CN101657547A - 用于诊断和治疗结肠癌相关疾病的基于微小rna的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供诊断和治疗结肠癌的新方法和组合物。本发明还提供鉴定肿瘤形成抑制剂的方法。

Description

用于诊断和治疗结肠癌相关疾病的基于微小RNA的方法和组合物
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2006年7月13日提交的美国临时申请No.60/807,304和2007年6月1日提交的美国临时申请No.60/932,736的权益，所述临时申请的公开内容以引用方式并入本文。
关于联邦赞助研究的说明
[0002]本发明在政府资助下进行，且政府在国立卫生研究院授权No.xxx和国立癌症研究所授权下对所述发明具有权力。
背景技术
[0003]结肠腺癌是世界上主要的癌症死亡原因1。
结直肠癌是美国第三最常见和第二主要的癌症死亡原因2。散发性结肠腺癌最初为腺瘤并通过分子进展、细胞和组织的变化来演化3。虽然5-年死亡率在最近30年内适当降低4，仍需要鉴定所述疾病的新预后生物标记物和治疗靶。目前，化疗法具有重要的治疗价值但手术是治疗的唯一治愈形式5。
[0004]理想的治疗靶应该与疾病原因上相关，且经可设计治疗干预进行修正；而理想的生物标记应该易于测量并与临床结果具有强相关性。微小RNA符合这两个标准6-8。
[0005]微小RNA为18-25个核苷酸的非编码RNA分子，其调节许多基因的翻译9。从发现它们开始10，11，已经发现它们调节多种细胞过程，包括细胞凋亡12-14，分化10，11，15和细胞增殖16。微小RNA在癌变中起因果作用16，17。微小RNA的表达水平在大多数肿瘤类型18，19，包括结肠癌19-22中被改变。在大多数慢性淋巴细胞白血病中微小RNA miR-15和miR-16a被删除或下调23。特异性微小RNA的实验操作调节小鼠模型系统中肿瘤发育16，24-26。还证实了微小RNA对慢性淋巴细胞白血病7、肺癌8、和神经母细胞瘤27的预后潜力。
[0006]微小RNA的异常表达可能引起癌变，抑制特异性微小RNA可能具有治疗意义。可以设计修饰的反义寡核苷酸来特异性抑制微小RNA的功能28。Antagomirs为一种被证明在抑制小鼠体内微小RNA功能中是有效的反义寡核苷酸29。由于微小RNA功能的特异性抑制剂易于设计，使得其成为治疗靶的候选。
发明概述
[0007]在一个广义的方面，本文提供一种诊断受试者是否患有结肠癌相关疾病、处于发展出结肠癌相关疾病的风险中、或具有降低的结肠癌相关疾病存活预后的方法。所述方法包括：测量来自受试者的测试样品中至少一种miR基因产物的水平，其中相对于对照样品中对应miR基因产物的水平，测试样品中所述miR基因产物水平的改变指示所述受试者患有结肠癌相关疾病或处于发展结肠癌相关疾病的风险中。在一个具体方面，所述至少一种miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。在一个实施方案中，所述的一种miR基因产物是miR-21。
[0008]在另一广义的方面，本文提供一种测试至少结肠癌相关疾病应答的开始、对结肠癌相关疾病应答的倾向或降低的存活预后的方法，其包括：
[0009](1)测定来自受试者的样品中至少一种标记物的表达水平；所述至少一种标记物包括至少一种m iR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组；
[0010](2)比较步骤(1)中测定的表达水平与来自健康受试者的样品中所述标记物的对照表达水平；和
[0011](3)当步骤(2)中的比较结果显示：i)受试者中的至少一个标记物的表达水平比对照中的高，或ii)受试者中的至少一个标记物的表达水平比对照中的低时，判断受试者患有结肠癌相关疾病。
[0012]样品可包括组织、血液、血浆、血清、尿和粪便中的一种或多种。此外，所有的方法步骤可以在体外进行。
[00013]在另一个广义的方面，本文提供一种诊断受试者是否患有结肠癌相关疾病、处于发展出结肠癌相关疾病的风险中、或是否具有降低的结肠癌相关疾病存活预后的方法，包括：
[0014](1)逆转录来自获自受试者的测试样品的RNA以提供一组靶寡聚脱氧核苷酸；
[0015](2)使所述靶寡聚脱氧核苷酸与微阵列杂交以提供测试样品的杂交谱，所述微阵列包括miRNA特异性探针寡核苷酸；和
[0016](3)比较测试样品的杂交谱与对照样品产生的杂交谱，其中至少一个miRNA信号的改变指示所述受试者患有结肠癌相关疾病，处于发展结肠癌相关疾病的风险中，或具有降低的结肠癌相关疾病存活预后。
[0017]在一个具体的方面，相对于对照样品产生的信号，至少一个miRNA信号是被上调或下调的。此外，所述微阵列可包括一个或多个miRNA的miRNA特异性探针寡核苷酸，所述miRNA选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
[0018]在另一个广义的方面，本文提供一种抑制受试者中肿瘤形成的方法，所述受试者患有或怀疑患有结肠癌相关疾病，其中相对于对照细胞，在受试者的癌细胞中至少一种miR基因产物是被上调或下调的，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组，包括：
[0019](1)当癌细胞中至少一种miR基因产物被下调时，给受试者施用有效量的至少一种分离的miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组，从而抑制受试者中肿瘤形成；或
[0020](2)当癌细胞中至少一种miR基因产物被上调时，给受试者施用有效量的至少一种抑制所述至少一种miR基因产物表达的化合物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组，从而抑制受试者中肿瘤形成。
[0021]在一个具体的方面，在步骤(1)和/或步骤(2)中至少一个分离的miR基因产物是miR-21、或其分离的变体、或其生物活性片段或功能等价物，或与其结合的抗体。
[0022]在另一个广义的方面，本文提供一种抑制患有结肠癌的受试者中肿瘤形成的方法，包括：
[0023](1)相对于对照细胞，测定受试者的癌细胞中至少一种miR基因产物的量；和
[0024](2)改变在癌细胞中表达的miR基因产物的量，通过：
[0025](i)给受试者施用有效量的至少一种分离的miR基因产物，如果在癌细胞中表达的所述miR基因产物的量少于对照细胞中表达的miR基因产物的量，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组；或
[0026](ii)给受试者施用有效量的至少一种用于抑制至少一种miR基因产物的化合物，如果在癌细胞中表达的miR基因产物的量大于对照细胞中表达的所述miR基因产物的量；
[0027]从而抑制受试者中肿瘤形成。
[0028]在一个具体的方面，步骤(i)中的至少一种分离的miR基因产物是miR-21或其分离的变体或生物活性片段。此外，在某些实施方案中，在步骤(ii)中的至少一种miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组，或其分离的变体或生物活性片段。
[0029]在另一个广义的方面，本文提供一种肿瘤形成抑制剂的鉴定方法，包括：给细胞提供一种测试试剂，并测量与结肠癌相关疾病中变化的表达水平相关的至少一种miR基因产物的水平，其中相对于合适的对照细胞，所述细胞中miR基因产物水平的升高或降低指示所述测试试剂为肿瘤形成的抑制剂。
[0030]在另一个广义的方面，本文提供一种肿瘤形成抑制剂的鉴定方法，包括：给细胞提供一种测试试剂，并测量与结肠癌相关疾病中改变的表达水平相关的至少一种miR基因产物的水平，其中相对于合适的对照细胞，所述细胞中miR基因产物水平的降低指示所述测试试剂为肿瘤形成的抑制剂。
[0031]在另一个广义的方面，本文提供一种用于评估一种或多种代谢途径的标记物，所述代谢途径对至少一种结肠癌相关疾病的引发、进展、严重性、病理、恶性(aggressiveness)、分期、活性、残疾、死亡率、发病率、疾病亚分类或其他潜在致病或病理特征的至少一种有贡献，其中所述标记物包括一种或多种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
[0032]在另一个广义的方面，本文提供包含一个或多个本文所述标记物的组合物。
[0033]在另一个广义的方面，本文提供鉴定引发或发展受试者中至少一种结肠癌相关疾病的潜力的方法，所述方法提供对一种或多种本文所述标记物的测量。在某些实施方案，在分离的样品中存在一种或多种标记物，且所有的方法步骤在体外进行。
[0034]在另一个广义的方面，本文提供测试结肠癌相关疾病的试剂，其中所述试剂包含多核苷酸，所述多核苷酸包括至少一种本文所述标记物的核苷酸序列或与所述标记物的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
[0035]在另一个广义的方面，本文提供测试结肠癌相关疾病的试剂，其中所述试剂包含抗体，所述抗体识别由至少一种本文所述的标记物编码的蛋白。
[0036]在另一个广义的方面，本文提供测试结肠癌相关疾病的DNA芯片，探针固定在所述芯片上以测试至少一种本文所述的标记物。
[0037]在另一个广义的方面，本文提供一种评估疗法预防、诊断和/或治疗至少一种结肠癌相关疾病的效力的方法，包括：
[0038]1)给动物施用一种疗法，评估所述疗法的效力，和
[0039]2)通过评价至少一个本文所述的标记物测定在治疗或预防结肠癌相关疾病中待测试的治疗的效力水平。
[0040]在某些实施方案中，候选治疗剂包括药物组合物、保健组合物和顺势疗法组合物的一种或多种。此外，待评估的疗法可用于人受试者。在某些实施方案中，所述方法不是通过手术或疗法来治疗人体或动物体的方法。
[0041]在另一广义的方面，本文提供一种评估至少一种材料引发动物模型中结肠癌相关疾病应答的能力的方法，所述方法包括：
[0042]1)在使动物与足以引发动物中结肠癌相关疾病应答的量的一种或多种材料接触后，测量一种或多种本文所述的被上调或下调的标记物；和
[0043]2)测定上调或下调标记物的至少一种是否具有引发结肠癌相关疾病应答的能力。
[0044]在另一广义的方面，本文提供一种治疗结肠癌相关疾病的药物组合物，包括：至少一种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组；和药学可接受的载体。
[0045]在另一广义的方面，本文提供治疗结肠癌的药物组合物，其包括至少一种miR表达抑制化合物和药学可接受的载体，其中所述的至少一种miR表达抑制化合物对miR基因产物具有特异性，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
[0046]在另一广义的方面，本文提供一种产品，包括：至少一种与结肠癌相关疾的标记物结合的捕获试剂，所述标记物选自本文所述标记物的至少一种。
[0047]在另一广义的方面，本文提供筛选用于治疗结肠癌相关疾病的治疗剂的候选化合物的试剂盒，其中所述试剂盒包括：至少一种本文所述的标记物的一种或多种试剂，和表达至少一种标记物的细胞。在某些实施方案中，使用包含抗体或抗体片段的试剂检测所述标记物的存在，所述抗体或抗体片段与至少一种标记物特异性结合。同样，在某些实施方案中，所述试剂是标记的、放射标记的、或生物素标记的，和/或所述抗体或抗体片段是放射标记的、生色团标记的、荧光团标记的或酶标记的。在一个具体的实施方案中，所述试剂盒进一步包括包含至少一种标记物的容器。同样，所述试剂可包括下述的一种或多种：抗体、附带或可附带的探针、和固定的金属螯合物。
[0048]在另一广义的方面，本文提供结肠癌相关疾病的筛选测试，包括：
[0049]使一种或多种权利要求20的标记物与所述标记物的底物和与测试试剂接触，和
[0050]测定所述测试试剂是否调节所述标记物的活性。
[0051]在某些实施方案中，所有的方法步骤可以在体外进行。
[0052]在另一广义的方面，本文提供预测受试者中结肠癌相关疾病存在的微阵列，包含针对至少一种权利要求20的标记物的抗体。
[0053]在另一广义的方面，本文提供方法、组合物等，其中通过检测转录多核苷酸或其部分的存在来评估标记物的表达水平，其中所述转录的多核苷酸包括所述标记物的编码区。同时，所述样品可以是结肠癌相关体液或组织。在一个具体的实施方案中，所述样品包括来自患者的细胞。
[0054]在另一广义的方面，本文提供治疗、预防、逆转或限制在需要其的个体中结肠癌相关疾病并发症的严重性的方法，包括：
[0055]给个体施用干扰至少一种结肠癌相关疾病应答信号传导途径的试剂，以足以干扰所述信号传导的量，其中所述试剂包含至少一种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
[0056]在另一广义的方面，本文提供干扰至少一种结肠癌相关疾病应答信号传导途径的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、预防、逆转或限制个体中结肠癌相关疾病并发症的严重性，其中所述试剂包含至少一种miR基因产物，所述m iR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
[0057]在另一广义的方面，本文提供治疗、预防、逆转或限制在需要其的个体中结肠癌相关疾病并发症的严重性的方法，包括给所述个体施用干扰至少一种结肠癌相关疾病应答级联的试剂，其中所述试剂包含至少一种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b，miR-203及其组合组成的组。
[0058]在另一广义的方面，本文提供干扰至少一种结肠癌相关疾病应答级联的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、预防、逆转或限制个体中结肠癌相关疾病并发症的严重性，其中所述试剂包含至少一种miR基因产物，所述m iR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
[0059]在另一广义的方面，本文提供包括一种包含数据库的计算机可读介质，所述数据库具有多种数据编码的参考谱，其中至少第一参考谱代表来自一个或多个受试者的一个或多个样品中至少第一标记物的水平，所述受试者展示结肠癌相关疾病应答的标记(indicia)，
[0060]其中所述标记物包括一种或多种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
[0061]在某些实施方案中，所述计算机可读介质包含至少第二参考谱，其代表来自一个或多个受试者的一个或多个样品中至少第二标记物的水平，所述受试者展示结肠癌相关疾病应答的标记，或受试者患有结肠癌相关疾病。
[0062]在另一广义的方面，本文提供一种测定患者是否患有，或倾向于患有结肠癌相关疾病，或具有差的结肠癌相关疾病存活预后的计算机系统，包括本文所述的数据库，和包括计算机可执行代码的服务器，其使计算机接收受试者的谱，从数据库识别匹配的在诊断上与受试者的谱相关的参考谱，并产生所述受试者是否患有或倾向于患结肠癌相关疾病的指示。
[0063]在另一广义的方面，本文提供一种评价受试者中结肠癌相关疾病的存在、不存在、性质或程度的计算机辅助方法，包括：
[0064]1)提供包括对来自获自受试者的样品的数据进行分类的模型或运算法则，其中，所述分类包括就至少一种标记物的存在、不存在或量分析所述数据，其中所述标记物包括一种或多种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
[0065]2)输入获自受试者的生物样品的数据；和
[0066]3)分类生物样品以指示结肠癌相关疾病的存在、不存在、性质或程度。
[0067]在另一广义的方面，至少一种mi R基因产物及其组合包括分离的变体、或其生物活性片段或功能等价物、或与其结合的抗体。
[0068]在另一广义的方面，本文提供结肠癌的动物模型，其中下述生物或化学过程的至少一个(上调或下调一种或多种miR基因产物)在所述动物模型中发生，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。在某些实施方案中，所述动物模型是非人脊椎动物。在具体的实施方案中，所述动物模型是小鼠、大鼠、兔或灵长类动物。
[0069]在附图的启发下阅读时，从下述优选实施方案的详细描述中，本发明的各种目的和优点对本领域技术人员来说是明显的。
附图说明
[0070]专利或申请文件包括至少一副以彩色绘制的附图。在提出要求和支付必须的费用后办事处(Office)可以提供带有彩色附图的本专利或专利申请出版物的副本。
[0071]图1a-1g：miR-21在结肠腺癌中以较高水平表达，在更晚期肿瘤中表达逐步增加。
[0072](图1a)对miR-21的原位杂交进行最优化以区分miR-21的高表达和低表达。人肿瘤(T)中的结肠上皮细胞与临近的非肿瘤组织(N)相比表达较高水平的miR-21。(图1c)在高的放大倍率下，肿瘤组织中结肠上皮细胞的细胞核和细胞质在肿瘤组织中表达显著量的miR-21。(图1e)非肿瘤组织在相同的放大倍率下不显示miR-21的显著表达。
[0073](图1b，图1d，图1f)如所预料的，在低或高的放大倍率下，在肿瘤组织和非肿瘤组织的连续切片中争夺对照探针(thescramble control probe)没有显示显著染色。标尺线(scale bars)(图1c-f)显示在晚期肿瘤中500μM(g)mi R-21以较高水平表达。点图表示腺瘤和肿瘤表达水平的miR-21相对Ct值(来自定量RT-PCR)，其已分别针对配对非腺瘤或非肿瘤组织进行标准化。组织类型从腺瘤到I-IV期的肿瘤进行排序。线条显示中间值。存在越晚期的肿瘤具有越高的miR-21表达的明显趋势(在排列的组中趋势的非参数测试)。
[0074]图2：miR-21在较晚期的肿瘤中以较高水平表达。使用微小RNA微阵列来测量miR-21的表达水平。点图代表miR-21 Iog2(肿瘤/非肿瘤比例)，如根据来自原来的群(cohort)的微小RNA微阵列所计算的。使用来自微阵列的探针hsa-miR-21-prec 17No 1来测量miR-21表达。排除基于微阵列数据具有不可测的miR-21表达的组织。组织类型从TNM的I期至IV期肿瘤进行排列。线条表示中间值。存在越晚期的肿瘤具有越高的miR-21表达的明显趋势(p＝0.04；在排列的组中趋势的非参数测试)。
[0075]图3a和3b：肿瘤中高的miR-21表达预测在两个独立群中具有典型腺癌组织结构的患者中差的存活。所述分析排除具有粘液腺癌或腺鳞状癌组织结构的受试者。
[0076](图3a)在马里兰测试群中使用微小RNA微阵列来测量肿瘤和非肿瘤组织的微小RNA表达水平。排除基于微阵列数据具有不可测的miR-21表达的组织。基于最高三分位组(tertile)对高的miR-21表达进行分类。红线表示具有高表达的个体，而绿线对应低表达。对于非肿瘤组织，24/69组织被分类为高的，而26/72肿瘤被分类为高的。肿瘤中高的miR-21表达(右)与差的存活相关，而其在非肿瘤组织中没有关联。
[0077](图3b)验证独立群中肿瘤高的miR-21表达与差的预后的相关性。通过定量RT-PCR测量miR-21的表达水平。高的表达基于最高三分位组。35/103非肿瘤组织被分类为高的，且34/103肿瘤组织被分类为高的。P-值为根据Kaplan-Meier分析的log秩p-值。在所有线上的X′s表示检查个体的时间。
[0078]图4a和4b：肿瘤中高miR-21表达预测两个独立群中的差的存活。所述分析包括所有受试者，不考虑腺癌组织结构。
[0079](图4a)在马里兰测试群中使用微小RNA微阵列来测量肿瘤和非肿瘤组织的微小RNA表达水平。排除基于微阵列数据检测不到miR-21表达的组织。基于最高三分位组对高miR21表达进行分类。红线表示具有高表达的个体，而绿线对应低表达。对于非肿瘤组织，26/74组织被分类为高的，而28/79肿瘤被分离为高的。肿瘤中高的miR-21表达(右)与差的存活相关，而其在非肿瘤组织中没有关联。
[0080](图4b)对独立群中肿瘤中高的miR-21表达与差的预后的相关性进行验证。通过定量RT-PCR测量miR-21的表达水平。高表达基于最高三分位组。37/111非肿瘤组织被分类为高的，且37/111肿瘤组织被分类为高的。所有p-值为根据Kaplan-Meier分析的log秩p-值。在所有线上的X′s表示检查个体的时间。
[0081]图5a、5b和5c：在常规腺癌组织结构情况下，高的miR-21表达与对辅助化疗低的应答有关。所述分析包括来自验证群的受试者，排除具有粘液腺癌组织结构或腺鳞状癌组织结构的受试者。
[0082](图5a)通过miR-21表达水平比较具有常规腺癌组织结构的TNM II/III期受试者和接受辅助化疗的受试者的存活率。对于77个II/III期的受试者，25个被分类为低的miR-21并接受治疗，28个为低miR-21且不接受治疗，11个为高的miR-21并接受治疗，和13个为高的miR-21且不接受治疗。对于接受辅助化疗的II/III期受试者，肿瘤中高的miR-21表达与差的存活相关(p＝0.03)。
[0083](图5b)比较具有常规腺癌组织结构的TNM II期受试者。对于33个II期受试者，8个被分类为低的miR-21并接受治疗，15个为低miR-21且不接受治疗，3为高miR-21的接受治疗，和7个为高miR-21的且不接受治疗。对于所有接受辅助化疗的II期的受试者，在研究期间存活。
[0084](图5c)比较具有常规腺癌组织结构的TNM III期受试者。对于44个III期受试者，17个被分类为低的miR-21并接受治疗，13个为低的miR-21且不接受治疗，8为高的miR-21并接受治疗，和6个为高的miR-21且不接受治疗。对于接受辅助化疗的III期受试者，肿瘤中高的miR-21表达与差的存活相关(p＝0.02)。在所有线上的X′s表示检查个体的时间。
[0085]图6a、6b和6c：马里兰测试群和香港验证群的联合分析，检测肿瘤和接受辅助化疗之间miR-21的表达与预后的相关性。所述分析包括来自两个群的所有TNM的II/III期受试者。排除具有粘液腺癌组织结构或腺鳞状癌组织结构的个体。左边的柱包括分析接受辅助疗法与预后之间的相关性的Kaplan-Meier图。中间的柱包括对肿瘤中高的miR-21表达与预后相关性的分析，且右边的柱基于化疗和miR-21表达情况对个体进行细分。
[0086](图6a)所有TNM的II/III期受试者。对于119个II/III期的受试者，40个被分类为低的miR-21并接受治疗，41个为低的miR-21但不接受治疗，16为高的miR-21并接受治疗，和22个为高的miR-21但不接受治疗。高的miR-21表达与接受化疗的那些(p＝0.003)和不接受化疗的那些(p＝0.04)的差的存活相关。
[0087](图6b)所有TNM的II期受试者。对于52个II/III期受试者，10个被分类为低的miR-21并接受治疗，25个为低miR-21但不接受治疗，4为高的miR-21并接受治疗，和13个为高的miR-21但不接受治疗。高的miR-21表达与预后之间的相关性在接受化疗的个体(p＝0.11)或不接受化疗的个体(p＝0.06)中不是统计学显著的。
[0088](图6c)所有TNM的III期受试者。对于67个III期的受试者，30个被分类为低的miR-21并接受治疗，16个为低miR-21但不接受治疗，12为高的miR-21并接受治疗，和9个为高的miR-21但不接受治疗。高的miR-21表达与在接受化疗的III期受试者中差的存活显著相关(p＝0.007)，但在不接受化疗的受试者中不显著相关(p＝0.30)。在所有线上的X′s表示检查个体的时间。
[0089]图7a-7c.总的miRNA谱与临床TNM分期和存活预后相关。miRNA TIN比例的分级聚类导致形成两个组，任意称为A组和B组。图7a显示所得的HEAT图和聚类分配。这两个组由对TNM分期具有显著不同存活预后的个体组成，其中与A组个体相比，B组个体更有可能被诊断为III或IV期(图7b)。Kaplan-Meier分析显示B组的存活预后更差(图7c)。
[0090]图8a-8i.个体miRNA的TIN比例预测存活预后。此处展示的图通过对9个miRNA的每一个进行TNM分期(左)和Kaplan-Meier分析(右)显示TIN比例。Y轴(TNM分期图显示的TIN比例)显示每一个个体的经log(2)转化的TIN比例，而TNM分期(I、II、III或IV)显示Y轴组个体。显示的权值为通过分期进行分组的个体的平均TIN比值的趋势的非参数测试的结果。Kaplan-Meier图包括对于那个具体的miRNA具有TIN比例数据的所有个体。发现TIN比例与临床分期和存活预后均有关。
[0091]图9a和9b.9个miRNA的miRNA信号预测死于结肠癌的风险。各个miR-21、miR-106a、miR181b、miR-16b、miR-203、let-7g、miR-29a、miR-103-2和miR-10a的TIN比例显示对结肠癌预后的预测。这9个miRNA的TIN比例的分级聚类将个体分成具有显著不同存活预后两组(1A)(1B)。B组个体死于结肠癌的风险比A组高得多。如果个体缺少大于组成miRNA信号的9个TIN比例中的2个，从所述分析中排除它们。
优选实施方案的详述
[0092]在一个广义的方面，本文提供对具体微小RNA的鉴定，相对于正常对照细胞，所述微小RNA的表达在与不同结肠癌相关的癌细胞中改变。
[0093]如在本文可互换使用的，“miR基因产物”、“微小RNA”、“miR”或“miRNA”指来自miR基因的未加工(例如，前体)或经加工的(例如，成熟)的RNA转录物。因为所述miR基因产物没有被翻译成蛋白，术语“miR基因产物”不包括蛋白。未加工的miR基因转录物还称为“miR前体”或“miR prec”并典型地包括长度约为70-100个核苷酸的RNA转录物。可以通过用RNAse(例如，Dicer、Argonaut或RNAse III(例如，大肠杆菌RNAse III))消化，将所述miR前体进行加工成具有19-25个核苷酸的活性RNA分子。所述具有19-25个核苷酸的活性RNA分子还称为“经加工的”miR基因转录或“成熟”miRNA。
[0094]所述具有19-25个核苷酸的活性RNA分子可以通过天然加工途径(例如，使用完整细胞或细胞裂解物)或通过合成加工途径(例如，使用分离的加工酶，诸如分离的Dicer、Argonaut或RNAseIII)获自miR前体。应理解所述具有19-25个核苷酸的活性RNA分子还可以通过生物或化学合成直接产生，无需从miR前体进行加工。当在本文中以名字提及微小RNA时，所述名字对应于前体和成熟形式，除非另外指出。
[0095]在一个方面，本文提供诊断受试者是否患有结肠或处于发展结肠癌风险中的方法，其包括测量来自受试者的测试样品中至少一种miR基因产物的水平，并比较测试样品中所述miR基因产物的水平与对照样品中对应miR基因产物的水平。如本文所使用的，“受试者”可以是任何患有或怀疑患有实体癌的哺乳动物。在一个优选的实施方式中，所述受试者是患有或怀疑患有结肠癌的人。
[0096]在一个实施方案中，在所述测试样品中测量的至少一种miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。在一个具体的实施方案中，所述miR基因产物是miR-21。
[0097]所述结肠癌相关疾病可以是任何由结肠组织引起的障碍或癌症。所述癌症典型地与肿瘤块的形成和/或存在相关，例如腺癌。
[0098]在一个实施方案中，所述结肠是腺癌和在所述测试样品中测量的至少一种miR基因产物选自由miR20a、miR-21、mi R-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
[0099]在另一个实施方案中，在测试样品中测量的至少一种miR基因产物是miR-21。
[00100]可以测量获自受试者的生物样品(例如，细胞、组织)中至少一种miR基因产物的水平。例如，可以通过常规的活检技术从怀疑患有结肠癌相关疾病的受试者提取组织样品(例如，来自肿瘤)。在另一个实施方式中，可以从受试者提取血液样品，并通过标准技术对血细胞(例如，白血细胞)进行分离以获得DNA提取物。所述血液或组织样品优选获自开始放射治疗、化学疗法或其他治疗性治疗之前的受试者。对应的对照组织样品或血液样品可获自所述受试者未受影响的组织、正常人个体或正常个体群、或对应于所述受试者样品中大多数细胞的培养细胞。然后将对照组织样品或血液样品与来自受试者的样品一起处理，从而比较由来自受试者样品的细胞中给定miR基因产生的miR基因产物的水平与来自对照样品的细胞的对应miR基因产物水平。所述生物样品的参考miR表达标准也可用作对照。
[00101]相对于对照样品中对应miR基因产物的水平，获自受试者的样品中miR基因产物水平的改变(例如，增加或降低)指示受试者中存在结肠癌相关疾病。
[00102]在一个实施方案中，测试样品中至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中对应miR基因产物的水平(即，所述miR基因产物的表达被“上调”)。如本文所使用的，当来自受试者的细胞或组织中的基因产生的miR基因产物的量大于对照细胞或组织样品中相同基因产物的量时，miR基因产物的表达被“上调”。
[00103]在另一个实施方案中，测试样品中至少一种miR基因产物的水平小于对照样品中对应miR基因产物的水平(即，miR基因产物的表达被“下调”)。如本文所使用的，当来自受试者的细胞或组织中miR基因产物的量小于对照细胞或组织样品中相同基因产生的量时，miR基因产物的表达被“下调”。
[00104]对照和正常样品中相对的miR基因表达可以相对于一种或多种RNA表达标准进行测定。所述标准例如可以包括零miR基因表达水平、在标准细胞系中所述miR基因的表达水平，受试者未受影响的组织中所述miR基因的表达水平、或之前获自正常人对照群的miR基因表达的平均水平。
[00105]可以使用任何适合检测生物样品中RNA表达水平的技术测定样品中miR基因产物的水平。测定生物样品(例如，细胞、组织)中RNA表达水平的合适技术(例如，Northern印迹分析、RT-PCR、原位杂交)为本领域所述技术人员所熟知的。在一个具体的实施方案中，使用Northern印迹分析测定至少一种miR基因产物的水平。例如，可以在核酸提取缓冲溶液存在下通过匀浆化作用，然后通过离心从细胞分离出总的细胞RNA。沉淀核酸，通过用DNase处理和沉淀除去DNA。然后根据标准技术通过琼脂糖凝胶上的凝胶电泳分离所述RNA分子，并转移到硝化纤维素滤膜。然后通过加热将所述RNA固定在滤膜上。使用与可疑RNA互补的合适标记的DNA或RNA探针来完成特异性RNA的检测和定量。例如参见，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook等，eds.，2nd edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989，Chapter 7，其公开的全部内容以引用方式并入本文。
[00106]可以由所述核酸序列产生用于给定miR基因产物Northern印迹杂交的合适探针，其包括但不限于与目的miR基因产物至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或完全互补的探针。标记的DNA和RNA探针的制备方法，以及其与靶核苷酸序列的杂交条件描述于Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook等编辑，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，第10和11章，其公开内容以引用方式并入本文。
[00107]在一个非限制性的实施例中，所述核酸探针例如可以用放射性核素(诸如3H、32P、33P、14C或35S)；重金属；能用作经标记配体的特异性结合对成员的配体(例如，生物素、亲和素或抗体)；荧光分子；化学发光分子；酶等进行标记。
[00108]通过Rigby等(1977)，J.Mol.Biol.113：237-251的缺口翻译方法，或通过Fienberg等(1983)，Anal.Biochem.132：6-13的随机引物法，探针可以被标记为具有高的特异性活性，其全部公开的内容以引用方式并入本文。后者是从单链DNA或从RNA模板选择合成高特异性活性的32P-标记探针的选择方法。例如，根据缺口翻译方法通过用高放射性的核苷酸替代先前存在的核苷酸，有可能制备超过108cpm/mg的32P标记具有特异性活性的核酸探针。然后通过将杂交的滤膜曝光于胶片来进行杂交的放射自显影检测。由杂交滤膜曝光的胶片的光密度扫描提供mi R基因转录水平的准确测量。使用另一种方法，miR基因转录水平可以通过计算机成像系统(诸如购自AmershamBiosciences，Piscataway，NJ的Molecular Dynamics 400-B 2DPhosphorimager)进行定量。
[00109]在DNA或RNA探针的放射性核标记是不可行的情况下，可以使用随机引物方法将类似物，例如，dTTP类似物5-(N-(N-生物素酰-ε-氨基己酰基)-3-氨基烯丙基)脱氧尿苷三磷酸整合到探针分子中。所述生物素探针寡核苷酸可以通过与生物素-结合蛋白反应来检测，诸如亲和素、链霉亲和素与荧光染料或产生颜色反应的酶偶合的抗体(例如，抗生物素抗体)。
[00110]除了Northern和其他RNA杂交技术外，可以使用原位杂交技术来完成RNA转录水平的测定。所述技术与Northern印迹技术相比需要更少的细胞，且包括将全细胞沉积到显微镜盖玻片上，并用含放射性或经其他方式标记的核酸(例如，cDNA或RNA)探针的溶液探测所述细胞的核酸含量。所述技术特别适合对来自受试者的组织活检样品进行分析。原位杂交技术的实践更详细描述于美国专利No.5,427,916，其公开的全部内容以引用方式并入本文。
[00111]在一个非限制性的实施例中，可以由所述核酸序列产生给定miR基因产物原位杂交的合适探针，其包括但不限于与目的miR基因产物至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或完全互补的探针，如上述所。
[00112]细胞中miR基因转录物的相对数量还可以通过miR基因转录物的逆转录，接下来通过聚合酶链式反应的逆转录(RT-PCR)转录物的扩增来确定。与内标(例如，来自存在于同一样品的“管家”基因的mRNA水平)进行比较来对miR基因转录物的水平进行定量。用作内标的合适“管家”基因例如包括，肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)。进行定量和半定量RT-PCR的方法，及其变化形式是本领域所属的技术人员所熟知的。
[00113]在一些情况下，可能需要同时测定样品中多种不同miR基因产物的表达水平。在其他情况下，可能需要测定与癌症相关的所有已知m iR基因转录物的表达水平。评估数百个m iR基因或基因产物的癌症特异性表达水平是耗时的，且需要大量的总RNA(例如，对于每个Northern印迹至少20μg)和需要放射性同位素的放射自显影技术。
[00114]为了克服这些限制，可以构建微芯片形式的寡核苷酸文库(即，微阵列)，其含有一组寡核苷酸(例如，寡脱氧核苷酸)探针，所述探针对一组miR基因具有特异性。使用所述微阵列，通过逆转录RNA以产生一组靶寡脱氧核苷酸并对它们进行杂交来探测微阵列上的寡核苷酸以产生杂交谱或表达谱，可以测定生物样品中多个微小RNA的表达水平。然后比较测试样品和对照样品的杂交谱以测定实体癌细胞中哪个微小RNA具有改变的表达水平。
[00115]如本文所使用的，“探针寡核苷酸”或“探针寡脱氧核苷酸”指能与靶寡核苷酸杂交的寡核苷酸。“靶寡核苷酸”或“靶寡脱氧核苷酸”指待检测(例如，经由杂交)的分子。“miR-特异性探针寡核苷酸”或“对miR特异性的探针寡核苷酸”指一种探针寡核苷酸，其具有经选择与特异性miR基因产物或与所述特异性miR基因产物的逆转录物杂交的序列。
[00116]具体样品的“表达谱”或“杂交谱”本质上为样品状态的指纹谱；而两个状态可能使任何具体基因被类似地表达，对许多基因同时进行评价允许产生独特于细胞状态的基因表达谱。即，正常组织可能与癌(例如，肿瘤)组织不同，且可以测定癌组织中不同的预后状态(例如，好的或差的长期存活前景)。通过比较不同状态中结肠癌组织的表达谱，获得关于在这些状态的每一个中哪些基因是重要的(包括基因的上调和下调)的信息。在结肠癌组织中差异表达的序列的鉴定，以及导致不同预后结果的差异表达，允许以多种方式使用所述信息。
[00117]在一个非限制性的实施例中，可以评价具体的治疗方案(例如，确定化疗药物是否起到改善具体患者中长期预后的作用)。类似地，可以进行诊断或通过比较患者样品与已知表达谱来证实。此外，这些基因表达谱(或个别基因)允许筛选抑制结肠癌表达谱或将差的预后谱转变成较好的预后谱的候选药物。
[00118]因此，本文还提供诊断受试者是否患有结肠癌或处于发展出结肠癌风险中的方法，其包括：对来自获自受试者的测试样品的RNA进行逆转录以提供一组靶寡聚脱氧核苷酸，使所述靶寡聚脱氧核苷酸与微阵列杂交以提供测试样品的杂交谱，所述微阵列包括miRNA特异性探针寡核苷酸，和比较测试样品的杂交谱与对照样品或参考标准产生的杂交谱，其中至少一种mi RNA信号的改变指示所述受试者患有实体癌，处于发展实体癌的风险中。
[00119]在一个实施方案中，所述微阵列包括大部分的所有已知人miRNA的miRNA-特异性探针寡核苷酸。在一个具体的实施方案中，所述微阵列包括针对一种或多种miRNA的miRNA特异性探针寡核苷酸，所述miRNA选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
[00120]所述微阵列可以由产生自已知miRNA序列的基因特异性寡核苷酸探针制备。所述阵列针对每种miRNA可以包含两种不同的寡核苷酸探针，一种包含活性、成熟的序列和另一种对所述miRNA前体具有特异性。所述阵列还可以包含对照、诸如与人直系同源物的区别仅在于几个碱基的一种或多种小鼠序列，其可用作严格杂交条件的对照。还可以在微芯片上印刷来自这两个物种的tRNA或其他RNA(例如rRNAs、mRNAs)，以提供特异性杂交的内在的、相对稳定的阳性对照。还可以在所述微芯片上包括非特异性杂交的一种或多种合适对照。出于这个目的，基于不存在任何已知miRNA的任何同源来选择序列。
[00121]可以使用本领域已知的技术来制备微阵列。例如，合适长度的探针寡核苷酸(例如，40个核苷酸)，在C6位置为5′-胺修饰的并用商购可得的微阵列系统(例如，GeneMachine OmniGridTM 100microarrayer和Amersham CodeLinkTM activated slides)进行印刷。通过用经标记的引物逆转录靶RNA来制备对应于靶RNA的经标记的cDNA低聚物。在第一链合成后，使RNA/DNA杂交体变性以降解RNA模板。然后，将由此制备的标记靶cDNA在杂交条件下(例如，在25℃下6X SSPE/30％甲酰胺持续18小时，然后在37℃下在0.75X TNT(Tris HCl/NaCl/Tween 20)中洗涤40分钟)与微阵列芯片杂交。在阵列上固定的探针DNA识别样品中互补的靶cDNA的位置上发生杂交。经标记的靶cDNA标记所述阵列上结合发生的准确位置，允许自动检测和定量。输出信号由一系列杂交事件组成，指示患者样品中特异性cDNA序列的相对丰度，从而对应的互补miR的相对丰度。
[00122]根据一个实施方案，所述经标记的cDNA低聚物是由生物素标记的引物制备的生物素标记的cDNA。然后通过使用，例如，链亲和素-Alexa647缀合物，直接检测含生物素的转录物，对所述微阵列进行操作，并利用常规扫描方法进行扫描。阵列上每一个点的图像强度与患者样品中对应miR的丰度成正比。
[00123]微阵列的使用对于miRNA表达检测来说具有几个优点。第一，可以同时鉴定同一样品中几百个基因的总表达。第二，通过仔细设计寡核苷酸探针可以鉴定成熟和前体分子的表达。第三，与Northern印迹分析相比，所述芯片需要少量的RNA，并通过使用2.5μg总RNA提供可重复的结果。相对有限数量的miRNA(几百个/物种)允许构建几个物种的共同微阵列，针对每个物种具有不同的寡核苷酸探针。所述工具允许在不同条件下分析每个已知miR的跨物种(trans-species)表达。
[00124]除了用于特异性miR的定量表达水平测试外，含有对应于大部分miRNome(优选全部miRNome)的miRNA特异性探针寡核苷酸的微芯片，可用来实现miR基因表达分析，以分析miR表达模式。不同的miR信号可以与已确定的疾病标记物，或直接与疾病状态相关。
[00125]根据本文所述的表达分析方法，来自怀疑患有结肠癌相关疾病的受试者的样品的总RNA被定量逆转录以提供一组与样品中所述RNA互补的经标记的靶寡脱氧核苷酸。然后，所述靶寡脱氧核苷酸与包括miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供样品的杂交谱。所述结果是代表样品中miRNA表达模式的样品杂交谱。所述杂交谱包括来自样品的所述靶寡脱氧核苷酸与微阵列中所述miRNA特异性探针寡核苷酸结合的信号。所述谱可被记录为存在或不存在结合(信号相对零信号)。
[00126]更优选地，所记录的谱包括每个杂交信号的强度。比较所述谱与正常(即，非癌)对照样品产生的杂交谱。信号的改变指示受试者中存在或倾向于发展癌症。
[00127]测量miR基因表达的其他技术也在本领域的技术范围内，包括测量RNA转录和降解速率的各种技术。
[00128]本文还提供确定患有结肠癌的受试者预后的方法，包括测量来自所述受试者的测试样品中至少一种miR基因产物的水平，其与结肠癌相关疾病中的具体预后(例如，好的或良性预后，差的或不良预后)相关。
[00129]根据这些方法，与对照样品中对应miR基因产物水平相比，与测试样品中具体预后相关的miR基因产物水平的改变指示所述受试者患有具有具体预后的实体癌。在一个实施方案中，所述miR基因产物与不良(即，差的)预后相关。不良预后的实例包括，但不限于低存活率和快速疾病进展。在某些实施方案中，通过对来自获自受试者的测试样品的RNA进行逆转录以提供一组靶寡聚脱氧核苷酸，使所述靶寡聚脱氧核苷酸与微阵列杂交以提供所述测试样品的杂交谱，所述微阵列包括miRNA特异性探针寡核苷酸，并比较测试样品的杂交谱与对照样品产生的杂交谱来测量所述至少一种miR基因产物的水平。
[00130]不希望受任何理论限制，认为细胞中一种或多种miR基因产物水平的改变能导致这些miR的一个或多个目标靶的失调，其能导致实体癌的形成。因此，改变所述miR基因产物的水平(例如，通过降低在实体癌细胞中被上调的miR基因产物的水平，或增加在实体癌细胞中被下调的miR基因产物的水平)可以成功地治疗所述实体癌。
[00131]因此，本文进一步提供抑制患有或怀疑患有实体癌的受试者中肿瘤形成的方法，其中在所述受试者的癌细胞中至少一种miR基因产物失调(例如，下调、上调)。如果在所述癌细胞中所述至少一种分离的miR基因产物(例如，miR-21)是被下调的，所述方法包括施用有效量的所述至少一种分离的miR基因产物、或其分离的变体或生物活性片段，从而抑制所述受试者中癌细胞增殖。
[00132]例如，如果miR基因产物在受试者的癌细胞中是被下调的，给所述受试者施用有效量的分离的miR基因产物可以抑制所述癌细胞增殖。给所述受试者施用的分离的miR基因产物与在癌细胞中被下调的内源性野生型miR基因产物(例如，miR基因产物)一致，或可以是其变体或生物活性片段。
[00133]如本文所定义的，miR基因产物的“变体”指与对应的野生型miR基因产物具有低于100％同一性的mi RNA并具有对应野生型miR基因产物的一种或多种生物活性。所述生物活性的实例包括，但不限于，抑制靶RNA分子的表达(例如，抑制靶RNA分子的翻译、调节靶RNA分子的稳定性、抑制靶RNA分子的加工)和抑制与实体癌相关的细胞过程(例如，细胞分化、细胞生长、细胞死亡)。这些变体包括物种变体和由miR基因中一个或多个突变(例如，置换、删除、插入)导致的变体。在某些实施方案中，所述变体与对应野生型miR基因产物至少具有约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％的同一性。
[00134]如本文所定义的，miR基因产物的“生物活性片段”指miR基因产物的RNA片段，其具有对应野生型miR基因产物的一种或多种生物活性。如上所述，所述生物活性的实例包括，但不限于，抑制靶RNA分子的表达和抑制与结肠癌相关的细胞过程。在某些实施方案中，所述生物活性片段的长度至少为约5、7、10、12、15或17个核苷酸。在一个具体的实施方案中，分离的miR基因产物可以与一种或多种其他抗癌治疗联合施用于受试者。合适的抗癌治疗包括，但不限于，化学疗法、放射疗法及其组合(例如，化放疗(chemoradiation))。
[00135]如果所述至少一种分离的miR基因产物在所述癌细胞中是被上调的，所述方法包括给受试者施用有效量的至少一种用于抑制所述至少一种miR基因产物表达的化合物，本文称为miR基因表达抑制化合物，从而抑制实体癌细胞增殖。在一个具体的实施方案中，所述至少一种miR表达抑制化合物对miR基因产物具有特异性，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
[00136]miR基因表达抑制性化合物可以与一种或多种其他抗癌治疗联合施用于受试者。合适的抗癌治疗包括，但不限于，化学疗法、放射疗法及其组合(例如，化放疗)。
[00137]术语“治疗(treat)”，“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”，如本文所使用的，指缓解与疾病或病症(例如，实体癌)相关的症状，包括预防或延迟疾病症状的发作，和/或减轻疾病或病症症状的严重性或频率。本文定义术语“受试者(subject)”、“患者(patient)”和“个体(individual)”包括动物，诸如哺乳动物，包括，但不限于灵长类动物、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其他牛科、羊科、马科、犬科、猫科、啮齿动物或鼠科类。在一个优选的实施方式中，所述动物是人。
[00138]如本文所使用的，分离的miR基因产物的“有效量”是指足以抑制遭受实体癌的受试者中癌细胞增殖的量。通过考虑因素，诸如受试者的尺寸和体重、疾病入侵的程度、受试者的年龄、健康和性别、给药途径以及给药是局部的或全身的，本领域的技术人员能容易地确定给给定受试者施用的miR基因产物的有效量。
[00139]例如，分离的miR基因产物的有效量可以基于待治疗的瘤块的近似重量。瘤块的近似重量可以通过计算所述瘤块的近似体积确定，其中一立方厘米体积大约相当于1g。基于瘤块重量，分离的m iR基因产物的有效量可以在约10-500μg/g瘤块的范围内。在某些实施方案中，所述瘤块至少可以是约10μg/g瘤块、至少大约60μg/g瘤块或至少大约100μg/g瘤块。
[00140]分离的miR基因产物的有效量还可以基于待治疗的受试者的近似或估算体重。优选地，如本文所述，所述有效量可以肠胃外或肠内给药。例如，给受试者施用的分离的miR基因产物的有效量可以在约5-3000μg/kg体重、约700-1000μg/kg体重、或大于约1000μg/kg体重的范围内。
[00141]本领域的技术人员还可以容易地确定给给定受试者施用分离的miR基因产物的合适给药方案。例如，可以一次给所述受试者施用miR基因产物{例如，以单一注射或沉积(deposition))。或者，可以给受试者施用miR基因产物一天一次或两次，持续约3-28天，更具体地约7-10天的周期。在一个具体的给药方案中，施用miR基因产物一天一次，持续7天。在给药方案包括多次施用的情况下，应理解给受试者施用的分离的miR基因产物的有效量可以包括整个给药方案中施用的基因产物的总量。
[00142]如本文所使用的，“分离的”miR基因产物是指合成的、或从天然状态通过人干预改变或提取的基因产物。例如，认为合成的miR基因产物、或部分或完全分离自其天然状态的共存材料的miR基因产物是“分离的”。分离的miR基因产物可以以基本上纯的形式存在，或可以存在于所述miR基因产物被递送到的细胞中。因此，有意地被递送到细胞或在细胞中表达的miR基因产物被认为是“分离的”miR基因产物。在细胞内从miR前体分子产生的miR基因产物也被认为是“分离的”分子。根据一个具体的实施方案，本文所描述的分离的miR基因产物可用于制备药物，所述药物用于治疗受试者(例如，人)的实体癌。
[00143]使用许多标准技术可以获得分离的miR基因产物。例如，使用本领域中已知的方法可以化学合成或重组产生miR基因产物。在一个实施方案中，使用适当保护的核糖核苷酸亚磷酰胺和常规的DNA/RNA合成仪化学合成miR基因产物。合成的RNA分子或合成试剂的商品供应商例如包括，Proligo(Hamburg，Germany)、DharmaconResearch(Lafayette，CO，U.S.A.)、Pierce Chemical(part of PerbioScience，Rockford，IL，U.S.A.)、Glen Research(Sterling，VA，U.S.A.)、ChemGenes(Ashland，MA，U.S.A.)和Cruachem(Glasgow，UK)。
[00144]或者，可以使用任何合适的启动子从重组的环状或线性DNA质粒表达所述miR基因产物。用于从质粒表达RNA的合适启动子例如包括，U6或H1 RNA pol III启动子序列，或细胞巨化病毒启动子。其他合适启动子的选择是在本领域技术范围内的。本发明的重组质粒还可以包括用于在癌细胞中表达miR基因产物的诱导型或调节型启动子。
[00145]可由重组质粒表达的miR基因产物可以通过标准技术从培养的细胞表达系统中分离出来。由重组质粒表达的miR基因产物还可以被递送至癌细胞中，并直接在癌细胞中表达。在下面将更详细讨论使用重组质粒将miR基因产物递送至癌细胞中。
[00146]所述miR基因产物可以由分开的重组质粒表达，或它们可以由相同的重组质粒表达。在一个实施方案中，所述miR基因产物在单一质粒中被表达为RNA前体分子，并且所述前体分子被合适的加工系统加工成功能性miR基因产物，所述加工系统包括但不限于癌细胞中现存(extant)的加工系统。其他合适的加工系统例如包括，体外果蝇细胞裂解系统(例如，如在Tuschl等人的美国公开的专利申请No.2002/0086356中所述的，其公开的全部内容以引用方式并入本文)和大肠杆菌RNAseIII系统(例如，如在Yang等人的美国公开的专利申请No.2004/0014113中所述的，其公开的全部内容以引用方式并入本文)。
[00147]适合表达miR基因产物的质粒的选择，将核酸序列插入到质粒中以表达所述基因产物的方法，和将重组质粒递送到目的细胞中的方法是在本领域技术范围内的。例如参见，Zeng等(2002)，Molecular Cell 9：1327-1333；Tuschl(2002)，Nat.Biotechnol，20：446-448；Brummelkamp等(2002)，Science 296：550-553；Miyagishi等(2002)，Nat.Biotechnol.20：497-500；Paddison等(2002)，Genes Dev.16：948-958；Lee等(2002)，Nat.Biotechnol.20：500-505；和Paul等(2002)，Nat.Biotechnol.20：505-508，其公开的全部内容以引用方式并入本文。
[00148]在一个实施方案中，表达所述miR基因产物的质粒包含在CMV中间体早期启动子(CMV intermediate-early promoter)的控制下编码miR前体RNA的序列。如本文所使用的，启动子的“控制下”指编码所述miR基因产物的核酸序列被定位在启动子的3′，使得所述启动子能引发miR基因产物编码序列的转录。
[00149]还可以由重组病毒载体表达所述miR基因产物。预期所述miR基因产物可以由两个分开的重组病毒载体表达，或由相同的病毒载体表达。由重组病毒载体表达的RNA可以通过标准技术分离自培养的细胞表达系统，或可以在癌细胞中被直接表达。在下面将更详细讨论重组病毒载体将所述miR基因产物递送至癌细胞中的使用。
[00150]本发明的重组病毒载体包括编码所述miR基因产物的序列和任何用于表达所述RNA序列的合适启动子。合适的启动子包括，但不限于U6或H1 RNA pol III启动子序列或细胞巨化病毒启动子。其他合适启动子的选择是在本领域技术范围内的。本发明的重组病毒载体还可以包括用于在癌细胞中表达miR基因产物的诱导型或调节型启动子。
[00151]可以使用能接受所述miR基因产物的编码序列的任何病毒载体；例如，衍生自腺病毒(AV)、腺相关病毒(AAV)、逆转录酶病毒(例如，慢病毒(LV)、棒状病毒、鼠白血病病毒)、疱疹病毒等的载体。可以通过用来自其他病毒的衣壳蛋白或其他表面抗原假型包装载体，或通过置换不同的病毒壳体蛋白(如果合适的话)来改变所述病毒载体的向性(tropism)。
[00152]例如，本发明的慢病毒载体用来自水泡性口炎病毒(VSV)、狂犬病、埃博拉病毒(Ebola)、Mokola等的表面蛋白进行假型包装。通过改造载体以表达不同的衣壳蛋白血清型，可以使本发明的AAV载体靶向不同的细胞。例如，在血清2型基因组上表达血清2型衣壳的AAV载体被称为AAV 2/2。在AAV 2/2载体中这种血清2型衣壳基因能被血清5型衣壳基因替代以产生AAV 2/5载体。构建表达不同衣壳蛋白血清型的AAV载体的技术在本领域技术的范围内；例如参见，Rabinowitz，J.E.，等(2002)，J.Virol.76：791-801，其公开的全部内容以引用方式并入本文。
[00153]适用于本发明的重组病毒载体的选择，将表达RNA的核酸序列插入到所述载体中的方法，将病毒载体递送至目的细胞的方法，和所表达的RNA产物的回收是在本领域技术范围内的。例如参见，Dornburg(1995)，Gene Therapy 2：301-310；Eglitis(1988)，Biotechniques 6：608-614；Miller(1990)，Hum.Gene Therapy 1：5-14；and Anderson(1998)，Nature 392：25-30，其公开的全部内容以引用方式并入本文。
[00154]特别适合的病毒载体是衍生自AV和AAV的那些。表达所述miR基因产物的合适AV载体，构建所述重组AV载体的方法，和将所述载体递送至靶细胞的方法描述于Xia等(2002)，Nat.Biotech.20：1006-1010，其公开的全部内容以引用方式并入本文。表达miR基因产物的合适AAV载体，构建所述重组AAV载体的方法，和将所述载体递送至靶细胞的方法描述于Samulski等(1987)，J.Virol.61：3096-3101；Fisher等(1996)，J.Virol.，70：520-532；Samulski等(1989)，J.Virol.63：3822-3826；美国专利No.5252479；美国专利No.5,139,941；国际专利申请No.WO 94/13788；和国际专利申请No.WO 93/24641，其公开的全部内容以引用方式并入本文。在一个实施方案中，所述m iR基因产物表达自包含CMV中间体早期启动子的单一重组AAV载体。
[00155]在某一实施方案，本发明重组AAV病毒载体包含在人U6RNA启动子的控制下，与polyT终止序列可操作连接的、编码miR前体RNA的核酸序列。如本文所使用的，“与polyT终止序列可操作连接”指编码正义或反义链的核酸序列与5′方向的polyT终止信号直接相邻。在从载体转录miR序列期间，polyT终止信号起终止转录的作用。
[00156]在本发明治疗方法的其他实施方案中，可以给所述受试者施用有效量的至少一种抑制miR表达的化合物。如本文所使用的，“抑制miR表达”指治疗后miR基因产物的前体和/或活性、成熟形式的产生低于治疗前产生的量。例如使用上面关于诊断方法所讨论的测定miR转录水平的技术，本领域的技术人员能容易地确定癌细胞中miR的表达是否受到抑制。抑制在基因表达水平上(即，通过抑制编码miR基因产物的miR基因的转录)或在加工水平上(例如，通过抑制将miR前体加工成成熟、活性的miR)发生。
[00157]如本文所使用的，抑制miR表达的化合物的“有效量”是指足以抑制遭受癌症(例如，结肠癌)的受试者中癌细胞增殖的量。通过考虑因素，诸如受试者的尺寸和体重、疾病入侵的程度、受试者的年龄、健康和性别、给药途径以及给药是局部的或全身的，本领域的技术人员能容易地确定给给定受试者施用的miR表达抑制化合物的有效量。
[00158]例如，如本文所述，所述表达抑制化合物的有效量可以基于待治疗瘤块的近似重量。如本文所述，抑制miR表达的化合物的有效量还可以基于待治疗受试者的近似或估算体重。
[00159]本领域的技术人员还可以容易地确定给给定受试者施用抑制miR表达的化合物的合适给药方案。
[00160]抑制miR基因表达的合适化合物包括双链RNA(诸如短或小的干扰RNA或“siRNA”)，反义核酸和酶促RNA分子(诸如核酶)。这些化合物的每一个可以靶向给定miR基因产物并干扰靶miR基因产物的表达(例如，抑制靶miR基因产物翻译、诱导靶miR基因产物的切割或破坏)。
[00161]例如，通过用分离的双链RNA(“dsRNA”)分子诱导对miR基因的RNA干扰，可以抑制给定miR基因的表达，所述双链RNA分子与所述miR基因产物的至少一部分具有至少90％，例如至少95％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，所述dsRNA分子是“短或小的干扰RNA”或“siRNA”。
[00162]本发明方法中有用的siRNA包括长度为约17个核苷酸至约29个核苷酸的短双链RNA，优选长度为约19至约25个核苷酸。所述siRNA包括一个正义RNA链和一个互补的反义RNA链，通过标准的Watson-Crick碱基配对相互作用(以下称为”碱基配对”)退火在一起。正义链包括与包含在所述靶miR基因产物内的核酸序列基本一致的核酸序列。
[00163]如本文所使用的，在siRNA中与包含在所述靶mRNA基因产物内的核酸序列“基本一致”的核酸序列是与所述靶序列一致或与所述靶序列区别在于一个或两个核苷酸的核酸序列。siRNA的正义链和反义链可包括两个互补的单链RNA分子，或可包括其中两个互补部分通过单链“发夹”区碱基配对和共价连接的单一分子。
[00164]所述siRNA还可以是改变的RNA，其通过添加、删除、置换和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的RNA。所述改变可包括诸如将非核苷酸材料添加到所述siRNA的端上或所述siRNA的一个或多个内部核苷酸上，或使siRNA对核酸酶消化具有抗性的修饰，或用脱氧核糖核苷酸置换所述siRNA中的一个或多个核苷酸。
[00165]所述siRNA的一条或两条链还可以包含一个3′突出端。如本文所使用的，“3′突出端”指延伸自双重RNA链的3′-端的至少一个未配对的核苷酸。因此，在某些实施方案中，所述siRNA包括至少一个长度为1至约6个核苷酸(其包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)，长度为1至约5个核苷酸，长度为1至约4个核苷酸，或长度为约2至约4个核苷酸的3′突出端。在一个具体的实施方案中，所述3′突出端存在于所述siRNA的两条链，且长度为2个核苷酸。例如，所述siRNA的每一条链可包括二胸苷酸(“TT”)或二尿苷酸(“uu”)的3′突出端。
[00166]如上面关于所述分离的miR基因产物的描述，所述siRNA可以化学或生物制备，或可以由重组质粒或病毒载体表达。制备和测试dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于Gewirtz的美国公开的专利申请No.2002/0173478和Reich等人的美国公开的专利申请No.2004/0018176，两者公开的全部内容以引用方式并入本文。
[00167]给定miR基因的表达还可以被反义核酸抑制。如本文所使用的，“反义核酸”指通过RNA-RNA、RNA-DNA或RNA-肽核酸相互作用的方式与靶RNA结合的核酸分子，其改变所述靶RNA的活性。适用于本发明方法的反义核酸是单链核酸(例如，RNA、DNA、RNA-DNA嵌合体、肽核酸(PNA))，其通常包含与miR基因产物中连续核酸序列互补的核酸序列。所述反义核酸可包含与miR基因产物中连续核酸序列50-100％互补、75-100％互补、或95-100％互补的核酸序列。
[00168]不希望受任何理论限制，认为所述反义核酸激活RNase H或另一个消化所述miR基因产物/反义合适双链体的细胞核酸酶。
[00169]反义核酸还可含有对所述核酸骨架或对糖和碱基部分(或其等价物)的修饰以增强靶特异性、核酸酶抗性、与分子功效相关的递送或其他性质。所述修饰包括胆固醇部分、双链嵌入剂(诸如，吖啶)，或一种或多种抗核酸酶基团。
[00170]如上面关于所述分离的miR基因产物的描述，反义核酸可以化学或生物制备，或可以由重组质粒或病毒载体表达。示例性的制备和测试方法是在本领域的技术范围内的；例如参见，Stein andCheng(1993)，Science 261：1004和Woolf等的美国专利No.5,849,902，其公开的全部内容以引用方式并入本文。
[00171]给定miR基因的表达还可以被酶促核酸抑制。如本文所使用的，“酶促核酸”指包含与mi R基因产物的连续核酸序列互补的底物结合区的核酸，且其能特异性切割miR基因产物。所述酶促核酸底物结合区例如可以与miR基因产物中的连续核酸序列50-100％互补、75-100％互补、或95-100％互补。所述酶促核酸还可在碱基、糖和/或磷酸基团处包含修饰。用于本发明方法的示例性酶促核酸是核酶。
[00172]如上面关于分离的miR基因产物的描述，所述酶促核酸可以化学或生物制备，或可以由重组质粒或病毒载体表达。制备和测试dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于Werner和Uhlenbeck(1995)，Nucl.Acids Res.23：2092-96；Hammann等人(1999)，Antisense and Nucleic Acid Drug Dev.9：25-31；和Cech等的美国专利No.4,987,071，其公开的全部内容以引用方式并入本文。
[00173]施用至少一种miR基因产物或至少一个抑制miR表达的化合物将抑制在患有实体癌的受试者中癌细胞增殖。如本文所使用的，“抑制癌细胞增殖”指杀死所述细胞、或长期或临时妨碍或减慢所述细胞的生长。如果在施用所述miR基因产物或miR基因表达抑制化合物后，受试者中所述细胞的数量维持不变或降低，可以推定癌细胞增殖的抑制。如果所述细胞的绝对数量增加但肿瘤的生长速率降低，也可以推定癌细胞增殖的抑制。
[00174]受试者体内的癌细胞数量可以通过直接测量，或通过根据原发性或转移性瘤块的大小估计测定。例如，受试者中癌细胞的数量可以通过免疫组织学方法，流式细胞仪，或其他设计用于检测癌细胞特征表面标记物的技术进行测量。
[00175]瘤块的大小可以通过直接目测法、或通过诊断显像方法(诸如，X-射线、核磁共振成像、超声波和闪烁扫描法)确定。如本领域已知的，用于确定瘤块大小的诊断显像方法-可以与或不与造影剂一起使用。瘤块的大小还可以通过物理手段(诸如组织块的触诊或用测量仪器(如卡钳)测量组织块)确定。
[00176]可以通过任何适合给受试者的癌细胞递送这些化合物的方式给受试者施用所述miR基因产物或miR基因表达抑制化合物。例如，可以通过适合用这些化合物或用包括编码这些化合物的序列的核酸转染受试者细胞的方法施用所述miR基因产物或miR表达抑制化合物。
[00177]在一个实施方案中，用包含编码至少一种miR基因产物或miR基因表达抑制化合物的序列的质粒或病毒载体转染所述细胞。
[00178]真核细胞的转染方法是本领域所熟知的，例如包括，将所述核酸直接注入细胞的核或原核中；电穿孔；脂质体转移或亲脂性材料介导的转移；受体介导的核酸递送、生物弹道(bioballistic)或粒子加速；磷酸钙沉淀，和病毒载体介导的转染。
[00179]例如，用脂质体转移化合物例如，DOTAP(N-[1-(2，3-二油酰基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基-甲基硫酸铵，Boehringer-Mannheim)或等价物(诸如LIPOFECTIN)转染细胞。所使用的核酸的量对本发明实践来说不是关键的；用0.1-100μg核酸/105细胞可获得可接受的结果。例如，可以使用在3μg DOTAP/105细胞中约0.5μg质粒载体的比例。
[00180]还可以通过任何合适的肠内或肠胃外施用途径给受试者施用miR基因产物或miR基因表达抑制化合物。本发明方法的合适肠内施用途径例如包括，口服、直肠或鼻内递送。合适的肠胃外施用途径例如包括，血管内施用(例如，静脉内推注、静脉内输注、动脉内推注、动脉内输注和导管灌注到脉管系统中)；组织周围和组织内注射(例如，肿瘤周围和肿瘤内注射、视网膜内注射、或视网膜下注射)；皮下注射或沉积，包括皮下输注(诸如通过渗透泵)；直接施用到目的组织；例如通过导管或其他敷设装置(例如，视网膜丸粒或栓剂或包括多孔、无孔或凝胶材料的植入物)；和吸入。特别合适的施用途径是注射、输注和直接注射到肿瘤中。
[00181]在本发明的方法中，miR基因产物或miR基因产物表达抑制化合物可以以裸RNA，或与递送剂组合，或以包含表达所述miR基因产物或miR基因产物表达抑制化合物的序列的核酸(例如，重组质粒或病毒载体)给受试者施用。合适的递送剂例如包括，MirusTransit TKO亲脂试剂；脂质转染(lipofectin)；脂质转染胺(lipofectamine)；cellfectin；聚阳离子(例如，聚赖氨酸)和脂质体。
[00182]包含表达所述miR基因产物或miR基因产物表达抑制化合物的序列的重组质粒和病毒载体，和将所述质粒和载体递送至癌细胞的技术如本文所讨论的和/或在本领域中是熟知的。
[00183]在一个具体的实施方案中，使用脂质体将miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或包括编码它们的序列的核酸)递送到受试者中。脂质体还可以增加所述基因产物或核酸的血液半衰期。用于本发明的合适脂质体可以由标准微泡形成脂形成，其通过包括中性或带负电的磷酸脂和固醇，诸如胆固醇。脂质的选择通常通过考虑因素，诸如所需脂质体的大小和血液中所述脂质体的半衰期来进行指导。已知许多制备脂质体的方法例如，如Szoka等(1980)，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467；和美国专利Nos.4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369中所描述的，其公开的全部内容以引用方式并入本文。
[00184]用于本发明方法的脂质体可包括使脂质体靶向癌细胞的配体分子。优选与癌细胞中普遍存在的受体结合的配体，诸如与肿瘤细胞抗原结合的单克隆抗体。
[00185]还可以修饰用于本发明方法的脂质体以避免被单核巨噬细胞系统(“MMS”)和网状内皮组织系统(“RES”)清除。如此修饰的脂质体在表面上具有调理抑制(opsonization-inhibition)部分或使调理抑制部分整合到所述脂质体结构中。在一个特别优选的实施方案中，本发明的脂质体可包括调理抑制部分和配体。
[00186]用于制备本发明脂质体的调理抑制部分典型地为与脂质体膜结合的大的亲水聚合物。如本文所使用的，当调理抑制部分与膜化学或物理连接时(例如，通过将脂溶性锚插入膜自身中，或通过直接与膜脂的活性基团结合)，调理抑制部分与脂质体膜“结合”。这些调理抑制亲水聚合物形成保护的表面层，其通过MMS和RES显著降低所述脂质体的摄取；例如，如在美国专利No.4,920,016中所描述的，其公开的全部内容以引用方式并入本文。
[00187]适合修饰脂质体的调理抑制部分优选是数均分子量优选为约500-40000道尔顿，和更优选为约2000-20000道尔顿的水溶性聚合物。所述聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG，和PEG或PPG硬脂酸脂；合成聚合物，诸如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯吡咯烷酮；直链、支链或树枝状聚酰氨基胺；聚丙烯酸；多元醇，例如，与羧基或氨基化学连接的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂(诸如神经节苷脂GM1)。PEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG的共聚物、或其衍生物也是合适的。此外，所述调理抑制聚合物可以是PEG与聚氨基酸、多糖、聚酰氨基胺、聚乙烯胺或聚核苷酸之一的嵌段共聚物。所述调理抑制聚合物还可以是含氨基酸或羧酸的天然多糖，例如，半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、褐藻酸、角叉菜胶、胺化多糖或寡糖(直链或支链)；或羧化多糖或寡糖，例如，与具有羧酸基团所得连接的碳酸衍生物反应。优选地，所述调理抑制部分是PEG、PPG、或其衍生物。用PEG或PEG-衍生物改性的脂质体有时称为“PEG化脂质体”。
[00188]可以通过众多熟知技术中之一，将所述调理抑制部分与脂质体膜连接。例如，PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯可以与磷脂酰乙醇胺的脂溶性锚结合，然后与膜结合。类似地，葡聚糖聚合物可以在60℃下经由使用Na(CN)BH3和溶剂混合物(诸如30∶12的四氢呋喃和水)的还原性胺化(amination)用硬脂酰氨脂溶性锚衍生。
[00189]经调理抑制部分改性的脂质体比未改性的脂质体在循环中维持更长时间。因此，所述脂质体有时称为“隐形”脂质体。已知隐形脂质体在由多孔或“渗透”微血管系统供养的组织中聚集。因此，这种微血管系统缺陷表征的组织，例如，实体瘤将有效聚集这些脂质体，参见Gabizon，等(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，18：6949-53。此外，RES摄取的降低通过防止肝和脾内脂质体显著的积累来降低隐形脂质体的毒性。因此，用调理抑制部分改性的脂质体特别适合于将miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或包括编码它们的序列的核酸)递送至肿瘤细胞。
[00190]根据本领域中已知的技术，所述miR基因产物或miR基因表达抑制化合物可配制成药物组合物，在给受试者施用它们之前，有时称为“药物”。因此，本发明包括治疗实体癌的药物组合物。在一个实施方案中，所述药物组合物包含至少一个分离的miR基因产物或其分离的变体或生物活性片段，和药学可接受的载体。在一个具体的实施方案中，所述至少一种m iR基因产物对应于一种miR基因产物，其相对于合适的对照细胞，在实体癌细胞中具有降低的表达水平。在一些实施方案中，所述分离的miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
[00191]在其他实施方案中，本发明的药物组合物包含至少一种miR表达抑制化合物。在一个具体的实施方案中，所述至少一种miR基因表达抑制化合物对miR基因具有特异性，所述miR基因在结肠癌细胞中的表达高于在对照细胞中的表达。在某些实施方案中，所述miR基因表达抑制化合物对一种或多种miR基因产物具有特异性，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
[00192]本发明的药物组合物特征在于至少是无菌和无致热原的。如本文所使用的，“药物组合物”包括用于人和兽医用途的制剂。本发明药物组合物的制备方法是在本领域的技术范围内的，例如，如在Remington′s Pharmaceutical Science，第17版，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.(1985)中所述的，其公开的全部内容以引用方式并入本文。
[00193]本发明的药物组合物包含至少一种miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)(例如，0.1-90重量％)或其生理学可接受的盐，与药学可接受的载体混合。在某些实施方案中，本发明的药物组合物还包含一种或多种抗癌试剂(例如，化疗试剂)。本发明的药物制剂还包含至少一种miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)，其被脂质体和药学可接受的载体封装成胶囊。在一个实施方案中，所述药物组合物包含为miR-21的miR基因或基因产物。
[00194]尤其适合的药学可接受的载体是水、缓冲水溶液、正常盐水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。
[00195]在一个具体的实施方案中，本发明的药物组合物包含对核酸酶降解具有抗性的至少一种miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)。本领域的技术人员能容易地合成核酸酶抗性的核酸，例如，通过将一种或多种在2′-位置修饰的核糖核苷酸整合到所述miR基因产物中。合适的2′-修饰的核糖核苷酸包括在2′-位置用氟、氨基、烷基、烷氧基和O-烯丙基修饰的那些。
[00196]本发明的药物组合物还包含常规的药物赋形剂和/或添加剂。合适的药物赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、等渗调节剂、缓冲剂和pH调节剂。合适的添加剂例如包括，生理学上生物相容的缓冲溶液(例如，盐酸氨丁三醇)，加入螯合剂(诸如，例如，DTPA或DTPA-双酰胺)或钙螯合复合物(诸如，例如，钙DTPA、CaNaDTPA-双酰胺)、或任选地加入钙或钠盐(例如，氯化钙、抗坏血酸钙、葡萄糖酸钙或乳酸钙)。可包装本发明的药物组合物以液体形式使用或可将其冻干。
[00197]对于本发明的固体药物组合物，可以使用常规无毒的固体药学可接受载体；例如，医药级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。
[00198]例如，口服施用的固体药物组合物可包含上面所列的任何载体和赋形剂，且包含10-95％、优选25％-75％的所述至少一种miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)。用于气溶胶(吸入)施用的药物组合物可包含如上所述封装在脂质体中的0.01-20重量％、优选1重量％-10重量％的所述至少一种miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)，和推进剂。还可以根据需要包含载体，例如，用于鼻内递送的卵磷脂。
[00199]本发明的药物组合物可进一步包含一种或多种抗癌试剂。在一个具体的实施方案中，所述组合物包含至少一种miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)和至少一种化疗试剂。适用于本发明方法的化疗试剂包括，但不限于，DNA-烷基化试剂、抗肿瘤抗生素试剂、抗代谢试剂、微管蛋白稳定剂、微管蛋白去稳定剂、荷尔蒙拮抗剂、拓扑异构酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、HMG-CoA抑制剂、CDK抑制剂、细胞周期蛋白抑制剂、胱天蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、反义核酸、三螺旋DNA、核酸适配体(nucleic acids aptamers)，以及分子改良的病毒、细菌和外毒素试剂。适合本发明组合物的试剂的实例包括，但不限于：胞苷阿拉伯糖苷、甲氨蝶呤、长春新碱、依托泊甙(VP-16)、阿霉素(亚德里亚霉素)、顺铂(CDDP)、地塞米松、arglabin、环磷酰胺、沙可来新、甲基亚硝基脲、氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶(5FU)、长春花碱、喜树碱、放线菌素-D、丝裂霉素C、过氧化氢、奥沙利铂、依立替康、拓扑替康、醛氢叶酸、卡氮芥、链脲佐菌素、CPT-11、紫杉醇、他莫昔芬、达卡巴嗪、利妥昔单抗、柔红霉素、1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶、伊马替尼、氟达拉滨、多西他塞、FOLFOX4。
[00200]本发明还提供肿瘤形成抑制剂的鉴定方法，包括给细胞提供测试试剂并测量所述细胞中至少一种miR基因产物的水平。在一个实施方案中，所述方法包括给细胞提供一种测试试剂并测量癌细胞中与表达水平降低相关的至少一种miR基因产物的水平。在提供所述试剂后，相对于合适的对照细胞(例如，没有提供试剂)，所述细胞中miR基因产物水平的增加指示所述测试试剂为肿瘤形成的抑制剂。在一个具体的实施方案中，在癌细胞中与表达水平降低相关的至少一种miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
[00201]在其他实施方案中，所述方法包括给细胞提供一种测试试剂并测量癌细胞中与表达水平增加相关的至少一种miR基因产物的水平。在提供试剂后，相对于合适的对照细胞(例如，没有提供试剂)，所述细胞中miR基因产物水平的降低指示所述测试试剂为肿瘤形成的抑制剂。在一个具体的实施方案中，在癌细胞中与表达水平增加相关的至少一种miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
[00202]合适的试剂包括，但不限于药物(例如，小分子、多肽)，和生物大分子(例如，蛋白、核酸)。所述试剂可以重组、合成产生，或其可以由天然来源分离(即，纯化)。给细胞提供所述试剂的各种方法(例如，转染)是本领域中熟知的，所述方法中的几个描述于上文中。检测至少一种miR基因产物表达的方法(例如，Northern印迹、原位杂交、RT-PCR、表达分析)也是本领域中熟知的。这些方法中的几个也描述于上文中。
[00203]本发明现在将通过下述非限制性实施例进行描述。
实施例
[00204]实施例1
[00205]结肠肿瘤中微小RNA表达模式的改变
[00206]使用微小RNA微阵列比较84对结肠肿瘤和临近非肿瘤组织的微小RNA谱30。这84个受试者是招募自马里兰巴尔的摩地区的患者，所述患者患有易发性结肠腺癌(incident colonadenocarcinoma)，并称为马里兰测试群(cohort)(表1)。
[00207]表1-群(population)和肿瘤的特征
  马里兰测试群   香港验证群
  N＝84   N＝113
  招募地区   美国马里兰巴尔的摩   中国香港
  注册年龄-年平均±SD   64.6±10.7   55.8±15
  范围   32-87   32-84
  性别-no.(％)男性   66(79)   56(50)
  女性   18(21)   57(50)
  种族-no.(％)白人   52(62)   0(0)
  黑人   32(38)   0(0)
  亚洲人   0(0)   113(100)
  肿瘤部位-no.(％)远端的(Distal)   48(59)   90(80)
  近端的(Proximal)   34(41)   23(20)
  腺癌历史-no.(％)腺癌   75(89)   105(93)
  粘液腺癌   8(10)   7(6)
  腺鳞状癌   1(1)   0(0)
  印戒细胞和粘液   0(0)   1(1)
  辅助化学疗法2-no.(％)接受   22(37)   40(35)
  没有接受   37(63)   73(65)
  TNM分期-no.(％)
  II   29(34)   37(33)
  III   36(43)   48(42)
  IV   10(12)   19(17)
1远端的包括位于或远离降结肠的肿瘤。近端的肿瘤包括位于或临近脾曲的肿瘤。最初群中82个受试者和验证群中所有受试者的肿瘤部位是可利用。2测试群中59个受试者和验证群中所有受试者的与接受化学治疗相关的详细信息是可利用。化学治疗主要是基于氟尿嘧啶(以静脉内5-氟尿嘧啶或包括替加氟与尿嘧啶[UFT]的口服药物形式)，伴有或无左旋咪唑或醛氢叶酸。
[00208]肿瘤微小RNA谱明显不同与非肿瘤谱。发现37个独立的微小RNA在肿瘤中差异表达(p＜0.001，错误发现率＜0.5％；表2。
[00209]表2-在肿瘤中差异表达的微小RNA
  探针   成熟miR   p-值1   FDR2   变化倍数   染色体定位
  hsa-mir-21No1   miR-21   ＜1e-07   ＜1e-07   1.7   17q23.2
  hsa-mir-021-prec-17No1   miR-21   ＜1e-07   ＜1e-07   1.8   17q23.2
  hsa-mir-092-prec-13＝092-1No2   miR-92   ＜1e-07   ＜1e-07   1.4   13g 31.3
  hsa-mir-222-precNo2   miR-222   1.40E-06   8.05E-05   1.2   Xp11.3
  hsa-mir-181b-2No1   miR-181b   1.90E-06   8.74E-05   1.2   9q 33.3
  hsa-mir-210-prec   mIR-210   1.12E-05   0.00032   1.2   11p15.5
  hsa-mir-020-prec   miR-20a   2.53E-05   0.00057   1.5   13q31.3
  hsa-mir-106-prec-X   miR-106a   3.30E-05   0.00058   1.4   X26.2
  hsa-mir-106aNo1   miR-106a   3.51E-05   0.00058   1.4   X26.2
  hsa-mir-093-prec-7.1＝093-1   miR-93   3.52E-05   0.00058   1.2   7q22.1
  hsa-mir-335No2   miR-335   3.55E-05   0.00058   1.2   7q32.2
  hsa-mir-222-precNo1   miR-222   4.27E-05   0.00065   1.2   Xp11.3
  hsa-mir-338No1   miR-338   5.78E-05   0.00074   1.1   17q25.3
  hsa-mir-133bNo2   miR-133b   6.50E-05   0.00079   1.1   6p12.2
  hsa-mir-092-prec-X＝092-2   miR-92   7.95E-05   0.00083   1.4   Xq26.2
  hsa-mir-346No1   miR-346   8,42E-05   0.00084   1.2   10q23.2
  hsa-mir-106bNo1   miR-106b   0.0002091   0.00178   1.2   7q22.1
  hsa-mir-135-2-prec   miR-153a   0.0002363   0.00194   1.1   12q23.1
  hsa-mir-219-1No2   miR-219   0.0002515   0.00199   1.3   9q 34.11
  hsa-mir-34aNo1   miR-34a   0.000265   0,00203   1.1   1p36.22
  hsa-mir-099b-prec-19No1   miR-99b   0.0003758   0.00259   1.1   19q13.41
  hsa-mir-185-precNo2   miR-185   0.0003827   0.00259   1.2   22q11.21
  hsa-mir-223-prec   miR-223   0.0004038   0.00265   1.4   Xq12
  hsa-mir-211-precNo2   miR-211   0.0004338   0.00277   1.1   15q13.3
  hsa-mir-135-1-prec   miR-135a   0.0004648   0.00287   1.1   3p21.1
  hsa-mir-127-prec   miR-127   0.0004748   0.00287   1.1   14q32.31
  hsa-mir-203-precNo1   miR-203   0.0004993   0.00294   1.4   14q32.33
  hsa-mir-212-precNo1   miR-212   0.0006339   0.00364   1.1   17p13.3
  hsa-mir-095-prec-4   miR-95   0.0006996   0.00392   1.2   4p16.1
  hsa-mir-017-precNo2   miR-17-5p   0.0007252   0.00392   1.3   13q31.3
在肿瘤中表达降低的微小RNA
  探针   成熟miR   p-值1   FDR2   变化倍数   染色体定位
  hsa-mir-342No2   miR-342   4.00E-06   0.00015   0.9   14q32.2
  hsa-mir-192-2/3No1   miR-192   8.70E-06   0.00029   0.7   11q13.1
  hsa-mir-1-2No2   miR-1   2.22E-05   0.00057   0.9   18g11.2
  hsa-mir-34bNo2   miR-34b   4.78E-05   0.00069   0.8   11q23.1
  hsa-mir-215-precNo1   miR-215   5.26E-05   0.00071   0.7   1q41
  hsa-mir-192No1   miR-192   7.36E-05   0.00081   0.7   11q13.1
  hsa-mir-301No2   miR-301   7.44E-05   0.00081   0.7   17q23.2
  hsa-miR-324-5pNo2   miR-324-5p   1.00E-04   0.00096   0.9   17p13.1
  hsa-mir-030a-precNo2   miR-30a-3p   0.0001933   0.00171   0.9   6q13
  hsa-mir-1-1No2   miR-1   0.0002906   0.00216   0.9   20q13.33
  hsa-mir-34cNo2   miR-34c   0.0007334   0.00392   0.9   11q23.1
  hsa-mir-331No2   miR-331   0.0008555   0.00446   0.9   12q22
  hsa-mir-148bNo2   miR-148b   0.0008726   0.00446   0.9   12q13.13
1报导的P-值是来自84对结肠腺癌和非肿瘤组织的微小RNA表达模式的成对分类比较分析结果。2FDR＝错误发现率
[00210]26个微小RNA在肿瘤中以较高水平表达，其中miR-21富集最高为1.8倍。通过使用3-最近邻或最近质心算法类预测算法，总微小RNA谱在肿瘤和配对非肿瘤组织之间的区别具有89％的准确度，(10倍交叉验证，重复100次)，显示在肿瘤形成中微小RNA表达模式的系统变化。
[00211]基于它们在肿瘤和成对非肿瘤组织之间的表达差异结合它们与差的存活的相关性，选择miR-20a、miR-21、miR-106a、mtR-181b和miR-203用于验证。关于验证，用qRT-PCR测量这些微小RNA在来自独立群的肿瘤和配对非肿瘤组织中的表达水平。验证群由113个招募自中国香港的患者组成，所述患者患有易发性结肠癌(表1)。
[00212]MiR-20a(2.3倍)、miR-21(2.8倍)、miR106a(2.4倍)、miR-181b(1.4倍)和miR-203(1.8倍)在肿瘤中均以较高水平表达(p＜0.001，Wilcoxon配对测试)(表3a)。
[00213]表3-肿瘤相对配对非肿瘤组织中微小RNA的表达
表3a-香港验证群
  变化倍数
  微小RNA   ΔΔCt1   SD(ΔΔCt)   肿瘤2   p-值3
  miR-20a   1.18   0.97   2.3倍   p＜0.001
  miR-21   1.47   1.20   2.8倍   p＜0.001
  miR-106a   1.25   0.94   2.4倍   p＜0.001
  miR-181b   0.47   1.03   1.4倍   p＜0.001
  miR-203   0.83   1.40   1.8倍   p＜0.001
表3b腺瘤相对配对非腺瘤组织中微小RNA的表达
  平均   倍数变化
  微小RNA   ΔΔCt1   SD(ΔΔCt)   腺瘤2   p-值3
  miR-20a   -0.11   0.97   0.9倍   p＝0.82
  miR-21   0.64   0.90   1.6倍   p＝0.006
  miR-106a   0.28   1.22   1.2倍   p＝0.19
  miR-181b   0.30   1.24   1.2倍   p＝0.27
  miR-203   0.77   1.98   1.7倍   p＝0.14
1来自qRT-PCR的平均(肿瘤ΔCt-配对非肿瘤ΔCt)或平均(腺瘤ΔCt-配对非腺瘤ΔCt)。2根据2ΔΔ3Wilcoxon配对测试计算。SD＝标准偏差。加黑数字是统计学显著的。对于肿瘤/非肿瘤比较，针对miR-20a和miR-203使用113对组织，而针对miR-21、miR-106a、和miR-181b使用111对组织。对于所有的腺瘤/非腺瘤比较，使用18对组织。
[00214]大多数肿瘤(miR-20a为89％、miR-21为87％、miR-106a为90％、miR-181b为71％和miR-203为74％)中这些微小RNA的表达比配对非肿瘤组织高。分别基于3-最近邻或最近质心算法，这5种微小RNA的表达模式在肿瘤相对配对非肿瘤之间的区别具有96％或98％的准确度(10倍交叉验证，重复100次)。
[00215]使用原位杂交来显现肿瘤和邻近非肿瘤组织中miR-21的表达(参见图1a-f)。
[00216]与邻近的非肿瘤组织相比，MiR-21在人肿瘤组织的结肠上皮细胞的细胞核和细胞质中均以高水平表达。这些结果与qRT-PCR和微阵列数据一致，并支持微小RNA在癌发生中的地位。
[00217]MiR-21在结肠腺瘤中以较高水平表达
[00218]腺瘤代表结肠腺癌的前体阶段3。通过qRT-PCR测试18对腺瘤和邻近非腺瘤组织中miR-20a、miR21、miR-106a、miR-181b和miR-203的表达水平。虽然5个微小RNA中的4个在腺瘤组织中显示出增加的水平，但只有miR-21显著富集，为1.6-倍高(p＝0.006，Wilcoxon配对测试)(参见表3b)。
[00219]腺瘤组织在15/18配对中表达较高水平的miR-21。较晚期阶段的肿瘤表达较高水平的miR-21。根据腺瘤的诊断和TNM分期对受试者进行分类，而认为腺瘤为最早期和TNM IV期为最晚期。与来自验证群的肿瘤相比，腺瘤表达较低水平的miR-21表达(p＜0.001，Mann-Whitney测试)。较晚期的肿瘤表达较高水平的miR-21表达(测试趋势，p＜0.001)(参见图1g)。
[00220]使用来自马里兰测试群的微小RNA微阵列数据也观察到这个趋势(p＝0.04)(参见图2)。
[00221]高miR-21表达预测在两个独立群中差的预后
[00222]分析个别微小RNA肿瘤/非肿瘤(T/N)表达比以确定是否与差的预后有关。基于最高的三分位组，将T/N微小RNA表达比分类为高的。搜索任何高TIN比与癌症存活相关的微小RNA(p＜0.05)。根据这些，选择在肿瘤中差异表达的微小RNA(p＜0.001)。5个微小RNA满足这些标准。Kaplan-Meier分析表示miR-20a(p＝0.02)、miR-21(p＝0.004)、miR-106a(p＝0.01)、miR-181b(p＝0.04)和miR-203(p＝0.004)的高T/N比各自与差的存活相关。选择这5个微小RNA用于进一步分析。
[00223]在该研究中，来自89-93％的受试者的结肠腺癌具有典型的组织结构。少数肿瘤具有粘液腺癌、腺鳞状癌或印戒细胞癌组织结构(参见表1)。不同亚型的腺癌与不同的临床结果相关，包括存活预后31。为了除去与组织结构相关的潜在混淆，从最初分析中排除所有患有粘液腺癌、腺鳞状癌和印戒细胞癌的受试者。
[00224]T/N比与差的存活的相关性归因于肿瘤组织、周围非肿瘤组织、或两者的组合中微小RNA的表达水平。为了区分这些可能性，分别分析了微小RNA表达在肿瘤和配对非肿瘤中的相关性。肿瘤中miR-20a、miR-21、miR106a、miR-181b和miR-203的高表达水平(基于最高的三分位组)各自与马里兰测试群中的差的存活相关(参见图3a，还来自未显示的数据)。没有观察到这5个微小RNA中的任何一个与非肿瘤组织中微小RNA表达显著相关。
[00225]使用单变量和多变量Cox比例风险分析评价患有典型腺癌的个体中肿瘤表达水平与预后的相关性(表4a)。
[00226]表4-患有结肠腺癌的受试者中miR-21表达水平和总癌症存活率的单变量和多变量Cox回归分析1
表4a马里兰测试群
Figure A20078003306600541
表4b香港验证群
Figure A20078003306600542
＜50
≥50  1.5(0.9-2.6)     0.14
性别女性 1.0
男性  1.4(0.8-2.3)     0.29
肿瘤部位远端的 1.0
近端的   0.7(0.3-1.4)     0.27
用马里兰群的miRNA微阵列和用香港群的qRT-PCR测量微小RNA表达。1在分析中排除粘液腺癌、腺鳞状癌或印戒细胞癌的病例。2多变量分析使用逐步加入和除去发现与单变量模型中的存活相关的临床协变量(p＜0.10)，且最终模型仅包括与存活显著相关的那些协变量(Wald统计p＜0.05)。3基于最高的三分位组，定义肿瘤中所有miRNA的高表达。
[00227]在单变量(HR＝2.5[1.2-5.2]，p＝0.01)和多变量(HR＝2.9[1.4-6.1]，p＝0.004)分析中，具有表达高水平miR-21的肿瘤的个体处在显著较高的死于结肠癌的风险中。
[00228]为了验证这些发现，使用qRT-PCR来测量香港验证群中这五个微小RNA的肿瘤和非肿瘤表达水平，并分析与预后的相关性。高的miR-21肿瘤表达预测香港验证群中差的预后(p＝0.001，Kaplan-Meier log秩测试)，而在非肿瘤组织中的表达没有这种情况(参见图3b)。
[00229]没有发现在所述群中预后与miR-20a、miR-106a、181b或miR-203的表达统计学显著相关。
[00230]在香港验证群中，肿瘤中高的miR-21表达与年龄、性别、肿瘤组织结构或肿瘤部位不是显著相关的(Fisher′s exact test)。通过Cox比例风险分析检查所有的协变量(表4b)。
[00231]肿瘤中高miR-21表达(HR＝2.4[1.4-3.9]，p＝0.002)和TNM分期(HR＝4.7[2.4-9.5]，p＜0.001)与单变量模型中的存活率显著相关。多变量Cox回归分析证实肿瘤中高的miR-21表达预测差的存活预后(HR＝2.4[1.4-4.1]，p＝0.002)，独立于其他临床协变量，与马里兰测试群中的结果一致。
[00232]重复包括所有受试者的分析，不考虑肿瘤组织结构。在两个群中，高miR-21表达与预后之间存在相关性(参见图4，参见表5)。
[00233]表5-对于所有受试者，受试者中miR-21表达水平和总癌症存活的单变量和多变量Cox回归分析
表5a马里兰测试群
Figure A20078003306600561
表5b香港验证群
Figure A20078003306600562
  注册年龄＜50 1.0
  ≥50   1.4(0.8-2.4)   0.20
  性别女性 1.0
  男性   1.3(0.8-2.3)   0.27
  肿瘤部位远端的 1.0
  近端的   0.7(0.3-1.4)   0.27
  组织结构腺癌 1.0
  粘液腺癌   1.2(0.4-3.3)   0.74
用马里兰群的miRNA微阵列和用香港群的qRT-PCR测量微小RNA的表达。1在所述分析中包括所有的个体，不考虑肿瘤组织结构。2多变量分析使用逐步加入和除去发现与单变量模型中的存活相关的临床协变量(p＜0.10)，且最终的模型仅包括与存活显著相关的那些协变量(wald统计p＜0.05)。3基于最高的三分位组，定义肿瘤中所有miRNA的高表达。
[00234]MiR-21的表达水平和对治疗的应答
[00235]对与对辅助化学治疗的应答相关的生物标记的鉴定允许医师更好地预测治疗的益处。为此，分析了II和III期癌症患者中miR-21表达与对辅助化学治疗的应答的相关性。关于施用辅助化学治疗的信息在马里兰测试群的65个II和III期受试者中的47个以及香港验证群的所有受试者中是可利用的。
[00236]在这两个群中，化学治疗方案主要是基于氟尿嘧啶(以静脉内5-氟尿嘧啶的形式或以包括替加氟与尿嘧啶[UFT]的口服药物形式)，伴有或无左旋咪唑或醛氢叶酸。在所述分析中仅使用患有典型腺癌组织结构受试者，使剩下马里兰群中42个II/III期的个体中的20个接受化学治疗。对接受化学治疗的那些，肿瘤中高的miR-21表达预测较差的总存活(p＝0.01，Kaplan-Meierlog秩测试)，初步支持高的miR-21与对辅助化学治疗的差应答相关。
[00237]对于香港验证群，所述分析使用患有II/III期癌症的具有典型腺癌组织结构的77个个体。接受辅助化学治疗的II/III期受试者比没有接受辅助化学治疗的那些具有更好的存活预后(p＝0.02，Kaplan-Meier log秩测试)。在接受辅助化学治疗的那些受试者中(n＝36)，肿瘤中高的miR-21表达与对治疗的差应答相关(p＝0.03，Kaplan-Meier log秩测试)，与马里兰群中的观察一致(参见图5a)。
[00238]在所述群中，接受辅助化学治疗的所有II期受试者(n＝11)均存活(参见图5b)，但对接受辅助化学治疗的III期受试者(n＝25)，高的miR-21表达与差的存活相关(p＝0.02，Kaplan-Meierlog秩测试)(参见图5c)。
[00239]使用多变量Cox回归分析对这些观察进行分析显示高的miR-21表达预测差的预后(HR＝3.1[1.5-6.1]；p＝0.001)并且接受化学治疗预测改善的存活结果(HR＝0.3[0.1-0.5]；p＜0.001)，独立于其他临床协变量(表6a)。
[00240]表6-单变量和多变量Cox回归分析患有腺癌的I/III1期受试者中miR-21表达、辅助化学治疗的接收和癌症的存活
表6a马里兰测试群
Figure A20078003306600581
表6b香港验证群
Figure A20078003306600591
用qRT-PCR测量miRNA的表达。1所述分析包括具有典型腺癌组织结构的TNMII/III期受试者。2多变量分析使用逐步加入和除去发现与单变量模型中的存活相关的临床协变量(p＜0.10)，且最终模型仅包括与存活显著相关的那些协变量(Wald统计p＜0.05)。3根据最高的三分位组，定义肿瘤中所有miRNA的高表达。种族与差的预后无关。
[00241]使用癌复发而不是癌死亡作为终点的分析导致肿瘤中与高的miR-21表达的类似相关性，预测更快速的疾病复发(数据未显示)。
[00242]合并这两个群的分析导致类似的相关性。Kaplan-Meier分析证实高的miR-21表达预测在II期(p＝0.02)或III期(p＝0.004)受试者中差的预后(参见图6)。
[00243]高的miR-21表达预测II/III期受试者(p＝0.003)或仅III期受试者(p＝0.007)中对化学治疗的差应答。多变量Cox回归证实高的miR-21表达预测差的预后(HR＝3.0[1.7-5.4]；p＜0.001)且用辅助化学疗法的治疗预测改善的存活(HR＝0.4[0.2-0.8]；p＝0.004)，独立于其他临床些变量(表6b)。
[00244]讨论
[00245]使用两个独立的群分析结肠癌组织中微小RNA谱。根据微小RNA微阵列分析，37个微小RNA在肿瘤组织中差异表达。被测试的所有5个微小RNA的表达模式都在香港群中进行验证。5个微小RNA在肿瘤和非肿瘤组织之间不同的鉴别力表示在肿瘤形成期间微小RNA表达模式发生可预测和系统的变化且可能代表大多数散发性结肠腺癌。
[00246]发现miR-20a、miR-21、miR-106a、miR-181b和miR-203都在结肠肿瘤中以较高水平表达。微小RNA表达模式的这些变化可能仅仅与结肠癌相关或引起癌症的组织结构的进展。存在有力证据表示微小RNA表达模式的变化促进肿瘤形成，特别是miR-20a和miR-21。miR-20a是miR-17-92多顺反子微小RNA簇的一部分32。
[00247]所述簇的过表达增强体外细胞增殖33并加速动物模型中的肿瘤形成16。miR-17-92簇的强制表达通过负调节抗血管生成Tsp1蛋白引起小鼠中增加的肿瘤大小和肿瘤血管形成24。实验证据还显示miR-21表达的提高促进肿瘤发育。在大多数实体瘤中miR-21以高水平表达19，34。miR-21的过表达在人恶性胶质瘤中用作抗细胞凋亡因子13。miR-21的抑制通过间接下调抗凋亡因子Bcl-2来抑制体外细胞生长并抑制异种移植小鼠模型中肿瘤生长35。人细胞系的研究显示miR-21还能靶向肿瘤抑制基因PTEN36和TPM137。所有这些数据一起支持肿瘤形成期间微小RNA表达的变化具有因果作用。
[00248]腺瘤代表腺癌的前体时期。腺瘤表达高水平的miR-21。如果miR-21表达的增加促进结肠癌进展，腺瘤中增加的表达可能是向癌症发展的一个早期细胞事件。抑制miR-21活性可能帮助防止处于结肠癌高风险的群(如患有家族性腺瘤性息肉病的个体)中肿瘤的促进38。
[00249]因此，本文呈现的证据证实了微小RNA表达模式与结肠癌预后和对辅助化学疗法的应答之间的相关性。较晚期的肿瘤表达较高水平的miR-21。分别在马里兰测试群和香港验证群中观察到肿瘤中高miR-21表达与差的存活之间的稳固相关性。
[00250]在每个群中，这些相关性独立于所有其他临床协变量，表示除了TNM分期和其他临床参数外miR-21表达可能是一个有用的预后指示，以帮助鉴定处于较高末期癌症风险中的患者。这些观察在具有不同种族和地理组成的两个独立的群中进行。因此，所述观察广泛适用于其他群体是可能的。
[00251]在这两个群中，肿瘤中高的miR-21表达与对辅助化学疗法的差应答相关。这些结果有助于预测个体中治疗的益处，所述个体的miR-21表达情况是已知的。此外，如果高的miR-21表达引起结肠癌患者的差的存活，antagomirs29，39或其他靶向miR-21的反义治疗剂在具有高miR-21表达的肿瘤的受试者中可具有治疗益处。除了目前的治疗外，这些可用于改善存活结果。
[00252]本发明人发现在结肠癌和配对非结肠癌组织之间微小RNA表达模式的系统差异。肿瘤中高的miR-21表达预测在两个独立群中差的存活结果和对辅助化学治疗的差应答，独立于分期和其他临床协变量，表示其可能是有用的结肠腺癌诊断和存活预后(包括对治疗的应答)的生物标记。
[00253]方法
[00254]组织的收集和RNA分离：
[00255]来自84个招募自1993至2002年期间马里兰大学医学中心的患者的原发性结肠肿瘤和邻近的非肿瘤组织对，以及来自113个招募自1991至2000年期间香港玛丽医院的患者的原发性结肠肿瘤和邻近的非肿瘤组织对。收集了每个组织捐赠者的详细背景，包括年龄、性别、临床分期、肿瘤部位、从诊断到接受辅助化学治疗的存活时间。根据肿瘤体系的世界卫生组织分类1(World Health OrganizationClassification of Tumor system)对肿瘤组织病理学进行分类。腺瘤组织获自Cooperative Human Tissue Network。所述研究得到美国国家卫生院的机构审查委员会(Institutional Review Board of theNational Institutes of Health)、香港大学/Hospital AuthorityHong Kong West Cluster的机构审查委员会和马里兰大学关于人受试者研究的机构审查委员会(Institutional Review Board for HumanSubject Research at the University of Maryland)的批准。
[00256]RNA分离和微小RNA谱：
[00257]使用标准的TRIZOL(Invitrogen，Carlsbad)方法从组织中提取RNA。如之前所描述，进行微小RNA微阵列分析30。简而言之，标记5lag的总RNA并与每一包含约400个人微小RNA探针(一式四份)的微小RNA微阵列杂交。使用PerkinElmer ScanArray LX5K扫描仪扫描载片(slide)。根据制造商关于7500实时RT-PCR系统(Applied Biosystems，Foster City)的说明，使用Taqman微小RNA测试(Applied Biosystems，Foster City)进行微小RNA的qRT-PCR。U6B是所有qRT-PCR实验的标准化对照。所有试验按一式两份(miR-20a、miR-203)或一式三份(miR-21、miR-106a、miR-181b)进行。AJS对miR-21、miR-106a和miR-181b进行qRT-PCR，AJS看不见那时验证群成员的存活结果和临床数据。
[00258]微阵列分析：
[00259]在所述出版物中讨论的数据已经存放在NCBIs GeneExpression Omnibus(GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)并通过GEO系列登记号GSE7828可获得。将LOESS标准化的微阵列数据输入到BRB array tools 3.5.0(http://linus.nci.nih.gov/. BRB-ArrayTools.html)并用所述软件进行所有的后续微阵列分析。
[00260]进行微阵列分析。从分析中除去其值损失大于20％的阵列的探针，留下230个探针。成对的、分类比较分析识别在肿瘤中差异表达的微小RNA(p＜0.001)。
[00261]为了最初搜索与差的存活相关的微小RNA，使用微阵列数据分析马里兰群中的肿瘤/非肿瘤(T/N)微小RNA的表达比。通过从log2肿瘤表达值减去log2非肿瘤表达值产生微小RNA的TN表达比。过滤掉损失大于25％的T/N比的微小RNA，留下208个。将T/N表达比分成两部分，最高的三分位组分类为高的和较低的2个三分位组被分类为低的(参见补充方法)。所述高/低分界在整个研究中普遍使用。基于所有存活相关性的分析的微阵列实验的日期，对肿瘤和非肿瘤微小RNA表达水平进行分批标准化。
[00262]原位杂交：
[00263]用人miR-21探针、scramble和U6(Exiqon，Woburn)进行原位杂交(ISH)，带有由W.Kloosterman所著的关于人结肠组织的甲醛固定石蜡包埋(FFPE)组织的制造商方案的改进版本(http: //www.exiqon.com/uploads/.LNA 52-FFPE miRNA in situj.rotocol. pdf)。改进包括使用多克隆兔抗-DIG/HRP-缀合抗体和DakoCytomation GenPoint Tyramide Signal Amplication System(DakoCytomation，Carpinteria)、以及VECTOR
Figure A20078003306600631
NovaRedTM底物(Vector Laboratories，Burlingame)。在使用Olympus DP70数码相机和DP controller软件(Olympus，Champaign)的Olympus BX40显微镜上获得图像。
[00264]统计学分析
[00265]进行统计学分析。使用Wilcoxon配对测试来分析所有qRT-PCR数据中肿瘤和配对非肿瘤组织之间微小RNA表达的差异，以及腺瘤和配对非腺瘤组织之间的差异。所报道的所有趋势测试是关于有序组趋势的非参数测试。用WINSTAT 2001(R.Fitch Software)进行所有Kaplan-Meier分析。使用Intercooled Stata 9.2(StataCorpLP，College Station)进行多变量Cox回归分析。最终的多变量模型基于逐步加入和除去发现与单变量模型中差的存活相关的临床协变量(p＜0.10)。采用p＜0.05的Wald统计量作为最终多变量模型中内含物的标准。所报导的所有p-值是双边的。所报导的风险落在95％的置信区间内。使用Graphpad Prism 4.0(Graphpad Software Inc.，SanDi ego)绘制表达图。
[00266]其他微阵列分析
[00267]用于该分析的微阵列是针尖打点的(pin-spotted)微小RNA微阵列(来自Ohio State University Comprehensive CancerCenter，version 2.0)。每一个点的强度是前景的中间强度。用于所述研究的170个微阵列的每一个包含11520个点。前景强度低于背景的所有点被再指定为NA(NA标记缺失的数据点)。扫描仪标记为不足的所有点也被再指定为NA。所有具有高前景强度的空白(nooligo)点被再指定为NA。每一个微小RNA oligo由这些阵列上的点(一式四份)表示为两个邻近点的远对(distant pair)。如果一个oligoquadruple存在0或1个NA，和远的oligo对的平均值在log2量度上的区别大于1，所有一式四份的点被再指定为NA。如果一个oligoquadruple存在2个NA，和2个非NA点强度在log2量度上的区别大于1，所有一式四份的点被再指定为NA。如果一个quadruple存在3个NA点，最终的点被再指定为NA。使用这些方法，总共在1,958,400个点中有1,082,689个被再指定为NA。使用R软件包进行LOESS(Locally Weighted Scatterplot Smoothing)标准化。然后将所有数据输入BRB array tools version 3.5.0以进行分析并对所有重复点进行平均。使用最初存在85对(肿瘤和配对非肿瘤组织)的阵列。一个最初被鉴定为易发性结肠腺癌的患者的病例后来发现被诊断为原位癌，并从所述分析中除去，留下84个受试者的研究群。过滤微小RNA的列表使其仅包括389个人hsa-miR probesets。对其进一步过滤以除去任何在超过25％的阵列中缺少的探针组，留下230个人微小RNA探针组。使用成对的分类比较分析来鉴定在肿瘤和配对非肿瘤组织中差异表达的微小RNA。对于两个微小RNA(miR-181b和miR-338)，两个测量彼此的独立探针给出了矛盾的结果，其中对于每一个微小RNA，一个探针在肿瘤中显示较高的表达，而一个探针在肿瘤中显示较低的表达。对于每一个，放弃指示miR-181b和miR-388在肿瘤中富集较不显著的结果。此外，qRT-PCR证实miR-181b在肿瘤中富集。
[00268]最初使用每一个微小RNA的肿瘤/非肿瘤(T/N)表达谱来搜索与差的存活率相关的微小RNA。对于所述分析，决定用普遍高和低的分界将所有表达数据分为两个部分，以寻找与差的存活的相关性。为了确定所使用的普遍高/低的分界，以三种独立的方式，将T/N表达数据分成两个部分，并确定哪个方法在测试群中给出最多数量的显著结果。高的表达基于高于中间、最高三分位组或最高四分位组(Quartile)进行分类，并使用单变量Cox回归分析测试了这些分界与差的存活的相关性。在37个在肿瘤中表达不同的微小RNA中，基于高于中值，4个高的表达与差的存活相关，基于最高三分位组，5个高的表达与差的存活相关，基于最高四分位组，2个高的表达与差的存活相关(p＜0.05，数据未显示)。基于最高三分位组的二分化，基于马里兰测试群中的标准给出与差的存活最相关的微小RNA；因此，在整个研究中一致使用基于最高三分位组的分类来分析马里兰测试群和香港验证群中微小RNA的表达水平与差的预后之间的相关性。
[00269]使用微小RNA微阵列比较肿瘤中miR-21的表达水平与预后。用于所述分析的微阵列探针是hsa-miR-21-prec17No1。该分析要求根据微阵列实验的日期对数据进行批标准化。为了根据日期进行标准化，每天分别将表达给定微小RNA的最高的1/3的阵列归类为高的。在任意给定的一天，对至多12对组织进行分析。对进行少于10对微阵列的任意一天，放弃在那些天进行的阵列，导致损失5对阵列。然后合并这些数据以分析与存活结果的相关性。检查并发现在基于微阵列实验(Fisher′s exact test)的时间进行分类的组之间，在年龄、性别、种族、肿瘤部位、TNM期、或癌症存活的频率分布上没有显著差异。
[00270]统计学分析
[00271]使用Cox比例风险回归分析mir-21表达水平和其他临床变量对患者存活的影响。包括的临床变量是年龄、性别、种族、肿瘤部位、肿瘤组织结构、辅助化学疗法的接收和TNM分期。对于这些模型，选择对年龄进行二分，为年龄＞50相对年龄＜50，因为结肠癌的推荐筛选年龄是50；如果肿瘤位于脾曲内或附近，肿瘤部位被定义为近端的(proximal)，如果肿瘤位于降结肠内或远离降结肠，肿瘤部位被定义为远端的(distal)；基于转移相对非转移疾病将TNM分期二分，导致I-II期相对III-IV期。马里兰群中的一个患者在手术当天死亡，导致0个月的存活时间。所述病例包括在Kaplan-Meier分析中并从Cox回归分析中除去，引起图2(n＝72)的肿瘤中miR-21表达的案例与表4的Cox回归分析(n＝71)中的案例数有差别。对每一个临床协变量进行单变量Cox回归以检查每一个对患者存活的影响。最终的多变量模型基于逐步加入和除去发现与单变量模型中差的存活相关的临床协变量(p＜0.10)。采用p＜0.05的Wald统计量作为最终多变量模型中内含物的标准。将最节俭Cox回归模型用于最终的多变量模型。
[00272]实施例2-最初的结果
[00273]MiRNA在结肠肿瘤中差异表达
[00274]使用miRNA微阵列分析85对癌和邻近的非癌结肠组织的miRNA谱。发现肿瘤的miRNA表达谱与正常组织非常不同，表示miRNA在结肠癌变中起显著作用。成对的分类比较分析鉴定了27个在这些肿瘤中差异表达的独立miRNA(表7)。
[0275]表7-与配对的正常组织相比，27个miRNA在结肠肿瘤中差异表达不同。在BRB array tools 3.4中使用成对的分类比较分析发现27个miRNA在肿瘤中差异表达。使用p＜0.001的权值作为差异表达的标准，其导致0.08％的估计错误发现率。上调(Up)指在肿瘤中以较高水平表达的miRNA，而下调(down)表示肿瘤中miRNA水平较低。
  表7   微小RNA   上调/下调   P-值
  1   miR-331   下调   1.00E-07
  2   miR-21   上调   1.00E-07
  3   miR-34b   下调   2.00E-07
  4   miR-342   下调   2.00E-07
  5   miR-215   下调   2.20E-05
  6   miR-371   下调   7.00E-07
7 miR-373 下调 6.30E-06
  8   miR-192   下调   7.70E-06
  9   miR-148b   下调   1.03E-05
  10   miR-138   下调   1.49E-05
  11   miR-301   下调   1.85E-05
  12   miR-338   下调   2.63E-05
  13   miR-153   下调   2.67E-05
  14   miR-129   下调   3.20E-05
  15   miR-222   上调   9.08E-05
  16   miR-346   上调   0.000126
  17   miR-204   上调   0.000244
  18   miR-181b   上调   0.000263
  19   let-7a-2   下调   0.000272
  20   miR-106a   上调   0.000305
  21   miR-093   上调   0.000334
  22   miR-34c   下调   0.000341
  23   miR-219   上调   0.000352
  24   miR-019b   上调   0.000364
  25   miR-210   上调   0.000389
  26   miR-185   上调   0.000516
  27   miR-1   下调   0.00064
[00276]用于解释多重比较测试的错误发现率约为0.8％，表示这些miRNA的大部分(如果不是全部的话)差异表达，且不是多重比较测试的结果。发现11个miRNA在肿瘤中具有提高的表达水平而发现16个miRNA在肿瘤中降低。此外，可以使用miRNA谱来预测所述组织是肿瘤或非肿瘤的，具有92％的准确率。基于2000个随机排列，偶然随机发生的这些预测的可能性是非常低的(p＜0.0005)。这些结果显示在肿瘤和正常组织之间存在miRNA表达谱的系统差异，表示在结肠癌变期间miRNA表达谱发生改变。
[00277]总miRNA表达谱预测结肠癌的存活预后
[00278]确定miRNA表达谱是否预测患者的存活。对于所述分析，计算每一个个体的每一个miRNA的肿瘤相对正常的miRNA表达比(TIN比)。所有miRNA TIN比的无监督分层聚类将个体分成两组，随机被标记为A组和B组(图7)。
[00279]这两个组在临床分期(p＝0.009；图1b)和存活预后(p＝0.026；图7c)上显著不同。
[00280]这表示总miRNA谱预测临床分期，且更重要地，预测存活预后。
[00281]使用单变量和多变量Cox回归分析更详细研究所述关系(表8)。
[00282]表8总miRNA谱的Cox回归分析
[00283]进行单变量(上)和多变量(下)Cox回归分析显示归类在miRNA B组的个体处于较高的死于结肠癌的风险中。年龄、性别或种族均不是存活风险的显著贡献者。出于这些分析的目的，将年龄二分为大于或小于50，并将种族二分为美国黑人(AA)和白种人(Caucasian)。
Figure A20078003306600681
[00284]B组个体具有显著较高的死于结肠癌的风险(风险比[HR]＝2.6(p＝0.04)。在根据年龄、种族和性别进行校准后，这风险仍维持显著高(HR＝2.7；p＝0.03)。这些结果证实了使用结肠癌的miRNA谱预测预后的潜力。这些结果显示miRNA还可能在结肠癌变中起作用。
[00285]miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-16h、miR-203、let-7tg、miR-29a、miR-103-2和miR-10a的谱预测结肠癌预后
[00286]识别其表达水平预测结肠癌预后的个别miRNA。对TIN比使用Kaplan Meier存活图和多变量Cox回归分析以鉴定与差的存活预后相关的miRNA表达模式。使用BRB阵列工具鉴定与差的存活相关的TIN比(数据未显示)。选择更详细地分析这些miRNA。还分析任何在肿瘤中差异表达的miRNA(p＜0.01)。根据中间或最高四分位组TIN比，对每个个体的TIN比进行二分。还从分析中除去任何在大于18个个体中TIN比缺失的miRNA。鉴定至少9个miRNA，包括miR-21、nriR-106a、miR-181b、miR-16h、miR-203、let-7g、miR-29a、miR-103-2和miR-10a，其TIN比预测结肠癌预后(图8，表9)。
[00287]Cox回归分析各个miRNA的TIN比
[00288]进行单变量和多变量Cox回归分析显示可以使用各个miRNA的TIN比来分类处于较高的死于结肠癌风险中的个体。这9个miRNA的TIN比是存活预后的重要预测因子，独立于TNM分期、年龄、性别和种族。注意根据中间TIN比值对miR-16b、miR-21、miR-29a、miR-103-2、miR-I06a和miR-203的高/低区别进行分类，而根据最高四分位组TIN比对Iet-7g，miR-10a和miR-1815进行分类。
[00289]表9：各个miRNA的TIN比的Cox回归分析
Figure A20078003306600701
Figure A20078003306600702
Figure A20078003306600703
Figure A20078003306600704
Figure A20078003306600705
Figure A20078003306600711
Figure A20078003306600712
Figure A20078003306600713
Figure A20078003306600714
  男性/女性   1.7(0.6-5.0)   0.34
  AA/白人   1.0(0.45-2.3)   0.98
  III-IV期/I-II期   4.9(1.9-12.2)   0.001
[00290]评价肿瘤中MiR-21表达(表7)。还将miR-21 TIN比与结肠癌患者的临床分期和存活预后相关联(表9，图8a)。
[00291]存在一个趋势：较晚期TNM分期的个体具有较高的TIN比(p＝0.034)。根据80个个体的每一个的中值对TIN比进行二分。基于Kaplan Meier分析，具有高的miR-21 TIN表达比的个体具有较差的存活预后(p＝0.004)，表示表达高水平miR-21的肿瘤预测差的预后。用Cox回归分析进一步分析这些结果。
[00292]根据对年龄、性别、种族和TNM分期进行校准的单变量(HR＝3.0；p＝0.01)和多变量(HR＝2.8；p＝0.02)分析，具有高的miR-21 TIN比的个体处于较高风险中(表9)。
[00293]该结果表示miR-21表达水平可用作预后预测方法并能提供比单独的TNM分期更具有预测性的存活预后值。已经在许多肿瘤类型中发现miR-21的差异表达12-18。
[00294]研究还证实mi R-21的高水平可能导致恶性胶质瘤中细胞凋亡的抑制5，而miR-21的抑制能导致HeLa细胞中细胞增殖增加19。
[00295]本发明人发现目前认为miR-21以类似方式贡献于结肠癌变。
[00296]发现肿瘤中miR-106a的升高(表7)和miR-106a TIN比与存活预后相关(表9，图8b)。
[00297]MiR-106a是旁系同源miRNA类的成员，所述旁系同源miRNA包括miR-17、miR-20、miR-106a和miR-106h20。这些miRNA非常类似于另一个，区别仅在于1-2个核苷酸。由于它们的相似性，它们可能都具有类似的靶。有趣地是，这四个miRNA都显示类似的表达模式和与预后的相关性(数据未显示)。本文提供miR-106a的相关性，但形式上没有排除任何或所有其他miRNA平行基因对所述相关性有贡献的可能性。基于82个个体的每一个的中值对MiR-106a TIN比进行二分。基于Kaplan Meier分析，具有高miR-106a TIN表达比的个体具有较差的存活预后(p＝0.013；图8b)。
[00298]这表示高水平表达miR-106a的肿瘤预测差的存活预后。根据对年龄、性别、种族和TNM分期进行校准的单变量(FIR＝2.6，p＝0.01)和多变量(HR＝2.4；p＝0.05)分析，具有高的miR-106aTIN比的个体处于较高风险中(表7)。因此，miR-106a可以成为有用的结肠癌预后的预后预测因子，独立于TNM分期。有趣地是，视网膜神经胶质瘤抑制基因已显示是miR-106a的功能靶12，支持miR-106a在机理上贡献于结肠癌变的机制。
[00299]包含miR-106a平行基因的miR-17-92簇的过表达导致小鼠肿瘤发育加速10。这在实验上显示所述miR-106a家族的miRNA能影响癌变，进一步支持了miR-106a可能对癌变和肿瘤进展有贡献的假说。
[00300]7个其他miRNA的表达模式与临床分期和差的存活预后相关(表9，图8c-8i)。
[00301]存在一个趋势：诊断患有较晚期TNM分期的个体，对/et-7a(p＝0.010)、miR-10a(p＝0.008)、miR-16h(p＝0.048)、miR-29a(p＝0.005)、miR-103-2(p＝0.033)、miR-181h(p＝0.016)和miR-203(p＝0.016)而言，具有较高的TIN比(图8)。
[00302]基于中间值(miR-16h、miR-29a、miR-103-2、miR-203)或最高四分位组(let-7g、miR-10a、miR-181h)将TIN比分成两部分，Kaplan Meier分析揭示：发现每一个高的TIN比是差的存活预后的预测因子(图8c-8i)。
[00303]单变量和多变量Cox回归分析证实这些miRNA的任一个的高TI N比预测差的结肠癌预后，独立于TNM分期(表9)。对年龄、性别、种族和TNM分期进行校准的多变量Cox回归模型显示对miR-16b(HR＝5.1；p＝0.003)、Jet-7g(HR＝2.5；p＝0.03)、miR-10a(HR＝3.4；p＝0.003)、miR-29a(HR＝3.2；p＝0.01)、miR-103-2(HR＝3.1；p＝0.01)、miR-181h(HR＝3.2；p＝0.01)和miR-203(HR＝3.2；p＝0.03)而言，高的TIN比各自预测差的存活预后。这些结果显示具有表达高水平的这些miRNA中任一个的肿瘤的患者，处于增加的死于结肠癌的风险中。因此，任何这些miRNA的表达水平可能成为有用的生物标记，所述生物标记能帮助预测结肠癌患者的存活风险，独立于分期。
[00304]9个miRNA的MiRNA表达特征预测存活预后：
[00305]使用所有9个之前提到的miRNA的TIN比来产生可用于预测结肠癌预后的miRNA特征。从所述分析中排除在9个这些值中缺失超过2个的个体。所述9个miRNA的TIN比的分层聚类将剩下78个患者分成两组(图9a)。
[00306]这些组具有显著不同的存活预后(图9b，p＝0.004)。单变量(HR＝3.2，p＝0.008)和多变量(HR＝2.8，p＝0.04)。Cox回归分析证实所述miRNA特征与差的存活预后相关，独立于TNM分期(表10)。
[00307]表10-微小RNA特征的Cox回归分析
Figure A20078003306600741
[00308]进行单变量(上)和多变量(对年龄、性别、种族和分期进行校准；下)Cox回归分析显示使用所述9个miRNA特征被分类为B组的个体处于死于较高的结肠癌风险中。年龄、性别或种族均对存活风险没有显著贡献。与聚类指定(cluster assignment)有关的风险独立于分期。
[00309]这些结果证实miRNA特征可用作生物标记来预测结肠癌患者的存活预后。
[00310]讨论
[00311]个别miRNA在结肠肿瘤中差异表达12，13显示这些miRNA改变的表达可能是造成结肠癌变的细胞变化的一部分。除了这些发现外，本文显示miRNA表达谱与结肠癌分期和预后相关。因此miRNA(单独分析或作为miRNA特征的一部分)可用作生物标记，所述生物标记将能让医师更准确地预测患者的存活风险。
[00312]miRNA TIN比与存活预后的强相关性显示改变的miRNA表达可能是结肠癌变和进展中因果途径的一部分。如果这些miRNA中的任一个的改变的表达引起癌变，也许能够设计能用于治疗癌症的类antagomir的医药品。使用miRNA分析和基于miRNA的治疗剂，根据这9个miRNA中的哪一些被改变，也许能够设计针对性的药物治疗方案。此外，这些方案可用于预防人的结肠癌，所述人处于归因于基因学上遗传的风险或以前的癌症史的高风险中。
[00313]实施例3
[00314]诊断、分期、预测、监测和治疗结肠癌相关疾病的方法、试剂和试剂盒。
[00315]在一个实施方案中，提供评估患者是否患有结肠癌相关疾病或是否具有高于正常发展结肠癌相关疾病的风险的诊断方法，包括比较患者样品中标记物的表达水平与对照(例如，来自不患有结肠癌相关疾病的患者的样品)中所述标记物的正常表达水平的步骤。与正常水平相比，患者样品中所述标记物显著较高的表达水平指示患者患有结肠癌相关疾病或具有高于正常发展结肠癌相关疾病的风险。
[00316]选择所述标记物，使得所述方法的正预测值至少约为10％，且在某些非限制性实施方案中，约为25％、约为50％或约为90％。与正常细胞相比，还优选用于所述方法的标记物，其中至少约20％，且在某些非限制性实施方式中约50％或约75％，被差异表达至少2倍。
[00317]在评估患者是否患有结肠癌相关疾病的一种诊断方法中(例如，新的检测(“筛选”)，复发的检测，反射测试(reflextesting))，所述方法包括比较：a)患者样品中标记物的表达水平，和b)对照非结肠癌相关疾病样品中所述标记物的正常表达水平。与正常水平相比，患者样品中所述标记物显著较高的表达水平指示患者患有结肠癌相关疾病。
[00318]还提供评估抑制患者中结肠癌相关疾病的治疗功效的诊断方法。所述方法包括比较a)获自患者的第一样品中标记物的表达，所述患者为对其提供至少一部分治疗之前的患者，和b)获自患者的第二样品中所述标记物的表达，所述患者为对其提供部分治疗后的患者。相对于第一样品中所述标记物的表达水平，第二样品中所述标记物显著低的表达水平指示所述治疗对于抑制所述患者中结肠癌相关疾病是有效的。
[00319]将理解在这些方法中，所述“治疗(therapy)”可以是任何用于治疗结肠癌相关疾病的任何治疗，包括但不限于药物组合物，基因治疗和生物治疗，诸如施用抗体和趋化因子。因此，本文所述的方法可用于评价治疗前、治疗中和治疗后的患者，例如，评价病情的缓解。
[00320]在某些方面，所述诊断方法涉及使用化学或生物试剂的治疗。这些方法包括比较：a)获自患者的第一样品中标记物的表达，并在化学或生物试剂存在下维持，和b)获自患者的第二样品中所述标记物的表达，并在不存所述试剂下维持。相对于第一样品中所述标记物的表达水平，第二样品中所述标记物显著较低的表达水平指示所述试剂对于抑制所述患者中结肠癌相关疾病是有效的。在一个实施方案中，所述第一和第二样品可以是获自所述患者的单一样品的部分或获自所述患者的样品库的部分。
[00321]还提供评估患者中结肠癌相关疾病进展的监测方法，所述方法包括：
a)在第一个时间点检测患者样品中标记物的表达；
b)及时在后续时间点重复步骤a)；和
c)比较步骤a)和b)中检测到的表达水平，由此监测患者中结肠癌相关疾病的进展。与在第一时间点时样品中所述标记物的表达水平相比，在后续时间点时样品中所述标记物显著较高的表达水平指示所述结肠癌相关疾病在恶化，而显著较低的表达水平指示结肠癌相关疾病在退化。
[00322]进一步提供确定结肠癌相关疾病是否恶化或将来是否可能恶化的诊断方法，所述方法包括比较：a)患者样品中标记物的表达水平，和b)对照样品中所述标记物的正常表达水平。与正常水平相比，患者样品中显著较高的表达水平指示结肠癌相关疾病会恶化或将来可能恶化。
[00323]还提供选择抑制患者中结肠癌相关疾病的组合物的测试方法。所述方法包括下述步骤：a)获得包含来自患者的细胞的样品；b)在多种测试组合物存在下，分别维持等分试样的样品；c)比较每一个等分试样中标记物的表达；和d)选择测试组合物中的一个，其相对于在其他测试组合物存在下所述标记物的表达水平，显著降低含有该组合物的等分试样中所述标记物的表达水平。
[00324]还提供评估引起结肠癌相关疾病的化合物的危害潜力。所述方法包括下述步骤：a)在化合物存在和不存在下维持分开的细胞等分试样；和b)比较每一个等分试样中标记物的表达。相对于不存在所述化合物而维持的等分试样，在所述化合物存在下维持的等分试样中所述标记物显著较高的表达水平指示所述化合物具有所述危害潜力。
[00325]此外，进一步提供一种抑制患者中结肠癌相关疾病的方法。所述方法包括下述步骤：a)获得包含来自患者的细胞的样品；b)在多种测试组合物存在下，分别维持等分试样的样品；c)比较每一个等分试样中标记物的表达；和d)给所述患者施用所述组合物中的至少一种，其相对于在其他组合物存在下所述标记物的表达水平，显著降低含有所述组合物的等分试样中所述标记物的表达水平。
[00326]例如，通过检测样品中下述物质的存在可以评估样品中标记物的表达水平：相应标记蛋白或所述蛋白的片段(例如，通过使用试剂，诸如与所述蛋白或蛋白片段特异性结合的抗体衍生物、抗体片段或单链抗体)、相应标记核酸(例如，核苷酸转录物、或其补体)、或所述核酸的片段(例如，通过使获自样品的经转录的多核苷酸与底物接触，所述底物在其上固定有一个或多个具有完整或部分核酸序列或其补体的核酸)、由相应标记蛋白直接(即，催化)或间接产生的代谢物。
[00327]可以使用结肠癌相关疾病标记物的至少一个或多个(例如，2、3、5或10或更多)，包括结肠癌相关疾病标记物来进行前述方法的任何一个。
[00328]在所述方法中，比较样品中多个标记物(至少一个是标记物)中每一个的表达水平与相同类型的获自不患有结肠癌相关疾病的对照人的样品中多个标记物中每一个的正常表达水平。相对于标记物相应的正常或对照水平，样品中一个或多个标记物，或其一些组合的显著改变(即，如使用单一标记物的上述方法中所指出的，升高或降低)的表达水平指示所述患者患有结肠癌相关疾病。对于所有前述的方法，选择所述标记物使得所述方法的正预测值至少约为10％。
[00329]在另一方面，提供各种诊断和测试试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒用于评估患者是否患有结肠癌相关疾病。所述试剂盒包括评估标记物表达的试剂。在另一个实施方式中，试剂盒用于评估用于抑制患者中结肠癌相关疾病的化学或生物试剂的适宜性。所述试剂盒包括评估标记物表达的试剂，且还可以包括一种或多种所述试剂。
[00330]在另一个实施方案中，所述试剂盒用于评估结肠癌相关疾病细胞的存在或用于治疗结肠癌相关疾病。所述试剂盒包括与标记蛋白或所述蛋白的片段特异性结合的抗体、抗体衍生物或抗体片段。所述试剂盒还可以包括多种抗体、抗体衍生物或抗体片段，其中多种所述抗体试剂与标记蛋白或所述蛋白的片段特异性结合。
[00331]在另一个实施方案中，所述试剂盒用于评估结肠癌相关疾病细胞的存在，其中所述试剂盒包括与标记核酸或所述核酸的片段特异性结合的核酸探针。所述试剂盒还可以包括多种探针，其中每一种探针与标记核酸或所述核酸的片段特异性结合。
[00332]在另一方面，提供治疗患有结肠癌相关疾病或处于发展出肠癌相关疾病的风险中的患者的方法。所述方法包括降低标记物的表达和/或干扰标记物的生物功能。在一个实施方案中，所述方法包括给患者提供与标记核酸或其片段互补的反义寡核苷酸或多核苷酸。例如，通过递送表达标记核酸或其片段的反义多核苷酸的载体，可以给患者提供反义多核苷酸。在另一个实施方式中，所述方法包括给患者提供与标记蛋白或所述蛋白的片段特异性结合的抗体、抗体衍生物或抗体片段。
[00333]在一个广义的方面，提供产生用于评估至少一种结肠癌相关疾病的非人动物模型的方法。所述方法包括使动物接触重复剂量的至少一种认为引起结肠癌的化学试剂。在某些方面，所述方法进一步包括收集一种或多种来自所述动物的选择样品；并比较所收集的样品与一种或多种潜在结肠癌引发或发展的标记。
[00334]在广义方面，提供产生动物模型的方法，包括：将动物维持在无特别化学试剂的环境下，并用至少一种认为引起结肠癌的化学试剂使所述动物过敏。在某些实施方案中，所述动物结肠的至少一部分通过多次连续接触被敏化。
[00335]在另一方面，提供筛选有效对抗至少一种结肠癌相关疾病的试剂的方法。所述方法通常包括：给动物施用至少一种试剂，测定所述试剂是否减轻或加重结肠癌相关疾病症状的一种或多种；使一种或多种症状的减轻与对抗所述结肠癌相关疾病的试剂的有效性相关联；使没有一种或多种症状的减轻与对抗所述结肠癌相关疾病的试剂的无效性相关联。
[00336]所述动物模型用于评估一种或多种代谢途径，所述代谢途径对至少一种结肠癌相关疾病的引发、进展、严重性、病理、恶化、分级、活性、残疾、死亡率、发病率、疾病亚分类或其他潜在致病或病理特征的至少一种有贡献。所述分析可以是下述的一种或多种：分层聚类(hierarchical clustering)、信号网构建(signature networkconstruction)、质谱蛋白组学分析(mass spectroscopy proteomicanalysis)、表面等离子体共振(surface plasmon resonance)、线性统计建模(linear statistical modeling)、偏最小二乘法判别分析(partial least squares discriminant analysis)、和多线性回归分析(multiple linear regression analysis)。
[00337]在一个具体方面，所述动物模型通过检查一种或多种标记物或其功能等价物的表达水平来对至少一种结肠癌相关疾病进行评估。
[00338]除非另有说明，所有本文所使用的术语的意义与本领域技术人员通常理解的意义相同(例如，在细胞培养、分子基因学、核酸化学、杂交技术和生物化学中)。标准技术是在本领域技术范围内用于分子、基因和生物化学的方法。所述技术在文献中得到详细解释。例如参见，Molecular Cloning A Laboratory Manual，2nd Ed.，ed.by
Sambrook，Fritsch and Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNACloning，Volumes I and II(Glover ed.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(Gait ed.，1984)；Mullis et al.U.S.Pat.No：4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(Hames & Higgins eds.，1984)；Transcription And Translation(Hames & Higgins eds.，1984)；Culture OfAnimalCells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRLPress，1986)；Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer Vectors ForMammal ian Cells(Miller and Calos eds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；MethodsIn Enzymology，Vols.154 and 155(Wu et al.eds.)，Immunochemical Methods In CellAnd Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes I-IV(Weir and Blackwell，eds.，1986)；The Laboratory Rat，editor in chief：Mark A.Suckow；authors：Sharp and LaRegina.CRCPress，Boston，1988，其以引用方式并入本文)和化学方法。
[00339]本文所描述的是最近发现的与各种细胞的结肠癌诱导状态相关的标记物。已经发现这些标记物中的任何一个或这些标记物的组合高于正常的表达水平与患者中结肠癌相关疾病的存在相关。提供检测样品中结肠癌相关疾病存在、样品中结肠癌相关疾病不存在、结肠癌相关疾病的分期和其他结肠癌相关疾病特征的方法，所述特征与患者中结肠癌相关疾病的评估、预防、诊断、表征和治疗相关。还提供治疗结肠癌相关疾病的方法。
[00340]定义  如本文所使用的，下述每一个术语在所述部分中具有与其相关的意义。
[00341]本文使用的冠词“一个”指一个或多于一个(即，至少一个)语法对象的物品。例如，“一个要素”指一个要素或多个要素。
[00342]“标记物(marker)”是基因或蛋白，其相对于正常或健康组织或细胞中的表达水平在组织或细胞中表达水平的改变与病情相关。
[00343]“正常”的标记物表达水平是在不患有结肠癌相关疾病的人受试者或患者的结肠系统细胞中所述标记物的表达水平。
[00344]标记物的”过表达”或”显著高水平的表达”指测试样品中的表达水平高于用于评估表达的试验的标准误差，且在某些实施方案中，至少两倍，在其他实施方案中，3、4、5、或10倍高于对照样品中所述标记物的表达水平(例如，来自不患有与所述标记物相关疾病的健康受试者的样品)，和在某些实施方案中，高于几个对照样品中所述标记物的平均表达水平。
[00345]标记物的“显著较低水平的表达”指测试样品中的表达水平是至少2倍，和在某些实施方案中，3、4、5、或10倍低于对照样品中所述标记物的表达水平(例如，来自不患有与所述标记物相关疾病的健康受试者的样品)和在某些实施方案中，低于几个对照样品中所述标记物的平均表达水平。
[00346]试剂盒是任何制品(例如，包装或容器)，其包括至少一种试剂，例如，特异性检测标记物表达的探针。所述试剂盒可以作为执行本发明方法的一个单元被推广、配销或销售。
[00347]“蛋白”包括标记蛋白及其片段；变体标记蛋白及其片段；肽和多肽，其包括标记物或变体标记蛋白的至少15个氨基酸片段；和融合蛋白，所述融合蛋白包含标记物或变体标记蛋白、或标记物或变体标记蛋白的至少15个氨基酸的片段。
[00348]本文所述的组合物、试剂盒和方法尤其具有下述用途：1)评估患者是否患有结肠癌相关疾病；2)评估人患者中结肠癌相关疾病的阶段；3)评估患者中结肠癌相关疾病的等级；4)评估患者中结肠癌相关疾病的性质；5)评估患者中发展出结肠癌相关疾病的潜在可能；6)评估患者中与结肠癌相关疾病相关的细胞组织结构类型；7)制备抗体、抗体片段或抗体衍生物，所述抗体、抗体片段或抗体衍生物可用于治疗结肠癌相关疾病和/或评估患者是否患有结肠癌相关疾病；8)评估结肠癌相关疾病细胞的存在；9)评估用于抑制患者中结肠癌相关疾病的一种或多种测试化合物的功效；10)评估用于抑制患者中结肠癌相关疾病的治疗的功效；11)监测患者中结肠癌相关疾病的进展；12)选择用于抑制患者中结肠癌相关疾病的组合物或疗法；13)治疗患有结肠癌相关疾病的患者；14)抑制患者的结肠癌相关疾病；15)评估测试化合物的危害潜力；和16)预防处于发展出结肠癌相关疾病风险的患者中结肠癌相关疾病的发作。
[00349]筛选方法
[00350]通过本文所述的方法构建的动物模型将实现对用于治疗或预防结肠癌相关疾病的治疗试剂的筛选。因此，所述方法用于鉴定用于治疗或预防结肠癌相关疾病的治疗试剂。所述方法包括：给动物模型施用候选试剂，所述动物模型由本文所述的方法构建；相对于没有施用所述候选试剂的对照动物模型，评估所述动物模型中至少一种结肠癌相关疾病的应答。如果症状中至少一种结肠癌相关疾病应答减轻或延迟发作，则所述候选试剂是治疗或预防结肠癌相关疾病的试剂。
[00351]所述候选试剂可以是本领域已知的药学试剂或可以是之前不知道具有药学活性的试剂。所述试剂可是天然来源的或实验室设计的。它们可以分离自微生物、动物或植物，或可以重组产生或通过任何合适的化学方法合成。它们可以是小分子、核酸、蛋白、肽或肽模拟物。在某些实施方案中，候选试剂可以是分子量大于50并小于约2500道尔顿的小有机化合物。候选试剂包含与蛋白发生结构相互作用所必需的官能团。还在大分子中发现候选试剂，包括但不限于肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、其结构类似物或组合。
[00352]候选试剂获自各种来源，包括合成或天然化合物文库。存有例如众多可用于随机和定向合成多种有机化合物和生物分子的方法，包括随机寡核苷酸和寡肽的表达。或者，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库是可用的或容易产生的。此外，天然或合成产生的文库和化合物可通过常规的化学、物理和生物化学方法容易地进行改性，并可用于产生组合文库。在某些实施方案中，所述候选试剂可使用组合文库方法技术中任一种方法获得，包括，但不限于：生物文库、空间可寻的平行固相或液相文库(spatiallyaddressable parallel solid phase or solution phase libraries)；需要去卷积的合成文库法、”一珠一物”文库法、和使用亲和色谱选择的合成文库法。
[00353]在某些其他实施方案中，可以对某些药物试剂进行定向或随机的化学改性(诸如，酰化、烷基化、酯化、酰胺化(amidification)等)以产生结构类似物。
[00354]鉴定用于治疗结肠癌相关疾病的治疗剂的相同方法也可用于验证体外研究产生的前导化合物/试剂。
[00355]所述候选试剂可以是上调或下调一种或多种结肠癌相关疾病应答途径的试剂。在某些实施方案中，所述候选试剂可以是影响所述途径的拮抗剂。
[00356]治疗结肠癌相关疾病的方法
[00357]本文提供治疗、抑制、减轻或逆转结肠癌相关疾病应答的方法。在本文所述的方法中，给需要其的个体(诸如，但不限于所述并发症还不明显的结肠癌相关疾病患者以及已经具有至少一个结肠癌相关疾病应答的那些)，施用干扰信号级联的试剂。
[00358]在前面的情况中，所述治疗用于预防所述结肠癌相关疾病应答的发生和/或降低它们发生的程度。在后面的情况中，所述治疗用于降低所述结肠癌相关疾病应答发生的程度，预防其进一步发展或逆转所述结肠癌相关疾病应答。
[00359]在某些实施方案中，干扰结肠癌相关疾病应答级联的试剂可以是对所述应答具有特异性的抗体。
[00360]标记物的表达
[00361]可以以多种方式抑制标记物的表达，以非限制性举例的方式包括，可以给结肠癌相关疾病细胞提供反义寡核苷酸以抑制所述标记物的转录、翻译或两者。或者，可以给所述细胞提供与合适启动子/调控区可操作连接的多核苷酸以产生抑制所述蛋白功能或活性的细胞内抗体，所述多核苷酸编码特异性结合标记蛋白的抗体、抗体衍生物或抗体片段。还可以通过用特异性结合标记蛋白的抗体、抗体衍生物或抗体片段治疗结肠癌相关疾病细胞来抑制标记物的表达和/或功能。使用本文所述的方法，对多种分子，特别包括能穿过细胞膜的足够小的分子进行筛选以鉴定抑制标记物表达或抑制标记蛋白功能的分子。可以给患者提供如此鉴定的化合物以抑制患者的结肠癌相关疾病细胞。
[00362]可以在本文所述的组合物、试剂盒和方法中使用任何标记物或标记物的组合以及任何某些标记物与所述标记物的组合。通常，希望使用这样的标记物，所述标记物在结肠癌相关疾病细胞中的表达水平与相同标记物在正常结肠系统细胞中的表达水平之间的差异尽可能大。虽然所述差异可以小到所述标记物表达的评估方法的检出限，希望所述差异至少大于评估方法的标准误差，且在某些实施方案中，至少2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、15-、20-、100-、500-、1000-倍或大于正常组织中相同标记的表达水平。
[00363]认识到某些标记蛋白被分泌到细胞周围的细胞间隙。由于可在结肠癌相关体液样品(其可能比组织活检样品更容易从人患者中收集)中检测到所述标记蛋白这一事实，在所述组合物、试剂盒和方法的某些实施方案中使用这些标记物。此外，标记蛋白的体内检测技术包括向受试者中引入针对所述蛋白的经标记的抗体。例如，所述抗体可以用放射性标记物标记进行标记，受试者中所述放射性标记物的存在和位置可以通过标准成像技术检测。
[00364]为了确定任何具体的标记蛋白是否是分泌蛋白，例如在哺乳动物细胞(诸如，人结肠系)中表达所述标记蛋白，收集细胞外液，并评估细胞外液中所述蛋白存在与否(例如，使用与所述蛋白特异性结合的经标记的抗体)。
[00365]将理解可以在本文所述的方法中使用包含结肠细胞的患者样品。在这些实施方案中，所述标记物的表达水平可以通过评估样品中所述标记物的量(例如，绝对量或浓度)来评估。当然在评估样品中所述标记物的量之前，可以对所述细胞样品进行各种收集后制备和贮藏技术(例如，核酸和/或蛋白提取、固定、贮藏、冷冻、超滤、浓缩、蒸发、离心等)。
[00366]还将理解所述标记物可能从细胞流到消化系统、血流和/或胞间隙中。例如可以通过检查血清或血浆可以检测所述流出的标记物。
[00367]所述组合物、试剂盒和方法可用于检测标记蛋白的表达，所述标记蛋白具有至少一部分呈现在表达其的细胞的表面上。例如，免疫学方法可用于检测全细胞上的所述蛋白，或基于计算机的序列分析方法可用于预测至少一种胞外结构域(即，包括两种分泌蛋白和具有至少一个细胞表面结构域的蛋白)的存在。可以检测标记蛋白的表达，无需裂解所述细胞，其中所述标记蛋白具有至少一部分呈现在表达其的细胞的表面上(例如，使用与蛋白的细胞表面结构域特异性结合的标记抗体)。
[00368]可以通过检测转录核酸或蛋白表达的多种方法中的任一种评估标记物的表达。所述方法的非限制性实例包括检测分泌、细胞表面、细胞质或核蛋白的免疫学方法、蛋白纯化方法、蛋白功能或活性检测、核酸杂交方法、核酸逆转录方法和核酸扩增方法。
[00369]在一个具体的实施方案中，使用抗体(例如，放射标记的、生色团标记的、荧光团标记的或酶标记的)，抗体衍生物(例如，与底物或蛋白或蛋白质配体对的配体缀合的抗体)，或与标记蛋白或其片段(包括已经进行全部或部分正常的翻译后修饰的标记蛋白)特异性结合的抗体片段(例如，单链抗体、分离的抗体高变区等)来评估标记物的表达。
[00370]在另一个具体的实施方案中，通过从患者样品的细胞中制备mRNA/cDNA(即，转录多核苷酸)，和通过使mRNA/cDNA与参考多核苷酸杂交，所述参考多核苷酸与标记核酸或其片段的补体)，来评估标记物的表达。任选地，在与参考多核苷酸杂交之前，可以使用多种聚合酶链式反应方法中的任一种对cDNA进行扩增；优选地，其没有被扩增。同样地使用定量PCR检测一种或多种标记物的表达以评估所述标记物的表达水平。或者，可以使用多种检测标记物的突变或变体(例如，单个核苷酸多型现象、删除等)的方法中的任一种来检测患者中标记物的出现。
[00371]在相关的实施方案中，获自样品的转录多核苷酸的混合物与底物接触，在所述底物上固定有与标记核酸的至少一部分(例如，至少7、10、15、20、25、30、40、50、100、500或多个核苷酸残基)互补或同源的多核苷酸。如果与标记核酸互补或同源的多核苷酸在底物上是差异可检测的，(例如，使用不同的生色团或荧光团是可检测，或固定到不同所选的位置上)，那么多个标记物的表达水平可以使用单个底物(例如，固定在所选位置上的多核苷酸的“基因芯片”微阵列)同时进行评估。当使用涉及一个核酸与另一个杂交的标记物表达的评估方法时，希望所述杂交可以在严格杂交条件下进行。
[00372]在某些实施方案中，可使用质谱或表面等离子体共振进行生物标记测试。在各种实施方案中，鉴定对结肠癌相关疾病具有活性的试剂的方法，包括a)提供含有一种或多种标记物或其衍生物的细胞样品；b)制备来自所述细胞的提取物；c)混合物所述提取物与含有标记物结合位点的经标记的核酸探针；和d)测定在所述测试试剂存在或不存在下，所述标记物与所述核酸探针之间复合物的形成。测定步骤可以包括给所述提取物/核酸探针混合物进行电泳迁移率变动分析。
[00373]在某些实施方案中，所述测定步骤包括选自下述的试验：酶联免疫吸附试验(ELISA)、基于荧光的试验和超高通量试验，例如表面等离子体共振(SPR)或荧光关联谱(FCS)试验。在所述实施方案中，由于SPR对金属绝缘表面上的微小折射率变化敏感，所述SPR传感器用于直接实时观察生物分子的相互作用。SPR是一种表面技术，其对约200nm的SPR传感器/样品界面内105至10-6折射率(RI)单位的变化敏感。因此，SPR光谱用于监测沉积在传感层上的有机薄膜的生长。
[00374]因为所述组合物、试剂盒和方法取决于检测一种或多种标记物表达水平的差异，希望所述标记物的表达水平显著大于所述方法的最小检出限，所述方法用于评估在至少一种正常细胞和结肠癌感染细胞中的表达。
[00375]应该理解通过使用一种或多种标记物对其他患者样品进行常规扫描，将认识到某些标记物在各种类型(包括特异性结肠癌相关疾病)的细胞中是过表达的。
[00376]此外，因为评估较大数量患者样品中所述标记物的表达并关联样品获自其的个体患者的结果，还证实某些标记物改变的表达与结肠癌相关疾病强相关联且其他标记物改变的表达与其他疾病强相关联。因此所述组合物、试剂盒和方法用于表征患者中结肠癌相关疾病的分期、分级、组织结构类型和性质的一种或多种。
[00377]当所述组合物、试剂盒和方法用于表征患者中结肠癌相关疾病的分期、阶段、组织结构类型和性质的一种或多种，希望选择所述标记物或标记物库，使得在至少约20％，和在某些实施方案中，至少约40％、60％、或80％和基本上全部受对应期、阶段、组织结构类型或性质的结肠癌相关疾病折磨的患者中获得阳性结果。可以选择本发明的所述标记物或标记物库，使得对于普通人口获得大于约10％的正预测值(在非限制性实例中，与试验偶合，特异性大于80％)。
[00378]当在所述组合物、试剂盒和方法中使用多种标记物时，可以在单一反应混合物中(即，使用试剂，诸如对于每个标记物使用不同的荧光探针)或在对应一种或多种标记物的单独的反应混合物中，比较患者样品中每个标记物的表达水平与同一类的非结肠癌样品中多种标记物的每一种的表达水平。在一个实施方案中，相对于对应的正常水平，样品中多个标记物中一种以上表达水平显著增加指示所述患者患有结肠癌相关疾病。当使用多种标记物时，可以使用2、3、4、5、8、10、12、15、20、30、或50或更多个体标记物；在某些实施方案中，可能希望使用更少的标记物。
[00379]为了最大化所述组合物、试剂盒和方法的灵敏度(即，由于归因于源自患者样品中的非结肠癌系统细胞的干扰)，希望本文所用的标记物是具有限制组织分布的标记物，例如，正常下不在非结肠癌系统组织中表达。
[00380]承认所述组合物、试剂盒和方法对具有增强的发展出结肠癌相关疾病风险的患者和其医学顾问是特别有用的。公认具有增强的发展出结肠癌相关疾病风险的患者例如包括，具有结肠癌相关疾病家族史的患者。
[00381]可以用各种方式评估正常人结肠系统组织中标记物的表达水平。在一个实施方案中，通过评估一部分似乎正常的结肠系统细胞中所述标记物的表达水平，并通过比较所述正常表达水平与怀疑异常的一部分结肠系统细胞中的表达水平，来评估所述正常的表达水平。或者，且特别因为进一步信息可作为常规执行本文所述方法的结果，可以使用所述标记物正常表达的群体平均值。在其他实施方案中，可以通过评估获自非结肠癌折磨患者的患者样品中，获自怀疑患者中结肠癌相关疾病发作之前的患者样品中，获自存档患者样品等中标记物的表达来测定所述标记物的“正常”表达水平。
[00382]本文还提供评估样品中结肠癌相关疾病细胞存在的组合物、试剂盒和方法(例如，归档的组织样品或获自患者的样品)。这些组合物、试剂盒和方法基本上与上述的相同，只是，当需要时，可以改变所述组合物、试剂盒和方法以用于除了患者样品外的样品。例如，当待使用的样品是石蜡化的，存档人组织样品时，可能需要调整组合物中、试剂盒中化合物的比例，或调整用于评估所述样品中标记物表达水平的方法。
[00383]试剂盒和试剂
[00384]所述试剂盒用于评估结肠癌相关疾病细胞的存在(例如，在诸如患者样品的样品中)。所述试剂盒包括多种试剂，每一种试剂能特异性结合标记核酸或标记蛋白。结合标记蛋白的合适试剂包括抗体、抗体衍生物、抗体片段等。结合标记核酸的合适试剂(例如，基因组DNA、MRNA、剪切MRNA、cDNA等)包括互补核酸。例如，所述核酸试剂可以包括固定到底物的寡核苷酸(标记或未标记的)，不与底物结合的标记寡核苷酸，PCR引物对，分子信标探针等。
[00385]所述试剂盒任选可包括用于进行本文所述方法的其他成分。例如，所述试剂盒可以包括流体(例如，SSC缓冲溶液)，所述流体适合于退火互补核酸或使抗体与与其特异性结合的蛋白结合，一种或多种样品室，描述执行所述方法的说明材料，正常结肠系统细胞的样品，结肠癌相关疾病细胞的样品等。
[00386]抗体的制备方法
[00387]还提供分离的杂交瘤的制备方法，所述杂交瘤产生用于评估患者是否患有结肠癌相关疾病的抗体。在所述方法中，合成或分离(例如，通过从表达其的细胞中纯化，或通过体外转录和翻译编码所述蛋白或肽的核酸)包含标记蛋白的全部或部分的蛋白或肽。使用所述蛋白或肽免疫脊椎动物，例如，哺乳动物诸如小鼠、大鼠、兔或羊。任选可以用所述蛋白或肽至少再次免疫所述脊椎动物使所述脊椎动物对所述蛋白或肽展现强的免疫应答。通过使用多种方法中的任一种，脾细胞分离自免疫脊椎动物并用永生细胞系融合以形成杂交瘤。这种方式形成的杂交瘤然后使用标准方法进行筛选以鉴定一种或多种杂交瘤，所述杂交瘤产生与所述标记蛋白或其片段特异性结合的抗体。本文还提供这种方法制备的杂交瘤和使用所述杂交瘤制备的抗体。
[00388]评估功效的方法
[00389]本文还提供评估测试化合物功效的方法，所述测试化合物抑制结肠癌相关疾病细胞。如上所述，所述标记物表达水平的差异与结肠系统细胞的异常状态相关联。虽然承认某些标记物表达水平的变化可能由结肠系统细胞的异常状态引起，同样承认其他标记物表达水平的变化诱导、维持和促进这些细胞的异常状态。因此，抑制患者中结肠癌相关疾病的化合物将使一个或多个所述标记物的表达水平变化到更接近那个标记物的正常表达水平(即，正常结肠系统细胞中所述标记物的表达水平)。
[00390]因此，所述方法包括比较第一结肠细胞样品中以及在测试化合物存在下维持的标记物表达和第二结肠细胞样品中以及在测试化合物不存在下维持的标记物表达。在所述测试样品存在下，标记物表达的显著降低指示测试化合物抑制结肠癌相关疾病。所述结肠细胞样品例如可以是获自患者的正常结肠细胞的等分试样，获自患者的正常结肠细胞、正常结肠细胞系的细胞的合并样品的等分试样，获自患者的结肠癌相关疾病细胞的单个样品的等分试样，获自患者的结肠癌相关疾病细胞、结肠癌相关疾病细胞的合并样品的等分试样等。
[00391]在一个实施方案中，所述样品是获自患者的结肠癌相关疾病细胞，并对多个认为对于抑制各种结肠癌相关疾病是有效的化合物进行测试以鉴定可能最好抑制患者中结肠癌相关疾病的化合物。
[00392]所述方法同样可用于评估用于抑制患者中结肠癌相关疾病的治疗的功效。在所述方法中，评估在一对样品中一个或多个标记物的表达水平(一个接受所述治疗，另一个不接受所述治疗)。与评估测试化合物功效的方法一样，如果所述治疗诱导显著较低的标记物表达水平，那么所述治疗对于抑制结肠癌相关疾病是有效的。如上所述，如果在所述方法中使用来自所选患者的样品，那么可以体外评估备选治疗以选择最可能有效抑制患者中结肠癌相关疾病的治疗。
[00393]如本文所述，将人结肠细胞的异常状态与所述标记物的表达水平的变化相关联。还提供评估测试化合物危害潜力的方法。所述方法包括在所述测试化合物存在和不存在下维持分开的人结肠细胞的等分试样。比较每一个等分试样中标记物的表达。在所述测试化合物存在下维持的等分试样中显著较高的标记物表达水平指示(相对于在不存在所述测试化合物下维持的等分试样)指示所述测试化合物具有危害潜力。可以通过比较相关标记物表达水平增强或抑制的程度，通过比较表达水平被增强或抑制的标记物的数，或通过比较两者来评估各种测试化合物的相对危害潜力。
[00394]在下述小节中进一步详细描述各个方面。
[00395]分离的蛋白和抗体
[00396]一个方面涉及分离的标记蛋白及其生物学活性部分，以及多核苷酸片段，所述多核苷酸片段适合用作免疫原以产生针对标记蛋白或其片段的抗体。在一个实施方案中，通过使用标准蛋白纯化技术的合适纯化方案可以从细胞或组织分离所述天然标记蛋白。在另一个实施方式中，包含整个标记蛋白或其片段的蛋白或肽可以通过重组DNA技术来制备。重组表达的备选方案，使用标准肽合成技术化学合成所述蛋白或肽。
[00397]“分离”或“纯化”蛋白或其生物学活性部分是基本上不含细胞材料或其他来自所述蛋白所衍生的细胞或组织来源的污染蛋白，或基本上不含化学合成时的化学前体或其他化学产品。表述“基本上不含细胞材料”包括蛋白制品，其中所述蛋白分离自细胞的细胞成分，所述细胞指从其分离或重组产生所述蛋白的细胞。因此，基本上不含细胞材料的蛋白包括含有低于约30％、20％、10％或5％(基于干重)异源蛋白的蛋白制品(本文也称为“污染蛋白”)。
[00398]当重组产生所述蛋白或其生物学活性部分时，还优选基本上不含培养基，即，培养基代表低于约20％、10％或5％的蛋白制品体积。当所述蛋白通过化学合成制备，优选基本上不含化学前体或其他化学产品，即，将其与参与所述蛋白合成的化学前体或其他化学产品分离。因此，所述蛋白制品含有低于约30％、20％、10％、5％(基于干重)的除目的多肽外的化学前体或化合物。
[00399]标记蛋白的生物学活性部分包括多肽，所述多肽包括与所述标记蛋白的氨基酸序列充分一致或衍生自所述标记蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列，其包括比全长蛋白少的氨基酸，但展示对应全长蛋白至少一种活性。典型地，生物活性部分包括具有对应全长蛋白的至少一种活性的结构域或基序。标记蛋白的生物活性部分可以是例如，长度为10、25、50、100或更多氨基酸的多肽。此外，可以通过重组技术制备其他生物学活性部分(其中所述标记蛋白被删除)，并就所述标记蛋白天然形式的一种或多种功能活性对其进行评价。在某些实施方案中，有用的蛋白与这些序列之一基本上是一致的(例如，至少约40％，且在某些实施方案中，50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％)，并维持对应天然标记蛋白的功能活性，然而由于天然变异或突变在氨基酸序列上不同。
[00400]此外，标记蛋白片段的文库可用于产生各种多肽群以用于筛选和随后对变体标记蛋白或其片段的选择。
[00401]预测药物
[00402]本文还提供动物模型和标记物在预测医学领域中的用途，其中出于预后(预测)目的采用诊断测试、预后测试、药物基因组学和检测临床试验，从而预防性地治疗个体。因此，本文还提供确定一种或多种标记蛋白或核酸的表达水平的诊断测试，以确定个体是否处于发展结肠癌相关疾病的风险中。所述测试可用于诊断或预测目的，从而在所述结肠癌相关疾病发作之前预防性治疗个体。
[00403]在另一方面，所述方法用于至少周期性筛选同一个体以了解所述个体是否与改变其表达模式的化学产品或毒素接触。
[00404]然而另一个方面涉及监测试剂对临床测试中标记物表达或活性的影响(例如，施用药物或其他化合物以抑制结肠癌相关疾病或治疗或预防任何其他障碍(例如，为了了解所述治疗可能具有的任何系统效应))。
[00405]药物基因组学
[00406]所述标记物还用作药物基因组学标记物。如本文所使用的，“药物基因组学标记物”是客观的生物化学标记物，其表达水平与患者中一种具体的临床药物应答或易感性有关。药物基因组学标记物表达的存在或定量与患者的预测应答相关，更具体地患者肿瘤对于一种具体的药物或一类具体的药物的治疗相关。通过评估患者中一种或多种药物基因组学标记物表达的存在或定量，可以选择最适合患者的药物治疗或预测具有最大成功度的药物治疗。
[00407]监测临床测试
[00408]监测试剂(例如，药物化合物)对标记物表达水平的影响不仅可以在基础药物筛选中进行，也可以在临床试验中进行。例如，可以在受试者的临床试验中监测试剂影响标记物表达的效力，所述受试者接受结肠癌相关疾病的治疗。
[00409]在非限制实施方案中，本发明提供监测用试剂(例如，激动剂、拮抗剂、拟肽、蛋白、肽、核酸、小分子、或其他药物候选)治疗受试者的效力的方法，包括下述步骤：(i)在施用所述试剂之前，获得来自受试者的施用前样品；(ii)检测所述施用前样品中一种或多种所选标记物的表达水平；(iii)从所述受试者中获得一种或多种施用后样品；(iv)检测所述施用后样品中所述标记物的表达水平；(v)比较施用前样品中所述标记物的表达水平与施用后样品中所述标记物的表达水平；和(vi)相应地改变给所述受试者施用的试剂。
[00410]例如，在治疗过程中，所述标记基因增加的表达可能指示无效剂量或增加剂量的需要。相反，所述标记基因降低的表达可能指示有效治疗并且不需要改变剂量。
[00411]电子设备可读介质、系统、阵列和使用其的方法
[00412]如本文所使用的，“电子设备可读介质”指任何适合存储、保留或包含数据或信息的介质，所述数据或信息可通过电子设备直接读取或获取。所述介质可包括，但不限于：磁存储介质，诸如软磁盘，硬磁盘存储介质和磁带；光存储介质，诸如，光盘；电子存储介质，诸如RAM、ROM、EPROM、EEPROM等；和普通硬盘以及这些种类的混合，诸如磁/光存储介质。调整或设定所述介质以在其上记录本文所述标记物。
[00413]如本文所使用的，术语“电子设备”意图包括任何合适的计算或加工设备，或构建或改变其他设备以储存数据或信息。适用于本发明的电子设备的实例包括：单机计算机设备；网络，包括局域网(LAN)、广域网(WAN)、因特网、内部网和外联网；电子器件，诸如个人数字助理(PDAs)、移动电话、寻呼机等；和局部和分布式处理系统。
[00414]如本文所使用的，“记录”指在电子设备可读介质上储存和编码信息的过程。本领域的技术人员能容易采用任何在介质上记录信息的方法以产生包括本文所述标记物的材料。
[00415]多种软件程序和格式可用于在电子设备可读介质上储存本发明的标记物信息。可以采用任何数量的数据处理结构格式(structuring format)(例如，文本文件或数据库)以获得或产生在其上记录有所述标记物的介质。通过提供可读形式的标记物，可以常规地获得用于各种目的的标记物序列信息。例如，本领域的技术人员可使用可读形式的核苷酸或氨基酸序列以比较靶序列或靶结构基序与储存于数据储存工具中的序列信息。使用搜索方法来鉴定与具体靶序列或靶基序匹配的序列的片段或区域。
[00416]因此，本文还提供保留说明书的介质，所述说明书关于实行确定受试者是否患有结肠癌相关疾病或具有结肠癌相关疾病诱因的方法，其中所述方法包括下述步骤：确定标记物的存在与否，并基于标记物的存在与否确定受试者是否患有结肠癌相关疾病或具有结肠癌相关疾病诱因，和/或为结肠癌相关疾病和预结肠癌相关疾病病症推荐具体治疗。
[00417]本文还提供电子系统和/或在网络中，一种确定受试者是否患有结肠癌相关疾病或具有与标记物相关的结肠癌相关疾病诱因的方法，其中所述方法包括下述步骤：确定所述标记物的存在与否，并基于标记物的存在与否确定受试者是否患有结肠癌相关疾病或是否具有结肠癌相关疾病诱因，和/或为结肠癌相关疾病和预结肠癌相关疾病情况推荐具体治疗。所述方法还进一步包括接受与受试者相关的表型信息和/或从网络获得与受试者相关的表型信息的步骤。
[00418]本文还提供了一种网络，一种确定受试者是否患有结肠癌相关疾病或具有与标记物相关的结肠癌相关疾病诱因的方法，所述方法包括下述步骤：接受与标记物相关的信息，接受与受试者相关的表型信息，从网络获得对应于所述标记物和/或结肠癌相关疾病的信息，并基于表型信息、所述标记物和获得的信息中的一种或多种确定患者患有结肠癌相关疾病或具有结肠癌相关疾病的诱因。所述方法还进一步包括为结肠癌相关疾病和预结肠癌相关疾病病症推荐具体治疗的步骤。
[00419]本文还提供确定受试者是否患有结肠癌相关疾病或具有结肠癌相关疾病诱因的商业方法，所述方法包括下述步骤：接受与标记物相关的信息，接受与受试者相关的表型信息，从网络获得对应于所述标记物和/或结肠癌相关疾病的信息，并基于表型信息、所述标记物和获得的信息中的一种或多种确定患者患有结肠癌相关疾病或具有结肠癌相关疾病的诱因。所述方法还进一步包括为结肠癌相关疾病和预结肠癌相关疾病病症推荐具体治疗的步骤。
[00420]本文还提供一种阵列，其能用于分析在所述阵列中一种和多种基因的表达。在一个实施方案中，所述阵列可用于分析组织中基因的表达以确定在所述阵列中基因的组织特异性。以这种方式，可以同时分析直至约7000或更多种基因的表达。这允许形成一个谱，显示在一种或多种组织中特异性表达的一串基因。
[00421]除了所述定性测定外，本文提供基因表达的定量。因此，不仅组织特异性，而且所述组织中一串基因的表达水平是可确定的。因此，基因可以基于其自身的组织表达和在该组织的表达水平来分组。例如，这可用于确定组织之间的基因表达关系。因此，可以干扰一个组织并可以确定在第二个组织中对基因表达的影响。在所述上下文中，可以确定一种细胞类型对另一种细胞类型在应答生物刺激中的影响。
[00422]所述测定例如对于在基因表达水平上了解细胞-细胞相互作用的影响是有用的。如果治疗性施用一种试剂以治疗一种细胞类型但对另一种细胞类型具有不希望的影响，所述方法提供一种确定不希望的效果的分子基础的测试，并由此提供共同施用抵消试剂，或者治疗该不希望的效果的机会。类似地，甚至在单一细胞类型中，可以在分子水平上确定不需要的生物影响。因此，可以确定和抵消所述试剂对靶基因以外的其他基因表达的影响。
[00423]在另一个实施方式中，所述阵列可用于监测所述阵列中一种或多种基因表达的时间过程。这可以在各种生物环境中发生，如本文所公开的，例如结肠癌相关疾病的发展，结肠癌相关疾病的进展，和过程，诸如与结肠癌相关疾病相关的细胞转化。
[00424]所述阵列还用于确定在相同细胞或不同细胞中基因表达或其他基因表达的影响。这例如提供，如果最终靶或下游靶不能被调控，治疗干预的替代分子靶的选择。
[00425]所述阵列还用于确定在正常和异常细胞中一种或多种基因的差异表达模式。这提供一串基因，其可用作诊断或治疗干预的分子靶。
[00426]替代标记物
[00427]所述标记物可用作一种或多种障碍或疾病状态，或作为导致结肠癌相关疾病状态的病症的替代标记物。如本文所使用的，“替代标记物”是客观的生物化学标记物，其与疾病或障碍的存在与否，或与疾病或障碍的进展相关。所述标记物的存在或数量独立于所述疾病。因此，这些标记物可用于指示治疗的具体过程在减轻疾病状态或障碍中是否是有效的。当疾病状态或障碍的存在或程度通过标准方法学难于评估时，或当在到达潜在危险临床终点之前需要评估疾病进展时，替代标记物是特别有用的。
[00428]所述标记物还用做药物动力学标记物。如本文所使用的，“药物动力学标记物”是一种客观的生化标记物，其与药效特别地相关。药学标记物的存在或数量与施用所述药物的疾病状态或障碍无关；因此所述标记物的存在或数量指示受试者中所述药物的存在或活性。例如，药物动力学标记物可以指示生物组织中药物的浓度，其中根据所述药物水平，所述标记物在所述组织中被表达或转录或不被表达或转录。以这种方式，所述药物的分配和摄取可以通过药学标记物进行标记。类似地，所述药物动力学标记物的存在或数量可能与药物的代谢产物的存在或数量相关，使得所述标记物的存在或数量指示体内所述药物的相对分解速率。
[00429]药物动力学标记物特别用于增加药物效果的检测灵敏度，特别是当所述药物以低剂量施用时。因为甚至小量的药物可能足以激活多轮的标记物转录或表达，所述扩增的标记物的量可以是比药物本身更容易被检测的量。此外，由于标记物本身的性质，所述标记物可能更容易被检测；例如，使用本文所述的方法，可以在基于免疫的蛋白标记物检测系统中采用抗体，或可以使用标记物特异性的同位素标记探针来检测mRNA标记物。此外，由于在可能直接观察的范围外的药物治疗，药物动力学标记物的使用可以提供基于机理的风险预测。
[00430]测试方案
[00431]结肠癌相关疾病的测试方法例如包括，测量来自受试者的生物样品中每个标记基因随时间的表达水平，并比较所述水平与对照生物样品中所述标记基因的水平。
[00432]当所述标记基因是本文所述的基因之一，并且所述表达水平是差异性表达的(例如，高于或低于对照水平)，判断所述受试者患有结肠癌相关疾病。当所述标记基因的表达水平落入允许范围内，所述受试者不太可能患有结肠癌相关疾病。
[00433]对照的标准值可以通过测量对照中所述标记基因的表达水平来预先确定，以比较所述表达水平。例如，可以基于对照中上述标记基因的表达水平确定标准值。例如，在某些实施方案中，基于所述标准值允许范围为±2S.D.。一旦标准值被确定，所述测试方法可以通过仅测量来自受试者的生物样品中的表达水平并比较所述值与确定的对照标准值来进行。
[00434]标记基因的表达水平包括将标记基因转录成mRNA，并翻译成蛋白。因此，一种测试结肠癌相关疾病的方法基于比较对应于所述标记基因的mRNA的表达强度，或所述标记基因编码的蛋白的表达水平进行。
[00435]在结肠癌相关疾病的测试中标记基因表达水平的测量可以根据各种基因分析方法进行。具体地，例如可以使用杂交技术或基因扩增技术，所述杂交技术采用与作为探针的那些基因杂交的核酸，所述基因扩增技术使用与作为引物的所述标记基因杂交的DNA。
[00436]用于所述测试的探针或引物可以根据所述标记基因的核苷酸序列进行设计。各个标记基因的核苷酸的识别数(identificationnumber)如本文所述。
[00437]此外，应理解较高级动物的基因通常伴随高频率的多型现象。还存在许多在剪切过程中产生亚型的分子，所述亚型包含突变上不同的氨基酸序列。与标记基因具有类似活性的结肠癌相关疾病相关的任何基因包括在所述标记基因内，即使其由于多型现象或成为亚型而具有核苷酸序列差异。
[00438]还应理解所述标记基因可以包括除人以外的其他物种的同源物。因此，除非另有说明，表述“标记基因”指物种独有的标记基因的同源物或被引入到个体中的外源标记基因。
[00439]此外，还应理解“标记基因的同源物”指衍生自人以外的物种的基因，其在严格条件下能作为探针与人标记基因杂交。所述严格条件对本领域技术人员来说是已知的，所述本领域技术人员能选择适当条件来产生实验或经验上的严格性。
[00440]多核苷酸可用作引物或探针，所述多核苷酸包括标记基因的核苷酸序列或与标记基因核苷酸序列的互补链互补并具有至少15个核苷酸的核苷酸序列。因此“互补链”指双链DNA相对于另一条链的一条链，并且其由A:T(RNA为U)和G:C碱基对组成。
[00441]此外，“互补的”不仅指与至少15个连续核苷酸区完全互补的那些，还指在某些情况下具有至少40％、在某些情况下具有至少50％、在某些情况下具有至少60％、在某些情况下具有至少70％、在某些情况下具有至少80％、90％和95％或更高的核苷酸序列同源性的那些。核苷酸序列之间的同源性程度可以通过算法BLAST等测定。
[00442]所述多核苷酸用作检测标记基因的探针，或用作扩增标记基因的引物。当用作引物时，所述多核苷酸通常包含15bp-100bp，和在某些实施方案中15bp-35bp的核苷酸。当用作探针时，DNA包含所述标记基因的整个核苷酸序列(或其互补链)，或其具有至少15bp核苷酸的部分序列。当用作引物时，3′区必须与所述标记基因互补，而5′区可以与限制性酶识别序列或tag连接。
[00443]“多核苷酸”可以是DNA或RNA。这些多核苷酸可以是合成或天然存在的。此外，用作杂交探针的DNA通常是经标记的。本领域的技术人员容易理解所述标记方法。本文中，术语“寡核苷酸”指具有相对低聚集度的多核苷酸。寡核苷酸包括在多核苷酸中。
[00444]使用杂交技术的结肠癌相关疾病的测试例如可以使用Northern杂交、斑点杂交或DNA微阵列技术来进行。此外，可以使用基因扩增技术，诸如，RT-PCR方法。通过在RT-PCR的基因扩增步骤期间使用PCR扩增监测方法，可以获得标记基因表达的更定量的分析。
[00445]在PCR基因扩增监测方法，检测靶(DNA或RNA的逆转录物)与探针杂交，所述探针用荧光染料和吸收荧光的淬灭剂进行标记。当PCR进行且Taq聚合酶降解具有其5′-3′核酸外切酶活性的探针，所述荧光染料和淬灭剂彼此被分开，并检测到荧光。实时检测所述荧光。通过同时测量其中靶的副本数是已知的标准样品，用PCR扩增是线性的情况下的循环数来确定受试者样品中所述靶的副本数是可能的。此外，本领域技术人员承认PCR扩增监测方法能使用任何合适方法进行。
[00446]用于结肠癌相关疾病的测试方法还可以通过检测标记基因编码的蛋白来进行。在下文中，标记基因编码的蛋白被描述为“标记蛋白”。对于这些测试方法，例如通过使用与每个标记蛋白结合的抗体，可以采用蛋白印迹法，免疫沉淀发，和ELISA法。
[00447]在检测中使用的与标记蛋白结合的抗体，可以通过任何合适的技术制备。此外，为了检测标记蛋白，所述抗体可以被适当地标记。或者，除了标记所述抗体外，可以标记特异性结合抗体的底物，例如，蛋白A或蛋白G，以间接检测所述标记蛋白。更具体地，所述检测方法可以包括ELISA方法。
[00448]例如通过在表达载体中插入标记基因或其部分，在合适寄主细胞中引入构建体以产生转化株，培育所述转化株以表达重组蛋白，并从所述培养物或培养物上清液纯化所述表达的重组蛋白，可以获得用作抗原的蛋白或其部分肽。或者，化学合成基因编码的氨基酸序列，或包括由全长cDNA编码的氨基酸序列的一部分的寡肽以用作免疫原。
[00449]此外，结肠癌相关疾病的测试不仅可以使用标记基因的表达水平作为指标还可以使用生物样品中标记物活性作为指标来进行。标记蛋白的活性指所述蛋白固有的生物活性。各种方法可用于测量每种蛋白的活性。
[00450]即使在常规测试中患者没有被诊断为患有结肠癌相关疾病，尽管症状暗示这些疾病，所述患者是否患有结肠癌相关疾病通过根据本文所述的方法进行测试可以容易地测定。
[00451]更具体地，在某些实施方案中，当所述标记基因是本文所述基因之一时，在患者中所述标记基因的表达水平的增加或降低指示所述症状主要由结肠癌相关疾病引起，所述患者的症状显示至少对结肠癌相关疾病具有易感性。
[00452]此外，所述测试用于测定患者中结肠癌相关疾病是否改善。本文所述的方法可用于判断结肠癌相关疾病治疗的治疗效果。此外，当所述标记基因是本文所述基因之一时，被诊断为患有结肠癌相关疾病的患者中，所述标记基因表达水平的增加或降低暗示所述疾病已经进一步发展。
[00453]结肠癌相关疾病的严重性和/或易感性还可以基于表达水平的差异确定。例如，当所述标记基因是本文所述基因之一时，所述标记基因表达水平的增加程度与结肠癌相关疾病的严重性和/或易感性相关。
[00454]动物模型
[00455]在另一个方面，本文提供用于结肠癌相关疾病的动物模型，其中一种或多种标记基因的表达水平或与标记基因功能上等价的基因的表达水平在所述动物模型中被提高。本文所使用的“功能上等价的基因”通常是一种基因，其编码具有与所述标记基因编码的蛋白的已知活性类似的活性的蛋白。功能上等价的基因的代表性实例包括，受试者动物的标记基因的类似物，其内源于所述动物。
[00456]所述结肠癌相关疾病的动物模型用于检测由于结肠癌相关疾病引起的生理变化。在某些实施方案中，所述动物模型用于显示标记基因的其他功能，并评价其靶为所述标记基因的药物。
[00457]在一个实施方案中，结肠癌相关疾病的动物模型可以通过控制同源基因(counterpart gene)的表达水平或施用同源基因来创建。所述方法可以包括通过控制选自本文所述基因的基因的表达水平创建用于结肠癌相关疾病的动物模型。在另一个实施方式中，所述方法可以包括通过施用本文所述基因编码的蛋白，或施用针对所述蛋白的抗体创建结肠癌相关疾病的动物模型。还应理解，在某些实施方案中，可以过表达所述标记物，然后使用合适方法测量所述标记物。
[00458]在另一个实施方式中，结肠癌相关疾病的动物模型可以通过引入选自所述基因的组的基因，或通过施用所述基因编码的蛋白来创建。
[00459]在另一个实施方式中，通过抑制选自所述基因的组的基因的表达，或抑制所述基因编码的蛋白活性可以诱导结肠癌相关疾病。反义核酸、核酶或RNAi可用于抑制表达。可以通过施用抑制活性的物质(诸如，抗体)有效控制蛋白活性。
[00460]动物模型用于阐明结肠癌相关疾病的潜在机理，并还可用于测试通过筛选获得的化合物的安全性。例如，当动物模型发展出结肠癌相关疾病的症状时，或当动物中涉及某些结肠癌相关疾病的测量值变化时，可以构建筛选系统来探测具有减轻疾病活性的化合物。
[00461]如本文所使用的，表述“表达水平增加”指下述任何一种：作为外来基因引入的标记基因被人工表达；受试动物的内源标记基因的转录及其翻译成蛋白被增强；或所述蛋白水解受到抑制，所述蛋白为翻译产物。如本文所使用的，表述“表达水平降低”指其中受试动物的标记蛋白转录及其翻译成蛋白受到抑制的状态，或其中蛋白水解增强的状态，所述蛋白为翻译产物。例如，通过DNA芯片上信号强度的差异可以测定基因的表达水平。此外，翻译产物(所述蛋白)的活性可以通过与正常状态的活性比较来测定。
[00462]动物模型可以包括转基因动物(例如包括标记基因被人工引入和表达的动物，标记基因被敲除的动物，和其中另一个基因被标记基因替代的敲入动物)也在预期的范围内。在其中引入标记基因的反义核酸、核酶、具有RNAi效应的多核苷酸、或用作诱骗核酸的DNA等的转基因动物，可以被用作所述转基因动物。所述转基因动物还包括，例如，其中标记蛋白活性通过在基因编码区引入突变被增强或抑制，或已对氨基酸序列进行修饰以对水解具有抗性或易于水解的动物。氨基酸序列中的突变包括置换、删除、插入和添加。
[00463]此外，通过在基因的转录调节区内引入突变可以控制标记基因自身的表达。本领域的技术人员理解这些氨基酸置换。而且，不特别限制突变的氨基酸数，只要活性得到保留。正常地，其在50个氨基酸内，在某些非限制性实施方案中，在30个氨基酸内，在10个氨基酸内，或在3个氨基酸内。突变位点可以是任何位点，只要活性得到保留。
[00464]在另一个方面，本文提供筛选用作治疗结肠癌相关疾病的治疗试剂的候选化合物的方法。一种或多种标记基因选自本文所述的基因。通过选择能增加或降低所述标记基因表达水平的化合物可以获得结肠癌相关疾病的治疗试剂。
[00465]应该理解，表述“增加基因表达水平的化合物”指促进基因转录、基因翻译或蛋白活性表达阶段中任一个的化合物。另一方面，表述“降低基因表达水平的化合物”，如本文所使用的，指抑制这些步骤中任一个的化合物。
[00466]在具体方面，筛选结肠癌相关疾病的治疗剂的方法可以在体内或体外进行。所述筛选方法例如可以通过下述方式进行，通过(1)给动物受试者施用候选化合物；(2)测量来自所述动物受试者的生物样品的标记基因的表达水平；或(3)选择与对照相比增加或降低标记基因表达水平的化合物，所述对照没有与候选化合物接触。
[00467]在另一个方面，本文提供评估药物试剂的候选化合物对标记基因表达水平的功效的方法，通过使动物受试者接触候选化合物并监测所述化合物对源自所述动物受试者的生物样品中所述标记基因表达水平的影响。可以使用如上述测试方法中使用的相同方法监测源自所述动物受试者的生物样品中所述标记基因表达水平的变化。此外，基于所述评价，药物试剂的候选化合物可以通过筛选进行选择。
[00468]本文引用所有专利、专利申请和参考文献以引用方式整体并入本文。虽然本发明已经充分详细地描述和举例以使本领域技术人员能制备和使用它，但各种改变、修改和改进在不背离本发明的精神和范围下是显而易见的。本领域的技术人员容易理解可以很好的调整本发明以实现目的并获得所提到的结果和优点，以及固有的那些。
[00469]本文所述的方法和试剂代表优选实施方案，是代表性的，并不意图作为对本发明范围的限制。本领域的技术人员能想到本文的修改和其他用途。这些修改被包括在本发明的精神内，并通过权利要求的范围进行限定。对本领域的技术人员来说，在不背离本发明的精神和范围下可以进行各种替代和修改也是显而易见的。
[00470]应该理解通过优选实施方案和任选特征已经详细公开了本发明，本文所公开的概念的修改和变化取决于本领域技术人员，且认为所述修改和变化在本发明所附权利要求所定义的范围内。
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Claims (66)

1.一种诊断受试者是否患有结肠癌相关疾病、处于发展出结肠癌相关疾病的风险中、或具有降低的结肠癌相关疾病存活预后的方法，包括：测量来自受试者的测试样品中至少一种miR基因产物的水平，其中相对于对照样品中对应miR基因产物的水平，测试样品中所述miR基因产物水平的改变指示所述受试者患有结肠癌相关疾病或处于发展出结肠癌相关疾病的风险中。
2.权利要求1的方法，其中所述至少一种miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
3.权利要求1的方法，其中所述至少一种miR基因产物是miR-21。
4.一种测试结肠癌相关疾病应答的引发、对结肠癌相关疾病应答的倾向、或降低的结肠癌相关疾病应答存活预后中至少一种的方法，其包括：
(1)测定来自受试者的样品中至少一种标记物的表达水平；所述至少一种标记物包括至少一种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组；
(2)比较步骤(1)中测定的表达水平与来自健康受试者的样品中所述标记物的对照表达水平；和
(3)当步骤(2)中的比较结果指示i)受试者中所述至少一种标记物的表达水平比对照中的高，或ii)受试者中所述至少一种标记物的表达水平比对照中的低时，判断受试者患有结肠癌相关疾病。
5.权利要求4的测试方法，其中所述样品包括组织、血液、血浆、血清、尿和粪便的一种或多种。
6.权利要求4的测试方法，其中所有的方法步骤在体外进行。
7.一种诊断受试者是否患有结肠癌相关疾病、处于发展出结肠癌相关疾病的风险中、或具有降低的结肠癌相关疾病存活预后的方法，包括：
(1)对来自获自受试者的测试样品的RNA进行逆转录以提供一组靶寡聚脱氧核苷酸；
(2)使所述靶寡聚脱氧核苷酸与微阵列杂交以提供所述测试样品的杂交谱，所述微阵列包括miRNA特异性探针寡核苷酸；和
(3)比较所述测试样品的杂交谱与对照样品产生的杂交谱，
其中至少一种miRNA信号的改变指示所述受试者患有结肠癌相关疾病，处于发展出结肠癌相关疾病的风险中，或具有降低的结肠癌相关疾病的存活预后。
8.权利要求7的方法，其中相对于对照样品产生的信号，至少一种miRNA信号是被上调或下调的。
9.权利要求7的方法，其中所述微阵列包括针对一种或多种miRNA的miRNA特异性探针寡核苷酸，所述miRNA选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
10.一种抑制受试者中肿瘤形成的方法，所述受试者患有或怀疑患有结肠癌相关疾病，其中相对于对照细胞，在受试者的癌细胞中至少一种miR基因产物是被上调或下调的，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组，包括：
(1)如果癌细胞中所述至少一种miR基因产物是被下调的，给受试者施用有效量的至少一种分离的miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组，从而抑制受试者中肿瘤形成；或
(2)如果癌细胞中所述至少一种miR基因产物是被上调的，给受试者施用有效量的至少一种用于抑制至少一种miR基因产物表达的化合物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组，从而抑制受试者中肿瘤形成。
11.权利要求10的方法，其中在步骤(1)和/或步骤(2)中所述至少一种分离的miR基因产物是miR-21、或其分离的变体、或其生物活性片段或功能等价物，或与其结合的抗体。
12.一种抑制患有结肠癌的受试者中肿瘤形成的方法，包括：
(1)测定相对于对照细胞，来自所述受试者的癌细胞中至少一种miR基因产物的量；和
(2)改变在癌细胞中表达的miR基因产物的量，通过：
(i)如果在癌细胞中表达的所述miR基因产物的量少于对照细胞中表达的miR基因产物的量，给受试者施用有效量的至少一种分离的miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组；或
(ii)如果在癌细胞中表达的miR基因产物的量大于对照细胞中表达的所述miR基因产物的量，给受试者施用有效量的至少一种抑制所述至少一种miR基因产物的化合物；
从而抑制受试者中的肿瘤形成。
13.权利要求12的方法，其中在步骤(i)中所述至少一种分离的miR基因产物是miR-21或其分离的变体或生物活性片段。
14.权利要求12的方法，其中在步骤(ii)中所述至少一种miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组，或其分离的变体或生物活性片段。
15.一种鉴定肿瘤形成抑制剂的方法，包括：
给细胞提供一种测试试剂，并
测量与结肠癌相关疾病中改变的表达水平相关的至少一种miR基因产物的水平，
其中相对于合适的对照细胞，所述细胞中所述miR基因产物水平的升高或降低指示所述测试试剂为肿瘤形成的抑制剂。
16.权利要求15的方法，其中所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
17.一种鉴定肿瘤形成抑制剂的方法，包括：
给细胞提供一种测试试剂，并
测量与结肠癌相关疾病中改变的表达水平相关的至少一种miR基因产物的水平，
其中相对于合适的对照细胞，所述细胞中所述miR基因产物水平的降低指示所述测试试剂为肿瘤形成的抑制剂。
18.权利要求25的方法，其中所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
19.权利要求26的方法，其中所述结肠癌相关疾病是腺癌。
20.一种评估一种或多种代谢途径的标记物，所述代谢途径对至少一种结肠癌相关疾病的引发、进展、严重性、病理、恶性、分期、活性、残疾、死亡率、发病率、疾病亚分类或其他潜在致病或病理特征的至少一种有贡献，
其中所述标记物包括一种或多种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
21.一种包含一种或多种权利要求20的标记物的组合物。
22.一种鉴定受试者中至少一种结肠癌相关疾病引发或发展的潜力的方法，所述方法提供对权利要求20的标记物的一种或多种的测量。
23.权利要求22的方法，其中在分离的样品中存在一种或多种标记物，且所有的方法步骤在体外进行。
24.一种测试结肠癌相关疾病的试剂，其中所述试剂包含多核苷酸，所述多核苷酸包括权利要求20的标记物的至少一种的核苷酸序列或与所述标记物的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
25.一种测试结肠癌相关疾病的试剂，其中所述试剂包含抗体，所述抗体识别由权利要求20的标记物的至少一种编码的蛋白。
26.一种测试结肠癌相关疾病的DNA芯片，探针固定在所述芯片上以测试权利要求20的标记物的至少一种。
27.一种评估疗法对预防、诊断和/或治疗至少一种结肠癌相关疾病的效力的方法，包括：
1)给动物实施一种疗法，对所述疗法的效力进行评估，和
2)通过评价权利要求20的标记物的至少一种以测定在治疗或预防结肠癌相关疾病中被测试的治疗的效力水平。
28.权利要求27的方法，其中所述候选治疗剂包括药物组合物、保健组合物和顺势疗法组合物的一种或多种。
29.权利要求27的方法，其中所述被评估的疗法可用于人受试者。
30.权利要求27的方法，其中所述方法不是通过手术或疗法来治疗人体或动物体的方法。
31.一种评估至少一种材料在动物模型中引发结肠癌相关疾病应答的潜力的方法，所述方法提供：
1)在使动物与足以引发动物中结肠癌相关疾病应答的量的一种或多种材料接触后，测量一种或多种被上调或下调的权利要求20的标记物；和
2)测定所述被上调或下调标记物的至少一种是否具有引发结肠癌相关疾病应答的能力。
32.一种治疗结肠癌相关疾病的药物组合物，包括：
至少一种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组；和
药学可接受的载体。
33.权利要求32的药物组合物，其中所述至少一种miR基因产物对应于在癌细胞中相对于合适的对照细胞被上调或下调的miR基因产物。
34.权利要求32的药物组合物，其中所述miR基因产物是miR-21。
35.权利要求32的药物组合物，其中所述结肠癌相关疾病是腺癌。
36.一种治疗结肠癌的药物组合物，包括：
至少一种miR表达抑制化合物，和
药学可接受的载体，
其中所述的至少一种miR表达抑制化合物对miR基因产物具有特异性，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
37.权利要求36的药物组合物，其中所述至少一种miR表达抑制化合物对在癌细胞中相对于合适的对照细胞被上调或下调的miR基因产物具有特异性。
38.一种产品包括：至少一种与结肠癌相关疾病的标记物结合的捕获试剂，所述标记物选自权利要求20的标记物的至少一种。
39.一种用于筛选用于治疗结肠癌相关疾病的治疗剂的候选化合物的试剂盒，其中所述试剂盒包括：
至少一种权利要求20的标记物的一种或多种试剂，和
表达至少一种标记物的细胞。
40.权利要求39的试剂盒，其中使用包括抗体或抗体片段的试剂以检测所述标记物的存在，所述抗体或抗体片段与至少一种标记物特异性结合。
41.权利要求40的试剂盒，其中所述试剂是标记的、放射标记的、或生物素标记的，和/或其中所述抗体或抗体片段是放射标记的、生色团标记的、荧光团标记的或酶标记的。
42.权利要求39的试剂盒进一步包括容器，其包含所述标记物的至少一种。
43.权利要求39的试剂盒，其中所述试剂包括抗体、与所述附带或可附带的探针、和固定金属螯合物的一种或多种。
44.一种结肠癌相关疾病的筛选测试包括：
使权利要求20的标记物的一种或多种与所述标记物的底物和与测试试剂接触，并
测定所述测试试剂是否调节所述标记物的活性。
45.权利要求44的筛选测试，其中所有的方法步骤在体外进行。
46.一种预测受试者中结肠癌相关疾病存在的微阵列，包括抗体，其针对权利要求20的标记物的至少一种。
47.前述权利要求中任一项的方法，其中通过检测经转录的多核苷酸或其部分的存在以评估所述标记物的表达水平，其中所述经转录的多核苷酸包括所述标记物的编码区。
48.前述权利要求中任一项的方法，其中所述样品是结肠癌相关体液或组织。
49.前述权利要求中任一项的方法，其中所述样品包括获自患者的细胞。
50.一种治疗、预防、逆转或限制在需要其的个体中结肠癌相关疾病并发症的严重性的方法，包括：
给所述个体施用干扰至少一种结肠癌相关疾病应答信号传导途径的试剂，以足以干扰所述信号传导的量，
其中所述试剂包含至少一种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
51.权利要求50的方法，其中所述至少一种miR基因产物是miR-21。
52.一种干扰至少一种结肠癌相关疾病应答信号传导途径的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、预防、逆转或限制个体中结肠癌相关疾病并发症的严重性，
其中所述试剂包含至少一种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
53.权利要求52的用途，其中所述至少一种miR基因产物是miR-21。
54.一种治疗、预防、逆转或限制在需要其的个体中结肠癌相关疾病并发症的严重性的方法，包括：
给所述个体施用干扰至少一种结肠癌相关疾病应答级联的试剂，
其中所述试剂包含至少一种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b，miR-203及其组合组成的组。
55.权利要求55的方法，其中所述至少一种miR基因产物是miR-21。
56.一种干扰至少一种结肠癌相关疾病应答级联的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、预防、逆转或限制个体中结肠癌相关疾病并发症的严重性，
其中所述试剂包含至少一种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
57.权利要求56的用途，其中所述至少一种miR基因产物是miR-21。
58.一种包含数据库的计算机可读介质，所述数据库具有多种数字编码的参考谱，其中至少第一参考谱代表来自一个或多个受试者的一个或多个样品中至少第一标记物的水平，所述受试者展示结肠癌相关疾病应答的标记，
其中所述标记物包括一种或多种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
59.权利要求58的计算机可读介质，包含至少第二参考谱，其代表来自一个或多个受试者的一个或多个样品中至少第二标记物的水平，所述受试者展示结肠癌相关疾病应答的标记，或受试者患有结肠癌相关疾病。
60.一种测定患者是否患有，或倾向于患有结肠癌相关疾病，或具有差的结肠癌相关疾病存活预后的计算机系统，包括：
权利要求58的数据库，和
包含计算机执行代码的服务器，所述代码使计算机接收受试者的谱，从数据库中识别在诊断上与受试者谱相关的匹配参考谱，并产生所述受试者是否患有或倾向于患结肠癌相关疾病的指示。
61.一种评价受试者中结肠癌相关疾病的存在、不存在、性质或程度的计算机辅助方法，包括：
1)提供一种计算机，其包括对获自所述受试者的样品的数据进行分类的模型或运算法则，
其中，所述分类包括就至少一种标记物的存在、不存在或量针对所述数据进行分析，和
其中所述标记物包括一种或多种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
2)输入获自受试者的生物样品的数据；和
3)对生物样品进行分类以指示结肠癌相关疾病的存在、不存在、性质或程度。
62.前述权利要求中任一项的方法，其中所述至少一种miR基因产物及其组合包括其分离的变体、或生物活性片段或功能等价物、或与其结合的抗体。
63.前述权利要求中任一项的方法，其中所述结肠癌相关疾病是腺癌。
64.一种结肠癌的动物模型，其中存在一种或多种miR基因产物中至少一种改变的表达，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
65.权利要求64的动物模型，其中所述动物模型是非人脊椎动物。
66.权利要求64的标记物，其中所述动物模型是小鼠、大鼠、兔或灵长类动物。
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