-8℃)解冻溶液的15mL圆锥管中。去除上清液之前，在室温下圆锥管中400g离心肌细胞5分钟。剩余体积用移液管测量(估测)；在室温下剩余体积和细胞沉淀重悬于含1％FBS的PBS中，得到细胞浓度250×x103细胞/100μL缓冲液。例如，将1×106细胞重悬于400μL 1％FBS。将细胞悬液置于预标记的5mL FACS管(Becton Dickinson(BD)，FranklinLakes，NJ)。对于每种第一抗体类别，将100μL的细胞悬液分装至一个同型对照管。表型分析前，将全部抗体的浓度最优化以达到好的信号/噪声比以及CD抗原跨4-log动态范围的充分检测。对于用来染色各样品的各同型和样品抗体的体积进行了测定。为了标准化同型和样品管中抗体的量(以μg计)，各抗体的浓度按照下式计算：(1/实际抗体浓度(μg/μL))x(对于2.5×105细胞的目标最终抗体μg数)＝添加的抗体#μL。通过添加适当数量的抗体至各管中制备同型和样品抗体的master mix。将细胞在暗处室温下染色15-20分钟。染色后，通过离心(400g×5分钟)去除各样品中未结合的抗体，然后在重悬于150μL的室温1％FBS PBS之前使用2mL 1％FBSPBS(室温)洗涤。然后在Becton Dickinson FACSCalibur、FACSCantoI或BD FACSCantoII流式细胞仪中按照生产商的使用说明进行样品分析。在不设定实时设备补偿参数的情况下得到多参数流式细胞仪数据集(侧散射(SSC)、前散射(FSC)和整合荧光谱(FL))。在得到(数据)后使用FACSDiva软件根据生产商的使用说明测定补偿参数。这些设备的设定被应用至各个样品。在这些研究中所使用的荧光基团偶联物为别藻蓝蛋白(APC)、荧光剂647(AF647)、异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)和多甲藻素叶绿素蛋白(PerCP)，其全部来自BD Biosciences。表2总结了选定的细胞表面标记，包括血管生成标记的表达。
表2：按照流式细胞术测定的羊膜来源的贴壁细胞中表达的细胞表面标记。
“免疫定位流式细胞术”一栏表示通过免疫定位，特别是流式细胞术测定特定标记是否存在。
在另一个实验中，AMDAC细胞被标记了抗人CD49f(藻红蛋白-偶联的克隆GoH3；BDPharmingen商品号555736)，并通过流式细胞术进行分析。大约96％的AMDAC标记了抗CD49f(即，为CD49f+)。
在另外的实验中，通过免疫定位还发现AMDAC表达CD49a、CD106、CD119、CD130、c-met(肝细胞生长因子受体；HGFR)、CXC趋化因子受体1(CXCR1)、PDGFRA、和PDGFRB。通过免疫定位还发现AMDAC缺乏CD49E、CD62E、成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)、肿瘤坏死因子受体超家族成员12A(TNFRSF12A)、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、趋化因子受体1(CCR1)、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、表皮生长因子受体(EGF-R)、胰岛素受体(CD220)、白细胞介素受体4(IL4-R；CD124)、IL6-R(CD126)、TNF-R1a和1b(CD120a、b)以及erbB2/Her2的表达。
6.2.3使用免疫组织化学(IHC)/免疫荧光化学(IFC)评价羊膜来源的贴壁细胞的血管生成能力
将第6代羊膜来源的贴壁细胞在4孔腔式载玻片上生长至大约70％汇合度并用4％福尔马林溶液各固定30分钟。固定后，用PBS洗涤载玻片两次5分钟。将载玻片与来自第二抗体相同宿主的10％常规血清、2×酪蛋白和PBS中0.3％的Triton X100一起在室温下的湿度箱中孵育20分钟。吸干过量血清并用第一抗体(山羊多克隆IgG(Santa Cruz；Santa Cruz，CA))在湿度箱中孵育载玻片。孵育温度和时间取决于针对所用抗体选择的最优条件。一般而言，孵育时间为37℃下1-2小时或4℃下过夜。然后用PBS洗涤载玻片三次各5分钟并在室温下湿度箱中与针对第一抗体(兔抗山羊抗体(Santa Cruz))宿主的荧光-偶联的抗免疫球蛋白第二抗体一起孵育20-30分钟。随后用PBS洗涤载玻片三次各5分钟，使用DAPI(Vector Labs)装好盖玻片，加入溶液以复染胞核。细胞染色可以使用Nikon荧光显微镜进行观测。所有图像均采用相等的曝光时间，其针对对应类别(山羊IgG(SantaCruz))的背景进行标准化。表3总结了羊膜来源的贴壁细胞表达血管生成蛋白的结果。
表3：羊膜来源的贴壁细胞存在或缺失的血管生成标记。
羊膜来源的贴壁细胞表达血管生成标记肿瘤内皮细胞标志物7(TEM-7)，表3所示蛋白质中的一种。参见图2。
6.2.4使用膜蛋白质组学评价羊膜来源的贴壁细胞的血管生成能力
膜蛋白纯化：将第6代羊膜来源的贴壁细胞在生长培养基中生长至大约70％汇合度，胰蛋白酶消化，并用PBS洗涤。在细胞裂解前，将细胞用含有蛋白酶抑制剂混合物(P8340，Sigma Aldrich，St.Louis，MO)的溶液孵育15分钟。然后通过添加10mM HCl溶液(从而避免使用洗涤剂)裂解细胞并在400g下离心10分钟以沉淀和去除胞核。将去核上清液转移至超离心管并使用具有T-1270转子(Thermo Fisher Scientific，Asheville，NC)的WX80超速离心机在100,000g下离心150分钟，产生膜蛋白沉淀。
蛋白脂质体的生成、固定化和消化：将膜蛋白沉淀用Nanoxis缓冲液(10mM Tris，300mM NaCl，pH 8)洗涤几次。将膜蛋白沉淀重悬于1.5mL的Nanoxis缓冲液中，然后使用VIBRA-CELLTM VC505超声处理器(Sonics&Materials，Inc.，Newtown，CT)在冰上尖端超声20分钟。通过使用FM1-43染料(Invitrogen，Carlsbad，CA)染色测定蛋白脂质体大小并用荧光显微镜观察。蛋白脂质体悬液的蛋白浓度通过BCA分析(ThermoScientific)测定。然后使用标准移液管头将蛋白脂质体注射至LPITMFlowCell(Nanoxis AB，Gothenburg，Sweden)并使之固定化1小时。固定化以后，进行一系列洗涤步骤，并直接向LPITM Flow Cell注射胰蛋白酶5μg/mL(Princeton Separations，Adelphi，NJ)。37℃下将芯片孵育过夜，并将胰蛋白酶多肽从LPITM芯片上洗脱，然后使用Sep-Pak盒(WatersCorporation，Milford，MA)脱盐。
LTQ线性离子阱LC/MS/MS分析：将各胰蛋白酶消化样品在0.2mm×150mm 3μm MAGIC C18柱(Michrom Bioresources，Inc.，Auburn，CA)上分离，其直接连接于沿轴式去溶剂化真空辅助纳米毛细管级电喷雾电离(ADVANCE)源(Michrom Bioresources，Inc.)。使用180分钟梯度(缓冲液A：水，0.1％甲酸；缓冲液B：乙腈，0.1％甲酸)。ADVANCE源在非常高的流速3μL/min下操作是可以达到相当于传统的纳米ESI的灵敏度。在LTQ线性离子阱质谱仪(Thermo Fisher Scientific，SanJose，CA)上对洗脱的多肽进行分析，其在各全扫描质谱后采用10数据依赖的MS/MS扫描。对各生物样品收集7个分析重复数据集。
生物信息学：对各细胞系收集的7个分析重复数据集对应的7个RAW文件进行搜索作为针对IPI人数据库的单独搜索，其中使用SorcererSoloTM工作站(Sage-N Research，SanJose，CA)实施的SEQUEST算法。指定1.2amu的肽质量允差、甲硫氨酸氧化作为差分修正、以及脲甲基化作为静态修正。使用Trans-Proteomic Pipeline(TPP)实施的支架软件来分类和解析膜蛋白质组学数据。对于那些鉴定为肽概率95％、蛋白概率95％且为唯一肽的蛋白考虑进行分析。使用自身发展的自定义Perl脚本对于膜蛋白质组学数据集进行比较。
结果：如表4所示羊膜来源的贴壁细胞表达不同的血管生成和心原性标记。
表4：羊膜来源的贴壁细胞表达的心原性或血管生成标记。
6.2.5使用分泌蛋白质组谱评价羊膜来源的贴壁细胞的血管生成能力
蛋白阵列：将第6代的羊膜来源的贴壁细胞按照与生长培养基中相等的数量接种，4天后收集条件化培养基。使用RayBiotech血管生成蛋白阵列(Norcross，GA)对于细胞条件化培养基中的多个血管生成细胞因子/生长因子进行同步定性分析。简要地，将蛋白阵列与2mL 1×封闭缓冲液(Ray Biotech)一起在室温下孵育30分钟(min)以封闭膜。然后，倾倒出封闭缓冲液并将膜与1mL的样品(用各自的细胞条件化生长培养基4天)在室温下一起孵育1-2小时。然后，倾出样品并将膜用2mL 1×洗涤缓冲液I(RayBiotech)在室温下振荡洗涤3×5min。然后，将膜用2mL 1×洗涤缓冲液II(Ray Biotech)在室温下振荡洗涤2×5min。其后，将1mL稀释的生物素-偶联抗体(Ray Biotech)加至各膜，在室温下孵育1-2小时，并用如上所述的洗涤缓冲液进行洗涤。然后将稀释的HRP-偶联的链霉亲和素(2mL)加至各膜，并将膜在室温下孵育2小时。最终，再次洗涤膜，按照说明书用ECLTM检测试剂盒(Amersham)进行孵育，对结果用Kodak Gel Logic 2200成像系统进行观察和分析。AMDAC分泌的各种血管生成蛋白显示于图3。
ELISA：使用商业可获得的R&D SYSTEMS(Minneapolis，MN)试剂盒对细胞条件化培养基中的单一血管生成细胞因子/生长因子进行了定量分析。简要地，根据生产商的使用说明进行ELISA分析，条件化培养基中的每种血管生成生长因子的数量被归一化为1×106细胞。羊膜来源的贴壁细胞(n＝6)表现出大约4500pg VEGF每百万细胞和大约17,200pg IL-8每百万细胞。
表5：血管生成标记的ELISA结果
在另一个实验中，经确认AMDAC还分泌促血管新生蛋白因子-1、促血管新生蛋白因子-2、PECAM-1(CD31；血小板内皮细胞粘附分子)、层粘连蛋白和纤维粘连蛋白。
6.2.6AMDAC的微RNA表达证实了血管生成活性
本实施例显示了AMDAC比骨髓来源的间质干细胞表达更高水平的某些微-RNA(miRNA)和更低水平的某些其它miRNA，这些表达分别与血管生成功能相关。
已经知道促-血管生成miR-296通过调节生长因子受体水平来调节血管生成功能。例如，内皮细胞中的miR-296显著有助于血管生成，其通过直接靶向肝细胞生长因子-调控酪氨酸激酶基质(HGS)mRNA，导致HGS水平降低并从而降低HGS-介导的生长因子受体VEGFR2和PDGFRb的降解。参见Würdinger等人，Cancer Cell 14：382-393(2008)。另外，miR-15b和miR-16已显示控制VEGF的表达，后者为一种涉及血管生成的促-血管生成因子，且低氧诱导的miR-15b和miR-16的减少导致VEGF的增加，VEGF为一种促-血管生成细胞因子。参见Kuelbacher等人，Trends inPharmacological Sciences，29(1)：12-15(2007)。
按照描述于上述实施例1的方法制备AMDAC。使用MIRVANATMmiRNA分离试剂盒(Ambion，Cat#1560)用AMDAC和BM-MSC细胞(用作比较)进行微RNA(miRNA)的制备。将0.5×106-1.5×106细胞在变性裂解缓冲液中进行破碎。然后，用酸-酚+氯仿抽提样品，分离高度富集小RNA分子的RNA。加入100％乙醇使得样品含25％乙醇。当该裂解物/乙醇混合物经过玻璃纤维滤器后，大的RNA被固定化，小RNA分子被在过滤物中进行收集。过滤物的乙醇浓度随后增至55％，且将该混合物经过第二玻璃纤维滤器，其中小RNA分子被固定化。对该RNA进行洗涤并使用低离子强度溶液进行洗脱。回收的小RNA的浓度和纯度通过检测其在260和280nm的吸光度进行测定。
发现AMDAC能够表达下述血管生成miRNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、(血管生成miRNA簇17-92的成员)、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、miR-16。还发现AMDAC比骨髓来源的间质干细胞(BM-MSC)表达更高水平的下述血管生成miRNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92(血管生成miRNA簇17-92的成员)、miR-296。这些结果很好地符合观察到的AMDAC高水平表达VEGFR2/KDR(参见上述)。相反，发现AMDAC比BM-MSC表达更低水平的下述血管生成miRNA：miR-20a、miR-20b、(血管生成miRNA簇17-92的成员)、miR-221、miR-222、miR-15b、miR-16。miR-15b和miR-16的减少表达符合观察到的AMDAC中更高水平的VEGF表达。
6.3实施例3：羊膜来源的贴壁细胞的功能表征
本实施例显示AMDAC与血管生成和分化能力相关的不同特性。
6.3.1HUVEC管腔形成评价羊膜来源的贴壁细胞的血管生成能力
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在第3代或更少的代时被次培养于EGM-2培养基(Cambrex，East Rutherford，NJ)中3天，并在汇合度为大约70％-80％时进行收获。将HUVEC用基本培养基/抗生素(DMEM/F12(Gibco))洗涤一次并以期望的浓度重悬于相同培养基。在HUVEC制备的1小时之内使用。将人胎盘胶原蛋白(HPC)用10mM HCl(pH 2.25)配成浓度为1.5mg/mL，用缓冲液“中和”至pH 7.2并置于冰上直至使用。将HPC与HUVEC悬液混合至细胞终浓度为4000细胞/μl。得到的HUVEC/HPC悬液马上移液至96-孔板中，3μl每孔(板周围需要预先填充无菌PBS以防止蒸发，每个条件下n＝5)。将HUVEC液滴在不添加培养基的情况下孵育于37℃和5％CO275-90分钟以允许胶原蛋白聚合。在“干燥”孵育完成后，轻柔地在各孔中填充200μl条件化的AMDAC培养基(n＝5细胞系)或对照培养基(例如，DMEM/F12作为阴性对照，EGM-2作为阳性对照)并在37℃和5％CO2下孵育20小时。通过将第6代羊膜来源的贴壁细胞在生长培养基中孵育4-6小时制备条件化培养基；在贴壁和扩散后，将培养基替换为DMEM/F12培养24小时。孵育后，将培养基从孔中移除，而不干扰HUVEC液滴，并将孔用PBS洗涤一次。然后使HUVEC液滴固定10秒并使用Diff-Quik细胞染色试剂盒染色1分钟，然后用无菌水洗涤3次。风干染色的液滴，使用Zeiss SteReo Discovery V8显微镜获取各孔的图像。然后使用计算机软件包“ImageJ”和/或MatLab分析图像。将图像从彩色转为8-bit灰度图像，并设置临界值转化为黑白图像。然后使用粒子分析特征来对图像进行分析，后者提供像素密度数据，包括计数(个体粒子的数量)、总面积、(个体粒子的)平均大小和面积分数，其等价于分析中的内皮管腔形成数。
条件化培养基对于内皮细胞具有血管生成效果，如诱导增殖管腔的形成所示(参见图4)。
6.3.2HUVEC迁移分析
本实验显示羊膜来源的贴壁细胞的血管生成能力。HUVEC在纤维粘连蛋白(FN)包被的12-孔板上生长至全满，并用1mL塑料移液管头“划伤”单层以在全孔内形成细胞系。通过用5种羊膜来源的贴壁细胞系生长3天获得的无血清的条件化培养基(EBM2；Cambrex)孵育“受伤的”细胞来检测HUVEC迁移。不含细胞的EBM2培养基用作对照。15小时后，使用反转的显微镜记录细胞记录(n＝3)迁移至非细胞区的细胞。然后使用计算机软件包“ImageJ”和/或MatLab分析图像。将图像从彩色转为8-bit灰度图像，并设置临界值转化为黑白图像。然后使用粒子分析特征来对图像进行分析，后者提供像素密度数据，包括计数(个体粒子的数量)、总面积、(个体粒子的)平均大小和面积分数，其等价于分析中的内皮迁移数。将细胞迁移的程度相对于初始记录的受伤细胞系的大小进行计分，并将结果归一化为1×106细胞。
羊膜来源的贴壁细胞分泌的营养因子对于内皮细胞具有血管生成效果，如诱导细胞迁移所示(图5)。
在一个单独的实验中，HUVEC在FN-包被的96-孔板上生长至半满，通过用来自5种各自的羊膜来源的贴壁细胞系(EBM-2培养基，3天)的无血清的条件化培养基孵育细胞检测诱导增殖。EBM-2培养基用作阴性对照，EGM-2用作阳性对照。48小时后，通过使用PromegaCell Titer AZ One Solution Cell Proliferation Assay(Promega，Madison，WI)检测DNA含量对细胞增殖进行评分。误差线表示分析平行重复(n＝3)的标准误差，结果被归一化为1×106细胞。
羊膜来源的贴壁细胞分泌的营养因子导致DNA浓度的增加，其表示了HUVEC的增殖。参见图6，其中“CM”为条件化培养基。
6.3.3使用乙酰化低密脂蛋白(AcLDL)的摄取来评价羊膜来源的贴壁细胞的血管生成能力
培养的内皮细胞和微神经胶质细胞可以通过其吸收荧光AcLDL的能力进行鉴定。如果LDL载脂蛋白的赖氨酸残基被乙酰化，那么LDL复合物不再结合LDL受体，相反其可以被内皮细胞和巨噬细胞以高度细胞特异性的方式摄取。
羊膜来源的贴壁细胞或者生长于不添加VEGF的生长培养基，或者生长于添加VEGF的EGM2-MV(Cambrex)，以评价羊膜来源的贴壁细胞的一般血管生成能力，以及VEGF对羊膜来源的贴壁细胞分化潜力的影响。细胞培养于12-孔板上各自的培养基中4-7天，直至达到70-80％汇合度，然后与10μg/mL乙酰化LDL(Invitrogen)一起孵育过夜。然后使用钙黄绿素AM(Invitrogen)复染色细胞并使用荧光显微镜评价其乙酰化LDL吸收。HUVEC作为乙酰化LDL吸收的对照细胞生长于EGM2-MV并进行如上所述的分析。羊膜来源的贴壁细胞在正常生长条件下表现出最小的乙酰化LDL吸收，但会在受到VEGF刺激的情况下诱导/分化至吸收能力增强。参见图7。
6.3.4使用管腔形成来评价羊膜来源的贴壁细胞的血管生成能力
羊膜来源的贴壁细胞或者生长于不添加VEGF的生长培养基，或者生长于添加VEGF的EGM2-MV，以评价羊膜来源的贴壁细胞的一般血管生成能力，以及VEGF对羊膜来源的贴壁细胞分化潜力的影响。HUVEC作为管腔形成的对照细胞生长于EGM2-MV。细胞培养于各自培养基4-7天，直至达到70-80％汇合度。将冷的(4℃)MATRIGELTM溶液(50μL；BDBiosciences)分散至12-孔板的孔中，将板在37℃孵育60min允许溶液凝胶化。对AMDAC和HUVEC细胞进行胰蛋白酶化，重悬于适当培养基中(含有或不含VEGF)，并将100μL的稀释的细胞(1-3x104细胞)加至各个含有MATRIGELTM的孔中。在聚合的MATRIGELTM上的细胞，在0.5-100ng VEGF存在或不存在下，被置于37℃5％CO2培养箱4-24小时。在孵育后使用标准光学显微镜评价细胞的管腔形成迹象。
羊膜来源的贴壁细胞在缺少VEGF的条件下表现出最小的管腔形成，但会在受到VEGF刺激的情况下诱导/分化至形成管样结构。参见图8。
6.3.5使用缺氧响应评价羊膜来源的贴壁细胞的血管生成能力
为评价内皮细胞和/或内皮祖细胞的血管生成功能，可以针对在缺氧和常氧条件下细胞分泌血管生成生长因子的能力进行评估。在缺氧条件下培养通常由内皮细胞或内皮祖细胞诱导产生增加的血管生成生长因子分泌，其可以在条件化培养基中进行检测。将羊膜来源的贴壁细胞按照与其标准培养基中相等的数量接种并生长至大约70-80％汇合度。然后，将细胞转向无血清的培养基(EBM-2)并在常氧(21％O2)或缺氧(1％O2)条件下孵育48小时。收集条件化培养基并使用商业可获得的R&D SYSTEMS的ELISA试剂盒对血管生成生长因子的分泌进行分析。根据生产商的使用说明进行ELISA分析，在条件化培养基中各血管生成生长因子(VEGF和IL-8)的数量被归一化为1×106细胞。
羊膜来源的贴壁细胞在低氧条件表现出增加的血管生成生长因子分泌。参见图9。
在一个单独的实验中，将AMDAC按照与其标准培养基中相等的数量接种并生长至大约70-80％汇合度。然后，将细胞转向无血清的培养基(EBM-2)并在常氧(21％O2)或低氧(1％O2)条件下孵育48小时。对细胞进行流式细胞分析其细胞标记CD202b(也称为Tie2、Tek或促血管新生蛋白因子-1受体)，一种涉及血管发育和血管生成的受体。收集条件化培养基并使用商业可获得的R&D SYSTEMS的ELISA试剂盒对血管生成生长因子的分泌进行分析。按照如上所述进行流式细胞分析，根据生产商的使用说明进行ELISA分析。在条件化培养基中各血管生成生长因子(VEGF和IL-8)的数量被归一化为1×106细胞。AMDAC在低氧条件下比常氧条件下的表现出增加的CD202b表达。参见图10。
6.3.6使用心原性分化评价羊膜来源的贴壁细胞的血管生成能力
为诱导祖细胞向心肌细胞系分化，在几个阶段进行了悬滴培养(HD，停止细胞增殖并开始分化过程)并随后对于具有特定因子的限制生长细胞进行处理的步骤组合。悬滴培养后，使用活化素A、骨形态发生蛋白4(BMP4)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，也称为FGF2)、血管内皮生长因子(VEGF、也称为VEGFA)和dickkopf同源物1(DKK1)的组合诱导细胞16天。简要地，羊膜来源的贴壁细胞在标准生长培养基中生长至大约70％汇合度。然后将细胞胰蛋白酶化，并用之前描述的缓冲液进行洗涤。将20μl含有700细胞的液滴悬浮于相关培养基并使用多通道移液器置于100mm Petri培养皿的盖子内侧。小心反转盖子，将其置于培养皿顶部，其中含有25mL的无菌PBS以防止液滴干燥。悬滴培养物在37℃5％CO2的培养箱中孵育48h。然后，聚集的细胞体被重新接种至包被有0.1％明胶的含有细胞系特异性的分化培养基的培养板，用于进一步诱导。
刺激步骤如下：阶段1，4天BMP4(0.5ng/mL)；阶段2，5天BMP4(10ng/mL)、bFGF(5ng/mL)、活化素A(3ng/mL)；阶段3，3天VEGF(10ng/mL)、DKK1(150ng/mL)；阶段4，4天VEGF(10ng/mL)、DKK1(150ng/mL)、bFGF(5g/mL)(+/-5-10nM 5-氮杂-胞苷)。然后，制备处理后的细胞的总RNA，如前述进行qRT-PCR分析心原性标记。
结果显示羊膜来源的贴壁细胞可被诱导/分化为表达不同成心肌细胞标记。参见图11。
6.3.7AMDAC-条件化培养基的HUVEC响应
AMDAC在含有60％DMEM-LG(Gibco)；40％MCBD-201(Sigma)；2％FBS(HycloneLabs)，1×胰岛素-转铁因子-硒补充剂(ITS)；10ng/mL亚油酸-牛血清白蛋白(LA-BSA)；1n-地塞米松(Sigma)；100μM抗坏血酸2-磷酸盐(Sigma)；10ng/mL表皮生长因子(R&D系统)；以及10ng/mL血小板衍生的生长因子(PDGF-BB)(R&D系统)的生长培养基中培养48小时，然后在无血清培养基中另外培养48小时。收集来自AMDAC培养物的条件化培养基并用于刺激血清饥饿的HUVEC 5、15和30分钟。然后裂解HUVEC并用BDTM CBA(Cytometric Bead Assay)Cell Signaling Flex试剂盒(BD Biosciences)染色磷蛋白，后者已知在血管生成途径信号中起作用。AMDAC被发现为AKT-1(其抑制凋亡过程)、AKT-2(其为胰岛素信号途径的重要信号蛋白)、和HUVEC的ERK 1/2细胞增殖途径的强激活剂。这些结果进一步显示AMDAC的血管生成能力。
6.4实施例4：AMDAC诱导血管生成
本实施例显示AMDAC在使用鸡绒毛膜尿囊膜(CAM)的体内分析中的促血管生成。
进行了两组单独的CAM分析。在第一组CAM分析中，评价了来自不同AMDAC制备的完整的细胞沉淀。在第二组CAM分析中，评价了来自不同AMDAC制备的上清液。成纤维细胞生长因子(bFGF)被用作阳性对照，MDA-MB-231人乳腺癌细胞作为参比(阴性对照)。本研究的终点是测定全部处理组和对照组的血管密度。
6.4.1使用细胞进行CAM分析
使用了按照上述方法制备和低温贮藏的3批AMDAC细胞制备物，在此称为Lot 1、Lot 2和Lot 3。将AMDAC解冻用于施用并测定了用于CAM施用的细胞的数量。
研究设计：本研究包括7个组，每组10个胚胎。本研究的设计描述于表6。
表6：研究组，鸡绒毛膜尿囊膜血管生成分析。
CAM分析方法：在37℃的标准鸡蛋培养箱中将新鲜受精卵孵育3天。在第3天，在无菌条件下将蛋打破，将胚胎置于20个100mm塑料板中，在胚胎培养箱中37℃培养，底架上储水。使用一个小泵持续将空气通入储存水中，从而培养箱湿度维持恒定。在第6天，在各CAM放置一个无菌的“O”型硅胶环，然后在无菌状态下将AMDAC以密度为7.69×105细胞/40μL培养基/MATRIGELTM混合物(1∶1)转移至各“O”型环。表2A和2B表示所使用的细胞数量和添加至各细胞制备物用于施用的培养基数量。载体对照胚胎中加入40μL的载体(PBS/MATRIGELTM，1∶1)，阳性对照中加入在40μL的DMEM培养基/MATRIGELTM混合物(1∶1)中的100ng/mlbFGF，以及培养基对照中只加入40μL的DMEM培养基。在各施用完成后将胚胎返回各培养箱。在第8天，将胚胎从培养箱中移出并置于室温下，使用放大100×的图像捕捉系统测定各“O”型环的血管密度。
通过使用正实数0-5、或指数血管1-32的评分系统检测生成血管的密度，显示CAM处理位置处的血管数量。较高的分值表示较高的血管密度，0表示没有血管生成。对于各施用位置的抑制百分比使用该位置记录的分值/每个个体实验中对照样品获得的平均分值进行计算。对于给定化合物的各施用的抑制百分比通过合并来自8-10胚胎施用的所有结果进行计算。
表7：为了归一化最终施用的细胞悬液而添加至各细胞制备物的培养基的量
所有使用细胞处于第6代。
结果
血管密度评分值的结果见图12。该结果清楚地显示分别用干细胞悬液、或100ng/mL的bFGF、或MDAMB231乳腺癌细胞悬液处理的鸡绒毛膜尿囊膜的血管密度分值在统计学上显著高于载体对照组的CAM(P＜0.001，T检验)。用于培养干细胞的培养基对血管密度没有任何效果。此外，AMDAC制备物诱导的血管密度显示了一些变化，但是这些变化在统计学上并不显著。这说明5种干细胞制备物各自的诱导能力基本相同。
6.4.2使用AMDAC细胞上清液进行CAM分析
来自MDA-MB-231细胞和各描述于上述AMDAC的CAM分析的不同干细胞制备物的上清液样品被用于第二次CAM分析。如同AMDAC的CAM分析，bFGF和MDA-MB-231细胞被用作阳性对照。
研究设计：本研究包括7个组，每组10个胚胎。本研究的设计描述于表8。
表8：研究设计-使用细胞上清液进行CAM分析
使用的AMDAC细胞是第6代。
CAM分析方法：分析方法与如上所述AMDAC的CAM分析相同。唯一的区别是来自各干细胞制备物或来自MDA-MB-231细胞的上清液被用作测试材料。对于剂量，各上清液与MATRIGELTM(以1∶1体积比)进行混合并对各胚胎施用40μL的混合物。
结果
血管密度分值(参见图13)显示各干细胞制备物上清液的血管形成诱导各不相同。来自三个批次的AMDAC上清液样品表现出对于血管诱导的显著影响，分别为P＜0.01、P＜0.001和P＜0.02(T检验)。如同预料的那样，阳性对照bFGF同样显示出对于血管形成的强诱导，如上述CAM分析编号1(P＜0.001，T检验)所示。然而，MDA-MB-231人乳腺癌细胞上清液相对于载体对照组而言没有显示出对于血管形成的显著诱导。如前所示，培养基本身没有任何效果。
6.5实施例5：AMDAC表现出神经保护效果
本实施例使用氧气-葡萄糖剥夺(OGD)损伤(insult)分析，显示AMDAC在低氧和低葡萄糖条件下具有神经保护效果，并降低活性氧。这些结果显示AMDAC对于治疗诸如中风或周围血管疾病的缺血性病症是有效的，并能够保护缺血性症状导致的再灌注损伤。
将人神经元(ScienCell，目录号1520)根据生产商的建议进行培养。简要地，培养容器在37℃下无菌蒸馏水中用聚-L-赖氨酸(2μg/mL)进行包被1小时。将容器用双蒸水洗涤3次。将神经元培养基(ScienCell)加至容器中并在培养箱中平衡至37℃。解冻神经元，并直接加至容器中，不必离心。在随后的培养中，初始培养后的当天更换培养基，之后每隔一天更换。神经元一般在第4天可以进行损伤分析。
通过首先水浴加热培养基，在一定程度上降低液体培养基中的氧气溶解度，来配制OGD培养基(Dulbecco的修饰的Eagle培养基-无葡萄糖)。使用0.5μm漫射石在培养基中通入100％氮气30分钟以去除溶解氧。加入HEPES缓冲液至终浓度为1mM。喷射结束时将培养基直接加至神经元。取培养基的小样品使用下沉型氧气传感器确认氧气水平。氧气水平一般被降至0.9％至约5.0％氧气。
通过将箱子在充气前置于37℃培养箱中至少4小时(优选过夜)制备缺氧箱。去除培养容器中的培养基并替换为脱气的培养基，将培养容器置于缺氧箱中。通过系统在缺氧箱中以20-25Lpm的速率通入95％N2/5％CO2气体至少5分钟。将系统在培养箱中37℃下孵育4小时，且1小时后再次对箱子进行脱气。
在该损伤流程的最后，对OGD培养基进行吸气并将温热的培养基加至神经元。24-28小时后，将AMDAC和神经元以相等的100,000细胞每孔的数量接种至6-孔板，其悬浮于神经元培养基，后者被加至神经元并共培养6天。
对于各条件下的6孔板的随机区域拍摄显微照片。对具有典型神经元形态的细胞进行了鉴定，并记录神经突长度。神经突的平均长度与神经元健康成正相关，其在神经元和AMDAC的共培养物中更长，表明AMDAC保护细胞不受损伤。
活性氧分析
经测定，AMDAC在缺氧条件下表达超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和血红素加氧酶基因。在使用过氧化氢作为活性氧发生器的分析中测定了AMDAC吸收活性氧和保护细胞不受该种条件影响的能力。
分析描述：将目标细胞(星形细胞，ScienCell Research Laboratories)接种到96-孔黑孔板，该板使用6000/cm2聚-L-赖氨酸进行预包被。将星形细胞在生长培养基中37℃和5％二氧化碳下贴壁过夜。第二天，去除培养基并将细胞与细胞渗透性染料DCFH-DA(二氯荧光素二脂)一起孵育，后者为荧光探针。用Dulbecco磷酸缓冲液盐或Hank缓冲盐溶液洗涤去除过量染料。然后通过添加1000μM过氧化氢30-60分钟损伤细胞。然后去除含过氧化氢的培养基并替换为无血清的、无葡萄糖的生长培养基。AMDAC(Lot 1或Lot 2的细胞)，或BM-MSC，被加至6000/cm2，并将细胞再培养24小时。然后用标准荧光读板仪在480Ex和530Em下读取细胞。培养基的活性氧含量与细胞溶质中的DCFH-DA水平成正比。活性氧含量通过与预测定的DCF标准曲线比较进行测定。所有实验中N＝24。
为了进行分析，在使用前制备1×DCFH-DA，其中将20×DCFH-DA储存液在不含胎牛血清的细胞培养基中稀释至1×，并搅拌均匀。过氧化氢(H2O2)稀释液根据需要在DMEM或DPBS中进行制备。如下制备标准曲线：通过用细胞培养基稀释1mM标准DCF，按照浓度范围0μM-10μM的1∶10进行系列稀释，转移100μL的标准DCF至适于荧光检测的96孔板，并添加100μL的细胞裂解缓冲液。在480Ex和530Em下读取荧光。
结果：所用的两个批次AMDAC均显著降低了星形细胞共培养中的活性氧浓度。参见图14A和14B。作为对比，BM-MSC没能显著降低星形细胞共培养中的活性氧浓度。
6.6使用羊膜来源的贴壁细胞的治疗方法
6.6.1治疗心肌梗塞
50岁中期的一名成年男性表现出超过20分钟的持续胸痛并辐射至左臂，气短、恶心、心悸、出汗等。根据心电图结果和血中肌酸激酶浓度的升降，鉴别诊断为(透壁性)心脏前壁心肌梗塞。在使用硝化甘油和溶栓素使个体稳定后，对该个体局部麻醉心脏注射直接施用0.9％盐水中的1×108至5×108的AMDAC至病损区域。在接下来的72小时对该个体按照急诊基础进行监护。在治疗后接下来的3个月内进一步通过心电图和/或染料可视化技术监护个体，评价梗塞区域的血管再生程度。如果心电图效果比施用AMDAC之前明显更加接近正常，或如果梗塞区域可视化地明显发生血管再生，则确认治疗效果。
6.6.2治疗心肌病
个体表现出气短、腿和踝部肿胀和不规则心跳。排除其它原因，并根据心电图确认，诊断为心肌病。超声图确认该个体患有充血性心肌病。对该个体使用局部麻醉心脏注射直接施用0.9％盐水中的1×108至5×108的AMDAC至心动脉。在接下来的3个月内监护个体的超声图变化，是否显示血流更加正常，且气短的感觉有所改善以及腿和踝部肿胀减少。如果在监护期间个体的任何这些体征表现出改善，则确认治疗效果。
6.6.3治疗周围血管疾病
个体表现出足部寒冷发麻并在悬空时发红，以及腿部疼痛、无力和疲劳。在排除了糖尿病后，诊断为周围动脉疾病。对该个体静脉内施用450mL 0.9％盐水中的1×109至5×109的AMDAC，并在接下来的3个月内进行两周一次监护。如果在监护期间任何上述症状表现出改善，则确认治疗效果。
6.6.4治疗周围血管疾病
个体表现出足部寒冷发麻并在悬空时发红，以及腿部疼痛、无力和疲劳。在排除了糖尿病后，诊断为周围动脉疾病。对该个体静脉内施用5mL 0.9％盐水中的1×108至5×108的AMDAC，和/或脚趾间局部的静脉内或动脉内施用相当的量，并在接下来的3个月内进行两周一次监护。如果在监护期间任何上述症状表现出改善，则确认治疗效果。
6.6.5组合治疗周围血管疾病
个体表现出足部寒冷发麻并在悬空时发红，以及腿部疼痛、无力和疲劳。在排除了糖尿病后，诊断为周围动脉疾病。对该个体静脉内施用450mL 0.9％盐水中的1×109至5×109的AMDAC，并在接下来的3个月内进行两周一次监护。还对个体处方西洛他唑100mg每天两次。如果在监护期间任何上述症状表现出改善，则确认治疗效果。
6.6.6组合治疗周围血管疾病
个体表现出足部寒冷发麻并在悬空时发红，以及右腿疼痛、无力和疲劳。在排除了糖尿病后，诊断为周围动脉疾病。对个体实施血管成形术并在大腿动脉内手术植入支架。然后对该个体静脉内施用450mL 0.9％盐水中的1×109至5×109的AMDAC，并在接下来的3个月内进行两周一次监护。如果在监护期间任何上述症状表现出改善，则确认治疗效果。
6.6.7使用AMDAC治疗中风
一名52岁的男性表现出左侧身体偏瘫和部分失语症。诊断为缺血性中风。在使用磁共振成像确定缺血区域后，对个体准备手术，在受损侧颅骨开口。开口后，1-2mL 0.9％盐水溶液中的5×107至1×108AMDAC被施用至缺血性区域。在接下来的7-14天对个体进行监护，观察中风，特别是偏瘫或失语症等任何症状是否有改善的迹象。如果在监护期间任何上述症状表现出改善，则确认治疗效果。
6.6.8使用AMDAC治疗中风
一名52岁的男性表现出左侧身体偏瘫和部分失语症。诊断为缺血性中风。在使用磁共振成像确定缺血区域后，对个体准备手术，在受损侧颅骨开口。开口后，静脉内施用450mL 0.9％盐水溶液中的1×109至5×109AMDAC。在接下来的7-14天对个体进行监护，观察中风，特别是偏瘫或失语症等任何症状是否有改善的迹象。如果在监护期间任何上述症状表现出改善，则确认治疗效果。
等同：
本发明并不限于在此描述的具体实施方式的范围。事实上，除了这些描述之外，根据之前的描述和随后的附图而对本发明进行的各种改变对于本领域技术人员而言是显而易见的。这些改变同样落入附加的权利要求的范围之内。
在此引用了各种出版物、专利和专利申请，其公开内容全文引入作为参考。

Claims (32)

1.一种分离的羊膜来源的贴壁细胞，其中所述细胞附着于组织培养塑料，其中所述细胞经RT-PCR测定是OCT-4–(八聚体结合蛋白4)和HLA-G-，且经流式细胞术测定还是CD49f+和CD90+。
2.权利要求1的分离的细胞，其中所述细胞经流式细胞术测定是CD105+或CD117–。
3.权利要求2的分离的细胞，其中所述细胞是CD105+和CD117–。
4.权利要求1的分离的细胞，其中所述细胞经免疫定位测定是VEGFR1/Flt-1+(血管内皮生长因子受体1)和VEGFR2/KDR+(血管内皮生长因子受体2)。
5.权利要求1的分离的细胞，其中所述细胞经免疫定位测定具有CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+(血管生成素受体)、TEM-7+(肿瘤内皮细胞标志物7)、CD31–、CD34–、CD45–、CD133–、CD143–(血管紧张素Ⅰ转换酶，ACE)、CD146–(黑色素瘤细胞粘附分子)或CXCR4–(趋化因子(C-X-C基序)受体4)中的一种或多种。
6.权利要求1的分离的细胞，其中所述细胞经免疫定位测定是CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+(血管生成素受体)、TEM-7+(肿瘤内皮细胞标志物7)、CD31–、CD34–、CD45–、CD133–、CD143–、CD146–和CXCR4–。
7.权利要求1的分离的细胞，其中所述细胞经免疫定位测定是VE-钙粘蛋白–。
8.权利要求1的分离的细胞，其中所述细胞经免疫定位测定还是CD105+和CD200+阳性。
9.权利要求1的分离的细胞，其中所述细胞在暴露于50ng/mL VEGF 7天后免疫定位测定不表达CD34。
10.一种含有权利要求1的细胞的分离的细胞群。
11.权利要求10的分离的细胞群，其中所述群中至少50％的细胞是权利要求1的细胞。
12.权利要求10的分离的细胞群，其中所述群中至少90％的细胞是权利要求1的细胞。
13.一种分离的细胞群，其包含权利要求3的细胞。
14.权利要求13的分离的细胞群，其中所述群中至少50％的细胞是权利要求3的细胞。
15.权利要求13的分离的细胞群，其中所述群中至少90％的细胞是权利要求3的细胞。
16.一种组合物，其包含权利要求1或3的分离的羊膜来源的贴壁细胞。
17.权利要求10的分离的细胞群，其中所述群包括第二种细胞类型，且其中所述第二种细胞类型是血细胞、分离自外周血的干细胞、分离自胎盘血的干细胞、分离自胎盘灌流液的干细胞、分离自胎盘组织的干细胞、分离自脐带血的干细胞、脐带干细胞、骨髓来源的间质干细胞、骨髓来源的间质细胞、造血干细胞、体干细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌细胞、内皮细胞、成血管细胞、内皮祖细胞、周皮细胞、心肌细胞、肌细胞、成心肌细胞或成肌细胞。
18.权利要求17的分离的细胞群，其中所述第二种细胞类型包含所述群中至少10％的细胞。
19.权利要求17的分离的细胞群，其中所述第二种细胞类型包含所述群中至少25％的细胞。
20.权利要求17的分离的细胞群，其中所述第二种细胞类型是造血干细胞或祖细胞。
21.权利要求20的分离的细胞群，其中所述造血干细胞或祖细胞是CD34+细胞。
22.一种分离的羊膜来源的贴壁细胞，其中所述细胞附着于组织培养塑料，且其中所述细胞经RT-PCR测定是OCT-4–，以及经免疫定位测定是CD49f+、HLA-G–、CD90+、CD105+和CD117–，且其中所述细胞：
(a)经免疫定位测定表达CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1、或VEGFR2/KDR(CD309)中的一种或多种；
(b)经免疫定位测定不表达CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G、或VE-钙粘蛋白，或经RT-PCR测定不表达SOX2；
(c)表达下述mRNA：ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、CD44、CD200、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP1、NRP2、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAM1、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TIMP2、TIMP3、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIE2/TEK、TNF、TNNI1、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC、VEGFR1/FLT1或VEGFR2/KDR；
(d)表达一种或多种下述蛋白质：CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、β2-微球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳凝素-1、ADAM 17、血管紧张肽原前体、细丝蛋白A、α-辅肌动蛋白1、巨蛋白、巨噬细胞乙酰化的LDL受体I和II、活化素受体IIB型前体、Wnt-9蛋白、胶质原纤维酸性蛋白、星形细胞、肌凝蛋白结合的蛋白C或肌球蛋白重链，非肌A型；
(e)分泌VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR或半乳凝素-1至细胞生长的培养基中；
(f)表达下述微RNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92或miR-296，表达水平高于数量相当的骨髓来源的间质干细胞；
(g)表达下述微RNA：miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b或miR-16，表达水平低于数量相当的骨髓来源的间质干细胞；
(h)表达下述miRNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b或miR-16；或者
(i)当低于5％O2培养时，与在21％O2中表达的CD202b、IL-8或VEGF相比表达增加水平的CD202b、IL-8或VEGF。
23.权利要求22的分离的羊膜来源的贴壁细胞，其中所述细胞经RT-PCR测定是OCT-4–，和经免疫定位测定是CD49f+、HLA-G–、CD90+、CD105+和CD117–，且其中所述细胞：
(a)经免疫定位测定表达CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1和/或VEGFR2/KDR(CD309)；和
(b)经免疫定位测定不表达CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G和/或VE-钙粘蛋白，和/或经RT-PCR测定不表达SOX2；和
(c)表达下述mRNA：ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、CD44、CD200、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP1、NRP2、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAM1、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TIMP2、TIMP3、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIE2/TEK、TNF、TNNI1、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC、VEGFR1/FLT1和/或VEGFR2/KDR；和
(d)表达CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、β2-微球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳凝素-1、ADAM 17、血管紧张肽原前体、细丝蛋白A、α-辅肌动蛋白1、巨蛋白、巨噬细胞乙酰化的LDL受体I和II、活化素受体IIB型前体、Wnt-9蛋白、胶质原纤维酸性蛋白、星形细胞、肌凝蛋白结合的蛋白C和/或肌球蛋白重链，非肌A型中的一种或多种；和
(e)分泌VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR和半乳凝素-1中的一种或多种至细胞生长的培养基中；和
(f)表达下述微RNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92和/或miR-296，表达水平高于数量相当的骨髓来源的间质干细胞；和
(g)表达下述微RNA：miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b和/或miR-16，表达水平低于数量相当的骨髓来源的间质干细胞；以及
(h)表达下述miRNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b和/或miR-16；和
(i)当低于5％O2培养时，与在21％O2中表达的CD202b、IL-8或VEGF相比，表达增加水平的CD202b、IL-8或VEGF。
24.权利要求22的细胞的分离的细胞群。
25.权利要求23的细胞的分离的细胞群。
26.一种永久的或可降解的去细胞化或合成的基质或支架，其包含权利要求1、3或5任一项所述的细胞。
27.权利要求26的基质或支架，其中所述基质或支架为羊膜；脱水胞外基质；胎盘胶原蛋白，或胎盘胞外膜。
28.权利要求1或权利要求3的细胞在制备用于在个体中诱导血管生成的药物中的用途。
29.权利要求1或权利要求3的细胞在制备用于治疗患有CNS内部或周围血流破坏的个体的药物中的用途。
30.权利要求1或权利要求3的细胞在制备用于治疗患有肢体内部或周围血流破坏的个体的药物中的用途。
31.一种分离的羊膜来源的贴壁细胞的群，其中所述群的细胞附着于组织培养塑料，且其中所述群经RT-PCR测定是OCT-4–，以及经免疫定位测定是CD49f+、HLA-G–、CD90+、CD105+和CD117–，且其中所述群的细胞：
(a)经免疫定位测定表达CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1或VEGFR2/KDR(CD309)中的一种或多种；
(b)经免疫定位测定不表达CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G、或VE-钙粘蛋白，或经RT-PCR测定不表达SOX2；
(c)表达下述mRNA：ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、CD44、CD200、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP1、NRP2、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAM1、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TIMP2、TIMP3、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIE2/TEK、TNF、TNNI1、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC、VEGFR1/FLT1或VEGFR2/KDR；
(d)表达一种或多种下述蛋白质：CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、β2-微球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳凝素-1、ADAM 17、血管紧张肽原前体、细丝蛋白A、α-辅肌动蛋白1、巨蛋白、巨噬细胞乙酰化的LDL受体I和II、活化素受体IIB型前体、Wnt-9蛋白、胶质原纤维酸性蛋白、星形细胞、肌凝蛋白结合的蛋白C或肌球蛋白重链，非肌A型；
(e)分泌VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR或半乳凝素-1至细胞生长的培养基中；
(f)表达下述微RNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92或miR-296，表达水平高于数量相当的骨髓来源的间质干细胞；
(g)表达下述微RNA：miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b或miR-16，表达水平低于数量相当的骨髓来源的间质干细胞；
(h)表达下述miRNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b或miR-16；或者
(i)当低于5％O2培养时，与在21％O2中表达的CD202b、IL-8或VEGF相比表达增加水平的CD202b、IL-8或VEGF。
32.权利要求31的分离的羊膜来源的贴壁细胞的群，其中所述群的细胞经RT-PCR测定是OCT-4–，和经免疫定位测定是CD49f+、HLA-G–、CD90+、CD105+和CD117–，且其中所述群的细胞：
(a)经免疫定位测定表达CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1和/或VEGFR2/KDR(CD309)；和
(b)经免疫定位测定不表达CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G和/或VE-钙粘蛋白，和/或经RT-PCR测定不表达SOX2；和
(c)表达下述mRNA：ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、CD44、CD200、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP1、NRP2、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAM1、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TIMP2、TIMP3、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIE2/TEK、TNF、TNNI1、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC、VEGFR1/FLT1和/或VEGFR2/KDR；和
(d)表达CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、β2-微球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳凝素-1、ADAM 17、血管紧张肽原前体、细丝蛋白A、α-辅肌动蛋白1、巨蛋白、巨噬细胞乙酰化的LDL受体I和II、活化素受体IIB型前体、Wnt-9蛋白、胶质原纤维酸性蛋白、星形细胞、肌凝蛋白结合的蛋白C和/或肌球蛋白重链，非肌A型中的一种或多种；和
(e)分泌VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR和半乳凝素-1中的一种或多种至细胞生长的培养基中；和
(f)表达下述微RNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92和/或miR-296，表达水平高于数量相当的骨髓来源的间质干细胞；和
(g)表达下述微RNA：miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b和/或miR-16，表达水平低于数量相当的骨髓来源的间质干细胞；以及
(h)表达下述miRNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b和/或miR-16；和
(i)当低于5％O2培养时，与在21％O2中表达的CD202b、IL-8或VEGF相比，表达增加水平的CD202b、IL-8或VEGF。
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