CN101874039A - 蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本文描述了脂质酰基转移酶。所述脂质酰基转移酶包含SEQ ID No.90所示的氨基酸序列，或与SEQ ID No.90具有95％或更高同一性的氨基酸序列。

Description

蛋白质
参考文献
本文引用了多篇文件(“本文引用的文件”)。本文引用的每份文件，以及本文引用的文件中引用或参考的每份文件均通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及脂质酰基转移酶。
本发明涉及使用脂质酰基转移酶在食品中原位产生乳化剂的方法。
本发明还涉及使用脂质酰基转移酶在食品中原位产生乳化剂的方法，其中所述方法使得产生该乳化剂而不增加或基本不增加所述食品中的游离脂肪酸。
本发明还涉及使用脂质酰基转移酶在食品中原位产生至少两种乳化剂的方法。
本发明还涉及使用脂质酰基转移酶在食品中原位产生碳水化合物酯和/或甾醇酯和/或甾烷醇酯(stanol ester)和/或蛋白质酯和/或甘油酯和/或羟基酸酯的方法。
本发明涉及含有脂质酰基转移酶的食品酶组合物和/或饲料酶组合物，以及所述组合物在本发明方法中的应用。
本发明还涉及鉴定适宜本发明的脂质酰基转移酶的方法，及如前述所鉴定的脂质酰基转移酶。
本发明进一步还涉及固定化的脂质酰基转移酶。
背景技术
对在食品或饲料工业中使用的磷脂酶以及脂酶(称为脂解酶(EC.3.1.1.x)的有益用途已知多年。
例如，在EP 0585988中声称在面团中添加脂酶具有促进抗腐败(antistaling)效应的作用。提示从少根根霉菌(Rhizopus arrhizus)中得到的脂酶，在与起酥油/脂肪(shortening/fat)联用时，添加到面团中可提高所生产的面包的质量。WO94/04035中教导在面团中添加脂酶可改善柔软性而不需另外添加脂类或油类。Castello，P.ESEGP 89-10Dec.1999Helsinki，表明外源性脂酶可以改变面包体积。
脂解酶可将食品中存在的脂质水解出一种或多种脂肪酸，使食品中产生有效的乳化剂分子，这提供了有商业价值的功用。提供最显著的乳化特性的分子是部分水解产物，诸如溶血磷脂(lyso-phospholipid)、溶血糖脂(lyso-glycolipid)和甘油单酯(mono-glyceride)分子。极性脂质水解产物，如溶血磷脂和溶血糖脂是特别有利的。在制作面包时，所述原位产生的乳化剂可起到与乳化剂(诸如DATEM)相当的作用。
但是，脂解酶的活性也导致游离脂肪酸的堆积，这能对食品产生不良作用。脂解酶的这一固有活性限制了其功能。
本领域尝试了多种方法解决此技术问题。然而，这些方法导致食品中游离脂肪酸显著增加，特别是对于含水量高的食品，包括但不仅限于面包面团和蛋黄。
磷脂酶，特别是磷脂酶A2(E.C.3.1.1.4)，在蛋或基于蛋的食品处理中应用多年(例如参见US 4,034,124和Dutihl&Groger 1981J.Sci.Food Agric.32，451-458)，磷脂酶在蛋或基于蛋的食品处理中使具有乳化剂作用的极性溶血卵磷脂蓄积，磷脂酶处理蛋或基于蛋的产品可提高稳定性，如巴氏灭菌法等热处理时的热稳定性，并且具有明显的稠化作用。基于蛋的产品包括但不仅限于蛋糕、蛋黄酱、色拉调料、沙司、冰淇淋等等。磷脂酶的应用使游离脂肪酸蓄积。游离脂肪酸的蓄积可能导致显著的不良风味，另外，游离脂肪酸的蓄积使产品易于氧化，因此产品保质期短，易变色以及其它食品重要性质如口味和质地改变。近来，具有广泛底物特异性的脂解酶已经市场化用于处理蛋黄和相关食品。它们的优势在于不像多数的磷脂酶A2，它们不是源于哺乳动物。但是它们导致游离脂肪酸显著蓄积，这不仅是磷脂的水解，还有甘油三酯的水解所导致。
如同前面提到的，脂酶广泛应用的另一领域是面包制造业。八十年代早期，磷脂酶就已应用于烘焙工艺。
小麦粉中脂酶作用的底物是1.5-3％内源性小麦脂质，所述内源性小麦脂质是极性与非极性脂质的混合物。极性脂质分为糖脂和磷脂。这些脂质与两个脂肪酸和一个极性基团所酯化的甘油构成。该极性基团对这些脂质的表面活性产生贡献。对这些脂质中的脂肪酸之一的酶解能使脂质具有更高的表面活性。公知的，诸如DATEM等具有高表面活性的乳化剂被添加到面团中可产生显著作用。
然而，脂酶(E.C.3.1.1.X)在生面类产品中使用会对酵母活性产生损害作用，和/或对面包体积产生负面影响，对面包体积的负面影响往往以剂量过大来解释。剂量过大可导致面筋弹力下降，这使面团过硬，使面包体积缩小。另外，或可选，这些脂酶会降解添加到面团中的起酥油、油脂和乳脂，导致面团和烘焙食品的有不良风味。剂量过大和不良风味归因于面团中游离脂肪酸的蓄积。
据EP 1193314、EP 0977869和WO01/39602中记载，在制作面包的过程中使用作用于糖脂的脂解酶有很大的好处，其部分水解产物-溶血糖脂具有强的乳化作用，显然导致与游离脂肪酸的不良蓄积相比更高比例的积极乳化剂作用。但是，酶对甘油三酯具有显著的非选择性作用，从而产生不必要的大量游离脂肪酸。
WO00/32758报导了同样发现，该文献公开了对磷脂和/或糖脂有增强活性的脂解酶变体以及对长链而非短链脂肪酸有选择性的变体。WO01/39602也公开了后一特性，认为该特征对防止游离短链脂肪酸蓄积造成的不良味道尤为重要。不过，产生大量的游离脂肪酸。
在WO02/094123中解决了高甘油三酯活性问题，其中教导了脂解酶作用于面团中的极性脂质(如磷脂和糖脂)，而对于甘油三酯或1-甘油单酯基本没有活性。但产生大量的游离脂肪酸。
有些脂解酶对极性脂质(如糖脂/磷脂)处于溶解状态时呈现低活性或者无活性。此类酶的应用被认为是优选的，因为这类酶可以使高极性溶血脂质(lyso-lipid)聚集从而产生最佳功效。但是游离脂肪酸也同时会蓄积。这种选择性功能是磷脂酶A2和公开在EP0977869、EP1193314和WO01/39602中的糖脂的特点。已制备了低选择性脂解酶的变异酶，与其母体酶相比对极性溶血脂质活性更低(WO03/060112)。不过，产生显著的游离脂肪酸。
WO00/05396教导了用于制备含有乳化剂的食品的方法，其中食品原料与酶接触，从而在酶的作用下从脂肪酸酯生成乳化剂，并且从第二成分产生第二功能性成分。WO00/05396还教导了具体的脂酶或脂酶的用途。但在WO00/05396中没有提及脂质酰基转移酶的具体应用。另外，WO00/05396教导的酯酶和脂酶在高含水量的食品中使用会导致显著的游离脂肪酸蓄积。
与脂酶包括磷脂酶和糖脂酶的使用相关的缺点可能由从脂质释放的游离脂肪酸累积所导致。在过去的二十年间，由于游离脂肪酸有害的蓄积与有积极作用的溶血脂质的生成之间的平衡，脂解酶在食品中的使用受限。虽然在本领域内进行了大量策略的尝试，其中一些提供了明显的功能改善，但没有一个能完全处理和解决现有技术中的该根本问题，即用脂解酶原位产生的食品中有游离脂肪酸大量蓄积。
未加工的原料或食品产品中存在高水平游离脂肪酸(FFA)普遍被认为是质量缺陷，食品生产商和消费者往往在食品规范中规定了FFA的最高水平。过量的FFA水平可能会导致感官和/或功能上的缺陷。
脂解作用导致食品的水解酸败，形成特征性的“肥皂”味道，这种“肥皂”口味对中等链长度(C8-C12)的脂肪酸尤为显著，尽管这些脂肪酸不以高浓度存在但是可能是食品如乳制品或植物油中的重要成分。更普遍的感官缺陷是由于脂解酶和氧化过程的联合作用的结果。当在酰基脂质中非酯化时，不饱和脂肪酸对酶促氧化作用比其发生酯化时更为敏感。
认为高水平FFA导致食品功能缺陷，但仍不能很好的解释。不希望被理论所束缚，未发生改变的脂质水解成羧酸使[H+]增加，并产生能与其它化合物或金属离子结合的羰基。游离脂肪酸还可以通过疏水性相互作用与蛋白质结合，并能在烹饪过程中与淀粉结合(complex)。FFA还可以干扰表面活化剂如极性脂质和乳化剂的作用(Lipid in Cereal Technology，P.J.Bames，AcademicPress 1983.)
WO03/100044公开了一类已知为PDAT(或ATWAX)的酰基转移酶。这些酶利用甘油单酯或甘油二酯作为受体分子，以磷脂酰胆碱(PC)作为供体分子，产生如下产物：溶血碱磷脂酰胆碱、三酰甘油和/或二酰甘油。
在一个实施方案中，本发明涉及将乳清蛋白加入食品中的改进，提供了提高的产量，同时不损害食品组合物和产品的质量例如质构。
干酪组合物通常由液体奶制品通过包括用凝结剂或凝固剂处理所述液体的方法制备。该凝结剂可以是凝乳酶(curding enzyme)、酸或合适的细菌培养物，或者其可包括所述培养物。形成的乳凝块一般包括经转化的酪蛋白、脂肪(包括天然乳脂)和特别是当使用细菌培养物需要的调味剂。乳凝块可以与液态乳清分离，乳清中含有不受凝固反应影响的可溶性蛋白，因此没有掺入乳凝中。
因此，乳清是生产食品-例如干酪的商业方法生产的副产品。传统意义上，乳清被当作无用的废物或者被用作肥料或饲料或被加工成食品成分。
乳清蛋白不能充分的被保留在乳凝块中是导致奶制品诸如干酪用乳凝块常规生产的效率低下以及与起始乳制液体中所有的蛋白质固体掺入所得干酪凝块中相关的总产量缩减的重要原因。
进行许多努力以将乳清蛋白包含到干酪中，例如通过加热处理牛奶，加热处理乳清，或通过过滤例如超滤。
也有关于应用具体可蛋白酶诱导乳清蛋白聚集的数篇记述。已证明源于地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenformis)的丝氨酸蛋白酶具有诱导乳清蛋白聚集的能力(US5,523,237)。
然而，在生产过程诸如制造干酪中添加乳清蛋白还存在许多难点。例如，乳清蛋白掺入干酪中与产品味道和口感的下降有关，进一步还会干扰凝结和产品的后续加工。之前已有报道能加入干酪用乳中用于乳清蛋白水解的蛋白酶导致酪蛋白的明显水解，如Madsen，J.S.&Qvist，K.B.(1997)在“Hydrolysisof milk protein by a Bacillus licheniformis protease specific for acidic amino acidresidues”(JFood Sci.62，579-582)中所述。
因此，在本领域需要这样的方法和组合物，其在保留感官和其它期望特性的同时改善了乳清蛋白向食品中的掺入。这种优化会导致功效的提高、食品产量的提高和总原料成本的降低。
脂酶:胆固醇酰基转移酶已经是已知的(参见例如Buckley-Biochemistry伯克利生物化学1983，22，5490-5493)。具体地，已经发现甘油磷酸酯:胆固醇酰基转移酶(GCAT)，其象植物和/或哺乳动物卵磷脂:胆固醇酰基转移酶(LCAT)一样可以催化脂肪酸在磷脂酰胆碱与胆固醇之间的转移。
Upton和Buckley(TIBS 20，May 1995p 178-179)以及Brumlik和Buckley(J.of Bacteriology Apr.1996p 2060-2064)教导了源自嗜水气单胞菌(Aeromonahydrophila)、在水介质中能够将酰基转移到乙醇受体上的脂酶/酰基转移酶。
发明内容
第一方面，本发明提供一种在食品中原位产生乳化剂的方法，所述方法包括将在本文定义的脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
在另一方面，本发明提供一种在食品中原位产生乳化剂的方法，其中所述方法使得产生所述乳化剂而不增加或基本不增加食品中的游离脂肪酸，并且其中所述方法包括将脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
另一方面，本发明提供一种在食品中原位产生乳化剂以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的方法，其中所述方法使得产生所述乳化剂而不增加或基本不增加食品中的游离脂肪酸，并且其中所述方法包括将脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
另一方面，本发明提供一种在食品中原位产生乳化剂以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的方法，所述方法包括将脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面，提供一种在食品中原位产生至少两种乳化剂的方法，所述方法包括将脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面，提供一种在食品中原位产生至少两种乳化剂以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的方法，其中所述方法使得产生所述乳化剂而不增加或基本不增加食品中的游离脂肪酸，并且其中所述方法包括将脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供一种在食品中原位产生至少两种乳化剂以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的方法，所述方法包括将脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供一种在食品中原位产生碳水化合物酯的方法，所述方法包括将脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供一种在食品中原位产生碳水化合物酯和乳化剂的方法，所述方法包括将脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供一种在食品中原位产生乳化剂以及碳水化合物酯、甾醇酯、甾烷醇酯、蛋白质酯、甘油单酯或甘油二酯中的一种或多种的方法，并且其中所述方法包括将脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供一种包含乳化剂的食品的生产方法，所述方法包括将本文定义的脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供一种包含乳化剂的食品的生产方法，其中所述方法使得产生所述乳化剂而不增加或基本不增加食品中的游离脂肪酸，所述方法包括将脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供一种包含乳化剂以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的食品的生产方法，其中所述方法使得产生所述乳化剂而不增加或基本不增加食品中的游离脂肪酸，并且其中所述方法包括将脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供一种包含乳化剂以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的食品的生产方法，所述方法包括将脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供一种包含至少两种乳化剂的食品的生产方法，所述方法包括将脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供一种包含至少两种乳化剂以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的食品的生产方法，其中所述方法使得产生所述乳化剂而不增加或基本不增加食品中的游离脂肪酸，并且其中所述方法包括将脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供一种包含至少两种乳化剂以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的食品的生产方法，所述方法包括将脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供一种包含碳水化合物酯的食品的生产方法，所述方法包括将脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供一种包含碳水化合物酯和乳化剂的食品的生产方法，所述方法包括将脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供一种包含乳化剂以及碳水化合物酯、甾醇酯、甾烷醇酯、蛋白质酯、甘油单酯或甘油二酯中的一种或多种的食品的生产方法，所述方法包括将脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供脂质酰基转移酶用于从食品原料制备含乳化剂的食品的用途，其中所述乳化剂是通过脂质酰基转移酶从食品原料组分中产生的。
本发明的另一方面提供脂质酰基转移酶用于从食品原料制备含乳化剂的食品的用途，其中所述方法使得产生所述乳化剂而不增加或基本不增加所述食品中的游离脂肪酸，并且其中其中所述乳化剂是通过脂质酰基转移酶从食品原料组分中产生的。
在另一方面，本发明提供脂质酰基转移酶用于从食品原料制备含乳化剂以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的食品的用途，其中所述方法使得产生所述乳化剂而不增加或基本不增加所述食品中的游离脂肪酸，其中所述乳化剂和/或甾醇酯和/或甾烷醇酯通过脂质酰基转移酶从食品原料组分中产生。
在另一方面，本发明提供脂质酰基转移酶用于从食品原料制备含乳化剂以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的食品的用途，其中所述乳化剂和/或甾醇酯和/或甾烷醇酯是通过脂质酰基转移酶从食品原料组分中产生的。
在另一方面，本发明提供脂质酰基转移酶用于从食品原料制备含有至少两种乳化剂的食品的用途，其中所述两种乳化剂是通过脂质酰基转移酶从食品原料组分中产生的。
本发明另一方面提供脂质酰基转移酶用于从食品原料制备含有至少两种乳化剂以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的食品的用途，其中所述方法使得产生所述乳化剂而不增加或基本不增加所述食品中的游离脂肪酸，所述乳化剂的一种或两种和/或甾醇酯和/或甾烷醇酯是通过脂质酰基转移酶从食品原料组分中产生的。
本发明另一方面提供脂质酰基转移酶用于从食品原料制备含有至少两种乳化剂以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的食品的用途，所述乳化剂的一种或两种和/或甾醇酯和/或甾烷醇酯是通过脂质酰基转移酶从食品原料组分中产生的。
本发明另一方面提供脂质酰基转移酶用于从食品原料制备含有碳水化合物酯的食品的用途，其中所述碳水化合物酯是通过脂质酰基转移酶从食品原料组分中产生的。
在另一方面，本发明提供脂质酰基转移酶用于从食品原料制备含有至少一种碳水化合物酯和其它乳化剂的食品的用途，其中所述碳水化合物酯和乳化剂是通过脂质酰基转移酶从食品原料组分中产生的。
在另一方面，本发明提供脂质酰基转移酶用于从食品原料制备含有乳化剂和碳水化合物酯、甾醇酯、甾烷醇酯、蛋白质酯、甘油单酯或甘油二酯中的一种或多种的食品的用途，其中所述乳化剂和/或碳水化合物酯和/或甾醇酯和/或甾烷醇酯和/或蛋白质酯和/或甘油单酯和/或甘油二酯是通过脂质酰基转移酶从食品原料组分中产生的。
本发明另一方面提供一种在基于蛋的食品中原位产生乳化剂(优选溶血卵磷脂)和甾醇酯的方法，其中所述方法使得产生所述乳化剂而不增加或基本不增加食品中的游离脂肪酸，并且其中所述方法包括将脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明另一方面提供一种在基于蛋的食品中原位产生乳化剂(优选溶血卵磷脂)和甾醇酯的方法，其中所述方法包括将脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
在另一方面，本发明提供一种基于蛋的食品的生产方法，所述基于蛋的食品中含有一种乳化剂(优选溶血卵磷脂)和甾醇酯，其中所述方法使得产生所述乳化剂而不增加或基本不增加食品中的游离脂肪酸，并且其中所述方法包括将脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
在另一方面，本发明提供一种基于蛋的食品的生产方法，所述基于蛋的食品中含有乳化剂(优选溶血卵磷脂)和甾醇酯，所述方法包括将脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明另一方面还提供按照本发明的方法可得到的、优选得到的食品。
在另一方面，本发明进一步涉及包含脂质酰基转移酶的食品酶组合物和/或饲料酶组合物及所述组合物在本方明的方法中的应用。
本发明另一方面进一步提供一种鉴定用于本发明的合适的脂质酰基转移酶的方法，所述方法包括以下步骤：使用“低水环境中的转移酶测定法”(″Transferase Assay in a Low Water environment″)，“高水蛋黄中的转移酶测定法”(″Transferase Assay in High Water Egg Yolk″)或“经缓冲的底物中的转移酶测定法”(″Transferase Assay in Buffered Substrate″)中的一种或多种测定法测试目标酶，和选择脂质酰基转移酶，所述脂质酰基转移酶具有以下一种或多种性质：(a)当使用“低水环境中的转移酶测定法”进行检测时，在经过选自30、20或120分钟的时间后测定，具有至少1％的相对转移酶活性；(b)当在含54％水的蛋黄中使用“高水蛋黄中的转移酶测定法”进行检测时，具有高达100％的相对转移酶活性；或者(c)当使用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”进行检测时，具有至少2％的酰基转移酶活性。
本发明还进一步提供使用本发明的方法鉴定的脂质酰基转移酶。
在另一方面，本发明提供本文所定义的固定化的脂质酰基转移酶。
具体实施方式
本文使用的术语“脂质酰基转移酶”是指这样的酶，其也具有脂酶活性(根据国际生物化学分子生物学联合会命名委员会的酶命名法推荐(EnzymeNomenclature Recommendations)(1992)通常分类为E.C.3.1.1.x)，该酶还具有酰基转移酶活性(通常分类为E.C.2.3.1.x)，该酶能够将酰基从脂质转移到一种或多种受体底物，例如以下物质中的一种或多种：甾醇；甾烷醇；碳水化合物；蛋白质；蛋白质亚单位；甘油。
用于本发明方法和/或应用的脂质酰基转移酶可以是WO2004/064537，或WO2004/064987，或PCT/IB2004/004378，或GB0513859.9，或PCT/GB05/002823中描述的一种。这些文献通过引用并入本文。
用于本发明方法和/或应用的脂质酰基转移酶可以是天然脂质酰基转移酶或者可以是脂质酰基转移酶变体。
优选地，用于本发明方法和/或应用的脂质酰基转移酶能够将酰基从脂质(如本文的定义)转移到一种或多种以下酰基受体底物：甾醇、甾烷醇、碳水化合物、蛋白质或其亚单位，或甘油。
在本发明的一些方面中的“酰基受体”可以是任何包含羟基(-OH)的化合物，例如多价醇，包括甘油；甾醇；甾烷醇；碳水化合物；羟基酸，包括果酸、枸橼酸、酒石酸、乳酸和抗坏血酸；蛋白质或其亚单位，如氨基酸、蛋白质水解物和肽(部分水解的蛋白质)；及其混合物和衍生物。优选地，本发明的“酰基受体”不是水。
在一个实施方案中，所述酰基受体优选不是甘油单酯和/或甘油二酯。
在一方面中，优选地，所述酶能够将酰基从脂质转移到甾醇和/或甾烷醇。
在一方面中，优选地，所述酶能够将酰基从脂质转移到碳水化合物。
在一方面中，优选地，所述酶能够将酰基从脂质转移到蛋白质或其亚单位。适宜地，所述蛋白质亚单位可以是以下中的一种或多种：氨基酸、蛋白质水解物、肽、二肽、寡肽、多肽。
适宜地，在蛋白质或蛋白质亚单位中，酰基受体可以是蛋白质或蛋白质亚单位的一或多种以下组分：丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或半胱氨酸。
当蛋白质亚单位是氨基酸时，合适地，所述氨基酸可以为任何适合的氨基酸。合适地，所述氨基酸例如为丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸中的一种或多种。
在一方面，优选地，所述酶能够将酰基从脂质转移到甘油。
在一方面，优选地，所述酶能够将酰基从脂质转移到羟基酸。
在一方面，优选地，所述酶能够将酰基从脂质转移到多价醇。
在一方面，脂质酰基转移酶还可以能将酰基从脂质转移到甾醇和/或甾烷醇，以及还能将酰基从脂质转移到下列一种或多种物质：碳水化合物、蛋白质、蛋白质亚单位、甘油。
优选地，本发明的脂质酰基转移酶作用的脂质底物是下列一种或多种脂质：磷脂，诸如卵磷脂，例如磷脂酰胆碱、三酰甘油、心磷脂、甘油二酯，或糖酯，诸如二半乳糖基甘油二酯(DGDG)。本文所指的脂质底物可称为“脂质酰基供体”，本文所用的术语卵磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油。
在一些方面，优选地，脂质酰基转移酶作用的脂质底物是磷脂，诸如卵磷脂，例如磷脂酰胆碱。
在一些方面，优选地，所述脂质底物是糖脂，例如DGDG。
脂质底物优选是食品脂质，也就是说食品中的脂质成分。
在一些方面，优选地，本发明的脂质酰基转移酶不能或基本不能作用于甘油三酯和/或1-甘油单酯和/或2-甘油单酯。
合适地，所述脂质底物或脂质酰基供体可以为一种或多种脂质，所述脂质存在于一种或多种下列底物中：脂肪，包括猪油、牛羊油(tallow)、乳脂；油，包括从棕榈油、葵花油、大豆油、红花油、棉籽油、花生油(ground nut oil)、玉米油、橄榄油、花生油(peanut oil)、椰子油和油菜籽油(rape seed oil)中提取或由它们衍生的油。来自大豆、油菜籽、或蛋黄的卵磷脂也是适宜的脂质底物。脂质底物也可以是燕麦脂质或其它包含半乳糖脂的基于植物的物质。
在一方面，脂质酰基供体优选蛋黄中的卵磷脂(如磷脂酰胆碱)。
在本发明的一些方面，脂质可选自脂肪酸链长为8-22碳的脂质。
本发明的一些方面，脂质可选自脂肪酸链长为16-22碳的脂质，更优选为16-20碳的脂质。
本发明的一些方面，脂质可选自脂肪酸链长不多于14碳的脂质，适宜地选自脂肪酸链长4-14碳的脂质，适宜为4-10碳的脂质，适宜为4-8碳的脂质。
适宜地，本发明中的脂质酰基转移酶可显示出一种或多种下列脂酶活性：糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)、三酰甘油脂酶活性(E.C.3.1.1.3)、磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)或磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)。本文使用的术语“糖脂酶活性”包括“半乳糖脂酶活性”。
适宜地，本发明中的脂质酰基转移酶具有至少一种或多种下列活性：糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)和/或磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)和/或磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)。
对于本发明一些方面，脂质酰基转移酶可以至少具有糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)。
适宜地，对于一些方面，本发明的脂质酰基转移酶可能够将酰基从糖脂和/或磷脂上转移到以下一种或多种受体底物：甾醇、甾烷醇、碳水化合物、蛋白质、甘油。
一些方面，优选本发明的脂质酰基转移酶能够将酰基从糖脂和/或磷脂转移到甾醇和/或甾烷醇，形成至少甾醇酯和/或甾烷醇酯。
一些方面，优选本发明的脂质酰基转移酶能够将酰基从糖脂和/或磷脂转移到碳水化合物，形成至少碳水化合物酯。
一些方面，优选本发明的脂质酰基转移酶能够将酰基从糖脂或磷脂转移到蛋白质，形成至少蛋白酯(或蛋白脂肪酸缩合物(condensate))。
一些方面，优选本发明的脂质酰基转移酶能够将酰基从糖脂和/或磷脂转移到甘油，至少形成甘油二酯和/或甘油单酯。
在一个实施方案中，所述酰基受体为甘油。甘油可以天然地包含在含有酰基供体(即，例如磷脂)的食品和/或食品材料例如乳脂、乳或奶油中。或者，也可以在添加脂质酰基转移酶之前、期间或之后向含有酰基供体(即，例如磷脂)的食物和/或食品材料例如向乳脂、乳或奶油中添加甘油。
在一些方面，优选本发明的脂质酰基转移酶不发挥三酰甘油脂酶活性(E.C.3.1.1.3)或不发挥显著的三酰甘油脂酶活性(E.C.3.1.1.3)。
在一些方面，所述脂质酰基转移酶可将酰基从脂质转移到甾醇和/或甾烷醇。因此，在一个实施方案中，本发明的“酰基受体”既可以是甾醇又可以是甾烷醇，或二者的组合。
在一个实施方案中，适宜地，所述甾醇和/或甾烷醇可以包括以下一种或多种结构特征：
i)3-β羟基或3-α羟基；和/或
ii)顺式位置的A:B环或反式位置的A:B环或者C5-C6是不饱和的。
适宜的甾醇酰基受体包括胆固醇和植物甾醇，例如α-谷甾醇、β-谷甾醇、豆甾醇、麦角固醇、菜油甾醇、5，6-二氢固醇、菜子甾醇、α-菠菜甾醇、β-菠菜甾醇、γ-菠菜甾醇、δ-菠菜甾醇、岩藻甾醇、dimosterol、子囊甾醇(ascosterol)、serebisterol、表甾醇(episterol)、anasterol、α-苯基丁酰胺(hyposterol)、chondrillasterol、链甾醇、海绵甾醇(chalinosterol)、多孔甾醇、γ-谷甾醇(clionasterol)、固醇糖苷(sterol glycoside)和其它天然或合成的同分异构体和衍生物。
在本发明的一方面，适宜地，一种以上甾醇和/或甾烷醇可以作为酰基受体，适宜地，两种以上甾醇和/或甾烷醇可以作为酰基受体。换言之，在本发明的一个方面，适宜地，可以产生一种以上甾醇酯和/或甾烷醇脂。适宜地，当胆固醇是酰基受体时，一种或多种其他甾醇和一种或多种甾烷醇也可作为酰基受体。因此，在一个方面，本发明提供胆固醇酯与至少一种甾醇酯或甾烷醇酯组合的原位产生方法。换言之，在本发明的一些方面，脂质酰基转移酶可以将酰基从脂质上转移到胆固醇与至少一种其它甾醇和/或至少一种甾烷醇。
在一方面，优选的甾醇酰基受体是下列一种或多种物质：α-谷甾醇、β-谷甾醇、豆甾醇、麦角固醇、菜油甾醇。
在一方面，优选的所述甾醇酰基受体是胆固醇。当胆固醇作为脂质酰基转移酶的酰基受体的情况下，食品中游离胆固醇的量与用脂质酰基转移酶处理前的食品中的游离胆固醇相比和/或与未经脂质酰基转移酶处理的等量食品中的游离胆固醇相比减少。
有利地，优选与对照食品(例如，乳制品，如干酪、乳、奶油、乳脂或冰淇淋)，例如未经本发明的脂质酰基转移酶处理的食品)相比，所述食品(例如，乳制品，如干酪、乳、奶油、乳脂或冰淇淋)中的胆固醇水平降低。
在另一个实施方案中，所述酰基受体为胆固醇。胆固醇可以天然地包含在含有酰基供体(即，例如磷脂)的食品和/或食品材料例如乳脂、乳或奶油中。或者，也可以在添加脂质酰基转移酶之前、期间或之后向含有酰基供体(即，例如磷脂)的食物和/或食品材料例如向乳脂、乳或奶油中添加胆固醇。
适合的甾烷醇酰基受体包括植物甾醇，例如β-谷甾醇或ss-谷甾醇。
在一方面，优选地，所述甾醇和/或甾烷醇酰基受体是除胆固醇之外的甾醇和/或甾烷醇。
在一些方面，按照本发明方法制备的食品可用于降低血清胆固醇和/或低密度脂蛋白。血清胆固醇和低密度脂蛋白与人某些疾病有关，诸如动脉粥样硬化和/或心脏病。因此，可以设想，按照本发明方法制备的食品可用于降低患这些疾病的风险。
因此，在本发明的一方面，提供本发明中的食品用于治疗和/或预防动脉粥样硬化和/或心脏病的用途。
在又一方面，本发明提供一种含有本发明食品的药物。
在又一方面，本发明提供一种治疗和/或预防人和动物患者疾病的方法，所述方法包括给予患者有效量的本发明的食品。
适宜地，甾醇和/或甾烷醇“酰基受体”可天然存在于所述食品中。所述甾醇和/或甾烷醇可选择地添加到食品中。在将甾醇和/或甾烷醇添加到所述食品中的情况下，可在添加本发明的脂质酰基转移酶之前，同时，和/或之后在食品中添加甾醇和/或甾烷醇。适当地，本发明的方法可包括在添加本发明的酶之前或者同时将外源性甾醇/甾烷醇(具体为植物甾醇/植物甾烷醇)添加到食品中。
在一些方面，在添加本发明的脂质酰基转移酶之前或同时，所述食品中的一种或多种的甾醇可能被转化成一种或多种甾烷醇。任何将甾醇转化成甾烷醇的适宜方法都可使用，例如，可以通过化学氢化作用实施所述转化。这种转化可在本发明的脂质酰基转移酶添加之前或本发明的脂质酰基转移酶添加的同时进行。将甾醇转化成甾烷醇的适宜的酶在WO00/061771中有教导。
本发明可以适宜应用于在食品中原位产生植物甾烷醇酯。植物甾烷醇酯具有增加的通过脂质膜的溶解性，生物利用度，以及增加的健康益处(参见例如WO92/99640)。
在本发明的一些实施方案中，甾烷醇酯和/或甾醇酯可以是一种调味剂和/或组织形成剂。在这些实施例中本发明包括了原位产生的调味剂和/或组织处理剂(texturiser)。
在本发明的一些方面，本发明所述的脂质酰基转移酶可利用碳水化合物作为酰基受体。碳水化合物酰基受体可以为以下物质中的一种或多种：单糖、二糖、寡糖或多糖。优选的碳水化合物是以下物质中的一种或多种：葡萄糖、果糖、脱水果糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、半乳糖、木糖、木寡糖(xylooligosacharide)、阿拉伯糖、麦芽寡糖(maltooligosaccharide)、塔格糖(tagatose)、microthecin、ascopyrone P、ascopyrone T、cortalcerone。
适宜地，碳水化合物“酰基受体”可以天然存在于食品中。或者，碳水化合物可以被添加到食品中。当向食品中添加碳水化合物时，可在添加本发明中的脂质酰基转移酶之前、同时、和/或之后添加碳水化合物。
碳水化合物酯可以在食品中用作有价值的乳化剂。因此，当酶的作用为将酰基转移到糖上时，本发明包括了在食品中产生第二原位乳化剂。
在一些实施方案中，脂质酰基转移酶可以利用甾醇和/或甾烷醇以及碳水化合物作为酰基受体。
对于包含蛋的食品，利用可将酰基转移到碳水化合物及甾醇和/或甾烷醇上的脂质酰基转移酶特别有益。具体地，蛋和蛋食品中糖特别是葡萄糖的存在，常被认为是不利的。蛋黄可以包含多至1％葡萄糖。通常，蛋或基于蛋的食品可以用葡萄糖氧化酶处理以去除部分或全部葡萄糖。然而，在本发明中，这种多余的糖可以很容易通过糖的酯化生成糖酯来去除。
在本发明的一些方面，本发明所述脂质酰基转移酶可以利用蛋白质作为酰基受体。适宜的蛋白质可以是食品中例如在乳制品和/或肉制品中存在的一种或多种蛋白质。仅作为实例，适宜的蛋白质可能是乳凝块或乳清中的蛋白质，如乳球蛋白。其它适宜的蛋白质包括来自蛋的卵清蛋白、麸蛋白(gliadin)、麦谷蛋白(glutenin)、puroindoline、谷物中的脂质转移蛋白和肉类中的肌球蛋白。
因此在本发明中，可以实现一种或多种如下的有益性质：原位产生乳化剂而不增加游离脂肪酸含量；食品中游离脂肪酸蓄积量下降；食品中的游离胆固醇水平下降；甾醇酯和/或甾烷醇酯增加；血清胆固醇和/或低密度脂蛋白下降；碳水化合物酯增加；多余的游离碳水化合物减少。
本发明的优势在于，在食品中原位产生乳化剂而不增加或基本不增加食品中游离脂肪酸的含量。游离脂肪酸的产生对食品是有害的。具体地，游离脂肪酸与食品中不良气味(off-odour)和/或不良味道有关，另外还有其它有害影响，包括例如干酪中有肥皂味等等。优选地，本发明提供的方法使乳化剂在原位制备，减少和/或消除其中游离脂肪酸的蓄积。不局限于理论，根据本发明所述，用脂质酰基转移酶将脂质上的脂肪酸转移到酰基受体，例如甾醇和/或甾烷醇上。因此，食品中的游离脂肪酸总体水平不会增加或仅增加到不显著的水平。这和利用脂酶(E.C.3.1.1.x)原位产生乳化剂的情况形成鲜明对比。具体地，脂酶的使用可使食品中游离脂肪酸大量增加，这一点是有害的。本发明中游离脂肪酸的蓄积量与使用脂酶(具体为磷脂酶A)代替本发明中的脂质酰基转移酶时游离脂肪酸的蓄积量相比，减少和/或消除。
利用脂质酰基转移酶将酰基转移到甾醇和/或甾烷醇，对含蛋的食品特别有益。具体地，发现利用本文定义的脂质酰基转移酶处理的基于蛋的食品与用常规的磷脂酶例如(Novozymes A/S，Denmark)，Lecitase
Figure GPA00001103919300162
(Novozymes A/S，Denmark)或来自Biocatalysts的Lipomod 22L处理的基于蛋的食品相比，明显具有更好的特性。
另一方面，所述酰基受体可以是抗坏血酸或包含抗坏血酸。因此，可向食品和/或食品材料或含水乳液中添加抗坏血酸，或者可与适当水平的甘油和任选的甾醇/甾烷醇组合。抗坏血酸是抗氧化剂。在用于食品中时特别优选使用抗坏血酸，因为抗坏血酸的抗氧化性质能够发挥防腐剂的作用，例如以防止或减少脂质的氧化。这样，在本发明的食品和/或食品材料中使用抗坏血酸能够防止或减少改进的食品和/或食品材料的酸败。因此，在用于会出现酸败问题的乳制品例如在干酪中，抗坏血酸的应用特别有用。所添加的抗坏血酸的量可以非常低，例如达到如本文定义的甘油的推荐添加量的至多1/5，例如至多1/10，或至多1/100。优选地，抗坏血酸的范围应为0.02-0.05重量％。在优选的实施方案中，以抗坏血酸棕榈酸酯的形式添加抗坏血酸，例如作为于油中的抗氧化剂使用，优选其剂量在0.1-0.2重量％之间，相应于优选在0.04-0.08重量％之间的抗坏血酸。
在优选的实施方案中，按照本发明处理的改进食品和/或食品材料包含溶血磷脂，优选溶血卵磷脂，优选按照本发明处理的食品和/或食品材料包含至少0.001重量％，例如0.005重量％，包括至少0.01重量％的溶血磷脂，优选溶血卵磷脂，更优选至少0.05重量％，或至少0.1重量％的溶血磷脂，优选溶血卵磷脂。也可使用较高浓度的溶血磷脂，优选溶血卵磷脂，例如至少0.5重量％，或至少1重量％的溶血磷脂，优选溶血卵磷脂，包括至少2重量％，或至少5重量％的溶血磷脂，优选溶血卵磷脂。
在优选的实施方案中，按照本发明处理的改进食品和/或食品材料包含以下甘油磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺、磷酯酰肌醇和磷酯酰丝氨酸中的一种或多种，优选按照本发明处理的食品和/或食品材料包含至少0.001重量％的以下甘油磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺、磷酯酰肌醇和磷酯酰丝氨酸中的一种或多种，例如0.005重量％，包括至少0.01重量％，更优选至少0.05重量％，或至少0.1重量％的以下甘油磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺、磷酯酰肌醇和磷酯酰丝氨酸中的一种或多种。也可使用较高浓度的以下甘油磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺、磷酯酰肌醇和磷酯酰丝氨酸中的一种或多种，例如至少0.5重量％，或至少1重量％，包括至少2重量％，或至少5重量％。
优选上文中描述的改进食品和/或食品材料包含甘油磷脂酰胆碱。
当所述改进食品和/或食品材料包含甘油磷脂酰胆碱时，所述改进食品和/或食品材料可包含小于0.001重量％的溶血磷脂，例如溶血卵磷脂。其可包含小于0.0005重量％溶血磷脂，包括其中所述改进食品和/或食品材料不包含溶血磷脂的实施方案。
在优选的实施方案中，所述改进食品和/或食品材料包含至少0.001重量％甘油单酯，例如0.005重量％，包括至少0.01重量％甘油单酯，更优选0.05重量％的甘油单酯，或至少0.1重量％甘油单酯。也可使用较高浓度的甘油单酯，例如至少0.5重量％的甘油单酯，或至少1重量％的甘油单酯，包括至少2重量％的甘油单酯，或至少5重量％的甘油单酯。
在优选的实施方案中，所述改进食品和/或食品材料包含至少0.001重量％甾醇酯，例如0.005重量％，包括至少0.01重量％的甾醇酯，更优选至少0.05重量％的甾醇酯，或至少0.1重量％甾醇酯。也可使用较高浓度的甾醇酯，例如至少0.5重量％的甾醇酯。
在一个实施方案中，即其中所述酰基受体是例如甘油的实施方案中，通过选自醇解，优选甘油解(glycerolysis)产生本发明的功能性成分。
根据本发明的方法，改进食品和/或食品材料的优选温度可取决于多个因素，包括所用酶的最适温度和稳定性、所述食品和/或食品材料的熔点和粘度、待改进的食品和/或食品材料的体积、所述食品和/或食品材料的热稳定性。
例如，在一个实施方案中，可在10-70℃之间进行酶改进，例如10-32℃或10-34℃，包括10-20℃之间，更优选20-60℃之间，例如30-60℃之间，或36-60℃，例如37-60℃，包括40-60℃之间进行酶改进。
例如对于乳和/或奶油的酶改进，可优选使用低于约50℃的温度，例如在约10-34℃之间，或例如约36-49℃之间，或例如约40-49℃之间，或例如约40-45℃之间，或例如约45-49℃之间。可使用20-50℃之间的适合温度，例如30-40℃之间。
在一些实施方案中，使用本文公开的脂质酰基转移酶的优点是其具有高温稳定性，并因此可用于在所述食品和/或食品材料的粘度是低的温度下处理所述食品和/或食品材料。高热稳定性也可允许使用较低剂量的酶。
在一些实施方案中，所述脂质酰基转移酶可适宜地具有例如约50℃至约70℃的最适温度。在一些实施方案中，根据使用PLU测试的测量，脂质酰基转移酶可适宜地具有温度稳定性，其中所述酰基转移酶在55℃下1小时后保留其活性的至少约25％，例如至少约50％。
可在任何适合的时期内进行本发明的处理食品和/或食品材料的方法。这可取决于所使用的温度和酶剂量。仅举例而言，所述时期可以在约1分钟至约4小时之间，例如在约5分钟至约2小时之间，或在约10分钟至约1小时之间，或在约5分钟至约30分钟之间，或在约1分钟至约29分钟之间，或在约31分钟至约60分钟之间。所述时间可适宜地在约5分钟至1小时之间。
酶的剂量可以是任何适合的剂量，例如在按照PLU活性添加时，所述酶剂量可以在约1-10,000PLU/kg食品和/或食品材料之间，例如在5-5000PLU/kg食品和/或食品材料之间，例如在100-1000PLU/kg食品和/或食品材料之间，或在1000-3000PLU/kg食品和/或食品材料之间。在一些实施例中，对于脂质酰基转移酶，可优选50-1000PLU/kg食品和/或食品材料。
优选地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以用下列标准来表征：
(i)该酶具有酰基转移酶活性(可定义为酯转移活性)，由此将脂质酰基供体的原始酯键上的酰基部分转移到酰基受体上形成新酯；和
(ii)该酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是一种或多种下列氨基酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S。
优选地，GDSX基序的X为L或Y。更优选，GDSX基序的X为L。因此，优选本发明的酶包含氨基酸序列基序GSDL。
GDSX基序是由四种保守氨基酸构成。优选地，所述基序中的丝氨酸是脂质酰基转移酶的催化性丝氨酸。适宜地，GDSX基序中的丝氨酸可以在与Brumlik和Buckley(Journal of Bacteriology Apr.1996，Vol.1，No.7，p2060-2064)教导的嗜水气单胞菌脂解酶中的Ser-16相应的位置。
为确定一种蛋白质是否含有本发明所述GDSX基序，该序列优选与Pfam数据库中的隐藏markov模型图谱(model profile)(HMM图谱)进行比较。
Pfam是蛋白质结构域家族的数据库。Pfam包括为每个家族的辅助(curated)多重序列比对以及用于鉴定新序列中的这些结构域的隐藏Markov模型图谱(HMM图谱)。对Pfam的介绍见于Bateman A等.(2002)NucleicAcids Res.30；276-280。隐藏Markov模型被应用于许多用于对蛋白质进行分类的数据库中，综述见Bateman A和Haft DH(2002)Brief Bioinform3；236-245。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？cmd＝Retrieve&db＝PubMed&list uids＝12230032&dopt＝Abstract
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？cmd＝Retrieve&db＝ PubMed&list uids＝11752314&dopt＝Abstract
对隐藏Markov模型的详细解释和这些模型如何在Pfam数据库中应用参见Durbin R，Eddy S，和Krogh A(1998)Biological sequence analysis；probabilistic models of proteins and nucleic acids.Cambridge University Press，ISBN 0-521-62041-4(Durbin R，Eddy S，和KroghA(1998)生物序列分析，蛋白质和核苷酸概率模型，剑桥大学出版，ISBN 0-521-62041-4。Hammer程序包可以从华盛顿大学，St Louis，USA获得。
或者，GDSX基序可以通过应用Hammer软件包鉴别，指导说明由DurbinR，Eddy S，和Krogh A(1998)Biological sequence analysis；probabilisticmodels of proteins and nucleic acids.Cambridge University Press，ISBN0-521-62041-4(Durbin R，EddyS，和KroghA(1998)生物序列分析，蛋白质和核苷酸概率模型，剑桥大学出版，ISBN 0-521-62041-4)及其中的参考文献提供。HMMER2的资料在这些详细说明书中提供。
PFAM数据库可以通过，例如，目前位于如下网址的几个服务器进行访问：
http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml
http://pfam.wustl.edu/
http://pfam.jouy.inra.fr/
http://pfam.cgb.ki.se/
数据库提供检索工具，在此可以输入蛋白质序列。应用数据库的默认参数，对蛋白质序列中Pfam结构域的存在进行分析。GDSX结构域是在数据库中已建立的结构域，因此任何查询序列中存在的该结构域可以得到识别。数据库将返回Pfam00657共有序列与查询序列的比对。
多重比对，包括杀鲑气单胞菌或嗜水气单胞菌可以通过下列方法获得。
a)手工方法
通过上述程序，可获得目的蛋白与Pram00657共有序列的比对并获得P10480序列与Pfam00657共有序列的比对；
b)通过数据库
在鉴定Pfam00657共有序列之后，数据库提供选项显示查询序列与Pfam00657共有序列的种子比对(seed alignment)，P10480是该种子比对的一部分，且表示为GCAT_AERHY。查询序列和P10480都将在同一窗口显示。
嗜水气单胞菌参比序列：
嗜水气单胞菌GDSX脂酶的残基在NCBI文件P10480中进行编号，所述文本中的编号是指由该文件给出的编号，在本发明中它用来确定具体的氨基酸残基，所述具体的氨基酸残基在优选实施方案中，存在于本发明的脂质酰基转移酶中。
进行Pfam比对(图33和34)：
下列保守的残基可被识别，并且在优选的实施方案中其可存在于用于本发明的组合物和方法的酶中。
1区-GDSX区
hid hid hid hid Gly Asp Ser hid
28  29  30  31  32  33  34  35
2区-GANDY区
hid Gly hid Asn Asp hid
130 131 132 133 134 135
3区-HPT区
His
309
其中′hid′是指选自Met、Ile、Leu、Val、Ala、Gly、Cys、His、Lys、Trp、Tyr或Phe的疏水残基。
优选地，应用于本发明的组合物/方法中的脂质酰基转移酶可用Pfam00657共有序列进行比对。
优选地，与pfam00657结构域家族的隐藏markov模型图谱(HMM图谱)的阳性匹配表明本发明中的GDSL或GDSX结构域的存在。
优选地，当与Pfam00657共有序列比对时，应用于本发明的组合物/方法中的脂质酰基转移酶含有至少一个，优选一个以上，优选两个以上下列区域，GDSx区、GANDY区、HPT区。适宜地，脂质酰基转移酶含有GDSx区和GANDY区。或者，所述酶含有GDSx区和HPT区。优选地，所述酶含有至少一个GDSx区。
优选地，GANDY基序的残基选自GANDY、GGNDA、GGNDL，更优选GANDY。
优选地，当与Pfam00657共有序列比对时，应用于本发明的组合物/方法中的酶与参照嗜水气单胞菌多肽序列即SEQ ID No.32比较时含有至少一个，优选一个以上，优选两个以上，优选三个以上，优选四个以上，优选五个以上，优选六个以上，优选七个以上，优选八个以上，优选九个以上，优选十个以上，优选十一个以上，优选十二以上，优选十三以上，优选十四个以上下列氨基酸残基：28hid、29hid、30hid、31hid、32gly、33Asp、34Ser、35hid、130hid、131Gly、132hid、133Asn、134Asp、135hid、309His。
pfam00657GDSX结构域是将具有该区域蛋白与其它酶区分的独特标识。
Pfam00657共有序列，表示为图1的SEQ ID No.1。这是从第6版数据库Pfam00657家族的鉴定衍生出来的，本文也称其为pfam00657.6。
共有序列可通过新版Pfam数据库来更新。
例如，图33和34显示第11版数据库中00657家族的pfam比对，本文也称其为pfam00657.11。
发现两个版本的数据库中Pfam00657家族中都存在GDSx区、GANDY区和HPT区。其他版本的pfam数据库可用来鉴定pfam00657家族。
优选地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以用下列标准来表征：
(i)该酶具有酰基转移酶活性(可定义为酯转移活性)，由此将脂质酰基供体的原始酯键上的酰基部分转移到酰基受体上形成新酯；
(ii)该酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是一种或多种下列氨基酸残基：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S；
(iii)该酶包含His-309或包含对应于图2(SEQ ID No.2或SEQ ID No.32)所示的嗜水气单胞菌脂解酶中的His-309位的组氨酸残基。
优选地，GDSX基序的氨基酸残基是L。
在SEQ ID No.2或SEQ ID No.32中，前18个氨基酸残基形成信号序列。全长序列(包含信号序列的蛋白质)的His-309，等同于该蛋白质成熟部分(即不含有信号序列的序列)中的His-291。
优选地，本发明所述的脂质酰基转移酶包括下列催化三联体：Ser-34、Asp-306和His-309或者包含位置分别对应于图2(SEQ ID No.2)或图28(SEQID No.32)所示的嗜水气单胞菌脂解酶中Ser-34、Asp-306和His-309的丝氨酸残基、天冬氨酸残基和组氨酸残基。如上所述，在SEQ ID No.2或SEQ IDNo.32所示序列中，前18个氨基酸残基形成信号序列。全长序列(包含信号序列的蛋白质)的Ser-34、Asp-306和His-309，等同于蛋白质成熟部分(即不含有信号序列的序列)的Ser-16、Asp-288和His-291。在图1(SEQ ID No.1)所示的Pfam00657共有序列中，活性位点残基对应于Ser-7、Asp-345和His-348。
优选地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以用下列标准来表征：
(i)该酶具有酰基转移酶活性(可定义为酯转移活性)，由此将第一脂质酰基供体原始酯键上的酰基部分转移到酰基受体形成新酯；并且
(ii)该酶包含至少Gly-32、Asp-33、Ser-34、Asp-306和His-309或者包含位置分别对应于图2(SEQ ID No.2)或图28(SEQ ID No.32)所示的嗜水气单胞菌脂解酶中Gly-32、Asp-33、Ser-34、Asp-306和His-309的甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸残基。
适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以获自于，优选获自于来自以下一个或多个属的生物体：气单胞菌属(Aeromonas)、链霉菌属(Streptomyces)、酵母菌属(Saccharomyces)、乳球菌属(Lactococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、脱亚硫酸菌属(Desulfitobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弧菌属(Vibrionaceae)、木杆菌属(Xylella)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、曲霉属(Aspergillus)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、李斯特菌属(Listeria)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、黄单胞菌属(Xanthomonas)和假丝酵母属(Candida)。
适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以获自于，优选获自于以下一种或多种生物体：嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)、分枝杆菌(Mycobacterium)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、脱卤脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium dehalogenans)、芽孢杆菌(Bacillus sp)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、弧菌(Vibrionaceae)、苛养木杆菌(Xylellafastidiosa)、硫磺矿硫叶菌(Sulfolobus solftaricus)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、土曲霉(Aspergillus terreus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)。
一方面，优选地，本发明中的脂质酰基转移酶可以获自于，优选获自于嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌中的一种或多种。
适宜地，本发明的脂质酰基转移酶可以由以下任何一种核苷酸序列所编码：
(a)SEQ ID No.7所示的核苷酸序列(见图9)；
(b)SEQ ID No.8所示的核苷酸序列(见图10)；
(c)SEQ ID No.9所示的核苷酸序列(见图11)；
(d)SEQ ID No.10所示的核苷酸序列(见图12)；
(e)SEQ ID No.11所示的核苷酸序列(见图13)；
(f)SEQ ID No.13所示的核苷酸序列(见图15)；
(g)SEQ ID No.21所示的核苷酸序列(见图17)；
(h)SEQ ID No.23所示的核苷酸序列(见图19)；
(i)SEQ ID No.25所示的核苷酸序列(见图21)；
(j)SEQ ID No.27所示的核苷酸序列(见图23)；
(k)SEQ ID No.29所示的核苷酸序列(见图25)；
(l)SEQ ID No.31所示的核苷酸序列(见图27)；
(m)SEQ ID No.33所示的核苷酸序列(见图29)；
(n)SEQ ID No.35所示的核苷酸序列(见图31)；
(o)SEQ ID No.46所示的核苷酸序列(见图95)；
(p)SEQ ID No.75所示的核苷酸序列(见图87)；
(q)SEQ ID No.77所示的核苷酸序列(见图89)；
(r)SEQ ID No.78所示的核苷酸序列(见图90)；
(s)SEQ ID No.81所示的核苷酸序列(见图93)；
(t)SEQ ID No.83所示的核苷酸序列(见图37)；
(u)SEQ ID No.87所示的核苷酸序列(见图99)；
(v)SEQ ID No.88所示的核苷酸序列(见图100)；或者
(w)与SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.21、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQ ID No.29、SEQ ID No.31、SEQ ID No.33、或SEQ IDNo.35、SEQ ID No.46、SEQ ID No.75、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQID No.81、SEQ ID No.83、SEQ ID No.87或SEQ ID No.88所示的任一序列有70％或者更高同一性，优选75％或者更高同一性的核苷酸序列。
适宜地，可以对由SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.21、SEQ ID No.23、SEQID No.25、SEQ ID No.27、SEQ ID No.29、SEQ ID No.31、SEQ ID No.33、SEQ ID No.35、SEQ ID No.46、SEQ ID No.75、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.81、SEQ ID No.83、SEQ ID No.87或SEQ ID No.88所示任一核苷酸序列编码的脂质酰基转移酶，或者由与SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.21、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQ ID No.29、SEQ IDNo.31、SEQ ID No.33、SEQ ID No.35、SEQ ID No.46、SEQ ID No.75、SEQID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.81、SEQ ID No.83、SEQ ID No.87或SEQ ID No.88所示任一核苷酸序列具有70％或更高，优选75％或更高同一性的核苷酸序列编码的脂质酰基转移酶进行转录后修饰和/或翻译后修饰。
适宜地，核苷酸序列可与SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.21、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQ ID No.29、SEQ ID No.31、SEQ ID No.33、SEQ ID No.35、SEQ ID No.46、SEQ ID No.75、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.81、SEQ ID No.83、SEQ ID No.87或SEQ ID No.88所示任一序列具有80％或更高，优选85％或更高，更优选90％或更高，且更优选95％或更高的同一性。
在一个实施方案中，编码用于本发明方法和应用的脂质酰基转移酶的核苷酸序列是与如下所示任一序列具有70％或更高，优选75％或更高同一性的核苷酸序列：SEQ ID No.88、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.33、and SEQ ID No.34。适宜地，所述核苷酸序列与如下所示任一序列具有80％或更高，优选85％或更高，更优选90％或更高，且更优选95％或更高的同一性：SEQ ID No.88、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.33、and SEQID No.34。
在一个实施方案中，编码用于本发明方法和应用的脂质酰基转移酶的核苷酸序列是与SEQ ID No.88所示任一序列具有70％或更高，75％或更高，80％或更高，优选85％或更高，更优选90％或更高，且更优选95％或更高同一性的核苷酸序列。
适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以包含一个或多个下列氨基酸序列：
(i)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列(见图2)；
(ii)SEQ ID No.3所示的氨基酸序列(见图3)；
(iii)SEQ ID No.4所示的氨基酸序列(见图4)；
(iv)SEQ ID No.5所示的氨基酸序列(见图5)；
(v)SEQ ID No.6所示的氨基酸序列(见图6)；
(vi)SEQ ID No.12所示的氨基酸序列(见图14)；
(vii)SEQ ID No.20所示的氨基酸序列(见图16)；
(viii)SEQ ID No.22所示的氨基酸序列(见图18)；
(ix)SEQ ID No.24所示的氨基酸序列(见图20)；
(x)SEQ ID No.26所示的氨基酸序列(见图22)；
(xi)SEQ ID No.28所示的氨基酸序列(见图24)；
(xii)SEQ ID No.30所示的氨基酸序列(见图26)；
(xiii)SEQ ID No.32所示的氨基酸序列(见图28)；
(xiv)SEQ ID No.34所示的氨基酸序列(见图30)；
(xv)SEQ ID No.62所示的氨基酸序列(见图74)；
(xvi)SEQ ID No.90所示的氨基酸序列(见图102)；或
与SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.34、SEQ IDNo.62或SEQ ID No.90所示任一序列具有75％或更高同一性的氨基酸序列。
适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以包含SEQ ID No.2或SEQ IDNo.3或SEQ ID No.32或SEQ ID No.34或SEQ ID No.62或SEQ ID No.90所示的氨基酸序列，或者可以包含与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或SEQID No.3所示的氨基酸序列或SEQ ID No.32所示的氨基酸序列或SEQ ID No.34所示的氨基酸序列具有75％或更高，优选80％或更高，优选85％或更高，优选90％或更高，优选95％或更高同一性的氨基酸序列。
为本发明的目的，同一性的程度基于相同序列元素的数目。本发明的氨基酸序列的同一性程度可通过本领域已知计算机程序，诸如Vector NTI 10(Invitrogen Corp.)适宜地测定。利用下列设置进行多肽序列比较：GAP生成罚分3.0和GAP延伸罚分0.1。对于成对比对，所用的评分优选为空位开放罚分为10.0、空位延伸罚分为0.1的BLOSUM62。
适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶包含这样的氨基酸序列，其与SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32或SEQ ID No.34所示的任一序列具有80％或更高，优选85％或更高，更优选90％或更高，还更优选95％或更高的同一性。
适宜地，本发明的脂质酰基转移酶在进行翻译后修饰之前可包含SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQ ID No.26、SEQID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.34或SEQ ID No.62中的一个或多个序列。本发明还包括已经过翻译后修饰的脂质酰基转移酶的应用，其中原始翻译的酶或酶前体包含SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.20、SEQ IDNo.22、SEQ ID No.24、SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQID No.32、SEQ ID No.34或SEQ ID No.62中的一个或多个序列。
在一个实施方案中，本发明的脂质酰基转移酶可以是以下一个或多个氨基酸序列SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.34、SEQ ID No.62或SEQ ID No.90的片段。在一个实施方案中，在分别与SEQID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQID No.12、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.34、SEQ ID No.62或SEQ ID No.90所示序列的全长比较进行测定时，优选所述氨基酸序列片段与SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.34、SEQ ID No.62或SEQ ID No.90所示任一序列具有70％或更高，优选75％或更高的同一性。
在一个实施方案中，本发明的脂质酰基转移酶适宜地包含SEQ ID No.90所示的氨基酸序列或者由SEQ ID No.90所示的氨基酸序列组成，或者包含与SEQ ID No.90具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％同一性的氨基酸序列或者由与SEQ ID No.90具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％同一性的氨基酸序列组成。
适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶包含下列氨基酸序列中的一个或多个：
(a)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的1-100氨基酸残基所示的氨基酸序列；
(b)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的101-200氨基酸残基所示的氨基酸序列；
(c)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的201-300氨基酸残基所示的氨基酸序列；或
(d)与上述(a)-(c)定义的任意氨基酸序列有75％或更高，优选85％或更高，更优选90％或更高，还更优选95％或更高同一性的氨基酸序列。
适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶包含下列氨基酸序列中的一个或多个：
(a)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基28-39所示的氨基酸序列；
(b)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基77-88所示的氨基酸序列；
(c)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基126-136所示的氨基酸序列；
(d)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基163-175所示的氨基酸序列；
(e)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基304-311所示的氨基酸序列；或
(f)与上述(a)-(e)定义的任意氨基酸序列有75％或更高，优选85％或更高，更优选90％或更高，甚至更优选95％或更高同一性的氨基酸序列。
一方面，用于本发明方法和应用的脂质酰基转移酶可以是来自如EP 1275711教导的近平滑假丝酵母的脂质酰基转移酶。因此，一方面，用于本发明方法和应用的脂质酰基转移酶可以是包含SEQ ID No.63或SEQ ID No.64所示氨基酸序列之一的脂质酰基转移酶。
优选地，用于本发明方法和应用的脂质酰基转移酶可以是包含SEQ IDNo.62所示氨基酸序列，SEQ ID No.90所示氨基酸序列，或者与SEQ ID No.62或SEQ ID No.90具有75％或更高，优选85％或更高，更优选90％或更高，更优选95％或更高，更优选98％或更高，或甚至更优选99％或更高同一性的氨基酸序列。此酶可被视为酶变体。
一方面，本发明所述的脂质酰基转移酶可以为卵磷脂:胆固醇酰基转移酶(LCAT)或其变体(例如分子进化产生的变体)。
适宜的LCAT是本领域已知的，可以获自于一种或多种以下生物体，例如：哺乳动物、大鼠、小鼠、小鸡、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、植物，包括拟南芥(Arabidopsis)和稻(Oryza sativa)、线虫、真菌和酵母。
用于本发明方法的高优选脂质酰基转移酶(具体为磷脂甘油酰基转移酶)包括从气单胞菌菌种，优选嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌，最优选从杀鲑气单胞菌分离的那些。用于本发明的最优选脂质酰基转移酶是由SEQ ID No.2、3、32、34、62或90之一编码。本领域技术人员可理解，优选在转移酶表达期间切除酰基转移酶的信号肽。SEQ ID No.2、3、32、34、62和90的信号肽是第1-18位氨基酸。因此，最优选区域为SEQ ID No.32和SEQ ID No.2(嗜水气单胞菌)的第19-335位氨基酸，以及SEQ ID No.34、SEQ ID No.62和SEQ ID No.90(杀鲑气单胞菌)的第19-336位氨基酸。在用于确定氨基酸序列同一性的同源性时，优选使用成熟序列进行本文所述的比对。所述成熟序列可以是去除信号肽的序列和/或已进行翻译后修饰的序列。
因此，确定同源性(同一性)的最优选区域为SEQ ID No.32和SEQ ID No.2(嗜水气单胞菌)的第19-335位氨基酸，以及SEQ ID No.3、SEQ ID No.34和SEQ ID No.62(杀鲑气单胞菌)的第19-336位氨基酸。SEQ ID No.73和74分别为来自嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌的高优选脂质酰基转移酶的“成熟”(即不带信号肽)的蛋白序列。SEQ ID No.73和74可进一步进行或不进行翻译后修饰。
用于本发明的脂质酰基转移酶还可分离自喜热裂孢菌(Thermobifida)，优选为褐色喜热裂孢菌(T.fusca)，最优选由SEQ ID No.67编码。
用于本发明的脂质酰基转移酶还可分离自链霉菌属，优选为阿维链霉菌(S.avermitis)，最优选由SEQ ID No.71编码。用于本发明的来自链霉菌的其它可能的酶包括由SEQ ID No.4、5、20、22、24、26、28、30、70、72编码的那些酶。
用于本发明的酶也可以分离自棒状杆菌属(Corynebacterium)，优选为C.efficiens，最优选由SEQ ID No.68编码。
适合地，用于本发明方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含SEQID No.76、77、79、80、82、84或86所示的任一氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶，或可以由SEQ ID No.75、78、81、83、85或87所示的任一核苷酸序列所编码，或由与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列所编码。
在一个实施方案中，用于本发明方法和/或应用中的脂质酰基转移酶优选由选自以下组成的组的核酸编码：
a)包含SEQ ID No.75所示的核苷酸序列的核酸；
b)由于遗传密码简并性而与SEQ ID No.75的核苷酸序列相关的核酸；和
c)包含与SEQ ID No.75所示的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的核酸。
在一个实施方案中，用于本发明方法和/或应用中的脂质酰基转移酶优选为包含SEQ ID No.76所示的氨基酸序列或与其具有至少60％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
在另一个实施方案中，用于本发明方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含SEQ ID No.76、77、79、80、82、84或86所示的任一氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶，或由SEQ ID No.78、81、83、85或87所示的任一核苷酸序列所编码，或由与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列所编码。
在另一实施方案中，用于本发明方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含SEQ ID No.77、79、80、84或86所示的任一氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶，以用于本发明所述的应用。
在另一实施方案中，用于本发明方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含SEQ ID No.77、79或86所示的任一氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列脂质酰基转移酶，以用于本发明所述的应用。
更优选地，在一个实施方案中，用于本发明方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含SEQ ID No.86所示的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
在另一实施方案中，用于本发明方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含SEQ ID No.82或83所示的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
在另一实施方案中，用于本发明方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含SEQ ID No.80所示的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
在一个实施方案中，用于本发明方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以由选自以下组成的组的核酸编码：
a)包含SEQ ID No.75所示核苷酸序列的核酸；
b)由于遗传密码简并性而与SEQ ID No.75的核苷酸序列相关的核酸；和
c)包含与SEQ ID No.75所示的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的核酸。
适合用于本发明的应用和/或本发明的方法的脂质酰基转移酶可包含任一以下氨基酸序列和/或由以下核苷酸序列编码：
编码本发明脂质酰基转移酶的多核苷酸(SEQ ID No.62)；
本发明脂质酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No.63)；
编码本发明脂质酰基转移酶的多核苷酸(SEQ ID No.90)。
也可使用Align X(使用默认设置的VectorNTI的Clustal W成对比对算法)通过与L131(SEQ ID No.76)序列的比对而鉴定的适合用于本发明方法和/或应用中的脂质酰基转移酶。
L131与来自灰色链霉菌(S.avermitilis)和褐色喜热裂孢菌的同源物的比对说明了GDSx基序(L131以及灰色链霉菌和褐色喜热裂孢菌中为GDSY)、GANDY框(其为GGNDA或GGNDL)和HPT区(被认为是保守的催化组氨酸)的保守性。这三个保守区突出标记在图103中。
与pfam Pfam00657共有序列和/或本文公开的L131序列(SEQ ID No.76)比对时，可以鉴定出三个保守区，GDSx区、GANDY区和HTP区。
与pfam Pfam00657共有序列和/或本文公开的L131序列(SEQ ID No.76)比对时，
i)本发明的脂质酰基转移酶，或用于本发明方法的脂质酰基转移酶优选具有GDSx基序，更优选为选自GDSL或GDSY基序的GDSx基序；和/或
ii)本发明的脂质酰基转移酶，或用于本发明方法的编码脂质酰基转移酶优选具有GANDY区，更优选包含氨基酸GGNDx(更优选为GGNDA或GGNDL)的GANDY区；和/或
iii)本发明的酶，或用于本发明方法的酶优选具有HTP区；
和优选地，
iv)本发明的脂质酰基转移酶，或用于本发明方法的脂质酰基转移酶优选具有GDSx或GDSY基序，和包含氨基酸GGNDx(优选为GGNDA或GGNDL)的GANDY区，和HTP区(保守的组氨酸)的脂质酰基转移酶。
脂质酰基转移酶变体
在优选的实施方案中，所述脂质酰基转移酶是脂质酰基转移酶变体。WO2005/066347中描述了生产用于本发明的脂质酰基转移酶的适合方法。可以使用对磷脂的活性增加的变体，如对磷脂的水解活性增加和/或转移酶活性增加的变体，优选为对磷脂的转移酶活性增加的变体。
优选地，通过如上定义的脂质酰基转移酶的一个或多个氨基酸修饰来制备所述脂质酰基转移酶变体。
适合地，当用于本发明方法和应用中的脂质酰基转移酶可以为脂质酰基转移酶变体时，在此情况下，所述酶的特征可以为所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S中的一种或多种，且其中所述酶变体与亲本序列相比在第2组、第4组、第6组或第7组(如WO2005/066347和下文所定义)限定的一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸修饰。
例如，脂质酰基转移酶变体可以被表征为所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S，且其中酶变体与亲本序列相比在第2组、第4组、第6组或第7组(如WO2005/066347和下文所定义)限定的一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述组是通过所述亲本序列与本文定义的P10480结构模型的结构比对而鉴定出来的，其优选是通过P10480晶体结构等同物(crystal structure coordinates)与如WO2005/066347和下文所定义的1IVN.PDB和/或1DEO.PDB的结构比对而获得的。
在另一个实施方案中，用于本发明方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是脂质酰基转移酶变体，其可以被表征为所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S，且其中酶变体与亲本序列相比在第2组所教导的一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸修饰，所述第2组是在将所述亲本序列与pfam共有序列(SEQ ID No.1-图2)比对时被鉴定出来的，并根据P10480的结构模型进行修饰以确保如WO2005/066347和下文所定义的最佳匹配重叠(best fit overlap)。
适合地，所述脂质酰基转移酶变体可以包含氨基酸序列，其中所述氨基酸序列如SEQ ID No.73、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.65、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.34、SEQ ID No.36、SEQ ID No.89、SEQ ID No.66、SEQ IDNo.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.71或SEQ ID No.72所示，但在通过与SEQ ID No.73的序列比对而鉴定出来的第2组、第4组、第6组或第7组(如WO2005/066347和下文所定义)限定的一个或多个氨基酸残基处有一个或多个氨基酸修饰，所述组是。
或者，所述脂质酰基转移酶变体可以是包含以下氨基酸序列的酶变体，其中所述氨基酸序列如SEQ ID No.73、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.65、SEQ IDNo.22、SEQ ID No.24、SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQID No.32、SEQ ID No.34、SEQ ID No.36、SEQ ID No.89、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.71或SEQ ID No.72所示，并在如WO2005/066347和下文所定义的第2组、第4组、第6组或第7组限定的一个或多个氨基酸残基处有一个或多个氨基酸修饰，所述组是通过所述亲本序列与本文定义的P10480的结构模型的结构比对而鉴定出来的，其优选是通过P10480晶体结构等同物与如WO2005/066347和下文所教导的1IVN.PDB和/或1DEO.PDB的结构比对而获得的。
或者，所述脂质酰基转移酶变体可以是包含以下氨基酸序列的酶变体，其中所述氨基酸序列如SEQ ID No.73、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.89、SEQ IDNo.22、SEQ ID No.24、SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQID No.32、SEQ ID No.34、SEQ ID No.36、SEQ ID No.89、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.71或SEQ ID No.72所示，但在第2组所教导的一个或多个氨基酸残基处有一个或多个氨基酸修饰，所述第2组是在将所述亲本序列与pfam共有序列(SEQ ID No.1)比对时被鉴定出来的，并根据P10480的结构模型进行修饰以确保如WO2005/066347和下文所教导的最佳匹配重叠。
优选地，所述亲本酶是包含SEQ ID No.73和/或SEQ ID No.34和/或SEQID No.74所示氨基酸序列或与它们同源的酶。
优选地，所述酶变体是包含以下氨基酸序列的酶，其中所述氨基酸序列如SEQ ID No.73或SEQ ID No.74所示，但在如WO2005/066347和下文所定义的第2组、第4组、第6组或第7组限定的任意一个或多个氨基酸残基处有一个或多个氨基酸修饰。
组的定义
第1组氨基酸：
第1组氨基酸(注意这些是图53和图54的1IVN中的氨基酸)
Gly8、Asp9、Ser10、Leu11、Ser12、Tyr15、Gly44、Asp45、Thr46、Glu69、Leu70、Gly71、Gly72、Asn73、Asp74、Gly75、Leu76、Gln106、Ile107、Arg108、Leu109、Pro110、Tyr113、Phe121、Phe139、Phe140、Met141、Tyr145、Met151、Asp154、His157、Gly155、Ile156、Pro158
高度保守的基序，如GDSx和催化残基从第1组中取消选定(标有下划线的残基)。为了避免争议，第1组定义了在1IVN模型活性位点中的甘油中心碳原子
Figure GPA00001103919300361
以内的氨基酸残基。
第2组氨基酸：
第2组氨基酸(注意氨基酸的编号是指P10480成熟序列中的氨基酸)
Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289和Val290。
第1组中所选残基与第2组的比较表
Figure GPA00001103919300362
Figure GPA00001103919300371
第3组氨基酸：
第3组氨基酸与第2组相同，但是是指杀鲑气单胞菌(SEQ ID No.3)的编码序列，即第3组中的氨基酸残基编号要大18，这反映了成熟蛋白(SEQ ID No.73)与包含信号序列的蛋白(SEQ ID No.36)中氨基酸编号之间的差异。
杀鲑气单胞菌GDSX(SEQ ID No.3)和嗜水气单胞菌GDSX(SEQ ID No.73)的成熟蛋白有五个氨基酸不同。它们是Thr3Ser、Gln182Lys、Glu309Ala、Ser310Asn、Gly318-，其中杀鲑气单胞菌的残基列在前面，而嗜水气单胞菌的残基列在后面。嗜水气单胞菌蛋白的长度只有317个氨基酸，且在第318位上缺少残基。与嗜水气单胞菌蛋白相比，杀鲑气单胞菌GDSX对极性脂(如半乳糖脂底物)具有相当高的活性。对全部五个氨基酸位置进行了位点扫描。
第4组氨基酸：
第4组氨基酸是S3、Q182、E309、S310和-318。
第5组氨基酸：
F13S、D15N、S18G、S18V、Y30F、D116N、D116E、D157N、Y226F、D228N、Y230F。
第6组氨基酸：
第6组氨基酸是Ser3、Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Gln182、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、Val290、Glu309、Ser310、-318。
第6组中的氨基酸的编号是指P10480(SEQ ID No.36)中的氨基酸残基，其它序列骨架上的相应氨基酸可以通过与P10480和/或1IVN的同源比对和/或结构比对来确定。
第7组氨基酸：
第7组氨基酸是Ser3、Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Gln182、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lvs284、Met285、Gln289、Val290、Glu309、Ser310、-318、Y30X(其中X选自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W)、Y226X(其中X选自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W)、Y230X(其中X选自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W)、S18X(其中X选自A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W或Y)、D157X(其中X选自A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y)。
第7组中氨基酸的编号是指P10480(SEQ ID No.36)中的氨基酸残基，其它序列骨架上的相应氨基酸可以通过与P10480和/或1IVN的同源比对和/或结构比对来确定。
适合地，与亲本酶相比，所述酶变体包含一种或多种以下氨基酸修饰：
S3E、A、G、K、M、Y、R、P、N、T或G
E309Q、R或A，优选为Q或R
-318Y、H、S或Y，优选为Y。
优选地，GDSX基序的X是L。因此，优选所述亲本酶包含氨基酸基序GDSL。
适合地，所述第一亲本脂质酰基转移酶可以包含任何一种以下氨基酸序列：SEQ ID No.73、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.65、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ IDNo.34、SEQ ID No.36、SEQ ID No.89、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.71或SEQ ID No.72。
适合地，所述第二相关脂质酰基转移酶可以包含任何一种以下氨基酸序列：SEQ ID No.2、SEQ ID No.73、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.65、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ IDNo.34、SEQ ID No.36、SEQ ID No.89、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.71或SEQ ID No.72。
与所述亲本酶相比，所述酶变体必须包含至少一个氨基酸修饰。在一些实施方案中，与亲本酶相比，所述酶变体可以包含至少2个，优选为至少3个，优选为至少4个，优选为至少5个，优选为至少6个，优选为至少7个，优选为至少8个，优选为至少9个，优选为至少10个氨基酸修饰。
当在本文中提及具体的氨基酸残基时，可以从序列变体与SEQ ID No.73或SEQ ID No.74所示的参考序列的比对获得编号。
一方面，优选酶变体包含一种或多种以下氨基酸取代：
S3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y；和/或
L17A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
S18A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W或Y；和/或
K22A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
M23A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Y30A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或
G40A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
N80A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
P81A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
K82A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
N87A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
N88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
W111A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
V112A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；和/或
A114C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Y117A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或
L118A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
P156A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
D157A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
G159A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Q160A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y；和/或
N161A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
P162A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
S163A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y；和/或
A164C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
R165A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y；和/或
S166A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y；和/或
Q167A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y；和/或
K168A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
V169A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；和/或
V170A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；和/或
E171A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
A172C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Y179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或
H180A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
N181A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Q182A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y，优选为K；和/或
M209A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
L210A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
R211A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
N215A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Y226A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或
Y230A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或
K284A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
M285A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Q289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y；和/或
V290A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；和/或
E309A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
S310A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y。
此外或可选地，可以有一个或多个C末端延伸。优选地，所述附加的C末端延伸由一个或多个脂肪族氨基酸构成，优选为非极性氨基酸，更优选为I、L、V或G。因此，本发明进一步提供包含以下C末端延伸中的一个或多个的酶变体：318I、318L、318V、318G。
优选的酶变体可以具有降低的对磷脂如磷脂酰胆碱(PC)的水解活性，还可具有升高的对磷脂的转移酶活性。
优选的酶变体可以具有升高的对磷脂如磷脂酰胆碱(PC)的转移酶活性，也可以升高的对磷脂的水解活性。
一个或多个以下残基的修饰可以产生对磷脂的绝对转移酶活性升高的酶变体：S3、D157、S310、E309、Y179、N215、K22、Q289、M23、H180、M209、L210、R211、P81、V112、N80、L82、N88、N87。
可以提供对磷脂的转移酶活性改善的酶变体的优选具体修饰可以选自以下一种或多种：
S3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，优选为N、E、K、R、A、P或M，最优选为S3A；
D157A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为D157S、R、E、N、G、T、V、Q、K或C；
S310A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，优选为S310T、-318E；
E309A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，优选为E309R、E、L、R或A；
Y179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W，优选为Y179D、T、E、R、N、V、K、Q或S，更优选为E、R、N、V、K或Q；
N215A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为N215S、L、R或Y；
K22A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为K22E、R、C或A；
Q289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y，优选为Q289R、E、G、P或N；
M23A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为M23K、Q、L、G、T或S；
H180A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为H180Q、R或K；
M209A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为M209Q、S、R、A、N、Y、E、V或L；
L210A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为L210R、A、V、S、T、I、W或M；
R211A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y，优选为R211T；
P81A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为P81G；
V112A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y，优选为V112C；
N80A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；优选为N80R、G、N、D、P、T、E、V、A或G；
L82A、C、D、E、F、G、H、I、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为L82N、S或E；
N88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为N88C；
N87A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为N87M或G；
一个或多个以下残基的优选修饰产生对磷脂的绝对转移酶活性升高的酶变体：
S3N、R、A、G
M23K、Q、L、G、T、S
H180R
L82G
Y179E、R、N、V、K或Q
E309R、S、L或A。
一个优选的修饰是N80D。特别地，当使用参考序列SEQ ID No.74时更是如此。在本发明的优选实施方案中，本发明的脂质酰基转移酶可以包含SEQ ID No.74，或与SEQ ID No.74具有75％或更高，优选为85％或更高，更优选为90％或更高，更优选为95％或更高，更优选为98％或更高，或更优选为99％或更高同一性的氨基酸序列。
如上指出，当在本文中提及具体氨基酸残基时，其编号是通过序列变体与SEQ ID No.73或SEQ ID No.74所示的参考序列的比对获得的。
优选地，用于本发明的方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含SEQ ID No.62所示的氨基酸序列或SEQ ID No.90所示的氨基酸序列的脂质酰基转移酶，或包含与SEQ ID No.62和/或SEQ ID No.90具有75％或更高，优选为85％或更高，更优选为90％或更高，更优选为95％或更高，更优选为98％或更高，或更优选为99％或更高同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。该酶可以认为是酶变体。
为本发明的目的，同一性程度基于相同序列元素的数目。本发明的同一性的程度可通过本领域已知的计算机程序适宜地确定，例如GCG程序包(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，GeneticsComputer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，US53711)(Needleman&Wunsch(1970)，J.of Molecular Biology 48，443-45)中提供的GAP，其在多肽序列比较中使用以下设定：3.0的GAP生成罚分和0.1的GAP延伸罚分。适合地，关于氨基酸序列的同一性程度，在至少20个连续的氨基酸内，优选为至少30个连续的氨基酸内，优选为至少40个连续的氨基酸内，优选为至少50个连续的氨基酸内，优选为至少60个连续的氨基酸内进行测定。
适合地，用于本发明的脂质酰基转移酶和编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可获自于，优选获自于一种或多种以下属的生物：气单孢菌属、链霉菌属、酵母菌属、乳球菌属、分支杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、脱亚硫酸菌属、芽孢杆菌、弯曲菌属、弧菌属、木杆菌属、硫化叶菌属、曲霉属、裂殖酵母属、李斯特菌属、奈瑟氏球菌属、中慢生根瘤菌属、雷尔氏菌属、黄单胞菌属、念珠菌属、喜热裂孢菌属和棒状杆菌属。
适合地，用于本发明的脂质酰基转移酶和编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可获自于，优选获自于一种或多种以下生物：嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、龟裂链霉菌(Streptomycesrimosus)、分支杆菌、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、化脓性链球菌、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、Streptomyces thermosacchari、灰色链霉菌、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、脱卤脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium dehalogenans)、芽孢杆菌、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、弧菌、苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、土霉菌(Aspergillus terreus)、粟酒裂殖酵母、无害李斯特菌(Listeria innocua)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)、百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)、近平滑假丝酵母、褐色喜热裂孢菌和Corynebacterium efficiens。
一方面，优选用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂质酰基转移酶可获自于，优选获自或来自于气单孢菌、嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌中的一种或多种。
优选地，当实施本发明的方法时，在不增加或基本不增加食品中的游离脂肪酸的情况下产生产品。
本文使用的术语“转移酶”与术语“脂质酰基转移酶”可以互换。
适宜地，本发明定义的脂质酰基转移酶催化下列一种或多种反应：酯交换作用(interesterification)，酯转移作用(transesterification)，醇解作用，水解作用。
术语“酯交换作用”指的是酰基在脂质供体与脂质受体之间的酶催化转移，其中的脂质供体不是游离的酰基。
本文术语“酯转移作用”指的是酰基从脂质供体(除外游离脂肪酸)上经酶催化转移到酰基受体(除外水)。
本发明使用的术语“醇解作用”指的是通过与醇ROH的反应酸衍生物的共价键的酶裂解，使得一产物与醇的H结合而另一产物与醇的OR基团结合。
本发明使用的术语“醇”指的是包含羟基的烷基化合物。
本发明使用的术语“水解作用”指的是酰基从脂质到水分子OH基团的酶催化转移作用。由水解作用引起的酰基转移作用需要水分子的分离。
本文使用的术语“不增加或基本不增加游离脂肪酸”指的是本发明的脂质酰基转移酶优选具有100％转移酶活性(即将100％的酰基从酰基供体转移到酰基受体，无水解活性)；但是此酶可将不到100％的存在于脂质酰基供体中的酰基转移到酰基受体。在这种情况下，优选的酰基转移酶活性占总酶活性的至少5％，更优选至少10％，更优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，并且更优选至少98％。％转移酶活性(即转移酶活性占总酶活性的百分比)可通过下列方案测定：
测定转移酶活性百分率的实验设计：
酶促反应后，可用CHCl3∶CH3OH 2∶1提取已添加本发明的脂质酰基转移酶的食品，分离包含脂质物质的有机相，并可根据在下文描述的详细步骤通过GLC和HPLC分析。通过GLC和HPLC的分析，确定游离脂肪酸和一种或多种甾醇/甾烷醇酯类；碳水化合物酯；蛋白质酯；甘油二酯；或单甘油酯的量。不添加本发明的酶的对照食品用同种方法分析。
计算：
从GLC和HPLC分析的结果可以计算出游离脂肪酸和/或甾醇/甾烷醇酯类和/或碳水化合物酯和/或蛋白质酯和/或甘油二酯和/或单甘油酯的增加量。
Δ％脂肪酸＝％脂肪酸(酶)-％脂肪酸(对照)；Mv脂肪酸＝脂肪酸平均分子量
A＝Δ％甾醇酯/Mv甾醇酯(其中Δ％甾醇酯＝％甾醇/甾烷醇酯(酶)-％甾醇/甾烷醇酯(对照)，Mv甾醇酯＝甾醇/甾烷醇酯的平均分子量)，这适用于酰基受体是甾醇和/或甾烷醇酯；
B＝Δ％碳水化合物酯/Mv碳水化合物酯(其中Δ％碳水化合物酯＝％碳水化合物酯(酶)-％碳水化合物酯(对照)，Mv碳水化合物酯＝碳水化合物酯平均分子量)，这适用于酰基受体是碳水化合物。
C＝Δ％蛋白质酯/Mv蛋白质酯(其中Δ％蛋白质酯＝％蛋白质酯(酶)-％蛋白质酯(对照)，Mv蛋白质酯＝蛋白质酯平均分子量)，这适用于酰基受体是蛋白；和
D＝甘油二酯和/或单甘油酯/Mv甘油二酯/单甘油酯的绝对值(其中Δ％甘油二酯和/或甘油单酯＝％甘油二酯和/或甘油单酯(酶)-％甘油二酯和/或甘油单酯(对照)，Mv甘油二酯/甘油单酯＝甘油二的酯和/或甘油单酯的平均分子量)，这适用于酰基受体是甘油。
转移酶活性以占总酶活性的百分率计算：
Figure GPA00001103919300481
*指适当时删除。
如果食品中的游离脂肪酸增加，优选它们基本不增加，即不达到显著水平。我们的意思是游离脂肪酸的增加不会负面影响食品质量。
本发明的一些方面，使用的术语“基本不增加游离脂肪酸”意思是用本发明脂质酰基转移酶处理过的食品或组合物中的游离脂肪酸量少于在已使用除本发明脂质酰基转移酶以外的酶时食品或化合物中产生的游离脂肪酸量，例如与已使用常规的磷脂酶如
Figure GPA00001103919300491
(Novozymes A/S，丹麦)时产生的游离脂肪酸含量进行比较。
本文术语“原位”意思是乳化剂和/或甾醇/甾烷醇酯类和/或碳水化合物酯和/或蛋白质酯和/或甘油单酯或甘油二酯在食品或食品级分中产生。这与以下情形相反：乳化剂和/或甾醇/甾烷醇酯类和/或碳水化合物酯和/或蛋白质酯和/或甘油单酯或甘油二酯与食品分开制备，并作为形成的产物在等同制备过程中添加到食品中。换句话说，本发明使用的术语“原位”意思是通过将本发明的脂质酰基转移酶添加到食品中，或加到构成所述食品的食物成分/材料中，乳化剂和/或甾醇/甾烷醇酯类和/或碳水化合物酯和/或蛋白质酯和/或甘油单酯或甘油二酯可从食品成分产生。食品中的成分可适宜为酶的底物。如有必要，食品中的成分可通过添加一种或多种与所述食品中的成分相同或与已存在于所述食品中的成分不同的成分而得到补充。为避免产生疑问，在一个实施方案中，本发明方法可以是一种在食品中原位产生乳化剂和/或甾醇酯和/或甾烷醇酯和/或碳水化合物酯和/或蛋白质酯和/或甘油单酯或甘油二酯的方法，而不是制备用于随后加到食品中的乳化剂和/或甾醇酯和/或甾烷醇酯(例如是分离和/或纯化的形式)的方法。
在另一实施方案中，脂酶酰基转移酶可在食物加工中使用，但并不保留于食品中。例如，脂酶酰基转移酶可以是固定化的，能够被再使用。
优选地，本发明的脂质酰基转移酶能在极性环境，优选含水环境，优选含水食品中将酰基从脂质转移到甾醇和/或甾烷醇和/或碳水化合物和/或蛋白和/或甘油。适宜的含水环境可以是水的缓冲液或可以是食品的含水相。本文的术语“含水环境”优选指这样的环境，其不存在有机溶剂，优选不存在极性有机溶剂，更为优选为不存在不可食用有机溶剂。术语“含水环境”具体指不添加外源性有机溶剂，优选不添加极性有机溶剂的环境。本文使用的术语有机溶剂不包括食物油，优选不包括含大量非极性脂质的食物油。在一个实施方案中术语有机溶剂应除外可食用有机溶剂，如乙醇、丙二醇和/或甘油。本发明适宜的含水环境可包含体积百分比小于80％的有机溶剂，体积百分比小于70％的有机溶剂，体积百分比小于50％的有机溶剂，体积百分比小于30％的有机溶剂，优选含体积百分比小于15％的有机溶剂，更优选含体积百分比小于5％的有机溶剂。适宜的食品应含1-5％的有机溶剂，如乙醇。但是，当食品中含有这样的有机溶剂时，优选在食品中内源生成它。这就是说，当食品中含有这样的有机溶剂时，优选的有机溶剂并非外源性有机溶剂。
本文使用的术语“食品”是指适于人和/或动物消费的物质。
适宜地，本文使用的术语“食品”可以指准备消费的形式的食品。然而，可选或者进一步，本文使用的术语“食品”也可以指一种或多种用于制备食品的食品材料。仅作为举例，术语食品包括由面团制作的烘焙食品以及制备上述烘焙食品所用的面团。另外举例而言，术语食品包含终产品，即例如最终的乳制品，例如干酪，以及例如用于制备所述乳制品(例如干酪)的乳(例如干酪用乳)、奶油和/或乳脂。
本文所用的术语“食品材料”是指食品制备中使用的一种或多种材料。术语食品在本文用于指食品材料，反之亦然。在一些实施方案中，例如所述食品材料可以是最终食品。仅举例而言，最终食品可以是食用油(例如烹饪油)，在这种情况下，所述食品材料也可以是食用油。在一些实施方案中，例如所述食品材料可以是最终食品的一种组分。仅举例而言，最终食品可以是乳制品，例如干酪，在这种情况下，所述食品材料可以是例如用于制备所述乳制品(例如干酪)的乳(例如干酪用乳)、奶油和/或乳脂。
当所述食品材料仅形成所述最终食品的一种组分时，例如在一些实施方案中，所述最终食品可包含小于10重量％，例如小于5重量％的所述食品材料。
在一些实施方案中，适宜地，所述最终食品可包含0.01-4重量％的所述食品材料。
在一些实施方案中，适宜地，所述最终食品可包含0.01-2重量％的所述食品材料。
在一些实施方案中，适宜地，所述最终食品可包含0.01-1重量％的所述食品材料。
在一些实施方案中，适宜地，所述最终食品可包含0.01-0.5重量％的所述食品材料。
在一些实施方案中，适宜地，所述最终食品可包含0.01-0.3重量％的所述食品材料。
优选的方面，本发明提供以上定义的食品，其中所述食品选自以下的一种或多种食品：蛋，基于蛋的产品，包括但不限于蛋黄酱、色拉调料、沙司(sauce)、冰淇淋、蛋粉、改良蛋黄及其制品；烘焙食品，包括面包、蛋糕、甜面制品(sweet dough product)、层状面点(laminated dough)、液态奶蛋糊(liquid batter)、松饼、油炸圈饼、饼干(biscuit)、薄脆饼干(cracker)和曲奇饼干；糖食(confectionary)，包括巧克力、糖果(candy)、焦糖(caramel)、halawa、胶皮糖(gum)，包括无糖胶皮糖和含糖甜胶皮糖、泡泡糖、软泡泡糖、口香糖和布丁；冷冻产品，包括冰糕(sorbet)，优选冷冻乳制品，包括冰淇淋、牛奶冰淇淋；乳制品，包括干酪、黄油、牛奶、稀奶油(coffee cream)、生奶油(whippedcream)、蛋奶羹(custard cream)、奶饮品和酸奶；慕思(mousse)、生植物奶油(whipped vegetable cream)、肉制品(包括加工的肉制品)；食用油和脂肪、充气和无气搅打的产品(aerated and non-aerated whipped product)、水包油乳液、油包水乳液、人造黄油、起酥油(shortening)以及涂抹物(spread)，包括低脂和极低脂涂抹物；调料(dressings)、蛋黄酱、蘸料(dip)、基于奶油的沙司(cream based sauce)、基于奶油的汤(cream based soup)、饮料、调味乳和沙司。
本发明合适的食品可以是一种“精制食品(fine foods)”，包括蛋糕、发面点心(pastry)、糖食、巧克力、法奇软糖(fudge)等。
本发明的食品的一方面可以是面团制品或烘焙产品，例如面包，油炸食品，小吃，蛋糕，馅饼，核仁巧克力饼(brownie)，曲奇，面条，小吃诸如薄脆饼干，全麦饼干(graham cracker)，脆饼干(pretzel)，薯片，意大利面(pasta)。
另一方面，本发明的食品可以是源自植物的食品制品，例如面粉、预混合物(pre-mix)、油、脂肪、可可脂、咖啡伴侣(coffee whitener)、色拉调料、人造黄油、涂抹物、花生酱、起酥油、冰淇淋、烹饪油。
另一方面，本发明所述食品可以是一种乳制品，包括黄油、奶、奶油、干酪，如天然的、经加工的和人造的干酪，它可以呈现多种形式(包括切碎的(shredded)、块状的(blocked)、薄片状的(sliced)、或搓碎状的(grated))、奶油干酪、冰淇淋、冷冻的甜点、酸奶、酸奶饮品、黄油脂肪、脱水奶脂肪、其它乳制品。本发明所述的酶能够提高乳制品中脂肪的稳定性。
本文所用术语“乳”可包含来自动物或植物源的乳。可能使用来自动物来源的乳，例如单独来自水牛(buffalo)、(传统)奶牛、绵羊、山羊等的乳或组合的乳。也可使用植物乳，例如豆乳。通常将植物乳与动物乳组合使用，例如以低百分数(植物乳)，例如低于15％，或低于20％，或低于25％v/v与动物乳组合使用。术语乳也可包含干酪用乳和奶油。本发明的优点之一是在与来自动物源的乳混合时，其有助于在干酪生产中加入较高浓度的豆乳。尽管不希望被理论束缚，但这可能是由于按本发明处理的豆乳的乳化性质造成的。
一方面，本发明的食品可以是冰淇淋。
一方面，本发明的食品可以是或包含干酪或干酪类似物。
在一个实施方案中，本发明涉及利用脂质酰基转移酶生产干酪的方法和/或脂质酰基转移酶在干酪生产中的用途。优选地，所述用途在干酪中产生本文教导的一种或多种技术效果。
在一些实施方案中，所述食品可适宜地为本发明食品的衍生物。仅举例而言，所述食品可以是包含本发明生产的干酪的披萨。
在本申请中，术语“干酪(cheese)”是指任何品种的干酪，例如天然干酪、干酪类似物或再制干酪(processed cheese)。可通过本领域已知的任何适合的方法获得干酪，例如通过使用凝乳酶(rennet)对干酪用乳和/或奶油进行酶促凝乳，或使用食品级酸或通过乳酸菌生产产生的酸对干酪用乳和/或奶油进行酸凝乳。
在一个实施方案中，通过本发明方法生产的干酪是凝乳酶凝乳酪(rennet-curd cheese)。凝乳酶可商购获得，例如为Naturene(动物凝乳酶)、Chy-maxe(发酵产生的凝乳酶)、Microlane(通过发酵产生的微生物凝乳剂)，均来自丹麦Chr.Hansen A/S)。可以对干酪用乳和/或奶油进行常规的干酪加工处理。
优选的凝乳剂是
Figure GPA00001103919300521
其为纯微生物凝乳剂，提供发酵产生的凝乳酶(FPC)优点，而不影响产量或口味。
优选通过蒸煮并例如使用乳化盐(例如磷酸盐和柠檬酸盐)乳化干酪，从而从天然干酪或干酪类似物制备再制干酪。此方法可进一步包括添加香料/调味料。
术语“干酪类似物”是指干酪样的产品，其包含作为其组成部分的脂肪(例如，乳脂(如奶油))，并且其还包含作为其组成部分的非乳组分，例如植物油。干酪类似物的实例为干酪基料(cheese base)。干酪类似物可包含豆乳或大豆蛋白。
通过本发明方法生产的干酪包括所有种类的干酪，例如Campesino、Chester、Danbo、Drabant、
Figure GPA00001103919300531
Manchego、Primativo、Provolone、SaintPaulin、Soft干酪(软干酪)、Svecia、Taleggio、White干酪(白干酪)，包括通过干酪凝块的凝乳酶凝乳产生的凝乳酶凝乳酪；成熟干酪，例如Cheddar、Colby、Edam、Muenster、Gryere、Emmenthal、Camembert、Parmesan和Romano；新鲜干酪，例如莫泽雷勒干酪(Mozzarella)和Feta；酸凝乳酪，例如奶油干酪，Neufchatel、Quarg、村舍式干酪(Cottage Cheese)和QuesoBlanco；和塑性凝乳干酪(pasta filata cheese)。
一个实施方案涉及通过本发明的方法生产比萨干酪。
在干酪制造过程中，优选通过两种方式进行乳中的酪蛋白的凝固：所谓的凝乳酶凝乳酪和酸凝乳酪。在干酪生产中，这两种凝乳方式产生了两种主要的干酪类型。新鲜的酸凝乳酪是指通过酸化或酸和热的组合使乳、奶油或乳清凝固而生产的各种干酪，其在生产后即可食用而无需完成成熟。新鲜的酸凝乳酪通常不同于凝乳酶凝乳酪类型(例如，Camembert、Cheddar、Emmenthal)，后者通常通过在pH 6.4-6.6下经凝乳酶的作用诱导凝固，而前者与后者的不同在于通常在接近酪蛋白等电点处发生凝固，即例如在pH 4.6或当使用加热时在更高的pH值发生凝固，例如对于Ricotta为pH 6.0和80℃。
在一个实施方案中，所述干酪属于凝乳酶凝乳酪。
莫泽雷勒干酪是所谓塑性凝乳干酪(pasta filata)或拉伸凝乳(stretched curd)干酪的成员，其区别通常在于通过将新鲜凝乳块在热水中进行独特的塑化和揉捏处理，这使最终的干酪具有纤维样结构，以及其熔化和拉伸性质的特点，参见，例如Paul S.Kindstedt，“Mozzarella and Pizza cheese”Cheese：Chemistry，physics and microbiology，Volume 2：Major Cheese groups，second edition，page337-341，Chapman&Hall。本文所用的“比萨干酪”包括适合用于披萨的干酪，并且其通常为塑性凝乳酪/拉伸凝乳酪。在一个实施方案中，本发明的方法还包括用于塑性凝乳干酪的热/拉伸处理，例如用于生产莫泽雷勒干酪。
在一个实施方案中，优选本发明的干酪为莫泽雷勒干酪。
在本发明的另一个实施方案中，完全或部分从干酪用乳组分，例如全脂奶粉、脱脂奶粉、酪蛋白、酪蛋白盐、总乳蛋白或酪乳粉或其任意组合制备干酪用乳。
在一个实施方案中，优选本发明的食品和/或食品材料是乳脂。
在一个实施方案中，特别是用本发明的脂质酰基转移酶处理的食品和/或食品材料为乳脂时，可将经酶处理的乳脂随后用于生产其他乳制品(特别是干酪)和/或人造黄油或涂抹物(包括低脂和极低脂的涂抹物)。
在一个实施方案中，可向乳(例如干酪用乳)和/或奶油中添加本发明所述的经酶处理乳脂，随后将其用于制备其他奶制品，例如干酪。
在另一个实施方案中，本发明的食品和/或食品材料是乳和/奶油。
在一个实施方案中，特别是用本发明的脂质酰基转移酶处理的食品和/或食品材料为乳(优选干酪用乳)和/或奶油时，可将经酶处理的乳脂随后用于生产其他乳制品(例如干酪、冰淇淋、冰冻的甜点、酸奶、酸奶饮品中的一种或多种，特别是干酪和/或冰淇淋)。
在一个实施方案中，所述食品由干酪食品构成或包含干酪食品，其中将所述干酪食品加热至高于所述干酪熔点的温度。本发明制备的干酪在加热食品中的应用能够使得干酪“溢油”效应减少。使用本发明制备的干酪或干酪产品也可获得有益的质构(texture)和风味优点。
本发明还涉及通过本发明方法生产的干酪在披萨、即食食品，例如烤宽面条或再制干酪中的应用，或作为其他食品组分的应用。因此，通过本发明方法生产的干酪可用于加工食品，例如再制干酪、披萨、汉堡、烤面包片、沙司、调味品、干酪粉或干酪香精。
在另一个实施方案中，本发明的方法还包括对根据本发明制备的干酪或包含所述干酪的食品进行热处理，例如在约150-350℃的范围，或约155-345℃的范围，或在约160-340℃的范围，或在约170-330℃的范围，或在约180-320℃的范围，或在约200-300℃的范围。所述热处理可适宜地为至少2分钟，例如至少5分钟，包括至少10分钟。
在本发明的一个方面，本发明生产的干酪的熔解温度与对照干酪(即没有使用脂质酰基转移酶生产的干酪)相比没有显著差别。
在本发明的另一方面，本发明生产的干酪具有与对照干酪(即没有使用脂质酰基转移酶生产的干酪)类似的或更好的质构和粘稠度(consistency)。
利用本发明制备干酪是特别有利的，因为干酪中的游离脂肪酸的产生与“肥皂”口味有关。因此，应用本发明的脂质酰基转移酶有利于制备出没有“肥皂”口味的干酪。
与本发明脂质酰基转移酶的应用相关的“肥皂”口味减少和/或不良风味和不良口感的减少提供与使用标准脂肪酶和/或磷脂酶(例如Lecitase)相比的显著优点。有利地，不良风味和不良口感的减少可以是在酶反应期间游离脂肪酸产生减少的结果。脂质酰基转移酶通过酶促作用从酰基供体去除的脂肪酸被转移到酰基受体分子上，因此不会在干酪中累积脂肪酸。
另一方面，本发明所述食品可以是含有动物来源的成分的食品，例如加工的肉制品、烹饪油、起酥油。
另一方面，本发明的食品可以是饮料、水果、水果混合物、蔬菜或葡萄酒。在一些情况下，所述饮料中可以含有最高达到20g/l的添加的植物甾醇。
另一方面，本发明的食品可以是动物饲料。该动物饲料可以富含植物甾醇类和/或植物甾烷醇，优选β-谷甾醇/甾烷醇。适宜地，该动物饲料可以是家禽饲料。当所述食品是家禽饲料时，本发明可以用于降低喂饲了本发明饲料的家禽所产的蛋中的胆固醇含量。
优选地，所述食品选自以下食品中的一种或多种：蛋、基于蛋的产品(包括蛋黄酱)、色拉调料、沙司、冰淇淋、蛋粉、改良蛋黄及其制品。
优选地，本发明的食品是含水食品。适宜地，所述食品可以含水10-98％，适宜地14-98％，适宜地18-98％，适宜地20-98％，适宜地40-98％，适宜地50-98％，适宜地70-98％，适宜地75-98％。
在一些方面，优选地，本发明的食品不是纯植物油，诸如橄榄油、葵花油、花生油、油菜籽油。为了避免产生疑问，在本发明的一些方面，本发明的食品可以含油，但是优选地，所述食品不主要地由油或油的混合物组成。对于本发明的一些方面，优选所述食品包含低于95％，优选低于90％，优选低于85％，优选低于80％的脂质。因此，对于本发明的一些方面，油可以是食品的组成成分，但优选所述食品本身不是油。
本发明的权利要求应包括上面列出的每一类食品。
当根据本发明产生碳水化合物酯时，优选所述碳水化合物酯是寡糖酯、单糖酯或二糖酯。
适宜地，当根据本发明产生碳水化合物酯时，碳水化合物酯可以是以下的一种或多种：葡萄糖酯、果糖酯、脱水果糖酯、麦芽糖酯、乳糖酯、半乳糖酯、木糖酯、木寡糖酯(xylooligosaccharide ester)、阿拉伯糖酯(arabinoseester)、麦寡糖酯(maltooligosaccharide ester)、塔格糖酯(tagatose ester)、蔗糖酯、microthecin酯、ascopyrone P酯、ascopyrone T酯、或cortalcerone酯。
根据本发明优选产生的碳水化合物酯是以下一种或者多种：碳水化合物单酯(carbohydrate mono-ester)、糖单酯(sugar mono-ester)、寡糖单酯、三糖单酯、二糖单酯、单糖单酯、葡萄糖单酯、果糖单酯、脱水果糖单酯、麦芽糖单酯、乳糖单酯、半乳糖单酯、木糖单酯、木寡糖单酯、阿拉伯糖单酯、麦寡糖单酯、塔格糖单酯、蔗糖单酯、microthecin酯、ascopyrone P酯、ascopyroneT酯、或cortalcerone酯。
在一个实施方案中，microthecin酯、ascopyrone P酯、ascopyrone T酯和/或cortalcerone酯可以作为抗微生物剂起作用。可选地或者进一步地，microthecin酯、ascopyrone P酯、ascopyrone T酯和/或cortalcerone酯可以作为抗氧化剂和/或乳化剂的一个或两个来起作用。
优选地，本发明碳水化合物酯的的形成(如果有的话)不依赖于UDP-葡萄糖。
优选地，本发明的食品不包含UDP-葡萄糖或仅仅包含不显著量的UDP-葡萄糖。
适宜地，本发明乳化剂可以例如是以下一种或多种：甘油二酯、甘油单酯诸如1-甘油单酯或溶血卵磷脂如溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine)，如二半乳糖基甘油单酯(DGMG)。所述乳化剂优选在从脂质酰基供体去除(remove)一或多个酰基后从所述脂质酰基供体产生。本文使用的术语溶血卵磷脂包含溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphatidylethanolamine)、溶血磷脂酰肌醇(lysophosphatidylinositol)、溶血磷脂酰丝氨酸(lysophosphatidylserine)和溶血磷脂酰甘油(lysophosphatidylglycerol)。
当乳化剂的一种是碳水化合物酯，那第二种乳化剂可以是以下举例的乳化剂中的一种或多种：甘油二酯、甘油单酯诸如1-甘油单酯、溶血磷脂酰胆碱、或二半乳糖基甘油单酯(DGMG)。第二乳化剂优选在从脂质酰基供体去除一或多个酰基后从所述脂质酰基供体产生。本文使用的术语溶血磷脂酰胆碱与术语溶血卵磷脂同义，而且在本申请中二者可以互相替代。
优选的第二乳化剂是DGMG。适宜地，DGMG是通过从DGDG去除酰基而原位产生的，且该去除的酰基转移至碳水化合物上形成碳水化合物酯。
当乳化剂的一种是蛋白质酯和/或甘油二酯和/或甘油单酯，则第二种乳化剂可以是例如以下乳化剂中的一种或多种：甘油二酯、甘油单酯诸如1-甘油单酯、溶血磷脂酰胆碱或二半乳糖基甘油单酯(DGMG)。第二乳化剂优选在从脂质酰基供体去除一或多个酰基后从所述脂质酰基供体产生。本文使用的术语溶血磷脂酰胆碱与溶血卵磷脂同义，而且在本申请中二者可以互相替代。
在一个实施方案中，本发明的脂质酰基转移酶可用于制备食品的方法中，所述食品例如烹饪(例如食用)油、人造黄油或涂抹物、乳脂(例如随后用于干酪和/或人造黄油和/或涂抹物)，其中所述食品天然地包含，或已经补充有甘油，和/或已经补充有至少一种磷脂(例如卵磷脂)和/或糖脂(例如二半乳糖基甘油二酯)，以及任选补充有植物甾醇或植物甾烷醇。
在一个实施方案中，本发明的脂质酰基转移酶可用于制备食品的方法中，所述食品例如人造黄油或涂抹物，其中所述食品天然地包含，或已经补充有甘油，和/或已经补充有至少一种磷脂(例如卵磷脂)和/或糖脂(例如二半乳糖基甘油二酯)，以及任选补充有植物甾醇或植物甾烷醇。
在一个实施方案中，本发明提供用于生产改进的食用油或脂肪(包括乳脂)的方法，所述改进的食用油或脂肪包含i)溶血磷脂和/或以下甘油磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷酯酰肌醇和磷酯酰丝氨酸中的一种或多种，和ii)甘油单酯，所述方法包括：
a)选择至少一种食用油或脂肪或其组合，其中所述食用油或脂肪包含至少一种磷脂，
b)向步骤a)中选择的所述食用油或脂肪中补充外源甘油和任选补充b)外源磷脂，其中当步骤a)中选择的改进食用油或脂肪基本上由植物油组成时，在步骤b)期间添加外源磷脂，
c)使步骤b)中补充的食用油或脂肪接触至少一种脂质酰基转移酶和任选接触另一种酶，以生产食用油/酶反应混合物；和
d)将所述食用油/酶反应混合物在所述至少一种脂质酰基转移酶具有活性的温度下温育，以产生包含i)溶血磷脂和/或以下甘油磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷酯酰肌醇和磷酯酰丝氨酸中的一种或多种，和ii)甘油单酯的改进食用油或脂肪，和
e)任选地灭活或除去所述脂质酰基转移酶和/或任选的其他酶。
当用作烹饪油或人造黄油时，该食品可以有增强的抗粘锅(antiplattering)性质。进一步或者可选地，该食品可以有一种或多种有益的技术性质，例如增强的氧化稳定性，改善的乳化性能，或健康益处。
在一个实施方案中，本发明的脂质酰基转移酶可以用于制备低脂食品，例如低脂涂抹物、低脂色拉调料、低脂蛋黄酱、低脂人造黄油等。与脂肪较高的等价物相比，通过添加乳化剂和额外的水通常降低了这些低脂食品中的脂肪含量。
已发现本发明组合物和方法中应用的脂质酰基转移酶与脂解酶相比具有独特的性质，它们明显优先地将酰基从脂质转移到水以外的受体上，即使在有大量水存在的条件下也是如此。与现有技术中的酶相比发现，本发明中应用的脂质酰基转移酶在存在6％水，54％水，73％水，89％水和大约95％水的条件下具有高的相对转移酶活性。被测试的脂解酶在这些水浓度条件下基本上不具有明显的相对转移酶活性。
酶的脂酶活性和酰基转移酶活性可以使用以下测定方法来评估。通过此方法可以获得/鉴定具有本文定义的酶特性的脂质酰基转移酶。
磷脂酶活性的测定(磷脂酶活性TIPU-K测试)：
底物
将1.75％L-磷脂酰胆碱95％Plant(Avanti#441601)、6.3％Triton-X 100(无过氧化物)和5mM CaCl2溶解在0.05M HEPES缓冲液(pH＝7)中。
试验过程：
将21μl底物加入到试管(Kone-Lab.Robot)中，并在30℃温育5分钟。在T＝0分钟时，加入4μl酶溶液。同时对以水代替酶的空白进行分析。在T＝10分钟时，加入75μl NEFA A(来自德国Wako Chemicals的NEFA试剂盒的底物A)，混合并在30℃温育。在T＝15分钟时，加入150μl NEFA B(来自德国WakoChemicals的NEFA试剂盒的底物B)，并在30℃温育。在T＝20分钟时，测量吸光度(OD 520nm)。
绘制基于油酸的校准曲线，并将其用于计算样品中的游离脂肪酸。
将酶活性TIPU-K计算为在测试条件下每分钟产生的脂肪酸微摩尔数。
磷脂酶活性的测定(磷脂酶活性PLU-7测试)：
底物
将0.6％L-α磷脂酰胆碱95％Plant(Avanti#441601)、0.4％Triton-X 100(Sigma X-100)和5mM CaCl2溶解在0.05M HEPES缓冲液(pH＝7)中。
试验过程：
将400μl底物加入到1.5ml Eppendorf试管中，并在37℃的Eppendorf热混合仪中放置5分钟。在T＝0分钟时，加入50μl酶溶液。同时对以水替代酶的空白进行分析。使样品在37℃的Eppendorf热混合仪中以10×100rpm混合10分钟。在T＝10分钟时，将所述Eppendorf试管在另一个99℃的热混合仪中放置10分钟以终止反应。
利用来自WAKO GmbH的NEFA C试剂盒分析样品中的游离脂肪酸。
以在试验条件下每分钟产生脂肪酸的微摩尔数计算酶活性PLU-7(pH7)。
可使用以下试验评估酶的脂肪酶和酰基转移酶活性。通过此方法可以获得/鉴定具有本文定义的酶特性的脂质酰基转移酶。
经缓冲的底物中的转移酶测定法(参见实施例12)
起脂质酰基转移酶作用以用于本发明组合物和方法中的酶可以用实施例12中教导的测定法常规鉴定出来。此测定方法将在下文称为“经缓冲的底物中的转移酶测定法”。在实施例12中对本发明源于杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶进行分析并与本发明未涉及的一定范围的脂解酶进行比较。可以看出脂解酶中只有
Figure GPA00001103919300591
F(Novozymes，丹麦)具有转移酶活性，因此仅具有较低的水平(1.3％)。
适于本发明的组合物和方法中应用的酶可以利用在经缓冲的底物中的转移酶测定法来常规确定。应用这种测定方法(其中含水量非常高-大约95％)，本发明应用的脂质酰基转移酶是至少有2％酰基转移酶活性(相对转移酶活性)，优选至少5％相对转移酶活性，优选至少10％相对转移酶活性，优选至少15％、20％、25％、26％、28％、30％、40％、50％、60％或75％相对转移酶活性的酶。本发明适宜的脂质酰基转移酶可以具有小于28％，小于30％，优选小于40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的酰基转移酶活性。
高水蛋黄中的转移酶测定法(参见实施例11)
作为“经缓冲底物中的转移酶测定法”(参见上面所述)的替换(或附加)，本发明所用脂质酰基转移酶可以用实施例11教导的“高水蛋黄中的转移酶测定法”来鉴定。
在一个具体的实施方案中，本发明方法和/或组合物适用的脂质酰基转移酶是这样的一种酶，当使用高水蛋黄中的转移酶测定法在含水量54％的蛋黄中进行检测时，所述酶具有最高100％的相对转移酶活性。事实上，在高水蛋黄中进行的实验显示，在实验的开始，初始的转移酶速率经计算为100％转移酶活性，即没有观察到水解活性。相反的，作为对照的脂解酶即
Figure GPA00001103919300601
F和磷脂酶A2在含水54％的蛋黄或富含水的蛋黄(即含水73％或89％的蛋黄)中没有显示出可检测的转移酶活性。优选地，含水量的增加并没有显著降低本发明方法或组合物中所用脂质酰基转移酶的百分比酰基转移酶活性。
在一个优选的实施方案中，使用高水蛋黄中的转移酶测定法在含水量54％的蛋黄中进行检测时，在供体分子(即磷脂)消耗10％后，本发明所用脂质酰基转移酶具有的初始百分比转移酶活性(初始相对转移酶活性)为至少0.1％相对转移酶活性，优选至少1％相对转移酶活性，优选至少5％相对转移酶活性，优选至少10％相对转移酶活性，优选至少20％相对转移酶活性，优选至少30％相对转移酶活性，优选至少40％相对转移酶活性，优选至少50％相对转移酶活性，优选至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少99％，优选大约100％酰基转移酶活性。
在一个优选的实施方案中，使用高水蛋黄中的转移酶测定法在含水量54％的蛋黄中进行检测时，在供体分子(即磷脂)消耗10％后，本发明组合物和方法中所用的脂质酰基转移酶具有可测的转移酶活性，即0.1到100％之间的相对转移酶活性，优选至少1％的相对转移酶活性，优选至少5％的相对转移酶活性，优选至少10％的相对转移酶活性，优选至少20％的相对转移酶活性，优选至少30％的相对转移酶活性，优选至少40％的相对转移酶活性，优选至少45％、50％、60％、70％、80％或90％的相对转移酶活性。适宜地，在使用高水蛋黄中的转移酶测定法在含水量54％的蛋黄中进行检测时，在供体分子(即磷脂)消耗10％后，本发明脂质酰基转移酶可以具有少于45％、47％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的百分比酰基转移酶活性(相对转移酶活性)。
在一个优选的实施方案中，使用高水蛋黄中的转移酶测定法在含水量73％的蛋黄中进行检测时，在供体分子(即磷脂)消耗10％后，本发明组合物和方法中所用的脂质酰基转移酶具有可测的转移酶活性，即0.1到100％之间的相对转移酶活性，优选至少1％的相对转移酶活性，优选至少5％的相对转移酶活性，优选至少10％的相对转移酶活性，优选至少20％的相对转移酶活性，优选至少30％的相对转移酶活性，优选至少40％的相对转移酶活性，优选至少45％、50％、58％、60％、70％、80％或90％的相对转移酶活性。适宜地，在使用高水蛋黄中的转移酶测定法在含水量73％的蛋黄中进行检测时，在供体分子(即磷脂)消耗10％后，本发明脂质酰基转移酶可以具有少于45％、47％、50％、58％、60％、70％、80％、90％或100％的百分比酰基转移酶活性(相对转移酶活性)。
在优选的实施方案中，使用高水蛋黄中的转移酶测定法在含水量89％的蛋黄中进行检测时，在供体分子(即磷脂)消耗10％后，本发明组合物和方法中所用的脂质酰基转移酶具有可测的转移酶活性，即在0.1与100％之间的相对转移酶活性，优选至少1％的相对转移酶活性，优选至少5％的相对转移酶活性，优选至少10％的相对转移酶活性，优选至少20％的相对转移酶活性，优选至少30％的相对转移酶活性，优选至少40％的相对转移酶活性，优选至少45％、50％、60％、70％、80％或90％的相对转移酶活性。适宜地，在使用高水蛋黄中的转移酶测定法在含水量89％的蛋黄中进行检测时，在供体分子(即磷脂)消耗10％后，本发明脂质酰基转移酶可以具有少于45％、47％、50％、60％、70％、80％、90％或100％百分比酰基转移酶活性(相对转移酶活性)。
在优选的实施方案中，根据高水蛋黄中的转移酶测定法，本发明组合物中和方法中应用的脂质酰基转移酶具有显著的相对转移酶活性(即在两种水含量都至少0.1％)，在含水量54％和含水量73％的蛋黄中具有相当的相对转移酶活性，测定是供体分子(即磷脂)消耗10％后进行。
在优选的实施方案中，根据高水蛋黄中的转移酶测定法，本发明组合物中和方法中应用的脂质酰基转移酶具有显著的相对转移酶活性(即在两种水含量都至少0.1％)，在含水量54％和含水量89％的蛋黄中具有相当的相对转移酶活性，测定是供体分子(即磷脂)消耗10％后进行。
在优选的实施方案中，根据高水蛋黄中的转移酶测定法，本发明组合物中和方法中应用的脂质酰基转移酶具有显著的相对转移酶活性(即在两种水含量都至少0.1％)，在含水量73％和含水量89％的蛋黄中具有相当的相对转移酶活性，测定是供体分子(即磷脂)消耗10％后进行。
本文使用的术语“相当的相对转移酶活性”表示酶具有的相对转移酶活性(％酰基转移酶活性)在水含量较高的蛋黄中比在水含量较低的蛋黄中，至少低2％，优选地至少低5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
低水环境中的转移酶测定法
作为“高水蛋黄中的转移酶测定法”和/或“经缓冲的底物中的转移酶测定法”的替代或附加，本发明中使用的脂质酰基转移酶可以通过“低水环境中的转移酶测定法”来鉴定。
为了判定一种酶是否是属于根据本发明的脂质酰基转移酶，可进行“低水环境中的转移酶测定法”，即如实施例22教导在含水6％的油性环境中。这个例子说明在水含量6％的油性环境中本发明的脂质酰基转移酶具有高的相对转移酶活性，而现有技术的脂解酶具有水解活性。
在一实施方案中，本发明组合物和/或方法中应用的适宜脂质酰基转移酶是用“低水环境中的转移酶测定法”试验的酶，在30、20或120分钟后进行测定时，其相对转移酶活性至少1％，优选至少2％，优选至少5％，优选至少10％，优选至少20％，优选至少30％，优选至少40％，优选至少50％，优选至少60％，优选至少70％，优选至少75％。适宜地，用“低水环境中的转移酶测定法”在10、20、30或120分钟后进行测定时，本发明脂质酰基转移酶，可有少于30％、40％、50％、60％、70％或80％的活性。
如上所述，本发明中的脂酶酰基转移酶可以用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”或“低水环境中的转移酶测定法”以胆固醇为酰基受体进行鉴定。当然，本领域技术人员会容易意识到，通过对分析性方法进行显著修改，“经缓冲的底物中的转移酶测定法”或“低水环境中的转移酶测定法”可用于确定脂质酰基转移酶对任何脂质酰基供体或任何酰基受体组合的活性。如有必要，技术人员可简单地用可选酰基供体底物(如糖脂，甘油三酯)替换酰基供体底物(如磷脂)和/或用可选酰基受体底物(如碳水化合物，蛋白质，其它甾醇，甾烷醇或甘油)替换酰基受体底物(如胆固醇)。
本文使用的术语“高水”意味着任何底物或食品，其水含量大于2％，优选大于3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
本文使用的术语“低水”意味着任何底物或食品，其水含量小于6％，优选小于5％、4％、3％、2％、1％或0.5％。
LUS试验
水解甘油三酯的能力(E.C.3.1.1.3活性)可以根据Food Chemical Codex(3rd Ed.，1981，pp 492-493)(其中修改为以葵花油，pH 5.5替代橄榄油，pH 6.5)测定的脂肪酶活性来测定。脂肪酶活性以LUS(葵花油的脂肪酶单位)来计量，其中将1LUS定义为在以上试验条件下每分钟可以从葵花油中释放1μmol脂肪酸的酶量。
LUS试验
或者，也可以使用如WO9845453中定义的LUT试验。此文献通过引用并入本文。
本发明的脂质酰基转移酶或用于本发明方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以为基本上不能作用于甘油三酯的脂质酰基转移酶，所述脂质酰基转移酶的LUS/mg可以小于1000，如小于500，如小于300，优选为小于200，更优选为小于100，更优选为小于50，更优选为小于20，更优选为小于10，如小于5，小于2，更优选为小于1LUS/mg。可选地，LUT/mg活性小于500，如小于300，优选为小于200，更优选为小于100，更优选为小于50，更优选为小于20，更优选为小于10，如小于5，小于2，更优选为小于1LUT/mg。
本发明的脂质酰基转移酶或用于本发明方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是基本上不能作用于甘油单酯的脂质酰基转移酶，所述脂质酰基转移酶可以在LUS试验中使用单油酸酯(M77651-油酰-rac-甘油99％)以替代葵花油来测定。将1MGHU定义为能够在所述试验条件下每分钟从甘油单酯中释放1μmol脂肪酸的酶量。
本发明的脂质酰基转移酶或用于本发明方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是优选基本上不能作用于甘油三酯的脂质酰基转移酶，所述脂质酰基转移酶具有的MGHU/mg可以小于5000，如小于1000，如小于500，如小于300，优选为小于200，更优选为小于100，更优选为小于50，更优选为小于20，更优选为小于10，如小于5，小于2，更优选为小于1MGHU/mg。
优选地，可以在以下温度在食品中实施本发明的方法和/或用途，例如，15-60℃温度范围时，优选20-60℃温度范围，优选20-50℃温度范围，优选20-45℃温度范围，优选20-40℃温度范围。在一些方面，例如在面团中，优选发生酰基转移酶反应时食物的温度在20至40℃之间。对于其它方面，例如对于乳制品诸如干酪，食物的适宜温度可以在30至60℃之间。在其它方面，例如对于蛋黄酱，食物的适宜温度可以在20至40℃之间。更为优选的应在25至30℃之间。
优选地，依照本发明产生的乳化剂占食品重量的5重量％以下。
优选地，依照本发明产生的乳化剂占食品重量的0.01到4重量％。
优选地，依照本发明产生的乳化剂占食品重量的0.01到2重量％。
优选地，依照本发明产生的乳化剂占食品重量的0.01到1重量％。
优选地，依照本发明产生的乳化剂占食品重量的0.01到0.5重量％。
优选地，依照本发明产生的乳化剂占食品重量的0.01到0.3重量％。
依照本发明适宜的方法包括使酶失活或变性，使得食品中包含失活或变性形式的酶。适宜地，所述酶可以用烘焙或用巴氏灭菌法而得以变性。
本发明可进一步包括本文定义的脂质酰基转移酶在食品和/或饲料酶组合物中的用途，而且可包括其中含有本文定义的脂质酰基转移酶的食品和/或饲料酶组合物。这样的组合物可以包含一种或多种另外的酶，例如本发明所列举的。或者，本发明的酶组合物可与本文所述其它食品成分/食品添加剂(包括其它酶组合物)联用。通过将本发明的脂质酰基转移酶配制在食品和/或饲料组合物中，所述酶可在用于食品和/或饲料生产之前得以稳定化，以便长期保存(在适宜条件下)。另外，本发明的酶组合物提供适宜形式的酶，其可安全地在食品和/或饲料或者用于食品和/或饲料制品的组分的制备过程“原位”应用。这些组合物可以以流体，半流体或固体/颗粒形式存在。
在一实施方案中，适宜的食品酶组合物可为面团改良组合物(doughimproving composition)。面团改良组合物可包括其它有益成分如乳化剂和/或本发明列举的其它酶。
食品酶以稳定液态浓缩剂或固体颗粒形式出售。制成食品酶组合物使得在运输、储藏、使用过程中的酶活性损失量降到最低。在食品和饮料生产过程中酶常常处于湿、热或氧化环境中。制剂通过对抗主要灭活作用力：变性、催化部位失活和蛋白质水解，来增强稳定性。当一种酶的蛋白质三级结构在热或化学应力作用下物理性去折叠，酶就发生了变性。酶一旦开始去折叠就极易失活并发生蛋白质水解。为了最小化去折叠，配制者可以改变蛋白的环境来诱导紧密的蛋白质结构；最有效的方法是通过添加缔合水的化合物如糖、多羟基醇和易溶性盐从蛋白表面“优先除去”水。防止活性位点失活的最佳方法是确保任何必需辅助因子的水平充足，添加可逆抑制剂，并且从制剂中除去氧化性或具有反应活性种类。
除了酶稳定性之外，制剂还要求满足几个关键的次要需求，包括防止微生物污染的保藏，避免物理性沉淀或云雾状混浊(haze)形成，使致敏尘埃或气溶胶的形成降到最低，和达到最佳的美感性标准如色泽和气味。这些问题许多通过尽可能关注“上游”而得以很好地解决，包括在发酵或酶回收过程中原材料的选择。下游操作如渗滤、吸附、层析、结晶和提取可以用来除去与色泽、气味和沉淀有关的杂质。物理沉淀的风险可通过在接近酶等电点利用亲水的溶剂诸如甘油或丙二醇进行配制而降到最低。技术人员也可有效添加水平适中的助溶盐，来避免盐析或避免“反向盐助溶(reverse salting-in)”。为防止微生物污染，可联合使用过滤、酸化，以及使游离水减到最小限度；杀生物剂可有效，但用于控制或杀灭微生物的可接受化学物质的范围越来越受到健康与安全规范的限制。
迄今为止，两种产生耐磨性最强的颗粒的方法是高剪切力制粒法和流床喷雾包衣法，例如见T.Becker：″Separation and Purification Processes forRecovery of Industrial Enzymes″(“工业酶回收的分离纯化过程”)in R.K.Singh，S.S.H.Rizvi(eds.)：Bioseparation Processes in Foods(食品的生物分离过程)，Marcel Dekker，New York，pp.427-445。这些方法使用各种粘合剂，包衣剂，颗粒形态学来产生不易碎的颗粒，这种颗粒还在储藏过程中对酶起到保护作用，但允许它们在使用过程中容易地释放到溶液中。
可以用标准化的配制技术如喷雾干燥或液体配制来制备包含本发明所述脂质酰基转移酶的食物酶组合物。
本发明所述脂质酰基转移酶可在任何适宜的表达宿主表达。例如本发明所述脂质酰基转移酶可在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表达，并且可以通过超滤法和/或乙醇沉淀法和/或离心法纯化，接着可以使用淀粉(麦芽糊精)作为酶的载体进行喷雾干燥。经喷雾干燥后的酶通过添加另外的粉末形式载体而标准化为规定的PLU活性。有关技术在本领域中是很明确且常规的。
或者，本发明使用的脂质酰基转移酶，例如，本发明外源性产生的脂质酰基转移酶，一旦经纯化，可稳定于适宜的液体制剂中，如基于甘油的那些。其它制备稳定化酶制剂的方法在EP 0770037和EP 0702712中有所描述。
粉末状的酰基转移酶也可以与本文列出的其它酶联用，来制备具有产品说明书所限定的活性的酶组合物。
通常食物酶制剂的剂量是每1000千克食品10克到1000克，优选每1000千克食品50克到200克，优选每1000千克食品75克到125克。
本发明优选的酶以失活或变性的形式存在于食品中。
在一实施方案中，本发明的酶优选非固定化的，具体为不固定于固体载体上。
在一可选择的实施方案中，所述酶可以是固定化的。
固定化的脂质酰基转移酶可以使用本领域熟知的固定化技术制备。本领域有大量的对本领域技术人员而言清楚明白的制备固定化的酶的方法(例如以下文献中所述的技术：EP 0746608；或Balcao VM，Paiva AL，Malcata FX.，Enzyme Microb Technol.1996May 1；18(6)：392-416；或Reetz MT，Jaeger KE.Chem Phys Lipids.1998Jun；93(1-2)：3-14；或Bornscheuer UT，Bessler C，Srinivas R，Krishna SH.TrendsBiotechnol.2002Oct；20(10)：433-7(将每篇都包含在本文中作为参照)。
在一实施方案中，本发明的食品可以包含使用固定化脂质酰基转移酶制备的食品成分，但不包含食品成分或食品中的脂质酰基转移酶。例如所述食品可包含一种或多种下列物质：乳化剂、一种以上的乳化剂、一种或多种调味剂、一种或多种结构强化剂和/或一种或多种甾醇酯，如植物甾醇酯或植物甾烷醇酯。
本发明的酶可以与一种或多种常规乳化剂共同使用，所述乳化剂包括例如甘油单酯、二醋酸基酒石酸的脂肪酸单甘油酯和二甘油酯，和卵磷脂，例如其得自大豆。
本发明的酶可以与一种或多种其它合适的食品级酶一起使用。因此，除了本发明的酶外，向所述食品中加入至少一种额外的酶，这也属于本发明的范围。所述额外的酶包括淀粉降解酶，例如内切淀粉酶或外切淀粉酶、支链淀粉酶(pullulanases)、脱支酶，半纤维素酶，包括木聚糖酶、纤维素酶，氧化还原酶，例如过氧化物酶、酚氧化酶、葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、巯基氧化酶，或者碳水化合物氧化酶，例如氧化麦芽糖的酶，例如己糖氧化酶(HOX)，脂肪酶，磷脂酶，糖脂酶(glycolipases)，半乳糖脂酶(galactolipases)和蛋白酶。
在一个实施方案中，所述酶可以是Dairy HOXTM，其作为去氧剂以延长干酪货架期，同时在比萨烤箱中提供褐变控制。因此，在本发明的一个方面，涉及能够还原食品中的美拉德反应的酶(参见WO02/39828，其通过引用并入本文)在制备本发明的食品材料和/或食品中的应用，所述食品如奶产品(例如干酪)，其中所述酶优选为麦芽糖氧化酶，例如碳水化合物氧化酶，葡萄糖氧化酶和/或己糖氧化酶。
在一优选的实施方案中，脂质酰基转移酶与具有下列一种或多种脂酶活性的脂酶联合使用：糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)、三酰甘油脂酶活性(E.C.3.1.1.3)、磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)或磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)。适宜地，脂酶在本领域是公知的，并包括下列用举例方式说明的脂酶：
Figure GPA00001103919300671
F和/或
Figure GPA00001103919300672
ULTRA(Novozymes A/S，丹麦)、磷脂酶A2(例如磷酯酶A2来自Biocatalysts的LIPOMODTM 22L，来自Genecor的LIPOMAXTM)、
Figure GPA00001103919300681
(Novozymes A/S，丹麦)，在WO03/97835、EP0977869或EP 1193314中教导的脂酶。本发明脂质酰基转移酶和脂酶的联用在面团制品或烘焙食品或在精细食品例如蛋糕和糖食的生产中是特别优选的。
在一些实施方案中，将脂质酰基转移酶和脂肪分解酶组合使用也可能是有益的，所述脂肪分解酶例如是从小牛、羔羊、仔胃(kid stomach)制备的凝乳酶膏(rennet paste)，或者Palatase A750L(Novo)、Palatase M200L(Novo)、Palatase M1000(Novo)或Piccantase A(DSM)，以及来自DSM(K，KL，L&C)的动物源Piccantase或Lipomod 187、Lipomod 338(Biocatalysts)。通常这些脂肪酶用在干酪的生产中，从而产生干酪调味剂。这些脂肪酶还可以用于产生经过酶修饰的食品，例如奶制品(例如干酪)，尤其当所述奶制品由乳脂(butterfat)组成，由乳脂产生或者包含乳脂时。所述脂质酰基转移酶与一种或多种所述脂肪酶的组合可以对奶制品(例如干酪)的风味产生有益影响。
脂酶与本发明的酶的联合使用在可能需要游离脂肪酸的一些蓄积的情况下尤其有优势，例如在游离脂肪酸可以产生所需香气的干酪中，或在精细食品的制备中。本领域的技术人员可以联用成比例的脂解酶，例如
Figure GPA00001103919300682
F和/或
Figure GPA00001103919300683
ULTRA(Novozymes A/S，丹麦)、磷脂酶A2(例如磷酯酶A2来自Biocatalysts的LIPOMODTM 22L，来自Genecor的LIPOMAXTM)，(Novozymes A/S，丹麦)，在WO03/97835，EP0977869或EP 1193,314中教导的脂酶，以提供理想的水解与转移酶活性比例，这能够带来食品中优选的技术效果或技术效果的组合(例如那些在本文中在“技术效果”中所列的内容)。
组合使用脂质酰基转移酶和磷脂酶(例如磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶B、磷脂酶C和/或磷脂酶D)也可能是有益的。
所述组合使用可以依次或同时进行，例如脂质酰基转移酶处理可以在所述额外酶处理前或者处理过程中进行。或者，所述额外酶处理也可以在脂质酰基转移酶处理之前或处理过程中进行。
在依次酶处理的情况下，在一些实施方案中，在利用第二个(和/或第三个等)酶处理前，例如通过失活或者通过使用固定化酶除去所使用的第一个酶可能是有益的。
传统的蛋糕工业使用蛋糕改良剂以改善蛋糕产量并保证在口味、结构、食用质量和外观方面具有高质量的蛋糕。这些蛋糕改良剂一般是基于在如淀粉和麦芽糊精等的载体上经喷雾干燥的乳化剂。一些蛋糕改良剂还为基于乳化剂、糖和水的凝胶形式。这些蛋糕改良剂对于蛋糕生产企业生产出高质量蛋糕至关重要。但是蛋糕改良剂含有乳化剂和其它具有E编号的“非天然”成分。由于消费者要求减少E编号的数量，蛋糕生产企业就需要不使用乳化剂而采取其它替代的方法生产出高质量蛋糕。
一种替代方法是生产蛋糕时使用一种酶，即本文限定的脂质酰基转移酶或本发明的酶组合物。
本文限定的脂质酰基转移酶和/或本发明的食品酶组合物可在生产精细食品如蛋糕时使用。在这样的例子中，下列成分可在精细食品中形成。
i)食糖酯和溶血卵磷脂(源于蛋糕配方中的碳水化合物和形成蛋糕配方组成部分的蛋中的卵磷脂)；和/或
ii)酰化的肽和溶血卵磷脂(在蛋白脂肪酸缩合物形成过程中，将脂肪酸从卵磷脂转移到蛋白或肽，这种蛋白脂肪酸缩合物被认为是十分有效的乳化剂(Herstellung und Anvendungmoglichkeiten vonEiweiss-Fettsaurekondensaten.Andreas Sander，Eberhard Eilers，AndreaHeilemann，Edith von Kreis.Fett/lipid 99(1997)Nr.4，115-120))。
一般认为在制备一些精细食品时，具体是高脂肪精细食品，如蛋糕，需要一些脂肪酸蓄积。因此，联合应用脂解酶和本文所述的脂质酰基转移酶对于生产高脂肪精细食品尤其有益。或者，可选择另外的游离脂肪酸或脂肪酸皂化物(E470a)，并与所述脂质酰基转移酶联合应用。
本发明的食品适宜地包含一种或多种下列添加剂：
大豆蛋白材料；类胡萝卜素、黄酮素(flavenoid)、抗氧化剂和植物化学成分(具体是anthocyanonide、类胡萝卜素、生物黄酮素(bioflavinoid)、谷胱甘肽、儿茶素、异黄酮、番茄红素(lycopene)、人参皂苷(ginsenoside)、柏松素(pycnogenol)、生物碱(alkaloid)、臀果木(pygeum)植物甾醇、萝卜硫素(sulphoraphone)、芪三酚(resveretol)、葡萄籽提取物或含有甾烷醇酯类的食品)，维生素(具体是维生素C、维生素A、维生素B3、维生素D、维生素E、硫胺(thiamine)、核黄素、烟酸、吡哆醇(pyridoxine)、氰钴胺素(cyanocobalamin)、叶酸、生物素、泛酸或维生素K)，矿物质(具体是钙、碘、镁、锌、铁、硒、锰、铬、铜、钴、钼或磷)，脂肪酸(具体是γ-亚油酸(linoleic acid)、ucospentaenoicacid或二十二碳六烯酸)、油(特别是琉璃苣油(borage oil)、高类胡萝卜素canola油(high carotenoid canola oil)或亚麻仁油(flax seed oil))，氨基酸(具体是色氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、精氨酸、门冬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、牛磺酸或酪氨酸)，酶((具体是菠萝蛋白酶(bromelain)，木瓜蛋白酶，淀粉酶，纤维素酶或辅酶Q)、木质素、甾烷醇酯或无害细菌(具体是嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus bulgaricus)、双歧乳杆菌(Lactobacillus bifidus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)或屎肠球菌(Streptococcus faecium))，叶酸和可溶性纤维。
技术效果：
出乎意料地，脂质酰基转移酶在食品中具有显著的酰基转移酶活性。这种活性在食品的制备方法中具有意想不到的有益应用。
本发明基于意想不到的发现，即本发明的脂质酰基转移酶可在含水量较高的食品中通过醇解作用(alcoholosis)进行碳水化合物酯化作用，即从脂质转移酰基。现有技术提示这种酶如果完全以这种方式发挥功能，那么只能在溶剂环境中发挥作用(即在含水量低或无水的环境中)。
本发明提供一或多种以下在蛋制品具体是蛋黄酱中的意外的技术效果：在巴氏灭菌过程中改善的热稳定性；改善的感官特性，改善的粘稠度。
本发明提供一或多种在面团和/或烘焙产品中的下列意外的技术效果：改善的面团或烘焙产品(例如面包和/或蛋糕)的比体积(specific volume)；改善的面团稳定性；改善的外皮评分(例如更薄和/或更脆的面包外皮)；改善的面团瓤评分(例如更为均匀的面团瓤分布和/或更精细的面团瓤结构和/或更为柔软的面团瓤)；改善的外观(例如表面光滑没有泡或者洞，或者基本上没有泡或者洞)；变味减少；改善的柔软度；改善的气味；改善的口味。
本发明可提供有益的效果，所述效果源于食品中高表面活性物质的形成而基本上不形成大量的游离脂肪酸，这样可降低食品在储藏时的氧化能力，这是因为游离脂肪酸比相应的脂肪酸酯更易于被氧化。
适宜地，本发明可提供在食品中的一种或多种以下意外的技术效果：改善的外观、改善的口感、提高的稳定性，具体是提高的热稳定性、改善的口味、提高的柔软度、改善的弹性、改善的乳化作用。
适宜地，本发明提供在乳制品例如冰淇淋中的一种或多种以下意外的技术效果：改善的口感(更好的奶油性口感)、改善的口味、改善的熔化特性。
适宜地，本发明提供在蛋或蛋产品中的一种或多种以下意外的技术效果：乳化稳定性的提高，热稳定性的提高，改善的风味，降低的恶臭，改善的增稠特性，改善的粘稠度。
与本文定义的脂质酰基转移酶在食品制备中的应用相关的具体技术效果可列举在以下表格中：
Figure GPA00001103919300711
适宜地，本发明可在干酪中提供以下一种或多种意外的技术效果：干酪中溢油(oiling-off)效果的下降、干酪产率的增加、口味的改进、臭味减少、“肥皂”味减少。
溢油是在贮存和熔化后形成游离油的趋势。过量溢油通常是与使用干酪的加热产品，例如披萨和相关食品(参见，例如Kindstedt J.S；Rippe J.K.1990，J Dairy Sci.73：867873)最相关的缺点。随着消费者对饮食脂肪水平的关注日益提高，控制/消除此缺点变得越来越重要。产品中的游离油/脂肪可被视为高脂肪含量，并通常不受欢迎。溢油效应不仅能够影响干酪的外观，而且在多种情况下干酪释放的油还可能扩散穿透食品并被食品吸收。这对于包含烘焙成分的食品(例如披萨饼底(pizza base))特别有害，而且这种效应不仅体现于不期望的外观，而且还导致有害的质构和风味。
在食品中，通常通过机械乳化，例如均质化来稳定脂肪相。此技术通常不应用于干酪生产中，这是因为干酪用乳的均质化对干酪用乳的凝乳性以及由此生产的干酪的产量和口味具有负面影响。
本发明经酶处理的食品和/或食品材料(例如包括经酶处理的乳、奶油和/或乳脂)的应用可用于生产溢油效应减少的食品(例如干酪)和/或用于改进干酪用乳的均质性，和/或减少均质化干酪用乳在制成干酪时对凝乳性的负面影响，和/或改进干酪的风味和/或质构。
可根据WO00/54601中公开的方法测定溢油效应以及干酪产量和脂肪产量/含量。
在一个实施方案中，本发明制备的食品(例如乳制品，如干酪)可具有较高的产量。
在通过酶处理直接改进干酪用乳和/或奶油时和/或向干酪用乳中补充经酶处理的油或脂肪例如经酶处理的乳脂时，可获得提高的干酪产量。
本发明的另一个优点在于减少不良风味和/或不良口感，优选通过减少经酶处理的食品(例如干酪)中的游离脂肪酸量。
本发明的一个优点在于可使用较低剂量的脂质酰基转移酶以产生与磷脂酶A2(PLA2)相同(或更好)的效果。因此，有效的酶可能是获得相同(或更好)的结果所必需的。
本发明的另一个优点在于用于本发明，特别是干酪制备中的脂质酰基转移酶不一定需要乳和/或奶油的预处理。实际上，用于本发明时，可直接向干酪槽(vat)中添加脂质酰基转移酶。这可以有利地简化最终用户的干酪制备过程。
本发明的另一个优点在于与例如使用如LecitaseTM的磷脂酶相比，脂质酰基转移酶可提高食品，例如干酪(如意大利干酪(mozarella))的含水量。
在一个实施方案中，本发明经酶改进的食品和/或食品材料的应用可用于生产食品，例如与使用如LecitaseTM的磷脂酶时相比，含水量提高的干酪。这个实施方案在所述食品和/或食品材料是乳制品，例如乳、奶油、乳脂和/或奶酪的情况下可以特别有利。
本发明的另一个优点是可在食品中产生甾醇酯和/或甾烷醇酯。这个实施方案在所述食品和/或食品材料是乳制品，例如乳、奶油、乳脂和/或奶酪的情况下可以特别有利。
有利地，本发明可用于降低食品，特别是乳制品，例如干酪的胆固醇水平。
在食品生产中，具体是干酪的生产中，应用本发明的脂质酰基转移酶在从乳制品回收可溶蛋白的能力方面具有显著的优点。例如，在干酪生产中接近全部牛奶蛋白的20％从乳清(即在乳凝块形成以后残留的牛奶的水样部分)去除。乳清中包含可溶性乳蛋白，疏水蛋白保留在乳凝块中。通过使用本发明的脂质酰基转移酶，可将酰基从脂质(优选从糖脂或磷脂)转移到蛋白质(具体是乳清蛋白，例如乳球蛋白(lactoglobulin))形成蛋白脂肪酸缩合物。因此，产生一种产品，它更加疏水而且能够保留在乳凝块中而非在乳清中洗脱。用这种方式，更多乳蛋白被保留在最终的产品中，即最终的乳制品如干酪。
一方面，本发明部分基于可通过使用脂质酰基转移酶改善食品诸如干酪产量。另外地或可以替代地，食品风味、质地、抗氧化稳定性和/或食品保质期都可以改善。另外地或可以替代地，食品可以具有降低的胆固醇水平或提高的植物甾醇酯/甾烷醇酯含量。
不期望局限于某种具体的理论，认为食品产量的增加是由乳清蛋白和肽的酰基转移作用导致的，并且导致干酪凝乳中乳清蛋白疏水性以及酰化的乳清蛋白的沉淀量显著提高。
在生物系统中，例如，膜结合蛋白和酶的沉积可以通过两种不同机制获得。膜结合蛋白或具有一定数量的跨膜或疏水域，或可选具有与多肽链连接的脂肪酸。脂肪酸通常具有14或16碳原子的碳链。脂肪酸与多肽链在三处不同位置共价连接，氨基酸氨基末端作为酰胺键，半胱氨酸残基作为硫酯(thioester)连接，或丝氨酸或苏氨酸作为酯连接。每一多肽分子仅一个脂肪酸对于将蛋白质掺入细胞膜中是必需的。
当脂肪酸通过共价键结合到非膜蛋白时，其物理的和功能的特性将明显改变。WO97/14713描述了将大豆蛋白和谷蛋白通过用源自米黑毛霉(Mucormiehei)的脂酶(LipozymeTM，Novozymes)处理转化成酰基衍生物，和有机溶剂中的脂肪酸。本发明的脂质酰基转移酶可用于在低水或高水环境中产生酰化蛋白。
我们注意到酰化的蛋白形成两亲性复合物，可以用于多种化妆品。酰化的蛋白能形成凝胶(可结合水以保持湿度)具有乳化性质，在水和脂质之间的中间相中具有非常好的活性。
因此，本发明一方面可以提供包含本文定义的脂质酰基转移酶的化妆品组合物。
此外，本发明还提供本文定义的脂质酰基转移酶在生产化妆品组合物中的用途。
另一方面，本发明还提供在化妆品组合物中原位产生蛋白质酯的方法，该方法包括将本文定义的脂质酰基转移酶添加到化妆品组合物(或它的组分)中的步骤。
多种食物蛋白能溶于水，因此适于通过脂酶酰基转移酶(lipase acyltransferase)进行原位修饰。在干酪生产中，β-乳球蛋白进入乳清级分而被丢失。在应用脂酶酰基转移酶或其变体进行酰化之后，初始的结果表明在凝乳酶(rennet)凝固过程中，β-乳球蛋白被沉淀于酪蛋白微团表面中。β-乳球蛋白在三个表面环上有三个潜在的酰化作用位点(丝氨酸残基)。牛乳包含足量的卵磷脂，卵磷脂是脂质酰基转移酶对β-乳球蛋白进行酰化的适宜底物。形成的溶血卵磷脂可以具有附加的乳化作用。
与应用不具有酰基转移酶活性的脂解酶例如三酰甘油脂酶和磷脂酶相比，可以看到应用本发明的脂质酰基转移酶具有明显的改进。
优点
从至少一种食品原料成分原位产生的乳化剂和甾醇/甾烷醇酯的产生表示食品原料将至少包含一种更少量的附加原料。由于在生产的方便性方面的改进，这是有益的。例如，无需进行进一步的加工过程或额外添加附加的成分，或附加的乳化剂。进一步，食品中可以包含更少量的“添加剂”。添加剂的减少或者去除是消费者想要的，而且，添加剂的添加经常要求必须在产品成分表单中注明以便让消费者清楚知道。因此，本发明是更具优势的。
本发明的益处可以是食品中原位产生的乳化剂产品没有带来食品中自由脂肪酸含量的有害的增加。
从至少一种食品原料成分中原位产生的两种乳化剂和/或一种碳水化合物脂表明食品原料至少含有一种更少量的附加原料。
另外，当脂质酰基转移酶作用于糖脂时，能够有益地原位产生乳化剂DGMG而不带来食品中游离脂肪酸含量的有害的增加。因此，减少由于游离脂肪酸的增加而产生的有害效应，包括但不限于降低干酪中的“肥皂”味道，防止在面团中和烘焙面食中的超量使用。
在一些方面，本发明的优点在于降低了食品中游离胆固醇的水平。
另一方面，本发明的优点在于增加了食品中甾烷醇酯/甾醇酯的含量。一些甾醇酯和/或甾烷醇酯可以是有效的调味剂和/或质地改良剂。本发明不但能够原位产生乳化剂，而且能够在食品中原位产生调味剂和/或质地改良剂。已知一些甾醇酯/甾烷醇酯若添加到食品中能够降低血清胆固醇和/或低密度脂蛋白。因此，本发明可以用于生产含有高水平甾醇酯和/或甾烷醇酯的食品。
在一些方面，具体地，优点在于本发明的酶应用于基于蛋的产品时去除了多余的游离碳水化合物。
有益地，食品乳化剂性质也得到增强，带来了外观的改善和/或可控性的增强和/或结构的改善和/或一致性的增强和/或热稳定性的加强，而对口味没有负面影响。
另外，一些实施方案中，有利地，当自身应用脂酶时，通过添加本发明的酶可有效地克服观察到的“超剂量”效应。这至少部分归功于当应用本发明所述的酶时没有产生游离脂肪酸或仅有极低量的游离脂肪酸产生。
上文标题为“技术效果”的小节中教导了其他和/或可选的优点。
分离
在一方面，优选地，用于本发明的多肽或蛋白质是分离形式的。术语“分离的”是指序列至少基本上不包含至少一种其它成分，这些成分原本与所述序列天然结合，并且原本在一起发现。
纯化
在一方面，优选用于本发明的多肽或蛋白质是纯化的形式。术语“纯化的”意思是序列处于相对纯化的状态-如至少大约51％纯度、或至少大约75％纯度、至少大约80％纯度、至少大约90％纯度、至少大约95％纯度、至少大约98％纯度。
克隆编码本发明所述多肽的核苷酸序列
克隆编码本发明多肽的核苷酸序列
编码具有如本文所定义的特定性质的多肽或适合修饰的多肽的核苷酸序列可以从产生所述多肽的任何细胞或生物中分离得到。用于分离核苷酸序列的各种方法都是本领域熟知的。
例如，可以使用产生所述多肽的生物的染色体DNA或信使RNA来构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果所述多肽的氨基酸序列是已知的，可以合成经标记的寡核苷酸探针，并将其用于从由该生物制备的基因组文库中鉴定编码多肽的克隆。或者，也可以使用包含与另一已知多肽基因同源的序列的经标记寡核苷酸探针来鉴定编码多肽的克隆。在后一种情况下，使用严谨性较低的杂交和清洗条件。
或者，可以通过如下方式鉴定编码多肽的克隆：将基因组DNA的片段插入到表达载体(如质粒)中，使用所得的基因组DNA文库转化酶为阴性的细菌，并随后将转化的细菌涂布在包含被所述多肽抑制的酶的琼脂上，由此可以鉴定出表达所述多肽的克隆。
再者，也可以通过成熟的标准方法通过合成来制备编码所述多肽的核苷酸序列，如Beucage S.L.等(1981)Tetrahedron Letters 22，p 1859-1869描述的亚磷酰胺法，或Matthes等(1984)EMBO J.3，p 801-805描述的方法。在亚磷酰胺法中，在如自动DNA合成仪上合成寡核苷酸，然后将其纯化、退火、连接并克隆到适当的载体中。
所述核苷酸序列可以是源自混合的基因组和合成来源、混合的合成和cDNA来源、或混合的基因组和cDNA来源，其根据标准技术通过连接源自合成的、基因组的或cDNA的片段(根据需要)而制得。每个连接的片段对应于整个核苷酸序列的不同部分。所述DNA序列也可以使用特定引物通过聚合酶链式反应(PCR)来制备，如US 4,683,202或Saiki R K等(Science(1988)239，pp 487-491)中所述。
核苷酸序列
本发明还涵盖编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列。本文所用的术语“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列和其变体、同源物、片段和衍生物(如其部分)。所述核苷酸序列可以是源自基因组或合成物或重组物，其可以是双链的或单链的(无论其代表正义链还是反义链)。
本发明的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成的DNA和RNA。优选地，其指DNA，更优选为编码序列的cDNA。
在优选的实施方案中，编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列本身不涵盖在其天然环境中存在的天然核苷酸序列，此时该序列与同处于其天然环境中其天然结合序列相连接。为了便于参考，我们将此优选实施方案称为“非天然核苷酸序列”。由此，术语“天然核苷酸序列”是指与处于其天然环境中并与其天然结合的完整启动子(同处于其天然环境中)可操作地连接的完整核苷酸序列。因此，可以利用核苷酸序列在其天然生物中表达本发明的多肽，但是其中所述核苷酸序列不受所述生物中与其天然结合的启动子的控制。
优选地，所述多肽不是天然多肽。由此，术语“天然多肽”是指处于其天然环境中并已经由其天然核苷酸序列表达的完整多肽。
通常，使用重组DNA技术(即重组的DNA)制备编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列。然而，在本发明的另一个可选实施方案中，可以使用本领域已知的化学方法来合成全部或部分核苷酸序列(参见Caruthers MH等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23和Horn T等(1980)NucAcids Res Symp Ser 225-232)。
分子进化
分离出编码酶的核苷酸序列或鉴定出编码假定酶的核苷酸序列后，可能需要对所选择的核苷酸序列进行修饰，例如可能需要对所述序列进行突变以制备本发明的酶。
可以使用合成的寡核苷酸来引入突变。这些寡核苷酸包含目标突变位点侧翼的核苷酸序列。
Morinaga等(Biotechnology(1984)2，p646-649)中公开了适合的方法。Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，p 147-151)中描述了向编码酶的核苷酸序列中引入突变的另一种方法。
除了如上文所述的定点诱变，可以随机引入突变，如使用商品试剂盒，如来自Stratagene的GeneMorph PCR诱变试剂盒，或来自Clontech的DiversifyPCR随机诱变试剂盒。EP 0583265提到基于PCR的诱变的优化方法，其也可以结合使用DNA突变类似物，如EP 0866796中所述的那些。易错PCR技术也适用于制备具有优选性质的脂质酰基转移酶变体。WO0206457提到了脂肪酶的分子进化。
获得新型序列的第三种方法是使用任何数量的限制性酶或如Dnase I的酶将不同的核苷酸序列片段化，并重新组装成编码功能性蛋白的全长核苷酸序列。或者，可以使用一个或多个不同的核苷酸序列，并在重新组装全长核苷酸序列时引入突变。DNA改组(shuffling)和家族改组技术适用于制备具有优选性质的脂质酰基转移酶变体。适合进行“改组”的方法可以参见EP0752008、EP1138763、EP1103606。改组也可以与如US 6,180,406和WO 01/34835中所述的其它形式的DNA诱变相结合。
因此，有可能在体内或体外在核苷酸序列中产生大量定点突变或随机突变，并随后通过多种手段筛选功能性得到改进的编码多肽。可以使用例如计算机分析(in silico)和核酸外切酶介导(exo-mediated)的重组方法(参见WO00/58517、US 6,344,328、US 6,361,974)进行分子进化，其中所产生的变体保留了与已知酶或蛋白的很低的同源性。由此获得的所述变体可与已知的转移酶具有显著的结构类似性，但却具有很低的氨基酸序列同源性。
此外，如在非限定性实例中，多核苷酸序列的突变体或天然变体也可以与野生型或其它突变体或天然变体重组以生产新的变体。也可以筛选所述新的变体以获得功能性得到改进的编码多肽。
应用以上以及类似的分子进化方法能够在没有关于蛋白结构或功能的任何现有知识的情况下鉴定和选择具有优选特性的本发明的酶变体，并能够产生不可预测的但有益的突变体或变体。在本领域中应用分子进化来优化或改变酶活性的实例有很多，所述实例包括但不限于以下的一种或多种：优化在宿主细胞或体外的表达和/或活性、增加酶活性、改变底物和/或产物特异性、增加或降低酶稳定性或结构稳定性、改变在优选环境条件(如温度、pH、底物)中酶的活性/特异性。
使用分子进化工具可以改变酶以提高该酶的功能性，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
适合地，用于本发明的脂质酰基转移酶可以是变体，即当与亲本酶比较时，所述脂质酰基转移酶可以包含至少一个氨基酸的取代、缺失或添加。变体酶与亲本酶保持至少1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％的同源性。适合的亲本酶可以包括具有酯酶或脂肪酶活性的任何酶。优选地，亲本酶与pfam00657共有序列相比对。
在优选的实施方案中，脂质酰基转移酶变体保留或加入了在GDSx、GANDY和HPT区中发现的至少一个或多个pfam00657共有序列氨基酸残基。
可以使用分子进化工具使酶(如在含水环境中没有或具有低脂质酰基转移酶活性的脂肪酶)突变，以引入或增强转移酶活性，由此生产适合用于本发明的组合物和方法的具有显著转移酶活性的脂质酰基转移酶。
适合地，用于本发明的脂质酰基转移酶可以是变体，与亲本酶相比，该变体对极性脂质，优选磷脂和/或糖脂，具有增强的酶活性。优选地，所述变体还对溶血极性脂质(lyso polar lipid)具有低活性或无活性。对极性脂质、磷脂和/或糖脂的活性增强可能是由于水解和/或转移酶活性或二者组合的结果。
与亲本酶相比，用于本发明的脂质酰基转移酶变体可以对甘油三酯和/或甘油单酯和/或甘油二酯具有降低的活性。
适合地，所述酶变体可以没有对甘油三酯、和/或甘油单酯和/或甘油二酯的活性。
或者，用于本发明的所述酶变体可以对甘油三酯具有提高的活性，和/或也对以下的一种或多种具有提高的活性：极性脂质、磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱、糖脂、二半乳糖基甘油单酯、单半乳糖基甘油单酯。
脂质酰基转移酶变体是已知的，且一种或多种所述变体可以适用于本发明的方法和应用，和/或本发明的酶组合物。仅举例来说，根据本发明可以使用以下文献中阐述的脂质酰基转移酶变体：Hilton&Buckley J Biol.Chem.1991Jan 15：266(2)：997-1000；Robertson等J.Biol.Chem.1994Jan 21；269(3)：2146-50；Brumlik等J.Bacteriol 1996Apr；178(7)：2060-4；Peelman等Protein Sci.1998Mar；7(3)：587-99。
氨基酸序列
本发明还包括具有本文定义的特性的多肽的氨基酸序列。
本文所使用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白”同义。在一些实例中，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。
所述氨基酸序列可以从适合的来源制备/分离，或其可以通过合成制备、或其可以使用重组DNA技术制备。
适合地，所述氨基酸序列可以通过标准技术从本文教导的分离多肽获得。
一种适合测定分离多肽的氨基酸序列的方法如下：
可以将纯化的多肽冻干，并将100μg的冻干原料溶解于8M尿素和0.4M碳酸氢铵(pH 8.4)的50μl混合物中。在覆盖氮气并加入5μl 45mM二硫苏糖醇后，可以将溶解的蛋白在50℃变性并还原15分钟。冷却至室温后，可以加入5μl100mM碘乙酰胺，从而使半胱氨酸残基在室温、避光和氮气下衍生15分钟。
可以向以上反应混合物中加入135μl水和含5μg内切蛋白酶Lys-C的5μl水溶液，并在37℃氮气保护下消化24小时。
可以使用溶剂A(0.1％TFA的水溶液)和溶剂B(0.1％TFA的乙腈溶液)在VYDAC C18柱(0.46×15cm；10μm；The Separation Group，California，USA)上通过反相HPLC分离所得到的肽。在N-末端测序前，可以使用相同的溶剂体系在Develosil C18柱上对所选择的肽进行重新层析。可以使用AppliedBiosystems 476A测序仪，根据生产商的说明书(Applied Biosystems，California，USA)使用脉冲液态快速循环来完成测序。
序列同一性或序列同源性
本发明还包括与具有本文定义的特性的多肽的氨基酸序列或任何编码这样一个多肽的核苷酸序列的氨基酸序列(后面记为“同源序列”)具有一定程度的序列同一性或序列同源性的序列的应用。在此，术语“同源物”是指与目标氨基酸序列和目标核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可以等同于“同一性”。
所述同源氨基酸序列和/或核苷酸序列可以提供和/或编码保留所述酶的功能活性和/或增强所述酶的活性的多肽。
在本文中，认为同源序列包括可以与目标序列有至少75％、85％或90％同一性，优选为至少95％或98％同一性的氨基酸序列。通常，同源物将包含与目标氨基酸序列相同的活性位点等。虽然同源性也可以被视为相似性(即氨基酸残基具有相似的化学性质/功能)，但是在本发明的内容中，优选同源性表达序列的同一性。
在本文中，认为同源序列包括可以与编码本发明多肽的核苷酸序列(目标序列)有至少75％、85％或90％同一性的核苷酸序列，优选为至少95％或98％同一性的核苷酸序列。通常，同源物将包括与目标序列相同的活性位点编码序列等。虽然同源性也可以被视为相似性(即氨基酸残基具有相似的化学性质/功能)，但是在本发明的内容中，优选同源性表达序列的同一性。
可以通过目测进行同源性比较，或者更通常是借助易于获得的序列比较程序进行同源性比较。这些商业性计算机程序可以计算两个或多个序列间的同源性％。
可以在连续的序列中计算同源性％，即一个序列与其它序列比对，且将一个序列中的每个氨基酸与其它序列中的相应氨基酸直接比较，每次比较一个残基。这被称为“无空位”比对。通常所述无空位比对仅在数量相对少的残基中进行。
虽然这是非常简单且稳定的方法，但是其未能考虑到如在其它方面相同的成对序列中，一个插入或缺失将引起随后的氨基酸残基无法比对，因此可能导致在进行整体比对时的同源性％大大降低。因此，大部分序列比对方法被设计成产生考虑了可能的插入和缺失而不过度地惩罚整体同源性得分的最佳比对。这可以通过在比对序列中插入“空位”以试图使局部同源性最大化而实现。
然而，这些更加复杂的方法给比对中出现的每个空位赋予“空位罚分”，使得对于相同数目的相同氨基酸，具有尽量少空位的序列比对(反映了两个比较的序列间更高的相关性)将比具有更多空位的序列比对具有更高的得分。通常使用“仿射空位罚分”(Affine gap cost)，即对空位的存在处以较高罚分，而对空位中的每个后续残基处以较小罚分。这是最常用的空位评分系统。高空位罚分将无疑产生具有更少空位的优化比对。大多数比对程序允许修正空位罚分。然而，当使用所述软件进行序列比较时，优选使用默认值。例如，当使用GCG Wisconsin最佳拟合程序包时，默认的氨基酸序列空位罚分为每个空位-12和每个延伸-4。
计算最大同源性％首先需要考虑到空位罚分，产生最佳排列，实现这样排列的适宜的计算机程序是GCG Wisconsin最佳拟合程序包(Devereux等1984Nuc.Acids Research 12p387)或Vector NTI(Invitrogen Corp.)。可进行序列对比的软件实例，包括例如，BLAST程序包(参见Ausubel等1999ShortProtocols in Molecular Biology，4th Ed，Chapter 18)，FASTA(Altschul etal 1990J.Mol.Biol.403-410)和Align X，但不限于此。BLAST和FASTA都可以脱机和在线检索(参见Ausubel等1999，7-58页至7-60页)。称为BLAST 2序列的新工具也可以用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 1999174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett1999 177(1)：187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)
尽管最终同源性％能够以同一性的方式测定，排列程序普遍不是基于一种全或无的成对比较。作为替代，成比例的相似性分数矩阵是普遍应用的，该矩阵为基于化学相似性和进化距离的每个配对比较分配分值。平常应用的这样一种矩阵的一个实例就是BLOSUM62矩阵——BLAST程序组件的缺省矩阵。如果能提供的话(想得到进一步的详细信息，参见用户手册)，Vector NTI程序和GCG Wisconsin程序通常应用公开的缺省值或应用定制的标记比较表。在一些应用中，优选使用GCG程序包或Vector NTI公开的缺省值，或者在应用其它软件的情况下，使用缺省的矩阵，如BLOSUM62。
或者，也可以使用基于与CLUSTAL(Higgins DG&Sharp PM(1988)，Gene 73(1)，237-244)类似的算法的DNASISTM(Hitachi Software)中的多重比对特征来计算同源性％。
如果在测定序列同一性时使用空位罚分，随后优选使用以下参数进行成对比对：
  BLAST
  空位开放   0
  空位延伸   0
CLUSTAL   DNA   蛋白
字长(WORD SIZE)   2   1   K三联体
空位罚分   15   10
空位延伸   6.66   0.1
在一个实施方案中，可以使用具有以上定义的空位罚分和空位延伸的CLUSTAL。
适合地，在至少20个连续的核苷酸中，优选为在至少30个连续的核苷酸中，优选为在至少40个连续的核苷酸中，优选为在至少50个连续的核苷酸中，优选为在至少60个连续的核苷酸中，优选为在至少100连续的核苷酸中测定核苷酸序列的同一性程度。
适合地，在全序列中测定核苷酸序列中的同一性程度。
一旦软件生成了最佳比对，就可以计算同源性％，优选为序列同一性％。软件通常将其作为序列比较的一部分来执行，并生成数值结果。
所述序列也可以具有产生沉默改变和产生功能等价物的氨基酸残基的缺失、插入或取代。可以根据残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质上的相似性来进行谨慎的氨基酸取代，只要该物质的次要结合活性被保持即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电荷的极性头基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
例如可以根据下表进行保守取代。在第二列中相同栏中的氨基酸，优选为在第三列中相同行中的氨基酸可以相互取代：
Figure GPA00001103919300841
本发明还涵盖可以发生的同源取代(本文所用的取代和替换均指现存氨基酸残基与可选残基的互换)，即相似取代，如碱性氨基酸取代碱性氨基酸、酸性氨基酸取代酸性氨基酸、极性氨基酸取代极性氨基酸等。也可以发生非同源取代，即从一类残基变成另一类残基，或涉及非天然氨基酸，如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯甘氨酸。
也可以使用非天然氨基酸进行替换。
氨基酸变体序列可以包含可以在序列的任何两个氨基酸残基间插入的适合的间隔子基团，除氨基酸间隔子如甘氨酸或β-丙氨酸残基外，还包括烷基基团如甲基、乙基或丙基基团。本领域的技术人员可充分理解其它形式的变异，其涉及以类肽(peptoid)形式存在的一个或多个氨基酸残基。为了避免争议，“类肽形式”用来指α-碳取代基基团在残基的氮原子上而非在α-碳上的氨基酸残基变体。制备类肽形式的肽的方法是本领域内已知的，如Simon RJ等，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，Trends Biotechnol.(1995)13(4)，132-134。
本发明所使用的或编码具有本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列可以在其内部包含合成的或修饰的核苷酸。本领域中已知对寡核苷酸的许多不同类型的修饰。这些修饰包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架和/或在分子的3’末端和/或5’末端添加吖啶或多赖氨酸链。出于本发明的目的，应该理解可以用本领域中可用的任何方法来修饰本文所述的核苷酸序列。可以进行所述修饰以增强核苷酸序列的体内活性或寿命。
本发明还涵盖与本文所讨论的序列或其任何衍生物、片段或衍生物互补的核苷酸序列的应用。如果序列与其片段互补，此序列可以被用作探针以鉴定其它生物等中相同的编码序列。
可以以多种方式获得与本发明的序列并非100％同源但却落入本发明范围中的多核苷酸。可以通过例如探测由一系列个体(如来自不同种群的个体)制备的DNA文库来获得本文所述序列的其它变体。此外，可以获得其它病毒/细菌或细胞同源物，特别是在哺乳动物细胞(如大鼠、小鼠、牛和灵长类细胞)中发现的细胞同源物，且所述同源物或其片段将通常能够选择性地与本文序列表中所示的序列杂交。可以通过探测从其它动物物种制备的cDNA文库或基因组DNA文库，并在中度至高度严谨条件下使用包含所附序列表中任何一个序列的全部或部分的探针探测所述文库来获得所述序列。类似的考虑用于获得本发明多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。
也可以使用简并PCR来获得变体和株系/物种同源物，所述简并PCR将使用设计为靶向变体和同源物中编码本发明序列中的保守氨基酸序列的序列。例如可以通过比对来自多个变体/同源物的氨基酸序列来预测保守序列。可以使用本领域已知的计算机软件进行序列比对。例如广泛使用GCGWisconsin PileUp程序。
简并PCR中所用的引物可包含一个或多个简并位点，且其使用条件的严谨性可低于使用针对已知序列的单一序列引物克隆序列所用的那些条件。
或者，也可以通过已表征序列的定点诱变来获得所述多核苷酸。例如当需要沉默密码序列的改变，从而为表达多核苷酸序列的特定宿主细胞优化密码子偏爱性时，这可能是有用的。可能需要其它序列改变，以引入限制性多肽识别位点，或改变由多核苷酸编码的多肽的性质或功能。
可以使用本发明的多核苷酸(核苷酸序列)制备引物，如PCR引物，用于可选扩增反应的引物；探针，如使用放射性或非放射性标记物通过常规方法用显色标记物标记的探针；或可以将多核苷酸克隆到载体中。所述引物、探针和其它片段的长度可以是至少15个，优选为至少20个，如至少25个，30个或40个核苷酸，且其也涵盖在如本文所用的术语多核苷酸之内。
可以重组、合成或通过本领域技术人员可利用的任何方法来制备根据本发明的多核苷酸(如DNA多核苷酸)和探针。它们也可以通过标准技术进行克隆。
通常，可通过合成方法来制备引物，该方法包括以每次一个核苷酸的方式逐步制备所需要的核酸序列。本领域中易于获得使用自动化技术来实现上述方法的技术。
通常使用重组方法，如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术来制备较长的多核苷酸。这包括制备位于所需要克隆的脂质靶向序列区域侧翼的一对引物(如约15至30个核苷酸)，使引物接触从动物或人细胞获得的mRNA或cDNA，在可以使所需区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段(如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)，并回收扩增的DNA。可以设计引入使其包含适合的限制性酶识别位点，以便可以将扩增的DNA克隆到适合的克隆载体中。
杂交
本发明还涵盖与本发明的序列互补的序列，或能够与本发明的序列杂交或与其互补序列杂交的序列。
本文所用的术语“杂交”包括“一条核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程”，以及在聚合酶链式反应(PCR)技术中进行扩增的过程。
本发明还涵盖所述核苷酸序列的应用，所述核苷酸序列能够和与本文所讨论的目标序列、或其任何衍生物、片段或衍生物互补的序列杂交。
本发明还涵盖能够与本文所讨论的核苷酸序列杂交的序列的互补序列。
杂交条件基于核苷酸结合复合物的解链温度(Tm)，如Berger和Kimmel(1987，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology，Vol.152，Academic Press，San Diego CA)中所教导，且给出了如下文所解释的定义的“严谨性”。
最高严谨性通常出现在约Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)；高严谨性在比Tm低约5℃至10℃；中等严谨性比Tm低约10℃至20℃；低严谨性出现在比Tm低约20℃至25℃。如本领域技术人员的理解，最高严谨性杂交可以用于鉴定或检测相同的核苷酸序列，而中等(或低)严谨性杂交可以用于鉴定或检测相似或相关的多核苷酸序列。
优选地，本发明涵盖能够在高严谨性条件或中等严谨性条件下与编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列杂交的序列的互补序列。
更优选地，本发明涵盖能够在高严谨性条件(如65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠，pH 7.0})下与编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列发生杂交的序列的互补序列。
本发明还涉及能够与本文讨论的核苷酸序列(包括本文讨论的那些序列的互补序列)杂交的核苷酸序列。
本发明还涉及能够与本文讨论的核苷酸序列(包括本文讨论的那些序列的互补序列)杂交的序列的互补核苷酸序列。
本发明的范围还包括能够在中等至最高严谨性条件下与本文所讨论的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列。
在优选的方面，本发明涵盖能够在严谨性条件(如50℃和0.2×SSC)下与本文所讨论的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。
在更优选的方面，本发明涵盖能够在高严谨性条件(如65℃和0.1×SSC)下与本文所讨论的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。
多肽的表达
可以将用于本发明的核苷酸序列或用于编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列引入重组的复制型载体中。载体可以用于在相容的宿主细胞中和/或从相容的宿主细胞复制并以多肽形式表达所述核苷酸序列。可以使用包控制序列来控制表达，所述控制序列包括含启动子/增强子和其它表达调控信号。可以使用原核生物的启动子和在真核细胞中有功能的启动子。可以使用组织特异的或刺激特异性启动子。也可以使用包含来自上述两个或更多不同启动子的序列元件的嵌合启动子。
根据所用的序列和/或载体，通过由宿主重组细胞表达核苷酸序列而产生的多肽可以被分泌，或被包含在细胞内。编码序列经设计可以具有信号序列，该信号序列指导编码序列物质分泌通过特定的原核生物或真核细胞膜。
表达载体
术语“表达载体”意思是一种能够在体内或体外表达的构建体。
优选地，表达载体插入到生物体基因组中。术语“插入”优选包括稳定地插入到基因组中。
本发明的核苷酸序列或编码具有本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列可以存在于载体中，其中所述核苷酸序列可操作地连接到调控序列上，使得该调控序列能够通过适宜的宿主生物体表达核苷酸序列，即该载体是表达载体。
本发明的载体可以被转化到合适的以下描述的宿主细胞中来表达具有本文定义的特定性质的多肽。
载体例如质粒、粘粒、病毒或嗜菌体的选择通常依赖于其被引入的宿主细胞。
载体可以包含一种或多种选择性标记基因-诸如提供抗生素抗性的基因，如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。或者，该选择可以通过共转化完成(如WO91/17243中描述的)。
载体可体外使用，例如产生RNA或用于转染或转化宿主细胞。
因此，在进一步的实施方案中，本发明提供制备本发明的核苷酸序列或编码具有本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列的方法，所述方法是通过将核苷酸序列引入到可复制载体中，将该载体引入到适合的宿主细胞中，和在能够引起所述载体复制的条件下使所述宿主细胞生长。
载体可以进一步包含在目标宿主细胞中使载体能够复制的核苷酸序列。这些序列的实例是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。
调控序列
在一些应用中，本发明使用的核苷酸序列或编码具有本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列可以可操作地连接到调控序列上，例如通过被选宿主细胞所述调控序列能够提供所述核苷酸序列的表达。例如，本发明包括这样的载体，其包含可操作地连接到所述调控序列上的本发明核苷酸序列，即该载体是表达载体。
术语“可操作地连接”是指并列放置(juxtaposition)，其中所述组件的关系允许它们能以其希望的方式发挥功能。“可操作地连接”到编码序列的调控序列的连接方式使其能在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
本文使用的术语“启动子”是本领域内可常规使用的，例如RNA聚合酶结合位点。
编码具有本文定义的特定性质的酶的核苷酸序列的增强表达也可以通过选择异源的调控序列例如启动子、分泌前导序列(secretion leader)和终止区来完成。
优选地，本发明的核苷酸序列可以与至少一个启动子可操作地连接。
指导细菌、真菌或酵母宿主内核苷酸序列转录的适宜启动子的例子是本领域公知的。
构建体
术语“构建体”，与术语如“结合物(或连接物)”、“盒(cassette)”和“杂合体(hybrid)”同义，其包含依照本发明使用的编码具有本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列，且其直接或间接地与启动子连接。间接连接的实例是在启动子和本发明的核苷酸序列之间提供适合的间隔子基团，如内含子序列，如Sh1内含子或ADH内含子。本发明中的相关术语“融合”也是如此，其包括直接或间接连接。在一些情况中，这些术语不涵盖编码所述蛋白的核苷酸序列与其通常连接的野生型基因启动子的天然组合(此时这两者均处于其天然环境中)。
所述构建体甚至可以包含或表达允许选择基因构建体的标记物。
对于一些应用，优选构建体至少包含本发明的核苷酸序列，或编码具有如本文定义的特定性质的多肽且可操作地与启动子连接的核苷酸序列。
宿主细胞
本发明的术语“宿主细胞”包括任何细胞，该细胞包含编码具有本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列，或者上面描述的用于重组制备具有本文定义的特定性质的多肽的表达载体。
因此，本发明进一步的实施方案提供用本发明的核苷酸序列或表达具有本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列所转化或转染的宿主细胞。可选择所述细胞与上述载体相容，并且所述细胞可以例如是原核生物(如细菌)、真菌、酵母或植物细胞。优选的宿主细胞不是人细胞。
适合的细菌宿主生物体的例子是革兰阴性菌或革兰氏阳性菌。
依赖于编码具有本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列性质，和/或进一步加工所表达蛋白质的需求，真核生物的宿主例如酵母或其它真菌是优选的。一般地，相对真菌细胞而言，酵母细胞是优选的，因为酵母细胞较容易操纵。然而，一些蛋白质从酵母细胞中分泌不良，或者在以下情况下没有被正确地加工(例如酵母中的高糖基化)。在这些情况下，应选择不同的真菌宿主生物体。
适宜的宿主细胞，如酵母、真菌和植物宿主细胞的使用可以提供翻译后修饰(例如豆蔻酰化、糖基化、截短、脂质化(lapidation)以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)，这可能是使本发明的重组表达产物具有最佳生物活性所需要的。
所述宿主细胞可以是蛋白酶缺陷的或蛋白酶阴性(minus)菌株。
生物体
本发明的术语“生物体”包括任何包含本发明所述的核苷酸序列，或包含用于编码具有本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列和/或由此获得的产品的生物体。
适宜的生物体可包括原核生物、真菌，酵母或植物。
与本发明有关的术语“转基因生物体”包括任何包含编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物的生物，和/或其中启动子能够允许编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列在所述生物内表达。优选核苷酸序列被引入到生物的基因组中。
术语“转基因生物体”不涵盖在处于自身天然环境中并同时受到其同处于自身天然环境中的天然启动子控制的天然核苷酸编码序列。
因此，本发明的转基因生物包括包含以下任何一种或组合的生物：编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列、本文定义的构建体、本文定义的载体、本文定义的质粒、本文定的细胞或其产物。例如，转基因生物体还可包含在异源启动子控制下用于编码具有本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列。
宿主细胞/宿主生物体转化
正如之前指出的，宿主生物体可以是原核生物体或真核生物体。适合的原核生物宿主的例子包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。
原核宿主的转化的教导在本领域中有详细的记载，例如参见Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，1989，Cold SpringHarbor Laboratory Press)。如果使用原核宿主，则在转化前需要适当地修饰核苷酸序列，例如去除内含子。
在另一个实施方案中，所示转基因生物可以为酵母。
可以利用本领域已知的多种方法转化丝状真菌，例如包括原生质体形成和原生质体转化，然后以已知的方式重建细胞壁的方法。在EP 0238023中公开了曲霉作为宿主微生物的应用。
另一种宿主生物可以为植物。用于转化植物的常用技术的概述可见于Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)。关于植物转化的其它教导可见于EP-A-0449375。
以下部分为关于真菌、酵母和植物转化的一般教导。
转化的真菌
宿主生物可以为真菌，例如丝状真菌。此类宿主的合适实例包括属于嗜热菌属(Thermomyces)、枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属、青霉属(Penicillium)、毛霉菌属(Mucor)、脉孢菌属(Neurospora)和木霉属(Trichoderma)等的任何成员。
关于转化丝状真菌教导的概述见于US-A-5741665，其中声称用于丝状真菌转化以及真菌培养的标准技术是本领域所熟知的。应用于链孢霉(N.crassa)的技术的研究进展见于，例如Davis and de Serres，Methods Enzymol(1971)17A：79-143。
关于丝状真菌的进一步教导的概述见于US-A-5674707。
一方面，所述宿主生物可以为曲霉属，例如黑曲霉。
本发明的转基因曲霉属还可以通过以下制备，例如Turner G.1994(Vectors for genetic manipulation.In：Martinelli S.D.，Kinghorn J.R.(编著)Aspergillus：50years on.Progress in industrial microbiology vol 29.ElsevierAmsterdam 1994.pp.641-666)的教导。
丝状真菌的基因表达的综述见于Punt等.(2002)Trends Biotechnol 2002May；20(5)：200-6，Archer&Peberdy Crit Rev Biotechnol(1997)17(4)：273-306。
转化的酵母
在另一个实施方案中，所示转基因生物可以为酵母。
酵母中异源基因表达的原则的综述见于，例如Methods Mol Biol(1995)，49：341-54，and Curr Opin Biotechnol(1997)Oct；8(5)：554-60。
在这一点上，酵母，例如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(参见FEMS Microbiol Rev(200024(1)：45-66)可用作异源基因表达的载体。
在酿酒酵母中的异源基因表达和基因产物的分泌的原则的综述见于EHinchcliffe E Kenny(1993，″Yeast as a vehicle for the expression of heterologousgenes″，Yeasts，Vol 5，Anthony H Rose and J Stuart Harrison，eds，2nd edition，Academic Press Ltd.)。
对于酵母的转染，已经开发出了多个转染方法。例如，本发明的转基因酵母可以根据以下教导制备：Hinnen等，(1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the USA 75，1929)；Beggs，J D(1978，Nature，London，275，104)；和Ito，H等(1983，J Bacteriology 153，163-168)。
可以利用各种筛选标记物筛选转化的酵母细胞，例如营养缺陷型标记物、显性抗生素抗性标记物。
合适的酵母宿主生物可以选自在生物技术上相关的酵母种，例如但不限于选自毕赤酵母、汉逊酵母、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、耶氏酵母(Yarrowinia)、酵母菌(包括酿酒酵母)或裂殖酵母菌(包括粟酒裂殖酵母)的酵母种。
甲醇营养型酵母种的菌株巴斯德毕赤酵母可以用作宿主生物。
在一个实施方案中，所述宿主生物可以为汉逊酵母种，例如汉森酵母(H.polymorpha)(如WO01/39544中的阐述)。
转化的植物/植物细胞
适合用于本发明的宿主生物可以为植物。常用技术的综述可见于以下文献：Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 199417-27)，或者WO01/16308。转基因植物可以产生，例如水平提高的植物甾醇酯和植物甾烷醇酯。
因此，本发明还涉及产生具有增强水平的植物甾醇酯和植物甾烷醇酯的转基因植物的方法，其包括以下步骤：利用本文定义的脂质酰基转移酶(尤其是利用包含本文定义的脂质酰基转移酶的表达载体或构建体)转化植物细胞，和由转化的植物细胞培养出植物。
分泌
通常，期望表达宿主将多肽分泌到培养基中，由此可以更容易地回收酶。根据本发明，可以基于所需的表达宿主来选择分泌前导序列。本发明中也可以使用杂合信号序列。
异源分泌前导序列的典型实例是那些源于真菌淀粉葡萄糖苷酶(AG)基因(glaA-18个氨基酸和24个氨基酸两种形式，如来自曲霉菌属)、a-因子基因(酵母，如酵母属、克鲁维酵母和汉逊酵母)或α-淀粉酶基因(芽孢杆菌)的序列。
检测
本领域已知多种用于检测和测定氨基酸序列表达的操作方法。实例包括酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和荧光活化的细胞分选(FACS)。
本领域技术人员已知多种标记物和结合技术，并可以将其用于各种核酸和氨基酸分析。
许多公司如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)和US Biochemical Corp(Cleveland，OH)为这些方法提供商业试剂盒和操作说明。
适合的报告分子或标记物包括那些放射性核素、酶、荧光剂、化学发光剂或显色剂，以及底物、辅助因子、抑制剂和磁性粒子等。教导这些标记物应用的专利包括US-A-3,817,837、US-A-3,850,752、US-A-3,939,350、US-A-3,996,345、US-A-4,277,437、US-A-4,275,149和US-A-4,366,241。
此外，可以如US-A-4,816,567中所示制备重组免疫球蛋白。
融合蛋白
具有本文所定义的特定性质的多肽可以作为融合蛋白制备，例如以便有助于其提取和纯化。融合蛋白配偶体(partner)的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录激活结构域)和β-半乳糖苷酶。也可以方便地在融合蛋白配偶体和目的蛋白序列之间包含蛋白水解切割位点以去除融合蛋白序列。优选地，融合蛋白将不会妨碍蛋白序列的活性。
Curr.Opin.Biotechnol.(1995)6(5)：501-6已经对大肠杆菌中的基因融合表达系统进行了综述。
在本发明的另一个实施方案中，具有如本文定义的特定性质的多肽的氨基酸序列可以与异源序列连接以编码融合蛋白。例如，为了筛选多肽文库寻找能够影响物质活性的试剂，其可用于编码表达可被商购抗体所识别的异源表位的嵌合体。
下文将参照以下附图和实施例，仅以举例的方式描述本发明。
图1显示来自第6版数据库的pfam00657共有序列(SEQ ID No.1)；
图2显示从生物体嗜水气单胞菌获得的氨基酸序列(SEQ ID No.2)(P10480；GI：121051)；
图3显示从生物体杀鲑气单胞菌获得的氨基酸序列(SEQ ID No.3)(AAG098404；GI：9964017)；
图4显示从生物体天蓝色链霉菌A3(2)获得的氨基酸序列(SEQ ID No.4)(Genbank登录号NP 631558)；
图5显示从生物体天蓝色链霉菌A3(2)获得的氨基酸序列(SEQ ID No.5)(Genbank登录号CAC42140)；
图6显示从生物体酿酒酵母获得的氨基酸序列(SEQ ID No.6)(Genbank登录号P41734)；
图7显示所选序列与pfam00657共有序列的比对；
图8显示SEQ ID No.3与SEQ ID No.2配对比对，其显示93％的氨基酸序列同一性。信号序列加下划线。+表示不同。含有活性位点丝氨酸16的GDSX基序以及活性位点天冬氨酸116和组氨酸291被突出显示(参见阴影区)。氨基酸后的数字是减去信号序列的编号；
图9显示编码从生物体嗜水气单胞菌获得的本发明脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.7)；
图10显示编码从生物体杀鲑气单胞菌获得的本发明脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.8)；
图11显示编码从生物体天蓝色链霉菌A3(2)获得的本发明脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.9)(Genebank登录号NC_003888.1：8327480..8328367)；
图12显示编码从生物体天蓝色链霉菌A3(2)获得的本发明脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.10)(Genebank登录号AL939131.1：265480..266367)；
图13显示编码从生物体酿酒酵母获得的本发明脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.11)(Genebank登录号Z75034)；
图14显示从生物体雷尔氏菌获得的氨基酸序列(SEQ ID No.12)(Genebank登录号AL646052)；
图15显示编码从生物体雷尔氏菌获得的本发明脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.13)；
图16显示SEQ ID No.20。Scoe1 NCBI蛋白登录号CAB39707.1GI：4539178的保守的假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图17显示如SEQ ID No.21所示的核苷酸序列，其编码NCBI蛋白登录号CAB39707.1GI：4539178的保守假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图18显示如SEQ ID No.22所示的氨基酸。Scoe2NCBI蛋白登录号CAC01477.1GI：9716139的保守的假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图19显示SEQ ID No.23所示的核苷酸序列，其编码Scoe2NCBI蛋白登录号为CAC01477.1GI：9716139的保守的假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图20显示氨基酸序列(SEQ ID No.24)。Scoe3NCBI蛋白登录号CAB88833.1GI：7635996的推定的分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图21显示SEQ ID No.25所示的核苷酸序列，其编码Scoe3NCBI蛋白登录号为CAB88833.1GI：7635996的推定的分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图22显示氨基酸序列(SEQ ID No.26)。Scoe4NCBI蛋白登录号CAB89450.1GI：7672261的推定的分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图23显示SEQ ID No.27所示的核苷酸序列，其编码Scoe4NCBI蛋白登录号为CAB89450.1GI：7672261的推定的分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图24显示氨基酸序列(SEQ ID No.28)。Scoe5NCBI蛋白登录号CAB62724.1GI：6562793的推定的脂蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图25显示SEQ ID No.29所示的核苷酸序列，其编码Scoe5NCBI蛋白登录号为CAB62724.1GI：6562793的推定的脂蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图26显示氨基酸序列(SEQ ID No.30)。Srim1NCBI蛋白登录号AAK84028.1GI：15082088的GDSL-脂肪酶[龟裂链霉菌]；
图27显示SEQ ID No.31所示的核苷酸序列，其编码Srim1NCBI蛋白登录号为AAK84028.1GI：15082088的GDSL-脂肪酶[龟裂链霉菌]；
图28显示从嗜水气单胞菌(ATCC#7965)获得的脂质酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No.32)；
图29显示编码从嗜水气单胞菌(ATCC#7965)获得的脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.33)；
图30显示从杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.Salmonicid)(ATCC#14174)获得的脂质酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No.34)；
图31显示编码从杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(ATCC#14174)获得的脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.35)；
图32显示可使用美国国家生物技术信息中心(NIH，MD，USA)的基础局部序列比对检索工具服务(basic local alignment search tool service)和完整基因组数据库鉴定出气单胞菌基因的同源物。GDSX基序已在数据库搜索中使用，而且鉴定了可能编码具有脂解活性的酶的许多序列/基因。已从链霉菌属、黄单胞菌属和雷尔氏菌属中鉴定了基因。如下面的例子，青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)与杀鲑气单胞菌(satA)基因作比对。成对比对表现出23％的同一性。活性位点丝氨酸出现在氨基端，且能够鉴定催化性残基组氨酸和天冬氨酸；
图33显示Pfam00657.11[家族00657，数据库版本11]共有序列(此后称作Pfam共有)以及不同序列与Pfam共有序列的比对。箭头表示活性位点残基，加下划线的框表示三种已由[Upton C and Buckley JT(1995)TrendsBiochem Sci 20；179-179]标明的同源框。Pfam共有中的大写字母表示许多家族成员的保守残基。“-”标记表示预期在Pfam共有序列的隐藏Markov模型中发现残基而没有发现残基，因而有空位被插入的位点。“.”标记表示在Pfam共有序列中没有对应残基的残基。这些序列是在图16、18、20、22、24、26、28和30中列出的氨基酸序列；
图34显示Pfam00657.11[家族00657，数据库版本11]共有序列(此后称作Pfam共有)以及不同序列与Pfam共有序列的比对。箭头表示活性位点残基，加下划线的框表示三种已由[Upton C and Buckley JT(1995)TrendsBiochem Sci 20；179-179]标明的同源框。Pfam共有中的大写字母表示许多家族成员的保守残基。“-”标记表示Pfam共有序列的隐藏Markov模型中期望发现残基而没有发现残基，因而有空位被插入的位点。“.”标记表示在Pfam共有序列中没有对应残基的残基。这些序列是在图2、16、18、20、26、28和30中列出的氨基酸序列。发现这些蛋白都对脂质底物具有活性；
图35显示包含羧基末端组氨酸标记的杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶基因的表达载体pet12-AsalGCAT-pSM；
图36显示用NEFA试剂盒测定法测试的细胞提取物的结果，结果描述了重组体杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶对卵磷脂的活性。从左至右的孔表示的是：阳性对照，阴性对照(即空质粒提取物)和IPTG诱导后温育0、1、2和3小时收集的样本；
图37显示含表达载体pet12-AsalGCAT-pSM的BL21(DE3)pLysS的生长优化，其显示在30℃培养产生了对卵磷脂具有高活性的酶。用NEFA试剂盒测定法来测试细胞提取物的磷脂酶活性。从左至右的孔表示的是：阳性对照；阴性对照；20℃；30℃；
图38显示与底物卵磷脂一同温育、表达活性脂质酰基转移酶的BL21(DE3)pLysS的细胞粗提物，反应混合物通过薄层色谱法分析，显示降解产物的存在。泳道：1.无酶；2.+杀鲑气单胞菌(10μl)37℃；3.+杀鲑气单胞菌(20μl)37℃；4.+杀鲑气单胞菌(10μl)24℃；5.+杀鲑气单胞菌(20μl)24℃；
图39显示部分纯化的杀鲑气单胞菌酰基转移酶，其显示与纯化的组氨酸标记蛋白相关的磷脂酶活性。SE＝超声提取物，His＝用Qiagen的Ni-NTA柱离心试剂盒(Ni-NTA spin-kit)纯化；
图40显示包含C-末端组氨酸标签的嗜水气单胞菌甘油脂质酰基转移酶(GCAT)基因的表达载体pet12-A.h.GCAT-pSMa，其用于转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS；
图41显示使用Non-Esterified Fatty Acid(NEFA)试剂盒(Roche，瑞士)测定的、含有重组嗜水气单胞菌GCAT酶的粗提物(5和10μl)对卵磷脂的活性，显示存在对磷脂，卵磷脂具有活性的酶；
图42显示含有表达载体pet12-AsalGCAT-pSM的BL21(DE3)pLysS生长优化，其显示在30℃培养产生了对卵磷脂具有高活性的酶。用NEFA试剂盒测定法来测试细胞提取物的磷脂酶活性；
图43显示部分纯化的嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌的酰基转移酶，其显示与纯化的组氨酸标记蛋白相关的磷脂酶活性。SE＝超声提取物，His＝用Qiagen的Ni-NTA柱离心试剂盒纯化；
图44显示气单胞菌基因在枯草芽孢杆菌163中的表达，其显示产生了对卵磷脂和DGDG均具有活性的分泌性酶。pUB-AH为包含嗜水气单胞菌基因的构建体，并且pUB-AS为带有杀鲑气单胞菌基因的构建体，培养物滤液与底物一起温育60分钟；
图45与图46显示在展开剂IV中的薄层色谱板(氯仿∶甲醇∶水(65∶25∶4))；泳道1：40mg谷甾醇30分钟；泳道2：转移酶+40mg谷甾醇30分钟；泳道3：转移酶+80mg谷甾醇30分钟；泳道4：转移酶+40mg谷甾醇120分钟；泳道5：转移酶+80mg谷甾醇120分钟；泳道6：转移酶+40mg谷甾醇300分钟；泳道7：40mg谷甾醇300分钟；泳道8：胆固醇；泳道9：谷甾醇；
图47描述了通过脂质酰基转移酶的催化作用，磷脂酰胆碱与胆固醇之间的反应；
图48显示对从酶处理或不经酶处理的蛋黄中提取的脂质进行薄层色谱分析，6)0.31PLU/g转移酶#179，7)1.25PLU/g转移酶#178-9，8)23.25PLU/g转移酶#3108，9)对照；
图49显示用酶处理或不经酶处理的蛋黄生产的蛋黄酱检测样本：5)转移酶#179，0.31PLU/g，6)转移酶#178-9，1.25PLU/g，7)磷脂酶#3108，23.3PLU/g，8)对照，水；
图50显示用从嗜水气单胞菌提取的脂质酰基转移酶处理的蛋黄脂质的薄层色谱(在溶剂I中)；
图51显示用从嗜水气单胞菌提取的脂质酰基转移酶处理的蛋黄脂质的薄层色谱(在溶剂IV中)；
图52显示不同时间进程的转移酶处理的蛋黄脂质的薄层色谱分析；
图53显示应用脂质酰基转移酶(Tranf#178-9)时脂肪酸和甾醇酯的产生量作为时间的函数，并与应用对照的脂解酶，绵毛嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)作比较；
图54显示在高含水量的蛋黄中的酶促反应中表示为％转移酶活性和水解活性的相对转移酶活性，#1991(磷脂酶A2)和#2427(磷脂酶A1)是对照磷脂酶，#178是脂质酰基转移酶；
图55显示含水量对在高含水量的蛋黄中的转移酶反应中测定的转移酶#178的转移酶活性的影响；
图56显示在含水量高的蛋黄中的转移酶反应中脂质酰基转移酶(#178)的转移酶活性作为反应时间的函数；
图57和图58所示的图描述了脂肪酸和胆固醇酯作为时间的函数。这些图描述了测定中通过气液色谱分析法获得的结果，该测定用缓冲液中的卵磷脂和胆固醇作为底物测定了脂质酰基转移酶活性；
图59显示溶剂I中的薄层色谱。经来自于杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶#138处理的蛋黄(泳道1和2)，或用磷脂酶#2938(LIPOPAN F)处理的蛋黄(泳道3)，或未经过处理的蛋黄(泳道4)；
图60显示溶剂IV中的薄层色谱。经脂质酰基转移酶#138处理的蛋黄(泳道1和2)，或用磷脂酶#2938处理的蛋黄(泳道3)，或未经过处理的蛋黄(泳道4)；
图61显示经脂质酰基转移酶#138处理的蛋黄(样本1和2)，或用磷脂酶#2938处理的蛋黄(样本3)，或未经过处理的蛋黄(样本4)；
图62显示在100℃处理2小时后的食物乳液。0)未处理的蛋黄，1)经脂质酰基转移酶#138处理210分钟的蛋黄，3)经对照磷脂酶#2938处理210分钟的蛋黄；
图63显示薄层色谱板，其显示对植物甾醇和甘油的转移酶活性的筛选。PC＝磷脂酰胆碱，LPC＝溶血磷脂酰胆碱，PE＝磷脂酰乙醇胺；monogl＝甘油单酯；
图64显示溶剂I中的薄层色谱板，样本1到6是反应24小时后，样本1到4是反应4小时后。薄层色谱分析证实在样本1、2、5和6中形成了甾醇酯；
图65显示溶剂I中的薄层色谱板，其中来自杀鲑气单胞菌的固定化的酰基转移酶的转移酶活性在油混合物中测试，使用在0.5、1、3、6和24小时取出的样本；
图66与图67显示溶剂I和IV中的薄层色谱板：泳道1＝卵磷脂；泳道2＝对照，10分钟；泳道3＝0.75PLU，10分钟；泳道4＝0.75PLU，60分钟；泳道5＝0.75PLU，220分钟；泳道6＝对照，20小时；泳道7＝0.75PLU，20小时；泳道8＝胆甾醇酯；
图68与图69显示在溶液IV中的薄层色谱板：泳道1＝卵磷脂；泳道2＝对照，10分钟；泳道3＝1PLU，10分钟；泳道4＝1PLU，60分钟；泳道5＝1PLU，180分钟；泳道6＝1PLU，220分钟；泳道7＝1PLU，1200分钟；泳道8＝对照，1200分钟；泳道9＝葡萄糖酯；泳道10＝胆固醇；泳道11＝葡萄糖；
图70显示当由脂质酰基转移酶催化时DGDG与葡萄糖的反应；
图71显示在实施例17中用于突变嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶基因的融合构建体的氨基酸序列(SEQ ID No.36)。加下划线的氨基酸是木聚糖酶信号肽；
图72显示编码来源于嗜水气单胞菌的含木聚糖酶信号肽的酶的核苷酸序列(SEQ ID No.45)；
图73显示薄层色谱板清楚地显示植物甾醇酯和甘油单酯的形成。泳道1是1小时反应时间后，泳道2是4小时反应时间后，泳道3是24小时反应时间后，泳道4是植物甾醇；和
图74显示杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)突变体的氨基酸序列，该突变体具有Asn80Asp突变(注意，第80位氨基酸位于成熟序列中)(SEQID 62)；
图75显示SEQ ID No.63，其为来自近平滑假丝酵母脂质酰基转移酶的氨基酸序列；
图76显示SEQ ID No.64，其为来自近平滑假丝酵母脂质酰基转移酶的氨基酸序列；
图77显示SEQ ID No.65。Scoe1NCBI蛋白登录号CAB39707.1GI：4539178的保守的假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图78显示来自喜热裂孢菌的脂质酰基转移酶的多肽序列(SEQ ID No.66)；
图79显示来自喜热裂孢菌的脂质酰基转移酶的多肽序列(SEQ ID No.67)；
图80显示来自Corynebacterium efficiens的脂质酰基转移酶的多肽GDSx300个氨基酸(SEQ ID No.68)；
图81显示来自Novosphingobium aromaticivorans的脂质酰基转移酶的多肽GDSx 284个氨基酸(SEQ ID No.69)；
图82显示来自天蓝色链霉菌的脂质酰基转移酶的多肽GDSx 269个氨基酸(SEQ ID No.70)；
图83显示来自灰色链霉菌的脂质酰基转移酶的多肽\GDSx 269个氨基酸(SEQ ID No.71)；
图84显示来自链霉菌的脂质酰基转移酶的多肽(SEQ ID No.72)；
图85显示从生物体嗜水气单胞菌获得的氨基酸序列(SEQ ID No.73)(P10480；GI：121051)(注意，这是成熟序列)；
图86显示杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)突变体的氨基酸序列(SEQ ID No.74)(注意，这是成熟序列)；
图87显示来自Streptomyces thermosacchari的核苷酸序列(SEQ ID No.75)；
图88显示来自Streptomyces thermosacchari的氨基酸序列(SEQ ID No.76)；
图89显示来自褐色喜热裂孢菌的氨基酸序列/GDSx 548个氨基酸(SEQID No.77)；
图90显示来自褐色喜热裂孢菌的核苷酸序列(SEQ ID No.78)；
图91显示来自褐色喜热裂孢菌的氨基酸序列/GDSx(SEQ ID No.79)；
图92显示来自Corynebacterium efficiens的氨基酸序列/GDSx 300个氨基酸(SEQ ID No.80)；
图93显示来自Corynebacterium efficiens的核苷酸序列(SEQ ID No.81)；
图94显示来自天蓝色链霉菌的氨基酸序列/GDSx 268个氨基酸(SEQ IDNo.82)；
图95显示来自天蓝色链霉菌的核苷酸序列(SEQ ID No.83)；
图96显示来自灰色链霉菌的氨基酸序列(SEQ ID No.84)；
图97显示来自灰色链霉菌的核苷酸序列(SEQ ID No.85)；
图98显示来自褐色喜热裂孢菌的氨基酸序列/GDSx(SEQ ID No.86)；
图99显示来自褐色喜热裂孢菌的核苷酸序列/GDSx(SEQ ID No.87)；
图100显示来自杀鲑气单胞菌的包含信号序列(preLAT-从第1位至第87位)的核苷酸序列(SEQ ID No.88)；
图101显示来自链霉菌的脂质酰基转移酶的多肽序列(SEQ ID No.89)；
图102显示杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)突变体(该突变体具有Asn80Asp突变(注意，第80位氨基酸位于成熟序列中)-本文显示为SEQID No.62)经过翻译后修饰的氨基酸序列(SEQ ID No.90)；
图103显示L131与来自灰色链霉菌和褐色喜热裂孢菌的同源物的比对，说明了GDSx基序(在L131以及灰色链霉菌和褐色喜热裂孢菌中为GDSY)、GANDY框(其为GGNDA或GGNDL)和HPT区(被认为是保守的催化组氨酸)的保守性。这三个保守部分均被突出显示；
图104：10份乳脂样品、甘油单酯-二酯和包含胆固醇、油酸和胆固醇酯的St 17的TLC(运行缓冲液5)；
图105：10份乳脂样品、甘油单酯-二酯和包含胆固醇的St 8的TLC(运行缓冲液1)；
图106：乳脂样品1(对照)和样品2(酶)的TLC(运行缓冲液5)；参照包含胆固醇、油酸和胆固醇酯的St 17；
图107：乳脂样品1(对照)、2(酶)、甘油单酯-二酯和包含胆固醇、脂肪酸和胆固醇酯的St 17的TLC(运行缓冲液1)；
图108：乳脂样品1(对照)、2(酶)和包含磷脂酰胆碱(PC)和溶血磷脂酰胆碱的St 4的TLC(运行缓冲液4)；
图109：奶油样品3(对照)、4(酶)和包含胆固醇、油酸和胆固醇酯的参照物St 17的TLC(运行缓冲液5)；
图110：奶油样品3(对照)、4(酶)、甘油单酯-二酯和包含胆固醇、脂肪酸和胆固醇酯的St 17的TLC(运行缓冲液1)；
图111：奶油样品3(对照)、4(酶)和包含磷脂酰胆碱(PC)和溶血磷脂酰胆碱的St 4的TLC(运行缓冲液4)；
图112显示活性位点中具有甘油的1IVN.PDB晶体结构的带状显示图。此图使用Deep View Swiss-PDB观测器制作。
图113显示活性位点中具有甘油的1IVN.PDB晶体结构的侧视图(使用Deep View Swiss-PDB观测器制作)，黑色部分为活性位点甘油
Figure GPA00001103919301031
以内的残基。
图114显示活性位点中具有甘油的1IVN.PDB晶体结构的俯视图(使用Deep View Swiss-PDB观测器制作)，黑色部分为活性位点甘油
Figure GPA00001103919301032
以内的残基。
图115显示比对1；
图116显示比对2；
图117和118显示1IVN与P10480的比对(P10480为嗜水气单胞菌酶数据库序列)，此比对从PFAM数据库获得并用在模型构建过程中；
图119显示其中P10480为嗜水气单胞菌数据库序列的比对。此序列用于模型构建和位点选择。注意，绘制出了完整的蛋白(SEQ ID No.36)，成熟蛋白(等价于SEQ ID No.73)起始于第19位残基。A.sal为杀鲑气单胞菌的GDSX脂肪酶(SEQ ID No.3)，A.hyd为嗜水气单胞菌的GDSX脂肪酶(SEQID No.73)。所列序列间的差异位置在共有序列中用*表示；
图120显示说明向每个槽(vat.)中添加酶的示意图；Han PL为Lecitase；Dan PL为本发明的脂质酰基转移酶KLM3；
图121显示从奶油提取的脂质，以及磷脂酰胆碱(PC)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)、5.13％磷脂酸(PA)和鞘脂(SG)的标准磷脂混合物(ST16)的TLC(溶剂6)；
图122显示从奶油提取的脂质，以及游离脂肪酸(FFA)、胆固醇(CHL)和胆固醇酯(CHL酯)的标准混合物的TLC(溶剂1)；
图123显示通过TLC分析的经酶处理的奶油(30％)中胆固醇的ANOVA评估(表43)，A＝对照，B＝Lecitase，C＝KLM3′；
图124显示通过TLC分析的经酶处理的奶油(30％)中脂肪酸的ANOVA评估(表43)，A＝对照，B＝Lecitase，C＝KLM3′；
图125显示通过GLC分析的胆固醇的ANOVA评估(表44)，A＝对照，B＝Lecitase，C＝KLM3′；
图126显示通过GLC分析的胆固醇酯的ANOVA评估(表44)，A＝对照，B＝Lecitase，C＝KLM3′；
图127显示通过GLC分析的总FFA(棕榈酸，C：16:0+油酸，C 18:1+亚油酸，C 18:2+硬脂酸，C 18.0)的ANOVA评估(表44)，A＝对照，B＝Lecitase，C＝KLM3′；
图128显示从干酪提取的脂质，以及游离脂肪酸(FFA)、胆固醇(CHL)和胆固醇酯(CHL酯)的标准混合物的TLC(溶剂6)；
图129显示从干酪提取的脂质，以及脂酰胆碱(PC)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酸(PA)的标准磷脂混合物的TLC(溶剂6)；
图130显示通过GLC分析的干酪中胆固醇的ANOVA评估(表45)，A＝对照，B＝Lecitase，C＝KLM3′；
图131显示通过GLC分析的干酪中胆固醇酯的ANOVA评估(表45)，A＝对照，B＝Lecitase，C＝KLM3′；
图132显示通过GLC分析的干酪中油酸(C18:1)+亚油酸(C18:2)的ANOVA评估(表45)，A＝对照，B＝Lecitase，C＝KLM3′；
图133显示通过GLC分析的干酪中棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C 18:1)+亚油酸(C 18:2)的ANOVA评估(表45)，A＝对照，B＝Lecitase，C＝KLM3′；
图134显示描述作为质量、加速度和变位性(deflection property)的结果的力的示意图；
图135显示对照样品DAN011(左侧)和使用KLM3生产的干酪DAN013(右侧)的照片。加热后静置5分钟；
图136显示使用干酪DAN011烘焙的披萨(左侧)、DAN012烘焙的披萨(中间)和DAN013烘焙的披萨(右侧)；
图137显示实施例32中使用的基因构建体；
图138显示实施例32中使用的密码子优化的基因构建体(no.052907)；
图139显示包含LAT-KLM3′前体基因的XhoI插入物的序列，下划线处为-35框和-10框；和
图140显示在三丁酸甘油酯琼脂上于37℃生长48小时后的BML780-KLM3’CAP50(包含SEQ ID No.90-上侧菌落)和BML780(空宿主菌株-下侧菌落)。
实施例
除了另外指出，按照实施例6中的描述实施TLC分析，并按照实施例11中的描述实施GLC分析。
实施例1：来源于杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida)的转移酶的克隆，序列测定和异源性表达。
所用的菌株：
杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(ATCC 14174)获自ATCC，在30℃、Luria-Bertani培养基(LB)中培养过夜。对所述细胞进行离心并用来自Qiagen Ltd.的基因组DNA分离操作方法分离基因组DNA。基因组DNA缓冲液组(目录号19060)，蛋白酶K(目录号19131)和RNAse A(目录号19101)均获自于Qiagen.Ltd(Boundary court Gatwick Court，West Sussex，RH10 2AX)。
宿主菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen)用于产生重组气单胞菌酶。BL21(DE3)pLysS的感受态细胞作为用表达载体pet12-AsalGCAT-pSM转化的宿主。包含适宜质粒的转化体在37℃下在含有100μg氨苄青霉素/ml的LB琼脂培养基中培养。
表达载体pet12-AsalGCAT-pSM的构建：
对于来自气单胞菌的转移酶基因的所有DNA扩增，以基因组DNA(0.2-1μl)作为模板，pfu DNA聚合酶(2.5单位)与10μl10×pfu缓冲液、1μl的各引物(50pmol/μl)、200μMdNTP以100μl的总反应体积一起使用。PCR反应在可程控的热循环仪中利用如下条件进行：95℃保持30秒，以95℃30秒、60℃1分钟、68℃2分钟循环30次。72℃再延伸5分钟。
来自杀鲑气单胞菌的转移酶基因的PCR扩增通过两个分离的PCR反应进行。PCR反应1使用以下引物对进行：as1USNEW(5′AGCATATGAAAAAATGGTTTGT TTGTTTATTG GGG 3′[SEQ ID No.36])和asls950new(5′GTG ATG GTG GGC GAG GAA CTC GTA CTG3′[SEQ ID No.37])。进行第二PCR反应以掺入C-末端组氨酸标签，所述反应使用第一反应的PCR产物以及以下引物进行：as1USNEW(5′AGCATATGAAAA AATGGTTTGTTTGTTTATTG GGG 3′[SEQ ID No.38])和AHLS1001(5′TTGGATCCGAATTCAT CAATG GTG ATG GTG ATG GTG GGC3′[SEQ ID No.39])。纯化第二反应的PCR产物并利用限制性内切酶Ndel和BamHI消化。2μg pET12a载体DNA同样经限制性内切酶Ndel和BamHI消化并用磷酸酶处理。限制性内切酶处理的pET 12a与反应2的PCR产物经纯化，用快速连接试剂盒(Rapid Ligation Kit)(Roche，瑞士)连接。连接混合物用来转化大肠杆菌TOP10细胞。转化体铺在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上。
T7启动子引物(5′TAATACGACTCACTATAG3′[SEQ ID No.40])和T7终止子引物(5′CTAGTTATTGCTCAGCGG3′[SEQ ID No.41])用于验证pET12a载体中所克隆的转移酶基因的序列和方向。用ABI
Figure GPA00001103919301061
BigDyeTM终止子循环测序试剂盒(Terminators Cycle sequencing kit)，以500ng质粒DNA作为模板，以及3.2pmol T7启动子和终止子引物进行DNA序列测定。
图35所示构建体用于转化感受态细菌宿主菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen)，挑选出氨苄青霉素抗性转化体并用于表达分析。
重组杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶的表达
用非酯化的脂肪酸(Non-Esterified Fatty Acid)(NEFA)试剂盒(Roche，瑞士)在细胞提取物中定量测定对于卵磷脂的酶活性。
在图36中，包含表达载体pet12-AsalGCAT-pSM的BL21(DE3)pLysS在LB培养基+100μg/ml氨苄青霉素中生长，37℃振荡下培养，直到OD600＝0.6到1.0。用IPTG(0.4mM)诱导所述培养物，再培养3小时。IPTG诱导0、1、2和3小时后取样品。以卵磷脂作为底物用NEFA试剂盒检测酶活性。
用于制备活性更强的酶的生长优化
包含表达载体pet12-AsalGCAT-pSM的BL21(DE3)pLysS在LB培养基+100μg/ml氨苄青霉素中生长，在不同生长温度(37℃、30℃、20℃)下振荡培养。产生活性脂质酰基转移酶的最适条件是当如图37所示培养物在30℃下生长时。
重组杀鲑气单胞菌转移酶的部分纯化
包含表达载体pet12-AsalGCAT-pSM的菌株BL21(DE3)pLysS在37℃生长，通过超声处理(sonification)制备细胞粗提物。重组酶用Qiagen的Ni-NTA柱离心试剂盒从经超声处理的细胞粗提物进一步纯化。使用NEFA试剂盒且以卵磷脂作为底物测定磷脂酶活性。来自表达活性转移酶的BL21(DE3)pLysS的细胞粗提物与底物卵磷脂一同培养，用薄层色谱法分析反应混合物，显示降解产物的存在(参见图38)。
重组杀鲑气单胞菌转移酶的部分纯化
包含表达载体pet12-AsalGCAT-pSM的菌株BL21(DE3)pLysS在37℃生长，通过超声处理制备细胞粗提物。重组酶用Qiagen的Ni-NTA柱离心试剂盒从经超声处理后的细胞粗提物进一步纯化。使用NEFA试剂盒且以卵磷脂作为底物测定磷脂酶活性(参见图39)。
实施例2：嗜水气单胞菌转移酶在大肠杆菌中的克隆与表达
嗜水气单胞菌(ATCC#7965)从ATCC获得，在30℃下在Luria-Bertani培养基(LB)中培养过夜。离心细胞并用来自Qiagen.Ltd的基因组DNA分离操作方法分离基因组DNA。基因组DNA缓冲液组(目录号19060)、蛋白酶K(目录号19131)和RNAse A(目录号19101)均来自于Qiagen Ltd.(Boundary courtGatwick Court，West Sussex，RH10 2AX)。
宿主细菌菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen)用于制备重组的气单胞菌酶。BL21(DE3)pLysS的感受态细胞作为用表达载体pet12a-A.h.GCAT-pSMa转化的宿主。包含适宜质粒的转化体在含有100-μg氨苄青霉素/ml的LB琼脂培养基中在37℃下培养。
表达载体pet12-AsalGCAT-pSMa的构建：
对于来自气单胞菌的转移酶基因的所有DNA扩增，以基因组DNA(0.2-1μl)作为模板，pfu DNA聚合酶(2.5单位)与10μl 10×pfu缓冲液、1μl的各引物(50pmol/μl)、200μM dNTP以100μl的总反应体积一起使用。PCR反应在可程控的热循环仪中利用如下条件进行：95℃维持30秒，以95℃30秒、60℃1分钟、68℃2分钟循环30次。72℃再延伸5分钟。
来自嗜水气单胞菌(ATCC#7965)的转移酶基因的PCR扩增通过两个分离的PCR反应进行。
PCR反应1使用以下引物对进行：AHUS1(5′GTCATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC3′，SEQ IDNo.42)和ahls950(5′ATGGTGATGGTGGGCGAGGAACTCGTACTG3′，SEQID No.43)。
进行第二PCR反应以掺入C-末端组氨酸标签，所述反应使用第一反应的PCR产物以及以下引物进行：AHUS1(5′GTCATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC3′SEQ ID No.44，)和AHLS1001(5′TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATGGTGATGGTGGGC3′SEQ ID No.45)。
纯化第二反应的PCR产物并利用限制性内切酶Ndel和BamHI消化。2μgpET 12a载体DNA同样经限制性内切酶Ndel和BamHI消化并用磷酸酶处理。限制性内切酶处理的pET 12a与反应2的PCR产物经纯化，用快速连接试剂盒(Rapid Ligation Kit)(Roche，瑞士)连接。连接混合物用来转化大肠杆菌TOP10细胞。转化体铺在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上。
T7启动子引物(5′TAATACGACTCACTATAG3′)和T7终止子引物(5′CTAGTTATTGCTCAGCGG3′)用于验证pET12a载体中所克隆GCAT的序列和方向。用ABIBigDyeTM终止子循环测序试剂盒(Terminators Cyclesequencing kit)，以500ng质粒DNA作为模板，以及3.2pmol T7启动子和终止子引物进行DNA序列测定。
图40所示构建体用于转化感受态细菌宿主菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen)，挑选出氨苄青霉素抗性转化体并用于表达分析。
嗜水气单胞菌转移酶在BL21(DE3)pLysS中的表达
包含表达载体pet12a-A.h.GCAT-pSMa的大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS在LB培养基+100μg/ml氨苄青霉素中生长，并在37℃下振荡培养，直到OD600＝0.6到1.0。用IPTG(0.4mM)诱导所述培养物，再培养3小时。IPTG诱导0、1、2和3小时后取样品。以卵磷脂作为底物用NEFA试剂盒检测酶活性(图41)。
用于制备活性更强的酶的生长优化
包含表达载体pet12a-A.h.GCAT-pSMa的BL21(DE3)pLysS在LB培养基+100μg/ml氨苄青霉素中生长，在不同生长温度(37℃、30℃、20℃)下振荡培养。产生活性脂质酰基转移酶的最适条件是当如图42所示培养物在30℃生长时。
重组嗜水气单胞菌转移酶(GCAT)的部分纯化
包含表达载体pet12a-A.h.GCAT-pSMa的菌株BL21(DE3)pLysS在37℃下生长，并通过超声处理制备细胞粗提物。重组酶用Qiagen的Ni-NTA柱离心试剂盒(Ni-NTA spin kit)从经超声处理的细胞粗提物进一步纯化。使用NEFA试剂盒且以卵磷脂作为底物测定磷脂酶活性。(图43)。
实施例3：气单胞菌转移酶在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)163中的表 达
质粒构建
两种不同的枯草芽孢杆菌表达载体(pUB 110&pBE5)用于气单胞菌基因在枯草芽孢杆菌的异源表达。pUB 110载体包含α淀粉酶启动子而pBE载体含有P32启动子，该P32启动子作为用于融合的气单胞菌基因的表达的调节区。在pUB 110中，气单胞菌成熟GCAT基因的第一个氨基酸与枯草芽孢杆菌的木聚糖酶信号肽的最后一个氨基酸通过在限制酶切位点Nhe1在框内融合，在成熟蛋白之前产生两个额外的氨基酸。pBE5含有在Nco 1位点融合的cgtase信号序列，使重组蛋白分泌入培养过滤物中。
进行PCR反应获得与pUB 110和pBE5载体的信号序列框内融合的气单胞菌基因。用下列的引物对对嗜水气单胞菌基因进行PCR。
PCR反应1：usAHncol(5′ATGCCATGGCCGACAGCCGTCCCGCC3′，SEQ ID No.46)和lsAH(5′TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3′，SEQID No.47)
PCR反应2：US-AhnheI(5′TTGCTAGCGCCGACAGCCGTCCCGCC3′，SEQ ID No.48.)和lsAH(5′TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3，SEQID No.49)
用下列引物对对杀鲑气单胞菌基因进行PCR。
PCR反应3：US-Asncol(5′TTGCCATGGCCGACACTCGCCCCGCC3′，SEQ ID No.50)和lsAH(5′TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3′，SEQID No.51)
PCR反应4：US-ASnhe1(5′TTGCTAGCGCCGACACTCGCCCCGCC3′，SEQ ID No.52)和lsAH(5′TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3′，SEQID No.53)
全部PCR产物克隆到PCR blunt II(TOPO载体)中并用反向或正向测序引物进行测序。
来自PCR反应1和3的克隆用Ncol和Bam HI酶切，作为插入物与Nco1/BamH1/磷酸酶酶切的pBE5载体连接。来自PCR反应2和4的克隆用Nhe1和BamH1酶切，作为插入物与Nhe1/BamH1/磷酸酶酶切的pUB载体连接。
枯草芽孢杆菌中气单胞菌转移酶基因的表达与所述酶的活性表征。
来自两种气单胞菌菌种的酰基转移酶已成功地在大肠杆菌中表达(结果如上)。芽孢杆菌pUB 110和pBE5基因融合构建体用来转化枯草芽孢杆菌，并通过铺在卡那霉素板上选择转化株。分离并在2xYT中生长的卡那霉素抗性转化体能在枯草芽孢杆菌中异源表达气单胞菌基因。培养过滤物除具有酰基转移酶与磷脂酶活性外，还具有二半乳糖基甘油二酯(digalactosyldiacylglycerol)(DGDG)半乳糖脂酶活性。针对二半乳糖基甘油二酯(DGDG)的活性在将上清液与底物一起温育60分钟后测定，来自小麦粉的DGDG(可从Sigma获得)以及针对卵磷脂的活性在图44中显示。芽孢杆菌在培养基中培养过夜(20-24小时)至48小时以后作为分泌性蛋白产生所述酶。在一些情况下，已表明气单胞菌基因的表达干扰芽孢杆菌和大肠杆菌细胞活力和生长，因此有必要仔细选择表达菌株并优化生长条件以确保表达。例如，数种芽孢杆菌宿主菌株(B.s 163、DB104和OS 21)用表达载体转化作为生长对照。B.s163可由两种气单胞菌基因转化并具有表达活性蛋白的能力。DB 104可用所有构建体转化但仅能表达杀鲑气单胞菌转移酶。
实施例4：大肠杆菌中产生的气单胞菌脂质酰基转移酶的发酵和纯化
大肠杆菌发酵：
微生物
本研究中使用大肠杆菌的两个菌株，一个包含嗜水气单胞菌(实施例2)脂质酰基转移酶而另外的包含杀鲑气单胞菌(实施例1)脂质酰基转移酶。
包含嗜水气单胞菌基因的大肠杆菌菌株命名为DIDK0124，包含杀鲑气单胞菌基因的大肠杆菌菌株命名为DIDK0125。DIDK0124的发酵物命名为HYDRO0303，而DIDK0125的发酵物命名为SAL0302。从HYDRO025纯化的蛋白命名为REF#138。从HYDRO0303纯化的蛋白命名为REF#135。
生长培养基与培养条件
LB-琼脂
用于维持菌株的LB-琼脂板包含：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/LNaCl、15g/L琼脂、100mg/L氨苄青霉素和35mg/L氯霉素。琼脂板在30℃下培养。
LB摇瓶
用于产生生物反应器培养的接种物的LB培养基(50mL/摇瓶)包含：10g/L胰蛋白胨、5gL酵母提取物、5g/L NaCl、100mg/L氨苄青霉素和35mg/L氯霉素。摇瓶从LB琼脂板接种，30℃和200rpm下培养。
生物反应器培养
生物反应器培养在6L自建(in-house built)的生物反应器中进行，生物反应器中装有4L培养基，该培养基包含：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L NaCl、8g/L KH2PO4、0.9g/L MgSO4·7H2O、40g/L葡萄糖一水合物、0.4mL/ADD
Figure GPA00001103919301121
Foamstop Sin 260(ADD APT Chemicals AG，Helmond，TheNetherlands)、10mg/L(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O、0.7mg/L CuSO4·5H2O、3mg/LZnSO4·7H2O、3mg/L MnSO4·H2O、10mg/L EDTA、0.1mg/L NiSO4·6H2O、0.1mg/L CoCl2、0.1mg/L H3BO4、0.1mg/L KI、0.1mg/L Na2MoO4·2H2O、1g/L氨苄青霉素和35mg/L氯霉素。
在生物反应器中接种一定量的LB培养基，确保在大约20小时培养后生长终点(通过以下参数计算：最大比生长速率0.6h-1，LB摇瓶的OD600和大约20的生物反应器终末OD600)。
SAL0302接种了10mL的LB培养基，而HYDR00303接种了4mL的LB培养基。
生物反应器在下列条件下操作：温度30℃，搅拌800-1000rpm(依照实验)，通气5L/min，pH 6.9pH控制8.75％(w/v)NH3-水和2M H2SO4。添加异丙基β-D-硫代半乳糖苷至终末浓度0.6mM来实现诱导，分别产生0.4摩尔(HYDR00303)和0.7摩尔CO2。
收获
以下操作步骤用于生物质的收获与匀浆：
1)来自发酵的发酵肉汤在5000×g离心，4℃放置10分钟，弃去上清液。生物质用前在-20℃下放置保存。融化所述生物质并重悬在500mL 20mMNaH2PO4，pH 7.4、500mM NaCl、10mM咪唑和完全(无EDTA)蛋白酶抑制剂(Roche，Germany)中。
2)悬浮的生物质在2千巴和4℃下，在来自Constant Systems公司(Warwick，UK)的细胞破裂仪(cell disrupter)中匀浆。
3)以10,000×g离心去除细胞碎片，4℃放置30分钟，收集上清液。
4)将上清液以13,700×g离心而澄清化，4℃放置60分钟，收集上清。
5)所述上清液通过0.2μm Vac Cap过滤器(Pall LifeSciences，UK)过滤，收集滤出液，直接用于层析纯化。
转移酶的层析纯化
用50ml螯合型琼脂糖ff.凝胶填充柱(2.5×10cm)，并用镍-硫酸盐装料(根据生产商Amersham Biosciences所述方法)。以200ml 20mM NaH2PO4，pH7.4、500mM NaCl、10mM咪唑平衡柱，将400ml粗提物以5ml/min的流速加样于柱。用20mM NaH2PO4，pH 7.4、500mM NaCl、10mM咪唑洗柱直到UV280达到基线，然后用40ml 20mM NaH2PO4，pH 7.4、500mM NaCl、500mM咪唑洗脱GCAT。
实施例5：枯草芽孢杆菌中产生的气单胞菌脂质酰基转移酶的发酵与纯 化
发酵
BAC0318-19，BAC0323-24
微生物
本研究中所用的微生物来源于含有插入pUB110OIS载体中、编码杀鲑气单胞菌转移酶的基因的质粒对枯草芽孢杆菌宿主菌株#163的转化。该基因的表达受α淀粉酶启动子控制，转移酶的分泌由枯草芽孢杆菌木聚糖酶信号序列介导(实施例3)。菌株命名为DIDK0138(发酵BAC0318-19)和DIDK0153(发酵BAC0323-24)。
生长培养基及培养条件
预培养基
摇瓶(总容积500mL，有隔板)加入100mL培养基，所述培养基包含：
NaCl                                5g/L
K2HPO4                              10g/L
大豆粉                              20g/L
酵母提取物，BioSpringer 106         20g/L
消泡剂，SIN260                      5mL/L
高压灭菌前pH调整到7.0
高压灭菌后向每个摇瓶中添加6mL 50％(w/w)Nutriose。并且在高压灭菌后添加浓度50mg/L的卡那霉素。
接种
预培养摇瓶用直接来自25％(w/v)甘油贮液的冻存培养物接种。摇瓶在33℃、175rpm培养大约16小时，取50mL接种发酵罐。
发酵
发酵在6L自建的发酵罐中进行。
批次培养基(batch medium)(3L)包含：
玉米浆(50％dw)                                40g/L
酵母提取物BioSpringer 153(50％dw)             10g/L
NaCl                                          5g/L
CaCl2，2H2O                                   0.25g/L
Mn(NO3)2，H2O                                 0.2g/L
消泡剂SIN260                                  1mL/L
卡那霉素(经滤过灭菌处理后加入高压灭菌的发酵罐)50mg/L
进料(feed)包含：
葡萄糖一水合物                         540g/kg
MgSO4，7H2O                            4.8g/kg
消泡剂SIN260                           4mL/kg
酵母提取物，BioSpringer 153(50％dw)    150g/kg
(分别高压灭菌)
根据下列方程式，发酵BAC0318和BAC0323中的进料基于蓄积的CO2开始：
进料率-流率[g/h]＝0，AcCO2＜0.15
进料率-流率[g/h]＝2.85+t·1.54，Ac CO2≥0.15和t＜12
进料率-流率[g/h]＝21.3，t＞12
t：从蓄积的CO2(AcCO2)达到0.15摩尔的点开始的时间(小时)。
根据下列方程式，发酵BAC0319和BAC0324中的进料基于蓄积的CO2开始：
进料率-流率[g/h]＝0，AcCO2＜0.15
进料率-流率[g/h]＝2.0+t·1.08，Ac CO2≥0.15和t＜12
进料率-流率[g/h]＝15，t＞12
t：从蓄积的CO2(AcCO2)达到0.15摩尔的点开始的时间(小时)。
加入12.5％(w/v)氨水或2M磷酸使pH值控制在7.0。
通气量为3L/min对应1vvm。
温度33℃。
发酵罐配备有相距10cm的两个8cm推进器(impeller)。
收获
在室温下以16,000×g离心10分钟，去除生物质。上清液经过滤灭菌，滤出液用于纯化和应用试验。
实施例6：蛋黄中的应用试验
在如下实验中，在大肠杆菌中表达的、分离自杀鲑气单胞菌的转移酶仅在蛋黄中以及添加了植物甾醇的蛋黄中检出。
材料：
来自杀鲑气单胞菌的转移酶REF#138
蛋黄：来自新鲜卵(母鸡鸡蛋)
植物甾醇：β-谷甾醇，Sigma S 5753
TLC板：二氧化硅板Merck nr.1.05715.0001
TLC分析
薄层色谱板在温箱(110℃)中放置半小时，使之活化
将100ml展开剂倒入加盖的层析小室。小室的壁覆有滤纸(Whatman 2)使展开剂蒸汽将该小室饱和。
TLC板放于支架中，并将样品可加到距底部2cm的TLC板。TLC板放入有展开剂的TLC小室中。当展开剂距离板底部14cm时，取出TLC板，置于蒸发板(fume board)上干燥，然后置于加热箱(heat board)(110℃)中放置10分钟。
接着使TLC板浸入展开试剂中，在加热箱(110℃)中干燥15分钟。
展开剂：
Nr.IV：氯仿∶甲醇∶水(65∶25∶4)
Nr.I：P-醚∶MTBE∶乙酸(60∶40∶1)
展开缓冲液(钒酸盐-缓冲液)：
32g Na2CO3 ad 300ml H2O(1M)
加入18.2g五氧化二钒(V2O5)并微热溶解。
将溶液冷却至环境温度。
小心加入460ml 2.5M H2SO4.(460ml H2O+61ml H2SO4)
加水至1000ml。
磷脂酶活性
底物：
0.6％L-α磷脂酰胆碱95％Plant(Avanti#441601)+0.4％Triton-X 100(Sigma X-100)+5mM CaCl2溶于pH7的0.05M HEPES缓冲液中。
步骤
将400μl底物加到1.5ml Eppendorf管中，并置于Eppendorf热混合器(thermomixer)中，30℃下保持5分钟。
时间T＝0时，加入50μl酶溶液。对含有水而不是酶的空白进行分析。
以1000rpm在Eppendorf热混合器中于30℃混合所述样品10分钟。时间T＝10分钟时，将Eppendorf管置于另一热混合器中，在99℃、10分钟以结束反应。
样品中游离脂肪酸使用WAKO GmbH的NEFA试剂盒分析。
测定条件下，酶活性PLU-7pH 7以每分钟产生的微摩尔脂肪酸来计算。
脂质提取
1g蛋黄和7.5ml氯仿∶甲醇2∶1在Whirley中混合，以750×g离心10分钟。
分离3ml氯仿相，用于进一步脂质分析。
结果：
以上述方法分析在大肠杆菌中表达的、来自杀鲑气单胞菌的转移酶(REF#138)的磷脂酶活性，并在有或没有β-谷甾醇的蛋黄中检测。反应过程中所述样品用磁力搅拌器搅拌。实验设计如表1。
表1
  测定   反应时间在37℃下   蛋黄   谷甾醇   转移酶#138
  序号   分钟   克   毫克   单位
  1   30   1   40
  2   30   1   40   0,75PLU
  3   30   1   80   0,75PLU
  4   120   1   40   0,75PLU
  5   120   1   80   0,75PLU
  6   300   1   40   0,75PLU
  8   300   1   40
加入7.5ml氯仿∶甲醇(2∶1)并在Whirley混合器中混合30秒终止反应。离心分离氯仿相，将2μl的氯仿相转移到预先活化的硅胶TLC板，TLC板用展开剂nr.I洗脱，另一TLC板在展开剂IV中洗脱。
图45和46显示TLC分析结果。
在添加植物甾醇的蛋黄中利用来自杀鲑气单胞菌的转移酶的转移酶反应表明，该酶在胆固醇酯形成过程将脂肪酸从蛋黄的卵磷脂转移到胆固醇。TLC层析图也表明加到蛋黄中的部分甾醇被转移到甾醇酯。
在反应过程中与形成的胆固醇酯的量有关的甾醇酯量可用HPLC或GLC分析。
现已知植物甾醇酯可减少肠道对胆固醇的吸收。文献中也表明肠道对胆固醇酯的吸收少于对游离胆固醇的吸收。当转移酶和植物甾醇添加到蛋黄，可得到减少胆固醇吸收的产品，同时产生可改善蛋黄乳化性质的溶血卵磷脂。在蛋黄中添加转移酶和植物甾醇的更进一步的优势在于植物甾醇酯与天然获得的胆固醇一同被摄入，预期这对胆固醇吸收减少具有最大效应。
实施例7：来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶对蛋黄的修饰
依照本发明，现已证明，使用转移酶可能从蛋黄中产生溶血卵磷脂而基本上不形成脂肪酸。
蛋黄中的卵磷脂含量是制备蛋黄酱的一种重要的乳化剂，但局限在于所得蛋黄酱对热不稳定。因此，近几年来已表明，使用胰腺得来的磷脂酶将蛋黄的卵磷脂修饰为一种更有效的乳化剂，即溶血卵磷脂。在蛋黄酱生产过程中用酶修饰的蛋黄有助于改善在巴氏灭菌时蛋黄酱的热稳定性。在蛋黄中使用胰磷脂酶的局限性在于游离脂肪酸数量也增多，这导致抗氧化能力的下降，因为游离脂肪酸比其相应酯更易于被氧化。游离脂肪酸也可能导致肥皂味道的出现。
如实施例5所述，来自杀鲑气单胞菌的转移酶在枯草芽孢杆菌中成功表达并在实验室规模发酵，通过液相层析纯化，用来修饰蛋黄脂质。经酶修饰的蛋黄用于耐热蛋黄酱的生产。
来自杀鲑气单胞菌的转移酶能在蛋黄中产生溶血卵磷脂和胆固醇酯而不产生大量游离脂肪酸。也就是说不增加或基本不增加食品中的游离脂肪酸。
经酶修饰的蛋黄显示改善的乳化剂特性并能用于热稳定的生产。
酶通过催化卵磷脂和胆固醇间的脂质转移反应(图47)表现出对蛋黄修饰的高度功能。
该研究进一步研究了转移酶在对蛋黄的修饰中的用途以及经修饰的蛋黄在热稳定生产中的用途。
本实施例描述了转移酶的发酵，分离和在蛋黄中的应用以及经酶修饰的蛋黄在耐热蛋黄酱生产中的应用。本实施例分成两部分：
A.转移酶在蛋黄中的应用
B.经酶修饰的蛋黄在蛋黄酱中的测试
实验
A.应用
酶与底物
来自杀鲑气单胞菌的转移酶#178-9，纯化2554-100C73，15PLU-7/ml
来自杀鲑气单胞菌的转移酶#179，18.5PLU-7/ml
磷脂酶A1LECITASETM Ultra(Novozymes A/S，Denamrk)
蛋黄：含8％盐的液态蛋黄，SANOVAFOODS，DK
TLC分析按前述方法进行(见前述实施例6)
磷脂酶活性：见前述实施例。
脂质提取
1g蛋黄和7.5ml氯仿∶甲醇2∶1在Whirley中混合30秒，以750×g离心10分钟。
分离4ml氯仿相并用于进一步脂质分析。
氧化稳定性测试
蛋黄酱的氧化稳定性在ML OXIPRESS仪器中测量，其中所述样品通过在氧气气氛下加压条件下的加热来经受氧化应激。
经过被称作诱导期(IP)的一段时间以后，样品的氧化导致一定的氧气消耗，通过压力传感器记录为压力改变。诱导期越高表明氧化稳定性越好。
操作步骤
将5克蛋黄酱置于玻璃容器中，并将玻璃容器用压力传感器封闭。该容器充有氧气至5巴(bar)。打开阀排空容器。该操作重复两次并将5巴氧气气氛下的样品置于80℃下。氧分压被测定为时间的函数且诱导期(IP)以小时计算。
结果
来自杀鲑气单胞菌的经纯化的转移酶样品#179和#178-9用于处理蛋黄，如表2所述。初始检测显示，加入的GCAT转移酶的磷脂酶(PLU)活性应当以比商品磷脂酶的活性低得多。原因在于GCAT是转移酶，因此具有比普通磷脂酶低得多的水解活性。
表2
  Sanofo蛋黄8％盐   2344-44C8918.5PLU-7/ml   转移酶#178-9  #3108，LecitaseUltra   水
  序号   蛋黄   转移酶#179   18.5PLU-7/ml  1500PLU-7/ml7/ml
  克   克   克  毫升   克   PLU-7/ml
  6   120   2.00   8.00   0.31
  7   120   10   0   1.25
  8   120  1.86   8.14   23.25
  9   120   10   0
按比例将蛋黄和酶放于烧杯中进行酶促反应。样品置于加热箱中，37℃下慢速搅拌。反应1、2和4小时后，取样品做TLC分析。反应4小时后，将所述产物保存在5℃以备蛋黄酱实验使用。
从经酶处理的蛋黄提取的脂质的TLC分析如图48所示。
图48所示的TLC分析表明，磷脂酶#3108在形成游离脂肪酸过程中，对于甘油三酯以及一些甘油单酯和甘油二酯具有明显的水解作用。磷脂酶#3108对胆固醇似乎无影响。两种转移酶样品都明显地有助于胆固醇酯的形成并伴有胆固醇含量的下降。
D.在蛋黄酱中的经酶修饰的蛋黄
为研究表2中提到的对蛋黄样品修饰作用的效应，以含50％脂肪的蛋黄酱实施应用实验。也产生含有未经处理的蛋黄的蛋黄酱。
研究目的是明确对经酶修饰蛋黄的乳化特性与热稳定性的影响。全部蛋黄酱样品含有相同的油水平并只利用蛋黄进行乳化。全部蛋黄酱样品用KoruMa调拌器(Disho V60/10)制备，制备过程中加热至95℃维持5分钟。
由经酶处理的蛋黄制备的蛋黄酱样品(图49)质地细密均匀无油分离。对照样品在油与水相中分离。
经由酶处理的蛋黄制备的蛋黄酱样品中的油滴颗粒大小用MalvernMastersizer测量。测量前样品与0.1％SDS在pH 7的0.1M磷酸盐缓冲液中混合。读数是表3所示的所有颗粒的大小均值。
表3
  实验   酶  颗粒大小均值，μm
  6   转移酶#179，0.31PLU-7/g  12.9
  7   转移酶#178-9，1.25PLU-7/g  7.2
  8   #3108，Lecitase Ultra，23PLU-7/g  5.2
颗粒大小测量结果清楚地显示来自杀鲑气单胞菌的转移酶剂量增加的效应。使用大剂量的转移酶，颗粒大小与用Lecitase Ultra制备的蛋黄酱的颗粒近似。但是，应注意，Lecitase Ultra产生大量脂肪酸，这可能促成了较细小的颗粒分布。
利用酶所制备的蛋黄酱的油滴大小明显小于没有利用酶所制备的蛋黄酱(即对照蛋黄酱)的油滴大小。
氧化稳定性
蛋黄酱样品7和8的氧化稳定性用ML OXIPRES分析，分析结果如表4所示。
表4
  样品   诱导期   诱导期
  1.测定小时   2.测定小时
  7   37.44   38.08
  8   35.68   35.52
氧化稳定性的测定说明抗氧化稳定性有显著性差异。转移酶179-8处理的蛋黄制成的蛋黄酱比Lecitase Ultra处理的蛋黄制成的蛋黄酱具有更好的抗氧化稳定性。这是由于Lecitase Ultra产生更多的游离脂肪酸，这些游离脂肪酸更易于被氧化成相应的脂肪酸酯。
用于蛋黄酱生产的蛋黄样品用氯仿提取，蛋黄中的脂质用GLC分析，结果见表5。
表5
  实验   酶   脂肪酸   胆固醇   胆固醇酯   甘油三酯
  6   转移酶#179   0.96   0.94   0.49   23.95
  7   转移酶#178-9   1.84   0.60   1.06   24.54
  8   #3108，Lecitase Ultra   14.05   1.16   0.12   2.45
  实验   酶   脂肪酸   胆固醇   胆固醇酯   甘油三酯
  9   对照   0.48   1.16   0.13   22.87
表5中的GLC结果证实了TLC分析的结果，Lecitase Ultra产生非常大量的游离脂肪酸并且大部分的甘油三酯被水解。另一方面，转移酶仅产生适量的游离脂肪酸且无甘油三酯被水解。还清楚地显示转移酶从胆固醇产生胆固醇酯。
这些结果表明，与对照蛋黄酱相比，“经酶处理的”蛋黄酱中的PC量减少，而与对照蛋黄酱相比，经酶处理的蛋黄酱的LPC量增加。LPC量增加可能很好地解释经酶处理的蛋黄酱与对照蛋黄酱相比，前者乳化作用增强的原因。HPLC和GLC分析也表明经酶处理的蛋黄酱的游离胆固醇水平比对照蛋黄酱的游离胆固醇水平低，可能是由于在转移酶反应中，胆固醇作为受体分子导致经酶处理的蛋黄酱与对照蛋黄酱相比，前者有更多的胆固醇酯产生。另外，结果还表明，当用转移酶处理蛋黄时游离脂肪酸不显著性增加。所述结果还进一步表明，经脂质酰基转移酶处理的食品中的游离脂肪酸含量显著低于用对照磷脂酶处理的食品中的游离脂肪酸含量，即使是食品中溶血卵磷脂形成量是相同的，也是如此。
实施例8：杀鲑气单胞菌转移酶在蛋糕中的效应
在蛋糕配方(recipe)中检测来自杀鲑气单胞菌的GCAT酰基转移酶的效应。酶被单独检测以及与其它脂解酶组合检测。将酶加到一些蛋糕成分中或在混合蛋糕前与其它蛋糕成分一同加入。
初步实验表明，与对照相比，酰基转移酶与甘油三酯水解酶结合改善蛋糕体积和瓤(crumb)结构。
在如下实验中，来自杀鲑气单胞菌的转移酶及其变体被单独检测或与甘油三酯水解酶组合检测。这些酶对鸡蛋以及起酥油中的脂质成分有活性，以及对构成蛋糕配方一部分的糖、蛋白质、甘油和胆固醇(蛋中)有活性。
材料与方法
酶
#179，来自杀鲑气单胞菌的酰基转移酶
Grindamyl EXEL 16，脂酶来自绵毛嗜热丝孢菌
蛋糕配方：
  成分   ％   g
  糖35/20   20.37   204
  蛋糕粉，Albatros   18.11   181
  小麦淀粉   5.21   52
  烘焙粉(baking powder)   0.36   4
  成分   ％   g
  经巴氏消毒的液态全蛋   22.63   226
  起酥油Vegao(Aarhus United   18.11   181
  乳清粉   0.68   7
  葡萄糖浆，75％42DE   4.53   45
  甘油   1.36   14
  盐   0.32   3
  菜籽油   6.34   63
 山梨酸钾(Potassium sorbate)   0.18   1.8
设备：
混合器：带铲的Hobart N50
烤箱：Simon蛋糕烤箱
操作步骤：
所有组分控制在室温。
1.使糖和起酥油乳化(cream up)3分钟-以第二速度开始，30秒内调到第三速度
2.添加其余成分-以第一速度开始，30秒内调到第二速度-搅拌总共5分钟
3.在1dl量杯中测定糊(batter)的体积
4.用“Babette”油涂抹物(oil spread)喷洒(spray)磅蛋糕罐(pound cake tin)，并用纸覆盖
5.称2×350g放入磅蛋糕罐中
6.用铲均匀展开团块
7放入烤箱之前-在蛋糕的顶部(蛋糕的中间沿纵长方向)加一行油-使蛋糕从中间断开
8180℃下烘焙50分钟
9烘焙完后，将罐从烤箱取出，将罐“掉落”到桌子上，然后将蛋糕从罐中取出
10除去蛋糕上的纸并将正面朝上
11将蛋糕放在格子上冷却60分钟，称重和测量体积，
备注：
所用的一种或多种酶在混合开始时加入，或加到蛋糕的一些成分中，然后加入到其它成分中。
所述酶仅在蛋糕成分混合或反应过程中有活性，在蛋糕烘焙过程中这些酶失活。
结果
以下实验按下表所示进行
  1  2   3   4
  全蛋   G   250   250   250   250
  葡萄糖浆，75％DE 42   G   10   10   10   10
  #179酰基转移酶，26PLU/ml   ML   25   25
  Grindamyl EXEL 16，   Mg   37.5   37.5
  水   25
根据上面提供的配方，在鸡蛋用于制作蛋糕之后，很快使鸡蛋、葡萄糖浆和酶在37℃下反应30分钟。
初步结果表明，与水对照相比，酰基转移酶与来自绵毛嗜热丝孢菌的甘油三酯水解脂酶的组合改善蛋糕体积，还改善瓤结构、口感和外观。初步结果表明，在蛋糕中将脂质酰基转移酶和脂酶联合使用可能是更好的。
实施例9：这些实验的目的是检测在大肠杆菌中表达的来自嗜水气单胞 菌的转移酶
在蛋黄中检测嗜水气单胞菌转移酶#135(0.5NEFA-PLU/ml)的转移酶反应。实验设计如表6所示。
表6
  反应时间   蛋黄   #135浓度
  序号   分钟   克   单位，PLU-NEFA
  1   30   1   0.000
  2   30   2   0.100
  3   60   2   0.100
  4   150   2   0.100
  5   240   2   0.100
  6   1560   2   0.100
  7   1560   1   0.000
将蛋黄加热至37℃，加入酶。反应时间后加入7ml氯仿∶甲醇2∶1并在Whirley中混合30秒。
将样品以800×g离心10分钟，分离出下层的溶剂相。取2μl样品加至TLC二氧化硅板上并用洗脱液IV洗脱。TLC分析结果如图50和51所示。
本实施例提及的材料与方法见于以上实施例详细描述的材料与方法。
本实验的样品作为TMS衍生物还进行GLC分析。GLC结果如表7所示。
表7：蛋黄脂质的GLC
  序号   反应   转移酶#135，浓度
  时间   单位/g蛋黄   游离脂肪酸   胆固醇   胆固醇酯
  分钟   ％   ％   ％
  7   对照   0   0.25   2.88   0.34
  3   60   0.025   0.25   2.68   0.56
  4   150   0.025   0.29   1.85   1.72
  5   240   0.025   0.53   1.42   3.54
  6   1560   0.025   0.95   0.3   4.43
从对游离脂肪酸、胆固醇和胆固醇酯的GLC分析，可以计算出每种成分摩尔浓度并计算出转移酶活性百分比，如表7所示。
转移酶活性百分比计算
依据结果，游离脂肪酸，甾醇酯的增加量如下计算
Δ％脂肪酸＝％脂肪酸(酶)-％脂肪酸(对照)
Δ％甾醇酯＝％甾醇酯/甾烷醇酯(酶)-％甾醇酯/甾烷醇酯(对照)
转移酶活性以总酶活性的百分比计算：
Figure GPA00001103919301251
其中：
Mv甾醇酯＝甾醇酯平均分子量
Mv脂肪酸＝脂肪酸平均分子量
表8蛋黄中嗜水气单胞菌的转移酶#135活性
  序号   反应   转移酶#135浓度
  时间   单位/g蛋黄   游离脂肪酸   胆固醇   胆固醇酯   转移酶活性
  分钟   mM   mM   mM   ％
  7   对照   0   8.9   74.5   5.3   -
  3   60   0.05   8.9   69.3   8.7   100
  4   150   0.05   10.4   47.8   26.5   93
  5   240   0.05   18.9   36.7   54.6   77
  6   1560   0.05   33.9   7.8   68.4   48
TLC和GLC分析都证实最初嗜水气单胞菌的转移酶#135反应是主要反应。反应150分钟后开始出现一些水解活性。1560分钟后，转移酶反应与水解反应基本达到相同水平。结果还证实，只要有受体分子胆固醇可利用，转移酶反应就是主要反应。当胆固醇浓度下降，水解活性变得更主要了。
实施例10：以蛋黄作为底物的转移酶活性的测定法-下文成为“蛋黄测定 法”
脂质酰基转移酶从杀鲑气单胞菌分离并在枯草芽孢杆菌中表达。本研究工作的目的是开发一种分析方法，该方法能够测量酶的转移酶和水解活性，通过这些分析，使用包含卵磷脂和胆固醇的底物来定义酶的转移酶和水解活性成为可能。
由于蛋黄包含卵磷脂和胆固醇且已知转移酶与磷脂酶对这种底物非常好地起作用，所以本研究工作将蛋黄作为酶测定的底物。
使用蛋黄的缺点是这种底物是水、脂质和蛋白质的复杂混合物。脂质成分包括甘油酯，66.2％；磷脂，29.6％；和胆固醇，4.2％。磷脂包括73％卵磷脂、15％脑磷脂和12％其它磷脂。对于脂肪酸，33％是饱和脂肪酸和67％是不饱和脂肪酸，包括42％油酸和7％亚油酸(参考Kirk-Othmer Encyclopedia ofChemical Technology，John Wiley&Sons，Inc.)
可预期蛋黄成分有所改变。但文献(Biochimica et Biophysica Acta，1124(1992)205-222)中提到“尽管饮食与环境条件有很大改变，家养母鸡的成熟蛋黄中的脂质及脂蛋白成分非常恒定”，并进一步引证“结果，蛋黄持续提供组成基本稳定的食品，这就可保持它的化学及物理化学特性从而可信地应用于烘焙，化妆品和制药工业中”。
这篇文献表明蛋黄组分非常稳定，因此决定在蛋黄测定中用鸡蛋黄作为底物。
量化对蛋黄的酶处理所得的脂质反应产物是通过从底物中提取脂质，接着做脂质成分的GLC分析得来的。
操作步骤
材料
蛋黄：巴氏灭菌的液态蛋黄，来自
Figure GPA00001103919301261
Products A/S，DK-4000Roskilde。
HEPES缓冲液Sigma目录号H 3375
氯仿，分析级
酶
来自杀鲑气单胞菌的纯化的脂质酰基转移酶#178-9
绵毛嗜热丝孢菌脂酶：GRINDAMYL EXEL 16，产品号147060(对照)
以蛋黄为底物的酶测定
在20ml Wheaton玻璃杯中称量5克液态蛋黄，加热到35℃。
添加0.25ml酶溶液，计时开始。
以规律间隔时间将0.5g样品移到10ml Dram玻璃杯中。
添加20μl 4M HCl以终止酶反应并酸化脂肪酸皂。
添加3ml氯仿。将样品在Whirley中混合30秒
将样品以3000×g离心10分钟，并取0.8ml氯仿相移至涂焦油的(tarred)Dram玻璃杯中。在60℃和氮蒸汽下蒸发氯仿。再次称量dram玻璃杯。
提取的脂质通过GLC和TLC分析。
TLC分析-如本文所述。
GLC分析-如本文所述。
结果
对于用蛋黄作为底物的蛋黄测定法，如表9所示进行实验。
表9
  1   2   3
  蛋黄，液态   克   5   5   5
  转移酶#178-9，32PLU-7/ml*   ml   0.25
  绵毛嗜热丝孢菌脂酶，200LIPU/ml   ml   0.25
分别在15、30、60、120和1080分钟后取出0.5g样品，通过溶剂提取分离脂质。分别用溶剂I和IV做脂质的TLC分析。TLC板的照片如图52所示。
TLC分析清楚的表明，杀鲑气单胞菌的转移酶#178-9的活性(样品3)。这可以从磷脂PC和PE的下降看出。结果还表明溶血卵磷脂LPC的量不如预期的那样高。这说明也许该酶对溶血卵磷脂有水解活性或也可能是由于溶血卵磷脂极性强，可部分地分散在水相中，导致提取不充分所致。
为确定游离脂肪酸、胆固醇及胆固醇酯的量，还对溶剂提取所分离的脂质进行GLC分析。GLC分析结果如表10所示。
表10为来自经酶处理的蛋黄的脂质的GLC。结果以基于脂质成分的％表示
  15分钟   30分钟   60分钟   120分钟   1080分钟
  游离脂肪酸   对照 1 0.328 0.304 0.332 0.333 0.369
  绵毛嗜热丝孢菌(T.lanuginosus) 2 0.391 0.376 0.459 0.627 22.909
  杀鲑气单胞菌#178-9   3   1.007   1.668   4.013   6.761   15.098
  胆固醇   对照   1   3.075   2.968   3.103   3.056   3.099
  绵毛嗜热丝孢菌   2   3.130   3.032   3.045   3.026   3.225
  杀鲑气单胞菌#178-9   3   2.835   1.912   0.356   0.220   0.206
  胆固醇酯   对照   1   0.416   0.397   0.422   0.408   0.437
  绵毛嗜热丝孢菌   2   0.436   0.400   0.425   0.419   0.416
  杀鲑气单胞菌#178-9   3   1.414   2.988   6.107   6.694   5.760
  甘油三酯   对照   1   76.153   73.505   75.565   79.344   77.382
  绵毛嗜热丝孢菌   2   74.099   74.413   77.079   74.284   21.781
  杀鲑气单胞菌#178-9   3   73.781   73.342   77.857   82.040   72.117
从结果来看，观察到在60分钟后样品3中的胆固醇几乎全部被酯化。得出，在前30分钟中有过量的反应底物。因此，将来自15和30分钟后所取得样品的结果用于计算所述酶的活性。
基于表10的信息和蛋黄中含有27％脂质的事实，可计算出每毫升酶产生的微摩尔脂肪酸与胆固醇酯的量，结果见于表11。
表11的结果是通过对样品3(杀鲑气单胞菌，15分钟)中脂肪酸的结果进行如下计算得来的
5g蛋黄中的脂质＝5*0.27＝1.35克
1.35克脂质含1.007％脂肪酸＝1.35*1.007/100＝0.01359克
脂肪酸的平均分子量是272
0.01359克＝0.01359*1000000/272μmol＝49.9798μmol
添加0.25ml酶
μmol脂肪酸/ml酶＝49.9798/0.25＝199.9
表11
  微摩尔/ml酶
 0分钟   15分钟   30分钟
  游离脂肪酸   对照   65.01   60.37
  绵毛嗜热丝孢菌(T.lanuginose) 77.61 74.71
  转移酶#178-9   199.86   331.06
  胆固醇酯   对照
  绵毛嗜热丝孢菌   35.09   33.50
  转移酶#178-9   36.77   33.73
从表11的结果，能够计算出与对照相比，酶引起的脂肪酸和胆固醇酯的量的变化，见表12。
表12
  Δ微摩尔/ml酶  0分钟   15分钟   30分钟
  游离脂肪酸   绵毛嗜热丝孢菌   12.593   14.340
  转移酶#178-9   134.843   270.691
  胆固醇酯   绵毛嗜热丝孢菌   1.677   0.235
  转移酶#178-9   84.196   218.652
产生的脂肪酸和胆固醇酯的量作为时间的函数，如图53所示。
作为时间的函数的水解活性(FFA形成)和脂质酰基转移酶活性(胆固醇酯形成)可从曲线的斜度计算出。接着可以算出相对转移酶活性(％酰基转移酶活性)和相对水解活性，如表13所示。相对转移酶活性可通过先前描述的酰基转移酶活性百分比测定方案来测定。例如，计算#178-9相对活性：总活性是FFA活性+转移酶活性＝9,023+7,2884＝16,311μmol/min/ml，相对转移酶活性＝7,2884*100/16,311＝44,7，相对水解活性＝9,023*100/16,311＝55,3
表13
  绵毛嗜热丝孢菌  FFA活性   0.4780   μmol/min/ml
  杀鲑气单胞菌#178-9   FFA活性   9.0230   μmol/min/ml
  绵毛嗜热丝孢菌   胆固醇酯活性   0.0078   μmol/min/ml
  杀鲑气单胞菌#178-9   胆固醇酯活性   7.2884   μmol/min/ml
  绵毛嗜热丝孢菌   相对转移酶活性   1.6
  杀鲑气单胞菌#178-9   44.7
  绵毛嗜热丝孢菌   相对水解活性   98.4
  杀鲑气单胞菌#178-9   55.3
表13中的结果证实来自杀鲑气单胞菌的转移酶具有显著的转移酶活性，而且所述结果也证实该酶具有显著的水解活性。
来源于绵毛嗜热丝孢菌的脂酶主要有水解活性，相对转移酶活性1.6不是任何转移酶活性的证据，只能用分析中的不确定因素来解释。
结论
利用蛋黄作为底物，来测定来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶和来自绵毛嗜热丝孢菌的脂酶的转移酶和水解酶活性。测定条件下，在胆固醇酯与游离脂肪酸的形成与脂质酰基转移酶的时间之间初始存在线性关系。基于这种线性关系就能计算出水解活性(FFA形成)和转移酶活性(胆固醇酯形成)。还计算相对水解活性和转移酶活性。来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶(本例是GCAT)在这些测定条件下，表现出几乎相等的水解和转移酶活性。
来自绵毛嗜热丝孢菌的脂酶表现出非常低的水解活性且转移酶活性不显著。
实施例11：高水的蛋黄中的转移酶测定
简介
本发明的脂质酰基转移酶从杀鲑气单胞菌中分离并在枯草芽孢杆菌中表达。初步实验证明，该酶对于利用蛋黄为底物将脂肪酸从脂质转移到胆固醇非常有效。
在如下实验中，将更详细研究用蛋黄作为底物的转移酶反应，特别关注所述底物中的水浓度。
操作步骤
材料
蛋黄：巴氏灭菌的液态蛋黄，来自
Figure GPA00001103919301311
Products A/S，DK-4000Roskilde。
HEPES缓冲液Sigma产品号H 3375
氯仿，分析级
角鲨烷，分析级
酶：
#178-9：本发明的来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶
#2427：来自尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)的磷脂酶A1，
Figure GPA00001103919301312
F，来自Novozymes，DK(相当于脂解酶)
#1991：来自胰腺的磷脂酶A2，LIPOMOD 22L，来自Biocatalysts，UK(相当于脂解酶)
以蛋黄为底物的酶测定
用20ml Wheaton玻璃杯称量5克液态蛋黄，加热到35℃。
添加水和酶溶液，开始计时。
以规律的间隔时间将0.5g样品移到10ml Dram玻璃杯中。
添加20μl 4M HCl以终止酶反应并酸化脂肪酸皂。
添加3ml氯仿。将样品在Whirley中混合30秒。
将样品在3000×g离心10分钟并取0.8ml氯仿相移至涂焦油的Dram玻璃杯中。在60℃氮蒸汽下蒸发氯仿。再次称量dram玻璃杯。
分离的脂质通过GLC分析。
GLC分析
Perkin E1mer Autosystem 9000毛细管气相色谱仪，配备有WCOT熔凝硅石柱12.5m×0.25mm ID×0.1μm膜厚度5％苯甲基硅酮(phenyl-methyl-silicone)(CP Sil 8CB，来自Chrompack)。
载气：氦
注射器.PSSI冷分流注射(最初温度50℃加热到385℃)，体积1.0μl
检测器FID：395℃
炉程序：            1     2      3
炉温度，℃          90    280    350
等温线，时间，分钟. 1     0      10
变温速率，℃/min    15    4
样品制备：30mg样品溶于含有0.5mg/ml内部十七烷的9ml庚烷∶吡啶(2∶1)中。将300μl的样品溶液移到钳口瓶(crimp vial)，添加300μl MSTFA(N-甲基-N-三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺(N-Methyl-N-trimethylsilyl-trifluoraceamid))，60℃下反应20分钟。
计算：甘油单-二-三酯(mono-di-triglycerides)和游离脂肪酸的反应因子通过标准2(单-双-甘油三酯)确定，胆固醇、胆固醇棕榈酸酯(Cholesterylpalmitate)和胆固醇硬脂酸酯的反应因子通过纯化的参比物质(称重纯化物质10mg)来确定。
结果
含有2％角鲨烷的蛋黄作为反应的底物。加入角鲨烷作为GLC分析的内标，以量化蛋黄中的脂质成分。
实验设计如表14所示。
表14
30、60和120分钟后取样品，用上述方法分析(取样品0.5ml(exp.1-4)0.86ml(exp.5-6)和2.2ml(exp.7-8))。
GLC结果如表15所示。GLC结果用底物(蛋黄)的百分比表示。该表还显示反应时间与反应混合物中总的水含量。
表15
  酶   反应时间   水％  GLC   GLC   GLC
  分钟   反应中   ％脂肪酸   ％胆固醇   ％胆固醇酯
  对照   120   54   0.247   0.863   0.083
  #178   30   54   0.422   0.669   0.445
  #178   60   54   0.515   0.549   0.672
  #178   120   54   0.711   0.364   1.029
  #2427   30   54   2.366   0.848   0.090
  #2427   60   54   3.175   0.837   0.088
  #2427   120   54   3.926   0.833   0.082
  #1991   30   54   1.606   0.911   0.083
  #1991   60   54   1.701   0.838   0.080
  #1991   120   54   1.781   0.763   0.053
  #178   30   73   0.377   0.764   0.495
  #178   60   73   0.488   0.665   0.719
  #178   120   73   0.626   0.426   0.931
  #2427   30   73   2.471   0.853   0.092
  #2427   60   73   3.284   0.858   0.087
  #2427   120   73   4.176   0.837   0.081
  #178   30   89   0.344   0.720   0.308
  #178   60   89   0.443   0.725   0.446
  #178   120   89   0.610   0.597   0.607
  #2427   30   89   0.510   0.167   0.010
  #2427   60   89   0.602   0.133   0.010
  #2427   120   89   0.867   0.147   0.009
基于对脂肪酸、胆固醇和胆固醇酯的分析，能够计算出产生的游离脂肪酸和胆固醇酯的含量作为反应时间和含水量的函数。在这些结果的基础上，则能以脂肪酸形成和胆固醇酯形成的总和计算出总酶活性。通过表16所示结果计算出相对水解活性和相对转移酶活性(即％酰基转移酶活性)。
表16所示结果还用Statgraphic Multifactor ANOVA做统计学分析。图54的统计学结果证实，在这些测定条件下，磷酸脂酶A1，#2427和磷酸脂酶A2，#1991没有转移酶活性而转移酶#178-9显示出50％的转移酶活性。
在该测定中含水量对于转移酶#178的转移酶活性的影响也进行了统计学分析，如图55所示。这些结果表明该测定中的含水量在54-89％范围之间的情况下，含水量对于相对转移酶活性无明显影响。
反应时间对于转移酶#178的转移酶活性的影响利用如表16与图56所示的结果评估。图56结果表明相对转移酶活性作为反应时间的函数下降。这可以用大多数受体分子胆固醇被消耗，因此相对水解活性提高这一事实来解释。#2427转移酶反应的负值仅表明对于该分析方法，在变异内没有转移酶活性。
表16
 酶   反应时间分钟   在反应混合物中的水％   产生的脂肪酸   消耗的胆固醇   产生的胆固醇酯   水解活性％   转移酶活性％
 #178   30   54   0.175   0.194   0.362   53   47
 #178   60   54   0.268   0.314   0.589   52   48
 #178   120   54   0.464   0.499   0.946   53   47
 #2427   30   54   2.119   0.015   0.007   100   0
 #2427   120   54   2.928   0.026   0.005   100   0
 #2427   60   54   3.679   0.030   -0.001   100   0
 #1991   30   54   1.359   -0.048   0.000   100   0
 #1991   60   54   1.454   0.025   -0.003   100   0
 #1991   120   54   1.534   0.100   -0.030   101   -1
 #178   30   73   0.130   0.099   0.412   42   58
 #178   60   73   0.241   0.198   0.636   47   53
 #178   120   73   0.379   0.437   0.848   51   49
 #2427   30   73   2.224   0.010   0.009   100   0
 #2427   60   73   3.037   0.005   0.004   100   0
 #2427   120   73   3.929   0.026   -0.002   100   0
 #178   30   89   0.097   0.143   0.225   50   50
 #178   60   89   0.196   0.138   0.363   56   44
 #178   120   89   0.363   0.266   0.524   62   38
 #2427   30   89   0.263   0.696   -0.073   113   -13
 #2427   60   89   0.355   0.730   -0.073   110   -10
 #2427   120   89   0.620   0.716   -0.074   105   -5
结论
在底物蛋黄中并在不同含水量条件下对来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶进行测试。将该酶与对照脂解酶即来自尖孢镰刀菌的磷脂酶A1和来自胰腺的磷脂酶A2进行比较。
结果证明，在胆固醇酯形成过程中只有转移酶催化卵磷脂与胆固醇之间的转移酶反应。结果表明，在底物含水量在54％到89％的范围内，对于来自杀鲑气单胞菌转移酶的相对转移酶活性几乎是相同的。
实施例12：“经缓冲的底物中的转移酶测定法”用于测定酰基转移酶活性 (例如用于使用卵磷脂与胆固醇的食品)
从杀鲑气单胞菌中分离脂质酰基转移酶并在枯草芽孢杆菌中表达。该酶在形成胆固醇酯过程中，对于将脂肪酸从脂质转移到胆固醇非常有效。通过观察游离脂肪酸的形成，表明该酶具有一定的水解活性。传统的磷脂酶(EC3.1.1.4和EC3.1.1.32)在游离脂肪酸和溶血卵磷脂的形成过程中具有水解卵磷脂的能力，并且没有报道过这些酶有转移酶活性。
我们这里详细描述了酶的转移酶和水解活性的测定方法，并因此鉴别本发明的脂质酰基转移酶，所述测定方法所用底物包括卵磷脂和胆固醇。本研究工作中使用基于分散在缓冲液中的磷脂酰胆碱和胆固醇的底物。从所述底物中提取脂质，然后用GLC分析脂质成分，从而定量反应产物。
操作步骤
材料
L-α-磷脂酰胆碱95％(Plant)Avanti no.441601
胆固醇：Sigma目录C 8503
胆固醇棕榈酸酯，Sigma C 6072
胆固醇硬脂酸酯，Sigma C 3549
HEPES缓冲液，Sigma目录号H 3375
氯仿，分析级
酶
来源杀鲑气单胞菌的纯化GCAT#178-9
TLC分析如实施例6所述进行。
GLC如实施例11所述进行。
结果：转移酶测定基于作为底物的磷脂酰胆碱和胆固醇。
在以下中，根据下述操作，在以磷脂酰胆碱和胆固醇基础的底物中测定转移酶的转移酶活性。
450mg磷脂酰胆碱(＞95％PC Avanti产品号441601)和50mg胆固醇溶于氯仿，在真空条件下蒸发干燥。300mg胆固醇/磷脂酰胆碱混合物转移到Wheaton玻璃杯中并且添加15ml 50mM HEPES缓冲液pH 7。在搅拌过程中脂质分散在缓冲液中。
底物在磁力搅拌器混合下加热至35℃，添加0.25ml酶溶液。这是大约95％水的非常高的含水量环境。
在反应0、5、10、15、25、40和60分钟后取出2ml样品。立即添加25μl 4M HCl以酸化游离脂肪酸并终止酶反应。添加3.00ml氯仿。将样品在Whirley中剧烈振摇30秒。将样品离心，分离2ml氯仿相并用0.45μm的滤器过滤入10ml涂焦油的Dram玻璃杯中。在60℃氮蒸汽条件下蒸发氯仿。并再次称量样品。提取的脂质通过GLC分析。
GLC分析结果如图17所示。结果以所提取脂质的百分比计算。形成的脂肪酸和胆固醇酯的数量作为时间的函数，如图57所示。从图57推断酶反应作为时间的函数不是线性的，因为观察到初始的水解和转移酶活性较高。在大约10分钟之后，大约60分钟之前，反应显示出脂肪酸和胆固醇酯的形成与时间的线性关系。因此决定以这种时间间隔观察酶反应。
表17
  分钟   0   5   10   15   25   40   60
  胆固醇，％   10.064   8.943   8.577   8.656   8.102   7.856   7.809
  胆固醇酯，％   0.000   1.571   2.030   2.058   2.282   2.659   3.081
  总FFA，％   0.260   1.197   1.239   1.466   2.445   2.943   3.940
根据已知的反应混合物中的脂质含量与添加的酶量能够计算出脂肪酸和胆固醇酯的形成量，用μmol/ml酶表示(表18与图58)
表18
  分钟   10   15   25   40   60
  μmol/ml   μmol/ml   μmol/ml   μmol/ml   μmol/ml
  总FFA   58.1   68.7   114.6   138.0   184.7
  胆固醇酯   88.8   90.0   99.3   115.6   133.8
从表18的结果和图58的曲线的斜率，能够计算出作为时间函数的脂肪酸和胆固醇酯的量，用μmol/min/ml酶表示。
水解活性与转移酶活性的计算如表19所示。用在上文描述的酰基转移酶活性百分比的测定方案测定相对转移酶活性。
表19
  水解活性(脂肪酸)   2.52   μmol/min/ml酶
  转移酶活性(胆固醇酯)   0.94   μmol/min/ml酶
  总活性   3.45   μmol/min/ml酶
  水解活性(脂肪酸)   2.52   μmol/min/ml酶
  相对转移酶活性   27.1   ％
  相对水解活性   72.9   ％
其它酶的转移酶活性筛选
使用上面提到的方法来筛选不同脂解酶的转移酶活性和水解活性。测试的酶如表20所示。
表20
Figure GPA00001103919301371
包含300mg磷脂酰胆碱/胆固醇的底物分散到50mM pH 7.0的HEPES缓冲液中，搅拌下加热至35℃，添加酶溶液，搅拌下于35℃样品保持。以规律的时间间隔取出样品并用氯仿提取。分离的脂质用GLC分析，结果如表21所示。
表21
Figure GPA00001103919301372
Figure GPA00001103919301381
从GLC分析观察到，只有脂质酰基转移酶(178-9)产生大量的胆固醇酯和脂肪酸。还观察到来自尖孢镰刀菌的磷脂酶使得游离脂肪酸量稳定增加，仅最初有少量的胆固醇酯形成，但是没有观察到胆固醇酯作为时间函数而增高。
根据脂质底物的量与GLC分析，能够基于得自10到60分钟反应时间的结果计算出相对转移酶活性和相对水解活性。转移酶178-9和尖孢镰刀菌脂酶的结果如表21所示。测试的其它的酶没有表现出活性。
表21
 转移酶178-9   尖孢镰刀菌
  水解活性，微摩尔/分钟/毫升酶   1.03   0.96
  转移酶活性，微摩尔/分钟/毫升酶   0.40   0.01
  总活性，微摩尔/分钟/毫升酶   1.43   0.98
  相对水解活性   71.8   98.7
  相对转移酶活性   28.2   1.3
表21所示结果证实脂质酰基转移酶(样品178-9)具有显著的转移酶活性。还观察到相对转移酶活性与表19所示实验十分一致。
然而观察到来自尖孢镰刀菌的磷脂酶具有非常低的转移酶活性。转移酶活性非常低以至于其落在分析的不确定性范围中。如所意料的，尖孢镰刀菌的磷脂酶具有显著的水解活性。
结论
基于纯化的磷脂酰胆碱和胆固醇的人造底物替代蛋黄(实施例11所示)作为测定杀鲑气单胞菌转移酶活性的底物。在反应时间10到60分钟之间，游离脂肪酸与胆固醇酯形成作为时间的函数呈现几乎线性。基于反应时间10到60分钟之间的活性，计算出水解活性与转移酶活性。
本测定方法中的底物浓度相对低于蛋黄中的底物浓度而言较低，而含水量相对较高。
根据来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶(这种情况中是GCAT)在缓冲液中人造底物磷脂酰胆碱/胆固醇中的实验的结果，得出这种酶在含水量很高的体系中也具有很好的转移酶活性。
基于蛋黄(参见实施例11)和缓冲液中的磷脂酰胆碱/胆固醇(参见实施例12)的测定方法都能用于测定酶的转移酶活性和水解活性。根据以下来优选蛋黄：水解活性和转移酶活性与时间呈线性关系，而缓冲液中的磷脂酰胆碱/胆固醇仅在某一时间范围内呈线性关系。
实施例13：食品乳液(Food Emulsion)
在含60％油脂的标准食品乳液配方(recipe)中测定经酶修饰的液态蛋黄的影响。
标准方法与材料如以上实施例中所详述。
如表22所示，蛋黄用来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶(#138)或磷脂酶即商品酶
Figure GPA00001103919301401
(Novozymes A/S，Denmark)(#2938)处理。
表22蛋黄的酶处理
1 2 3 4
  蛋黄，Sanofo产品号1123P2   克   10   10   10   10
1 2 3 4
  #138，10PLU/ml   ML   1   1
  #2938，200PLU/ml   ML   1
  水   ML   1
  反应时间   分钟   210   360   210   210
来自酶处理过的蛋黄的蛋黄脂质的TLC分析显示在图59和60。
在本实验中，#2939的剂量增大10倍，这使蛋黄产生非常明显的活性。游离脂肪酸量明显升高，卵磷脂(PC)水解为溶血卵磷脂(LPC)。由于游离胆固醇转化为胆固醇酯，部分卵磷脂转化为溶血卵磷脂，所以转移酶#138发生了明显的转移酶反应。
酶修饰作用的另一有趣方面是产物的稠度。经磷脂酶#2938处理的样品变得十分坚硬，而用脂质酰基转移酶#138处理的样品与对照样品具有相同的液体稠度(参见图61)。
在食品乳液配方中检测修饰后的蛋黄，如表23所示。
表23蛋黄酱与酶修饰蛋黄
  0   1a   2a   3a   4a
  ％   ％   ％   ％   ％
  Rapsolie   60   60   60   60   60
  蛋黄，Sanofo product no.123P2   2.8
  酶修饰蛋黄1   2.8
  酶修饰蛋黄2   2.8
  酶修饰蛋黄3   2.8
  对照(未处理)蛋黄4   2.8
  水   39   36.2   36.2   36.2   36.2
  醋，10％乙酸   1   1   1   1   1
经修饰的蛋黄1和2是经脂质酰基转移酶处理的；经修饰的蛋黄3是经商品磷脂酶处理的。
根据下列操作程序生产水包油乳液的食品乳液：蛋黄与水在烧杯中称量，油单独称量。
将Turrax混合器(20000rpm)浸于水相。油以恒定速度泵入水相，持续2分钟。混合过程再持续1分钟。然后加入醋并混合5秒。
在100℃加热箱中检验乳化剂的稳定度。100℃下2小时后评定所述乳液(参见图62)。
该实验中未经处理的蛋黄的乳液稳定性十分良好。但用脂质酰基转移酶#138处理的蛋黄由于水分离的量减少而具有提高的稳定性。经磷脂酶#2938处理的蛋黄产生非常不稳定的乳液，在100℃时油与水相几乎完全分离。
认为，在一些应用中，使用本发明的组合物和方法能够提高乳液的热稳定性，如水包油色拉调料等。这一点对于食品乳化剂尤为重要，这些食品乳化剂为延长保质期要经巴氏灭菌处理和/或储存之前接受加热处理，如在食用之前要再加热处理的经预加工的肉类(如微波炉肉类)。虽然不期望受任何具体理论束缚，在一些应用中，游离脂肪酸的蓄积被认为可损害这些乳液的热稳定性。应认识到，使用本发明的方法获得热稳定性增强的食品乳液可能在所有食品应用中都未被发现或甚至是不可期望的。所属领域中的技术人员明白，在这些领域的应用中，这些特点在应用中是期望的，乳液的稳定性可使用等同于例如巴氏灭菌处理或微波炉再加热的简单加热实验而容易地检测。本发明的发明人已发现，在优选的实施方案中，用本发明的酶获得的食品乳液具有提高的热稳定性。
实施例14：富含植物甾醇的蛋黄中的转移酶反应
源自杀鲑气单胞菌的转移酶能够催化在富含植物甾醇与甘油的蛋黄中形成溶血卵磷脂、甘油单酯和植物甾醇酯。所述酶还在包括棕榈油、卵磷脂、植物甾醇与甘油的低含水量体系中测试。通过TLC和GLC分析显示，在这些反应条件下有甘油单酯和植物甾醇酯产生。
简介：
在卵磷脂、脂肪、植物甾醇和甘油的几乎不含水的体系中，测定来自杀鲑气单胞菌的转移酶的转移酶活性。
材料：
蛋黄：经巴氏灭菌的液态蛋黄来自
Figure GPA00001103919301411
Products A/S，DK-4000Roskilde
GCAT转移酶纯化178-9，32PLU-7/ml(Journal 2254-100)
大豆卵磷脂，Yolkin，来自Aarhus United，Denmark。
棕榈油43，来自Aarhus United，Denmark。
L-α磷脂酰胆碱95％Plant(Avanti#441601)
谷甾醇，Sigma noS5753
植物甾醇：Generol N122，来自Cognis，Germany
甘油：产品号085915
结果
对植物甾醇与甘油的转移酶活性初始筛选在蛋黄中如表24所述进行。
表24
1 2 3 4
蛋黄   克   1   1   1   1
甘油   克   0.1   0.1
谷甾醇∶olie 3∶7   克   0.13   0.13
转移酶#178-9   单位   1   1
水   *   *
*相应酶溶液中水量的水＝83μl
混合各组分并加热至37℃，在用磁力搅拌器搅拌的过程中保持在这个温度。
3和23小时后取出0.1克样品，用TLC分析。
TLC分析结果如图63所示。
图63中的结果表明，胆固醇与植物甾醇通过转移酶反应酯化，并伴随溶血卵磷脂的形成(样品3和4)，原因是在样品3中几乎所有的游离甾醇和胆固醇都转化为相应的酯。
结果还说明只有具有甘油和蛋黄的样品产生甘油单酯。甘油单酯的量需经过GLC分析确认。当甾醇与甘油(样品3)同时添加时，甘油单酯的量非常低，以至于应用TLC检测不到。这表明只要甾醇和胆固醇有剩余，使用甘油的转移酶反应就是适度的。
在另一实验中，将转移酶178-9添加到大豆卵磷脂、甘油和植物甾醇的混合物中，目的是研究酶在该反应混合物中的催化活性。
在这些实验中反应混合物中的组成如表25所示。
表25
  1   2   3   4   5   6
  大豆卵磷脂   克   1.875   2.25   1.875   2.5   3.5   3.5
  植物甾醇；Generol N 122   克   0.225   0.225   0   0   0.225   0.5
  棕榈油43   克   2.675   2.25   2.8   2.125   1.062   0.831
  甘油   克   0.225   0.275   0.325   0.375   0.248   0.238
  转移酶#178-9，32PLU/ml   ml   0.2   0.2   0.2   0.2   0.2   0.2
实验通过在46℃搅拌下混合所述脂质成分来进行。添加酶，4和24小时后取出样品。
样品通过TLC分析，如图64所示。
在反应24小时后，取出实验2、4和5的样品，也进行GLC分析，结果如表26所示。
表26
                         2                     4                        5
甘油               ％    3.16                  5.71                     4.17
脂肪酸             ％    4.23                  5.36                     6.67
甘油单酯           ％    2.24                  3.87                     3.92
甾醇               ％    2.13                                           2.62
甾醇酯             ％    2.89                                           2.14
结果证实了转移酶178-9在含有大豆卵磷脂、甘油和植物甾醇的反应混合物中，能够催化植物甾醇酯和甘油单酯的形成。在需要甘油单酯的乳化性质以及植物甾醇的降低胆固醇效应的情况下，这种反应混合物可用于人造黄油的生产。
结论
来源于杀鲑气单胞菌的CGAT转移酶能够催化添加了植物甾醇和甘油的蛋黄中植物甾醇酯和甘油单酯的形成。同样的酶还催化在棕榈油、卵磷脂、植物甾醇和甘油的混合物中形成植物甾醇酯和甘油单酯。因此在需要甘油单酯和溶血卵磷脂以改善乳化作用并需要植物甾醇的降低胆固醇效应的情况下，该酶可用于人造黄油和其它含油脂食品的生产。
实施例15：来源于杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶的固定化和在甾醇酯 合成方面的应用
来源于杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶(本例中为GCAT)通过丙酮的沉淀作用固定在C盐(Celite)上。10ml酶溶液在20mM pH 7的TEA缓冲液与0.1克C盐535535(来自Fluka)在室温缓慢搅拌2小时。
在持续搅拌过程中加入50ml冷丙酮。
沉淀物通过在5000g离心1分钟分离。
沉淀物用20ml冷丙酮洗涤2次。
C盐在环境温度干燥1小时
固定化的转移酶在含有13％磷脂酰胆碱酶和7％植物甾醇的油混合物中测试。(表27)
表27
  ％
  Avanti卵磷脂   12.0
  植物甾醇Generol 122N   6.6
  ％
  棕榈油43   71.4
  甘油   5.0
  固定化的转移酶#178，45U/g   2.0
  水   3.0
卵磷脂、植物甾醇和大豆油加热至46℃，溶解植物甾醇。添加固定化的转移酶。
在用磁力搅拌器温和搅拌的过程中，转移酶反应在46℃持续进行。在1/2、1、3、6和24小时后取出样品，并进行TLC分析。反应24小时后终止反应，滤出固定化的酶。
TLC分析样品结果如图65所示。
TLC分析明确显示来自杀鲑气单胞菌的固定化的转移酶在将胆固醇转化为胆固醇酯中的效应。还观察到少量甘油单酯形成。还显示酶在含水量高(6-89％)的环境中具有高的活性，因此该转移酶以及用于本发明的其它转移酶也能用于具有高含水量的固定化酶的应用中。这允许在利用转移酶的脂质的生物转化中替代目前的固定化的脂酶。
实施例16：嗜水气单胞菌转移酶能够从磷脂转移到甾醇形成甾醇酯和/ 或转移到糖分子形成糖酯。
来自嗜水气单胞菌的在大肠杆菌(Hydro 0303HVP)中表达的脂质酰基转移酶(标号#139)在螯合型琼脂糖凝胶FF，HR 2.5/10柱上纯化并分析磷脂酶活性。在蛋黄中评价转移酶活性来确定在蛋黄中的酶活性与功能性。所述酶还在含有葡萄糖的蛋黄中测试。
磷脂酶活性
从螯合型琼脂糖凝胶FF，HR 2.5/10柱分离的转移酶#139用NEFA-PLU(pH7)测定，活性为1,15单位NEFA-PLU/ml。
蛋黄
在初始应用测试中，转移酶#139根据下列操作步骤在蛋黄中测试。
1克新鲜蛋黄在10ml有螺旋盖的烧瓶中称量。加入酶制剂并在旋涡混合器中混合。样品放置于37℃并用磁性搅拌器搅拌。
加入7.5ml氯仿∶甲醇(2∶1)终止反应并在Whirley中混合30秒。氯仿相通过离心分离，将2μl氯仿相转移至预活化的硅胶TLC板上并用运行缓冲液nr.I洗脱，另一TLC板在运行缓冲液IV中洗脱。
实验设计如表28所示
表28
  测试   反应时间   蛋黄   转移酶#139
  序号   分钟   克   单位
  测试   反应时间   蛋黄   转移酶#139
  1   10   1
  2   10   1   0.75NEFA-PLU
  3   60   1   0.75NEFA-PLU
  4   300   1   0.75NEFA-PLU
  5   1200   1
  6   1200   1   0.75NEFA-PLU
TLC分析如图66和图67所示。TLC分析清楚显示转移酶#139的转移酶反应。胆固醇转化为胆固醇酯，卵磷脂量减少。然而结果同样还表明由于转移酶#139还作用于溶血卵磷脂，所以溶血卵磷脂仅有少量的蓄积。游离脂肪酸(FFA)的形成支持本观察结果。
蛋黄与葡萄糖
之前已证明来自杀鲑气单胞菌的转移酶(#138)能够在转移酶反应中利用葡萄糖作为受体分子。还测试了转移酶(#139)是否能够利用葡萄糖作为受体分子。实验设计见于表29。
表29
  测试   反应时间   蛋黄   葡萄糖，70％   转移酶#139
  序号   分钟   克   毫克   单位
  1   10   1   500
  2   10   1   500   1NEFA-PLU
  3   60   1   500   1NEFA-PLU
  4   180   1   500   1NEFA-PLU
  5   300   1   500   1NEFA-PLU
  6   1200   1   500   1NEFA-PLU
  7   1200   1   500
反应产物通过TLC分析(图68和图69)。
TLC分析表明在反应时间220分钟后形成葡萄糖酯(图69，泳道6)但在反应1200分钟后观察不到葡萄糖酯。
因此，得出转移酶#139具有转移酶和水解活性。游离脂肪酸作为反应时间的函数稳定升高也证明了这一点。
概述：
来自嗜水气单胞菌的转移酶在蛋黄中测试。结果证实该酶催化胆固醇酯的形成并伴有溶血卵磷脂的形成。延长的反应时间之后，当大部分胆固醇消耗掉，游离脂肪酸也形成。因此能够得出该酶主要具有转移酶活性，当只有水作为供体分子时，还观察到水解活性。
在利用蛋黄与葡萄糖的实验中，观察到来自嗜水气单胞菌的转移酶在含水量高的食物环境中可催化葡萄糖酯的原位形成(图70)。
实施例17：来自嗜水气单胞菌(Ahyd2)的脂质酰基转移酶的变体(SEQ ID No.36(参见图71))
用来自Stratagene，La Jolla，CA 92037，USA的
Figure GPA00001103919301461
Multi-SiteDirected Mutagenesis试剂盒引入突变，按Stratagene提供的说明进行。
变异位于酪氨酸256的变体显示对磷脂的活性增加。
变异位于酪氨酸256和酪氨酸260的变体显示对半乳糖脂的活性增加。
变异位于酪氨酸265的变体显示对作为酰基供体的半乳糖脂的转移酶活性增加。
编号指示在下列序列中的位置：来自嗜水气单胞菌的酶，其氨基酸序列如图71SEQ ID No.36所示(加下划线的氨基酸表示木聚糖酶信号肽)。核苷酸序列如图72中SEQ ID No 54所示。
实施例18：酰基转移酶反应在产生用于人造黄油制备的植物甾醇酯和甘 油单酯中的应用
在枯草芽孢杆菌中表达的、源自杀鲑气单胞菌的酰基转移酶在包含植物卵磷脂、植物甾醇和甘油的棕榈油混合物中被测试。酰基转移酶在产生植物甾醇酯和甘油单酯的过程中，表现出利用植物甾醇和甘油作为受体分子的能力。反应混合物用于基于反应混合物中的甘油单酯生产高品质的食用人造黄油，与此同时，人造黄油中富含有降胆固醇作用的植物甾醇酯。
此实验工作的目的是研究通过溶于植物脂肪中的卵磷脂、植物甾醇和甘油的酶促反应生成甘油单酯和植物甾醇酯的可能性。
初始实验表明能够利用来自杀鲑气单胞菌的酰基转移酶从卵磷脂、甘油和植物甾醇生成甘油单酯和植物甾醇酯。
在该实验中，这种反应混合物被用于生产食用人造黄油。
材料：
来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶，#196C101，18.6PLU/g(Journal2254-104)
棕榈油43，来自Aarhus United，DK
L-α磷脂酰胆碱95％Plant(Avanti#441601)
植物甾醇：Generol N122，来自Cognis，Germany
甘油：产品号085915
蒸馏过的甘油单酯，Dimodan HP来自Danisco。
人造黄油的制备
1、混合水相成分。(如需要，将水相加热至80℃进行巴氏灭菌)。调整到pH 5.5。
2、熔化脂肪相，温度调节到大约40-45℃。
3、加热乳化剂和一些油脂(乳化剂和油脂的比例为1份乳化剂比5份油脂)到一定温度(75-80℃)，该温度比乳化剂的熔点高5-10℃。当混合物完全熔化并充分搅拌后，将其加入持续加热的油脂中，持续搅拌。
4、添加调味料。
5、将水相添加到脂肪相中，持续搅拌。
6、冷凝管(正常容量，正常冷却)中冷却至出口温度8-10℃。
结果
在棕榈油混合物中测试源自杀鲑气单胞菌的酰基转移酶，如表30所示。为使植物甾醇和卵磷脂溶解，在搅拌过程中将卵磷脂、植物甾醇、甘油和棕榈油加热至60℃。
表30
底物                    ％
Avanti卵磷脂            12
植物甾醇，Generol
122N                    6.6
棕榈油，熔点43          76.4
甘油                    5
底物冷却至48℃，按表31所示量添加酰基转移酶#196。缓慢搅拌下保持反应混合物在48℃24小时。
表31
                克
底物            220
转移酶#196      15
C101，
18.6PLU/g
在反应1、4和24小时后从反应混合物中取出样品，并在溶剂I中做TLC分析(图73)。TLC结果清楚显示有植物甾醇酯和甘油单酯形成。在图73中，第一泳道是反应1小时后，泳道2是反应4小时后，泳道3是反应24小时后，泳道4是植物甾醇。
反应24小时后终止反应，弃去不溶性植物甾醇的残余物，澄清溶液用于生产人造黄油。
人造黄油
根据表32所示配方，含甘油单酯和植物甾醇酯的反应混合物用于生产食用人造黄油。
表32
  Jour.No 3734   1   2
  水相
  Jour.No 3734   1   2
  水相   16   16
  盐   0.5   0.5
  脱脂奶粉   1   1
  山梨酸钾   0.1   0.1
  EDTA   0.015   0.015
  PH   5.5   5.5
  总水相   16.6   16.6
  脂肪相
  棕榈油43   25   25
  菜籽油   75   75
  总脂肪相   83.2   78.4
  Dimodan HP   0.2
  反应混合物   5
从反应混合物生产的人造黄油品质优良，具有良好的可涂抹性，良好的口感且没有任何风味丧失。将人造黄油与用蒸馏过的甘油单酯Dimodan HP生产的参比人造黄油在质量水平上进行比较。
观察到人造黄油jour.3734no 2与反应混合物的唯一不同就是稍稍硬一些，原因是配方中所含的棕榈油43比参照人造黄油中的含量大。
实施例19：脂质酰基转移酶在面包制作中的用途
在制作面包时，使用脂酶的局限性之一是脂酶反应过程中有游离脂肪酸形成。众所周知，过多的游离脂肪酸形成将对面粉的烘焙效果产生负面影响，原因是谷蛋白变得太硬和僵(bucky)(即弹性下降)的面团形成，其在发酵和烘焙过程中不能膨胀。
从抗氧化稳定性角度而言，也应避免形成游离脂肪酸，原因是游离脂肪酸比相应的甘油三酯更易于发生脂质氧化。
本发明中，在面团中添加脂解酶导致游离脂肪酸形成的问题用添加脂质酰基转移酶的方法克服，脂质酰基转移酶不产生游离脂肪酸，而将一个或多个脂肪酸从脂质酰基供体转移到面团中的非水受体分子，如碳水化合物、蛋白或肽链上，或者如果用于含有乳脂肪的面包中，甾醇可选或与其它上面列出的受体联合添加到面团中，所述甾醇如植物甾醇或植物甾烷醇。优选面团中的受体分子可能是葡萄糖、蔗糖或麦芽糖和/或其它常用在面团中的碳水化合物中的一种或多种。
在下列实验中，在微型烘焙实验中检测脂质酰基转移酶。反应产物的形成，从充分醒发成形的面团中的脂质成分由水饱和的丁醇提取，并通过HPLC和GLC分析。
材料与方法
酶：酰基转移酶，550PLU-7/ml
LipopanTM F BG，Novozymes提供的商品脂酶，12000LIPU/g或GrindamylExel 16.12000LIPU/g
卵磷脂粉，95％磷脂(Danisco A/S Denmark提供)
二半乳糖基甘油二酯，来自全麦(面)粉(来自SigmaD4651)
面粉：
Figure GPA00001103919301501
nr.2001084(丹麦小麦粉，来自Havnemollerne，Odense，Denmark)
微型烘焙实验
面粉50克、干酵母10克、葡萄糖0.8克、盐0.8克、70ppm抗坏血酸和400Brabender单位的水在50克Brabender混合碗中在30℃下揉捏5分钟。
34℃静置10分钟。将面团分成各15克的面团。然后在一特定装置中成形，在该装置中面团卷在木盘和树脂玻璃支架之间。所述面团在罐中34℃下醒发45分钟，在Voss家用烤炉中225℃烘焙8分钟。
烘焙后，使面包冷却至室温。20分钟后称量面包并用油菜籽置换法(rapeseed displacement method)测量体积。还将面包切开，并评价瓤和皮(crust)。
结果与结论：
初步结果表明脂质酰基转移酶对于面包的体积与外观都显示出明显的积极作用。具体地，初步结果表明与对照(无酶)及与使用商品脂解酶即Grindamyl Exel 16或LipopanFTM相比，使用脂质酰基转移酶使面包比体积增大。
实施例20：利用乳脂的标准冰淇淋
用于冰淇淋的乳化剂产生受控制的脂肪结晶化和轻微的去稳定化，这是由于在冰淇淋的老化(aging)过程中蛋白质吸附作用导致。这种改变改善了冰淇淋品质。甘油单酯或甘油二酯通常用于冰淇淋生产，还已知在冰淇淋生产过程中联合使用极性乳化剂如聚山梨酯和糖酯以及甘油单酯-二酯(mono-diglyceride)有助于控制脂肪去稳定化，生产的冰淇淋具有良好的奶油质感和幼滑的口感。
用于冰淇淋生产的乳化剂通常以粉剂形式添加到冰淇淋混合物。但近来已表明使用脂酶对冰淇淋配方中的脂肪进行酶促反应，可产生甘油单酯-二酯。但是使用脂酶带来的问题是当反应混合物中存在有水时，脂酶也催化游离脂肪酸的形成。
但是，令人惊奇的是脂质酰基转移酶克服了脂酶的缺陷，因为脂质酰基转移酶能够将脂肪酸从卵磷脂和其它脂质上转移至受体分子如甾醇、胆固醇、葡萄糖、甘油和蛋白/肽链，而不形成大量的游离脂肪酸。
冰淇淋中的主要成分之一是含有38％乳脂的乳制奶油(diary cream)。乳制奶油也包含少量的卵磷脂，卵磷脂是脂质酰基转移酶的供体分子。(“containssmaller amount of lecithin，which is a donor molecule for acyl-transferase.(“Complex milk lipids account for about 1％of the total milk fat and are mainlycomposed of phospholipids”Ref.Mllmann′s Encyclopedia of Industrial
Figure GPA00001103919301511
2003by Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA.)。乳制奶油还含有少量作为脂质酰基转移酶的受体分子的胆固醇。
从冰淇淋的组成成分来看，其能够产生甘油单酯和极性乳化剂，如溶血卵磷脂和糖酯，这些对于冰淇淋生产有益。
在乳制奶油中酰基转移酶反应的另一有益效果是形成胆固醇酯，这可以减慢胆固醇在肠道中的吸收。
冰淇淋配方
  加乳化剂   加酶
  乳制奶油，38％   23.65   23.65
  脱脂牛奶   53.30   53.30
  脱脂奶粉   4.90   11.30
  糖   12.00   12.00
  葡萄糖糖浆DE 42.75％TS   4.25   4.25
甘油 1.0 1.0
  稳定剂   0.2   0.2
  Cremodan SE 30   0.6
  脂质酰基转移酶500PLU/g   0.1
  Grindsted调味料2976   0.1   0.1
  色泽   +   +
冰淇淋生产过程：
1.将乳制奶油，葡萄糖糖浆和甘油加热至约40℃。添加脂质酰基转移酶，并让混合物反应30分钟。取出样品用于分析。
2.加热所有其它脂质成分至40℃左右。
3.添加其它干燥成分。(添加之前，先混合稳定剂混合物(stabiliser blend)和糖)
4.当干燥成分溶解，加入乳制奶油-葡萄糖混合物。
5.80-85℃巴氏灭菌20-40秒。
6.80℃匀浆(配方1，190巴；配方2，175巴)
7.冷却至老化温度，4℃
8.在持续冷冻箱中冷冻到所需超限(desired overrun)(100％建议)
9.在管道(tunnel)中于-40℃下硬化
10.低于-25℃保存
结果：
与使用商品乳化剂Cremodan SE 30制备的冰淇淋相比，在冰淇淋生产过程中使用酰基转移酶有助于生产味道极佳、奶油口感很好的冰淇淋。由脂质酰基转移酶生产的冰淇淋的熔化现象也有改善。
实施例21：干酪中的酰基转移酶
干酪是通过经粗制凝乳酶或其它适宜的促凝剂的作用将牛奶、脱脂牛奶、部分脱脂牛奶、奶油、乳清奶油或酪乳，或这些物质的任何组合凝固，和部分排出所述凝固产生的乳清，从而制成的新鲜或成熟的固体或半固体产品。
干酪产量主要依赖于牛奶中的脂肪与蛋白成分。盐(具体是钙盐)和蛋白浓缩物，还有酸度，对于凝固非常重要。(参考Mllmann′s Encyclopedia of Industrial Chemistry
Figure GPA00001103919301531
2003by Wiley-VCH Verlag GmbH&Co)。
所述努力是为优化和增加干酪产量，其通过干酪生产程序的最优化(USP4,959,229)或通过使用改良凝固方法(USP 4,581,240)实现，后一种方法增加凝乳中乳清蛋白的含量。
在本发明中，使用脂质酰基转移酶制备干酪过程中，通过对牛奶的处理，通过酶促修饰乳清蛋白使凝乳中乳清蛋白的含量增加。
当脂肪酸与非膜性蛋白如β-乳球蛋白共价结合时，它的物理的和功能的特性将显著改变。
为本发明的干酪生产，在牛奶中添加粗制凝乳酶之前或同时将脂质酰基转移酶加到牛奶中。
酪蛋白沉淀的过程中，酰基转移酶可在形成酰化的蛋白或酰化的肽链过程中利用卵磷脂和牛奶中的其它脂质作为供体，肽或蛋白作为受体分子。
乳蛋白疏水性的改变有助于增加干酪生产过程中凝乳中的蛋白沉淀。
由于本发明获得的干酪产量增加源于提高常常丢失到乳清中的蛋白的干酪凝块中的保留量增加，因此一种直接与本发明机制相关的适宜方法是建立在测定乳清中的最终蛋白含量的基础上。乳清中的蛋白越少必然意味着凝乳中的蛋白越多，干酪产量也越高。
乳清中蛋白量的测定含可按以下方法进行。在100ml烧杯中，将脱脂或全脂牛奶加热至适宜粗制凝乳酶凝固的温度，通常是30-35℃。任选添加1％的批乳酸菌起子(bulk lactic acid bacteria starter)，并添加相应量(例如0.03-0.05％)的标准粗制凝乳酶。当牛奶变成凝块，其硬度足够大从而允许被切成边长约0.5cm的小块，用锋利的刀进行所述切割。脱水收缩作用从而开始，保持30分钟，使凝乳沉降，取出乳清样品，用实验室离心机离心10分钟。用例如Kjeldahl方法分析该样品进行蛋白含量。做为选择，和/或作为补充，样品应通过能确定单独蛋白组分的类型和质量的方法分析。
实施例22：“低水环境中的测定法”
脂解酶在低含水量环境中的转移酶反应。
操作步骤
材料
胆固醇，Sigma目录C 8503
L-α-磷脂酰胆碱95％(Plant)Avanti#441601
大豆油，Aarhus United，DK.
氯仿，分析级
酶
#179，GCAT，来自杀鲑气单胞菌
#2427，来自尖孢镰刀菌的磷脂酶A1，
Figure GPA00001103919301541
F(来自Novozymes，Denmark)
#1991，来自胰腺的磷脂酶A2，LIPOMOD 22L(来自Biocatalysts，UK)
#2373，南极假丝酵母(Candida antarctica)脂酶，Novozyme 525L(来自Novozymes Denmark)
酶测定
通过在搅拌过程中加热到60℃，使13.1％卵磷脂与6.6％胆固醇溶于大豆油
用20ml Wheaton玻璃杯称量底物并加热到46℃
添加水与酶溶液并开始计时
以规律间隔时间将50mg样品转移到10ml Dram玻璃杯中并冷冻
分离出的脂质通过GLC分析
GLC分析
GLC分析按实施例11所述进行
结果
实验设计如表33所示
将以含有13.1％卵磷脂与6.6％胆固醇的大豆油为基础的底物加热到46℃。添加酶溶液并开始计时。
反应30、60和120分钟后，取样品做GLC分析。
表33
  1   2   3   4   5
  底物   克   5   5   5   5   5
  转移酶#179-C72，56PLU-7/ml   ml   0.3
  #2427，200PLU-7/ml   ml   0.3
  胰腺PLA 2#19916300PLU/ml   ml   0.3
  Novozyme 525L，#2373，200LIPU/ml   ml   0.3
  1   2   3   4   5
  水   ml   0.3
  ％水   6   6   6   6   6
GLC结果如表34所示。结果以基于总样品组分的百分比表示。以GLC结果为基础，计算出相对不加酶的对照样品，通过酶反应产生的脂肪酸与胆固醇酯的量。在这些实验条件下，总体酶活性以水解活性(通过游离脂肪酸形成测定)与转移酶活性(通过胆固醇酯形成估计)来评价。从这些结果以及脂肪酸与胆固醇酯的分子量信息能够计算出相对摩尔水解活性与相对摩尔转移酶活性，如表35所示。
表34
酶         反应时间        脂肪酸          胆固醇         胆固醇酯
           分钟            ％              ％             ％
对照       120             0.533           7.094          0.000
#179       30              0.770           5.761          2.229
#179       60              0.852           5.369          2.883
#179       120             0.876           4.900          3.667
#2427      30              3.269           7.094          0.000
#2427      60              3.420           7.094          0.000
#2427      120             3.710           7.094          0.000
#1991      30              2.871           7.094          0.000
#1991     60      3.578       7.094      0.000
#1991     120     3.928       7.094      0.000
#2373     30      1.418       7.094      0.000
#2373     60      1.421       7.094      0.000
#2373     120     1.915       7.094      0.000
表35
Figure GPA00001103919301561
结论
在这些实验中观察到所有检测酶都表现有水解活性，这是由于脂肪酸的量增加。但只有来自杀鲑气单胞菌的GCAT表现出转移酶活性。因此，得出在含6％水的卵磷脂和胆固醇的油性体系中，来自尖孢镰刀菌的磷脂酶A1、来自胰腺的磷脂酶A2和来自南极念珠菌的脂酶只有水解活性。
实施例23：乳脂的处理
源自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶(SEQ ID No.90，N80D变体)在地衣芽孢杆菌中表达(下文称为KLM3)(参见以下)。
在乳脂中测试脂质酰基转移酶，目的是研究当向乳脂中加入0.5％甘油和1％磷脂时的转移反应。
用TLC分析反应产物，结果清楚地显示出甘油单酯的形成，这证明脂质酰基转移酶利用甘油作为受体分子。
实验
酶：
在地衣芽孢杆菌中表达的脂质酰基转移酶(LAT)：2005876(5500TIPU/ml)，Lipomod 699L，来自Biocatalysts的胰腺磷脂酶。10000U/ml
乳脂：来自Croman Belgium的无水乳脂A0019659，批号0130547。
甘油：
卵磷脂：磷脂酰胆碱，95％Plant(Avanti#441601)
HPTLC
点样仪：LINOMAT 5，CAMAG点样仪
HPTLC板：10×10cm(Merck号1.05633)
在使用前，通过在160℃烘箱中干燥20-30分钟来活化所述板。
点样：使用LINOMAT 5点样仪将溶解于氯仿∶甲醇(2∶1)中的1.0μl 15.0％的反应的乳脂点样到HPTLC板上。
运行缓冲液：1：P-醚∶MTBE∶乙酸(60∶40∶1)
点样/洗脱时间：14分钟。
运行缓冲液：5：P-醚∶MTBE∶乙酸(70∶30∶1)
点样/洗脱时间：12分钟。
运行缓冲液：4：氯仿∶甲醇∶水(75∶25∶4)
点样/洗脱时间：20分钟。
显色液：含6％乙酸铜的16％H3PO4溶液
在洗脱后，将板在160℃烘箱中干燥5分钟，冷却并浸在显色液中，随后再在160℃下干燥5分钟。对所述板进行目测评估并扫描(Camag TLC扫描仪)。
结果
在20ml Wheaton玻璃杯中称量乳脂、甘油、卵磷脂和酶的样品。
如表36所示
表36
Figure GPA00001103919301581
*LAT2005876(5000TIPU/ml)，以甘油和酶9∶1的比例溶于甘油中
**Lipomod 699L(#3332)，以甘油和酶9∶1的比例溶于甘油中
将样品置于加热器(heating block)中，在50℃下加热4小时，随后将样品取出用于分析，并溶解在氯仿∶甲醇(2∶1)中。
在运行缓冲液5、1和4中通过TLC分析所述样品，结果如图104所示。
如图105所示，用Camag光密度扫描仪(Camag Dentiometric scanner)扫描TLC板，并基于甘油单酯-二酯的参比样品中甘油单酯的量计，计算在乳脂中甘油单酯的量，结果如表37所示。
表37：通过TLC板的光密度测量计算出的乳脂样品中的甘油单酯
  样品Jour.2390-67   甘油单酯％
  1   0.005
  2   0.005
  样品Jour.2390-67   甘油单酯％
  3   0.009
  4   0.005
  5   0.005
  6   0.004
  7   0.423
  8   0.449
  9   0.004
  10   0.004
结论
来自用脂质酰基转移酶对包含甘油/磷脂的乳脂进行酶处理的TLC结果证实此酶使用磷脂为酰基供体将胆固醇转化为胆固醇酯以及将甘油转化为甘油单酯的能力。
在所进行的这个实验中，显示出全部磷脂(磷脂酰胆碱(PC)和溶血磷脂酰胆碱(LPC))均能被完全被转化为甘油磷酸胆碱。
实验还显示胰腺磷脂酶在低水环境中活性较弱且不具有显著的酰基转移酶活性。
将酶修饰的乳脂(表37的样品7和8)加入到脱脂乳中至终浓度为3.6重量％，以产生用于制备干酪的乳。
实施例24：乳脂和奶油的处理
在乳脂和奶油(38％脂肪)中测试脂质酰基转移酶，目的是研究当向乳脂中加入0.5％甘油和1％磷脂时的转移反应。
用TLC分析反应产物，乳脂的结果清楚地显示出甘油单酯和溶血磷脂的形成。从使用奶油的实验结果也证实了甘油单酯的形成(虽然水平较低)，这可能是由于引起游离脂肪酸形成的竞争性水解反应。在使用奶油的实验中，几乎观察不到溶血磷脂的增加，但这可解释为酶剂量过高。
实验
酶：
脂质酰基转移酶(同实施例23)
乳脂：来自Croman Belgium的无水乳脂A0019659，批号0130547。
奶油：38％脂肪，来自ARLA，DK
甘油：
卵磷脂：磷脂酰胆碱，95％Plant(Avanti#441601)
HPTLC
点样仪：LINOMAT 5，CAMAG点样仪
HPTLC板：10×10cm(Merck号1.05633)
在使用前通过在160℃烘箱中干燥20至30分钟来活化所述板。
点样：使用LINOMAT 5点样仪将溶解于氯仿∶甲醇(2∶1)的1.0μl15.0％的反应的乳脂点样到HPTLC板上。
运行缓冲液：1：P-醚∶MTBE∶乙酸(60∶40∶1)
点样/洗脱时间：14分钟。
运行缓冲液：5：P-醚∶MTBE∶乙酸(70∶30∶1)
点样/洗脱时间：12分钟。
运行缓冲液：4：氯仿∶甲醇∶水(75∶25∶4)
点样/洗脱时间：20分钟。
显色液：含6％乙酸铜的16％H3PO4溶液
在洗脱后，将板在160℃烘箱中干燥5分钟，冷却并浸在显色液中，随后再在160℃下干燥5分钟。对所述板进行目测评估并扫描(Camag TLC扫描仪)。
结果
在20ml Wheaton玻璃杯中称量乳脂、甘油、卵磷脂和酶的样品。
如表38所示
表38
Figure GPA00001103919301601
*LAT 2005876(5000TIPU/ml)，以甘油和酶9∶1的比例溶于甘油中
将样品置于加热器中，在45℃下加热，在10、30、60和120分钟后将样品取出，并溶解在氯仿∶甲醇(2∶1)中。
通过TLC在运行缓冲液5、1和4中分析所述样品，其结果如图106、107和108所示。
结论：乳脂实验
来自用脂质酰基转移酶对含甘油/磷脂的乳脂进行酶处理的TLC结果证实此酶使用磷脂为酰基供体将胆固醇转化为胆固醇酯以及将甘油转化为甘油单酯的能力。
在所进行的实验中，显示出磷脂(PC)被转化为溶血磷脂酰胆碱(LPC)。通过延长反应时间，溶血磷脂酰胆碱(LPC)被进一步转化为甘油磷酸胆碱。因此可优化酶剂量和反应时间，以确定用于任何具体应用的最佳甘油单酯和溶血磷脂产生水平。
将酶修饰的乳脂加入到脱脂乳中至终浓度为3.6重量％，以产生用于制备干酪的乳。初步实验表明与未修饰的乳脂相比，酶修饰的乳脂可更易于加入到脱脂乳中。
使用奶油的结果
在20ml Wheaton玻璃杯中称量乳脂、甘油、卵磷脂和酶的样品。
如表39所示
表39
*LAT 2005876(5000TIPU/ml)，以甘油和酶9∶1的比例溶于甘油中
将样品置于加热器中，在45℃下加热，在10、30、60和120分钟后将样品取出，并溶解在氯仿∶甲醇(2∶1)中。
在运行缓冲液5、1和4中通过TLC分析所述样品，其结果如图109、110和111所示。
结论：奶油实验
用脂质酰基转移酶对含磷脂和甘油的奶油进行处理后的TLC结果清楚地证实在胆固醇酯形成期间，将酰基基团从磷脂(PC)转移胆固醇的转移反应。
观察到酰基基团转移到甘油的转移酶反应。也有明显的水解活性。因此可通过调节酶剂量、甘油剂量和反应时间，从而进一步优化产生最佳水平的甘油单酯。
实施例25：莫泽雷勒干酪的制备
酶
EDS 188：在地衣芽孢杆菌中表达的本发明脂质酰基转移酶(本文中称为KLM3)：2005876(1460TIPU/ml)(SEQ ID No.90，N80D变体)。
Lecitase，胰腺磷脂酶，Sigma P0861，10,000单位/ml。
第一天
1、在55℃下将乳分离为脱脂乳(约0.075％脂肪，w/w)和奶油(30％脂肪，w/w)。通过将脱脂乳和奶油掺和来制备“脱脂”(0.83重量/重量％)脂肪(参见图120)。
2、每kg奶油(30％脂肪)加入0.4g CaCl2(50％，w/v)，并将奶油分为3等份，即对照(槽1)、Lecitase(槽2)和KLM3′(槽3)。
3、向槽2中加入0.2％(脂肪含量，w/w)Lecitase，等于0.06％(30％脂肪奶油，w/w)或等于0.6g/kg 30％脂肪奶油。
4、向槽3中加入KLM3′25TIPU/kg奶油。
5、在对照(槽1)中，没有加入酶溶液(或水)。
6、全部奶油处理物(包括对照)在50℃下温育30分钟。
7、随后立即，将正确重量的各奶油加入到正确的冷(10℃)脱脂乳(0.83％，w/v)脂肪中，以在混合物中获得正确的脂肪含量(3.5％，w/v)，这是标准化的乳。
8、在72℃下对其进行巴氏灭菌26秒。
9、冷却5℃并保持过夜。
第二天
10、将乳加热至41℃并保持30分钟(完成此步以逆转冷贮存对乳的老化作用)。
11、将乳冷却至34.4℃。
12、加入初始培养物(DAN 011、Dan 012、DAN 013中Choozit Ta 61 100DCU，Choozit LH100 50DCU；和DAN 021、DAN 022、DAN 023中ChoozitTa 61 100DCU，Choozit LH100 23.3DCU)。向DAN 021、DAN 022和DAN023中加入少量Choozit LH100，以反映在莫泽雷勒干酪工业生产中常用的Helveticus培养物的添加速率。将培养物直接加入到干酪用乳中并搅拌下保持45分钟。
13、加入凝乳酶(145ml Marzyme10(140imcu/ml)，用水稀释至1升)。
14、将凝乳酶混合2分钟。将凝乳酶乳的样品取出并置于流变计中，以测量作为时间函数的弹性模量(G′)的变化。
15、根据受控应力流变计上的测量，当坚度(G′)达到40Pa时，切割槽中的凝胶(凝乳)。
16、将凝胶使用线栅切割(速度2-15秒，保持1分钟，切割速度1-15秒，保持1分钟，切割速度1-10秒)，并将凝乳乳清混合物静置(恢复(heal))。将恢复步骤加入工业奶酪生产中，以使损失到乳清中的脂肪最少化。
17、将凝乳乳清混合物搅拌(在切割开始的10分钟)5分钟，以获得运动的凝乳/乳清混合物。
18、在30分钟内，将凝乳/乳清混合物加热至41.1℃。
19、继续搅拌直至凝乳pH(由从凝乳压挤出的乳清测得)到达5.9。
20、将凝乳乳清混合物排入最终槽中，并通过重力流去除乳清。
21、凝乳分隔在槽的侧面，从而获得两个凝乳块(curd trench)。
22、将凝乳块切割为厚片。
23、将凝乳厚片每15至20分钟翻转，并置于最终槽中直至pH(通过将pH探针插入凝乳样品测得)到达5.25。
24、随后将凝乳磨成小块(约0.75cm×约0.75cm×约7cm长)。
25、用冷水(17℃)覆盖15分钟。
26、排水10分钟。
27、将凝乳称重，并以干酪用乳重量0.2％(w/w)的水平向凝乳中加入盐(向来自450kg乳的奶酪凝乳中加入0.9kg)。将凝乳静置20分钟以吸收所施用的盐。
28、将凝乳置于塑化捏合/拉伸单元(通过建造在装置中的粉碎单元)中。
29、通过80℃的循环水将凝乳加热到63℃，同时将其捏合/拉伸。
30、将凝乳在7℃水中放置30分钟。
31、随后将凝乳在7℃盐水(23％NaCl)中放置90分钟。
32、将凝乳从盐水中取出，并静置脱水10分钟。
33、将经盐渍的凝乳称重。
34、真空包装并在4℃放置。
结果
表40：干酪产率和乳清的脂肪含量
编号 乳重量kg   模中凝乳的重量kg   未模制的凝乳kg   不包括盐水的凝乳kg   盐渍干酪的总重量kg 干酪产率kg/100kg乳 乳清中脂肪重量/重量％
  DAN011   454.1   26.62   18.36   26.78   45.25   9.96   0.48
  DAN012   454.6   26.62   21.66   26.69   48.41   10.65   0.41*
  DAN013   454.2   26.6   23.56   26.83   50.59   11.14*   0.34*
  DAN021   454.4   26.55   18.63   26.7   45.44   10.00   0.51
  DAN022   454.1   26.5   20.69   26.69   47.53   10.47   0.41*
  DAN023   454.3   26.4   21.61   26.52   48.23   10.62*   0.35*
DAN011和DAN021＝对照，DAN012和DAN022＝Lecitase，DAN013和DAN023＝KLM3
[*是指与对照相比有统计学意义]
实施例26：由经酶处理的干酪制成的披萨(Pizza)
在披萨制备中使用实施例25制备的干酪。
披萨饼底
500gms高筋面粉(strong white flour)
将12gms新鲜酵母溶解于200-250ml水中，所述水中包含1茶匙溶化的糖，并在20℃静置10分钟。
1枚鸡蛋
1-2汤匙橄榄油以调味。
调味的盐
将上述物质混合，随后用手连续揉捏5分钟以生成面团。将面团静置，以湿布覆盖直至其体积至少加倍。随后根据口味要求将面团擀成约5mm-1cm的厚度。
在有橄榄油的锅中快速翻炒切成小块的洋葱和蒜，并添加切碎的西红柿，从而制备西红柿酱。使沙司降低到适合的粘稠度。冷却后，将沙司添加到擀好的披萨面团上。
添加实施例25中制备的干酪，并添加蔬菜、肉和海鲜馅料。将披萨在送风炉(fan assisted oven)中200℃的石质基底上烘焙。
由本发明的含食用油/脂肪的干酪制备的披萨在外观上具有显著减少表面油，并且烘焙披萨饼底在外观上的油饱和度较小，特别是在边缘附近，以及在酱料和馅料的表面上(参见图136)。这使得披萨更美味，易于取食。
披萨具有改进的外观和较少的可见溢油。
实施例27：脂质分析
对按照实施例25中详述的莫泽雷勒干酪生产方法生产的奶油和干酪进行分析如下：
脂质分析
使用有机溶剂提取按照实施例25中详述的莫泽雷勒干酪生产方法生产的奶油和干酪，并通过HPTLC和GLC分析所分离的脂质。在干酪试验中，使用胰腺磷脂酶(Lecitase)或本发明的脂质酰基转移酶(KLM3)处理用于生产干酪的奶油。另外还进行不使用任何酶处理的对照试验。所有三种试验均在两天内进行，一式两份。
对从经酶处理的奶油分离的脂质和由所述奶油生产的干酪的脂质分析显示，Lecitase和KLM3均作用于产品中的磷脂，并且大部分磷脂，即磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)几乎被完全降解。
在Lecitase处理的样品中，PC和PE降解后伴随产生游离脂肪酸，主要为油酸和亚油酸。在使用KLM3的试验中，游离脂肪酸的形成显著低于磷脂的降解，这是因为该酶进行将脂肪酸从磷脂转移到胆固醇的转移反应，从而形成胆固醇酯。与对照和Lecitase处理的干酪相比，使用KLM3处理的干酪样品中仅剩余40％的胆固醇。在使用KLM3处理的干酪中，形成少量的饱和游离脂肪酸，这是由于对磷脂sn-1位的饱和脂肪酸的非特异活性的结果。
对30％的奶油进行酶处理，在酶处理后将其加入到脱脂乳中，并调至3.5％脂肪以用于干酪生产。
在此报道中，分析了用于干酪生产的奶油中的脂质成分以及所述干酪。
材料和方法
酶：
EDS 188：在地衣芽孢杆菌中表达的本发明的脂质酰基转移酶(下文称作KLM3)：2005876(1460TIPU/ml)，(SEQ ID No.90，N80D变体)
Lecitase，胰腺磷脂酶，Sigma P0861，10,000单位/ml。
TLC标准品：
ST16：0.5％的磷脂溶液，其包含14.76％磷脂酰胆碱(PC)、0.49％溶血磷脂酰胆碱(LPC)、10.13％磷脂酰肌醇(PI)、12.74％磷脂酰乙醇胺(PE)和5.13％磷脂酸(PA)。
ST17：0.1％胆固醇、0.1％胆固醇硬脂酸酯和0.1％油酸的溶液。
用于生产莫泽雷勒干酪的奶油进行酶处理
按照实施例25中的公开进行处理。
HPTLC
点样器：CAMAG点样器AST4。
HPTLC板：20×10cm(Merck no.1.05641)。
在使用前，通过在160℃的炉中干燥20-30分钟活化所述板。
点样：使用AST4点样器向HPTLC板加样溶于氯仿∶甲醇(2∶1)的3.0μl提取脂质。另外，还向向HPTLC板加样0.1μl、0.3μl、0.5μl、0.8μl、1.5μl浓度已知的标准组分的标准溶液。
运行缓冲液1：P-醚∶MTBE∶乙酸(50∶50∶1)
点样/洗脱时间：12分钟。
运行缓冲液6：乙酸甲酯∶氯仿∶甲醇∶异丙醇∶0.25％KCl水溶液(25∶25∶25∶10∶9)
点样/洗脱时间：20分钟。
显色液：含6％乙酸铜的16％H3PO4溶液
洗脱后将板在160℃的炉中干燥10分钟，冷却并浸入显色液中，随后再在160℃干燥5分钟。目测评估所述板并将其扫描(Camag TLC扫描仪)。
干燥后，通过在TLC扫描仪(Camag)中扫描所述板而将TLC斑点定量。基于标准组分的密度绘制校准曲线，并将其用于样品中组分的量化。
GLC分析
Perkin Elmer Autosystem 9000毛细管气相色谱仪，其配备有WCOT熔凝硅石柱12.5m×0.25mm ID×0.1μm膜厚度5％苯甲基硅酮(CP Sil 8CB，来自Crompack)。
载气：氦。
注射器：PSSI冷分流注射(由最初温度50℃加热至385℃)，体积1.0μl。
检测器FID：395℃。
炉程序(自2003年10月30日起使用)：1     2     3
炉温(℃)                        90    280   350
等温，时间(分钟)                1     0     10
变温速率(℃/min)                15    4
样品制备：将由干酪或奶油样品提取的脂质溶于包含0.5mg/ml十七烷内标的0.5ml庚烷∶吡啶(2∶1)中。将300μl样品溶液转入钳口瓶，添加300μlMSTFA(N-甲基-N-三甲基甲硅烷基-三氟乙酰胺)，并在60℃反应20分钟。
计算：由纯的参照材料测定游离脂肪酸(FFA)、胆固醇、胆固醇棕榈酸酯和胆固醇硬脂酸酯的反应因子。
提取奶油
将Eppendorf管中的奶油样品在99℃加热10分钟以灭活酶，并冷却至室温。将1ml奶油转移到带螺盖的10ml微量玻璃瓶(dram glass)中。加入3ml氯仿∶甲醇(2∶1)，并在Whirley上混合。在Rotamix上提取样品30分钟。将样品在1700g离心10分钟。分离下层的有机相以用于TLC和GLC分析。
提取干酪
在带有螺盖的12ml离心管中称量0.5g干酪。添加2ml 99％乙醇，并使用Ultra Turrax搅拌器以20000rpm均质30秒。使用1.5ml乙醇清洗搅拌器。添加5ml氯仿并在Whirley上混合。在Rotamix上以25rpm提取样品30分钟。将样品在1700g离心10分钟。
分离下层的有机相以用于TLC和GLC分析。
样品
表41：酶处理30分钟后取出的奶油样品
  试验编号   酶  剂量，ppm   天数
  DAN011   对照   0   1
  试验编号   酶  剂量，ppm   天数
  DAN012   Lecitase   600   1
  DAN013   KLM3   17.1   1
  DAN021   对照   0   2
  DAN022   Lecitase   600   2
  DAN023   KLM3   17.1   2
表42：莫泽雷勒干酪样品的标记
  试验编号   酶   天数
  DAN011   对照   1
  DAN012   Lecitase   1
  DAN013   KLM3   1
  DAN021   对照   2
  DAN022   Lecitase   2
  DAN023   KLM3   2
结果
奶油脂质分析
根据“材料和方法”一节中描述的方法使用氯仿-甲醇提取用于生产干酪的奶油样品，并通过HPTLC分析。
奶油样品的TLC分析结果显示在图121和图122中。
图121显示从奶油提取的脂质，以及磷脂、磷脂酰胆碱(PC)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)、5.13％磷脂酸(PA)和鞘脂的标准混合物(ST16)的TLC(溶剂6)。
图121显示从奶油提取的脂质，以及游离脂肪酸(FFA)、胆固醇(CHL)和胆固醇酯(CHL酯)的标准混合物的TLC(溶剂1)。
测定TLC色谱的带强度，并以标准磷脂混合物为基础，由图121中的TLC色谱图计算PC和PE的量，以胆固醇和脂肪酸的标准混合物为基础，由TLC色谱图计算样品中游离脂肪酸和胆固醇的量。试验结果显示于表43中。
表43：以图121和图122的TLC色谱图为基础，分析磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和游离脂肪酸(FFA)
  酶   天数  PC，ppm  PE，ppm   CHL，ppm FFA，ppm
  对照   1   149   278   713   201
  Lecitase   1   23   17   638   396
  KLM3   1   11   24   328   274
  对照   2   117   214   638   166
  Lecitase   2   39   29   629   345
  KLM3   2   15   28   311   201
表43中的结果是由利用Windows 3.1版Statgraphic Plus的ANOVA统计学计算的。图123和图124中图示说明了胆固醇和游离脂肪酸的统计学计算结果。
使用Lecitase和KLM3处理的奶油的TLC分析显示奶油中磷脂酶的强效作用(图121)，并可见两种主要磷脂组分PC和PE几乎被完全水解(表43)。
在图122显示，与Lecitase相比，KLM3对胆固醇具有强的作用。可见经Lecitase处理的样品中产生的脂肪酸的量明显高于经KLM3处理的样品和对照。
脂肪酸量的统计学计算(图124)显示与对照相比，KLM3产生少量，而非显著量的游离脂肪酸。然而，Lecitase处理的样品中脂肪酸的量则显著较高。这可以解释为Lecitase水解磷脂，从而形成游离脂肪酸。KLM3也降解磷脂(表43)，但将来自磷脂的脂肪酸转移到胆固醇，从而形成胆固醇酯。通过KLM3处理的样品中胆固醇的量显著减少，而对照和Lecitase处理的样品出于相同的水平(参见图123)证实了这一点。
基于摩尔比例，可计算出，对于Lecitase和KLM3，PC和PE的降解量均为0.6mmol/kg，而在Lecitase处理的奶油中和KLM3处理的奶油中产生的脂肪酸的量分别为0.65mmol/kg和0.2mmol/kg，这验证了Lecitase水解磷脂，而KLM3催化转移反应的观察结果。
另外，还通过GLC分析了在酶反应30分钟后从奶油提取的脂质，以量化具体的脂肪酸、胆固醇和胆固醇酯。
GLC分析结果显示于表44中。
表44：棕榈酸(FFA-16)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)、硬脂酸(C：18:0)、总FFA(C16:0、C18:0、C18:1和C18:2)、胆固醇和胆固醇酯的GLC分析。
  酶   天数   FFA-16ppm   FFA-18:1和C：18:2ppm   FFA-C18:0ppm  总FFAppm   胆固醇ppm   胆固醇酯Ppm
  对照   1   119   154   54   327   551   0
  Lecitase   1   133   316   60   508   546   0
  KLM3   1   125   177   51   353   216   286
  对照   2   111   152   54   317   520   0
  Lecitase   2   130   314   62   507   547   0
  KLM3   2   130   195   63   388   238   335
表44中的结果是由利用Windows 3.1版Statgraphic Plus的ANOVA统计学计算的。图125-127中说明了胆固醇、胆固醇酯和总游离脂肪酸(FFA)的统计学计算结果。
GLC分析确认了此前TLC分析的观察结果，即与对照和Lecitase处理的奶油相比，KLM3显著减少了胆固醇的量(参见图126)。KLM3处理的奶油中的胆固醇被转化为胆固醇酯(参见图121)，而Lecitase处理的奶油和对照不包含胆固醇酯。胆固醇酯的形成还影响游离脂肪酸的水平(参见图127)，其中Lecitase通过水解磷脂产生显著量的游离脂肪酸，而KLM3仅产生少量，而非显著量的游离脂肪酸。还发现酶处理期间增加的主要是不饱和脂肪酸，这是因为Lecitase是sn-2特异性磷脂酶，而KLM3进行sn-2位特异的转移反应。天然存在的磷脂在sn-2位主要包含不饱和脂肪酸。
干酪脂质分析
根据上述提及的方法使用氯仿乙醇提取由经酶处理的奶油生产的干酪样品，并通过HPTLC和GLC分析。
每个样品一式两份进行分析。
TLC分析结果显示在图128和图129中。
图129中的TLC色谱图说明Lecitase和KLM3均已将磷脂，即磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺完全水解。图128中的色谱图说明与对照和Lecitase处理的干酪相比，使用KLM3处理的干酪中的胆固醇含量下降。还观察到KLM3处理的干酪中游离脂肪酸的量低于Lecitase处理的干酪，尽管两种酶均完全水解了磷脂PC和PE。
莫泽雷勒干酪磷脂的GLC分析
另外，还通过GLC分析了从干酪提取的脂质，以量化具体的脂肪酸、胆固醇和胆固醇酯。提取每份干酪并分析，一式两份。
GLC分析结果显示在表45中。脂肪酸分析分别表示为棕榈酸(C16:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)和硬脂酸(C：18:0)的量。
表45：莫泽雷勒干酪磷脂的GLC分析
  酶   天数   FFA-16   FFA-18:1和18:2   FFA-18:0  总FFA   胆固醇   胆固醇酯
  对照   1   291   291   158   740   689   0
  酶   天数   FFA-16   FFA-18:1和18:2   FFA-18:0  总FFA   胆固醇   胆固醇酯
  对照   1   304   275   156   735   758   0
  Lecitase   1   345   566   195   1105   688   0
  Lecitase   1   336   546   180   1062   690   0
  KLM3   1   374   453   202   1030   296   440
  KLM3   1   399   481   228   1109   304   492
  对照   2   285   259   160   703   726   0
  对照   2   302   261   167   730   702   0
  Lecitase   2   354   584   202   1140   728   0
  Lecitase   2   357   591   202   1150   744   0
  KLM3   2   377   458   221   1056   302   419
  KLM3   2   388   485   227   1099   315   487
表45中显示莫泽雷勒干酪磷脂的GLC分析的结果是由利用Windows 3.1版Statgraphic Plus的ANOVA统计学计算的。图130-133中说明了胆固醇、胆固醇酯、油酸+亚油酸和总FFA的统计学计算结果。
莫泽雷勒干酪中脂质的GLC分析确认了KLM3对胆固醇的作用(参见图130)以及胆固醇酯的形成(参见图131)。与对照干酪相比，利用KLM3生产的干酪仅包含40％的胆固醇。Lecitase没有显示对胆固醇水平的任何影响，并且在对照和Lecitase处理的干酪中没有形成胆固醇酯。
由于转移反应，还可见利用KLM3生产的干酪中游离脂肪酸的量低于利用Lecitase生产的干酪。从不饱和脂肪酸-油酸和亚油酸清楚地看到这一点，其中使用KLM3的试验中不饱和脂肪酸低于Lecitase的试验(参见图132)。然而，对于棕榈酸和硬脂酸，差异不太显著(参见表45)。已知乙酰磷脂酶Lecitase非常特异于磷脂的sn-2位，因此主要产生不饱和脂肪酸。KLM3的一些非特异性水解活性是已知的，这可解释从乳脂中磷脂sn-1位形成的饱和脂肪酸。
在此试验中，看到在对奶油进行30分钟酶处理后，几乎所有的磷脂都被降解。然而，酶反应在干酪用乳标准化期间持续直到对干酪用乳进行巴氏灭菌。奶油酶处理后进行的酶反应(直到对干酪用乳进行巴氏灭菌)解释了KLM3试验中形成饱和脂肪酸C16:0和C18:0的原因。在用KLM3酶处理30分钟后的奶油中没有形成饱和脂肪酸，而饱和脂肪酸仅见于干酪中的事实确认了这一点。可以通过减少奶油的温育时间来减少或防止KLM3试验中形成饱和脂肪酸。
结论
对用于生产莫泽雷勒干酪的奶油的酶处理显示KLM3和Lecitase对乳脂中的磷脂的活性很高。发现磷脂，即磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺几乎完全被转化。
Lecitase对磷脂的活性导致游离脂肪酸增加。所产生的脂肪酸主要是不饱和脂肪酸，即油酸和亚油酸，这是因为Lecitase具有sn-2特异性，而不饱和脂肪酸在sn-2位的磷脂中最为丰富。
然而，KLM3产生的游离脂肪酸较少，这是因为此酶在胆固醇酯形成期间将脂肪酸从磷脂转移胆固醇。
从最终产物莫泽雷勒干酪提取的脂质的脂质分析显示的脂质谱(lipidprofile)与在用于生产莫泽雷勒干酪的奶油中观察到的相同。
实施例28：水分分析
通过标准方法IDF 4A，1982分析来自使用莫泽雷勒干酪中试生产(参见实施例25)中的酶的6个试验的干酪的含水量，并通过牛奶生产者国际联合会(International Dairy Federation)的标准方法IDF 5B，1986测定脂肪含量。
结果：
表46：含水量和脂肪含量分析
  干酪   水％   脂肪％
  DAN011   对照   48.75   23.26
  DAN012   Lecitase   50.95   23.02
  DAN013   KLM3   52.03   22.70
  DAN021   对照   48.67   24.69
  DAN022   Lecitase   49.60   24.25
  DAN023   KLM3   51.66   23.67
干酪的含水量受到酶处理的影响；在与lecitase和对照相比时，KLM3酰基转移酶显著增加了干酪的含水量。这部分解释了经酶处理后产量增大的原因。由于总产量增加，因此干酪中的脂肪百分比略有下降。
实施例29：溢油分析
通过扩散试验分析来自使用莫泽雷勒干酪中试生产(参见实施例25)中的酶的试验的干酪的溢油情况。在生产后，将干酪在6℃熟化8天。
溢油直径测试：
将干酪样品(2g)磨碎并使用从高5cm处落下的16g重量将其压入宽2cm的环中，重复3次以使致密。这是测量溢油的关键点，除非用于制备样品的力(以及被压紧的材料的抗力)是已知的，否则最终质量的密度将是不清楚的，而这对加热期间的溢油具有直接影响(参见图134)。
将样品放置在Whatman 4号滤纸上，并在90.0℃的干燥炉中一起加热5分钟。
10分钟后，通过测量通过滤纸上可见的半透明区域的直径来确定溢油量。
结果：
表47-溢油
  干酪   平均值   SD   平均面积/mm2   对照面积％
  DAN011   32.33   1.25   821.09
  DAN013   25.00   2.16   490.87   59.78
将DAN011作没有酶的对照。DAN013经KLM3处理。
图135显示对照样品DAN011(左侧)和使用KLM3生产的干酪DAN013(右侧)的照片。加热步骤后静置5分钟。
结论：
从以上结果可见，当天10分钟后，KLM3干酪的溢油确实显著少于对照。
实施例30：熔化试验：
通过Olsen所述的试管法(Olsen，NF.& WV.Price，Journal of Dairy Science1958，Vol.41：999-1000)，分析在来自使用莫泽雷勒干酪中试生产(参见实施例25)中的酶的试验的干酪的熔化能力。将干酪的流动性测量为相对于试管加热前起点时变化的百分比(Olsen 1958)。
结果：
表48-干酪的流动性结果
  干酪   干酪的流动性(％)
  DAN011   对照   211
  DAN012   Lecitase   217
  DAN013   KLM3   221
  DAN021   对照   168
  DAN022   Lecitase   200
  DAN023   KLM3   200
在干酪的熔化试验中未观察到统计学意义的差异，因此Lecitase和酰基转移酶KLM3均不改变干酪的熔化性质。
另外，还通过烘焙比萨测定熔化性质，以确定与未使用酶的对照相比莫泽雷勒干酪的视觉变化。所述干酪显示披萨上溢油较少并具有正常的熔化性质。
实施例31：地衣芽孢杆菌中表达脂质酰基转移酶
在地衣芽孢杆菌中将编码脂质酰基转移酶(SEQ ID No.90，下文称为KLM3)的核苷酸序列(SEQ ID No.100)与地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(LAT)的信号肽一起作为融合蛋白表达(参见图137和138)。为了优化在芽孢杆菌中的表达，从Geneart(GeneartAG，雷根斯堡，德国)订购了经密码子优化的基因构建体(no.052907)。
构建体No.052907包含位于LAT-KLM3’前体基因之前的不完全LAT启动子(仅-10序列)和位于LAT-KLM3’前体基因下游的LAT转录(Tlat)(参见图137和139)。为了构建包含5’末端侧翼有完全LAT启动子、3’末端侧翼有LAT终止子的LAT-KLM3’前体基因的XhoI片段，以Plat5XhoI_FW和EBS2XhoI_RV为引物并以基因构建体052907为模板进行PCR(聚合酶链式反应)扩增。
Plat5XhoI_FW：
ccccgctcgaggcttttcttttggaagaaaatatagggaaaatggtacttgttaaaaattc
ggaatatttatacaatatcatatgtttcacattgaaagggg
EBS2XhoI_RV：tggaatctcgaggttttatcctttaccttgtctcc
根据生产商的说明书(退火温度55℃)使用Phusion高保真度DNA聚合酶(Finnzymes OY，芬兰埃斯波)在热循环仪进行PCR。
根据生产商的说明书(Invitrogen，Carlsbad，Calif.USA)，使用限制性酶XhoI消化所得PCR片段，并使用T4DNA连接酶将其连接到经XhoI消化的pICatH中。
如美国专利申请US20020182734(国际公布WO 02/14490)所述，将连接混合物转化入枯草芽孢杆菌株SC6.1中。通过DNA测序确定包含LAT-KLM3’前体基因的XhoI插入物的序列(BaseClear，荷兰莱顿)，并将正确质粒克隆之一命名为pICatH-KLM3’(ori1)(图137)。在允许的温度(37℃)下将pICatH-KLM3’(ori1)转化进入地衣芽孢杆菌株BML780(BRA7和BML612的衍生物，参见WO2005111203)中。
选择一个新霉素抗性(neoR)和氯霉素抗性(CmR)的转化株并将其命名为BML780(plCatH-KLM3’(ori1))。通过在非允许的温度(50℃)下、于含有5μg/ml氯霉素的培养基中培养菌株，从而使BML780(plCatH-KLM3’(ori1))中的质粒整合到地衣芽孢杆菌基因组的catH区中。选择一个CmR抗性克隆，并将其命名为BML780-plCatH-KLM3’(ori1)。再次在允许的温度、没有抗生素的情况下培养BML780-plCatH-KLM3’(ori1)数代以使载体序列环出(loop-out)，随后选择一个对新霉素敏感(neoS)的CmR克隆。在此克隆中，染色体上的plCatH载体序列被切除(包括新霉素抗性基因)，并只留下catH-LATKLM3’盒。随后，通过在氯霉素浓度增加的培养基中/上培养菌株来扩增染色体上的catH-LATKLM3’盒。在扩增数轮后，选择一个克隆(抗50μg/ml氯霉素)，并将其命名为BML780-KLM3’CAP50。为了确定KLM3’表达，使BML780-KLM3’CAP50和BML780(空宿主菌株)在添加有1％三丁酸甘油酯的Heart Infusion(Bacto)琼脂培养板上于37℃下培养48小时。在BML780-KLM3’CAP50菌落周围清楚可见澄清的区域(指示脂质酰基转移酶活性)，而宿主菌株BML780周围则不可见(参见图140)。此结果显示在地衣芽孢杆菌株BML780-KLM3’CAP50中表达了大量的KLM3’，且这些KLM3’分子是有功能的。
总结段
本发明由权利要求书和相应的说明书限定。为了方便起见，本文通过编号段的方式展示本发明的这些和其他方面。
1.一种在食品中原位产生乳化剂的方法，其中所述方法包括将脂质酰基转移酶添加到所述食品中的步骤。
2.如第1段所述的方法，其中产生至少两种乳化剂。
3.如第1段或第2段所述的方法，其中在食品中产生所述乳化剂而不增加或基本不增加所述食品中的游离脂肪酸。
4.如第1-3段中任一段所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶是这样的酶，其能够将酰基从脂质转移到下述酰基受体中的一种或多种：甾醇、甾烷醇、碳水化合物、蛋白质或其亚单位、甘油。
5.如第2段所述的方法，其中至少一种所述乳化剂是碳水化合物酯。
6.如第2段所述的方法，其中至少一种所述乳化剂是蛋白质酯。
7.如前述任一段所述的方法，其中在食品中原位产生甾醇酯，或甾烷醇酯，或蛋白质酯，或碳水化合物酯，或甘油二酯，或甘油单酯中的一种或多种。
8.如第7段所述的方法，其中所述甾醇酯是α-谷甾醇酯、β-谷甾醇酯、豆甾醇酯、麦角固醇酯、菜油甾醇酯或胆固醇酯中的一种或多种。
9.如第6段所述的方法，其中所述甾烷醇酯是β-谷甾醇酯或ss-谷甾醇酯中的一种或多种。
10.如前述任一段所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶的特征在于其为这样的酶，该酶具有酰基转移酶活性，并包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S中的一个或多个。
11.如前述任一段所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶包含H-309，或在与SEQ ID No.2或SEQ ID No.32所示嗜水气单胞菌脂解酶的氨基酸序列中的His-309相应的位置处包含组氨酸残基。
12.如前述任一段所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶可以得自于一个或多个以下属的生物体：气单胞菌属(Aeromonas)、链霉菌属(Streptomyces)、酵母菌属(Saccharomyces)、乳球菌属(Lactococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、脱亚硫酸菌属(Desulfitobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弧菌属(Vibrionaceae)、木杆菌属(Xylella)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、曲霉属(Aspergillus)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、李斯特菌属(Listeria)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、中慢生根瘤菌(Mesorhizobium)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、黄单胞菌属(Xanthomonas)和假丝酵母属(Candida)。
13.如前述任一段所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶包含一种或多种以下氨基酸序列：(i)SEQ ID No.2所示氨基酸序列；(ii)SEQ ID No.3所示氨基酸序列；(iii)SEQ ID No.4所示氨基酸序列；(iv)SEQ ID No.5所示氨基酸序列；(v)SEQ ID No.6所示氨基酸序列；(vi)SEQ ID No.12所示氨基酸序列；(vii)SEQ ID No.20所示氨基酸序列；(viii)SEQ ID No.22所示氨基酸序列；(ix)SEQ ID No.24所示氨基酸序列；(x)SEQ ID No.26所示氨基酸序列；(xi)SEQ ID No.28所示氨基酸序列；(xii)SEQ ID No.30所示氨基酸序列；(xiii)SEQ ID No.32所示氨基酸序列；(xiv)SEQ ID No.34所示氨基酸序列；(xv)SEQ ID No.62所示氨基酸序列；(xvi)SEQ ID No.90所示氨基酸序列；或者与SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32或SEQID No.34、SEQ ID No.62、SEQ ID No.90所示序列中的任一序列具有75％或更高同一性的氨基酸序列。
14.如前述任一段所述的方法，其中所述乳化剂是下列物质中的一种或多种：甘油单酯、溶血磷脂酰胆碱、DGMG。
15.脂质酰基转移酶用于从食品材料制备包含乳化剂的食品的应用，其中在食品中产生所述乳化剂而不增加或基本不增加所述食品中的游离脂肪酸，且其中所述乳化剂是通过所述脂质酰基转移酶从所述食品材料组分中产生的。
16.如第15段所述的应用，其中产生至少两种乳化剂。
17.如第16段所述的应用，其中至少一种所述乳化剂是碳水化合物酯。
18.如第16段所述的应用，其中至少一种所述乳化剂是蛋白质酯。
19.如第15-18段中任一段所述的应用，其中在食品中还原位产生甾醇酯，或甾烷醇酯，或蛋白质酯，或碳水化合物酯，或甘油二酯，或甘油单酯中的一种或多种。
20.如第19段所述的应用，其中所述甾醇酯是α-谷甾醇酯、β-谷甾醇酯、豆甾醇酯、麦角固醇酯、菜油甾醇酯或胆固醇酯中的一种或多种。
21.如第20段所述的应用，其中所述甾烷醇酯是β-谷甾醇酯或ss-谷甾醇酯中的一种或多种。
22.如第15-21段中任一段所述的应用，其中所述脂质酰基转移酶的特征在于其为这样的酶，该酶具有酰基转移酶活性，并包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S中的一个或多个。
23.如第15-22段中任一段所述的应用，其中所述脂质酰基转移酶包含H-309，或在与SEQ ID No.2或SEQ ID No.32所示嗜水气单胞菌脂解酶的氨基酸序列中的His-309相应的位置处包含组氨酸残基。
24.如第15-23段中任一段所述的应用，其中所述脂质酰基转移酶可以得自于一种或多种以下属的生物体：气单胞菌属、链霉菌属、酵母菌属、乳球菌属、分枝杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、脱亚硫酸菌属、芽孢杆菌属、弯曲杆菌属、弧菌属、木杆菌属、硫化叶菌属、曲霉属、裂殖酵母属、李斯特菌属、奈瑟氏球菌、中慢生根瘤菌、雷尔氏菌属、黄单胞菌属和假丝酵母属。
25.如第15-24段中任一段所述的应用，其中所述脂质酰基转移酶包含一种或多种以下氨基酸序列：(i)SEQ ID No.2所示氨基酸序列；(ii)SEQ ID No.3所示氨基酸序列；(iii)SEQ ID No.4所示氨基酸序列；(iv)SEQID No.5所示氨基酸序列；(v)SEQ ID No.6所示氨基酸序列；(vi)SEQ ID No.12所示氨基酸序列；(vii)SEQ ID No.20所示氨基酸序列；(viii)SEQ ID No.22所示氨基酸序列；(ix)SEQ ID No.24所示氨基酸序列；(x)SEQ ID No.26所示氨基酸序列；(xi)SEQ ID No.28所示氨基酸序列；(xii)SEQ ID No.30所示氨基酸序列；(xiii)SEQ ID No.32所示氨基酸序列；(xiv)SEQ ID No.34所示氨基酸序列；(xv)SEQ ID No.62所示氨基酸序列；(xvi)SEQ ID No.90所示氨基酸序列；或者与SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ IDNo.32、SEQ ID No.34、SEQ ID No.62、SEQ ID No.90所示序列中的任一序列具有75％或更高同一性的氨基酸序列。
26.如第15-25段中任一段所述的应用，其中所述乳化剂是下列物质中的一种或多种：甘油单酯、溶血磷脂酰胆碱、DGMG。
27.食品酶组合物或饲料酶组合物，其包含脂质酰基转移酶。
28.如第27段所述的食品酶组合物或饲料酶组合物，其中所述脂质酰基转移酶的特征在于其为这样的酶，该酶具有酰基转移酶活性，并包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S中的一个或多个。
29.如第27段或第28段所述的食品酶组合物或饲料酶组合物，其中所述脂质酰基转移酶包含H-309，或在与SEQ ID No.2或SEQ ID No.32所示嗜水气单胞菌脂解酶的氨基酸序列中的His-309相应的位置处包含组氨酸残基。
30.如第27-29段中任一段所述的食品酶组合物或饲料酶组合物，其中所述脂质酰基转移酶可以得自于一种或多种以下属的生物体：气单胞菌属、链霉菌属、酵母菌属、乳球菌属、分枝杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、脱亚硫酸菌属、芽孢杆菌属、弯曲杆菌属、弧菌属、木杆菌属、硫化叶菌属、曲霉属、裂殖酵母属、李斯特菌属、奈瑟氏球菌、中慢生根瘤菌、雷尔氏菌属、黄单胞菌属和假丝酵母属。
31.如第27-30段中任一段所述的食品酶组合物或饲料酶组合物，其中所述脂质酰基转移酶包含一种或多种以下氨基酸序列：(i)SEQ ID No.2所示氨基酸序列；(ii)SEQ ID No.3所示氨基酸序列；(iii)SEQ ID No.4所示氨基酸序列；(iv)SEQ ID No.5所示氨基酸序列；(v)SEQ ID No.6所示氨基酸序列；(vi)SEQ ID No.12所示氨基酸序列；(vii)SEQ ID No.20所示氨基酸序列；(viii)SEQ ID No.22所示氨基酸序列；(ix)SEQ ID No.24所示氨基酸序列；(x)SEQ ID No.26所示氨基酸序列；(xi)SEQ ID No.28所示氨基酸序列；(xii)SEQ ID No.30所示氨基酸序列；(xiii)SEQ ID No.32所示氨基酸序列；(xiv)SEQ ID No.34所示氨基酸序列；(xv)SEQ ID No.62所示氨基酸序列；(xvi)SEQ ID No.90所示氨基酸序列；或者与SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32或SEQ ID No.34、SEQ ID No.62、SEQ IDNo.90所示序列中的任一序列具有75％或更高同一性的氨基酸序列。
32.第27-31段中任一段所述的食品酶组合物或饲料酶组合物依照第15-26段中任一段所述的应用，或在第1-14段中任一段所述的方法中的应用。
33.通过第1-14段中任一段所述的方法可获得的食品。
34.固定化的脂质酰基转移酶。
35.如第34段所述的固定化脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶的特征在于其为这样的酶，该酶具有酰基转移酶活性，并包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S中的一个或多个。
36.如第34段或第35段所述的固定化脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶包含H-309，或在与SEQ ID No.2或SEQ ID No.32所示嗜水气单胞菌脂解酶的氨基酸序列中的His-309相应的位置处包含组氨酸残基。
37.如第34-36段中任一段所述的固定化脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶可以得自于一种或多种以下属的生物体：气单胞菌属、链霉菌属、酵母菌属、乳球菌属、分枝杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、脱亚硫酸菌属、芽孢杆菌属、弯曲杆菌属、弧菌属、木杆菌属、硫化叶菌属、曲霉属、裂殖酵母属、李斯特菌属、奈瑟氏球菌、中慢生根瘤菌、雷尔氏菌属、黄单胞菌属和假丝酵母属。
38.如第34-37段中任一段所述的固定化脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶包含一种或多种以下氨基酸序列：(i)SEQ ID No.2所示氨基酸序列；(ii)SEQ ID No.3所示氨基酸序列；(iii)SEQ ID No.4所示氨基酸序列；(iv)SEQ ID No.5所示氨基酸序列；(v)SEQ ID No.6所示氨基酸序列；(vi)SEQ ID No.12所示氨基酸序列；(vii)SEQ ID No.20所示氨基酸序列；(viii)SEQ ID No.22所示氨基酸序列；(ix)SEQ ID No.24所示氨基酸序列；(x)SEQ ID No.26所示氨基酸序列；(xi)SEQ ID No.28所示氨基酸序列；(xii)SEQ ID No.30所示氨基酸序列；(xiii)SEQ ID No.32所示氨基酸序列；(xiv)SEQ ID No.34所示氨基酸序列；(xv)SEQ ID No.62所示氨基酸序列；(xvi)SEQ ID No.90所示氨基酸序列；或者与SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32或SEQ ID No.34、SEQ ID No.62、SEQ ID No.90所示序列中的任一序列具有75％或更高同一性的氨基酸序列。
39.鉴定适合用于本发明所述应用的脂质酰基转移酶的方法，所述方法包括使用“低水环境中的转移酶测定法”、“高水蛋黄中的转移酶测定法”或“经缓冲的底物中的转移酶测定法”中的一种或多种测定目标酶，和选择具有以下一种或多种性质的脂质酰基转移酶：(a)当使用“低水环境中的转移酶测定法”进行检测时，在经过选自30、20或120分钟的时间后测定，具有至少1％的相对转移酶活性；(b)当在含54％水的蛋黄中使用“高水蛋黄中的转移酶测定法”进行检测时，具有高达100％的相对转移酶活性；或者(c)当使用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”进行检测时，具有至少2％的酰基转移酶活性。
40.如第39段所述的方法，其中选择具有两种以上的下述性质的脂质酰基转移酶：(a)当使用“低水环境中的转移酶测定法”进行检测时，在经过选自30、20或120分钟的时间后测定，具有至少1％的相对转移酶活性；(b)当在含54％水的蛋黄中使用“高水蛋黄中的转移酶测定法”进行检测时，具有高达100％的相对转移酶活性；或者(c)当使用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”进行检测时，具有至少2％的酰基转移酶活性。
41.如第39段所述的方法，其中选择具有三种以上的下述性质的脂质酰基转移酶：(a)当使用“低水环境中的转移酶测定法”进行检测时，在经过选自30、20或120分钟的时间后测定，具有至少1％的相对转移酶活性；(b)当在含54％水的蛋黄中使用“高水蛋黄中的转移酶测定法”进行检测时，具有高达100％的相对转移酶活性；或者(c)当使用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”进行检测时，具有至少2％的酰基转移酶活性。
42.如第39段所述的方法，其中选择具有所有下述性质的脂质酰基转移酶：(a)当使用“低水环境中的转移酶测定法”进行检测时，在经过选自30、20或120分钟的时间后测定，具有至少1％的相对转移酶活性；(b)当在含54％水的蛋黄中使用“高水蛋黄中的转移酶测定法”进行检测时，具有高达100％的相对转移酶活性；或者(c)当使用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”进行检测时，具有至少2％的酰基转移酶活性。
43.使用第39-42段所述方法鉴定的脂质酰基转移酶。
44.脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶包含如SEQ ID No.90所示的氨基酸序列，或与SEQ ID No.90具有至少75％同一性的氨基酸序列，优选与SEQ ID No.90具有至少80％同一性，优选与SEQ ID No.90具有至少85％同一性，优选与SEQ ID No.90具有至少90％同一性，优选与SEQ IDNo.90具有至少95％同一性的氨基酸序列。
45.如第44段所述的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶的特征在于其为这样的酶，该酶具有酰基转移酶活性，并包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S中的一个或多个。
46.如第44段或第45段所述的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶可得自于(或得自于)气单胞菌属。
47.如第44-46段中任一段所述的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶具有一个或多个以下特征：(a)当使用“低水环境中的转移酶测定法”进行检测时，在经过选自30、20或120分钟的时间后测定，具有至少1％的相对转移酶活性；(b)当在含54％水的蛋黄中使用“高水蛋黄中的转移酶测定法”进行检测时，具有高达100％的相对转移酶活性；或者(c)当使用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”进行检测时，具有至少2％的酰基转移酶活性。
48.如第47段所述的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶具有两个以上的下述特征：(a)当使用“低水环境中的转移酶测定法”进行检测时，在经过选自30、20或120分钟的时间后测定，具有至少1％的相对转移酶活性；(b)当在含54％水的蛋黄中使用“高水蛋黄中的转移酶测定法”进行检测时，具有高达100％的相对转移酶活性；或者(c)当使用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”进行检测时，具有至少2％的酰基转移酶活性。
49.如第47段所述的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶具有三个以上的下述特征：(a)当使用“低水环境中的转移酶测定法”进行检测时，在经过选自30、20或120分钟的时间后测定，具有至少1％的相对转移酶活性；(b)当在含54％水的蛋黄中使用“高水蛋黄中的转移酶测定法”进行检测时，具有高达100％的相对转移酶活性；或者(c)当使用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”进行检测时，具有至少2％的酰基转移酶活性。
50.如第47段所述的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶具有所有的下述特征：(a)当使用“低水环境中的转移酶测定法”进行检测时，在经过选自30、20或120分钟的时间后测定，具有至少1％的相对转移酶活性；(b)当在含54％水的蛋黄中使用“高水蛋黄中的转移酶测定法”进行检测时，具有高达100％的相对转移酶活性；或者(c)当使用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”进行检测时，具有至少2％的酰基转移酶活性。
51.固定化的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶包含如SEQ ID No.90所示的氨基酸序列，或与SEQ ID No.90具有至少75％同一性的氨基酸序列，优选与SEQ ID No.90具有至少80％同一性，优选与SEQ IDNo.90具有至少85％同一性，优选与SEQ ID No.90具有至少90％同一性，优选与SEQ ID No.90具有至少95％同一性的氨基酸序列。
52.如第51段所述的固定化脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶的特征在于其为这样的酶，该酶具有酰基转移酶活性，并包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S中的一个或多个。
53.如第51段或第52段所述的固定化脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶可得自于气单胞菌属的生物体。
54.如第51-53段中任一段所述的固定化脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶具有一个或多个以下特征：(a)当使用“低水环境中的转移酶测定法”进行检测时，在经过选自30、20或120分钟的时间后测定，具有至少1％的相对转移酶活性；(b)当在含54％水的蛋黄中使用“高水蛋黄中的转移酶测定法”进行检测时，具有高达100％的相对转移酶活性；或者(c)当使用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”进行检测时，具有至少2％的酰基转移酶活性。
55.如第54段所述的固定化脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶具有两个以上的下述特征：(a)当使用“低水环境中的转移酶测定法”进行检测时，在经过选自30、20或120分钟的时间后测定，具有至少1％的相对转移酶活性；(b)当在含54％水的蛋黄中使用“高水蛋黄中的转移酶测定法”进行检测时，具有高达100％的相对转移酶活性；或者(c)当使用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”进行检测时，具有至少2％的酰基转移酶活性。
56.如第54段所述的固定化脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶具有三个以上的下述特征：(a)当使用“低水环境中的转移酶测定法”进行检测时，在经过选自30、20或120分钟的时间后测定，具有至少1％的相对转移酶活性；(b)当在含54％水的蛋黄中使用“高水蛋黄中的转移酶测定法”进行检测时，具有高达100％的相对转移酶活性；或者(c)当使用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”进行检测时，具有至少2％的酰基转移酶活性。
57.如第54段所述的固定化脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶具有所有的下述特征：(a)当使用“低水环境中的转移酶测定法”进行检测时，在经过选自30、20或120分钟的时间后测定，具有至少1％的相对转移酶活性；(b)当在含54％水的蛋黄中使用“高水蛋黄中的转移酶测定法”进行检测时，具有高达100％的相对转移酶活性；或者(c)当使用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”进行检测时，具有至少2％的酰基转移酶活性。
58.食品酶组合物或饲料酶组合物，其包含前述任一段所述的脂质酰基转移酶。
59.脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶包含SEQ ID No.90所示的氨基酸序列，或与SEQ ID No.90具有95％或更高同一性的氨基酸序列。
60.如第59段所述的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶的特征在于其为这样的酶，该酶具有酰基转移酶活性，并包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S中的一个或多个。
61.如第59段或第60段所述的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶可得自于(或得自于)气单胞菌属。
62.如第59-61段中任一段所述的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶具有一个或多个以下特征：(a)当使用“低水环境中的转移酶测定法”进行检测时，在经过选自30、20或120分钟的时间后测定，具有至少1％的相对转移酶活性；(b)当在含54％水的蛋黄中使用“高水蛋黄中的转移酶测定法”进行检测时，具有高达100％的相对转移酶活性；或者(c)当使用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”进行检测时，具有至少2％的酰基转移酶活性。
63.如第62段所述的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶具有两个以上的下述特征：(a)当使用“低水环境中的转移酶测定法”进行检测时，在经过选自30、20或120分钟的时间后测定，具有至少1％的相对转移酶活性；(b)当在含54％水的蛋黄中使用“高水蛋黄中的转移酶测定法”进行检测时，具有高达100％的相对转移酶活性；或者(c)当使用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”进行检测时，具有至少2％的酰基转移酶活性。
64.如第62段所述的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶具有三个以上的下述特征：(a)当使用“低水环境中的转移酶测定法”进行检测时，在经过选自30、20或120分钟的时间后测定，具有至少1％的相对转移酶活性；(b)当在含54％水的蛋黄中使用“高水蛋黄中的转移酶测定法”进行检测时，具有高达100％的相对转移酶活性；或者(c)当使用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”进行检测时，具有至少2％的酰基转移酶活性。
65.如第62段所述的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶具有所有的下述特征：(a)当使用“低水环境中的转移酶测定法”进行检测时，在经过选自30、20或120分钟的时间后测定，具有至少1％的相对转移酶活性；(b)当在含54％水的蛋黄中使用“高水蛋黄中的转移酶测定法”进行检测时，具有高达100％的相对转移酶活性；或者(c)当使用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”进行检测时，具有至少2％的酰基转移酶活性。
66.固定化的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶包含SEQID No.90所示的氨基酸序列，或与SEQ ID No.90具有95％或更高同一性的氨基酸序列。
67.如第66段所述的固定化脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶的特征在于其为这样的酶，该酶具有酰基转移酶活性，并包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S中的一个或多个。
68.如第66段或第67段所述的固定化脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶可得自于气单胞菌属的生物体。
69.如第66-68段中任一段所述的固定化脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶具有一个或多个以下特征：(a)当使用“低水环境中的转移酶测定法”进行检测时，在经过选自30、20或120分钟的时间后测定，具有至少1％的相对转移酶活性；(b)当在含54％水的蛋黄中使用“高水蛋黄中的转移酶测定法”进行检测时，具有高达100％的相对转移酶活性；或者(c)当使用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”进行检测时，具有至少2％的酰基转移酶活性。
70.如第69段所述的固定化脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶具有两个以上的下述特征：(a)当使用“低水环境中的转移酶测定法”进行检测时，在经过选自30、20或120分钟的时间后测定，具有至少1％的相对转移酶活性；(b)当在含54％水的蛋黄中使用“高水蛋黄中的转移酶测定法”进行检测时，具有高达100％的相对转移酶活性；或者(c)当使用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”进行检测时，具有至少2％的酰基转移酶活性。
71.如第69段所述的固定化脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶具有三个以上的下述特征：(a)当使用“低水环境中的转移酶测定法”进行检测时，在经过选自30、20或120分钟的时间后测定，具有至少1％的相对转移酶活性；(b)当在含54％水的蛋黄中使用“高水蛋黄中的转移酶测定法”进行检测时，具有高达100％的相对转移酶活性；或者(c)当使用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”进行检测时，具有至少2％的酰基转移酶活性。
72.如第69段所述的固定化脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶具有所有的下述特征：(a)当使用“低水环境中的转移酶测定法”进行检测时，在经过选自30、20或120分钟的时间后测定，具有至少1％的相对转移酶活性；(b)当在含54％水的蛋黄中使用“高水蛋黄中的转移酶测定法”进行检测时，具有高达100％的相对转移酶活性；或者(c)当使用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”进行检测时，具有至少2％的酰基转移酶活性。
73.食品酶组合物或饲料酶组合物，其包含前述任一段所述的脂质酰基转移酶。
74.脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶包含SEQ ID No.90所示的氨基酸序列，或与SEQ ID No.90具有95％或更高同一性的氨基酸序列。
75.如第74段所述的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶具有SEQ ID No.90所示的氨基酸序列。
76.如第74段或第75段所述的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶是固定化的。
77.食品酶组合物或饲料酶组合物，其包含前述任一段所述的脂质酰基转移酶。
78.脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶包含SEQ ID No.90所示的氨基酸序列。
79.如第78段所述的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶具有SEQ ID No.90所示的氨基酸序列。
80.如第78段或第79段所述的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶是固定化的。
81.食品酶组合物或饲料酶组合物，其包含前述任一段所述的脂质酰基转移酶。
上面说明书中提及的所有公开的内容包含在本文中作为参考。本发明方法和体系的不同修饰和改变对于本领域普通技术人员来说是清楚的，而不偏离本发明的范围和精神。尽管本发明根据优选的实施方案进行了描述，但是应理解，本发明权利要求保护的范围不应该不适当地限于这些具体的实施方案。事实上，对于生物化学领域和生物工程学领域或相关领域的普通技术人员而言显而易见的那些对所述发明实施方式的各种修改意欲包含在权利要求的保护范围内。
保藏证明
布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
保藏人的姓名和地址
Figure GPA00001103919301892
1当适用细则6/4(d)时，此日期为国际保藏单位获得资格的日期。
表BP/4(单页)
布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
存活证明所授予一方的名称及地址
Figure GPA00001103919301902
1指原始保藏日，或者，当进行了新保藏或转保藏时，指最新近的相关日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。
2对于涉及细则10.2(a)(ii)和(iii)的情况，指最近的存活性检验。
3用打叉表示选定。
表BP/9(第一页)
Figure GPA00001103919301911
4如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。
表BP/9(第二页且为最后一页)
布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
Figure GPA00001103919301921
保藏人的姓名和地址
Figure GPA00001103919301922
1当适用细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位获得资格的日期。
表BP/4(单页)
布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
Figure GPA00001103919301931
存活证明所授予一方的名称及地址
Figure GPA00001103919301932
1指原始保藏日，或者，当进行了新保藏或转保藏时，指最新近相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。
2对于涉及细则10.2(a)(ii)和(iii)的情况，指最近的存活性检验。
3用打叉表示选定。
表BP/9(第一页)
4如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。
表BP/9(第二页且为最后一页)
布达佩斯条约有关用于专利程序的国际认可的微生物保藏国际表格
Figure GPA00001103919301951
保藏人的姓名和地址
Figure GPA00001103919301952
1当适用细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位获得资格的日期。
表BP/4(单页)
布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
Figure GPA00001103919301961
存活证明所授予一方的名称及地址
Figure GPA00001103919301962
1指原始保藏日，或者，当进行了新保藏或转保藏时，指最新近相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。
2对于涉及细则10.2(a)(ii)和(iii)的情况，指最近的存活性检验。
3用打叉表示选定。
表BP/9(第一页)
Figure GPA00001103919301971
4如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。
表BP/9(第二页且为最后一页)
布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏国际表格
Figure GPA00001103919301981
保藏人的姓名和地址
Figure GPA00001103919301982
1当适用细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位获得资格的日期。
表BP/4(单页)
布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
Figure GPA00001103919301991
存活证明所授予一方的名称及地址
Figure GPA00001103919301992
1指原始保藏日，或者，当进行了新保藏或转保藏换时，指最新近相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。
2对于涉及细则10.2(a)(ii)和(iii)的情况，指最近的存活性检验。
3用打叉表示选定。
表BP/9(第一页)
Figure GPA00001103919302001
4如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。
表BP/9(第二页且为最后一页)

Claims (12)

1.脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶包含SEQ ID No.90所示的氨基酸序列，或与SEQ ID No.90具有95％或更高同一性的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶的特征在于其为这样的酶，该酶具有酰基转移酶活性，并包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S中的一个或多个。
3.如权利要求1或权利要求2所述的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶可得自于(或得自于)气单胞菌属。
4.如权利要求1-3中任一项所述的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶具有一个或多个以下特征：
(a)当使用“低水环境中的转移酶测定法”进行检测时，在经过选自30、20或120分钟的时间后测定，具有至少1％的相对转移酶活性；(b)当在含54％水的蛋黄中使用“高水蛋黄中的转移酶测定法”进行检测时，具有高达100％的相对转移酶活性；或者(c)当使用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”进行检测时，具有至少2％的酰基转移酶活性。
5.如权利要求4所述的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶具有两个以上的下述特征：(a)当使用“低水环境中的转移酶测定法”进行检测时，在经过选自30、20或120分钟的时间后测定，具有至少1％的相对转移酶活性；(b)当在含54％水的蛋黄中使用“高水蛋黄中的转移酶测定法”进行检测时，具有高达100％的相对转移酶活性；或者(c)当使用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”进行检测时，具有至少2％的酰基转移酶活性。
6.如权利要求4所述的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶具有三个以上的下述特征：(a)当使用“低水环境中的转移酶测定法”进行检测时，在经过选自30、20或120分钟的时间后测定，具有至少1％的相对转移酶活性；(b)当在含54％水的蛋黄中使用“高水蛋黄中的转移酶测定法”进行检测时，具有高达100％的相对转移酶活性；或者(c)当使用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”进行检测时，具有至少2％的酰基转移酶活性。
7.如权利要求4所述的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶具有所有的下述特征：(a)当使用“低水环境中的转移酶测定法”进行检测时，在经过选自30、20或120分钟的时间后测定，具有至少1％的相对转移酶活性；(b)当在含54％水的蛋黄中使用“高水蛋黄中的转移酶测定法”进行检测时，具有高达100％的相对转移酶活性；或者(c)当使用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”进行检测时，具有至少2％的酰基转移酶活性。
8.如前述权利要求中任一项所述的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶包含与SEQ ID No.90具有98％或更高同一性的氨基酸序列。
9.如前述权利要求中任一项所述的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶包含SEQ ID No.90所示的氨基酸序列。
10.如前述权利要求中任一项所述的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶具有SEQ ID No.90所示的氨基酸序列。
11.如前述权利要求中任一项所述的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶是固定化的。
12.食品酶组合物或饲料酶组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的脂质酰基转移酶。
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