CN101754969A - 制备埃坡霉素化合物和类似物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明披露了制备埃坡霉素化合物及其类似物例如表-埃坡霉素A或表-埃坡霉素B和氮杂环丙基-埃坡霉素类似物的方法。

Description

制备埃坡霉素化合物和类似物的方法
技术领域
本发明涉及制备埃坡霉素(epothilone)化合物及其类似物例如表-埃坡霉素A(epi-epothilone A)或表-埃坡霉素B(epi-epothilone B)和氮杂环丙基-埃坡霉素(aziridinyl-epothilone)类似物的方法。
背景技术
埃坡霉素A和B为由
Figure GPA00001008498900011
等人发现的自微生物纤维堆囊菌(Sorangiumcellulosum)的发酵产物分离出的天然存在的化合物(参见例如WO93/10121)。
Figure GPA00001008498900012
等人亦发现由纤维堆囊菌产生的37种天然埃坡霉素变体及相关化合物，包括埃坡霉素C、D、E、F以及其它异构体及变体。参见例如美国专利第6,624,310号。
埃坡霉素A和B是纤维堆囊菌的主要代谢产物，并且作为天然产物，它们具有如下立体专一性形式：
Figure GPA00001008498900013
R＝H，埃坡霉素A
R＝CH3，埃坡霉素B。
Bristol-Myers Squibb公司已发现天然存在的埃坡霉素的多种衍生物及类似物。所述埃坡霉素类似物的实例包括称为伊沙匹隆(ixabepilone)的氮杂埃坡霉素B类似物和氮杂环丙基-埃坡霉素类似物。参见例如美国专利6,605,599、6,262,094、6,399,638、6,498,257、6,380,395和6,800,653。
已经发现一些氮杂环丙基-埃坡霉素在制备在治疗癌症中用于靶向药物疗法的组合物中是特别有用的，如在美国临时申请60/808,366(2006年5月25日提交)和题目为“Azirdinyl-Epothilone Compounds”的美国专利申请11/735,785(US2007/0276018A1，公开于2007年11月29日，其要求已经转让给本受让人的60/808,366申请的优先权)中所披露，将这些文献引入本文作为参考。
由环氧乙烷基埃坡霉素制备氮杂环丙基-埃坡霉素类似物的方法披露在授权给Borzilleri等人并已经转让给本受让人的美国专利6,291,684中。在Borzilleri专利中，氮杂环丙基-埃坡霉素由具有与埃坡霉素A或B一致的立体构型的化合物制备。然后使用这些立体专一性化合物通过几个步骤来制备氮杂环丙基-埃坡霉素，所述步骤包括：当与金属卤化物反应时破坏环氧化物环，当与叠氮盐反应时将卤化物转化为叠氮化物，进行三信(Mitsunobu)反应以形成中间体酯，将酯断裂以形成中间体叠氮醇，然后使叠氮醇环合以得到氮杂环丙基-埃坡霉素化合物。参见例如美国专利6,291,684B1中的2-3栏。据报道，使用上述多步方法以得到保留起始物质立体构型的氮杂环丙基-埃坡霉素化合物(Col.1，1.57-60)。
Regueiro-Ren et al.，Organic Letters，3：2693-2696(2001)披露了通过中间体非对映异构的埃坡霉素A或表-埃坡霉素A(“epi-epo A”)制备氮杂环丙基-埃坡霉素的方案。Regueiro-Ren等人报道了如下方案：
Figure GPA00001008498900021
Regueiro-Ren等人指出，对3进行的环氧化得到所需的12β，13β-环氧化物5(表-埃坡霉素A)，但是埃坡霉素A与12β，13β-埃坡霉素A的比例为3∶1。Regueiro-Ren等人还报道，改变和提高该比例以利于所需的12β，13β-环氧化物5的尝试没有成功，并且其它反应条件(包括低温、溶剂变化和可选择的二环氧乙烷(dioxirane)源)对非对映异构体选择性没有影响。参见Regueiro-Ren et al.，2694页，脚注8。
因此，存在的技术问题为开发制备埃坡霉素和类似物的有效方法(例如制备表-立体专一性形式的比例得以改进的表-埃坡霉素(例如表-埃坡霉素A或表-埃坡B)的有效方法)和使用表-埃坡霉素作为中间体制备埃坡霉素类似物例如氮杂环丙基-埃坡霉素类似物的有效方法。
发明内容
本发明提供制备可用作中间体的表-埃坡霉素(例如表-埃坡霉素A/B和表-埃坡霉素A/B的经保护形式)的改进方法，其得到比例显著改进的表-立体专一性形式(例如与主要的天然构型的异构体相比)，以及本发明提供将表-埃坡霉素转化为氮杂环丙基-埃坡霉素化合物的改进方法。
在一个实施方案中，本发明提供一种方法，其包括：
(i)使具有式(C)的化合物与卤化剂反应：
Figure GPA00001008498900031
其中
R1为氢或R1与Z1形成键；
Z1为羟基或氰基，或Z1与R1一起形成键，或Z1为ORp；
Z2为羟基或ORp；其中每个Rp为保护基；
R2、R3和R5独立为氢、烷基、经取代的烷基、芳基或经取代的芳基；或R2和R3可与它们连接的碳一起形成任选经取代的环烷基；
R4为氢、烷基、经取代的烷基、烯基、炔基、芳基或经取代的芳基；
R6为氢、烷基或经取代的烷基；
R12为氢、烷基、经取代的烷基或卤素；以及
R13为芳基、经取代的芳基、杂芳基或经取代的杂芳基；
(ii)得到具有式(B.1)和(B.2)的化合物：
Figure GPA00001008498900041
其中Y为卤素，以及R1、R2、R3、R4、R5、R6、R12、R13、Z1和Z2如前面所述；以及
(iii)对式(B.1)和/或(B.2)化合物进行环氧化物环闭合(epoxide ringclosure)，得到式(A.1)化合物：
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R12、R13、Z1和Z2如前面所述。
式(A.1)化合物在制备具有微管稳定作用的氮杂环丙基-埃坡霉素化合物(例如下述具有式(H)的那些化合物)中是特别有用的。
另一个实施方案提供通过在碱的存在下用烷基卤化物处理具有式A.1(任选如上面所概述的那样来制备)的化合物来制备氮杂环丙基-埃坡霉素类似物(例如下面具有式G或H的那些化合物)的方法。
上述“发明内容”是非限制性的，并且本发明的其它实施方案如下所述。
具体实施方式
术语的定义
以下为在本说明书中使用的术语的定义。除非另有说明，本文为基团或术语提供的初始定义适用于在整篇说明书中单独出现或作为另一基团的部分而出现的该基团或术语。
叠氮供体试剂是能够提供叠氮基团的亲核试剂，并且可包括无机叠氮盐(例如叠氮化锂或叠氮化钠)、叠氮化四烷基铵(例如叠氮化四丁基铵)或三烷基甲硅烷基叠氮化物(例如三甲基甲硅烷基叠氮化物)等。优选的叠氮供体为叠氮化钠和叠氮化四丁基铵。
“碱”，当其用在本文中时，包括金属氧化物、金属氢氧化物、金属烷氧化物、金属氢化物或如氨那样的化合物，它们在水或溶剂中接受质子。因此，示范性碱包括但不限于：碱金属氢氧化物和碱金属烷氧化物(即MOR，其中M是碱金属例如钾、锂或钠，以及R为氢或如上所定义的烷基，更优选其中R为直链或支链C1-5烷基，因此所述碱金属氢氧化物和碱金属烷氧化物包括但不限于氢氧化钾、叔丁醇钾、叔戊醇钾(potassium tert-pentoxide)、氢氧化钠、叔丁醇钠、氢氧化锂等)；其它氢氧化物，例如氢氧化镁(Mg(OH)2)或氢氧化钙(Ca(OH)2)；碱金属氢化物(即MH，其中M如上所定义，因此所述碱金属氢化物包括但不限于氢化钠和氢化锂)；烷基化二甲硅烷基氨基化物(alkylated disilazide)，例如六甲基二甲硅烷基氨基钾和六甲基二甲硅烷基氨基锂；碳酸盐，例如碳酸钾(K2CO3)、碳酸钠(Na2CO3)、碳酸氢钾(KHCO3)和碳酸氢钠(NaHCO3)；烷基氢氧化铵，例如氢氧化四正丁基铵(TBAH)等。本文优选的碱包括有机碱，特别是叔胺例如N-甲基吗啉、三乙胺和二异丙基乙基胺(a/k/a/许尼希碱(a/k/a/Hunig’s base))。
本文使用的术语“偶联剂”是指用于使羧酸和胺(或苯胺)偶联以形成酰胺键的试剂。其可包括偶联添加剂，例如CDI、HOBt、HOAt、HODhbt、HOSu或NEPIS，它们用于与另一种偶联剂组合以加速偶联过程和抑制副反应。具体的肽偶联剂可包括DCC、EDC、BBC、BDMP、BOMI、HATU、HAPyU、HBTU、TAPipU、AOP、BDP、BOP、PyAOP、PyBOP、TDBTU、TNTU、TPTU、TSTU、BEMT、BOP-Cl、BroP、BTFFH、CIP、EDPBT、Dpp-Cl、EEDQ、FDPP、HOTT-PF6、TOTT-BF4、PyBrop、PyClop和TFFH。参见Peptide Coupling Reagents：Names，Acronyms and References，AlbanyMolecular Research，Inc.，Technical Reports，Vol.4，No.1，将其并入本文作为参考。
本文中的高温指的是高于室温的温度(即高于约25℃)，优选为高于约30℃的温度，以及更优选为高于约30-40℃的温度。本领域技术人员会意识到的是，针对任意具体反应步骤所选择的温度可受在具体步骤中所用溶剂或其它试剂的选择所限制(例如受它们的沸点或熔点所限制)。
术语“卤化剂”或“卤化试剂”指的是能够对本文中的式(C)(包括C’)化合物进行卤化的一种或多种试剂。卤化试剂包括无机卤化试剂和有机卤化试剂。无机卤化试剂的实例包括氯、溴、碘、氟和次氯酸钠。有机卤化试剂包括：N-卤代琥珀酰亚胺，例如N-氯琥珀酰亚胺(NCS)、N-溴琥珀酰亚胺(NBS)和N-碘琥珀酰亚胺(NIS)；或乙内酰脲，例如1，3-二氯-5，5-二甲基乙内酰脲、1，3-二溴-5，5-二甲基乙内酰脲和1，3-二碘-5，5-二甲基乙内酰脲。
本文使用的“高收率”指的是大于60％的收率，更优选为大于70％的收率，更优选为大于80％的收率，甚至更优选为大于85％的收率，以及最优选为大于90％的收率。
“离去基团”指的是当与亲核试剂反应时具有被置换的能力的基团，其包括I、Br、Cl、ReSO2O-(其中Re为本文定义的烷基、经取代的烷基、芳基或杂芳基)和弱碱(例如HSO4-)。优选的离去基团包括甲氧基磺酸酯基团、甲磺酸酯基团、三氟甲磺酸酯基团、甲苯磺酸酯基团(对甲苯磺酸酯基团)和硝苯磺酸酯基团。
本文使用的“保护基”指的是本领域已知的任意保护基，例如在Greene，T.W.et al.，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，Inc中所定义。当官能团被称作“经保护的”时，其指的是所述基团呈经修饰的形式以减轻(特别是排除)在经保护的位点发生不希望的副反应。因此，保护基可选自烷基、经取代的烷基(例如烷氧基烷基或芳基氧基烷基)、烷氧基羰基和-Si(Rf)3，其中Rf彼此独立选自烷基和芳基。优选的保护基为甲硅烷基保护基，例如三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基等。
叠氮还原剂包括有机膦，例如三烷基膦、三芳基膦和三(烷基/芳基)膦(或它们的混合物)，更优选为三甲基膦、三乙基膦、三丁基膦、三苯基膦、三环己基膦、三(4-甲氧基苯基)膦和/或三丙基膦和/或它们的混合物。
本文使用的“合适的溶剂”意指单一的溶剂以及多种溶剂的混合物。为了适于给定的反应步骤，溶剂可选自例如：非质子性极性溶剂，例如DMF、DMA、DMSO、二甲基亚丙基脲、N-甲基吡咯烷酮和六甲基磷酸三酰胺；醚溶剂，例如乙醚、THF、1，4-二噁烷、甲基叔丁基醚、二甲氧基甲烷和乙二醇二甲基醚；醇溶剂，例如MeOH、EtOH和异丙醇；以及含有卤素的溶剂，例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳和1，2-二氯乙烷。
“极性溶剂”是具有偶极距并且能够溶解离子化合物或离子化共价化合物的那些溶剂。例如，本文中的极性溶剂可包括水、乙腈、1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)和醇(例如MeOH、EtOH、IPA、叔丁醇等)及它们的混合物。优选的极性溶剂包括乙腈、水、EtOH和它们的混合物。
本文中的低温指的是低于室温的温度(即低于约25℃)，优选为低于约10℃的温度，以及更优选为低于约0℃的温度。本领域技术人员会意识到的是，针对任意具体反应步骤所选择的温度可受在具体步骤中所用溶剂或其它试剂的选择所限制(例如受它们的冰点所限制)。
术语“烷基”和“烷……”，当单独出现或与一些其它基团组合时，是指在任何可用碳原子处连接的直链或支链烷(烃)基，其含有1至10个碳原子，优选1至6个碳原子，更优选1至4个碳原子。示范性的上述基团包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基、庚基、4，4-二甲基戊基、辛基、2，2，4-三甲基戊基等。“低级烷基”或“低级亚烷基”意指具有1至4个碳原子的直链或支链烷基。当针对烷基或其它基团使用下标时，所述下标是指所述基团可含有的碳原子数。举例而言，术语“C0-4烷基”包括化学键及含有1至4个碳原子的烷基，且术语“C1-4烷基”意指含有1至4个碳原子的烷基。
术语“亚烷基”是指如以上就“烷基”所述但具有两个连接点的二价烃基。例如，亚甲基为-CH2-基团且亚乙基为-CH2-CH2-基团。
当术语烷基与另一基团组合使用(如在杂环烷基或环烷基烷基中)时，此意指另一确定的(名称在先的)基团直接经由如上所定义的烷基(例如所述烷基可为支链或直链)连接。因此，在上述情况下术语“烷基”用来指具有两个可用连接点的亚烷基(例如二价烷基)。举例而言，环丙基C1-4烷基意指经由具有1至4个碳原子的直链或支链亚烷基连接的环丙基，且羟基烷基意指经由具有1至10个碳原子优选具有1至6个碳原子更优选具有1至4个碳原子的直链或支链亚烷基连接的OH基团。就取代基而言，如在“经取代的环烷基烷基”中，所述基团中的亚烷基部分除呈支链形式或直链形式外还可如以下就经取代的烷基所描述的那样被取代，和/或名称在先的基团(例如环烷基)可如本文就所述名称在先的基团(例如环烷基)所描述的那样被取代。
“经取代的烷基”指在任何可用连接点处经一个或多个取代基优选1至4个取代基取代的烷基。然而，当烷基经多个卤素取代基取代时，所述烷基可随价数允许而含有多达10个取代基，更优选含有多达7个取代基。烷基上的取代基可包括一个或多个以下基团：卤素(例如单卤素取代基或多卤素取代基，在多卤素取代基的情况下形成基团诸如全氟烷基或具有Cl3或CF3的烷基)、氰基、-ORa、-SRa、-C(＝O)Ra、-C(＝O)ORa、-OC(＝O)Ra、-OC(＝O)ORa、-NRaRb、-C(＝O)NRaRb、-OC(＝O)NRaRb、-S(＝O)Ra、-S(O)2Ra、-NHS(O)2Ra、-NHS(O)2NHRa、-NHC(＝O)NHRa、-NHC(＝O)Ra、-NHC(O)2Ra、-NHC(＝N-CN)Ra、芳基、杂环基、环烷基及/或杂芳基，其中基团Ra及Rb独立选自氢、烷基、烯基、环烷基、杂环基、芳基及杂芳基，且其中每个Ra及/或Rb又任选经1至4个选自以下的基团取代：烷基、烯基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、氰基、硝基、氨基、烷基氨基、氨基烷基、羟基、羟基烷基、烷氧基、巯基、烷基硫基、苯基、苄基、苯基氧基、苄基氧基、C3-7环烷基、5员或6员杂环基、5员或6员杂芳基及/或低级烷基或低级烯基，所述基团经1至4个选自羟基、氰基、卤素、卤代C1-4烷基、卤代C1-4烷氧基、氰基、硝基、氨基、C1-4烷基氨基、氨基C1-4烷基、羟基C1-4烷基、C1-4烷氧基、巯基及/或C1-4烷基硫基的基团取代。为了避免产生疑义，“经取代的低级烷基”意指这样的烷基，其具有1至4个碳原子及1至4个选自以上刚刚就经取代的烷基所描述的取代基。就经取代的低级烷基而言，基团Ra及Rb优选地选自氢、低级烷基、低级烯基、C3-7环烷基、苯基及5至6员单环杂环基及/或杂芳基，这些取代基又如上任选经取代。
术语“烯基”指含有2至12个碳原子及至少一个碳-碳双键的直链或支链烃基。示范性的上述基团包括乙烯基或烯丙基。“经取代的烯基”指在任何可用连接点处经一个或多个取代基优选1至4个取代基取代的烯基。示范性的取代基包括烷基、经取代的烷基及以上作为烷基上的取代基而描述的那些基团。
术语“烷氧基”及“烷基硫基”指分别经由氧键(-O-)或硫键(-S-)连接的如上所述的烷基。术语“经取代的烷氧基”及“经取代的烷基硫基”指分别经由氧键或硫键连接的如上所述的经取代的烷基。“低级烷氧基”或C1-4烷氧基为基团OR，其中R为低级烷基(含有1至4个碳原子的烷基)。
“氨基”为-NH2。烷基氨基为-NRcRd，其中Rc与Rd中的至少一个为烷基或经取代的烷基，且Rc与Rd中的另一个选自氢、烷基及经取代的烷基。“氨基烷基”意指经由亚烷基连接的氨基(-亚烷基-NH2)，且烷基氨基烷基意指经由亚烷基连接的如上所定义的烷基氨基(-亚烷基-NRcRd)。
术语“芳基”指具有1至3个芳环的环状芳族烃基，尤其为单环或二环基团，诸如苯基或萘基。二环或三环的芳基必须包含至少一个完全芳族的碳环，但其它稠环可为芳族或非芳族且可任选含有杂原子，其限制条件为在上述情况下连接点应该在芳族碳环上。另外，当芳基已与杂环基环或环烷基环稠合时，所述杂环基环及/或环烷基环可具有一个或多个羰基碳原子，即所述碳原子经由双键与氧原子连接而形成羰基。因此，“芳基”的实例可包括但不限于：
Figure GPA00001008498900091
术语“亚芳基”指二价芳基即在芳基环的任何可用连接点处具有与两个其它基团连接的两个连接点的如上所定义的芳基。亚芳基环亦可经适于在本文所定义的芳基上进行取代的任何基团取代。
“经取代的芳基”指在任何连接点处经一个或多个取代基优选1至4个取代基取代的如上所定义的芳基或亚芳基。取代基包括烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基及以上作为烷基上的取代基而描述的那些基团。
术语“碳环”意指饱和或不饱和的单环、二环或三环(优选为单环或二环)，其中所有环中的所有原子为碳。因此，所述术语包括环烷基环及芳基环。碳环可被取代，在这种情况下取代基选自以上就环烷基及芳基而描述的那些取代基。
术语“环烷基”指含有1至3个环且每个环含有3至7个碳原子的完全饱和或部分饱和的环烃基。示范性的完全饱和的环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基及环己基。示范性的部分饱和的环烷基包括环丁烯基、环戊烯基及环己烯基。术语“环烷基”包括具有由3至4个碳原子构成的桥的环烷基。另外，二环或三环的环烷基必须包含至少一个完全饱和或部分饱和的烃环，但其它稠环可为芳族或非芳族且可含有杂原子，其限制条件为在这种情况下连接点应该在环状非芳族烃基上。另外，环烷基中的一个或多个碳原子可形成定义为羰基的碳-氧双键。因此，“环烷基”的实例可包括但不限于：
术语“亚环烷基”指二价环烷基即在环烷基环的任何两个可用连接点处具有与两个其它基团连接的两个连接点的如上所定义的环烷基。
“经取代的环烷基”指在任何可用连接点处经一个或多个取代基优选1至4个取代基取代的如上所定义的环烷基。环烷基上的取代基包括烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基及以上作为烷基上的取代基而描述的那些基团。
术语“胍基”意指基团
Figure GPA00001008498900102
因此，胍基烷基意指与胍基连接的烷基，诸如具有式
Figure GPA00001008498900103
的基团。
术语“卤素”或“卤代”指氟、氯、溴及碘。
术语“杂原子”包括氧、硫及氮。
术语“卤代烷基”意指具有一个或多个卤素取代基的烷基，其包括但不限于如-CH2F、-CHF2及-CF3那样的基团。
术语“卤代烷氧基”意指具有一个或多个卤素取代基的烷氧基。举例而言，“卤代烷氧基”包括-OCF3。
当术语“不饱和的”在本文中用来指示环或基团时，所述环或基团可为完全不饱和或部分不饱和。
术语“杂芳基”指4至7员单环环系的芳族基团、7至11员二环环系的芳族基团或10至15员三环环系的芳族基团，其具有至少一个含有至少一个杂原子的环。含有杂原子的杂芳基中的每个环可含有一个或两个氧原子或一个或两个硫原子及/或1至4个氮原子，其限制条件为各环中杂原子的总数为4或小于4且各环具有至少一个碳原子。构成二环基团及三环基团的稠环可仅含有碳原子且可为饱和的、部分饱和的或不饱和的。氮原子及硫原子可任选被氧化且氮原子可任选被季铵化。二环或三环的杂芳基必须包含至少一个完全芳族的环，但其它稠环可为芳族或非芳族且可为碳环，其限制条件为在这种情况下连接点应该在含有杂原子的芳环中的任何可用氮原子或碳原子处。另外，杂芳基其自身的定义包括这样的环，其中一个或多个碳原子经由双键与氧原子连接以形成羰基(其限制条件为所述杂芳基是芳族的)，且亦当杂芳基已与杂环基环环或环烷基环稠合时，所述杂环基环及/或环烷基环可具有一个或多个羰基。
示范性的单环杂芳基包括吡咯基、吡唑基、吡唑啉基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基(即)、噻二唑基、异噻唑基、呋喃基、噻吩基、噁二唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、三嗪基等。另外，因杂芳基其自身的定义包括其中一个或多个碳原子形成羰基的环，故杂芳基包括如2，4-二氢-[1，2，4]三唑-3-酮(即
Figure GPA00001008498900112
)等那样的环。
示范性的二环杂芳基包括吲哚基、苯并噻唑基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并噁唑基、苯并噻吩基、喹啉基、四氢异喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并吡喃基、吲嗪基、苯并呋喃基、色酮基、香豆素基、苯并吡喃基、噌啉基、喹喔啉基、吲唑基、吡咯并吡啶基、呋喃并吡啶基、二氢异吲哚基、四氢喹啉基等。
示范性的三环杂芳基包括咔唑基、苯并吲哚基、菲咯啉基(phenanthrolinyl)、吖啶基(acridinyl)、菲啶基(phenanthridinyl)、呫吨等。
术语“亚杂芳基”指二价杂芳基即在杂芳基环的任何两个可用连接点处具有与两个其它基团连接的两个连接点的如上所定义的杂芳基。
“经取代的杂芳基”为在任何可用连接点处经一个或多个取代基优选1至4个取代基取代的如上所定义的杂芳基。示范性的取代基包括但不限于烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基及以上作为烷基上的取代基而描述的那些基团。
术语“杂环”、“杂环的”和“杂环基”可互换使用，并且各自指完全饱和或部分不饱和的非芳族环状基团，其可经取代或未经取代，例如其为4至7员单环环系、7至11员二环环系或10至15员三环环系，其在至少一个含有碳原子的环中具有至少一个杂原子。含有杂原子的杂环基中的各环可具有1个、2个或3个选自氮、氧及硫原子的杂原子，其中氮杂原子及硫杂原子亦可任选被氧化且氮杂原子亦可任选被季铵化。优选地，两个相邻的杂原子不同时选自氧及氮。二环或三环的杂环基必须包含至少一个非芳族的非碳环，但其它稠环可为芳族或非芳族且可为碳环，其限制条件为在这种情况下连接点应该在含有杂原子的非芳环中的任何可用氮原子或碳原子处。另外，杂环基其自身的定义包括这样的环，其中一个或多个碳原子经由双键与氧原子连接以形成羰基(其限制条件为所述杂环基为非芳族)，且亦当杂环基已与另一环稠合时，所述另一环可具有一个或多个羰基。
示范性的单环杂环基包括吡咯烷基、咪唑烷基、四氢呋喃基、哌啶基、哌嗪基、吡唑烷基、咪唑啉基、吡咯啉基、四氢吡喃基、吗啉基、硫吗啉基等。
“经取代的杂环”、“经取代的杂环的”和“经取代的杂环基”指在任何可用连接点处经一个或多个取代基优选1至4个取代基取代的如上所定义的“杂环”、“杂环的”或“杂环基”。示范性的取代基包括烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基及以上作为烷基上的示范性取代基而描述的那些基团。
“羟基”指-OH。
“巯基”意指基团-SH。
如本文所使用的术语“叶酸结合部分或其类似物或衍生物”意指可与叶酸受体(folate receptor)蛋白结合的部分(不是单克隆抗体)，所述叶酸受体蛋白在癌细胞上过度表达或优先表达。例如，已知叶酸受体(FR)在卵巢癌细胞及其它癌细胞中过度表达。叶酸的示范性类似物及衍生物披露于Vlahov等人的美国专利申请公开号2005/0002942(下文中称为“Vlahov”)中。
如本文所使用的术语“可释放的连接基团”意指这样的二价连接基团，其包含至少一个可在生理条件下断裂的可裂解键(例如pH不稳定的键、还原不稳定的键、酸不稳定的键、氧化不稳定的键或酶不稳定的键)。应该理解的是，引起键断裂的上述生理条件包括标准化学水解反应，其例如在生理pH下发生、由于区域化(compartmentalization)至细胞器(诸如pH比胞质pH低的内体)内而发生或由于与细胞还原剂(诸如谷胱甘肽)反应而发生。
应该理解的是，如本文中所述，可裂解的键可连接可释放的连接基团中的两个相邻原子，和/或在所述连接基团的任一端或两端将如Q及K那样的其它基团与可释放的连接基团连接。
术语“四级氮”指四价正电性氮原子，其包括例如四烷基铵基团(例如四甲基铵或N-甲基吡啶鎓)中的正电性氮、质子化铵物质(例如三甲基氢铵或N-氢吡啶鎓)中的正电性氮、胺N-氧化物(例如N-甲基-吗啉-N-氧化物或吡啶-N-氧化物)中的正电性氮及N-氨基-铵基团(例如N-氨基吡啶鎓)中的正电性氮。
一般方法
方案1
方案1说明了用于由式C化合物制备式A.1和A.2化合物的本发明的方法的实施方案，其中立体选择性偏向于式A.1化合物，其中各种基团R1、R2、R3、R4、R5、R6、R12、R13、Z1和Z2如本文在其它地方所定义(例如在发明内容和替代实施方案中)。式C化合物是已知的，并可通过本领域公知的方法得到，例如通过发酵得到(参见例如Gerth et al.，“Studies on theBiosynthesis of Epothilones：The Biosynthetic Origin of the Carbon Skeleton，”Journal of Antibiotics，53(12)：1373-1377(Dec.2000)和Hofle et al.，“EpothiloneA and B-Novel 16-Membered Macrolides：Isolation，Crystal Structure，andConformation in Solution”，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，35(13/14)：1567-1569(1996)；亦参见WO 03/072730、US 6,410,301、US6,303,342和US 2002/0137152A1)；将它们公开的内容并入本发明作为参考)或通过全合成或半合成得到(参见例如Vite等人的美国专利6,605,599、美国专利6,242,469、美国专利6,867,333、美国专利申请公开号2006/004065，将它们公开的涉及制备方法的内容并入本文作为参考)。例如，式C化合物(其中R1为氢，R2、R3、R4、R5和R12为甲基，Z1和Z2为羟基，R1为氢，以及R12为2-甲基噻唑-4-基)为埃坡霉素C(其中R6为氢)和埃坡霉素D(其中R6为甲基)，这两种化合物都可通过对纤维堆囊菌进行发酵而得到。式C化合物(其中Z1和Z2是经保护的，例如包含式ORp基团)是已知的，并可通过本领域公知的方法容易地得到。参见例如WO 93/10121、DE 19542986A1、WO 97/19086和WO 98/22461；亦参见U.S.6,369,234和6,972,335。一种这样的方法包括在碱例如许尼希碱的存在下用三乙基氯甲硅烷处理，得到经保护的化合物，其中Rp为三乙基甲硅烷基。亦参见Cooper，B.，“Silylation asa Protective Method In Organic Synthesis，”Chemistry & Industry，20：794-797(1978)、Lalonde“Use of Organosilicon Reagents As ProtectiVeGroups In Organic Synthesis，”Synthesis，9：817-845(1985)和Olsson，“Silicon-Based Protective Groups in Organic Synthesis，”Aeta PharmaceuticalSuecica，23(6)：370-385(1986)。
式B.1和B.2卤代醇(Y为Cl、Br或I)可由式C化合物通过用卤化剂处理来制备。例如，在极性溶剂中使用卤素(Y2)(优选地Y＝碘)进行的亲电加成反应可立体选择性地提供区域异构的(regioisomeric)式B.1和B.2卤代醇(其中Y为卤素(优选为碘))。可选择地，N-卤代琥珀酰亚胺也可用于同一转化，所述N-卤代琥珀酰亚胺为例如N-氯琥珀酰亚胺(NCS)、N-溴琥珀酰亚胺(NBS)或N-碘琥珀酰亚胺(NIS)。用于该步骤的极性溶剂可包括乙腈、水、NMP、DMA、DMF、THF和醇(例如MeOH、EtOH、IPA、叔丁醇等)及它们的混合物，并且优选包括乙腈、水、EtOH和它们的混合物，以及更优选为乙腈。
优选地，对式C埃坡霉素化合物进行卤化的步骤在低温进行，优选在低于10℃的温度进行，更优选在低于0℃的温度进行，更优选在约0℃至-15℃的温度进行，以及最优选在约-5℃至-10℃的温度范围内进行。
此外，在该步骤中优选使用过量的卤化试剂，随后使用淬灭剂以除去过量的卤化试剂。例如，卤化试剂可以按2至5(卤化剂)∶1(化合物C)的摩尔比例加入，更优选为约5∶1(卤化剂∶化合物C)(摩尔比例)，随后用本领域公知的淬灭剂淬灭。例如，可如在March，Advanced Organic Chemistry，Reactions，Mechanisms and Structures，J.Wiley & Sons，New York，p.813(1992)及其中引用的参考文献和Zanger，M.et al.，J.Org.Chem.，40：248(1975)中所披露的那样使用淬灭剂，将这两篇文献所公开的关于淬灭剂的内容并入本发明作为参考。作为非限制性实例，可使用15％焦亚硫酸钠(sodiummetabisulfite)溶液。
然后在碱的存在下对式B.1和B.2化合物进行环合，形成式A.1和A.2环氧化物埃坡霉素化合物。本发明人已经发现，就该反应而言无需分离或分开中间体B.1和B.2，而是一旦加入碱，这两种中间体就会转化成式A.1和A.2化合物，其中立体选择性偏向于式A.1化合物。因此，化合物A.1与A.2的可期望比例可以实现例如大于2∶1、甚至大于5∶1以及甚至大于9∶1。碱可选自如上所述的那些碱，并且用于该转化的碱优选为叔胺，例如N-甲基吗啉、三乙胺和二异丙基乙基胺(a/k/a/许尼希碱)，更优选为三乙胺或许尼希碱。优选地，反应在极性溶剂中进行，所述极性溶剂包括极性/含水溶剂系统。极性溶剂可包括如上所述的那些极性溶剂，并且优选为乙腈、水、EtOH和它们的混合物，更优选为乙腈/水。
此外，将B.1和B.2转化成A.1和A.2的反应优选在高温进行，所述高温加速反应。本领域技术人员会意识到的是，高温会受溶剂的选择所限制，并且可对温度/溶剂系统进行相应的优化。例如，当使用乙腈/水时，所述反应优选在约40℃至60℃的温度进行，更优选在约50℃至60℃进行。可通过本领域已知的方法(例如参见Regueiro-Ren et al.，Organic Letters，3：2693-2696(2001))或更优选如本文在其它地方(例如在随后的方案2和3以及实施例中)所示将式A.1化合物转化成立体专一性与主要天然埃坡霉素(例如埃坡霉素A、B、C、D等)一致的氮杂环丙基埃坡霉素。
方案1.1
R6＝H，埃坡霉素C                 R6＝H，表-埃坡霉素A
R6＝CH3，埃坡霉素D               R6＝CH3，表-埃坡霉素B
方案1.1显示了将式C化合物(在此以埃坡霉素C/D示例)直接转化成式A.1化合物(在此以表-埃坡霉素A/B示例)的实例，其进行过程不经由中间体保护基。按照方案1所示的一般条件，用卤化剂处理埃坡霉素C和/或D化合物，其优选在极性溶剂中和在低温进行，并优选用过量的卤化剂处理，接着淬灭，然后由此得到的中间体卤代醇化合物(不需要对其进行分离或纯化)用碱处理，其优选在高温和在极性/含水溶剂系统中进行，与非对映异构体埃坡霉素A/B相比，以高收率得到表-埃坡霉素A/B。
方案2
Figure GPA00001008498900162
方案2显示了将式A.1化合物转化成具有式G的氮杂环丙基-埃坡霉素化合物的实例。在式A.1化合物中，基团Z1和/或Z2可以是羟基，并且亦可包含保护基，例如Z1和/或Z2中的至少一个可以是基团ORp。在每种情况下，式A.1化合物可如下转化成式E.1和E.2叠氮基-醇：在醇性溶剂中在叠氮供体例如无机叠氮盐或叠氮化四烷基铵的存在下进行叠氮置换。有利地，铵盐例如卤化铵(氯化铵、溴化铵)与叠氮供体组合使用以提高叠氮化物的溶解性并加速反应。当Z1＝OH或CN或Z1与R1形成键以及Z2为羟基时，式G化合物的制备优选如下直接进行：在极性溶剂(更优选为无水极性溶剂(例如无水乙腈))中用叠氮还原剂例如有机膦(例如三烷基膦、三芳基膦和三(烷基/芳基)膦或它们的混合物，更优选为三甲基膦、三乙基膦、三丁基膦、三苯基膦、三环己基膦、三(4-甲氧基苯基)膦和/或三丙基膦和/或它们的混合物，以及甚至更优选为三苯基膦)还原叠氮基。当Z1和/或Z2包含保护基时，在制备式G化合物中应该有利的是使副产物反应最小化并提高收率，以及应该有利的是，首先通过本领域已知的方法将C12羟基、C13羟基转化成如式F.1和F.2化合物中所示的离去基团OG(例如甲磺酸酯基团、甲苯磺酸酯基团、硝苯磺酸酯基团、三氟甲磺酸酯基团等)，其例如通过在合适的有机溶剂例如二氯甲烷中用甲磺酰氯和三乙胺处理来进行。如上所述，F.1-和F.2化合物可通过在极性溶剂中用叠氮还原剂还原而转化成式G化合物。因此，当式A.1化合物包括表-埃坡霉素A和/或表-埃坡霉素B(如方案1.1中所示)时，式G氮杂环丙基化合物可如下直接制备：进行叠氮置换，然后在极性溶剂中用叠氮还原剂例如有机膦还原叠氮基。优选地，方案2的反应在约室温进行或在约20℃至40℃的温度范围内进行，并且在无水环境中进行。然后，式G化合物可通过本领域已知的方法(参见例如美国专利6,800,653和Regueiro-Ren et al.，Organic Letters，3：2693-2696(2001))或优选如方案3中所示用于制备其它氮杂环丙基埃坡霉素类似物(例如以下式H或X化合物)。
方案3
Figure GPA00001008498900171
方案3说明了由式G化合物制备式H氮杂环丙基类似物的改进方法，其中各种基团R1、R2、R3、R4、R5、R6、R12、R13、R40和B1如本文在其它地方所定义。与先前的方法相比，这种方法较简单，并提供较高收率的基本上纯化的最终产物，并且在保护基的使用方面是较灵活的。举例而言，式H化合物可如下由式G化合物直接制备：氮杂环丙烷环在碱的存在下用卤化物试剂R40-Y(其中Y为卤素)优选用过量的卤化物处理。例如，式H化合物(其中R40为2-羟基乙基)可如下制备：氮杂环丙烷用2-溴乙醇和碱(例如叔胺或碳酸钾)处理。所述反应优选在极性溶剂(最优选为乙腈)中和在高温(例如优选高于40℃，更优选为约50℃-75℃，以及最优选为70-75℃)进行。本申请人已经发现，就该反应而言卤化物与氮杂环丙基-埃坡霉素的优选比例为约5-7(卤化物)∶1(式G化合物)(摩尔比例)，从而减少杂质和提高收率，更优选使用6∶1(卤化物∶式G化合物)的比例；较高的比例可能产生较多的杂质，以及较小的比例(较少的卤化物)使反应较不完全。用该方法可以得到基本上纯的结晶的式H化合物，例如其中纯度高于90％，更优选高于95％，以及甚至更优选为约96-98％或97-99％。此外，由于在Z1和/或Z2位置处无需保护基，所以该方法具有灵活性，并且如果保护基位于式G化合物上，则可使用本领域已知的方法在将式G化合物转化成式H化合物的反应中的任何时刻将这些保护基除去，例如当Rp为三乙基甲硅烷基时，在二氯甲烷中用三氟乙酸处理来实现脱保护，从而得到式H化合物。
方案4
Figure GPA00001008498900181
方案4显示了制备如下具有式XI的叶酸类似物或衍生物V和二价连接基团T-Q的方法，所述式XI可与用本发明的方法制备的化合物一起使用以制备用于靶向药物递送的接合分子(conjugated molecule)(其符合下面进一步描述的式I)。如方案4所示，叶酸类似物和二价连接基团可使用本领域已知的方法来组装，特别是在V为叶酸或叶酸类似物并且T-Q为肽的情况下，参见例如Jackson，et al.，Advanced Drug Delivery Rev.，56：1111-1125(2004)，将其公开的内容并入本文作为参考。负载有半胱氨酸的聚苯乙烯树脂先后与经Fmoc(芴甲氧羰基)保护的天冬氨酸、经Fmoc保护的精氨酸、经Fmoc保护的天冬氨酸和经Fmoc保护的谷氨酸进行的肽偶联可使用PyBOP作为偶联剂和使用哌啶作为Fmoc脱保护剂来实现。N10经三氟乙酰胺基团保护的蝶酸(pteroic acid)可如下分两步制备：用酶(羧肽酶G)将叶酸转化成蝶酸，然后使用三氟乙酸酐对N10进行保护。接下来，使N10经保护的蝶酸与树脂所结合的肽偶联，然后用三氟乙酸将其从树脂上裂解下来，并用氢氧化铵除去N10-三氟乙酰基，得到式I化合物的V-T-Q片段，其中V为叶酸，以及T-Q为-Asp-Arg-Asp-Cys-OH。可选择地，可用蝶酸类似物代替蝶酸，并且可用其它氨基酸代替方案4中所示的那些氨基酸。
方案5
Figure GPA00001008498900191
上面的方案5显示了使用根据本发明制备的埃坡霉素衍生物来制备式I接合分子的方法，所述式I接合分子用于靶向药物递送。如方案5中所示，可如下实现式I化合物的组装：通过逐步引入可释放的连接基团M而使式X化合物与片段V-T-Q偶联。举例而言，式X化合物(其中-A-K-H为-CH2CH2OH)可使用经活化的式XII苯并三唑化合物而转化成二硫基乙基碳酸酯(disulfanylethyl carbonate)XIII。式XII化合物可由巯基乙醇、甲氧基羰基硫基氯(methoxycarbonyl sulfenyl chloride)和任选经取代的2-巯基吡啶来制备，得到中间体2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙醇，其可接着通过用双光气(diphosgene)及任选经取代的1-羟基苯并三唑处理而转化为式XII的化合物。随后二硫化物与如XI那样的肽基叶酸进行交换，得到式I化合物，其中V为叶酸，T-Q为-Asp-Arg-Asp-Cys-OH，M为-SCH2CH2O(C＝O)-，A为-CH2CH2-，K为O，以及R6为氢或甲基。
本发明的实施方案
本发明的一个实施方案提供一种方法，其包括：
(a)使具有式(C’)的化合物与卤化试剂反应：
Figure GPA00001008498900201
其中
R1为氢，或R1与Z1形成键；
Z1为羟基或氰基，或Z1与R1一起形成键，或Z1为ORp；
Z2为羟基或ORp；其中Rp为保护基；
R2、R3和R5独立为氢、烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基；或R2和R3可与它们连接的碳一起形成任选取代的环烷基；
R4为氢、烷基、烯基、炔基、取代的烷基、芳基或取代的芳基；
R6为氢或烷基；
R12为H、烷基、取代的烷基或卤素；以及
R13为芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基；
(b)得到具有式(B.1’)和(B.2’)的化合物：
Figure GPA00001008498900211
其中Y为卤素，以及R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R12、R13、Z1和Z2如前面所述；以及
(c)对式(B.1’)和(B.2’)化合物进行环氧化物环闭合，得到式(A.1’)和(A.2’)化合物，其中以高收率得到式(A.1’)化合物：
Figure GPA00001008498900212
在本文每种可选择的方法中，R1优选为氢。
在本文每种可选择的方法中，Z1和Z2优选为羟基，并且反应在没有任何保护基但Z1和Z2选自ORp的情况下进行；Rp优选为选自如下的保护基：烷基、取代的烷基(例如烷氧基烷基、芳基氧基烷基)、烷氧基羰基和-Si(Rf)3，其中Rf各自独立选自烷基和芳基；甚至更优选的保护基为甲硅烷基保护基，例如三乙基甲硅烷基(TES)、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基和三异丙基甲硅烷基，更优选为TES。
在本文每种可选择的方法中，R2、R3和R5优选独立为氢或低级烷基，更优选为甲基。
在本文每种可选择的方法中，R4优选为氢、烷基、烯基或炔基，更优选为低级烷基、低级烯基或低级炔基，更优选为甲基。
在本文每种可选择的方法中，R6优选为氢或烷基，更优选为氢或甲基。
在本文每种可选择的方法中，R12优选为H、低级烷基或卤素，更优选为卤素或甲基，最优选为甲基。
在本文每种可选择的方法中，R13优选为任选经取代的5或6元杂芳基，更优选为任选经取代的噻唑基、任选经取代的吡啶基或任选经取代的噁唑基，以及最优选为2-甲基噻唑-4-基。
可选择上述优选选项中的任意一个或上述优选选项中的任意组合以用在本文所描述的出现这些基团的任意一种方法中。
本发明的方法可用于制备如在美国专利6,800,653、美国专利6,399,638B1和/或与本发明同时提交的美国中请11/753,785(US 2007/0276018A1，公开于2007年11月29日，并要求2006年5月25日提交的美国临时申请60/808,366的优先权)中所描述的氮杂环丙基-埃坡霉素化合物，将这三篇专利和申请并入本文作为参考。
根据一个实施方案，本发明的方法用于制备具有式H的化合物(特别是具有立体专一性形式的式H’化合物)(包括其药用盐和/或溶剂化物)：
其中
R40为芳基、经取代的芳基、杂环基、经取代的杂环基、环烷基、经取代的环烷基或基团H-K1-A1-；
K1不存在，或K1为-O-、-S-或-NR7-；
A1为-(CR8R9)r-(CH2)s-Z，其中Z为-(CHR10)-、-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-、-OC(＝O)-、-N(R11)C(＝O)-、-SO2-或-N(R11)SO2-；
B1为羟基或氰基，以及R1为氢，或B1和R1一起形成双键；
R2、R3和R5独立为氢、烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基；或R2和R3可与它们连接的碳一起形成任选取代的环烷基；
R4为氢、烷基、取代的烷基、烯基、炔基、芳基或取代的芳基；
R6为氢、烷基或取代的烷基；
R7、R8、R9、R10和R11独立为氢、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂环烷基、取代的杂环烷基、杂芳基或取代的杂芳基；
R12为H、烷基、取代的烷基或卤素；
R13为芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基；以及
r和s各自独立选自0至6。
本领域技术人员会从上述基团中进行选择以得到稳定的化合物和部分，例如当K1为-O-或-S-以及Z为-C(＝O)-C(＝O)-、-N(R11)C(＝O)-、-SO2-或-N(R11)SO2-时，r和s都优选不是零，而当K1为-NR7-以及Z为-C(＝O)-C(＝O)-时，r和s都优选不是零，诸如此类情况。
在另一个实施方案中，本发明的方法用于制备具有式X的化合物，更具体用于制备具有立体专一性式X’的化合物：
Figure GPA00001008498900231
其中各种基团如上所述来选择，并且K为K1，A为A1，或更优选地，其中K为-O-；A为C2-4亚烷基；B1为-OH；以及剩余基团R2、R3、R4、R5、R6、R12和R13选自针对这些基团的优选选项例如以上就“在本文每种可选择的方法中”而描述的优选选项(包括这些优选选项的任意组合)。
另一个实施方案提供制备具有式Xa或Xa’的化合物的方法：
Figure GPA00001008498900232
其中K为-O-、-S-或-NR7-(更优选为O)；A为C2-4亚烷基；R6为氢或甲基；R12为H、烷基、经取代的烷基或卤素(更优选为甲基)；以及R13为芳基、经取代的芳基、杂芳基或经取代的杂芳基(更优选选自任选经取代的噻唑基和以上就R13而言的其它优选选项)。
本发明的方法也可用于制备具有式Xb或Xb’的化合物(包括其药用盐和/或溶剂化物)：
Figure GPA00001008498900241
其中R6为氢或甲基(更优选为氢)。
本发明的另一个实施方案包括本文描述的任意方法在制备式X、Xa、Xa’、Xb和/或Xb’化合物(其中基团K、A、B1、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13可如本文其它地方所描述的那样进行选择)中的用途，所述化合物用于制备在患者中治疗癌症的药物组合物，特别用于制备含有接合化合物(conjugated compound)的药物组合物，所述接合化合物用于对过度表达或优先表达叶酸受体的肿瘤进行靶向药物递送。
本文中的示范性实施方案或优选实施方案意在说明而非限制。
例如，鉴于上述实施方案的组合，本发明的其它实施方案对于本领域技术人员而言是显而易见的，且本发明的其它实施方案包括在本发明的范围内。
实用性
本发明的方法可用于制备可用作微管稳定剂的埃坡霉素化合物和类似物，因此用本发明的方法制备的化合物可用于治疗癌症和其它增殖性疾病。例如，根据本发明制备的具有式G和H的化合物具有微管稳定作用，参见Regueiro-Ren et al.，Organic Letters，3：2693-2696(2001)和与本发明同时提交并转让给本受让人的美国专利申请11/753,785，所述美国专利申请的题目为“Azirdinyl-Epothilone Compounds”(US 2007/0276018A1，公开于2007年11月29日，并要求2006年5月25日提交的美国临时申请60/808,366的优先权)。
可用根据本发明的方法制备的化合物治疗的疾病包括但不限于如下这些疾病：
-癌，包括以上所列出的那些癌及/或膀胱癌、胰腺癌、胃癌、甲状腺癌及前列腺癌；
-淋巴系统的造血组织肿瘤，包括白血病，诸如急性淋巴细胞白血病及急性淋巴母细胞白血病；及淋巴瘤，诸如B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤及伯基特(Burkitt)淋巴瘤；
-骨髓系统的造血组织肿瘤，包括急性及慢性骨髓性白血病及前髓细胞白血病；
-中枢及外周神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤及神经鞘瘤；
-间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤及骨肉瘤；及
-其它肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病、精原细胞瘤、角化棘皮瘤、甲状腺滤泡癌及畸胎癌。
此外，根据本发明制备的化合物可用在制备得到叶酸接合物的化合物中，所述叶酸接合物用于将所述化合物递送至以表达叶酸受体的癌细胞或肿瘤为特征的那些癌症。本文使用的术语“叶酸受体相关病症”包括以叶酸受体表达为特征的疾病或紊乱，或换言之，本文使用的术语“叶酸受体相关病症”包括可基于与正常组织相比在患病组织中叶酸受体的表达水平来诊断或治疗的那些疾病或紊乱。本发明的方法用于制备一些化合物，所述化合物特别可用于形成接合物(特别是叶酸接合物)。
叶酸受体是在一些癌细胞中过度表达或优先表达的蛋白质之一。DNA的合成需要叶酸，并且已知一些人类肿瘤细胞过度表达叶酸结合蛋白。例如，Campbell et al.，“Folate Binding Protein is a Marker for Ovarian Cancer，”Cancer Research，51：5329-5338(Oct.1，1991)和Coney et al.，“Cloning of aTumor-Associated Antigen：MOv18 and MOv19 Antibodies RecognizeFolate-binding Protein，”Cancer Research，51：6125-6131(Nov.15，1991)都报道了叶酸结合蛋白是卵巢癌的标志物。作为非限制性实例，叶酸受体相关癌症包括卵巢癌、皮肤癌、乳癌、肺癌、结肠癌、鼻癌、咽喉癌、乳腺癌、肝癌、肾癌、脾癌、脑癌、间皮瘤(mesothelioma)、垂体腺瘤(pituitary adenoma)、子宫颈癌、肾细胞癌或其它肾癌、脉络丛癌(choroid plexus carcinoma)及上皮肿瘤(参见Asok，A.，“Folate Receptors：Reflections on a Personal Odysseyand a Perspective on Unfolding Truth，”Advanced Drug Delivery Reviews，56：1059-1066(2004))。就皮肤癌、肾癌、乳癌、肺癌、结肠癌、鼻癌、咽喉癌、乳腺癌和脑癌以及本文提到的其它癌症而言，叶酸受体的过度表达是已知的。
使用本发明的方法制备的化合物可用于形成如下式I接合化合物：
Figure GPA00001008498900261
其中
V为叶酸或其类似物或衍生物；
Q为O、S或NR7；
M为可释放的连接基团；
K为O、S或NR7a；
A为-(CR8R9)-(CH2)m-Z-，其中Z为-(CHR10)-、-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-、-OC(＝O)-、-N(R11)C(＝O)-、-SO2-或-N(R11)SO2-；
B1为羟基或氰基，以及R1为氢，或B1和R1一起形成双键；
R2、R3和R5独立为氢、烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基；或R2和R3可与它们连接的碳一起形成任选取代的环烷基；
R4为氢、烷基、烯基、取代的烷基、取代的烯基、芳基或取代的芳基；
R6为氢、烷基或取代的烷基；
R7a、R7、R8、R9、R10和R11独立为氢、烷基、经取代的烷基、环烷基、经取代的环烷基、芳基、经取代的芳基、杂环烷基、经取代的杂环烷基、杂芳基或经取代的杂芳基；
R12为H、烷基、经取代的烷基或卤素；
R13为芳基、经取代的芳基、杂芳基或经取代的杂芳基；
m为0至6；
T具有下式：
Figure GPA00001008498900262
其中
R14在每次出现时独立为氢、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、芳基烷基、经取代的芳基烷基、环烷基、经取代的环烷基、环烷基烷基、经取代的环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、经取代的杂芳基烷基、经取代的杂芳基、杂环烷基或经取代的杂环烷基；
Q为1至10；以及
R15、R16和R17独立为氢、烷基、经取代的烷基或环烷基。
作为另一个非限制性实例，本发明可用于制备具有上述式I的接合化合物，其中V为具有下式的叶酸受体结合部分：
Figure GPA00001008498900271
其中W和X独立为CH或氮；R20为氢、氨基或低级烷基；R21为氢或低级烷基，或R21与R23形成环烷基；R22为氢、低级烷基、低级烯基或低级炔基；以及R23为氢，或R23与R21形成环烷基；或更优选地，其中V为：
Figure GPA00001008498900272
根据另一个实施方案，本发明的方法可用于制备具有如下式Ib的接合化合物：
Figure GPA00001008498900273
其中V为叶酸受体结合部分(更优选地，其中V如以上刚刚所定义的那样)；Q为O、S或NR7；M为具有下式的可释放的连接基团：
Figure GPA00001008498900274
Figure GPA00001008498900281
或
Figure GPA00001008498900282
更优选为
Figure GPA00001008498900283
R14在每次出现时独立为氢、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基、芳基烷基、经取代的芳基烷基、环烷基、经取代的环烷基、环烷基烷基、经取代的环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、经取代的杂芳基烷基、经取代的杂芳基、杂环烷基或经取代的杂环烷基，以及优选为选自如下的基团：H、甲基、胍基丙基、-(CH2)1-2-CO2H、-CH2-SH、-CH2-OH、咪唑基(甲基)、氨基丁基和-CH(OH)-CH3，以及更优选为被-C(＝O)-OH或-NH-C(＝NH)-NH2之一取代的C1-C3烷基；q为1-10，优选为1-5(更优选为1-3)；R6为氢或甲基；R15、R16和R17独立为氢、低级烷基或取代的低级烷基；以及R18、R19、R31、R32、R33、R24、R25、R26、R27、R28和R29各自独立为H、低级烷基、经取代的低级烷基、环烷基或经取代的环烷基，或R18和R19、R31和R32、R19和R31、R33和R24、R25和R26、R24和R25或R27和R28中的任意一对可一起形成环烷基。
本发明的方法特别可用于制备一些可用于形成用于靶向药物递送的接合化合物的氮杂环丙基类似物，所述接合化合物为例如具有下式的接合化合物：
Figure GPA00001008498900284
其中R6为氢或甲基。就本文所列的能够插入到本文所述通式化合物中的任意二价基团而言，所述插入应该由左至右进行。例如，在如下A被定义为-(CR8R9)-(CH2)m-Z-的情况下，所述亚甲基与K连接，以及Z基团与氮杂环丙基环中的氮连接，其如下所示：
Figure GPA00001008498900291
用本发明的方法制备的药物组合物亦可与因其在与上述病症相关的给药治疗中特别有用而选择的其它治疗剂配制在一起或组合给药。举例而言，所述药物组合物可与诸如抗呕剂以及H1及H2抗组胺剂那样的预防恶心、超敏反应及胃刺激的药物配制在一起。
本发明的一个实施方案包括本发明的方法在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途特别是在制备用于对过度表达或优先表达叶酸受体的肿瘤进行靶向药物递送的药物组合物中的用途。本发明的药物组合物可通过任何合适的方法(例如非经肠给药，其诸如通过皮下、静脉内、肌肉内或胸骨内注射或输注技术(例如以无菌可注射水性或非水性溶液或无菌可注射水性或非水性悬浮液的形式)来进行)和/或以含有无毒药用媒介物或稀释剂的剂量单位制剂来给药，用于本文所述用途中的任何一种。例如，所述药物组合物可例如以适于立即释放或延迟释放的形式来给药。立即释放或延迟释放可如下实现：使用包含本发明化合物的合适药物组合物，或尤其在延迟释放的情况下，使用诸如皮下植入物或渗透泵那样的装置。
用于非经肠给药的示范性组合物包括可注射的溶液或可注射的悬浮液，其可含有例如合适的无毒的非经肠可接受的稀释剂或溶剂，诸如甘露醇、1，3-丁二醇、水、林格溶液(Ringer’s solution)、等张氯化钠溶液(0.9％氯化钠注射液[生理盐水]或5％右旋糖注射液)，或可含有其它合适的分散剂或湿润剂及助悬剂，其包括合成的甘油一酯或甘油二酯及脂肪酸。对使用本发明的方法制备的化合物进行给药的药用组合物及/或方法可包括使用共溶剂，所述共溶剂包括但不限于乙醇、N，N-二甲基乙酰胺、丙二醇、甘油及聚乙二醇(例如聚乙二醇300及/或聚乙二醇400)；对使用本发明的方法制备的化合物进行给药的药用组合物及/或方法可包括使用表面活性剂(可通过减小化合物的表面张力而用于增强其分散性质或湿润性质的药用表面活性剂)，所述表面活性剂包括但不限于
Figure GPA00001008498900292
聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、泊洛沙姆(poloxamer)、诸如N-烷基吡咯烷酮(例如N-甲基吡咯烷酮)及/或聚乙烯基吡咯烷酮那样的吡咯烷酮；对使用本发明的方法制备的化合物进行给药的药用组合物及/或方法亦可包括使用一种或多种“缓冲剂”(例如在加入增量的酸或碱后能够抵抗介质有效酸度或碱度变化的成份)，所述缓冲剂包括但不限于磷酸钠、柠檬酸钠、二乙醇胺、三乙醇胺、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-丙氨酸、甘氨酸、碳酸钠、氨丁三醇(a/k/a三[羟基甲基]氨基甲烷或Tris)及/或它们的混合物。
用本发明的方法制备的化合物的有效量可由本领域技术人员来确定，且包括约0.01-10mg活性化合物/kg体重的示范性成人日剂量，其可按单一剂量的形式给药或按分份剂量的形式(诸如每天1至4次)给药。优选的范围包括约0.02至5mg/kg体重的剂量，而约0.05-0.3mg/kg体重的范围是最优选的。应该理解的是，用于任何特定受试者的具体剂量水平及给药频率可发生变化且取决于多种因素，这些因素包括所使用的特定化合物的活性、所述化合物的代谢稳定性及作用持续时间、受试者的物种、年龄、体重、一般健康情况、性别及饮食、给药模式及时间、排泄速率、药物组合及具体病症的严重程度。接受治疗的优选受试者包括患有与微管稳定性相关的病症的动物，最优选为哺乳动物物种，诸如人类及家畜(诸如狗、猫等)。
缩写
为了便于参考，在本文的方案及实施例中使用以下缩写：
CBZ-OSu＝N-(苄基氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺
DCM＝二氯甲烷
DEA＝二乙胺
DIAD＝偶氮二羧酸二异丙酯
DIPEA＝二异丙基乙基胺
DMA＝二甲胺
DMF＝二甲基甲酰胺
DMSO＝二甲基亚砜
EDC＝1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
EtOH＝乙醇
EtOAc＝乙酸乙酯
FR＝叶酸受体
HOBt＝N-羟基苯并三唑
HPCL＝高效液相色谱
iPr-OH或IPA＝异丙醇
LC/MS＝液相色谱/质谱
LDA＝二异丙基氨基锂
MeOH＝甲醇
OTES＝O-三乙基甲硅烷基
OMs＝甲磺酸酯基团
Ph＝苯基
Pd/C＝钯/碳
PyBOP＝苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鎓六氟磷酸盐
Py＝吡啶基
RT＝室温
Sat’d＝饱和的
THF＝四氢呋喃
TFA＝三氟乙酸
TLC＝薄层色谱
TESCL＝三乙基氯甲硅烷
UV＝紫外线
现通过以下示范性的实施例来进一步描述本发明。
实施例
实施例1
(i)制备[4S，7R，8S，9S，13R，14R，16S]-4，8，13-三羟基-14-碘-5，5，7，9-四甲基-16-[(E)-1-[2-甲基噻唑-4-基]丙-1-烯-2-基]氧杂环十六烷-2，6-二酮
Figure GPA00001008498900311
将埃坡霉素C(54.3g，113.7mmol)溶解在乙腈(480mL)和水(50mL)中。将溶液冷却至-5℃至-10℃。向反应混合物中加入碘(144.3g，568.4mmol)，并将反应保持至少15小时。
用15％焦亚硫酸钠溶液(900mL)将反应淬灭。混合物用乙酸乙酯(2×1.1L)萃取。收集有机相，用饱和碳酸氢钠溶液(675mL)和饱和氯化钠溶液(675mL)顺序洗涤。减压蒸发溶剂，得到粗制化合物A，其为黄色油状物(85.6g)。所述化合物不经进一步纯化即用于下一反应。
HPLC：Phenomex Luna C8(2)3μm，4.6×150mm，等梯度，18分钟36％B，17分钟56％B，(流动相A＝0.01M NH4OAc/ACN∶水(5∶95)，流动相B＝0.01MNH4OAc/ACN∶水(95∶5))，流速为1.0ml/min，UV 245，Rt＝22.4分钟。
(ii)制备[1R，3S，7S，10R，11S，12S，16S]-7，11-二羟基-8，8，10，12-四甲基-3-[(E)-1-[2-甲基噻唑-4-基]丙-1-烯-2-基]-4，17-二氧杂二环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮
Figure GPA00001008498900321
将[4S，7R，8S，10R，9S，13R，16S]-4，8，13-三羟基-14-碘-5，5，7，9-四甲基-16-[(E)-1-[2-甲基噻唑-4-基]丙-1-烯-2-基]氧杂环十六烷-2，6-二酮(85.6g)溶解在乙腈(670mL)和水(130mL)中。向溶液中加入三乙胺(135mL，968.5mmol)。将反应混合物加热至50℃至60℃且保持至少8小时。
将其冷却至室温后，减压浓缩溶液。残余物用EtOAc(1.2L)稀释，并用饱和氯化钠溶液(3×500mL)洗涤。减压蒸发溶剂，得到粗制产物，其为黄色油状物。通过硅胶垫过滤来纯化(硅胶700g，66％EtOAc/庚烷(2×4L和1×3L))，得到化合物B，其为泡沫状物(50.3g，90％收率)，其中HPLC AP(HPLC分析纯度)为80。HPLC：Phenomex Luna C8(2)3μm，4.6×150mm，等梯度，18分钟36％B，17分钟56％B，(流动相A＝0.01M NH4OAc/ACN∶水(5∶95)，流动相B＝0.01M NH4OAc/ACN∶水(95∶5))，流速为1.0ml/min，UV 245，Rt＝15.0分钟。
实施例2
(i)制备(4S，7R，8S，9S，13R，14R，16S)-13-叠氮基-4，8，14-三羟基-5，5，7，9-四甲基-16-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)氧杂环十六烷-2，6-二酮和(4S，7R，8S，9S，13S，14S，16S)-14-叠氮基-4，8，13-三羟基-5，5，7，9-四甲基-16-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)氧杂环十六烷-2，6-二酮
Figure GPA00001008498900331
向搅拌的表-埃坡霉素A(14.35g，29.07mmol)于乙醇(240mL)和水(48mL)中的溶液中加入叠氮化钠(11.45g，174.41mmol)和氯化铵(3.14g，58.14mmol)。将混合物在60℃搅拌17-20小时。在旋转蒸发仪上在低于50℃的温度减压蒸发挥发物。将残余物溶解在乙酸乙酯(287mL)和水(50mL)的混合物中。分离各相，下层水相用乙酸乙酯(115mL)萃取。合并的有机相用25％氯化钠水溶液(盐水)洗涤。减压蒸发溶剂，使残余物通过硅胶垫(用乙酸乙酯/正庚烷(2∶1)的混合物洗脱)。减压蒸发溶剂，得到叠氮基-醇的区域异构体混合物(即比例为～6∶1的(4S，7R，8S，9S，13R，14R，16S)-13-叠氮基-4，8，14-三羟基-5，5，7，9-四甲基-16-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)氧杂环十六烷-2，6-二酮和(4S，7R，8S，9S，13S，14S，16S)-14-叠氮基-4，8，13-三羟基-5，5，7，9-四甲基-16-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)氧杂环十六烷-2，6-二酮)(12.8g，82％)，其为白色泡沫状物。
LC-MS：Phenomenex Luna C8(2)柱：3μm，4.6×50mm。梯度：15分钟，其中历时10分钟从0％B至100％B，然后在100％B保持5分钟。流动相A＝0.01M NH4OAc/CH3CN/H2O 5∶95；B＝0.01M NH4OAc/CH3CN/H2O 95∶5。流速：3.0mL/min。波长：UV 250nm。保留时间＝5.52分钟。
MS(ESI)(M+H)+＝537.69。
该反应也可在如上所述的其它溶剂中进行，例如使用丙酮、乙腈、四氢呋喃、2-丙醇、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和N-甲基-吡咯烷酮。
可使用如上所述的其它叠氮供体试剂，其包括叠氮化四丁基铵试剂。
(ii)制备(1S，3S，7S，10R，11S，12S，16R)-7，11-二羟基-8，8，10，12-四甲基-3-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)-4-氧杂-17-氮杂二环(14.1.0)十七烷-5，9-二酮
Figure GPA00001008498900332
在氮气气氛下向搅拌的(4S，7R，8S，9S，13R，14R，16S)-13-叠氮基-4，8，14-三羟基-5，5，7，9-四甲基-16-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)氧杂环十六烷-2，6-二酮和(4S，7R，8S，9S，13S，14S，16S)-14-叠氮基-4，8，13-三羟基-5，5，7，9-四甲基-16-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)氧杂环十六烷-2，6-二酮混合物(12.8g，23.85mmol)于无水乙腈(90mL)中的溶液中加入三苯基膦(9.48g，35.77mmol)。将透明溶液在20-40℃搅拌19-40小时。将反应混合物冷却至0-5℃且保持3-4小时，过滤产物。滤饼用庚烷(64mL)洗涤，在40℃减压干燥15-18小时，得到(1S，3S，7S，10R，11S，12S，16R)-7，11-二羟基-8，8，10，12-四甲基-3-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)-4-氧杂-17-氮杂二环(14.1.0)十七烷-5，9-二酮，其为白色固体(5.41g，46％)。
LC-MS：Phenomenex Luna C8(2)柱：3μm，4.6×50mm。梯度：15分钟，其中历时10分钟从0％B至100％B，然后在100％B保持5分钟。流动相A＝0.01M NH4OAc/CH3CN/H2O 5∶95；B＝0.01M NH4OAc/CH3CN/H2O 95∶5。流速：3.0mL/min。波长：UV 250nm。保留时间＝4.43分钟。
MS(ESI)(M+H)+＝493.68。
该反应也可用其它膦如三环己基膦、三甲基膦、三丁基膦和三(4-甲氧基苯基)膦和另一种溶剂即四氢呋喃来进行。
实施例3
制备[1S-[1R*，3R*(E)，7R*，10S*，11R*，12R*，16S*]]-7，11-二羟基-17-[2-羟基乙基]-8，8，10，12-四甲基-3-[1-甲基-2-(2-甲基噻唑-4-基)乙烯基]-4-氧杂-17-氮杂二环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮
Figure GPA00001008498900341
将Et3N(三乙胺)(4.95mL，35.52mmol)和2-溴乙醇(3.02mL，42.62mmol)加到(1S，3S，7S，10R，11S，12S，16R)-7，11-二羟基-8，8，10，12-四甲基-3-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)-4-氧杂-17-氮杂二环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮(3.50g，7.10mmol)于乙腈(35mL)中的溶液中，加热至72.5℃。20小时后，将反应混合物冷却至室温，通过旋转真空蒸馏浓缩至干。将粗品溶解在乙酸乙酯(50mL)中，并与去离子水(35mL)混合。混合物用乙酸乙酯(3×35mL)萃取，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩，在乙腈(35mL)中结晶，用乙腈(2×5mL)洗涤，并在真空烘箱中在45.5℃干燥过夜，分离到(1S，3S，7S，10R，11S，12S，16R)-7，11-二羟基-17-(2-羟基乙基)-8，8，10，12-四甲基-3-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)-4-氧杂-17-氮杂二环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮，其为白色结晶粉末(2.60g，HPLC AP为97.1，68.2％收率)。
LC-MS：Phenomenex C8，3μm，4.6×150mm，梯度：历时10分钟从10％B至50％B，以及在20分钟时停止。(A＝5％MeCN/H2O+0.01M NH4OAc；B＝95％MeOH/H2O+0.01M NH4OAc)，流速为1.0mL/min，UV 254nm。保留时间＝9.43分钟。MS(ESI)M+H＝537.21。
实施例4
制备[1S-[1R*，3R*(E)，7R*，10S*，11R*，12R*，16S*]]-7，11-二羟基-17-[2-羟基乙基]-8，8，10，12-四甲基-3-[1-甲基-2-(2-甲基噻唑-4-基)乙烯基]-4-氧杂-17-氮杂二环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮
将K2CO3(1.4g，10.2mmol)和2-溴乙醇(0.52mL，7.3mmol)加到[1S-[1R*，3R*(E)，7R*，10S*，11R*，12R*，16S*]]-8，8，10，12-四甲基-3-[1-甲基-2-(2-甲基噻唑-4-基)乙烯基]-7，11-二[(三乙基甲硅烷基)氧基]-4-氧杂-17-氮杂二环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮(1.05g，1.46mmol)于乙腈(20mL)中的溶液中，加热至82℃。4小时后，加入额外的2-溴乙醇(0.52mL，7.3mmol)和K2CO3(1.4g，10.2mmol)。5小时后，加入额外的2-溴乙醇(0.21mL，2.92mmol)。3小时后，将反应混合物冷却至室温，过滤通过硅藻土，用乙腈(5×5mL)和二氯甲烷(2×5mL)洗涤，浓缩并不经进一步纯化即用于下一步骤。
将粗制反应产物溶解在二氯甲烷(40mL)中，冷却至0℃，加入三氟乙酸(8.0mL)。1小时后，浓缩反应混合物，吸收在饱和NaHCO3(200mL)中，用二氯甲烷(3×100mL)萃取，用Na2SO4干燥，浓缩并通过硅胶色谱(10％甲醇/二氯甲烷)纯化，分离到[1S-[1R*，3R*(E)，7R*，10S*，11R*，12R*，16S*]]-7，11-二羟基-17-[2-羟基乙基]-8，8，10，12-四甲基-3-[1-甲基-2-(2-甲基噻唑-4-基)乙烯基]-4-氧杂-17-氮杂二环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮(化合物G)，其为透明膜状物(0.62g，两步收率为79％)。
LC-MS：Waters Sunfire C18，4.6×50mm，梯度：历时4分钟从0％B至100％B。(A＝10％MeOH/H2O+0.1％TFA；B＝90％MeOH/H2O+0.1％TFA)，流速为4.0mL/min，UV 220nm。保留时间＝2.12分钟。MS(ESI)M+H＝537.52。
实施例5
制备(S)-2-(4-((2-氨基-4-氧代-3，4-二氢蝶啶-6-基)甲基氨基)苯甲酰氨基)-5-((S)-3-羧基-1-((S)-1-((S)-3-羧基-1-((R)-1-羧基-2-(2-(2-((2-((1S，3S，7S，10R，11S，12S，16R)-7，11-二羟基-8，8，10，12-四甲基-3-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)-5，9-二氧代-4-氧杂-17-氮杂-二环[14.1.0]十七烷-17-基)乙氧基)羰基氧基)乙基)二硫基)乙基氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基)-5-胍基-1-氧代戊烷-2-基氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基)-5-氧代戊酸
(i)制备(S)-2-(4-((2-氨基-4-氧代-3，4-二氢蝶啶-6-基)甲基氨基)苯甲酰氨基)-5-((S)-3-羧基-1-((S)-1-((S)-3-羧基-1-((S)-1-羧基-2-巯基乙基氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基)-5-胍基-1-氧代戊烷-2-基氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基)-5-氧代戊酸
Figure GPA00001008498900362
(S)-2-(4-((2-氨基-4-氧代-3，4-二氢蝶啶-6-基)甲基氨基)苯甲酰氨基)-5-((S)-3-羧基-1-((S)-1-((S)-3-羧基-1-((S)-1-羧基-2-巯基乙基氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基)-5-胍基-1-氧代戊烷-2-基氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基)-5-氧代戊酸通过固相肽合成由H-Cys(4-甲氧基三苯甲基)-2-氯三苯甲基-树脂开始以5步来合成。表1显示了合成中所使用的试剂量。
表1
  mmol   当量   MW   量
  H-Cys(4-甲氧基三苯甲基)-2-氯三苯甲基-树脂(载量为0.57mmol/g)   1.14   2.0g
  Fmoc-Asp(OtBu)-OH(溶解于15mL DMF中)   1.14   2   411.5   0.938g
  Fmoc-Arg(Pbf)-OH(15mL DMF)   1.14   2   648   1.477g
  Fmoc-Asp(OtBu)-OH(溶解于15mL DMF中)   1.14   2   411.5   0.938g
  Fmoc-Glu-OtBu(15mL DMF)   1.14   2   425.5   0.970g
  mmol   当量   MW   量
  N10TFA喋酸(溶解于15mL DMSO中)   1.14   1.25   408   0.581g
  DIPEA   1.14   4   174   0.793g
  PyBOP   1.14   2   520   1.185g
使用如下操作：
偶联步骤：
在肽合成容器中将氨基酸溶液、DIPEA及PyBOP加到树脂中。对混合物进行鼓泡1小时，且用DMF及异丙醇洗涤3次。FMOC脱保护在各氨基酸偶联前通过用20％哌啶的DMF溶液处理2次(10min)而实现。对于各氨基酸偶联步骤，重复上述操作。
合成N10经TFA保护的喋酸：
在配备有加热套的22L机械搅拌的圆底烧瓶中将200g(0.453mol)叶酸加到10L 0.1M三羟甲基氨基甲烷(tris base)溶液(121.1g三羟甲基氨基甲烷在10L水中的溶液)中。搅拌混合物，溶解叶酸，且接着加入500mg(3.67mmol)氯化锌。加入羧肽酶G(13×20单位小瓶(unit vial)(得自Sigma))且用1N HCl将pH调至7.3，且在整个反应期间保持此pH。使混合物避光，且在30℃加热8-10天(使用自动滴定器来保持pH恒定，这使转化时间减少4-5天)。反应混合物通过分析型HPLC来监测，直至转化率达到80％(更大的转化率是期望的但还没有对其进行优化)。通过使用6N HCl将溶液的pH调至3.0而使产物从反应混合物中沉淀出来。将浆液转移至离心小瓶中且以4000rpm离心10分钟。倾出上清液。湿固体接着如下直接纯化(可将湿固体冷冻贮存或首先冻干，然而湿固体在溶解前贮存于冷冻器中是更有效的)。将1.0MNaOH加到40g粗制喋酸在700mL水中的溶液中直至pH为11.5。将混合物过滤(Whatman 1型)且接着进行色谱纯化(色谱柱：10×120cm；固定相：8kgDEAE纤维素；流动相：1.0M NaCl/0.01M NaOH，pH＝11.5；流速：17ml/min)。收集1升黄色馏分且通过HPLC对其进行分析。用6M HCl将含有纯喋酸的馏分调至pH为3，从而使喋酸沉淀出来。使混合物以3000rpm离心20分钟。倾出上清液，且用水洗涤三次。将固体冻干至少72小时。残余的水对下一反应的影响是未知的。
在高真空下经P2O5使喋酸进一步干燥24小时以上(注意：在保护步骤中在没有此另外干燥步骤的情况下得到了类似的结果)。随后将100g(0.32mol)喋酸加到配备有机械搅拌器及氩气入口的5L圆底烧瓶中，且在高真空下贮存过夜。加入氩气，接着加入3500g(2316mL)三氟乙酸酐。用橡胶塞或氩气入口转接器密封烧瓶，且接着剧烈搅拌。使烧瓶避光且在室温及氩气气氛下搅拌7天(反应混合物通过对用水及DMSO各稀释20倍的等分试样进行HPLC来监测)。将混合物旋转蒸发至干燥且用2.5L 3％三氟乙酸在水中的溶液处理。将混合物在室温搅拌过夜，使酸酐副产物水解。旋转蒸发，得到干燥固体。将固体悬浮于2L水中，且接着在250mL离心管中以3000rpm离心20分钟。除去上清液，且用水洗涤固体，并离心(4次)。将固体冻干3天，转移至琥珀色瓶中，且在高真空下在P2O5的存在下干燥2天(纯度≥95％；通过元素分析来评估残余的TFA)。
裂解步骤：
使用由92.5％(50mL)TFA、2.5％(1.34mL)H2O、2.5％(1.34mL)三异丙基甲硅烷及2.5％(1.34mL)乙二硫醇制备的裂解试剂将受保护的中间体从树脂上释放。将裂解试剂加到反应容器(25mL)中。历时1.5小时使氩气鼓泡经过混合物。将液体从容器中抽出，且用剩余的试剂(3×8mL)洗涤树脂。通过旋转蒸发使挥发物浓缩至体积为10mL。加入乙醚(35.0mL)，从而实现沉淀。固体通过离心来收集，且干燥，得到1.25g裂解产物。
脱保护步骤：
在碱性条件下除去喋酸部分中的N10-三氟乙酰基保护基。以250mg经保护的中间体在10mL水中的溶液开始，使用4∶1 H2O∶氢氧化铵(1-2mL)将pH调至9.3且维持1小时。1小时后，用1N HCl(约1mL)将pH调至5，且通过制备型HPLC纯化产物，得到125mg化合物H。
HPLC纯化条件：
色谱柱：Waters NovaPak C18 300×19mm
溶剂A：10mM乙酸铵缓冲液(pH＝5)
溶剂B：乙腈
洗脱：以15mL/min的流速历时40min从1％B至20％B
各反应的总产量：625mg
(ii)制备碳酸[2-((1S，3S，7S，10R，11S，12S，16R)-7，11-二羟基-8，8，10，12-四甲基-3-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)-5，9-二氧代-4-氧杂-17-氮杂-二环[14.1.0]十七烷-17-基)乙基]酯·[2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙基]酯
Figure GPA00001008498900391
A.制备2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙醇
Figure GPA00001008498900392
将巯基乙醇(7.6mL，110mmol)逐滴加到冷却至0℃的甲氧基羰基硫基氯(10mL，110mmol)在二氯甲烷(100mL)中的溶液中。将反应混合物在0℃搅拌30分钟。此时加入2-巯基吡啶(12.2g，110mmol)在二氯甲烷(160mL)中的溶液。使溶液在0℃反应1小时，且接着使其温热至室温并保持1小时。观察到固体产物从溶液中沉降下来。TLC(1∶1石油醚/EtOAc)显示已形成足够多的产物。将反应混合物浓缩至体积为125mL。经由布氏漏斗过滤混合物。用二氯甲烷洗涤滤饼且接着在真空下干燥过夜，得到呈盐酸盐形式的2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙醇(23.6g)。
TLC：Rf＝0.45
板：EMD硅胶60F254，5×10cm，250M
B.制备碳酸[苯并[d][1，2，3]三唑-1-基]酯·[2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙基]酯(化合物I)
Figure GPA00001008498900393
在圆底烧瓶中将双光气(2.28g，11.5mmol)在15mL无水二氯甲烷中的溶液在氩气下搅拌且通过冰/盐浴冷却。将装有2-(吡啶-2-基二硫基)乙醇(5.01g，22.4mmol)和三乙胺(2.25g，22.2mmol)在65mL无水二氯甲烷中的混合物的加料漏斗置于圆底烧瓶上。经20分钟逐滴加入混合物。使反应混合物温热至室温，且再搅拌一小时。对反应混合物进行的TLC分析显示起始原料被消耗，且形成“条纹状的(streaking)”极性较小的氯甲酸酯产物。TLC(6∶4EtOAc∶己烷)：起始原料的RF为0.4；氯甲酸酯产物的RF为0.8。
在圆底烧瓶中将反应混合物在氩气下搅拌且通过冰/盐浴冷却。将HOBt(3.02g，22.4mmol)和三乙胺(2.23g，22.0mmol)在10mL无水二氯甲烷中的混合物加到固定于圆底烧瓶上的滴液漏斗中。将混合物缓慢加到圆底烧瓶中，同时维持反应混合物温度为2℃。使反应混合物温热至室温，且搅拌过夜。接着在大气压力下将约27mL二氯甲烷从反应混合物中蒸馏出来。随后使混合物冷却至室温且搅拌2小时。固体通过过滤来收集，且用20mL二氯甲烷洗涤滤饼。接着通过旋转蒸发器在40℃和真空下干燥固体，得到7.81g灰白色固体。通过1H-NMR对此产物进行分析且确定为所要的产物。
C.制备碳酸[2-((1S，3S，7S，10R，11S，12S，16R)-7，11-二羟基-8，8，10，12-四甲基-3-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)-5，9-二氧代-4-氧杂-17-氮杂-二环[14.1.0]十七烷-17-基)乙基]酯·[2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙基]酯
Figure GPA00001008498900401
在0℃向[1S-[1R*，3R*(E)，7R*，10S*，11R*，12R*，16S*]]-7，11-二羟基-17-[2-羟基乙基]-8，8，10，12-四甲基-3-[1-甲基-2-(2-甲基噻唑-4-基)乙烯基]-4-氧杂-17-氮杂二环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮在无水二氯甲烷中的溶液中先后加入DMAP(1.2当量)及碳酸[苯并[d][1，2，3]三唑-1-基]酯·[2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙基]酯(1.0当量)。将反应混合物在0℃和氩气下搅拌且通过TLC每10分钟监测1次。按需要加入另外的DMAP(1.2当量)及化合物I(2)(1.0当量)直至所有化合物G被消耗。在0℃用MeOH(1mL)将反应淬灭，真空除去溶剂，且残余物通过色谱(硅胶，2.5-5％MeOH/DCM)来纯化，得到标题化合物，其为米色固体。在下表2中列出了化合物的量及回收率。由2.95g化合物G得到的总产量为2.80g(67.9％)化合物I。
表2
化合物G(mg) 化合物I(2)(mg) DMAP(mg) DCM(mL)   化合物I(mg)
  第1批   303   197×3   82.8×3   8.0   204
  第2批   952   683×3   260×3   22.0   984
  第3批   921   661×3   251×3   22.0   761
  第4批   775   556×3   211×3   18.0   851
*各色谱纯化通常得到纯的产物以及有些不纯的产物(纯度为80-90％)。将不纯的产物与来自下一批的粗产物合并，用于色谱纯化。就第2批及第4批而言，进行两次色谱纯化。
(iii)制备(S)-2-(4-((2-氨基-4-氧代-3，4-二氢蝶啶-6-基)甲基氨基)苯甲酰氨基)-5-((S)-3-羧基-1-((S)-1-((S)-3-羧基-1-((R)-1-羧基-2-(2-(2-((2-((1S，3S，7S，10R，11S，12S，16R)-7，11-二羟基-8，8，10，12-四甲基-3-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)-5，9-二氧代-4-氧杂-17-氮杂-二环[14.1.0]十七烷-17-基)乙氧基)羰基氧基)乙基)二硫基)乙基氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基)-5-胍基-1-氧代戊烷-2-基氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基)-5-氧代戊酸
Figure GPA00001008498900411
在50mL离心管中向15mL H2O(使用前用氩气鼓泡10分钟)中加入(S)-2-(4-((2-氨基-4-氧代-3，4-二氢蝶啶-6-基)甲基氨基)苯甲酰氨基)-5-((S)-3-羧基-1-((S)-1-((S)-3-羧基-1-((S)-1-羧基-2-巯基乙基氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基)-5-胍基-1-氧代戊烷-2-基氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基)-5-氧代戊酸(498mg，0.534mmol)中。向该悬浮液中逐滴加入饱和NaHCO3溶液(使用前用氩气鼓泡10分钟)直至所得溶液的pH达到6.9，同时用氩气鼓泡。快速加入碳酸[2-((1S，3S，7S，10R，11S，12S，16R)-7，11-二羟基-8，8，10，12-四甲基-3-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)-5，9-二氧代-4-氧杂-17-氮杂-二环[14.1.0]十七烷-17-基)乙基]酯·[2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙基]酯(400mg，0.534mmol)在THF中的溶液，且将所得均质溶液在氩气下搅拌30分钟。在15分钟时通过分析型HPLC检查反应进程。在分析型HPLC条件下产物峰在约6.4分钟时出现。用约15mL磷酸盐缓冲液稀释混合物且在真空下将THF除去。对浑浊的溶液进行离心和过滤。将黄色滤液分为两份且通过制备型HPLC纯化。合并纯的馏分(纯度大于98％)且冻干。收集尾馏分(纯度小于98％)且每3-6轮色谱操作就重新纯化1次，得到700mg标题化合物，其为白色粉末(含有11.8重量％的水以及8.7重量％的钠盐及磷酸钠盐，其通过Karl Fischer法及元素分析来确定)。
制备型HPLC参数：
色谱柱：Waters Nova-Pak HR C18 6μm 30×300mm
流动相A：7.0mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.2)
流动相B：乙腈
方法：以40mL/min的流速历时30分钟从10％B至50％B
分析型HPLC参数：
色谱柱：Waters Symmetry C18 3.5μm 4.6×75mm
流动相A：10mM乙酸三乙基铵(TEAOAc)缓冲液(pH＝7.5)
流动相B：乙腈
方法：以1.0mL/min的流速历时10分钟从20％B至40％B
精确质量m/z(C67H92N16O22S3)：
计算值：1570.58907(M+2H)、785.29454(M+2H)2+、523.86563(M+3H)3+、393.15118(M+4H)4+。
实测值：(M+2H)2+为785.29100(4.5ppm)，(M+3H)3+为523.86431(2.5ppm)，(M+4H)4+为393.14996(3.1ppm)。

Claims (20)

1.制备具有式A.1的化合物的方法：
Figure FPA00001008498800011
其中
R1为氢，或R1与Z1形成键；
Z1为羟基或氰基，或Z1与R1一起形成键，或Z1为ORp；
Z2为羟基或ORp；其中每个Rp为保护基；
R2、R3和R5独立为氢、烷基、经取代的烷基、芳基或经取代的芳基；
或R2和R3任选与它们连接的碳一起形成任选经取代的环烷基；
R4为氢、烷基、经取代的烷基、烯基、炔基、芳基或经取代的芳基；
R6为氢、烷基或经取代的烷基；
R12为H、烷基、经取代的烷基或卤素；以及
R13为芳基、经取代的芳基、杂芳基或经取代的杂芳基；
所述方法包括：
使具有式(C)的化合物与至少一种卤化剂反应：
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R12、R13、Z1和Z2如上所定义，
然后用碱处理，得到式A.1化合物，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R12、R13、Z1和Z2如上所定义。
2.权利要求1的方法，其中与至少一种卤化剂的反应提供具有式(B.1)和/或(B.2)的中间体卤代醇化合物：
Figure FPA00001008498800021
其中Y为卤素，以及R1、R2、R3、R4、R5、R6、R12、R13、Z1和Z2如权利要求1中所述；以及
用碱进行的处理实现环氧化物环闭合，得到式(A.1)和(A.2)化合物：
Figure FPA00001008498800022
其中与式(A.2)化合物相比，以高收率产生式(A.1)化合物。
3.权利要求1或2的方法，其中对式C化合物进行卤化的步骤在低温和在极性溶剂中进行。
4.权利要求3的方法，其中所述低温在约0℃至-15℃的范围内。
5.权利要求2的方法，其中用碱处理来实现环氧化物环闭合的步骤在不对式(B.1)和(B.2)化合物进行分离的情况下进行。
6.权利要求1的方法，其中用碱进行的处理在高温和在极性溶剂或极性/含水溶剂系统中进行。
7.权利要求6的方法，其中所述高温为约40℃至所述溶剂或溶剂系统的沸点。
8.权利要求1、2、3、4、5、6或7中任一项的方法，其中起始物质为具有下式的埃坡霉素C或D：
Figure FPA00001008498800031
9.权利要求8的方法，其中式A.1化合物为具有下式的表-埃坡霉素A或表-埃坡霉素B：
10.制备具有式G的化合物包括其药用盐和/或溶剂化合物的方法：
Figure FPA00001008498800033
其中
Z1、Z2、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R12和R13如权利要求1或9中所定义；
所述方法包括：
(i)按照权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9中任一项的方法制备具有式(A.1)的表-埃坡霉素中间体化合物：
其中基团Z1、Z2、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R12和R13如权利要求1或9中所定义；
(ii)在醇溶剂中用叠氮供体处理式(A.1)表-埃坡霉素中间体，得到式(E.1)和(E.2)叠氮基-醇：
Figure FPA00001008498800042
和
(iii)在极性溶剂中用叠氮还原剂处理步骤(ii)所提供的中间体化合物，得到式(G)化合物。
11.权利要求10的方法，其中在式(A.1)化合物中，基团Z1为氰基，或Z1与R1形成键，或Z1为基团ORp；以及Z2为基团ORp；并且其中来自步骤(ii)的式(E.1)和(E.2)化合物中的C12羟基、C13羟基在步骤(iii)用叠氮还原剂处理前首先被转化成离去基团，得到式(F.1)和(F.2)化合物：
Figure FPA00001008498800043
12.权利要求10的方法，其中步骤(i)中的表-埃坡霉素中间体是具有下式的表-埃坡霉素A、表-埃坡B、经保护的表-埃坡霉素A或经保护的表-埃坡霉素B：
Figure FPA00001008498800051
其中Z1为-ORp，并且Rp选自三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基和三异丙基甲硅烷基；
并且通过所述方法提供的式(G)化合物具有下式：
13.权利要求10、11或12的方法，其还包括将具有式(G)的化合物转化成具有式(H)或(H’)的氮杂环丙基-埃坡霉素化合物包括其药用盐和/或溶剂化物：
Figure FPA00001008498800053
其中
R40为芳基、经取代的芳基、杂环基、经取代的杂环基、环烷基、经取代的环烷基或基团H-K1-A1-；
K1不存在，或K1为-O-、-S-或-NR7-；
A1为-(CR8R9)r-(CH2)s-Z，其中Z为-(CHR10)-、-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-、-OC(＝O)-、-N(R11)C(＝O)-、-SO2-或-N(R11)SO2-；
B1为羟基或氰基，以及R1为氢，或B1和R1一起形成双键；
R2、R3和R5独立为氢、烷基、经取代的烷基、芳基或经取代的芳基；或R2和R3可与它们连接的碳一起形成任选经取代的环烷基；
R4为氢、烷基、经取代的烷基、烯基、炔基、芳基或经取代的芳基；
R6为氢、烷基或经取代的烷基；
R7、R8、R9、R10和R11独立为氢、烷基、经取代的烷基、环烷基、经取代的环烷基、芳基、经取代的芳基、杂环烷基、经取代的杂环烷基、杂芳基或经取代的杂芳基；
R12为H、烷基、经取代的烷基或卤素；
R13为芳基、经取代的芳基、杂芳基或经取代的杂芳基；和
r和s各自独立选自0至6。
14.权利要求13的方法，其中式H化合物具有下式：
Figure FPA00001008498800061
15.制备具有式H或H’的化合物的方法：
Figure FPA00001008498800062
其中R40、B1、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R12和R13如权利要求12中所定义，
所述方法包括在碱的存在下用卤化物试剂R40-Y处理具有式G或G’的化合物中的氮杂环丙烷环，其中Y为卤素，优选用过量的卤化物处理，
Figure FPA00001008498800063
16.权利要求15的方法，其中所述卤化物试剂为烷基卤化物，以及所述碱为叔胺或碳酸钾。
17.制备具有下式的化合物的方法：
Figure FPA00001008498800071
其中Z1和Z2为羟基或ORp；其中Rp为保护基，以及R6为氢或甲基，所述方法包括：
(i)提供具有下式的起始物质：
Figure FPA00001008498800072
其中Z1和Z2为羟基或ORp；和R6为氢或甲基；
(ii)用至少一种卤化剂处理步骤(i)中的起始物质，然后用碱处理，得到具有式A.3的化合物。
18.权利要求17的方法，其还包括将式A.3化合物转化成式G.1化合物：
Figure FPA00001008498800073
其中Z1和Z2为羟基或ORp；以及R6为氢或甲基，
所述方法包括在基本上无水的极性溶剂或无水的极性溶剂中用叠氮还原剂处理式A.3化合物。
19.权利要求18的方法，其还包括将式G.1化合物转化成具有下式的化合物：
Figure FPA00001008498800074
其中Z1和Z2为羟基或ORp；以及R6为氢或甲基，
所述方法包括用2-溴乙醇和碱处理权利要求18中的式G.1化合物；以及其中基团Rp选自烷基、经取代的烷基、烷氧基羰基和-Si(R41)3，其中R41彼此独立选自烷基和芳基。
20.使用权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19中任一项的方法制备的具有下式的化合物：
Figure FPA00001008498800081
其中Z1和Z2为羟基或ORp；和R6为氢或甲基。
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