CN101688234A

CN101688234A - 调节lrrk2的方法

Info

Publication number: CN101688234A
Application number: CN200880017563A
Authority: CN
Inventors: D·阿莱西
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 2007-04-05
Filing date: 2008-04-07
Publication date: 2010-03-31
Also published as: DK2132326T3; US20090142784A1; US7947468B2; WO2008122789A3; GB0706709D0; EP2132326A2; WO2008122789A2; CA2718580A1; JP2010523101A; EP2132326B1

Abstract

鉴定预期用于调节LRRK2蛋白激酶活性的化合物的方法，该方法包括下列步骤：(1)测定测试化合物是否调节LRRK2多肽在底物埃兹蛋白/根蛋白/膜突蛋白(ERM)家族多肽上的蛋白激酶活性，及(2)选择调节LRRK2多肽蛋白激酶活性的化合物。这样的化合物可以用于治疗帕金森病或帕金森综合症。鉴定了LRRK2催化活性片段，其需要GTPase、COR和激酶结构域以及WD_40样基序和C－末端尾。

Description

调节LRRK2的方法

方法

近期的发现已经引起很大的兴趣：在编码富含亮氨酸重复的蛋白激酶-2(LRRK2)的基因中的不同常染色体显性点突变使人类倾向于发生晚发的帕金森病(PD，OMIM登记号码609007)，其具有与原发性PD不能区分的临床征候[1-4]。截至目前进行的遗传分析显示，LRRK2中的突变是相对频繁的，不只占家族型PD的5-10％，还被发现占偶发PD病例的重要比例[5，6]。很少知道LRRK2是如何在细胞中被调节的，什么是其生理性底物，LRRK2中的突变是如何造成或增加PD风险。在哺乳动物中有2种LRRK蛋白激酶的亚型：LRRK1(2038残基)和LRRK2(2527残基)。它们属于也被称作Roco的蛋白家族[7]。迄今，LRRK2中的突变，而不是LRRK1中的突变，已经与PD联系上。

蛋白激酶的LRRK/Roco类最初在黏菌网柱菌slime mould Dictyosteliumdiscoideum中被鉴定为称作GbpC(cGMP结合蛋白C)的蛋白，其含有Ras/GTPase超家族的罕见成员，与其它小GTPase结构域不同，因为其具有包括蛋白激酶的其它结构域[7，8]。随后的研究提示，在网柱菌属中，GbpC调节趋化性(chemotaxis)和细胞极性[9]，但是该酶的生理性底物还未被阐明。LRRK/Roco-蛋白的定义(defining)特征是其具有富含亮氨酸重复(LRR)的基序、Ras-样小GTPase、高氨基酸保守区(被称为复合物的Ras的C-末端(COR)结构域(C-terminal Of Rasof complex(COR)domain)和蛋白激酶催化结构域[7，10]。LRRK2的蛋白激酶结构域属于酪氨酸样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶并且与Rho-相互作用蛋白激酶(RIPK)最相似，RIPK在先天的免疫信号通路中扮演重要角色[11]。在LRRK激酶的特异成员中还发现其它结构域。例如，GbpC具有另一个DEP、环GMP-结合和Ras-GEF结构域，其没有在哺乳动物LRRK1和LRRK2中发现。人类LRRK1具有在其N-末端的3个锚蛋白重复，而LRRK2缺少这些结构域，但是具有未在LRRK1中发现的定位于其C-末端的一个WD40重复[7]。

人类LRRK2包含富含亮氨酸重复(残基1010-1287)、小GTPase结构域(残基1335-1504)、COR结构域(残基1517-1843)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域(残基1875-2132)和与WD40重复有低相似性的基序(2231-2276)。迄今，～20单氨基酸置换性突变已经与常染色体显性PD联系起来，且已经发现这些突变是在小GTPase、COR、蛋白激酶和WD40结构域的保守残基当中或与它们很接近[3，4]。

占欧洲家族型PD的～6％和偶发性PD病例的3％的LRRK2最流行的突变形式包括在激酶结构域的亚结构域-VII中保守的DYG-Mg2+-结合基序内的Gly2019至丝氨酸残基的氨基酸置换[3]。近期的报告提示，该突变适中地增加了LRRK2的自磷酸化以及其磷酸化髓磷脂碱性蛋白的能力～2-3倍[12，13]。这些发现提示，LRRK2的过度活化使人类易发生PD，这意味着抑制LRRK2的药物可以用于延缓某些形式PD的发生或甚至治疗某些形式的PD。难以表达活性重组酶和缺少有力的定量分析阻碍了LRRK2的研究。

在本说明书中对在前公开的文件的列出或讨论不应必然地被认为是承认该文献是本领域的一部分或是公知常识。

我们已经研制了表达活性重组LRRK2的方法，并且将其用于激酶底物示踪和阐明(KinasE Substrate TRacking and ELucidation(KESTREL))筛选，所述筛选是近期开发出来的，用于帮助寻找蛋白激酶的生理性底物(在[14]中有综述)。这导致将膜突蛋白鉴定为潜在的生理性底物，其在被变性时在Thr558上被LRRK2有效地磷酸化，所述Thr558是以前鉴定的生理性相关磷酸化位点。我们已经应用这些发现开发LRRK2有力的和定量的分析(assay)。通过使用该方法，我们证明在PD患者中鉴定的几个LRRK2突变，或者不影响或者实际上抑制而不是活化LRRK2。

本发明的第一方面提供一种鉴定化合物的方法，该化合物预期在调节LRRK2蛋白激酶活性中有用，该方法包括下列步骤：(1)测定测试化合物是否调节LRRK2多肽在底物埃兹蛋白/根蛋白/膜突蛋白(Ezrin/Radixin/Moesin(ERM))家族多肽上的蛋白激酶活性，和(2)选择调节所述LRRK2多肽蛋白激酶活性的化合物。

在筛选方法中被调节/评估的LRRK2多肽的蛋白激酶活性是ERM家族多肽的磷酸化。ERM家族多肽的磷酸化可以用检测ERM家族多肽的磷酸化或调节而评估，如在下面和在实施例中进一步讨论的。例如，如本领域技术人员熟知的，对例如膜突蛋白的磷酸化(或非磷酸化)的磷酸化位点特异的抗体可以用于评估那个磷酸化位点的磷酸化。其他方法在本教导和评估蛋白磷酸化的许多已知方法的基础上对技术人员是明显的。

ERM家族多肽的磷酸化也可以通过评估ERM家族多肽结合肌动蛋白或结合细胞膜或膜成分例如PtdIns4，5P₂或膜相关(membrane-associated)多肽如L-选择蛋白、ICAM 123或CD44的能力来评估。例如已经报道膜突蛋白的FERM结构域与几个原生质膜蛋白[18，19]以及PtdIns4，5P₂相互作用。例如膜突蛋白的后30个残基被认为形成F-肌动蛋白(F-actin)结合位点[20，22]。评估这种结合的方法是本领域技术人员熟知的并且本文所引用的参考文献中也给出了范例，例如文献18、19、20、21、22、24和25。

ERM家族多肽的磷酸化或调节还可以在细胞中评估，例如通过评估细胞骨架参数评估。在一个实施例中，可以使用如在Nakamura等人(1995)J Biol Chem270(52)，31377-31385“Phosphorylation of Threonine 558 in the Carboxyl-terminalActin-binding Domain of Moesin by Thrombin Activation of Human Platelets”中公开的基于血小板的测定(assay)。已报道血小板含有膜突蛋白但不含其它家族成员根蛋白和埃兹蛋白。发现丝氨酸/苏氨酸激酶的非特异抑制剂(十字孢碱(staurosporine))和磷酸酶抑制剂对膜突蛋白磷酸化具有相反效果，但是发现它们都使血小板形成极长的丝状伪足并且不在玻璃上伸展。发现磷酸化的膜突蛋白在细胞中心与F-肌动蛋白集中在一起。因此，或者细胞的行为(例如细胞形状)或者膜突蛋白和/或肌动蛋白的定位可以用于(用合适的对照，如本领域的技术人员所公知的)评估(或进一步评估)测试化合物对LRRK2多肽蛋白激酶活性的效果。

本发明的另一个方面提供一种鉴定化合物的方法，该化合物预期在调节如抑制细胞中ERM家族多肽的磷酸化中有用，该方法包括下列步骤：(1)测定测试化合物是否调节，例如抑制，LRRK2多肽蛋白激酶活性，和(2)选择调节，例如抑制，LRRK2多肽蛋白激酶活性的化合物。

本发明的另一个方面提供一种鉴定化合物的方法，该化合物预期在治疗或预防帕金森病(PD)或帕金森综合症(或其它神经变性状况)中有用，该方法包括下列步骤：(1)测定测试化合物是否调节，例如抑制，ERM家族(例如膜突蛋白)多肽的磷酸化，和(2)选择调节，例如抑制，ERM家族(例如膜突蛋白)多肽的磷酸化的化合物。该方法可包括下列步骤：(1)测定测试化合物是否通过LRRK2多肽调节，例如抑制，ERM家族(例如膜突蛋白)多肽的磷酸化，和(2)选择通过LRRK2多肽调节，例如抑制，ERM家族(例如膜突蛋白)多肽的磷酸化的化合物。评估ERM家族多肽磷酸化的方法的范例在上面进行了讨论并包括使用如上所述的磷酸化特异抗体的方法。

在存在合适的如上所述的ERM家族多肽的磷酸供体时，LRRK2多肽的活性可以通过检测通过LRRK2多肽进行的磷酸化检测。上面指出了评估ERM家族多肽磷酸化的方法的范例。

蛋白激酶活性可以通过改变LRRK2多肽针对特定底物的V_max或K_m(或两者)而增加或减少。例如，活性可以通过增加V_max或降低K_m而增加。应理解的是，为了测定LRRK2多肽是否已经被活化或去活化，可不必测量V_max或K_m的值。

活性可测量为给定时间中被磷酸化的底物的量；因此，活性的变化可测量为给定时间中被磷酸化的底物量的变化(例如，在单一浓度下)。优选地，活性被适当地增加或降低至少2倍，优选地是5、10、15、20、25、30或50倍。

应理解的是，可能需要测定化合物对底物性质的影响，例如通过测量当暴露于化合物(1)在将底物暴露给LRRK2多肽之后，(2)在将底物暴露给LRRK2多肽之前和/或(3)没有将其暴露给LRRK2多肽时，底物的性质。

术语蛋白激酶活性的调节包括抑制或增加蛋白激酶的活性。

应理解的是，在本发明的方法中，其中多肽的磷酸化发生可能需要如本发明上述方面所述的合适的磷酸供体存在。合适的磷酸供体是本领域技术人员所知的并且包括ATP，例如如实施例中所述的ATP镁盐(MgATP)。

评估测试化合物对LRRK2多肽和ERM家族多肽结合的影响是有用的。评估多肽：多肽相互作用的方法是本领域技术人员公知的。

LRRK2和/或ERM家族多肽可以，例如自LRRK2和/或ERM家族多肽被天然表达的细胞中纯化，但是至少一个LRRK2和ERM家族的多肽被重组将是更便易的。

如上所述，术语ERM家族多肽是本领域技术人员熟知的。如上所述，ERM家族成员包括膜突蛋白、埃兹蛋白和根蛋白。Merlin是另一个ERM家族成员。在分析中使用的ERM家族多肽可以是重组体或非重组体。ERM家族多肽可以是，例如，细菌表达的或哺乳动物细胞表达的ERM家族多肽(例如实施例中所述的)。ERM家族多肽可以具有天然存在的ERM家族成员的氨基酸序列，例如天然存在的膜突蛋白、埃兹蛋白、根蛋白或merlin多肽的氨基酸序列，或可以是或含有融合多肽(例如实施例1中所述的)，或可以是天然存在的ERM家族成员的片段或变体，所述片段或变体保留了被LRRK2多肽，例如如实施例1中所述的LRRK2[1326-2527]或LRRK2[1326-2527，G2019S]磷酸化或活化的能力。因此，优选地，ERM家族多肽是在对应于全长的野生型人类膜突蛋白的苏氨酸558位置上保留苏氨酸(或丝氨酸)残基的ERM家族多肽。优选地，ERM家族多肽不是其中对应于Thr558的残基被非苏氨酸或丝氨酸的残基替代的突变体，例如Thr558由丙氨酸替代。ERM家族多肽可以是在对应于全长野生型人类膜突蛋白的苏氨酸526位置上保留了苏氨酸(或丝氨酸)残基的ERM家族多肽。ERM家族多肽不应是其中Thr526由非苏氨酸或丝氨酸的残基替代的突变体，例如Thr526由丙氨酸替代。可源自ERM家族多肽，例如膜突蛋白、根蛋白或埃兹蛋白的片段是用于筛选方法的合适底物，所述片段包括对应于膜突蛋白的Thr558残基的残基和包括该残基的周围序列的至少一部分，例如该残基C-末端和N-末端的至少2、3、4、5、6或7个残基。可源自ERM家族多肽，例如膜突蛋白、根蛋白或埃兹蛋白的片段可以是用于筛选方法的合适底物，所述片段包括对应于膜突蛋白的Thr526残基的残基和包括该残基的序列的至少一部分，例如该残基C-末端和/或N-末端的至少2、3、4、5、6或7个残基。多肽可以具有，例如包括该残基的至少8或9个残基，例如具有该残基N-末端的5至6个残基和该残基C-末端的2或3个残基。

如实施例和附图中显示的，LRRK2磷酸化在埃兹蛋白、根蛋白、膜突蛋白和merlin上等同的残基并且例如在筛选分析中，这些中的任一个可以用作LRRK2的底物。所有的都被相似地磷酸化并且据认为，不论使用哪个，都不会有显著的差别。

可源自膜突蛋白、根蛋白或埃兹蛋白并且包括对应于膜突蛋白Thr558残基的合适底物是RLGRDKYKTLRQIRQ或RLGRDKYKTLRQIRQGNTKQR。对应于膜突蛋白Thr558的残基加了下划线。

ERM家族多肽可以是包含氨基酸序列RLGRDKYK(T/S)LRQIRQ或RLGRDKYK(T/S)LRQIRQGNTKQR的在100、80、60、50、40、30、25、20、19、18、17或16个氨基酸残基以下的多肽，每个可没有或具有除了T/S残基的高达1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个保守或非保守残基的置换。ERM家族多肽还可以是含有来自这一序列的至少7、8、9、或10个氨基酸的在16个氨基酸残基以下的多肽，该序列包括可没有或具有除了T/S残基的高达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守或非保守的残基的置换。该多肽序列一般源自天然存在的ERM家族多肽的序列，例如膜突蛋白、根蛋白或埃兹蛋白，例如人类模突蛋白、根蛋白或埃兹蛋白，可选择地具有保守或非保守残基置换(例如多达10、20、30、40、50或60％的残基)。

图19和20中展示的数据也显示了在等同于Thr558的Thr残基周围的个体残基的相对重要性。最重要的残基似乎是Tyr556(-2位置)并且还注意到在+2位置上的碱性残基的显著偏好。因此，在一个具体实施方式中，在相对于T/S残基-2的位置上，多肽具有苏氨酸氨基和/或在相对于T/S残基的+2位置上具有碱性残基(例如精氨酸或赖氨酸)。

较长序列RLGRDKYK(T/S)LRQIRQGNTKQR(称作长-LRRKtide)被认为允许使用相对于较短序列RLGRDKYK(T/S)LRQIRQ(短LRRKtide)低5-10倍的肽量。但是在较短和较长肽序列中的核心识别基序是同样的。

可能需要将ERM多肽变性(例如如果其含有FERM结构域(例如人类膜突蛋白的残基1-298)和C-末端尾区(C-ERMAD结构域，例如人类膜突蛋白的残基489-575))以便其被LRRK2多肽在体外磷酸化，如在实施例1中所述。因此，可能渴望的是ERM多肽不包括功能性FERM结构域。

在NCBI数据库中ERM家族多肽的登录号的范例包括：

AAB02864，M86450(猪膜突蛋白)

AAA39728，M86390.1，NP_034963，NM_010833.2(家鼠膜突蛋白)

NP_002435，NM_002444.2(人类膜突蛋白)

NP_110490，NM_030863.1(挪威大鼠膜突蛋白)

NP_001039942，NM_001046477.1(牛膜突蛋白)

NP_062230，NM_019357.1(挪威大鼠埃兹蛋白)

CAA43086，X60671.1(家鼠埃兹蛋白)

P15311(人类埃兹蛋白)

NP_002897，NM_002906.3(人类根蛋白)

NP_033067，NM_009041(家鼠根蛋白)

NP_001005889，NM_001005889.2(挪威大鼠根蛋白)

NP_001009576，NM_001009576.1(猪根蛋白)

P35240(人类merlin)

P46662(家鼠merlin)

Q63648(挪威大鼠merlin)

如本领域技术人员熟知的，哺乳动物和非哺乳动物ERM家族多肽序列的大量其他范例可以在可从NCBI Medline^TM服务中进入的序列数据库中获得。

如上所述，术语LRRK2是本领域技术人员熟知的。用于分析的LRRK2多肽可以是重组体或非重组体。LRRK2多肽可以是，例如，细菌表达或哺乳动物细胞表达的LRRK2多肽(例如实施例中所述的)。与底物多肽例如ERM家族多肽并排表达LRRK2多肽可是恰当的。LRRK2多肽可以具有天然存在LRRK2的氨基酸序列，或可以是或包含融合多肽(例如实施例1中所述的)，或可以是保留了磷酸化ERM家族多肽或髓磷脂碱性蛋白能力的天然存在LRRK2的片段或变体，如在实施例1中所述，例如保留了在对应于全长人类膜突蛋白Thr558(或Thr 526)的残基的位置上磷酸化(变性的，如实施例1中所述的)膜突蛋白或其片段的能力的。因此LRRK2多肽是保留了活性激酶结构域的LRRK2多肽。还认为，为了是催化活性的，LRRK2多肽保留了对应于GTPase结构域、COR结构域、WD40样基序和C-末端尾的区域，如实施例1中所述。LRRK2多肽可不含有在全长LRRK2中存在的富含亮氨酸重复(LRR)基序。如实施例1中所述，LRRK2多肽可以含有或由野生型人类LRRK2的残基1326-2527，或这样片段的GST融合体组成。含有完整激酶结构域和上述其它结构域，但不包含其他LRRK2区域(例如富含亮氨酸重复(LRR)基序)的LRRK2的片段可以是有用的；LRRK2的这个区域足以保留蛋白激酶活性，但是比全长LRRK2短并且更易于以活性形式表达。用于分析的LRRK2多肽不是激酶-死亡突变体，如实施例中所述的(例如LRRK2，其中等同于全长人类LRRK2残基D2017的残基被突变至，例如丙氨酸)。

因此，LRRK2多肽可以是野生型人类LRRK2或其片段，或其二者之一的融合体。该片段可以至少含有野生型人类LRRK2的残基1326-2527。据认为，C-末端的截短可以不利地影响截短的LRRK2多肽的蛋白激酶活性，同时在片段N-末端的截短可被更好的忍受。因此截短的LRRK2多肽的N-末端可以选择性地在残基1326之后，例如在残基1326和大约残基1336之间。

LRRK2多肽可以是具有野生型人类LRRK2的天然存在突变的人类LRRK2，或其片段，或其二者之一的融合体。该片段可以至少含有具有天然存在的突变的人类LRRK2的残基1326-2527。

人类LRRK2的天然存在的突变可以是与帕金森病(PD)相关的突变。通过使用野生型人类LRRK2编号，该突变可以是G2019S。认为该突变增强LRRK2蛋白激酶活性，如实施例1中进一步所述的。

该突变通过使用野生型人类LRRK2的编号而言，可以选择性地是R1441C、R1441G、Y1699C、R1914H、I2012T、I2020T或G2385R。认为具有突变R1441C、R1441G、Y1699C或T2356I的LRRK2与野生型LRRK2具有相似的蛋白激酶活性。认为具有突变R1914H或I2012T的LRRK2是几乎无活性的。认为具有突变I2020T的LRRK2具有在野生型LRRK2和具有突变R1914H或I2012T的LRRK2中间的活性。还认为具有突变G2385R的LRRK2是几乎无活性的。其他突变体的活性在图17中显示。

测试对抗(against)多于一个LRRK2多肽的化合物是有帮助的；例如对抗多于一个的突变LRRK2多肽。这有助于决定需要设计和测试的其他化合物。

如实施例1中所述，LRRK2多肽可以是GST融合多肽。例如，LRRK2多肽可以是GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]。或者如本领域技术人员所熟知的，还可以使用其他融合部分。

特别优选地，尽管不必要，就在全长人类膜突蛋白残基Thr558或Thr526上的磷酸化；或含有这样残基的肽底物(例如上述的；例如RLGRDKYKTLRQIRQ或RLGRDKYKTLRQIRQGNTKQR)的磷酸化而言，LRRK2多肽具有全长人类LRRK2至少30％的酶活性。如上所述，就在全长人类膜突蛋白残基Thr558或Thr526上的磷酸化；或含有这样残基的肽底物的磷酸化而言，如果LRRK2多肽具有全长人类LRRK2的至少50％，优选地至少70％和更优选地至少90％的酶活性是更优选的。

在NCBI数据库中哺乳动物LRRK2序列的登录号包括：

AAV63975.1人类

XP_001168494.1黑猩猩属(Pan troglodytes)，(黑猩猩(chimpanzee))

XP_615760.3牛(Bos Taurus)(家牛(domestic cow))

XP_543734.2家犬(Canis familiaris)(犬)

NP_080006.2小鼠(Mus musculus)(小鼠(mouse))

XP_235581.4大鼠(Rattus norvegicus)(大鼠(rat))

如本领域技术人员熟知的，哺乳动物和非哺乳动物LRRK2多肽序列的大量其他范例可以在从NCBI Medline^TM服务可获得的序列数据库中获得。

术语多肽的“变体”包括保守性或非保守性的插入、删除和置换。特别地，其包括多肽的变体，其中，如适当的话(as appropriate)，这样的改变本质上不改变蛋白激酶活性或被磷酸化的能力。基于例如，比较每个多肽(例如来自不同物种的)的范例的序列，技术人员能容易地设计和测试合适的变体。技术人员能容易地测定哪里可以产生插入或删除；或哪个残基可以恰当地保持不变；被保守置换所替代，或被非保守置换所替代。例如在实施例1中所述地，可以容易地测试变体多肽，。

术语“保守性置换”是指组合如Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；和Phe、Tyr。

除了上述定义的符号Zaa，本文使用了IUPAC-IUB生物化学命名委员会的3字母或单字母氨基酸代码。特别地，Xaa代表任何氨基酸。优选地，至少对应于本文中定义的共有序列(consensus sequence)的氨基酸是L-氨基酸。

特别优选地，多肽变体具有与相关人类多肽氨基酸序列至少65％同一性的氨基酸序列，更优选地，与相关人类多肽的氨基酸序列具有至少70％、71％、72％、73％或74％，更优选地，至少75％，更优选地，至少80％，更优选地，至少85％，更优选地，至少90％，并且最优选地，至少95％或97％同一性的氨基酸序列。

更优选地，蛋白激酶变体具有与人类多肽的催化结构域的氨基酸序列至少65％同一性的氨基酸序列，更优选地，与相关人类氨基酸序列具有至少70％、71％、72％、73％或74％，更优选地，至少75％，更优选地至少80％，更优选地，至少83％或85％，更优选地，至少90％，并且最优选地，至少95％或97％同一性的氨基酸序列。

应理解的是，例如通过使用如下述的序列比较，本领域技术人员可以容易地鉴定蛋白激酶-相关多肽的催化结构域。蛋白激酶显示保守的催化核心，如Johnson等人(1996)Cell，85，149-158和Taylor和Radzio-Andzelm(1994)Structure 2，345-355中综述的。该核心折叠成大多含有反向平行的β-折叠片的小N-末端裂片(lobe)和大多是α-螺旋的C-末端裂片。

两个多肽之间的百分比序列同一性可以用适当的计算机程序确定，例如威斯康星大学遗传计算组的GAP程序，并且应理解的是，百分比同一性是关于多肽计算的，该多肽的序列已经被优化地比对。

比对可以选择性地使用Clustal W程序进行(Thompson等人.，1994)。使用的参数可以如下：

快速配对比对参数：K-元组(tuple)(字)大小；1，窗口大小；5，空位罚分；3，顶端对角线的数量；5。得分方法：x百分比。

多重比对参数：空位开放罚分；10，空位延伸罚分；0.05。

得分阵距：BLOSUM。

如在实施例1中所述，比对可以选择性地使用程序T-Coffee[19]或EMBOSS[20]进行。

对应(等同)于例如全长人类膜突蛋白Thr 558的残基可以通过比对多肽序列和全长人类膜突蛋白的序列，以使序列间最大化匹配的方式鉴定。可以通过目测和/或通过使用适当的计算机程序实现比对，例如使用威斯康星大学遗传计算组的GAP程序，该程序还允许计算多肽的百分比同一性。比对程序(Pearson(1994)in：Methods in Molecular Biology，Computer Analysis of Sequence Data，Part II(Griffin，AM and Griffin，HG eds)pp 365-389，Humana Press，Clifton)。因此，以该方式鉴定的残基也是“对应残基”。

应理解的是，在(例如)膜突蛋白的截短形式的情况下或在发生简单的氨基酸残基替换的形式下，鉴定“对应残基”是容易的。

优选地，筛选中使用的多肽是哺乳动物的，优选地，人类的(或在农业中有用的物种或作为家养或伴侣动物的物种，例如犬、猫、马、牛)，包括天然存在的等位基因变体(包括剪接变体)。筛选中使用的多肽可以包括GST部分或可以是生物素化的或其他标记的，例如具有6His、HA、myc或其他表位标记，如本领域技术人员知道的，或如实施例1中所述的。这可以在纯化和/或检测多肽中是有用的。

在不同浓度的化合物存在下，例如在缺少和存在该化合物下，例如在约100μM、30μM、10μM、3μM、1μM、0.1μM、0.01μM和/或0.001μM的浓度下，化合物的效果可以通过比较底物多肽被LRRK2多肽磷酸化的速率或程度测定。

通过本发明的方法鉴定的化合物可以调节LRRK2多肽磷酸化不同底物，例如膜突蛋白、根蛋白或埃兹蛋白或肽底物RLGRDKYKTLRQIRQ或RLGRDKYKTLRQIRQGNTKQR至不同程度的能力。因此，优选地，但不是必要的，当筛选用于调节膜突蛋白活性的化合物时，该膜突蛋白或其片段用作底物。相似地，优选地，但不是必要地，当筛选用于调节根蛋白活性的化合物时，该根蛋白或其片段用作底物。肽底物RLGRDKYKTLRQIRQ存在于每个膜突蛋白、根蛋白和埃兹蛋白中。

该方法在鉴定化合物中有用，该化合物例如通过LRRK2调节，例如抑制，LRRK2的蛋白激酶活性，或ERM家族多肽的磷酸化。通过LRRK2调节，例如抑制LRRK2蛋白激酶活性或ERM家族多肽磷酸化的化合物可用于治疗帕金森病(例如原发性帕金森病或迟发性帕金森病)或帕金森综合症。

调节，例如抑制ERM家族多肽，例如膜突蛋白磷酸化的化合物，可以用于其它神经变性状况。

化合物可以是结合在LRRK2多肽和ERM家族多肽之间接触区域或结合靠近该接触区域的一种化合物，或可以是结合到其它区域并且例如诱导稳定(或去稳定)复合物构象或变构变化的一种化合物，或促进(或抑制)复合物形成的一种化合物。化合物可以结合到LRRK2多肽或ERM多肽，以通过变构效应增加LRRK2多肽蛋白激酶的活性。变构效应可以是涉及LRRK2多肽活性天然调节的变构效应。

方法中鉴定的化合物本身可用作药物或其可以代表用于设计和合成更有效化合物的前导化合物。

化合物可以是药物样化合物或为每个上述鉴定化合物的方法开发药物样化合物的前导化合物。应理解的是，所述方法在开发药物化合物或药物中可作为筛选分析方法，如本领域技术人员熟知的。

术语“药物样化合物”在本领域技术人员中是熟知的，并且可以包括具有使其适用于药物中，例如作为药剂的活性成分的特征的化合物的意思。因此，例如，药物样化合物可以是通过有机化学技术，不太优选的是通过分子生物或生物化学技术合成的分子，并且优选的是小分子，其可以在5000道尔顿以下。药物样化合物另外可以显示与特定蛋白或蛋白选择性相互作用的特征并且是生物可利用的和/或能够穿透细胞膜，但是应理解的是，这些特征不是必要的。

相似地，术语“前导化合物”是本领域技术人员熟知的，且可以包括的意思是化合物，而其本身不适合作为药物(例如因为其对其预期的目标只有弱的效力，其作用是非选择性的，不稳定，难以合成或具有不良的生物利用率)可以提供设计有更多所需特征的其它化合物的起始点。

应理解的是，想要的是鉴定在体内可以调节蛋白激酶活性的化合物。因此，应理解的是，可以选择用于方法的试剂和条件，以使得在例如LRRK2多肽和ERM家族多肽，例如膜突蛋白、根蛋白或埃兹蛋白多肽之间的相互作用基本上与人类LRRK2和人类ERM家族多肽，例如膜突蛋白、根蛋白或埃兹蛋白多肽之间的相互作用相同。应理解的是，化合物可以结合到LRRK2多肽，或可以结合到ERM家族多肽。

在所述分析或其它分析中的筛选方法中测试的化合物，可以是(但不必必须是)使用分子建模(modelling)技术，例如使用计算机技术选择的和/或设计(包括修饰)的化合物，在所述其它分析中，可以检测化合物调节蛋白激酶例如LRRK2多肽的蛋白激酶活性的能力。可以合成(如果尚未被合成)所选或设计的化合物并测试所选或设计的化合物对LRRK2多肽的效果，例如其对蛋白激酶活性的效果。可以在本发明的筛选方法中测试该化合物。

测试的化合物可以是已经被认为可能能够调节蛋白激酶活性的化合物；或可以是基于可能调节蛋白激酶活性而尚未被选出的化合物。因此，测试的化合物可以是形成至少部分总的、未选择的化合物库的化合物；或可以选择性地是形成至少部分预选择的化合物库的化合物，所述预选择的化合物库是例如基于被认为可能调节蛋白激酶活性而预选择的化合物库。

应理解的是，能够高通量操作的筛选分析将是特别优选的。例如，通过使用基于一个膜突蛋白磷酸化位点的底物多肽，例如提供使用结合到肽的磷酸化形式但不是非磷酸化形式(或反之亦然)的抗体的分析可以是适合的。范例可以包括基于细胞的分析和蛋白-蛋白结合分析。另一个范例是如本领域技术人员熟知的基于SPA(闪烁亲近分析(Scintillation Proximity Assay)；Amersham International)的系统。例如，可以制备含有闪烁体和底物多肽，例如上述的ERM家族肽底物的珠子。珠子可以与含有³²P-或³³P-γ-标记的ATP、LRRK2多肽的样品混合，以及与测试化合物混合。方便地，这在96孔板中完成。然后使用合适的闪烁计数器，使用已知的³²P或³³P SPA分析的参数计数该板子。只检测与闪烁体接近的³²P或³³P，即只有那些结合到与珠子结合的底物的³²P或³³P。也可以使用这种分析的变体，例如其中通过结合抗体或抗体片段将底物多肽固定在闪烁体珠子上的变体。高通量蛋白激酶活性分析是本领域技术人员熟知的，并且考虑到本文提供的通过LRRK2多肽磷酸化ERM多肽的信息，能被容易地改造。

筛选方法可以进一步包括评估在整个细胞、组织或有机体中，化合物是否调节ERM家族多肽，例如膜突蛋白，磷酸化(或其它参数，例如肌动蛋白结合或膜成分结合或细胞特征，如上所述)的步骤；和选择调节磷酸化(或其它参数)的化合物的步骤。如上所讨论的，化合物可以在整个细胞、组织或具有与帕金森病关联的LRRK2突变的；或过表达LRRK2的有机体中测试。化合物可以例如在神经元细胞系中测试。因此，在神经元细胞系中可以评估化合物对ERM家族多肽，例如膜突蛋白磷酸化的效果。

如本领域技术人员公知的，可能需要的是评估化合物对于其他蛋白激酶有什么效果。例如，可能需要的是评估化合物对于其他蛋白激酶底物，例如RockII底物的磷酸化的效果，以便区分LRRK2和ROCK抑制剂。例如，在例如图20和22所显示和其中图例所述的，LRRK2和RockII的底物偏好性是不同的。作为一个例子，LRRK2不磷酸化MYPT，而RockII磷酸化MYPT。

表1.rho相关激酶(Rock)的已知底物。根据Kang等人(Biochimie 89.p.39-472007)改编的表显示了已知Rock底物的磷酸化位点。Merlin是埃兹蛋白、根蛋白、膜突蛋白(ERM)相关蛋白，其具有与膜突蛋白T558相似的但是退化(degenerate)的位点。

筛选方法仍可以进一步包括评估化合物是否在整个细胞、组织或有机体中调节LRRK2活性的步骤，和选择调节所选活性的化合物的步骤。

可在例如在下列链接中找到PD模型、生物标记和评估技术的信息，其中/以其为背景(against which)，通过使用本文所述的筛选方法，可进一步测试鉴定的化合物是适当的，且其中该链接是本领域技术人员可得到的信息代表。

http://www.ninds.nih.gov/about_ninds/plans/nihparkinsons_agenda.htm#Models

http://www.sciencedaily.com/releases/2006/07/060729134653.htm(具有线粒体失调的小鼠模型)

http://www.sciencedaily.com/releases/2004/10/041005074846.htm(胚胎干细胞模型)

http://en.wikipedia.org/wiki/Parkinson′s_disease

PD动物模型包括6-羟多巴胺处理的啮齿动物和MPTP处理的灵长动物。两者都基于多巴胺能脑细胞的毒性破坏(和某些其它类型)，并且经常使用年轻的不然则是健康的动物。因为这些模型再现了帕金森病的某些关键特征，认为其对于测试新出现的新型治疗是有用的。

还可以将化合物用于其它测试，例如毒理或代谢测试，如本领域技术人员熟知的。

本发明的筛选方法可以包括合成、纯化和/或配制所选化合物的步骤。

本发明还提供制备化合物的方法，该化合物调节LRRK2活性或ERM家族多肽的磷酸化，该方法包括：1)进行本发明适当的筛选方法，2)合成、纯化和/或配制所选化合物。

可以配制化合物用于药学应用，例如用于在动物或人类中的体内试验。

本发明的另一个方面是通过本发明的筛选方法鉴定的化合物或可鉴定的化合物。

本发明的另一个方面是用于药物的本发明的化合物。本发明的另一个方面是用于治疗帕金森病(例如原发性帕金森病或迟发性帕金森病)或帕金森综合症的本发明的化合物。

化合物可以任何合适的方式给药，通常是胃肠外，例如由静脉、向腹膜内、皮下或肌内或膀胱内，在标准无菌无热原的稀释剂和载体配方中使用。化合物也可局部给药。化合物还可以局限性的方式给药，例如通过注射。治疗可以由一段时间内的单一剂量或多剂量组成。化合物可以在治疗患有帕金森病或帕金森综合症或有罹患帕金森病或帕金森综合症风险的患者中有用。

同时可能的是本发明的化合物是单独给药，优选的是将其作为药学配方，与一个或更多的可接受载体一起给出。该载体必须是“可接受的”，意思是与本发明的化合物是可以配伍的并且对其接受者不是有害的。通常，载体是无菌的和无热原的水或盐水。

因此，本发明还提供含有通过本发明的筛选方法鉴定的或可鉴定的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。

该组合物还可以包括其他化合物或与其他化合物一起给药，如果适当的话，所述化合物在治疗帕金森病或帕金森综合症或其它神经变性状况中有用。

本发明的另一个方面提供纯化的制备物或部分的试剂盒，其包括LRRK2多肽(例如如上所述)或多核苷酸(即编码LRRK2多肽的多核苷酸)和ERM家族多肽(例如如上所述)或多核苷酸(即编码ERM家族多肽的多核苷酸)。该制备物或试剂盒可以，例如包括重组LRRK2多核苷酸和重组ERM家族多核苷酸。作为另一个例子，该制备物或试剂盒可以选择性地包括LRRK2和可源自ERM家族多肽，例如膜突蛋白、根蛋白或埃兹蛋白的片段，其含有对应于膜突蛋白Thr558残基的残基和含有该残基的至少部分周围序列，例如该残基的C-末端和N-末端的至少2、3、4、5、6或7个残基；例如多肽RLGRDKYKTLRQIRQ或RLGRDKYKTLRQIRQGNTKQR；或在100、80、60、50、40、30、25、20、19、18、17或16个氨基酸以下的多肽，所述多肽含有氨基酸序列RLGRDKYK(T/S)LRQIRQ或RLGRDKYK(T/S)LRQIRQGNTKQR，每个没有或具有除了如上所述的T/S残基的多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守性或非保守性残基置换。

该制备物或试剂盒可以用在本发明的第一、第二或第三方面的分析中。

该试剂盒可以进一步包括特异性结合配偶体，通常是抗体，其以磷酸化状态敏感的方式结合到含有膜突蛋白(例如人类膜突蛋白)Thr558或Thr526的表位或另一种ERM多肽，例如根蛋白或埃兹蛋白的对应部分。术语“以磷酸化状态敏感的方式结合”是指，当在可磷酸化的部分上被磷酸化时，特异性结合配偶体能够结合到表位(或含有该表位的ERM家族多肽)，但是当其在该表位的可磷酸化部分上未被磷酸化时，不能结合到表位(或含有该表位的ERM家族多肽)。因此，优选地，特异性结合配偶体在对磷酸化和非磷酸化ERM家族多肽的亲和力具有至少5倍，优选地10、20、50、100、200、500、1000、2000或5000倍的差别。在实践中，使用本领域中的已知方法(见例如，WO 03/087400；例如使用磷酸化肽亲和柱和非磷酸化肽亲和柱亲和纯化的)制备和纯化的/所选的特异性结合配偶体预期具有所需的亲和力和结合特异性。

术语“抗体”包括合成抗体和保留了抗原结合位点的整个抗体的片段和变体(例如如上所述的)。抗体可以是单克隆抗体，但还可以是多克隆抗体制备物、其部分(例如F_ab片段或F(ab′)₂)或合成抗体或其部分。Fab、Fv、ScFv和dAb抗体片段都可以在大肠杆菌中表达和从大肠杆菌中分泌，因此允许容易地产生大量的所述片段。术语“ScFv分子”指其中V_H和V_L配偶体结构域通过易弯曲的寡肽连接的分子。IgG类抗体是优选的。

抗所选抗原的合适单克隆抗体可以通过已知技术，例如如上所述修改的那些在“Monoclonal Antibodies：A manual of techniques”，H.Zola(CRC Press，1988)和在“Monoclonal Hybridoma Antibodies：techniques and Applications”，JGR Hurrell(CRCPress，1982)中揭示的技术进行制备。双特异性抗体可以通过细胞融合、通过重新组合单价片段或通过完整抗体的化学交联制备。制备双特异性抗体的方法在Corvalen等人，(1987)Cancer Immunol.Immunother.24，127-132和133-137和138-143中揭示。

在Winter & Milstein(1991)Nature 349，293-299中可发现上述技术的总的综述，所述技术涉及合成保留其特异性结合位点的抗体片段。

术语“纯化的”指制备物已经从其形成时存在的其他成分，例如重组细胞的其他成分中至少部分地分离。可以使用的纯化方法的例子在实施例中有描述。

制备物可以基本上是纯的。术语“基本上纯”的意思是所述多肽基本上没有其它蛋白。因此，我们包括含有至少2、3、4、5、10、15、20或30重量％的蛋白含量的任何组合物作为所述多肽，优选的是至少50％，更优选的是至少70％，更优选的是至少90％和最优选的至少95％的蛋白含量是所述多肽。

因此，本发明还包括含有所述多肽和污染物的组合物，其中污染物占组合物96、95、94、90、85、80或70重量％以下，优选的是在组合物的50％以下，更优选的是在组合物的30％以下，更优选的是在组合物的10％以下和最优选的是在组合物的5％以下。

当与离体的其它成分结合时，本发明还包括基本上纯的所述多肽，所述其它成分不是在发现所述多肽的细胞中发现的所有成分。

本发明的另一个方面提供能够表达LRRK2多肽和ERM家族多肽的重组细胞。该细胞可以含有重组LRRK2多核苷酸和重组ERM家族多核苷酸。该细胞可以能够从编码所述多肽的内源序列过表达LRRK2多肽和/或ERM家族多肽，例如通过使用转录活化剂的序列特异性靶向技术。因此，可以以一种方式修饰该细胞，该方式预期导致相对于未被如此修饰的细胞而言增加的至少一个LRRK2多肽和ERM家族多肽的表达。该细胞可以是原核或真核细胞。例如，其可以是真核细胞，例如昆虫、酵母或哺乳动物细胞，例如人类细胞。适合的细胞的例子公开在例如实施例中。

重组核酸优选地适于表达编码的多肽。重组核酸可以是表达载体的形式。适于表达给定多肽的重组多核苷酸是本领域技术人员熟知的，例子在实施例1中有描述。

本发明的另一个方面提供含有LRRK2多肽和ERM家族多肽的重组细胞。该细胞可以含有重组LRRK2多肽和重组ERM家族多肽。该细胞可以是根据本发明在前方面的细胞。该细胞可以含有比等同细胞至少多1.1、1.2、1.5、2、3、5、10或20倍的LRRK2多肽(和/或ERM家族多肽)，所述等同细胞没有为了过表达LRRK2多肽或表达重组LRRK2多肽而被修饰。

术语“适于表达”的意思是多核苷酸是可以被翻译以形成多肽的多核苷酸，例如RNA，或是编码本发明多肽的多核苷酸(优选的是DNA)以合适的方向和正确的表达阅读框被插入表达载体，如质粒。该多核苷酸可以连接到被任何所需宿主所识别的恰当的转录和翻译调节控制核苷酸序列；这样的控制序列可以并入表达载体。

适于在哺乳动物/真核细胞中复制的载体的特征是本领域技术人员熟知的，并且在下面给出实施例。应理解的是，载体可以同时适于在原核和真核细胞中复制。

已经研制出各种方法以可操作地连接多核苷酸，特别是DNA至载体，例如通过互补粘末端。合适的方法在Sambrook等人(1989)Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY中有描述。

修饰编码本发明多肽的DNA的所需方式是使用如Saiki等人(1988)Science239，487-491所述的聚合酶链反应。该方法可以用于将DNA引入合适载体中，例如通过在合适的限制性位点工程化，或其可以以本领域中已知的其它有用方式用于修饰DNA。

在该方法中，将被酶法扩增的DNA的旁侧有两个特异引物，所述引物本身可以并入扩增的DNA。所述特异引物可以含有限制性内切酶识别位点，通过使用本领域已知的方法，所述位点可以用于克隆进入表达载体。

然后在合适的宿主中表达DNA(或在逆转录病毒载体的情况下，RNA)以产生含有本发明化合物的多肽。因此，根据已知的并考虑本文含有的教导而适当修饰的技术，可以使用编码构成本发明化合物的多肽的DNA来构建表达载体，所述载体然后用于转化用于表达和产生本发明多肽的合适的宿主细胞。这样的技术包括那些在1984年4月3日授予Rutter等人的美国专利No.4,440,859，1985年7月23日授予Weissman的4,530,901，1986年4月15日授予Crowl的4,582,800，1987年6月30日授予Mark等人的4,677,063，1987年7月7日授予Goeddel的4,678,751，1987年11月3日授予Itakura等人的4,704,362，1987年12月1日授予Murray的4,710,463，1988年7月12日授予Toole Jr.等人的4,757,006，1988年8月23日授予Goeddel等人的4,766,075和1989年3月7日授予Stalker的4,810,648中揭示的技术，其全部通过引用并入本文。

为了引入合适的宿主，编码多肽的DNA(或在逆转录病毒载体的情况下，RNA)可以与广泛种类的其它DNA序列结合。伴侣DNA将依靠于宿主的性质、将DNA引入宿主的方式和是否需要附加型维持或整合。

通常，以合适的方向和正确的表达阅读框，将DNA插入表达载体，例如质粒。如果需要，DNA可以与所需宿主识别的合适的转录和翻译调节控制核苷酸序列连接，虽然这样的控制通常是在表达载体中可获得的。然后通过标准技术将载体引入宿主。通常，不是所有的宿主都能被载体转化。因此，有必要选择转化的宿主细胞。一种选择技术涉及将DNA序列与具有编码转化细胞中的可选择特性的任何必需的控制元件，如抗生素抗性的任何对照元件一起并入表达载体。或者，负责这样的可选择特性的基因可以在另一个载体上，所述另一个载体用于共转化所需宿主细胞。

然后将已经转化了本发明重组DNA的宿主细胞以足够的时间并在考虑到本文公开的技术的本领域技术人员已知的合适的条件下培养细胞，以便允许表达其然后可以被回收的多肽。

许多表达系统是已知的，包括细菌(例如大肠杆菌E.coli和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis)、酵母(例如酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、丝状真菌(例如曲霉Aspergillus)、植物细胞、动物细胞和昆虫细胞。

载体包括原核复制子，如ColE1 ori，用于在原核细胞中繁殖，即使该载体将用于在其它非原核细胞类型中表达。该载体还可以包括合适的启动子如原核启动子，所述启动子能够在细菌宿主，例如用其转化的大肠杆菌中指导表达(转录和翻译)基因。

启动子是由DNA序列形成的表达控制元件，其允许RNA聚合酶结合和转录发生。与范例细菌宿主相容的启动子序列通常是在质粒载体中提供的，所述载体含有方便的用于插入本发明DNA片段的限制性位点。

典型的原核载体质粒是可从Biorad Laboratories，(Richmond，CA，美国)获得的pUC18、pUC19、pBR322和pBR329和可从Pharmacia，Piscataway，NJ，美国获得的pTrc99A和pKK223-3。

典型的哺乳动物细胞载体质粒是可从Pharmacia，Piscataway，NJ，美国获得的pSVL。该载体使用SV40晚期启动子以驱动克隆基因的表达，最高水平的表达在T抗原-产生细胞，如COS-1细胞中发现。

可诱导的哺乳动物表达载体的例子是pMSG，也可从Pharmacia获得。该载体使用小鼠乳房肿瘤病毒长末端重复的糖皮质激素-诱导的启动子以驱动克隆基因的表达。

有用的酵母质粒载体是pRS403-406和pRS413-416，其通常从StratageneCloning Systems，La Jolla，CA 92037，美国获得。质粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合质粒(Yeast Integrating plasmids(YIp))并且整合酵母选择性标记HIS3、TRP1、LEU2和URA3。质粒pRS413-416是酵母着丝粒质粒(YCp)。

宿主细胞可以是原核或真核的。细菌细胞是优选的原核宿主细胞并且通常是大肠杆菌的菌株，如，例如可从Bethesda Research Laboratories Inc.，Bethesda，MD，美国获得的大肠杆菌菌株DH5，和可从Rockville，MD美国的American Type CultureCollection(ATCC)获得的RR1(No ATCC 31343)。优选的真核宿主细胞包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞，优选的是脊椎动物细胞如那些来自小鼠、大鼠、猴或人类成纤维细胞系的细胞。酵母宿主细胞包括通常可从Stratagene Cloning Systems，LaJolla，CA 92037美国获得的YPH499、YPH500和YPH501。优选的哺乳动物宿主细胞包括人胚肾293细胞(见实施例1)，可从ATCC作为CCL61获得的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，可从ATCC作为CRL 1658获得的NIH瑞士小鼠胚胎细胞NIH/3T3，和可从ATCC作为CRL 1650获得的猴肾-来源的COS-1细胞。优选的昆虫细胞是可以用杆状病毒表达载体转化的Sf9细胞。

用DNA构建体转化合适的细胞宿主是通过通常依赖使用的载体类型的熟知方法完成的。关于转化原核宿主细胞，见例如Cohen等人(1972)Proc.Natl.Acad Sci.USA 69，2110和Sambrook等人(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY。转化酵母细胞在Sherman等人(1986)Methods In Yeast Genetics，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY中有描述。Beggs(1978)Nature 275，104-109的方法也是有用的。关于在转染这样的细胞中有用的脊椎动物细胞、试剂，例如磷酸钙和二乙氨(基)乙基葡聚糖(DEAE-dextran)或脂质体配方，可从Stratagene Cloning Systems或LifeTechnologies Inc.，Gaithersburg，MD 20877美国获得。

电穿孔也对转化和/或转染细胞是有用的并且在转化酵母细胞、细菌细胞、昆虫细胞和脊椎动物细胞的领域中是熟知的。

例如，许多细菌物种可以通过Luchansky等人(1988)Mol.Microbiol.2，637-646中所述的方法转化，该文献通过引用并入本文。在25:FD使用每cm 6250V，将悬浮于2.5X PEB的DNA-细胞混合物电穿孔之后一致性地回收最大数量的转化体。

通过电穿孔转化酵母的方法在Becker & Guarente(1990)Methods Enzymol.194，182中公开。

成功转化的细胞，即含有本发明DNA构建体的细胞，可以通过熟知技术鉴定。例如，从导入本发明的表达构建体获得的细胞可以被培养而产生本发明的多肽。可以收集和裂解细胞并且通过使用如Southern(1975)J.Mol.Biol.98，503或Berent等人(1985)Biotech.3，208所述的方法可以检查其DNA含量而确定DNA的存在。

除了直接分析重组DNA的存在，当重组DNA能够指导蛋白表达时，成功的转化可以通过熟知的免疫方法证实。例如，成功地用表达载体转化的细胞产生显示适当抗原性的蛋白。收集怀疑被转化的细胞样品并且使用合适抗体分析蛋白。

因此，除了转化的宿主细胞本身，本发明还考虑那些细胞的培养物，优选的是单克隆(克隆同质的)培养物，或在营养培养基中的源自单克隆培养物的培养物。

用于产生本发明制备物的本发明的另一个方面包括从根据本发明的细胞纯化制备物的步骤。培养宿主细胞和分离重组蛋白的方法在本领域中是熟知的。合适的纯化技术的例子在实施例中有描述。例如，制备物的一个或更多成分可以被标记以通过使用亲和试剂帮助纯化，如本领域技术人员熟知的和实施例中所述的。还可以使用色谱技术，例如在实施例中所述的。

本发明另一个方面提供通过本发明在前方面的方法获得的或可获得的制备物。制备物可以包括，例如标记的LRRK2多肽和ERM家族多肽。

本发明的第一、第二或第三方面的方法可以用本发明制备物形式的LRRK2多肽和ERM家族多肽进行；或通过上述方法获得的或可获得的制备物或复合物进行；或在本发明的细胞中进行。

上面的多肽可以通过本领域熟知的方法和下面描述的方法和在实施例1中的方法制备，例如通过使用分子生物学方法或自动化学肽合成方法。

应理解的是，素拟肽(peptidomimetic)化合物也可以有用。因此，术语“多肽”或“肽”不仅包括其中氨基酸残基通过肽(-CO-NH-)键结合的分子，还包括其中肽键是反向的分子。这种向后相反(retro-inverso)的素拟肽可以通过使用本领域已知的方法制备，例如那些在

等人(1997)J.Immunol.159，3230-3237(并入本文作为参考)中描述的。这一方法涉及制备含有涉及骨架，而不是侧链方向变化的假肽(pseudopeptides)。Meziere等人(1997)显示，至少对于MHC II类和T辅助细胞反应，这些假肽是有用的。含有NH-CO键而不是CO-NH肽键的向后相反的肽对蛋白水解更加有抗性。

相似地，假如使用保留氨基酸残基的CI原子之间间距的合适连接部分(moiety)，可以完全省掉肽键；特别优选的是，该连接部分具有与肽键基本上相同的电荷分布和基本上相同的平面性。

应理解的是，可以方便地在N-或C-末端封闭肽，以便帮助减少对外切蛋白酶消化的易感性。

因此，应理解的是，LRRK2或更优选地，ERM家族多肽可以是素拟肽化合物。

包括编码LRRK2多肽的重组多核苷酸和编码ERM家族多肽的重组多核苷酸的本发明部分的试剂盒可以用于形成制备物或复合物，该制备物或复合物可以用于例如本发明的第一、第二或第三方面的筛选方法。重组多核苷酸可以在表达载体中(例如如上所述)或(较不希望)用于体外表达。如上所述，ERM家族多肽可以是包含人类膜突蛋白残基Thr558的肽。

本发明的另一个方面提供在2000氨基酸以下的截短的LRRK2多肽，其在底物ERM家族多肽(例如包括如上述的人类膜突蛋白残基Thr558的肽)上具有蛋白激酶活性，包含至少GTPase结构域、COR结构域、激酶结构域、WD40-样基序和野生型人类LRRK2或其变体或天然存在突变体的C-末端尾残基。截短的LRRK2多肽可以不含有富含亮氨酸重复(LRR)的基序。截短的LRRK2多肽可以含有或由至少野生型人类LRRK2或其变体或天然存在突变体的1326-2527残基组成。如上所述，据认为，在C-末端截短可以不利地影响截短的LRRK2多肽的蛋白激酶活性，同时，可以较好地容忍在片段N-末端的截短。因此，截短的LRRK2多肽的N-末端可以可选地位于残基1326之后，例如在残基1326和约残基1336之间。

因此，本发明的多肽的例子是LRRK2多肽GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]或GST-LRRK2[1326-2527]。

本发明的另一个方面提供一种底物多肽，其是可源自ERM家族多肽，例如膜突蛋白、根蛋白或埃兹蛋白的片段，其包含对应于膜突蛋白Thr558残基的残基和至少部分包括该残基的周围序列，例如该残基C-末端和N-末端的至少2、3、4、5、6或7个残基；例如多肽RLGRDKYKTLRQIRQ或RLGRDKYKTLRQIRQGNTKQR；或含有氨基酸序列RLGRDKYK(T/S)LRQIRQ或RLGRDKYK(T/S)LRQIRQGNTKQR的在100、80、60、50、40、30、25、20、19、18、17或16个氨基酸以下的多肽，每个均没有或具有达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守或非保守的不是如上所述的T/S残基的残基替代物。

底物多肽可以包含氨基酸序列RLGRDKYK(T/S)LRQIRQ或RLGRDKYK(T/S)LRQIRQGNTKQR，每个均没有或具有达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守或非保守的不是T/S残基的残基替代物。

本发明的另一个方面提供编码本发明的截短的LRRK2多肽的多核苷酸。

本发明的另一个方面提供编码本发明底物多肽的多核苷酸。

多核苷酸可以是适于在哺乳动物/真核细胞中复制和/或表达多肽的载体。本发明的另一个方面是适合于表达本发明多肽的重组多核苷酸。

多核苷酸或重组多核苷酸可以是DNA或RNA，优选是DNA。多核苷酸在编码序列中可以含有或不含有内含子，优选地，多核苷酸是或含有cDNA。

本发明的另一个方面提供磷酸化ERM家族多肽的方法，其中ERM家族多肽被LRRK2多肽磷酸化。通过该方法磷酸化的ERM家族多肽可以是部分或完全去磷酸化的ERM家族多肽。

本发明的另一个方面提供LRRK2多肽在磷酸化ERM家族多肽的方法中的用途。ERM家族多肽可以优选地在对应于全长人类膜突蛋白Thr558的苏氨酸残基上被磷酸化，但还可以或可选地在对应于全长人类膜突蛋白Thr 526的苏氨酸残基上被磷酸化。

应理解的是，如果ERM家族多肽已经被磷酸化，进一步的磷酸化是不可能的。应进一步理解的是，从细胞中分离的ERM家族多肽(或者作为内源的或重组的多肽)就其磷酸化状态可以是异质的。例如，完全磷酸化的、完全去磷酸化的和/或部分磷酸化的ERM家族多肽的分子可以存在于单细胞或细胞的集合/培养物中。

本发明的另一个方面提供鉴定LRRK2突变体，例如在患有帕金森病的患者中发现的LRRK2突变体的方法，该方法包括评估LRRK2突变体磷酸化底物ERM家族多肽的能力的步骤。该方法可以包括测定LRRK2突变体对于ERM家族多肽的K_m和/或V_max的步骤。这样的鉴定可以用于研究潜在的帕金森病或帕金森综合症的机理。

本文提及的所有文献并入本文作为参考。

现在通过参考下列非限制性的附图和实施例更详细地描述本发明。

图例

图1.产生用于KESTREL筛选的活性LRRK2片段。(上面的图)LRRK2结构域结构的图解表述显示预测的功能性结构域、对应于人类LRRK2(登录号AAV63975)残基的编号。缩写LRR(富含亮氨酸的重复)、COR(Ras保守基序的C-末端)、KD(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域)。以编码GST-LRRK2的指明形式的构建体转染293细胞。转染后36小时，亲和纯化LRRK2激酶并且用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析并且用胶体蓝(colloidal blue)染色以定量相对的蛋白水平。通过在聚丙烯酰胺凝胶上电泳和随后对应于MBP或LRRK2的胶体蓝染色的条带的放射自显影测定MBP的磷酸化和LRRK2的自磷酸化而分析GST-LRRK2。*指示污染GST-LRRK2制备物的蛋白。在3个单独的实验中获得了相似的结果。

图2.LRRK2[G2019S]KESTREL筛选。(A至D)从大鼠大脑中抽提的不结合肝素琼脂糖的蛋白(图9)连续地在指明的柱上色谱分离。特定的组分在存在(+)或无(-)GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]和在材料和方法中所述的[γ³²P]-ATP时被磷酸化。在样品的聚丙烯酰胺电泳和放射自显影后分析底物的磷酸化。将膜突蛋白和肌酸激酶鉴定为磷酸化的底物在图3中确立。

图3.将膜突蛋白鉴定为LRRK2底物。将在至Superdex之前进一步在Source-Q中纯化的含有与肝素-琼脂糖相互作用的62kDa底物(CRMP2)的Superdex 200柱的组分10-15(图10)、含有68kDa底物(膜突蛋白)的Superdex 200柱的组分12-15(图2)和含有43kDa底物(肌酸激酶)的Q-柱的组分11用VivaScience旋转滤器浓缩。在无(-)或有(+)GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]和在材料和方法中所述的[γ³²P]-ATP时磷酸化样品。在样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影之后分析底物的磷酸化。在相同的凝胶上跑所有的样品，但是将显示的条带切割并且贴在一起以便简化数据。黑色线指示凝胶在那里被切割。被LRRK2磷酸化的胶体蓝染色的条带(用*标记)从凝胶上切下，用胰蛋白酶在凝胶中消化，通过胰蛋白酶肽质谱指纹图谱确定其身份。Mascot得分是其中＞63的值被认为是显著的(P＜0.05)的地方。

图4.鉴定膜突蛋白上被LRRK2磷酸化的残基。(A)将大肠杆菌表达的膜突蛋白在65℃孵育15分钟，然后以GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]和[γ³²P]-ATP以所述的次数磷酸化。在聚丙烯酰胺凝胶电泳和随后的胶体蓝染色的对应于膜突蛋白的条带的放射自显影之后测定膜突蛋白的磷酸化。在3个单独的实验中获得相似的结果。(B)将以GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]磷酸化40分钟后的³²P-标记的膜突蛋白用胰蛋白酶消化并且在C18柱上色谱分离。显示了含有主要的³²P-标记的胰蛋白酶肽(P1)、肽(P2)和肽(P3)的组分并且在色谱的其它组分中未观察到其它主要的³²P-标记的肽。(C)将所述的肽进行固相测序并且测定在每个Edman降解循环后释放的³²P-放射性。(D)还通过MALDI-TOF-TOF质谱分析了肽并且指示出推断的氨基酸序列和用(p)表示的磷酸化位点，以及每条肽观察到的和理论的质量。(E)如在(A)中一样，除了所述的野生型和突变体形式的膜突蛋白用GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]磷酸化30分钟。在2个单独的实验中获得相似的结果。

图5.以LRRK2分析膜突蛋白磷酸化(A)大肠杆菌表达的GST-膜突蛋白(1μM)在标明的温度孵育15分钟，然后以GST-LRRK2[1326-2527，G2019S](上面图)或ROCK-II(下面图)在30℃磷酸化。在聚丙烯酰胺凝胶电泳和随后的对应于膜突蛋白的胶体蓝染色条带的放射自显影后测定膜突蛋白的磷酸化。(B和C)如在(A)中一样，除了通过在以活性GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]或激酶非活性的(KI)GST-LRRK2[1326-2527，D2017A]或ROCKII磷酸化之前在70℃孵育15分钟将所述野生型和截短形式的膜突蛋白(浓度都为1μM)“热变性”。在2个单独的实验中获得相似的结果。在凝胶条带上的数字表示与MBP(B)或膜突蛋白[500-577]相比相对的磷酸化(C)未经热变性的。(D)如上述一样，除了分析了以GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]磷酸化大肠杆菌表达的GST-埃兹蛋白和GST-根蛋白的全长野生型和所述突变体。

图6.产生LRRK2的肽底物。(A)以编码所述活性形式和激酶非活性形式(KI，D2017A)的GST-LRRK2的构建体转染293细胞。转染后36小时，亲和纯化LRRK2激酶并且用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析并且用胶体蓝染色而定量相对的蛋白水平。通过测定300μM的LRRKtide肽(RLGRDKYKTLRQIRQ)的磷酸化分析GST-LRRK2，如材料和方法中所述。将激酶催化分析的结果以3次重复进行的分析的平均催化活性±S.D.的形式显示。显示的结果是2-3个独立实验的代表。(B)如在(A)中一样，除了LRRKtide的浓度有变化以便能够计算V_max和K_m的酶的参数。

图7.PD疾病LRRK2突变体的分析。图解表述显示在我们分析的LRRK2上的9个造成PD的突变的位置(缩写同图1中一样)。(B)非突变的和所述突变形式的GST-LRRK2[1326-2527]在293细胞中表达并且在谷胱甘肽-琼脂糖上亲和纯化。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析2.0μg的每个制备物，凝胶用胶体蓝染色以便定量相对的蛋白水平。通过测定MBP、膜突蛋白[500-577]和LRRKtide肽的自磷酸化以及磷酸化分析每个制备物。将LRRKtide磷酸化的数据作为在3次重复中进行的分析的平均特异性活性(在纯化的GST-LRRK2制备物中的每mg总蛋白的单位)±S.D.展示。显示的结果是2-3个独立实验的代表。缩写：WT：野生型；KI：激酶非活性(D2017A)LRRK2。

图8.非激酶结构域在调节LRRK2活性中的作用。(A)(上面图)LRRK2的结构域结构的图解表述显示预测的功能性结构域和对应于人类LRRK2残基(登录号AAV63975)的残基的编号。缩写同图1中一样。GST-LRRK2的野生型和所述片段在293细胞中表达并在谷胱甘肽-琼脂糖上亲和纯化。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析1.0μg每个制备物，其以聚丙烯酰胺凝胶电泳分析并且用抗-GST抗体免疫印迹以便定量相对的蛋白水平。还通过测定MBP、膜突蛋白[500-577]和LRRKtide的自磷酸化以及磷酸化分析每个制备物。将LRRKtide分析的数据作为在3次重复中进行的分析的平均特异性活性(在纯化的GST-LRRK2制备物中的每mg总蛋白的单位)±S.D.显示。(B)如(A)中一样，除了通过使用LRRKtide底物分析GST-LRRK2[1327-2527，G2019S]的所述C-末端点突变体和小C-末端截短物的效果。显示的结果是2-3个独立实验的代表。缩写：WT：野生型；KI：激酶非活性(D2017A)LRRK2。

图9.在293细胞中各种形式的GST LRRK2的表达。(上面图)LRRK2结构域结构的图解表述显示预测的功能性结构域和对应于人类LRRK2残基(登录号AAV63975)的残基的编号。缩写LRR(富含亮氨酸重复)、COR(Ras保守基序的C-末端)、KD(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域)。用编码所述形式的GST-LRRK2的构建体转染293细胞。转染后36小时，亲和纯化LRRK2激酶并且通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析并用胶体蓝染色以便定量相对的蛋白水平。在聚丙烯酰胺凝胶电泳后，通过测定LRRK2的自磷酸化分析GST-LRRK2。

图10.LRRK2[G2019S]KESTREL筛选。将从大鼠大脑中提取的蛋白用60％硫酸铵沉淀、脱盐并且在肝素-琼脂糖柱上色谱分离。将所述组分的等份变性然后将其在有(+)或无(-)GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]和在材料和方法中所述的Mn-[γ³²P]-ATP时磷酸化。在样品聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影后分析底物的磷酸化。在图3中确立了作为磷酸化底物的CRMP2和肌酸激酶的身份。

图11.通过LRRK2进行的MBP的磷酸化的分析。(A)在与用于磷酸化膜突蛋白(图4B)相同的条件下以GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]磷酸化40分钟后的32P-标记的MBP。每摩尔MBP只磷酸化0.01摩尔的³²P。用胰蛋白酶消化磷酸化的MBP并且在C18柱上色谱纯化。显示了含有主要的³²P-标记的胰蛋白酶肽的组分(P1-P5)。在色谱的其它组分中未观察到其它主要的³²P-标记的肽。(B)将所述肽进行固相测序并且测定在每个Edman降解后释放的³²P-放射性。(C)还通过MALDI-TOF-TOF质谱分析了肽并且指出推断的氨基酸序列和通过(p)表示的磷酸化位点以及每个肽的观察到的和理论的质量。

图12.在LRRK2上的自磷酸化位点的分析。(A)将GST-LRRK2[1326-2527]的所述活性形式和激酶非活性(KI)形式在存在100μM ATP时孵育40分钟。将样品进行聚丙烯酰胺电泳并且将对应于GST-LRRK2[1326-2527]的考马斯染色条带切下并用胰蛋白酶消化。通过LC-MS和MS/MS的联合分析鉴定磷酸肽。图显示源自GST-LRRK2[1326-2527](蓝)、KI-GST-LRRK2[1326-2527，D2017A](绿)、GST-LRRK2[1326-2527，G2019S](红)的磷酸肽的信号强度(cps，每秒检测到的离子的计数)对离子分布(m/z)。我们能够通过质谱鉴定的磷酸化的肽用Pa至Pf标记。当肽中磷酸化的确切位点不能确定时，其在表中以一个？指出。

图13.LRRK2上的自磷酸化位点的突变不影响活性。非突变的GST-LRRK2[1326-2527]和GST-LRRK2[1326-2527]的所述自磷酸化位点突变体在293细胞中表达并在谷胱甘肽-琼脂糖上亲和纯化。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析它们并且用胶体蓝染色以便定量相对的蛋白水平。通过测定对LRRKtide肽的活性分析每个制备物。数据作为在3次重复中进行的分析的平均催化活性±S.D.显示。

图14.人类ERM家族多肽的序列比对。

图15.通过LRRK2进行的膜突蛋白磷酸化的分析。(A)埃兹蛋白、根蛋白和Merlin的C-末端区域的序列比对。星号指示了等同于膜突蛋白Thr555的残基。黑色和灰色阴影的残基分别代表相同和同源的残基。(B)大肠杆菌表达的全长GST-膜突蛋白、GST-埃兹蛋白、GST-根蛋白或GST-膜突蛋白[500-577]、C-末端片段(C’膜突蛋白)或者置于冰上(-)或者在70℃孵育15分钟(+)，然后以GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]磷酸化。在聚丙烯酰胺凝胶电泳和随后对应于膜突蛋白的胶体蓝染色条带(右图)的放射自显影后(左图)测定ERM家族蛋白的磷酸化。

图16.在膜突蛋白上主要的LRRK2磷酸化肽的MALDI-ToF-ToF分析。通过使用在50％乙腈、0.1％三氟乙酸中的5mg/ml的α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质在反射模式的Applied Biosystems 4700蛋白质组分析仪上分析在源自图4A中显示的实验的肽P2。通过y7(-98)⁺离子的存在显示从该肽中H₃PO₄的丢失。在分析图4A中显示的P1和P3肽时观察到相似的98Da的特征性丢失。

图17.在LRRK2激酶活性上的PD相关突变的分析。在292细胞中表达Flag表位标记的LRRK2全长野生型(WT)、激酶死亡(KD)和突变cDNA等位基因并且通过使用单克隆M2抗FLAG琼脂糖树脂通过免疫亲和色谱法纯化它们。当[γ^~32P]ATP存在时分析抗LRRKtide的免疫复合物。特异性活性是对于LRRK2的量校正的掺入LRRKtide的³²P的cpm，其通过LICOR通过免疫印迹定量测定。G2019S突变引起约2倍活性的增加，而A1442P、R1941H、I2012T、I2020T和G2385R引起活性的降低。

图18.膜突蛋白、根蛋白、埃兹蛋白和merlin作为LRRK2的底物的评估。ERM蛋白和merlin的羧基末端作为GST融合体在细菌中生产。产生的片段和突变如下：膜突蛋白氨基酸500末端、野生型和T558A；埃兹蛋白氨基酸505末端、野生型和T567A；根蛋白氨基酸503末端、野生型和T664A；和merlin 514末端野生型和T567A。通过在[γ-³²P]ATP存在时的体外激酶反应测定LRRK2和Rock修饰这些蛋白的能力。重组GST-LRRK 1326末端如所述方法(Jaleel等人Biochem J 2007，405(2)：307-17)制备。Rock是从昆虫细胞中纯化的组成性活性片段2-543氨基酸。通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色(CB)，然后通过放射自显影(³²P)评估反应产物。LRRK2容易地修饰在所有ERM蛋白，尤其是merlin上的相似的T558位点，这表明其是LRRK2的新型的体外底物。Rock还在T558位点和相似的ERM残基上修饰ERM蛋白，但是其不在T567上磷酸化merlin，这表明其显示与LRRK2不同的底物决定因素。

图19.在重组蛋白中LRRK2磷酸化位点决定因素的阐明。A.显示在左图中，将膜突蛋白500末端T526A进行定点突变，其中将磷酸化位点的-8至+8位置的氨基酸变成丙氨酸。在右图中，将膜突蛋白500末端T526A进行定点突变，其中将膜突蛋白的指明的残基用指明的残基替代。将这些蛋白用LRRK2和Rock进行体外激酶反应并且通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色(CB)然后通过放射自显影(³²P)评估反应产物。B.用编号和指明的残基位置显示在膜突蛋白(moesing)T558磷酸化位点周围的残基的序列。

图20.在肽中的LRRK2磷酸化位点决定因素的阐明。为了进一步研究与Rock相比指导LRRK2识别LRRKtide的氨基酸决定因素，合成了单独的肽，其中LRRKtide的残基-6至+5以Ala、3A和C替代。另外，合成了其中残基也变成图19B和D中指明的残基的肽。具有Thr558位点+7至+12残基的较长的LRRKtide(长)与LRRKtide比较。检测LRRK2(A和B)和Rock(C和D)的浓度依赖的肽磷酸化。

-6位置

将Gly552置换至Ala对LRRK2和Rock识别重组蛋白底物具有中度的效果。这与LRRK2以552A改变而修饰肽相似，但是对于Rock负面效果更加明显，因为其更多地降低反应速率。

-5位置

将Arg553置换成Ala减少重组蛋白以及LRRK2和Rock的肽的修饰。

-4位置

重组蛋白数据显示，LRRK2和Rock不喜欢在-4位置的酸性残基，其通过当该残基变成Ala时信号的增加而证实。对于LRRK2，当通过肽磷酸化分析时，在该位置上去除负电荷的正面效果较不明显；但是，对于通过增加肽的反应速率显示的Rock是明确显著的。

-3位置

重组蛋白数据显示，在LRRK2的-3位置上碱性残基(K555)是较为不利的，这通过当该残基变成Ala时信号的增加而证明。但是对于Rock，在该位置上的碱性残基似乎是有利的，因为至Ala或Glu酸的突变阻碍磷酸化。对于LRRK2和Rock，在该位置上Pro残基是非常易于接受的。在LRRK2中未见到增强的K555A肽的修饰并且通过反应速率的减少，Rock对于在555上的碱性残基的偏爱是明显的。

-2位置

将Tyr556置换成Ala将LRRK2磷酸化重组蛋白降低至近背景水平并且显著地减少通过Rock的磷酸化。另外，Tyr556至Pro、Glu或Arg也对于LRRK2识别底物具有不利的效果。当在LRRKtide的背景下评估置换，将概述所有这些观察。有趣的是对于Rock，Rock微弱修饰Tyr556Pro突变体并且Tyr556Glu置换的负电荷完全阻碍了通过Rock的磷酸化。这些结果也用肽磷酸化概述。在-2位置上的碱性电荷Tyr556Arg导致通过Rock的磷酸化的大量增加。尽管556R肽被磷酸化至与野生型相似的水平。这些结果标明，在-2位置上的疏水残基对于LRRK2是必需的并且碱性电荷是Rock最优选的。

-1位置

将Lys557置换成Ala导致减少通过LRRK2的修饰和完全阻碍通过Rock的磷酸化。当在肽中Lys557被改变时这一效果更显著并且反应速率值在野生型的一半以下。

+1位置

在重组蛋白中，将Leu559置换成Ala、Phe、Gly、Lys、Pro或Tyr对于通过LRRK2的磷酸化有很少的效果至无效果，但是Leu559至Glu的改变是不利的。当在LRRKtide的背景下分析Leu559Ala时，反应速率减少至约野生型的一半。但是，在+1位置上的Leu似乎对于通过Rock的底物识别是关键的，因为在重组蛋白或LRRKtide中分析的在该位置上的任何突变均阻碍磷酸化。

+2位置

对于LRRK2和Rock，在该位置上碱性残基是优选的。将Arg560置换成Ala、Pro或Glu阻碍通过这2种激酶的磷酸化。当在LRRKtide的背景下分析Arg560至Ala、Pro或Glu时，LRRK2不能磷酸化该肽。对于Rock，将Arg560置换成Ala或Pro降低反应速率但不完全，Pro置换显示轻微降低的亲和力。

+3位置

将Gln561改变至Ala对于LRRK2或Rock修饰重组底物的能力显示可忽略不计的效果。对于LRRK2，当通过肽磷酸化分析时，该效果也是最小的，反应速率只有轻微的降低。但是对于Rock，当在LRRKtide中用Ala置换Gln561时，可见反应速率的明显改变。

+4位置

将Ile562置换成Ala减少LRRK2对重组底物以及肽底物的磷酸化。这一置换增加Rock对重组底物的修饰但是轻微减少对肽底物的磷酸化。

+5位置

将Arg563改变为Ala、Pro或Glu对于重组蛋白底物识别LRRK2具有中度的效果；但是，Rock更易接受在重组蛋白中的Ala和Glu的置换但不是Pro的置换。在LRRKtide中Ala的置换引起对于Rock反应速率的中度效果，但是在LRRK2中可见速率的严重减少。Pro和Glu的置换563阻碍通过LRRK2的磷酸化，可见有这些改变的Rock的反应速率的降低。

+6位置

将Gln564置换成Ala减少LRRK2和Rock对重组底物的修饰。

+7位置

将Gly564置换成Ala轻度减少LRRK2和Rock对重组底物的修饰。

+8位置

将Asn564置换成Ala轻微增加LRRK2对重组底物的修饰并且轻微减少Rock对重组底物的磷酸化。

图21.LRRK2显示对于具有羧基末端延伸的较长LRRKtide的较高亲和力。具有Thr558位点+7至+12残基的较长的LRRKtide与用LRRK2磷酸化的LRRKtide比较。分析在重组膜突蛋白中远端+位置残基的Ala置换的分析显示了通过LRRK2的磷酸化的轻微差别。LRRK2对于长LRRKtide的亲和力是LRRKtide的10倍以上。

图22.LRRK2不磷酸化MYPT。重组GST-MYPT和热变性的GST全长埃兹蛋白在[γ-³²P]ATP存在时与增加量的Rock或LRRK2进行体外激酶反应。用SDS-PAGE，然后通过考马斯蓝染色和放射自显影或免疫印迹分析反应产物，免疫印迹用用于MYPT激酶反应的总的MYPT和磷酸-MYPT Thr850或用于埃兹蛋白激酶反应的总的ERM和磷酸-ERM进行。已知的MYPT Rock磷酸化含有在-2位置的Arg和在+2位置的Gly(表1)。如果LRRK2优选在-2位置上的疏水残基和在+2位置上的碱性残基，那么MYPT应该作为LRRK2的不良底物。MYPT是Rock而不是LRRK2的更好的底物，这支持了突变的数据。

实施例1：LRRK2在Thr558上磷酸化膜突蛋白；鉴定帕金森病突变体如何影响激酶活性。

缩写：GST，谷胱甘肽S-转移酶；KESTREL，激酶底物追踪和阐明；LRRK2，富含亮氨酸重复的激酶2；LDS，十二烷基硫酸锂；MBP，髓磷脂碱性蛋白；CRMP2，脑衰蛋白反应调节蛋白2；COR，Ras复合物C-末端；PD，帕金森病；GbpC，cGMP结合蛋白C；RIPK，ρ-相互作用蛋白激酶和ROCK-II，ρ相关激酶2。

摘要。在人类富含亮氨酸重复的激酶2(LRRK2)基因中的常染色体显性突变导致迟发的帕金森病(PD)。LRRK2是一个大的～280kDa的酶，除了蛋白激酶结构域，其还含有富含亮氨酸的重复、GTPase结构域、COR结构域和WD40基序。在每个这些结构域中的突变都与PD相关。鲜知LRRK2是如何被调控的，什么是其生理性底物或突变是如何影响LRRK2的功能。至今只通过自磷酸化和磷酸化髓磷脂碱性蛋白(MBP)而评估了LRRK2的活性，其被催化得相当缓慢。我们在大鼠大脑提取物中进行了KESTREL筛选以便鉴定被活化的PD LRRK2突变体(G2019S)磷酸化的蛋白。这导致一个发现，即将肌动蛋白-细胞骨架锚定至质膜的称作膜突蛋白的蛋白被LRRK2在Thr558上有效地磷酸化，Thr558是在先鉴定的调节膜突蛋白结合肌动蛋白能力的体内磷酸化位点。LRRK2还磷酸化含有Thr558的称作LRRKtide的肽。我们利用这些发现确定了9个在先报道的PDLRRK2的突变体如何影响激酶活性。只有一个被分析的突变体，即G2019S，促进激酶活性。4个突变体(R1941H、I2012T、I2020T和G2385R)抑制LRRK2激酶活性，而剩余的突变体(R1441C、R1441G、Y1699C和T2356I)不影响活性。因此，其中LRRK2突变诱导PD的方式有可能比原先想象的更复杂，并且不只是通过LRRK2激酶活性的增加造成。我们还显示，LRRK2的最小催化活性片段需要完整的GTPase、COR和激酶结构域以及WD40基序和C-末端尾(含有残基1326-2527)。在该研究中提出的发现将用于定量测定LRRK2激酶活性并且还可以用于筛选为了治疗PD的抑制LRRK2的药物。我们还讨论了通过突变的LRRK2对膜突蛋白磷酸化的解除调控如何能够导致帕金森病中的早期多巴胺能轴突末端的丢失。

材料和方法。

材料。蛋白酶抑制剂混合物片来自Roche；P81磷酸纤维素纸来自Whatman；[γ32P]-ATP和所有的蛋白色谱介质购自Amersham Biosciences。髓磷脂碱性蛋白(MBP)来自Invitrogen；预凝的SDS聚丙烯酰胺Bis-Tris凝胶来自Invitrogen；组织培养试剂来自Life Technologies；Millipore Immobilon-P来自Fisher Scientific。活性大鼠ROCKII[残基2-543]被信号转导治疗单位分部(Division of SignalTransduction Therapy Unit)(Dundee大学)在杆状病毒中表达。LRRKtide肽(RLGRDKYKTLRQIRQ)通过Bristol大学的Graham Bloomberg博士合成。

抗体。抗GST是针对谷胱甘肽S-转移酶蛋白在羊中产生的。用于免疫印迹的偶联至辣根过氧化物酶的第二抗体获自Pierce。

一般方法。使用标准的规程进行组织培养、转染、免疫印迹、限制性酶消化、DNA连接和其它重组DNA过程。使用快改变(Quick-Change)定点突变方法(Stratagene)进行所有的突变。使用Qiagen质粒Mega或Maxi试剂盒根据生产者的规程从大肠杆菌DH5α中纯化用于转染的DNA构建体。通过DNA测序证实所有的DNA构建体，其通过英国苏格兰Dundee大学生命科学院的测序服务中心使用DYEnamic ET终止化学(Amersham Biosciences)在Applied Biosystems的自动DNA测序仪上进行。

缓冲液。裂解缓冲液含有50mM Tris/HCl pH7.5、1mM EGTA、1mM EDTA、1％(w/v)Triton-X100、1mM正钒酸钠、10mMβ-甘油磷酸钠、50mM氟化钠、5mM焦磷酸钠、0.27M蔗糖、0.1％(v/v)2-巯基乙醇和完全蛋白酶抑制剂混合物(一片/50ml，Boehringer)。缓冲液A含有50mM Tris/HCl pH7.5、0.1mM EGTA和0.1％(v/v)2-巯基乙醇。抽提缓冲液含有50mM Tris/HCl pH7.5、5％(v/v)甘油、10mM2-巯基乙醇、1mM EDTA、1mM EGTA、0.03％(v/v)Brij-35、完全蛋白酶抑制剂混合物(一片/50ml)。样品缓冲液是含有1％(以体积计)2-巯基乙醇的1X

LDS样品缓冲液(Invitrogen)。

质粒。编码对应于NCBI Acc.AAV63975的LRRK2全长cDNA克隆是来自Michel Goedert博士(LMB Cambridge)的慷慨礼物。用于本研究的全长LRRK2基因和其片段根据标准的PCP方法，使用KOD聚合酶(Novagen)从LRRK2 cDNA片段中扩增而来。获得的PCR产物作为Bamh1-Not1片段被亚克隆进入哺乳动物pEBG2T和pCMV5表达载体。通过从购自Geneservice(IMAGE克隆4908580)的EST PCR扩增编码人类膜突蛋白(NCBI登录号NP_002435)的全长以及C-末端片段的cDNA。将PCR产物作为Not1-Not1片段连接进入不同的表达载体。

GST-LRRK2的表达和纯化。通常培养10至100个10cm直径碟的HEK 293细胞，并且使用多聚乙酰亚胺(polyethylenimine)方法[15]用5μg编码野生型或不同突变形式的LRRK2的pEBG-2T构建体转染每碟。进一步培养细胞36小时并且在0.5ml冰冷的裂解缓冲液中裂解细胞，将裂解液合并并且在4℃以26,000xg离心10分钟。通过在谷胱甘肽-琼脂糖(每碟293细胞10μl)上的亲和色谱法纯化GST-融合蛋白并且在含有20mM谷胱甘肽和0.27M蔗糖的缓冲液A中洗脱GST-融合蛋白。以小等份急速冷冻酶并且将其储存于-80℃。

LRRK2KESTREL筛选。切碎来自50个大鼠的大脑并且用4倍体积的抽提缓冲液匀浆。通过在4℃以28,000xg离心20分钟沉淀不溶的物质，通过用60％(w/v)的硫酸铵搅拌沉淀在上清液中的蛋白2小时。通过以28,000xg离心20分钟收集沉淀的蛋白，将蛋白重悬于抽提缓冲液，通过在葡聚糖凝胶-G25上的色谱法脱盐精制到30mM MOPS pH6.9、10％(v/v)甘油、10mM 2-巯基乙醇、0.03％(v/v)Brij-35，并且在肝素-琼脂糖上在后一缓冲液中色谱分离。将肝素柱的流出物(flow-through)用1M NaOH滴定至pH7.5并且置于8ml Source 15Q柱上，Source15Q柱在30mM Tris/HCl pH7.5、10％(v/v)甘油、10mM 2-巯基乙醇、0.03％(v/v)Brij-35中用136ml梯度洗脱(developed in)至1M NaCl。将所有组分的等份在50mM Tris/HCl pH7.5、10mM 2-巯基乙醇、10μg/ml亮肽素(leupeptin)、1mMPefabloc中稀释10倍，在65℃孵育15分钟，然后用3mM MnCl2、1MBq/ml[γ³²P]-ATP在无或有2μg GST-LRRK2[1326-2527，G2019S](估计的LRRK2酶的纯度是总蛋白的2-5％)时孵育5分钟。通过加入SDS-样品缓冲液终止反应，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并且电转至Immobilon P。将膜干燥和放射自显影。在-80℃冷冻所有的组分和测试等份。将含有Q-组分5和6的底物在30mM Tris/HCl pH8.2、10％(v/v)甘油、10mM 2-巯基乙醇、0.03％(v/v)Brij-35中稀释5倍并且置于1mlSource 15Q柱上。该柱在30mM Tris/HCl pH7.5、10％(v/v)甘油、10mM 2-巯基乙醇、0.03％(v/v)Brij-35中用10ml梯度洗脱至1M的NaCl，收集0.5ml的组分，如上所述用LRRK2筛选等份。将含有Q-组分6和7的底物置于120ml Superdex-200柱上，收集1.2ml等份并且筛选。将含有Superdex-组分12-15的底物合并，浓缩并且通过在2ml VivaScience系统中过滤而脱盐。将4μg等份变性或保持天然并且通过在有或无LRRK2时磷酸化检测底物的存在。样品在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用胶体蓝染色并且通过放射自显影分析。将对应于底物信号的蛋白条带切下，用胰蛋白酶消化并且通过质谱指纹图谱进行蛋白鉴定。

在大肠杆菌中人类膜突蛋白的表达和纯化。将编码野生型和突变形式的人类膜突蛋白的pGEX表达构建体转化入大肠杆菌BL21细胞，在37℃在含有100μg/ml氨苄青霉素的营养肉汤培养基中培养1L培养物直到在600nm的吸收为0.8。通过加入100μM异丙基-β-D-半乳糖苷进行蛋白表达的诱导，进一步在26℃培养细胞16小时。离心分离细胞，将其重悬于15ml冰冷的裂解缓冲液中并且在一轮冷冻/融解中裂解，然后用超声波处理至片段DNA。将裂解液在4℃以26,000xg离心30分钟，重组蛋白在0.2ml谷胱甘肽-琼脂糖上亲和纯化并且在0.4ml含有20mM谷胱甘肽和0.27M蔗糖的缓冲液A中洗脱。

定位在膜突蛋白上通过G2019S LRRK2磷酸化的位点。在65℃处理膜突蛋白(4μg)15分钟，然后在30℃用在缓冲液A中的1.5μg GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]孵育，缓冲液A含有在50μl总反应体积中的10mM MgCl₂和100μM[γ³²P]-ATP(10000cpm/pmol)。在40分钟后通过加入样品缓冲液至1％(w/v)LDS-10mM二硫苏糖醇(DTT)的终浓度终止反应，并且在100℃加热样品1分钟并且在冰上冷却样品。将4-乙烯吡啶加至50mM的浓度，将样品在室温留在摇动平台上30分钟以烷基化半胱氨酸残基。将样品在BisTris 4-12％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，凝胶用胶体蓝染色然后放射自显影。将磷酸化的膜突蛋白条带切下，切成较小的片，随后用1ml下列成分在震动平台上洗涤15分钟：水、水和乙腈的1∶1混合物、0.1M碳酸氢铵、0.2M碳酸氢铵和乙腈的1∶1混合物和最后的乙腈。用speedi-vac干燥凝胶片并且在0.1ml的50mM碳酸氢铵、含有1μg质谱级胰蛋白酶(Promega)的0.1％(w/v)n-辛基葡萄糖苷中孵育。16小时之后，加入0.1ml乙腈并且将混合物在摇动平台上孵育10分钟。去除上清液，进一步在0.3ml的50mM碳酸氢铵和0.1％v/v三氟乙酸中洗涤凝胶片10分钟。将含有＞90％32P-放射性的合并的上清液在用水中的0.1％v/v三氟乙酸中平衡的Vydac 218TP5215 C18柱(Separations Group，Hesperia，CA)上进行色谱分离。该柱用线性乙腈梯度(对角线)在0.2ml/min的流速下进行分离(developed)，收集0.1ml的组分。通过在Phospho-Select树脂(Sigma)上的固定的金属螯合亲和色谱法(IMAC)进一步纯化磷酸肽。

磷酸肽序列分析。在Applied Biosystems 4700蛋白质组分析仪(MALDI-TOF-TOF)上使用5μg/ml的α氰基肉桂酸作为基质分析分离的磷酸肽。获得在反射器和线性模式中的光谱，通过在所选质量上进行MALDI-MS/MS证实磷酸肽的序列。使用从亲代磷酸肽中特征性丢失磷酸(M-98Da)以及从磷酸丝氨酸中中性地丢失脱氢丙氨酸(M-69kDa)或从磷酸苏氨酸中中性地丢失脱氢氨丁酸(-83)分配磷酸化位点的位置。通过在肽的Applied Biosystems 494C序列分析仪上的固相Edman降解确定所有32P-标记的肽的磷酸化位点，所述肽结合至如前所述的Sequelon-AA膜上(Milligen)[16]。

使用膜突蛋白或MBP作为底物的LRRK2的分析。在含有0.5-0.7μg野生型或突变形式的LRRK2、1μM膜突蛋白(已经置于冰上或在分析前在65℃孵育15分钟的全长或指明的突变体)或1μM髓磷脂碱性蛋白、10mM MgCl2和0.1mM[γ32P]-ATP(300cpm/pmol)的总体积25μl的缓冲液A中建立分析。在30℃孵育30分钟后，通过加入LDS-样品缓冲液终止反应。在4-12％聚丙烯酰胺凝胶电泳样品和放射自显影干燥的考马斯蓝染色凝胶后测定至膜突蛋白或MBP底物的磷酸的掺入以及LRRK2的自磷酸化。还将磷酸化底物从凝胶上切下，并且用Cherenkov计数定量32P的掺入。

使用LRRKtide作为底物分析LRRK2。在存在300μM或指明浓度的LRRKtide(RLGRDKYKTLRQIRQ)肽底物时，在含有0.5-0.7μg野生型或突变形式的LRRK2、10mM MgCl₂和0.1mM [γ³²P]-ATP(300cpm/pmol)的总体积50μl的缓冲液A中建立分析。在30℃孵育30分钟后，通过将40μl的反应化合物加至P81磷酸纤维素纸上终止反应，在50mM磷酸中洗涤P81磷酸纤维素和Cherenkov计数后定量LRRKtide的磷酸化。一个单位(U)的LRRK2活性定义为催化1nmol³²P掺入LRRKtide的酶的量。通过使用不同浓度的LRRKtide进行上述分析测定K_m和V_max参数。使用Graph-Padprism程序计算K_m和V_max参数。

免疫印迹。将样品在样品缓冲液中在70℃加热5分钟，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并且转移至硝酸纤维素膜上。在50mM Tris/HCl pH7.5、0.15M NaCl、含有10％(w/v)脱脂奶的0.2％(v/v)Tween(TBST缓冲液)中封闭膜30分钟。在4℃在含有5％(w/v)脱脂奶的TBST缓冲液中用1μg/ml的抗-GST抗体用探针杂交膜16小时。用辣根过氧化物酶偶联的第二抗体和增强性化学发光试剂进行检测。

LRRK2自磷酸化位点的鉴定。在含有10mM MgCl₂和0.1mM ATP的总体积为50μl的缓冲液A中孵育10μg指明形式的纯化的GST-LRRK2[1326-2527]60分钟。通过加入样品缓冲液终止反应和在4-12％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，凝胶用胶体蓝考马斯染色。将GST-LRRK2条带从凝胶上切下并且用0.1M NH4HCO3和50％乙腈/50mMNH4HCO3洗涤凝胶。然后在65℃将蛋白用在0.1M NH4HCO3中的10mM DTT还原45分钟并且通过在室温加入50mM碘乙酰胺烷基化30分钟。在0.1M NH4HCO3和50％(v/v)乙腈/50mM NH4HCO3中洗涤凝胶片，干燥，用含有5μg/ml胰蛋白酶的25mM碳酸氢三乙胺在30℃孵育16小时。为了鉴定磷酸化位点，通过在Applied Biosystems 4000Q-TRAP上的LC-MS分析肽。使用Mascot搜索算法(www.matrixscience.com)搜索包括Celera Discovery System(Applied Biosystems)人类数据库的几个数据库。

结果。

用于KESTREL的LRRK2活性片段的表达。作为用于KESTREL筛选的蛋白激酶的来源，我们在293细胞中表达了GST-融合体。在谷胱甘肽-琼脂糖上的亲和纯化后，全长LRRK2的表达水平低，但是含有残基1326-2527、缺少富含亮氨酸重复但仍含有GTPase、COR、激酶、WD40和C-末端尾的LRRK2片段的表达水平显著地较高(图9)。当与镁和[γ³²P]-ATP和磷酸化的髓磷脂碱性蛋白(MBP)孵育时，尽管弱，LRRK2[1326-2527]片段还是被自磷酸化了(图1)。其中结合Mg₂ ⁺的Asp残基被突变的催化非活性突变体LRRK2[1326-2527，D2017A]不能在平行反应中自磷酸化或磷酸化MBP(图1)。我们还发现，在序言中提到的共同的PD突变体LRRK2[1326-2527，G2019S]与非突变的LRRK2[1326-2527]相比显示～3倍高的自磷酸化和MBP磷酸化水平，这与以前的工作是一致的，显示该突变促进LRRK2的活性[12，13]。

LRRK2KESTREL筛选。为了搜索在大脑中被LRRK2磷酸化的蛋白，将来自50个大鼠大脑的提取物用60％(w/v)硫酸铵沉淀，脱盐，在肝素-琼脂糖上色谱分离(图10)，然后用在pH7.5的Source-Q(图2A)和在pH8.2的Source-Q(图2B)，最后在Superdex 200凝胶上过滤(图2C)。将每个柱组分的等份在反应缓冲液中稀释并且在65℃孵育15分钟以便灭活可以磷酸化蛋白的内源性蛋白激酶，因此减少了不然可以干扰KESTREL分析的背景磷酸化水平[17]。然后在存在或不存在GST-LRRK2[1326-2527]或GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]和如材料和方法中所述的[γ³²P]-ATP的情况下孵育每个组分。使用纯化的非突变的GST-LRRK2[1326-2527]，未检测到任何大鼠大脑蛋白的显著磷酸化(数据未显示)。运用更多的活性GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]突变体，观察到3个蛋白被磷酸化(图2和图10)。将这些蛋白纯化，在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳并且通过胰蛋白酶肽的质谱指纹图谱方法建立在每个制备物中的被LRRK2磷酸化的考马斯蓝染色条带的身份(图3)。这显示，被LRRK2磷酸化的蛋白是脑衰蛋白反应调节蛋白2(CRMP2)、肌酸激酶和膜突蛋白。观察到CRMP2和肌酸激酶在大脑提取物中比膜突蛋白丰富50-100倍(AK数据未显示)。为了检查这些蛋白被LRRK2的相对磷酸化，用GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]磷酸化相似量的纯化的CRMP2、肌酸激酶和膜突蛋白，并且在这些条件下，膜突蛋白比CRMP2或肌酸激酶被磷酸化至显著更高的程度(图3)。因为CRMP2和肌酸激酶是高丰度蛋白并且比膜突蛋白被LRRK2以低的多的效率磷酸化，我们集中研究了通过LRRK2的膜突蛋白的磷酸化。

定位在被LRRK2磷酸化的膜突蛋白中的磷酸化残基。我们发现，在大肠杆菌中表达的重组人类GST-膜突蛋白被LRRK2以时间相关的方式磷酸化至每摩尔膜突蛋白～0.1摩尔的磷酸的最大化学计量(图4A)，如在KESTREL筛选中进行的在65℃孵育上述重组人类GST-膜突蛋白15分钟。我们不能将膜突蛋白磷酸化至更高的化学计量，这表示重组酶的重要部分可能是不能被磷酸化的构象。用胰蛋白酶消化被LRRK2磷酸化的³²P-膜突蛋白并且在C18柱上色谱分离以分离³²P标记的磷酸肽。这显示了两个主要的峰(P1和P2)和一个次要的峰(P3)(图4B)。P1和P2的固相Edman测序(图4C)和质谱(图4D)将其身份确定为在Thr558上被磷酸化的肽和P3作为在Thr526上被磷酸化的肽。我们接着评估了在膜突蛋白中的Thr526和Thr558的突变是如何影响通过GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]的磷酸化。Thr526的突变中度降低通过LRRK2的膜突蛋白的磷酸化，而Thr558的突变事实上去除了膜突蛋白的磷酸化(图4E)，这显示其是主要的磷酸化位点。当突变Thr526和Thr558时，未观察到膜突蛋白的磷酸化。

进一步分析通过LRRK2的膜突蛋白的磷酸化。膜突蛋白是蛋白埃兹蛋白/根蛋白/膜突蛋白(ERM)家族的成员，其功能是将肌动蛋白细胞骨架锚定至细胞膜，并在调节膜结构和组构中扮演重要角色[18，19]。膜突蛋白包含与几个质膜蛋白相互作用的条带四-点-一/埃兹蛋白/根蛋白/膜突蛋白(FERM)结构域(残基1至298)[18，19]以及磷酸肌醇4，5二磷酸盐(PtdIns4，5P2)。在膜突蛋白上的FERM结构域的后面是α-螺旋结构域(残基298至460)、易弯曲的连接区(残基460至489)和保守的C-末端尾(也称C-ERMAD结构域，残基489至575)。包含Thr558的膜突蛋白的后30个氨基酸形成F-肌动蛋白结合位点[20-22]。膜突蛋白和其它ERM蛋白存在至少两个构象状态，即能够结合膜和F-肌动蛋白的活性“开放”形式和因为肌动蛋白结合位点被遮蔽而不能将肌动蛋白细胞骨架连接至质膜的非活性或休眠“关闭”形式。膜突蛋白关闭状态的结构显示，膜突蛋白的FERM结构域和C-末端尾彼此相互作用，而在开放形式中，FERM和C-末端结构域是分离的[23]。在Thr558上磷酸化膜突蛋白，结合FERM结构域结合膜蛋白，或许结合PtdIns(4，5)P₂，促进C-末端尾从FERM结构域分离，这使得膜突蛋白结合F-肌动蛋白[24，25]。还没有肯定地建立在Thr558上磷酸化膜突蛋白的激酶，虽然一些候选激酶包括在体外和当在细胞中过表达时磷酸化ERM蛋白C-末端尾的ρ相关激酶(ROCK)[26-28]。

以前的报道发现，细菌表达的膜突蛋白的C-末端尾与全长膜突蛋白相比通过ROCK被磷酸化至大得多的程度[26，28]。这是推测的，因为当在大肠杆菌中表达膜突蛋白时，其是在关闭的构象中，其中Thr558对于磷酸化是不可进入的。我们推测，在KESTREL筛选中，在磷酸化之前在65℃孵育膜突蛋白可能已经诱导暴露Thr558的构象变化。为了研究这一点，我们在平行反应中研究了加热在大肠杆菌中表达的膜突蛋白是如何通过LRRK2(图5A)以及ROCK-II(图5B)影响其磷酸化。醒目的是，我们发现LRRK2和ROCK-II都不能磷酸化未在至少60℃温度下预孵育的膜突蛋白(图5A)。与此相反，缺失FERM结构域的膜突蛋白的片段可以在磷酸化前无热处理的情况下被LRRK2(图5C)或ROCK-II(图5D)磷酸化。在采用的条件下，膜突蛋白[400-577]C-末端片段与全长GST-膜突蛋白相比被磷酸化至高～2倍的程度(图5B)。

LRRK2的基于肽的底物分析的鉴定。我们接着研究了LRRK2是否可以磷酸化包含膜突蛋白Thr558的短肽底物(RLGRDKYKTLRQIRQ)，其中划了下划线的Thr残基与Thr558等同。我们发现，在激酶非活性GST-LRRK2[1326-2527，D2017A]不能磷酸化肽的条件下，GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]以比非突变GST-LRRK2[1326-2527]高～3倍的起始速率磷酸化该肽(图6A)。该肽被称作LRRKtide并且以相似的～200μM的Km被非突变GST-LRRK2[1326-2527]和GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]磷酸化(图6B)。通过GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]的LRRKtide的磷酸化的Vmax比通过非突变GST-LRRK2[1326-2527]的高～2.5倍(图6B)。GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]具有10U/mg的Vmax并且估计在这一制备物中酶的纯度为～5％，这提示LRRK2[G2019S]酶的纯制备物可以以200U/mg的特异性活性磷酸化LRRKtide，对于相对活性的激酶磷酸化合适的底物，这个活性是一个不小的速率。

LRRK2的PD突变形式的并排分析。通过应用本研究中详尽的分析，我们接着比较了已经在患有PD的人类中报道的9种LRRK2突变形式的活性(在[3]中综述)。发现研究的突变是在GTPase结构域(R1441C，R1441G)、COR区(Y1699C)、激酶结构域(R1914H，I2012T，G2019S，I2020T)和在位于WD40重复之外的C-末端尾的区域(T2356I，G2385R)中(图7A)。我们发现，只有通常观察到的G2019S突变显著地促进LRRK2自磷酸化以及膜突蛋白、LRRKtide和MBP的磷酸化(图7B)。4个突变(R1441C、R1441G、Y1699C和T2356I)和非突变LRRK2在所有的分析中具有相似的活性(图7B)。激酶结构域中4个突变中的2个(R1914H，I2012T)是近乎非活性的，这显示比作为对照的激酶非活性LRRK2[D2017A]略高的活性。第3个激酶结构域突变(I2020T)具有比非突变LRRK2显著低的活性，但是具有比R1914H和I2012T突变高的活性。有趣的是，2个C-末端尾LRRK2突变中的一个(G2385R)还在所有的分析中具有非常低的催化活性(图7B)。

定义保留蛋白激酶活性的LRRK2的最小片段。我们比较了全长和缺失特异性结构域的突变形式的LRRK2的活性。野生型全长LRRK2对于膜突蛋白、LRRKtide和MBP底物具有相似的活性，在本研究的其余部分中使用的LRRK2[1326-2527]片段也一样。缺失GTPase结构域(LRRK2[1541-2527])或GTPase和COR结构域(LRRK2[1856-2527])两者的突变体未显示自磷酸化并且不磷酸化任何底物。另外，缺失C-末端WD40结构域(LRRK2[1326-2149])或只是7个C-末端氨基酸([LRRK2[1326-2520])的LRRK2突变体也是非活性的。与其活性需要LRRK2的GTPase、COR、WD40和C-末端区的概念相一致，只包含激酶结构域的LRRK2的片段(LRRK2[1856-2145])无任何激酶活性(图8)。

在图6至8中显示的研究中，将相同量的GST纯化的蛋白加载到每个凝胶中，在每个分析中使用相同量的总蛋白。所有使用的LRRK2的制备物有相似的纯度。

用1μM MBP和300μM LRRKtide进行图7和图8中的激酶分析。在使用的条件下，我们获得掺入MBP的约300-1000cpm和掺入LRRKtide的通常为10-20倍高的计数。由于用于这些分析中的MBP和LRRKtide浓度的300倍的差别，难以直接从这个实验中直接比较这些底物。LRRKtide肽底物的优点是其可以采用比MBP高的多的浓度并且较不可能被可能的污染性蛋白激酶所磷酸化。MBP也以低水平在至少10个不同的位点被LRRK2磷酸化，如图11中显示。

定位在被LRRK2磷酸化的MBP中的磷酸化残基。我们还研究了在被LRRK2磷酸化的MBP上的残基。我们发现，MBP不被GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]很好地磷酸化，只达到只有每摩尔蛋白0.01摩尔磷酸盐的化学计量。在这些条件下磷酸化的32P-MBP的胰蛋白酶消化显示10个以上不同的32P标记的肽(图11)，这提示与膜突蛋白相比，LRRK2磷酸化MBP的许多位点，并且都以非常低的化学计量。通过使用质谱和固相测序，我们仍然能够定位这些磷酸化位点中的6个为Ser7、Thr18、Thr64、Thr94、Thr97、Thr148(图11)。

定位LRRK2的自磷酸化位点。我们还进行了定位在GST-LRRK2[1326-2527]、GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]以及催化非活性的GST-LRRK2[1326-2527，D2017A]的自磷酸化位点的质谱，其在将这些酶与Mg-ATP孵育后被观察到。在催化非活性的LRRK2上未观察到磷酸肽，但是在许多位点上观察到自磷酸化的LRRK2的非突变和G2019S形式(图12)。通过质谱分析，我们能够鉴定皆定位于GTPase结构域(在残基1335-1504之间，图12)之中的5个磷酸化的肽。在非突变的GST-LRRK2[1326-2527]上的主要自磷酸化位点是Thr1503。该残基在GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]上以2-3倍高的水平被磷酸化。包括Thr1410的其它残基在更有活性的GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]突变体上被磷酸化至更高的化学计量(图12)。我们将Thr1410和Thr1503突变成Ala，但是发现这不影响LRRK2的催化活性(图13)。

讨论。

在本研究中，我们采用了包含残基1326-2527的最有活性的LRRK2G2019S突变形式用于大脑中激酶底物的筛选并且鉴定膜突蛋白作为该酶的最已知的蛋白底物。包含Thr558磷酸化位点的肽也在体外底物中有用。通过使用这一方法，我们能够通过比较一套点突变和删除分析LRRK2的催化性激酶活性的需求，并且确立在PD患者中发现的LRRK2突变如何影响酶的活性。这个研究是使用KESTREL方法发现未被很好地鉴定的蛋白激酶的底物的另一个例子。需要进一步的工作来评估膜突蛋白是否含有LRRK2的生理性底物。为了严格地做到这一点，关键的是评价在LRRK2敲除/降低的小鼠或细胞中在膜突蛋白Thr558上的磷酸化。还有必要敲除/降低也具有磷酸化膜突蛋白潜力的LRRK1的表达。由于在膜突蛋白上Thr558位点周围的序列在埃兹蛋白和根蛋白中是相同的，有可能的是LRRK2至少在体外也能够磷酸化这些蛋白。

假如发现的ERM蛋白含有LRRK2的生理性底物，需要进一步研究其可以在神经变性和PD发展中的扮演的角色。就这一点而言，膜突蛋白和根蛋白涉及在调节神经突自然发展结果中扮演关键的角色，因为缺少这些蛋白的神经元显示出生长锥大小的显著减小、放射状条纹的消失、生长锥的退缩和侵入生长锥中心区的肌动蛋白丝的显著的结构破坏[29]。近来的研究还证明，过度表达活化的G2019SLRRK2突变体诱导神经突长度的进行性减少以及在原代神经细胞和大鼠黑质纹状体通路中的分枝，而缺少LRRK2导致神经突长度的增加和分枝[30]。通盘考虑，这些数据提示，通过突变的LRRK2的膜突蛋白磷酸化的解除调控可能导致在帕金森病中的早期多巴胺能轴突末端的丢失。在人类中，编码膜突蛋白相关的蛋白(称为merlin)的基因的失活性突变造成2型神经纤维瘤病，其是主要影响神经系统的癌症的一种形式[31]。很少知道关于磷酸化等同于merlin C-末端尾中的Thr558的残基的激酶的身份并且研究LRRK2是否可以在该残基上磷酸化merlin将是目的。

我们的结果证实，最普通的G2019S LRRK2PD突变增加激酶活性，这个结论与2个近期的研究相一致，在这2个研究中，LRRK2活性是通过自磷酸化和磷酸化MBP评估的[12，13]。我们用LRRKtide进行的动力学分析还显示，G2019S突变通过增加催化V_max常数而不是通过增加底物结合的K_m亲和力而促进LRRK2的活性。有趣的是将LRRK2催化结构域结晶并且确定靠近激酶催化结构域的亚结构域VII中的Mg₂ ⁺Asp残基的保守Gly残基的置换如何可以促进磷酸化的催化效率。对518个人类激酶的分析显示，2个蛋白激酶(TSSK1，BUBR1)以及7个预测的非活性假激酶(KSR2，STLK6，RSKL1，SgK071，结构域2_GCN2，SgK269，SgK196)在它们的催化结构域的亚结构域VII中具有Gly至Ser置换基序[11，32]。有趣的是建立TSSK1和BUBR1亚结构域VII Ser残基至Gly的突变如何影响这些激酶的活性。可能的是这样的氨基酸置换被用作进化机制以增加这些酶的基础活性。还有趣的是研究在其它蛋白激酶中Gly至Ser突变的效果。

我们的数据显示，不是所有的PD突变都促进LRRK2的活性。我们发现，4个PD突变R1441C、R1441G(位于GTPase结构域)、Y1699C(位于COR结构域)和T2356I(位于C-末端尾)不显著影响LRRK2的激酶活性。另外，3个突变R1941H、I2012T(位于激酶结构域)和G2385R(位于C-末端尾)显著抑制LRRK2的激酶活性。另一个PD突变I2020T(在位于Gly2019下一个的残基中)减少MBP和膜突蛋白的LRRK2自磷酸化和磷酸化，但是到了比R1941H、I2012T和G2385R突变低的程度。近期的报道指出，Y1699C突变与野生型蛋白相比具有～50％增加的自磷酸化[33]。虽然我们的数据可能显示该突变与野生型蛋白相比具有略高的活性(图7)，其比G2019S突变体也仅有显著少的活性。另一个报道认为I2020T LRRK2突变体自磷酸化的能力为比野生型高～40％的水平[34]，这与我们发现的该突变具有更低的活性是相反的。其原因不清楚，但是自磷酸化的测定有可能不可靠，尤其是因为难以保证这些分析是线性的，另外蛋白激酶的自磷酸化不总是与该酶的内在活性成比例。

我们在评估LRRK2的PD突变体形式中获得的这些结果显示，不是所有的突变都以与G2019S突变相同的方式施加其影响，其增加蛋白激酶活性。可能的是一些突变通过用调节性结合配偶体干扰LRRK2的细胞相互作用发挥其作用和/或改变LRRK2细胞稳定性或定位。一些突变降低激酶活性的发现表明，LRRK2的抑制还具有导致多巴胺能神经元的退化和PD发展的可能性。如果是这样的话，这将提示LRRK2抑制剂的治疗效果可能限于治疗具有活化的G2019S LRRK2突变的患者，并且需要使用不将引起疾病的LRRK2[G2019S]酶的活性降低至基础水平以下的这样药物的剂量。重要的是测试近期产生的LRRK2敲除小鼠[35]是否当其年老时发生神经变性的征兆。

我们的工作也证明，完整的LRRK2C-末端尾是活性需要的，因为只截去该区域的7个C-末端残基去除了LRRK2活性。我们还发现，位于朝向WD40基序的C-末端的G2385R PD突变灭活了LRRK2激酶活性。近期的工作显示，该突变，其特别是在中华民族的台湾人群中盛行，可能代表增加发生PD危险而不是PD造成的突变的多态性[36]。与WD40基序分开的LRRK2的C-末端区与任何其它已知蛋白或其它功能性结构域不具有同源性。通盘考虑，这些观察显示，完整的LRRK2C-末端区在调节激酶活性中扮演重要的角色。需要进一步的分析来研究该结构域可以调节LRRK2的机制，和该结构域是否可以与其它因子和/或LRRK2的其它区域相互作用以调节激酶活性。

总之，本研究中的结果定义了保留蛋白激酶活性的最小LRRK2片段并且还证明，在体外，LRRK2有效地在Thr558上磷酸化膜突蛋白。虽然需要进一步的工作来确定膜突蛋白是否含有LRRK2的生理性底物，我们的发现将通过提供更定量的和有力的方法来评估LRRK2蛋白激酶活性而有助于LRRK2的功能性分析。其还将能使更好地鉴定不同的PD突变如何影响LRRK2活性成为可能并且帮助药物发现程序来筛选用于治疗PD的LRRK2抑制剂。

实施例2：埃兹蛋白和根蛋白在等同于膜突蛋白Thr558的残基上被LRRK2磷酸化。

在膜突蛋白中在磷酸化Thr558位点周围的氨基酸序列在埃兹蛋白和根蛋白中是一样的，这提示这些蛋白也将被LRRK2磷酸化。为了研究这一点，我们研究了LRRK2是否磷酸化在大肠杆菌中表达的全长埃兹蛋白和根蛋白。与全长膜突蛋白相似，埃兹蛋白和根蛋白只在其在70℃加热之后被LRRK2[1326-2527，G2019S]磷酸化(图5D和图15)。等同于Thr558的埃兹蛋白中的残基(Thr567)和根蛋白中的残基(Thr564)至Ala的突变强烈地降低通过LRRK2的这些蛋白的磷酸化，这显示这些是主要的磷酸化位点。在使用的条件下，GST-埃兹蛋白以比GST-膜突蛋白和GST-根蛋白高～2倍的程度被LRRK2[1326-2527，G2019S]磷酸化，这提示其可能代表评估LRRK2酶活性的最好的体外底物。

实施例2：适合化合物筛选的分析模式

可以使用本领域已知的蛋白激酶筛选分析模式，并考虑到将ESM家族多肽鉴定为LRRK2多肽的底物而作了修改。

例如，在实施例1中使用的技术可以用于筛选化合物。可以使用类似于那些在WO 03/087400中所述的分析。可以使用能够高通量操作的筛选分析。例如，使用基于ERM家族多肽磷酸化位点中一个的底物肽的分析，例如使用结合至肽的磷酸化形式而不是非磷酸化形式(或反之亦然)的抗体可以是适合的。

例如当评估化合物对细胞体积反应的效果时，可以使用基于细胞的分析。

可以使用蛋白-蛋白结合分析，例如使用基于表面等离子体共振的技术或基于芯片的结合技术，如本领域技术人员熟知的。

如本领域技术人员熟知的，可以使用基于SPA(闪烁迫近分析(ScintillationProximity Assay)，Amersham International)的分析。例如，可以制备含有闪烁体和底物多肽，例如上述的膜突蛋白肽底物的珠子。可以将珠子与含有³²P-或³³P-γ-标记的ATP、LRRK2多肽的样品混合并且与测试化合物混合。方便地，这在96孔板中进行。然后使用合适的闪烁计数器计数该板，将已知的参数用于³²P或³³P SPA分析。只有与闪烁体接近的³²P或³³P，即只有结合到结合至珠子的底物的被检测。可以使用这种分析的变体，例如其中底物多肽通过结合抗体或抗体片段被固定在闪烁体珠子上。

也可使用适合于筛选小药物样化合物文库的ELISA模式的非放射性分析

抗磷酸膜突蛋白558和抗磷酸膜突蛋白526的抗磷酸肽抗体可以在羊中产生，例如用于western印迹的。评估其用于ELISA模式。膜突蛋白或膜突蛋白片段至微滴度板的固定，例如通过吸附或经由GST标签的俘获，未被预期影响LRRK2多肽磷酸化其的能力。

分析可以在maxisorp(Nunc)384透明板中进行。在4℃在pH7.4的Tris缓冲液盐(TBS)中包埋30ng/孔的膜突蛋白片段过夜。多余的结合位点用在含有0.2％Tween的TBS(TBST)中的5％BSA在室温封闭1小时，然后用TBST洗涤3次。将在反应缓冲液(50mM Tris pH7.5、0.01％BSA、0.1mM EGTA、1mM DTT)中的15μl LRRK2(1-1000ng)加入孔中并且加入溶于11％DMSO的2μl化合物并且孵育30分钟。通过加入5μL ATP(1-1000μM)/10mM MgCl₂开始反应并且在室温孵育25分钟。通过加入20μL 0.5M EDTA停止反应。在加入22μL抗磷酸膜突蛋白558抗体(在含有20μg/ml封闭肽的TBST中稀释1∶3700倍)前，用TBST洗板3次。1小时后，用TBST洗板3次，然后在每孔中加入22μL抗羊过氧化物酶偶联物(在1％BSA/TBST中1∶5000稀释)并且进一步孵育1小时。在加入在50mM乙酸、50mM乙酸钠、0.0009％H₂O₂中的22μl过氧化物酶底物3，3’，5，5’四甲基联苯胺TMB之前，进行最后4次TBST洗涤。显色进行15分钟，通过加入5μL 1MHCl而停止。在吸收度读出器上在450nm读板。

或者可以使用商业上可获得的过氧化物酶底物，其允许不同的颜色检测。例如，在492nm读数的邻苯二胺(OPD)或在405nm读数的二胺2，2’-叠氮-二(3-乙基-苯噻唑啉-6-磺酸盐)(Diammonium 2，2’-azino-bis(3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonate))。或者还可以应用使用荧光底物如10-乙酰基-3.7-二羟基吩恶嗪或用于发光的基于发光底物的检测技术。

认为分析可以适用于广泛的ATP浓度(1-1000μM)和1％DMSO(化合物储存溶剂)。认为源自自发荧光、淬灭或吸收的化合物干扰被最小化，因为其是涉及异质的几次洗涤步骤。

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Claims

1、一种鉴定预期用于调节LRRK2蛋白激酶活性的化合物的方法，该方法包括下列步骤：(1)确定测试化合物是否调节LRRK2多肽在底物埃兹蛋白/根蛋白/膜突蛋白(ERM)家族多肽上的蛋白激酶活性，及(2)选择调节所述LRRK2多肽蛋白激酶活性的化合物。

2、一种鉴定预期用于调节，例如抑制细胞中的ERM家族多肽的磷酸化的化合物的方法，该方法包括下列步骤：(1)测定测试化合物是否调节，例如抑制LRRK2多肽的蛋白激酶活性，及(2)选择调节，例如抑制LRRK2多肽的蛋白激酶活性的化合物。

3、一种鉴定预期用于治疗或预防帕金森病(PD)或帕金森综合症或其它神经变性状况的化合物的方法，该方法包括下列步骤：(1)测定测试化合物是否调节，例如抑制ERM家族(例如膜突蛋白)多肽的磷酸化，及(2)选择调节，例如抑制ERM家族(例如膜突蛋白)多肽的磷酸化的化合物。

4、根据权利要求3所述的方法，其包括下列步骤：(1)确定测试化合物是否调节，例如抑制通过LRRK2多肽的ERM家族(例如膜突蛋白)多肽的磷酸化，及(2)选择调节，例如抑制通过LRRK2多肽的ERM家族(例如膜突蛋白)多肽的磷酸化的化合物。

5、根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中LRRK2多肽是野生型人类LRRK2或其片段，或其二者之一的融合体。

6、根据权利要求5所述的方法，其中该片段至少含有野生型人类LRRK2的残基1326-2527。

7、根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中LRRK2多肽是具有野生型人类LRRK2天然存在突变的人类LRRK2，或其片段，或其二者之一的融合体。

8、根据权利要求7所述的方法，其中人类LRRK2的天然存在突变是与帕金森病(PD)相关的突变。

9、根据权利要求7或8所述的方法，其中该突变用野生型人类LRRK2编号而言是G2019S。

10、根据权利要求7或8所述的方法，其中该突变中用野生型人类LRRK2编号而言是R1441C、R1441G、Y1699C、R1914H、I2012T、I2020T、T2356I、G2385R、K544E、P755L、R793M、Q930R、S973N、R1067Q、S1096C、I1122V、S1228T、I1371V、R1441H、A1442P、R1514Q、M1869T或G2019S。

11、根据权利要求7-10任一项所述的方法，其中该片段至少对应于人类LRRK2的残基1326-2527。

12、根据前述权利要求任一项所述的方法，其中LRRK2多肽是GST融合多肽。

13、根据权利要求12所述的方法，其中LRRK2多肽是GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]。

14、根据前述权利要求任一项所述的方法，其中LRRK2多肽和/或ERM家族多肽是重组体。

15、根据前述权利要求任一项所述的方法，其中ERM家族多肽是源于ERM家族多肽，例如膜突蛋白、根蛋白或埃兹蛋白的片段，其含有对应于膜突蛋白Thr558残基的残基和至少部分包括该残基的周围序列，例如至少该残基的C-末端和N-末端的2、3、4、5、6或7个残基，例如多肽RLGRDKYKTLRQIRQ或RLGRDKYKTLRQIRQGNTKQR；或在100、80、60、50、40、30、25、20、19、18、17或16个氨基酸以下的多肽，其含有氨基酸序列RLGRDKYK(T/S)LRQIRQ或RLGRDKYK(T/S)LRQIRQGNTKQR，每个多肽没有或具有达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守的或非保守的不是T/S残基的残基替代。

16、一种纯化的制备物或部分的试剂盒，其包含LRRK2多肽或多核苷酸和ERM家族多肽或多核苷酸。

17、根据权利要求16所述的制备物或试剂盒，其含有重组LRRK2多核苷酸。

18、根据权利要求16或17所述的制备物或部分的试剂盒，其含有重组ERM家族多核苷酸。

19、一种能够表达LRRK2多肽和ERM家族多肽的重组细胞。

20、根据权利要求19所述的重组细胞，其含有重组LRRK2多核苷酸和重组ERM家族多核苷酸。

21、根据权利要求19所述的重组细胞，其含有LRRK2多肽和ERM家族多肽。

22、一种制备根据权利要求16至18任一项所述的制备物的方法，其包括从根据权利要求19至21任一项所述的细胞中纯化制备物的步骤。

23、一种通过权利要求22所述的方法获得的制备物。

24、一种在底物ERM家族多肽上具有蛋白激酶活性的在2000氨基酸以下的截短的LRRK2多肽，其至少含有野生型人类LRRK2的GTPase结构域、COR结构域、激酶结构域、WD40样基序和C-末端尾残基或其变体或其天然存在的突变体。

25、根据权利要求24所述的截短的LRRK2多肽，其至少含有野生型人类LRRK2的残基1326-2527或其变体或其天然存在的突变体。

26、LRRK2多肽GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]或GST-LRRK2[1326-2527]。

27、一种底物多肽，其是源自ERM家族多肽，例如膜突蛋白、根蛋白或埃兹蛋白的片段，其包含对应于膜突蛋白Thr558残基的残基和包括该残基的至少部分周围序列，例如该残基C-末端和N-末端的至少2、3、4、5、6或7个残基，例如多肽RLGRDKYKTLRQIRQ或RLGRDKYKTLRQIRQGNTKQR；或在100、80、60、50、40、30、25、20、19、18、17或16氨基酸以下的多肽，其含有氨基酸序列RLGRDKYK(T/S)LRQIRQ或RLGRDKYK(T/S)LRQIRQGNTKQR，每个多肽没有或具有达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守的或非保守的不是T/S残基的残基替代。

28、一种编码根据权利要求24至26任一项所述的截短的LRRK2多肽的多核苷酸。

29、一种编码根据权利要求28所述的底物多肽的多核苷酸。

30、一种磷酸化ERM家族多肽的方法，其中ERM家族多肽被LRRK2多肽磷酸化。

31、一种LRRK2多肽在磷酸化ERM家族多肽的方法中的用途。

32、根据权利要求30所述的方法，其中ERM家族多肽在对应于全长人类膜突蛋白Thr558的苏氨酸残基上被磷酸化。

33、根据权利要求1至15任一项所述的方法，其包括评估化合物是否在整个细胞、组织或有机体中调节ERM家族多肽磷酸化的步骤，或选择有机体中帕金森综合症或帕金森病特征和调节活性或疾病特征的化合物的步骤。

34、根据权利要求33所述的方法，进一步包括评估化合物是否在整个细胞、组织或有机体中调节ERM家族多肽的活性，和选择调节活性的化合物的步骤。

35、根据权利要求1至15、33或34任一项所述的方法，进一步包括合成、纯化和/或配制所选化合物的步骤。

36、一种制备调节LRRK2多肽活性或ERM家族多肽磷酸化的化合物的方法，该方法包括：1)进行根据权利要求1至15、33或34任一项所述的方法和2)合成、纯化和/或配制所选化合物。

37、一种鉴定LRRK2突变体，例如在患有帕金森病的患者中发现的LRRK2突变体的方法，该方法包括评估LRRK2突变体磷酸化底物ERM家族多肽的能力的步骤。