CN101680903A - 肾损伤的诊断试验 - Google Patents

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CN101680903A CN200880017176A CN200880017176A CN101680903A CN 101680903 A CN101680903 A CN 101680903A CN 200880017176 A CN200880017176 A CN 200880017176A CN 200880017176 A CN200880017176 A CN 200880017176A CN 101680903 A CN101680903 A CN 101680903A
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Abstract

本发明提供一种方法，通过测定中性粒细胞明胶酶相关脂笼蛋白(NGAL)在尿中的浓度与在血浆或血清中浓度的比值，来诊断和监测在人类或哺乳动物受试者中导致急性肾衰竭的急性肾损伤。

Description

肾损伤的诊断试验
本申请是基于2007年3月21日提交的美国临时专利申请流水号No.60/919,277的非临时申请，本申请要求该临时专利申请的优先权，将其全部内容援引并入本文。
技术领域
本发明涉及针对哺乳动物中新近发生过(recently occurred)或正在进行(ongoing)的、正在影响肾脏并可能导致急性肾衰竭(acute renal failure，ARF)，以下也同义地称为急性肾功能障碍(acute renal dysfunction，ARD)的损伤性(injurious)过程的诊断和监测。因此，本发明与内科学，特别是危重症医学或重症监护医学相关，也与其中实施可能损伤肾脏的程序的手术、肿瘤学和诊断性成像相关。本发明还与兽医学和手术，以及肾病理生理学和对实验动物肾有害影响的研究相关。
背景技术
本发明涉及一种在血液和尿中都有出现的肾病理学上的新标志分子用于检测显著的肾损伤的存在的诊断用途，肾损伤在下文中从对人类或哺乳动物肾脏的组成细胞的损伤的意义上来使用，包括但不限于肾小管细胞损伤。所述标志分子是中性粒细胞明胶酶相关脂笼蛋白(neutrophilgelatinase-associated lipocalin，NGAL)，也称为中性粒细胞脂笼蛋白(NL；对于人中性粒细胞脂笼蛋白为HNL)、脂笼蛋白2(LCN2)、25-kDa α2-微球蛋白相关蛋白(在大鼠中)或者24P3(在小鼠中)。在大鼠中，其也称为neu相关脂笼蛋白(NRL)，因为它的基因在neu(HER2/c-erbB-2)癌基因引发的乳腺肿瘤中过表达(Stoesz and Gould，1995)。NGAL是一种25-kDa的糖蛋白，最初是从嗜中性多形核白细胞的颗粒中分离的(Triebel et al.，1992；Kjeldsen et al.，1993)。它包含一个二硫桥，而且形成一定比例的二聚体和更小比例的三聚体。被分泌的总的NGAL中有一部分与92-kDa人中性粒细胞IV型胶原酶(也称为基质金属蛋白酶9(MMP-9)或明胶酶B)结合，或者作为NGAL单体形成约115kDa的复合物(Monier et al.，2000；Yan et al.，2001)，或者作为NGAL二聚体形成约125kDa的复合物(Yan et al.，2001)。已在多种癌症包括前列腺癌、膀胱癌、肾癌和乳腺癌的患者的尿中鉴别出这些复合物。
NGAL最初是作为一种中性粒细胞激活标志为人所知的，当入侵微生物(尤其是化脓性细菌)引起中性粒细胞脱颗粒和颗粒蛋白胞吐时，NGAL被释放到血液中。据此，人们认为，在来自人体的血清样品中测得NGAL水平提高则说明该个体正在经受炎症过程，特别是由细菌感染引起的炎症过程(美国专利6,136,526；PCT申请WO95/29404)。关于这一点，NGAL(24P3)在小鼠中被鉴定为一种1型急性期蛋白，在急性期反应期间表达主要定位在肝中(Liu and Nilsen-Hamilton，1995)，但这是与NGAL特异性地来自中性粒细胞的主张相矛盾的。
美国专利申请2004/0219603公开了NGAL用作尿生物标记，用来检测肾小管细胞损伤的早期发作。美国专利申请2005/0272101公开了血清中的NGAL用于同样目的。但这两个公开文件都没有描述怎样将肾小管细胞损伤与可导致NGAL水平上升的全身性炎症、或细菌感染、或癌症区分开来。本发明人先前已提交了PCT申请WO2006/066587，其公开了怎样将尿或血浆或血清中的NGAL水平分成不是肾损伤诊断特征的较低的上升，以及是肾损伤诊断特征的较高的上升：通过定义上述液体中NGAL的截止水平(cutoff level)，NGAL的测量结果必须超过截止值方可作为导致ARF或ARD的肾损伤的诊断特征。WO2006/066587(其全部内容通过引用并入本申请)考虑到这样一个事实，即在炎症、感染和某些癌症中，体液中的NGAL水平也可能上升，但通常上升到的值比与导致ARF或ARD的肾损伤相关的值要低。但少数有严重感染和/或患有癌症的患者即使在收治期间不发生肾损伤，也可能显示出超过用于诊断肾损伤的截止值的NGAL水平；而少数患者即使其NGAL水平不超过截止值，也发生较小程度的ARD。当利用截止值时，这两种类型的疑似病例(borderline cases)可分别导致假阳性的肾损伤诊断或者假阴性的无肾损伤诊断。
本发明的目的在于提供一种可靠的方法，来在不依靠利用给定体液中NGAL浓度的截止值的条件下，区分由于肾损伤引起的体液中NGAL增加和由于非肾脏性原因引起的体液中NGAL增加。
发明内容
本发明的依据是我们的观察到源于肾损伤的NGAL被分泌到尿中，从而在尿中达到的浓度比在血浆中达到的浓度高。相反，从肾脏之外的来源如如感染中的嗜中性多形核白细胞等或者某些腺癌分泌到血液中的NGAL通常使血浆中浓度比尿中浓度高。
由于肾脏对NGAL的表达和分泌在基础状态下较低，在健康人类受试者尿中NGAL的中值基础浓度为约5ng/mL。中性粒细胞，可能还有其他组织，也释放NGAL到血液中，在血浆中产生约60ng/mL的中值基础浓度。这意味着尿中NGAL浓度与血浆中NGAL浓度的中值比率为约0.08。我们没有观察到健康人类受试者中NGAL浓度的尿∶血浆比率大于0.3。
在肾损伤中，NGAL分泌到尿中的程度比分泌到血液中的程度高。这会增加尿∶血浆NGAL浓度比，使其超过在健康受试者中观察到的比率。据此，本发明包括通过下述步骤诊断肾损伤：
i)测定从哺乳动物采取的尿样品中NGAL的浓度；
ii)测定来自从同一哺乳动物采取的血液样品的血浆或血清中NGAL的浓度，所述血液样品是在采集尿样品的期间即将开始之前、该期间之中、或该期间刚结束时采取的；
iii)计算尿中的NGAL浓度与血浆或血清中的NGAL浓度的比率，将得到的比率的值与根据在有或没有肾损伤迹象的相同物种的哺乳动物中观察到的所述比率的范围而确定的截止值相比较，大于截止值的值说明发生了肾损伤。
还可以计算反比，即血浆或血清中的NGAL浓度除以尿中的NGAL浓度，将其与类似地确定的针对所述反比的截止值相比较。如果那样的话，使用的所有比率都将是上文iii)中提到的比率的倒数，这对于本发明的实施而言不是关键的，只是低于“反”截止值的反比的值将指示肾损伤的发生。所述方法具有不依赖于NGAL在尿和血浆或血清中绝对浓度的优势，因此这些浓度无需超过绝对浓度的某一截止值方可诊断肾损伤。这样就有可能在肾损伤的程度发展到引起尿和血浆或血清中NGAL水平超过在这些体液中确定的绝对浓度的截止值之前对肾损伤加以诊断：为了排除大多数上文提到的非肾性疾病中的NGAL水平提高，上述截止值设置得较高。
本发明的方法对收治于重症监护单位或危重症护理单位的患者特别有用，对于病情虽非危重，但已遭受了明确的可能导致肾缺血性损伤的创伤(如外科手术)或已暴露于肾毒剂(如化疗剂或抗微生物剂或者静脉给药用于诊断性成像的造影剂)的患者也将是特别有用的。在上述情形中，早期鉴定出肾脏受到了相关操作的影响并因此有发生ARF风险的患者，有助于更早地、更积极地进行干预以预防ARF的发生。该方法在兽医学、实验动物中肾病理生理学的研究、以及实验动物中针对候选化疗剂或诊断试剂的肾毒性试验等方面也将是有用的。
NGAL在体液中的水平优选借助于一种或多种特异性结合所述物种的NGAL的分子来加以测定，包括利用一种或多种针对NGAL的多克隆抗体或单克隆抗体的免疫化学方法。此类方法的实例包括但绝不限于夹心ELISA(酶联免疫吸附测定)、侧向流免疫层析法(1ateral flow immunochromatographicmethod)、抗体包被浸渍片、或基于抗体包被微粒的自动化免疫化学法。
附图说明
图1
来自收治于重症监护病房的90例成年患者的458个配对尿和血浆样品中关于导致急性肾衰竭的肾损伤的诊断的尿∶血浆NGAL浓度比率的接受者操作特征(ROC)曲线。
图2a和图2b
在一名肾损伤轻微发作的患者中尿∶血浆NGAL浓度比(图2a)及尿和血浆NGAL浓度(图2b)的时程。在第5天，尿∶血浆NGAL浓度约为1，但在次日上升到超过2。显示了比率的截止值0.73(图2a)。NGAL在尿和血浆中的绝对浓度未上升超过对所研究的患者组确定的截止值355ng/mL(图2b)，对于这些体液中任一种的NGAL浓度而言该截止值将指示ARF。血浆肌酸酐(未显示)从第5天和第6天时的正常值的上限起升高，至第8天，即尿∶血浆NGAL浓度达到峰值后的48小时，到达峰值。
图3a和图3b
在一名未发生ARF的患者中尿∶血浆NGAL浓度比(图3a)以及尿和血浆NGAL浓度(图3b)。并发的病症(肠穿孔和腹膜炎)导致血浆NGAL浓度大大超过可使其在该患者组中独立诊断ARF的的355ng/mL的截止值(图3b)，但尿∶血浆NGAL浓度比仍低于比率的截止值0.73(图3a)这一事实表明NGAL不是肾源的。血浆肌酸酐(未显示)仍较低，处在正常范围内。
图4a和图4b
在一名具有败血病所致的典型肾损伤发作的患者中，尿∶血浆NGAL浓度比(图4a)以及尿和血浆NGAL浓度(图4b)的时程。尿∶血浆NGAL浓度比从第1-3天的正常值上升到第4天超过截止值0.73(图4a)，第5天达到峰值，而血浆肌酸酐(未显示)在第6天达到峰值。虽然所达到的尿NGAL浓度可独立诊断ARF，但血浆NGAL浓度从未上升超过对所研究的患者组确定的355ng/mL的截止值(图4b)，不能独立诊断ARF。
图5a和图5b
在一名未发生ARF的患者中，尿∶血浆NGAL浓度比(图5a)以及尿和血浆NGAL浓度(图5b)的时程。患者被收治时患有肺炎和脱水，致使第0天血浆NGAL浓度高于此前确定的截止值355ng/mL，这在该患者组中本来是可独立诊断实际的或临近的ARF的。然而，这与尿∶血浆NGAL浓度比相矛盾：该比率仍远低于截止值0.73(图5a)。血浆肌酸酐(未显示)从第0天时稍低于正常值上限的值下降到了接下来几天的低基础值。
具体实施方式
在一系列被收治重症监护的危重症患者中，我们观察到来源于肾损伤的NGAL被分泌到尿中，在尿中达到的浓度比在血浆或血清中达到的浓度更高。相反，从肾外来源(例如感染中的嗜中性多形核白细胞)或者从某些腺癌分泌到血液中的NGAL通常使得血浆或血清中浓度比尿中高。
血液中游离的NGAL被肾小球滤过，并被远端曲小管从肾小球滤液中部分重吸收。因此，血液中NGAL浓度的增加将表现为(但相对较弱地)尿中NGAL浓度的较小增加。如果NGAL被受损伤的近端小管或其他细胞直接释放到肾小球滤液中，则其会在尿中呈现比在血液中更高的浓度，一些NGAL通过远端曲小管重吸收进入血液，和/或通过从受损伤细胞扩散到血液中。肾小管的损伤伴随着NGAL以及许多其他小蛋白分子的重吸收减少，这进一步提供了为什么肾损伤中NGAL浓度在尿中的上升大于在血浆或血清中的上升的原因。
因为肾脏对于NGAL的表达和分泌在基础状态下较低，故在健康人类受试者尿中NGAL的中值基础浓度为约5ng/mL。由肾小球滤过的血液中的游离NGAL有很大一部分被肾小管重吸收，从而保持NGAL的低基础尿浓度。NGAL通常以更高的水平存在于血浆或血清中，相当于约60ng/mL的中值基础浓度。这是由于通过中性粒细胞释放NGAL到血液中——其他组织可能也有少许释放——所致。尿中NGAL浓度与血浆中NGAL浓度的比率中值因此约为0.08。我们没有观察到健康人类受试者中的尿∶血浆NGAL浓度比大于0.3。
在如本说明书定义的肾损伤中，NGAL分泌到尿中的程度比分泌到血液中的程度大。同时，NGAL的肾小管重吸收作用发生障碍。两种现象都对尿∶(血浆或血清)NGAL浓度比增加并超过在健康受试者或没有肾损伤的患者中观察到的比值有贡献。
很明显，作为肾损伤结果的尿∶(血浆或血清)NGAL浓度比的增加将不仅适用于人类受试者，还适用于任何有类似于人类的肾结构和功能的哺乳动物。因此，本发明包括通过下述方法诊断肾损伤：
i)测定取自哺乳动物的尿样品中NGAL的浓度；
ii)测定来自从同一哺乳动物采取的血液样品的血浆或血清中NGAL的浓度，所述血液样品是在采集尿样品的期间即将开始之前、该期间之中、或该期间刚结束时采取的；
iii)计算尿中的NGAL浓度对血浆或血清中的NGAL浓度的比率，将得到的比率的值与根据在有或没有肾损伤迹象的相同物种的哺乳动物中观察到的所述比率的范围而确定的截止值相比较，大于截止值的值说明发生了肾损伤。
还可以计算反比，即血浆或血清中的NGAL浓度除以尿中的NGAL浓度，将其与同样确定的用于所述反比的截止值相比较。在那种情况下，使用的所有比值都将是上文iii)中提到的比值的倒数，这对于本发明的实施不是至关重要的，只是低于“反”截止值的反比值将说明发生了肾损伤。
所述方法具有不依赖于NGAL在尿和血浆或血清中绝对浓度的优势，因此这些浓度不需要超过绝对浓度的某一截止值方能使它们之间的比例能够诊断肾损伤。这样就有可能在肾损伤的程度发展到引起尿和血浆或血清中的NGAL绝对水平超过在这些体液中确定的绝对浓度的截止值之前对肾损伤加以诊断：为了排除大多数上文提到的非肾性疾病中的NGAL水平提高，上述截止值设置得较高。
尽管本发明的步骤ii)可通过测定血浆或血清中的NGAL来进行，但在本发明优选的实施方案中，是测定来自抗凝全血的血浆中的NGAL，而不是测定来自凝固血液的血清中的NGAL。用于测量NGAL的血浆或者是在分析之前先从血液样品分离的血浆，或者是作为自动化或半自动化分析程序的组成部分从血液分离的血浆，其中上述程序中施加的样品材料是抗凝全血。测定血浆而非血清中的NGAL的一个优势是允许在收集血液样品之后立即进行分析，没有任何时延来容许血液凝结和血清形成。测定血浆而不是血清中的NGAL还有一个优势，即可避免任何在凝血过程中NGAL从血液样品中的中性粒细胞释放到血清中的风险，这种情况在某些血清制备过程中是可能发生的。
在一项针对未经选择的重症监护成年患者的研究中，我们发现，尿样中NGAL浓度与同时收集的血浆样品中的NGAL浓度的比率可以很好地指示患者是否已遭受了已导致ARF或ARD或者将会在随后的一天或几天中导致ARF或ARD的肾损伤。该指征不依赖于在尿或血浆中NGAL浓度的绝对值。尽管如此，尿∶血浆NGAL浓度比的增加将几乎必然意味着尿NGAL浓度超过健康个体的正常范围，这是由于血浆NGAL浓度降低至正常范围以下是极为少见的。尿∶血浆NGAL浓度比在患有ARF的患者或者必定在接下来24小时内发生ARF的患者中显著提高，而该比率在收治期间不发生ARD的患者中很少超过正常范围，即使NGAL浓度的绝对值在尿中和血浆中均可能上升到正常值以上。
由于i)患者的可变性以及造成患者被重症监护的多种不同疾病和状况，ii)在重症监护条件下有时后勤上难以定时进行样品采集，和iii)ARF和ARD的临床诊断以及根据血清肌酸酐值的ARD生化诊断的不精确性，所以对尿∶血浆NGAL浓度比的解释仍然需要将该比值与经验上确定的截止值相比较，以实现最好地区分那些指示导致ARF或ARD的肾损伤的高比率与那些指示导致ARF或ARD的肾损伤的低比率。
来自临床研究的数据在以下实施例1中给出。从90例患者获得了458个配对的尿和血浆的同时样品，所述患者可以根据其他数据被归类为在取样时或随后24小时内是否正在经受ARF和ARD发作的影响。对这些样品的数据的接受者操作特征(ROC)曲线分析显示，利用0.73作为尿∶血浆NGAL浓度比的截止值，在单次配对检验中对ARF/ARD与非-ARF/ARD给出了最佳的总体区分(overall discrimination)。超过0.73的比率预示着实际存在或即将发生的ARF/ARD，阳性预测价值(positive predictive value)为96.3％。低于0.73的比率预示没有实际存在或即将发生的ARF/ARD，阴性预测价值(negative predictive value)为97.4％。诊断敏感度和特异度分别为96.3％和97.4％。0.73的截止值也接近于在没有ARF/ARD的每个患者个体中观察到的所有比率的中值的最大值(0.74)。
根据在患有ARF或ARD的个体患者中观察到的比率的最小值(0.33)和在没有ARF或ARD的患者中观察到的比率的最大值(1.14)，估计了对其他患者群体进行的类似研究中可能得到的截止值的范围。根据现有的结果，截止值0.33产生75.9％的阳性预测价值、100％的阴性预测价值、100％的诊断敏感度和77.1％的诊断特异度。截止值1.14将产生100％的阳性预测价值、92.7％的阴性预测价值、89.1％的诊断敏感度和100％的诊断特异度。
因此，截止水平(超过该水平的尿∶血浆NGAL浓度比预示ARF和ARD)优选为0.30或更高的值，例如0.33，或者从0.33至0.73(包括0.33和0.73在内)的任何值，在取后一个值时诊断敏感度、特异度以及阳性和阴性预测价值都超过95％；或者从0.73至1.14(包括0.73和1.14在内)的任何值，在取后一个值时阳性预测价值为100％；或者任一大于1.14的值，在取所有这些值时阳性预测价值均保持为100％。
本发明另一个方面是所述方法可用于在患者整个疾病过程中或者在进行了有引起ARF风险的诊断性或治疗性干预之后的不同时间对患者进行监测。将测得的尿∶血浆NGAL浓度比与截止值比较，可确定患者何时遭受肾损伤和处于发生ARF的风险中。用于监测的体液样品的采取间隔可以较短，从而提供尽可能早的肾损伤的指征，使得及早开始预防或治疗措施成为可能。为此目的，优选以不长于24小时的间隔进行尿∶血浆NGAL浓度比监测，更优选以更短的间隔，短至建议的不长于3小时的期间，或甚至更短，例如30分钟或1小时，比如如果已知发生了潜在的肾创伤，例如在外科或内科程序(surgical or medical procedure)中。
本发明的另一个优势是，通过一种分析技术确定的尿∶血浆NGAL浓度比的截止值可适用于通过另一种不同的分析技术获得的结果。这是因为所得到的浓度比与绝对浓度值不同，将与使用的分析技术和它们在校准上可能存在的差异无关——条件是所述分析方法显示出满意的线性，并且不受除NGAL浓度方面的差异之外的尿、血浆或血清的组成差异的影响。
本发明的方法在下述患者中特别有用：被收治于重症监护或危重症护理单位的患者，或者任何受严重炎症性、感染性或新生性疾病或病症的影响，该疾病或病症就其本身或藉由其并发症有较高的引起导致ARF或ARD的肾损伤的风险的患者。在这种情况下，所述炎症性、感染性或新生性病症本身可能在发生任何肾损伤之前引起NGAL浓度升高。这种升高通常在血浆中比在尿中更明显，且血浆水平在特定情况下可能超过截止水平(高于该水平的血浆中NGAL浓度通常被认为可诊断导致ARD的肾损伤)。根据本发明的方法，直到当NGAL的尿浓度升高使得尿∶血浆NGAL浓度比率高于针对该比率确定的诊断截止值时，才会将这样的患者诊断为具有导致ARD的肾损伤，从而在这些患者中提供比NGAL的血浆或尿水平单独所能提供的更高的对于导致ARD的肾损伤的诊断特异度。
本发明的方法对于这样的患者也将是有用的：他们虽然没有危重病情，但已遭受了明确的导致肾缺血性损伤的创伤(如外科手术)或已暴露于肾毒性剂(如化疗剂或抗微生物剂或者静脉内给药用于诊断性成像的造影剂)。在这些情况中，及早地鉴定出其肾脏受到了所述程序的影响因而有发生ARF之虞的患者，有助于更早、更积极地进行干预以预防ARF的发生。
本发明的方法在兽医学、实验动物中肾病理生理学的研究、以及实验动物中针对候选化疗剂或诊断试剂的肾毒性试验等方面也将是有用的。
体液样品(例如尿、血浆或血清样品)中NGAL的测量，可以用任何能提供满意的分析特异性、敏感度和精确度的方法来实现。优选的方法为结合测定法，这些测定法利用一种或多种对NGAL特异的结合分子，它们能够与样品所来源的哺乳动物物种的NGAL结合。这样的结合分子包括但不限于针对NGAL的多克隆或单克隆抗体或者通过其他手段产生的特异性NGAL结合分子。
在优选的方法中，使用针对重组NGAL产生的单克隆抗体，所述重组NGAL来自待分析的哺乳动物物种。将一个抗体连接到固体载体以从样品(例如尿样品、血浆或血清样品)捕获NGAL，而将另一个抗体用多种标记底物或化学模块中的至少一种来标记，所述标记底物或化学模块包括但不限于生色团、染料复合物、荧光团、电化学或化学发光标志物，或生物素或酶，它们可用本领域技术人员公知的许多方法中的任何一种来检测。固体载体可以例如是用于酶联免疫吸附测定(ELISA)的聚苯乙烯或聚氯乙烯表面，或者胶乳(聚苯乙烯)颗粒，或者由压缩聚乙烯颗粒构成的过滤填料(filterfrit)，或者多孔硝酸纤维素基质，或者实际上任何用在免疫化学分析中合适的载体。也可以使用包被有可特异性结合NGAL的分子的颗粒利用颗粒强化的(particle-enhanced)的比浊或浊度法(turbidimetric or nephelometricmethods)测定样品中的NGAL浓度，不管是通过手工完成还是用自动化方法完成。
根据本发明测定尿或血液样品中NGAL的优选手段包括浸渍片(dipstick)、侧向流(免疫层析)或微柱(minicolumn)试验，或者快速时间解析免疫荧光测定，或者基于双光子激发微粒的免疫测定，所有这些方法都可对样品进行迅速、接近受试者(near-subject)的分析。不过，正如本领域技术人员阅读本公开文本后将理解的，可使用其他方法测定NGAL，包括在中心实验室中实施的自动化方法，其中仪器容许对样品进行随机存取用于紧急分析。
在优选实施方案中，本发明的方法不包括对人体实施的手术、治疗或诊断步骤。
以下提供非限制性实施例以进一步举例说明本发明。
实施例
实施例1：来源于90例重症监护收治的成年患者的458个配对的尿和血浆样品中的尿∶血浆NGAL浓度比针对ARF或ARD的诊断力
测定了每天早晨从收治于重症监护室的总共90例患者收集的458个配对的尿和血浆样品中的NGAL(利用一种能提供实施例5中所述的夹心ELISA的NGAL ELISA试剂盒)。根据出院摘要和常规血液试验结果，将患者分类(在不知晓NGAL数据的条件下)为收治期间有一次或多次ARF或ARD发作的患者(37例，提供192个与采样时或采样24小时后ARF或ARD发作有关的配对样品)，以及没有ARF或ARD发作的患者(53例，266个配对样品)。在与ARF或ARD发作有关的样品对中，尿∶血浆NGAL浓度比的中值为3.18(范围0.33-40.02)，而在与ARF或ARD无关的样品对中尿∶血浆NGAL浓度比的中值为0.20(范围0.01-1.14)。
记录了每例个体患者的比率的中值、最大值和最小值，并针对有和没有ARF或ARD的所有患者确定了这些值的中值和范围。对于有ARF或ARD的患者，中值比值的中值为3.17(范围1.53-5.73)，最小比值的中值为1.18(范围0.33-1.72)，最大比值的中值为16.45(范围16.45-40.02)。对于没有ARF或ARD的患者，中值比值的中值为0.19(范围0.10-0.34)，最小比值的中值为0.05(范围0.01-0.07)，最大比值的中值为0.74(范围0.60-1.14)。
通过绘制如图1所示的ROC曲线确定了尿∶血浆NGAL浓度比对于ARF或ARD的诊断力。曲线下面积为0.991，确定的截止值——高于该值的尿∶血浆NGAL浓度比可诊断实际或即将发生ARF或ARD，且具有最佳的总体诊断性能特征——为0.73。取该截止值时，诊断敏感度为96.3％，诊断特异度为97.4％，阳性预测价值为96.3％，阴性预测价值为97.4％。但是，可以选择其他截止值来提高某些诊断性能特征，而以损失其他的诊断特征为代价。举例来说，截止值0.33，这是在有ARF或ARD的患者中观察到的最小比值，可产生100％的诊断敏感度和阴性预测价值，而诊断特异度将降低至77.1％，阳性预测价值将降低至75.9％。截止值1.14，这是在没有ARF或ARD的患者中观察到的最大比值，可产生100％的阳性预测价值和诊断特异度，而阴性预测价值将为92.7％，诊断敏感度为89.1％。
实施例2：NGAL浸渍测试
由聚苯乙烯表面构成的浸渍片的分析区域包被有针对人NGAL的捕获抗体。将等分的经过离心、稀释的样品加到第一个管中的针对NGAL的酶标检测抗体溶液中，将浸渍片浸渍于其中。酶标检测抗体与NGAL的复合物结合到浸渍片上，然后用自来水洗涤，放到第二个管中的显色底物溶液中。读取特定时间内底物溶液中显现的颜色，或者是通过肉眼并与指示尿样中NGAL浓度的颜色强度表相比较，或者是使用简单的比色计，其例如可以按程序直接显示NGAL浓度。
实施例3：NGAL侧向流设备
侧向流设备由条形的多孔硝酸纤维素或其他具有能促进液体通过毛细管作用力迁移的管道的材料构成，在其远端(distal end)附近包被有涂施成横向条带的针对NGAL的捕获抗体。在捕获抗体条带的更远端(distally to thecapture antibody end)置有另一抗体横向条带，该抗体针对所述捕获抗体的来源物种的抗体，作为条形功能的对照。所述条形的近端包含针对NGAL的检测抗体，所述检测抗体吸附或连接到带标记的聚苯乙烯颗粒或染料复合物颗粒上。当等分的经离心或过滤的样品置于所述条形的近端时，连接于检测抗体的带标记颗粒通过毛细管吸引作用沿所述条形移动。当到达捕获抗体条带时，只有那些已结合了样品中NGAL的颗粒将被保留，产生可检测条带。而到达针对检测抗体之抗体的对照条带的颗粒，无论是不是已结合了任何NGAL，都将产生可检测条带。就带标记条带的强度而言，若是有色颗粒，可通过肉眼读取；或者借助于针对所使用的标记物的合适检测设备。两条带中都有显色或标记物积聚表示阳性结果，而仅在对照条带中显色或有其他标记物则表示阴性结果。在对照带中没有显色或其他标记物表示条形的功能不足。试验的敏感度可通过稀释所施用的样品来调节，调节试验的敏感度以使得只有高于确定的截止值的NGAL浓度方可产生阳性结果。试验的敏感性还可以通过将检测抗体与标记和未标记颗粒的混合物连接来调节。可以将多个批次的条形预校准并配备以检测设备可读的校准编码，这样就可以从该设备读取定量或半定量结果。本领域技术人员公知，该侧向流技术各个方面的许多变化都是可能的。
实施例4：NGAL微柱试验
微柱包含由压缩聚乙烯颗粒构成的填料(frit)，其允许流体和细胞通过。填料包被有针对人NGAL的捕获抗体。将微柱整合在设备中，所述设备通过自动化液体操作能够以固定流速和体积施加稀释的样品，之后加入与染料复合的检测抗体。洗涤溶液通过后，通过光散射光度测定法读取填料的颜色强度。多个批次的填料经过预校准，微柱配备有能被该设备读取的校准编码，这样该仪器可直接显示定量结果，而不必先用标准品校准。
实施例5：NGAL夹心ELISA
如Kjeldsen等所述(1996)制备了纯化的重组人NGAL，用作标准和校准材料。针对NGAL的抗体是Kjeldsen等所描述的那些(1993；1996)。将聚苯乙烯ELISA板于4℃用抗体211-1包被过夜，所述抗体溶于0.05M碳酸钠缓冲液(pH 9.4)中，浓度2μg/mL，每孔使用100μL。将所述孔倒空，用含0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲盐水洗涤缓冲液(pH 7.4)洗涤3次，并吸干。将校准物和样品在稀释缓冲液(含0.1mg/mL牛白蛋白的洗涤缓冲液)中的稀释物以100-μL的体积加到孔中，室温在摇床上温育1小时。然后如前所述倒空孔，洗涤并吸干。将生物素化抗体211-2(0.25μg/mL，于稀释缓冲液中)加到各孔中，每孔100μL，室温在摇床上温育1小时。然后如前所述倒空孔，洗涤并吸干。将辣根过氧化物酶和链霉抗生物素蛋白(Zymed，CA)的复合物(以1/2000的稀释于稀释缓冲液中)加到各孔，每孔100μL，室温在摇床上温育1小时。然后如前所述倒空孔，洗涤并吸干。然后将含四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine)和过氧化物的底物溶液(TMB-ONE，Kem-En-Tech，Denmark)加到各孔，每孔100μL，室温黑暗中温育8分钟整，之后向每孔加入50μL 1M硫酸，终止颜色反应。然后用ELISA板酶标仪读取各孔在450nm波长处的吸光度，并减去650nm的吸光度。然后根据标准曲线计算了样品中NGAL的浓度，所述标准曲线由已知浓度校准物质的吸光度读数生成。
测定的范围为0.02ng/mL到1ng/mL，检出限(相对于零的差异的95％置信限)为2.4pg/mL，在经稀释的纯化校准物质和样品之间显示出平行性。
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Claims (14)

1.一种诊断或监测在哺乳动物中已导致急性肾衰竭或表明有发生急性肾衰竭的即刻风险的肾损伤之存在的方法，所述方法包括以下步骤：
i)测定从哺乳动物采取的尿样品中NGAL的浓度；
ii)测定来自从同一哺乳动物采取的血液样品的血浆或血清中NGAL的浓度，所述血液样品是在采集尿样品的期间即将开始之前、该期间之中、或该期间刚结束时采取的；
iii)计算尿中的NGAL浓度对血浆或血清中的NGAL浓度的比率，将得到的比率的值与根据在有或没有肾损伤迹象的相同物种的哺乳动物中观察到的所述比率的范围而确定的截止值相比较，大于截止值的值说明发生了肾损伤。
2.权利要求1的方法，其中计算血浆或血清中的NGAL浓度与在尿中的NGAL浓度的比率，将该比率与根据在有或没有肾损伤迹象的相同物种的哺乳动物中观察到的所述比率的范围而确定的截止值相比较，小于截止值的值说明发生了肾损伤。
3.权利要求1的方法，其中所述NGAL尿浓度对NGAL血浆浓度的比率的截止值优选0.30或更高的值，例如0.33，或者更高的值，例如0.33-0.73且包括0.33和0.73在内的任何值，或者更高的值，例如0.73-1.14且包括0.73和1.14在内的任何值，或者更高的值，例如任何大于1.14的值。
4.权利要求2的方法，其中所述NGAL血浆或血清浓度对NGAL尿浓度的比率的截止值优选3.33或更低的值，例如3.0，或者更低的值，例如1.37-3.0且包括1.37和3.0在内的任何值，或者更低的值，例如0.88-1.37且包括0.88和1.37在内的任何值，或者更低的值，例如0.88-0的任何值，这些值是权利要求3中的相应值的近似倒数。
5.前述权利要求的监测方法，还包括如下步骤：将权利要求1的步骤i)、ii)和iii)重复进行一次或多次。
6.前述权利要求的监测方法，还包括如下步骤：在24小时内，例如在12小时内，如6小时内，例如3小时内，如1小时内，例如30分钟内，重复进行权利要求1的步骤i)、ii)和iii)。
7.上述权利要求中任一项的监测方法，还包括如下步骤：在急性肾衰竭治疗已开始或结束后，重复权利要求1的步骤i)、ii)和iii)。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中发生急性肾衰竭的风险是由于缺血性肾损伤所致的。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中发生急性肾衰竭的风险是由于炎症、感染或肿瘤性疾病的并发症所致的。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中发生急性肾衰竭的风险是由于需要重症监护的任何起因的危重病情所致的。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中发生急性肾衰竭的风险是由于外科介入所致的。
12.前述权利要求中任一项的方法，其中发生急性肾衰竭的风险是由于施用肾毒性试剂所致的。
13.前述权利要求中任一项的方法，其中哺乳动物是人类个体。
14.前述权利要求中任一项的方法，其中借助与适用该方法的哺乳动物物种的NGAL特异性结合的分子来测量NGAL。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20100324