CN101506346A - 电融合微电极和使用其操纵细胞和/或细胞组分的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种由具有第一近端和第二远端的管制成的电融合微电极。所述管在其外表面上具有从管的第一近端连续延伸到管的第二远端的导电涂层。还公开了一种电融合微电极装置，其具有电融合微电极和能够在管的第二远端接纳该电融合微电极的固定工具。本发明还涉及具有两个或更多个本发明的电融合微电极的系统，和使用本发明的电融合微电极、装置和系统操纵细胞和/或细胞组分的方法。

Description

电融合微电极和使用其操纵细胞和/或细胞组分的方法
[0001]本申请要求2005年12月22日提交的申请序列号为No.11/315,475的美国专利申请的优先权，其在此全部引入作为参考。
发明领域
[0002]本发明涉及一种电融合微电极(electrofusion microelectrode)和使用其操纵(manipulate)细胞和/或细胞组分(cellular components)的方法。
发明背景
[0003]细胞的电融合和电穿孔包括对细胞施加电流。在许多情况下，希望在施加直流电之前对细胞进行排列。细胞的排列可以通过吸取或真空抽吸人工实施。细胞的排列还可以通过施加交流电进行。但是，当通过施加交流电进行排列时，细胞的存活率显著降低。所以，希望有一种具备人工排列细胞和传递直流电双重功能的工具。
[0004]细胞融合(cell fusion)的过程包括可以通过施加一个或多个直流(DC)脉冲诱导的细胞膜的局部可逆渗透。众所周知，当电融合细胞时，在给予DC脉冲之前为细胞排列施加介电泳(dielectrophoretic)交流电(AC)，会极大地提高细胞融合的速率。与介质的体积以及两个电极之间的距离有关，AC的使用对于细胞的排列和定位是必要的。然而，也已知晓AC对细胞是有害的，并且高电压和/或长的时间段甚至会导致细胞溶解(lysis)。而且，小室的典型构造设计成能使大量的细胞在同一时间融合。由于需要大体积的介质，特殊的低电导率溶液是必需的，其所含的抗氧化成分也会伤害细胞，或者在卵母细胞这种特殊情况下，甚至会诱导细胞激活。为了避免同时使用抗氧化剂和AC，针对现有小室的一个可替代方法是在解剖显微镜下人工完成单个细胞的排列。
[0005]总之，对于常规电融合方法的要求，可以将缺点概括为：i)需要显然不是生理性的并且会削弱细胞的生存能力的非电解质溶液；ii)由于大的电极间距，AC脉冲的通过会导致热伤害并随后引起细胞窘迫(cell distress)；iii)单个细胞排列耗费时间；和iv)由于反复使用，电小室可能会成为病原污染的来源。
[0006]本发明是为了克服本领域中的这些和其它不足。
发明概述
[0007]本发明一方面涉及一种由具有第一近端和第二远端的管制成的电融合微电极。所述管在其外表面上具有从管的第一近端连续延伸到管的第二远端的导电涂层。
[0008]本发明另一方面涉及一种电融合微电极装置，其包含如上所述的电融合微电极和能够在所述管的第二远端接纳电融合微电极的固定工具(holding tool)。
[0009]本发明的还一方面涉及含有两个或更多个如上所述的电融合微电极装置的系统。
[0010]本发明再另一方面涉及一种操纵细胞和/或细胞组分的方法。该方法包括将细胞和/或细胞组分与如上所述的电融合微电极的管的第一近端接触。这种接触在有效操纵细胞和/或细胞组分的条件下进行。
[0011]本发明的还另一方面涉及一种操纵细胞和/或细胞组分的方法。该方法包括将细胞和/或细胞组分与两个或更多个如上所述的电融合微电极接触。在有效操纵细胞和/或细胞组分的条件下，在每一个微电极管的第一近端进行对细胞和/或细胞组分的接触。
[0012]本发明提供了具备人工排列细胞和向细胞传递直流电双重功能的工具。
[0013]哺乳动物的细胞核移植用于少数细胞，尤其是处理人类卵母细胞时。所以，获得允许单个细胞排列的工具是理想的。在微操纵控制下，单独的微电极的使用使得能够精确定位将要融合的细胞的期望位置，并且由于电极-细胞的直接接触，可避免使用交流电，以及使用小量的介质。交流电的省去和所需的小体积，使得能够采用可以用油覆盖的常规培养介质。此外，直接的细胞接触甚至会减少将要使用的直流电量，降低对细胞热伤害的可能性。最后，这种微电极低廉的价格使其可以一次性使用，从而杜绝了污染的可能性。
附图简述
[0014]图1A-B是本发明的电融合微电极的两个不同的实施方案的平面图。图1A-B的电融合微电极由具有第一近端和一个第二远端的管制成，所述管在外表面上具有从管的第一近端连续延伸到管的第二远端的导电涂层。在图1A中，微电极管具有固定吸量管结构，其中第一近端是直的。在图1B中，微电极管具有固定吸量管结构，其中第一近端是弯曲的。图1C是图1A的电融合微电极的剖视图，示出了导电涂层怎样环绕微电极管沿圆周延伸。
[0015]图2A-D是示出了本发明的电融合微电极管的第一近端的各种实施方案的透视图。在图2A中，微电极管的第一近端是直的并是开放的。在图2B中，微电极管的第一近端是直的并是密封的。在图2C中，微电极管的第一近端是弯曲的并是开放的。在图2D中，微电极管的第一近端是弯曲的并是密封的。
[0016]图3A是本发明的电融合微电极装置的一个实施方案的平面图。该电融合微电极装置包含安装在固定工具内的本发明的电融合微电极。如图所示，固定工具在微电极管的第二远端接纳电融合微电极。图3B是图3A所示的电融合微电极装置的分解图。
[0017]图4是本发明的电融合微电极装置的一个实施方案的平面图，所述装置具有安装在固定工具内的本发明的电融合微电极。与电源可操作地连接的电极夹(electrode clip)在导电涂层处连接到电融合微电极。
[0018]图5示出了本发明的系统的一个实施方案。所述系统有两个可操作地与真空或抽吸器连接的本发明的电融合微电极装置，每个电融合微电极还安装有可操作地与电源连接的电极夹。
发明详述
[0019]本发明的一方面涉及一种由具有第一近端和第二远端的管制成的电融合微电极。所述管在其外表面上具有从管的第一近端连续延伸到管的第二远端的导电涂层。
[0020]图1A-B示出了本发明的电融合微电极的两个不同的实施方案。如图所示，电融合微电极10由具有近端14(电极尖端)和远端16的微电极管12制成。在管12的外表面上的导电涂层18从管12的近端14连续延伸到远端16。在图1A示出的实施方案中，微电极管12具有固定吸量管结构，其中近端14是直的。在图1B显示的实施方案中，微电极管12具有固定吸量管结构，其中近端14是弯曲的。
[0021]电融合微电极10的管12可以是具有不同几何构造的任何中空管。因此，如果需要，管12的壁可以有角度。在优选的实施方案中，管12是圆柱型的。更优选地，管12具有固定吸量管结构(holding pipette configuration)。
[0022]当然，管12的直径和长度是可变的。如以下更详细描述的那样，管12的直径和长度将根据细胞(和/或细胞组分)的种类以及使用电融合微电极10的操纵的类型变化。典型地，管12的长度为约50-80毫米，直径为约0.5-1.5毫米。
[0023]微电极10的管12可以由任意数目的包括但不限于玻璃、塑料、PVC、陶瓷和/或金属的材料制成。在优选的实施方案中，管12由玻璃制成。甚至更优选地，管12由硼硅酸盐玻璃毛细管制成，其经拉伸和煅造成为固定吸量管结构。
[0024]导电涂层18优选通过将其涂布在管12的外表面上以液体的形式施加。在图1C所示的优选的实施方案中，导电涂层18围绕微电极管12沿圆周延伸。适合的电导体包括但不限于：铝、铜、银、金、钛、铂、钨和合金以及它们的混合物。
[0025]微电极管12的近端14可以具有不同的构型。在一个实施方案(图2A-B)中，管12的近端14是直的。在可替代实施方案(图2C-D)中，管12的近端14是弯曲的。当管12的近端14是弯曲的时，从近端14的尖端弯曲优选为约0-90度。管12的近端14在尖端处可以是开放的(图2A和2C，开口20)或者封闭的(图2B和2D)。
[0026]发明另一方面涉及一种具有如上所述的电融合微电极和能够在微电极管的第二远端接纳电融合微电极的固定工具的电融合微电极装置。
[0027]图3A示出了本发明的电融合微电极装置的一个实施方案。如图所示，电融合微电极装置62具有安装在固定工具30内的电融合微电极10，电融合微电极10的近端14伸出固定工具30之外。
[0028]固定工具30是包含接纳组件36的管，接纳组件36含有孔34，电融合微电极10从中穿过被接纳。固定工具30还具有主轴32和位于接纳组件36和主轴32之间的电绝缘体38，从而流经接纳组件36的电流不会到达主轴32。
[0029]接纳组件36和主轴32可以由相同的材料构成，并且优选由导电的耐用材料构成。另一方面，电绝缘体38由不导电的材料构成，例如塑料。电绝缘体38的不导电特性防止电流通过接纳组件36传递到主轴32。这个设计在电操作实施过程中产生更定域的电效应，这在下面有更详细的讨论。电绝缘体38的绝缘特性也允许以最低细胞死亡抽吸细胞进入固定工具30。
[0030]图3B是图3A的电融合微电极装置62的分解图，其示出了固定工具30的装配。如图所示，支持工具30的三个主要组件(接纳组件36、电绝缘体38和主轴32)通过电绝缘体38上带螺纹的连接器42和主轴32上带螺纹的连接器44相连接。带螺纹的连接器42能够紧固入开口48，开口48具有与带螺纹的连接器42的螺纹相匹配的带螺纹的壁。同样，带螺纹的连接器44能被紧固入开口50，开口50具有与带螺纹的连接器44的螺纹相匹配的带螺纹的壁。这种特殊的组装方式防止接纳组件36的导电材料和主轴32的导电材料之间形成电接触。
[0031]绝缘套管40被安装在管12的远端16之上以防止管12在装入固定工具30中时发生不希望的移动，并在向导电涂层18施加电流时进一步绝缘固定工具30。
[0032]通过将管12(经由远端16)滑入接纳组件36的孔34将微电极10安装到固定工具30中。在优选的实施方案中，将微电极10在接纳组件36中安装得足够深，从而使接纳组件36施压固定微电极10。
[0033]再次参照图3A，根据一个实施方案，管12的第一近端14是开放的(图2A和2C)，并且电融合微电极装置62可操作地与真空或抽吸器连接。优选地，真空或抽吸器在管的远端可操作地与微电极管12连接。真空或抽吸器与微电极管12的连接优选通过连接软管46实现。如图3A所示，连接软管46安装在固定工具30的主轴32内，从而其在微电极管12和开口20的内部抽吸形成真空。
[0034]根据图4所示的另一个实施方案，电融合微电极装置62具有在导电涂层18处与微电极管12连接的电极夹56。电极夹56优选通过夹持在孔34附近的微电极管12上而与微电极管12连接。电极夹56经电连接器58与电源连接。根据该实施方案，电流通过电极夹56从电源传递到管12。
[0035]在一个优选的实施方案中，将本发明的电融合微电极装置安装在微操纵器(micromanipulator)上。优选地，所述微操纵器在倒置显微镜下使用。适合的微操纵器包括但不限于：MM188和MM109微操纵器，Narishigie Co.，LTD(东京，日本)生产。
[0036]可以共同使用一个以上的本发明的电融合微电极或微电极装置。因此，本发明的另一方面涉及一种包含两个或更多个本发明的电融合微电极的系统。
[0037]图5示出了本发明的系统的一个实施方案，所述系统包含两个电融合微电极装置62，每个电融合微电极装置可操作地与真空或抽吸器54连接。另外，电融合微电极10与通过连接器58可操作地与电源连接的电极夹56电接触。在所述系统的一个优选的实施方案中，本发明的第一电融合微电极装置和与直流电源的正极端(positive terminal)连接的第一电极夹58相连，而本发明的第二电融合微电极装置和与直流电源的负极端(negative terminal)连接的第二电极夹58相连。
[0038]在操作时，可以将本发明的电融合微电极、装置和系统用于操纵细胞和/或细胞组分。因此，本发明另一个方面涉及一种操纵细胞和/或细胞组分的方法。该方法包括将细胞和/或细胞组分与本发明的电融合微电极接触。在有效操纵细胞和/或细胞组分的条件下，在微电极管的第一近端实施细胞和/或细胞组分与本发明的电融合微电极的接触。
[0039]本发明的还一个方面涉及一种操纵细胞和/或细胞组分的方法。该方法包括将细胞和/或细胞组分与两个或更多个本发明的电融合微电极接触。在有效操纵细胞和/或细胞组分的条件下，在每一个微电极管的第一近端实施细胞和/或细胞组分的接触。
[0040]依照本发明的方法的细胞操纵可以包括细胞和/或细胞组分的排列(aligning)、融合(fusing)、电穿孔(electroporating)、电融合(electrofusing)和/或移植(transplanting)。
[0041]根据本发明的方法的一个实施方案，使用本发明的电融合微电极实施细胞和/或细胞组分的操纵，其中电融合微电极的第一近端是开放的，且其中所述电融合微电极具有在管的第二远端与该微电极可操作地连接的真空或抽吸器。根据该实施方案，接触细胞和/或细胞组分通过对细胞和/或细胞组分施加吸取(aspiration)或抽吸(suction)来实施。
[0042]为了人工排列细胞和/或细胞组分这一目的，依照本发明的方法通常将吸取或抽吸施加到细胞和/或细胞组分。根据该方法通过抽吸或吸取实施细胞人工排列，避免了用于排列的交流电的使用，从而显著地提高了细胞的存活。细胞存活的显著提高使得在每次操纵中可使用较少的细胞数量。
[0043]可以使用微电极运动与吸取或抽吸的组合来实施本发明的方法。通常，优选使用吸取或抽吸排列细胞，然后通过本发明的电融合微电极施加直流电。
[0044]本发明的方法特别适合于细胞核移植。使用本发明的电融合微电极、装置、或系统来进行细胞核移植，通过从第一卵母细胞移出细胞核，并将该细胞核移植到已经预先摘除了细胞核的第二卵母细胞的卵周隙(perivitelline space)中，然后使第一卵母细胞的移植细胞核与第二卵母细胞的细胞质结合。这通过对所述细胞核与细胞质释放直流电来完成。
[0045]如上所述，电融合微电极的长度和直径可以根据细胞的种类和使用微电极的操纵的类型而变化。例如：当用于哺乳动物细胞的细胞核移植时，管的直径优选在约15μm到约25μm的范围内。当用于哺乳动物细胞的融合时，管的直径优选在约60μm到约100μm的范围内。在一个实施方案中，管的外径可以为约0.97mm，而管的内径可为约0.69mm。在该实施方案中，所述管具有厚度只有约0.28mm的非常薄的管壁。
实施例
[0046]提供以下的实施例是为了阐明本发明的实施方案，而非要限制其范围。
实施例1-电融合微电极的构造
[0047]长度为78mm，外径为0.97mm和内径为0.69mm的毛细管(DrummondScientific，Boomall，Pa.)，在距离一端(近端)10-15mm的位置在水平微电极拉制器(微拉制器)(Campden Inc.，LTD.，伦敦)上拉伸大约60-100μm。将所述管在微煅仪(microforge)(Narishige Co.，LTD，Tokyo，Japan)上切割并抛光以获得最终的60μm的外径和20μm的内径。
实施例2-不成熟哺乳动物卵母细胞的细胞核移植
[0048]经穿刺B6D2F1雌小鼠未经促排卵巢的卵泡获得胚泡(germinal vesicle，GV)阶段的卵母细胞。然后，在补充了细胞松弛素B的介质中，使用一个或多个本发明电融合微电极通过显微操纵术取出细胞核。随后将一个细胞核引入到已预先摘除了细胞核的不成熟卵母细胞的卵周隙中。然后将每一个被移植的卵母细胞放置在两个本发明的电融合微电极之间，暴露于单或双1.0kV/cm，50-99μs的直流融合脉冲。30-60分钟后，检查卵母细胞的融合迹象。然后将该重组的卵母细胞放入培养基中并评定其成熟情况。可以将已经排出第一极体的卵母细胞固定并用姬姆萨(Giemsa)染色进行染色体分析。作为对照，对大约三分之一的卵母细胞不进行任何操作，仅仅培养在同样的介质中并暴露于同样的试剂。
实施例3-胚泡移植
[0049]经穿刺B6D2F1雌小鼠未经促排卵巢的卵泡获得胚泡(GV)阶段的卵母细胞。在PMSG促排的雌小鼠hCG注射后15小时收集分裂中期II(MII)卵母细胞。然后，在补充了细胞松弛素B的介质中，使用一个或多个本发明电融合微电极将细胞核从GV卵母细胞中取出。通过使用一个或多个本发明电融合微电极通过将分裂中期纺锤体所在的“中心”区和第一极体一起清除而将MII卵母细胞去细胞核。随后，将GV细胞核引入预先去细胞核的未成熟的(GV)或成熟的(MII)卵母细胞的卵周隙中。然后将每个被如此操纵的卵母细胞放置在两个本发明电融合微电极之间，暴露于单或双1.0kV/cm，50-99μs的直流融合脉冲以进行电融合。将30-60分钟后显示出融合迹象的卵母细胞放入培养基中培养12个小时使细胞核成熟。可以将排出第一极体的卵母细胞固定并用姬姆萨染色以进行染色体分析。
[0050]虽然出于说明的目的已经详细描述了本发明，但应该理解这些细节仅仅只为该目的，那些本领域的技术人员可以在不背离以下权利要求所限定的本发明的宗旨和范畴的情况下，对此做出各种改动。

Claims (20)

1.一种电融合微电极，其包括：具有第一近端和第二远端的管，其中该管具有在其外表面上的导电涂层，所述涂层从该管的第一近端连续延伸至该管的第二远端。
2.根据权利要求1的电融合微电极，其中所述管具有固定吸量管结构。
3.根据权利要求1的电融合微电极，其中所述管的第一近端是密封的。
4.根据权利要求1的电融合微电极，其中所述管的第一近端是开放的。
5.根据权利要求1的电融合微电极，其中所述管的第一近端是弯曲的。
6.根据权利要求1的电融合微电极，其中所述管由选自由玻璃、塑料、PVC、陶瓷和金属组成的组的材料制成。
7.根据权利要求6的电融合微电极，其中所述管由玻璃制成。
8.根据权利要求1的电融合微电极，其中所述导电涂层选自由铝、铜、银、金、钛、铂、钨、合金和它们的混合物组成的组。
9.根据权利要求1的电融合微电极，其中所述导电涂层环绕所述管沿圆周延伸。
10.一种电融合微电极装置，其包括：根据权利要求1的电融合微电极，和能够在所述管的第二远端接纳电融合微电极的固定工具。
11.根据权利要求10的电融合微电极装置，其中所述管的第一近端是开放的，所述电融合微电极装置进一步包括：
真空或抽吸器，其在所述管的第二远端与微电极可操作地连接，从而在第一近端引起抽吸。
12.根据权利要求10的电融合微电极装置，进一步包括：
电极夹，其可操作地与电源连接并可在所述导电涂层处连接到所述管，使得电流能通过电极夹从电源传递到所述管。
13.根据权利要求10的电融合微电极装置，其中所述固定工具进一步包括：
管，其包含：
接纳组件，微电极管的第二远端接纳进该接纳组件中；
主轴；和
电绝缘体，其位于主轴和接纳组件之间，从而流经接纳组件的电流不到达主轴。
14.根据权利要求10的电融合微电极装置，进一步包括：
为控制固定工具而安装的微操纵器。
15.一种系统，其包括：
两个或更多个根据权利要求10的电融合微电极装置。
16.一种操纵细胞和/或细胞组分的方法，所述方法包括：
在有效操纵细胞和/或细胞组分的条件下，将细胞和/或细胞组分与权利要求1的电融合微电极的管的第一近端接触。
17.根据权利要求16的方法，其中所述管的第一近端是开放的，所述电融合微电极进一步包括在管的第二远端与微电极可操作地连接的真空或抽吸器；所述方法进一步包括：
在所述接触过程中对所述细胞和/或细胞组分施加抽吸。
18.根据权利要求16的方法，其中所述电融合微电极进一步包括可操作地与电源连接并可在所述导电涂层处连接到所述管的电极夹，所述方法进一步包括：
在所述接触过程中对所述细胞和/或细胞组分施加电流。
19.根据权利要求16的方法，其中所述接触包括：
排列、融合、电穿孔、电融合和/或移植细胞和/或细胞组分。
20.一种操纵细胞和/或细胞组分的方法，所述方法包括：
将细胞和/或细胞组分与两个或更多个权利要求1的电融合微电极接触，其中所述接触在有效操纵细胞和/或细胞组分的条件下在所述管的第一近端实施。
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