优选的具体实施方案
如本文所使用,“免疫原性共有片段”意指CHIKV共有蛋白的片段,该CHIKV共有蛋白的片段包括足以对两种或多种CHIKV菌株提供交叉防护的共有序列,所述交叉防护在使用相应的天然序列时没有出现。片段长度一般是10个或更多个氨基酸。一些优选的CHIKV E1长度是至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少105、至少110、至少115、至少120、至少125、至少130、至少135、至少140、至少145、至少150、至少155、至少160、至少165、至少170、至少175、至少180、至少185、至少190、至少195、至少200、至少205、至少210、至少215、至少220、至少225、至少230、至少235、至少240、至少245、至少250、至少255、至少260、至少265、至少270、至少275、至少280、至少285、至少290、至少295、至少300、至少305、至少310、至少315、至少320、至少325、至少330、至少335、至少340、至少345、至少350、至少355、至少360、至少365、至少370、至少375、至少380、至少385、至少390、至少395、至少400、至少405、至少410、至少415、至少420、至少425或至少430。一些优选的CHIKV E1长度是15或更小、20或更小、25或更小、30或更小、35或更小、40或更小、45或更小、50或更小、55或更小、60或更小、65或更小、70或更小、75或更小、80或更小、85或更小、90或更小、95或更小、100或更小、105或更小、110或更小、115或更小、120或更小、125或更小、130或更小、135或更小、140或更小、145或更小、150或更小、155或更小、160或更小、165或更小、170或更小、175或更小、180或更小、185或更小、190或更小、195或更小、200或更小、205或更小、210或更小、215或更小、220或更小、225或更小、230或更小、235或更小、240或更小、245或更小、250或更小、255或更小、260或更小、265或更小、270或更小、275或更小、280或更小、285或更小、290或更小、295或更小、300或更小、305或更小、310或更小、315或更小、320或更小、325或更小、330或更小、335或更小、340或更小、345或更小、350或更小、355或更小、360或更小、365或更小、370或更小、375或更小、380或更小、385或更小、390或更小、395或更小、400或更小、415或更小、420或更小、425或更小、430或更小、或者435或更小。一些优选的CHIKV E2长度是至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少105、至少110、至少115、至少120、至少125、至少130、至少135、至少140、至少145、至少150、至少155、至少160、至少165、至少170、至少175、至少180、至少185、至少190、至少195、至少200、至少205、至少210、至少215、至少220、至少225、至少230、至少235、至少240、至少245、至少250、至少255、至少260、至少265、至少270、至少275、至少280、至少285、至少290、至少295、至少300、至少305、至少310、至少315、至少320、至少325、至少330、至少335、至少340、至少345、至少350、至少355、至少360、至少365、至少370、至少375、至少380、至少385、至少390、至少395、至少400、至少405、至少410、至少415或至少420。一些优选的CHIKV E2长度是15或更小、20或更小、25或更小、30或更小、35或更小、40或更小、45或更小、50或更小、55或更小、60或更小、65或更小、70或更小、75或更小、80或更小、85或更小、90或更小、95或更小、100或更小、105或更小、110或更小、115或更小、120或更小、125或更小、130或更小、135或更小、140或更小、145或更小、150或更小、155或更小、160或更小、165或更小、170或更小、175或更小、180或更小、185或更小、190或更小、195或更小、200或更小、205或更小、210或更小、215或更小、220或更小、225或更小、230或更小、235或更小、240或更小、245或更小、250或更小、255或更小、260或更小、265或更小、270或更小、275或更小、280或更小、285或更小、290或更小、295或更小、300或更小、305或更小、310或更小、315或更小、320或更小、325或更小、330或更小、335或更小、340或更小、345或更小、350或更小、355或更小、360或更小、365或更小、370或更小、375或更小、380或更小、385或更小、390或更小、395或更小、400或更小、415或更小、422或更小。一些优选的CHIKV衣壳长度是至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少105、至少110、至少115、至少120、至少125、至少130、至少135、至少140、至少145、至少150、至少155、至少160、至少165、至少170、至少175、至少180、至少185、至少190、至少195、至少200、至少205、至少210、至少215、至少220、至少225、至少230、至少235、至少240、至少245、至少250或至少255。一些优选的CHIKV衣壳长度是15或更小、20或更小、25或更小、30或更小、35或更小、40或更小、45或更小、50或更小、55或更小、60或更小、65或更小、70或更小、75或更小、80或更小、85或更小、90或更小、95或更小、100或更小、105或更小、110或更小、115或更小、120或更小、125或更小、130或更小、135或更小、140或更小、145或更小、150或更小、155或更小、160或更小、165或更小、170或更小、175或更小、180或更小、185或更小、190或更小、195或更小、200或更小、205或更小、210或更小、215或更小、220或更小、225或更小、230或更小、235或更小、240或更小、245或更小、250或更小、255或更小、或者260或更小。如本段所使用,对优选片段大小的提及旨在指至少和小于之间范围的所有排列组合,例如范围可以是以“至少”大小所列的任何数值到以“小于t”大小所列的任何数值,以提供一系列大小,例如20-400、20-30、40-100,等等。
本文使用的术语“基因构建体”指包含编码靶蛋白或免疫调节蛋白的核苷酸序列的DNA或RNA分子。编码序列包括可操作连接于调控元件的起始信号和终止信号,所述调控元件包括能够指导被施用核酸分子的个体细胞中表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。
本文使用的术语“可表达形式”指含有可操作连接于编码靶蛋白或免疫调节蛋白的编码序列的必要调控元件的基因构建体,使得当存在于个体细胞中时,所述编码序列被表达。
本文使用的短语“严格杂交条件”或“严格条件”指核酸分子与另一核酸分子杂交但不与其他序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的,并且在不同环境下有所不同。较长序列在较高温度下特异性杂交。一般而言,严格条件被选择为在确定的离子强度和pH下比特定序列的热力学熔点(Tm)低约5℃。Tm是平衡时与靶序列互补的探针的50%与靶序列杂交的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)。由于靶序列一般是过量存在的,所以在Tm下,平衡时探针的50%被占据。通常,严格条件是下述条件:即,其中在pH 7.0至8.3下,盐浓度小于约1.0M钠离子、通常约0.01至1.0M钠离子(或其他盐),并且温度对于短的探针、引物或寡核苷酸(例如10至50个核苷酸)而言是至少约30℃且对于较长探针、引物或寡核苷酸而言是至少约60℃。严格条件还可以通过添加去稳定剂(例如甲酰胺)来实现。
本文使用的“同源”指两个核酸序列之间或两个氨基酸序列之间的序列同源性。足够同源以使得免疫原性功能的两个核酸序列或两个氨基酸序列是“同源的”。核苷酸和氨基酸的序列同源性可以使用FASTA、BLAST和空位BLAST(Altschul等,Nuc.Acids Res.,1997,25,3389,该文献的全文以引用的方式并入本文)和PAUP*4.0b10软件(D.L.Swofford,Sinauer Associates,Massachusetts)来确定。“相似百分比”用PAUP*4.0b10软件(D.L.Swofford,Sinauer Associates,Massachusetts)来计算。共有序列的平均相似性与系统进化树中所有序列进行对比计算。简而言之,代表基本局部比对检索工具(Basic Local Alignment Search Tool)的BLAST算法适合确定序列相似性(Altschul等,J.Mol.Biol.,1990,215,403-410,该文献的全文以引用的方式并入本文)。进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法包括首先通过确定查询序列中的长度W的短字来确定高得分序列对(HSP),该查询序列与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足某一正值阈值分数T。T被称为相邻字分数阈值(Altschul等,同上)。这些初始相邻字的匹配用作启动寻找含有它们的HSP的检索的种子。字匹配沿每个序列两个方向延伸至尽可能使累积比对分数可以增加。下述情况下每个方向的字匹配延伸停止:1)累积比对分数从其最大实现值减少数量X;2)由于一个或多个负得分残基比对的累积,累积分数到达零或以下;或3)到达任一序列的末端。Blast算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。Blast程序使用下述作为默认值:字长(W)为11,BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992,89,10915-10919,该文献的全文以引用的方式并入本文)比对(B)为50,期望值(E)为10,M=5,N=4,和双链对比。BLAST算法(Karlin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90,5873-5787,该文献的全文以引用的方式并入本文)和空位BLAST进行两个序列之间相似性的统计分析。BLAST算法提供的相似性的一个量度是最小总和概率(P(N)),其指示两个核苷酸序列之间偶然发生匹配的概率。例如,如果测试核酸与其他核酸对比中的最小总和概率小于约1、优选小于约0.1、更优选小于约0.01且最优选小于约0.001,则认为核酸与另一核酸相似。
在一些实施方案中,提供了可以用于免疫个体的CHIKV的DNA疫苗。该疫苗包括体内体液免疫性和细胞免疫性两者。
根据一些实施方案,为了开发有能力诱发对屈曲病毒(CHIKV)的交叉反应性免疫应答的免疫原,我们设计了针对CHIKV病毒被膜E1、E2和核心蛋白衣壳的共有构建体。对于这些构建体,从1952年至2006年分离的导致人类感染和死亡的屈曲病毒中选择21个序列。所选择的每个基因的DNA序列来自S27菌株(首次分离株)和各个国家的菌株(包括留尼旺岛爆发分离株),以避免抽样偏差。对DNA序列进行比对,为合成序列选择各个位置最常见的核苷酸。推导的氨基酸序列用于指导引入比对空位,以便它们被引入到保持阅读框的密码子之间。共有序列产生之后,IgE前导序列被加至N末端以增强表达和分泌,构建体通过密码子优化并用更强序列(GCCGCCACC)(图1A-SEQ ID NO:18)替换现有Kozak序列来优化。为了分析,将多聚组氨酸标签加至E1和衣壳的C末端以证实表达。然后在根据之前对于分析、表达和免疫原性研究[21]所述的细菌和纯化环境下制备这些构建体。图1B示出了编码被膜E1、E2和衣壳DNA的构建体的琼脂糖凝胶电泳。
根据另一实施方案,我们设计了针对CHIKV病毒被膜E1、E2和E3各自的嵌合共有构建体。对于这些构建体,制备E1、E2和E3各自的共有序列,并将各共有序列彼此连接,优选使用编码蛋白酶切割位点的序列。此外,将IgE前导序列加至N末端以增强表达和分泌。
在优选实施方案中,构建体包括与IgE前导序列连接的CHIKV编码序列。然而,在一些实施方案中,CHIKV编码序列不与IgE前导序列连接,但是可任选地连接不同的前导序列。
SEQ ID NO:1指编码与IgE前导序列连接的CHIKV-E1共有蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:2指编码与IgE前导序列连接的CHIKV-E2共有蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:3指编码与IgE前导序列连接的CHIKV-衣壳共有蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:4指对应于SEQ ID NO:1的编码CHIKV-E1共有蛋白但是没有IgE前导序列的编码序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO:5指对应于SEQ ID NO:2的编码CHIKV-E2共有蛋白但是没有IgE前导序列的编码序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO:6指对应于SEQ ID NO:13的编码CHIKV-衣壳共有蛋白但是没有IgE前导序列的编码序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO:7指SEQ ID NO:1编码的氨基酸序列,是带有IgE前导序列的CHIKV-E1共有蛋白。
SEQ ID NO:8指SEQ ID NO:2编码的氨基酸序列,是带有IgE前导序列的CHIKV-E2共有蛋白。
SEQ ID NO:9指SEQ ID NO:3编码的氨基酸序列,是带有IgE前导序列的CHIKV-衣壳共有蛋白。
SEQ ID NO:10指SEQ ID NO:4编码的氨基酸序列,是没有IgE前导序列的CHIKV-E1共有蛋白。
SEQ ID NO:11指SEQ ID NO:5编码的氨基酸序列,是没有IgE前导序列的CHIKV-E2共有蛋白。
SEQ ID NO:12指SEQ ID NO:6编码的氨基酸序列,是没有IgE前导序列的CHIKV-衣壳共有蛋白。
SEQ ID NO:13指编码共有Env的核苷酸序列,所述共有Env是Kozak序列-IgE前导序列-CHIKV-E3编码序列-切割位点-CHIKV-E2编码序列-切割位点-CHIKV-E1编码序列-终止信号-终止信号。
SEQ ID NO:14指SEQ ID NO:13编码的氨基酸序列,是共有Env蛋白序列,即IgE前导序列-CHIKV-E3-切割位点-CHIKV-E2-切割位点-CHIKV-E1编码序列。
SEQ ID NO:15指对应于SEQ ID NO:13的编码共有Env但是没有IgE前导序列的核苷酸序列,即CHIKV-E3编码序列-切割位点-CHIKV-E2编码序列-切割位点-CHIKV-E1编码序列-终止信号-终止信号。
SEQ ID NO:16指SEQ ID NO:15编码的氨基酸序列,是没有IgE前导序列的共有Env蛋白序列,即CHIKV-E3-切割位点-CHIKV-E2-切割位点-CHIKV-E1编码序列。
SEQ ID NO:17指IgE前导序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18指优选的Kozak序列。
当编码共有蛋白的核酸分子被个体细胞摄取时,编码共有蛋白的核苷酸序列在细胞中表达,由此将蛋白递送给个体。本发明的多个方面提供了递送质粒上共有蛋白编码序列或者作为重组疫苗的一部分和作为减毒疫苗的一部分的共有蛋白编码序列的方法。
根据本发明一些方面,提供了针对病原体或异常的疾病相关细胞而预防性和/或治疗性免疫个体的组合物和方法。疫苗可以是任何类型的疫苗,例如减毒活疫苗、重组疫苗或核酸疫苗或DNA疫苗。
在一些实施方案中,疫苗包含一种、两种或所有三种共有蛋白。在一些实施方案中,疫苗包含同一核酸分子上两种共有蛋白的编码序列。在一些实施方案中,疫苗包含两种不同核酸分子上两种共有蛋白的编码序列。在一些实施方案中,疫苗包含同一核酸分子上三种共有蛋白的编码序列。在一些实施方案中,疫苗包含三种共有蛋白的编码序列,其中两种共有蛋白的编码序列在同一核酸分子上而第三种共有蛋白的编码序列在第二种核酸分子上。例如,一种核酸分子包含E1和E2的编码序列并且包含衣壳的编码序列;或者一种核酸分子包含E1和衣壳的编码序列并且包含E2的编码序列,或者一种核酸分子包含E2和衣壳的编码序列并且包含E1的编码序列。在一些实施方案中,疫苗包含三种共有蛋白的编码序列,其中有三种不同的核酸分子,并且每种核酸分子包含不同的编码序列。
在一些实施方案中,包括IgE前导序列的共有E1的编码序列是SEQ ID NO:1。在一些实施方案中,无IgE前导序列的共有E1的编码序列是SEQ ID NO:4。在一些实施方案中,含有IgE前导序列的共有E1蛋白是SEQ ID NO:7或其片段。在一些实施方案中,共有E1蛋白是SEQ ID NO:10或其片段。在一些实施方案中,含有IgE前导序列的共有E1蛋白80%、90%、95%、98%或99%同源于SEQ ID NO:7。在一些实施方案中,无IgE前导序列的共有E1蛋白80%、90%、95%、98%或99%同源于SEQ ID NO:10。在一些实施方案中,包括IgE前导序列的共有E2的编码序列是SEQ ID NO:2。在一些实施方案中,无IgE前导序列的共有E2的编码序列是SEQ ID NO:5。在一些实施方案中,含有IgE前导序列的共有E2蛋白是SEQ ID NO:8或其片段。在一些实施方案中,共有E2蛋白是SEQ ID NO:11或其片段。在一些实施方案中,含有IgE前导序列的共有E2蛋白80%、90%、95%、98%或99%同源于SEQ ID NO:7。在一些实施方案中,无IgE前导序列的共有E1蛋白80%、90%、95%、98%或99%同源于SEQ ID NO:11。在一些实施方案中,包括IgE前导序列的共有衣壳的编码序列是SEQ ID NO:3。在一些实施方案中,无IgE前导序列的共有E1的编码序列是SEQ ID NO:6。在一些实施方案中,含有IgE前导序列的共有E1蛋白是SEQ ID NO:9或其片段。在一些实施方案中,共有E1蛋白是SEQ ID NO:12或其片段。在一些实施方案中,含有IgE前导序列的共有E1蛋白80%、90%、95%、98%或99%同源于SEQ ID NO:9。在一些实施方案中,无IgE前导序列的共有E1蛋白80%、90%、95%、98%或99%同源于SEQ ID NO:12。
多种基因可以在单一核酸分子上或在多种核酸分子上。例如,一种核酸分子包含E1和E2的编码序列并且包含衣壳的编码序列;或者一种核酸分子包含E1和衣壳的编码序列并且包含E2的编码序列,或者一种核酸分子包含E2和衣壳的编码序列并且包含E1的编码序列。在一些实施方案中,疫苗包含三种共有蛋白的编码序列,其中存在三种不同的核酸分子并且每种核酸分子包含不同的编码序列。疫苗可以包含E1、E2和衣壳的两种或多种共有序列的组合。
在一些实施方案中,疫苗包含共有CHIKV Env,共有CHIKV Env包含连接在一起作为单一嵌合基因的E1、E2和E3。在一些实施方案中,个体共有序列通过编码蛋白酶切割位点的序列彼此连接。在一些实施方案中,嵌合基因包含E1、E2和E3各自的片段,使得嵌合基因在个体中的表达形成对E1、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中,嵌合基因包含SEQ ID NO:13或其片段,该片段包含的序列足以使蛋白在个体中的表达形成对E1、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中,嵌合基因包含至少85%同源于SEQ ID NO:13的核酸序列或其片段,该片段包含的序列足以使蛋白在个体中的表达形成对E1、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中,嵌合基因包含至少90%同源于SEQ ID NO:13的核酸序列或其片段,该片段包含的序列足以使蛋白在个体中的表达形成对E1、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中,嵌合基因包含至少95%同源于SEQ ID NO:13的核酸序列或其片段,该片段包含的序列足以使蛋白在个体中的表达形成对E1、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中,嵌合基因包含至少98%同源于SEQ ID NO:13或的核酸序列其片段,该片段包含的序列足以使蛋白在个体中的表达形成对E1、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中,嵌合基因包含至少99%同源于SEQ ID NO:13的核酸序列或其片段,该片段包含的序列足以使蛋白在个体中的表达形成对E1、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中,嵌合基因包含SEQ ID NO:15或其片段,该片段包含的序列足以使蛋白在个体中的表达形成对E1、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中,嵌合基因包含至少85%同源于SEQ ID NO:15的核酸序列或其片段,该片段包含的序列足以使蛋白在个体中的表达形成对E1、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中,嵌合基因包含至少90%同源于SEQ ID NO:15的核酸序列或其片段,该片段包含的序列足以使蛋白在个体中的表达形成对E1、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中,嵌合基因包含至少95%同源于SEQ ID NO:15的核酸序列或其片段,该片段包含的序列足以使蛋白在个体中的表达形成对E1、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中,嵌合基因包含至少98%同源于SEQ ID NO:15的核酸序列或其片段,该片段包含的序列足以使蛋白在个体中的表达形成对E1、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中,嵌合基因包含至少99%同源于SEQ ID NO:15的核酸序列或其片段,该片段包含的序列足以使蛋白在个体中的表达形成对E1、E2和E3各自的免疫应答。
在一些实施方案中,疫苗包含共有CHIKV Env,其编码连接在一起的E1、E2和E3的共有氨基酸序列。在一些实施方案中,个体共有序列通过编码蛋白酶切割位点的序列彼此连接。在一些实施方案中,嵌合基因编码E1、E2和E3各自的片段,其中由此编码的氨基酸序列具有免疫原性并且诱发对E1、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中,共有蛋白CHIKV Env包含SEQ ID NO:14或其片段,该片段包含足够序列,其中由此编码的氨基酸序列具有免疫原性并且诱发对E1、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中,CHIKV Env共有蛋白包含至少85%同源于SEQ ID NO:14的氨基酸序列或其片段,其中由此编码的氨基酸序列具有免疫原性并且诱发对E1、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中,CHIKV Env共有蛋白包含至少90%同源于SEQ ID NO:14的氨基酸序列或其片段,其中由此编码的氨基酸序列具有免疫原性并且诱发对E1、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中,CHIKV Env共有蛋白包含至少95%同源于SEQ ID NO:14的氨基酸序列或其片段,其中由此编码的氨基酸序列具有免疫原性并且诱发对E1、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中,CHIKV Env共有蛋白包含至少98%同源于SEQ ID NO:14的氨基酸序列或其片段,其中由此编码的氨基酸序列具有免疫原性并且诱发对E1、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中,CHIKV Env共有蛋白包含至少99%同源于SEQ ID NO:14的氨基酸序列或其片段,其中由此编码的氨基酸序列具有免疫原性并且诱发对E1、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中,CHIKV Env共有蛋白包含至少85%同源于SEQ ID NO:16的氨基酸序列或其片段,其中由此编码的氨基酸序列具有免疫原性并且诱发对E1、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中,CHIKV Env共有蛋白包含至少90%同源于SEQ ID NO:16的氨基酸序列或其片段,其中由此编码的氨基酸序列具有免疫原性并且诱发对E1、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中,CHIKV Env共有蛋白包含至少95%同源于SEQ ID NO:16的氨基酸序列或其片段,其中由此编码的氨基酸序列具有免疫原性并且诱发对E1、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中,CHIKV Env共有蛋白包含至少98%同源于SEQ ID NO:16的氨基酸序列或其片段,其中由此编码的氨基酸序列具有免疫原性并且诱发对E1、E2和E3各自的免疫应答。在一些实施方案中,CHIKV Env共有蛋白包含至少99%同源于SEQ ID NO:14的氨基酸序列或其片段,其中由此编码的氨基酸序列具有免疫原性并且诱发针对E1、E2和E3各自的免疫应答。
核酸分子可以使用几种已知技术中的任何一种来递送,所述已知技术包括DNA注射(还称为DNA接种)、重组载体(例如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组牛痘病毒)。
DNA疫苗描述于美国专利号5,593,972,5,739,118,5,817,637,5,830,876,5,962,428,5,981,505,5,580,859,5,703,055,5,676,594和其中引用的优先申请,这些文献均以引用的方式并入本文。除了那些申请中描述的递送方案以外,递送DNA的可选方法还描述于美国专利号4,945,050和5,036,006,这两个文献均以引用的方式并入本文。
施用途径包括但不限于肌内、鼻内、腹膜内、皮内、皮下、静脉内、动脉内、眼内和口服以及局部、经皮、通过吸入或栓剂或至粘膜组织(例如通过灌洗至阴道、直肠、尿道、口腔和舌下组织)。优选的施用途径包括至粘膜组织、肌内、腹膜内、皮内和皮下注射。基因构建体可以通过包括但不限于下述的工具施用:传统注射器、无针头注射装置或“微弹轰击基因枪”。
另一施用途径涉及使用电穿孔来递送基因构建体,描述于美国专利号5,273,525,5,439,440,5,702,359,5,810,762,5,993,434,6,014,584,6,055,453,6,068,650,6,110,161,6,120,493,6,135,990,6,181,964,6,216,034,6,233,482,6,241,701,6,347,247,6,418,341,6,451,002,6,516,223,6,567,694,6,569,149,6,610,044,6,654,636,6,678,556,6,697,669,6,763,264,6,778,853,6,865,416,6,939,862和6,958,060,这些文献据此以引用的方式并入。
优选用于促进DNA疫苗递送的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括描述于下述文献中的那些:Draghia-Akli等的美国专利号7,245,963,Smith等提交的美国专利公布2005/0052630,这两个文献的内容全文据此以引用的方式并入。还优选的是在2007年10月17日提交的共同待审和共同拥有的美国专利申请序号11/874072中提供的促进DNA疫苗递送的电穿孔装置和电穿孔方法,该美国专利申请根据35 USC 119(e)要求2006年10月17日提交的美国临时申请序号60/852,149和2007年10月10日提交的美国临时申请序号60/978,982的权益,所有申请的全文据此以引用的方式并入。
下面是使用电穿孔技术的实施方案的一个实例,并且在上述专利参考文献中更详细地讨论:电穿孔装置可被配置为向所需的哺乳动物组织递送能量脉冲,该能量脉冲产生类似于使用者预设电流输入的恒定电流。电穿孔装置包括电穿孔组件和电极部件或手柄部件。电穿孔组件可包括并并入电穿孔装置的各种元件的一种或多种,包括:控制器、电流波形发生器、阻抗测试仪、波形记录仪、输入元件、状态报告元件、通讯端口、记忆组件、电源和电源开关。电穿孔组件能够作为电穿孔装置的一个元件起作用,其他元件是与所述电穿孔组件联通的分开元件(或组件)。在一些实施方案中,电穿孔组件能够起到电穿孔装置中不止一个元件的作用,其还可以与电穿孔装置中与所述电穿孔组件分开的其他元件联通。使用电穿孔技术递送疫苗不受作为一个机电装置或机械装置的部分而存在的电穿孔装置的元件所限制,因为所述元件能够起到一个装置或起到与分开元件彼此联通的作用。电穿孔组件能够递送在所需组织中产生恒定电流的能量脉冲,并且包括反馈机制。电极部件包括具有空间排列的多个电极的电极阵列,其中电极部件接收来自电穿孔组件的能量脉冲并通过电极将其递送至所需的组织。多个电极的至少一个在能量脉冲递送中是中性的并且测量所需组织中的阻抗并且将阻抗联通至电穿孔组件。反馈机制可以接收测量的阻抗并且可以调节电穿孔组件递送的能量脉冲以保持恒定电流。
在一些实施方案中,多个电极可以以分散模式递送能量脉冲。在一些实施方案中,多个电极可以通过以编程顺序控制电极来以分散模式递送能量脉冲,所述编程顺序由使用者输入至电穿孔组件。在一些实施方案中,编程顺序包括顺序递送的多个脉冲,其中所述多个脉冲的每一个脉冲由至少两个活性电极(带有一个测量阻抗的中性电极)递送,并且其中所述多个脉冲的下一个脉冲由至少两个活性电极(带有一个测量阻抗的中性电极)的不同的一个递送。
在一些实施方案中,反馈机制通过硬件或软件进行。优选地,反馈机制通过模拟闭环电路进行。优选地,该反馈每隔50μs、20μs、10μs或1μs发生,但是优选为实时反馈或即时反馈(即,通过采用现有技术测定响应时间确定为基本上是即时的)。在一些实施方案中,中性电极测量所需组织中的阻抗并将阻抗联通至反馈机制,并且反馈机制响应阻抗并调节能量脉冲以保持恒定电流为类似于预设电流的值。在一些实施方案中,反馈机制在能量脉冲递送过程中连续并即时保持恒定电流。
当被细胞摄取时,基因构建体可以作为功能性染色体外分子保持存在于细胞中。DNA可以以质粒形式被引入细胞,DNA在细胞中短暂存在。可选地,RNA可以被施用至细胞。还考虑提供作为线性微型染色体的基因构建体,包括着丝粒、端粒和复制起点。基因构建体可以构成被施用于受试者的减毒活微生物或重组微生物载体中遗传物质的部分。基因构建体可以是重组病毒疫苗的基因组的部分,其中遗传物质保持在染色体外。基因构建体包括核酸分子基因表达所必要的调控元件。所述元件包括:启动子、起始密码子、终止密码子和多聚腺苷酸化信号。此外,增强子通常是编码靶蛋白或免疫调节蛋白的序列的基因表达所需要的。必要的是,这些元件与编码所需蛋白的序列可操作连接,并且所述调控元件在它们被施用的个体中是可操作的。
一般认为起始密码子和终止密码子是编码所需蛋白的核苷酸序列的部分。然而,必要的是,这些元件在基因构建体被施用的个体中是功能性的。起始密码子和终止密码子必须与编码序列在框内。
所使用的启动子和多聚腺苷酸化信号必须在个体细胞内是功能性的。
可用于实施本发明、特别是产生人类基因疫苗的启动子的实例包括但不限于来自猿猴病毒40(SV40)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人类免疫缺陷病毒(MV)(例如BIV长末端重复序列(LTR)启动子)、莫洛尼病毒、ALV(禽白血病病毒)、巨细胞病毒(CMV)(例如CMV立即早期启动子)、EB病毒(EBV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)的启动子以及来自人类基因的启动子,所述人类基因例如人类肌动蛋白、人类肌球蛋白、人类血红素、人类肌肉肌酸和人类金属硫蛋白。
可用于实施本发明、特别是产生人类基因疫苗的多聚腺苷酸化信号的实例包括但不限于SV40多聚腺苷酸化信号、小牛生长激素多聚腺苷酸化(bgh-PolyA)信号和LTR多聚腺苷酸化信号。特别地,使用在pCEP4质粒(Invitrogen,San Diego Calif.)中称为SV40多聚腺苷酸化信号的SV40多聚腺苷酸化信号。
除了DNA表达所需的调控元件,DNA分子中还可以包括其他元件。此类其他元件包括增强子。增强子可以选自下述组,包括但不限于:人类肌动蛋白、人类肌球蛋白、人类血红素、人类肌肉肌酸和病毒增强子(例如来自CMV、RSV和EBV的那些)。
基因构建体可以具有哺乳动物复制起点以在染色体外保持构建体并在细胞内产生多个构建体拷贝。来自Invitrogen(San Diego,Calif.)的质粒pVAX1、pCEP4和pREP4含有EB病毒复制起点和核抗原EBNA-1编码区,其产生高拷贝的无整合游离型复制。
在有关免疫应用的一些优选实施方案中,递送的核酸分子包括编码共有蛋白的核苷酸序列并且另外包括进一步增强对此类靶蛋白的免疫应答的蛋白基因。此类基因的实例是编码其他细胞因子和淋巴因子的那些基因,所述细胞因子和淋巴因子例如α-干扰素、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNF、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、II-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、IL-28,其包括信号序列缺失并任选包括来自IgE信号肽的IL-15。
用于本方法的组合物可以进一步包含一种或多种下述蛋白和/或编码此类蛋白的核酸分子,如在对应于美国公开号20030176378的美国序号10/139,423(该文献以引用的方式并入本文)中提出的:主要组织相容性复合物抗原,包括主要组织相容性复合物I类抗原或主要组织相容性复合物II类抗原;死亡结构域受体,包括但不限于Apo-1、Fas、TNFR-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2和DR6;死亡信号,即,与死亡结构域受体相互作用的蛋白,包括但不限于FADD、FAP-1、TRADD、RIP、FLICE和RAIDD;或包括结合死亡结构域受体并引发细胞凋亡的配体的死亡信号,包括但不限于FAS-L和TNF;和与死亡结构域受体相互作用的介体,包括但不限于FADD、MORT1和MyD88;毒素,包括杀伤细胞的蛋白,包括但不限于昆虫毒液和蛇毒液、细菌外毒素(例如假单胞杆菌外毒素)、双链核糖体失活蛋白(例如蓖麻毒素),包括单链毒素和白树毒素。
本方法中使用的组合物可以进一步包含一种或多种下述蛋白和/或编码此类蛋白的核酸分子,如在对应于美国公开号20070041941的美国序号10/560,650(该文献以引用的方式并入本文)中提出的:IL-15,包括包含与IL-15蛋白序列连接的非IL-15信号肽的融合蛋白,例如包含与IL-15蛋白序列连接的IgE信号肽的融合蛋白,CD40L,TRAIL;RAILreeDRC5、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、F461811或MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、CD30、CD153(CD30L)、Fos、c-jun、Sp-1、Ap1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、NIK、SAP K、SAP1、JNK2、JNK1B2、JNK1B1、JNK2B2、JNK2B1、JNK1A2、JNK2A1、JNK3A1、JNK3A2、NF-κ-B2、p49剪接形式、NF-κ-B2、p100剪接形式、NF-κ-B2、p105剪接形式、NF-κ-B 50K链前体、NFkB p50、人IL-1α、人IL-2、人IL-4、鼠IL-4、人IL-5、人IL-10、人IL-15、人IL-18、人TNF-α、人TNF-β、人白介素12、MadCAM-1、NGF IL-7、VEGF、TNF-R、Fas、CD40L、IL-4、CSF、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、LFA-3、ICAM-3、ICAM-2、ICAM-1、PECAM、P150.95、Mac-1、LFA-1、CD34、RANTES、IL-8、MIP-1α、E-选择子、CD2、MCP-1、L-选择子、P-选择子、FLT、Apo-1、Fas、TNFR-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4(TRAIL)、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、ICE、VLA-1和CD86(B7.2)。
用于本方法的组合物可以进一步包含一种或多种下述蛋白和/或编码此类蛋白的核酸分子,如在对应于美国公开号20070104686的美国序号10/560,653(该文献以引用的方式并入本文)中提出的:Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、失活NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1和TAP2。
如果为任何原因而希望消除接收基因构建体的细胞,可以添加用作细胞破坏的靶的其他元件。基因构建体中可以包括可表达形式的疱疹病毒胸苷激酶(tk)基因。药物更昔洛韦(gangcyclovir)可以施用至个体,并且该药物会引起形成tk的任何细胞的选择性杀伤,从而提供选择性破坏具有基因构建体的细胞的方式。
为了最大化蛋白制备,可以选择非常适合在被施用构建体的细胞中基因表达的调控序列。而且,可以选择在细胞中最有效转录的密码子。本领域普通技术人员可以制备在细胞中有功能性的DNA构建体。
在一些实施方案中,可以提供基因构建体以产生与IgE信号肽连接的本文所述的免疫调节蛋白的编码序列。
本发明的一个方法包括肌内、鼻内、腹膜内、皮下、皮内或局部或通过灌洗至粘膜组织而施用核酸分子的步骤,所述灌洗至粘膜组织选自由吸入、阴道、直肠、尿道、口腔和舌下组成的组。
在一些实施方案中,联合多核苷酸功能增强剂或基因疫苗促进剂的施用将核酸分子递送至细胞。多核苷酸功能增强剂描述于美国专利号5,593,972和5,962,428,这两个文献均以引用的方式并入本文。基因疫苗促进剂描述于美国专利号5,739,118,该文献以引用的方式并入本文。联合核酸分子施用的助剂可以作为与核酸分子的混合物施用或者在核酸分子施用的同时、之前或之后分开施用。此外,可以作为转染剂和/或复制剂和/或炎性剂的其他制剂和可以与多核苷酸功能增强剂共同施用的其他制剂包括生长因子、细胞因子和淋巴因子,例如α-干扰素、γ-干扰素、GM-CSF、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和IL-15以及成纤维细胞生长因子、表面活性剂(例如免疫刺激复合物(ISCOMS))、LPS类似物(包括单磷脂酰脂A(WL))、胞壁酰肽、醌类似物和诸如角鲨烯的小囊泡,透明质酸也可以联合基因构建体施用来使用。在一些实施方案中,免疫调节蛋白可以用作多聚核苷酸功能增强剂。在一些实施方案中,核酸分子与(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLG)联合提供以增强递送/摄取。
根据本发明的药物组合物包含约1纳克至约2000微克DNA。在一些优选实施方案中,根据本发明的药物组合物包含约5纳克至约1000微克DNA。在一些优选实施方案中,所述药物组合物含有约10纳克至约800微克DNA。在一些优选实施方案中,所述药物组合物含有约0.1至约500微克DNA。在一些优选实施方案中,所述药物组合物含有约1至约350微克DNA。在一些优选实施方案中,所述药物组合物含有约25至约250微克DNA。在一些优选实施方案中,所述药物组合物含有约100至约200微克DNA。
根据本发明的药物组合物根据要使用的施用方式来配制。在药物组合物是可注射药物组合物的情况下,它们是无菌、无热原和无微粒的。优选使用等渗制剂。一般而言,等渗性添加剂可以包括氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情况下,诸如磷酸盐缓冲盐水之类的等渗溶液是优选的。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方案中,将血管收缩剂添加至制剂中。
根据本发明一些实施方案,提供了诱发对屈曲病毒的免疫应答的方法。疫苗可以是减毒活疫苗、重组疫苗或核酸或DNA疫苗。
核酸分子可以提供为质粒DNA、重组载体的核酸分子或者减毒疫苗中提供的遗传物质的部分。可选地,在一些实施方案中,共有蛋白可以作为附随编码它们的核酸分子或者取代编码它们的核酸分子的蛋白而被递送。
基因构建体可以包含编码可操作地连接至基因表达所需的调控元件的靶蛋白或免疫调节蛋白的核苷酸序列。根据本发明,提供了基因构建体的组合,包括包含编码靶蛋白的核苷酸序列的可表达形式的一个构建体和包含编码免疫调节蛋白的核苷酸序列的可表达形式的一个构建体。将包含基因构建体组合的DNA或RNA分子递送入活细胞,导致DNA或RNA的表达以及靶蛋白和一种或多种免疫调节蛋白的产生。形成增强的对靶蛋白的免疫应答。
除了使用免疫调节蛋白编码序列的可表达形式来改进基因疫苗以外,本发明还涉及改进的减毒活疫苗和使用重组载体递送编码抗原的外源基因的改进的疫苗。减毒活疫苗和使用重组载体递送外来抗原的疫苗描述于美国专利号:4,722,848;5,017,487;5,077,044;5,110,587;5,112,749;5,174,993;5,223,424;5,225,336;5,240,703;5,242,829;5,294,441;5,294,548;5,310,668;5,387,744;5,389,368;5,424,065;5,451,499;5,453,364;5,462,734;5,470,734;和5,482,713,这些文献均以引用的方式并入本文。提供了包含编码共有蛋白或其免疫原性共有片段的核苷酸序列的基因构建体,其中所述核苷酸序列可操作地连接至可在疫苗中起作用以实现表达的调控序列。将基因构建体掺入减毒活疫苗和重组疫苗中以产生根据本发明的改进的疫苗。
本发明提供了免疫个体的改进的方法,该方法包括将基因构建体作为疫苗组合物的部分递送至个体细胞的步骤,所述疫苗组合物包括DNA疫苗、减毒活疫苗和重组疫苗。所述基因构建体包含编码共有蛋白或其免疫原性共有片段的核苷酸序列,所述核苷酸序列可操作地连接至可在疫苗中起作用以实现表达的调控序列。所述疫苗形成对不同菌株的交叉防护。
实施例
实施例1
这里,我们提供了采用DNA疫苗策略进行CHIKV疫苗设计的基于共有序列的新方法的数据。基于带有几种改性的CHIKV衣壳和被膜特异性共有序列设计了疫苗盒。衣壳、被膜E1和E1的表达使用T7-偶联转录/转译和免疫印迹分析来评估。使用自适应恒定电流电穿孔技术通过肌内注射编码CHIK-衣壳、E1和E1的质粒来免疫C57BL/6小鼠。细胞免疫应答的分析(包括表位作图)表明,这些构建体的电穿孔诱发了强力且广泛的细胞免疫性。此外,抗体ELISA表明,这些合成免疫原能够诱发可识别天然抗原的高滴度抗体。综合起来,这些数据支持在潜在疫苗混合物中使用CHIK共有抗原的进一步研究。
该研究中,我们设计了基于带有几种改性的衣壳(Cap)和被膜(E1)和被膜(E2)特异性共有序列和取代的免疫球蛋白E前导序列的疫苗盒,所述改性包括密码子优化、RNA优化、添加Kozak序列。疫苗盒被引入DNA疫苗载体pVax1的特定位点。使用特异限制性酶切并使用T7启动子的引物测序来检查疫苗构建体的插入物。基于体外表达以及使用体内蛋白质印迹分析,最终的构建体被高效表达。这证实了病毒构建体被正确表达并处理以用于进一步的免疫原性研究。
最近,使用EP递送DNA疫苗引起广泛关注。在小动物模型和非人灵长类动物中IM免疫+EP的最近研究一致性地报道了细胞应答、特别是抗体应答的增加[20-22]。
材料和方法
细胞和动物:
在补充有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养并保持从ATCC获得的BHK-21细胞系。哺乳动物质粒表达载体pVax1购自Invitrogen((Carlsbad,CA)。3-4周龄雌性C57BL/6小鼠(Jackson laboratories,Indianapolis,IN)用于这些实验并分成三个实验组(n4)。所有动物根据美国国立卫生研究院(Bethesda,MD,USA)和宾夕法尼亚大学(Philadelphia,PA,USA)机构动物管理与使用委员会(IACUC)的指导原则圈养于控温的光循环设施内。
CHIKV DNA构建体和合成:
通过合成引物的合成,随后使用从所有CHIKV病毒的NCBI数据库搜集的共有菌株预测序列进行DNA-PCR扩增,来设计CHIKV核心和被膜基因。共有序列被优化以用于表达,其包括密码子和RNA优化(GeneArt,Regensburg,Germany),然后插入pVax1表达载体(Invitrogen)。
体外和体内表达:
利用pVax1骨架中T7启动子和含有S35-甲硫氨酸CHIKV基因的基于T7的偶联转录/转译系统(Promega,Madison,WI)证实构建体表达。合成的蛋白使用抗E1抗体、抗E2抗体或抗衣壳抗体进行免疫沉淀。免疫沉淀蛋白在12%NuPage SDS-PAGE凝胶(Invitrogen,CA)上电泳并随后固定并干燥。进行自显影以检测掺入的S35标记的基因产物。在体内表达中,BHK-21细胞(1×106)使用Fugene转染方法(Roche,NJ)用CHIKV构建体转染。转染后72小时,蛋白(50μg)在SDS-PAGE(12%)上分级分离并转移至PVDF膜(Bio-Rad,Hercules,CA)。使用在小鼠中培养的特异性抗血清进行免疫印迹分析,并使用ECL检测系统(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)用辣根过氧化物酶轭合的山羊抗小鼠IgG使表达的蛋白显现[19]。
免疫和电穿孔
使用标准方案用质粒DNA初次免疫动物[20]。四只小鼠的组用pCHIKV基因(25μg)免疫两次,2-3次,间隔2周,在最后一次免疫后1周处死。所有免疫通过体内电穿孔(EP)(VGX Pharmaceuticals Inc,Blue Bell,PA)以100μl的总体积递送至四头肌。动物在最后一次免疫后7天被处死,之后收集血清和脾用于免疫学分析。分别在第二次免疫和第三次免疫之后1周获得对照小鼠和免疫小鼠的血液。在所有实验中使用方波脉冲,并使用在我们实验室设计和测试的恒定电流EKD递送[20-22]。小鼠实验中使用三电极阵列(3-EA)。3-EA由三个26规实心不锈钢电极组成,形成等腰三角形,两个长边长0.5mm,短边长0.3mm,用不导电塑料固定在一起。小鼠实验的具体EP条件是使用恒定电流0.1安培,三脉冲,52毫秒/脉冲,脉冲间隔4秒。质粒注射和EP之间的延迟时间为约20秒。质粒施用/EP的事件顺序如下:将一次性电极组件放入手柄容器,按压手柄上的启动按钮并输入动物实验组号,使用胰岛素注射器注射50μl DNA构建体(共25μg DNA)质粒,立即将针头放入注射位点周围区域,按压手柄上的启动按钮,4秒钟倒计时后,脉冲被递送。电穿孔5秒钟后,将阵列轻轻从肌肉移开。所有电极在所有处理过程中完全插入肌肉[21,22]。所有DNA使用无内毒素的Qiagen柱制备。所有动物在宾夕法尼亚大学圈养于控温的光循环设施内,它们的管理依据美国国立卫生研究院和宾夕法尼亚大学的指导原则。
细胞应答:ELISPOT分析
ELISPOT分析如先前所述进行[23]。简而言之,ELISpot 96孔板(微孔)用抗小鼠IFN-γ捕获抗体涂布并在4℃下培养24h(R&D Systems)。第二天,将板洗涤并用1%BSA封闭2h。将来自免疫小鼠的20万脾细胞添加至每个孔,并在37℃下5%CO2中于存在RPMI 1640(阴性对照)、ConA(阳性对照)或特定肽抗原(10μg/ml;Invitrogen)的情况下中刺激过夜。肽库由11个氨基酸重叠的15肽组成。刺激24h后,细胞经洗涤后在4℃下与生物素化抗小鼠IFN-γ抗体(R&D Systems)一起培养24h。洗涤板,并将链霉亲和素-碱性磷酸酶(R&D Systems)加入每个孔并在室温下培养2h。洗涤板,向每个孔加入5-溴-4-氯-3′-吲哚基磷酸对甲苯胺盐和氯化四唑氮蓝(色原体显色剂;R&D Systems)。然后将板用蒸馏水冲洗并在室温下干燥。通过自动化ELISPOT读取仪(CTL Limited)计数斑点[21-23]。
体液免疫应答:抗体ELISA
确定每个CHIKV DNA构建体在每个DNA首次注射后的抗体水平和对接种的体液免疫应答。简而言之,96孔高结合聚苯乙烯板(Corning,NY)板用在PBS中稀释的合成特定肽(2μg/ml)在4℃下涂布过夜。第二天,板用PBST(PBS,0.05%吐温20)洗涤,用PBST中3%BSA封闭1h,并在37℃下与来自免疫小鼠和首次实验小鼠的血清的1∶100稀释液一起培养1h。结合的IgG使用1∶5,000稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP(Research Diagnostics,NJ)检测。结合的酶通过添加色原体基底溶液TMB(R&D Systems)来检测,并在Biotek EL312e Bio-Kinetics读取仪上在450nm读数。所有血清样品均以一式两份测试[22]。
结果
共有构建体表达:
三种CHIKV共有构建体的表达使用多种技术来验证。为了显现体外产生的蛋白质,进行S35标记的体外T7偶联转录和转译分析。使用组氨酸标签抗体免疫沉淀转译产物并进行凝胶分析。SDS-PAGE和放射显影分析显示,每种构建体(被膜E1、E2和衣壳)电泳在其理论预测的分子量(图2A)下进行。我们接着试图检验这些构建体在哺乳动物细胞中的体内表达。转染入BHK-21细胞后,在3天后提取蛋白质并使用特异性多克隆抗体通过蛋白质印迹分析来检测表达(图2B)。用特异性抗体进行免疫印迹时,在被膜E1构建体转染的细胞中观察到52kDa蛋白,在衣壳构建体转染的细胞中观察到36kDa蛋白。
体液免疫原性
我们假设,我们的共有免疫原防卫致命性CHIK病毒的强度取决于免疫系统的细胞免疫部分。而且,交叉反应性但非中和性抗体可以提供某种程度的对疾病严重度的防护。为了确定我们的构建体是否诱发抗体应答,我们对CHIK免疫的小鼠血清进行了抗体ELISA以确定DNA免疫后获得的血清的抗体滴度,通过ELISA测试抗体应答。用被膜E1免疫的小鼠血清中抗E1特异性IgG抗体显著高于用载体对照免疫的小鼠血清(图3A)。类似地,分别用被膜E2和衣壳构建体免疫的小鼠血清中抗E2特异性IgG抗体和衣壳特异性IgG抗体显著高于用载体对照免疫的小鼠血清(图3B&C)。这些结果进一步支持:质粒递送的可选方式、特别是电穿孔增加了响应DNA疫苗免疫原的抗体产生。
细胞免疫原性
E1、E2和衣壳构建体诱发CD8+CTL应答的能力通过IFN-γELISpot分析确定。共有被膜构建体E1、E2和衣壳疫苗能够在三次免疫之后在C57BL/6小鼠中诱发强的IFN-γ应答(图4A、5A和6A)。对于被膜E1诱发的细胞免疫应答的分子表征,针对跨整个被膜E1的肽文库进行ELISpot分析。使用了跨E1蛋白残基1-435的74种15肽(它们之间有9个氨基酸重叠)和跨E2蛋白1-423的肽。被膜诱发了E1蛋白中的优势表位HSMTNAVTI(图4B)和E2蛋白中的IILYYYELY(图5B)。类似地,对于衣壳蛋白,对跨整个衣壳蛋白的肽文库进行ELIspot分析。使用了跨衣壳蛋白残基1-261的45种15肽,它们之间有9个氨基酸重叠。构建体衣壳诱发了优势表位ACLVGDKVM(图5B)。有趣的是,构建体CHIKV-E1诱发的优势表位带有226A-V突变,表明所述构建体还可以有效地诱发对新出现的突变病毒的免疫应答。该发现可以表明,免疫应答能够在细胞选择过程中推动病毒进化。
讨论
C57BL/6小鼠中诱发的免疫应答评估显示,构建体具有高度免疫原性并且就IFN-γ应答和增殖而言引发了T细胞免疫应答。本研究的ELISpot数据表明,IFN-γ应答强度就获得的斑点数量而言是基础广泛的。尽管已知其他相关α病毒中的被膜蛋白和衣壳具有免疫原性,但是有关屈曲被膜和衣壳蛋白的免疫原性知之甚少。来自被膜E1和衣壳不同区域的基质肽库引发脾细胞的IFN-γ产生,分别确定了在E1和衣壳蛋白中的T细胞优势表位HSMTNAVTI和ACLVGDKVM。发现接种小鼠的总IgG水平与未接种对照的总IgG水平相比有所增加,表明强体液免疫应答的诱发。除了这些疫苗加强对多种屈曲病毒攻击的防护能力外,进一步分析所诱发的抗体应答类型的后续研究目前正在进行中。
该研究表明,这些构建体可以作为疫苗候选物进一步研究。然而,由于该研究局限于证明疫苗构建体在小鼠中肌内注射接着电穿孔之后的高效表达和免疫原性,因此所述疫苗构建体在包括非人灵长类动物模型在内的更多模型中的免疫原性详细评估是重要的。描述的合成盒构建体似乎是进一步考察屈曲病毒免疫生物学的方便工具。
实施例2
设计了测量中和性抗体滴度的分析,其提供了对临床人类CHIKV感染可行的快速诊断并应用于易感的脊椎动物宿主的临床前血清监视。
CHIKV通过RT-PCR识别。使用QIAamp病毒RNA迷你试剂盒从患者血清提取RNA。使用Quiagen一步式RT PCR试剂盒进行一步式RT-PCR测试。在编码病毒被膜蛋白E2的基因中,扩增产物为305bp。当观察细胞时,CHIKV形成泡沫细胞病变效应(CPE),其中在感染后(pi)24-48小时后看到细胞圆化(rounding)。
微量中和分析设计如下。中和试验是基于抗原与抗体反应。观察到患者血清中抑制已知病毒滴度对CHIKV病毒的同源抗体的存在。对血清进行连续稀释(通常例如1∶10至1∶640)并在足以使血清中抗体抑制病毒的条件和时间量下与已知滴度的CHIKV一起培养。培养后,如果病毒还未被血清中的抗体中和,在会导致细胞感染病毒的条件下向受纳细胞添加混合物。将抑制病毒繁殖的血清最高稀释度记录为抗体滴度。CPE(细胞病变效应)可以用作细胞中病毒繁殖的量度。
使用患者样品进行CHIKV中和测试。图7是显示预免疫和DNA免疫小鼠血清的中和抗体滴度的图。小鼠用编码E1、E2、衣壳、E1+E2或载体pVax的构建体免疫。血清被连续稀释(1∶10至1∶640)并在37℃下与CHIKV(100TCID50)一起培养90分钟。培养后,将混合物添加至96孔平底板中的Vero细胞(15,000细胞/孔)并在5%CO2气氛中37℃下培养5天。将没有观察到CPE(细胞病变效应)的最高滴度记录为中和抗体滴度。
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