CN102065904A - 肾功能分析方法和装置 - Google Patents

Abstract

一种用于在哺乳动物肾中测量肾小球滤过率的方法包含报告物和标志物荧光分子源。将荧光分子导入哺乳动物受试者的血流中。在一段时间里，采集报告物和标志物荧光分子的强度的测量。计算比率以确定受试者的肾的健康。此方法基于相对于报告物分子荧光的标志物分子荧光来测量血浆分布的体积。

Description

肾功能分析方法和装置

发明领域

本发明涉及与分析器官功能结合使用的医学方法和装置。更具体而言，本发明涉及用于分析并量化哺乳动物肾功能的装置和方法。

发明背景

急性肾损伤(Acute kidney injury，AKI)是一种重度的且致命的疾病过程，影响着所有住院患者的5-10％。这些病例中的死亡率常常超过50％。AKI与数种临床情况中(包括施用放射造影染料和心血管手术后)的死亡率升高独立相关。它在病因学中常常是多因素的，尤其在病危患者中。个别因素的相对重要性取决于潜在的病理学和患者共发病率(co-morbidity)。

最近的数据表明AKI病例总数的令人担忧的增加。利用来自1992年-2001年的医疗保险(Medicare)5％样本中的患者索赔，Xue等(J Am Soc Nephrol17：1135-11422006)已经显示了此时间期限过程中，AKI的发生从1992年的每1,000例出院(discharge)23.6例病例至2001年的每1,000名患者63.3例病例增加了约11.6％。

在最近的研究中，Hsu等(Hsu等，“Community-Based Incidence of AcuteRenal Failure，”Kidney Int.2007；72(2)：208-12.)在大综合健康护理提供系统(integrated health care delivery system)的成员间量化了非透析和透析AKI的发生。在1996年和2003年之间，非透析要求型(non-dialysis-requiring)AKI的发生从323例增加至522例，而透析要求型(dialysis-requiring)AKI的发生从每100,000人年20例增加至30例。此外，医院死亡率在AKI患者中比在非AKI出院中高得多。没有AKI的患者具有4.6％住院(in-hospital)死亡率，而那些原发性AKI和继发性AKI患者分别具有15.2和32.6％的比率。医院收治后90天内的死亡分别是没有AKI的出院中的13.1％，原发性和继发性AKI患者的34.5％和48.6％。在此大研究中，形成终末期肾病(end stage renal disease)的概率是作为原则诊断的急性肾损伤的患者中的18.8％和作为继发性诊断准则(secondary diagnostic code)的急性肾衰竭的患者中的10.1％。最后，使用所收集的数据，计算出美国的至少22.4％的终末期肾病(ESRD)病例来自患有医院获得性AKI的医疗保险受益人。

这些数据与由Paul Eggers博士(流行病学NIDDK的主任)进行的观察一致，这指明作为原发性或继发性诊断的AKI的住院患者的百分比和绝对数目及已经具有作为医院诊断的AKI且行进到ESRD上的慢性肾病(chronic kidneydisease，CKD)的患者的快速增加。

在另一项研究(Uchino等，“An Assessment of the RIFLE Criteria for AcuteRenal Failure in Hospitalized Patients，”Crit.Care Med.2006；34(7)：1913-7.)中，在回顾性单一中心研究中测定了20,126名住院患者的发生和结果。在这些患者中，14.7％需要ICU收治，18％患有AKI，而且死亡率与肾损伤的程度相关联。最后，在多中心回顾性ICU研究中，AKI在67％的收治中发生，而且总体预后再次与AKI的严重性相关联。

明显地，住院患者中的AKI流行以令人担忧的速率增加。损伤的严重性决定住院结果，而AKI加速慢性肾病的形成和CKD向ESRD的行进。

认为肾小球滤过率GFR是用于测定AKI的程度和CKD行进的最相关度量。肾损伤(急性的或慢性的)继发性GFR降低伴有血液尿素氮(BUN)和血清肌酸酐水平升高。目前，使用血清肌酸酐或基于血清肌酸酐的方程来测定患者的评估GFR(eGFR)。不幸地，这两种方法在GFR的全范围里是不可靠的，而且都不能在AKI中使用，因为肌肉质量(肌酸酐是肌酸的一种分解产物，其是肌肉的重要部分)和GFR两者决定患者的血清肌酸酐水平。

使用血清肌酸酐作为GFR的指标是高度患者特异性的。例如，1.0mg/dl的血清肌酸酐指明具有正常肌肉质量的70Kg(154lb)男性中的正常GFR(100ml/分钟)。然而，在患有中度肌肉消耗(muscle wasting)的50Kg(110lb)男性中，看到1.0mg/dl的血清肌酸酐，即使他的GFR仅是50ml/分钟。已经开发了源自大群体研究的公式以包括(factor in)患者重量、年龄、性别和种族。然而，这些公式即使在评估低于20或高于60ml/分钟的GFR中也是不准确的，而且常常是令人误解的。因此，这是它们不能在AKI的背景中使用的另一个原因。

最近的数据指明现在知道即使先前认为临床上不显著的非常小的肾功能变化(如通过小的血清肌酸酐总体平衡升高所测定的)预测升高的死亡率。数份最近的出版物已经利用风险、损伤、衰竭、损失和ESRD标准(常常称作“RIFLE”标准)来将患者分层入表观损伤水平中，其基于所获得的最大血清肌酸酐和对透析的需要来实现。对死亡率、住院期长度(length of hospital stay，LOS)、ICU停留的LOS、住院成本、和需要与此分层系统中实现的最高阶段有关的肾替换疗法收集数据。这些数据指明AKI中的肾损伤的严重性或程度是患者结果的一项重要的预后指标。此外，器官功能的早期变化预测严重败血症中的存活。

作为GFR测量的血清肌酸酐测定也可以是严格限制的，这是由于达到准确转换所要求的平衡值所花费的时间。急性肾衰竭患者形成其GFR的突然下降；然而，此下降的幅度仅在(如果通过上升的血清肌酸酐所测定的)平衡的数天后是明显的。例如，如果患者要丧失95％的其AKI继发性GFR，那么GFR会从100快速降低至5ml/分钟，但是血清肌酸酐仅会上升1mg/dl/天。血清肌酸酐的此缓慢上升限制内科医生在事件后12-24小时诊断损伤的能力，而且也没有可能测定损伤程度达数天。这具有显著有限的进行AKI的治疗试验的能力。由于GFR的下降程度，或血清肌酸酐的最终平台(plateau)与发病率、死亡率和恢复潜力相关联，准确测定急性肾损伤患者中的GFR的能力对于快速诊断、分层和及时治疗是具有极大临床意义的。

广泛认为AKI的12-24小时后开始治疗可以限制任何潜在治疗剂的成功率。因此，肾损伤的生物标志的搜索已经得到强化，而且现在许多专家认为是AKI领域中最高优先级的。潜在的分子包括NGAL、KIM-1、IL-18、和数种其它分子。任何一种生物标志或很可能地生物标志组合会充当损伤的结构标志物。然而，利用这些结构生物标志寻求的改善可能不是显著的，因为它们是使用不可适用于个体的群体结果开发的。

存在收集24小时尿和侵入技术以准确测定患者的GFR，但是这些是麻烦的、易于出错的、昂贵的、费时的、或将患者暴露于放射或放射性造影介质。还有，没有能在血清肌酸酐上升时在急性肾损伤患者中可靠地测定GFR的快速的且准确的测量技术。

肝负责数种活性，包括从血液清除代谢物和毒素、生成胆汁、脂质代谢、药物代谢、代谢许多药物、贮存多种维生素和蛋白质合成。不幸地，肝可以是急性或慢性患病的，而且其实施各种生命功能的能力可以是受限的。在加强护理病房中，肝的最重要功能之一是代谢药物(从其非活性的至其活性状态或者反之亦然)。因此，肝健康对于确定应当将多少药物导入患者中和持续多长可以是至关重要的。量化和/或检测肝功能或功能障碍的当前方法一般是模糊的且定性的，而且可以包括黄疸、变黑的尿、恶心、食欲不振(loss ofappetite)、不常见的重量减轻或重量增加、呕吐、腹泻、浅色粪便、全身性痒(generalized itching)、低血糖症(hypoglycemia)等。不幸地，检测肝健康的这些工具与用于检测其它主要健康问题的体征常常是相同，而且在诊断和治疗具有多发病率的患者时常常是无用的。因此，许多肝疾病仍然未被识别，直至它们达到严重状态，其中代谢功能和腹水常常是更明确的体征。因此，需要更定量的而不是定性的肝功能诊断。

提供了本发明以解决上文所讨论的问题和其它问题，而且提供了在先诊断技术未提供的优点和方面。本发明的特征和优点的全面讨论服从以下详述的描述，其参照附图进行。

发明概述

本发明的一方面涉及用于导入哺乳动物受试者的血管系统中以分析器官功能的组合物。所述组合物包含报告物分子和标志物分子。报告物分子和标志物分子共享共同的分子特征。报告物分子具有第一质量的报告物分子分子特性，而标志物分子具有与报告物分子分子特征第一质量可区别的第二质量的报告物分子分子特性。所述分子特性可以选自下组：分子量、分子大小、分子形状、分子电荷、化合物(compound)、和射频。

在分子特性是分子量时，报告物分子可以具有第一分子量，而标志物分子可以具有第二分子量。第一分子量可以小于第二分子量，而且可以实质上更小。第一分子量可以是巨大的，其中所述报告物分子是被适当发挥功能(function)哺乳动物肾过滤的。第二分子量可以大得足以抵抗人肾过滤所述标志物分子。任选地，第一分子量可以是巨大的，其中所述报告物分子是容易被适当发挥功能哺乳动物肾过滤的，而同时所述第二分子量大得足以抵抗哺乳动物肾过滤所述标志物分子。第一分子量可以选自下组范围：1kD至500kD、3kD至150kD、10kD至150kD、10kD至70kD、和20kD至70kD。或者，第一分子量可以小于500kD、在1kD和500kD之间、在3kD和150kD之间、在3kD和70kD之间、在3kD和20kD之间、或约5kD。

报告物分子可以具有第一荧光特征，而标志物分子可以具有第二荧光特征。这些荧光特征可以是不相等的，例如具有不同波长。第一荧光特征可以是第一荧光激发波长和第一荧光发射波长。第二荧光特征可以是第二荧光激发波长和第一荧光发射波长。第一和第二荧光激发波长和第一和第二荧光发射波长可以是不同的、不相等的、或可区分的。

报告物和标志物分子可以是右旋糖苷(dextrans)。报告物分子可以是磺基罗丹明101右旋糖苷。标志物分子可以是不被哺乳动物肾过滤的较大的未限定的右旋糖苷。报告物分子和标志物分子可以是与荧光素偶联的右旋糖苷。另外，报告物分子荧光素可以具有与标志物分子的荧光激发波长不相等的荧光激发波长。

或者，报告物分子和标志物分子可以是与不同荧光团偶联的右旋糖苷。另外，荧光报告物分子可以具有与标志物分子的荧光激发波长不相等的荧光激发波长。

报告物分子可以是异硫氰酸荧光素-菊粉(fluoresceinisothiocyanate-inulin)。

标志物分子可以具有约0的肾小球筛分系数(glomerular sievingcoefficient)。

标志物分子可以是不被哺乳动物肾分泌、重吸收、或过滤的。

标志物分子可以不能通过肾小球滤过屏障，而报告物分子可以能够通过肾小球滤过屏障。

本发明的第二方面涉及用于分析哺乳动物肾的运行状况的装置。所述装置包含荧光分子源、用于将所述荧光分子导入血管系统中的手段、用于测量所述血管系统内的所述荧光分子的手段(means)、和用于报告所述血管系统内的所述测量的荧光分子的手段。用于导入的手段可以包括导管。用于测量的手段可以包括与检测仪通信的光学纤维。用于报告的手段可以包括测定所述血管系统内测量的两种或更多种荧光分子之间的强度比率。荧光分子源可以包含多种荧光偶联的分子。

本发明的第三方面涉及用于分析哺乳动物肾的运行状况的装置。所述装置包含为第一荧光分子提供第一激发波长的光学手段和用于测量响应所述第一激发波长的来自所述第一荧光分子的发射的手段。

光学手段可以对第二荧光分子发射第二激发波长，而且所述装置可以进一步包含用于测量响应所述第二激发波长的来自所述第二荧光分子的发射的手段。

本发明的第三方面的装置可以进一步包含用于计算所述来自所述第一荧光分子的发射与所述来自所述第二荧光分子的发射的比率的手段。所述装置可以更进一步包含用于报告所述比率的手段。

本发明的第四方面涉及用于测量血管系统内多种荧光偶联的肾小球滤过率分子的相对量的光学装置。所述光学装置包含第一荧光激发波长源、荧光激发波长通过的投递光程、接受荧光激发波长投递的激发位置、发射的荧光信号通过的返回光程、和用于检测发射的荧光信号的强度的手段。此装置可以进一步包含第二荧光激发波长源。

用于检测的手段可以选自下组：光倍增管、光检测仪、固态检测仪、和电荷耦合装置。

激发位置可以包括纤维光缆。

本发明的第五方面涉及用于测量血管系统内多种荧光肾小球滤过率分子的相对量的光学装置。所述光学装置包含第一荧光激发波长源、第二荧光激发波长源、第一和第二荧光激发波长通过的投递光程、接受第一和第二荧光激发波长投递的激发位置、第一发射的荧光信号和第二发射的荧光信号从所述激发位置通过的所述返回光程、用于检测第一发射的荧光信号的强度的第一手段；和用于检测第二发射的荧光信号的强度的第二手段。

本发明的第五方面的光学装置可以进一步包含用于将第一或第二荧光激发波长中至少一种聚焦至所述激发位置上的第一透镜。第二透镜可以将第一或第二发射的荧光信号中至少一种聚焦至所述用于检测的第一或第二手段之一上。第三透镜可以将第一或第二发射的荧光信号中的另一种聚焦至用于检测的第一或第二手段之另一种上。可以提供第一聚光透镜，用于使与第一荧光激发波长有关的像差最小化。可以提供第二聚光透镜，用于使与第二荧光激发波长有关的像差最小化。第一二向性滤光器可以安放在投递光程内。第二二向性滤光器可以安放在返回光程内。第三二向性滤光器可以安放在投递光程和返回光程之间的光学装置内。

本发明的第六方面涉及用于分析肾的运行状况的导管。所述导管包含具有与远端相对的近端并限定通道的管状主构件和自远端可延伸的纤维光缆。导管可以进一步包含在一端与管状构件连接且具有可插入血管系统中的相对端的导引器(introducer)和/或插入工具。一定长度的纤维光缆可以是流体密封在所述插入工具内的。插入工具可以包括第二管状构件内可滑动的第一管状构件。纤维光缆可以被第一管状构件的一部分俘获。插入工具可以连接至所述管状主构件的一部分，其中所述纤维光缆通过所述插入工具，并进入所述管状主构件中。管状主构件可以通过连接器(connector)连接至所述导引器。纤维光缆可以在第一和第二管状构件之间的相对运动后自导引器可延伸。

第一和第二管状构件可以是流体密封的。

纤维光缆可以包括可插入血管系统中的远端上的弯曲。

本发明的第七方面涉及用于分析肾的运行状况的导管。导管包含纤维光缆、在一定长度的所述纤维光缆周围的纤维光学插入工具，其具有密封至第二管状构件的第一管状构件，而且能够与其相对运动，所述纤维光缆与所述第一管状构件的一部分保持附着，使得所述第一管状构件的运动将运动转移至所述纤维光缆，和密封至所述插入工具的管状主体，所述纤维光缆通过所述肾小球主体中的通道，而且在所述第一和第二管状构件之间的相对运动后自其可延伸。

导管可以进一步包含与所述肾小球主体连接的导引器。所述导引器可插入血管系统内，且所述纤维光缆自其可延伸。

纤维光缆在一端可以具有弯曲。所述一端可插入血管系统内。

本发明的第八方面涉及一种在哺乳动物肾中测量肾小球滤过率的方法。该方法包括下列步骤：提供多种第一荧光分子；提供多种第二荧光分子；将所述第一荧光分子和所述第二荧光分子导入哺乳动物受试者的血流中；用第一荧光激发波长激发所述第一荧光分子以产生具有第一荧光发放射波长的第一荧光发射信号，并第二荧光激发波长激发所述第二荧光分子以产生具有第二荧光发放射波长的第二荧光发射信号；所述导入步骤后测量所述第一荧光发射信号的强度和所述第二荧光发射信号的强度；并计算所述第一荧光发射信号的强度与所述第二荧光发射信号的强度的比率。可以以预定的时间间隔实施所述测量和计算步骤，并至少基本上实时地报告。

本发明的第九方面涉及一种在哺乳动物肾中测量肾小球滤过率的方法。此方法包括下列步骤：提供以预定的比率包含多种报告物分子和多种标志物分子的流体；将所述流体导入受试者的血管系统中；并在经过时间持续时间后在所述受试者的血管系统内测量所述报告物和标志物分子之每种的特征。此方法可以进一步包括下列步骤：在所述测量步骤后计算所述报告物分子特征与所述标志物分子特征的比率；并报告所述比率。可以在多个经过时间持续时间实施所述报告步骤。至少基本上实时地实施所述计算和报告步骤。

报告物分子可以能够通过肾小球滤过屏障。标志物分子可以比报告物分子更少地能够通过肾小球屏障。报告物分子和标志物分子可以是荧光分子。报告物分子和标志物分子可以包含右旋糖苷。标志物分子可以具有比报告物分子大的分子量。报告物分子可以具有1kD和150kD之间的分子量。标志物分子可以具有大于100kD的分子量。

本发明的第十方面涉及一种在哺乳动物肾中测量肾小球滤过率的方法。此方法包括下列步骤：提供具有已知波长的光源；将荧光分子暴露于所述光源，其中在哺乳动物受试者的血管系统内激发所述荧光分子达预定的时间持续时间；并测量所述激发的荧光分子的特征，所述特征具有与所述血管系统状况的关联。

从结合附图理解的以下说明书看，本发明的其它特征和优点会是显而易见的。

附图简述

为了理解本发明，它现在会参照附图举例进行描述，其中：

图1是利用本发明方法的本发明装置的例示；

图2是一系列显微照片，其显示了正常大鼠中小分子量右旋糖苷的肾清除，如通过活体2-光子显微术所显现的。自时间序列拍摄的显微照片揭示了小的FITC-菊粉(5.5kD)(下部显微照片系列)和大的500kD Texas

右旋糖苷(上部显微照片系列)两者在毛细管(CAP)内的定位。菊粉被快速地过滤入近端肾小球腔(PT腔)中，导致荧光信号随时间的稳定降低(小图E、小图F、小图G、和小图H)。比较而言，500kD右旋糖苷不被清除，而且其信号在毛细管内保持恒定(小图A、小图B、小图C、和小图D)。小图A、小图B、和小图C中在PT腔中看到的荧光不是500kD右旋糖苷的清除，而是来自FITC-菊粉的渗透(bleed through)发射。用不同LED序贯的激发和采集的当前方法会使此渗透现象最小化；

图3是一系列显微照片，其显示了FITC-菊粉与500kD Texas右旋糖苷的强度比率，其中500kD Texas右旋糖苷由于更大的分子大小而在染料输注后在血流中停留更长的时间；

图4是快速输注(bolus infusion)达60分钟后自血管测量的500kD FITC右旋糖苷的强度时间序列的图；

图5是推注的20kD FITC右旋糖苷与500kD Texas

右旋糖苷的强度比率作为时间函数以及最小二乘方拟合结果的图；

图6是使用比率技术和直接使用强度来测量血浆清除之间的图的比较；

图7是显示快速输注后来自两只大鼠的随时间作为结果的肾血管血浆强度比率的图，一只具有3kD FITC右旋糖苷和500kD Texas-Red右旋糖苷的混合物，而另一只具有20kD FITC右旋糖苷和500kD Texas

右旋糖苷；

图8是显示来自两只无肾大鼠的随时间的肝血管血浆强度比率的图，一只注射有10kD FITC右旋糖苷和500kD Texas

右旋糖苷的混合物，另一只注射有20kD FITC右旋糖苷和500kD Texas

右旋糖苷的混合物；

图9是本发明诊断装置的结构图；

图10是图9的装置的模型；

图11是FITC、罗丹明和Texas

染料的激发和发射谱的图；

图12是单通道光学系统的结构图；

图13是双通道光学系统的结构图；

图14是图13的双通道光学系统的分解图；

图15是二室模型的结构图；

图16是具有光学纤维的隐藏导管的例示；和

图17是装配并插入患者的静脉内的图16的导管的例示。

发明详述

虽然本发明容许有许多不同形式的实施方案，这些在附图中显示，而且在本文中会在本发明详细的优选实施方案中进行描述，理解的是要认为本公开内容例证了本发明的原则，而且并不意图将本发明的广泛方面限制于所例示实施方案。

发明人已经发现了AKI的结构和功能标志物两者的组合在诊断肾功能和肾相关疾病中呈现高水平的临床效用。如此，本发明的一个目标是提供用于分析和量化器官功能和过去难以或不可能测量的生理学参数的测试。本发明聚焦于用于快速检测急性肾损伤和慢性肾相关疾病的方法和装置。此开发利用由印第安纳生物学显微术中心(Indiana Center for Biological Microscopy)开发并许可的技术。此类技术记载于美国临时专利申请号60/672,708、PCT申请号US2006/014576(公布为WO/2006/113724)、和美国申请流水号11/911,895，在此通过提及而将它们收录，就像本文中完全列出的。具体地，WO/2006/113724的图6-9中所显示装置的图和其在编号96至104的段落的描述涉及所利用的技术。

在早期动物研究中，已经证明了此技术在提供实际肾小球滤过率(GFR)(肾能够从血流过滤废产物的速率)的准确且快速的测量中是有效的。虽然对疾病诊断学的需要随特定的疾病而有所变化，在肾疾病中，GFR是损伤、疾病行进、或恢复的主要临床指标。

GFR测量给定时间期限内过滤流过肾小球的血浆量。它是临床上最广泛使用的肾功能指标。内科医生常规地使用它来做出诊断和治疗决定两者。实际上，全国肾脏基金会(National Kidney Foundation)现在已经将慢性肾病患者分成5组(I-V)，这基于其估计的GFR(eGFR)进行。这已经帮助临床医生识别和理解患者中肾病的严重性。它还已经容许基于患者的基线GFR来启动合适的疗法。

多种技术诸如放射性和非放射性造影剂以及放射照相肾成像能快速测量GFR。血浆清除技术基于测量GFR标志物分子的血浆清除。通过使用放射性标志物诸如[51]Cr-EDTA或[99]m Tc-DTPA([99]m锝二亚乙基三胺五乙酸)，已经报告了血浆清除和GFR都可以使用放射检测仪来独立测定。结合放射检测仪使用放射性GFR标志物诸如[51]Cr-EDTA和[99]mTc-DTPA([99]m-锝二亚乙基三胺五乙酸盐)，可以以接近实时的速率监测急性肾损伤患者中的GFR。测量的血浆清除显示了与同时使用标准方法通过尿收集测量的GFR的卓越关联。然而，放射性GFR标志物的使用和实施此测试的临床困难使此方法变得不吸引人。通过使用荧光GFR标志物诸如FITC-菊粉，通过快速静脉内输注，接着通过在多个时间点时抽取血液样品，可以准确地测定GFR。潜在地，随着合适的造影剂的开发，磁共振成象(MRI)技术对于提供肾功能诊断学可以是非常有用的。使用此类技术的不利方面是低的易接近性、相关的高成本、重复研究的困难和需要移动患者来进行研究。

类似地，还已经使用通过标准方法诸如高效液相层析(HPLC)测定的非放射性标志物(例如碘酞酸盐(iothalamate))的血浆浓度来评估病危患者中的肾功能。已经报告了此类基于血浆清除的GFR测量技术在检测具有严重受损的肾功能的患者中的肾功能变化中具有良好的时间分辨率。通过使用单一荧光GFR标志物，即FITC-菊粉的快速输注，已经通过输注后序贯测量抽取的血液样品中的荧光信号作为时间函数来测定GFR。发明人已经详细叙述并增强了此方法，提供了改善的准确性、测定率、和降低的对潜在毒性的放射性分子的暴露。

菊粉(即一种仅通过肾小球滤过过滤并自身体清除的小的果糖聚合物)是一种参照标准GFR标志物。通常也使用其它非放射性标志物(诸如碘酞酸盐、碘海醇(iohexol)、多聚果聚糖)和放射性标志物(诸如[125]I-碘酞酸盐和[51]Cr-EDTA)。

在临床实践中，常规地使用内源标志物诸如血清肌酸酐和抑半胱氨酸蛋白酶蛋白(cystatin)C来评估GFR，因为这些分子的产生和肾小球重吸收率在不同个体间显著变化。与血清肌酸酐相比，抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C作为卓越的GFR内源血清标志物已经接受了最近的关注，因为它在患有AKI的ICU群体中比肌酸酐早提高达一天。

发明人已经开发了用于使用多光子显微术方法，优选地两光子显微术方法在哺乳动物受试者诸如人中直接测量GFR的最低限度侵入装置。该方法依赖于读取附着至不同大小的右旋糖苷分子的两种荧光分子。右旋糖苷是一种复合的、分支的多糖，由许多连接成不同长度(3-2,000kD)的链的葡萄糖分子构成。如此，本发明的另一个目标是提供使用基于导管的纤维光学探头来读取荧光标志物的方法和装置两者。可以将此导管放入血管系统(例如哺乳动物患者的臂静脉)中以容许实时监测荧光标志物的浓度，提供GFR的直接测量。

急性肾损伤的早期阶段中GFR的快速且准确测量对于诊断、损伤程度分层和治疗目的是重要的。本发明的优点是它会快速鉴定并测定损伤的程度，容许早期治疗，包括透析启动以及临床研究的登记和分层。也可以使用它来测定临床操纵对GFR的影响，诸如体积复苏。因此，此技术优点是有主要临床意义的，尤其在高风险患者中，其中强烈监护对于早期诊断、损伤分层和治疗潜力测定是必要的。

在文献和实践中都建立了目前临床上用于评估GFR的方法的不足。虽然对于鉴定用于检测损伤存在的生物标志取得了进步，但是在寻找实践得足以广泛接受的功能性标志物上仅取得很少的进步。发明人的方法代表在以接近实时的效率准确量化并追踪肾功能程度的能力上的真实进展。发明人还已经开发出易于在繁忙的医学环境(医学技术中的一项至关重要的采用障碍)中操作的装置。

由发明人开发的光学技术基于荧光生物报告物分子的血浆清除测量，并容许GFR的快速的、频繁的、且安全的评估。为了进一步证实数值，可以实施其它标准的GFR测试，包括但不限于菊粉清除。比较这些数值后，可以将校正因子应用于使用此新方法获得的数据，若需要的话。

参照图1，显示了并入本发明方法的装置10。装置10包含GFR测量组合物100源、肾荧光检测仪200、和导管300。将GFR测量组合物100(其包含多种报告物分子和多种标志物分子)经由导管300导入人受试者20的血流中。荧光检测仪200监测血流内GFR测量组合物的水平，并至少基本上实时地报告人受试者肾的运行状况。此装置基于相对于报告物分子荧光的标志物分子荧光来测量血浆分布的体积。“基本上实时地”意图涵盖测量血流内报告物和标志物水平、计算肾的运行状况、和报告所述状况之间经过的持续时间。发明人预期此经过时间会是非常接近实时的，以与上文所讨论的现有技术相比是可以忽略的。

GFR测量组合物

通过利用肾的活体内多光子显微术成像，发明人已经量化彼此独立的肾小球滤过和肾小球重吸收过程。发明人已经开发了比率测定(ratiometric)成像技术，其容许使用多荧光探针实验来定量分析肾的局部区域内的荧光信号。为了通过血浆清除来测量GFR，发明人使用荧光GFR报告物分子例如FITC右旋糖苷，以及大的不同荧光标志物分子，其不通过肾小球滤过屏障。此大的荧光标志物用来量化血管空间中分布的血浆体积，并容许比率测定技术。

发明人已经能够通过检查来自图像的血管区域内的两种分子的荧光强度的比率来量化荧光GFR标志物的血浆清除。可以使用此比率技术来快速测定GFR。已经在许多动物模型中测试了此方法。因为自血管内测量荧光信号以量化血浆清除的动力学，两种荧光分子的比率信号不依赖于实施测量的身体位置。

为了准确地测量GFR，发明人已经确定理想的GFR标志物分子在研究期间在血管区室内应当是稳定的，并且具有肾小球筛分系数(glomerular sievingcoefficient，GSC)0.0，保留在血管系统内，而且它不应或者基本上不应在肾内分泌、重吸收、或过滤，并且可以具有大于100kD的分子量。如本文所使用的，“基本上”限于±5％。满足这些条件，GFR在其静脉内输注后会等于报告物的尿清除。在理论上，可以使用具有任何已知大于0的GSC的GFR报告物。优选的标志物分子是具有大于100kD的分子量的磺基罗丹明101。

图2含有来自活的且健康的雄性大鼠的肾的数张荧光强度图像。这些图像在快速静脉内输注含有FITC-菊粉(5.5kD)和用磺基罗丹明101即Texas

标记的500kD右旋糖苷的染料混合物后作为时间函数进行拍摄。在下部显微照片系列中显示了来自FITC-菊粉的荧光强度信号，而在上部显微照片系列中显示了500kD Texas

右旋糖苷强度。在染料输注后约12秒时，在肾的毛细管和近端小管(PT)腔中都看到荧光强度。血管随时间的变化指明FITC-菊粉和500kD Texas

右旋糖苷两者都在这些血管中。在50秒时，FITC-菊粉由于此分子的立即血浆清除(肾小球过滤)而已经在毛细管和PT腔中在强度上降低。这对于红色的500kD右旋糖苷不是真实的，其中毛细管强度与12秒数值相似。红细胞(RBC)表现为黑暗的物体，因为它排除染料。在100和200秒时，FITC-菊粉强度在毛细管和PT腔中继续降低，因为过滤继续将其自身体除去。这对于500kD Texas

右旋糖苷又不是真实的，所述500kDTexas

右旋糖苷在此时间间隔期间没有强度变化，因为它不被过滤。因此，来自血管的强度的相对强度升高，指明500kD Texas

右旋糖苷与FITC-菊粉浓度比率的相对升高，这是由于FITC-菊粉的血浆清除。这种类型的时间序列图像收集含有关于通过肾的肾小球滤过屏障并变为滤液的一部分的给定分子的动态信息。这为发明人测量血浆清除率和GFR提供基础。

为了量化分子过滤动力学，发明人使用FITC-菊粉和500kD Texas

右旋糖苷的强度比率(参见图3)。图3中来自血管的强度比率随着两种染料的相对浓度变化而随时间变化。因为500kD右旋糖苷分子由于其大的大小而自血管培养物最小限度地清除(不被肾清除)，它在输注后在血浆中保持稳定达长时间。典型地，染料输注后的时间期限(数目在5-30分钟之间)内没有来自500kD右旋糖苷的明显强度下降。这导致随时间显现的强度比率递减。使关于使用荧光强度作为生物学研究读出的问题大大地最小化的正是此类型的比率。

发明人还已经对类似的研究使用500kD荧光右旋糖苷以进一步使过滤最小化并延长染料的血浆残存时间。图4是快速输注达60分钟后自血管测量的500kD FITC右旋糖苷的强度时间序列的例子。初始强度峰值(参见进口)是由于染料注射和染料分子快速分布入整个血浆体积中。对于曲线的剩余部分，它没有显示显著的强度下降。有效地，经标记的菊粉与经标记的500kD右旋糖苷的荧光强度比率的降低与经标记的菊粉的浓度降低相关联。

图5是推注的20kD FITC右旋糖苷与500kD Texas

右旋糖苷的强度比率作为时间函数以及最小二乘方拟合结果的图。图5中的每个数据点是自图像时间序列(诸如图3中所显示的图像)提取的来自血管的同一区域的平均比率数值。每0.5秒多至200秒将数据点绘图。衰减在两个阶段，即初始阶段和清除阶段(或过滤阶段/消除阶段)中发生。初始阶段的逐渐升高是由于IV注射后肾中的相对染料分布和积累。曲线的最高点(12秒左右)标记清除阶段的起始点，并与近端小管中开始出现FITC-菊粉相关联。

清除阶段的数据点与单一指数良好拟合。发明人获得20kD FITC右旋糖苷血浆清除率常数k为0.00458(s^-1)(使用95％置信限)。

快速输注GFR报告物分子后，GFR报告物分子的血浆浓度由于肾清除而作为时间函数降低。通过在不同时间点时获得血浆样品，可以直接计算或实施时间迹线的最小二乘方拟合以检索血浆清除率常数(k)。然后可以依照如下方程来测定GFR：

GFR＝kV_d                                        (1)

其中k是血浆清除率，而V_D是将GFR标志物稀释入其中的分布体积。已经在具有稳定的肾功能的患者以及啮齿类中证实了使用此技术测量的GFR，而且证明是正确的，并且与使用其它方法所测量的事物良好地相关联。

图6中显示了使用强度比率与直接使用经3kD FITC偶联的右旋糖苷(3kDFITC右旋糖苷)的强度数值来测量清除率之间的比较。主要差异是分布阶段显著更小的噪音和更好的鉴定。

单独的3kD FITC右旋糖苷的强度波动是相当显著的(图6-B)。因此，清除率常数k的拟合结果含有较大的误差，而且是限定较差的。比较而言，强度比率(3kD FITC右旋糖苷和500kD Texas

右旋糖苷之间)具有显著更小的噪音，而且所测量的清除率常数k限定得好得多，仅具有3％的误差。这部分是由于荧光强度通常对即使显微镜焦点的略微变化和样品运动是非常灵敏的。另一方面，强度比率对成像深度和移动的微小变化是不灵敏的。发明人聚焦于来自血液的荧光信号。此外，来自血液的染料的强度信号可以在血液流速改变时改变。然而，两种分子之间的相对强度比率即使在血液流速或血液体积改变(假设没有清除)时也不改变。这是由于这两种染料分子存在于血液中并一起移动。由发明人开发的方法限制了此问题。

使用强度比率，初始染料分布与清除阶段间的分开是明确限定的。在使用单独的单一染料强度时，测定在什么时间点时开始清除阶段是更困难的。强度曲线中最高的数据点在时间上通常与近端小管腔中出现较小的分子不相关。因此，染料分布和过滤阶段在强度唯一曲线(intensity only curve)中是难解的。使用多光子显微术方法容许此类相关性，而且是高度有益的。

认为右旋糖苷的纯度(根据大小分布或分子量)是极其重要的。另外，分子量分布在可以多好地测量GFR中发挥重要的作用。虽然在医学应用中广泛使用右旋糖苷，这些先前的应用不要求本发明中使用所需要的更严格的大小控制。

参照图7，显示了快速输注后自两只大鼠所获得的强度数值的图。用3kDFITC右旋糖苷和500kD Texas

右旋糖苷的混合物输注一只大鼠。用20kDFITC右旋糖苷和500kD Texas

右旋糖苷输注第二只大鼠。该图以3kD/500kD荧光比率曲线显示了快速衰减。这指明快速的清除及移入胞间隙中。然而，它的实质部分是由于非肾血浆清除，如自图8中所显示的肝成像的10kD右旋糖苷数据所看到的。

自一对无肾大鼠(其中两个肾都被除去)产生图8。用10kD FITC右旋糖苷和500kD Texas

右旋糖苷的混合物注射大鼠之一。用20kD FITC右旋糖苷和500kD Texas右旋糖苷的混合物注射另一只大鼠。10kD/500kD比率曲线显示了有明显的证据，即10kD右旋糖苷的非肾血浆清除仍然是实质的。同时，20kD右旋糖苷(其能被肾小球过滤)显示了最小的非肾血浆清除。因此，可以使用它来测定GFR。

另外，可以使用结合两室动力学模型的作为报告物分子的3kD至5kD的更小分子来测量器官功能。如此，发明人已经测定了过滤分子的优选分子量在3kD至500kD，更优选3kD至150kD，还更优选3kD至150kD，还更优选3kD至70kD，还更优选3kD至5kD，且最优选大约(on the order of)5kD的范围，或其中的任何范围或范围组合内。方法还涵盖使用已知的常见大小诸如10kD和500kD右旋糖苷以及次常见的大小20kD、70kD和150kD。优选氨基荧光素右旋糖苷。

荧光检测仪

荧光检测仪200包括用于读取并报告数据的软件、用于控制装置10并审阅结构的用户界面202、和用于发送和接受荧光信号的装置204(参见图9、图10、和图12-图14)。将此单元200设计为与标准的IV泵架台兼容，或者它可以在桌面上操作。它并入电池备用系统，其能够在不连接AC电源的情况中运行2小时。

任何临床医生能够使用用户界面202。它包括用于大部分软件用户界面的触摸屏技术。这在如何对临床医生显示数据上提供了灵活性。

基于使用多光子显微术来使比率技术完善所完成的工作主体，发明人确定放置在受试者的血流中的纤维光学导管会能够测量荧光分子。使用多光子显微术的当前方法造成产生由于荧光强度减弱的大量变化，因为较深地穿过组织。如本文中所公开的使用纤维光学导管会消除这些变化，因为会实时地或基本上实时地直接在血液中进行测量。下文更为详细地解释纤维光学导管。

图9和图10显示了使用单一多色LED 206(发光二极管)作为光源的双通道装置204。此装置204的目标是测定多少荧光信号会自纤维光学元件210返回。图9和图10显示了此装置中使用的光学系统的图示和计算机模型两者。装置包括作为检测仪的光倍增管(PMT)208a、b，因为这些装置具有公知的特征。或者，检测仪可以是光检测仪、固态检测仪、和电荷耦合装置、或任何不偏离本发明精神前提下的其它等同装置。此装置可以具有一个或多个电源207、209，和/或控制器，用于向LED 206和PMT 208a、b提供电源。

光程212经由选择通带216和二向性滤光器220来使来自LED源206的光聚焦，然后至纤维光学元件210上。然后纤维光学元件210将激发光传递入测试溶液中，所述测试溶液选择用于模拟血流中荧光右旋糖苷的近似水平。纤维光学元件210一般是直径范围为0.5至1mm或甚至更小的纤维光缆。

一旦激发，荧光信号的小部分便向后传递通过纤维光学元件210。然后信号传递通过聚焦镜224、分色光束分离器(dichroic beam splitter)228和带通滤光器232，之后落在PMT 208a的阴极上。

自PMT 208a、b对荧光素染料测量容易地可检测的荧光信号。此染料具有约494nm的激发峰，而且发射集中于519nm的波长的宽带中的光。荧光素染料仅仅是标志物染料的一个例子。也可以使用罗丹明染料；然而，LED源206必须具有足以激发罗丹明染料的强度。可以在图11中看到荧光素、罗丹明和Texas

的光谱响应。

可以在本装置200中使用基于向LED管芯添加磷而出现的白色LED，但是与标准LED有关的窄光谱带宽对于降低背景光是卓越的。光源的强度和如何可以有效地将能量投递至纤维光学210是至关重要的。

可以使用激光二极管作为LED的替代。激光二极管提供别的光能，其可以容许血流中染料标志物的浓度降低。然而，大多数可用的波长对于荧光素和磺基罗丹明101优选的荧光分子是不理想的。

已经评估了来自数个厂家的LED。数种LED满足装置的需要。这些LED提供每单位面积最好的流量密度，而且与滤光器一起良好地工作，所述滤光器提供截留波长(offwavelength)背景的卓越消除。

对于荧光素，可以选择由奥地利的ROITHNER LASERTECHNIK GmbH生产的LED490-03U。此LED具有用于荧光素激发的490nm峰波长。在1.2mw评定这种LED。或者，对于荧光素，由Durham，NC的Cree Inc.生产的XREBLU-L1-0000-00K01LED是优选的。这部分是具有良好热特征的大功率表面贴装(surface mount)LED。本申请的峰波长是485nm，其中最小流量输出为30.6流明。可以用可分类为具有相似特征的表面贴装部分替换此部分。

对于磺基罗丹明101激发，可以使用具有峰波长595nm的来自OPTEK的828-OVTL01LGAAS，其在北美洲和全世界具有销售。此表面贴装LED具有较高的流量密度，因此它可以以较低的电源背景运行以使波长热漂移最小化。1mm纤维光学的目标输出电源会是约50微瓦。对于磺基罗丹明101激发，来自Durham，NC的Cree Inc.的XRCAMB-L1-0000-00K01LED是优选的。可以对此类型的LED分类在585nm至595nm的范围里的峰波长。已经选择590nm的峰输出来应用。这些是具有良好热特征的大功率表面贴装LED。此LED的光流量输出也是30.6流明(lumens)。

滤光器选择对于此系统的性能是至关重要的。因为返回通过纤维光学210的荧光信号会低于激发能多个数量级，滤光器阻断和带通特征对于适当的性能是至关重要的。已经在显微术和其它应用中使用多年的荧光标志物是本领域中公知的。如此，卓越的滤光器装置可购自多个制造商诸如美国的SEMROCK。这些滤光器对于此应用是理想的。

发明人已经涵盖了用于发送和接受荧光信号的两个额外装置204。这些装置显示于图12和图13中，并且目的在于改善的光学几何学。单通道装置显示于图12中。单通道装置的一个目标是改善信号比背景比率，并对全血中带有荧光标签的右旋糖苷测定目标信号强度。改善的光学几何学已经显著降低背景水平超过一个数量级。此新的光学几何学和纤维耦合已经为我们提供30比1的信号比背景比率。

图12是单通道光学系统的结构图。图12中所显示的单通道装置使用简单光学设计。控制(relay)来自490nm LED 206的光通过通带二向性滤光器220，然后聚焦至纤维光学表面贴装适配器(SMA)连接器244上。使用简单聚光透镜元件240来使球面像差最小化，所述球面像差会限制聚焦至小的0.5至1mm纤维光学靶物210上的能力。纤维透镜224充当(work as)用于来源光的最终聚焦元件和用于荧光发射的初始准直器(collimator)两者。控制荧光发射光向后通过二向性滤光器220，并重聚焦至PMT 208上。对这使用简单双凸透镜248，因为PMT 208上的目标大小不是至关重要的，并且提供FITC发射滤光器作为通带滤光器。通过在组件构建中利用良好的光吸收涂层材料对此系统中的杂散光和反射给予密切注意。

参照图13和图14，显示了双通道光学系统。在双通道设计中使用与单通道设计中选择的那些组件相似的组件。主要的差异是在固定器(holder)254a、b内的且通过垫圈(spacer)256a，b与主体(main block)255隔开的额外二向性滤光器，用于将来自490nm LED 206a和595nm LED 206b的光组合在一起。每个来源利用其自身的聚光透镜组件240a、b和固定器242a、b内的带通滤光器216a、b(分别为595nm滤光器和490nm滤光器)。然后控制来自LED 206a、b的光束通过专门的双带二向性滤光器252，之后由透镜224聚焦至光纤耦合器244，具体地纤维光学靶物210上。此双带滤光器容易购自SEMROCK。然后来自这两种荧光分子的发射向后传播通过纤维光缆210。将光纤透镜224附着到固定器258和环262内的主体255，并用于校准此光以控制向后通过双带二向性滤光器252，然后使用最终的发射二向性滤光器228来分开至合适的PMT208a、b。每个PMT组件208a、b具有最终的聚焦透镜248a、b和在固定器260a、b和PMT适配器262a、b内的发射滤光器232a、b，优选地分别为FITC发射滤光器和磺基罗丹明101发射滤光器。通过密封板264a、b和密封垫266a、b用紧固件268封闭主体255。

电路含有微控制器以控制对LED 206a、b的脉冲率和使来自PMT 208a、b的读取同步。以100Hz的频率使LED 206a，b通电短时间。决不照明ED206a、b两者，这消除两种荧光标志物的一些渗透。使用高速16位模拟/数字转换器来读取PMT 208a、b，并计算数据的平均值。可以对此系统的软件构件使用膝上型计算机，或者可以将电路、微处理器、和软件保存在荧光检测仪200内。

数学模型

可以使用两室数学模型来从两种带标签的右旋糖苷分子的强度比率计算GFR。此模型可以包含在软件中，所述软件可以存储在外部计算机上或在荧光检测仪200内。或者，数学模型可以是对于装置而言内部的或外部的硬接线电路。

可以通过监测通过单剂推注静脉内施用的经荧光标记的右旋糖苷分子的血浆消失来测量GFR和分布的表观体积。图15显示了广泛使用的两室模型，又称为三构件模型。所讨论的两室是血管空间和胞间隙。此模型的基础假设是输注的报告物分子在推注后会从血管空间分布至胞间隙，但是会将标志物分子保留在血管空间中。仅自血管空间发生报告物分子的血浆除去。

血浆清除率和室间清除率分别表示为G和k。血管空间和胞间隙的实际体积分别是V₁和V₂。如由Sapirstein等(Sapirstein，L.A.，D.G.Vidt等.(1955).“Volumes of distribution and clearances of intravenously injected creatinine inthe dog.”American Journal ofPhysiology 181(2)：330-6.)表明的，如下方程给出了V₁的每单位时间的量变化：

$V_1\frac{{\mathrm{dG}}_1}{\mathrm{dt}}=-{\mathrm{GC}}_1-k(C_1-C_2)---\left(2\right)$

总共注射量D可以表示为如下：

$D=C_1{V}_1+C_2{V}_2+G{\∫}_0^t{C}_1\mathrm{dt}---\left(3\right)$

其中C₁和C₂分别表示血管空间和胞间隙中报告物分子的浓度。

组合上述的两个方程产生如下的二阶线性微分方程(Sapirstein，Vidt等.1955)：

$V_1\frac{d^2{C}_1}{{\mathrm{dt}}^2}+(\frac{G+k}{V_1}+\frac{k}{V_2})\frac{{\mathrm{dC}}_1}{\mathrm{dt}}+\frac{{\mathrm{kGC}}_1}{V_1{V}_2}=0---\left(4\right)$

方程(4)的通解是下述方程(16)中表示的双指数函数：

C₁(t)＝Ae^-αt+Be^-βt    (5)

其中衰减常数α和β可以在k、G、V₁和V₂中表示(Sapirstein，L.A.，D.G.Vidt，等(1955).“Volumes of distribution and clearances of intravenously injectedcreatinine in the dog.”American Journal ofPhysiology 181(2)：330-6.)。

假设室间运动在完成V1中的室内混合前是可以忽略的，那么t＝0时的如下两个边界条件变为有效的：C₀＝D/V₁和C₂＝0。

从方程(2)、(3)、(5)、和两个边界条件，我们可以导出下式(Sapirstein，L.A.，D.G.Vidt等(1955).“Volumes of distribution and clearances of intravenouslyinjected creatinine in the dog.”American Journal ofPhysiology 181(2)：330-6.)：

$\mathrm{GFR}=\frac{D}{A/\mathrm{\α}+B/\mathrm{\β}}---\left(6\right)$

$V_1=\frac{D}{A+B}---\left(7\right)$

$V_d=\frac{D(\frac{A}{{\mathrm{\α}}^2}+\frac{B}{{\mathrm{\β}}^2})}{{(\frac{A}{\mathrm{\α}}+\frac{B}{\mathrm{\β}})}^2}---\left(8\right)$

其中分布V_d的总共胞外体积是V₁和V₂的总数。

可以通过将实验数据拟合至方程(5)来获得参数A、B、α、和β。

实际上，我们可以使用标志物分子来获得V₁。如果浓度与荧光强度之间的线性关系适用于报告物分子，那么方程(5)可以改写为：

F₁(t)＝A_1e ^-αt+B_1e ^-βt    (9)

其中F₁是作为时间函数的报告物分子的荧光强度。A₁和B₁是常数。

如此，方程(6)和(8)可以改写为下式：

$\mathrm{GFR}=\frac{V_1(A_1+B_1)}{A_1/\mathrm{\α}+B_1/\mathrm{\β}}---\left(10\right)$

$V_d=\frac{V_1(A_1+B_1)(\frac{A_1}{{\mathrm{\α}}^2}+\frac{B_1}{{\mathrm{\β}}^2})}{{(\frac{A_1}{\mathrm{\α}}+\frac{B_1}{\mathrm{\β}})}^2}---\left(11\right)$

其中方程(10)表示来自单一的、自由可过滤的报告物分子类型的强度的GFR，而方程(11)表示与单一的、自由可过滤的报告物分子类型有关的体积分布。

另外，因为标志物的荧光随时间是恒定的，方程(9)也可以按报告物分子与标志物分子的荧光比率表示。如此，双指数方程变为：

R(t)＝A_2e ^-αt+B_2e ^-βt    (12)

其中R(t)是报告物分子比标志物分子的荧光比率。

可以通过将实验数据拟合至上述方程来获得参数A₂、B₂、α、和β。如此，清除GFR和分布的总体积可以表示为：

$\mathrm{GFR}=\frac{V_1(A_2+B_2)}{A_2/\mathrm{\α}+B_2/\mathrm{\β}}---\left(13\right)$

$V_d=\frac{V_1(A_2+B_2)(\frac{A_2}{{\mathrm{\α}}^2}+\frac{B_2}{{\mathrm{\β}}^2})}{{(\frac{A_2}{\mathrm{\α}}+\frac{B_2}{\mathrm{\β}})}^2}---\left(14\right)$

其中方程(13)表示来自自由可过滤的报告物分子类型与较大的标志物分子类型之间的强度比率的GFR，而方程(11)表示与来自自由可过滤的报告物分子类型和较大的标志物分子类型有关的体积分布。

明显地，在室间体积交换率接近0时，此模型折叠(collapse)成单室模型。然而，已经显示了随着血浆清除水平升高，此单指数逼近会导致GFR的过度估计(Schwartz，G.J.，S.Furth，等.(2006).“Glomerular filtration via plasmaiohexol disappearance：pilot study for chronic kidney disease in children.”Kidney International 69(11)：2070-7；Yu，W.，R.M.Sandoval，等(2007).“Rapiddetermination of renal filtration function using an optical ratiometric imagingapproach.”American Journal of Physiology-Renal Physiology 292(6)：F1873-80.)。

光学导管

参照图16和图17，显示了与本发明一起使用的导管300。导管300包括纤维光学插入工具304、双端口Luman 308、和French 5至8大小导引器312。可以将标准的1mm塑料纤维光缆316通过通道320插入，所述通道320通过与连接有导引器312的Luman 308连接的插入工具304的组合限定。因而，这些构件之每种是管状构造的。优选地，将0.75mm纤维光缆通过通道320插入。仅选择0.75mm直径以容许使用标准的18口径导引器。

插入工具304包括在第二管状构件328内可滑动的第一管状构件324。通过分别在第一管状构件324和纤维光缆316周围的O型环332在第二管状构件328的反向末端提供流体密封。在插入工具304的反向末端通过密封物336将纤维光缆316在插入工具304内安全地保持或固定。

将插入工具304连接至Luman 308上的端口之一340a。止血密封物(homostatic seal)344a、b位于端口340a、b上。另一端口340b提供荧光分子的推注或连续输注。Luman 308的反向末端处的鲁尔连接器(Luer connector)348用导引器312连接受试者。

纤维光缆316可以包含单纤维或多单纤维，用于光传递并收集发射和激发。通过挤压第一管状构件324和捕捉(captive)光缆316通过第二管状构件328将纤维光缆316插入受试者的静脉352内，其中所述纤维光缆316自导管300可延伸。光缆316通过鲁尔连接器348通过导引器312横切穿过受试者，并进入受试者的静脉352中。纤维光缆316可以具有在插入受试者静脉352中的一端上的小的永久弯曲。此弯曲有助于穿过组织，并使静脉内纤维光缆316的干扰最小化。

使用中，纤维光缆316是荧光检测仪200的纤维光缆210的延伸或放置得与荧光检测仪200的纤维光缆210通信以将在受试者的静脉处产生的一种或多种信号传递至荧光检测仪200进行评估。

本发明公开了一种独特的且新的用于量化肾功能的方法和装置，但是它还呈现了一种定量测定肝功能的独特方法。例如，将较大分子量标志物和较小分子量报告物分子的染料组合物注射入受试者中，并使用报告物分子比标志物分子的降低的比率来检测肾功能。较小的报告物分子被肾过滤，而标志物分子保留在血管系统中。对于要检测的标志物分子与信号分子的合理比率，标志物分子在诊断测试的过程中必须以相对恒定的水平保留在血液中。最后，按长得多的时间规模(通常为12至24小时)，标志物分子通常会被肝而不是肾自血管系统吸收并加工。这里，描述了新的方法和装置，其中可以通过随时间测量血液中标志物分子的绝对降低来定量测定相对肝功能和健康。此方法会具有超过其它方法的优点，其通过按与肝健康相关联的任意规模提供定量数值来实现。因此，会给医疗护理专家提供一种新的工具，其容许他们更好地治疗其患者，并预测某些药物的适当剂量给药。此方法会使用与先前所描述相同的装置，而且还会利用与先前所描述相同的染料组合物；然而，它会提供一种使用如下方程来分析结果以提供别的功能和效用的方法：

虽然具体的实施方案已经进行了例示和描述，但是在不显著偏离本发明精神的前提下可以有许多修饰，而且保护范围仅限于所附权利要求书的范围。

Claims (84)

1.一种用于导入哺乳动物受试者的血管系统中以分析器官功能的组合物，该组合物包含：

报告物分子；和

标志物分子，其中所述报告物分子和所述标志物分子共享分子特性，所述报告物分子的分子特性具有第一质量，而所述标志物分子的分子特性具有与所述第一质量可区别的第二质量。

2.权利要求1的组合物，其中所述分子特性选自下组：分子量、大小、形状、电荷、化合物、和射频。

3.权利要求1的组合物，其中所述报告物分子具有第一荧光特征，而所述标志物分子具有第二荧光特征。

4.权利要求1的组合物，其中所述报告物分子具有第一荧光特征，而所述标志物分子具有第二荧光特征，且其中所述第一荧光特征和所述第二荧光特征是可区别的。

5.权利要求1的组合物，其中所述报告物分子具有第一荧光特征，而所述标志物分子具有第二荧光特征，且其中所述第一荧光特征是第一荧光激发波长和第一荧光发射波长，所述第二荧光特征是第二荧光激发波长和第二荧光发射波长，所述第一和第二荧光激发波长和所述第一和第二荧光发射波长是不同的。

6.权利要求1的组合物，其中所述分子特性是分子量，而所述报告物分子具有比所述标志物分子的第二分子量小的第一分子量。

7.权利要求6的组合物，其中所述第二分子量足够大以抵抗人肾对所述标志物分子的过滤。

8.权利要求6的组合物，其中所述第一分子量是巨大的，其中所述报告物分子被适当发挥功能哺乳动物肾过滤。

9.权利要求6的组合物，其中所述第一分子量是巨大的，其中所述报告物分子容易被适当发挥功能哺乳动物肾过滤，且其中所述第二分子量足够大以抵抗哺乳动物肾对所述标志物分子过滤。

10.权利要求6的组合物，其中所述第一分子量实质上小于所述第二分子量。

11.权利要求6的组合物，其中所述第一分子量选自下组范围：1kD至500kD、3kD至150kD、10kD至150kD、10kD至70kD、和20kD至70kD。

12.权利要求6的组合物，其中所述第一分子量小于500kD。

13.权利要求6的组合物，其中所述第一分子量是1kD-500kD。

14.权利要求6的组合物，其中所述第一分子量是3kD-150kD。

15.权利要求6的组合物，其中所述第一分子量是3kD-70kD。

16.权利要求6的组合物，其中所述第一分子量是3kD-20kD。

17.权利要求6的组合物，其中所述第一分子量是约5kD。

18.权利要求1的组合物，其中所述报告物分子是右旋糖苷。

19.权利要求1的组合物，其中所述标志物分子是右旋糖苷。

20.权利要求1的组合物，其中所述报告物分子是氨基荧光素右旋糖苷。

21.权利要求1的组合物，其中所述标志物分子是不被所述器官过滤的较大的磺基罗丹明101右旋糖苷。

22.权利要求1的组合物，其中所述报告物分子是异硫氰酸荧光素-菊粉。

23.权利要求1的组合物，其中所述标志物分子具有约0的肾小球筛分系数。

24.权利要求1的组合物，其中所述标志物分子是基本上不由哺乳动物肾分泌、重吸收、或过滤的。

25.权利要求1的组合物，其中所述标志物分子不能通过肾小球滤过屏障。

26.权利要求1的组合物，其中所述报告物分子和所述标志物分子是与荧光素偶联的右旋糖苷。

27.权利要求1的组合物，其中所述报告物分子和所述标志物分子是与荧光素偶联的右旋糖苷，且其中所述报告物分子荧光素具有与所述标志物分子的荧光激发波长不相同的荧光激发波长。

28.权利要求1的组合物，其中所述报告物分子能够通过肾小球滤过屏障。

29.一种用于分析哺乳动物肾的运行状况的装置，所述装置包含：

荧光分子源；

用于将所述荧光分子导入血管系统中的手段；

用于测量所述血管系统内的所述荧光分子的手段；和

用于报告所述血管系统内的所述测量的荧光分子的手段。

30.权利要求29的装置，其中所述用于导入的手段包括导管。

31.权利要求29的装置，其中所述用于测量的手段包括与检测仪通信的(in communication with)光学纤维。

32.权利要求29的装置，其中所述用于报告的手段包括测定所述血管系统内测量的两种或更多种荧光素之间的强度比率。

33.权利要求29的装置，其中所述荧光分子源包含多种荧光偶联分子。

34.权利要求29的用于分析哺乳动物肾的运行状况的装置，其进一步包含依照如下方程来计算肾小球滤过率的手段：

$\mathrm{GFR}=\frac{V_1(A_2+B_2)}{A_2/\mathrm{\α}+B_2/\mathrm{\β}}$

其中V₁是血管空间的实际体积；A₂和B₂是常数；α是快相衰变常数；而β是慢相衰变常数。

35.权利要求29的用于分析哺乳动物肾的运行状况的装置，其进一步包含利用如下方程来计算肾小球滤过率的手段：

$V_d=\frac{V_1(A_2+B_2)(\frac{A_2}{{\mathrm{\α}}^2}+\frac{B_2}{{\mathrm{\β}}^2})}{{(\frac{A_2}{\mathrm{\α}}+\frac{B_2}{\mathrm{\β}})}^2}$

其中V_d是总胞外体积；V₁是血管空间的实际体积；A₂和B₂是常数；α是快相衰变常数；而β是慢相衰变常数。

36.一种用于分析哺乳动物肾的运行状况的装置，所述装置包含：

向第一荧光分子提供第一激发波长的光学手段；和

用于测量响应所述第一激发波长的来自所述第一荧光分子的发射的手段。

37.权利要求36的装置，其中所述光学手段向第二荧光分子发射第二激发波长。

38.权利要求37的装置，其进一步包含：

用于测量响应所述第二激发波长的来自所述第二荧光分子的发射的手段。

39.权利要求37的装置，其进一步包含：

用于计算所述来自所述第一荧光分子的发射与所述来自所述第二荧光分子的发射的比率的手段。

40.权利要求39的装置，其进一步包含：

用于报告所述比率的手段。

41.用于测量血管系统内多种荧光肾小球滤过率分子(fluorescentglomerular filtration)的相对量的光学装置，所述光学装置包含：

第一荧光激发波长源；

所述荧光激发波长通过的投递光程；

所述荧光激发波长投递的激发位置；

发射的荧光信号通过的返回光程；和

用于检测所述发射的荧光信号的强度的手段。

42.权利要求41的光学装置，其进一步包含第二荧光激发波长源。

43.权利要求41的光学装置，其中所述用于检测的手段选自下组：光倍增管、光检测仪、固态检测仪、和电荷耦合装置。

44.权利要求41的光学装置，其中所述激发位置包括纤维光缆。

45.用于测量血管系统内多种荧光肾小球滤过率分子的相对量的光学装置，所述光学装置包含：

第一荧光激发波长源；

第二荧光激发波长源；

所述第一和第二荧光激发波长通过的投递光程；

所述第一和第二荧光激发波长投递的激发位置；

第一发射的荧光信号和第二发射的荧光信号从所述激发位置通过的返回光程；

用于检测所述第一发射的荧光信号的强度的第一手段；和

用于检测所述第二发射的荧光信号的强度的第二手段。

46.权利要求45的光学装置，其进一步包含：

用于将所述第一或第二荧光激发波长中至少一种聚焦至所述激发位置上的第一透镜。

47.权利要求46的光学装置，其进一步包含：

用于将所述第一或第二发射的荧光信号中至少一种聚焦至所述用于检测的第一或第二手段之一上的第二透镜。

48.权利要求47的光学装置，其进一步包含：

用于将所述第一或第二发射的荧光信号中的另一种聚焦于所述用于检测的第一或第二手段之另一种上的第三透镜。

49.权利要求45至48中任一项的光学装置，其进一步包含：

第一聚光透镜，用于使与所述第一荧光激发波长有关的像差最小化。

50.权利要求49的光学装置，其进一步包含：

第二聚光透镜，用于使与所述第二荧光激发波长有关的像差最小化。

51.权利要求45至50中任一项的光学装置，其进一步包含：

所述投递光程内的第一二向性滤光器。

52.权利要求45至51中任一项的光学装置，其进一步包含：

所述返回光程内的第二二向性滤光器。

53.权利要求45至52中任一项的光学装置，其进一步包含：

位于所述投递光程和所述返回光程之间的第三二向性滤光器。

54.用于分析肾的运行状况的导管，所述导管包含：

管状主构件，其具有与远端相对的近端并限定通道；和

自所述远端可延伸的纤维光缆。

55.权利要求54的导管，其进一步包含：

在一端与所述管状构件连接且具有可插入血管系统中的相对端的导引器。

56.权利要求54的导管，其进一步包含：

插入工具。

57.权利要求54的导管，其中一定长度的所述纤维光缆是流体密封在所述插入工具内的。

58.权利要求57的导管，其中所述插入工具包括第二管状构件内可滑动的第一管状构件。

59.权利要求58的导管，其中所述第一和第二管状构件是流体密封的。

60.权利要求59的导管，其中所述纤维光缆固定至所述第一管状构件部分的。

61.权利要求60的导管，其中所述纤维光缆是所述导管内可滑动的且自其可延伸的。

62.权利要求61的导管，其中所述纤维光缆包括可插入血管系统中的远端上的弯曲。

63.权利要求54的导管，其进一步包含插入工具，所述插入工具包含用第二管状构件密封且在其中可滑动的第一管状构件，所述纤维光缆被所述第一管状构件的部分俘获，所述插入工具连接至所述管状主构件的部分，其中所述纤维光缆通过所述插入工具，并进入所述管状主构件中，所述管状主构件通过连接器连接至所述导引器，所述纤维光缆在所述第一和第二管状构件间相对运动后自所述导引器可延伸。

64.用于分析肾的运行状况的导管，该导管包含：

纤维光缆；

在一定长度的所述纤维光缆周围的纤维光学插入工具，其具有密封至第二管状构件的第一管状构件，而且能够与其相对运动，所述纤维光缆与所述第一管状构件的部分保持附接，使得所述第一管状构件的运动将运动转移至所述纤维光缆；和

密封至所述插入工具的管状主体，所述纤维光缆通过所述管状主体中的通道，而且在所述第一和第二管状构件间相对运动后自其可延伸。

65.权利要求64的导管，其进一步包含与所述管状主体连接的导引器，所述导引器可插入血管系统内，且所述纤维光缆自其可延伸。

66.权利要求64的导管，其中所述纤维光缆在一端具有弯曲，所述一端可插入血管系统内。

67.一种在哺乳动物肾中测量肾小球滤过率的方法，该方法包括下列步骤：

提供多种第一荧光分子；

提供多种第二荧光分子；

将所述第一荧光分子和所述第二荧光分子导入哺乳动物受试者的血流中；

用第一荧光激发波长激发所述第一荧光分子以产生具有第一荧光发射波长的第一荧光发射信号，并用第二荧光激发波长激发所述第二荧光分子以产生具有第二荧光发射波长的第二荧光发射信号；

所述导入步骤后测量所述第一荧光发射信号的强度和所述第二荧光发射信号的强度；并

计算所述第一荧光发射信号的强度与所述第二荧光发射信号的强度的比率。

68.权利要求67的方法，其中以预定的时间间隔进行所述测量和计算步骤，并至少基本上实时地报告。

69.一种在哺乳动物器官中测量肾小球滤过率的方法，所述方法包括下列步骤：

提供以预定的比率包含多种报告物分子和多种标志物分子的流体；

将所述流体导入受试者的血管系统中；并

在经过的持续时间后在所述受试者的血管系统内测量所述报告物和标志物分子之每种的特征。

70.权利要求69的方法，其进一步包括下列步骤：

在所述测量步骤后计算所述报告物分子特征与所述标志物分子特征的比率。

71.权利要求70的方法，其进一步包括下列步骤：

报告所述比率。

72.权利要求71的方法，其中在多个经过的持续时间进行所述报告步骤。

73.权利要求72的方法，其中至少基本上实时地进行所述计算和报告步骤。

74.权利要求69的方法，其中所述报告物分子能够通过肾小球滤过屏障。

75.权利要求69的方法，其中所述标志物分子比报告物分子更少地能够通过肾小球屏障。

76.权利要求70的方法，其中所述报告物分子和所述标志物分子是荧光素。

77.权利要求71的方法，其中所述报告物分子和所述标志物分子包含右旋糖苷。

78.权利要求69的方法，其中所述标志物分子具有比所述报告物分子大的分子量。

79.权利要求78的方法，其中所述报告物分子具有1kD-150kD的分子量。

80.权利要求78的方法，其中所述标志物分子具有大于100kD的分子量。

81.一种在哺乳动物肾中测量肾小球滤过率的方法，所述方法包括下列步骤：

提供具有已知波长的光源；

将荧光分子暴露于所述光源，其中在哺乳动物受试者的血管系统内激发所述荧光分子达预定的持续时间；并

测量所述激发的荧光分子的特征，所述特征具有与所述血管系统状况的关联。

82.权利要求81的方法，其进一步包括依照如下方程计算肾小球滤过率的步骤：

$\mathrm{GFR}=\frac{V_1(A_2+B_2)}{A_2/\mathrm{\α}+B_2/\mathrm{\β}}$

其中V₁是血管空间的实际体积；A₂和B₂是常数；α是快相衰变常数；而β是慢相衰变常数。

83.权利要求81的方法，其进一步包括依照如下方程计算肾小球滤过率的步骤：

$\mathrm{GFR}=\frac{D}{C_2(A/\mathrm{\α}+B/\mathrm{\β})}$

其中D是所述荧光分子内的报告物分子的体积；C₂是来自所述荧光分子的标志物分子的血浆浓度；A和B是常数；α是快相衰变常数；而β是慢相衰变常数。

84.权利要求81的方法，其进一步包括下列步骤，即进一步包括利用如下方程计算肾小球滤过率的步骤：

$V_d=\frac{V_1(A_2+B_2)(\frac{A_2}{{\mathrm{\α}}^2}+\frac{B_2}{{\mathrm{\β}}^2})}{{(\frac{A_2}{\mathrm{\α}}+\frac{B_2}{\mathrm{\β}})}^2}$

其中V_d是总胞外体积；V₁是血管空间的实际体积；A₂和B₂是常数；α是快相衰变常数；而β是慢相衰变常数。

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