CN101595227A

CN101595227A - 核酸大小检测方法

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Publication number: CN101595227A
Application number: CNA2007800451729A
Authority: CN
Inventors: D·黄; C·M·思特罗姆; S·J·波茨; J·E·鲁克
Original assignee: US Genomics Inc; Quest Diagnostics Investments LLC
Current assignee: US Genomics Inc; Quest Diagnostics Investments LLC
Priority date: 2006-10-05
Filing date: 2007-04-11
Publication date: 2009-12-02
Also published as: WO2008045136A3; WO2008045136A2; US20080124709A1; US8163480B2; CA2665723A1; ATE515573T1; EP2082055A2; AU2007307320B2; US8697399B2; JP5386357B2; BRPI0720549A2; US20100167284A1; EP2082055A4; JP2010505413A; AU2007307320A1; MX2009003736A; EP2082055B1

Abstract

本发明提供了通过DNA断裂(片段化)、大小分级、任选的第二次断裂和使用标记序列进行鉴定，从而确定在核酸样品中感兴趣的特定核酸区段的大小的方法。在特定方面，能够检测串联重复序列的扩增或者减少。在进一步的方面，可以将携带者或受脆性X综合症或其它与串联重复相关的疾病侵袭的个体与正常个体区别开来。

Description

核酸大小检测方法

发明领域

【0001】本发明大体上涉及医学诊断领域。特别是，本发明涉及检测特征为串联重复序列增殖的基因突变的方法。

发明背景

【0002】在DNA中串联重复代表两个或两个以上连续的近似拷贝的核苷酸模式。串联重复已经显示出了与多种人类疾病的起因有关。三核苷酸重复序列的急剧增殖已发现与这些疾病有关，如脆性X智力迟钝(参见Verkerk等，(1991)Cell，65，905-914)、亨廷顿氏症(参见Huntington′s Disease Collaborative Research Group.(1993)Cell，72，971-983)、强直性肌营养不良症(参见Fu等，(1992)Science，255，1256-1258)、脊髓和延髓肌萎缩症(参见La Spada等，(1991)Nature，352，77-79)和弗里德赖希型共济失调(参见Campuzano等，(1996)Science，271，1423-1427)。

【0003】脆性X综合症是遗传性智力迟钝的最常见的原因之一，在1250个男性(雄性)中大约出现1个，在2500个女性(雌性)中大约出现一个。具有脆性X综合症的男性通常表现出一定程度的智力损害，在从学习障碍到智力迟钝到孤独症的范围内变化。还可表现出典型的身体特征(例如增大的耳朵、有突出下巴的拉长的脸)、结缔组织问题(如二尖瓣脱垂和双关节手指)和典型的行为(如注意力缺陷障碍、言语错乱和对各种触觉、听觉或视觉刺激的不寻常反应)。受侵袭女性显示出与那些受侵袭男性类似的智力损害、身体特征和行为特征，但是较为轻微。

【0004】造成脆性X综合症的突变涉及位于X染色体上FMR1基因5’非翻译区的三核苷酸(CGG)串联重复序列的增殖。在FMR1基因中，CGG重复数目决定一个人是否正常或是否具有两类突变：前突变和全突变中的一种。在正常、非携带个体中重复数目范围少于55个重复，而前突变由55到200个重复组成，全突变由200以上个重复组成(Chen等。Hum.Mol.Genetics 12(23)：3067-74，2003)。

【0005】在一个FMR1基因中有前突变的男性和有前突变的女性都是携带者，然而不受侵袭。男性携带者被称为“正常传递的”男性，并以大小相对不变的方式将突变传递到每一个女儿。尽管这样的女儿不受侵袭，但是她们处于有受侵袭的后代的危险，因为在经过女性减数分裂途径之后，前突变可被扩增。而且，前突变越大，在任何一个后代中扩大到全突变的风险越高。

【0006】有全突变的大多数男性显示出智力迟钝和刻板的身体以及行为特征。对在一个FMR1基因中有全突变的女性，约三分之一显示出正常智力，约三分之一显示出临界智力，大约有三分之一显示出智力迟钝。

【0007】目前，用于筛选具有串联重复区域扩增如脆性X的携带者或受侵袭个体的行业标准是串联重复区域的PCR扩增和Southern印迹分析的结合。

发明概述

【0008】本发明的一个方面，提供在核酸样品中确定一个感兴趣的特定核酸区段(segment)的大小的方法。这个方法通过如下完成：分离核酸片段(fragment)，其中从包含核酸的样品中制备片段，其中片段包括一些含有区段和标记序列的片段，其中分离是依照大小分离成部分(级分，fraction)中，在包含所述区段的片段将依照区段大小定位于所述部分的条件下进行，以及通过检测所述标记序列来鉴定包含所述区段的那些部分(一个或多个)，其中由鉴定到所述区段的组分确定所述区段大小。

【0009】这个方法适合于基本上任何感兴趣的核酸区段，然而该方法特别可改良用于确定这样的核酸区段的大小，该核酸区段例如难以通过利用扩增(例如PCR)整个核酸区段的方法测定大小。难以通过利用扩增整个核酸区段的方法测定大小的核酸区段例子包括具有高含量鸟嘌呤和胞嘧啶碱基的核酸区段、大的核酸区段和/或具有大量串联重复的核酸区段。在优选的实施方式中，感兴趣的特定核酸区段是串联重复的核酸序列。难以通过PCR扩增的核酸的长度一般大于50,000个碱基，更为典型地大于100,000个碱基，更为典型地大于150,000个碱基，或者超过200,000个碱基，乃至超过250,000个碱基。

【0010】在另外一方面，本发明方法用于确定来自于人样品中的特定核酸区段的大小，由此确定该个体的该特定核酸区段的大小是否具有异常，其中异常的原因是在特定核酸区段中的复制、添加或者删除。

【0011】在还有另外一方面，本发明提供了检测核酸样品中基因串联重复区段中的突变的方法，其中该突变的特征是与在野生型等位基因中的重复数量相比，重复数量增加。该方法通过如下完成：分离核酸片段，其中该片段从包含核酸的样品中制备，其中该片段包括一些包含串联重复区段和标记序列的片段，其中该分离是依照大小分离成为部分，这在包含串联重复区段的片段将依照所述串联重复区段的重复数量定位于所述部分的条件下进行，和通过检测所述标记序列来鉴定包含所述区段的那些部分。通过在其中片段是被识别的组分来确定在串联重复区段中的重复数量。将该重复数量与在相应的野生型等位基因中的数量相比较，其中重复数量比在野生型等位基因中的数量大则表示突变。

【0012】在某些实施方式中，本发明上述方面还包括确定突变是否是前突变或者全突变。通过比较来自于核酸样品的串联重复区段的重复数量与在相应的全突变等位基因中的数量来完成这种确定，其中比野生型等位基因大但是比全突变小的重复数量表示是前突变等位基因，重复数量大于或者等于全突变表示是全突变等位基因。在其它实施方式中，在核酸样品的串联重复区域中的重复数量能与在野生型等位基因、前突变等位基因和全突变等位基因的每一个中所发现的重复数量进行比较。

【0013】在本发明以上的特定实施方式中，提供了在个体的核酸中识别具有正常串联重复数量、前突变或者全突变的FMR1等位基因的方法，其中该方法包括：

将来自个体样品中的核酸断裂成为片段，其中在片段中FMR1基因的重复串联区段与标记序列连接，

分离核酸片段，其中从包含核酸的个体样品制备片段，其中片段包括一些包含FMR1基因的重复串联区段和标记序列的片段，依照大小分离成部分，这在以下条件下进行：其中包含具有正常重复数量的串联重复区段的片段将定位在第一部分中，包含具有前突变的串联重复区段的片段将定位在第二部分中；和包含具有全突变的串联重复区域的片段将定位在第三部分中，

通过检测标记序列来鉴定包含所述区段的那些部分，其中通过在其中片段被鉴定的部分确定串联重复区段中的重复数量，其中，

在第一部分中的阳性结果表示个体具有拥有正常数量的串联重复的FMR1等位基因；

在第二部分中的阳性结果表示个体具有前突变FMR1等位基因；和

在第三部分中的阳性结果表示个体具有全突变FMR1等位基因。

【0014】在另外一方面，提供了用于检测特征在于基因的串联重复区段扩增或减少的遗传突变的携带者和诊断受由这种扩增所引起疾病折磨的个体的方法。如以上所描述地，该方法涉及检测特定基因的野生型等位基因、前突变等位基因和/或全突变等位基因。根据个体中存在的等位基因可随后确定基因型，从而能够指明正常、携带者或受侵袭的状况。

【0015】在这里所使用的“携带者”是携带了基因的突变或改变的等位基因，但是没有受到与突变相关的障碍或者疾病侵袭的个体。携带者能将突变传递到子女或者后代子孙，他们可能受到疾病或者障碍的侵袭。对脆性X综合症，男性和女性都可能是携带者。对于男性，在这里所使用的术语“携带者”与“前突变携带者”可交替地使用并且指的是有前突变等位基因的男性。对于女性，在这里所使用的术语携带者包括具有前突变等位基因或者全突变等位基因的女性。这样的女性携带者在这里也可指的是“前突变携带者”(也就是，具有前突变FMR1等位基因)或者“全突变携带者”(也就是，具有全突变FMR1等位基因)。

【0016】这里所使用“受侵袭的”指的是特定基因中具有一个或者多个突变的等位基因并显出了与突变相关的疾病或者障碍(也就是，表现型)的个体。对于脆性X综合症，具有全突变FMR1等位基因的男性是受侵袭的，而具有单个全突变等位基因的女性可能是受侵袭的或者可能是全突变携带者。

【0017】在本发明以上方面的一些实施方式中，受脆性X综合症(全突变)侵袭的男性个体能够与携带者(前突变)个体或者与那些正常个体区分开。来自个体的核酸样品被断裂产生核酸片段，其中在片段中FMR1基因的串联重复区段与标记序列连接。该片段依照大小分离成部分，这在以下条件下进行：在其中包含串联重复区段的片段将按照串联重复区段中的重复数量定位于所述部分中，和通过检测标记序列识别那些包含区段的部分。在一些实施方式中，选择部分以便第一部分捕获具有在正常等位基因的重复范围之内的重复数目的片段；第二部分捕获具有在前突变等位基因的重复范围之内的重复数目的片段；第三部分捕获具有在全突变等位基因的重复范围之内的重复数目的片段。依照在脆性X领域最新研究，对于FMR1基因的正常等位基因的重复范围是小于55个重复；对于前突变等位基因的重复范围是55-220；对于全突变等位基因的重复范围是大于220个重复。这些变化范围可以是±10％。这些变化范围可能会随着时间而改变，因为新的研究在被进行并得到了更多关于重复数量和疾病状况之间相关性的信息。由于男性一般具有单X-染色体(FMR1基因位于其中)，对于标记序列只有一部分应该是阳性。因此，根据按照以下的基因型，男性被给予表现型：如果对于标记序列第一部分是阳性，那么个体是正常的；如果对于标记序列第二部分是阳性，那么个体是携带者；如果对于标记序列仅第三部分是阳性，那么个体受脆性X综合症侵袭。

【0018】在另外一方面，提供了筛查男性和女性个体在FMR1基因的串联重复区域中的突变携带者状况的方法，该方法包括：

分析来自于个体的核酸，以确定性别；和

分析核酸，以确定FMR1基因的串联重复区域的长度，其中所述确定包括：

扩增串联重复区域，

检测扩增产物，和

确定在扩增产物中串联重复的数量，

其中，

在男性个体中：

具有小于55个串联重复的扩增产物的存在表示个体不是携带者，

具有55个或者更多个串联重复的扩增产物的存在表示个体是携带者，或者

不存在扩增产物时，携带者状况是不确定的；和

在女性个体中：

具有多于55个串联重复的扩增产物的存在表示个体是携带者；或

具有小于55个串联重复的单个扩增产物的存在表示携带者状况是不确定的。

【0019】在某些实施方式中，上述方法还包括，分析未确定的个体来确定携带者状况，其中该分析包括，

分离核酸片段，其中该片段由包含核酸的个体样品制备，其中该片段包括了一些包含FMR1基因的串联重复区段和标记序列的片段，按照大小分离成部分，这在以下条件下进行：含有具有正常重复数量的串联重复区段的片段将定位在第一部分中；含有具有前突变的串联重复区段的片段将定位在第二部分中；以及含有具有全突变的串联重复区域的片段将定位在第三部分中，

通过检测标记序列来识别包含区段的那些部分，其中通过在其中片段被识别的部分来确定在串联重复区段中的重复数量，其中，

在男性个体中：

在第一部分中的阳性结果表示个体不是携带者，

在第二部分中的阳性结果表示个体是前突变携带者，

在第三部分中的阳性结果表示个体是受侵袭的；和

在女性个体中：

仅在第一部分中的阳性结果表示个体对于正常等位基因是纯合的(同型接合的)；

在第二部分中的阳性结果表示个体是前突变携带者，和

在第三部分中的阳性结果表示个体是全突变携带者。

【0020】在上述方法的优选实施方式中，分析核酸确定性别包括扩增核酸区域，优选地用PCR扩增。例如，对Y染色体特异的序列，如SRY基因座可以是扩增的目标。在这种情况下，扩增仅在Y染色体存在时发生。(参见Sinclair A.H.，等，Nature 346：240 244(1990))。在其它例子中，某些在X染色体和Y染色体上都出现的基因可以被检测以确定性别，如果相应基因的长度在每个染色体上是不同的。因此，扩增产生具有对X或Y染色体特异的长度的不同大小的扩增子。在这种情况下，来自于男性的核酸的扩增将产生两个扩增子，而来自于女性样品将仅有一个扩增子。这样基因的例子包括DXZ1、DXZ2和牙釉蛋白基因。在更优选的实施方式中，确定性别的分析包括：

从X染色体上的牙釉蛋白基因和Y染色体上的牙釉蛋白基因扩增产生不同大小扩增产物的牙釉蛋白基因的区域，

确定扩增产物或多个产物的大小，其中单一大小的一个产物的存在表示性别是女性，而两种不同大小产物的存在表示性别是男性。

【0021】在还有进一步的实施方式中，确定性别的分析用串联重复区域的多重扩增来实现，优选地是多重PCR；优选地在多重反应中包括一个或多个内对照。在优选实施方式中，雄激素不敏感基因的区域作为内对照扩增。

【0022】在本发明以上方面的优选实施方式中，分析包含基因组DNA的样品用于FMR1基因的串联重复区域的扩张。因此，基因组样品进行核酸片段化(断裂)并且产生的核酸片段依照大小分离成多个部分。FMR1基因的串联重复区域的上游或下游的标记序列通过聚合酶链式反应扩增，标记序列与片段化核酸中的串联重复区域连接。在一些实施方式中，使用TaqMan系统进行标记序列的扩增和扩增子的检测。在其它实施方式中，使用标记的引物扩增标记序列和使用毛细管电泳检测产生的标记的扩增子。

【0023】本领域技术人员会容易认识到通过大小将片段分离成部分是能够改进的，使得所述部分对应于串联重复的正常数量或者串联重复的异常数量。在一些实施方式中，成片段的核酸可以依照大小分成两个部分，较大尺寸片段的上部分和较小尺寸片段的下部分。在这种方法中，设计部分，使得来自于包含正常数量的串联重复的核酸的片段将在下部分中找到，而来自于包含异常增加数量的串联重复的核酸的片段将在上部分中找到。在其它实施方式中，片段化的DNA可分离成任意数量的部分。在一些实施方式中，片段化的DNA可分离成选自2-16的数量的部分，优选地3个部分，或者4个部分，或者5个部分，或者6个部分，或者8个部分，或者甚至16个部分。

【0024】在以上方法的优选实施方式中，片段化的DNA分离成上部分和下部分，其中下部分对应于包含小于55个重复的串联重复区域(正常的重复数量)和上部分包含55个或更多个重复(前突变和全突变)。因此，正常等位基因与前突变或者全突变区别开来。

【0025】在以上方法的另一个优选实施方式中，片段化DNA分离成三部分，其中第一部分对应于正常等位基因的串联重复区域(也就是小于55个重复)，第二部分对应于前突变等位基因的串联重复区域(也就是55-200个重复)，第三部分对应于全突变等位基因的串联重复区域(也就是大于200个重复)。

【0026】在以上方法的另外一个优选的实施方式中，片段化的DNA分离成四个部分，其中第一部分对应于正常等位基因的串联重复区域，第二部分对应于小的前突变等位基因的串联重复区域，第三部分对应于大的前突变等位基因的串联重复区域，第四部分对应于全突变的等位基因的串联重复区域。在特定实施方式中，第一部分对应于0-60个重复；优选地第二部分对应于60-200个重复；优选地第三部分对应于200-2000个重复；优选地第四部分对应于2000以上的重复。在另外一个实施方式中，DNA用BlpI和MlyI片段化并分级，这样第一部分对应于6-62个重复；优选地第二部分对应于63-140个重复；优选地第三部分对应于141-220个重复；和优选地第四部分对应于221-2000以上个重复。在另外一个实施方式中，DNA用AluI片段化并分级，这样第一部分对应于6-68个重复；优选地第二部分对应于69-102个重复；优选地第三部分对应于102-202个重复；和优选地第四部分对应于203以上个重复。在还有另外一个实施方式中，DNA用SphI和BmtI片段化并分级，这样第一部分对应于6-62个重复；优选地第二部分对应于63-163个重复；优选地第三部分对应于164-196个重复；和优选地第四部分对应于197以上个重复。

【0027】也提供了估计基因组DNA样品中串联重复的数量方法。在这个方法中，包含基因组DNA的样品进行核酸片段化。产生的核酸片段根据大小分离成三个或更多的大小范围部分，通过检测位于串联重复区段侧翼的标记序列识别在各个部分中包含串联重复区段的片段，所述标记序列与片段化的核酸中的串联重复区域连接。接着通过将包含重复的部分大小与在这种核酸片段中存在的串联重复区段的大小相关联，来确定所检测的串联重复区域的大小。分离成三个或更多个大小范围部分使得能够更精细地估计串联重复的数量。在脆性X情况下，能评价前突变或者全突变的扩张程度。

【0028】在本发明以上方面的优选实施方式中，所述方法包括第二核酸片段化。优选地，在大小分离之后进行第二片段化，而大小分离在第一核酸片段化之后；优选地，第二片段化通过限制性酶消化进行。在更优选的实施方式中，第二片段化作用从位于特定核酸区段侧翼的标记序列剪切感兴趣的特定核酸区段(例如，串联重复区段)。优选地，第二核酸片段化不在标记序列内剪切。

【0029】在本发明以上方面的一些实施方式中，通过扩增所有或者一部分标记序列和检测扩增子来检测标记序列。在优选的实施方式中，通过PCR来扩增标记序列和通过电泳来检测扩增子。在更优选的实施方式中，在PCR扩增反应中所使用的引物包含标记，因而对所产生的扩增子进行标记。如此标记的扩增子然后可以通过诸如毛细管电泳的方法进行检测。

【0030】在本发明以上方面的其它实施方式中，用实时PCR方法例如TaqMan系统来检测标记序列。在这种方法中，用探针检测标记序列的扩增区域。

【0031】在本发明以上方面的其它实施方式中，标记序列不需要扩增并且能通过杂交两种不同标记的寡核苷酸探针进行直接检测。这两种探针——与标记序列的不同区段杂交，这样两种探针能够同时结合——在杂交条件下与片段化的核酸接触。同时检测到与多个部分中的单个核酸片段杂交的不同标记的探针，表明包含在那部分中的片段中存在串联重复区域。这个实施方式中的两个寡核苷酸探针可设计成与串联重复上游或者下游的标记序列的区段杂交。标记序列的这些区段可以邻接串联重复区域或者可以在上游或者下游的远处。在优选的实施方式中，标记序列的区段在串联重复区域上游或者下游的500个碱基范围之内；在更优选的实施方式中，标记序列的区段在串联重复区域上游或者下游的250个碱基范围之内；在最优选的实施方式中，标记序列的区段在串联重复区域上游或者下游的100个碱基范围之内。探针可设计成与双链标记序列的同一链或者相对链杂交。探针可与串联重复区域的上游或者下游杂交。可选地，一个探针可与串联重复区域上游杂交，而另一个探针与串联重复区域下游杂交。在一个或多个片段化步骤后，如果两个区段都位于相同的连续核酸分子上，探针可与被零个碱基或者数十万个碱基隔开的标记序列的区段杂交。优选地，探针被小于1kb个碱基，或者优选地小于500个碱基，或者小于300个碱基，或者小于200个碱基，或者小于100个碱基，或者小于50个碱基，或者小于20个碱基，或者小于10个碱基，或者小于5个碱基，或者1个碱基，或者0个碱基隔开。

【0032】在本发明的另外一方面，提供了确定核酸样品中特定核酸区段大小的方法，其中应用使用第一种和第二种方法获得的信息确定大小。因此，该方法包含用第一种方法测量串联重复区段的大小，用第二种方法测量串联重复区段的大小，和用通过第一种和第二种方法得到的信息确定串联重复区域的大小。在一些实施方式中，第一种方法包括串联重复区域的扩增，优选地用PCR扩增。在优选的实施方式中，PCR扩增包含标记的引物。在另外优选的实施方式中，扩增子可以进行电泳，优选毛细管电泳，和通过与平行进行的标准品比较来确定扩增子大小。在其它实施方式中，第一种方法包括Southern印迹。在优选实施方式中，第二种方法包括：使样品的核酸片段化，依照大小将片段化的核酸分离为几个部分，和检测感兴趣的特定核酸区段上游或者下游的标记序列，其中标记序列与片段化的核酸中感兴趣的特定核酸区段连接。然后通过将包含特定核酸区段的部分大小与核酸样品中特定核酸区段的大小相关联，来确定特定感兴趣核酸区段的大小。在某些实施方式中，第一种方法用作起始筛选，对于通过这种方法不能确定特定核酸区段的大小的样品通过第二种方法进一步分析。在其它实施方式中，使用以上两种方法中的一种方法进行分级，确认通过上述两种方法中另一种方法分级的结果。在还有其它实施方式中，通过第一种方法进行的分级被用于精确地确定特定核酸片段的大小。

【0033】在本发明的另外一方面，提了用于扩增位于FMR1基因的串联重复区域侧翼的标记序列的引物。在特定的实施方式中，引物选自SEQ ID NO：4-9。

【0034】在本发明的还有另外一方面，提供了用于检测样品中特定核酸区段大小的试剂盒，其包含用于扩增特定核酸区段上游或下游标记核苷酸序列的引物对，和一种或多种限制性内切核酸酶，所述限制性内切核酸酶用于剪切核酸样品以产生包含特定核酸区段和上游或下游标记序列的核酸样品片段。在某些实施方式中，试剂盒还包含一种或者多种限制性内切核酸酶，其用于从标记核苷酸序列剪切特定的核酸区段。在还有其它的实施方式中，试剂盒还可包含用于证实片段的合适大小分离的一种或者多种对照；优选地对照由一种或多种引物对组成，用于扩增来自大小分离的核酸样品的一个或多个对照片段。在进一步的实施方式中，试剂盒还包含用于证实一种或多种酶消化已经完成的一种或多种对照；优选地对照包含设计用于扩增包括所使用酶的识别位点的对照片段的一种或多种引物对。试剂盒还可包含任何必要的缓冲液或者其它试剂。

【0035】在本发明以上方面的优选实施方式中，特定核酸区段包含串联重复序列区段。在更优选的实施方式中，试剂盒用于检测FMR1基因的串联重复区段；优选地用于产生核酸样品片段的酶是AluI；优选地用于从串联重复剪切标记序列的酶是BstNI；优选地试剂盒包含一对或多对用于确定酶消化是否完成的对照引物；优选地试剂盒包含一对或多对用于检测在大小分离的核酸样品中一个或多个对照片段存在的引物。在其它优选的实施方式中，试剂盒用于检测FMR1基因的串联重复区段；优选地用于产生核酸样品片段的酶是BlpI和MlyI；优选地用于从串联重复切割标记序列的酶是BmtI；优选地试剂盒包含一对或多对确定酶消化是否完成的对照引物；优选地试剂盒包含一对或多对用于检测在大小分离的核酸样品中一个或多个对照片段存在的引物。在还有其它优选的实施方式中，试剂盒用于检测FMR1基因的串联重复区段；优选地用于产生核酸样品片段的酶是SphI和BmtI；优选地用于从串联重复切割标记序列的酶是BstNI；优选地试剂盒包含一对或多对确定酶消化是否完成的对照引物；优选地试剂盒包含一对或多对用于检测在大小分离的核酸样品中一个或多个对照片段存在的引物。

【0036】关于核酸，在这里所使用的“区段”指一条连续的核酸。

【0037】在这里所使用的“感兴趣的特定核酸区段”指特定“区段”或者一条具有已知序列的核酸，优选的区段是那些PCR难扩增的区段。例子包括具有高含量鸟嘌呤和胞嘧啶碱基的核酸区段、大的核酸区段或者有大量串联重复的区段，一般超过100个三核苷酸重复。在一些实施方式中，区段包含删除、重复或者插入。在优选的实施发生中，感兴趣的特定核酸区段包含串联重复区域。

【0038】“具有高含量鸟嘌呤和胞嘧啶碱基的核酸区段”或“富含GC”指比基因组的平均值大的基因组的那些核酸区段。一般而言，富含GC是大于40％的鸟嘌呤和胞嘧啶碱基，或者大于50％，或者大于60％，或者大于75％。

【0039】关于感兴趣的特定核酸区段，在这里所使用的“大小(尺寸，size)”指描述那个区段大小(magnitude)的数目或数量，并能够用例如分子量、碱基对数量、或者串联重复拷贝数来表示。

【0040】在这里所使用的“片段”指由较长长度的核酸断裂为较短长度的核酸的方法产生的一部分核酸。核酸可以通过化学或生物化学方法断裂或者片段化，优选地以可重复的方式片段化核酸，优选地用一种或多种限制性内切核酸酶片段化核酸。优选地，核酸被片段化以便感兴趣的特定核酸区段和它连接的标记序列定位于相同的片段。包含感兴趣的核酸区段的核酸片段的长度将取决于感兴趣的核酸区段的长度以及选择用于片段化DNA的限制性酶。因此，片段的长度包括感兴趣核酸区段外加区段上游到5’限制性酶识别位点的区域(也就是片段的5’端)和区段区域下游到3’限制性酶识别位点的区域(也就是片段的3’端)。

【0041】在这里所使用的“分离片段”指这样的过程，借助该过程，包含于不同片段混合物中的片段通过物理方式相互分离。

【0042】在这里所使用的“分级(fractionation)”指这样的过程，借助该过程，单独组分的单一混合物被处理，这样混合物中的至少一些单独组分互相分开。例如，层析是根据一些物理/化学原理分离多组分的混合物的分级方法。可以在凝胶上或者膜上分离成分，这样单独的组分可以被分开鉴定。通过分离混合物成为被捕获在分开的液体等分试样(也就是部分)中的不同组分，混合物的单独组分可被分级。在这里使用的“部分(fraction)”在本发明的上下文中指这样的片段群，其具有与片段的起始非分级混合物的大小或者大小范围不同的某一大小或者大小范围。

【0043】在这里所使用的“鉴定包含区段的那些部分”意思是包含感兴趣区段的大小分离片段的部分，通过检测在核酸片段上与区段连接的标记序列来确定。

【0044】在这里所使用的短语“串联重复区域”或者“串联重复区段”指的是包含多拷贝的短DNA序列的DNA区域。“串联重复序列”或者“串联重复”或者简单地“重复”在这里可交替使用和指的是在串联重复区域中重复的短的DNA序列。这样的串联重复能够在同一方向上彼此相邻(也就是同向串联重复)或者彼此在相反方向上(也就是反向串联重复)。重复序列可以是长度上为二、三、四或者更多个核苷酸。在一些人类基因编码或者非编码区域之内的串联重复序列的拷贝数量的扩增与重复扩增疾病相联系。

【0046】在这里所使用的术语“样品”或者“试样”指的是任何包含基因组DNA的液体或者固体材料。在优选的实施方式中，从生物源(也就是“生物样品”)中得到试样，例如培养的细胞或者来自于动物的组织样品，最优选地是人。优选的组织样品包括血、骨髓、体液、脑脊液、血浆、血清或组织(如活检材料)，但不限于此。

【0046】这里所使用的“核酸”泛指染色体区段、DNA、cDNA和/或RNA的区段或部分。从任何来源的起始分离核酸样品可得到或获得核酸(例如分离自、纯化自、扩增自、克隆自、逆转录自样品DNA或RNA)。

【0047】在这里所使用的“目标核酸”指的是染色体区段、有或没有基因间序列的全基因、有或者没有基因间序列的基因区段或者部分、或者用于设计探针或引物的核酸序列。目标核酸可包括野生型序列、包含突变、删除或者重复的核酸序列、串联重复区域、感兴趣的基因、感兴趣基因的区域或者其任何上游或者下游区域。目标核酸可代表特定基因的替代序列或等位基因。目标核酸可来自于基因组DNA、cDNA或者RNA。在这里所使用的目标核酸可以是天然DNA或者PCR扩增产物。

【0048】在这里所使用的术语“标记序列”指的是与感兴趣的核酸区段连接的核酸区段，结果是样品中感兴趣的标记序列的检测表示感兴趣的核酸区段存在。应该根据标记与在特定大小部分中存在的片段中感兴趣核酸区段独特或充分地连接，选择用于检测感兴趣的特定核酸区段的标记序列。以杂交方法为基础，通过使用引物的核酸扩增能够检测标记序列。通过杂交到一个或多个核酸探针也能够检测标记序列。依照在这里所公开的方法，通过检测串联重复上游或者下游的标记序列来鉴定在大小分级的核酸片段中包含串联重复区段的片段。

【0049】标记序列可以是在感兴趣的核酸区段之内或者可以是在感兴趣核酸的侧翼。在这里所使用的术语“侧翼”指的是邻接或者远离感兴趣区域的DNA区域。侧翼区域可以是感兴趣区域的“上游”(也就是5’)或者下游(也就是3’)。标记序列可以邻接串联重复区域或者位于上游或者下游的一定距离。在优选的实施方式中，标记序列在串联重复区域的上游或下游的500个碱基之内；在更优选的实施方式中，标记序列在串联重复区域上游或下游的250个碱基之内；在最优选的实施方式中，标记序列在串联重复区域上游或下游的100个碱基之内。侧翼区域可以是编码或者非编码序列和可以是与包含感兴趣区域的基因相同或者不同的基因。在优选的实施方式中，标记序列位于感兴趣核酸区段的侧翼。

【0050】在某些实施方式中，通过包含特定核酸区段的部分大小与核酸样品中的特定核酸区段的大小相关联，确定感兴趣的特定核酸区段的大小。使用在这里所公开的查阅表，来完成将包含特定核酸区段的部分大小与核酸样品中特定核酸区段的大小相关联的这个步骤。在其它实施方式中，用计算机程序来完成这个步骤。

【0051】这里所使用的短语“在产生片段的条件下，将包含感兴趣的特定核酸区段的部分大小与存在于该部分中感兴趣的特定核酸区段的大小相关联”指的是由在特定部分大小中的位置来确定感兴趣的特定核酸区段的大小的方法。在一个方法中，查询表基于感兴趣的特定核酸区段的每一组合和片段化方法(例如，使用特定的限制性内切核酸酶)而建立。查询表联系每个部分(包含一系列的片段大小)与存在于这样的片段中的感兴趣区段的长度。在任何特定部分中，具有包含感兴趣的区段和其它序列的片段。因此，在任何部分中，从序列数据本领域普通技术人员能够计算出片段中代表感兴趣区段的碱基的数量。这种相关性可用实验来建立或者通过使用产生的片段的已知DNA序列来建立。对于任何特定未知的样品，通过将包含感兴趣的区段的片段大小与反映产生片段的相同条件的合适查询表相关联来确定感兴趣的区段的大小。通过使用这个过程，在产生片段条件下，本领域普通技术人员将包含感兴趣的特定核酸区段的部分大小与存在于该部分中感兴趣的特定核酸区段的大小相关联。为了实现该方法，本领域普通技术人员制作查询表不是必不可少的。例如，本领域普通技术人员可以产生计算机程序来实现该相关步骤。

【0052】“基因组核酸”或者“基因组DNA”指的是来自于细胞核的一些或者所有的DNA。基因组DNA可以是完整的或者成片段的(例如通过现有技术中已知的方法用限制性内切核酸酶来消化)。在一些实施方式中，基因组DNA可包括来自于单一基因的所有或者一部分或者来自多基因的序列、来自于一个或多个染色体的序列、或者来自于细胞的所有染色体的序列。相比之下，在这里所使用的术语“全部的基因组核酸”指的是包含在细胞基因中全互补DNA。众所周知，基因组核酸包括基因编码区域、内含子、5′和3′非翻译区、5′和3′侧翼DNA以及结构区段例如端粒和着丝粒DNA、复制起点和基因间DNA。基因组核酸可以从细胞核得到，或者重组产生。也可由直接从细胞核分离的DNA或者RNA来转录基因组DNA。也可使用PCR扩增。从多种样品纯化DNA和/或RNA的方法在现有技术中是众所周知的。

【0053】术语“等位基因”和“等位变异”在这里可交换使用。等位基因是占据染色体上特定基因座或者位置的相同基因的序列或许多替代形式中的任一种。对于每个基因座的单个等位基因分别从每个亲本遗传，对于每个基因产生两个等位基因。具有特定基因的两个拷贝的相同等位基因的个体在那个基因座上是纯合的，而具有特定基因的两个不同等位基因的个体是杂合的。

【0054】“重复扩增疾病(repeat expansion disease)”指的是显示孟德尔遗传模式的大约24种人类疾病中的任何疾病，其显示出由内在多态性串联重复的扩增所引起，主要涉及不同的三核苷酸基序但还涉及多达12聚体的较长重复序列(表1)。包含扩增的串联重复的等位基因的特征是在连续世代中过分的不稳定性(动态突变)。而且，在相同生物的细胞群中，这些等位基因在长度上可以不同(镶嵌现象)。一种类型的重复扩增疾病是三核苷酸重复序列疾病(例如，脆性X综合症、强直性肌营养不良1等)，这是最大量形式的重复扩增疾病。这些疾病显示了代间重复不稳定性，并具有串联重复进一步扩增的趋势。在连续世代中增加的重复长度能够导致在受侵袭的个体中较早年龄的发作和/或加重的临床症状。本文所述测量串联重复长度的方法可以应用于测量表3中任一种疾病/基因的串联重复长度。

表1示例性的串联重复扩增疾病

疾病(基因名称)	蛋白	串联重复序列	重复位置	正常重复范围	扩增的重复
疾病(基因名称)	蛋白	串联重复序列	重复位置	正常重复范围	扩增的重复	齿状核红核苍白球路易氏体萎缩症(DRPLA)	萎缩蛋白-1	CAG	编码	6-35	49-88
进行性肌阵孪性癫痫(EPM1)#	CSTB	CCCCGCCCCGCG(SEQ IDNO：39)	5′UTR	2-3	50-80	齿状核红核苍白球路易氏体萎缩症(DRPLA)	萎缩蛋白-1	CAG	编码	6-35	49-88
进行性肌阵孪性癫痫(EPM1)#	CSTB	CCCCGCCCCGCG(SEQ IDNO：39)	5′UTR	2-3	50-80	脆性XA综合症(FRAXA)*	FMR1	CGG	5′UTR	6-53	＞230
脆性XE综合症(FMR1)*	FMR-2	GCC	5′UTR	6-35	＞200	脆性XA综合症(FRAXA)*	FMR1	CGG	5′UTR	6-53	＞230
脆性XE综合症(FMR1)*	FMR-2	GCC	5′UTR	6-35	＞200	弗里德雷希共济失调(FRDA)#	共济蛋白	GAA	内含子	7-34	＞100
亨廷顿病(亨廷顿蛋白)	亨廷顿蛋白	CAG	编码	4-35	36-250	弗里德雷希共济失调(FRDA)#	共济蛋白	GAA	内含子	7-34	＞100
亨廷顿病(亨廷顿蛋白)	亨廷顿蛋白	CAG	编码	4-35	36-250	类亨廷顿病2(JPH-3)	亲衔蛋白-3	CTG	编码	6-27	＞40-60
脊延髓肌萎缩症，肯尼迪病(AR)*	雄激素受体	CAG	编码	9-36	38-62	类亨廷顿病2(JPH-3)	亲衔蛋白-3	CTG	编码	6-27	＞40-60
脊延髓肌萎缩症，肯尼迪病(AR)*	雄激素受体	CAG	编码	9-36	38-62	肌强直性营养不良1(DM1)	DMPK/SIX5	CTG	3′UTR	5-37	＞50
肌强直性营养不良2(DM2)	ZNF9	CCTG	内含子	10-26	75-＞11000	肌强直性营养不良1(DM1)	DMPK/SIX5	CTG	3′UTR	5-37	＞50
肌强直性营养不良2(DM2)	ZNF9	CCTG	内含子	10-26	75-＞11000	脊髓小脑性共济失调1(SCA1)	共济失调蛋白-1	CAG	编码	6-44	39-82
脊髓小脑性共济失调2(SCA2)	共济失调蛋白-2	CAG	编码	15-31	36-63	脊髓小脑性共济失调1(SCA1)	共济失调蛋白-1	CAG	编码	6-44	39-82
脊髓小脑性共济失调2(SCA2)	共济失调蛋白-2	CAG	编码	15-31	36-63	脊髓小脑性共济失调3，马查多-约瑟夫病(machado-joseph disease)(SCA3)	共济失调蛋白-3	CAG	编码	12-40	55-84

脊髓小脑性共济失调6(SCA6)	CACNA1A	CAG	编码	4-18	21-33
脊髓小脑性共济失调6(SCA6)	CACNA1A	CAG	编码	4-18	21-33	脊髓小脑性共济失调7(SCA7)	共济失调蛋白-7	CAG	编码	4-35	37-306
脊髓小脑性共济失调8(SCA8)	未知	CTG	3′UTR	16-37	110-250	脊髓小脑性共济失调7(SCA7)	共济失调蛋白-7	CAG	编码	4-35	37-306
脊髓小脑性共济失调8(SCA8)	未知	CTG	3′UTR	16-37	110-250	脊髓小脑性共济失调10(SCA10)	共济失调蛋白-10	ATTCT	内含子	10-22	800-4600
脊髓小脑性共济失调12(SCA12)	PP2A-PR55B	CAG	启动子	7-28	66-78	脊髓小脑性共济失调10(SCA10)	共济失调蛋白-10	ATTCT	内含子	10-22	800-4600
脊髓小脑性共济失调12(SCA12)	PP2A-PR55B	CAG	启动子	7-28	66-78	脊髓小脑性共济失调17(SCA17)	TBP	CAG	编码	25-42	47-63
眼肌型肌营养不良症(PABPN1)	PABPN1	GCG	编码	6	7-13	脊髓小脑性共济失调17(SCA17)	TBP	CAG	编码	25-42	47-63
眼肌型肌营养不良症(PABPN1)	PABPN1	GCG	编码	6	7-13	并多指畸形，类型II(HOXD13)	HOXD13	GCN	编码	15	22-24

*＝X染色体；#＝常染色体隐性；未指定＝常染色体显性

【0055】在这里所使用的术语“寡核苷酸”指的是由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或者其任何组合组成的短聚合物。本发明的寡核苷酸在长度上一般是在大约10至大约100个核苷酸之间。寡核苷酸优选长度为15到70个核苷酸，以20到26个核苷酸最常见。用于核苷酸的单字母代码如在美国专利局的专利审查程序手册2422章节的表1中所描述。在这点上，核苷酸名称“R”表示鸟嘌呤或者腺嘌呤。“Y”表示胸腺嘧啶(如果是RNA，表示尿嘧啶)或者胞嘧啶；“M”表示腺嘌呤或鸟嘌呤。寡聚核苷酸可以用作引物或者探针。

【0056】关于寡核苷酸，在这里所使用的术语“基本上纯化的”不要求绝对的纯度。相反，它表示序列比在自然环境中相对更纯。通过多种方法可得到这样的寡核苷酸，包括例如实验室合成、限制性酶消化或者PCR。“基本上纯化的”寡核苷酸优选地大于50％纯、更优选地至少75％纯，和最优选地至少95％纯。

【0057】在这里所使用的，当比对寡核苷酸和核酸时，如果寡核苷酸与核酸的一部分具有至少50％序列同一性时，寡核苷酸对于核酸是“特异的”。对核酸特异的寡核苷酸是这样的寡核苷酸，其在合适的杂交或者洗涤条件下，能够与感兴趣的目标杂交，而与非感兴趣的核酸基本上不杂交。较高水平的序列同一性是优选的，包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％和最优选的至少98％的序列同一性。

【0058】在这里所使用的，术语“杂交”或者“特异性杂交”指的是在适当严格条件下两个互补核酸链互相退火的过程。杂交典型地和优选地用探针长度的核酸分子进行，优选长度为20-100个核苷酸。核酸杂交技术在现有技术中是众所周知的。参见，例如，Sambrook等，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，SecondEdition，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y。本领域技术人员知道如何评估和调整杂交条件的严格性，这样至少具有理想水平的互补性的序列将稳定地杂交，而具有低互补性的序列则不会稳定地杂交。对于杂交条件和参数的例子，参见Sambrook等，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，ColdSpring Harbor Press，Plainview，N.Y.；Ausubel，F.M.等1994，Current Protocols inMolecular Biology.John Wiley & Sons，Secaucus，N.J。

【0059】在这里所使用的术语“基本上互补”意思是在严格杂交条件下两条序列杂交。熟练技术人员将理解基本互补的序列不需要在它们的整个长度杂交。特别地是，基本互补的序列包含了不与目标或标记序列杂交的连续碱基序列，位于在严格杂交条件下与目标或标记序列杂交的连续碱基序列的3’或5’端。

【0060】在这里所使用的术语“互补”意思是依照沃森/克里克配对规则与核酸互补的序列。互补序列也可以是与DNA序列或者它的互补序列互补的RNA序列，和也可以是cDNA。

【0061】在这里所使用的术语“编码序列”意思是能够被转录和/或翻译产生用于和/或多肽或其片段的mRNA的核酸序列或者它的互补、或者它的一部分。在基因组DNA或者未成熟的初级RNA转录物中编码序列包含外显子，其通过细胞的生化机制连接在一起以提供成熟mRNA。反义链是这样核酸的互补，并由之可以推算出编码序列。

【0062】在这里所使用的“非编码序列”意思是在体内不转录成为氨基酸的核酸序列、它的互补或者它的一部分，或者在tRNA不相互作用以安置或试图安置氨基酸时。非编码序列包含在基因组DNA或者未成熟的初级RNA转录物中的内含子序列和基因相关序列，如启动子、增强子、沉默基因等。

【0063】在这里所使用“扩增(amplification)”或者“扩增(amplify)”意思是在现有技术中已知用于复制目标核酸的一种或者多种方法，由此增加选择的氨基酸序列的拷贝数。扩增可以是指数扩增或者线性扩增。目标核酸可以是DNA或者RNA。以这种方式扩增的序列形成了“扩增子”。而在下文中所描述的示例方法涉及到使用聚合酶链反应(“PCR”)的扩增，在现有技术中已知有许多用于扩增核酸的其它方法(例如等温方法、滚环方法等)。本领域技术人员将理解的是这些其它方法可以替代或者与PCR方法一起使用。参考，例如Saiki，“Amplification of Genomic DNA”in PCR Protocols，Innis等，Eds.，Academic Press，San Diego，CA 1990，pp 13-20；Wharam等，Nucleic Acids Res.2001 Jun 1；29(11)：E54-E54；Hafner等，Biotechniques2001Apr；30(4)：852-6,858,860passim；Zhong等，Biotechniques 2001Apr；30(4)：852-6,858,860passim。

【0064]在这里所使用的用于扩增的“引物”是与目标或者标记核苷酸序列特异性退火的寡核苷酸。引物的3’端核苷酸应该与在相应的核苷酸位置用于最佳扩增的目标或者标记序列相同。

【0065】“有义链”意思是双链DNA(dsDNA)中包含功能蛋白至少一部分编码序列的链。“反义链”意思是与有义链反相互补的dsDNA的链。

【0066】在这里所使用的，“正向引物”是与dsDNA的反义链退火的引物。“反向引物”与dsDNA的有义链退火。

【0067】在这里所使用的，具有“高度序列同一性”的序列在至少大约50％的比对核苷酸位置具有相同的核苷酸，优选地在至少大约75％的比对的核苷酸位置，更优选地在至少大约90％的比对的核苷酸位置，和最优选地在至少大约95％的比对的核苷酸位置具有相同的核苷酸。

【0068】在这里所使用的“TagMan PCR检测系统”指实时PCR方法。在这种方法中，与扩增的核酸区段杂交的TaqMan探针包含在PCR反应混合中。TaqMan探针包括在探针任一端的供体和荧光团淬灭剂并且彼此之间足够紧密接近，以便淬灭剂吸收供体的荧光。然而，当探针与扩增的区段杂交时，Taq聚合酶的5′-核酸外切酶活性剪切探针，因而使得供体荧光团发出能够被检测到的荧光。

附图简述

【0069】图1，显示检测串联重复的方法的一个实施方式示意图。在每个所标示的大小部分(例如，小、中和大)的底部图解显示了具有特定长度的串联重复的FMR1片段的存在。在PCR下面所显示的+或者-符号表明了当在部分中存在特定片段时，侧翼标记序列的PCR扩增是否发生。

【0070】图2，FMR1基因的区域的示例性序列(SEQ ID NO：1)，显示了CGG串联重复区域(单下划线)、用于杂交PCR引物的优选位置(阴影区域)和用于杂交探针的优选位置(双下划线)。

【0071】图3，DM-1基因3’下游非翻译区的示例性序列(SEQ ID NO：2)，显示了CTG串联重复区域(单下划线)、用于杂交PCR引物的优选位置(阴影区域)和用于杂交探针的优选位置(双下划线)。

【0072】图4，FRDA基因第一内含子区的示例性序列(SEQ ID NO：3)，显示了CAA串联重复区域(单下划线)、用于杂交PCR引物的优选位置(阴影区域)和用于杂交探针的优选位置(双下划线)。

【0073】图5，FMR1基因的区域的限制酶图谱。FXCEF3、FXCER3、FMR1F4、FMR1R4、FXCEF2和FXCER2显示了优选核苷酸引物的杂交位置。当用SphI/BmtI、AluI和BlpI/MlyI分别片段化核酸的时候，FXCEF3/FXCER3、FMR1F4/FMR1R4和FXCEF2/FXCER2是用于扩增标记序列的优选引物对。

发明详述

【0074】依照本发明，提供了在核酸样品中检测感兴趣的特定核酸区段的方法。在特定的实施方式中，感兴趣的特定核酸区段是串联重复和该方法用于确定关于这种串联重复的大小的信息。这种信息可用于确定个体是否携带遗传突变，该遗传突变的特征是与特定基因相关的串联重复数量增加(也就是扩增)或减少(也就是减小)。因此，所描述的是测量核酸样品中串联重复区段大小的方法，该方法包括：通过检测位于串联重复区段侧翼的标记序列，在大小分离的核酸片段的部分中鉴定串联重复，和然后将包含重复的部分大小与这样的核酸片段中存在的串联重复区段的大小相关联。图1以示图形式显示了这种方法的一个实施方式。如以下所讨论，在大小分离之后和在“分析”步骤之前，这种方法的变化是进行第二次片段化作用。

样品制备

【0075】本发明的方法可用于检测特征是在试样的基因组DNA中基因的串联重复区域扩增或者减小的突变。因此，该方法可以用包含基因组DNA的任何生物样品进行。例子包括组织样品或者任何包含细胞的体液。血液是优选的生物样品。生物样品可用标准流程得到，和可以立即使用或者在该类型生物样品的合适条件下贮存，供以后使用。

【0076】获得试样的方法对于本领域技术人员是众所周知的并且包括吸出、组织切片、血液或者其它流体的抽取、外科或者针吸组织检查等，但是不限于此。试样可以从个体或者患者获得。试样可包含从怀疑正在受折磨的患者或者由串联重复序列的扩增所引起的疾病的携带者得到的细胞、组织或者流体。试样可以是包含细胞的液体或者组织。样品可以包括羊水、活组织检查、血液、血细胞、骨髓、细针活组织检查样品、腹腔液、血浆、胸水、唾液、精液、血清、组织或组织匀浆、冷冻或石蜡组织切片，但不限于此。样本也可处理，如组织的切片、分级、纯化或细胞器分离。

【0077】本发明方法也可以用于进行使用胚胎、胎儿细胞或者包含核酸的体液中任何种类的产前诊断。胎儿细胞可以通过怀孕女性或者从胚胎样品中得到。因此，胎儿细胞可以存在于通过羊膜穿刺术获得的羊水、通过注射器吸取的绒膜绒毛、经皮脐血、胎儿皮肤活组织检测、来自四细胞到八细胞阶段胚胎的卵裂球(着床前)、或者来自胚泡的滋养外胚层样品(着床前或者通过子宫冲洗术)中。

【0078】在特定的实施方式中，可使用基因组DNA。基因组DNA可以用标准方法从细胞或者组织中分离，参见，例如，Sambrook等，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Press，Plainview，NY。

基因组DNA的片段化

【0079】基因组DNA可通过现有技术中众所周知的各种方法片段化。优选地，用限制性内切核酸酶消化来使DNA片段化。

【0080】在这里所使用的“限制性内切核酸酶”或者“限制性酶”指的是在特定的序列(也就是识别序列或者位点)剪切双链DNA的酶。给定限制性内切核酸酶切割DNA的频率取决于酶识别位点的长度。例如，一些酶识别位点是四个核苷酸长(称为“四刀具(four cutter)”)。一般而言，根据识别位点的长度和任何一个核苷酸出现在给定位置的可能性是四分之一的假定，本领域技术人员能够估计酶应该以怎样的频率切割一片DNA。在“四刀具”的情况下，四个核苷酸的特定序列必须存在。假定每个核苷酸有相等的机会(也就是四分之一)出现在四个核苷酸序列之内的任何特定位点，那么四刀具应该平均每256个碱基对切割一次(也就是1/4×1/4×1/4×1/4＝1/256)。只要识别位点的长度是已知的，类似的计算方法可应用于任何限制性酶，这使得预测通过剪切已知大小的DNA分子得到的DNA片段的大小和数量成为可能。这使得本领域技术人员能够生产已知大小的DNA片段。限制性内切核酸酶从细菌得到，或者通过重组技术产生，和容易从许多商业来源获得。

【0081】在限制性内切核酸酶片段化方法中，限制性内切核酸酶与基因组DNA样品和用于内切核酸酶最佳活性的缓冲液结合。一般而言，一个单位的内切核酸酶将在37℃、1小时内消化1微克的DNA。

【0082】本领域技术人员将认识到，通过使用以特定频率或者在特定位置切割的限制性内切核酸酶或者使用多种限制性酶，能够改进这种片段化方法。在试验中，选择适合感兴趣的基因的酶或者酶组合。一般而言，本领域技术人员将选择酶或者酶组合以产生包含全部串联重复区域和上游或者下游标记序列的片段。通过使用包围串联重复的区域的限制性酶图谱，可以选择用于片段化的酶。通过本领域技术人员众所周知的软件程序，可以容易产生这样图谱。

【0083】特别是，本领域技术人员会选择获得合适大小的片段的酶或者酶组合，以将正常长度的串联重复区域与异常长度的串联重复区域区别开。在确定片段的合适大小时，本领域技术人员将考虑与异常串联重复区域相比正常串联重复区域长度范围内的差异。例如，如果正常串联重复区域和异常串联重复区域之间的差异小，本领域技术人员将选择较短长度的片段，而如果差异大，本领域技术人员将选择较长长度的片段。

【0084】在优选的实施方式中，用AluI片段化核酸。AluI是一种识别双链DNA的四核苷酸序列(也就是-AGCT-)的限制性酶。本领域技术人员将认识到，AluI的同切点酶(也就是具有相同识别序列和切割位点的限制性酶)可容易地替代AluI。AluI同切点酶的例子包括BsaLI、MarI、MltI和OxaI，但是不限于此。本领域技术人员还会认识到，AluI的异切点酶(也就是与另一酶具有相同识别位点、但是不同切割位点的限制酶)也可能替代AluI。

【0085】本领域技术人员会认识到，在这个方法中与AluI具有相同切割频率的其它限制酶可以替代AluI。例如，识别4-核苷酸序列的AluI以大约每256个碱基剪切DNA。预期具有不同4-核苷酸识别序列的其它酶(例如DpnI、RsaI、MboI和NlaI)将以与AluI相似的频率切割，和因此会产生大小类似于AluI的片段。

【0086】在其它优选的实施方式中，BlpI和MlyI组合用于片段化核酸。在还有其它优选实施方式中，SphI和BmtI组合用于片段化核酸。

DNA片段的大小分离

【0087】使用本领域技术人员已知的各种方法可完成依照大小进行的DNA片段分离。例如，可以使用凝胶电泳或柱层析的各种方法(例如，尺寸排阻高效液相层析(SEC-HPLC)和变性HPLC(DHPLC))。

【0088】在凝胶电泳中，利用施加了电场的凝胶基质根据大小来分离核酸分子或者其片段。一般而言，较小的核酸片段会比较大的片段更快地移动通过凝胶基质。优选的凝胶基质包括琼脂糖和聚丙烯酰胺。

【0089】在优选的实施方式中，使用毛细管电泳分离片段化的核酸。毛细管电泳是根据当施加电压时，样品成分在毛细管中的不同电泳迁移率进行的分离方法。一般通过在毛细管中的窗口，使用紫外线光谱或荧光分析“柱上”检测分离的片段或者分子。一般而言，首先将一种或者多种标准品(具有已知长度的核酸区段)注射入到毛细管中，使用柱上检测确定每种标准品的洗脱时间。然后，为了获得合适大小范围的部分，标准品的洗脱时间被用于确定收集部分所经历的时间长度。

【0090】在一些实施方式中，在试验中所使用的部分的大小范围可根据商业上可获得的标准品的碱基对长度来选择。许多包含混合长度的核酸的标准品是能够得到的。在一个例子中，使用包含具有以下长度的核酸片段的标准品：200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp和1000bp。因此，随后根据在标准品中存在的一种或多种大小来选择部分。例如，本领域技术人员可以选择以下三个部分：1)小于或者等于300bp，和2)301-500bp，和5)大于或者等于501。本领域技术人员随后根据300bp和500bp标准品的洗脱时间来收集片段化核酸样品的部分。能够计算出在每个部分中存在的串联重复的数量范围。

【0091】可选地，可以根据每个部分合适数量的串联重复来选择部分。在这种情况下，如果市场上没有销售，可以合成表示每个部分大小的上线和下限的标准品。

【0092】在一些实施方式中，为了区别正常与异常长度的串联重复区域，将片段分离成最小数量的部分。在特定的实施方式中，部分可分离成两个部分，一个对应于正常的串联重复区域和一个对应于异常的串联重复区域。

【0093】在其它的实施方式中，为了确定串联重复区域的大小，将片段分离成较大数量的部分。一般而言，更多的部分将使得能够更精确地确定串联重复区域的长度。为了在确定串联重复区域的长度时获得期望水平的精确度，可以选择部分的数量。

【0094】在确定FMR1基因串联重复数量的试验的优选实施方式中，AluI片段化的DNA被分离成对应于大小约211-358bp(较低部分)和359bp-9kbp(较高部分)的两个部分。来自于包含正常FMR1基因样品的片段(也就是小于55个串联重复)将分离入较低部分，而来自于包含前突变(也就是大约55-200个串联重复)或者全突变(也就是大于200个串联重复)的FMR1基因的片段将分离入较高部分。

【0095】在确定FMR1基因串联重复数量的试验的另一优选实施方式中，AluI片段化的DNA被分离成对应于大小约211-400bp(较低部分)和401bp-9kbp(较高部分)的两个部分。来自于包含正常FMR1基因样品(也就是小于55个串联重复)和具有56-69串联重复的前突变的片段将分离入较低部分，而来自于包含具有70-200个串联重复的前突变或者全突变(也就是大于200个串联重复)的FMR1基因的片段将分离入较高部分。

【0096】在确定FMR1基因串联重复数量的试验的另一优选实施方式中，AluI片段化的DNA被分离成对应于大小大约小于或者等于400bp(第一/最低部分)、401-500bp(第二部分)、501-800bp(第三部分)和800bp-9kp(第四/最高部分)的四个部分。来自于包含正常FMR1基因的样品的片段(也就是小于55个串联重复)和那些包含具有56-68个串联重复的前突变的片段将分离入第一/最低部分，而来自于包含小前突变的FMR1基因的片段(也就是69-102个串联重复)将分离入第二部分，而来自于包含大前突变(也就是103-200个串联重复)和包含具有201-202个串联重复的全突变的FMR1基因的片段将分离入第三部分，而具有大于202个串联重复的全突变将分离进入第四/最高部分。

【0097】在确定FMR1基因串联重复数量的试验的另一优选实施方式中，用SphI和BmtI组合片段化的DNA被分离成对应于大小大约小于或者等于500bp(第一/最低部分)、501-800bp(第二部分)、801-900bp(第三部分)和901bp-9kp(第四/最高部分)的四个部分。来自于包含正常FMR1基因的样品的片段(也就是小于55个串联重复)和那些包含具有56-62个串联重复的前突变的片段将分离进入第一/最低部分，而来自于包含小前突变的FMR1基因的片段(也就是63-163个串联重复)将分离入第二部分，而来自包含大前突变的FMR1基因的片段(也就是164-196个串联重复)将分离入第三部分，和具有197-200个串联重复的大前突变和全突变(也就是大于200个串联重复)将分离入第四/最高部分。

【0098】在确定FMR1基因串联重复数量的试验的另一优选实施方式中，用BlpI和dMlyI组合片段化的DNA被分离成对应于大小大约小于或者等于603bp(第一/最低部分)、604-840bp(第二部分)、841-1078bp(第三部分)和1079bp-9kp(第四/最高部分)的四个部分。来自于包含正常FMR1基因的样品的片段(也就是小于55个串联重复)和那些包含具有56-62个串联重复的前突变的片段将分离入第一/最低部分，而来自于包含小前突变的FMR1基因的片段(也就是63-140个串联重复)将分离进入第二部分，而来自于含有大前突变(也就是141-200个串联重复)和具有201-220个串联重复的全突变的FMR1基因的片段将分离入第三部分，和具有大于220个串联重复的大的前突变将分离入第四/最高部分。

【0099】在另外优选实施方式中，片段化的DNA依据大小分离成为多个部分。使用例如预置部分时间窗口(preset fraction time window)来实现部分的自动收集，在大约200bp开始和在9kb终结。这种方法使得能够较精细地估计片段大小，和由此估计重复的数量。

DNA的第二次片段化

【00100】在还有其它优选实施方式中，本发明方法包括在第一核酸片段化的大小分离后进行第二次核酸片段化。优选地，用限制性内切核酸酶消化来进一步断裂DNA。优选地，第二次片段化将串联重复区段与连接的标记序列分离。

【00101】在优选的实施方式中，当标记序列位于串联重复区段的上游时，使用限制性酶BsaWI、Hpy188I、HphI或者BstNI进行核酸第二次片段化。在其它优选实施方式中，当标记序列位于串联重复区段的下游时，使用限制性酶SmlI、BbvI或者BmtI进行核酸第二次片段化。本领域技术人员会认识到，也可以使用所列出的限制性酶的同切点酶和异切点酶。通过分析包括标记位置、标记序列以及标记序列与串联重复区段之间序列的因素，但是不限于此，本领域技术人员将能够鉴定用于第二次核酸片段化的合适的限制性酶。

大小分离的DNA片段或者第二次片段化后的DNA片段的扩增

【00102】大小分离的DNA可以通过本领域技术人员已知的各种方法扩增。适合本方法使用的扩增方法包括例如聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)、基于核酸序列的扩增(NASBA)反应、自动维持序列复制(3SR)、链置换扩增(SDA)反应、反向DNA扩增(boomerang DNAamplification)(BDA)、Q-β复制或等温核酸序列依赖性扩增。在下文对这些扩增方法每个进行简单描述，这些扩增方法在现有技术中是众所周知的。

【00103】PCR是用于产生特定模板DNA序列的许多拷贝的技术。反应由多个扩增循环组成和使用杂交到将被复制序列的5’和3’端的一对引物序列来起始。扩增循环包括最初的变性、最高达50个循环的退火、链延伸和链分离(变性)。在反应的每个循环中，引物之间的DNA序列进行了复制。引物能够结合到复制的DNA以及原始的模板序列，因此整个拷贝数随着时间推移以指数增加。可以依照Whelan等，Journal of Clinical Microbiology，33(3)：556-561(1995)，进行PCR。简单地说，PCR反应混合物包括两条特定的引物、dNTPs、大约0.25U的Taq聚合酶和1×PCR缓冲液。对于每25微升的PCR反应，加入2微升样品(例如来自目标生物中的分离DNA)和使用热循环仪进行扩增。

【00104】LCR是类似于PCR的DNA扩增方法，除了它使用四条引物而不是两条引物和使用连接酶来连接或者结合两个DNA区段之外。可以依照Moore等，Journal of Clinical Microbiology 36(4)：1028-1031(1998)，进行LCR。简单地说，LCR反应混合物包含大约90微升的两对引物、dNTPs、DNA连接酶和DNA聚合酶，加入100微升从目标生物中分离的核酸。使用热循环仪进行扩增(例如，LCx，来自Abbott Labs，North Chicago，IL)。

【00105】TAS是每个循环由cDNA合成步骤和RNA转录步骤组成的核酸扩增系统。在cDN合成步骤中，由DNA依赖的RNA聚合酶所识别的序列(也就是聚合酶结合序列或者PBS)被插入待扩增的目标或者标记序列下游的cDNA拷贝中，这利用双结构域的寡核苷酸引物进行。在第二步骤中，使用RNA聚合酶从cDNA模板合成多拷贝的RNA。使用TAS的扩增仅需要少数几个循环，因为DNA依赖性的RAN转录对于每个cDNA模板的拷贝能够产生10-1000个拷贝。可以依照Kwoh等，PNAS 86：1173-7(1989)进行TAS。简单而言，提取的RNA与TAS扩增缓冲液和牛血清白蛋白、dNTPs、NTPs和其中一个包含PBS的两个寡核苷酸引物组合在一起。加热样品使RNA模板变性并冷却到引物退火的温度。反转录酶(RT)加入到在合适温度温育的样品中，使cDNA延伸。随后，加入T7 RNA聚合酶，样品在37℃温育大约25分钟，用于合成RNA。然后重复上述步骤。可选地，在最初的cDNA合成之后，在1分钟100℃变性后，加入RT和RNA聚合酶，接着在37℃下RNA延伸大约30分钟。也可以依照Wylie等，Journal of ClinicalMicrobiology，36(12)：3488-3491(1998)，在固相上进行TAS。在这种方法中，用包含特定捕获引物的磁珠来捕获目标核酸。在加入包含扩增引物、dNTP、NTP、2500U的反转录酶和2500U的T7 RNA聚合酶的扩增试剂之前，携带捕获的目标的磁珠进行清洗和沉淀。100微升的TMA反应混合物放置到试管中，加入200微升的油试剂(oil reagent)和通过在42℃水浴中温育1小时来完成扩增。

【00106】NASBA是从RNA或者DNA目标物扩增RNA的转录依赖性扩增方法。NASBA是用于在单一混合物在一个温度中连续扩增核酸的方法。例如，对于RNA扩增，使用禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶、核糖核酸酶H和T7RAN聚合酶。可以依照Heim等，Nucleic Acids Res.，26(9)：2250-2251(1998)进行该方法。简单而言，NASBA反应混合物包含两种特定引物、dNTP、NTP、6.4U的AMV反转录酶、0.08U的大肠杆菌核糖核酸酶H和32U的T7 RNA聚合酶。在20微升总体积中，于41℃，进行扩增120分钟。

【00107】在相关的方法中，自动维持序列扩增(3SR)反应、等温扩增目标DNA或者RAN的序列在体外使用三种酶活性：反转录酶、DNA依赖性RNA聚合酶和大肠杆菌核糖核酸酶H。通过使用人类免疫缺陷病毒(HIV)-1反转录酶代替禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶，可将这种方法从3-酶系统改良为2-酶系统，从而使得能用T7 RNA聚合酶扩增，而无需大肠杆菌核糖核酸酶H。在2-酶的3SR中，与3-酶3SR进行比较，得到较纯形式的扩增RNA(Gebinoga & OehlenschlagerEuropean Journal of Biochemistry，235：256-261，1996)。

【00100】SDA是一种等温核酸扩增方法。包含限制位点的引物与模板退火。扩增引物随后与5’邻近序列退火(形成切口)，和在固定温度开始扩增。新合成的DNA链通过限制性酶形成切口，聚合酶扩增再次开始，从而替代新合成的链。可以依照Walker等，PNAS，89：392-6(1992)进行SDA。简单而言，SDA反应混合物包含四种SDA引物、dGTP、dCTP、TTP、dATP、150U的Hinc II和5U的核酸外切酶缺陷的大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段(外-Klenow聚合酶)。在加入酶之前，样品混合物加热到95℃、4分钟，使得目标DNA变性。在加入两种酶之后，在50微升的总体积中于37℃，进行扩增120分钟。随后，在95℃加热2分钟，终止反应。

【0101】反向DNA扩增(BDA)是这样的方法，其中聚合酶从单个引物-结合位点延伸，随后围绕另一条链产生环，从而最终回到DNA上的原始引发点。BDA因其使用单一引物而不同于PCR。这种方法涉及核酸内切酶消化核酸样品DNA、产生具有黏性末端的离散DNA片段、将片段连接到“衔接(adapter)”多核苷酸(由可连接端和间隔序列所分开的第一及第二自互补序列组成)，由此形成连接的双链体。连接的双链体变性形成模板，寡核苷酸引物在感兴趣的目标或者标记序列之内的特异序列处与该模板退火。用DNA聚合酶延伸引物以形成双链体产物，接着变性双链体产物。随后进行多个循环后的退火、延伸和变性以获得期望程度的扩增(美国专利号5,470,724)。

【0102】Qβ复制系统使用RNA作为模板。Qβ复制酶合成大肠杆菌噬菌体Qβ的单链RNA基因组。当RNA通过Qβ复制酶进行复制时，剪切RNA和在感兴趣的核酸中连接，从而复制该序列(Kramer & Lizardi Trends Biotechnol.19919(2)：53-8，1991)。

【0103】多种扩增酶在现有技术中是众所周知的，包括例如DNA聚合酶、RNA聚合酶、反转录酶、Qβ复制酶、耐热DNA和RNA聚合酶。因为这些和其它的扩增反应由酶催化，在单步骤试验中，核酸释放试剂和检测试剂不应该是扩增酶的潜在抑制剂，如果最终检测是基于扩增的话。适用于本方法的扩增方法包括例如链置换扩增、滚环扩增、引物延伸预扩增或者简并寡核苷酸PCR(DOP)。这些扩增方法在现有技术中是众所周知的并且每一个在下文被简单描述。

【0104】优选地，使用PCR扩增位于感兴趣的串联重复区段侧翼的目标或者标记序列。在这个方法中，与目标或者标记序列的相反链退火的两个或者多个寡核苷酸引物反复与它们的互补序列退火，通过DNA聚合酶延伸(例如AmpliTaqGold聚合酶)、和热变性，从而导致目标核酸序列的指数扩增。循环参数可以变化，这取决于将被延伸的核酸长度。本领域人员能够设计和制备适合于扩增目标或者标记序列的引物。用于本发明的扩增引物的长度取决于数个因素，包括核苷酸序列同一性和这些核酸在体外核酸扩增期间的杂交或者使用时的温度。必须要考虑确定特定序列同一性的扩增引物的优选长度，这是本领域技术人员是众所周知的，并包括在这里所描述的考虑。例如，短的核酸或者寡核苷酸的长度可能关系到其杂交特异性或者选择性。

【0105】在一些实施方式中，扩增可包括标记的引物，由此允许检测引物的扩增产物。在特定实施方式中，扩增可包括多样性的标记引物，优选地这样的引物被可区别地标记，允许同时检测多种扩增产物。

【0106】可以设计寡核苷酸引物，其为大约10到大约100个核苷酸长度并与标记序列杂交。寡核苷酸引物的长度优选12到70个核苷酸，更优选15到60个核苷酸长度；和最优选地15到25个核酸长度。

【0107】在一个实施方式中，引物对被设计为在对由AluI所断裂的核酸进行大小分离之后，扩增FMR1基因的串联重复区域上游的标记序列。用于设计杂交引物的FMR1串联重复区域的上游的示例性标记序列在图2中描述(SEQ ID NO：1)。正向引物能够杂交到SEQ ID NO：1的核苷酸1到45之间，更优选地位于22到39之间，而反向引物能够杂交到SEQ ID NO：1的位于70到115之间，更优选地在97到113之间。一个例子是使用引物对扩增对应于串联重复区域上游的大约95bp的侧翼序列区域；更具体地使用正向引物SEQ ID NO：4和反向引物SEQ IDNO：5去扩增标记序列的93bp区域。因此，可以用作扩增引物的优选的寡核苷酸包括SEQ ID NO：4(5′-GGTGGAGGGCCGCCTCTG-3′)和SEQ ID NO：5(5′-AGCGGCGCCTCCGTCACC-3′)。其它优选的寡核苷酸引物长度大约15-100核苷酸和包括SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5。还有其它优选的寡核苷酸引物包括与15-100核苷酸序列的互补序列杂交的寡核苷酸序列，包括SEQ ID NO：4或SEQID NO：5。这样的寡核苷酸可以是基本纯化的。

表2.用于扩增位于FMR1侧翼的标记序列的引物

引物名称	SEQ ID NO：	引物序列
引物名称	SEQ ID NO：	引物序列	FMR1F4	4	5′-GGTGGAGGGCCGCCTCTG-3′
FMR1R4	5	5′-AGCGGCGCCTCCGTCACC-3′	FMR1F4	4	5′-GGTGGAGGGCCGCCTCTG-3′
FMR1R4	5	5′-AGCGGCGCCTCCGTCACC-3′	FXCEF2	6	5′-GATGGAGGAGCTGGTGGTGG-3′
FXCER2	7	5′-GGAAGGGCGAAGATGGGG-3′	FXCEF2	6	5′-GATGGAGGAGCTGGTGGTGG-3′
FXCER2	7	5′-GGAAGGGCGAAGATGGGG-3′	FXCEF3	8	5′-CGTGACGTGGTTTCAGTGTTTACA-3’
FXCER3	9	5′GGAAGTGAAACCGAAACGGAG-3′	FXCEF3	8	5′-CGTGACGTGGTTTCAGTGTTTACA-3’

【0108】在另外一个实施方式中，引物对被设计为在对由BlpI和MlyI所断裂的核酸进行大小分离之后，扩增位于FMR1基因的串联重复区域侧翼的标记序列。在一个例子中，引物对被用于扩增串联重复区域下游的侧翼序列的区域；更特定使用正向引物FXCEF2(SEQ ID NO：6)和反向引物FXCER2(SEQ ID NO：7)来扩增标记序列的86bp区域。因此，可以用作为扩增引物的优选寡核苷酸包括SEQID NO：6(5′-GATGGAGGAGCTGGTGGTGG-3′)和SEQ ID NO：7(5′-GGAAGGGCGAAGATGGGG-3′)。其它优选的寡核苷酸引物长度大约15-100个核苷酸和包括SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7。还有其它更优选的寡核苷酸引物包括杂交到15-100个核苷酸序列的互补序列的寡核苷酸序列，包括SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7。这样的寡核苷酸可以是基本上纯化的。

【0109】在另外一个实施方式中，引物对被设计为在对由SphI和BmtI所断裂的核酸进行大小分离之后，扩增位于FMR1基因串联重复区域侧翼的标记序列。在一个例子中，引物对被用于扩增串联重复区域下游侧翼序列区域；更特异地使用正向引物FXCEF3(SEQ ID NO：8)和反向引物FXCER3(SEQ ID NO：9)来扩增标记序列的86bp区域。因此，可用作扩增引物的优选寡核苷酸包括SEQ ID NO：8(5′-CGTGACGTGGTTTCAGTGTTTACA-3′)和SEQ ID NO：9(5′-GGAAGTGAAACCGAAACGGAG-3′)。其它优选的寡核苷酸引物长度大约15-100个核苷酸并包括SEQ ID NO：8或者SEQ ID NO：9。还有其它优选的寡核苷酸引物包括杂交到15-100个核苷酸序列的互补序列的寡核苷酸序列，包括SEQID NO：8或SEQ ID NO：9。这样的寡核苷酸可以是基本上纯化的。

【0110】试验对照可以被用于试验中以检测携带者和受脆性X综合症影响的个体。可以使用用于正常或者野生型FMR1基因(例如小于55个串联重复)、前突变(55-200个串联重复)和全突变(大于200个串联重复)的阳性对照。

【0111】额外的对照可以被包括于试验中以确定基因组DNA的限制性酶消化是否完成。一种评价由特定限制性酶进行消化的完成情况的方法，是通过使用跨越用于消化的限制性酶位点的测试引物对来确定消化的DNA是否能够支持PCR扩增。因此，如果核酸已被限制性酶完全消化，则应该没有来自于测试引物对的扩增，然而，如果消化不完全，留下一些完整的核酸，则测试引物对应该扩增目标。在消化之后任何时间，包括在标记序列的扩增期间，能够进行该测试消化PCR扩增。

表3.示例性对照引物

引物名称	SEQ ID NO：	引物序列
引物名称	SEQ ID NO：	引物序列	AluIF	10	5′-CTCCAATGCCTCCTGCGTCC-3′
AluIR	11	5′-GGGGGTAGGGAGTGTCTGAGAGTCT-3′	AluIF	10	5′-CTCCAATGCCTCCTGCGTCC-3′
AluIR	11	5′-GGGGGTAGGGAGTGTCTGAGAGTCT-3′	BlpIF	12	5′-AGTGTTTAGAAGGAAAAGGCTGAGC-3′
BlpIR	13	5′-GCCCAAAGTTTCATAGGTAGCAAA-3′	BlpIF	12	5′-AGTGTTTAGAAGGAAAAGGCTGAGC-3′
BlpIR	13	5′-GCCCAAAGTTTCATAGGTAGCAAA-3′	LargeF	14	5′-CACCCTACAAGCCGTCGCTAACA-3′
LargeR	15	5′-CGTGCCTTGTCGGTATCATTAGCAA-3′	LargeF	14	5′-CACCCTACAAGCCGTCGCTAACA-3′
LargeR	15	5′-CGTGCCTTGTCGGTATCATTAGCAA-3′	FIIctrl1F	16	5′-CTGAATTTGTTTGGTTTGATGATGC-3′
FIIctrl1R	17	5′-CCTGTGTTATCTGTGCCCATTTTAA-3′	FIIctrl1F	16	5′-CTGAATTTGTTTGGTTTGATGATGC-3′
FIIctrl1R	17	5′-CCTGTGTTATCTGTGCCCATTTTAA-3′	FIIIctrl3F	18	5′-/6-FAM/ATCTGGGTCTGAATAATGTGAGGAG-3′
FIIIctrl3R	19	5′-CCTAACTTTCATTCTTGTCACCCTT-3′	FIIIctrl3F	18	5′-/6-FAM/ATCTGGGTCTGAATAATGTGAGGAG-3′
FIIIctrl3R	19	5′-CCTAACTTTCATTCTTGTCACCCTT-3′	LgctrlF	20	5′-/6-FAM/AGGTTTGAGTGTATCGCCTGATAGA-3′
LgctrlR	21	5′-TGAGTTTCATGTTTGCTCTTGCTC-3′	LgctrlF	20	5′-/6-FAM/AGGTTTGAGTGTATCGCCTGATAGA-3′
LgctrlR	21	5′-TGAGTTTCATGTTTGCTCTTGCTC-3′	AluIFtaq	22	5′-GCCTCCTGCGTCCTTGTAGA-3′
AluIRtaq	23	5′-TGAGAGTCTTGTTTCAGCAGTGTTAA-3′	AluIFtaq	22	5′-GCCTCCTGCGTCCTTGTAGA-3′
AluIRtaq	23	5′-TGAGAGTCTTGTTTCAGCAGTGTTAA-3′	LargeFtaq	24	5′-CAAGCCGTCGCTAACAAGGA-3′
LargeRtaq	25	5′-GATGTCTTGTATGGTGCCCTCAT-3′	LargeFtaq	24	5′-CAAGCCGTCGCTAACAAGGA-3′

【0112】在从携带者和受到脆性X综合症影响的个体中区别正常个体的试验的特定实施方式中，基因组DNA用AluI消化。因此，通过扩增包含AluI识别位点的区域能够确定AluI消化基因组DNA的完成。在这样对照的一个例子中，使用一对引物AluIF和AluIR(各自为SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11)来扩增包含AluI识别位点的核酸片段的103bp目标区段。当AluI消化不完全时，将仅出现这种区段的扩增。在这种试验的另一种优选实施方式中，用BlpI和MlyI来消化基因组DNA。因此，通过扩增包含BlpI或MlyI的识别位点的区域，能够确定用BlpI和MlyI消化基因组DNA的完成。在这样对照的一个例子中，使用一对引物BlpIF和BlpIR(各自为SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13)来扩增包含BlpI识别位点的核酸的目标区段的138bp区段。当BlpI消化不完全时，将仅出现这种区段的扩增。

【0113】为验证合适大小分离的片段化DNA，在试验中可包含额外的对照。使用本领域技术人员已知的序列分析工具，本领域技术人员能够确定通过使用特定限制性酶得到的片段的大小分布。本领域技术人员随后能够识别具有对应于特定部分的大小范围的大小的特定对照片段。因此通过检测在针对其大小的适当部分中的对照片段，本领域技术人员能够验证片段化DNA的合适的大小分离。本领域技术人员可以在一个部分中使用单一的对照片段，在每个部分中与正常对异常串联重复的确定相关的对照，或者在所有部分中的对照部分。

【0114】在从具有前突变FMR1等位基因的那些个体和具有全突变FMR1等位基因的那些个体中区别具有正常FMR1等位基因的个体的试验的特定实施方式中，也包括对照扩增来确定包含最大串联重复的片段(通过用AluI消化获得)是否收集入大小合适的部分中。在这样的对照的一个例子中，当存在于部分中时，一对引物LargeF和LargeR(各自为SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15)将扩增USP41基因的8,479bp AluI片段的121bp区段。在试验的另一个实施方式中，在其中用BlpI和MlyI消化基因组DNA，包括对照以检测合适大小分离的675bp、905bp和7,031bp的片段。在一个例子中，当存在于部分中时，一对引物FIIctrl1F和FIIctrl1R(分别为SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17)将扩增CFTR基因的675bpBlpI/MlyI片段的102bp区段。在另一个例子中，当存在于部分中时，一对引物FIIIctrl3F和FIIIctrl3R(分别为SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19)将扩增CFTR基因的905bp BlpI/MlyI片段的113bp区段。在另外一个实例中，当存在于部分中时，一对引物LgctrlF和LgctrlR((分别为SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21)将扩增来自于染色体21(21：20912766-20919795)的7,031bp BlpI/MlyI片段的156bp区段。

标记序列的检测

【0115】在检测之前可扩增标记序列或者可在大小分离之后不进行扩增步骤而直接检测标记序列。在一些实施方式中，扩增标记序列和通过电泳检测生成的扩增子，优选毛细管电泳。在优选实施方式中，用标记的引物来扩增标记序列，这样生成的扩增子被可检测地标记。在优选的实施方式中，引物对被荧光标记，然而，可以依照以下针对寡核苷酸探针所描述的方法，标记引物。

【0116】在优选的实施方式中，直接检测片段化的DNA，而不进行扩增步骤，使用与串联重复上游或者下游的标记序列的两个分开的区段杂交的两种可区别地标记的核酸探针。在一个杂交复合体中同时检测两种标记表示标记序列的存在(和因此表示连接的串联重复的存在)。在一个实施方式中，使用Trilogy 2020Analyzer(US Genomics Woburn，MA)完成检测。在这个实施方式中，带有可区别荧光标记的两种探针与大小分离的DNA片段接触。生成的杂交复合体混合物被引入毛细管，在其中它暴露于多种不同波长的激光。探针的荧光标记被激发，这样光子被发射和检测。同时检测到不同颜色的荧光标记表示目标区域的存在。

【0117】寡核苷酸探针可以通过本领域已知的方法可检测地标记。有用的标记包括例如荧光染料(例如

异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、镧磷(lanthamide phosphors)、得克萨斯红)、³²P、³⁵S、³H、¹⁴C、¹²⁵I和¹³¹I、电子致密试剂(例如金)、例如在ELISA中通常使用的酶(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、色度标记(例如胶体金)、磁标记(例如Dynabeads^TM)、生物素、地高辛，或半抗原和可得到抗血清或者单克隆抗体的蛋白质。其它标记包括能够分别与相应受体或者寡核苷酸补体形成复合物的配体或者寡核苷酸。标记能够直接整合入待检测的核酸，或者其能够连接到与待检测的核酸杂交或者结合的探针(例如寡核苷酸)或者抗体。

【0118】在一个优选的实施方式中，可检测的标记是荧光团。在这里所使用的术语“荧光团”指这样的分子，其在特定波长(激发频率)吸收光，并且作为响应随后发射不同的，通常更长的波长(发射频率)的光。合适的荧光分子包括现有技术中已知的以下荧光团：

4-乙酰氨基-4′-异硫氰酸芪-2，2′-二磺酸；

吖啶和衍生物：

吖啶

异硫氰酸吖啶

Alexa350、Alexa

488、Alexa

546、Alexa555、Alexa568、Alexa

594、Alexa

647(分子探针)

5-(2′-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(ENANS)

4-氨基-N-[3-乙烯砜基)苯基]萘二甲酰亚胺-3，5二磺酸酯(Lucifer Yellow VS)

N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺

邻氨基苯甲酰胺

Black Hole Quencher^TM(BHQTM))染料((biosearch Technologies)R-6G、

530/550、

FL

亮黄颜料(Brilliant Yellow)

香豆素和衍生物：

香豆素

7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)

7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)

焰红染料(cyanosine)

4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)

5′，5”-二溴代焦棓酸-磺酞(Bromopyrogallol Red)

7-二乙氨基-3-(4′-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素

二亚乙基三胺五乙酸酯

4，4′-二异硫氰酸二氢-芪-2，2′-二磺酸

4，4′-二异硫氰酸芪-2，2′-二磺酸

5-[二甲氨基]萘基-1-磺酰氯(DNS，丹酰氯)

4-(4′-二甲氨基苯基偶氮基)苯甲酸(DABCYL)

4-二甲氨基苯基偶氮苯基-4′-异硫氰酸酯(DABITC)

Eclipse^TM(Epoch Biosciences Inc.)

曙红及衍生物：

曙红

曙红异硫氰酸酯

赤藓红及衍生物：

赤藓红B

赤藓红异硫氰酸酯

溴化乙锭

荧光素及衍生物：

5-羧基荧光素(FAM)

5-(4，6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)

2′，7′-二甲氧基-4′5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)

荧光素

荧光素异硫氰酸酯(FITC)

六氯-6-羧基荧光素(HEX)

QFITC(XRITC)

四氯荧光素(TET)

荧光胺

IR144

IR1446

孔雀绿异硫氰酸酯

4-甲基伞形酮

邻甲酚酞

硝基酪氨酸

副品红碱

酚红

B-藻红蛋白、R-藻红蛋白

邻酞二醛

Oregon

碘化丙啶

芘及衍生物：

芘

芘丁酸酯

琥珀酰亚胺1-芘丁酸酯

7、9、

21、35(分子探针)

活性红4(

亮红3B-A)

罗丹明及衍生物：

6-羧基-X-罗丹明(ROX)

6-羧基罗丹明(R6G)

丽丝胺罗丹明B磺酰氯

罗丹明(Rhod)

罗丹明B

罗丹明123

罗丹明绿

罗丹明X异硫氰酸酯

硫氰酸胺B

硫氰酸胺101

硫氰酸胺101的磺酰氯衍生物(德州红)

N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)

四甲基罗丹明

四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)

核黄素

玫红酸

铽螯合物衍生物。

【0119】也可使用其它的荧光核苷酸类似物，参见Jameson，Meth.Enzymol.278：363-390，1997；Zhu，Nucl.Acids Res.22：3418-3422，1994。美国专利5,652,099和6,268,132也描述了用于结合进入核酸的核苷酸类似物，例如DNA和/或RNA，或者寡核苷酸，经过酶或者化学合成以产生荧光寡核苷酸。美国专利5,135,717描述了用作荧光标记的酞菁染料和四苯并叠氮卟啉(tetrabenztriazaporphyrin)试剂。

【0120】可检测的标记能够合并入、连接或者结合到核酸。标记可以通过各种长度的间隔臂连接，以减少潜在的位阻或者对其它有用或期望性质的影响。参见，例如，Mansfield，Mol.Cell.Probes 9：145-156，1995。

【0121】通过共价或者非共价的方法能够将可检测标记合并入核酸，例如通过转录，如通过使用Klenow聚合酶的随机引物标记、或者切口移位、或者扩增、或者在现有技术中已知等同方法。例如，核苷酸碱基与可检测部分结合，如荧光染料，例如

或者

然后在核酸合成或者扩增期间合并入基因组核酸。当使用与未标记dCTP混合的

-或者

-dCTP偶联物合成时，由此能够标记核酸。

【0122】在标记的前体核苷酸存在时，通过使用PCR或者切口移位能够标记核酸探针，例如，可以使用通过偶联烯丙胺-dUTP到荧光染料或者半抗原(如生物素或者地高辛)的琥珀酰亚胺酯衍生物所合成的修饰的核苷酸；这种方法使得能定制最常见的荧光核苷酸，参见，Henegariu，Nat.Biotechnol.18：345-348，2000。

【0123】核酸可以通过现有技术中已知的非共价方法标记。例如，KreatechBiotechnology’s Universal Linkage

提供了一种非酶标记技术，其中通过结合到鸟嘌呤的N7位置，铂基团与DNA、RNA或者核苷酸形成了配位键。通过结合到包含氮和硫的氨基酸侧链，这种技术也可用于标记蛋白。参见，例如美国专利号5,580,990；5,714,327和5,985,566；和欧洲专利号0539466。

【0124】通过杂交可以确定探针与位于串联重复区域侧翼的标记序列的结合，这在现有技术中是众所周知的。可以实时或者非实时地检测杂交。

【0125】用于实时PCR的一种常用方法使用荧光探针例如

探针、分子信标和蝎(scorpions)。在

和分子信标技术中所应用的探针基于荧光淬灭原理并涉及供体荧光团和淬灭部分。

【0126】在这里所使用的术语“供体荧光团”意思是当紧邻淬灭剂部分时，供给或者转移发射能量到淬灭剂的荧光团。由于将能量供给淬灭剂部分，供体荧光团自身将以特定的发射频率发出较少的光，这会在缺乏紧密安置的淬灭剂部分时发生。

【0127】在这里所使用的术语“淬灭剂部分”意思是这样的分子，其当紧邻供体荧光团时，吸收通过供体所产生的发射能量和以热的形式消散能量或者发射波长比供体的发射波长长的光。在后者的情况下，据认为淬灭剂是受体荧光团。淬灭部分能够经近端(也就是，碰撞的)淬灭或者通过或者荧光共振能量转移(“FRET”)来起作用。通过FRET进行的淬灭在

探针中广泛地使用，而近端淬灭在分子信标和蝎类探针中使用。

【0128】在近端淬灭(也叫做“接触”或者“碰撞”淬灭)中，供体紧密接近淬灭剂部分，这样供体能量转移到淬灭剂，其以热的形式消散能量而不是荧光发射。在FRET淬灭中，供体荧光团转移它的能量到淬灭剂，在较高波长作为荧光来释放能量。近端淬灭要求供体和淬灭剂部分的位置非常接近，而FRET淬灭——其也是距离相关的，在较大的距离发生(一般1-10纳米，能量转移取决于R^-6，其中R是供体和受体之间的距离)。因此，当涉及FRET淬灭时，淬灭部分是具有与供体发射频率光谱重叠的激发频率光谱的受体荧光团。当通过应用FRET淬灭时，试验可以检测到供体荧光团荧光的增加和受体荧光团发射的减少，其中供体荧光团荧光的增加由于供体和淬灭剂(受体荧光团)之间增加的距离所致，受体荧光团发射的减少由于供体和淬灭剂(受体荧光团)之间增加的距离所致。

【0129】探针(Heid等，1996)使用Taq聚合酶的荧光5′核酸外切酶活性来测量在DNA样品中目标或者标记序列的量。

探针是通常在或者接近5′碱基包含供体荧光团以及通常在或者接近3′碱基包含淬灭部分的寡核苷酸。淬灭剂部分可以是染料例如TAMRA，或者可以是非荧光分子例如4-(4′-二甲氨基苯基偶氮基)苯甲酸(DABCYL)。参见Tyagi等，Nature Biotechnology 16：49-53(1998)。当照射时，通过FRET而不是发荧光，激发的荧光供体转移能量到附近的淬灭部分。因此，供体和淬灭剂的紧密近端阻止供体荧光的发射，而探针是完整的。

【0130】

探针被设计成与PCR产物的内部区域退火。当聚合酶复制其上结合探针的模板时，它的5′核酸外切酶活性剪切探针。这结束了淬灭剂活性(没有FRET)并且供体荧光团开始发射荧光，荧光在每个循环中与探针剪切速度成比例地增加。通过监测报道染料荧光的增加来检测PCR产物的积聚(注意，引物没有被标记)。如果淬灭剂是受体荧光团，那么可以通过监测受体荧光团的荧光减少检测PCR产物的积聚。

【0131】试验使用通用的热循环参数和PCR反应条件。因为仅如果探针杂交到目标才出现剪切，所以所检测的荧光源于特定的扩增。杂交和剪切的过程不妨碍产物的指数积聚。一个对于荧光探针的特定要求是在5′端没有G。与报告染料邻近的′G′淬灭报告荧光，即使在剪切之后。

【0132】其它实时检测的探针杂交的方法能够用于检测位于串联重复区域侧翼的目标或者标记序列的扩增。例如，可以使用商业上可获得的MGB Eclipse^TM探针(Epoch Biosciences)，其不依赖于探针降解。MGB Eclipse^TM探针通过杂交触发的荧光机理来工作。MGB Eclipse^TM探针具有Eclipse^TM的黑淬灭剂(Dark Quencher)和位于探针5′-端的MGB。荧光团位于探针的3′-端。当探针在溶液中和不杂交时，三维构造使得淬灭剂紧密接近荧光团，并且荧光被淬灭。然而，当探针与目标或者标记序列退火时，探针被展开，淬灭剂从荧光团中移去，和能够检测产生的荧光。

【0133】合适的供体荧光团包括6-羧基荧光素(FAM)、四氯-6-羧基荧光素(TET)、2’-氯-7’-苯基-1，4-二氯-6-羧基荧光素(VIC)等。合适的淬灭剂包括四-甲基羧基罗丹明(TAMRA)、4-(4-二甲氨基苯基偶氮基)苯甲酸(“DABCYL”或者DABCYL类似物)等。四甲基罗丹明(TMR)或者5-羧基罗丹明6G(RHD)可作为供体荧光团与作为淬灭剂的DABCYL组合。可以使用每个包含不同供体和淬灭剂组合的多个可检测标记，进行多重TaqMan试验。用于实时检测扩增序列的探针可以冷冻存放(-10℃到-30℃)如100微升库存量。可以从Applied BioSystems(4316032)获得TaqMan探针。

【0134】在一个优选的实施方式中，可以使用与合适的扩增/分析仪如ABIPrism 7900HT序列检测系统组合的

探针，进行实时PCR。ABI

7900HT序列检测系统是一种检测和定量核酸序列的高通量实时PCR系统。简单而言，在PCR扩增反应中包含对扩增的目标或者标记序列特异的

探针。这些探针在5′端包含报告染料，和在3′端包含淬灭剂染料。将与不同目标或者标记序列杂交的探针与不同的荧光报告染料结合。在PCR期间，荧光标记的探针特异结合它们各自的目标或者标记序列；Taq聚合酶的5′核酸酶活性从探针剪切报告染料并且产生荧光信号。只有目标或者标记序列与探针互补和在PCR期间扩增，才检测到荧光信号增加。探针和目标之间的错配大大降低探针杂交和剪切的效率。ABI Prism 7700HT或7900HT序列检测系统测量在PCR热循环期间的荧光增加，从而提供了PCR产物积聚的“实时”检测。

【0135】在ABI Prism 7700HT或7900HT序列检测仪上的实时检测监测荧光和计算在每个PCR循环期间的Rn。阈循环或者Ct值是荧光相交阈值时的循环。通过序列检测系统软件或者手工确定阈值。

【0136】可以设计长度在大约10至大约100个核苷酸之间并与扩增区域杂交的寡核苷酸探针。寡核苷酸探针优选地是在12到70个核苷酸之间；更优选地是长度在15-60个核苷酸；和最优选地在长度上15-25个核苷酸。探针可以是标记的。在一个例子中，当分别用SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5中所说明的正向和反向引物扩增标记序列时，可以使用SEQ ID NO：26作为寡核苷酸探针来检测与FMR1基因的串联重复区域连接的标记序列(在通过AluI的基因组片段化之后)。可以使用SEQ ID NO：27来检测由AluIFtaq和AluIRtaq(各自为SEQ ID NO：22和23)所扩增的AluI对照片段扩增子，和可以使用SEQ ID NO：28来检测由LargeFtaq和LargeRtaq(各自为SEQ ID NOs：24和25)所扩增的8,479bp AluI对照片段扩增子。

表4.Taqman探针

探针名称	SEQ ID NO：	探针序列
探针名称	SEQ ID NO：	探针序列	CGG侧翼	26	5’-6-FAM-CTCTGAGCGGGCG-3’
AluI对照	27	5’-VIC-AGGAAGCTAAGCAGTTG-3’	CGG侧翼	26	5’-6-FAM-CTCTGAGCGGGCG-3’
AluI对照	27	5’-VIC-AGGAAGCTAAGCAGTTG-3’	大对照	28	5’-NED-ACTGTACACAACATCG-3’

【0137】可以使用标准凝胶电泳方法检测扩增片段。例如，在一个优选的实施方式中，扩增部分在琼脂糖凝胶上分离和通过使用现有技术中已知的方法用溴化乙锭染色，以检测扩增片段。

通过PCR扩增和电泳进行大小排列(sizing)

【0138】在某些实施方式中，涉及扩增串联重复区域的方法被用于测量区域的大小。在一些实施方式中，使用这种方法作为在使用第二种方法按大小排列串联重复区域之前的筛选。在优选的实施方式中，优选地通过PCR进行扩增。在这个方法中，扩增了整个的串联重复区域。使用电泳按大小排列产生的扩增子，优选地是毛细管电泳。

【0139】在一个例子中，在扩增反应中使用正向引物FX-5F(SEQ ID NO：29；5’GCT CAg CTC CgT TTC ggT TTC ACT TCC GGT 3’)及反向引物FX-3F(SEQ IDNO：30；5’-AGC CCC GCA CTT CCA CCA CCA GCT CCT CCA-3’)来扩增FMR1基因的串联重复区域。优选地，这对引物当中一个引物被标记，优选地标记是荧光标记。可通过电泳，优选毛细管电泳，检测和按大小排列扩增产物。可选地，使用Southern印迹检测和按大小排列扩增产物。

片段大小与正常或者携带者/受侵袭状态的相关性

【0140】在其中检测串联重复区域上游或者下游的标记序列的部分对应于包含串联重复的片段的大小。这种相关性使能够估计串联重复区域的数量，和因此估计个体是否正常或者携带具有串联重复区域扩增的等位基因。

【0141】在一些实施方式中，受与在基因中的串联重复区域突变相关疾病所侵袭的个体能够与那些正常个体区分开来。断裂来自个体的核酸样品，产生核酸片段，在其中基因的串联重复区段与片段中标记序列连接。在其中包含串联重复区段的片段会依照串联重复区段中的重复数量定位在部分中的条件下，核酸片段依照大小分离成部分，并通过检测标记序列鉴定那些包含区段的部分。选择部分，以便一个部分对应于具有正常重复数量的串联重复区域(也就是正常的等位基因)和另外一个部分对应于异常数量的重复(也就是突变的等位基因)。如果仅是前一部分是阳性的，那么个体是正常的；如果仅是后一部分是阳性的，那么个体可能是携带者或者可能受疾病侵袭。在两个部分中都是阳性结果则表明是杂合子和个体可能或者可能不受侵袭，这取决于疾病是否是显性的或者隐性的。如果疾病是显性的，杂合子将受到侵袭；如果疾病是隐性的，杂合子将不会受到侵袭，但是会是疾病携带者。

【0142】在其它实施方式中，能够从那些在基因的串联重复区域中具有前突变或者全突变的个体中区别具有正常等位基因的个体。来自个体的核酸样品被断裂产生核酸片段，其中在片段中基因的串联重复区段与标记序列连接。在其中包含串联重复区段的片段会依照串联重复区段中的重复数量定位在部分中的条件下，核酸片段依照大小分离成部分，并通过检测标记序列鉴定那些包含区段的部分。选择部分，以便第一部分对应于具有正常重复数量的串联重复区域(也就是正常等位基因)，第二部分对应于具有前突变中重复数量的串联重复区域(也就是前突变等位基因)，第三部分对应于具有全突变中重复数量的串联重复区域(也就是全突变等位基因)。一般而言，如果仅第一部分是阳性的，那么个体是正常的；如果仅第二部分是阳性的，那么个体携带前突变；如果仅第三部分是阳性的，那么个体是受疾病侵袭的。在一个以上部分中的阳性结果表明是杂合子。杂合子可能是携带者或者受侵袭的个体，这取决于所涉及的基因和疾病的显性。

【0143】在一些实施方式中，具有与脆性X综合症相关的突变的个体(也就是在FMR1基因中全突变)能够与具有前突变或者正常等位基因的个体区分开来。来自个体的核酸样品被断裂产生核酸片段，其中在片段中FMR1基因的串联重复区段与标记序列连接。在其中包含串联重复区段的片段会依照串联重复区段中的重复数量定位在部分中的条件下，片段依照大小分离成部分，并通过检测标记序列鉴定那些包含区段的部分。选择部分，以便第一部分对应于具有正常重复数量的串联重复区域(也就是正常等位基因)，第二部分对应于具有前突变中重复数量的串联重复区域(也就是前突变等位基因)，第三部分对应于具有全突变中重复数量的串联重复区域(也就是全突变等位基因)。在优选的实施方式中，选择部分，以便第一部分对应于具有小于55个重复的串联重复区域，第二部分对应于具有55-200个重复的串联重复区域，以及第三部分对应于具有大于200个重复的串联重复区域。因此，如果第一部分是阳性的(也就是在这个部分中检测到标记序列)，它表明串联重复区域包含小于55个重复(也就是正常等位基因)；如果第二部分是阳性的，它表明串联重复区域包含55-200个重复(也就是前突变等位基因)；如果第三部分是阳性的，它表明串联重复区域包含大于200个重复(也就是全突变等位基因)。在男性个体中，依照这个结果，可以指定显型或者疾病状况。男性一般只拥有一个X染色体(包含FMR1基因的染色体)，因此，如果第一部分是阳性的，个体是正常；如果第二部分是阳性的，个体是前突变携带者；如果第三部分是阳性的，个体受脆性X综合症侵袭。女性有两个X染色体，因此，拥有两个正常等位基因的女性是正常的和拥有前突变等位基因或者全突变基因的女性是携带者。对于正常等位基因和全突变等位基因的杂合的女性可能受或者可能不受侵袭，这取决于其它因素如基因的甲基化状况。

【0144】在区分具有FMR1基因的正常串联重复区域的个体与那些具有前突变或者全突变的个体的试验的某些实施方式中，AluI所断裂的基因组DNA的两个部分通过毛细管电泳分离和通过自动部分收集器来收集，一个是在211-400bp之间，一个是在401bp-9kb之间。具有6-68个重复的AluI片段将存在于下面部分中，因而正常等位基因和那些具有小前突变(也就是55-68个重复)的等位基因将分离入这个部分。通过扩增串联重复区域和通过电泳进行大小分离还可以进一步区分正常等位基因和小前突变。包含69-200个重复范围的前突变和包含201-2000以上重复的全突变将存在于上面部分。因此，如果下面部分是阳性的(也就是在这个部分中检测到标记序列)，它表明存在包含6-68个重复的CGG串联重复区域。如果上面部分是阳性的，它表明存在包含68-2000以上个重复的CGG串联重复区域。两个部分的阳性结果表明是杂合子，其中一个等位基因是正常的，另外一个等位基因包含前突变或者全突变。

【0145】在确定FMR1基因串联重复区域大小的试验的另外实施方式中，用BlpI和dMlyI组合所断裂的DNA被分离成对应于大小大约小于或者等于603bp(第一/最低部分)、604-840bp(第二部分)、841-1078bp(第三部分)和1079-9kb(第四/最高部分)的四个部分。来自于包含正常FMR1基因样品的片段(也就是小于55个串联重复)和那些包含具有56-62个串联重复的前突变的片段将分离入第一/最低部分。通过扩增串联重复区域和用电泳进行大小分离可以进一步区别正常等位基因和小前突变。来自于包含小前突变(也就是63-140个串联重复)的FMR1基因的片段分离入第二个部分，而来自于包含大前突变(也就是141-200个串联重复)和具有201-220个串联重复的全突变的FMR1基因的片段将分离入第三部分，和而具有大于220个串联重复的大前突变将分离入第四/最高部分。使用例如标准Southern印迹方法，能够区别141-200个重复的大前突变和201-220个重复的全突变。

【0146】在另一实施方式中，使用毛细管电泳将AluI消化的基因组DNA根据大小分级成多个部分。使用预先设置的每个部分大约30秒的部分时间窗(fractiontime window)完成自动部分收集，在200bp开始和在9kb结束。大约收集了16个部分。对于串联重复区域上游或下游标记序列的检测是阳性的这个或者这些部分对应于大小范围，并因此能够估计串联重复的数量。

性别确定

【0147】在一些实施方式中，确定性别的核酸试验与确定FMR1基因串联重复区域的长度的试验结合在一起。在优选的实施方式中，核酸试验包括DNA扩增。这样的DNA扩增试验可针对扩增Y染色体特有的序列(例如SRY基因座(Sinclair等，Nature 346：240 244，1990))。在这种情况下，扩增仅在Y染色体存在时出现，表明了核酸来自于男性。没有扩增则表明核酸来自于女性。然而，在这些试验中，优选地包括阳性对照来检测假阴性。

【0148】在其它例子中，可以以某些基因为目标进行扩增，这些基因出现在X染色体和Y染色体上，但取决于基因出现在X染色体还是Y染色体上具有不同的长度。在这个例子中，包含在X和Y染色体之间具有不同的基因区段的区域将被扩增。这导致具有不同大小的扩增产物，对应于核酸模板(也就是X染色体或Y染色体)。因此，来自于男性的核酸扩增会产生两个大小的扩增子，而来自于女性的样品会产生仅有一个大小的扩增子。

【0149】在一个优选的实施方式中，把牙釉蛋白基因作为用于性别确定目标。已经使用在牙釉蛋白基因的X和Y同系物之间的序列差异来区别男性和女性。例如，已经使用跨越X染色体上牙釉蛋白基因的6对碱基(bp)缺失的两组引物来分别产生X/Y产物的106/112bp或212/218bp的片段(Sullivan等，BioTechniques15：636-9，1993)。在优选的实施方式中，使用下列引物扩增牙釉蛋白基因的区域：

AMLF2引物，5’-AGTACTTGACCACCTCCTGATCTACAAGG 3’(SEQ IDNO：40)和

AMLR2引物，5’-TTTTTAACAGTTTACTTGCTGATAAAACTCAYCCC 3’(SEQ ID NO：41)。

这个引物对产生对应于X染色体同系物的134bp扩增子和对应于Y染色体的140bp扩增子。这样，通过扩增来自于男性的核酸会产生两个扩增子，而通过扩增来自于女性的核酸仅产生一个扩增子。

【0150】以下实施例用于举例说明本发明。这些实施例绝非意欲限制本发明的范围。

实施例1

限制性酶消化

【0151】这个实施例描述了检测FMR1基因串联重复区域扩张(扩增)的方法。用限制性核酸内切酶AluI消化基因组DNA试样和对照DNA样品。每次消化使用1.0微克试样或对照DNA。纯化和稀释基因组DNA到50纳克/微升的浓度。用于消化的反应混合物依照下表制备。

表5.AluI反应混合物

试剂	(微升/样品)
试剂	(微升/样品)	10×NE缓冲液2	3.0
AluI(10U/μL)	1.0	10×NE缓冲液2	3.0
AluI(10U/μL)	1.0	无菌H₂O	7.0
总数	10.0	无菌H₂O	7.0

【0152】10微升的AluI反应混合物加入到每个DNA样品中。样品通过涡旋混合，和用微量离心机离心以及随后在37℃温育过夜。

实施例2

消化的DNA的大小分离

【0153】A.二部分方法

【0154】如在例子1中所描述的限制性酶所消化DNA依照大小分离成各部分。1kb的DNA序列梯和消化的试样基因组DNA样品被放置入96孔板中。使用以反极性分离模式进行的Beckman Coulter P/ACE MDQ系列毛细管电泳系统，96孔板进行自动取样和自动分级。首先以6kv/60sec将序列梯注射入毛细管，随后以200V/cm运行以确定正确的大小排列截止时间(cuttofftime)。使用对应于211-400bp(较低部分或下部分)和401bp-9kb(较高部分或上部分)的预先设置分级时间窗，实现级分自动收集。通过紫外检测在柱中监测分离情况。获得数据并通过P/ACEMDQ 32Karat软件包来评价。

【0155】使用与1kb的DNA序列梯相同条件来分级消化的样品。根据大小排列截止时间——如使用1kb梯对每个大小范围所确定的，收集较低部分(211-396bp)和较高部分(396bp-9kb)。使用P/ACE MDQ自动收集器收集部分并存放在每个孔中30微升0.1×TBE缓冲液的96孔板中。

【0156】A.16部分方法

【0157】使用每个部分30秒的预先设置分级时间窗，完成自动部分收集，大约从200bps开始和在9kbs结束。通过紫外检测在柱中监测分离。获得数据并通过P/ACE MDQ 32Karat软件包来评价。

【0158】1kb的DNA序列梯和消化的基因组DNA样品被放置入96孔板中。在具有冷却控制的Beckman Coulter P/ACE MDQ仪器上，96孔板进行自动取样和自动分级。首先以6kv/60sec通过电子动力(electronkinetic)方式将序列梯注射入毛细管，随后以200V/cm运行来确定正确的大小分离窗口(优选地200bps-9Kbs)。

【0159】根据与1kb的DNA序列梯运行条件相同的条件，分级消化的样品。使用P/ACE MDQ的自动收集器收集总共16个部分并存放在每个孔中5微升双蒸水(dH₂O)的96孔板中。

实施例3

PCR扩增和检测具有串联重复的片段

【0160】在检测特征是FMR1基因串联重复区域扩张的突变的试验中，根据描述的方法制备工作用PCR主混合物。

【0161】A.PCR扩增(非TaqMan)

【0162】如表6中所示，制备用于扩增片段和用于PCR产物大小分离分析的PCR主混合物。

表6.制备用于CCG 5’侧翼序列的PCR引物(非TaqMan)主混合物

贮存液	一个反应(μL)	500个反应(μL)	终浓度
贮存液	一个反应(μL)	500个反应(μL)	终浓度	10×PCR缓冲液(包含15mM MgCl₂)	2.5	1250	1×(1.5mM)
5×Q-溶液	5.00	2500	1×	10×PCR缓冲液(包含15mM MgCl₂)	2.5	1250	1×(1.5mM)
5×Q-溶液	5.00	2500	1×	25mM MgCl₂	0.5	250	0.5mM
25mM dNTPs	0.2	100	0.2mM	25mM MgCl₂	0.5	250	0.5mM
25mM dNTPs	0.2	100	0.2mM	100μM FMR1F4引物	0.5	250	2.0μM

(SEQ ID NO：4)
(SEQ ID NO：4)				100μM FMR1R4引物(SEQ ID NO：5)	0.5	250	2.0μM
100μM AluIF引物(SEQ IDNO：10)	0.1	50	0.4μM	100μM FMR1R4引物(SEQ ID NO：5)	0.5	250	2.0μM
100μM AluIF引物(SEQ IDNO：10)	0.1	50	0.4μM	100μM AluIR引物(SEQ ID NO：11)	0.1	50	0.4μM
100μM LargeF引物(SEQ IDNO：14)	0.10	50	0.4μM	100μM AluIR引物(SEQ ID NO：11)	0.1	50	0.4μM
100μM LargeF引物(SEQ IDNO：14)	0.10	50	0.4μM	100μM LargeR引物(SEQ IDNO：15)	0.10	250	0.4μM
DMSO	1.25	625	5％	100μM LargeR引物(SEQ IDNO：15)	0.10	250	0.4μM
DMSO	1.25	625	5％	1M KCl₂	1.25	625	50mM
双蒸水	7.5	3750		1M KCl₂	1.25	625	50mM
双蒸水	7.5	3750		总数	19.6	9800

【0163】在使用之前，PCR引物主混合物以1.5毫升等分试样在-20℃储存。当准备使用的时候，如在图7中所示制备PCR反应物。

表7.用于CCG 5’侧翼序列的最终PCR扩增混合物

试剂	每个反应(μL)	1/2板(μL)	全板(μL)
试剂	每个反应(μL)	1/2板(μL)	全板(μL)	主混合物	19.6	940.8	1881.6
热启动	0.4	19.2	38.4	主混合物	19.6	940.8	1881.6
热启动	0.4	19.2	38.4	DNA片段	5.0	-	-
总数	25.0	1200	2400	DNA片段	5.0	-	-

【0164】最终扩增混合物用Microseal A膜紧紧地密封在板中。将板短暂地涡旋(大约5秒)和在离心机板中以2,000-6,000g旋转沉淀(spin down)大约30秒(在Sorvall T6000D离心机中以1,600rpm的转速)。将板转移到ABI9700热循环仪。

【0165】用于扩增的热循环仪条件如下：

步骤1：95℃，15分钟。

步骤2：95℃，60秒。

步骤3：64℃，60秒。

步骤4：72℃，30秒。

步骤5：重复步骤2-4，34次。

步骤6：72℃，5分钟。

步骤7：4℃，无限期。

【0166】PCR产物随后装载在ABI 3100遗传分析仪上用于检测。

【0167】B.TaqMan PCR扩增

【0168】如表8中所示，制备用于检测CCG 5’侧翼序列的TaqMan PCR主混合物。

表8.制备用于CCG 5’侧翼序列的TaqMan PCR主混合物

贮存液	一个反应(μL)	500个反应(μL)	终浓度
贮存液	一个反应(μL)	500个反应(μL)	终浓度	5×Q-溶液	10.00	5000	1×
25mM MgCl₂	1.0	500	0.5mM	5×Q-溶液	10.00	5000	1×
25mM MgCl₂	1.0	500	0.5mM	100μM FMR1F4引物(SEQ ID NO：4)	1.0	500	2.0μM
100μM FMR1R4引物(SEQ ID NO：5)	1.0	500	2.0μM	100μM FMR1F4引物(SEQ ID NO：4)	1.0	500	2.0μM
100μM FMR1R4引物(SEQ ID NO：5)	1.0	500	2.0μM	100μM AluIFtaq引物(SEQ ID NO：22)	0.40	200	0.8μM
100μM AluIRtaq引物(SEQ ID NO：23)	0.40	200	0.8μM	100μM AluIFtaq引物(SEQ ID NO：22)	0.40	200	0.8μM
100μM AluIRtaq引物(SEQ ID NO：23)	0.40	200	0.8μM	100μM LargeFtaq引物(SEQ ID NO：24)	0.40	200	0.8μM
100μM LargeRtaq引物(SEQ ID NO：25)	0.40	200	0.8μM	100μM LargeFtaq引物(SEQ ID NO：24)	0.40	200	0.8μM
100μM LargeRtaq引物(SEQ ID NO：25)	0.40	200	0.8μM	DMSO	2.50	1250	5％
1M KCl₂	2.50	1250	50mM	DMSO	2.50	1250	5％
1M KCl₂	2.50	1250	50mM	CGG侧翼探针(SEQ ID NO：26)	0.10	100	0.2μM
AluI对照探针(SEQ ID NO：27)	0.10	100	0.2μM	CGG侧翼探针(SEQ ID NO：26)	0.10	100	0.2μM
AluI对照探针(SEQ ID NO：27)	0.10	100	0.2μM	大对照探针(SEQ ID NO：28)	0.10	100	0.2μM
双蒸水	0.10	100		大对照探针(SEQ ID NO：28)	0.10	100	0.2μM
双蒸水	0.10	100		总数	20	10000

【0169】在使用之前，TaqMan PCR主混合物以1.5毫升等分试样在-20℃储存。当准备使用的时候，如在图9中所示，制备PCR反应物。

表9.TaqManPCR主混合物

试剂	1反应(μL)	1/4板(μL)	1/2板(μL)	3/4板(μL)	整板(μL)
试剂	1反应(μL)	1/4板(μL)	1/2板(μL)	3/4板(μL)	整板(μL)	TaqMan 2×通用主混合物	25.0	750	1600	2150	2750
引物/探针混合物	20.0	600	1280	1720	2200	TaqMan 2×通用主混合物	25.0	750	1600	2150	2750

总数

45.0

1350

2880

3870

4950

【0170】45微升的TaqMan PCR主混合物加到包含大小分离的DNA的部分的96孔板的每个孔中。孔用Microseal A膜紧紧地密封。将板短暂地涡旋(大约5秒)和在离心机板中以2,000-6,000g旋转沉淀(spin down)大约30秒(在SorvallT6000D离心机中以1,600rpm的转速)。将板转移到ABI7700(或者7900HT)序列检测仪。

【0171】用于TaqMan的热循环仪条件如下：

步骤1：95℃，15分钟。

步骤2：95℃，60秒。

步骤3：64℃，60秒。

步骤4：72℃，30秒。

步骤5：重复步骤2-4，40次。

步骤6：72℃，5分钟。

步骤7：4℃，无限期。

实施例4

通过凝胶电泳检测扩增的部分

【0172】使用凝胶电泳来鉴定如在实施例3A中描述所制备的PCR扩增片段的大小。6微升的6×FEB(聚蔗糖，EDTA溴酚蓝加样染料)加到6微升的PCR产物中并将生成的混合物加样到凝胶中。50bp的DNA序列梯加样到凝胶的第一和最后一个孔中。使样品在0.8％琼脂糖中以200V电泳1.5小时。用紫外拍照记录(photodocumentation)仪器(Alpha Innotech Image Analysis System)照下完整的凝胶。

实施例5

检测DM-1基因串联重复区域的扩增突变

【0173】在检测特征是DM-1基因串联重复区域扩增的突变的试验中，用限制性内切核酸酶AluI消化基因组DNA试样。每个消化使用大约1.0微克的试样基因组DNA。依照酶供应商的操作方案制备用于消化的反应混合物。混合样品，并在37℃温育完成消化。

【0174】限制性酶消化的DNA使用毛细管电泳依照大小分离并收集到了两个部分，如此第一部分(250-360bp)对应于正常重复范围(例如5-37个重复)和第二部分(400bp-9kb)对应于扩增的重复突变(例如大于50个突变)。首先将1kb的DNA序列梯注射入毛细管中以确定正确的大小排列截止时间。使用对应于较低部分和较高部分的预先设置分级时间窗实现自动化部分收集。通过紫外检测在柱上监控分离。随后使用与1kb的DNA序列梯相同的条件对消化的样品进行分级。根据使用1kb序列梯对每个大小范围所确定的大小排列截止时间，收集较低部分和较高部分。

【0175】使用TaqMan实时PCR方法分析每个部分是否存在包含DM-1串联重复区域的片段。在这个方法中，使用正向引物(例如，5′-CCATTTCTTTCTTTCGGCCA-3′；SEQ ID NO：31)和反向引物(如5′-AGGCCTGCAGTTTGCCC-3′；SEQ ID NO：32)扩增DM-1基因的3′-非翻译区的区段。用TaqMan标记的探针5′-TGAGGCCCTGACGTGG-3′(SEQ ID NO：33)检测扩增片段。

【0176】扩增区段仅在较低部分中的存在表示对于正常DM-1等位基因纯合的个体。扩增区段仅在较高部分中的存在表示对于突变体等位基因纯合的个体。扩增区段在两个部分中都存在表示杂合体。

实施例6

检测FRDA基因串联重复区域的扩增突变

【0177]在检测特征是FRDA基因串联重复区域扩增的突变的试验中，用限制性内切核酸酶AluI和RsaI消化基因组DNA试样。每个消化使用大约1.0微克的测试基因组DNA。依照酶供应商的操作方案制备用于消化的反应混合物。混合样品，并在37℃温育以完成消化。

【0178】限制性酶消化的DNA使用毛细管电泳依照大小分离，并收集到了两个部分，如此第一部分(300-405bp)对应于正常重复范围(例如7-34个重复)和第二部分(600bp-9kb)对应于扩增的重复突变(例如大于100个突变)。首先将1kb的DNA序列梯注射入毛细管中以确定正确的大小排列截止时间。使用对应于较低部分和较高部分的预先设置分级时间窗实现自动化部分收集。通过紫外检测在柱上监控分离。随后使用与1kb的DNA序列梯相同的条件对消化的样品进行分级。根据使用1kb序列梯对每个大小范围所确定的大小排列截止时间，收集较低部分和较高部分。

【0179】使用TaqMan实时PCR方法分析每个部分是否存在包含FRDA串联重复区域的片段。在这个方法中，使用正向引物(例如，5′-AGGCCTAGGAAGGTGGATCAC-3′；SEQ ID NO：34)和反向引物(如5′-ACCATGTTGGCCAGGTTAGTCT-3′；SEQ ID NO：35)扩增FRDA基因第一内含子区域的区段。用TaqMan标记的探针5′-TGAGGTCCGGAGTTC-3′(SEQ IDNO：36)检测扩增片段。

【0180】扩增区段仅在较低部分中的存在表示对于正常FRDA等位基因纯合的个体。扩增区段仅在较高部分中的存在表示对于突变体等位基因纯合的个体。扩增区段在两个部分中都存在表示杂合体。

实施例7

检测FMR1基因串联重复区域的扩增突变

【0181】在这个实施列中，通过用AluI断裂、大小分级，接着用BstNI进行第二次限制性酶消化，检测FMR1基因串联重复区域的扩增突变。因此，如在以上实施例1中所描述，用限制性内切核酸酶AluI消化基因组DNA试样。使用毛细管电泳将消化的DNA分级为四个部分。部分1包含具有0-60个CCG串联重复的核酸，部分2包含60-200个CCG串联重复，部分3包含200-2000个CCG串联重复，部分4包含2000个以上CCG串联重复。分级之后，四个部分中每个部分的等分试样用第二种限制性内切核酸酶BstNI消化，BstNI从CCG串联重复区域中剪切标记。第二次核酸分级之后，四个部分中的每一个部分进行PCR，如在实施例3B中所描述的(也就是TaqMan PCR扩增)。

【0182】A.第二次限制性酶消化来自受侵袭个体的样品

【0183】受侵袭样品用或不用第二次限制性酶消化进行检测，其中标记序列从串联重复区域剪切。进行第二次消化的样品同没有经历第二次酶消化的样品相比较具有更强的信号(也就是较高的相对荧光单元(RFU)信号)。每个样品重复一次进行；数据在以下表9中示出。这些数据表明，当标记序列从串联重复区域剪切时，存在增加的标记序列扩增。

表10.进行(有“2°”)和不进行(无“2°”)第二次限制性酶消化的受侵袭样品的相对荧光单元(RFU)信号

样品号	部分1	部分2	部分3	部分4
样品号	部分1	部分2	部分3	部分4	15251无2°	75	0	445	0
重复	0	0	0	0	15251无2°	75	0	445	0
重复	0	0	0	0	15251有2°	1752	781	787	0
	2566	931	695	0	15251有2°	1752	781	787	0
	2566	931	695	0	15050无2°	980	0	210	0
	259	0	318	0	15050无2°	980	0	210	0
	259	0	318	0	15050有2°	3571	0	873	0
	2270	586	1042	0	15050有2°	3571	0	873	0
	2270	586	1042	0	14792无2°	575	0	328	0
	662	280	246	0	14792无2°	575	0	328	0
	662	280	246	0	14792有2°	1223	243	658	0
	1308	450	967	0	14792有2°	1223	243	658	0

【0184】B.第二次限制性酶消化来自正常个体的样品

【0185】正常样品用或不用第二次限制性酶消化进行检测，其中标记序列从串联重复区域剪切。具有较少起始材料的经历第二次消化的样品同具有较多起始材料的没有经历第二次酶消化的样品相比较具有相当的或者更强的信号(也就是较高的相对荧光单元(RFU)信号)。数据在以下表10中示出。这些数据表明，当标记序列从串联重复区域剪切时，存在增加的标记序列扩增。

表11.进行(有“2°”)和不进行(无“2°”)第二次限制性酶消化的正常样品的相对荧光单元(RFU)信号

样品号	部分1	部分2	部分3	部分4
样品号	部分1	部分2	部分3	部分4	14028无2°	3044	0	0	0
14028有2°	4356	0	0	0	14028无2°	3044	0	0	0
14028有2°	4356	0	0	0	13616无2°	2701	0	0	0
13616有2°	2396	0	0	0	13616无2°	2701	0	0	0
13616有2°	2396	0	0	0	13488无2°	1399	0	0	0
13488有2°	2258	0	0	0	13488无2°	1399	0	0	0
13488有2°	2258	0	0	0	13524无2°	1051	0	0	0
13524有2°	1074	0	0	0	13524无2°	1051	0	0	0

实施例8

检测FMR1基因串联重复区域的扩增突变

【0186】在这个实施列中，通过用BlpI和MlyI断裂、大小分级，接着用BmtI进行第二次限制性酶消化，检测FMR1基因串联重复区域的扩增突变。

【0187】用限制性内切核酸酶BlpI和MlyI消化基因组DNA试样，每个消化使用大约1.5微克的测试或者对照DNA(纯化和稀释到50纳克/微升的浓度)。依照下表制备用于消化的反应混合物。

表12.BlpI/MlyI反应混合物

试剂	(微升/样品)
试剂	(微升/样品)	基因组DNA 50纳克/微升	30μL
10×NE缓冲液4(New England BioLabs)	3.5	基因组DNA 50纳克/微升	30μL
10×NE缓冲液4(New England BioLabs)	3.5	BlpI(10U/μL)	0.75
MlyI(10U/μL)	0.75	BlpI(10U/μL)	0.75
MlyI(10U/μL)	0.75	总数	35.0

【0188】通过涡旋混合样品，在微量离心机中离心，随后在37℃温育16小时和在4℃储存。消化的DNA随后使用毛细管电泳分级成为四个部分，使用P/ACEMDQ毛细管电泳系统。部分1(小于603bp)包含具有6-62个CCG串联重复的核酸，部分2(603-840bp)包含63-140个CCG串联重复，部分3(841-1078bp)包含141-220个CCG串联重复，部分4(1079bp-9kb)包含221-2000个以上CCG串联重复。分级之后，用从CGG串联重复区域剪切标记的限制性内切核酸酶BmtI消化四个部分中每个的等分试样。BmtI反应混合物依照下表制备。

表13.BmtI反应混合物

试剂	(微升/样品)
试剂	(微升/样品)	分级的基因组DNA	30μL
10×NEB缓冲液2(New England BioLabs)	3.0	分级的基因组DNA	30μL
10×NEB缓冲液2(New England BioLabs)	3.0	BmtI(10U/μL)	0.75
总数	33.75.0	BmtI(10U/μL)	0.75

【0189】消化反应混合物在37℃温育16小时并储存在4℃。

【0190】第二次核酸消化之后，四个部分中每一个部分可以使用如下引物进行PCR：

表14.用于PCR扩增BlpI/MlyI片段的引物

引物名称	SEQ IDNO：	引物序列
引物名称	SEQ IDNO：	引物序列	FXCEF2	6	5’-/6-FAM/GATGGAGGAGCTGGTGGTGG-3’
FXCER2	7	5’-GGAAGGGCGAAGATGGGG-3’	FXCEF2	6	5’-/6-FAM/GATGGAGGAGCTGGTGGTGG-3’
FXCER2	7	5’-GGAAGGGCGAAGATGGGG-3’	BlpIF	12	5’-/HEX/AGTGTTTAGAAGGAAAAGGCTGAGC-3’
BlpIR	13	5’-GCCCAAAGTTTCATAGGTAGCAAA-3’	BlpIF	12	5’-/HEX/AGTGTTTAGAAGGAAAAGGCTGAGC-3’
BlpIR	13	5’-GCCCAAAGTTTCATAGGTAGCAAA-3’	FIIctrl1F	16	5’-/HEX/CTGAATTTGTTTGGTTTGATGATGC-3’
FIIctrl1R	17	5’-CCTGTGTTATCTGTGCCCATTTTAA-3’	FIIctrl1F	16	5’-/HEX/CTGAATTTGTTTGGTTTGATGATGC-3’
FIIctrl1R	17	5’-CCTGTGTTATCTGTGCCCATTTTAA-3’	FIIIctrl3F	18	5’-/6-FAM/ATCTGGGTCTGAATAATGTGAGGAG-3’
FIIIctrl3R	19	5’-CCTAACTTTCATTCTTGTCACCCTT-3’	FIIIctrl3F	18	5’-/6-FAM/ATCTGGGTCTGAATAATGTGAGGAG-3’
FIIIctrl3R	19	5’-CCTAACTTTCATTCTTGTCACCCTT-3’	LgctrlF	20	5’-/6-FAM/AGGTTTGAGTGTATCGCCTGATAGA-3’
LgctrlR	21	5’-TGAGTTTCATGTTTGCTCTTGCTC-3’	LgctrlF	20	5’-/6-FAM/AGGTTTGAGTGTATCGCCTGATAGA-3’

【0191】用于扩增片段以进行大小分析的PCR主混合物依照表15制备。

表15.PCR主混合物

试剂	用于1次反应的体积(μL)	PCR反应中的终浓度
试剂	用于1次反应的体积(μL)	PCR反应中的终浓度	Qiagen 10×缓冲液	2.5	1×
Qiagen 25mM MgCl₂*	0.75	2.25mM	Qiagen 10×缓冲液	2.5	1×
Qiagen 25mM MgCl₂*	0.75	2.25mM	DMSO	1.25	5％(v/v)
1M KCl**	1.25	105mM	DMSO	1.25	5％(v/v)
1M KCl**	1.25	105mM	25mM dNTP	0.2	0.2mM
100μM FXCEF2	0.25	1μM	25mM dNTP	0.2	0.2mM
100μM FXCEF2	0.25	1μM	100μM FXCER2	0.25	1μM
100μMBlpIF	0.015	0.06μM	100μM FXCER2	0.25	1μM
100μMBlpIF	0.015	0.06μM	100μM BlpIR	0.015	0.06μM
100μM lgctrlF	0.06	0.24μM	100μM BlpIR	0.015	0.06μM
100μM lgctrlF	0.06	0.24μM	100μM lgctrlR	0.06	0.24μM
100μM FIIctrl1F	0.015	0.06μM	100μM lgctrlR	0.06	0.24μM
100μM FIIctrl1F	0.015	0.06μM	100μM FIIctrl1R	0.015	0.06μM
100μM FIIIctrl3F	0.02	0.08μM	100μM FIIctrl1R	0.015	0.06μM
100μM FIIIctrl3F	0.02	0.08μM	100μM FIIIctrl3R	0.02	0.08μM
水	12.83		100μM FIIIctrl3R	0.02	0.08μM
水	12.83		总数	19.5

*、**2.5微升10×PCR缓冲液包含15mM MgCl₂、50mM KCl。总反应的MgCl₂是2.25mM，KCl是105mM。

【0192】通过加入0.5微升HotStarTaq(Qiagen)到每个单独的PCR反应中，接着加入5微升消化分级的DNA，制备最终PCR扩增混合物。最终扩增混合物用Microseal A膜紧紧地密封在板中。将板短暂地涡旋混合(大约5秒)和在离心机板中以2,000-6,000g旋转沉淀大约30秒(在Sorvall T6000D离心机中以1,600rpm的转速)。将板转移到ABI9700热循环仪。

【0193】用于扩增的热循环仪条件如下：

步骤1：95℃，15分钟。

步骤2：95℃，30秒。

步骤3：55℃，30秒。

步骤4：72℃，60秒。

步骤5：重复步骤2-4，33次。

步骤6：72℃，10分钟。

步骤7：4℃，无限期。

【0194】2微升PCR产物与10.5微升的去离子甲酰胺(Applied Biosystems)以及ROX 350大小标准(Applied Biosystems)组合，在95℃加热5分钟，接着在冰上5分钟。随后样品装载到ABI3100遗传分析仪上用于检测。

实施例9

检测FMR1基因串联重复区域的扩增突变

【0195】在这个实施列中，通过用SphI和BmtI断裂、大小分级，接着用BstNI进行第二次限制性酶消化，检测FMR1基因串联重复区域的扩增突变。用限制性内切核酸酶SphI和BmtI消化基因组DNA试样，每个消化使用大约1.5微克的测试或者对照DNA(纯化和稀释到50纳克/微升的浓度)。依照下表制备用于消化的反应混合物。

表16.SphI/BmtI反应试剂

试剂	(微升/样品)
试剂	(微升/样品)	基因组DNA(50纳克/微升)	30
10×NEB缓冲液2(New England BioLabs)	3.5	基因组DNA(50纳克/微升)	30
10×NEB缓冲液2(New England BioLabs)	3.5	SphI(10U/μL)	0.75
BmtI(10U/μL)	0.75	SphI(10U/μL)	0.75
BmtI(10U/μL)	0.75	总数	35.0

【0196】样品通过涡旋混合，在微量离心机离心，随后在37℃温育过夜。消化的DNA随后使用毛细管电泳分级成为四个部分。部分1包含具有6-62个串联重复的核酸，部分2包含63-163个串联重复，部分3包含164-196个串联重复和部分4包含大于196个串联重复。分级之后，用第二限制性内切核酸酶BmtI消化四个部分中每个的等分试样，BmtI从CGG串联重复区域剪切标记。第二次核酸分级之后，四个部分中的每一个部分使用下列引物进行PCR：

表17.用于PCR扩增SphI/BmtI片段的引物

引物名称	序列号	引物序列
引物名称	序列号	引物序列	FXCEF3	8	5’-CGTGACGTGGTTTCAGTGTTTACA-3’
FXCER3	9	5’-GGAAGTGAAACCGAAACGGAG-3’	FXCEF3	8	5’-CGTGACGTGGTTTCAGTGTTTACA-3’

【0197】用下列条件进行PCR：

步骤1：95℃，15分钟。

步骤2：95℃，30秒。

步骤3：55℃，30秒。

步骤4：72℃，60秒。

步骤5：重复步骤2-4，33次。

步骤6：72℃，10分钟。

步骤7：4℃，无限期。

【0198】将PCR产物装载到ABI3100遗传分析仪上用于检测。

实施例10

鉴定在FMR1试验中使用的对照片段

【0199】来自不同于FMR1的基因组的区域的AluI片段被鉴定用作FMR1试验中的对照片段，所述AluI片段大于6000个碱基，包含三核苷酸重复和具有高GC含量和/或CpG岛。如下鉴定该片段。使用EMBOSS限制程序(Rice等，“EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite.”Trends inGenetics 16(6)：276-7(2000))在人基因中鉴定所有AluI位点，导致了通过AluI消化所生产的预计11.5百万个片段。从这些片段中，使用TACG程序(Mangalam，HJ.“tacg-a grep for DNA.”BMC Bioinformatics 3：8(2002))鉴定20个长度大于6000个碱基的片段。通过使用EMBOSS ExtractSeq得到这20个片段的序列。在这20个片段中，一个对应于22号染色体上USP41基因的区域(也就是染色体22：19033185-19041663)的片段发现具有大的三核苷酸重复区域。使用EMBOSS geecee分析GC含量，和使用EMBOSS cpgseek和newcpgreport进行CpG岛分析。

实施例11

使用PCR确定FMR1串联重复区域的大小

【0200】为了确定FMR1区域的串联重复区域大小，在荧光标记引物(例如6-FAM)存在时，通过聚合酶链反应扩增该区域，并通过毛细管电泳确定产生的标记扩增子的大小。使用引物对共扩增第二个三核苷酸重复(在X-连接雄激素受体基因中的CAG)并共分析以提供内部扩增对照，所述引物对中的一个引物是荧光标记的。

【0201】这样，使用FX-5F(SEQ ID NO：29)作为正向引物和FX-3F(SEQ IDNO：30)作为反向引物扩增FMR1基因的串联重复区域，和使用AR-5F(SEQ IDNO：37)作为正向引物和AR-R2(SEQ ID NO：38)作为反向引物扩增X-连接雄激素受体基因的三核苷酸重复，如在下表中说明的。

表18.用于PCR扩增的引物

引物名称	序列号	引物序列
引物名称	序列号	引物序列	FX-5F	29	5’-(6-FAM)GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTCACT TCC GGT 3’
FX-3F	30	5’-AGC CCC GCA CTT CCA CCA CCA GCT CCTCCA-3’	FX-5F	29	5’-(6-FAM)GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTCACT TCC GGT 3’
FX-3F	30	5’-AGC CCC GCA CTT CCA CCA CCA GCT CCTCCA-3’	AR-5F	37	5’-(HEX)ACC AGG TAG CCT GTG GGG CCTCTA CGA TGG GC-3’
AR-R2	38	5’-GCT TTC CAG AAT CTG TTC CAG AGC GTGCGC GA-3’	AR-5F	37	5’-(HEX)ACC AGG TAG CCT GTG GGG CCTCTA CGA TGG GC-3’

【0202】依照表19制备用于扩增用于大小分析的片段的PCR主混合物。

表19.PCR主混合物

试剂	用于1个反应的体积(μL)	用于100个反应的体积(μL)
试剂	用于1个反应的体积(μL)	用于100个反应的体积(μL)	10×缓冲液(Qiagen)	1.0	1000
Qiagen 25mM MgCl₂(Qiagen)	0.2	200	10×缓冲液(Qiagen)	1.0	1000
Qiagen 25mM MgCl₂(Qiagen)	0.2	200	25mM dNTP	0.08	80
100μM FX-5F引物	0.04	40	25mM dNTP	0.08	80
100μM FX-5F引物	0.04	40	100μM FX-3F引物	0.04	40
100μM AR-5F引物	0.04	40	100μM FX-3F引物	0.04	40
100μM AR-5F引物	0.04	40	100μM AR-R2引物	0.04	40
DMSO	0.2	200	100μM AR-R2引物	0.04	40
DMSO	0.2	200	5X Q(甜菜碱)溶液	5.0	5,000
水	1.16	1,160	5X Q(甜菜碱)溶液	5.0	5,000
水	1.16	1,160	总数	10.0

【0203】PCR主混合物等分分为1,100微升的等分试样，加入来自于Qiagen的5.5微升Taq聚合酶(5U/μL)和来自于Stratagene的22微升Pfu DNA聚合酶(2.5U/μL)，以制备聚合酶/主混合物溶液。

【0204】在TE缓冲液中基因组DNA稀释到20纳克/微升。样品加热到93-97℃，持续4-6分钟，并在冰上冷却。加入10微升聚合酶/主混合物溶液到2微升(40纳克)稀释的基因组DNA。

【0205】一旦热循环仪达到85℃+/-2℃，样品转移到ABI 9700热循环仪。用于扩增的PCR条件如下：

步骤1：95℃，6分钟。

步骤2：95℃，1分钟。

步骤3：60℃，2分钟。

步骤4：75℃，5分钟。

步骤5：重复步骤2-4，31次。

步骤6：75℃，13分钟。

步骤7：4℃，无限期。

【0206】随后将PCR产物装载到ABI 3100遗传分析仪用于检测。

实施例12

脆性X综合症携带者筛查

【0207】在这个实施列中，通过两步法筛查来自男性和女性个体的样品的脆性X综合症携带状况，其中，样品起初用多重PCR筛查以确定性别和FMR1区域的大小，并依据多重PCR结果进行进一步的大小排列分析。确定为女性和对于两个正常等位基因杂合的所有样品可以不进行进一步的分析。确定为女性和在FMR1基因座明显为纯合(所有分析的24％)的所有样品进行进一步的分析，以确定FMR1串联重复区域的大小。鉴定为男性和对于正常FMR1等位基因为半合子的样品不进行进一步的分析，而鉴定为男性、但显示没有FMR1扩增的样品进行进一步的分析，以确定FMR1串联重复区域的大小。

【0208】依照生产厂家的全血DNA提取操作方案，使用Xtractor GeneTM(Corbett Life Science，Mortlake，NSW，Australia)从收集于EDTA抗凝采血真空管中的150微升全血中提取全基因组DNA。在100微升缓冲液中进行最终洗脱，以一致地产生50-100纳克/微升的浓度。

【0209】随后通过多重PCR分析基因组DNA样品，多重PCR由以下扩增组成：使用FX-5F引物(FAM标记的；SEQ ID NO：29)和FX-3F引物(SEQ ID NO：30)扩增FMR1串联重复的区域；使用AMLF2引物5’-AGTACTTGACCACCTCCTGATCTACAAGG 3’(FAM-标记的；SEQ ID NO：40)和AMLR2引物5’-TTTTTAACAGTTTACTTGCTGATAAAACTCAYCCC 3’(SEQID NO：41)扩增牙釉蛋白基因的区域以确定性别；和使用AR-5F(HEX-标记的SEQ ID NO：37)和AR-R2引物(SEQ ID NO：38)扩增X-连接雄激素受体的三核苷酸重复作为阳性内部对照。

【0210】制备用于多重PCR的PCR主混合物，由3.3μM的每个上述引物、1×Qiagen标准PCR缓冲液、0.4mM MgCl₂、2％DMSO、1×Qiagen Q溶液、0.2mMdNTP、和0.25单位Qiagen Taq DNA聚合酶(Qiagen，Valencia，CA)、0.5单位Pfu DNA聚合酶(Strategene，La Jolla，CA)组成。1微升分离的DNA溶液加到10微升的多重引物混合物中至最终体积为11微升。PCR条件如下：95℃6分钟；接着32个循环：95℃1分钟，60℃2分钟，75℃5分钟；和最后扩增的产物在75℃延伸15分钟。在ABI3100自动DNA测序仪(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)上分析PCR片段，和用ABI GeneScanTM V3.7和GenotyperTM V3.7软件(AppliedBiosystems)完成片段分析。牙釉蛋白引物对产生了对应于X染色体同系物的134bp扩增子和对应于Y染色体的140bp扩增子。

【0211】为了进一步分析确定FMR1基因串联重复区域的大小，用限制性酶BlpI和MlyI(New England BioLabs，Ipswich，MA，USA)在37℃消化基因组DNA 16小时。在温育之后，限制性片段加压注射或者真空注射到携带紫外/可见检测器的P/ACE^TM MDQ毛细管电泳系统(Beckman Coulter，Fullerton，CA，USA)上。以100V/cm的电场强度和在1×TBE缓冲液(90mM Tris-硼酸，2mM EDTA，pH 8.3)中，分离未变性的双链DNA。毛细管温度维持在25℃。四个部分被收集入0.1×TBE缓冲液(9mMTris-硼酸，0.2mM EDTA，pH 10)。由在400bps到600bps之间的分子量组成的起始部分；包含600bps到800bps之间分子量的第二部分；包含800bps到1,000bps分子量的第三部分；和包含1,000bps到8,000bps分子量的第四部分。因为两个酶中任一个在FMR1中不能剪切将导致区段太大而不被收集在任一个部分中，所以没有使用针对不完全限制性消化的内对照。

【0212】为了从串联重复区域剪切标记序列，依照厂家的方案，用限制性酶BmtI(New England BioLabs)消化所有收集的部分。5微升的每个消化部分转被移到在每个孔中包含20微升PCR混合物的96孔板中。该PCR混合物由以下组成：1×Qiagen标准PCR缓冲液、1.5mM MgCl₂、5％DMSO、100mM KCl、0.2mM dNTP、2.5单位HotStart Taq DNA聚合酶(Qiagen Inc)和1微升的每种以下引物：FXCEF2引物(FAM-标记的；SEQ ID NO：6)、FXCER2引物(SEQ ID NO：7)，以及0.01μM的每种以下引物：BlpIF引物(HEX标记的，SEQ ID NO：12)、BlpIR引物(SEQ IDNO：13)、lgctrlF引物(FAM标记的，SEQ ID NO：20)、lgctrlR引物(SEQ ID NO：21)、F2ctrl1F引物(HEX标记，SEQ ID NO：16)、F2ctrl1R引物(SEQ ID NO：17)、F3ctrl3F引物(FAM标记的，SEQ ID NO：18)、F3ctrl3R引物(SEQ ID NO：19)。PCR条件如下：95℃15分钟，接着33个循环：95℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟；和最后在72℃延伸扩增产物10分钟。然后在3100Prism遗传分析仪(Applied Biosystems)上使用GenescanTM-350ROX大小标准(Applied Biosystems)分析最终PCR产物。

【0213】提交已经剥去鉴定数据的1,662份血液样品以便通过上述方法进行分析。在这该样品群中，具有995个女性和557个男性。在女性个体中，6个被确定是前突变携带者(0.6％)和7个被确定是全突变携带者(0.7％)。通过标准的PCR/Southern印迹分析验证，所有13个携带者被正确识别，使得灵敏度为100％。通过标准的PCR/Southern印迹试验被认为非携带者的单个患者通过上述方法似乎是前突变携带者。该患者可能是前突变等位基因的嵌合体或者这表示是假阳性结果。由于样品的匿名性质，因此不可能去再检查Southern印迹数据或重新测试样品。假设这个结果是假阳性的，上述方法的特异性是99.5％。在557个男性中，有1个前突变携带者和5个受侵袭的个体。通过Southern印迹分析确认了这些测定。这样，上述方法检测到所有男性前突变携带者和受侵袭的男性，在551个未受侵袭的男性中没有假阳性结果。

【0214】除非另有规定，在这里所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常所理解的相同含义。在这里所提供的核苷酸序列是以5’到3’的方向显示。

【0215】在这里举例描述的发明可在没有任何要素或多种要素、限制或多种限制的情况下合适地实施，而不是在这里特定地公开。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应该被广泛而没有限制地阅读。另外，在这里所应用的术语和词组被用作为描述性和非限制性术语，并且在使用这样的术语和词组时没有意欲排除所示出和描述的特征的任何等同特征或其部分，而是认为在本发明所要求保护的范围之内各种修改是可能的。

【0126】因此，应当理解虽然本发明通过优选的实施方式和任选的特征进行了特定地公开，本领域技术人员可以采取包含在本文公开内容中的对本发明的修改、改进和变化，和应当理解这样的修改、改进和变化被认为包含在本发明的范围之内。这里所提供的材料、方法和实施列代表优选的实施方式，是示范性的并且不意欲限制本发明的范围。

【0217】本发明在这里被广泛地和一般性地描述。落入一般公开范围内的每个较窄种类和亚类组也形成了本发明的一部分。这包括本发明的一般性描述，其条件或者负限定是从该种类中除去任何主题，而不管除去的材料是否在这里被特定描述。

【0218】另外，如果本发明的特征或方面根据马库什组进行描述，本领域技术人员会认识到，本发明也由此根据马库什组的任何单个成员或者成员的亚组进行描述。

【0219】在这里所提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献在此通过参考以全部特别引入，引入的程度如同每篇参考文献通过参考单独引入。在冲突情况下，包含定义的本说明书将处于支配地位。

【0220】在所附的权利要求书中阐述了其它实施方式。

序列表

<110>奎斯特诊断投资公司

美国基因组公司

<120>核酸大小检测方法

<130>054769-0202

<140>

<141>

<150>11/544.293

<151>2006-10-05

<160>41

<170>PatentIn Ver.3.3

<210>1

<211>253

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

ctccgtttcg gtttcacttc cggtggaggg ccgcctctga gcgggcggcg ggccgacggc 60

gagcgcgggc ggcggcggtg acggaggcgc cgctgccagg gggcgtgcgg cagcgcggcg 120

gcggcggcgg cggcggcggc ggcggaggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggctggg 180

cctcgagcgc ccgcagccca cctctcgggg gcgggctccc ggcgctagca gggctgaaga 240

gaaga tggag gag 253

<210>2

<211>310

<212>DNA

<213>智人

<400>2

ctccagtcct gtgatccggg cccgccccct agcggccggg gagggagggg ccgggtccgc 60

ggccggcgaa cggggctcga agggtccttg tagccgggaa tgctgctgct gctgctgctg 120

ctgctgctgc tgctgctgct gctgctgctg ctgctgctgc tggggggatc acagaccatt 180

tctttctttc ggccaggctg aggccctgac gtggatgggc aaactgcagg cctgggaagg 240

cagcaagccg ggccgtccgt gttccatcct ccacgcaccc ccacctatcg ttggttcgca 300

aagtgcaaag 310

<210>3

<211>168

<212>DNA

<213>智人

<400>3

aggcctagga aggtggatca cctgaggtcc ggagttcaag actaacctgg ccaacatggt 60

gaaacccagt atctactaaa aaatacaaaa aaaaaaaaaa aagaagaaga agaagaagaa 120

aataaagaaa agttagccgg gcgtggtgtc gcgcgcctgt aatcccag 168

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>4

ggtggagggc cgcctctg 18

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>5

agcggcgcct ccgtcacc 18

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>6

gatggaggag ctggtggtgg 20

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>7

ggaagggcga agatgggg 18

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>8

cgtgacgtgg tttcagtgtt taca 24

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>9

ggaagtgaaa ccgaaacgga g 21

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>10

ctccaatgcc tcctgcgtcc 20

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>11

gggggtaggg agtgtctgag agtct 25

<210>12

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>12

agtgtttaga aggaaaaggc tgagc 25

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>13

gcccaaagtt tcataggtag caaa 24

<210>14

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>14

caccctacaa gccgtcgcta aca 23

<210>15

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>15

cgtgccttgt cggtatcatt agcaa 25

<210>16

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>16

ctgaatttgt ttggtttgat gatgc 25

<210>17

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>17

cctgtgttat ctgtgcccat tttaa 25

<210>18

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>18

atctgggtct gaataatgtg aggag 25

<210>19

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>19

cctaactttc attcttgtca ccctt 25

<210>20

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>20

aggtttgagt gtatcgcctg ataga 25

<210>21

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>21

tgagtttcat gtttgctctt gctc 24

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>22

gcctcctgcg tccttgtaga 20

<210>23

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>23

tgagagtctt gtttcagcag tgttaa 26

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>24

caagccgtcg ctaacaagga 20

<210>25

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>25

gatgtcttgt atggtgccct cat 23

<210>26

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

探针

<400>26

ctctgagcgg gcg 13

<210>27

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

探针

<400>27

aggaagctaa gcagttg 17

<210>28

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

探针

<400>28

actgtacaca acatcg 16

<210>29

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>29

gctcagctcc gtttcggttt cacttccggt 30

<210>30

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>30

agccccgcac ttccaccacc agctcctcca 30

<210>31

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>31

ccatttcttt ctttcggcca 20

<210>32

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>32

aggcctgcag tttgccc 17

<210>33

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

探针

<400>33

tgaggccctg acgtgg 16

<210>34

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>34

aggcctagga aggtggatca c 21

<210>35

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>35

accatgttgg ccaggttagt ct 22

<210>36

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

探针

<400>36

tgaggtccgg agttc 15

<210>37

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>37

accaggtagc ctgtggggcc tctacgatgg gc 32

<210>38

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>38

gctttccaga atctgttcca gagcgtgcgc ga 32

<210>39

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

寡核苷酸

<400>39

ccccgccccg cg 12

<210>40

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>40

agtacttgac cacctcctga tctacaagg 29

<210>41

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

引物

<400>41

tttttaacag tttacttgct gataaaactc ayccc 35

Claims

1.一种用于在核酸样品中确定核酸区段大小的方法，包含：

分离核酸片段，所述片段从包含核酸的样品中制备，其中所述片段包括一些包含所述区段和标记序列的片段，依照大小分离成部分，这在包含所述区段的片段将依照所述区段大小定位于所述部分的条件下进行，和

通过检测所述标记序列来鉴定包含所述区段的那些部分，其中，所述区段的大小通过在其中其被鉴定的部分来确定。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸区段难以通过聚合酶链反应扩增。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述核酸区段富含鸟嘌呤和胞嘧啶碱基。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述片段使用一种或多种限制性内切核酸酶制备。

5.根据权利要求1所述的方法，其中选择所述部分以将包含具有正常大小的区段的片段与包含具有异常大小的区段的片段分开。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离是分离为选自2-16的许多组分。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离通过电泳进行。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述电泳是毛细管电泳。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离通过层析进行。

10.根据权利要求1所述的方法，还包括在所述分离步骤之后，在包含所述区段和所述标记序列的片段中，从所述标记序列剪切所有或者部分的所述区段。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述剪切使用限制性内切核酸酶完成。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测还包括扩增所述标记序列。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述扩增用聚合酶链反应(PCR)完成。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述PCR包括标记的引物。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测使用Taqman PCR检测系统完成。

16.根据权利要求1所述的方法，其中通过与两个探针杂交来检测所述标记序列，所述两个探针与所述标记序列同时杂交。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述区段包含串联重复区域。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所确定的大小是在所述串联重复区域中重复的数量。

19.根据权利要求18所述的方法，其中选择所述组分以将具有正常串联重复数量的片段与具有异常串联重复数量的片段分离。

20.根据权利要求17所述的方法，其中所述串联重复是三核苷酸串联重复。

21.根据权利要求17所述的方法，其中所述串联重复与选自DRPLA、EPM1、FRAXA、FMR1、FRDA、亨廷顿蛋白、JPH-3、AR、DM1、DM2、SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA8、SCA10、SCA12、SCA17、PABPN1和HOXD13的基因相关。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述串联重复与选自FMR1、FRDA和DM1的基因相关。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述基因是FMR1。

24.一种在核酸样品中检测在基因串联重复区段中的突变的方法，其中所述突变的特征为与在野生型等位基因中重复数量相比较重复数量的变化，所述方法包括：

分离核酸的片段，所述片段从包含核酸的样品中制备，其中所述片段包括一些包含所述串联重复区段和标记序列的片段，所述分离依照大小分离成部分，这在包含所述串联重复区段的片段将依照所述串联重复区段中重复的数量而定位于所述部分中的条件下进行；

通过检测所述标记序列来鉴定包含所述区段的那些部分，其中，在所述串联重复区段中的重复数量通过在其中其被鉴定的部分来确定，和

将来自所述核酸样品的所述串联重复区段中的重复数量与相应野生型等位基因中的数量进行比较，其中，不同于在所述野生型等位基因中的数量的重复数量表明是突变。

25.根据权利要求24所述的方法，还包括：

通过将来自所述核酸样品的所述串联重复区段中的重复数量与相应的全突变等位基因中数量进行比较，来确定所述突变是否是前突变或者全突变，其中大于所述野生型等位基因但是小于所述全突变的重复数量表明是前突变等位基因，而大于或者等于所述全突变的重复数量表明是全突变等位基因。

26.根据权利要求24所述的方法，其中使用一种或多种限制性内切核酸酶获得所述片段。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述一种或多种限制性内切核酸酶选自AluI、SphI、BmtI、BlpI、MlyI和BstNI。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述一种或多种限制性内切核酸酶是AluI。

29.根据权利要求27所述的方法，其中所述一种或多种限制性内切核酸酶是SphI和BmtI。

30.根据权利要求27所述的方法，其中所述一种或多种限制性内切核酸酶是BlpI和MlyI。

31.根据权利要求24所述的方法，其中所述分离通过电泳进行。

32.根据权利要求33所述的方法，其中所述电泳是毛细管电泳。

33.根据权利要求24所述的方法，其中所述分离通过层析进行。

34.根据权利要求24所述的方法，其中选择所述部分以将包含具有正常数量的串联重复的串联重复区段的片段与包含具有异常数量的重复的串联重复区段的片段分离开来。

35.根据权利要求24所述的方法，其中所述分离是分离成为选自2-16的许多部分。

36.根据权利要求24所述的方法，还包括在所述分离步骤之后，在包含所述串联重复区段和所述标记序列的片段中，从所述标记序列剪切所有或者部分的所述串联重复区段。

37.根据权利要求36所述的方法，其中使用限制性内切核酸酶完成所述剪切。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述限制性内切核酸酶选自BsaWI、HphI、BbvI、BstNI、Hpy1881、SmlI和BmtI。

39.根据权利要求24所述的方法，其中所述检测还包括扩增所述标记。

40.根据权利要求39所述的方法，其中用聚合酶链反应(PCR)完成所述扩增。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述扩增利用可检测地标记的引物。

42.根据权利要求41所述的方法，其中用电泳完成所述检测。

43.根据权利要求24所述的方法，其中使用Taqmam PCR检测系统完成所述检测。

44.根据权利要求24所述的方法，其中通过与两个探针杂交来检测所述标记序列，所述两个探针与所述标记序列同时杂交。

45.根据权利要求24所述的方法，其中所述串联重复是三核苷酸串联重复。

46.一种鉴定在个体核酸中具有正常数量的串联重复、前突变或者全突变的FMR1等位基因的方法，所述方法包括：

分离核酸片段，所述核酸从个体包含核酸的样品中制备，其中所述片段包括一些包含FMR1基因的串联重复区段和标记序列的片段，所述分离是依照大小分离成部分，这在以下条件下进行：其中包含具有正常重复数量的所述串联重复区段的片段将定位在第一部分中；包含具有前突变的串联重复区段的片段将定位在第二部分中；和包含具有全突变的串联重复区域的片段将定位在第三部分中，

通过检测所述标记序列来鉴定包含所述串联重复区段的那些部分，其中，所述串联重复区段中的所述重复数量通过在其中其被鉴定的所述部分来确定，其中

在所述第一部分中的阳性结果表示个体有具有正常数量串联重复的FMR1等位基因；

在所述第二部分中的阳性结果表示个体具有前突变FMR1等位基因；

在所述第三部分中的阳性结果表示个体具有全突变FMR1等位基因。

47.根据权利要求46所述的方法，其中使用一种或多种限制性内切核酸酶获得所述片段。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述一种或多种限制性内切核酸酶选自AluI、SphI、BmtI、BlpI、MlyI和BstNI。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述一种或多种限制性内切核酸酶是AluI。

50.根据权利要求48所述的方法，其中所述一种或多种限制性内切核酸酶是SphI和BmtI。

51.根据权利要求48所述的方法，其中所述一种或多种限制性内切核酸酶是BlpI和MylI。

52.根据权利要求46所述的方法，其中所述分离通过电泳进行。

53.根据权利要求46所述的方法，其中所述分离通过层析进行。

54.根据权利要求46所述的方法，还包括在所述分离步骤之后，从包含所述串联重复区段和所述标记序列的所述标记序列片段剪切所有或者部分的所述串联重复区段。

55.根据权利要求54所述的方法，其中使用限制性内切核酸酶完成所述剪切。

56、根据权利要求55所述的方法，其中所述限制性内切核酸酶选自BsaWI、HphI、BbvI、BstNI、Hpy1881、SmlI和BmtI。

57.根据权利要求46所述的方法，其中所述检测还包含扩增所述标记。

58.根据权利要求57所述的方法，其中用聚合酶链反应(PCR)完成所述扩增。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述扩增利用可检测地标记的引物。

60.根据权利要求59所述的方法，其中用电泳完成所述检测。

61.根据权利要求46所述的方法，其中使用Taqman PCR检测系统完成所述检测。

62.一种确定核酸样品中串联重复区段的大小的方法，所述方法包括：

a)通过第一种方法测量所述串联重复区段的大小，所述第一种方法包括扩增所述串联重复区段，

b)通过依照权利要求17所述的第二种方法测量所述串联重复区段的大小，

c)使用在步骤a)和b)中得到的信息来确定所述串联重复区段的大小。

63.根据权利要求62所述的方法，其中用聚合酶链反应(PCR)完成步骤a)中的扩增。

64.根据权利要求63所述的方法，还包括使用电泳对所述扩增的串联重复区域进行大小排列。

65.一种用于筛查男性和女性个体在FMR1基因的串联重复区域中的突变携带者状况的方法，所述方法包括：

分析来自个体的核酸以确定性别；和

分析所述核酸以确定所述FMR1基因的串联重复区域的长度，其中所述确定包括：

扩增串联重复区域，

检测扩增产物，和

确定在所述扩增产物中的串联重复数量，其中

在男性个体中：

具有小于55个串联重复的扩增产物的存在表示所述个体不是携带者，

具有55个或者更多个串联重复的扩增产物的存在表示所述个体是携带者，或者

不存在扩增产物时，携带者状况是不确定的；和

在女性个体中：

具有多于55个串联重复的扩增产物的存在表示所述个体是携带者；或

具有小于55个串联重复的单个扩增产物的存在表示所述携带者状况是不确定的。

66.根据权利要求65所述的方法，还包括，分析未确定的个体以确定携带者状况，其中所述分析包括，

分离核酸片段，其中所述片段由包含核酸的个体样品制备，其中所述片段包括一些包含FMR1基因的串联重复区段和标记序列的片段，按照大小分离成部分，这在以下条件下进行：含有具有正常重复数量的串联重复区段的片段将定位在第一部分中；含有具有前突变的串联重复区段的片段将定位在第二部分中；以及含有具有全突变的串联重复区域的片段将定位在第三部分中，

通过检测标记序列来鉴定包含所述区段的那些部分，其中，在所述串联重复区段中的所述重复数量通过在其中其被鉴定的部分来确定，其中，

在男性个体中：

在所述第一部分中的阳性结果表示所述个体不是携带者，

在所述第二部分中的阳性结果表示所述个体是前突变携带者，

在所述第三部分中的阳性结果表示所述个体是受侵袭的；和

在女性个体中：

仅在所述第一部分中的阳性结果表示所述个体对于所述正常等位基因是纯合的；

在所述第二部分中的阳性结果表示所述个体是前突变携带者，和

在所述第三部分中的阳性结果表示所述个体是全突变携带者。

67.根据权利要求65所述的方法，其中所述分析核酸以确定性别包括核酸扩增。

68.根据权利要求67所述的方法，其中所述核酸扩增包括，

确定所述扩增产物或多个扩增产物的大小，其中单一大小的一个产物的存在表示性别是女性，而不同大小的两种产物的存在表示性别是男性。

69.根据权利要求67所述的方法，其中所述牙釉蛋白基因区域的所述扩增是用所述FMR1基因的所述串联重复区域的多重扩增进行。

70.根据权利要求69所述的方法，其中所述多重扩增还包括扩增一个或多个对照序列。

71.根据权利要求66所述的方法，还包括在所述分离步骤之后，从包含所述串联重复区段和所述标记序列的所述标记序列片段剪切所有或者部分的串联重复区段。

72.用于检测样品中特定核酸区段的大小的试剂盒，所述试剂盒包含用于扩增所述特定核酸区段上游或下游的标记核苷酸序列的引物对，和一种或多种限制性内切核酸酶，所述限制性内切核酸酶用于剪切所述核酸样品以产生包含所述特定核酸区段和所述上游或下游标记序列的核酸样品片段，其中所述特定核酸区段是串联重复序列。

73.根据权利要求72所述的试剂盒，还包含一种或多种限制性酶，用于将所述特定核酸区段与所述标记序列分开。

74.根据权利要求72所述的试剂盒，还包含一种或多种对照，用于验证用所述限制性内切核酸酶消化的核酸的合适大小分离。

75.根据权利要求72所述的试剂盒，其中所述串联重复区段来自FMR1基因。