CN102077093A - 用于测定角化结构中分析物的非蛋白水解方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供从个体(其曾摄入过一种或多种分析物)的头发或体毛或其它角化结构中快速释放一种或多种分析物的方法。所述方法可包括使角化结构与还原剂相接触，但不与蛋白水解剂相接触。所述方法还可包括通过已知的分析技术，例如免疫试验鉴定和定量测定一种或多种分析物。所述方法不会损害分析物，也不会对随后使用的分析物检测探针(如抗体)产生有害影响。

Description

用于测定角化结构中分析物的非蛋白水解方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2008年4月29日提交的美国专利申请第12/111,914号的优先权，其内容通过引用纳入本文。
技术领域
本发明涉及用于测定对象的角化结构中一种或多种感兴趣分析物的存在和含量的材料和方法，更具体涉及用于上述目的但不需要对所述角化结构进行蛋白水解加工的材料和方法。
背景技术
本发明涉及一种改进的分析方法，它允许较快地释放和直接分析毛发和其它角化结构如指甲和趾甲中存在的分析物，包括有机分析物，如某些滥用药物或其代谢物。该方法能够灵敏地检测这类分析物，而不影响该分析物的结构，不会对可用于检测该分析物的分析物探针如抗体、RNA/DNA和生物受体探针产生不利影响。例如，在一些实施方式中，分析物探针可直接加入怀疑含有一种或多种分析物且经过本文所述处理的角化结构中。可以此方式评价所述一种或多种分析物的种类以及对象消耗所述一种或多种分析物的程度和持续时间。
在感兴趣分析物的检测中，与尿液、血液或口腔液体的分析技术相比，分析毛发和其它角化结构有某些优势。这些优势包括容易处理和储存、检测窗宽以及药物的存在和含量与使用时间和摄入剂量相关联。尿液、血液和口腔液体技术的已知缺点包括无法确定使用或接触的持续时间和强度。这些技术至多提供有关摄入分析物的短期信息。此外，解释这些结果时也有问题。例如，在尿液中检测到低水平的摄入药物或药物代谢物可能表明对象最近摄入少量这种药物或几天前摄入较大量的这种药物。因此，在不重复检测的情况下，使用这些方法无法测定长期药物使用。
在对建立用于测定感兴趣分析物的持续时间和强度的精确可靠方法的问题的回应中，Werner A.Baumgartner博士进行的工作(参见“用于测定阿片类滥用历史的毛发的放射性免疫试验”(Radioimmunoassay of Hair for Determining Opiate Abuse Histories)，J.Nucl Med 20：749-752(1979))确定可通过分析哺乳动物体毛获得接触滥用药物的长期历史，因为在纤维合成期间这些物质被“嵌入”个体毛发纤维中。在这个方面，毛发能够像录音带那样工作，即可通过对毛发样品进行区块分析评价过往接触史。例如，曾发现一旦血流中出现吗啡，则会发现其随着毛发的合成进入毛发中。
经测定，各种化学物质，包括滥用药物均能够在毛发合成过程中俘获在毛发中；这些物质主要在躯体上存在毛发的时间“锁定”在毛发中。在头发和体毛，以及其它角化结构如指甲中发现这种现象；参见Suzuki等，Forensic Sci.International，24：9-16，1984。这些俘获的物质无法从毛发中洗出，曾认为只有在完全或接近完全破坏毛发纤维时才能完全释放这些物质。
以前从毛发中提取分析物的方法包括将毛发加入热的甲醇溶液中，或者在碱性或酸性介质中孵育毛发数小时(通常过夜)；Yegles，等，刊于：《在毛发中进行药物测试的分析和实践方法》(Analytical and Practical Aspects of Drug Testing in Hair)，CRC出版社，2007，第73-94页；Jurado，C.刊于：《在毛发中进行药物测试的分析和实践方法》，CRC出版社，2007，第95-125页；Cheze，M.等，刊于：《在毛发中进行药物测试的分析和实践方法》，CRC出版社，2007，第163-185页)。现有方法也包括使用超声波或杵臼和溶剂溶剂辅助提取。
在精确测定摄入分析物的存在和含量时，溶剂提取方法可能存在以下几个问题。这些问题之一是溶剂提取方法常常只去除毛发样品所含全部分析物中未知和可变的一小部分。另一缺点是不同分析物可能需要不同溶剂或不同时间和温度进行提取。此外，在免疫试验分析中，需要蒸发溶剂，许多溶剂是有毒有害的。
其它现有方法采用蛋白水解和还原性处理的组合来完全消化和降低角化结构，以便释放一种或多种分析物。参见例如，美国专利5,466,579；5,324,642；6,022,693；6,582,924；和6,949,344，通过引用将其全文纳入本文，这些文献提供了用于筛选和验证感兴趣分析物的实验的示范性检测方法，包括免疫试验方法，例如放射性免疫试验和酶促免疫试验方法的示范性检测方法。这类合并的蛋白水解和还原性处理方法虽然有效，但由于使用蛋白水解酶使得成本相当高，这也会干扰通过蛋白水解切割分析物检测探针如抗体进行的后续分析物检测实验，从而阻止某些高度灵敏的分析技术的应用或者需要在中间使用蛋白酶中和、分离或纯化步骤。
因此，需要能够快速和完全地释放身体角化结构，例如毛发、指甲和趾甲中的分析物，能够允许直接测定分析物的种类和对象使用它们的时间，但不会破坏或干扰感兴趣分析物和/或分析物检测探针的有效和相对廉价的分析物检测方法，例如免疫试验方法。
发明概述
角化结构如毛发是在分子内和分子间由许多二硫键交联，以提供最终结构的刚度和强度的角蛋白多肽链的复杂的大组装体。例如，毛发由卷曲螺旋角蛋白多肽链构成，这些多肽链组装形成“初原纤维”；然后，许多初原纤维在两个或多个初原纤维周围捆扎成圆形，形成称为“微原纤维”的多链缆索；几百个这种微原纤维聚在一起形成称为“大原纤维”的纤维束。大原纤维形成毛发纤维的皮层(或主体层)。
随着这些结构的生长，对象的角化结构中可能俘获感兴趣的分析物。以前用于检测嵌入这类结构的分析物的方法中，使用蛋白水解和还原型方法完全消化和破坏该角化结构，切割角蛋白的蛋白主链(例如，打断角蛋白中的酰胺(肽键)连接)和将分子内和分子间二硫键还原成巯基，导致这些复杂蛋白质的宏观结构发生伸直、解旋和肽断裂。本发明人惊讶地发现，就释放嵌入分析物而言不必对角化结构进行这种蛋白水解切割，与以前的方法相比在不存在蛋白水解酶的情况下用还原剂如二硫苏糖醇(“DTT”)处理角化结构就足以定量地释放分析物。因此，本发明人发现前述还原剂如DTT和蛋白水解酶之间的协同作用(其中各试剂能促进其它试剂进一步穿透毛发结构并发挥作用)虽然有用，但对释放感兴趣分析物而言并不必要。与现有方法相比，所得方法在成本和时间上有效，同时仍然能够灵敏地检测感兴趣的一种或多种分析物。而且，所得方法可用于筛选验证感兴趣的分析物，例如，也是与免疫试验相容的。
因此，本文提供了一种测定对象的角化结构样品中是否存在分析物的方法，所述方法包括
(a)提供任选洗涤的角化结构样品；
(b)将所述角化样品与还原剂水溶液相接触以产生测试溶液，其中所述接触不会蛋白水解切割所述角化结构；和
(c)测定步骤(b)的测试溶液中是否存在所述分析物。该方法还可包括在存在所述分析物的前提下测定测试溶液中所述分析物的含量。在一些实施方式中，该方法还可包括在步骤(c)之前使步骤(b)的测试溶液中残留的还原剂失活以得到失活的测试溶液，并测定所述失活的测试溶液中是否存在所述分析物，其中所述失活过程不会蛋白水解切割所述角化结构。在一些实施方式中，该方法还可包括纯化步骤(b)的测试溶液以分离测试溶液中残留的角化样品，得到纯化的测试溶液，并测定所述纯化的测试溶液中是否存在所述分析物；其中所述纯化过程不会蛋白水解切割所述角化结构。
还提供了一种测定对象的角化结构样品中是否存在分析物的方法，所述方法主要由以下步骤构成：
(a)提供任选洗涤的角化结构样品；
(b)使所述角化样品与还原剂水溶液相接触，得到测试溶液；
(c)使步骤(b)的测试溶液中残留的还原剂失活以得到失活的测试溶液；
(d)纯化步骤(c)的失活测试溶液以去除残留的角化样品，得到纯化、失活的测试溶液；和
(e)测定步骤(d)的纯化、失活的测试溶液中是否存在所述分析物。在一些实施方式中，该方法还可包括在存在所述分析物的前提下测定所述纯化、失活的测试溶液中所述分析物的含量。
还提供了一种测定对象的角化结构样品中是否存在分析物的方法，所述方法包括
(a)提供任选洗涤的角化结构样品；
(b)使所述角化样品与还原剂水溶液相接触，得到测试溶液；和
(c)测定所述测试溶液中是否存在所述分析物。
其中所述方法不包括使所述角化结构样品与蛋白水解酶相接触。所述方法还可包括在存在所述分析物的前提下测定测试样品中所述分析物的含量，和/或使测试溶液中残留的还原剂失活，和/或纯化所述测试溶液以去除残留的角化样品。
还提供了一种测定对象的角化结构样品中是否存在分析物的方法，所述方法包括
(a)提供任选洗涤的角化结构样品；
(b)使所述角化样品与还原剂水溶液相接触，得到测试溶液；和
(c)测定所述测试溶液中是否存在所述分析物。
其中所述方法不包括蛋白水解切割所述角化结构样品。所述方法还可包括在存在所述分析物的前提下测定测试样品中所述分析物的含量，和/或使测试溶液中残留的还原剂失活，和/或纯化所述测试溶液以去除残留的角化样品。
还提供了一种测定对象的角化结构样品中是否存在分析物的方法，所述方法包括
(a)提供任选洗涤的角化结构样品；
(b)处理所述角化结构样品，以便减少所述角化结构样品中存在的二硫键，但不切割所述样品中的肽键，从而得到测试溶液；和
(c)测定所述测试溶液中是否存在所述分析物。所述方法还可包括在存在所述分析物的前提下测定测试样品中所述分析物的含量，和/或使测试溶液中残留的还原剂失活，和/或纯化所述测试溶液以去除残留的角化样品。
在任何上述方法中，还原剂可包含DTT或DTE。
在任何上述方法中，失活步骤可包括使所述测试溶液与金属盐的水溶液相接触，其中所述盐的金属阳离子选自下组：Cu++、Zn++、Mn++、Fe+++、Fe++、Pb++、Cd++、Hg++、Ag++、As+++和Co++。
在任何上述方法中，纯化步骤可包括分离、过滤或离心所述测试溶液。
在任何上述方法中，可以用所述分析物的特异性免疫试验测定是否存在分析物；并且在任何上述方法中，所述分析物的特异性免疫试验可包括使用所述分析物的特异性抗体。在一些实施方式中，所述免疫试验是放射性免疫试验。在一些实施方式中，所述免疫试验是酶促免疫试验。
在所述方法的一些实施方式中，使用质谱技术测定是否存在分析物。
在一些实施方式中，用色谱技术测定是否存在分析物。
在所述方法的一些实施方式中，进行接触步骤或处理步骤的pH约为5.0至10.5，例如，进行接触步骤或处理步骤的pH约为5至8.8，或者约为8.8至10.5。
在所述方法的一些实施方式中，进行接触步骤或处理步骤的温度约为20℃至40℃。
在所述方法的一些实施方式中，所述接触或处理步骤进行约0.5小时至12小时，例如约1至5小时，或者约2小时。
在一些实施方式中，所述分析物是滥用药物或其代谢物、处方药或其代谢物、止痛药或其代谢物、营养剂、或内源性分析物，或任何上述物质的盐形式。
滥用药物或其代谢物可选自下组：可卡因、苯甲酰芽子碱、古柯乙烯、去甲可卡因、PCP、苯丙胺、去氧麻黄碱、大麻素、THC、羧基-THC、海洛因、可待因、吗啡、6-单乙酰基吗啡(MAM)、羟考酮、3，4-亚甲基二氧苯丙胺(MDA)；和3，4-亚甲基二氧去氧麻黄碱(MDMA)。
角化结构样品可包括毛发、指甲或趾甲。
在一些实施方式中，洗涤所述角化结构样品，如毛发样品。
在一些实施方式中，滥用药物或其代谢物、处方药或其代谢物、或止痛药或其代谢物是阿片类药物、大麻素、NSAID、类固醇、苯丙胺、苯并二氮
Figure BPA00001284445600061
巴比妥类药物、三环药物或麻黄碱，或其代谢物。
除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。虽然在本发明所述方法的实施或测试中可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但是，下面描述了合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其他文献都全文参考结合于本文。在抵触的情况，以本说明书包括定义在内为准。此外，材料、方法和例子都只是说明性的，并不构成限制。
从以下详述和所附权利要求不难了解其它特征和优点。
附图简要说明
图1和2显示毛发截面图，说明毛发的复杂宏观结构是如何由多个较小结构(角蛋白α-螺旋；卷曲螺旋的初原纤维、微原纤维和大原纤维)组装形成的，所有这些结构由二硫键广泛交联。
详述
本发明提供一种方法，其能够从个体(其曾摄入过一种或多种分析物)的头发或体毛或其它角化结构中快速释放一种或多种分析物，然后通过已知的分析方法，包括例如，高度灵敏的受体试验、免疫试验或仪器技术如质谱或原子吸收光谱来鉴定所述一种或多种分析物。在不损害分析物且不对随后使用的分析物检测探针(如抗体)产生有害影响的条件下，使所述一种或多种分析物从所述角化结构内释放到还原溶液中。所述方法也允许检测对象在较长时间内的既往使用模式，而不用进行测定血液、尿液或口腔液体样品中分析物含量的常规测试方法中必需的重复测试。众所周知，同一个体的毛发中俘获的分析物含量与分析物的摄入量成正比，毛发样品的区块分析可提供有关历史使用的信息。
在所述方法中，首先，由对象，例如可能摄入某种具体分析物或怀疑摄入该种分析物的对象收集角化结构样品，如毛发。本文所用术语“分析物”指对象内源性产生或外源性引入的任何化合物。
因此，在一些实施方式中，感兴趣分析物可能从外部引入对象，即通常情况下对象中不存在这种分析物，但通过外源性方法，例如吸入、胃肠道外给药(例如IV、透皮、皮下或IM途径)或摄取(例如口服、口颊或跨粘膜途径)引入这种分析物。本文所用的外源性引入的分析物的代谢物或降解产物是感兴趣的外源性分析物，因为尽管它是对象体内产生的，但它验证自外源性引入的分析物。
在一些实施方式中，感兴趣分析物可以是外源性引入的滥用药物、处方药、止痛药、有机化合物、营养剂、金属、毒性化合物、杀虫剂或它们的代谢物或降解产物。滥用药物、止痛药、处方药或其代谢物的例子包括阿片类药物、大麻素、NSAID、类固醇、苯丙胺、苯并二氮
Figure BPA00001284445600081
巴比妥类药物、三环药物或麻黄碱、或其代谢物。
具体的例子包括：可卡因(和代谢物苯甲酰芽子碱、古柯乙烯和去甲可卡因)、阿片类药物和其代谢物(吗啡、海洛因、6-单乙酰基吗啡、二乙酰基吗啡、可待因、羟考酮、氢可酮、氢吗啡酮、羟吗啡酮和美沙酮)、大麻素类、苯环利定(PCP)、苯丙胺、去氧麻黄碱、MDMA(摇头丸、亚甲基二氧去氧麻黄碱)、MDA(亚甲基二氧苯丙胺)、大麻(和THC和羧基-THC代谢物)、丙氧芬、哌替啶、苯并二氮、卡立普多、曲蚂多、芬太尼、丁丙诺啡、纳曲酮、三环药物、烟碱(和其代谢物可替宁)、伊文(eve)(亚甲基二氧-乙基苯丙胺)、氟硝西泮、麦角酸(LSD)、地高辛、哌甲酯、对乙酰氨基酚、水杨酸盐、氟西汀、舍曲林、右美沙芬、麻黄碱、苯乙胺、伪麻黄碱和昔奈福林。杀虫剂包括但不限于对硫磷、马拉硫磷、氯螨硫磷、二嗪磷、敌敌畏和杀虫畏。
在其它实施方式中，感兴趣分析物是内源性产生的，例如其产量与对象是否存在某种疾病状态或代谢状态相关。内源性分析物的例子包括脂肪酸酯(例如，作为饮酒标记物)；铬(例如，作为葡萄糖耐受和2型糖尿病的衡量)；葡萄糖(例如，作为葡萄糖耐受和2型糖尿病的衡量)；和糖基(例如，作为慢性高血糖的衡量)。
角化样品的大小范围可以是约4-16mg/mL还原剂溶液，例如，约5-12mg、约6-10mg、约7-15mg、约5-10mg、或者约8-14mg/mL还原剂溶液。首先，可以用已知方法洗涤样品以去除可能通过外部接触而非实际使用沉积在表面上的分析物或污染物。
然后处理角化结构样品，以释放俘获的分析物。重要的是，角化结构的处理方法不包括使角化结构与一种或多种蛋白水解酶，如木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶和蛋白酶K相接触。因此，所述处理方法不会蛋白水解切割所述结构中的肽(酰胺)键，例如基本不切割它们。在一些实施方式中，所述方法能减少，例如显著减少角化结构样品中存在的二硫键，但不切割样品中的肽键(例如，基本不切割它们)。通常，所述处理方法包括还原步骤、任选的失活步骤和任选的纯化步骤(例如，分离、过滤或离心)。
在还原步骤中，使所述样品与还原剂溶液(还原溶液)，如二硫苏糖醇(“DTT”)相接触，以便还原角蛋白宏观结构中的分子间和分子内二硫键，从而释放俘获的分析物。在一些实施方式中，可将所述角化结构样品与主要由还原剂组成的还原溶液相接触，或者与不含蛋白水解酶的还原溶液相接触。在一些实施方式中，所述接触步骤不会导致角蛋白多肽链中的肽主链键(即酰胺键)发生大量断裂。
与还原溶液接触后，可任选处理还原的角化结构样品，以便使残留的还原剂失活。如同接触步骤那样，失活步骤在不存在蛋白水解酶的情况下进行(例如，在主要由失活剂组成的溶液中，或者在不含蛋白水解酶的溶液中)。
为了确定一种或多种分析物是否存在和(任选地)浓度，在与还原溶液接触的步骤之后或者是任选失活步骤之后，可由经处理的角化样品获得样品。该样品可直接取出、在任选的失活步骤后取出或者在任选的用于去除残留的还原角化样品的纯化步骤(例如，分离、离心或过滤)后取出。
包含在还原溶液中的还原剂可以是能够还原角化结构中二硫键的任何还原剂。典型例子包括DTT(2，3二羟基丁-1，4-二硫醇)或其异构体DTE(2，3二羟基丁-1，4-二硫醇)、巯基乙酸酯、半胱氨酸、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硫化物、二硫化物或TCEP(三(2-羧基乙基)膦)，或任何上述物质的盐形式。具体地，TCEP可用于在较低pH范围，例如5.5-约8下进行的实验。
通常，在接触步骤中水溶液中还原剂的浓度约为1-20g/L，例如，约1-15、约2-14、约5-15、约10-18、约3-12、约4-8g/L。本领域普通技术人员认识到，还原剂含量可根据反应时间的长短和所用的检测方法而改变。
在一些实施方式中，所述方法可以在室温或接近室温的温度下，并在中性pH下进行。例如，所述方法可以在约20℃-60℃的温度(例如约20、25、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56或60℃)和约pH 5-10.5的条件下进行。在一些实施方式中，所述方法的pH约为8.8-9.7(例如，8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.45、9.5、9.55、9.6、9.65)，所述方法在大约37℃的温度下进行。例如，在其它实施方式中，当感兴趣分析物或者其代谢物或降解产物对碱性pH敏感时，可使用较低的pH，例如，约5-8.7(例如，约5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6或8.7)。本领域普通技术人员不难确定合适的反应条件，包括反应温度、时间和pH。其它信息参见例如，美国专利号5,466,579；5,324,642；6,022,693；6,582,924；和6,949,344，通过引用将其全文纳入本文，这些专利讨论了通过在较低pH下进行实验保持感兴趣分析物(如海洛因代谢物、可卡因)的化学结构的方法。
DTT和DTE是特别有用的还原剂。已发现，在所述方法中使用DTT或DTE导致在较短时间内(取决于角化样品的量和类型)，例如约0.5-4小时、约1-3小时或约1.5-2.5小时内释放俘获的分析物。在某些实施方式中，对于(例如)约5-15mg角化样品如毛发而言，处理约2小时是足够的。
一旦所述一种或多种分析物释放到溶液混合物中，任选可通过本领域普通技术人员了解的方法使残留的活性还原剂失活，包括简单的等待足够时间使其自然失活。通常，这一时间约为还原剂与角化样品初次接触后2-14小时，这取决于所用还原剂的浓度和量、pH、温度、样品大小等因素。
或者，如本领域普通技术人员所知的那样，可通过向还原溶液中加入某些金属离子，通常是金属盐形式，使残留的还原剂失活。在与样品接触后，在还原溶液中加入少量，例如在最终样品溶液中达到约0.1-1.0g/L的这种金属盐可显著减少对还原样品进行所述分析物检测方法所需的时间，因为不需要等待还原剂自身失活。大部分有效的金属盐是在化学连接后不会从溶液中析出、并且能使所述还原剂如DTT或DTE失活的某些金属盐。避免在还原溶液中析出可能有用，因为这种析出可能导致分析物吸附在沉淀上或者俘获在沉淀中而产生损失，或者可引起颗粒阻碍对光学读出方法的干扰。
在某些实施方式中，也通过将还原溶液的pH保持在约6-8，最优选约7来防止析出。实现这种目的的一种方式是加入一摩尔BIS-TRIS碱，以便将pH保持在约7。就某些分析物检测方法，例如放射性免疫试验(RIA)或酶促免疫试验的性能而言，pH约7也是有用的pH。
除如美国专利5,466,579和5,324,642所述的Cu++盐(如硫酸铜)外，Zn++盐(如硫酸锌和硝酸锌)；Mn++盐(如硫酸锰)；Fe+++盐(如硫酸铁和氯化铁)；和Fe++盐(如硫酸亚铁)是有效的。有效的还有Pb++盐(如乙酸铅和硝酸铅)；Cd++盐(如氯化镉)；Hg++盐(如氯化汞)；Ag++盐(如硝酸银)；和Co++盐(如氯化钴)。参见美国专利6,022,693和6,350,582。
在某些实施方式中，可使用亚砷酸盐，如亚砷酸钠(NaAsO2)，通过形成可沉淀化合物去除残留的还原剂(如DTT或DTE)。通常，将100微升100mg/mL的亚砷酸钠溶液加入1mL毛发消化溶液(终浓度约为10g/L)，以使还原剂失活。然而，不优选亚砷酸盐，因为可能因产生沉淀而吸附或俘获分析物。通常，在所述样品与所述还原溶液接触后约1-5小时(例如，约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5小时)，可将约0.1-1mg(例如，约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1mg)溶液中的金属盐加入约0.8-1.6mL(例如，约0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5或1.6mL)还原溶液中。通常，失活过程快速完成，例如在约30分钟内，例如约20分钟内，约10分钟内、约5分钟内或约2分钟内完成。
一旦样品处理完成后，可通过本领域认可的分析物检测方法，包括受体试验、基于蛋白质的分析方法如免疫试验，包括放射性免疫试验(RIA)或酶促免疫试验(EIA)和/或仪器方法如质谱、色谱技术或原子吸收，对还原的角化样品溶液进行直接分析。因此，惊讶地发现，所述还原剂可破坏角蛋白的二硫键连接但不破坏免疫试验中所用的IgG蛋白(抗体)。
在具体实施方式中，可使用仪器方法验证免疫试验方法中获得的阳性结果。由于这些方法不是基于蛋白质的方法，所以不需要使还原剂失活的步骤。处理方法的速度和温和性以及通过包含“峰”，即包含含量已知的氘化分析物定量测定效率的能力，使得本发明所述的处理方法也成为仪器分析方法如气相色谱、液相色谱和质谱中选择的方法。
可使用该方法，检测如前所述任何感兴趣分析物的使用或早先使用，这些分析物包括滥用药物如可卡因、吗啡/海洛因和其它阿片类药物、大麻素类、大麻、苯环利定或“PCP”、安眠酮和苯丙胺。而且，所述方法能够有效确定处方药如地高辛、美沙酮和苯并二氮
Figure BPA00001284445600121
的早先使用。考虑到，个体血流中存在的、在毛发合成期间转移到毛发中的任何分析物，特别是任何有机分析物可利用本文所述方法提取和分析。
在某些实施方式中，可使用去污剂辅助释放感兴趣的一种或多种分析物。可用于溶解生物膜组分的某些生物去污剂化合物有助于在较低pH下释放分析物，而不干扰还原或后续的分析物检测。这些生物去污剂可能有助于在pH范围约为5-10.5的条件下处理角化样品。合适的去污剂包括胆汁酸去污剂，如甘胆酸、胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸及其盐，包括钠盐。用于所述方法的其他去污剂是磺基甜菜碱，如两性去污剂(Zwittergents)
Figure BPA00001284445600122
和甜菜碱，如Empigen BB(N-十二烷基-N，N-二甲基甘氨酸)(均购自加利福尼亚州拉霍亚的卡巴开公司(Calbiochem Corp.，La Jolla，CA))。其他去污剂包括烷基葡糖苷，包括己基-β-D-吡喃葡糖苷、庚基-β-D-吡喃葡糖苷、辛基-β-D-吡喃葡糖苷、壬基-β-D-吡喃葡糖苷、癸基-β-D-吡喃葡糖苷、十二烷基-β-D-麦芽糖苷和辛基-β-D-硫代吡喃葡糖苷(OSGP)。烷基葡糖苷混合物如ELUGENT
Figure BPA00001284445600123
产品(卡巴开公司)也是有效的。
特别优选的是胆汁酸、胆酸和甘胆酸，它们有助于在pH范围约6.3-8的条件下消化毛发。脱氧胆酸类如脱氧胆酸和甘氨脱氧胆酸能在pH高于约7的条件下有效辅助消化毛发。
这些去污剂可用于工业标准的五种药物筛选(美国最常见的滥用药物，即大麻、可卡因、苯环利定、去氧麻黄碱和阿片类)，用本文所述方法进行测定。因此，它们不影响五种药物筛选中涉及的任何分析物或抗体，不会导致假阴性或假阳性。物种药物筛选中最有效的具体去污剂是胆酸盐、脱氧胆酸盐、胆酸、脱氧胆酸、辛基-β-D-吡喃葡糖苷和辛基-β-D-硫代吡喃葡糖苷。当进行包括可卡因、阿片类、苯环利定、苯丙胺和拟交感神经胺在内的筛选时，优选胆汁酸去污剂、烷基葡糖苷、磺基甜菜碱和甜菜碱。在单独用于可卡因的筛选中，优选去污剂是胆酸、两性去污剂(Zwittergents)
Figure BPA00001284445600124
烷基葡糖苷和N-十二烷基-N，N二甲基甘氨酸。
实践中，将生物去污剂与还原性水溶液混合，然后将在大约30-40℃的温度范围内将该溶液与角化样品相接触。通常，将约1-2mg生物去污剂加入约1ml还原溶液中。
有关本文所述方法的额外信息，包括使用生物去污剂、离子交换树脂(例如，去除干扰物质)和改变用于消化的pH范围，可参见通过引用纳入本文的美国专利6,022,693和6,350,582。
通过本发明所述方法获得的益处颇多，包括能够迅速、准确和廉价地确定早先接触特定的分析物。该方法可提供长时间上的消耗记录或未消耗记录。通过剔除所有蛋白水解处理步骤，蛋白水解方法的花费和对生物分析物检测的某些干扰都被降低。令人惊讶的是，用于使各物质扩散到毛发结构中的蛋白水解酶和还原剂的协同作用对于有效释放感兴趣分析物而言不是必需的。而且，毛发收集侵入性和身体排斥性均低于血液或尿液的收集，样品无法改变或替换，也无法通过在预定测试，例如雇佣前检查或年度体检前短期戒除或“冲淡”(摄取过量液体)来规避检测。样品可无限期的保存而无需冷藏。最后，所述方法有利于用于检测感兴趣分析物的筛选和验证实验。
下述实施例旨在说明而不是限制权利要求书。
实施例
实施例I：毛发样品的非蛋白水解消化物的放射性免疫试验
向试管中的8mg毛发样品中加入1.6mL 6％二硫苏糖醇(pH 9.5)，该样品在37℃孵育2小时。然后，用140uL含有6％五水硫酸铜的1.0M Bis Tris(pH 7)中和该样品，混合并离心。采集上清液，测定可卡因、阿片类、PCP、苯丙胺和大麻素类。
通过将样品等份与I125-标记的药物和针对该药物的第一抗体混合进行放射性免疫试验。样品中标记和未标记的药物竞争结合第一抗体上的位点。孵育后，加入针对第一抗体的第二抗体，以沉淀抗体结合的药物。离心和倾析上清液后，用γ计数器对沉淀的结合组分进行计数。
可卡因的示范性结果
Figure BPA00001284445600141
*比较RIA结果使用美国专利5,324,642和6,350,582所述方法获得。
**MS＝对样品中存在的药物进行质谱定量测定。COC＝可卡因；BE＝苯甲酰芽子碱；CE＝古柯乙烯；NOR＝去甲可卡因
注：RIA试验的B/Bo百分数的解释—阴性(Bo)值100％是样品中不含分析物的参比管获得的数值，它代表抗体与放射性示踪剂发生最大结合。将未知样品表示为阴性Bo的百分数，称为“B/Bo百分数”。样品中分析物的浓度与B/Bo百分数反向变化。阳性样品是药物含量等于或大于校准器截止值的样品，因此B/Bo百分数等于或低于校准器截止值。
阿片类药物的示范性结果
Figure BPA00001284445600151
*比较RIA结果使用美国专利5,324和6,350,582所述方法获得。
**MS＝对样品中存在的药物进行质谱定量测定。MAM＝6-单乙酰基吗啡
PCP的示范性结果
Figure BPA00001284445600161
*比较RIA结果使用美国专利5,324,642和6,350,582所述方法获得。
**MS＝对样品中存在的药物进行质谱定量测定。PCP＝苯环利定
苯丙胺的示范性结果
*比较RIA结果使用美国专利5,324,642和6,350,582所述方法获得。
**MS＝对样品中存在的药物进行质谱定量测定。METH＝去氧麻黄碱；AMP＝苯丙胺；MDA＝3，4-亚甲基二氧苯丙胺；MDMA＝3，4-亚甲基二氧去氧麻黄碱
实施例II：利用市售抗体包被的微孔板对毛发样品的非蛋白水解消化物进行酶促免疫试验
向试管中的8mg毛发样品中加入0.8mL 1.5％二硫苏糖醇(pH 9.5)，该样品在37℃孵育2小时。然后，用70uL含有1.25％锌的1.0Bis Tris(pH 7)中和该样品，混合并离心。采集上清液，在抗体包被的微孔板上测定PCP(苯环利定)。在孔中孵育样品1小时后，倒空该孔，洗涤一次，然后加入HRP-抗原并继续进行生产商(科扎特工业公司(Cozart Industries))所述的方法。
PCP的示范性结果
**MS＝对样品中存在的药物进行质谱定量测定。PCP＝苯环利定
实施例III：毛发样品的低-pH非蛋白水解消化的仪器分析
向试管中的12mg毛发中加入1.2mL含有12％二硫苏糖醇和0.2％胆酸的1.0M Bis-Tris溶液(pH 5.5)。在37℃、120转/分钟的振荡培养箱中培育样品过夜(8-12小时)。在为后续分析步骤(如MS)进行清洁/提取后，分析来自这些消化样品的上清液。
实施例IV：显示还原剂(如DTT)是消化物中的活性成分
为了证明DTT是本发明所述的非蛋白水解消化方法中的活性成分，将一个等份的可待因阳性毛发样品与pH 9.5的Tris-缓冲液(不含DTT)相接触，将另一等份的样品与pH 9.5的含有6克DTT/L的溶液接触。不含DTT的pH 9.5溶液从每10mg毛发中回收到2.36ng可待因，而含DTT的pH 9.5溶液从每10mg毛发中回收到19.34ng可待因。
其它实施方式
描述了许多实施方式。然而，应理解，可进行各种改进而不背离本发明的构思和范围。因此，其他实施方式包括在所附权利要求书的范围内。

Claims (40)

1.一种测定对象的角化结构样品中是否存在分析物的方法，所述方法包括
(a)提供任选洗涤的角化结构样品；
(b)将所述角化样品与还原剂水溶液相接触以产生测试溶液，其中所述接触不会蛋白水解切割所述角化结构；和
(c)测定步骤(b)的测试溶液中是否存在所述分析物。
2.如权利要求1所述的方法，还包括在存在所述分析物的前提下测定所述测试溶液中所述分析物的含量。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括在步骤(c)之前使步骤(b)的测试溶液中残留的还原剂失活以得到失活的测试溶液，并测定所述失活的测试溶液中是否存在所述分析物，其中所述失活过程不会蛋白水解切割所述角化结构。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括纯化步骤(b)的测试溶液以分离测试溶液中残留的角化样品，得到纯化的测试溶液，并测定所述纯化的测试溶液中是否存在所述分析物；其中所述纯化过程不会蛋白水解切割所述角化结构。
5.一种测定对象的角化结构样品中是否存在分析物的方法，所述方法主要由以下步骤构成：
(a)提供任选洗涤的角化结构样品；
(b)使所述角化样品与还原剂水溶液相接触，得到测试溶液；
(c)使步骤(b)的测试溶液中残留的还原剂失活以得到失活的测试溶液；
(d)纯化步骤(c)的失活测试溶液以去除残留的角化样品，得到纯化、失活的测试溶液；和
(e)测定步骤(d)的纯化、失活的测试溶液中是否存在所述分析物。
6.如权利要求5所述的方法，还包括在存在所述分析物的前提下测定所述纯化、失活的测试溶液中所述分析物的含量。
7.一种测定对象的角化结构样品中是否存在分析物的方法，所述方法包括
(a)提供任选洗涤的角化结构样品；
(b)使所述角化样品与还原剂水溶液相接触，得到测试溶液；和
(c)测定所述测试溶液中是否存在所述分析物。
其中所述方法不包括使所述角化结构样品与蛋白水解酶相接触。
8.如权利要求7所述的方法，还包括在存在所述分析物的前提下测定所述测试样品中所述分析物的含量。
9.如权利要求7所述的方法，还包括使所述测试溶液中残留的还原剂失活。
10.如权利要求7所述的方法，还包括纯化所述测试溶液以去除残留的角化样品。
11.一种测定对象的角化结构样品中是否存在分析物的方法，所述方法包括
(a)提供任选洗涤的角化结构样品；
(b)使所述角化样品与还原剂水溶液相接触，得到测试溶液；和
(c)测定所述测试溶液中是否存在所述分析物。
其中所述方法不包括蛋白水解切割所述角化结构样品。
12.如权利要求11所述的方法，还包括在存在所述分析物的前提下测定所述测试样品中所述分析物的含量。
13.如权利要求11所述的方法，还包括使所述测试溶液中残留的还原剂失活。
14.如权利要求11所述的方法，还包括纯化所述测试溶液以去除残留的角化样品。
15.一种测定对象的角化结构样品中是否存在分析物的方法，所述方法包括
(a)提供任选洗涤的角化结构样品；
(b)处理所述角化结构样品，以便减少所述角化结构样品中存在的二硫键，但不切割所述样品中的肽键，从而得到测试溶液；和
(c)测定所述测试溶液中是否存在所述分析物。
16.如权利要求15所述的方法，还包括在存在所述分析物的前提下测定所述测试样品中所述分析物的含量。
17.如权利要求1、5、7、11或15所述的方法，其特征在于，所述还原剂包含DTT或DTE。
18.如权利要求3、5、9或13所述的方法，其特征在于，所述失活步骤包括使所述测试溶液与金属盐的水溶液相接触，其中所述盐的金属阳离子选自下组：Cu++、Zn++、Mn++、Fe+++、Fe++、Pb++、Cd++、Hg++、Ag++、As+++和Co++。
19.如权利要求4、5、10或14所述的方法，其特征在于，所述纯化步骤包括分离、过滤或离心所述测试溶液。
20.如权利要求1、5、7、11或15所述的方法，其特征在于，用特异于所述分析物的免疫试验测定是否存在所述分析物。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述分析物的特异性免疫试验包括使用所述分析物的特异性抗体。
22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述免疫试验是放射性免疫试验。
23.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述免疫试验是酶促免疫试验。
24.如权利要求1、5、7、11或15所述的方法，其特征在于，用质谱技术测定是否存在所述分析物。
25.如权利要求1、5、7、11或15所述的方法，其特征在于，用色谱技术测定是否存在所述分析物。
26.如权利要求1、5、7、11或15所述的方法，其特征在于，进行所述接触步骤或处理步骤的pH约为5.0至10.5。
27.如权利要求1、5、7、11或15所述的方法，其特征在于，进行所述接触步骤或处理步骤的pH约为5至8.8。
28.如权利要求1、5、7、11或15所述的方法，其特征在于，进行所述接触步骤或处理步骤的pH约为8.8至10.5。
29.如权利要求1、5、7、11或15所述的方法，其特征在于，进行所述接触步骤或处理步骤的温度约为20℃至40℃。
30.如权利要求1、5、7、11或15所述的方法，其特征在于，所述接触步骤或处理步骤进行约0.5至12小时。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述接触步骤或处理步骤进行约1至5小时。
32.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述接触步骤或处理步骤进行约2小时。
33.如权利要求1、5、7、11或15所述的方法，其特征在于，所述分析物是滥用药物或其代谢物、处方药或其代谢物、止痛药或其代谢物、营养剂、或内源性分析物，或任何上述物质的盐形式。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述滥用药物或其代谢物选自下组：可卡因、苯甲酰芽子碱、古柯乙烯、去甲可卡因、PCP、苯丙胺、去氧麻黄碱、大麻素、THC、羧基-THC、海洛因、可待因、吗啡、6-单乙酰基吗啡(MAM)、羟考酮、3，4-亚甲基二氧苯丙胺(MDA)；和3，4-亚甲基二氧去氧麻黄碱(MDMA)。
35.如权利要求1、5、7、11或15所述的方法，其特征在于，所述角化结构样品包括毛发、指甲或趾甲。
36.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述角化结构样品包括毛发。
37.如权利要求1、5、7、11或15所述的方法，其特征在于，洗涤所述毛发样品。
38.如权利要求15所述的方法，还包括使所述测试溶液中残留的还原剂失活。
39.如权利要求15所述的方法，还包括纯化所述测试溶液以去除残留的角化样品。
40.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述滥用药物或其代谢物、处方药或其代谢物、或止痛药或其代谢物是阿片类药物、大麻素、NSAID、类固醇、苯丙胺、苯并二氮
Figure FPA00001284445500041
巴比妥类药物、三环药物或麻黄碱，或其代谢物。
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