CN101652474A - 由地衣芽孢杆菌转化细胞制备脂酰基转移酶 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及脂酰基转移酶的制备方法，步骤包括：(i)提供地衣芽孢杆菌细胞；(ii)用编码脂酰基转移酶的异源核苷酸序列转化地衣芽孢杆菌细胞；和(iii)在启动子序列的控制下在细胞中表达脂酰基转移酶。此外，本发明还涉及地衣芽孢杆菌在表达脂酰基转移酶中的应用，包含异源脂酰基转移酶的地衣芽孢杆菌宿主细胞，和包含编码脂酰基转移酶的核苷酸序列的载体，所述核苷酸序列可操作地连接与地衣芽孢杆菌同源的启动子序列。
Description
相关申请的引用
引用以下相关申请：US 2002-0009518、US 2004-0091574、WO2004/064537、WO2004/064987、WO2005/066347、WO2005/066351、2006年2月2日提交的美国申请第60/764,430号和WO2006/008508。所述每个申请以及各申请中所引用的每篇文献(“申请引用的文献”)，和申请引用的文献中所参考或引用的每篇文献(无论是出现在这些申请的正文中或是在审查过程中)以及在所述审查中支持先进专利性的辩论，均通过引用并入本文。本文还引用了多份文献(“本文引用的文献”)。因此，每篇被本文引用的文献以及本文引用文献中所引用或参考的每篇文献均通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及脂酰基转移酶(lipid acyltransferase)的制备。具体而言，本发明涉及通过在芽孢杆菌(Bacillus)宿主细胞(优选地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)宿主细胞)中表达脂酰基转移酶来制备脂酰基转移酶的方法。此外，本发明还涉及芽孢杆菌(优选为地衣芽孢杆菌)在表达脂酰基转移酶上的应用，还涉及在其基因组中包含编码脂酰基转移酶的基因的芽孢杆菌宿主细胞(优选地衣芽孢杆菌宿主细胞)。
背景技术
已知脂酰基转移酶在食品应用中具有优势。已经发现脂酰基转移酶在食物中具有显著的酰基转移酶活性。这种活性在食物的制备方法中有惊人的有益应用。
例如，WO 2004/064537公开了通过使用脂酰基转移酶来原位制备乳化剂的方法和与其相关的优点。
因此，需要脂酰基转移酶的商业制备方法。
然而，基因通常可能难以在异源宿主中表达，且在宿主细胞中表达脂酰基转移酶可能会有问题。
WO 2004/064537公开了在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和大肠杆菌(Escherichia coli)的表达两种气单胞菌(Aeromonas)脂酰基转移酶。然而，其在枯草芽孢杆菌中的表达很低，同时大肠杆菌不是GRAS生物体并因此不适合作为食品工业用酶的宿主。
US 6,255,076公开了在芽孢杆菌(Bacillus)宿主细胞中制备多肽的方法。然而，此种方法需要使用串联的启动子，其中每个启动子序列可操作地连接编码所述多肽序列的单拷贝核酸序列。因此，本领域中需要一种制备脂酰基转移酶的改进方法。
发明内容
本发明的各个方面体现在权利要求书和以下详述中。
本发明的一个方面涉及脂酰基转移酶的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供宿主细胞，优选为芽孢杆菌宿主细胞，其中所述芽孢杆菌宿主细胞为除枯草芽孢杆菌之外的一种，优选为地衣芽孢杆菌细胞；
(ii)用编码脂酰基转移酶的异源核苷酸序列转化宿主细胞，所述宿主细胞优选为芽孢杆菌宿主细胞，其中所述芽孢杆菌宿主细胞为除枯草芽孢杆菌之外的一种，优选为地衣芽孢杆菌细胞；和
(iii)在启动子序列的控制下在细胞中表达脂酰基转移酶。
另一方面，本发明涉及包含异源脂酰基转移酶的芽孢杆菌宿主细胞，其中所述芽孢杆菌宿主细胞为除枯草芽孢杆菌之外的一种，优选为地衣芽孢杆菌宿主细胞。
另一方面，本发明涉及芽孢杆菌宿主细胞在制备异源脂酰基转移酶中的应用，其中所述芽孢杆菌宿主细胞为除枯草芽孢杆菌之外的一种，优选为地衣芽孢杆菌宿主细胞。
适合地，与在枯草芽孢杆菌中的表达相比，在芽孢杆菌宿主中的表达可以引起表达的增加，其中所述芽孢杆菌宿主为除枯草芽孢杆菌之外的一种，且优选芽孢杆菌宿主为地衣芽孢杆菌。
再一方面，本发明涉及包含编码脂酰基转移酶的核苷酸序列的表达载体，所述核苷酸序列可操作地连接一个或多个调控序列，使得所述调控序列能够在适合的宿主或宿主细胞中表达编码脂酰基转移酶的核苷酸序列，优选在芽孢杆菌宿主(或细胞)，其中所述芽孢杆菌宿主(或细胞)为除枯草芽孢杆菌之外的一种，优选在地衣芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌细胞。
适合地，所述脂酰基转移酶可以是重组的脂酰基转移酶。
具体实施方式
根据本发明的第一方面，本发明提供了脂酰基转移酶的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供宿主细胞，优选为芽孢杆菌宿主细胞，其中所述芽孢杆菌宿主细胞为除枯草芽孢杆菌之外的一种，优选为地衣芽孢杆菌细胞；
(ii)用编码脂酰基转移酶的异源核苷酸序列转化宿主细胞，优选为芽孢杆菌宿主细胞，其中所述芽孢杆菌宿主细胞为除枯草芽孢杆菌之外的一种，优选为地衣芽孢杆菌细胞；和
(iii)在启动子序列的控制下在细胞中表达脂酰基转移酶。
此外，可以使编码信号肽的核苷酸序列可操作地连接编码脂酰基转移酶的所述异源核苷酸序列。
适合地，本发明的方法还包括分离/回收脂酰基转移酶的附加步骤。
另一方面，本发明涉及包含异源脂酰基转移酶的地衣芽孢杆菌宿主细胞。
适合地，所述脂酰基转移酶可以是重组的脂酰基转移酶。
适合地，在本发明的宿主细胞、载体、方法和/或用途中所用的启动子序列可以与宿主细胞同源。“与宿主细胞同源”是指来源于宿主生物体；即，所述启动子序列是在宿主生物体中自然发现的。适合地，所述启动子序列可以选自由编码以下启动子的核苷酸序列组成的组：α-淀粉酶启动子、蛋白酶启动子、枯草杆菌蛋白酶启动子、谷氨酸特异性蛋白酶启动子和果聚糖蔗糖酶启动子。适合地，所述启动子序列可以是编码以下启动子的核苷酸序列：LAT(如来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶启动子，也称作AmyL)、AprL(如枯草杆菌蛋白酶Carlsberg启动子)、EndoGluC(如来自地衣芽孢杆菌的谷氨酸特异性启动子)、AmyQ(如来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶启动子的α-淀粉酶启动子)和SacB(如枯草芽孢杆菌的果聚糖蔗糖酶启动子)。
在本发明的一个实施方案中，所述启动子序列为α-淀粉酶启动子的-35至-10序列，优选为地衣芽孢杆菌α-淀粉酶启动子的-35至-10序列。所述“-35至-10序列”描述了相对于转录起点的位置。“-35”和“-10”均为框(即多个核苷酸)，每个框包含6个核苷酸，且这些框被17个核苷酸分开。这17个核苷酸通常被称为“间隔子”。图55对此进行了说明，其中下划线处为-35框和-10框。为了避免混淆，本文所用的“-35至-10序列”是指从-35框的起始至-10框的终止的序列，即包括-35框、长度为17个核苷酸的间隔子和-10框。
在一些方面，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以包含GDSx基序和/或GANDY基序。
优选地，将所述脂酰基转移酶表征为具有酰基转移酶活性并包含氨基酸序列基序GDSX的酶，其中X是以下氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S。
适合地，优选用于本发明载体、宿主细胞、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以从以下一个或多个属的生物体中获得：气单孢菌属、链霉菌属(Streptomyces)、酵母菌属(Saccharomyces)、乳球菌属(Lactococcus)、分支杆菌属(Mycobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、脱亚硫酸菌属(Desulfitobacterium)、芽孢杆菌属、弯曲菌属(Campylobacter)、弧菌科(Vibrionaceae)、木杆菌属(XyIeIIa)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、曲霉属(Aspergillus)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、李斯特菌属(Listeria)、奈瑟菌属(Neisseria)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、黄单胞菌属(Xanthomonas)和念珠菌属(Candida)。优选地，所述脂酰基转移酶是可以获得的，且优选从气单孢菌属的生物体中获得。
在本发明的一些方面，用于本发明载体、宿主细胞、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶在对应于SEQ ID No.35所示的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)脂酰基转移酶的氨基酸序列中的N-80位置上包含天冬氨酸残基。
此外或备选地，用于本发明载体、宿主细胞、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列编码的脂酰基转移酶包含SEQ ID No.16所示的氨基酸序列，或与其具有75％或更高同源性的氨基酸序列。适合地，编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以包含SEQID No.16所示的氨基酸序列。
本文所用的术语“异源的”是指源自分离的遗传资源或物种的序列。异源序列是非宿主序列、修饰的序列、来自不同宿主细胞株的序列、或来自宿主细胞的不同染色体位置的同源序列。
“同源”序列是指在同一遗传资源或物种中发现的序列，即其天然存在于宿主细胞的相关物种中。
本文所用的术语“重组的脂酰基转移酶”是指已经通过遗传重组的方式制备的脂酰基转移酶。例如，将编码脂酰基转移酶的核苷酸序列插入克隆载体，得到以存在异源脂酰基转移酶为特征的地衣芽孢杆菌细胞。
宿主细胞
在本发明的一个实施方案中，用于本发明方法和/或应用中的宿主细胞是地衣芽孢杆菌宿主细胞。
已经发现与其它生物体如枯草芽孢杆菌相比，使用地衣芽孢杆菌宿主细胞可使脂酰基转移酶的表达增加。
已经将来自于杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的脂酰基转移酶插入到多个常规表达载体中，所述表达载体经设计可分别在枯草芽孢杆菌、多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)和塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)中有最佳的表达。然而，在多型汉逊酵母、粟酒裂殖酵母和塔宾曲霉中仅检测到极低的水平。这些表达水平低于1μg/ml，因此不可能选择出产生足量蛋白以起始商业生产的细胞(结果未显示)。相反，地衣芽孢杆菌能够产生对商业生产的可行性具有吸引力的蛋白水平。
具体而言，已经发现在aprE启动子的控制下时，地衣芽孢杆菌中的表达比在枯草芽孢杆菌中的表达高约100倍，或在A4启动子的控制下并与纤维素融合时，比在变铅青链霉菌(S.lividans)中的表达高约100倍(结果未显示在本文中)。
在另一实施方案中，宿主细胞可以为除枯草芽孢杆菌之外的任何芽孢杆菌细胞。优选地，所述芽孢杆菌宿主细胞可以是以下物种中的一种：地衣芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、环状芽孢杆菌(B.circulans)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、坚强芽孢杆菌(B.firmus)、B.lautus、缓慢芽孢杆菌(B.lentus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)或嗜热脂肪芽孢杆菌(S.stearothermophilus)。
本发明涉及的术语“宿主细胞”所包括具有以下特征的任何细胞：包含本文所定义的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列或如上所述的表达载体，且用于具有如本文所定义的特异性质的脂酰基转移酶的重组制备。
因此，本发明的其它实施方案提供了宿主细胞，其包含(如经转化或转染)本发明的核苷酸序列，或包含表达具有如本文所定义的特异性质的多肽的核苷酸序列。
适合地，在一些实施方案中，宿主细胞可以是蛋白酶缺陷型或无蛋白酶型细胞株和/或α-淀粉酶缺陷型或无α-淀粉酶型细胞株。
调控序列
在一些应用中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的脂酰基转移酶序列可操作地连接能够通过如所选宿主细胞(如地衣芽孢杆菌细胞)表达核苷酸序列的调控序列。
例如，本发明涵盖包含可操作地连接此调控序列的本发明核苷酸序列的载体，即所述载体是表达载体。
术语“可操作地连接”是指并列放置(juxtaposition)，其中所述组件的关系允许它们能以其希望的方式发挥功能。“可操作地连接”编码序列的调控序列以这样的方式连接，即能在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
术语“调控序列”包括启动子和增强子以及其它表达调控信号。
所用的术语“启动子”为本领域的一般含义，如RNA聚合酶结合位点。
编码具有如本文所定义的特定性质的酶的核苷酸序列的增强表达也可以通过选择调控区(如启动子、分泌引导子和终止子区)来实现，所述终止子区本质上不是编码所述酶的核苷酸序列的调控区。
适合地，本发明的核苷酸序列至少可以可操作地连接启动子。
适合地，编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以可操作地连接编码终止子序列的核苷酸序列。用于本发明载体、宿主细胞、方法和/或应用中任一项的适合的终止子序列的实例包括：α-淀粉酶终止子序列(如，CGGGACTTACCGAAAGAAACCATCAATGATGGTTTCTTTTTTGTTCATAAA-SEQ ID No.64)、碱性蛋白酶终止子序列(如，CAAGACTAAAGACCGTTCGCCCGTTTTTGCAATAAGCGGGCGAATCTTACATAAAAATA-SEQ ID No.65)、谷氨酸特异性终止子序列(如，ACGGCCGTTAGATGTGACAGCCCGTTCCAAAAGGAAGCGGGCTGTCTTCGTGTATTATTGT-SEQ ID No.66)、果聚糖酶终止子序列(如，TCTTTTAAAGGAAAGGCTGGAATGCCCGGCATTCCAGCCACATGATCATCGTTT-SEQ ID No.67)和枯草杆菌蛋白酶E终止子序列(如，GCTGACAAATAAAAAGAAGCAGGTATGGAGGAACCTGCTTCTTTTTACTATTATTG)。适合地，编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以可操作地连接α-淀粉酶终止子，如地衣芽孢杆菌α-淀粉酶终止子。
启动子
根据本发明所用的启动子序列与编码脂酰基转移酶的序列可以是异源的或同源的。
所述启动子序列可以是能够指导脂酰基转移酶在所选宿主细胞中表达的任何启动子序列。
适合地，所述启动子序列可以与芽孢杆菌(如地衣芽孢杆菌)同源。优选地，所述启动子序列与所选宿主细胞是同源的。
用于本发明的适合的启动子序列包括：地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶基因的启动子、枯草芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶基因的启动子、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(枯草杆菌蛋白酶Carlsberg基因)的启动子、地衣芽孢杆菌谷氨酸特异性蛋白酶基因的启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶的启动子和具有α-淀粉酶基因的“-35”区序列TTGACA和“-10”区序列TATAAT的“共有”启动子(即-35至-10启动子)。
适合在本发明方法中指导核酸序列转录的启动子的其它实例包括：缓慢芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprH)的启动子、枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyE)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子、和/或苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种(Bacillusthuringiensis subsp.tenebrionis)CryIIIA基因的启动子。
在优选实施方案中，所述启动子序列为α-淀粉酶启动子(如地衣芽孢杆菌α-淀粉酶启动子)。优选地，所述启动子序列包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶启动子的-35至-10序列(参见图53和图55)。
信号肽
根据所用的序列和/或载体，宿主细胞通过表达编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所产生的脂酰基转移酶可以被分泌出或包含在细胞内。
信号序列可以用于指导编码序列分泌通过特定的细胞膜。所述信号序列对脂酰基转移酶编码序列来说可以是天然的或外源的。例如，所述信号肽编码序列可以是从芽孢杆菌物种，优选是从地衣芽孢杆菌获得的淀粉酶或蛋白酶基因。
可以由一种或多种以下基因获得适合的信号肽编码序列：麦芽糖α-淀粉酶基因、枯草杆菌蛋白酶基因、β-内酰胺酶基因、中性蛋白酶基因、prsA基因和/或酰基转移酶基因。
优选地，所述信号肽为地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的信号肽、气单孢菌酰基转移酶的信号肽(如，mkkwfvcllglialtvqa-SEQ ID No.21)、枯草芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的信号肽(如，mrskklwisllfaltliftmafsnmsaqa-SEQ ID No.22)或地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的信号肽(如，mmrkksfwfgmltafmlvftmefsdsasa-SEQ ID No.23)。适合地，所述信号肽可以为地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的信号肽。
然而，可以使用能够指导所表达的脂酰基转移酶进入所选芽孢杆菌宿主细胞(优选为地衣芽孢杆菌宿主细胞)的分泌途径的任何信号肽编码序列。
在本发明的一些实施方案中，编码信号肽的核苷酸序列可以可操作地连接编码所选脂酰基转移酶的核苷酸序列。
所选脂酰基转移酶可以在本文所定义的宿主细胞中作为融合蛋白表达。
表达载体
术语“表达载体”是指能够在体内或体外表达的构建体。
优选地，所述表达载体被引入到生物体如地衣芽孢杆菌宿主的基因组中。术语“引入”优选涵盖稳定的引入到基因组中。
如本文所定义的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以存在于载体中，在该载体中所述核苷酸序列可操作地连接调控序列，使得所述调控序列能够通过适合的宿主生物体(如地衣芽孢杆菌)表达所述核苷酸序列，即所述载体是表达载体。
本发明的载体可以被转化到上述的适合的宿主细胞中，以表达具有如本文所定义的脂酰基转移酶活性的多肽。
通常根据其将被引入的宿主细胞来选择载体(如质粒、粘粒、病毒或噬菌体载体、基因组插入物)。本发明可以涵盖具有等同功能且本领域已知或可知的其它形式的表达载体。
一旦转化到所选择的宿主细胞中，载体可以不依赖宿主细胞的基因组而复制并发挥功能，或可以自行整合进入基因组。
所述载体可以包含一种或多种选择性标记基因，如提供抗生素抗性的基因，如氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性或四环素抗性的基因。或者，可以通过共转化完成选择(如WO91/17243中所述)。
载体可以在体外使用，例如，用于制备RNA或用于转染或转化宿主细胞。
因此，在另一实施方案中，本发明提供用于本发明载体、宿主细胞、其它方法和/或应用中任一项的本发明的核苷酸序列或编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列的制备方法，所述方法是通过将核苷酸序列引入可复制载体，将所述载体引入相容的宿主细胞，并使宿主细胞在可以进行载体复制的条件下生长。
所述载体可以进一步包含能使该载体在所述宿主细胞中复制的核苷酸序列。所述序列的实例为质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。
脂酰基转移酶
用于本发明方法、载体和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码天然的脂酰基转移酶或脂酰基转移酶变体。
例如，用于本发明的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以是WO2004/064537、WO2004/064987、WO2005/066347或WO2006/008508中所述的一种。这些文献通过引用并入本文。
本文所用的术语“脂酰基转移酶”优选地是指具有脂酰基转移酶活性的酶(通常被归类为E.C.2.3.1.x，如2.3.1.43)，其中所述酶能够将酰基基团从脂质转移到一个或多个受体(acceptor)物质，如以下的一种或多种：固醇(sterol)、甾烷醇(stanol)、碳水化合物、蛋白、蛋白亚基、糖醇(如抗坏血酸和/或甘油)，优选甘油和/或固醇，如胆固醇。
优选地，用于本发明载体、宿主细胞、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列编码能够将酰基基团从磷脂(如本文所定义)转移到糖醇(如抗坏血酸和/或甘油，最优选为甘油)的脂酰基转移酶。
对于一些方面，本发明的“酰基受体”可以是包含羟基基团(-OH)的任何化合物，例如多价的醇，包括甘油、固醇、甾烷醇、碳水化合物；羟酸，包括果酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸和抗坏血酸；蛋白或其亚基，如氨基酸、蛋白水解产物和肽(部分水解的蛋白)；和其混合物和衍生物。优选地，根据本发明的“酰基受体”不是水。优选地，根据本发明的“酰基受体”是糖醇如多元醇，最优选为甘油。出于本发明的目的，抗坏血酸也被认为是糖醇。
优选地，所述酰基受体不为甘油单酯。
优选地，所述酰基受体不为甘油二酯。
一方面，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以且能够将酰基基团从脂质转移到甘油，此外能够将酰基基团从脂质转移到以下的一种或多种物质：碳水化合物、蛋白、蛋白亚基、固醇和/或甾烷醇，优选其能够转移到糖醇(如抗坏血酸和/或甘油，最优选为固醇(如胆固醇))和/或植物固醇/甾烷醇。
优选地，脂酰基作用的脂质底物是以下脂质中的一种或多种：磷脂，如卵磷脂，如磷脂酰胆碱。
所述脂质底物在本文中可以被称为“脂酰基供体”。本文所用的术语卵磷脂涵盖磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油。
对于一些方面，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列优选编码不能或基本上不能作用于甘油三酯和/或1-甘油单酯和/或2-甘油单酯的脂酰基转移酶。
对于一些方面，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列编码不表现出三酰基甘油(triacylglycerol)脂肪酶活性(E.C.3.1.1.3)或不表现出显著的三酰基甘油脂肪酶活性(E.C.3.1.1.3)的脂酰基转移酶。
水解甘油三酯的能力(E.C.3.1.1.3活性)可以由根据Food ChemicalCodex(3rd Ed.，1981，pp 492-493)(修改为葵花油、pH 5.5以替代橄榄油、pH 6.5)测定的脂肪酶活性来测定。脂肪酶活性以LUS(葵花的脂肪酶单位)来测定，其中将1 LUS定义为在以上试验条件下每分钟可以从葵花油中释放1μmol脂肪酸的酶量。或者，也可以使用如WO9845453中定义的LUT试验。此文献通过引用并入本文。
用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码基本上不能作用于甘油三酯的脂酰基转移酶，所述脂酰基转移酶的LUS/mg可以小于1000，如小于500、如小于300、优选为小于200、更优选为小于100、更优选为小于50、更优选为小于20、更优选为小于10，如小于5、小于2、更优选为小于1LUS/mg。优选地，LUT/mg活性小于500，如小于300、优选为小于200、更优选为小于100、更优选为小于50、更优选为小于20、更优选为小于10，如小于5、小于2、更优选为小于1LUT/mg。
用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码基本上不能作用于甘油单酯的脂酰基转移酶，所述脂酰基转移酶可以在LUS试验中使用单油酸酯(M7765 1-油酰-rac-甘油99％)以替代葵花油来测定。将1MGHU定义为在所述试验条件下每分钟可以从甘油单酯中释放1μmol脂肪酸的酶量。
用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码基本上不能作用于甘油三酯的脂酰基转移酶，所述脂酰基转移酶具有的MGHU/mg可以小于5000，如小于1000、如小于500、如小于300、优选为小于200、更优选为小于100、更优选为小于50、更优选为小于20、更优选为小于10(如小于5、小于2)、更优选为小于1MGHU/mg。
适合地，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列编码可以表现出一种或多种以下磷脂酶活性的脂酰基转移酶：磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)和/或磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)。所述脂酰基转移酶也可以具有磷脂酶B活性(E.C 3.1.1.5)。
适合地，对于一些方面，所述脂酰基转移酶可以能够将酰基基团从磷脂转移到糖醇(优选为甘油和/或抗坏血酸)。
对于一些方面，优选地用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列编码能够将酰基基团从磷脂转移到固醇和/或甾烷醇以至少形成固醇酯和/或甾烷醇酯的脂酰基转移酶。
所述脂酰基转移酶可以能够将酰基基团从脂质转移到多元醇(如甘油)和/或固醇(如胆固醇或植物固醇)和/或甾烷醇。因此，在一个实施方案中，本发明的“酰基受体”可以为甘油和/或胆固醇或植物固醇和/或甾烷醇。
优选地，所述脂酰基转移酶可以使用以下标准进行表征：
所述酶具有可以被定义为酯转移活性的酰基转移酶活性，通过此活性将脂酰基供体的原初酯键的酰基部分转移到酰基受体(优选为甘油或胆固醇)以形成新的酯；和
所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S。
优选地，GDSX基序的X为L或Y。更优选地，GDSX基序的X为L。因此，优选本发明的酶包含氨基酸序列基序GDSL。
GDSX基序由四个保守的氨基酸构成。优选地，该基序中的丝氨酸为所述脂酰基转移酶的催化性丝氨酸。适合地，GDSX基序的丝氨酸的位置对应于Brumlik和Buckley(Journal of Bacteriology Apr.1996，Vol.178，No.7，p 2060-2064)中教导的嗜水气单胞菌脂酰基转移酶的Ser-16。
为了测定蛋白是否具有本发明的GDSX基序，优选使用WO2004/064537或WO2004/064987(均通过引用并入本文)中教导的方法，将序列与pfam数据库的隐马尔可夫模型序型(hidden markov model profile)(HMM序型)进行比较。
优选地，所述脂酰基转移酶可以使用Pfam00657共有序列进行比对(完整的解释可参见WO2004/064537或WO2004/064987)。
优选地，与pfam00657结构域家族的隐马尔可夫模型序型(HMM序型)的阳性匹配表示存在本发明的GDSL或GDSX结构域。
优选地，当与Pfam00657共有序列进行比对时，用于本发明方法和/或应用的脂酰基转移酶可以具有至少一个、优选为大于一个、更优选为大于两个的下述部分(block)：GDSx、GANDY、HPT。适合地，所述脂酰基转移酶可以具有GDSx部分和GANDY部分。或者，所述酶可以具有GDSx部分和HPT部分。优选地，所述酶至少包含GDSx部分。更多细节请参见WO2004/064537或WO2004/064987。
优选地，GANDY基序的残基选自GANDY、GGNDA、GGNDL，最优选为GANDY。
优选地，当与Pfam00657共有序列进行比对时，与嗜水气单胞菌多肽参考序列(SEQ ID No.1)相比，用于本发明方法和/或应用的酶具有以下氨基酸残基中的至少一个、优选大于两个、优选大于三个、优选大于四个、优选大于五个、优选大于六个、优选大于七个、优选大于八个、优选大于九个、优选大于十个、优选大于十一个、优选大于十二个、优选大于十三个、优选大于十四个：28hid、29hid、30hid、31hid、32gly、33Asp、34Ser、35hid、130hid、131Gly、132Hid、133Asn、134Asp、135hid、309His。
Pfam00657 GDSX结构域是区分有此结构域的蛋白和其它酶的独特标志。
表3中显示了pfam00657共有序列(SEQ ID No.2)。其源自于对第6版数据库pfam家族00657(在本文中也可以称为pfam00657.6)的鉴定。
所述共有序列可以通过使用较新版pfam数据库来升级(如参见WO2004/064537或WO2004/064987)。
在一个实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列编码可以使用以下标准进行表征的脂酰基转移酶：
(i)所述酶具有可以被称为酯转移活性的酰基转移酶活性，通过此活性将脂酰基供体的原初酯键的酰基部分转移到酰基受体(优选为甘油或胆固醇)以形成新的酯，优选分别为甘油单酯或胆固醇酯；
(ii)所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S；
(iii)所述酶包含His-309或在图2和4中(SEQ ID No.1或SEQ ID No.3)所示的嗜水气单胞菌脂酰基转移酶中His-309的对应位置上包含组氨酸残基。
优选地，所述GDSX基序的氨基酸残基为L。
在SEQ ID No.3或SEQ ID No.1中，起始的18个氨基酸残基形成信号序列。全长序列(即包含信号序列的蛋白)中的His-309等同于蛋白的成熟部分(即不含信号序列的序列)中的His-291。
在一个实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶包含以下催化三联体：Ser-34、Asp-306和His-309，或在图4(SEQ ID No.3)或图2(SEQ ID No.1)中所示的嗜水气单胞菌脂酰基转移酶中Ser-34、Asp-306和His-309的对应位置上分别包含丝氨酸残基、天冬氨酸残基和组氨酸残基。如上所述，在SEQ ID No.3或SEQ ID No.1所示的序列中，起始的18个氨基酸残基形成信号序列。全长序列(即包含信号序列的蛋白)中的Ser-34、Asp-306和His-309等同于蛋白的成熟部分(即不含信号序列的序列)中的Ser-16、Asp-288和His-291。在图3(SEQ ID No.2)所示的pfam00657共有序列中，活性位点残基为Ser-7、Asp-345和His-348。
在一个实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列编码可以使用以下标准进行表征的脂酰基转移酶：
所述酶具有可以被称为酯转移活性的酰基转移酶活性，通过此活性将第一脂酰基供体的原初酯键的酰基部分转移到酰基受体以形成新的酯；和
所述酶至少包含Gly-32、Asp-33、Ser-34、Asp-134和His-309，或在SEQ ID No.3或SEQ ID No.1所示的嗜水气单胞菌脂酰基转移酶中Gly-32、Asp-33、Ser-34、Asp-306和His-309的对应位置上分别包含甘氨酸残基、天冬氨酸残基、丝氨酸残基、天冬氨酸残基和组氨酸残基。
适合地，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以是以下核苷酸序列中的一种：
(a)SEQ ID No.36所示的核苷酸序列(参见图29)、
(b)SEQ ID No.38所示的核苷酸序列(参见图31)、
(c)SEQ ID No.39所示的核苷酸序列(参见图32)、
(d)SEQ ID No.42所示的核苷酸序列(参见图35)、
(e)SEQ ID No.44所示的核苷酸序列(参见图37)、
(f)SEQ ID No.46所示的核苷酸序列(参见图39)、
(g)SEQ ID No.48所示的核苷酸序列(参见图41)、
(h)SEQ ID No.49所示的核苷酸序列(参见图57)、
(i)SEQ ID No.50所示的核苷酸序列(参见图58)、
(j)SEQ ID No.51所示的核苷酸序列(参见图59)、
(k)SEQ ID No.52所示的核苷酸序列(参见图60)、
(l)SEQ ID No.53所示的核苷酸序列(参见图61)、
(m)SEQ ID No.54所示的核苷酸序列(参见图62)、
(n)SEQ ID No.55所示的核苷酸序列(参见图63)、
(o)SEQ ID No.56所示的核苷酸序列(参见图64)、
(p)SEQ ID No.57所示的核苷酸序列(参见图65)、
(q)SEQ ID No.58所示的核苷酸序列(参见图66)、
(r)SEQ ID No.59所示的核苷酸序列(参见图67)、
(s)SEQ ID No.60所示的核苷酸序列(参见图68)、
(t)SEQ ID No.61所示的核苷酸序列(参见图69)、
(u)SEQ ID No.62所示的核苷酸序列(参见图70)、
(v)SEQ ID No.63所示的核苷酸序列(参见图71)或
(w)与SEQ ID No.36、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.42、SEQ ID No.44、SEQ ID No.46、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62或SEQ ID No.63中所示的任一序列具有70％或更高，优选为75％或更高同一性的核苷酸序列。
适合地，所述核苷酸序列可以与SEQ ID No.36、SEQ ID No.38、SEQID No.39、SEQ ID No.42、SEQ ID No.44、SEQ ID No.46、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62或SEQ ID No.63中所示的任一序列具有80％或更高，优选为85％或更高，更优选为90％或更高，且更优选为95％或更高同一性。
在一个实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列为与SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.62和SEQ ID No.63中所示的任一序列具有70％或更高，优选为75％或更高同一性的核苷酸序列。适合地，所述核苷酸序列可以与SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.62和SEQ ID No.63中所示的任一序列具有80％或更高，优选为85％或更高，更优选为90％或更高，且更优选为95％或更高同一性。
在一个实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列为与SEQ ID No.49中所示的序列具有70％或更高，75％或更高，80％或更高，优选为85％或更高，更优选为90％或更高，且更优选为95％或更高同一性的核苷酸序列。
适合地，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码包含一种或多种以下氨基酸序列的脂酰基转移酶：
(i)SEQ ID No.3所示的氨基酸序列、
(ii)SEQ ID No.4所示的氨基酸序列、
(iii)SEQ ID No.5所示的氨基酸序列、
(iv)SEQ ID No.6所示的氨基酸序列、
(v)SEQ ID No.7所示的氨基酸序列、
(vi)SEQ ID No.8所示的氨基酸序列、
(vii)SEQ ID No.9所示的氨基酸序列、
(viii)SEQ ID No.10所示的氨基酸序列、
(ix)SEQ ID No.11所示的氨基酸序列、
(x)SEQ ID No.12所示的氨基酸序列、
(xi)SEQ ID No.13所示的氨基酸序列、
(xii)SEQ ID No.14所示的氨基酸序列、
(xiii)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列、
(xiv)SEQ ID No.15所示的氨基酸序列或
与SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14或SEQ ID No.15中所示的任一序列具有75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高同一性的氨基酸序列。
适合地，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以包含如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4或SEQ ID No.1或SEQ ID No.15所示的氨基酸序列，或包含与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列或SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或SEQ ID No.15所示的氨基酸序列具有75％或更高、优选为80％或更高、优选为85％或更高、优选为90％或更高、优选为95％或更高的同一性的氨基酸序列。
适合地，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以包含与SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.1或SEQ ID No.15中所示的任一序列具有80％或更高、优选为85％或更高、更优选为90％或更高、且更优选为95％或更高的同一性的氨基酸序列。
适合地，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码包含一种或多种以下氨基酸序列的脂酰基转移酶：
(a)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基1-100所示的氨基酸序列；
(b)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基101-200所示的氨基酸序列；
(c)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基201-300所示的氨基酸序列；或
(d)与以上(a)至(c)中所定义的氨基酸序列中任一序列具有75％或更高、优选为85％或更高、更优选为90％或更高、且更优选为95％或更高的同一性的氨基酸序列。
适合地，用于本发明方法和/或应用中的脂酰基转移酶可以包含一种或多种以下氨基酸序列：
(a)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基28-39所示的氨基酸序列；
(b)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基77-88所示的氨基酸序列；
(c)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基126-136所示的氨基酸序列；
(d)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基163-175所示的氨基酸序列；
(e)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基304-311所示的氨基酸序列；或
(f)与以上(a)至(e)中所定义的氨基酸序列中任一序列具有75％或更高、优选为85％或更高、更优选为90％或更高、且更优选为95％或更高的同一性的氨基酸序列。
一方面，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以是如EP 1 275 711中教导的来自于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)的脂酰基转移酶。因此，一方面，用于本发明方法和应用中的脂酰基转移酶可以为包含SEQID No.17或SEQ ID No.18所教导的一种氨基酸序列的脂酰基转移酶。
优选地，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以是包含SEQ ID No.16所示的氨基酸序列的脂酰基转移酶，或者是包含与SEQ ID No.16具有75％或更高、优选为85％或更高、更优选为90％或更高、更优选为95％或更高、更优选为98％或更高、或更优选为99％或更高的同一性的氨基酸序列的脂酰基转移酶。所述酶可以被认为酶的变体。
一方面，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以为卵磷脂：胆固醇酰基转移酶(LCAT)或其变体(如由分子进化产生的变体)。
适合的LCAT为本领域已知的，且可以获得来自一种或多种如下的生物体，如：哺乳类、大鼠、小鼠、鸡、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、植物(包括拟南芥(Arabidopsis)和水稻(Oryza sativa))、线虫、真菌和酵母。
在一个实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以是可获得的，优选从带有pPet12aAhydro和pPet12aASalmo的大肠杆菌株TOP 10获得的脂酰基转移酶，所述大肠杆菌株TOP 10由Danisco A/S ofLangebrogade 1，DK-1001 Copenhagen K，Denmark根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约保藏在National Collection of Industrial，Marine and Food Bacteria(NCIMB)23 St.Machar Street，Aberdeen Scotland，GB，保藏日为2003年12月22日，保藏号分别为NCIMB 41204和NCIMB41205。
用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码磷脂甘油酰基转移酶。磷脂甘油酰基转移酶包括分离自气单孢菌，优选为嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌，最优选为杀鲑气单胞菌或其变体的那些磷脂甘油酰基转移酶。用于本发明的最优选的脂酰基转移酶可以由SEQ ID No.1、3、4、15和16所编码。本领域技术人员可以理解，优选酰基转移酶的信号肽已经在转移酶的表达过程中被切割。SEQ ID No.1、3、4、15和16的信号肽为氨基酸1-18。因此，最优选的区域为SEQ ID No.1和SEQ ID No.3(嗜水气单胞菌)中的氨基酸19-335，和SEQ ID No.4、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16(杀鲑气单胞菌)中的氨基酸19-336。当用于测定氨基酸序列的同一性或同源性时，优选使用成熟序列进行本文所述的比对。
因此，用于测定同源性(同一性)的最优选的区域为SEQ ID No.1和3(嗜水气单胞菌)中的氨基酸19-335，和SEQ ID No.4、15和16(杀鲑气单胞菌)中的氨基酸19-336。SEQ ID 34和35分别是来自嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌的脂酰基转移酶的成熟蛋白序列。
用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶也可以分离自喜热裂孢菌(Thermobifida)，优选为褐色喜热裂孢菌(T.fusca)，最优选其由SEQ ID No.28编码。
用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的核苷酸序列也可以分离自链霉菌属，优选为阿维链霉菌(S.avermitis)，最优选其由SEQ ID No.32编码。用于本发明的来自链霉菌的其它可能的酶包括由SEQ ID No.5、6、9、10、11、12、13、14、31和33所编码的那些酶。
用于本发明的酶也可以分离自棒状杆菌属(Corynebacterium)，优选为C.efficiens，最优选其由SEQ ID No.29编码。
适合地，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以包含SEQ ID No.37、38、40、41、43、45或47所示的任一氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID No.36、39、42、44、46或48所示的任一核苷酸序列所编码，或由与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列所编码。
在一个实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列选自由以下组成的组：
a)包含SEQ ID No.36所示的核苷酸序列的核酸；
b)由于遗传密码简并性而与SEQ ID No.36的核苷酸序列相关的核酸；和
c)包含与SEQ ID No.36所示的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的核酸。
在一个实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶包含SEQID No.37所示的氨基酸序列或与其具有至少60％同一性的氨基酸序列。
在另一实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以包含SEQ ID No.37、38、40、41、43、45或47所示的任一氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID No.39、42、44、46或48所示的任一核苷酸序列所编码，或由与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列所编码。
在另一实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以包含SEQ ID No.38、40、41、45或47所示的任一氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列，以用于本发明。
在另一实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以包含SEQ ID No.38、40或47所示的任一氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列，以用于本发明。
更优选地，在一个实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以包含SEQ ID No.47所示的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列。
在另一实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以包含SEQ ID No.43或44所示的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列。
在另一实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以包含SEQ ID No.41所示的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列选自由以下组成的组：
a)包含SEQ ID No.36所示的核苷酸序列的核酸；
b)由于遗传密码简并性而与SEQ ID No.36的核苷酸序列相关的核酸；和
c)包含与SEQ ID No.36所示的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的核酸。
在一个实施方案中，根据本发明的脂酰基转移酶可以是可获得的，优选从链霉菌属株L130或L131获得的脂酰基转移酶，所述链霉菌属株L130或L131由Danisco A/S of Langebrogade 1，DK-1001 Copenhagen K，Denmark根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约保藏在NationalCollection of Industrial，Marine and Food Bacteria(NCIMB)23 St.MacharStreet，Aberdeen Scotland，GB，保藏日为2004年6月25日，保藏号分别为NCIMB 41226和NCIMB 41227。
用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的适合的核苷酸序列可以编码脂酰基转移酶(SEQ ID No.16)，或可以编码脂酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No.17)。
用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的适合核苷酸序列可编码如下所述的氨基酸序列，该氨基酸序列可使用Align X(使用默认设置的VectorNTI的Clustal W成对比对算法)通过与L131(SEQ ID No.37)序列的比对进行鉴定。
L131与来自灰色链霉菌(S.avermitilis)和褐色喜热裂孢菌的同源物的比对可以显示GDSx基序(L131以及灰色链霉菌和褐色喜热裂孢菌中为GDSY)、GANDY框(其为GGNDA或GGNDL)和HPT部分(被认为是保守的催化性组氨酸)的保守性。这三个保守部分突出标记在图42中。
与pfam Pfam00657共有序列(如WO04/064987中所述)和/或本文公开的L131序列(SEQ ID No.37)比对时，可以鉴定出三个保守区，GDSx部分、GANDY部分和HTP部分(详述参见WO04/064987)。
与pfam Pfam00657共有序列(如WO04/064987中所述)和/或本文公开的L131序列(SEQ ID No.37)比对时，
i)用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码具有GDSx基序，更优选为选自GDSL或GDSY基序的GDSx基序的脂酰基转移酶；和/或
ii)用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码具有GANDY部分，更优选为包含氨基GGNDx的GANDY部分，更优选为GGNDA或GGNDL的脂酰基转移酶；和/或
iii)用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码优选具有HTP部分的脂酰基转移酶；和优选地，
iv)用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码优选具有GDSx或GDSY基序，和包含氨基GGNDx(优选为GGNDA或GGNDL)的GANDY部分，和HTP部分(保守的组氨酸)的脂酰基转移酶。
脂酰基转移酶变体
在优选的实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶为脂酰基转移酶变体。
可以使用对磷脂的活性增加的变体，如对磷脂的水解活性增加和/或转移酶活性增加的变体，优选为对磷脂的转移酶活性增加的变体。
优选地，通过如上定义的脂酰基转移酶的一个或多个氨基酸修饰来制备所述脂酰基转移酶变体。
适合地，当用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶为脂酰基转移酶变体时，在此情况中，所述酶的特征为所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S，且其中所述酶变体相对于亲本序列在第2组、第4组、第6组或第7组限定的一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸修饰(如WO2005/066347和下文所定义)。
例如，脂酰基转移酶变体可以被表征为所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S，且其中酶变体相对于亲本序列在第2组、第4组、第6组或第7组限定的一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸修饰(如WO2005/066347和下文所定义)，所述组是通过所述亲本序列与本文定义的P10480结构模型在结构上进行比对而鉴定出来的，其优选是通过P10480晶体结构等同物(crystal structure coordinates)与如WO2005/066347和下文所定义的1IVN.PDB和/或1DEO.PDB的结构比对而获得的。
在其它实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码脂酰基转移酶变体，其可以被表征为所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S，且其中酶变体相对于亲本序列在第2组所教导的一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸修饰，所述第2组是在将所述亲本序列与pfam共有序列(SEQID No.2-图3)比对时被鉴定出来的，并根据P10480的结构模型进行修饰以确保如WO2005/066347和下文所定义的最佳符合交叠(best fit overlap)。
适合地，当用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码可包含以下氨基酸序列的脂酰基转移酶变体，其中所述氨基酸序列如SEQ ID No.34、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ IDNo.19、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.1、SEQ ID No.15、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQID No.32或SEQ ID No.33所示，并在第2组、第4组、第6组或第7组限定的一个或多个氨基酸残基处有一个或多个氨基酸修饰(如WO2005/066347和下文所定义)，所述组是通过与SEQ ID No.34的序列比对而鉴定出来的。
或者，编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码包含以下氨基酸序列的脂酰基转移酶变体，其中所述氨基酸序列如SEQ ID No.34、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.19、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.1、SEQ ID No.15、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32或SEQ ID No.33所示，并在第2组、第4组、第6组或第7组限定的一个或多个氨基酸残基处有一个或多个氨基酸修饰(如WO2005/066347和下文所定义)，所述组是通过所述亲本序列与本文定义的P10480的结构模型在结构上进行比对而鉴定出来的，其优选是通过P10480晶体结构等同物与如WO2005/066347和下文所教导的1IVN.PDB和/或1DEO.PDB的结构比对而获得的。
或者，编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码包含以下氨基酸序列的脂酰基转移酶变体，其中所述氨基酸序列如SEQ ID No.34、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.19、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.1、SEQ ID No.15、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32或SEQ ID No.33所示，并在第2组所教导的一个或多个氨基酸残基处有一个或多个氨基酸修饰，所述第2组是在将所述亲本序列与pfam共有序列(SEQ ID No.2)比对时被鉴定出来的，并根据P10480的结构模型进行修饰以确保如WO2005/066347和下文所教导的最佳符合交叠。
优选地，所述亲本酶是包含SEQ ID No.34和/或SEQ ID No.15和/或SEQ ID No.35所示氨基酸序列或与它们同源的酶。
优选地，编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码包含以下氨基酸序列的脂酰基转移酶变体，其中所述氨基酸序列如SEQ ID No.34或SEQ IDNo.35所示，并在如WO2005/066347和下文所定义的第2组、第4组、第6组或第7组限定的一个或多个氨基酸残基处有一个或多个氨基酸修饰。
组的定义
第1组氨基酸：
第1组氨基酸(注意这些是图53和图54的1IVN中的氨基酸)
Gly8、Asp9、Ser10、Leu11、Ser12、Tyr15、Gly44、Asp45、Thr46、Glu69、Leu70、Gly71、Gly72、Asn73、Asp74、Gly75、Leu76、Gln106、Ile107、Arg108、Leu109、Pro110、Tyr113、Phe121、Phe139、Phe140、Met141、Tyr145、Met151、Asp154、His157、Gly155、Ile156、Pro158
从第1组中不包含高度保守的基序，如GDSx和催化残基(标有下划线的残基)。为了避免争议，第1组定义了1IVN模型活性位点中在甘油的中心碳原子
以内的氨基酸残基。
第2组氨基酸：
第2组氨基酸(注意氨基酸的编号是指P10480成熟序列中的氨基酸)
Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289和Val290。
第1组和第2组中所选残基的比较表
第3组氨基酸：
第三组氨基酸与第2组相同，但是是指杀鲑气单胞菌(SEQ ID No.4)的编码序列，即第3组中的氨基酸残基编号要大18，这反映了成熟蛋白(SEQ ID No.34)与包含信号序列的蛋白(SEQ ID No.25)中氨基酸编号之间的差异。
杀鲑气单胞菌GDSX(SEQ ID No.4)和嗜水气单胞菌GDSX(SEQ IDNo.34)的成熟蛋白有五个氨基酸不同。它们是Thr3Ser、Gln182Lys、Glu309Ala、Ser310Asn和Gly318-，其中杀鲑气单胞菌的残基列在前面，而嗜水气单胞菌的残基列在后面。嗜水气单胞菌蛋白的长度只有317个氨基酸，且在第318位上缺少残基。与嗜水气单胞菌蛋白相比，杀鲑气单胞菌GDSX对极性脂质(如半乳糖脂底物)具有相当高的活性。对全部五个氨基酸位置进行了位点扫描。
第4组氨基酸：
第4组氨基酸是S3、Q182、E309、S310和-318。
第5组氨基酸：
F13S、D15N、S18G、S18V、Y30F、D116N、D116E、D157N、Y226F、D228N、Y230F。
第6组氨基酸：
第6组氨基酸是Ser3、Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Gln182、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、Val290、Glu309、Ser310、-318。
第6组中的氨基酸的编号是指P10480(SEQ ID No.25)中的氨基酸残基，其它序列主链上的相应氨基酸可以通过与P10480和/或1IVN的同源比对和/或结构比对来确定。
第7组氨基酸：
第7组氨基酸是Ser3、Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Gln182、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、Val290、Glu309、Ser310、-318、Y30X(其中X选自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W)、Y226X(其中X选自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W)、Y230X(其中X选自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W)、S18X(其中X选自A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W或Y)、D157X(其中X选自A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y)。
第7组中氨基酸的编号是指P10480(SEQ ID No.25)中的氨基酸残基，其它序列主链上的相应氨基酸可以通过与P10480和/或1IVN的同源比对和/或结构比对来确定。
适合地，与亲本酶相比，所述酶变体包含一种或多种以下氨基酸修饰：
S3E、A、G、K、M、Y、R、P、N、T或G
E309Q、R或A，优选为Q或R
-318Y、H、S或Y，优选为Y。
优选地，GDSX基序的X是L。因此，优选所述亲本酶包含氨基酸基序GDSL。
适合地，所述第一亲本脂酰基转移酶可以包含任何一种以下氨基酸序列：SEQ ID No.34、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.19、SEQ ID No.1 0、SEQID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.1、SEQ ID No.15、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32或SEQ ID No.33。
适合地，所述第二相关脂酰基转移酶可以包含任何一种以下氨基酸序列：SEQ ID No.3、SEQ ID No.34、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.19、SEQ ID No.10、SEQID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.1、SEQ ID No.15、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32或SEQ ID No.33。
与所述亲本酶相比，所述酶变体必须包含至少一个氨基酸修饰。在一些实施方案中，与亲本酶相比，所述酶变体可以包含至少2个、优选为至少3个、优选为至少4个、优选为至少5个、优选为至少6个、优选为至少7个、优选为至少8个、优选为至少9个、优选为至少10个氨基酸修饰。
当在本文中提及具体的氨基酸残基时，可以从序列变体与SEQ ID No.34或SEQ ID No.35所示的参考序列的比对获得编号。
一方面，优选酶变体包含一种或多种以下氨基酸取代：
S3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y；和/或
L17A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
S18A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W或Y；和/或
K22A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
M23A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Y30A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或
G40A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
N80A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
P81A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
K82A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
N87A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
N88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
W111A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
V112A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；和/或
A114C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Y117A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或
L118A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
P156A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
D157A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
G159A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Q160A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y；和/或
N161A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
P162A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
S163A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y；和/或
A164C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
R165A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y；和/或
S166A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y；和/或
Q167A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y；和/或
K168A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
V169A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；和/或
V170A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；和/或
E171A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
A172C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Y179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或
H180A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
N181A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Q182A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y，优选为K；和/或
M209A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
L210A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
R211A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
N215A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Y226A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或
Y230A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或
K284A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
M285A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Q289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y；和/或
V290A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；和/或
E309A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
S310A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y。
此外或可选地，可以有一个或多个C末端延长。优选地，所述附加的C末端延长由一个或多个脂肪族氨基酸构成，优选为非极性氨基酸，更优选为I、L、V或G。因此，本发明进一步提供了包含以下C末端延长中的一个或多个的酶变体：318I、318L、318V、318G。
优选的酶变体可以降低对磷脂如磷脂酰胆碱(PC)的水解活性，并可以升高对磷脂的转移酶活性。
优选的酶变体可以升高对磷脂如磷脂酰胆碱(PC)的转移酶活性，也可以升高对磷脂的水解活性。
一个或多个以下残基的修饰可以产生对磷脂具有升高的绝对转移酶活性的酶变体：S3、D157、S310、E309、Y179、N215、K22、Q289、M23、H180、M209、L210、R211、P81、V112、N80、L82、N88、N87。
可以提供对磷脂具有改进的转移酶活性的酶变体的优选具体修饰可以选自以下一种或多种：
S3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，优选为N、E、K、R、A、P或M，最优选为S3A；
D157A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为D157S、R、E、N、G、T、V、Q、K或C；
S310A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，优选为S310T、-318E；
E309A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，优选为E309 R、E、L、R或A；
Y179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W，优选为Y179D、T、E、R、N、V、K、Q或S，更优选为E、R、N、V、K或Q；
N215A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为N215S、L、R或Y；
K22A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为K22E、R、C或A；
Q289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y，优选为Q289R、E、G、P或N；
M23A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为M23K、Q、L、G、T或S；
H180A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为H180Q、R或K；
M209A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为M209Q、S、R、A、N、Y、E、V或L；
L210A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为L210R、A、V、S、T、I、W或M；
R211A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y，优选为R211T；
P81A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为P81G；
V112A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y，优选为V112C；
N80A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；优选为N80R、G、N、D、P、T、E、V、A或G
L82A、C、D、E、F、G、H、I、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为L82N、S或E；
N88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为N88C；
N87A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为N87M或G；
一个或多个以下残基的优选修饰产生对磷脂具有升高的绝对转移酶活性的酶变体：
S3N、R、A、G
M23K、Q、L、G、T、S
H180R
L82G
Y179E、R、N、V、K或Q
E309 R、S、L或A
一个优选的修饰是N80D。尤其当使用参考序列SEQ ID No.35作为骨架时更是如此。因此，参考序列可以为SEQ ID No.16。所述修饰可以与一个或多个其它修饰组合。因此，在本发明的优选实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以包含SEQ ID No.35，或与SEQ ID No.35具有75％或更高、优选为85％或更高、更优选为90％或更高、更优选为95％或更高、更优选为98％或更高、或更优选为99％或更高同一性的氨基酸序列。
如上指出，当在本文中提及具体氨基酸残基时，编号是通过序列变体与SEQ ID No.34或SEQ ID No.35所示的参考序列的比对获得的。
优选地，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码包含SEQ ID No.16所示的氨基酸序列的脂，或与SEQ ID No.16具有75％或更高、优选为85％或更高、更优选为90％或更高、更优选为95％或更高、更优选为98％或更高、或更优选为99％或更高同一性的氨基酸序列的脂。所述酶可以被认为是酶变体。
出于本发明的目的，同一性的程度是基于相同序列元件(sequenceelements)的数目。根据本发明，可以通过本领域已知的计算机程序的方法(如Vector NTI 10(Invitrogen Corp.))来适当地确定氨基酸序列的同一性程度。对于成对比对，所用的评分优选为空位开放罚分为10.0、空位延伸罚分为0.1的BLOSUM62。
适合地，关于氨基酸序列的同一性程度，在至少20个连续的氨基酸内、优选为至少30个连续的氨基酸内、优选为至少40个连续的氨基酸内、优选为至少50个连续的氨基酸内、优选为至少60个连续的氨基酸内进行测定。
适合地，可以在全序列中测定氨基酸序列的同一性程度。
适合地，编码本发明脂酰基转移酶的核苷酸序列是可以获得的，优选从一种或多种以下属的生物体中获得：气单孢菌属、链霉菌属、酵母菌属、乳球菌属、分支杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、脱亚硫酸菌属、芽孢杆菌、弯曲菌属、弧菌科、木杆菌属、硫化叶菌属、曲霉属、裂殖酵母属、李斯特菌属、奈瑟菌属、中慢生根瘤菌属、雷尔氏菌属、黄单胞菌属、念珠菌属、喜热裂孢菌属和棒状杆菌属。
适合地，编码本发明脂酰基转移酶的核苷酸序列是可以获得的，优选从一种或多种以下生物体中获得：嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)、分支杆菌属、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、酿脓链球菌、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、Streptomycesthermosacchari、灰色链霉菌、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、脱卤脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium dehalogenans)、芽孢杆菌、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、弧菌科(Vibrionaceae)、苛养木杆菌(Xylellafastidiosa)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、土霉菌(Aspergillus terreus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)、百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)、近平滑假丝酵母、褐色喜热裂孢菌和Corynebacterium efficiens。
一方面，优选用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码本发明脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶是可以获得的，优选获得自或来自气单孢菌属、嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌的一种或多种。
可以使用WO2004/064537的实施例12中教导的试验对本发明具有脂酰基转移酶功能的酶进行常规鉴定。所述试验使用很高的水含量(约95％)，本发明的脂酰基转移酶是具有至少2％的酰基转移酶活性(相对转移酶活性)，优选为至少5％的相对转移酶活性，优选为至少10％的相对转移酶活性，优选为至少15％、20％、25％、26％、28％、30％、40％、50％、60％或75％的相对转移酶活性。
磷脂酶在低水环境中可以起酰基转移酶的作用。因此，当在低水环境中进行脂肪食用油的修饰过程时，可以考虑使用磷脂酶替代磷脂酰基转移酶，或除磷脂酰基转移酶之外，可以同时使用磷脂酶。
本文所用的术语“高水”是指水含量大于3％、优选为大于4％、大于5％、大于6％、大于7％、大于8％、大于9％、大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％或大于90％的任何底物或食物。
本文所用的术语“低水”是指水含量水含量小于3％、优选为小于2％、小于1％或小于0.5％、小于0.3％、小于0.2、小于0.1、小于0.05或小于0.01％的任何底物或食物。
为了避免争议，牛奶为高水环境，而乳脂(butterfat)为低水环境。
用于本发明的适合的磷脂酶包括磷脂酶A1、磷脂酶A2或磷脂酶B。也可以将磷脂酶A1、磷脂酶A2或磷脂酶B与脂酰基转移酶活性协同使用。也可以将磷脂酶C和/或D与脂酰基转移酶活性/磷脂酶A1、A2和/或B活性协同使用，这类似于WO2005/089562。优选的磷脂酶可以包括磷脂酶A2，如LecitaseTM或WO2004/97012(Novozymes/Chr.Hansen)公开的镰孢霉(Fusarium venenatum)的磷脂酶和Tuber albidum的磷脂酶。Novozymes销售的镰孢霉磷脂酶名为MAX YIELDTM。
分离的
一方面，本发明的方法包括回收/分离脂酰基转移酶的额外步骤。因此，所制备的脂酰基转移酶可以是分离的形式。
另一方面，用于本发明的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以是分离的形式。
术语“分离的(或分离)”是指序列或蛋白至少基本不包含其它至少一种成分，所述成分在自然中与该序列或蛋白天然连接，并以这种连接状态发现于自然中。
纯化的
一方面，本发明的方法包括对所述脂酰基转移酶进行纯化的额外步骤。
另一方面，用于本发明的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以是纯化的形式。
术语“纯化的”是指序列处于相对纯的状态，如至少约51％纯的、或至少约75％纯的、或至少约80％纯的、或至少约90％纯的、或至少约95％纯的、或至少约98％纯的。
克隆编码本发明多肽的核苷酸序列
编码具有如本文所定义的特定性质的多肽或适合修饰的多肽的核苷酸序列可以从产生所述多肽的任何细胞或生物体中分离得到。用于核苷酸序列分离的各种方法都是本领域熟知的。
例如，可以使用产生所述多肽的生物体的染色体DNA或信使RNA来构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果所述多肽的氨基酸序列是已知的，可以合成经标记的寡核苷酸探针，并将其用于从由该生物体制备的基因组文库中鉴定编码多肽的克隆。或者，也可以使用包含与另一已知多肽基因同源的序列的经标记寡核苷酸探针来鉴定编码多肽的克隆。在后一种情况下，使用严谨性较低的杂交和清洗条件。
或者，可以通过如下方式鉴定编码多肽的克隆：将基因组DNA的片段插入到表达载体(如质粒)中，使用所得的基因组DNA文库转化酶为阴性的细菌，并随后将转化的细菌涂布在含由能够被所述多肽抑制的酶的琼脂上，由此可以鉴定出表达多肽的克隆。
再者，也可以通过已建立的标准方法通过合成来制备编码所述多肽的核苷酸序列，如Beucage S.L.等(1981)Tetrahedron Letters 22，p 1859-1869描述的亚磷酰胺法，或Matthes等(1984)EMBO J.3，p 801-805描述的方法。在亚磷酰胺法中，在如自动DNA合成仪上合成寡核苷酸，然后将其纯化、退火、连接并克隆到适当的载体中。
所述核苷酸序列可以是源自基因组片段和合成片段的连接物、源自合成片段和cDNA片段的连接物、或源自基因组片段和cDNA片段的连接物，其根据标准技术通过连接源自合成的、基因组的或cDNA的片段(根据需要)而制得。每个连接的片段对应于整个核苷酸序列的不同部分。所述DNA序列也可以使用特定引物通过聚合酶链式反应(PCR)来制备，如US4,683,202或Saiki R K等(Science(1988)239，pp 487-491)中所述。
核苷酸序列
本发明还涵盖编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列。本文所用的术语“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列和其变体、同源物、片段和衍生物(如其部分)。所述核苷酸序列可以是源自基因组或合成物或重组物的，其可以是双链的或单链的(无论其代表正义链还是反义链)。
本发明的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成的DNA和RNA。优选地，其指DNA，更优选为编码序列的cDNA。
在优选的实施方案中，编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列不涵盖在天然环境中存在的并与其天然相连序列(同处于其天然环境中)连接的天然核苷酸序列。为了便于参考，我们将此优选实施方案称为“非天然核苷酸序列”。由此，术语“天然核苷酸序列”是指与其天然相连的完整启动子(同处于其天然环境中)可操作地连接的完整核核苷酸序列(同处于其天然环境中)。因此，本发明的多肽可以利用核苷酸序列在其天然生物体中表达，但是其中所述核苷酸序列不受所述生物体中与其天然结合的启动子的控制。
优选地，所述多肽不是天然多肽。由此，术语“天然多肽”是指处于其天然环境中并已经被其天然核苷酸序列表达的整个多肽。
通常，使用重组DNA技术制备编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列(即重组的DNA)。然而，在本发明的另一个具体实施方案中，可以使用本领域已知的化学方法来合成全部或部分核苷酸序列(参见Caruthers MH等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23和Horn T等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。
分子进化
分离出编码酶的核苷酸序列或鉴定出编码推定酶的核苷酸序列后，就可能需要对所选择的核苷酸序列进行修饰，例如需要对所述序列进行突变以制备本发明的酶。
可以使用合成的寡核苷酸来引入突变。这些寡核苷酸包含目标突变位点侧翼的核苷酸序列。
适合的方法公开在Morinaga等(Biotechnology(1984)2，p646-649)。另一种向编码酶的核苷酸序列中引入突变的方法描述在Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，p 147-151)。
除了如上文所述的定点诱变，可以随机引入突变，如使用商品试剂盒，如来自Stratagene的GeneMorph PCR诱变试剂盒或来自Clontech的Diversify PCR随机诱变试剂盒。EP 0 583 265提到基于PCR的诱变的优化方法，其也可以结合使用DNA突变类似物，如EP 0 866 796中所述的那些。易错PCR技术也适用于制备具有优选的性质的脂酰基转移酶变体。WO0206457提到了脂肪酶的分子进化。
获得新型序列的第三种方法是使用任何数量的限制性酶或如Dnase I的酶来将不同的核苷酸序列片段化，并重新组装成编码功能性蛋白的全长核苷酸序列。或者，可以使用一个或多个不同的核苷酸序列，并在重新组装全长核苷酸序列时引入突变。DNA改组(shuffling)和家族改组技术适用于制备具有优选性质的脂酰基转移酶变体。适合进行“改组”的方法可以参见EP0 752 008、EP1 138 763、EP1 103 606。改组也可以与如US6,180,406和WO 01/34835中所述的其它形式的DNA诱变相结合。
因此，有可能在体内或在体外使核苷酸序列中产生大量定点突变或随机突变，并随后通过多种手段筛选功能性得到改进的编码多肽。使用例如in silico和exo介导的重组方法(参见WO 00/58517、US 6,344,328、US6,361,974)，可以进行分子进化，其中所产生的变体保留了与已知酶或蛋白的很低同源性。由此获得的所述变体可与已知的转移酶具有显著的结构类似性，但却具有很低的氨基酸序列同源性。
此外，如在非限定性实施例中，多核苷酸序列的突变或天然变体也可以与野生型或其它突变或天然变体重组以生产新的变体。也可以筛选所述新的变体以获得功能性得到改进的编码多肽。
应用以上以及类似的分子进化方法能够在没有关于蛋白结构或功能的任何现有知识的情况下鉴定和选择具有优选特性的本发明的酶变体，并能够产生不可预测的但有益的突变或变体。在本领域中应用分子进化来优化或改变酶活性的例子有很多，所述例子包括但不限于以下的一种或多种：优化在宿主细胞或体外的表达和/或活性、增加酶活性、改变底物和/或产物特异性、增加或降低酶稳定性或结构稳定性、改变在优选环境条件(如温度、pH、底物)中酶的活性/特异性。
使用分子进化工具可以对酶进行改变以提高该酶的功能性，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
适合地，用于本发明的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码脂酰基转移酶变体，即当与亲本酶比较时，所述脂酰基转移酶可以包含至少一个氨基酸的取代、缺失或加入。变体酶与亲本酶保持至少1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％的同源性。适合的亲本酶可以包括具有酯酶或脂肪酶活性的任何酶。优选地，亲本酶对应于pfam00657共有序列。
在优选的实施方案中，脂酰基转移酶变体保留或掺入了在GDSx、GANDY和HPT部分中发现的至少一个或多个pfam00657共有序列氨基酸残基。
可以使用分子进化工具使酶(如在含水环境中没有或具有低脂酰基转移酶活性的脂肪酶)突变，以引入或增强转移酶活性，有此生产适合用于本发明的组合物和方法的具有显著转移酶活性的脂酰基转移酶。
适合地，用于本发明载体、宿主细胞、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以是变体，与亲本酶相比，该变体对极性脂质(优选为磷脂和/或糖脂)具有增强的酶活性。优选地，所述变体还可以对可溶性极性脂质(lyso polar lipids)具有低活性或无活性。对极性脂质、磷脂和/或糖脂的增强的活性可能是由于水解和/或转移酶活性或二者组合的结果。
与亲本酶相比，所述脂酰基转移酶变体对甘油三酯和/或甘油单酯和/或甘油二酯的活性可以降低。
适合地，所述酶变体对甘油三酯、和/或甘油单酯和/或甘油二酯可以没有活性。
或者，所述酶变体对甘油三酯的活性可以增加，和/或对以下的一种或多种的活性也可以增加：极性脂质、磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱、糖脂、二半乳糖基甘油单酯、单半乳糖基甘油单酯。
脂酰基转移酶变体是已知的，且一种或多种所述变体可以适用于本发明的方法和应用，和/或本发明的酶组合物。仅举例来说，根据本发明可以使用以下文献中阐述的脂酰基转移酶变体：Hilton & Buckley J Biol.Chem.1991 Jan 15：266(2)：997-1000；Robertson等J.Biol.Chem.1994 Jan 21；269(3)：2146-50；Brumlik等J.Bacteriol 1996 Apr；178(7)：2060-4；Peelman等Protein Sci.1998 Mar；7(3)：587-99。
氨基酸序列
本发明还涵盖由用于本发明载体、宿主细胞、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。
本文所使用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白”同义。在一些实例中，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。
所述氨基酸序列可以从适合的来源制备/分离，或其可以通过合成制备、或其可以使用重组DNA技术制备。
适合地，所述氨基酸序列可以通过标准技术从本文教导的分离多肽中获得。
一种适合测定分离多肽的氨基酸序列的方法如下：
可以将纯化的多肽冻干，并将100μg的冻干原料溶解于8M尿素和0.4M碳酸氢铵的50μl混合物(pH 8.4)中。在覆盖氮气并加入5μl 45mM二硫苏糖醇后，可以将溶解的蛋白在50℃变性并还原15分钟。冷却至室温后，可以加入5μl 100mM碘乙酰胺，从而使半胱氨酸残基在室温、避光和氮气下衍生15分钟。
可以向以上反应混合物中加入135μl水和含5μg内切蛋白酶Lys-C的5μl水溶液，并在氮气下在37℃进行24小时消化。
可以使用溶剂A(0.1％TFA的水溶液)和溶剂B(0.1％TFA的乙腈溶液)在VYDAC C18柱(0.46x15cm；10μm；The Separation Group，California，USA)上通过反向HPLC分离所得到的肽。在N末端测序前，可以使用相同的溶剂体系在Develosil C18柱上对所选择的肽进行重新层析。可以使用Applied Biosystems 476A测序仪，根据生产商的说明书(Applied Biosystems，California，USA)使用脉冲液态快速循环来完成测序。
序列同一性或序列同源性
在此，术语“同源物”是指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可以等同于“同一性”。
所述同源氨基酸序列和/或核苷酸序列可以提供和/或编码保留所述酶的功能活性和/或增强所述酶的活性的多肽。
在本文中，认为同源序列包括可以与主题序列有至少75、85或90％同一性，优选为至少95或98％同一性的氨基酸序列。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。虽然同源性也可以被看作为相似性(即氨基酸残基具有相似的化学性质/功能)，在本发明的内容中，在序列同一性方面优选用同源性来表达。
在本文中，认为同源序列包括可以与编码本发明多肽的核苷酸序列(主题序列)有至少75、85或90％同一性的核苷酸序列，优选为至少95或98％同一性的核苷酸序列。通常，同源物将包括与主题序列相同的活性位点编码序列等。虽然同源性也可以被看作为相似性(即氨基酸残基具有相似的化学性质/功能)，在本发明的内容中，在序列同一性方面优选用同源性来表达。
可以通过目测进行同源性比较，或者更通常是借助易于获得的序列比较程序进行同源性比较。这些商业性计算机程序可以计算两个或多个序列间的同源性％。
可以在连续的序列中计算同源性％，即一个序列与其它序列比对，且将一个序列中的每个氨基酸与其它序列中的相应氨基酸直接比较，每次一个残基。这种称为“无缺口”比对。通常所述无缺口比对仅在数量相对少的残基中进行。
虽然这是非常简单且可靠的方法，但是其未能考虑到如在其它方面相同的成对序列中，一个插入或缺失将引起随后的氨基酸残基无法比对，因此可能在进行整体比对时导致同源性％的大大降低。因此，大部分序列比对方法被设计成在考虑可能的插入和缺失的情况下产生最佳的比对，而不过度地处罚整体同源性的得分。这可以通过在序列中插入“缺口”以设法将局部同源性最大化而实现的。
然而，这些更加复杂的方法给比对中出现的每个缺口赋予“缺口罚分”，使得对于相同数目的相同氨基酸，具有尽量少缺口的序列比对(反映了两个比较的序列间更高的相关性)将比具有更多缺口的序列比对具有更高的得分。通常使用“仿射缺口代价”(Affine gap costs)，即对缺口的存在处以较高代价，而对缺口中的每个后续残基处以较小罚分。这是最常用的缺口评分系统。高缺口罚分将无疑将产生具有更少缺口的优化比对。大多数比对程序允许修正缺口罚分。然而，当使用所述软件进行序列比较时，优选使用默认值。
因此，最大同源性％的计算首先需要在考虑缺口罚分下产生最佳的比对。适合用于进行所述比对的计算机程序为Vector NTI(Invitrogen Corp.)。可以进行序列比较的其它软件的实例包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel等1999 Short Protocols in Molecular Biology，4th Ed，Chapter 18)和FASTA(Altschul等1990 J.Mol.Biol.403-410)。BLAST和FASTA均可进行离线和在线搜索(参见Ausubel等1999，7-58页至7-60页)。然而，对于一些应用，优选使用Vector NTI程序。也可以将称为BLAST 2 Sequences的新型工具用于比较蛋白和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 1999174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)：187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。
虽然根据同一性来测定最终的同源性％，但是比对方法本身通常不是基于全是或全非成对比较。而是，通常使用大规模相似性评分矩阵(scaledsimilarity score matrix)，基于化学相似性或进化距离对每对比较评分。通常所用的此矩阵的实例为BLOSUM62矩阵(BLAST程序套的默认矩阵)。Vector NTI程序通常使用公开的默认值，或者也可能提供的自定义的符号比较表(详见用户手册)。对于一些应用，优选使用VectorNTI软件包的默认值。
或者，也可以使用基于与CLUSTAL(Higgins DG & Sharp PM(1988)，Gene 73(1)，237-244)类似的算法的Vector NTI(Invitrogen Corp.)中的多重比对特征来计算同源性％。
一旦软件生成了最佳比对，就可以计算同源性％，优选为序列同一性％。软件通常将其作为序列比较的一部分来执行，并生成数值结果。
如果在测定序列同一性时使用缺口罚分，随后优选使用以下参数进行成对比对：
| BLAST | |
| 缺口开口 | 0 |
| 缺口延伸 | 0 |
| CLUSTAL | DNA | 蛋白 | |
| 字长(WORD SIZE) | 2 | 1 | K三联体 |
| 缺口罚分 | 15 | 10 | |
| 缺口延伸 | 6.66 | 0.1 |
在一个实施方案中，优选使用具有以上定义的缺口罚分和缺口延伸值的CLUSTAL来测定核苷酸序列的序列同一性。
适合地，在至少20个连续的核苷酸中、优选为在至少30个连续的核苷酸中、优选为在至少40个连续的核苷酸中、优选为在至少50个连续的核苷酸中、优选为在至少60个连续的核苷酸中、优选为在至少100连续的核苷酸中测定核苷酸序列的同一性程度。
适合地，在全序列中测定核苷酸序列中的同一性程度。
在一个实施方案中，本发明的氨基酸序列的同一性程度可以通过本领域已知的计算机程序的方法，如Vector NTI 10(Invitrogen Corp.)来适当地测定。对于成对比对，所用的矩阵优选为缺口开口罚分为10.0且缺口延伸罚分为0.1的BLOSUM62。
适合地，在至少20个连续的氨基酸中、优选为在至少30个连续的氨基酸中、优选为在至少40个连续的氨基酸中、优选为在至少50个连续的氨基酸中、优选为在至少60个连续的氨基酸中测定氨基酸序列的同一性程度。
适合地，在全序列中测定氨基酸序列的同一性程度。
所述序列也可以具有产生沉默改变和产生功能等同物的氨基酸残基的缺失、插入或取代。可以根据残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质上的相似性来进行谨慎的氨基酸取代，只要保持该物质的次要结合活性即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电荷的极性头基团(polar head groups)的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
例如可以根据下表进行保守取代。在第二列中相同栏中的氨基酸，优选为在第三列中相同行中的氨基酸可以相互取代：
本发明还涵盖可以发生的同源取代(本文所用的取代和替换均指现存氨基酸残基与备选残基的互换)，即相似取代，如碱性氨基酸取代碱性氨基酸、酸性氨基酸取代酸性氨基酸、极性氨基酸取代极性氨基酸等。也可以发生非同源取代，即从一类残基变成另一类残基，或涉及非天然氨基酸，如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯甘氨酸。
也可以使用非天然氨基酸进行替换。
氨基酸变体序列可以包含可以在序列的任何两个氨基酸残基间插入的适合的间隔子基团，除氨基酸间隔子如甘氨酸或β-丙氨酸残基外，还包括烷基基团如甲基、乙基或丙基基团。本领域的技术人员将理解其它形式的变异，其涉及以类肽(peptoid)形式存在的一个或多个氨基酸残基。为了避免争议，“类肽形式”用来指α-碳取代基基团在残基的氮原子上而非在α-碳上的氨基酸残基变体。制备类肽形式的肽的方法是本领域内已知的，如Simon RJ等，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，TrendsBiotechnol.(1995)13(4)，132-134。
本发明所使用的或编码具有本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列可以在其内部包含合成的或修饰的核苷酸。本领域中已知对寡核苷酸的许多不同类型的修饰。这些修饰包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链和/或在分子的3’末端和/或5’末端添加吖啶或多赖氨酸链。出于本发明的目的，应该理解可以用本领域中的任何方法来修饰本文所述的核苷酸序列。可以进行所述修饰以增强核苷酸序列的体内活性或寿命。
本发明还涵盖与本文所讨论的序列或其任何衍生物、片段或衍生物互补的核苷酸序列的应用。如果序列与其片段互补，此序列可以被用作鉴定其它生物体中相似编码序列等的探针。
可以以多种方式获得与本发明的序列并非100％同源但却落入本发明范围中的多核苷酸。可以通过例如探查由一系列个体(如来自不同种群的个体)制备的DNA文库来获得本文所述序列的其它变体。此外，可以获得其它病毒/细菌或细胞的同源物，特别是发现于哺乳类细胞(如大鼠、小鼠、牛和灵长类细胞)中的细胞同源物，且所述同源物或其片段将通常能够选择性地与本文序列表中所示的序列杂交。可以通过探查从其它动物物种制备的cDNA文库或基因组DNA文库，且在中度至高度严谨条件使用包含所附序列表中任何一个序列的全部或部分的探针来探查所述文库来获得所述序列。类似的考虑用于获得本发明多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。
也可以使用简并PCR来获得变体和株系/物种同源物，所述简并PCR将使用设计为靶向变体和同源物中编码本发明序列中的保守氨基酸序列的序列。例如可以通过比对来自多个变体/同源物的氨基酸序列来预测保守序列。可以使用本领域已知的计算机软件进行序列比对。例如广泛使用GCGWisconsin PileUp程序。
简并PCR中所用的引物将包含一个或多个简并位点，且其使用条件的严谨性将低于通过针对已知序列的单一序列引物克隆序列的那些条件。
或者，也可以通过已表征序列的定点诱变来获得所述多核苷酸。例如当需要在表达多核苷酸序列的特定宿主细胞中改变沉默密码子序列以优化密码子偏爱性时，这可能是有用的。可能需要其它序列改变，以引入限制性多肽识别位点，或改变多核苷酸编码的多肽的性质或功能。
可以使用本发明的多核苷酸(核苷酸序列)来制备引物，如PCR引物，用于可选扩增反应的引物；探针，如使用放射性或非放射性标记物通过常规方法用显现标记物标记的探针；或可以将多核苷酸克隆到载体中。所述引物、探针和其它片段在长度上将为至少15个、优选为至少20个、如至少25个、30个或40个核苷酸，且其也被如本文所用的本发明的术语多核苷酸所涵盖。
可以重组、合成或通过本领域技术人员可利用的任何方法来制备根据本发明的多核苷酸(如DNA多核苷酸)和探针。它们也可以通过标准技术进行克隆。
通常，将通过合成方法来制备引物，该方法包括以每次一个核苷酸的方式逐步制备所需要的核酸序列。使用自动化技术来实现这一点的技术是本领域中易于获得的。
通常使用重组方法，如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术来制备更长的多核苷酸。这包括制备所需要克隆的脂质靶向序列区域侧翼的一对引物(如约15至30个核苷酸)，使引物接触从动物或人细胞获得的mRNA或cDNA，在可以使所需区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段(如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)，并回收扩增的DNA。可以设计引入使其包含适合的限制性酶识别位点，以便可以将扩增的DNA克隆到适合的克隆载体中。
杂交
本发明还涵盖与本发明的序列互补的序列，或能够与本发明的序列杂交或与其互补序列杂交的序列。
本文所用的术语“杂交”包括“一条核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程”，以及在聚合酶链式反应(PCR)技术中进行扩增的过程。
本发明还涵盖所述核苷酸序列的应用，所述核苷酸序列能够和与本文所讨论的主题序列、或其任何衍生物、片段或衍生物互补的序列杂交。
本发明还涵盖能够与本文所讨论的核苷酸序列杂交的序列的互补序列。
杂交条件基于核苷酸结合复合物的熔解温度(Tm)，如Berger和Kimmel(1987，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology，Vol.152，Academic Press，San Diego CA)中所教导，且赋予了下文所解释的定义的“严谨性”。
最高严谨性通常出现在约Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)；高严谨性出现在比Tm低约5℃至10℃；中等严谨性出现在比Tm低约10℃至20℃；且低严谨性出现在比Tm低约20℃至25℃。正如本领域技术人员所理解的是，最高严谨性杂交可以用于鉴定或检测相同的核苷酸序列，而中等(或低)严谨性杂交可以用于鉴定或检测相似或相关的多核苷酸序列。
优选地，本发明涵盖能够在高严谨性条件或中等严谨性条件下与编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列杂交的序列所互补的序列。
更优选地，本发明涵盖能够在高严谨性条件(如65℃和0.1xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠，pH 7.0})下与编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列发生杂交的序列的互补序列。
本发明还涉及能够与本文讨论的核苷酸序列(包括本文讨论的那些序列的互补序列)杂交的核苷酸序列。
本发明还涉及能够与本文讨论的核苷酸序列(包括本文讨论的那些序列的互补序列)杂交的序列的互补核苷酸序列。
本发明的范围还包括在中等至最高严谨性条件下能够与本文所讨论的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列。
在优选的方面，本发明涵盖在严谨性条件(如50℃和0.2xSSC)下能够与本文所讨论的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。
在更优选的方面，本发明涵盖在高严谨性条件(如65℃和0.1xSSC)下能够与本文所讨论的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。
多肽的表达
可以将用于本发明的或用于编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列引入重组的复制型载体中。载体可以用于在相容的宿主细胞中和/或从相容的宿主细胞复制并以多肽形式表达核苷酸序列。可以使用包含启动子/增强子和其它表达调控信号在内的控制序列来控制表达。可以使用原核生物的启动子和在真核细胞中有功能的启动子。可以使用组织特异的或刺激特异性启动子。也可以使用包含来自上述两个或更多不同启动子的序列元件的嵌合启动子。
根据所用的序列和/或载体，由宿主重组细胞通过表达核苷酸序列所产生的多肽可以被分泌，或被包含在细胞内。编码序列经过设计可以具有信号序列，该信号序列可指导物质的编码序列分泌通过特定的原核生物或真核细胞膜。
构建体
术语“构建体”，与术语如“结合物(或连接物)”、“盒(cassette)”和“杂合体(hybrid)”同义，其包含依照本发明使用的编码具有本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列，且其直接或间接地与启动子连接。间接连接的实例是在启动子和本发明的核苷酸序列之间提供适合的间隔基如内含子序列，如Sh1内含子或ADH内含子。术语“融合”在本文中也是如此，其包括直接或间接连接。在一些情况中，这些术语不涵盖编码所述蛋白的核苷酸序列与其通常连接的野生型基因启动子的天然组合，并且此时这两者均处于其天然环境中。
所述构建体甚至可以包含或表达允许选择基因构建体的标记物。
对于一些应用，优选构建体至少包含本发明的核苷酸序列，或编码具有如本文定义的特定性质的多肽且可操作地与启动子连接的核苷酸序列。
生物体
与本发明有关的术语“生物体”包括任何包含本发明的核苷酸序列或编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物的生物体。
与本发明有关的术语“转基因生物体”包括任何包含编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物的生物体，和/或其中启动子能够允许编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列在所述生物体内表达。优选核苷酸序列被引入到生物体的基因组中。
术语“转基因生物体”不涵盖在处于自身天然环境中并同时受到其同处于自身天然环境中的天然启动子控制的天然核苷酸编码序列。
因此，本发明的转基因生物体包括包含以下任何一种或组合的生物体：编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列、本文定义的构建体、本文定义的载体、本文定义的质粒、本文定的细胞或其产物。例如，所述转基因生物体还可以包含编码具有如本文定义的特定性质的多肽且受到启动子控制的核苷酸序列，其中所述启动子与脂酰基转移酶编码基因不是天然相连。
宿主细胞/生物体的转化
原核生物体宿主的转化为本领域所公知，例如参见Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，1989，Cold SpringHarbor Laboratory Press)。如果使用原核生物体宿主，则在转化前需要通过如去除内含子来适当地修饰核苷酸序列。
已知芽孢杆菌物种转化的各种方法。
分泌
通常，期望多肽被从表达宿主分泌到培养基中，由此可以更容易地回收酶。根据本发明，可以基于所需的表达宿主来选择分泌前导序列。本发明中也可以使用杂交信号序列。
不与天然的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列连接的分泌前导序列的典型实例为那些源于真菌淀粉葡萄糖苷酶(AG)基因(glaA-18个氨基酸和24个氨基酸两种形式，如来自曲霉菌属)、a-因子基因(酵母，如酵母属(saccharomyces)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)和汉逊酵母(Hansenula))或α-淀粉酶基因(芽孢杆菌)的序列。
检测
本领域已知多种用于检测和测定氨基酸序列表达的方法。实例包括酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和荧光活化的细胞分选(FACS)。
本领域技术人员已知多种标记物和偶联技术，且它们可以被用在各种核酸和氨基酸分析中。
许多公司如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)和US Biochemical Corp(Cleveland，OH)为这些步骤提供商业试剂盒和方法。
适合的报告分子或标记物包括那些放射性核素、酶、荧光剂、化学发光剂或显色剂，以及底物、辅助因子、抑制剂、磁性粒子等。教导这些标记物应用的专利包括US-A-3,817,837、US-A-3,850,752、US-A-3,939,350、US-A-3,996,345、US-A-4,277,437、US-A-4,275,149和US-A-4,366,241。
此外，可以如US-A-4,816,567中所示制备重组免疫球蛋白。
融合蛋白
在本发明的方法中，脂酰基转移酶可以作为融合蛋白来制备，如以便有助于其提取和纯化。融合蛋白配偶体(partners)的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录激活结构域)和β-半乳糖苷酶。在融合蛋白配偶体和目的蛋白序列间也可以包含蛋白水解切割位点以便于去除融合蛋白序列。优选地，融合蛋白将不会妨碍蛋白序列的活性。
Curr.Opin.Biotechnol.(1995)6(5)：501-6已经对大肠杆菌中的基因融合表达系统进行了综述。
在本发明的另一实施方案中，具有如本文定义的特定性质的多肽的氨基酸序列可以与非天然序列连接以编码融合蛋白。例如，对于为获得能够影响实质活性的试剂而进行的肽库筛选，编码这样的嵌合物可能是有用的，即它表达可被商购抗体所识别的非天然表位。
以下将参照附图和实施例仅以举例的方式描述本发明。
附图说明
图1显示了杀鲑气单胞菌成熟脂酰基转移酶突变体(GCAT)的氨基酸序列，该突变体具有Asn80Asp突变(注意，第80位氨基酸指在成熟序列中)(SEQ ID 16)；
图2显示了来自嗜水气单胞菌(ATCC#7965)的脂酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No.1)；
图3显示了来自第6版数据库的pfam00657共有序列(SEQ ID No.2)；
图4显示了从生物体嗜水气单胞菌获得的氨基酸序列(SEQ ID No.3)(P10480；GI：121051)；
图5显示了从生物体杀鲑气单胞菌获得的氨基酸序列(SEQ ID No.4)(AAG098404；GI：9964017)；
图6显示了从生物体天蓝色链霉菌A3(2)获得的氨基酸序列(SEQ IDNo.5)(Genbank登录号NP_631558)；
图7显示了从生物体天蓝色链霉菌A3(2)获得的氨基酸序列(SEQ IDNo.6)(Genbank登录号CAC42140)；
图8显示了从生物体酿酒酵母获得的氨基酸序列(SEQ ID No.7)(Genbank登录号P41734)；
图9显示了从生物体雷尔氏菌属获得的氨基酸序列(SEQ ID No.8)(Genbank登录号AL646052)；
图10显示了SEQ ID No.9。Scoe1为NCBI蛋白登录号CAB39707.1GI：4539178的保守的假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图11显示了如SEQ ID No.10所示的氨基酸。Scoe2为NCBI蛋白登录号CAC01477.1 GI：9716139的保守的假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图12显示了氨基酸序列(SEQ ID No.11)。Scoe3为NCBI蛋白登录号CAB88833.1 GI：7635996的公知分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图13显示了氨基酸序列(SEQ ID No.12)。Scoe4为NCBI蛋白登录号CAB89450.1 GI：7672261的公知分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图14显示了氨基酸序列(SEQ ID No.13)。Scoe5为NCBI蛋白登录号CAB62724.1 GI：6562793的公知脂蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图15显示了氨基酸序列(SEQ ID No.14)。Srim1为NCBI蛋白登录号AAK84028.1 GI：15082088的GDSL-脂肪酶[龟裂链霉菌]；
图16显示了来自杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.Salmonicida)(ATCC#14174)的脂酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No.15)；
图17显示了SEQ ID No.19。Scoe1为NCBI蛋白登录号CAB39707.1GI：4539178的保守的假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图18显示了用于嗜水气单胞菌脂酰基转移酶基因诱变的融合构建体的氨基酸序列(SEQ ID No.25)。下划线的氨基酸为木聚糖酶信号肽；
图19显示了来自链霉菌属的脂酰基转移酶的多肽序列(SEQ ID No.26)；
图20显示了来自喜热裂孢菌属的脂酰基转移酶的多肽序列(SEQ IDNo.27)；
图21显示了来自喜热裂孢菌属的脂酰基转移酶的多肽序列(SEQ IDNo.28)；
图22显示了来自Corynebacterium efficiens GDSx 300氨基酸的脂酰基转移酶的多肽序列(SEQ ID No.29)；
图23显示了来自Novosphingobium aromaticivorans GDSx 284氨基酸的脂酰基转移酶的多肽(SEQ ID No.30)；
图24显示了来自天蓝色链霉菌GDSx 269氨基酸的脂酰基转移酶的多肽(SEQ ID No.31)；
图25显示了来自灰色链霉菌/GDSx 269氨基酸的脂酰基转移酶的多肽(SEQ ID No.32)；
图26显示了来自链霉菌属的脂酰基转移酶的多肽(SEQ ID No.33)；
图27显示了从生物体嗜水气单胞菌获得的氨基酸序列(SEQ ID No.34)(P10480；GI：121051)(注意，其为成熟序列)；
图28显示了杀鲑气单胞菌成熟脂酰基转移酶突变体(GCAT)的氨基酸序列(SEQ ID 35)(注意，其为成熟序列)；
图29显示了来自Streptomyces thermosacchari的核苷酸序列(SEQ IDNo.36)；
图30显示了来自Streptomyces thermosacchari的核苷酸序列(SEQ IDNo.37)；
图31显示了来自褐色喜热裂孢菌/GDSx 548氨基酸的氨基酸序列(SEQ ID No.38)；
图32显示了来自褐色喜热裂孢菌的核苷酸序列(SEQ ID No.39)；
图33显示了来自褐色喜热裂孢菌/GDSx的氨基酸序列(SEQ ID No.40)；
图34显示了来自Corynebacterium efficiens/GDSx 300氨基酸的氨基酸序列(SEQ ID No.41)；
图35显示了来自Corynebacterium efficiens的核苷酸序列(SEQ ID No.42)；
图36显示了来自天蓝色链霉菌/GDSx 268氨基酸的氨基酸序列(SEQID No.43)；
图37显示了来自天蓝色链霉菌的核苷酸序列(SEQ ID No.44)；
图38显示了来自灰色链霉菌的氨基酸序列(SEQ ID No.45)；
图39显示了来自灰色链霉菌的核苷酸序列(SEQ ID No.46)；
图40显示了来自褐色喜热裂孢菌/GDSx的氨基酸序列(SEQ ID No.47)；
图41显示了来自褐色喜热裂孢菌/GDSx的核苷酸序列(SEQ ID No.48)；
图42显示了L131和来自灰色链霉菌和褐色喜热裂孢菌的同源物的比对，说明了GDSx基序(在L131以及灰色链霉菌和褐色喜热裂孢菌中均为GDSY)、GANDY框(其为GGNDA或GGNDL)和HPT部分(被认为是保守的催化组氨酸)的保守性。这三个保守部分有突出标记；
图43显示了来自近平滑假丝酵母脂酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ IDNo.17)；
图44显示了来自近平滑假丝酵母脂酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ IDNo.18)；
图45显示了活性位点中具有甘油的1IVN.PDB晶体结构的带状显示图。此图使用Deep View Swiss-PDB viewer制作。
图46显示了活性位点中具有甘油的1IVN.PDB晶体结构的侧视图(使用Deep View Swiss-PDB viewer)，黑色部分为在活性位点甘油的
内的残基。
图47显示了活性位点中具有甘油的1IVN.PDB晶体结构的俯视图(使用Deep View Swiss-PDB viewer)，黑色部分为在活性位点甘油的
内的残基。
图48显示了比对1；
图49显示了比对2；
图50和51显示了1IVN与P10480的比对(P10480为嗜水气单胞菌酶数据库序列)，此比对从PFAM数据库获得并用在模型构建过程中；和
图52显示了比对，其中P10480为嗜水气单胞菌数据库序列。此序列用于模型构建和位点选择。注意绘制出了完整的蛋白(SEQ ID No.25)，成熟蛋白(等价于SEQ ID No.34)起始于第19位残基。A.sal为杀鲑气单胞菌的GDSX脂肪酶(SEQ ID No.4)，A.hyd为嗜水气单胞菌的GDSX脂肪酶(SEQ ID No.34)。所列序列间的差异位置在共有序列中用*表示。
图53显示了用在实施例1中的基因构建体；
图54显示了用在实施例1中的密码子优化的基因构建体(no.052907)；和
图55显示了包含LAT-KLM3’前体基因的XhoI插入物的序列，下划线处为-35和-10框；
图56显示了在三丁酸甘油酯琼脂上于37℃生长48小时后的BML780-KLM3’CAP50(包含SEQ ID No.16-上面的菌落)和BML780(空宿主菌株-下面的菌落)。
图57显示了来自杀鲑气单胞菌的包含信号序列(前LAT-从第1位至第87位)的核苷酸序列(SEQ ID No.49)；
图58显示了从生物体嗜水气单胞菌获得的本发明的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.50)；
图59显示了从生物体杀鲑气单胞菌获得的本发明的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.50)；
图60显示了从生物体天蓝色链霉菌A3(2)获得的本发明的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.52)(Genbank登录号NC_003888.1：8327480..8328367)；
图61显示了从生物体天蓝色链霉菌A3(2)获得的本发明的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.53)(Genbank登录号AL939131.1：265480..266367)；
图62显示了从生物体灰色链霉菌获得的本发明的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.54)(Genbank登录号Z75034)；
图63显示了从生物体雷尔氏菌属获得的本发明的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.55)；
图64显示了如SEQ ID No.56所示的核苷酸序列，其编码NCBI蛋白登录号CAB39707.1 GI：4539178的保守的假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图65显示了如SEQ ID No.57所示的核苷酸序列，其编码Scoe2，NCBI蛋白登录号CAC01477.1 GI：9716139的保守的假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图66显示了如SEQ ID No.58所示的核苷酸序列，其编码Scoe3，NCBI蛋白登录号CAB88833.1 GI：7635996的公知分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图67显示了如SEQ ID No.59所示的核苷酸序列，其编码Scoe4，NCBI蛋白登录号CAB89450.1 GI：7672261的公知分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图68显示了如SEQ ID No.60所示的核苷酸序列，其编码Scoe5，NCBI蛋白登录号CAB62724.1 GI：6562793的公知脂蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图69显示了如SEQ ID No.61所示的核苷酸序列，其编码Srim1，NCBI蛋白登录号AAK84028.1 GI：15082088 GDSL-脂肪酶[龟裂链霉菌]；
图70显示了来自嗜水气单胞菌(ATCC#7965)的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.62)；
图71显示了来自杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(ATCC#14174)的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.63)；和
图72显示了来自嗜水气单胞菌的编码包含木聚糖酶信号肽的酶的核苷酸序列(SEQ ID No.24)。
实施例1
地衣芽孢杆菌中KLM3’的表达
编码脂酰基转移酶(SEQ.ID No.16，下文称为KLM3’)的核苷酸序列(SEQ ID No.49)在地衣芽孢杆菌中作为融合蛋白被表达，所述融合蛋白具有地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(LAT)的信号肽(参见图53和54)。为了优化在芽孢杆菌中的表达，从Geneart(Geneart AG，Regensburg，Germany)订购了密码子优化的基因构建体(no.052907)。
构建体no.052907包含位于LAT-KLM3’前体基因之前的不完全LAT启动子(仅-10序列)和LAT-KLM3’前体基因下游的LAT转录物(Tlat)(参加图53和55)。为了构建包含5’末端侧翼具有完全LAT启动子、3’末端侧翼具有LAT终止子的LAT-KLM3’前体基因的XhoI片段，Plat5XhoI_FW和EBS2XhoI_RV为引物，基因构建体052907作为模板进行PCR(聚合酶链式反应)扩增。
Plat5XhoI_FW：
ccccgctcgaggcttttcttttggaagaaaatatagggaaaatggtacttgttaaaaattc
ggaatatttatacaatatcatatgtttcacattgaaagggg
EBS2XhoI_RV：tggaatctcgaggttttatcctttaccttgtctcc
在热循环仪上，根据生产商的说明书(退火温度55℃)使用Phusion高保真度DNA聚合酶(Finnzymes OY，Espoo，Finland)来进行PCR。
根据生产商的说明书(Invitrogen，Carlsbad，Calif.USA)，所得PCR片段用限制性酶XhoI消化，并使用T4 DNA连接酶将其连接到XhoI消化过的pICatH中。
如美国专利申请US20020182734(国际公布WO 02/14490)所述，将连接混合物转化到枯草芽孢杆菌菌株SC6.1中。通过DNA测序确定包含LAT-KLM3’前体基因的XhoI插入物的序列(BaseClear，Leiden，TheNetherlands)，并将其中的一个正确质粒克隆命名为pICatH-KLM3’(ori1)(图53)。在许可的温度(37℃)下将pICatH-KLM3’(ori1)转化地衣芽孢杆菌菌株BML780(BRA7和BML612的衍生物，参见WO2005111203)中。
选择一个新霉素抗性(neoR)和氯霉素抗性(CmR)的转化株并将其命名为BML780(plCatH-KLM3’(ori1))。通过在非许可温度(50℃)下、于含有5μg/ml氯霉素的培养基中培养菌株，使BML780(plCatH-KLM3’(ori1))中的质粒整合到地衣芽孢杆菌基因组的catH区中。选择一个CmR抗性克隆并命名为BML780-plCatH-KLM3’(ori1)。再次在许可温度、没有抗生素的情况下培养BML780-plCatH-KLM3’(ori1)数代，以使载体序列环出(loop-out)，并随后选择一个新霉素敏感(neoS)的CmR克隆。在此克隆中，染色体上的plCatH载体序列被切除(包括新霉素抗性基因)，并只剩下catH-LATKLM3’盒。随后，通过使菌株在氯霉素浓度增加的培养基中/上生长来扩增染色体上的catH-LATKLM3’盒。在扩增数轮后，选择一个克隆(抗50μg/ml氯霉素)，并将其命名为BML780-KLM3’CAP50。为了确定KLM3’表达，使BML780-KLM3’CAP50和BML780(空宿主菌株)在添加有1％三丁酸甘油酯的Heart Infusion(Bacto)琼脂培养板上于37℃下培养48小时。清晰的区域(指示脂酰基转移酶活性)在BML780-KLM3’CAP50菌落周围而非宿主菌株BML780周围清晰可见(参见图56)。此结果显示KLM3’在地衣芽孢杆菌菌株BML780-KLM3’CAP50中被大量的表达，且这些KLM3’分子是有功能的。
比较例1
载体构建体
所述质粒构建体为pCS32new N80D，其为携带有第80位氨基酸由Asn取代成Asp的成熟形式的天然杀鲑气单胞菌甘油磷酸酯-胆固醇酰基转移酶的编码序列的pCCmini衍生物(KLM3′)，其在p32启动子的控制下并具有CGTase信号序列。
用于表达的宿主菌株为枯草芽孢杆菌OS21ΔaprE菌株。
以用酯化胆固醇的百分数表示的转移酶活性来计算表达水平，在PC(TPC)为供体和胆固醇为受体分子的反应中，根据参比样品中游离胆固醇和酶样品中游离胆固醇的差值来计算。
培养条件
将单一菌落接种在添加有50mg/l卡那霉素的5ml的LB肉汤培养基(酪蛋白酶促消化物，10g/l；低钠酵母提取物，5g/l；氯化钠，5g/l；惰性片化助剂(Inert tableting aids)，2g/l)中，并将LB肉汤培养基中于205rpm下、30℃孵育6小时。将0.7ml此培养物接种到添加有50mg/l卡那霉素和高麦芽糖淀粉水解物溶液(60g/l)的50ml SAS培养基(K2HPO4，10g/l；MOPS(3-吗啡啉丙烷磺酸)，40g/l；氯化钠，5g/l；消泡剂(Sin 260)，5滴/l；脱脂豆粉，20g/l；Biospringer 106(100％dw YE)，20g/l)中。在30℃和180rmp下继续孵育40小时，随后以19000rpm离心30分钟来分离培养物上清液。将上清液转移到清洁试管并直接用于转移酶活性测定。
底物的制备和酶促反应
以9∶1的比例称量PC(Avanti Polar Lipids #441601)和胆固醇(SigmaC8503)，将其溶解在氯仿中，并蒸发至干燥。
通过将3％PC和胆固醇(9∶1)分散到50mM Hepes缓冲液(pH 7)中来制备底物。
将0.250ml底物溶液转移到带有螺纹盖的3ml玻璃试管中。加入0.025ml培养物上清液并将混合物在40℃下孵育2小时。用水代替酶来制备参比样品。将反应混合物在沸水浴中加热10分钟来终止酶反应。进行胆固醇试验分析前向反应混合物中加入2ml 99％的乙醇。
胆固醇试验
将100μl底物在37℃下孵育5分钟，随后加入5μl酶反应样品并混合，其中所述底物为含有1.4U/ml胆固醇氧化酶(SERVA Electrophoresis GmbHcat.No 17109)、0.4mg/ml ABTS(Sigma A-1888)、6U/ml过氧化物酶(Sigma6782)的0.1M Tris-HCl(pH 6.6)和0.5％Triton X-100(Sigma X-100)溶液。将反应混合物继续孵育5分钟并测量OD405。根据对胆固醇标准溶液的分析计算胆固醇的含量，所述胆固醇标准溶液为含有0.4mg/ml、0.3mg/ml、0.20mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml和0mg/ml胆固醇的99％EtOH溶液。
结果
此表显示了8个单独表达培养物的平均值
以上说明书提到的全部出版物均通过引用并入本文。本发明所述方法和体系的各种修改和改变对本领域的技术人员来说都是显而易见的，并不脱离本发明的范围和精神。虽然本发明是根据具体优选的实施方案进行描述的，但是应该理解所主张的发明不仅限于所述具体实施方案。实际上，用于实施本发明的所述模式的各种修改对于生物化学和生物工程或相关领域的技术人员来说都是显而易见的，均应落入本发明权利要求书的范围。
Claims (35)
1、用于制备脂酰基转移酶的方法，包括以下步骤：
(i)提供地衣芽孢杆菌细胞；
(ii)用编码脂酰基转移酶的异源核苷酸序列转化所述地衣芽孢杆菌细胞；和
(iii)在启动子序列的控制下，在所述细胞中表达脂酰基转移酶。
2、如权利要求1所述的方法，其中，所述启动子序列与编码脂酰基转移酶的核苷酸序列不是天然连接。
3、如权利要求2所述的方法，其中，编码信号肽的核苷酸序列可操作地连接所述编码脂酰基转移酶的异源核苷酸序列。
4、如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述方法还包括分离/回收所述脂酰基转移酶的步骤。
5、如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述启动子序列与宿主细胞是同源的。
6、如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述启动子序列可以选自以下组成的组：α-淀粉酶启动子序列、蛋白酶启动子序列、枯草杆菌蛋白酶启动子序列、谷氨酸特异性蛋白酶启动子序列和果聚糖蔗糖酶启动子序列。
7、如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述启动子序列为α-淀粉酶启动子序列。
8、如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述编码脂酰基转移酶的核苷酸序列编码包含GDSx基序和/或GANDY基序的脂酰基转移酶。
9、如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述编码脂酰基转移酶的核苷酸序列编码如下所述的脂酰基转移酶，该脂酰基转移酶的特征在于其是具有酰基转移酶活性并包含氨基酸序列基序GDSX的酶，其中X是以下氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S。
10、如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述编码脂酰基转移酶的核苷酸序列编码如下所述的脂酰基转移酶，该脂酰基转移酶可以从一种或多种以下属的生物体中获得：气单孢菌属、链霉菌属、酵母菌属、乳球菌属、分支杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、脱亚硫酸菌属、芽孢杆菌、弯曲菌属、弧菌科、木杆菌属、硫化叶菌属、曲霉属、裂殖酵母属、李斯特菌属、奈瑟菌属、中慢生根瘤菌属、雷尔氏菌属、黄单胞菌属和念珠菌属。
11、如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述编码脂酰基转移酶的核苷酸序列编码可以从来自气单孢菌属的生物体获得的脂酰基转移酶。
12、如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述编码脂酰基转移酶的核苷酸序列编码如下所述的脂酰基转移酶，该脂酰基转移酶在对应于SEQ ID No.35所示的嗜水气单胞菌脂酰基转移酶氨基酸序列的N-80的位置上包含天冬氨酸残基。
13、如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述编码脂酰基转移酶的核苷酸序列编码如下所述的脂酰基转移酶，该脂酰基转移酶包含SEQID No.16所示的氨基酸序列或与SEQ ID No.16具有至少75％同源性的氨基酸序列。
14、如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述编码脂酰基转移酶的核苷酸序列编码包含SEQ ID No.16所示的氨基酸序列的脂酰基转移酶。
15、包含编码异源脂酰基转移酶的核苷酸序列的地衣芽孢杆菌宿主细胞。
16、如权利要求14所述的宿主细胞，其中，所述编码脂酰基转移酶的核苷酸序列编码包含GDSx基序和/或GANDY基序的脂酰基转移酶。
17、如权利要求15或16所述的宿主细胞，其中，所述编码脂酰基转移酶的核苷酸序列编码如下所述的脂酰基转移酶，该脂酰基转移酶的特征在于其是具有酰基转移酶活性并包含氨基酸序列基序GDSX的酶，其中X是以下氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S。
18、如权利要求15-17中任一项所述的宿主细胞，其中，所述脂酰基转移酶可以从一种或多种以下属的生物体中获得：气单孢菌属、链霉菌属、酵母菌属、乳球菌属、分支杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、脱亚硫酸菌属、芽孢杆菌、弯曲菌属、弧菌科、木杆菌属、硫化叶菌属、曲霉属、裂殖酵母属、李斯特菌属、奈瑟菌属、中慢生根瘤菌属、雷尔氏菌属、黄单胞菌属和念珠菌属。
19、如权利要求15-17中任一项所述的宿主细胞，其中所述编码脂酰基转移酶的核苷酸序列编码可以从来自气单孢菌属的生物体中获得的脂酰基转移酶。
20、如权利要求15-19中任一项所述的宿主细胞，其中，所述编码脂酰基转移酶的核苷酸序列编码如下所述的脂酰基转移酶，该脂酰基转移酶在对应于SEQ ID No.35所示的嗜水气单胞菌的脂酰基转移酶氨基酸序列的N-80的位置上包含天冬氨酸残基。
21、如权利要求15-20中任一项所述的宿主细胞，其中，所述编码脂酰基转移酶的核苷酸序列编码如下所述的脂酰基转移酶，该脂酰基转移酶包含SEQ ID No.16所示的氨基酸序列或与SEQ ID No.16具有75％或更高同源性的氨基酸序列。
22、如权利要求15-21中任一项所述的宿主细胞，其中，所述编码脂酰基转移酶的核苷酸序列编码包含SEQ ID No.16所示的氨基酸序列的脂酰基转移酶。
23、地衣芽孢杆菌宿主细胞在制备异源脂酰基转移酶中的应用。
24、如权利要求23所述的应用，其中，与枯草芽孢杆菌宿主细胞相比，在地衣芽孢杆菌宿主细胞中的表达得到提高。
25、包含编码脂酰基转移酶的核苷酸序列的表达载体，其中，所述核苷酸序列可操作地连接与地衣芽孢杆菌同源的启动子序列。
26、如权利要求25所述的表达载体，其中，所述启动子不与编码脂酰基转移酶的核苷酸序列天然连接。
27、如权利要求25或26所述的表达载体，其中，编码信号肽的核苷酸序列可操作地连接所述编码脂酰基转移酶的异源核苷酸序列。
28、如前述任一项权利要求所述的表达载体，其中，所述启动子序列可以选自以下组成的组：α-淀粉酶启动子序列、蛋白酶启动子序列、枯草杆菌蛋白酶启动子序列、谷氨酸特异性蛋白酶启动子序列和果聚糖蔗糖酶启动子序列。
29、如前述任一项权利要求所述的表达载体，其中，所述启动子序列为α-淀粉酶启动子序列。
30、用于制备脂酰基转移酶的方法，包括以下步骤：
(i)提供芽孢杆菌细胞，其中所述芽孢杆菌细胞为除枯草芽孢杆菌之外的一种；
(ii)用编码脂酰基转移酶的异源核苷酸序列转化芽孢杆菌细胞，其中所述芽孢杆菌细胞为除枯草芽孢杆菌之外的一种；和
(iii)在启动子序列的控制下，在所述细胞中表达脂酰基转移酶。
31、芽孢杆菌宿主细胞，其中，所述芽孢杆菌细胞为除枯草芽孢杆菌之外的一种，其包含编码异源脂酰基转移酶的核苷酸序列。
32、芽孢杆菌宿主细胞在制备异源脂酰基转移酶中的应用，其中，所述芽孢杆菌宿主细胞为除枯草芽孢杆菌之外的一种。
33、参照实施例和附图基本如前所述的应用。
34、参照实施例和附图基本如前所述的表达载体。
35、参照实施例和附图基本如前所述的地衣芽孢杆菌宿主细胞。
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