CN101520414B - 通过注射到流动溶剂中测定溶液中分子的平均性质的方法 - Google Patents

Abstract

提供一种测量未分级的大分子溶液的分子性质的新方法。跨越一定浓度范围的样品等分试样被顺序地注射到溶液流中并且流向检测器。由此每等分试样产生有效的“峰”，其要素相应于不同浓度的稀释的等分试样。溶液中大分子的重均摩尔质量、均方半径和第二位力系数是由整个相应峰中散射信号的角度和浓度依赖性分析而得到的。与较早的在线方法相比，在使用较小量样品时，获得更佳的准确度。还提供用于测定两种截然不同种类的大分子之间的交叉位力系数的类似方法。

Description

通过注射到流动溶剂中测定溶液中分子的平均性质的方法

背景技术

溶液中的分子一般被表征为其重均摩尔质量M、其均方半径<r_g ²>＝∫r²dm/∫dm(这里r是与该分子的质心的距离并且dm是那个距离处的小体积的质量)和第二位力系数(维里系数，virialcoefficient)A₂。在一些情况中，第三位力系数A₃也是关心的。在其它情况中，两个截然不同的分子A和B之间的交叉位力系数A₂ ^AB是关心的。M和<r_g ²>是溶液中全部分子求平均的单个分子的性质，位力系数是溶剂所介导的分子间平均相互作用的度量。对于未分级的溶液来说，这些性质可以通过利用Bruno Zimm在他1948年学术论文(seminal1948paper)——其出现在Journal of Chemical Physics，第16卷，第1093至1099页——中描述的方法测量它们散射光的方式而测定。从小体积的溶液中散射的光在一定范围的角度和浓度内进行测量。在一定范围的散射角内光散射数据的收集更常见地被称为多角度光散射，MALS。由单一种类分子的光散射测量得到的性质通过Zimm研究的方程表达并且由W.A.J.Bryce在Polymer 10804-809(1969)进行修正：R^*(c，θ)＝McP(θ)-2A₂[MP(θ)c]²-[3A₃Q(θ)-4A₂ ²MP²(θ)][MP(θ)]²c³(1)其中R^*(c，θ)＝R(c，θ)/K^*，R(c，θ)是每单位立体角在方向θ上所测量的超瑞利比(excess Rayleigh ratio)，其被定义为R(θ)＝[I_s(θ)-I_solv(θ)]r²/[I₀V]，I_s(θ)是溶液所散射的光的强度，其为角的函数，I_solv(θ)作为角的函数是从溶剂中散射的光的强度，I₀是入射强度，r是从散射体积到检测器的距离，V是检测器所见的照明体积，K＝4π²n₀ ²/(N_Aλ₀ ⁴)，并且K^*＝K(dn/dc)²，N_A是阿伏加德罗常数(Avogadro′s number)，dn/dc是折光率增量，n₀是溶剂折光率，并且λ₀是真空中入射光的波长。P(θ)是散射分子的形状因子，其被定义为P(θ)＝lim_c→0R(θ)/R(0)。P(θ)的一般形式通过P.Debye在J.Phys.Colloid Chem.，5118(1947)得到，为： $P\left(\mathrm{\&theta;}\right)=1-P_1{\sin }^2\left(\frac{\mathrm{\&theta;}}{2}\right)+P_2{\sin }^4\left(\frac{\mathrm{\&theta;}}{2}\right)+K---\left(2\right)$ P₁与均方半径有关： $P_1=\frac{{\left(2k\right)}^2}{3}<{r_g}^2>,$ 并且k＝2π/λ，其中λ是溶剂中入射光的波长。P₂与均方半径<r_g ²>和均四次方半径(the mean quadri-radius)<r_g ⁴>有关： $P_2=\frac{2k^4}{45}(10{<{r_g}^2>}^2-3<{r_g}^4>).$ 该方程是基于浓度和sin²(θ/2)的幂的级数展开的近似；因为如此，精确程度取决于高次项的相对大小。

进行该测试的标准方法，也被称为“平稳方法(平台方法plateau method)”，涉及制备一系列具有增加浓度的已知值的样品；将样品顺序地导入MALS检测器，不管是通过在光束中插入含有该样品的玻璃瓶还是通过将样品注射到位于该光束中的流动池中；借助光检测器获得每个角度处的散射强度；计算每个浓度和角度的超瑞利比；并且将该数据拟合到方程(1)以求出M、<r_g ²>、A₂和A₃。

在将该样品注射到含有一些先前的样品或溶液的流动池的情况中，必须注射足够的体积以使该池“饱和”，即，使该池中的浓度达到最初已知的样品浓度；这可以通过观察散射信号和使样品流动直至信号值对时间的曲线达到平稳而实现，该平稳指数依赖性地渐近地出现。可选地，具有流动池的浓度检测器可以被加入到流路上，并且必须注射足够的样品以便MALS和浓度信号两者随着时间达到平稳；以这种方式MALS检测器中的浓度可以由浓度检测器中的浓度推出，以提供方程(1)中R和c的值。每次注射使流动池饱和所需的一般体积为1-3mL。

考虑到渐近地接近每个池中正确的浓度值，更精确的测量可以通过增加浓度系列接着降低浓度系列而获得，其中正确浓度从上面渐进地接近而不是从下面。两次测量(增加和降低浓度)的平均以总样品加倍和测量时间加倍为代价提供更准确的计算。按照Trainoff等人的美国专利号6,651,009——‘009专利——可以定义品质因数FOM，其描述在光散射方程的位力展开中A₂和A₃项相对于纯质量项的大小；这些容易从方程(1)中得到，分别为2A₂Mc-4A₂ ²M²c²和3A₃Mc²。光散射可以由这种位力展开描述的假设暗示了该方程的收敛性，即逐次高阶项的大小相当快地下降，换句话说1＞＞FOM(A₂)＞＞FOM(A₃)，并且品质因数越小，近似性越好。另一方面，从信噪比考虑，显然的是品质因数必须是某一有限值以便获得可靠的测量。对于特定样品和仪器，测定A₂和A₃的FOM的期望上限和下限通过这些考虑进行设定。

在美国专利号6,411,383中，Wyatt描述了利用单次注射有限体积的未分级样品——其流过MALS检测器和浓度检测器——测量M、<r_g ²>和A₂的方法。先注射样品，接着是充分纯的溶剂，以将MALS和浓度信号变回至基线(I_solv)，并且样品注射在信号中称为“峰”。由于样品的有限特性，在流过该系统后，它被稀释和扩大，以至于该注射的不同部分呈现不同浓度。代替方程使用每次注射I(θ)和c单一值将方程(1)应用于多重注射，本发明人计算单一峰内I(θ)、c和c²的和并且通过方程(1)和M的先验知识确定<r_g ²>和A₂。

利用单一流动峰的这种方法在本文被称为“Wyatt峰”方法。因为不需要流动池饱和，所以需要更少的体积，其一般在200-500μL的范围内，其中最大洗脱间隔浓度对应于利用平稳方法将获得的浓度。

在从检测器到检测器的流通中，由于混合和稀释样品峰进一步变宽并且高度下降。因此来自浓度检测器的时间依赖性浓度信号没有精确地复制光散射检测器中存在的时间依赖性的浓度。因为光散射信号不是浓度的线性函数，所以将方程(1)应用于光散射和浓度的连续值导致计算位力系数上某一程度的误差。随着检测器间加宽增加，以及随着MALS信号与对浓度线性依赖性的偏离增加，即具有更大的FOM，Wyatt峰方法中的误差增加。

‘009专利描述了意欲降低该误差的校正因子，其在本文称为“Trainoff-Wyatt峰方法”。在该方法中，一系列不同浓度的峰被注射到检测器中。这些注射的一般体积为100-200μL。在检测器间变宽不存在的情况下，通过对每个峰内R(θ)、c和c²加和并且将该和拟合到方程(1)而计算目标参数是可能的。此外，变宽效应将误差引入到计算中。‘009专利表明，在变宽仅引起峰宽小的变化的情况中，该误差可以通过简单的倍增因子(multiplicative factor)进行校正。该因子可以以几种方式进行测定。最简单的是这样的校准方法，其中参考标准的注射方法的结果与平稳方法的结果相比。由此确定的校正因子可用于随后的未知样品。在高斯(Gaussian)峰的特定情况中，校正因子可以由峰宽的比值推出。该方法的局限是对于较大的变宽它不能很好地起作用，并且其需要额外的努力确定先验的校正因子。

因此，这样的方法将是有利的，所述方法利用最小的样品量的流动峰，如‘009专利一样，但是以与检测器间变宽效应不相关的方式分析峰数据以得到M、<r_g ²>、A₂和A₃，而不受峰形限制。

交叉位力系数——其测量不同种类分子A和B之间的相互作用——也是科学和工业上具有基础重要性(fundamental importance)的量。对于两种分子种类的溶液来说的光散射方程在方程(3)中呈现为一阶形式。至于单一种类的情况，自身位力系数和交叉位力系数可以在两种种类的情况中用一系列含有不同浓度的注射进行测量，其类似于平稳方法将光散射和浓度值拟合到该方程以获得M_A、M_B、<r_g ²>_A、<r_g ²>_B、A₂ ^A、A₂ ^B和A₂ ^AB，其中A₂ ^A和A₂ ^B可被认为是“自身位力系数(self-virial coefficients)”，并且A₂ ^AB可被认为是交叉位力系数。类似于自身位力系数的Wyatt峰方法，利用最小样品量表征交叉位力系数的方法将是有利的。

$\frac{R(c_A,c_B,\mathrm{\&theta;})}{K}={\left(\frac{\mathrm{dn}}{d{c}_A}\right)}^2\{M_A{c}_A{P}_A\left(\mathrm{\&theta;}\right)-2A_2^A{\left[M_A{P}_A\left(\mathrm{\&theta;}\right)c_A\right]}^2\}$ $+{\left(\frac{\mathrm{dn}}{d{c}_B}\right)}^2\{M_B{c}_B{P}_B\left(\mathrm{\&theta;}\right)-2A_2^B{\left[M_B{P}_B\left(\mathrm{\&theta;}\right)c_B\right]}^2\}---\left(3\right)$ $-\left(\frac{\mathrm{dn}}{d{c}_A}\frac{\mathrm{dn}}{d{c}_B}\right)4A_2^{\mathrm{AB}}{M}_A{M}_B{P}_A\left(\mathrm{\&theta;}\right)P_B\left(\mathrm{\&theta;}\right)c_A{c}_B.$

各种种类的在线浓度检测器是已知的，其包括紫外可见吸光度、荧光和差示折光率dRI检测器。dRI检测器与光散射测量联合是特别有用的，并且足够通用以测量宽范围的可溶性大分子。dRI测量的一个缺点是需要相对于溶剂完全透析蛋白样品，这恰恰因为dRI检测器对可能存在于蛋白样品但不存在于纯缓冲液的盐和赋形剂以及溶解的气体敏感。

透析在位力系数测量中也是重要的，这是因为位力系数随着缓冲液条件变化并且这些对于有意义的测量来说必须是明确的。在一些情况中，缓冲液对分子相互作用的影响通过在几种不同的缓冲液下测量位力系数确定，并且同一样品的等分试样必须相对于每种缓冲液进行透析。然而，透析可能是冗长且费时的过程，并且将流动峰测量与流线透析(in-line dialysis)联合的方式在使这些测量自动化方面将是有利的。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用最小量的样品由一系列不同浓度的注射样品直接测定M、<r_g ²>、A₂和A₃的方法，其具有提高的准确度和降低的计算量，其在本文被称为“在线位力系数法”。

本发明的另一目的是基于在线位力系数法利用最小量的样品确定交叉位力系数。

本发明的又一目的是通过将透析过程与测量相联合提供增加的自动化，这避免了在注射前对不同溶剂透析样品的需要。

附图说明

图1是本发明的一种优选实施方式注射阀方法的主要元件的图。

图2是本发明的第二优选实施方式复式泵方法的主要元件的图。

图3显示一系列注射的90°光散射信号和浓度信号，其用于构建磷酸盐缓冲液(PBS)中牛血清白蛋白(BSA)的席姆(Zimm)图。

图4是溶解于PBS的BSA的传统席姆图，其基于图3的平稳数据和通过将平稳方法应用于图4的数据而进行的标准分析。

图5显示(a)一系列注射的90°光散射信号和浓度信号，其用于借助在线位力系数法构建PBS中BSA的席姆图；(b)(a)中标绘的一部分数据，其显示单个峰。

图6是利用在线位力系数分析——其应用于图5数据——的席姆图。具体实施方式

如‘009专利，本方法首先制备一组浓度的样品，用于注射通过顺次排列的MALS和浓度检测器的流动池。可用于产生样品浓度并将它们传递给检测器的技术中的两个是下面描述的注射回路/注射阀方法以及复式泵方法。产生和注射不同样品浓度峰的方法的其它实施方式对于知识渊博的专业人员来说将是明显的。

注射阀方法：

在第一优选实施方式中，溶剂流在旁路位置经由注射阀连续流过检测器。正当在旁路位置的时候，样品被装载到样品回路中。然后该阀转向注射位置，其将样品回路插入到流路中，并且样品被携带至检测器。如果自动取样器可用，那么可以提供单一的样品储备溶液，用于随后自动稀释至指定浓度。存在两种方法，自动取样器可用于制备浓度。第一，它可以逐渐地将较小量的储备溶液注射到样品回路中，其未将其充满。可选地，自动取样器可以被设定程序以在填充样品回路前预先稀释样品，然后将稀释的样品注射到回路中，一般每个浓度采用等体积。前一方法是优选的，因为它执行起来更简单。如果不存在自动取样器，那么一系列不同浓度下的样品可以通过手工或者通过可为本领域技术人员熟知的任何其它方法制备，用于注射。

复式泵方法：

在第二优选实施方式中，样品和溶剂借助两个泵混合并流过检测器，一个泵供应样品原料，而另一个泵供应溶剂。对泵流速的比值进行调节以产生期望的稀释，以至于总流速达到期望值；两股流在达到检测器前被组合并且穿过混合器。流动可以在样品达到检测器前的任何时刻停止，例如以便于使稀释的样品均匀、平衡等。在产生期望稀释下样品的期望体积后，停止提供样品储备溶液的泵并且对提供溶剂的泵进行调节以匹配期望的总流速值，其将样品推进至检测器中。

在第三优选实施方式中，这两种注射方法可以进行组合，其中复式泵系统将稀释的样品提供给注射回路。

在到达MALS和浓度检测器后，这些检测器测量的信号被计算机获取，储存并且处理，以便计算分子特性。

计算考虑了这样的事实：尽管样品在从一个检测器到下一个检测器的通道中被稀释，但是没有样品损失。代替超瑞利比通常表示为浓度和角度的幂的级数展开式(参见方程(1))，反演席姆方程以提供将浓度表示为超瑞利比和角度的幂的级数展开式，其与标准的席姆方程具有相同的近似阶。将新方程应用于光散射数据，以获得穿过MALS检测器的峰中每一点处的浓度；然后对两个检测器中的浓度信号积分以获得每个峰中的总样品质量。因为假定这些质量是相等的，所以两个检测器的积分值可以是相等的。对于不同浓度下整个系列的峰重复该过程，并且结果拟合到该方程以获得M、<r_g ²>、A₂和A₃参数。

计算涉及对检测器信号在峰内的积分，其中假定恒定流速通过检测器。因此在样品存在于检测器中时保持恒定流速是重要的；然而，在样品到达检测器之前以及返回到基线后，当需要时流动可以停止。

1.0单一种类表征

1.1理论描述

计算依赖于反演光散射方程以便提供c＝c(R^*，θ)。反演最容易从标准席姆方程(1)形式得到： $\frac{c}{R*(c,\mathrm{\&theta;})}=\frac{1}{\mathrm{MP}\left(\mathrm{\&theta;}\right)}+2A_{2}c+[2A_{3}Q\left(\mathrm{\&theta;}\right)-4{A_2}^2\mathrm{MP}\left(\mathrm{\&theta;}\right)(1-P\left(\mathrm{\&theta;}\right))]c^2---\left(3\right)$ 该展开式可被容易反演以产生： $c(R^{*},\mathrm{\&theta;})=\frac{R^{*}}{M}(1+P_1{\sin }^2\left(\frac{\mathrm{\&theta;}}{2}\right)-P_2{\sin }^4\left(\frac{\mathrm{\&theta;}}{2}\right))+\frac{2A_2}{M}{R^{*}}^2(1+P_1{\sin }^2\left(\frac{\mathrm{\&theta;}}{2}\right))---\left(4\right)$ $+(\frac{3A_3}{M^2}+\frac{4A_2^2}{M}){R^{*}}^3.$ 重要的是注意这描述了光散射检测器内部样品的瞬时浓度。甚至在校正了与两检测器间传输时间相关的延迟后，由于上述的检测器间变宽的效应，顺次连接的浓度检测器中的浓度一般地将稍微有所差别。尽管瞬时浓度不同，但是质量守恒保证了每个峰中穿过每个检测器的总质量是相同的。

在在线位力系数测量中，我们使通过对浓度积分在浓度和MALS检测中所检测到的每个峰的总质量相等：

其中c_i是浓度检测器所获得的第i次浓度测量，其对洗脱体积Δv_i求平均，并且c_j是由光散射检测器所获得的数据计算的第j次浓度，其对稀释的体积Δv_j求平均。方便起见，我们采用下列符号，其中R(θ)_j是在角度θ由光检测器获得的超瑞利比的第j次光散射测量，其对洗脱体积Δv_j求平均：

和

方程(5)可被重写为： $C_m=\frac{1}{M}{R}_{1,\mathrm{mk}}+\frac{P_1}{M}{\sin }^2\left(\frac{\mathrm{\&theta;}}{2}\right)R_{1,\mathrm{mk}}-\frac{P_2}{M}{\sin }^4\left(\frac{\mathrm{\&theta;}}{2}\right)R_{1,\mathrm{mk}}---\left(6\right)$ $+\frac{2A_2}{M}{R}_{2,\mathrm{mk}}+\frac{2A_2{P}_1}{M}{\sin }^2\left(\frac{\mathrm{\&theta;}}{2}\right)R_{2,\mathrm{mk}}+(\frac{3A_3}{M}+\frac{4{A_2}^2}{M^2})R_{3,\mathrm{mk}}.$

将来自一系列不同浓度的峰的数据拟合到方程(6)求出M、<r_g ²>、A₂和A₃的值。以类似的方式可以将R(θ，c)的位力展开式反演成任何阶，以获得类似阶的c(θ，R)。体积元素的大小由洗脱时间和流速确定。因为MALS和浓度检测器串联连接，所以通过两者的流速是相同的并且体积元素可以用时间元素Δt_i和Δt_j代替。主要的观测结论是检测器间带变宽影响瞬时浓度c_mi但没有影响积分浓度C_m。因此方程(6)与检测器间带变宽无关，其是该方法优于早期方法的主要优点。

该方法假定洗脱通过两个检测器的总质量相等；因此测量和计算必须覆盖足以包含基本上全部洗脱样品的洗脱体积元素的范围。

1.2测量装置和过程

一组初始浓度c₁、c₂、...c_n的样品按顺序注射到一组检测器中——MALS检测器，其包含多个角度θ_k下的光检测器，以及浓度检测器，诸如图1中所示。MALS检测器的一个实例是DAWN-HELEOS，来自Wyatt Technology Corporation，Santa Barbara，CA，浓度检测器的实例是Optilab rEX，也来自Wyatt TechnologyCorporation。在一般的实施方式中，浓度系列符合c_m＝mΔc，其中m取1至n的整数值并且Δc是固定的浓度跃迁(concentration step)。真实的峰浓度将因为在流过该系统过程中样品峰稀释和变宽，与初始值不同。借助泵使得样品连续流过检测器。随着样品穿过检测器，数据由进行前述拟合程序的计算机从检测器中获得，储存并且分析。

在图1所示的被称为“注射阀方法”的第一实施方式中，溶剂通过泵工具1从溶剂储罐2中抽出穿过脱气装置3，并且然后泵过过滤工具4进入注射阀11并且通到检测器8和9中。脱气装置3一般用于从溶剂中去除溶解的气体，因为这种气体可能随后在溶液中产生可能干扰溶液本身期望测量的小气泡。过滤工具4一般如所示被并入以便从所述溶剂中去除可能干扰期望测量的残余颗粒物质。泵工具的一个实例是型号G1310等度泵(恒溶剂泵，isocratic pump)，其来自Agilent Technologies，Inc.，Santa Clara，CA。脱气装置的实例是Systec多通道真空脱气装置(Systec Multi-Channel Vacuum Degasser)，其可从Upchurch Scientific，Oak Harbor，WA得到。溶剂穿过设定在旁路位置的注射阀11，以便溶剂没有流过样品回路12。注射阀的实例是型号7725分析注射器，其也来自Upchurch Scientific。样品5的等分试样——其重均摩尔质量、均方半径以及第二和第三位力系数通过本发明的方法得到——通过注射器工具6转移到样品回路12中。当样品转移完成时，注射阀换到注射位置以便溶剂流过样品回路12，这样溶剂将样品携带至检测器8和9。不同浓度可以预先制备并且手工注射到样品回路中。可选地，它们可以预先制备并且借助自动取样器注入。在优选的实施方式中，商业自动取样器诸如1329A——其也来自Agilent Technologies，Inc——被设定程序以通过在小瓶中混合不同体积的储备溶液和溶剂而从样品储备溶液中产生多种浓度。在另一优选实施方式中，多种浓度通过对自动取样器设定程序以将不同体积的储备溶液直接注射到样品回路中而产生，其中样品回路被充以溶剂，并且注射体积小于回路体积，以至于通过在样品回路中混合而发生稀释。优先地，样品浓度将跨越一个数量级或更大。

在图2所示的被称为“复式泵方法”的第二实施方式中，两台计算机控制的泵21a和21b——例如Microlab 500 Dual-SyringeDiluter/Dispenser(复式注射稀释器/分配器)，Hamilton Corp.，Reno，NV，其包括两个独立的可控注射泵(syringe pump)——被用于从样品储罐22抽出样品以及从溶剂储罐23抽出溶剂。这些被转移穿过脱气装置室24a和24b，并且被泵过过滤器25a和25b。这两台泵的流速借助计算机进行调节，并且这些流被混合并且被泵过混合室——例如Hypershear轴向静态混合器，其可从Analytical Scientific Instruments，El Sobrante，CA得到——以便产生期望浓度的连续样品流。混合后的样品可以被暂时储存在保留体积(holding volume)26中，其包括混合室、管道、脱盐柱及可能需要的任何其它体积。在期望体积的混合样品已经被注射到所述保留体积中后，停止样品储备溶液的流动，并且通过泵21a泵溶剂，以便让样品以期望流速从所述保留体积流过检测器。优选的稀释范围如前述实施方式。

对本领域技术人员来说显然的是，第三实施方式按照复式泵方法用一对泵将混和样品注射到样品回路将产生序贯样品浓度，并且按照注射阀方法在切换注射阀后通过其它泵工具将样品推送至检测器。

在样品需要现有透析的情况中，脱盐柱7——例如HiTrap脱盐柱，其可从Amersham BioSciences，Uppsala，Swede得到——可被置于MALS检测器8前。

各个连续样品5穿过MALS检测器8，由此每个角度下的超瑞利比的值R_j(θ_k)在连续洗脱体积Δv_j下测量；并且穿过浓度检测器9，显示为差示折光率(dRI)检测器，由此样品浓度c_i在各个体积间隔Δv_i下测量。所得到的光散射和浓度信号然后通过计算机工具10进行储存和处理以计算各个注入的等分试样m的值C_m、R_1，mk、R_2，mk和R_3，mk。计算机工具10也通过将计算结果拟合到方程(6)计算分子特性，其包括M、<r_g ²>、A₂和A₃。可以执行各种拟合程序以求出分子特性。在角度依赖性可忽略或者A₃项可忽略的情况中，线性最小二乘方拟合是一种优选的实施方式。在另一优选的实施方式中，拟合程序是由非线性最小二乘方拟合组成，其利用Levenberg-Marquardt算法。如本领域技术人员已知的，如果数据的量或FOM不值得保持所有的高阶项，可以进行低阶拟合，放弃例如A₃项。

尽管样品浓度检测器9可以是dRI检测器，但是紫外或可见光吸收检测器可以被当作代用品。蒸发式光散射检测器(evaporativelight scattering detector)也可被用于监控各个洗脱样品的浓度，尽管这种装置可能需要专门的校准，因为它的响应一般是非线性的。其它在线检测器对本领域技术人员来说是熟知的。

对本领域技术人员显然的是，不管通过线性最小二乘方方法、Levenberg-Marquardt方法或其它算法，将测量的数据拟合到方程(6)的形式，可以包括统计加权，由此用于进行这些拟合的数据通过它们测量的标准差进行加权。

1.3该方法的实施例

为了证明该方法的实用性，我们提供了溶解在磷酸盐缓冲水溶液PBS中的牛血清白蛋白BSA的分子参数的测量。来自Sigma-Aldrich Corporation的样品的单体分子量为66,400(实际重均摩尔质量稍微高一些，这是由于存在低浓度的二聚体和三聚体)并且其均方半径在通过可见光散射可测的极限值以下(采用静态光散射技术)。

该样品采用两种方法进行表征。第一种方法是平稳方法。制备浓度10g/L的样品储备溶液。该储备溶液和溶剂借助三元组注射泵稀释器/分配器被抽吸穿过脱气室，进行过滤并且在静态混合器中混合成固定浓度间隔下的期望浓度系列。足够大体积的样品——2mL——被注射到串联连接的MALS和浓度检测器中，以便填充流动池并且使每个信号达到平稳。来自90°光散射检测器27的原始信号以及来自浓度检测器28的原始信号被显示在图3中。平台(平稳)是清楚可见的，并且每个峰平台上小范围的数据被平均并且被用于产生图4中所示的席姆图。所测量的量为M＝67,760±0.05kD以及A₂＝1.33±0.01×10^-4mol·mL/g²。该数据是高质量的，但是需要相对大量的样品(每等分试样大约2mL)。

第二种方法是本发明的目的。同样的样品浓度通过复式泵方法进行注射，每次注射只使用200μl，所以流动池没有完全被充满并且没有达到平稳。数据显示在图5中。它表明90°光散射信号29与dRI检测器信号30叠加。两者都已经减去基线。从每次注射计算出c_m、R_1，mk、R_2，mk和R_3，mk。采用线性最小二乘方拟合方法对方程(6)所得的拟合显示在图6中。所得到的结果是M＝66,700±0.03kD以及A₂＝1.17±0.01×10^-4mol·mL/g²。这些值与用平稳方法获得的那些值非常一致。

2.0两种类表征：

2.1理论描述：

对于溶剂中存在的两种非相关大分子种类来说，浓度中上至二阶的光散射方程，由方程7给出： $\frac{R(c_A,c_B,\mathrm{\&theta;})}{K}={\left(\frac{\mathrm{dn}}{d{c}_A}\right)}^2\{M_A{c}_A{P}_A\left(\mathrm{\&theta;}\right)-2A_2^A{\left[M_A{P}_A\left(\mathrm{\&theta;}\right)c_A\right]}^2\}$ $+{\left(\frac{\mathrm{dn}}{d{c}_B}\right)}^2\{M_B{c}_B{P}_B\left(\mathrm{\&theta;}\right)-2A_2^B{\left[M_B{P}_B\left(\mathrm{\&theta;}\right)c_B\right]}^2\}---\left(7\right)$ $-\left(\frac{\mathrm{dn}}{d{c}_A}\frac{\mathrm{dn}}{d{c}_B}\right)4A_2^{\mathrm{AB}}{M}_A{M}_B{P}_A\left(\mathrm{\&theta;}\right)P_B\left(\mathrm{\&theta;}\right)c_A{c}_B.$

这里dn/dc_A和dn/dc_B是种类A和B的差示折光增量，M_A和M_B为种类A和B的重均摩尔质量，c_A和c_B为种类A和B的浓度，P_A(θ)和P_B(θ)为假定<r_g ²>_A和<r_g ²>_B由于种类A和B的角度分布，A₂ ^A和A₂ ^B为种类A和B的自身位力系数，并且A₂ ^AB为种类A和B的交叉位力系数。M_A、M_B、<r_g ²>_A、<r_g ²>_B、A₂ ^A和A₂ ^B的值可以通过上述单一种类方法进行确定。

剩余参数A₂ ^AB现在可以在联合两个种类的测量中确定。该测量将由一系列具有不同浓度的种类A和种类B的样品组成，并且将由小的、连续流动的等分试样组成，以便享有在线位力系数方法的优点。

为了如对单一散射种类所描述的反演方程，需要另外的关系。对于那种关系，我们可以安全地假定在每等份试样m的整个注射期间，c_B与c_A的比例f_m是恒定的并且是已知的(因为它是由装置确定的)，即使这些浓度的大小变化，这是因为混合同等地影响两个种类：c_B，m＝f_mc_A，m    (8)

方程(7)和(8)可以进行组合以产生表达式R＝R(c_A，θ)，其可已被反演以表达c_A＝c_A(R，θ)： $c_A(R^{*},\mathrm{\&theta;})=\frac{R}{K{X}^{\mathrm{AB}}}$ $+\frac{{\left(\frac{\mathrm{dn}}{d{c}_A}\right)}^2{M}_A{P}_1^A+{\left(\frac{\mathrm{dn}}{d{c}_B}\right)}^{2}f{M}_B{P}_1^B}{K{\left(X^{\mathrm{AB}}\right)}^2}R{\sin }^2\left(\frac{\mathrm{\&theta;}}{2}\right)---\left(9\right)$ $+\frac{{\left(\frac{\mathrm{dn}}{d{c}_A}\right)}^{2}2A_2^A{M}_A^2+{\left(\frac{\mathrm{dn}}{d{c}_B}\right)}^{2}2A_2^B{f}^2{M}_B^2+\frac{\mathrm{dn}}{d{c}_A}\frac{\mathrm{dn}}{d{c}_B}4A_2^{\mathrm{AB}}f{M}_A{M}_B}{K{\left(X^{\mathrm{AB}}\right)}^3}{R}^2,$ 其中R或sin²(θ/2)的高于二阶的项已经被忽略，并且定义了下列变量： $X^{\mathrm{AB}}={\left(\frac{\mathrm{dn}}{d{c}_A}\right)}^2{M}_A+{\left(\frac{\mathrm{dn}}{d{c}_B}\right)}^{2}f{M}_B;$ P₁ ^A＝[(4k²/3]<r_g ²>_A；和P₁ ^B＝[4k²/3]<r_g ²>_B。

由于质量守恒，从浓度信号中计算得到的每次注射m中A的总质量可以与依靠方程(9)和(5)从光散射所获得的总质量相等： $\underset{i}{\mathrm{\&Sigma;}}{c}_{A,\mathrm{mi}}\mathrm{\&Delta;}{v}_i=\underset{i}{\mathrm{\&Sigma;}}{c}_{\mathrm{mi}}\mathrm{\&Delta;}{v}_i/(1+f_m)=C_m,---\left(10\right)$ 其中，c_mi＝c_A，mi+c_B，mi， $C_m=\frac{R_{1,\mathrm{mk}}}{K\left(X^{\mathrm{AB}}\right)}$ $+\frac{{\left(\frac{\mathrm{dn}}{d{c}_A}\right)}^2{M}_A{P}_1^A+{\left(\frac{\mathrm{dn}}{d{c}_B}\right)}^2{f}^m{M}_B{P}_1^B}{K{\left(X^{\mathrm{AB}}\right)}^2}{\sin }^2\left(\frac{\mathrm{\&theta;}}{2}\right)R_{1,\mathrm{mk}}---\left(11\right)$ $+\frac{{\left(\frac{\mathrm{dn}}{d{c}_A}\right)}^{2}2A_2^A{M}_A^2+{\left(\frac{\mathrm{dn}}{d{c}_B}\right)}^{2}2A_2^B{\left(f^m\right)}^2{M}_B^2+\frac{\mathrm{dn}}{d{c}_A}\frac{\mathrm{dn}}{d{c}_B}4A_2^{\mathrm{AB}}{f}^m{M}_A{M}_B}{K{\left(X^{\mathrm{AB}}\right)}^3}{R}_{2,\mathrm{mk}}.$

在一定范围的c_A和c_B的值内进行测量并且将结果拟合到方程(10)和(11)将确定交叉位力系数A₂ ^AB。

对本领域技术人员明显的是，位力展开的阶可以被增加以包括更高阶参数，例如A₃ ^A或A₃ ^B。

2.2测量装置和过程

测量按照单一种类测量进行，除了样品包括：1)一系列浓度的单独种类A；2)一系列浓度的单独种类B；和3)一系列包含不同浓度A和B的样品。部分(1)和(2)是必须的以便获得A₂ ^AB的明确测量。

在一种优选的实施方式中，c_A与c_B的比值在整个所有两组分等份试样中是固定的，这样两个样品的摩尔浓度比为1∶1。

在另一优选的实施方式中，在固定的总浓度下，A和B的比例在整个两组分等份试样中变化跨越整个比例范围，从纯A至纯B。

装置类似于单一种类测量的装置，除了在优选的实施方式中，复式泵被三重泵(triple pump)取代，各个泵可以用计算机控制以抽吸种类A、种类B和溶剂。这种三重泵是Calypso系统，其可从WyattTechnology Corporation，Santa Barbara，CA得到。

对光散射领域的技术人员来说明显的是，我们已经发明并描述的方法存在许多显而易见的变化，这没有脱离为其实施我们所列的基本要素；所有这些变化仅仅是上文所述发明显而易见的实现方式并且通过参考下面的权利要求书而被包括在内。

Claims (16)

1.一种测定溶剂中分子的溶液的重均摩尔质量M、均方半径<r_g ²>、第二位力系数A₂和第三位力系数A₃的方法，其包括下列步骤：

A.提供所述溶剂的储罐；

B.提供所述溶液的储罐；

C.用所述溶剂采用稀释工具从所述溶剂的所述储罐和所述溶液的所述储罐制备一系列所述溶液的n总数个稀释液D_m，其中m为1至n；

D.提供取样工具，通过所述取样工具所述稀释液D_m，其中m＝1至n被按顺序注射并且使其逐次流过

a.光散射检测工具，其收集在所述稀释液D_m，其中m＝1至n的每个增加的注射体积Δv_i下在多个q总数个角度θ_k，其中k=1至q散射的光；

b.浓度检测工具，其测量在所述稀释液D_m，其中m＝1至n并且n为稀释液的总数的每个增加的注射体积Δv_i下相应的分子浓度c_mi，其中m＝1至n并且n为稀释液的总数；

E.从在每个流动体积增加的间隔Δv_i下测量的散射光强度和所述相应的浓度c_mi中产生相关的超瑞利比R*(θ_k，c_mi)；

F.在各个所述稀释液D_m的整个洗脱中，从所述分子浓度c_mi计算与每个所述稀释液D_m相应的n个浓度和

其中m＝1至n，并且n为稀释液的总数；

G.从所述产生的超瑞利比R*(θ_k，c_mi)计算与所述n总数个稀释液相应的3qn超瑞利比和，

$R_{2,\mathrm{mk}}=\underset{i}{\mathrm{\&Sigma;}}{[R*({\mathrm{\&theta;}}_k,c_{\mathrm{mi}})]}^2\mathrm{\&Delta;}{v}_i$ 和 $R_{3,\mathrm{mk}}=\underset{i}{\mathrm{\&Sigma;}}{[R*({\mathrm{\&theta;}}_k,c_{\mathrm{mi}})]}^3\mathrm{\&Delta;}{v}_i,$ 其中k＝1至q并且m＝1至n；

H.通过用下列方程拟合收集的浓度值和产生的超瑞利比值从所述3qn超瑞利比和获取所述分子溶液的平均分子性质，

$C_m=\frac{1}{M}{R}_{1,\mathrm{mk}}+\frac{P_1}{M}{\sin }^2\left(\frac{\mathrm{\&theta;}}{2}\right)R_{1,\mathrm{mk}}-\frac{P_2}{M}{\sin }^4\left(\frac{\mathrm{\&theta;}}{2}\right)R_{1,\mathrm{mk}}+\frac{2A_2}{M}{R}_{2,\mathrm{mk}}+\frac{2A_2{P}_1}{M}{\sin }^2\left(\frac{\mathrm{\&theta;}}{2}\right)R_{2,\mathrm{mk}}$

$+(\frac{3A_3}{M}+\frac{4{A_2}^2}{M^2})R_{3,\mathrm{mk}},$

其中 $P_1=\frac{4{\mathrm{\&kappa;}}^2}{3}<r_g^2>,$ $P_2=\frac{2{\mathrm{\&kappa;}}^4}{45}(10{<r_g^2>}^2-3<r_g^4>),$ $\mathrm{\&kappa;}=\frac{2\mathrm{\&pi;}{n}_0}{{\mathrm{\&lambda;}}_0},$ n₀是所述溶剂的折光率，并且λ₀是所述光散射检测工具的入射真空波长，和所述重均摩尔质量M、所述均方半径<r_g ²>、所述第二位力系数A₂和所述第三位力系数A₃是所述拟合的参数。

2.权利要求1所述的方法，其中所述拟合通过计算机工具进行。

3.权利要求1所述的方法，其中所述拟合是线性最小二乘方拟合。

4.权利要求1所述的方法，其中所述拟合是Levenberg-Marquardt非线性最小二乘方拟合。

5.权利要求1所述的方法，其中所述浓度检测工具包括差示折光率dRI检测器。

6.权利要求1所述的方法，其中所述浓度检测工具包括紫外UV吸收检测器。

7.权利要求1所述的方法，其中所述稀释工具包括自动取样器。

8.权利要求7所述的方法，其中所述自动取样器被操作以便逐渐地将较小量的所述溶液注射入样品回路，用所述溶液未充满所述样品回路，固定体积的剩余的所述样品回路填充有溶剂，从而经过在所述样品回路中混合产生稀释液。

9.权利要求7所述的方法，其中所述自动取样器被操作以便注射预先制备的所述溶液的所述稀释液。

10.权利要求1所述的方法，其中所述稀释工具包括复式泵系统。

11.权利要求10所述的方法，其中所述取样工具包括提供所述溶剂的所述复式泵系统的泵。

12.权利要求11所述的方法，其中所述稀释液D_m在到达所述光散射检测工具和浓度检测工具之前沉积在保留体积中。

13.权利要求10所述的方法，其中所述稀释液D_m借助静态混合器混合。

14.权利要求1所述的方法，其中所述取样工具进一步包括使所述溶剂流过样品回路的泵，所述稀释液D_m已被转移到所述样品回路中，以便所述溶剂流过所述样品回路，携带所述溶液至所述光散射检测工具和浓度检测工具。

15.权利要求10所述的方法，其中所述复式泵系统的一个泵提供所述溶液，和所述复式泵系统的另一个泵提供所述溶剂，从而调节所述泵的流速的比值以产生期望的稀释液。

16.权利要求1所述的方法，进一步包括在流路中使脱盐柱放置在所述光散射检测工具之前的步骤，所述脱盐柱提供所述溶液相对于所述溶剂的透析。

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