CN101410511A - 产后来源的细胞在滚瓶中的体外扩增 - Google Patents
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Abstract
描述了使哺乳动物细胞体外生长和扩增的参数最大化的方法，所述细胞特别是容器例如速滚瓶中的产后来源的细胞。提供了优化在所述培养系统中的生长速率和细胞产量的方法。这些方法特别适合于人产后来源的细胞，例如脐来源的细胞。
Description
相关申请的交叉参考
[0001]本申请主张2005年12月19日提交的美国临时专利申请No.60/751,550的权益，其全文在此引入作为参考。
发明领域
[0002]这一般地涉及哺乳动物细胞的生长和扩增。特别地，涉及产后来源的细胞在例如滚瓶的容器中的体外生长和扩增的方法。
发明背景
[0003]商业上的细胞治疗产品优选生产于封闭的无菌系统。然而，用于商业上细胞治疗产品的许多细胞系的生长是依赖于贴壁的。虽然搅拌罐反应器，摇瓶，转瓶，抬升反应器(uplift reactors)等对于悬浮液中生长的细胞是有用的(例如，用于单克隆抗体生产的杂交瘤，用于重组DNA技术的许多细胞，和大多数昆虫细胞培养物)，但是生长和扩增依赖于贴壁或优选贴壁的细胞的选择是更有限的。
[0004]包括在依赖于贴壁的细胞中的是许多正常的二倍体细胞株，以及大多数原代细胞系。所述细胞的大规模生产的选择包括滚瓶，纤维床和中空纤维系统，多板或层叠板培养系统，细胞立方体(cellcubes)，和微载体，每种有优点也有缺点。
[0005]基于滚瓶的细胞培养方法可能是用于生长依赖于贴壁和优选贴壁细胞的最常用方法。滚瓶基本上是圆筒状玻璃或塑料容器，至少部分填充了生长培养基。大多数现代滚瓶是由一次性塑料材料制成。瓶子置于一种转动的装置上，导致瓶子持续“滚动”或以典型的每小时大约5到250转的恒速旋转。滚动允许附着于瓶子内表面的细胞浸泡在培养基中，同时与瓶中空气有着充分的气体交换。
[0006]可获得多种尺寸的滚瓶，每种尺寸提供固定量的表面积和容积。在1-2升的容积范围内可获得许多瓶子。两种常见尺寸的商业滚瓶分别提供850cm2和1050cm2。对于一些申请，大尺寸可成为一种限制，因为太大的滚瓶是难以操作的，在其中微生物安全是关键的。近来，为帮助解决该问题，具有扩大内表面的滚瓶已经是商业上可获得的。滚瓶培养物的处理，例如传代培养物的操作，当可能时应该最小化。
[0007]基于滚瓶的培养系统提供了许多优点，包括相对低的设备和装配成本，相对容易的装配，和根据需要扩大或降低规模的能力。这种瓶，典型地是透明的，允许肉眼和显微镜检查细胞和生长。受污染的样品可容易地认出并可被抛弃。
[0008]潜在的缺点包括接种，转移，收获细胞或产生的生物制品，和其他进行的细胞处理需要相对高水平的技巧。由于需要的技巧水平，与进行的操作相关的成本可能是高的。由于需要的操作量，污染的风险是相对高的。尽管有这些潜在的缺点，滚瓶仍然是有用的，甚至对于一些生物制品的商业化生产也是有用的。
[0009]在应用滚瓶于细胞培养中应该考虑的因素有附着效率，以及达到汇合的时间，附着细胞的生长参数，包括每单位表面积的最大可获得密度，需要的分离技术，和分离效率，培养条件的可量测性，以及在扩大规模条件下培养物的同质性，和成功地扩大分离过程规模的能力。这些考虑中的一些可被以下因素影响：接种参数(例如旋转速度，培养基体积)，培养条件例如瓶子的旋转速度，以及起始培养物的接种密度，相对于瓶子表面积和/或形状的利用的培养基体积，和孵育培养物的时长。
[0010]在扩大规模的滚瓶条件下生长的细胞的特征在表面标记物，基因表达，存活力(高于70到80％)等方面是期望的细胞类型的那些特征，这也是重要的，特别是在细胞治疗应用中。
[0011]需要尝试使可控制的培养参数最佳化，从而在使生长速率、获得的群体倍增次数，和可收获的总细胞同时最大化方面改进滚瓶培养系统。
发明简述
[0012]在几个方面之一，本发明提供了使滚瓶培养系统中产后细胞的生长参数最大化的方法。根据本发明，提供了使滚瓶培养系统中产后细胞培养物的数目倍增最大化的方法。该方法包含利用至少大约0.85rpm的旋转速度，在850平方厘米培养瓶中利用至少大约100ml培养基体积；利用每平方厘米少于大约2500个细胞的接种密度；并且孵育至少大约5.5天。
[0013]也根据本发明的是使滚瓶培养系统中产后细胞培养物的倍增速率最大化的方法。使倍增速率最大化的方法优选包含利用至少大约0.85rpm的旋转速度，在850平方厘米培养瓶中利用大约300ml生长培养基；利用每平方厘米少于大约2500个细胞的接种密度；并且孵育少于大约6天。
[0014]在另一方面，本发明提供了使滚瓶培养系统中产后细胞的收获细胞密度最大化的方法。这些方法包含利用大约0.5-1rpm的旋转速度，在850平方厘米培养瓶中利用大约300ml的生长培养基；利用每平方厘米大约10000个细胞的接种密度；并且孵育大约5.5到6.7天。
[0015]也根据本发明的一方面的是使滚瓶培养系统中产后细胞的倍增速率，收获密度，和群体倍增总次数同时最大化的方法。这些方法在此有时表示为对前述参数优化滚瓶培养系统。该方法优选包含利用大约0.65-0.9rpm的旋转速度，在850平方厘米培养瓶中利用至少大约300ml生长培养基；利用每平方厘米少于大约2500个细胞的接种密度；并且孵育大约5.5到6.5天。
[0016]当产后细胞是脐来源的细胞，并且目前优选脐细胞是基本上类似于，或甚至是等同于ATCC NOS PTA-6067和PTA-6068时，前述方法是特别有用的。
[0017]本发明的这些和其他方面将参考实施例，附图，和下面的本发明的不同方面的详述而进行描述。
附图简述
[0018]图1：计算的为获得最大群体倍增次数(3.04)的最佳旋转速度(1.0rpm)，培养基体积(112ml)，接种密度(2,500个细胞/cm sq.)，和培养天数。每个图的黑线代表了因素水平(沿着x轴由低到高)vs.群体倍增次数(沿着y轴由最小到最大)的绘制数值。蓝线代表了所有四个图的单个最大y轴数值。红线代表x轴上的点，在该点因素水平vs.群体倍增值(黑线)的绘制值与单个最大y轴数值(蓝线)相交因而限定了最佳因素水平。
[0019]图2：计算的为获得每次群体倍增的最小小时数(29.71)的最佳旋转速度(0.92rpm)，培养基体积(300ml)，接种密度(2500细胞/cmsq)，培养天数(5天)。每个图上的黑线代表因素水平(沿着x轴由低到高)vs.每次群体倍增的小时数(沿着y轴由最小到最大)的绘制数值。蓝线代表了所有四个图的单个最大y轴数值。红线代表x轴上的点，在该点因素水平vs.每次群体倍增的小时数(黑线)的绘制值与单个最大y轴数值(蓝线)相交因此限定了最佳因素水平。
[0020]图3：计算的为获得最大收获密度(细胞/cm sq.)(3.59E+04)的最佳旋转速度(0.98rpm)，培养基体积(300ml)，接种密度(10000细胞/cm sq)，和培养天数(6.67天)。每个图上的黑线代表因素水平(沿着x轴由低到高)vs.最大收获密度(沿着y轴由最小到最大)的绘制数值。蓝线代表了所有四个图的单个最大y轴数值。红线代表x轴上的点，在该点因素水平vs.最大收获密度(黑线)的绘制值与单个最大y轴数值(蓝线)相交因此限定了最佳因素水平。
[0021]图4：计算的为获得最小小时数/群体倍增(38.07小时)，最大群体倍增(3.17)，和最大收获密度(细胞/cm sq.)(1.8E+04)的最佳旋转速度(0.705rpm)，培养基体积(300ml)，接种密度(2,500细胞/cm sq.)，和培养天数(6.1天)。每个图上的黑线代表因素水平(沿着x轴由低到高)vs.响应值(沿着y轴由最小到最大)的绘制数值。蓝线代表了所有四个图的单个最大，或最小y轴数值。红线代表x轴上的点，在该点因素水平vs.响应值(黑线)的绘制值与群体倍增和收获密度的单个最大y轴数值和每次群体倍增的小时数的最小y轴数值(蓝线)相交因此限定了最佳因素水平。
[0022]图5：在最佳滚瓶培养条件下从第六代到第九代扩增的脐细胞系050604B的群体倍增次数vs.培养天数。
解释性实施方式的详细描述
[0023]在几个方面，本发明提供了使从生长于滚瓶培养系统的细胞群中可获得的依赖于贴壁细胞的数量，所述培养物的生长速率，或所述培养物的倍增总次数最大化的方法。本发明还提供了使所有这三种前述参数同时最大化的方法。在此还提供了通过前述方法生产的细胞和细胞群。
[0024]滚瓶培养系统在细胞培养领域是已知的。如此处使用的，滚瓶培养系统包括至少一种感兴趣的细胞系，生长培养基，滚瓶，旋转瓶子的装置，和收获细胞的工具。生长培养基优选包括一种基本培养基，例如，Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)，高级DMEM，Ham′s F12，或其组合，例如1∶1 DMEM∶F12。培养基可补充血清，例如在一些实施方式中培养基补充胎牛血清(FBS)或新生小牛血清(NCS)。血清成分可在从0到20％的总培养基体积的浓度范围内变动。生长因子，例如，血小板来源的生长因子BB(PDGF-BB)，碱性成纤维生长因子(bFGF)，和其他，或所述的组合，可用于补充生长培养基。含血清或不含血清培养基都可补充或不补充生长因子。
[0025]滚瓶培养系统典型的进一步包含控制孵育中温度的工具，以及无菌处理培养物的工具，例如在用细胞起始接种瓶子的过程中，或在后续转移中。收获细胞可通过酶处理而实现，例如用胰蛋白酶，胰蛋白酶-EDTA，中性蛋白酶，和胶原蛋白酶，或其他酶或具有或不具有其他成分的酶的组合。其他商业产品例如但不限于TrypLE Express(Gibco，Inc.)可被利用。细胞也可通过手工操作收获，包括例如，分批离心，或者收获可自动化。
[0026]目前，使可收获细胞的量最大化的方法优选应用于产后来源的细胞，特别是来源于胎盘或脐的细胞。此处优选的类型的细胞描述于美国专利申请Nos：10/877,446(胎盘来源的细胞)和10/877,012(脐来源的细胞)，每个都于2004年6月25日提交。这些申请整体在此引入作为参考。还优选的是可获自美国典型培养物保藏中心的类型的细胞，其是ATCC保藏号PTA-6067；PTA-6068；PTA-6074；PTA-6075；或PTA-6079，每种的特征和描述在此引入作为参考。对于本方法特别优选的是定向于培养脐来源的细胞，例如ATCC保藏号PTA-6067和PTA-6068的最大化或最优化的方法。
[0027]在几个方面之一，本发明提供了使生长于滚瓶培养系统中细胞群的可获得的群体倍增次数最大化的方法。优选细胞是产后来源的细胞，甚至更优选细胞是脐来源的细胞。在一个目前的优选实施方式中细胞是ATCC保藏号PTA-6067或PTA-6068。
[0028]用于使滚瓶培养物的群体倍增次数最大化的自变量是旋转速度，细胞接种于瓶中的密度，孵育时间，和置于瓶中的培养基体积。此处和贯穿实施方式例示了这些自变量在一定范围内被测试，出于实践性的原因。熟练技术人员将理解测试范围之外的其他数值可利用同样的方法被常规地测试，并且这些数值可能证明可提供增加的群体倍增次数。检测了因变量的最大响应，此处为获得的群体倍增次数，其作为这些参数的函数，并且在此没有特别例示的实施方式预期作为本公开的一部分。
[0029]为帮助使作为这四种自变量的函数的因变量最大化，利用了回归分析。特别地，响应面法(RSM)目前是一种优选的最优化培养生长参数的方法。RSM应用于最优化技术是本领域已知的。RSM使得多种自变量能最优化，以实现需要的或最优的响应。提供最大和最小响应的参数设置可利用RSM精确地确定。
[0030]如可从此处和下面所例示的数据所见的，测试的自变量可再现地影响最大群体倍增次数。因此，这些数据的统计学分析允许了熟练技术人员确定这四种自变量中每种对于使倍增次数最大化的最佳数值。
[0031]在一个优选实施方式中，因此，瓶子填充了100-300ml的生长培养基，在其他实施方式中利用大约100-120ml，如可从图1中所见的。在一个实施方式中，大约100-120ml，或甚至105-115ml被置于瓶子中。在其他实施方式中，瓶子填充了大约112ml生长培养基以获得最大群体倍增。瓶子接种了每平方厘米大约2500到大约10000个细胞。在一个优选实施方式中，应用了该范围的较低端点值，例如，接种每平方厘米少于大约3000个细胞。如可从图1中所见的，仍然更优选的是接种测试范围的甚至更低端点值的实施方式-接种每平方厘米大约2500个细胞。接种的瓶在附着和生长过程中旋转。旋转速度设置在大约0.5到1rpm之间。优选地，旋转在大约0.75到1rpm之间。更优选地，瓶子以大约0.8到1rpm旋转。如可从图1中所见的，以1rpm附近或大约1rpm旋转是优选的。
[0032]填充并接种的滚瓶被旋转和孵育大约5到7天以获得最大倍增。目前大约5.5到大约6.5天的孵育时间是优选的。如图1反映的，大约6.2到6.3天的孵育也是优选的。
[0033]从图1中也可见，自变量可选为一套参数以使群体倍增次数最大化。一种滚瓶培养系统将提供在所述系统中可完成的最大化的群体倍增次数，所述系统包含大约112ml填充体积的生长培养基，和每平方厘米大约2500个细胞的接种密度，其以大约1rpm的速度旋转，孵育大约6.2天。
[0034]应当指出优选应用的滚瓶典型地包被了一种试剂，所述试剂辅助细胞附着于滚瓶内表面，例如明胶，细胞外基质分子(例如明胶，层粘连蛋白，玻连蛋白，纤连蛋白，I，IV和VI型胶原质)等。虽然对于许多示例性实施方式，应用了明胶包被，其他包被也被认为是适合的，并且熟练技术人员将理解商业上可获得的包被的瓶与此处教导的方法是完全兼容的。所述商业上可获得包被的瓶的一个例子是包被了CellBind(可从Corning获得，目录号3907)的瓶子。CellBind瓶子的应用及其与明胶包被瓶的对比示例于下面的实施例4中。可以预见到多种包被试剂将发现对于根据此处提供的方法的细胞附着和生长是可接受的。
[0035]在另一方面，本发明提供了使小时数/群体倍增最小化的方法(见图2)，或替代表示，使生长于滚瓶培养系统中的细胞群的群体倍增速率最大化。如此处所用的，群体倍增速率是每单位时间的群体倍增次数，并且是每次群体倍增的小时数的倒数。获得最大群体倍增速率降低了产生为治疗用途需要的细胞数量的时间并且提高了具有有限能力的培养系统的总通量。如上和贯穿本公开的，优选细胞是产后来源的细胞，并且甚至更优选细胞是脐来源的细胞。在一个目前优选的实施方式中，细胞是ATCC保藏号PTA-6067或PTA-6068。
[0036]用于使滚瓶培养物中可完成的群体倍增次数最大化的自变量与为完成最大群体倍增次数的相同：旋转速度，细胞接种到瓶中的密度，孵育时间，和置于瓶中的培养基体积。因变量的最大响应，此处为群体倍增速率，被测量并作为这些参数的函数被计算。
[0037]回归分析，并且特别是RSM再次应用以帮助使作为这四个自变量的函数的因变量最大化。
[0038]因此，在一个目前优选的实施方式中，滚瓶填充了大约100-300ml生长培养基，优选应用大约300ml，如可从图2所见的。这些瓶子接种每平方厘米大约2500到大约10000个细胞。在一个目前优选的实施方式中，应用该范围较低端点值，例如接种每平方厘米少于大约3000个细胞。仍然更优选的是接种每平方厘米大约2500个细胞的实施方式。这些接种的瓶在附着和生长过程中被旋转。旋转速度设置在大约0.5到1rpm之间，如可从图2中所见的。优选地，旋转在大约0.75到1rpm之间。更优选地，这些瓶子以大约0.8到1rpm旋转。目前优选以0.9-1.0rpm附近或大约0.9-1.0旋转，如图中所示。
[0039]为使群体倍增速率最大化，被填充并接种了的滚瓶被旋转并孵育大约5到7天，优选孵育大约5到大约6天。图2显示了孵育大约5天也是优选的。
[0040]自变量可选为一套参数以最大化群体倍增速率，基于图2所示的结果。一种滚瓶培养系统将提供在所述系统中可获得的最大群体倍增速率，所述滚瓶培养系统包含大约300ml生长培养基的填充体积，和每平方厘米大约2500个细胞的接种密度，其以大约0.9rpm的速度旋转孵育大约5天。
[0041]在另一方面，本发明提供了使在滚瓶培养系统中生长的细胞群中可收获的依赖于贴壁细胞的密度最大化的方法。如上所述，优选细胞是产后来源的细胞，并且甚至更优选细胞是脐来源的细胞。在一个目前优选的实施方式中细胞是ATCC保藏号PTA-6067或PTA-6068。
[0042]在另一方面，本发明提供了使生长于滚瓶培养系统中的细胞群的收获细胞群密度最大化的方法。收获密度表示为每平方厘米(滚瓶内表面)的细胞数。
[0043]用于使滚瓶培养物中收获密度最大化的自变量与使此处讨论的其他响应最大化的自变量是相同的，也就是，旋转速度，细胞接种到瓶中的密度，孵育时间，置于瓶中的培养基体积。收获密度的最大响应被测量并作为这些参数的函数被计算。
[0044]回归分析，并且特别是RSM如上所述应用于此以帮助使作为这四个自变量的函数的因变量最大化。
[0045]因变量的最大响应，此处为可收获的细胞密度，作为这些参数的函数被计算。在一个目前优选的实施方式中，滚瓶填充了大约100-3 00ml生长培养基，优选应用大约300ml，如可从图3中所见的。瓶子接种每平方厘米大约2500到大约10000个细胞，优选接种密度选自该范围的较低端点值，例如小于每平方厘米大约3000个细胞的数值。更优选的是其中接种密度为每平方厘米大约2500个细胞的实施方式。接种的瓶在附着和生长过程中以大约0.5到1rpm之间的速度旋转，如图3所示。在优选的实施方式中，旋转是大约0.75到1rpm之间。更优选地，瓶子以大约0.8到1rpm旋转。目前优选以0.9-1.0rpm附近或大约0.9-1.0rpm旋转，例如0.98rpm，如图所示。
[0046]为使培养细胞的收获密度最大化，填充并接种了的滚瓶被旋转并孵育大约5到7天，优选孵育时间为大约6到大约7天。图3显示孵育大约5.8到少于大约6天或大约6.5到6.7天也是优选的。
[0047]在另一个方面，本发明提供了同时使小时数/群体倍增最小化，同时使生长于滚瓶系统中的细胞群体的群体倍增次数和收获密度最大化的方法。所述培养条件的最优化使得滚瓶培养系统对于生产治疗应用需要的细胞数量是更有用的，并且提高了具有有限能力的培养系统的总通量。如上所述，优选细胞是产后来源的细胞，并且甚至更优选细胞是脐来源的细胞。在一个目前优选的实施方式中，细胞是ATCC保藏号PTA-6067或PTA-6068。
[0048]调整以帮助使滚瓶培养物中细胞的可完成的群体倍增次数，群体倍增速率和最终收获密度同时最大化的自变量与上面详述的使各个方面最大化的自变量相同：也就是，旋转速度，细胞接种到瓶中的密度，孵育时间，和置于瓶中的培养基体积。因变量的最大响应被测量并作为这些自变量的函数被计算。
[0049]如上所述，回归分析，并且特别是RSM被应用以帮助同时最大化这三个作为这四个自变量的函数的因变量。
[0050]因此，在优选的实施方式中，滚瓶被填充了大约100-300ml的生长培养基，优选应用大约300ml，如参考图4可见的。瓶子接种每平方厘米大约2500到大约10000个细胞。在一个目前的优选实施方式中，应用该范围的较低端点值，例如接种每平方厘米少于3000个细胞。仍然更优选的是接种每平方厘米大约2500个细胞的实施方式。在其他实施方式中应用甚至更低的接种密度。接种了的瓶在附着和生长过程中以大约0.5到1rpm的速度旋转。进一步参考图4，可见优选地，旋转在大约0.6到0.9rpm之间。更优选的，瓶子以大约0.65到0.93rpm旋转。如图中所见，以大约0.85-0.9附近或大约0.85-0.9旋转的培养系统也是优选的。
[0051]为进一步最优化滚瓶培养，填充并接种了的滚瓶被旋转并孵育大约5到7天，孵育时间大约5.5到大约6.5天是优选的。图4显示了孵育大约6天也是优选的，例如5.9，6.0，6.1或6.2天。
[0052]在一个目前优选的培养系统中，自变量可选为一套参数以使群体倍增速率最大化，基于图4所示的结果。一种滚瓶培养系统将提供在所述系统中可获得细胞的最优化群体倍增速率，总倍增次数和收获密度，所述系统包含大约300ml的生长培养基填充体积，和每平方厘米大约2500个细胞的接种密度，其以大约0.7rpm的速度旋转孵育大约6.1天。
[0053]在另一方面，本发明提供了产后细胞，优选脐来源的细胞，其通过本发明的任何方法生产，例如最大化方法或最优化方法。在不同实施方式中，细胞生产为作为细胞治疗剂应用的群体，或提供有用的细胞产品或副产品，例如有用的细胞因子，或蛋白。
[0054]还提供了包含通过此处提供的方法培养的细胞的细胞治疗组合物。
[0055]在本发明的另一方面，根据提供的方法培养的细胞的特征在于具有与起始细胞基本上相同的细胞表面标记物谱或基因表达谱。对于基于细胞的治疗的许多应用，当扩大培养条件的规模以提高产量时细胞特征不改变是重要的。例如，形态学，细胞表面标记物，和帮助辨别或表示治疗细胞的特征基因的表达应该保持基本上不变(如果不是等同)。由于相同细胞在实验室条件按规模(ad scale)下生长，根据本发明提供的细胞和教导的方法在所述特征上是基本上不变的，或优选等同的。优选的脐来源的细胞保持与生长得到它们的细胞基本上相同的细胞表面标记物谱。优选地，根据此处提供的方法生产的细胞表达表面标记物CD10，CD13，CD44，CD73，CD90，PDGFr-α，以及HLA-ABC中的一种以上。更优选它们表达所有这些标记物。这些细胞还优选不表达细胞表面标记物CD31，CD34，CD45，CD117，CD141，以及HLA-DRDPDQ中的一种以上。更优选这些细胞不表达前面的任何一种。在一个高度优选的实施方式中，细胞表达与CD10，CD13，CD44，CD73，CD90，PDGFr-α，HLA-ABC，CD31，CD34，CD45，CD117，CD141，以及HLA-DRDPDQ中的每种等同的细胞表面标记物谱。而且，优选的细胞对于CD10，CD13，CD44，CD73，CD90，PDGFr-α，和HLA-ABC的表达是阳性的，但对于CD315 CD34，CD45，CD117，CD141，以及HLA-DRDPDQ的表达是阴性的。熟练技术人员将理解有几种方法评价细胞系的细胞表面标记物谱。如此处所用的，如果细胞表面标记蛋白可通过使用荧光标记抗体检测，该细胞被认为是阳性的，并且如果细胞表面标记物不能通过荧光抗体检测，该细胞被认为是对于该标记物阴性的。表6提供了对于本发明的脐来源的细胞的优选的细胞表面标记物的概要。
[0056]以相似的方式，根据本发明方法产生的细胞优选基本上保持相同，或甚至等同的基因表达谱，特别是对于其表达帮助表征细胞或作为该细胞系的特征指示物的基因。本发明的脐来源的细胞对于reticulon，LDL-R，IL-8，和GAPDH的基因表达是显著的。在不同实施方式中关于这些基因的表达，所提供的细胞基本上是类似的，或甚至是等同的。
[0057]本发明的这些和其他方面参考下面提供的附图和实施例进一步描述。熟练技术人员将理解实施例仅仅用以示例本发明的某些方面，而不限制本发明。
实施例1：确定培养条件参数的优化试验。
[0058]细胞：利用的细胞来自脐来源的细胞系ATCC保藏号PTA-6067和/或PTA-6068。
[0059]培养基：在优化试验中利用的生长培养基是具有低葡萄糖，15％胎牛血清，1％青霉素-链霉素，和1ppm的2-巯基乙醇的Dulbccco改良Eagle培养基(DMEM)。
[0060]瓶：利用850平方厘米瓶(例如，Corning目录号430851)。
[0061]明胶包被：20ml的2％明胶溶液加入每个850平方厘米瓶。瓶子置于1rpm的滚动系统上20分钟。过量的明胶溶液通过抽吸除去并且用20ml磷酸盐缓冲液(PBS)清洗瓶子。
[0062]细胞接种：来自冷藏细胞库的P13脐022803细胞从一种低温瓶中解冻，并且清洗以除去二甲基亚砜(DMSO)。细胞接种入预填充了300ml培养基并用含5％CO2，95％大气的压缩空气预充气1分钟的单个850平方厘米滚瓶中。
[0063]孵育：细胞在设置在37℃的温度控制室内培养。
[0064]收获：通过抽吸从每个滚瓶中除去培养基，并且用50mlPBS清洗附着细胞。通过抽吸除去PBS，加入10ml的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)以辅助细胞从滚瓶表面的释放。瓶子返回到滚动系统并以0.75rpm孵育5分钟。孵育之后，向每个瓶中加入40ml的培养基。具有细胞的培养基然后转移到50ml的圆锥形试管中并以300xg离心5分钟。离心之后，通过抽吸除去培养基，每个细胞沉淀重悬浮于10ml培养基中。利用Beckman-Coulter Cedex仪器计数细胞。
[0065]统计模型：利用Box-Behnken响应面模型。
[0066]试验设计和优化利用Minitab 14.0计算。测试的参数显示于表1。
表1：测试的因素和测试的数值范围
| 因素 | 低 | 高 |
| 旋转速度(rpm) | 0.5 | 1 |
| 培养基体积(ml) | 100 | 300 |
| 接种密度(细胞/cm sq) | 2500 | 10000 |
| 天 | 5 | 7 |
[0067]试验设计：表1提供的试验根据上述方法设立。
表2：为评价显著影响细胞产量的因素和因素的相互作用的Box-Behnken响应面试验设计，如通过Minitab 14.0统计软件计算。旋转速度(低0.5rpm，高1.0rpm)，培养基体积(低100ml，高500ml)，接种密度(低2500细胞/cm sq.，高10000细胞/cm sq.)和培养天数(低5天，高7天)的最高和最低因素水平是用户定义的，中间点是计算出的。
运行顺序 旋转速度(rpm) 培养基体积(ml) 接种密度(细胞/cm sq) 天
1 0.5 200 6,250 5
2 1 200 6,250 7
3 0.75 300 6,250 7
4 1 200 10,000 6
5 0.75 200 6,250 6
6 0.75 200 2,500 5
7 1 300 6,250 6
8 0.5 200 6,250 7
9 0.5 300 6,250 6
10 1 100 6,250 6
11 0.5 200 10,000 6
12 0.75 300 6,250 5
13 0.75 200 10,000 5
14 0.75 200 2,500 7
15 0.5 100 6,250 6
16 1 200 2,500 6
17 0.75 100 2,500 6
18 0.75 300 2,500 6
19 0.5 200 2,500 6
20 1 200 6,250 5
21 0.75 200 6,250 6
22 0.75 100 6,250 7
23 0.75 200 10,000 7
24 0.75 100 10,000 6
25 0.75 200 6,250 6
26 0.75 300 10,000 6
27 0.75 100 6,250 5
表3：从通过Box-Behnken响应面试验设计而限定的因素水平获得的细胞产量。收获密度以细胞/cm2表示。
瓶 接种 产量 扩增 倍增 时间(天) 小时数/倍增 收获密度
1 5.31E+06 9.80E+06 1.84 0.88 5 136 1.15E+04
2 5.31E+06 1.68E+07 3.16 1.66 7 101 1.98E+04
3 5.31E+06 1.50E+07 2.82 1.5 7 112 1.76E+04
4 8.50E+06 1.86E+07 2.19 1.13 6 127 2.19E+04
5 5.31E+06 2.10E+07 3.95 1.98 6 73 2.47E+04
6 2.13E+06 1.23E+07 5.79 2.53 5 47 1.45E+04
7 5.31E+06 2.17E+07 4.08 2.03 6 71 2.55E+04
8 5.31E+06 1.62E+07 3.04 1.6 7 105 1.90E+04
9 6.31E+06 2.78E+07 5.23 2.39 6 60 3.27E+04
10 5.31E+06 1.96E+07 3.69 1.88 6 76 2.31E+04
11 8.50E+06 2.94E+07 3.46 1.79 6 80 3.46E+04
12 5.31E+06 1.58E+07 2.97 1.57 5 76 1.86E+04
13 8.50E+06 3.03E+07 3.56 1.83 5 65 3.56E+04
14 2.13E+06 1.50E+07 7.06 2.82 7 60 1.76E+04
15 5.31E+06 1.31E+07 2.47 1.3 6 111 1.54E+04
16 2.13E+06 1.59E+07 7.48 2.9 6 50 1.87E+04
17 2.13E+06 1.47E+07 6.92 2.79 6 52 1.73E+04
18 2.13E+06 1.84E+07 8.66 3.11 6 46 2.16E+04
19 2.13E+06 1.22E+07 5.74 2.52 6 57 1.44E+04
20 5.31E+06 1.63E+07 3.07 1.62 5 74 1.92E+04
21 5.31E+06 2.21E+07 4.16 2.06 6 70 2.60E+04
22 5.31E+06 1.77E+07 3.33 1.74 7 97 2.08E+04
23 8.50E+06 3.48E+07 4.1 2.04 7 83 4.10E+04
24 8.50E+06 3.55E+07 4.18 2.06 6 70 4.18E+04
25 5.31E+06 2.23E+07 4.2 2.07 6 70 2.62E+04
26 8.50E+06 3.40E+07 4 2 6 72 4.00E+04
27 5.31E+06 1.14E+07 2.15 1.1 5 109 1.34E+04
表4：响应面回归分析：收获密度(细胞/cm2)对旋转速度，培养基体积，接种密度和培养天数。
收获密度的估计回归系数(编码单位)
项目 Coef SE Coef T P
常数 25647.1 2841 9.028 0.000
旋转速度(rpm) 43.1 1420 0.030 0.976
培养基体积(ml) 2029.4 1420 1.429 0.179
接种密度(细胞/cm sq) 9229.4 1420 6.498 0.000
天数 1921.6 1420 1.353 0.201
旋转速度(rpm)* -4010.8 2131 -1.882 0.084
旋转速度(rpm)
培养基体积(ml)*培养基体积(ml) 9.8 2131 0.005 0.996
接种密度(细胞/cm sq)* 3898.0 2131 1.830 0.092
接种密度(细胞/cm sq)
天数*天数 -4887.3 2131 -2.294 0.041
旋转速度(rpm)* -3705.9 2460 -1.506 0.158
培养基体积(ml)
旋转速度(rpm)*
-4264.7 2460 -1.733 0.109
接种密度(细胞/cm sq)
旋转速度(rpm)*天数
-1723.5 2460 -0.701 0.497
培养基体积(ml)*
-1529.4 2460 -0.622 0.546
接种密度(细胞/cm sq)
培养基体积(ml)*天数
-2088.2 2460 -0.849 0.413
接种密度(细胞/cm sq)*天数
541.2 2460 0.220 0.830
S＝4920 R-Sq＝85.3％ R-Sq(adj)＝68.2％
收获密度的方差分析
来源 DF Seq SS Adj SS Adj MS F P
回归 14 1691605592 1691605592 120828971 4.99 0.004
线性 4 1115938309 1115938309 278984577 11.52 0.000
二乘 4 408129068 408129068 102032267 4.21 0.023
交互 6 167538215 167538215 27923036 1.15 0.391
残差 12 290519868 290519868 24209989
失拟 10 289163467 289163467 28916347 42.64 0.023
纯误差 2 1356401 1356401 678200
总计 26 1982125460
收获密度的异常观测值
Obs Stdorder 收获密度 拟合 SE拟合 残余 St Resid
4 12 21882.350 30542.156 3757.991 -8659.806 -2.73R
(R表示一种大的标准化残余的观测值)
收获密度的估计回归系数(未编码单位)
项目 Coef
常数 -3.05951E+05
旋转速度(rpm) 195874.5033
培养基体积(ml) 281.8629
接种密度(细胞/cm sq) 2.3578
天数 69013.6992
旋转速度(rpm)* -64172.5667
旋转速度(rpm)
培养基体积(ml)*培养基体积(ml) 0.0010
接种密度(细胞/cm sq)* 0.0003
接种密度(细胞/cm sq)
天数*天数 -4887.2529
旋转速度(rpm)* -148.2353
培养基体积(ml)
旋转速度(rpm)* -4.5490
接种密度(细胞/cm sq)
旋转速度(rpm)*天数 -6894.1100
培养基体积(ml)* -0.0041
接种密度(细胞/cm sq)
培养基体积(ml)*天数 -20.8824
接种密度(细胞/cm sq)*天数 0.1443
表5：响应面回归分析：小时数/倍增对旋转速度，培养基体积，接种密度和培养天数。
小时数/倍增的估计回归系数(编码单位)
项目 Coef SE Coef T P
常数 70.740 10.095 7.008 0.000
旋转速度(rpm) -4.098 5.047 -0.812 0.433
培养基体积(ml) -6.351 5.047 -1.258 0.232
接种密度(细胞/cm sq) 15.516 5.047 3.074 0.010
天数 4.068 5.047 0.806 0.436
旋转速度(rpm)* 14.990 7.571 1.980 0.071
旋转速度(rpm)
培养基体积(ml)*培养基体积(ml) 2.919 7.571 0.386 0.707
接种密度(细胞/cm sq)* -14.948 7.571 -1.974 0.072
接种密度(细胞/cm sq)
天数*天数 17.023 7.571 2.248 0.044
旋转速度(rpm)* 11.188 8.742 1.280 0.225
培养基体积(ml)
旋转速度(rpm)* 13.635 8.742 1.560 0.145
接种密度(细胞/cm sq)
旋转速度(rpm)*天数 14.528 8.742 1.662 0.122
培养基体积(ml)* 1.885 8.742 0.216 0.833
接种密度(细胞/cm sq)
培养基体积(ml)*天数 12.015 8.742 1.374 0.194
接种密度(细胞/cm sq)*天数 1.222 8.742 0.140 0.891
S＝17.48 R-Sq＝76.4％ R-Sq(adj)＝48.9％
小时数/倍增的方差分析
来源 DF Seq SS Adj SS Adj MS F P
回归 14 11898.4 11898.42 849.89 2.78 0.042
线性 4 3773.1 3773.06 943.27 3.09 0.058
二乘 4 5439.2 5439.24 1359.81 4.45 0.020
交互 6 2686.1 2686.12 447.69 1.46 0.270
残差 12 3668.4 3668.38 305.70
失拟 10 3663.0 3662.98 366.30 135.71 0.007
纯误差 2 5.4 5.40 2.70
总计 2 615566.8
小时数/倍增的异常观测值
Obs Stdorder 小时数/倍增 拟合 SE拟合 残余 St Resid
4 12 127.460 95.835 13.354 31.625 2.80R
(R表示一种大的标准化残余的观测值)
小时数/倍增的估计回归系数(未编码单位)
项目 Coef
常数 1322.8425
旋转速度(rpm) -905.2233
培养基体积(ml) -1.2682
接种密度(细胞/cm sq) 0.0036
天数-269.8567
旋转速度(rpm)* 239.8467
旋转速度(rpm)
培养基体积(ml)*培养基体积(ml) 0.0003
接种密度(细胞/cm sq)* -0.0000
接种密度(细胞/cm sq)
天数*天数 17.0229
旋转速度(rpm)* 0.4475
培养基体积(ml)
旋转速度(rpm)* 0.0145
接种密度(细胞/cm sq)
旋转速度(rpm)*天数 58.1100
培养基体积(ml)* 0.0000
接种密度(细胞/cm sq)
培养基体积(ml)*天数 0.1202
接种密度(细胞/cm sq)*天数 0.0003
表6：响应面回归分析：群体倍增对旋转速度，培养基体积，接种密度和培养天数。
倍增的估计回归系数(编码单位)
项目 Coef SE Coef T P
常数 2.03667 0.15586 13.067 0.000
旋转速度(rpm) 0.06167 0.07793 0.791 0.444
培养基体积(ml) 0.14417 0.07793 1.850 0.089
接种密度(细胞/cm sq) -0.48500 0.07793 -6.223 0.000
天数 0.15250 0.07793 1.957 0.074
旋转速度(rpm)* -0.25542 0.11690 -2.185 0.049
旋转速度(rpm)
培养基体积(ml)*培养基体积(ml) -0.03417 0.11690 -0.292 0.775
接种密度(细胞/cm sq)* 0.47208 0.11690 4.038 0.002
接种密度(细胞/cm sq)
天数*天数 -0.35667 0.11690 -3.051 0.010
旋转速度(rpm)* -0.23500 0.13498 -1.741 0.107
培养基体积(ml)
旋转速度(rpm)* -0.26000 0.13498 -1.926 0.078
接种密度(细胞/cm sq)
旋转速度(rpm)*天数 -0.17000 0.13498 -1.259 0.232
培养基体积(ml)* -0.09500 0.13498 -0.704 0.495
接种密度(细胞/cm sq)
培养基体积(ml)*天数 -0.17750 0.13498 -1.315 0.213
接种密度(细胞/cm sq)*天数 -0.02000 0.13498 -0.148 0.885
S＝0.2700 R-Sq＝89.5％ R-Sq(adj)＝77.3％
倍增的方差分析
来源 DF Seq SS Adj SS Adj MS F P
回归 14 7.45883 7.45883 0.532773 7.31 0.001
线性 4 3.39682 3.39682 0.849204 11.65 0.000
二乘 4 3.29139 3.29139 0.822846 11.29 0.000
交互 6 0.77063 0.77063 0.128438 1.76 0.190
残差 12 0.87456 0.87456 0.072880
失拟 10 0.86969 0.86969 0.086969 35.74 0.028
纯误差 2 0.00487 0.00487 0.002433
总计 26 8.33339
倍增的异常观测值
Obs Stdorder 小时数/倍增 拟合 SE 拟合 残余 St Resid
4 12 1.130 1.570 0.206 -0.440 -2.52R
(R表示一种大的标准化残余的观测值)
倍增的估计回归系数(未编码单位)
项目 Coef
常数 -20.9241
旋转速度(rpm) 14.0700
培养基体积(ml) 0.0221
接种密度(细胞/cm sq) -0.0003
天数 5.3308
旋转速度(rpm)* -4.0867
旋转速度(rpm)
培养基体积(ml)*培养基体积(ml) -0.0000
接种密度(细胞/cm sq)* 0.0000
接种密度(细胞/cm sq)
天数*天数 -0.3567
旋转速度(rpm)* -0.0094
培养基体积(ml)
旋转速度(rpm)* -0.0003
接种密度(细胞/cm sq)
旋转速度(rpm)*天数 -0.6800
培养基体积(ml)* -0.0000
接种密度(细胞/cm sq)
培养基体积(ml)*天数 -0.0018
接种密度(细胞/cm sq)*天数 -0.0000
实施例2：最优化培养条件的验证
[0068]细胞：利用的细胞是脐来源的细胞，鉴定为CBAT 050604BP6(第6代)。
[0069]培养基：Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)-低葡萄糖，15％胎牛血清，青霉素-链霉素，2-巯基乙醇被用于验证试验。
[0070]瓶：利用的瓶子是850平方厘米培养瓶(例如，Corning目录号430851)。
[0071]明胶包被：向每850平方厘米瓶中加入20毫升2％的明胶溶液。瓶子置于滚动系统中20分钟。通过抽吸除去明胶溶液，并且用20ml PBS清洗每个瓶子。
[0072]细胞接种：5.0E+06P9脐来源的细胞(#050604B)从单个低温瓶中解冻，清洗以除去DMSO。细胞(2.12E+06)接种入用300ml培养基预填充并且用含5％CO2，95％大气的压缩空气预充气1分钟的单个850平方厘米滚瓶。
[0073]孵育：细胞在设置在37℃的温度控制室内培养。
[0074]速度：0.7RPM
[0075]传代：在传代中，通过抽吸从每个滚瓶中除去培养基，并且用50ml PBS清洗附着细胞。抽吸PBS并且加入10ml胰蛋白酶-EDTA。瓶子返回滚动系统并以0.75rpm孵育5分钟。孵育之后，向每个瓶中加入40ml培养基。具有细胞的生长培养基然后转移入50ml圆锥形试管中，并以300x g离心5分钟。离心之后，通过抽吸除去培养基并且细胞沉淀重悬浮于10ml培养基中。利用Beckman-Coulter Cedex仪器计数细胞。细胞以大约2500个细胞/cm sq接种入充气的滚瓶中。
[0076]每代的细胞产量
表7：在最佳滚瓶培养条件下从六代到九代扩增的脐细胞系050604B的生长动力学
代 接种 产量 扩增 倍增 总倍增 时间(天)小时数/倍增
2.13E+06 1
62.13E+06 3.10E+07 1.46E+01 3.87E+00 3.87E+00 6.00 37.24
72.13E+06 3.55E+07 1.67E+01 4.06E+00 7.93E+00 7.00 41.36
82.13E+06 2.54E+07 1.20E+01 3.58E+00 1.15E+01 6.00 40.23
92.13E+06 2.56E+07 1.20E+01 3.59E+00 1.51E+01 6.00 40.10
实施例3：在最佳培养条件下扩增的细胞的表征
[0077]细胞：用于表征试验的细胞是第六代的脐来源的细胞(050604B P6)。
[0078]生长培养基：用作生长培养基的是Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)-低葡萄糖，15％胎牛血清，青霉素-链霉素，2-巯基乙醇。
[0079]瓶：850平方厘米瓶(例如，Coming目录号430851)。
[0080]明胶包被：向每个850平方厘米瓶中加入20ml 2％的明胶溶液。瓶子置于滚动系统20分钟。通过抽吸除去明胶溶液，并用20ml PBS清洗每个瓶子。
[0081]细胞接种：从单个低温瓶中将第9代脐来源的细胞(5.0E+06P9)解冻并清洗以除去DMSO。细胞(2.12E+06)接种入预填充了300ml培养基并用含5％CO2，95％大气压缩空气预充气1分钟的850平方厘米滚瓶。
[0082]孵育：细胞在设置为37℃的温度控制室中培养。
[0083]速度：0.7RPM。
[0084]细胞收获：通过抽吸除去每个滚瓶中的培养基并且用50mlPBS清洗附着细胞。通过抽吸除去PBS并且加入10ml的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)。瓶子以0.75RPM在滚动系统上孵育5分钟。孵育之后，向瓶中加入40ml培养基。具有细胞的培养基然后被转移入50ml圆锥形瓶中并以300xg离心5分钟。离心之后，通过抽吸除去培养基并且将细胞沉淀重悬浮于10ml培养基中。利用Beckman-CoulterCedex仪器计数细胞。
[0085]用于流式细胞术分析的抗体染色：细胞以每毫升1×107的细胞浓度重悬浮于PBS中的3％(v/v)FBS中。抗体如产品说明书所述的加入，并与细胞在4℃下在黑暗中孵育30分钟。孵育之后，细胞用PBS清洗并离心以除去未结合的抗体。细胞在500毫升PBS中重悬浮并通过流式细胞术分析。
[0086]流式细胞术分析：流式细胞术用FACScalibur(BectonDickinson San Jose，CA)仪器进行。
[0087]抗体：利用了下列抗体：
抗体 产品 目录号
CD10 BD Pharmingen(San Diego，CA) 555375
CD13 BD Pharmingen(San Diego，CA) 555394
CD31 BD Pharmingen(San Diego，CA) 555446
CD34 BD Pharmingen(San Diego，CA) 555821
CD44 BD Pharmingcn(San Dicgo，CA) 555478
CD45RA BD Pharmingen(San Diego，CA) 555489
CD73 BD Pharmingen(San Diego，CA) 550257
CD90 BD Pharmingen(San Diego，CA) 555596
CD117 BD Biosciences(San Jose，CA) 340529
CD141 BD Pharmingen(San Diego，CA) 559781
PDGFr-alpha BD Pharmingen(San Diego，CA) 556002
HLA-A，B，C BD Pharmingen(San Diego，CA) 555553
HLA-DR，DP，DQBD Pharmingen(San Diego，CA) 555558
IgG-FITC Sigma(St.Louis，MO) F-6522
IgG-PE Sigma(St.Louis，MO) P-4685
[0088]总RNA分离：用RNeasy Mini试剂盒根据产品说明书(RNeasy Mini Kit；Qiagen，Valencia，CA)分离RNA。RNA用50μl的DEPC-处理的水洗脱并储存在80℃。
[0089]反转录：利用具有TaqMan反转录试剂(Applied Biosystems，Foster City，(A))的随机六聚体反转录RNA，25℃10分钟，37℃60分钟并且95℃10分钟.样品储存在-20℃。利用实时PCR进一步研究称为“信号基因”的基因(氧化LDL受体，白介素-8，肾素和reticulon)。
[0090]实时PCR：利用Assays-on-DemandTM基因表达产物在cDNA样品上进行PCR：利用具有ABI prism 7000SDS软件(AppliedBiosystems，Foster City，CA)的7000序列检测系统，将氧化LDL受体(Hs00234028)，肾素(Hs00166915)，reticulon(Hs00382515)，CXC配体3(Hs001 71061)，GCP-2(Hs00605742)，IL-8(Hs00174103)和GAPDH(Applied Biosystems，Foster City，CA)与cDNA和TaqMan通用PCR主混合物根据产品说明书(Applied Biosystems，Foster City，CA)混合。热循环条件起始是50℃2分钟，95℃10分钟，紧接着95℃15秒和60℃1分钟进行40个循环。
[0091]结果：
表6：通过流式细胞术分析的用静态TC瓶方法或最佳滚瓶方法扩增的Umb 050604B细胞表达的细胞表面蛋白的表达。
细胞表面标记物 静态TC瓶 滚瓶
CD 10 (+) (+)
CD 13 (+) (+)
CD 31 (-) (-)
CD 34 (-) (-)
CD 44 (+) (+)
CD 45 (-) (-)
CD 73 (+) (+)
CD 90 (+) (+)
CD 117 (-) (-)
CD 141 (-) (-)
PDGFr-α (+) (+)
HLA-ABC (+) (+)
HLA-DRDPDQ (-) (-)
[0092]在最佳滚瓶培养条件下扩增的细胞的实时PCR分析。
表7：静态塑料瓶条件下扩增与在最佳滚瓶条件下的TC瓶中生长的细胞(Umb 050604B)表达的基因的CT值的比较。
CT值CT值-标准化的
细胞系 reticulon LDL-R IL-8 GAPDH reticulon LDL-R IL-8
Umb-静态培养 27.79 32 28.7 27.02 0.972 0.844 0.941
Umb-滚瓶 24.22 27.37 19.91 20.49 0.846 0.749 1.029
实施例4：在CELLBIND滚瓶中最佳培养条件的验证
[0093]细胞：050604B P7
[0094]培养基：Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)-低葡萄糖，15％胎牛血清，青霉素-链霉素，2-巯基乙醇。
[0095]瓶：Corning 850平方厘米瓶(目录号430851)，CellBindCorning 850平方厘米瓶(目录号3907)。
[0096]明胶包被：向Corning 850平方厘米瓶(目录号430851)中加入20ml 2％的明胶溶液，并置于滚动系统上20分钟。通过抽吸除去明胶溶液，并用20ml PBS清洗。CellBind Corning 850平方厘米瓶不包被。
[0097]细胞接种：5.0E+06P9个脐050604B细胞从单个低温瓶中解冻并清洗以除去DMSO。2.12E+06个细胞接种入用300ml培养基预填充并用含5％CO2，95％大气的压缩空气预充气1分钟的单个850平方厘米滚瓶。
[0098]孵育：细胞在设置于37℃的温度控制室中培养。
[0099]速度：0.7RPM
[0100]传代：在传代中，通过抽吸从每个滚瓶中除去培养基，并且用50ml PBS清洗附着细胞。抽吸PBS并且加入10ml胰蛋白酶-EDTA。瓶子返回滚动系统并以0.75rpm孵育5分钟。孵育之后，向每个瓶中加入40ml培养基。具有细胞的生长培养基然后转移入50ml圆锥形试管中，并以300xg离心5分钟。离心之后，通过抽吸除去培养基并且细胞沉淀重悬浮于10ml培养基中。利用Beckman-Coulter Cedex仪器计数细胞。细胞以大约2500个细胞/cm sq接种入用气体处理过的滚瓶中。
[0101]结果：
表8：生长在明胶被的滚瓶中的细胞的每代的实际细胞产量，与用CellBind瓶培养的细胞比较。
Umb050604B最佳滚瓶-Gel包被
代 接种 产量 日期 扩增 倍增 时间 时间 小时数/倍增 收获密度
(天) (小时)
2.1E 4-Jan 1
+06
7 2.13E+0 2.45E 10- 1.15E+01 3.53E+0 6.00 144.00 40.83 2.88E+04
6 +07 Jan 0
Umb050604B最佳滚瓶-CellBind
代 接种 产量 日期 扩增 倍增 时间 时间 小时数/倍增 收获密度
(天) (小时)
2.13E+0 4-Jan 1
6
7 2.13E 3.17E+0 10- 1.49E+01 3.90E+0 6.00 144.00 36.93 3.73E+04
+06 7 Jan 0
[0102]本发明不限于上面所述和例示的实施方式，而是能够在所附的权利要求的范围内改变和修饰。
Claims (21)
1.使滚瓶培养系统中产后细胞培养物的数目倍增最大化的方法，包含利用至少大约0.85rpm的旋转速度，在850平方厘米培养瓶中利用至少大约100ml培养基体积；利用每平方厘米少于大约2500个细胞的接种密度；并且孵育至少大约5.5天。
2.权利要求1的方法，其中旋转速度为大约1rpm；在850平方厘米培养瓶中的培养基体积是大约112ml；并且孵育时间是大约6.2。
3.权利要求1的方法，其产生大约3次群体倍增。
4.权利要求1的方法，其中产后细胞是脐来源的细胞。
5.权利要求4的方法，其中产后细胞是ATCC Nos PTA-6067和PTA-6068。
6.使滚瓶培养系统中产后细胞培养物的倍增速率最大化的方法，包含利用至少大约0.85rpm的旋转速度，在850平方厘米培养瓶中利用大约300ml生长培养基；利用每平方厘米少于大约2500个细胞的接种密度；并且孵育少于大约6天。
7.权利要求6的方法，其中旋转速度是大约0.93rpm并且孵育时间少于大约5.5天。
8.权利要求6的方法，其中群体倍增需要的时间少于大约30小时。
9.权利要求6的方法，其中产后细胞是脐来源的细胞。
10.权利要求9的方法，其中产后细胞是ATCC Nos PTA-6067和PTA-6068。
11.使滚瓶培养系统中产后细胞的收获细胞密度最大化的方法，包含利用大约0.5-1rpm的旋转速度，在850平方厘米培养瓶中利用大约300ml的生长培养基；利用每平方厘米大约10000个细胞的接种密度；并且孵育大约5.5到6.7天。
12.权利要求11的方法，其中旋转速度是大约0.98rpm并且孵育时间是大约6.7天。
13.权利要求11的方法，其中细胞密度是大约至少大约3x E+4个细胞/平方厘米。
14.权利要求11的方法，其中产后细胞是脐来源的细胞。
15.权利要求14的方法，其中产后细胞是ATCC Nos PTA-6067和PTA-6068。
16.使滚瓶培养系统中产后细胞的倍增速率、收获密度，和群体倍增总次数同时最大化的方法，包含利用大约0.65-0.9rpm的旋转速度，在850平方厘米培养瓶中利用至少大约300ml生长培养基；利用每平方厘米少于大约2500个细胞的接种密度；并且孵育大约5.5到6.5天。
17.权利要求16的方法，其中旋转速度是大约0.7，并且孵育时间是大约6到6.3天。
18.权利要求16的方法，其中旋转速度是大约0.85，并且孵育时间是大约6到6.3天。
19.权利要求16的方法，其中群体倍增时间少于大约39小时，群体完成至少大约3次倍增，并且收获细胞密度是至少大约1.8E+4个细胞/平方厘米。
20.权利要求16的方法，其中产后细胞是脐来源的细胞。
21.权利要求20的方法，其中产后细胞是ATCC Nos PTA-6067和PTA-6068。
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