CN101389754A

CN101389754A - 胎盘干细胞和第二来源干细胞的联合培养

Info

Publication number: CN101389754A
Application number: CNA2006800534464A
Authority: CN
Inventors: 穆罕默德·海达兰; 王佳伦; 叶倩; 安德鲁·查特林
Original assignee: Anthrogenesis Corp
Current assignee: Clarity Acquisition II LLC
Priority date: 2005-12-29
Filing date: 2006-12-28
Publication date: 2009-03-18
Also published as: AU2006332679A1; IL191770A0; ZA200804718B; NZ568618A; WO2007079184A3; US7700090B2; WO2007079184A2; EP2412801A1; US20070292910A1; CA2633775A1; US20160298084A1; EP1976978A2; US20080175824A1; PE20071327A1; JP2009521930A; US20070292399A1; IL191770A; KR20080081088A; US8455250B2

Abstract

本发明涉及胎盘干细胞和来自第二来源的干细胞或祖细胞的组合，其中该组合相对于单独的胎盘干细胞或单独的第二来源干细胞，显示了移植后着床(engraftment)的改善。该组合被称作组合干细胞群落。本发明也提供在体外和体内识别和制备组合干细胞群落的方法，和移植后着床模型。依照本发明，胎盘干细胞可以与例如源自脐带血的干细胞或祖细胞、胎儿的或新生儿的干细胞或祖细胞、成体干细胞或祖细胞、造血干细胞或祖细胞、源自骨髓的干细胞或祖细胞等组合。

Description

胎盘干细胞和第二来源干细胞的联合培养

本发明主张在2006年12月29日提交的美国临时申请号60/754,962的优先权，该申请的公开内容被引入本文作为参考。

1.介绍

本发明提供了将源自胎盘的干细胞群落相对于来自第二来源的干细胞和/或祖细胞群落的比率最优化以产生组合干细胞群落的体外和体内方法，该组合干细胞群落的移植后着床(engraftment)潜能比单独的胎盘干细胞群落或单独的第二来源干细胞群落更高。本发明也提供包含源自胎盘的干细胞和第二来源干细胞和/或祖细胞的组合干细胞群落，其中该组合相对于单独的胎盘干细胞或单独的第二来源干细胞显示了改善的移植后着床。依照本发明，源自胎盘的干细胞可以与例如源自脐带血的干细胞或祖细胞、胎儿的或新生儿的干细胞或祖细胞、成体干细胞或祖细胞、造血干细胞或祖细胞、源自骨髓的干细胞或祖细胞等组合。组合干细胞群落可以被移植到需要干细胞移植的个体中，例如经历了清髓性治疗并且需要重建免疫和造血系统的个体，或者所患疾病、病症或状况可以通过引入干细胞来治疗的个体。组合干细胞群落可以被用来治疗任何将受益于干细胞施用的状况，包括血液病症例如贫血症、神经学病症、免疫病症等等。

2.发明背景

人类干细胞是能够生成各种成熟人类细胞系的全能的、多能的(pluripotential)、多潜能的(multipotential)祖细胞。干细胞可以被用来重建许多组织(如果不是全部的话)并且恢复组织的生理学和解剖学的功能。例如，包含干细胞的细胞群落被用于移植中，让经历了切除治疗的患者恢复部分或全部造血功能。

最近，Hariri报告了将干细胞从哺乳动物胎盘中分离和对这些干细胞进行表征。参见Hariri，美国申请公开号2002/0123141“Method of Collecting PlacentalStem Cells”、Hariri，美国申请公开号2002/0160510“Renovation andRepopulation of Decellularized Tissues and Cadaveric Organs by Stem Cells”、Hariri，美国申请公开号2003/0032179“Post-partum Mammalian Placenta，Its Useand Placental Stem Cells Therefrom”、以及Hariri，美国申请公开号2003/0180269“Embryonic-like Stem Cells Derived From Post-partum MammalianPlacenta，and Uses and Methods of Treatment Using Said Cells”。

许多不同类型的哺乳动物干细胞被表征。参见，例如Caplan等，美国专利号5,486,359(人类间充质干细胞)；Hu等，WO 00/73421(人羊膜上皮细胞的分离、冷冻储存方法和治疗用途)；Boyse等，美国专利号5,004,681(胎儿和新生儿造血干细胞和祖细胞)；Boyse等，美国5,192,553(同上)；Beltrami等，Cell 114(6):763-766(2003)(心脏干细胞)；Forbes等，J.Pathol.197(4):510-518(2002)(肝脏干细胞)。

干细胞移植的成功与施用的可移植后着床细胞数量显著相关。例如，可从单个捐赠体获得的单位脐带血里的可移植后着床细胞数量和脐带血数量可以变化两个数量级。参见，例如Gluckman，Hematology，American Society ofHematology Education Program Book，1-14(1998)。因此，需要改进脐带血、源自脐带血的有核细胞、或者其它干细胞单位的移植后着床潜能的方法，特别是在移植前改进移植后着床潜能的方法。

3.发明概述

本发明提供了确定源自胎盘的干细胞和第二来源干细胞的比率以制备干细胞群落的方法，该干细胞群落相对于单独的胎盘干细胞或单独的第二来源干细胞产生更多数量的克隆形成单位，或者体内移植后着床被改善。本发明提供了提高和/或促进干细胞、祖细胞、或包含干细胞或祖细胞的组织例如脐带血、以及它们的组合的培养物或单位的移植后着床潜能的方法。特别地，本发明提供了方法和组合物，以提高和/或促进胎盘干细胞和第二来源(例如脐带血、或胎盘血、或源自其中的干细胞)干细胞的组合的移植后着床潜能。这些群落在此被称作“组合干细胞群落”。本发明进一步提供了该组合干细胞群落的体内用途。在优选的实施方案中，胎盘干细胞是来自胎盘灌注液的细胞群落内所含的胎盘干细胞。

在一个实施方案中，本发明提供了识别胎盘干细胞和第二来源干细胞的比率的方法，包含识别胎盘干细胞和第二来源干细胞在细胞总量中的比率，当所述胎盘干细胞和第二来源干细胞在足以形成克隆形成单位的条件下共同培养一段时期时，相对于单独的与所述细胞总量相等的胎盘干细胞或第二来源干细胞，所述组合干细胞群落产生更多数量的克隆形成单位，因此将所述组合识别为组合干细胞群落。在具体实施方案中，当所述组合干细胞群落被移植到所述个体中，相对于单独移植与所述细胞数量相等的胎盘干细胞或与所述细胞数量相等的第二来源干细胞，所述组合干细胞群落改善了需要干细胞治疗的个体中的移植后着床。

在另一个实施方案中，本发明提供了识别组合干细胞群落的方法，包含用第二来源干细胞在体外以多个比率在可以形成克隆形成单位的条件下接触胎盘干细胞一段时间，并且识别所述多个比率中产生最大数量克隆形成单位的比率，其中所述胎盘干细胞和所述第二来源干细胞以该比率组合时，被识别为组合干细胞群落。在具体实施方案中，当所述组合干细胞群落被移植到需要干细胞的个体中时，所述组合干细胞群落改善了所述个体中的移植后着床。

在更加具体的实施方案中，所述组合干细胞群落在移植后的至少或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天时改善了需要干细胞的个体中的移植后着床。在另一个更加具体的实施方案中，所述组合干细胞群落在移植后的至少或超过21天时改善了需要干细胞的个体中的移植后着床。在具体实施方案中，所述组合干细胞群落在移植后的至少或超过25、30、35、40、45、50、55周、或者一年或更长时间时改善了需要干细胞的个体中的移植后着床。

在另一个具体实施方案中，所述接触包含让所述胎盘干细胞和所述第二来源干细胞在同一物理空间中培养。在另一个具体实施方案中，所述接触包含让所述胎盘干细胞和所述第二来源干细胞在分开的物理空间中在共用的培养基中培养。

在另一个实施方案中，所述第二来源干细胞是源自脐带血的干细胞。在另一个实施方案中，胎盘干细胞包含CD34⁺细胞，例如CD34⁺CD38⁺细胞和/或CD34⁺CD38^-细胞。在另一个实施方案中，胎盘干细胞包含表达CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73或CD105标记中的一个或多个，并且缺乏CD34、CD38、CD45、SSEA3和SSEA4标记中的一个或多个的细胞。在另一个实施方案中，胎盘干细胞包含对CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73或CD105呈阳性，并且对CD34、CD38、CD45、SSEA3和SSEA4呈阴性的细胞。在另一个实施方案中，胎盘干细胞包括包含CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73和CD105标记中的一个或多个，并且缺乏CD34、CD38、CD45、SSEA3和SSEA4标记中的一个或多个的细胞。在另一个实施方案中，胎盘干细胞包含对CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73和CD105呈阳性，并且对CD34、CD38、CD45、SSEA3和SSEA4成阴性的细胞。在另一个实施方案中，所述胎盘干细胞包含CD34^-细胞。在具体实施方案中，所述胎盘干细胞是CD34^-CD38^-胎盘干细胞。在另一个实施方案中，所述胎盘干细胞OCT-4⁺或ABC-p⁺。在更加具体的实施方案中，所述胎盘干细胞是OCT-4⁺和ABC-p⁺。在另一个实施方案中，所述胎盘干细胞包含对CD10、CD29、CD33、CD44、CD73、CD105、CD117和CD133呈阳性，并且对CD34或CD45呈阴性的细胞。在更加具体的实施方案中，所述胎盘干细胞包含HLA-ABC⁺的细胞。在更加具体的实施方案中，所述胎盘干细胞包含HLA-ABC^-的细胞。在更加具体的实施方案中，所述胎盘干细胞包含HLA-DR⁺的细胞。在更加具体的实施方案中，所述胎盘干细胞包含HLA-DR^-的细胞。在另一个具体实施方案中，胎盘干细胞包含CD200⁺和HLA-G⁺的细胞。在另一个具体实施方案中，胎盘干细胞包含CD73⁺、CD105⁺和CD200⁺的细胞。在另一个具体实施方案中，胎盘干细胞包含CD200⁺和OCT-4⁺的细胞。在另一个具体实施方案中，胎盘干细胞包含CD73⁺、CD105⁺的细胞，并且在包含所述干细胞的分离的胎盘细胞群落中，当所述群落在允许胚状体形成的条件下培养时，所述胎盘干细胞促进胚状体形成。在另一个具体实施方案中，胎盘干细胞包含CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺的细胞。在另一个具体实施方案中，胎盘干细胞包含OCT-4⁺的细胞，并且在包含所述干细胞的分离的胎盘细胞群落中，当所述群落在允许胚状体形成的条件下培养时，所述胎盘干细胞促进胚状体形成。

在具体实施方案中，所述胎盘干细胞从单一胎盘中获得。在另一个具体实施方案中，所述胎盘干细胞从多个胎盘中获得。在另一个具体实施方案中，所述胎盘干细胞从胎盘灌注液中获得。在另一个具体实施方案中，所述胎盘干细胞是通过用灌注溶液灌注胎盘从所述胎盘中获得的。在更加具体的实施方案中，所述灌注溶液包含蛋白酶或者粘液溶解酶。在另一个具体实施方案中，所述胎盘干细胞是通过物理破碎胎盘或胎盘的一部分获得的。在更加具体的实施方案中，所述物理破碎包含用蛋白酶或者粘液溶解酶接触所述胎盘。在甚至更加具体的实施方案中，所述蛋白酶是胶原酶(例如，胶原酶I、胶原酶IV)、胰蛋白酶(例如，胰蛋白酶-EDTA)、弹性蛋白酶、分散酶，或者其组合。在另一个甚至更加具体的实施方案中，所述粘液溶解酶是透明质酸酶。

在另一个具体实施方案中，所述第二来源干细胞是源自脐带血的干细胞。在一个更加具体的实施方案中，所述源自脐带血的细胞是造血干细胞。在另一个更加具体的实施方案中，所述源自脐带血的细胞是非造血干细胞。在另一个具体实施方案中，所述胎盘干细胞和第二来源干细胞在悬浮液中组合。在另一个具体实施方案中，该方法进一步包含向所述组合中加入生物活性分子。在更加具体的实施方案中，所述生物活性分子是细胞因子或者生长因子。

本发明也提供包含多个细胞的体外组合干细胞群落，所述多个细胞包含胎盘干细胞和第二来源干细胞，其中所述的组合干细胞群落，在可以形成克隆形成单位的条件下培养一段时间后，与单独的与组合干细胞群落细胞数量相等的胎盘干细胞或第二来源干细胞相比，产生更多的克隆形成单位。本发明进一步提供包含多个胎盘干细胞和第二来源干细胞的体外组合干细胞群落，其中相对于单独移植与组合干细胞群落细胞数量相等的所述胎盘干细胞，或者相对于单独移植与组合干细胞群落细胞数量相等的第二来源干细胞，移植所述组合干细胞群落改善了干细胞的移植后着床。在另一个具体实施方案中，组合干细胞群落以多个比率中的一个比率(即在可以形成克隆形成单位的条件下培养时，产生最多克隆形成单位的比率)包含所述胎盘干细胞和所述第二来源干细胞。在具体实施方案中，所述第二来源干细胞是脐带血干细胞、骨髓干细胞、造血干细胞、或者间充质干细胞。在更加具体的实施方案中，所述造血干细胞是脐带血造血干细胞。在另一个更加具体的实施方案中，所述造血干细胞是CD34⁺细胞。在另一个具体实施方案中，所述胎盘干细胞包含CD34⁺细胞。在另一个具体实施方案中，所述胎盘干细胞包含CD34^-细胞。在另一个具体实施方案中，所述胎盘干细胞包含OCT-4⁺或者ABC-p⁺的细胞。在另一个具体实施方案中，所述胎盘干细胞包含CD34⁺的细胞和OCT-4⁺或者ABC-p⁺的细胞。在另一个具体实施方案中，所述胎盘干细胞被包含在基本没有红血球细胞和细胞碎片的胎盘灌注液中。在另一个具体实施方案中，胎盘干细胞包含或者就是从胎盘灌注液中分离的胎盘干细胞。在另一个具体实施方案中，胎盘干细胞被包含在来自胎盘灌注液的总的有核细胞中。在另一个具体实施方案中，所述胎盘干细胞被包含在从胎盘灌注液中获得的细胞群落中。在另一个具体实施方案中，所述组合包含从酶消化的胎盘组织中分离的胎盘细胞。在另一个具体实施方案中，所述胎盘干细胞和所述第二来源干细胞从同一个体中获得。在另一个具体实施方案中，所述胎盘干细胞和所述第二来源干细胞从不同个体中获得。在另一个具体实施方案中，所述胎盘干细胞源自多个胎盘。在另一个具体实施方案中，所述第二来源干细胞从多个个体中获得。

在另一个实施方案中，所述组合干细胞群落中的胎盘干细胞包含CD34⁺细胞，例如CD34⁺CD38⁺细胞和/或CD34⁺CD38^-细胞。在另一个实施方案中，胎盘干细胞包含表达CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73或CD105标记中的一个或多个，并且缺乏CD34、CD38、CD45、SSEA3和SSEA4标记中的一个或多个的细胞。在另一个实施方案中，胎盘干细胞包含CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73或CD105阳性，并且CD34、CD38、CD45、SSEA3和SSEA4阴性的细胞。在另一个实施方案中，胎盘干细胞包括包含CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73和CD105标记中的一个或多个，并且缺乏CD34、CD38、CD45、SSEA3和SSEA4标记中的一个或多个的细胞。在另一个实施方案中，胎盘干细胞包含CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73和CD105阳性，并且CD34、CD38、CD45、SSEA3和SSEA4阴性的细胞。在另一个实施方案中，所述胎盘干细胞包含CD34^-细胞。在具体实施方案中，所述胎盘干细胞是CD34^-CD38^-胎盘干细胞。在另一个实施方案中，所述胎盘干细胞是OCT-4⁺或ABC-p⁺。在更加具体的实施方案中，所述胎盘干细胞是OCT-4⁺和ABC-p⁺。在另一个实施方案中，所述胎盘干细胞包含CD10、CD29、CD33、CD44、CD73、CD105、CD117和CD133阳性，并且CD34或CD45阴性的细胞。在更加具体的实施方案中，所述胎盘干细胞包含HLA-ABC⁺的细胞。在更加具体的实施方案中，所述胎盘干细胞包含HLA-ABC^-的细胞。在更加具体的实施方案中，所述胎盘干细胞包含HLA-DR⁺的细胞。在更加具体的实施方案中，所述胎盘干细胞包含HLA-DR^-的细胞。在另一个具体实施方案中，胎盘干细胞包含CD200⁺和HLA-G⁺的细胞。在另一个具体实施方案中，胎盘干细胞包含CD73⁺、CD105⁺和CD200⁺的细胞。在另一个具体实施方案中，胎盘干细胞包含CD200⁺和OCT-4⁺的细胞。在另一个具体实施方案中，胎盘干细胞包含CD73⁺、CD105⁺的细胞，并且在包含所述干细胞的分离的胎盘细胞群落中，当所述群落在允许胚状体形成的条件下培养时，所述CD73⁺、CD105⁺细胞促进胚状体形成。在另一个具体实施方案中，胎盘干细胞包含CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺的细胞。在另一个具体实施方案中，胎盘干细胞包含OCT-4⁺，并且在包含所述干细胞的分离的胎盘细胞群落中，当所述群落在允许胚状体形成的条件下培养时，所述OCT-4⁺细胞促进胚状体形成的细胞。

在另一个实施方案中，所述组合干细胞群落中的胎盘干细胞或第二来源干细胞包含醛脱氢酶(ALDH)阳性的CD34⁺细胞。这些细胞在ALDH测试中显示了可检测水平的ALDH活性。因此，在各种实施方案中，本发明的组合干细胞群落包含CD34⁺干细胞，其中至少大约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或至少95％的CD34⁺干细胞是ALDH⁺。

本发明也提供了药物组合物，该药物组合物在药物学上可接受的载体中包含组合干细胞群落，例如，胎盘灌注液、胎盘酶消化物、或者源自其中的胎盘干细胞与脐带血或者源自脐带血的干细胞组合。在各种具体实施方案中，所述组合干细胞群落中的胎盘干细胞可以源自单一捐赠体，或者来自多个捐赠体；第二来源干细胞可以源自单一捐赠体，或者来自多个捐赠体；或者胎盘干细胞和第二来源干细胞均可源自单一捐赠体，或者来自多个捐赠体。在本发明的方法中适用的组合干细胞群落可以包含与目标接受者HLA部分或完全不匹配的干细胞群落，和与目标接受者HLA完全匹配的干细胞或祖细胞群落。

组合干细胞群落，例如以最优化比率补充了胎盘灌注液、或者源自胎盘灌注液的干细胞和/或祖细胞的脐带血，有多种用途，包括预防、治疗和诊断用途。在本发明的一个实施方案中，包含胎盘干细胞和第二来源干细胞的组合干细胞群落被用来修复和重建组织和器官，由此替代或修复患病的组织、器官、或其部分。在另一个实施方案中，包含胎盘干细胞和第二来源干细胞的组合干细胞群落被用来促进进行了部分或全部清髓的个体的造血功能重建。在另一个实施方案中，组合干细胞群落被用来促进已被暴露在致死或半致死剂量辐射中的个体的造血功能重建。

本发明也提供了移植的方法和通过施用组合干细胞群落治疗对有移植需要的个体的方法，包含将若干胎盘干细胞和第二来源干细胞以一定比率移植给所述个体，其中与单独移植与组合干细胞群落细胞数量相等的胎盘干细胞、或者与组合干细胞群落细胞数量相等的第二来源干细胞相比，所述组合干细胞群落显示了改善的移植后着床。在更加具体的实施方案中，所述组合干细胞群落的移植在移植后的至少、或在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天时，与单独移植与组合干细胞群落细胞数量相等的胎盘干细胞或者与组合干细胞群落细胞数量相等的第二来源干细胞相比，改善了需要干细胞的个体的移植后着床。在另一个更加具体的实施方案中，所述组合干细胞群落在移植后超过21天时改善了需要干细胞的个体的移植后着床。

在更加具体的实施方案中，所述比率是在细胞总量中的比率，在可以形成克隆形成单位的条件下，与单独的与所述细胞总量相等的胎盘干细胞或第二来源干细胞相比，该比率在体外产生更多的克隆形成单位。在另一个更加具体的实施方案中，所述比率是胎盘干细胞和第二来源干细胞的多个比率中的一个，当在可以形成克隆形成单位的条件下在体外组合时，该比率生成最大数量的克隆形成单位。即，如果X是胎盘干细胞和第二来源干细胞数量的总和，在这样的实施方案中，胎盘干细胞和第二来源干细胞的比率比单独的X个胎盘干细胞、或单独的X个第二来源干细胞在体外生成更多的克隆形成单位。

本发明进一步提供了用于制备本发明的组合干细胞群落的HLA表征的源自胎盘的干细胞库的集合。在一个实施方案中，本发明提供了干细胞库，其包含多个单位的源自胎盘的干细胞，其中所述源自胎盘的干细胞通过至少一个HLA标记被识别。在具体实施方案中，所述源自胎盘的干细胞从胎盘灌注液中分离。在另一个具体实施方案中，所述源自胎盘的干细胞是CD34⁺干细胞。在另一个具体实施方案中，所述源自胎盘的干细胞是CD73或CD105阳性的，或者与抗体SH2、SH3或SH4结合。在另一个具体实施方案中，所述干细胞库还包含多个单位的胎盘血或者脐带血。在另一个具体实施方案中，所述多个单位胎盘血或者脐带血中的至少一个单位通过所述多个单位胎盘干细胞中的一个单位所享有的HLA标记来识别。在另一个具体实施方案中，所述多个单位的胎盘血或脐带血中的多数单位通过所述多个单位胎盘干细胞中的多数单位所享有的HLA标记被识别。

3.1定义

在此使用的术语“放血”，当用于胎盘时，指从胎盘中移除和/或排干几乎所有脐带血。

在此使用的关于细胞培养物的“传代”，指将一份培养物中的多个细胞等分到分离的容器中，以开始新的细胞培养。典型地，传代包含将一个容器里的一份培养物中的例如10⁴-10⁵个细胞等分到分离容器中的新鲜培养基里。细胞典型地在细胞培养物接近汇合时传代，即单层贴壁细胞在可供生长的整个区域上形成单层的时候传代。

在此使用的术语“灌注”，指让液体流经胎盘的脉管系统，且伴随的压力足以收集大量胎盘细胞的行为。在此使用的术语“胎盘灌注液”，指在液体流经胎盘以后，收集到的液体，它包含了在灌注期间从胎盘中收集到的细胞。

在此使用的术语“胎盘血”和“脐带血”是等同的。

在此使用的术语“胎盘干细胞”和“源自胎盘的干细胞”是等同的。

在此使用的术语“胎盘干细胞”，指从哺乳动物的胎盘或其部分(例如，羊膜、绒毛膜等)中获得的或源自其中的干细胞，不必顾及形态学、细胞表面标记等，但是不包含滋养层。该词组包含直接从胎盘中获得的干细胞，例如作为胎盘灌注液或者消化的胎盘组织(消化物)中的胎盘细胞群落的一部分的干细胞，或者作为已经扩增和/或传代一次或多次的胎盘细胞群落的一部分的干细胞。但是，该术语不包含单独源自另一个组织例如胎盘血或者脐带血的干细胞。胎盘包含具有例如明显的标记组、并且通过这些标记组可以彼此区别开来的干细胞群落。

在此使用的关于干细胞标记的术语“阳性”，指相对于作为参照的非-干细胞例如纤维原细胞中所述标记的数量或者水平，该标记以可检测的较大数量、或可检测的较高水平存在。更通常地，当可以基于细胞内或细胞上存在的标记将所述细胞与一种或多种其它细胞类型相区分时，该细胞对于那个标记呈“阳性”。

在此使用的“第二来源干细胞”指任何来自哺乳动物的胎盘以外来源的哺乳动物的干细胞(包括祖细胞)。

在此使用的术语“干细胞”包含干细胞和祖细胞。

在此使用的术语“单位”，当用于脐带血或者胎盘血时，指来自单一捐赠体的单一血液收集、或者可从这样的收集中获得的有核细胞或干细胞。典型地，来自单一捐赠体的血液体积范围从大约50毫升血液到大约150毫升。术语“单位”，当用于胎盘灌注液时，指用于从单一胎盘中收集胎盘干细胞和祖细胞的灌注液体积，或者可从这样体积的灌注溶液中获得的有核细胞或干细胞。一单位胎盘灌注液的体积，典型地，大约100-500毫升到大约1000毫升。

4.附图简要描述

图1A-1D：两个独立实验中，使用CD45抗体对小鼠骨髓中移植后着床的人类细胞的FACS分析的总结。(A)：第一个实验，仅含脐带血细胞(UCB)、仅含胎盘灌注液细胞(PP)、或者脐带血细胞与胎盘灌注液细胞的组合(UCB+PP)，移植后三周，骨髓中存在的CD45⁺细胞。X轴：每次移植的细胞数量。(B)：第一个实验，移植后十周的CD45⁺细胞。(C)：第二个实验，移植后三周，骨髓中的CD45⁺细胞。(D)：第二个实验，移植后十周，骨髓中的CD45⁺细胞。

图2：在NOD/SCID小鼠中，移植后着床的表达淋巴-骨髓细胞标记的人类细胞的FACS分析。CD45⁺和CD19(每组的左侧柱)；CD33(中间柱)；或者CD7(右侧柱)的联合表达。X轴：每次移植的细胞数量。UCB＝仅含脐带血细胞的移植；PP＝仅含胎盘灌注液细胞的移植；UCB+PP＝与胎盘灌注液细胞组合的脐带细胞的移植。

5.发明的详细描述

本发明提供了(1)胎盘干细胞，例如人胎盘灌注液中的胎盘干细胞、胎盘酶消化物中的胎盘干细胞、分离的胎盘干细胞和/或祖细胞等；和(2)第二来源干细胞，在细胞总量中的组合，其中胎盘干细胞和第二来源干细胞以一定比率存在于组合中，与单独的与所述细胞总量相等的胎盘干细胞或第二来源干细胞所生成的克隆形成单位的数量相比，该比率生成更多数量的克隆形成单位。本发明进一步提供了胎盘干细胞和第二来源干细胞的组合，与单独的与所述组合中细胞数量相等的胎盘干细胞、或者单独的与所述组合中细胞数量相等的第二来源干细胞相比，该组合提高了体内的移植后着床。本发明进一步提供了识别这样比率和这样组合的方法，以及使用组合干细胞群落的方法。

5.1 将胎盘干细胞和第二来源干细胞的组合最优化

5.1.1 体外测试

本发明提供了体外联合培养方法以识别胎盘干细胞和第二来源干细胞的组合，该组合相对于单独的与所述组合细胞数量相等的胎盘干细胞或者第二来源干细胞或祖细胞，具有改善的移植后着床潜能。因此，该体外联合培养测试识别胎盘干细胞和第二来源干细胞的比率，该比率以一种不依赖于细胞数量的方式，改善克隆形成单位的数量和移植后着床。

在一个实施方案中，例如，本发明提供了识别胎盘干细胞和第二来源干细胞的比率的方法，包含识别胎盘干细胞和第二来源干细胞在细胞总量中的比率，当所述胎盘干细胞和第二来源干细胞在可以形成克隆形成单位的条件下共同培养一段时期，该比率比细胞数量与所述细胞总量相等的单独胎盘干细胞或单独第二来源干细胞，生成更多数量的克隆形成单位。在另一个实施方案中，当比较数个比率时，本发明提供了识别胎盘干细胞和第二来源干细胞或祖细胞在细胞总量中的比率的方法，包含在可以形成克隆形成单位的条件下，在体外以多个比率用所述第二来源干细胞群落接触所述胎盘干细胞群落一段时期，并识别所述多个比率中产生最大数量的克隆形成单位的那个比率。在具体实施方案中，相对于细胞数量与所述细胞总量相等的单独胎盘干细胞或单独第二来源干细胞的移植后着床，所述比率改善了接受者中的移植后着床。在更加具体的实施方案中，在移植后的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或21天，所述组合干细胞群落改善了需要干细胞的个体中的移植后着床。在另一个更加具体的实施方案中，在移植后超过21天的时期里，所述组合干细胞群落改善了需要干细胞的个体中的移植后着床。

5.1.1.1 源自胎盘的干细胞

在本发明的方法和组合物中适用的源自胎盘的干细胞包括，例如胚胎样细胞、多能细胞、多潜能细胞、定向祖细胞、造血祖细胞和来自胎盘的间充质样干细胞。在一个实施方案中，源自胎盘的干细胞被包含在胎盘灌注液中，或者来源于胎盘灌注液。

本发明方法中使用的源自胎盘的干细胞，可以来源于单一胎盘或者多个胎盘，并且可以通过任何方法获得。源自胎盘的干细胞可以通过例如灌注获得，如美国申请公开号2002/0123141和2003/0032179中所批露的，各申请的内容被引入本文以供参考。这些灌注可以是通过盆方法(pan method)的灌注，其中，灌注液被强制通过胎盘脉管系统，而且从胎盘中流出(典型地从母体一侧)的灌注液被收集在容纳胎盘的盆中。灌注也可以是闭路灌注，其中灌注液仅仅流经胎盘的胎儿脉管系统并从那里被收集。在具体实施方案中，这些灌注可以是连续的，即已经流经胎盘并且包含了大量胎盘细胞的灌注液，在分离胎盘细胞之前，再次或多次流经胎盘。

源自胎盘的干细胞也可以通过物理破碎或酶破碎胎盘来获得，例如使用蛋白酶和/或其它组织裂解酶来破坏胎盘的多细胞结构。这些蛋白酶可以包括中性蛋白酶或金属蛋白酶，例如胶原酶、分散酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶等。胎盘干细胞也可以通过物理破碎胎盘来获得，例如使用粘液溶解酶如透明质酸酶。

本发明的分离的经灌注的胎盘提供了大量富集CD34⁺干细胞的干细胞资源，例如CD34⁺CD38^-干细胞如CD34⁺CD38^-lin^-干细胞，和CD34^-干细胞如CD34^-CD38⁺干细胞。从胎盘中第一批收集到的血液被称为脐带血，其中主要包含CD34⁺CD38⁺造血祖细胞。在产后灌注的最初二十四小时内，大量的(例如1×10⁵个到大约2×10⁷个)CD34⁺CD38^-造血祖细胞可以随同高浓度的CD34^-CD38⁺细胞一起，从胎盘中被分离。在灌注大约二十四小时后，大量的(例如，一百万个到一千万个)CD34^-CD38^-细胞可以随同前述细胞一起从胎盘中被分离。已经被灌注了二十四小时或更多时间的分离的胎盘提供大量富集CD34^-CD38^-干细胞的干细胞资源。

在另一个实施方案中，本发明的组合干细胞群落包含醛脱氢酶(ALDH)阳性的CD34⁺胎盘干细胞。这些细胞在ALDH测试中显示了可检测水平的ALDH活性。这些测试在本领域中是已知的(参见，例如，Bostian和Betts，Biochem.J.，173,787，(1978))。在具体实施方案中，所述ALDH测试使用(Aldagen公司，Ashland，Oregon)作为醛脱氢酶活性的标记。因此，在各种实施方案中，本发明的组合干细胞群落包含CD34⁺干细胞，其中至少大约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或至少95％的CD34⁺干细胞是ALDH⁺。

至少一类的人胎盘干细胞具有胚胎干细胞或生殖细胞的特征。例如，这类干细胞是SSEA3^-(阶段特异性胚胎抗原3)、SSEA4^-、OCT-4⁺(干细胞转录因子)和ABC-p⁺(ATP结合框(ABC)转运蛋白)的，这是还未经历分化的多能干细胞所展示的标记图谱。因此，本发明的方法和组合物可以使用或包含非胚胎的胎盘干细胞，例如是SSEA3^-、SSEA4^-、OCT-4⁺、或者ABC-p⁺的胎盘干细胞。优选地，胎盘干细胞是OCT-4⁺ABC-p⁺的，而且甚至更加优选地，是SSEA3^-SSEA4^-OCT-4⁺ABC-p⁺的。在另一个实施方案中，本发明包括使用CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73或CD105中的至少一个呈阳性，或者CD34、CD38或CD45中的至少一个呈阴性的胎盘干细胞。在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物可以使用或包含具有CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73或CD105，或者CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73或CD105呈阳性；并且缺乏CD34、CD38或CD45，或者CD34、CD38或CD45呈阴性的胎盘干细胞。在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物可以使用或包含CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73或CD105中的至少一个呈阳性，或者CD34、CD38或CD45中的至少一个呈阴性的胎盘干细胞。在另一个实施方案中，本发明包含具有CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73或CD105，或者CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73、或CD105呈阳性；并且缺乏CD34、CD38或CD45，或者CD34、CD38或CD45呈阴性的胎盘干细胞的使用。

在一个实施方案中，通过标记CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD105(SH2)、CD73(SH3、SH4)、OCT-4和/或ABC-p的存在，和/或标记CD34、CD38、CD45、SSEA3或SSEA4的缺乏来识别本发明的方法和组合物中使用的胎盘干细胞。在具体实施方案中，胎盘干细胞是CD10⁺、CD29⁺、CD34^-、CD38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD73⁺、CD90⁺、CD105⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、SSEA3^-、SSEA4^-、OCT-4⁺和ABC-p⁺的。在另一个具体实施方案中，胎盘干细胞是CD200⁺和HLA-G⁺的。在此上下文里，“SH2⁺”、“SH3⁺”和“SH4⁺”指干细胞分别与抗体SH2、SH3、或SH4结合。在另一个具体实施方案中，胎盘干细胞是CD73⁺、CD105⁺和CD200⁺的。在另一个具体实施方案中，胎盘干细胞是CD200⁺和OCT-4⁺的。在另一个具体实施方案中，胎盘干细胞是CD73⁺、CD105⁺的，并且在包含所述干细胞的分离的胎盘细胞群落中，当所述群落在允许胚状体形成的条件下培养时，所述干细胞促进胚状体的形成。在另一个具体实施方案中，胎盘干细胞是CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺的。在另一个具体实施方案中，胎盘干细胞是OCT-4⁺的，并且在包含所述干细胞的分离的胎盘细胞群落中，当所述群落在允许胚状体形成的条件下培养时，所述干细胞促进胚状体的形成。在此使用的“胚状体”，指从贴壁干细胞层上长出的正在分化的和已分化的三维细胞簇。

在另一个实施方案中，人胎盘干细胞不表达MHC 2类抗原。

在一个实施方案中，源自胎盘灌注液的干细胞群落包含滋养层。

细胞标记，例如干细胞标记和细胞表面标记，可以依照本领域中熟知的方法被常规确定，例如，通过冲洗和用经适当荧光团标记的抗-细胞表面标记的抗体染色，通过流式细胞计数法或者荧光激活细胞分类(FACS)分析。例如，为了确定CD34或者CD38的存在，细胞可以用PBS冲洗，然后用抗CD34藻红蛋白和抗CD38荧光素异硫氰酸酯(Becton Dickinson，Mountain View，CA)双重染色。然后使用标准流式细胞仪分析细胞。可选择地，细胞内的标记也可以通过标准方法来检查。针对特异性标记的抗体/荧光团组合包括但不限于，针对HLA-G(可从Serotec，Raleigh，North Carolina得到)、CD10(可从BDImmunocytometry Systems，San Jose，California得到)、CD44(可从BDBiosciences Pharmingen，San Jose，California得到)和CD105(可从R&D Systems公司，Minneapolis，Minnesota得到)的荧光素异硫氰酸酯(FITC)偶联的单克隆抗体；针对CD44、CD200、CD117和CD13的藻红蛋白(PE)偶联的单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen)；针对CD33和CD10的藻红蛋白-Cy7(PECy7)偶联的单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen)；针对CD38的别藻蓝蛋白(APC)偶联的链霉亲合素和单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen)；和生物素化的CD90(BD Biosciences Pharmingen)。其它可以被使用的抗体/标记组合包括但不限于，CD133-APC(Miltenyi)、KDR-生物素(CD309，Abcam)、细胞角蛋白K-Fitc(Sigma或者Dako)、HLAABC-Fitc(BD)、HLA DRDQDP-PE(BD)、β-2-微球蛋白-PE(BD)、CD80-PE(BD)和CD86-APC(BD)、CD45-PerCP(多甲藻叶绿素蛋白)；CD44-PE；CD19-PE；CD10-F(荧光素)；HLA-G-F和7-氨基-放射菌素-D(7-AAD)；HLA-ABC-F等。

胎盘干细胞，例如包含在胎盘灌注液中的胎盘干细胞，可以在收集后立刻使用，也可以在测试前、或施用给个体前在组合干细胞群落中培养一段时间。例如，在一个实施方案中，干细胞可以被培养在包含Notch激动剂的培养基中，例如基本由Notch蛋白的胞内域组成的Notch蛋白的缺失形式，或者Delta蛋白。参见美国公开号2004/0067583。

5.1.1.2 第二来源干细胞

在此描述的方法和组合物使用胎盘干细胞与第二来源干细胞(即来自除了哺乳动物胎盘以外的任何来源的干细胞)的组合。第二来源干细胞可以包含一种或多种类型干细胞，例如胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、成体干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、非造血干细胞、源自骨髓的干细胞、神经干细胞、心脏干细胞、眼睛干细胞、上皮干细胞、内皮干细胞、肝脏干细胞、肺脏干细胞、肌肉干细胞、肠干细胞等。第二来源干细胞可以是从第二的、非胎盘的来源中分离的干细胞，或者可以是包含干细胞的组织。与从胎盘分离干细胞类似，可以通过对包含干细胞的器官的灌注、或者通过对包含干细胞的器官的组织破碎和/或酶消化来分离干细胞。第二来源干细胞可以是例如单独源自脐带，或者单独源自羊水的干细胞。

第二来源干细胞可以通过提供相应组织的样本，并且使用一个或多个细胞表面标记从组织中分离干细胞来获得。例如，造血干细胞可以从血液(例如，外周血、胎盘血、脐带血)或者骨髓中通过如下步骤获得：获得血液或骨髓样本，从血液或骨髓中分离单核细胞，以及从分离的单核细胞中分离CD34⁺细胞。这些分离可以通过本领域的常规方法来实施，例如使用分离术，随后使用磁珠或柱子分离，该磁珠或柱子包含一个或多个针对细胞表面标记例如CD34或CD200的抗体；荧光激活细胞分类(FACS)等。对于血液，来自血液的总的有核细胞(TNC)群落，例如来自外周血、胎盘血、脐带血等的总的有核细胞可以提供干细胞。

来自其它组织的干细胞可以用类似的方法来分离。通过分离CD73、CD105和/或CD45呈阳性的细胞，可以从例如骨髓中分离间充质干细胞(参见，例如美国专利号6,387,367)。通过获得角膜细胞并且分离SSEA-4⁺细胞，可以从角膜中获得眼睛(角膜缘)干细胞(参见，例如美国申请公开号2005/0186672)。通过筛选表达CD14、CD34、CD38、ICAM、CD45、CD117、血型糖蛋白A、间隙连接蛋白32、骨桥蛋白、骨涎蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白II、胶原蛋白III、胶原蛋白IV、或其组合的细胞，可以从肝脏特别是胎儿肝脏样本中获得肝脏干细胞(参见，例如美国申请公开号2005/0148072)。通过筛选不表达其它造血细胞标记的CD34⁺CD45^-细胞，可以从肌肉组织中获得肌肉干细胞(参见，例如美国申请公开号2005/0079606)。通过筛选c-kit^-CD31⁺CD38⁺细胞，可以从心脏组织中分离心脏干细胞(参见，例如美国申请公开号2004/0126879)。也可以使用其它已知特征或标记来实现干细胞的分离。

在一个实施方案中，所述第二来源干细胞是脐带血干细胞。在具体实施方案中，该脐带血干细胞是CD34⁺干细胞，例如CD34⁺CD38⁺干细胞、CD34⁺CD38^-干细胞、CD34⁺CD38^-lin^-干细胞等。在具体实施方案中，来自第二来源的CD34⁺干细胞是ALDH⁺的。脐带血本身、或者从脐带血中获得的干细胞和/或祖细胞，可以在本发明的方法中被使用。在具体实施方案中，当组合干细胞群落将被用于造血植入时，所述源自脐带血的细胞包含造血干细胞。第二来源干细胞可以来源于单一捐赠体，或者等量或不等量地来自多个捐赠体。来自多个第二(即非胎盘)来源的干细胞可以与胎盘干细胞组合，并用于本发明的方法和组合物。

第二来源干细胞，例如来自第二来源的造血干细胞，可以在收集后紧接着使用，或者可以在测定或个体施用之前，在组合干细胞群落中培养一段时期。例如，在一个实施方案中，干细胞可以在包含Notch激动剂的培养基中培养，例如Notch蛋白的缺失型，其本质上由Notch蛋白的胞内段组成；或者Delta蛋白。参见美国公开号2004/0067583。

5.1.1.3 测试参数

一旦获得了胎盘干细胞群落和第二来源干细胞群落，细胞可以在体外联合培养中组合或克隆形成测试中组合以确定特定组合中的若干干细胞是否相对于与所述组合中的细胞数量相等的单独的胎盘干细胞或者单独的第二来源干细胞产生更多的克隆形成单位。比相等细胞数量的单独的胎盘干细胞或单独的第二来源干细胞产生更多克隆形成单位的任何这样的一定比率的胎盘干细胞和第二来源干细胞的组合被识别为本发明的组合干细胞群落。

组合干细胞群落的鉴定可以使用本领域中已知的和通常使用的任何克隆形成单位测试，只要该测试允许胎盘干细胞和第二来源干细胞的增殖和分化，例如，由StemCell Technologies公司提供的克隆形成测试。这样的测试可以使用例如MESENCULT^TM培养基(Stem Cell Technologies公司，Vancouver British，Columbia)。组合干细胞群落的鉴定可以使用新鲜配备的细胞、从冷冻储存中解冻的细胞，或者两者。优选地，胎盘干细胞和第二来源干细胞两者在悬浮液中组合以联合培养。可以使用本领域中已知的标准技术评估胎盘干细胞和第二来源干细胞的生存能力、增殖潜能和寿命，例如台盼蓝排除测试、荧光素二醋酸酯吸收测试、碘化丙锭吸收测试(用于评估生存能力)；和胸腺嘧啶吸收测试，MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物)细胞增殖测试(用于评估增殖能力)。可以通过本领域中熟知的方法来检测寿命，例如通过检测在延长培养中群落倍增的最大数量来检测。

在体外方法的一个实施方案中，如下进行胎盘干细胞和脐带血干细胞的克隆形成单位测试：获得新鲜的或解冻的HLA/捐赠体匹配的胎盘灌注液单位和脐带血单位，而且用血球计数仪检测各自的总有核细胞数量。当使用解冻单位时，脐带血样本可以是羟乙基淀粉分离的，而且胎盘灌注液单位优选是Ficoll分离的。来自各个来源的有核细胞小样本，在联合培养中，以两个或更多个比率接种在悬浮液中并扩增。联合培养可以在例如35mm培养皿里，在适当的细胞培养基中(例如RPMI 1640培养基，其中补充了2-10％的胎牛血清，以及任选的1％的Stemspan细胞因子混合物；Methocult GF⁺ H4435培养基；等)，对于胎盘干细胞和第二来源干细胞的一个或多个比率进行三次重复。造血干细胞可以在包含GM-CSF、IL-3、IL-6、SCF和flt-3配体的培养基中被扩增。

联合培养测试中使用的容器优选适合干细胞的组织培养。例如，联合培养可以在玻璃的或塑料的Petri培养皿、16孔板、32孔板、96孔板、128孔板等中进行。典型地，在各个联合培养中，来自各个来源的有核细胞总量，变化范围从1×10⁴个到1×10⁶个。细胞也可以在微型模板结构(micropatternedconfiguration)中联合培养。参见美国专利号6,221,663。

当确定胎盘干细胞和第二来源干细胞在包含若干胎盘干细胞和若干第二来源干细胞的细胞群落中的比率时，优选的比率是在同样条件下比所述若干胎盘干细胞或所述若干第二来源干细胞产生更多的克隆形成单位的任何比率。更优选地，该比率是比测试的所有其它比率产生更多克隆形成单位的比率。测试的比率之间具有统计显著性是理想的，但不是必需的。克隆形成单位的较高数量可以归因于胎盘干细胞和第二来源干细胞；主要或仅仅因为胎盘干细胞；或者主要或仅仅因为第二来源干细胞。

组合干细胞群落被培养足以让克隆形成单位形成的一段时间，典型地，10-20天。在扩增期间，细胞培养遵循干细胞或祖细胞培养领域已知的的标准规程，并且包括，例如每日或者每半日更换培养基；在大约37℃下，5％CO₂，潮湿的培养箱中培养等。10-20天后，确定联合培养中的克隆形成单位的数量和形态(例如，对于造血干细胞，CFU-GM、CFU-L、CFU-M、CFU-G、CFU-DC、CFU-GEMM、CFU-E的数量)。

在联合培养测试的具体实施例中，来自胎盘灌注液的有核细胞和来自脐带血的有核细胞按1:1、1:3和3:1的比率(其中1等于例如1×10⁵个细胞)在Methocult GF⁺ H4435培养基中组合。然后联合培养物在组织培养基中扩增大约14天。确定联合培养细胞的形态和克隆形成单位的数量。提供最高数量的克隆形成单位的两个来源的有核细胞样本的比率被指定为最优化比率，而且两个单位、或者来自其中一个单位或两个单位的干细胞和/或祖细胞，以最优化比率组合以施用给需要干细胞移植的接受者。这样的最优化比率，当施用了相等数量的细胞时，比单独施用任何一个单位，或者施用来自单独任何一个单位的干细胞和/或祖细胞，在体内提供更优的移植后着床。

在联合培养中，胎盘干细胞和第二来源干细胞彼此直接或间接地接触。在最低限度，这包含将一种类型的干细胞与培养基接触，在该培养基中另一类型的干细胞已经培养了一段时间，例如将一种类型的干细胞与已经被另一类型的干细胞影响的培养基接触。例如，胎盘干细胞和第二来源干细胞在形成克隆形成单位的培养期间，可以在同一个物理空间中一起培养，例如，在同一个培养皿中或者多孔板中的同一个孔中一起培养。胎盘干细胞和第二来源干细胞也可以通过在分离的物理空间中培养(例如，通过膜被分离；或者在多孔板的两个孔中，其中培养基可以在孔之间主动地或被动地流动，但细胞不能混合)，但培养基是共同的，而彼此接触。在另一个实施方案中，胎盘干细胞和第二来源干细胞可以在没有共同培养基的分离的物理空间中培养，并且通过将来自一种干细胞培养的部分或全部培养基与另一种的交换使干细胞彼此接触。在另一个实施方案中，联合培养中的细胞以物理分离细胞但是允许生物分子在两种培养物之间扩散的方式培养。参见，例如，美国专利号5,665,596“Device for Cell Co-culture and Method for Its Use in Culturing Cells”。当干细胞培养物是分开的，对比率的每次重复以及如以上所述测定的最优化比率，将分离的、成对的培养物中的克隆形成单位的数量加合。

在本方法的另一个实施方案中，在测试期间，将生物活性分子加入到胎盘干细胞和第二来源干细胞中，并且识别胎盘干细胞和第二来源干细胞的比率，对于细胞总量，相对于与所述组合中的细胞总量相等的单独的胎盘干细胞或单独的第二来源干细胞，该比率导致更多的克隆形成单位，或者提高了移植后着床。这样的生物活性分子可以是小的有机分子，小于50kDa、30kDa、20kDa、10kDa、5kDa、3kDa、2kDa、1kDa、500Da、300Da、200Da、100Da或更小。在具体实施方案中，所述小的有机分子是合成的或非天然的，即不来源于自然来源。在另一个具体实施方案中，所述生物活性分子是细胞因子或者生长因子。可以被加入到联合培养物中的生物活性分子包括分化诱导剂，例如但不限于Ca²⁺、EGF、α-FGF、β-FGF、PDGF、角质形成细胞生长因子(KGF)、TGF-β、细胞因子(例如，IL-1α、IL-1β、IFN-γ、TFN)、视黄酸、铁传递蛋白、激素(例如雄激素、雌激素、胰岛素、催乳激素、三碘甲状腺原氨酸、氢化可的松、地塞米松)、丁酸钠、TPA、DMSO、NMF、DMF、基质成分(例如，胶原、层粘连蛋白、硫酸肝素、MATRIGEL^TM)、或其组合。也可以加入作为分化抑制剂的生物活性分子，例如但不限于人Delta-1和人Serrate-1多肽(参见，Sakano等，美国专利号6,337,387，题目是“Differentiation-suppressive polypeptide”，2002年1月8日授权)、白血病抑制因子(LIF)和干细胞因子。

当生物活性分子被加入到联合培养物中时，可以使用联合培养测试来识别移植后着床的正效应因子。因此，在一个实施方案中，本发明提供了识别作为移植后着床正效应因子的生物活性分子的方法，包含用所述生物活性分子接触组合干细胞群落，其中如果所述组合干细胞群落的移植后着床相对于未接触到所述生物活性分子的组合干细胞群落具有可检测的提高，那么所述生物活性分子被识别为移植后着床的正效应因子。在另一个实施方案中，本发明提供了识别移植后着床的正效应因子的方法，包含在所述生物活性分子的存在下，在体外以一个或多个比率组合胎盘干细胞和第二来源干细胞；培养所述胎盘干细胞和第二来源干细胞一段足以让克隆形成单位形成的时间；确定所述一个或多个比率中的每一个的克隆形成单位数量；并且对于所述一个或多个比率中的至少一个确定在所述生物活性分子存在时克隆形成单位的数量是否多于所述生物活性分子不存在时克隆形成单位的数量，以及如果是这样，将所述生物活性分子识别为移植后着床的正效应因子。

可以对任何胎盘干细胞群落和第二来源干细胞群落进行体外测试以确定移植后着床的最优比率。在这个方面，体外联合培养测试可以被用作在移植前表征干细胞群落的标准的、常规的步骤。

5.1.2 体内测试

以上体外测试的结果可以用体内移植后着床测试来确认。也可以在没有体外测试的情况下进行体内测试以确定胎盘干细胞和第二来源干细胞的最优比率以将移植后着床最大化。

在体内测试的一个实施方案中，胎盘干细胞和第二来源干细胞被移植到多个模型动物中，并给予足够的移植后着床时间(典型地，6到10周)。动物随后被处死，对每个动物的至少一个组织确定移植后着床程度。因此，在一个实施方案中，本发明提供识别接受者移植后着床的胎盘干细胞和第二来源干细胞或祖细胞的比率的方法，包括识别胎盘干细胞和第二来源干细胞在细胞总量中的比率，当移植给动物时，相对于移植细胞数量与所述细胞总量相等的单独的胎盘干细胞或单独的第二来源干细胞，该比率导致移植后着床的提高。在另一个实施方案中，所述识别胎盘干细胞或第二来源干细胞的比率包括以多个比率将若干胎盘干细胞和第二来源干细胞移植到多个动物中；对于所述多个比率中的每一个，确定所述动物的至少一个组织中移植后着床细胞的数量；以及识别所述多个比率中产生最高移植后着床细胞数量的那个比率。

和在体外测试中一样，胎盘干细胞可以是通过任何方式获得的或以任何可用形式存在的胎盘干细胞。例如，胎盘干细胞可以被包含在胎盘灌注液中，或者可以被包含在从胎盘灌注液中分离的总的有核细胞之内，或者可以是从总的有核细胞中分离的干细胞群落，或者可以是包含在酶消化的胎盘组织之内的胎盘干细胞，或者可以是从酶消化的胎盘组织中分离的胎盘干细胞，或者可以是已经在培养中扩增和/或传代的胎盘干细胞等。

任何标准的模型动物都可以在体内联合培养测试中使用。优选的模型动物是异种移植物的移植后着床可以在其中容易地完成的动物。小型哺乳动物例如标准的实验室啮齿动物如小鼠和大鼠是优选的，因为他们显示移植后着床所需要施用的干细胞较少。免疫缺陷的模型动物是高度优选的。可以被用于体内测试中的动物模型包括但不限于NOD/SCID(非肥胖型糖尿病/严重的组合免疫缺陷)小鼠(参见Hogan等，Blood 90(1):85-96(1997))、米色/x染色体联锁的免疫缺陷(BNX)的裸鼠(参见，例如Kamal-Reid等，Science242:1706(1988))、SCID小鼠(参见，例如Kamal-Reid等，Science 246:1597(1989))。移植后着床可以被实施在其它动物模型上，例如绵羊胚胎(参见，例如Shimizu等，Blood 91(10):3688-3692(1998)；Zanjani等，Int’1J.Hematol63(3):179-182(1996))。

在接受者动物的组织中移植后着床细胞的数量的确定可以通过本领域的任何已知方法来完成。例如，移植后着床细胞的检测可以通过检测移植后着床细胞特异性核酸来完成，例如通过多聚酶链式反应；或者通过检测移植后着床细胞特异性蛋白质来完成，例如通过免疫组织化学。体内的移植后着床识别可以通过使用在移植后的一个或多个时间从接受者的一个或多个部位提取的样本例如活组织切片样本来确定。

在一个实施方案中，显示胎盘干细胞和/或源自脐带血的干细胞的移植后着床可以通过提取活组织切片(例如骨髓抽样或外周血取样)并进行PCR来确定是否有任何非接受者遗传标记的存在(它们将显示移植后着床)来完成。在另一个实施方案中，移植后着床细胞的识别通过选择一个或多个识别移植后着床细胞表达标记的抗体来实现。在一个具体实施方案中，移植后着床细胞是人的，而且一种或多种抗体可特异性识别一个或多个人细胞标记。可以通过任何本领域接受的方法用抗体来检测标记，例如免疫组织化学方法。例如，为了确定细胞表面标记的存在，可以处死非人的宿主动物，获得所需的组织，在石蜡或类似基质中固定和包埋该组织；对该组织薄切片，任选地随后染色；并且用一种或多种识别标记的抗体接触该组织。以同样的方式，可以使用能识别移植后着床的干细胞可以分化成的细胞所表达的标记的抗体。例如，胎盘干细胞或者源自脐带血的干细胞，分化成表达CD45和波形蛋白的细胞；因此，CD45和波形蛋白的抗体可被用来确定移植后着床的和分化的干细胞的数量。优先识别例如人类细胞表面标记而非宿主细胞标记例如小鼠细胞表面标记的抗体在本领域中是熟知的。

在体内方法的非限制性实施例中，以多个比率将人胎盘干细胞和例如从脐带血中分离的人有核细胞(包括造血干细胞)移植到多个模型动物中，例如多个Mus musculus种小鼠。几天到几周后(即允许移植后着床的足够时间后)，处死宿主动物，并且检查组织(例如，脾脏、肺等)以确定已经移植后着床的人细胞的大致数量，如通过CD45和/或波形蛋白染色的细胞数量所证明的。CD45是白细胞的特异性标记，白细胞包括T淋巴细胞和B淋巴细胞、粒细胞、单核细胞和巨噬细胞。某些CD45抗体，例如克隆T29/33(BioDesign，Saco，Maine)，不与小鼠抗原交叉反应。波形蛋白是间充质细胞的标记，间充质细胞包括例如纤维原细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、雪旺细胞、血管内皮细胞等。某些波形蛋白抗体，例如克隆V9(BioDesign，Saco，Maine)，不与小鼠抗原交叉反应。因此，用这两个标记的抗体进行染色，通常可以在多种组织中确定胎盘干细胞和第二来源干细胞移植后着床的程度。这个实施例是非限制性的；可以用不同抗体来确定其它细胞类型移植后着床的程度。在长期的移植后着床模型中，从原始移植后着床动物例如小鼠中分离的骨髓细胞，可以被移植到第二个移植后着床模型动物中。对二次移植后着床的测试如以上列出的所述，而且包括为本领域中的技术人员所熟知的方法。

5.2 组合干细胞群落

本发明进一步提供了组合干细胞组合物，包含胎盘干细胞(例如来自胎盘灌注液的细胞，例如包含胎盘干细胞的来自胎盘灌注液的有核细胞)和第二来源干细胞，对于特定数量的细胞来说，与单独的胎盘干细胞或单独的第二来源干细胞相比，在克隆形成单位测试中，该细胞组合物导致更多数量的克隆形成单位，或者提高了移植接受者中的移植后着床。根据干细胞来源的特性(即包含在例如单位胎盘灌注液、单位脐带血等中的可移植后着床的细胞数量)，通过以上方法识别的组合干细胞群落代表了移植后着床提高的干细胞组合。

因此，在一个实施方案中，本发明包括以一定比率包含若干胎盘干细胞和若干第二来源干细胞的组合干细胞组合物，其中组合物中的干细胞相对于与所述组合物中细胞数量相等的单独的胎盘干细胞或单独的第二来源干细胞，显示了移植后着床的改善。在具体实施方案中，该比率通过以下方法识别：在可以形成克隆形成单位的条件和时间下，在体外以多个比率组合胎盘干细胞和第二来源干细胞；识别所述多个比率中产生最高数量克隆形成单位的比率。在更加具体的实施方案中，所述第二来源干细胞或祖细胞是脐带血干细胞或祖细胞、骨髓干细胞或祖细胞、造血干细胞或祖细胞、或者间充质干细胞或祖细胞。在另一个更加具体的实施方案中，所述第二来源干细胞或祖细胞是造血祖细胞。在甚至更加具体的实施方案中，所述造血干细胞是脐带血造血干细胞。在另一个甚至更加具体的实施方案中，所述造血细胞是CD34⁺细胞。

在另一个更加具体的实施方案中，所述胎盘干细胞包含CD34⁺细胞，例如CD34⁺CD38⁺细胞和/或CD34⁺CD38^-细胞。在具体实施方案中，所述CD34⁺CD38^-细胞包含CD34⁺CD38^-lin^-干细胞。在另一个具体实施方案中，所述CD34⁺胎盘干细胞包含ALDH⁺的细胞，即CD34⁺ALDH⁺胎盘干细胞。

在另一个更加具体的实施方案中，所述胎盘干细胞是OCT-4⁺或ABC-p⁺。在另一个更加具体的实施方案中，所述胎盘干细胞包含OCT-4⁺ABC-p⁺的细胞。在另一个更加具体的实施方案中，所述胎盘干细胞包含CD34⁺的细胞和OCT-4⁺ABC-p⁺的细胞。在另一个更加具体的实施方案中，所述胎盘干细胞包含在基本没有红血球细胞和细胞碎片的胎盘灌注液内。在另一个更加具体的实施方案中，所述组合物包含从胎盘灌注液中分离的胎盘干细胞。

在另一个实施方案中，胎盘干细胞包含表达CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73或CD105标记中的一个或多个，并且缺乏CD34、CD38、CD45、SSEA3和SSEA4标记中的一个或多个的细胞。在另一个实施方案中，胎盘干细胞包含CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73或CD105呈阳性，并且CD34、CD38、CD45、SSEA3和SSEA4呈阴性的细胞。在另一个实施方案中，胎盘干细胞包含的细胞含有CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73和CD105标记中的一个或多个，并且缺乏CD34、CD38、CD45、SSEA3和SSEA4标记中的一个或多个。在另一个实施方案中，胎盘干细胞包含CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73和CD105呈阳性，并且CD34、CD38、CD45、SSEA3和SSEA4呈阴性的细胞。在另一个实施方案中，所述胎盘干细胞包含CD34^-细胞。在具体实施方案中，所述胎盘干细胞是CD34^-CD38^-胎盘干细胞。在另一个实施方案中，所述胎盘干细胞包含CD10、CD29、CD33、CD44、CD73、CD105、CD117和CD133中的至少一个呈阳性，并且CD34或CD45中的至少一个呈阴性的细胞。在另一个实施方案中，所述胎盘干细胞包含CD10、CD29、CD33、CD44、CD73、CD105、CD117和CD133呈阳性，并且CD34或CD45呈阴性的细胞。在更加具体的实施方案中，所述胎盘干细胞包含HLA-ABC⁺的细胞。在更加具体的实施方案中，所述胎盘干细胞包含HLA-ABC^-的细胞。在更加具体的实施方案中，所述胎盘干细胞包含HLA-DR⁺的细胞。在更加具体的实施方案中，所述胎盘干细胞包含HLA-DR^-的细胞。在另一个具体实施方案中，所述胎盘干细胞包含CD200⁺或HLA-G⁺的细胞。在另一个具体实施方案中，胎盘干细胞包含CD200⁺HLA-G⁺的细胞。在另一个具体实施方案中，胎盘干细胞包含CD73⁺ CD105⁺ CD200⁺的细胞。在另一个具体实施方案中，胎盘干细胞包含CD200⁺OCT-4⁺的细胞。在另一个具体实施方案中，胎盘干细胞包含CD73⁺CD105⁺的细胞，并且在包含所述干细胞的分离的胎盘细胞群落中，当所述群落在允许胚状体形成的条件下培养时，所述细胞促进胚状体形成。在另一个具体实施方案中，胎盘干细胞包含CD73⁺CD105⁺HLA-G⁺的细胞。在另一个具体实施方案中，胎盘干细胞包含OCT-4⁺的细胞，并且在包含所述干细胞的分离的胎盘细胞群落中，当所述群落在允许胚状体形成的条件下培养时，所述细胞促进胚状体形成。

在另一个实施方案中，所述第二来源干细胞是源自脐带血的干细胞。

在本发明的组合干细胞群落中，胎盘干细胞和第二来源干细胞可以是同一HLA匹配的，即它们可以源自同一个体。在另一个实施方案中，胎盘干细胞和第二来源干细胞可以是HLA不匹配的，即它们可以源自不同个体。对于包含脐带血或源自脐带血的干细胞的组合干细胞群落，该组合可以也包含与目标接受者是HLA匹配的、部分HLA匹配的、或者HLA不匹配的干细胞。对于包含非脐带血干细胞的组合干细胞群落，优选地，至少第二来源干细胞与目标接受者是HLA匹配的、或者部分HLA匹配的。

在各种实施方案中，对比各个群落中的有核细胞总量，或者对比各个群落中的干细胞总量，胎盘干细胞和第二来源干细胞的比率可以是大约100,000,000:1、50,000,000:1、20,000,000:1、10,000,000:1、5,000,000:1、2,000,000:1、1,000,000:1、500,000:1、200,000:1、100,000:1、50,000:1、20,000:1、10,000:1、5,000:1、2,000:1、1,000:1、500:1、200:1、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10、1:100、1:200、1:500、1:1,000、1:2,000、1:5,000、1:10,000、1:20,000、1:50,000、1:100,000、1:500,000、1:1,000,000、1:2,000,000、1:5,000,000、1:10,000,000、1:20,000,000、1:50,000,000、或者大约1:100,000,000。在优选的实施方案中，胎盘干细胞和第二来源干细胞的比率可以是大约1:10到大约10:1。在其它优选的实施方案中，胎盘干细胞和第二来源干细胞的比率可以是大约3:1到大约1:3。

本发明的组合干细胞群落可以包含治疗有效量的胎盘干细胞、第二来源干细胞、或者两者。本发明的组合干细胞群落和包含组合干细胞群落的药物组合物，可以包含至少1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰或者1×10¹¹个胎盘干细胞、第二来源干细胞、或者两者；或者不多于1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰或者1×10¹¹个胎盘干细胞、第二来源干细胞、或者两者。

在其它的实施方案中，所述组合干细胞群落在移植后的至少或在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天时，改善了需要干细胞的个体中的移植后着床。在另一个更加具体的实施方案中，所述组合干细胞群落在移植后的至少或超过21天时改善了需要干细胞的个体中的移植后着床。在具体实施方案中，所述组合干细胞群落在移植后的至少或超过25、30、35、40、45、50、55周，或者一年或更长时改善了需要干细胞的个体中的移植后着床。

本发明的组合干细胞群落可以被保存，例如冷冻储存供以后使用。冷冻储存细胞例如干细胞的方法在本领域中是熟知的，例如使用Boyse等(美国专利号5,192,553，1993年3月9日授权)或者Hu等(WO 00/73421，2000年12月7日公开)的方法来冷冻储存。组成组合干细胞群落的源自胎盘的干细胞和第二来源干细胞可以在冷冻储存前组合，或也可以分开来冷冻储存，并例如在使用的几小时内通过解冻以适当的比率组合。

本发明的组合干细胞群落可以被制备成容易施用给个体的形式。例如，组合干细胞群落可以被包含在适合医疗用途的容器内。这样的容器可以是例如无菌塑料袋、瓶、罐、或其它的容器，容器中的组合干细胞群落可以容易地被分配。优选地，该容器是允许或促进静脉施用组合干细胞群落的容器。该容器(例如袋子)可以把源自胎盘的干细胞和第二来源干细胞保存在一起，例如，作为混合细胞群落保存；或者可以把该两种干细胞群落分开保存。在后一种实施方案中，该袋子优选包含若干互相连接的内腔或间隔，以允许源自胎盘的干细胞和第二来源干细胞在施用前、或在施用期间混合。该容器优选地允许组合干细胞群落的冷冻储存。在所述容器中的组合干细胞群落可以包含源自胎盘的干细胞、第二来源干细胞、或者两者，它们已经传代至少、或者至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20次，或者25、30、35、40或更多次。

本发明也提供了组合干细胞群落，包含例如作为分开的干细胞群落储存或保存的群落，例如源自胎盘的干细胞群落和第二来源干细胞群落，该组合干细胞群落与关于在使用前例如在对需要干细胞的个体施用前将两个群落以适当比率组合的信息相结合。在这个实施方案中，组合干细胞群落将在第一个容器中包含源自胎盘的干细胞群落，在第二个容器中包含第二来源干细胞群落，并且包含在对需要干细胞的个体施用前、或施用期间组合这两个群落的说明书。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含容器中的组合干细胞群落的组合物，其中所述组合干细胞群落包含源自胎盘的干细胞和第二来源干细胞。在具体实施方案中，该容器是袋、瓶或罐。在更加具体的实施方案中，所述源自胎盘的干细胞和所述第二来源干细胞一起包含在所述袋子中。在另一个更加具体的实施方案中，所述源自胎盘的干细胞和所述第二来源干细胞分开包含在所述袋子内。在另一个具体实施方案中，该组合物包含一种或多种促进组合干细胞群落冷冻储存的化合物。在另一个具体实施方案中，所述组合干细胞群落被包含在生理学上可接受的水溶液之内。在更加具体的实施方案中，所述生理学上可接受的水溶液是0.9％的NaCl溶液。在另一个更加具体的实施方案中，所述袋是无菌塑料袋。在更加具体的实施方案中，所述袋子允许或促进所述组合干细胞群落的静脉施用。在另一个具体实施方案中，所述组合干细胞群落包含与所述第二来源干细胞HLA匹配的胎盘细胞。在另一个具体实施方案中，所述组合干细胞群落包含与所述第二来源干细胞至少部分HLA不匹配的胎盘细胞。在另一个具体实施方案中，所述源自胎盘的干细胞来源于多个捐赠体。在另一个具体实施方案中，所述第二来源干细胞来源于多个捐赠体。

在施用给个体前，可将组合干细胞群落培养一段时间。例如，在一个实施方案中，组合干细胞群落中的干细胞可以在包含Notch激动剂的培养基中培养，例如基本由Notch蛋白的胞内域组成的Notch蛋白的缺失形式，或Delta蛋白。参见美国专利公开号2004/0067583。

5.3 药物组合物

本发明包含药物组合物，该组合物包含本发明的组合干细胞群落，和制药学上可接受的载体。

依照这个实施方案，本发明的组合干细胞群落可以被配制成可注射形式(例如WO 96/39101，全部引入本文以供参考)。在另一个实施方案中，可以使用可聚合的或交联的水凝胶配制本发明的组合干细胞群落，如美国专利号5,709,854、5,516,532、5,654,381中所述。

在另一个实施方案中，本发明规定在施用给个体前保存组合干细胞群落中的各干细胞群落，它们将作为分开的药物组合物被连续地或者共同地施用以在体内创建组合干细胞群落。各个成分可以在分开的容器中被储存和/或使用，例如，袋子(例如来自Baxter、Becton-Dickinson、Medcep、National HospitalProducts、Terumo等的血液储存袋)、或者分开的注射器，其包含了单一类型的细胞或细胞群落。在具体实施方案中，脐带血、或源自脐带血的有核细胞或干细胞被包含在一个袋子里，而胎盘灌注液、或来自胎盘灌注液的胎盘干细胞被包含在另一个袋子里。

胎盘干细胞的群落可以被富集。在具体实施方案中，通过依照标准方法移除红血球细胞和/或粒细胞来富集包含胎盘干细胞的细胞群落，所以相对于胎盘灌注液中的其它细胞类型，胎盘干细胞在留下来的有核细胞群落中富集。这样的胎盘干细胞的富集群落可以不冷冻直接使用，也可以被冷冻供以后使用。如果细胞群落将要被冷冻，那么在冷冻前，向富集的细胞群落中加入标准的冷冻防腐剂(例如，DMSO、甘油、EPILIFE^TM细胞冷冻培养基(CascadeBiologics))。

本发明的药物组合物可以包含一种或多种诱导细胞分化的试剂。在某些实施方案中，诱导分化的试剂包括但不限于Ca²⁺、EGF、α-FGF、β-FGF、PDGF、角质形成细胞生长因子(KGF)、TGF-β、细胞因子(例如IL-1α、IL-1β、IFN-γ、TFN)、视黄酸、铁传递蛋白、激素(例如雄激素、雌激素、胰岛素、催乳激素、三碘甲状腺原氨酸、氢化可的松、地塞米松)、丁酸钠、TPA、DMSO、NMF、DMF、基质成分(例如胶原、层粘蛋白、硫酸肝素、MATRIGEL^TM)，或其组合。

在另一个实施方案中，本发明的药物组合物可以包含一种或多种抑制细胞分化的试剂。在某些实施方案中，抑制分化的试剂包括但不限于人Delta-1和人Serrate-1多肽(参见，Sakano等，美国专利号6,337,387)、白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子，或其组合。

本发明的药物组合物可以在施用给个体前用调节TNF-α活性的化合物处理。这样的化合物在例如美国申请公开号2003/0235909中详细披露，该申请的内容全部引入本文。优选的化合物被称为IMiD(免疫调节化合物)和SelCID(选择性细胞因子抑制药物)，和特别地，优选的化合物可以是商品名为ACTIMID^TM、REVIMID^TM和REVLIMID^TM的产品。

5.4 移植干细胞的方法

5.4.1 移植方法

以上识别组合干细胞群落的方法(参见5.1部分)可以用例如胎盘灌注液或胎盘干细胞和第二来源干细胞如脐带血、脐带血干细胞等的成对单位进行，以制备用于治疗需要干细胞的个体的组合干细胞群落。在一个实施方案中，用一种或多种组合干细胞群落接触个体。在一个具体实施方案中，所述接触是引入例如移植所述组合干细胞群落到所述个体中。因此，制备组合干细胞群落的方法可以作为将干细胞引入到任何需要干细胞的个体中的程序的第一步来进行。这样的程序可以包含使用包含组合干细胞群落的药物组合物，如上所述。

在具体实施方案中，本发明的胎盘干细胞群落与第二来源干细胞群落在施用给需要的个体前以一定比率组合，相比于与所述细胞总量相等的单独的所述胎盘干细胞或单独的所述第二来源干细胞，该比率提供了改善或提高的移植后着床。在另一个具体实施方案中，在施用给需要的个体的过程中或同时将本发明的胎盘干细胞群落与第二来源干细胞群落以最优比率组合，其中所述的比率通过以下方法识别：在多个胎盘干细胞和第二来源干细胞的比率中识别一个比率，当所述的胎盘干细胞和第二来源干细胞在可以形成克隆形成单位的条件和时间下培养时，该比率产生了最大数量的所述克隆形成单位。在另一个具体实施方案中，本发明的胎盘干细胞群落和脐带血细胞群落顺序施用给需要的个体至最终的最优比率。在一个实施方案中，先施用胎盘干细胞群落，然后再施用第二来源干细胞群落。在另一个实施方案中，先施用第二来源干细胞群落，然后再施用胎盘干细胞群落。

在具体实施方案中，所述组合干细胞群落被包含在袋子或容器之内。在另一个实施方案中，本发明提供了包含在分开的袋子或容器之内的胎盘干细胞和第二来源干细胞的群落的在移植中的应用。在某些实施方案中，包含在两个袋子中的干细胞群落可以在施用给需要的患者前被混合，特别是在即将施用前被混合，或者在施用时被混合。在其它实施方案中，每个袋子的内容物可以被分开地施用给患者，其中两个细胞群落在体内作辅助使用。

胎盘干细胞和第二来源干细胞(例如源自脐带血的干细胞或祖细胞，或者脐带血，包括库存的或冷冻储存的脐带血)的组合群落可以在移植前通过任何医学上可接受的方法被混合。在一个实施方案中，这两个群落是物理混合的。在本方法的另一个实施方案中，所述胎盘干细胞和第二来源干细胞在即将施用给所述个体前混合(例如，施用前的1、2、3、4、5、7、10分钟之内)。在另一个实施方案中，所述胎盘干细胞和第二来源干细胞在施用给所述个体前多于5分钟的时间点混合。在本方法的另一个实施方案中，胎盘干细胞和/或第二来源干细胞被冷冻储存，并且在施用给所述个体前解冻。在另一个实施方案中，所述胎盘干细胞和第二来源干细胞在施用给所述个体前多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时的时间点混合以形成组合干细胞群落，其中所述胎盘干细胞和第二来源干细胞中的任一个或两者被冷冻储存并且在所述施用前被解冻。在另一个实施方案中，组合干细胞群落可以被施用多于一次。

在另一个实施方案中，包含在组合干细胞群落内的干细胞在移植前被预处理。在优选的实施方案中，预处理包含在透气容器中储存细胞一段时间，通常在大约-5℃到大约23℃，大约0℃到大约10℃，或者优选地大约4℃到大约5℃。细胞可以被储存18小时到21天之间，48小时到10天之间，优选地，3-5天之间。细胞可以在预处理前冷冻储存，或者在即将施用前预处理。

一旦胎盘干细胞和第二来源干细胞的适当比率被确定，可以在引入需要干细胞的个体前，将胎盘干细胞或第二来源干细胞之一或两者分化。例如，为了造血移植后着床目的而引入，干细胞可以被分化成造血细胞系的细胞。干细胞和分化的细胞的组合，或者来自两个干细胞来源的分化细胞的组合，被包含在术语“组合干细胞群落”中。因此，本发明提供了向个体中引入干细胞的方法，包含确定胎盘干细胞和第二来源干细胞在细胞总量中的比率，其中相对于引入与所述细胞总量相等的单独的胎盘干细胞或单独的第二来源干细胞，该比率改善了移植后着床；将所述胎盘干细胞或第二来源干细胞之一或两者分化为另一种细胞类型的细胞；以及向个体中引入所述干细胞和/或已分化的细胞。在本发明的某些实施方案中，移植组合干细胞群落的方法包含：(a)诱导胎盘干细胞的分化，(b)将该胎盘干细胞与第二来源干细胞例如脐带血干细胞的群落混合以形成组合细胞群落，和(c)将组合细胞群落施用给需要的个体。在另一个实施方案中，移植的方法包含：(a)诱导第二来源干细胞的分化，(b)将已分化的细胞与胎盘干细胞混合以形成组合细胞群落，和(c)将组合细胞群落施用给需要的个体。在本发明的另一个实施方案中，移植组合干细胞群落的方法包含：(a)将胎盘干细胞与脐带血细胞群落混合，(b)诱导脐带血细胞和胎盘干细胞的混合物的分化，和(c)将混合物施用给需要的患者。

本发明的组合干细胞群落可以用任何药物学上可接受的或医学上可接受的方式移植到患者中，包括通过注射，例如静脉注射、肌肉注射、腹腔内注射、眼内注射、对特定组织的直接注射、输液等。组合干细胞群落(例如胎盘干细胞和源自脐带血的干细胞的组合)例如可以通过静脉输注移植。在另一个实施方案中，包含胎盘干细胞和心脏干细胞的组合干细胞群落的悬浮液中可以被直接注射到心脏组织中，例如心脏的缺血区域。组合干细胞群落可以包含任何药物学上可接受的载体，或者被悬浮在任何药物学上可接受的载体中。组合干细胞群落可以在任何药物学上可接受的或医学上可接受的容器中携带、储存、或运输，例如血袋、转移袋、塑料试管、或小瓶。

移植后，使用例如核酸或蛋白质检测或分析方法可以评估人类接受者中的移植后着床。例如，多聚酶链式反应(PCR)、STR、SSCP、RFLP分析、AFLP分析等可被用来识别接受者组织样本中移植后着床细胞的特异性核苷酸序列。这些核酸检测和分析方法在本领域中是熟知的。在一个实施方案中，移植后着床可以通过接受者组织样本中区别于背景的移植后着床细胞特异性核酸的出现来确定。组织样本分析可以是例如活组织切片检查(例如骨髓抽样)或血液样本。

在一个实施方案中，在即将进行医疗步骤例如清髓之前从患者提取外周血样本。在该步骤后，本发明的组合干细胞群落被施用给该患者。施用后至少一次提取外周血的第二份样本。例如使用可以从LabCorp(LaboratoryCorporation of America)得到的标记(等位基因)的PCR引物获得两个样本的STR图谱。施用后，标记(等位基因)的数目或特征不同意味着已经发生移植后着床。

移植后着床也可以通过检测到嗜中性粒细胞的重新出现来证明。

在另一个实施例中，可以使用抗体检测接受者组织样本中的移植后着床细胞的特异性标记，所述抗体针对移植的干细胞的特异性标记或移植的干细胞预期分化成成的细胞的特异性标记。在一个实施方案中，通过FACS分析对胎盘干细胞和源自脐带血的干细胞的组合的移植后着床进行评估以确定CD45⁺、CD19⁺、CD33⁺、CD7⁺和/或CD3⁺的细胞的存在，分析通过以下步骤进行：加入适当的抗体并且允许结合；洗涤(例如用PBS)；固定细胞(例如用1％多聚甲醛)；在适当的FACS仪器上分析(例如FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson))。在另一个实施方案中，通过FACS分析评估胎盘干细胞和源自脐带血的干细胞的组合的移植后着床以确定CD200⁺或HLA-G⁺的细胞的存在。当胎盘干细胞和/或第二来源干细胞是来自与接受者性别不同的个体，例如男性捐赠体和女性接受者，可以通过检测性别特异性标记例如Y染色体特异性标记来确定移植后着床。胎盘干细胞和/或第二来源干细胞也可以被遗传修饰以表达利于识别的独特标记或核酸序列，例如，RFLP标记、β-半乳糖苷酶或绿色荧光蛋白的表达等。

移植后着床的程度可以通过本领域的任何已知方法来评估。在一个实施方案中，移植后着床的程度通过如下的等级系统来评估，其使用了移植接受者的已被固定和抗体结合的组织薄切片。在这个示例的等级系统中，移植后着床被如下分级：0＝没有阳性细胞(即无结合移植后着床细胞特异性抗体的细胞)；0.5＝1或2个阳性细胞，或许是阳性的，但难以从背景或者非特异性染色中区分出来；1＝2-20个零散的阳性细胞；2＝大约20-100个零散的或聚集的阳性细胞，遍布组织；3＝多于100个阳性细胞，包含少于50％的组织；4＝多于50％的细胞是阳性的。在具体实施方案中，当多于0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、7.5％、10％、15％、20％或者更多的细胞是阳性染色时，移植后着床被确定。

在另一个实施方案中，移植后着床的程度通过分析移植后着床的细胞所行使的一个或多个生物学功能的获得来确定。例如，当经历了清髓治疗的接受者接受包含了胎盘干细胞和源自脐带血的干细胞的组合干细胞群落的移植时，移植后着床的程度可以通过其中正常造血作用、血细胞群落、和血功能回复正常的程度来确定。

当组合干细胞群落与目标接受者全部或部分HLA不匹配时，可能需要治疗接受者以减轻对捐赠体细胞的免疫排斥。减轻免疫排斥的方法在例如美国专利号5,800,539和5,806,529中披露，两者都引入本文以供参考。

5.4.2 剂量

典型地，接受干细胞输注例如骨髓移植的患者接受一个单位的有核细胞，其中一个单位是大约1×10⁹个有核细胞(对应于1-2×10⁶个CD34⁺干细胞)。在各种实施方案中，移植组合干细胞群落到个体中，包括移植至少10万个、100万个、1000万个、1到2亿个、10亿个、30亿个、50亿个、100亿个、150亿个、200亿个、300亿个、400亿个、500亿个或更多个，或者可选择地，3、5、10、20、30、40或50个单位或更多的来自胎盘干细胞群落和第二来源的干细胞群落的总的有核细胞。在其它实施方案中，移植组合干细胞群落到个体中包括移植至少1000万到2000万个、1亿个、3亿个、5亿个、10亿个、15亿个、20亿个、30亿个、40亿个、50亿个、60亿个、70亿个、80亿个、90亿个、100亿个或更多的干细胞。在另一个实施方案中，施用给个体的有核细胞数量是通常在骨髓替代中施用的细胞数量的至少5倍。在本方法的另一个具体实施方案中，施用给个体的有核细胞数量是通常在骨髓替代中施用的细胞数量的至少10倍。在另一个具体实施方案中，施用给个体的有核细胞数量是通常在骨髓替代中施用的细胞数量的至少15倍。在本方法的另一个实施方案中，施用给个体的有核细胞总量(包括干细胞)是1-1000×10⁸/千克体重。

5.5 使用组合干细胞群落治疗的方法

本发明的组合干细胞群落可以被用来治疗需要可移植后着床的干细胞的个体。这样的个体，例如，需要移植干细胞来实现造血重建。在各种其它实施方案中，组合干细胞群落可以被用来治疗患有血癌、溶酶体贮积症、炎性病症、或自体免疫病症的个体。在其它实施方案中，组合干细胞群落可以被用来促进器官再生或修复，或者可以被用作转基因载体。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了治疗个体的方法，包含用本发明的组合干细胞群落接触(例如施用给)个体。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗个体的方法，包含识别组合干细胞群落，和用所述组合干细胞群落接触所述个体。在具体实施方案中，组合干细胞群落在细胞总量中包含一定比率的胎盘干细胞和第二来源干细胞，相对于与所述细胞总量相等的单独的胎盘干细胞或单独的第二来源干细胞，该比率改善或提高了移植后着床。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗个体的方法，其中包含将以一定比率包含了胎盘干细胞和第二来源干细胞的组合物引入所述个体，其中所述的比率通过以下方法选择：在胎盘干细胞和第二来源干细胞的多个比率中，识别一个比率，该比率在足以形成克隆形成单位的条件和时间下体外培养时生成最高数量的克隆形成单位，克隆形成单位中的细胞数量在每个条件下是相等的；其中所述个体患有可以用干细胞治疗的疾病、病症或状况。在具体实施方案中，所述第二来源干细胞是脐带血或者胎盘血干细胞。在另一个具体实施方案中，所述第二来源干细胞是造血干细胞。在另一个具体实施方案中，所述第二来源干细胞是源自骨髓的干细胞。在另一个具体实施方案中，所述治疗是预防性的。在另一个具体实施方案中，所述治疗是治疗性的。在各种实施方案中，所述疾病、病症或状况是以下列出的疾病、病症或状况中的一种。在此提供的疾病、病症或状况列表不是限制性的。

组合干细胞群落，特别是包含胎盘干细胞和脐带血或源自脐带血的干细胞的干细胞群落，它的一个用途是在患者中进行造血重建，该患者例如经历了部分或全部清髓治疗(作为抗癌方案的一部分)。典型地，移植骨髓干细胞以实现造血重建，在骨髓移植的移植后着床中，必须注入的剂量大约是每千克患者体重1×10⁸到2×10⁸个骨髓单核细胞，或者大约1-8×10⁶个CD34⁺干细胞(例如，对于70千克的捐赠体，大约70毫升骨髓)。造血重建可以通过向个体中引入相等数量的组合干细胞群落中的总的有核细胞来完成，该组合干细胞群落包含，例如胎盘干细胞和第二来源干细胞(例如胎盘血或者脐带血)。

胎盘干细胞和第二来源干细胞可以是全部或部分与接受者免疫匹配的，或者可以来自完全不相关的个体。在一个实施方案中，接受组合干细胞群落的个体，对于5/6 HLA匹配的细胞，接受≥3.5×10⁷个例如来自脐带血的总的有核细胞(TNC)/千克体重，或者对于4/6 HLA匹配的细胞，接受≥5.0×10⁷个总的有核细胞(TNC)/千克体重。例如来自UCB的TNC的输注之后，例如紧接着注入每千克体重大约5×10⁶个到大约30×10⁶个来自胎盘灌注液的TNC。个体可以接受单个这样的剂量，或者多个这样的剂量。

因此，在一个实施方案中，包含造血干细胞的组合干细胞群落可以被用来治疗患有血液癌症，例如恶性淋巴瘤、白血病(例如慢性或急性骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、Hodgkin’s症等)、脊髓发育不良、脊髓增生异常综合症等的患者。在另一个实施方案中，该疾病、病症或状况是慢性肉芽肿性疾病。

因为造血重建可以被用在贫血症的治疗中，本发明进一步包含用本发明的干细胞组合对个体的治疗，其中该个体患有贫血或血红蛋白病症。该贫血或病症可以是自然的(例如，由遗传或疾病引起)，也可以是人工诱导的(例如，通过意外中毒或故意下毒、化疗等)。在另一个实施方案中，该疾病或病症是骨髓衰竭综合症(例如，再生障碍性贫血、Kostmann综合症、Diamond-Blackfan贫血、无巨核细胞性血小板减少等)、骨髓病症、或者造血疾病或病症。

在另一个实施方案中，本发明的组合干细胞群落可以被引入到损伤的器官中用于体内器官再生和伤害修复。这些伤害可以起因于状况和病症，它们包括但不限于，心肌梗塞、癫痫症、多发性硬化、中风、血压过低、心脏骤停、局部缺血、炎症、与年龄相关的认知功能缺失、大脑性麻痹、神经退行性疾病、Alzheimer’s症、Parkinson’s症、Leigh症、AIDS痴呆、记忆缺失、肌萎缩性侧索硬化症、缺血性肾病、大脑或脊髓损伤、心肺分流、青光眼、视网膜缺血、或视网膜损伤。

在其它实施方案中，可以使用组合干细胞群落治疗的疾病、病症或状况，包括但不限于溶酶体贮积症，例如Tay-Sachs、Niemann-Pick、Fabry’s、Gaucher’s症(例如葡糖脑苷脂酶缺乏)、Hunter’s和Hurler’s综合症、Maroteaux-Lamy综合症、岩藻糖苷症(岩藻糖苷酶缺乏)、Battern症(CLN3)、以及其它的神经节苷脂沉积症、粘多糖贮积症和糖原贮积症。

组合干细胞群落也可以被用来治疗严重的组合免疫缺陷疾病，包括但不限于，组合免疫缺陷疾病(例如Wiskott-Aldrich综合症、严重的DiGeorge综合症等)。

在其它实施方案中，组合干细胞群落可以被用作基因治疗中自体同源的或者异源的转基因载体，来纠正例如新陈代谢的先天错误、脑白质营养不良(例如co-A连接酶缺乏)、异染性脑白质营养不良(芳基硫酸酯酶A缺乏)(例如，有症状的或者症状前的晚发婴儿型或少年型)、球状细胞脑白质营养不良(Krabbe’s症；半乳糖脑苷脂酶缺乏)、酸性连接酶缺乏(Wolman症)、囊肿性纤维化、糖原贮积症、甲状腺机能减退、镰刀形细胞贫血症、地中海贫血(例如β地中海贫血)、Pearson综合症、Pompe’s症、苯丙酮酸尿症(PKU)、卟啉症、枫糖尿症、高胱氨酸尿、粘多糖贮积症、慢性肉芽肿性疾病、和酪氨酸血症以及Tay-Sachs症，或者来治疗固体肿瘤或其它病理状况。

在其它实施方案中，疾病、病症或状况是需要替代或修复一个或多个组织的疾病、病症或状况。例如，本发明的组合干细胞群落可以用在治疗性移植方案中，例如，来增加或替代肝脏、胰腺、肾脏、肺、神经系统、肌肉系统、骨、骨髓、胸腺、脾脏、粘膜组织、生殖腺或头发中的干细胞或祖细胞。本发明的组合干细胞群落也可以被用在例如软骨、腱、或韧带的增加、修复或替代上。例如，在某些实施方案中，用本发明的组合干细胞群落生长出的替代软骨组织构建物来包涂假体(例如髋关节假体)。在其它实施方案中，关节(例如膝盖)用组合干细胞群落生长出的软骨组织构建物来重建。软骨组织构建物也可用在不同类型关节的主要重建性手术中(对于方案，参见例如，Resnick，D.和Niwayama，G.编辑，1998，DIAGNOSIS OF BONE AND JOINTDISORDERS，2D版，W.B.Saunders公司)。本发明的组合干细胞群落可以被用来修复外伤、新陈代谢病症、或疾病导致的组织和器官的损伤。在一个实施方案中，可以对患者施用组合干细胞群落来再生或修复已经作为疾病结果而损伤的组织或器官，例如，修复心肌梗塞后的心脏组织。

在另一个实施方案中，本发明的组合干细胞群落可以被用来治疗接受了致死或半致死剂量辐射的个体。这样的辐射可以是意外接受的，例如在核事故中，不管是工作相关的还是侵略相关的，或者是治疗性的，例如，作为医疗过程的一部分。辐射的具体类型(例如，α、β、γ)不重要。本发明的组合干细胞群落可以用来改善辐射疾病的一种或多种症状，例如，恶心、食欲丧失、嗜睡、呼吸困难、白血球细胞数量减少、慢性贫血、疲劳、衰弱、苍白、呼吸困难、感觉不适等，不管这些症状暗示了可恢复的辐射疾病还是致命的辐射疾病。在另一个实施方案中，个体患有与急性辐射综合症(ARS)有关的一种或多种症状。本发明的组合干细胞群落也可以被用来部分或全部地再造接受了致死或半致死剂量辐射的个体的造血系统，由此该个体变得部分或全部嵌合。这样的嵌合可以是临时的或永久的(例如，可能持续1、2、3周，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11个月或更长)。在优选的实施方案中，本发明的组合干细胞群落在暴露后的第一个24小时之内提供给个体。个体可以在暴露在辐射下后的第1个小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、9小时、12小时、15小时、18小时、或者21小时之内施用组合干细胞群落。本发明的组合干细胞群落也可以在暴露在辐射下后的2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周或者5周之内被施用。

当被施用给经历炎症的个体时，预期组合干细胞群落具有抗炎效果。在优选的实施方案中，本发明的组合干细胞群落可以被用来治疗任何导致炎症、或与炎症有关的疾病、病症或状况。炎症可以在任何器官或组织中存在，例如，肌肉；神经系统，包括脑、脊髓和外围神经系统；脉管组织，包括心脏组织；胰腺；肠或其它消化道的器官；肺；肾脏；肝脏；生殖器官；内皮组织，或者内胚组织。

组合干细胞群落也可以被用来治疗自体免疫的或者免疫系统相关的病症，包括那些与炎症有关的病症。因此，在某些实施方案中，本发明提供了治疗患有自体免疫疾病或状况的个体的方法，包含给这样的个体施用治疗有效量的本发明的细胞或补充细胞群落，其中所述的疾病或病症可以是但不限于糖尿病、肌萎缩性侧索硬化症、重症肌无力、糖尿病性神经病变或者红斑狼疮。在相关的实施方案中，本发明的组合干细胞群落可以被用来治疗免疫相关的病症，例如慢性或急性过敏。

组合干细胞群落也可以被施用给名义上健康的个体，来增加个体的整体健康。

如果疾病、病症或状况在任何方面有测量到的改善，就认为用组合干细胞群落对个体的治疗性或预防性治疗是有效的。这样的改善可以通过若干指标显示。可测量的指标包括，例如，与特定疾病、病症或状况相关的一个或一组生理状况中可检测的改变(包括但不限于血压、心率、呼吸频率、各种血细胞类型计数、血液中某种蛋白质、碳水化合物、脂质或细胞因子的水平，或者与该疾病、病症或状况相关的遗传标记的调节表达)。如果这些指标中的任何一个变到正常值之内或接近正常值从而对所述治疗产生响应，就认为用本发明的干细胞或补充的细胞群落对个体的治疗是有效的。各种指标的正常值可以通过本领域中已知的正常范围来确定，或者通过与对照组的这些值相比较来确定。如果引入组合干细胞群落的个体展示了任何移植后着床的指示(例如在活组织切片、或组织样本、或血液样本中出现移植后着床的细胞的标记；检测到一种或多种由移植后着床的细胞实现的生物化学功能等)，就可以认为为了移植后着床目的例如造血移植后着床而引入本发明的组合干细胞群落是成功的。在医药科学中，治疗的效果也经常通过个体的印象和对个体健康状态的主观感受进行表征。因此，也可以通过主观指标来表明改善，例如，在施用了本发明的干细胞或补充细胞群落后，该个体对改善、增加的幸福感、增加的健康状态、改善的精力水平的主观感受等。

5.6 干细胞库

以上描述的方法，特别是体外方法(参见5.1.1节)，可以在例如胎盘灌注液、胎盘干细胞、脐带血、脐带血干细胞等的单个单位上进行来制备用于治疗需要干细胞的个体的组合干细胞群落。同样的，测试可用作建干细胞库或者建血库(包括建脐带血库)方法的一部分，其中提供干细胞是所述建库的至少一部分。可以在由血库、干细胞注册或类似业务提供或使用的多个单位胎盘干细胞和第二来源干细胞中的每一个单位上进行测试。

例如，在一个实施方案中，本发明提供了干细胞建库方法，包含提供多个单位的包含多个胎盘干细胞和第二来源干细胞的组合干细胞群落，其中相对于与所述组合干细胞群落的细胞数量相等的单独的所述胎盘干细胞或单独的所述第二来源干细胞，所述组合干细胞群落显示了改善或提高的移植后着床。在具体实施方案中，所述组合干细胞群落通过以下方法产生，包含：提供多个单位的胎盘干细胞；也提供来自第二来源的多个干细胞；用第二来源干细胞单位匹配所述胎盘干细胞的每一个单位；并且识别所述胎盘干细胞和所述第二来源干细胞在细胞总量中的比率，当在足以形成克隆形成单位的条件和时间下组合时，该比率比与所述细胞总量相等的单独的所述胎盘干细胞或单独的所述第二来源干细胞生成更多数量的克隆形成单位。在具体实施方案中，所述第二来源干细胞是脐带血或者胎盘血干细胞。在另一个具体实施方案中，所述第二来源干细胞是外周血干细胞。在另一个具体实施方案中，所述第二来源干细胞是骨髓干细胞。在另一个具体实施方案中，所述胎盘干细胞和所述第二来源干细胞是随机匹配的。在另一个具体实施方案中，所述胎盘干细胞和所述第二来源干细胞是基于所述胎盘干细胞单位和所述第二来源干细胞单位的特征来匹配的。在更加具体的实施方案中，所述特征是所述胎盘干细胞单位和所述第二来源干细胞单位中的总的有核细胞数量。在另一个更加具体的实施方案中，所述特征是所述胎盘干细胞单位和所述第二来源干细胞单位中的干细胞数量。在另一个更加具体的实施方案中，所述特征是所述胎盘干细胞和所述第二来源干细胞显示的免疫学标记。

本发明进一步提供源自胎盘的干细胞的库，例如，源自胎盘的干细胞的单位和第二来源干细胞的单位的库，其中若干所述源自胎盘的干细胞和第二来源干细胞以一定比率被一起提供，该比率在可以形成克隆形成单位的条件下，在细胞总量中，比与所述细胞总量相等的单独的胎盘干细胞或单独的第二来源干细胞能产生更多的克隆形成单位。在优选的实施方案中，该库包含多个单位的源自胎盘的干细胞，它们与一个或多个单位的第二来源干细胞以对各自单位特定的比率相匹配或者被识别为可组合的，当这些单位被组合后，相对于相等数量的单独的源自胎盘的干细胞或单独的第二来源干细胞，该比率在克隆形成单位测试中显示更多数量的克隆形成单位，或者当移植给接受者时改善移植后着床。该库可以包含源自胎盘的干细胞和第二来源干细胞的分开的、匹配的单位，或者组合干细胞群落的单位。

包含在这样的库中或者包含在这样的库中的组合干细胞群落单位中的源自胎盘的干细胞可以是，例如，从胎盘中直接获得的灌注液内所包含的细胞；从胎盘灌注液或者胎盘酶消化物中分离的而且包含在有核细胞部分之内的源自胎盘的干细胞；从剩余的胎盘细胞中依照例如一种或多种细胞表面标记而分离的源自胎盘的干细胞群落；或者从任何一种前述胎盘干细胞培养和/或扩增的干细胞群落。第二来源干细胞可以被包含在组织匀浆、或者组织特异性细胞的其它收集物中，例如完整的脐带血或者胎盘血、从第二来源以任何程度分离的干细胞、或者从任何一种前述第二来源干细胞培养和/或扩增的干细胞。

优选地，胎盘干细胞和第二来源干细胞是源自同一个体的。在具体实施方案中，所述第二来源干细胞是脐带血和/或胎盘血干细胞，来自从中获得或衍生出胎盘干细胞的那个胎盘。在优选的实施方案中，该库包含多个单位的组合干细胞群落，其以对各自单位特定的比率包含来自相同个体的胎盘干细胞和来自脐带血或胎盘血单位的干细胞，在细胞总量中，相对于与所述细胞总量相等的单独的源自胎盘的干细胞或单独的第二来源干细胞，该比率在克隆形成单位测试中产生更多数量的克隆形成单位，或者当移植给接受者时改善移植后着床。

优选地，干细胞库中的源自胎盘的干细胞通过至少一个HLA标记被表征。在优选的实施方案中，该库包含HLA表征的源自胎盘的干细胞的多个单位。在一个实施方案中，本发明提供了干细胞库，其包含多个单位的源自胎盘的干细胞，其中所述的源自胎盘的干细胞通过至少一个HLA标记识别。在具体实施方案中，所述源自胎盘的干细胞从胎盘灌注液中分离。在另一个具体实施方案中，所述源自胎盘的干细胞是被包含在从胎盘灌注液中分离的有核细胞群落内。在另一个具体实施方案中，所述源自胎盘的干细胞是CD34⁺干细胞。在另一个具体实施方案中，所述源自胎盘的干细胞CD105或CD73阳性，或者结合抗体SH2、SH3和/或SH4。在另一个具体实施方案中，所述源自胎盘的干细胞OCT-4和/或HLA-G阳性。

在一个实施方案中，本发明的干细胞库包含多个单位的血液或源自血液的干细胞，例如胎盘血或脐带血，或者从脐带血或胎盘血中获得的干细胞。优选地，至少一个、并且优选大多数包含在干细胞库内的血液单位或源自血液的干细胞单位是或者可以与至少一个或者优选大多数包含在该库之内的源自胎盘的干细胞单位是HLA匹配的。因此，在另一个具体实施方案中，所述干细胞库进一步包含多个单位的血液或源自血液的干细胞。在另一个具体实施方案中，所述多个单位的血液或源自血液的干细胞中的至少一个单位通过至少一个HLA标记被识别，该标记被所述多个单位的源自胎盘的干细胞中的一个单位享有。在另一个具体实施方案中，所述多个单位的胎盘血或脐带血内的多数单位通过HLA标记被识别，该标记被所述多个单位的源自胎盘的干细胞内的多数单位享有。

为了易于识别和组合引入特定个体中，包含在干细胞库内的源自胎盘的干细胞单位和源自血液的干细胞单位优选地被编号和交叉匹配。例如，具有特定HLA标记、或者特殊HLA标记图谱的特定个体，可以匹配于一个或多个单位的源自胎盘的干细胞，且优选地，一个或多个单位的源自血液的干细胞，例如脐带血或胎盘血。优选地，在施用给所述个体前，源自胎盘的干细胞和血液干细胞被组合以形成本发明的组合干细胞群落。这样的组合干细胞群落可以依照本文中其它地方描述的方法来制备。

干细胞库可以包含从任何数量的个体中获得的源自胎盘的干细胞和/或匹配的血液单位。在各种实施方案中，本发明的干细胞库可以包含胎盘干细胞单位和/或血液单位，例如胎盘血和/或脐带血，从至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、或者1000000个或更多的个体中获得。

5.7 试剂盒

本发明进一步提供了可用于识别和/或制备本发明的组合干细胞群落的试剂盒。这样的试剂盒让使用者能够确定胎盘干细胞和第二来源干细胞用于制备组合干细胞群落的适当比率。这样的试剂盒可以被用来制备组合干细胞群落，该组合干细胞群落反映用来制备该组合该细胞群落的胎盘干细胞和第二来源干细胞的单个单位或多个单位的生理学状况。特别地，这样的试剂盒让使用者能够使用胎盘干细胞和第二来源干细胞进行克隆形成单位测试。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，该试剂盒在一个密封容器中包含胎盘干细胞群落和多个适合进行克隆形成测试的容器。在具体实施方案中，所述多个容器是组织培养板上的多个孔。所述板可以包含至少8个、至少12个、至少24个、至少48个、至少96个、或者至少128个孔。

在另一个具体实施方案中，所述试剂盒包含联合培养胎盘干细胞和第二来源干细胞的说明书。在更加具体的实施方案中，所述说明书包含培养所述胎盘干细胞和所述第二来源干细胞以制备克隆形成单位的说明书。在另一个更加具体的实施方案中，所述说明书包含以多个比率联合培养所述胎盘干细胞和所述第二来源干细胞的说明书以及筛选所述多个比率中的一个的说明书。

在另一个具体实施方案中，所述试剂盒包含一个或多个容器的适合分离干细胞的培养基。在另一个具体实施方案中，所述试剂盒包含一个或多个容器的适合培养干细胞和/或分化干细胞成为克隆形成单位的培养基。在更加具体的实施方案中，所述培养基是基于甲基纤维素或者基于淀粉的培养基。在另一个更加具体的实施方案中，所述培养基是适合培养干细胞的培养基。在甚至更加具体的实施方案中，所述培养基是Methocult GF⁺ H4435培养基、补充了2％胎牛血清和1％ Stemspan CC100细胞因子混合物的RPMI 1640培养基、Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM)、或者Iscove’s改良的Dulbecco’s培养基(IMDM)。

在其它具体实施方案中，试剂盒包含计分网格，其中所述的计分网格有助于计数克隆形成单位。在另一个更加具体的实施方案中，所述试剂盒包含血球计数器。

在另一个具体实施方案中，试剂盒包含适合以如上所述识别的比率组合和储存胎盘干细胞和第二来源干细胞的容器。在更加具体的实施方案中，所述容器是血袋。

在各种其它的实施方案中，试剂盒包含一或多个一次性物品(例如，手套、小毛巾等)、用于记录结果的日志、容器标签等。

在另一个具体实施方案中，所述试剂盒包含统计软件，用于确定胎盘干细胞和第二来源干细胞的多个比率中与所述多个比率中任何其它比率相比产生显著更多数量的克隆形成单位的比率。

6.实施例

6.1 实施例1：体外克隆形成单位测试

总的有核细胞从单位脐带血中通过Hetastarch分离法分离。总的有核的胎盘细胞从750毫升胎盘灌注液中通过Ficoll分离获得。来自胎盘和脐带血的总的有核细胞在35mm培养皿中在Methocult GF⁺ H4435培养基(Stem CellTechnologies，Vancouver，加拿大)、或者补充了2％胎牛血清和1％ StemspanCC100细胞因子混合物的RPMI 1640培养基(Stem Cell Technologies，Vancouver，加拿大)中组合，重复三次。细胞以至少两个比率组合(例如，2×10⁵：2×10⁵，1×10⁵：3×10⁵，3×10⁵：1×10⁵)，并且培养十四天。然后在相差显微镜下检查细胞的形态，并且记录克隆形成单位(例如，CFU-GM、CFU-L、CFU-M、CFU-G、CFU-DC、CFU-GEMM、CFU-E)的总数。然后确定哪个比率产生了最高数量的克隆形成单位。

6.2 实施例2：使用造血干细胞的联合培养测试

10个HLA/捐赠体匹配的胎盘灌注液和脐带血单位被解冻，并且总的有核细胞(TNC)在Cell-Dyn 1700(Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)上被计数.在35mm培养皿中，Methocult GF⁺ H4435培养基(Stem Cell Technologies，Vancouver，加拿大)中，进行联合培养实验的CFU测试，重复三次。单核细胞接种如下：单独的源自胎盘灌注液的干细胞(PP)为50×10³个/毫升/培养皿(低密度接种组)、250×10³个/毫升/培养皿(中等密度接种组)、和5000×10³个/毫升/培养皿(高密度接种组)；单独的源自脐带血的干细胞(CB)为50×10³个/毫升/培养皿；而联合培养的源自胎盘灌注液的干细胞和源自脐带血的干细胞，为50×10³个/毫升/培养皿的源自脐带血的干细胞和50×10³个/毫升/培养皿、250×10³个/毫升/培养皿、以及5000×10³个/毫升/培养皿的源自胎盘灌注液的干细胞的组合。克隆形成单位测试在接种后的第14天读取。基于以下公式计算克隆形成单位总数量的增加：总的克隆形成单位增加％＝CB/PP-(CB+PP)/(CB/PP)×100。

总数为10个的匹配的CB和PP样本被联合培养。在10个联合培养中的4个里，在每个培养皿的计数中，相对于单独的CB或者PP培养，总的CFU活性增加。总的克隆形成单位的活性增加的百分比，在低密度接种组中在7.1％到43.1％之间变化；在中等密度接种组中在14.9％到42.1％之间变化；而在高密度接种组中在24.4％到43.8％之间变化。

6.3 实施例3：临床前研究以通过评估SCID重建细胞活性来评估人胎盘灌注液和脐带血的造血重建活性

6.3.1 简介

在使用免疫缺陷的NOD/SCID小鼠异源基因移植模型中，使用定量评估来评价UCB和HPSC中的细胞的干细胞性质。在此报告的是初始实验的结果，通过限制性稀释移植研究来确定UCB和HPSC中的NOD/SCID重建细胞的频率和绝对数量。

6.3.2 材料和方法

6.3.2.1 UCB单位的收集和冷冻储存

简言之，在获得母亲的知情同意后，在医院里，用包含柠檬酸盐/磷酸盐/葡萄糖溶液的三袋系统采集UCB。在血液收集的48小时之内，在室温下储存和处理这些单位。用基于Hetastarch的方法以减少体积和去除RBC。最后TNC在冷冻袋中在LN2柜中气相冷冻，该冷冻袋包含40毫升的10％DMSO和自体同源血浆。

6.3.2.2 胎盘灌注和HPSC单位的冷冻储存

依照美国专利申请公开号2002/0123141和2003/0032179中(各自在此全部引入本文作为参考)披露的方法通过胎盘灌注收集胎盘干细胞。简言之，来自脐带血捐赠体的胎盘排干脐带血，并用0.9％NaCl溶液在控制压力下灌注。获得总量为750毫升的灌注液。集中细胞，并通过梯度分离法(Ficoll-Hypaque)分离以去除RBC和细胞碎片。

6.3.2.3 细胞计数和生存能力

用自动化细胞分析器(Cell-Dyn 1700或Cell-Dyn 3200，Abbott；Wiesbaden，德国)和手动计数来进行细胞计数。使用台盼蓝排除法来确定细胞的生存能力。

6.3.2.4 脐带血(UCB)和胎盘灌注液(HPSC)单位的表型

UCB和HPSC的单一捐赠体匹配单位被保持在液氮中直到使用。在移植的当天，该单位被解冻。使用台盼蓝法确定新鲜解冻的UCB和HPSC单位的生存能力。进行总的有核细胞的解冻后恢复。在移植前，1等分(0.5毫升)的新鲜解冻细胞被用来对以下细胞表面标记作FACS分析：CD34、CD38、CD33、CD14、CD7、CD3、CD56、CD10和CD19。

6.3.2.5 限制性稀释NOD/SCID重建细胞测试

对8到10周大的NOD/SCID小鼠用限制性稀释SCID重建细胞(SRC)测试进行定量研究。在移植前，小鼠被来自线性加速器的辐射在暴露率20cGy/分钟下辐射325-350cGy。然后，小鼠经由尾静脉外侧静脉移植200μl来自脐带血、或胎盘灌注液、或脐带血和胎盘灌注液组合的细胞。移植包含大约2-10×10⁵个干细胞/千克(未扩增的)或1-2×10⁶个干细胞/千克(扩增的)。使用四个细胞剂量以计算重建细胞的频率并移植6只小鼠/组。然后在移植后3周和移植后10周分析小鼠的人类细胞移植后着床。大腿骨中收集25μl骨髓抽样，从中获得细胞，然后通过FACS分析来分析人类淋巴-骨髓移植后着床。对于每一个抽样，准备包含大约30-40μl PBS的28号针头结核菌素注射器。在10周，杀死小鼠，并且从两条大腿骨、两条胫骨和胸腺中收获细胞供移植后着床分析。此外，在进行的第二个实验中，对最高细胞剂量组的所有小鼠进行尸体检验，并且收集组织供组织学和人类细胞的存在的检验。收集的组织包括：脾脏、肝脏、肺、大脑、心脏、骨骼肌、肾脏、和胸腺。移植后着床被定义为≥0.5％的CD45⁺细胞。

6.3.3 结果

6.3.3.1 实验中使用的UCB和HPSC单位的TNC、生存能力和TNC恢复

两个匹配的HPSC单位和与它们匹配的UCB单位在每个实验中被独立使用。表1显示这些细胞的TNC和解冻后的生存能力以及TNC恢复速度。两个UCB单位分别具有1237×10⁶个和778×10⁶个TNC和82％和83％的生存能力。相对于UCB单位，HPSC单位具有较低的TNC数(752.2×10⁶个和661.5×10⁶个)和生存能力(分别是67％和66％)。

表1：在NOD/SCID BTM移植后着床实验中使用的两个匹配胎盘和UCB单位的TNC和生存能力

	实验1 UCB	实验1 PP	实验2 UCB	实验2 PP
	实验1 UCB	实验1 PP	实验2 UCB	实验2 PP	冷冻前TNC(×10⁶个)	1237	752.5	778.0	661.5
解冻后生存能力	83％	67％	82％	66％	冷冻前TNC(×10⁶个)	1237	752.5	778.0	661.5
解冻后生存能力	83％	67％	82％	66％	解冻后TNC恢复	99％	53％	>100％	>100％

6.3.3.2 UCB和HPSC的表型分析

表2简述了脐带血和胎盘灌注液细胞移植前的表型分析结果。与预期的一致，实验1和实验2的脐带血捐赠体之间的CD34⁺细胞存在不同，实验1中有0.56％的细胞是CD34⁺，而实验2中有1.67％的CD34⁺细胞。这些不同反映了在捐赠体之间脐带血中TNC的自然生存能力和CD34⁺细胞的数量。在任一例子中，脐带血中存在的CD34⁺细胞比胎盘灌注液多。脐带血的骨髓标记(CD33和CD14)低，但是淋巴标记(CD3和CD7)高。HPSC中表达CD10的细胞数量明显比脐带血中高。

表2：在NOD/SCID小鼠BTM移植后着床实验中使用的匹配的UCB和HPSC单位的FACS分析

	实验1 UCB	实验1 PP	实验2 UCB	实验2 PP
	实验1 UCB	实验1 PP	实验2 UCB	实验2 PP	CD34+	0.56％	0.28％	1.67％	0.46％
CD34+CD38+	0.56％	0.28％	1.67％	0.46％	CD34+	0.56％	0.28％	1.67％	0.46％
CD34+CD38+	0.56％	0.28％	1.67％	0.46％	CD33+	26.0％	60％	28.00％	76.00％
CD14+	17.0％	46％	22.40％	58.40％	CD33+	26.0％	60％	28.00％	76.00％
CD14+	17.0％	46％	22.40％	58.40％	CD7+	38.5％	10.5％	63.00％	18.00％
CD3+	35.2％	11.8％	72.00％	29.00％	CD7+	38.5％	10.5％	63.00％	18.00％
CD3+	35.2％	11.8％	72.00％	29.00％	CD56+	7.7％	3.7％	16.50％	12.00％
CD10+	16.8％	53.0％	9.50％	59.00％	CD56+	7.7％	3.7％	16.50％	12.00％
CD10+	16.8％	53.0％	9.50％	59.00％	CD19+	15.6％	11.0％	8.80％	13.00％

6.3.3.3 在NOD/SCID小鼠中人类细胞的移植后着床

表3显示了在两个独立实验(实验1和2)中注入NOD/SCID小鼠中的TNC细胞剂量。在两个例子中，在所有接受了UCB或HPSC的小鼠中使用相等数量的来自UCB或HPSC的CD34⁺细胞。获得该CD34⁺细胞数量所需的TNC细胞剂量被注入小鼠。每剂量组使用6只小鼠。

表3：在NOD/SCID小鼠中移植后着床的TNC细胞剂量

A.实验1

B.实验2

图1显示了两个独立实验中使用CD45抗体对小鼠骨髓中移植后着床的人类细胞的FACS分析概述。在3周和10周时，通过FACS分析小鼠骨髓抽样中人类CD45⁺细胞的存在。在两个时间点，在单独接受了胎盘细胞的任何细胞剂量组的小鼠中，发现非常低的或不可检测数量的人类CD45⁺细胞。相反地，在两个时间点，在单独移植了脐带血和移植了脐带血与胎盘灌注液的组合的小鼠中观察到人类细胞的移植后着床。在3周时，在脐带血组、和脐带血与胎盘灌注液的组合组之间，没有观察到人类移植后着床的水平的显著差别。但是，在10周时，相对于单独接受了脐带血干细胞或者单独接受了胎盘干细胞的小鼠中的移植后着床，在接受了脐带血细胞和胎盘灌注液两者的小鼠中，人类细胞移植后着床的程度有显著的提高(实验1中p＝0.3；实验2中p＝0.0002)，表明胎盘干细胞提高了来自第二来源例如脐带血的干细胞的移植后着床。

为了确定人类移植后着床细胞是否包括淋巴-骨髓谱系，FACS分析也被用来分析来自小鼠骨髓的CD45⁺细胞中CD19、CD33和CD7的联合表达。这个实验的结果在图2中显示。这些结果显示，接受UCB和UCB+HPSC的小鼠的骨髓包含移植后着床的淋巴细胞和骨髓细胞。

6.3.3.4 SCID重建细胞(SRC)频率

SCID重建细胞频率是指能够移植后着床和重建个体造血系统的原始造血干细胞与移植细胞总量的比率。该比率对细胞群落向例如被辐射的个体提供可移植后着床的细胞的相对能力提供了指示。表4列出了实验2的SRC计算结果(见上)。通过限制性稀释移植和使用来自StemCell Technologies的L-Calc软件计算这些数字。这些研究并没有显示SRC频率的提高，但如上所述，确实显示了当脐带血和胎盘灌注液的共同输注时，总的人类移植后着床的显著提高。因此，在这种情况下，数据提示胎盘灌注液和UCB的共同输注提高干细胞的移植后着床，而不是增加总的干细胞数量。

表4：对UCB和HPSC的SRC频率评估

	频率	范围
	频率	范围		3周	3周
UCB	1/17,791,258	12,060,000-26,245,000		3周	3周
UCB	1/17,791,258	12,060,000-26,245,000	PP	NA	NA
UCB+PP	1/28,728,138	19,782,000-41,719,000	PP	NA	NA
UCB+PP	1/28,728,138	19,782,000-41,719,000		10周	10周
UCB	1/2,859,018	1,867,000-4,376,000		10周	10周
UCB	1/2,859,018	1,867,000-4,376,000	PP	NA	NA
UCB+PP	1/7,864,065	5,186,000-11,923,000	PP	NA	NA

6.3.3.5 在非骨髓组织中人类细胞的移植后着床

为了确定来自UCB、HPSC或UCB+HPSC的人类细胞是否移植后着床到骨髓以外的小鼠组织中，通过FACS分析确定实验小鼠胸腺中人类细胞的存在，并且在小鼠脾脏组织上进行免疫组织化学染色。

在实验1中，来自小鼠胸腺细胞的FACS分析显示6只联合注入了UCB和HPSC的小鼠中的1只显示了0.8％的人类CD45⁺细胞。在实验2中，6只注入了UCB(剂量2)的小鼠中的1只显示了8％的CD45⁺细胞，但是没有CD3⁺或CD7⁺细胞。然而，在UCB+HPSC组，所有6只小鼠显示了3-23％CD45⁺细胞的人类移植后着床，而且这些小鼠中的1只显示了CD3/CD7阳性细胞。

通过识别人类蛋白而不是小鼠蛋白的抗-波形蛋白和抗-CD45抗体的染色，检查小鼠脾脏的薄切片以检测人类细胞的存在。可同时识别人类和小鼠蛋白的平滑肌肌动蛋白抗体被用作阳性对照，而IgG1和IgG2a同型抗体被用作阴性对照。每个移植后着床组的染色结果在表5中显示。

表5.通过免疫组织化学检测NOD/SCID小鼠脾脏中的人类细胞

小鼠编号	产品	波形蛋白	CD45	平滑肌肌动蛋白	IgG1	IgG2a
小鼠编号	产品	波形蛋白	CD45	平滑肌肌动蛋白	IgG1	IgG2a	304	UCB-1和PP-1	3+	2+	2+	-	-
305	UCB-1和PP-1	2+	1+(少)	2+	-	-	304	UCB-1和PP-1	3+	2+	2+	-	-
305	UCB-1和PP-1	2+	1+(少)	2+	-	-	306	UCB-1和PP-1	3+	2+	2+	-	-
307	UCB-1和PP-1	3+	2+	2+	-	-	306	UCB-1和PP-1	3+	2+	2+	-	-
307	UCB-1和PP-1	3+	2+	2+	-	-	308	UCB-1和PP-1	3+	2+	2+	-	-
350	PP-1	-	-	2+	-	-	308	UCB-1和PP-1	3+	2+	2+	-	-
350	PP-1	-	-	2+	-	-	351	PP-1	-	-	2+	-	-
352	PP-1	-	-	2+	-	-	351	PP-1	-	-	2+	-	-
352	PP-1	-	-	2+	-	-	353	PP-1	-	-	2+	-	-
354	PP-1	±(非常少)	-	2+	-	-	353	PP-1	-	-	2+	-	-
354	PP-1	±(非常少)	-	2+	-	-	355	PP-1	-	-	2+	-	-
370	UCB-1	2+	-	2+	-	-	355	PP-1	-	-	2+	-	-
370	UCB-1	2+	-	2+	-	-	371	UCB-1	1+(少)	-	2+	-	-
372	UCB-1	2+	1+(少)	2+	-	-	371	UCB-1	1+(少)	-	2+	-	-
372	UCB-1	2+	1+(少)	2+	-	-	373	UCB-1	±(非常少)	-	2+	-	-
374	UCB-1	1+(少)	-	2+	-	-	373	UCB-1	±(非常少)	-	2+	-	-
374	UCB-1	1+(少)	-	2+	-	-	375	UCB-1	1+(少)	-	2+	-	-
人扁桃腺	NA	3+	3+	2+	-	-	375	UCB-1	1+(少)	-	2+	-	-

在所有单独接受UCB细胞的小鼠中可检测到小鼠脾脏中表达人类波形蛋白(间充质细胞标记)的细胞。在单独接受HPSC的小鼠中几乎不能检测到波形蛋白染色。然而，在同时接受UCB和HPSC细胞的小鼠中检测到显著高的波形蛋白染色水平。当脾脏组织被CD45(造血细胞标记)抗体染色时，发现类似的结果。小鼠脾脏的平滑肌肌动蛋白(阳性对照)染色显示了所有组织的相同染色水平。同型阴性对照抗体未对组织染色。

6.3.4 讨论

在这些实验中，来自同一捐赠体的胎盘细胞和脐带血细胞的联合输注与单独输注脐带血细胞或胎盘细胞相比，在10周后显示了小鼠中人类干细胞移植后着床水平的提高。在NOD/SCID小鼠中，也在组织包括胸腺和脾脏中发现提高的人类细胞移植后着床。据显示，移植后着床细胞包括骨髓细胞和淋巴细胞两种。在小鼠脾脏中，移植后着床的人类细胞对波形蛋白染色呈阳性，说明UCB-HPSC联合注入提高了人类干细胞的移植后着床。

6.4 实施例4：在NOD/SCID小鼠中的移植后着床

进行剂量范围的初步研究，其中人类脐带血细胞和胎盘细胞的组合以不同比率施用给被半致死辐射的NOD/SCID小鼠，且在该研究中确定人类细移植后着床和重建的程度。

人类移植移植后着床的模型，六组NOD/SCID小鼠被400cGy半致死辐射，且用脐带血细胞和胎盘细胞的三个剂量中的一个以脐带血细胞与胎盘细胞3:1或者1:1的比率静脉给药，所述剂量基于活的总有核细胞的数量。在组合和注射后对细胞进行FACS分析。施用后10周，通过血液和骨髓取样，监测小鼠的人类细胞移植后着床。

对小鼠施用表6所示的脐带血细胞和胎盘细胞的一个组合：

表6：施用给NOD/SCID小鼠的脐带血细胞和胎盘细胞的组合

^*细胞比率子集在每个剂量水平包含单一单位(即组1和组4使用同样的单位，组2和组5使用同样的单位，以及组3和组6使用同样的单位)。在最高的剂量，需要汇总。

材料和方法

动物操作依照DHHS公布号(NIH)86-23(修订版，1985)和美国农业部的Animal Welfare Act(7U.S.C.2131)，1985和Aminal Welfare Standard，并入9C.F.R.第三部分，1991。

全部为7到10周大的NOD/SCID雄性小鼠(Taconic Laboratory，Germantown，New York)，使用¹³⁷铯放射源以大约171 cGy/分钟的速率半致死辐射400cGy。在2.34分钟的辐射时间间隔中，未麻醉的动物被放置在Mark I型68A铯辐照器中。

人胎盘细胞和脐带血细胞通过正压力收集(PPC)或者负压力收集(NPC)分离，而且在施用前冷冻储存。细胞在37℃水浴中解冻并稀释，然后在湿冰上储存。细胞的稀释液包含5％葡聚糖(Baxter)和2.5％人血清白蛋白(Bayer)。对细胞计数并且评估生存能力。以单一剂量经每只小鼠的尾静脉施用细胞。小鼠居住在标准条件下，并且在辐射后的十周处死小鼠来分析移植后着床。

为了证明人类细胞的移植后着床，通过评估CD45⁺细胞的频率，以及CD34⁺、CD38⁺、CD19⁺、CD33⁺、CD7⁺、和CD3⁺的细胞的频率，对骨髓和胸腺进行FACS分析。细胞被计数，而且每孔大约500,000个细胞被染色，每个样本两孔。以1μg/百万个细胞的浓度加入小鼠Fc封闭剂(提纯的小鼠IgG)以减少非特异性结合。以约1μg/百万个细胞的浓度加入抗体。一个孔包含针对CD45、CD34、CD38和CD19的抗体，而另一个孔包含针对CD45、CD33、CD7和CD3的抗体。也以约1μg/百万个细胞的浓度使用每个抗体的同型对照。抗体染色后，细胞在2-8℃培养30分钟，用含1％牛血清白蛋白和0.05％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液冲洗3次，用1％多聚甲醛固定，并在2-8℃下在黑暗中储存直到分析。使用Becton-Dickinson FACS Calibur分析样本，其具有前向和侧向散射门，以排除碎片和凝聚块。通过同型对照确定最佳的电压设置和补偿。

使用人-特异性波形蛋白抗体在小鼠胸骨的石蜡切片上进行波形蛋白免疫染色。使用如下等级半定量进行评分：

分值＝0：没有阳性细胞

分值＝0.5：一个或两个阳性细胞，可能阳性但不能作为背景排除

分值＝1：2-20个零散的阳性细胞；

分值＝2：大约20-100个零散的或聚集的阳性细胞，遍布组织；

分值＝3：多于100个阳性细胞，但是构成少于50％的组织；

分值＝4：多于50％的骨髓细胞是阳性的。

结果：

在表7中总结重建数据，并在表8中总结FACS数据。在所有动物组中，重建在一定程度上是明显的，并且该效应呈现剂量依赖性。对比两个不同比率之间对各个标记呈阳性的细胞的平均百分比。在两个比率之间，CD7、CD33、和CD34显示了统计显著性差别，同时，跟3:1的比率相比，1:1的比率显示了较低百分比的阳性细胞。

波形蛋白染色。几乎所有的胸骨切片都是由5-6个基本为矩形的髓腔组成，在大小和形状上显示某些差异，而且被骨组织和软骨组织环绕。在骨髓中观察到的所有的波形蛋白阳性细胞均伴随着外周处于各个阶段或成熟期的红系和骨髓前体。在阴性对照中没有观察到波形蛋白阳性细胞。每个髓腔分别计分。通常地，波形蛋白分值与注射细胞剂量充分相关。具有最高数量干细胞的组3和组6有类似的高分3.4。在低剂量和中等剂量水平，在注射了同样数量细胞的组之间有轻微的不同。例如，组4(脐带血细胞与胎盘细胞比率3:1)的平均分数略高于组1(比率1:1)，而组5(比率3:1)的平均分数略高于组2(1:1)。

结论

对骨髓的流式细胞术和免疫组织化学的评估证实了细胞剂量依赖方式的实质性重建。两个细胞比率之间的差别对于CD7、CD33和CD34移植后着床达到了统计显著性的水平。当显著差别存在时，接受脐带血与胎盘细胞比率为3:1的动物比用1:1比率治疗的动物具有更高程度的重建。

表7：骨髓重建

组	胫骨	大腿骨
组	胫骨	大腿骨	1	9/10	6/10
2	6/7	5/7	1	9/10	6/10
2	6/7	5/7	3	9/9	9/9
4	4/10	5/10	3	9/9	9/9
4	4/10	5/10	5	7/7	7/7
6	9/9	9/9	5	7/7	7/7

分数的分子指示了每组中CD45⁺细胞的百分比大于或者等于0.5％的动物数量。分母指示了每组中进行流式细胞术的动物数量。

6.5 实施例5：NOD/SCID小鼠中的造血重建

用CD34⁺的胎盘干细胞(HPDSC)所进行的克隆形成测试证明了在胎盘灌注液中存在功能性造血干细胞和祖细胞。此外，有数据提示HPDSC包含其它新型干细胞群落，相对于脐带血(UCB)，其具有更多的未成熟特征。

使用免疫缺陷的NOD/SCID小鼠进行实验以确定在异源基因移植模型中胎盘灌注液干细胞的移植后着床潜能。研究的第一部分评估了单独的胎盘灌注液细胞和单独的脐带血细胞或其组合的的移植后着床潜能，对照组接受纯化的CD34⁺细胞。研究的第二部分评估了胎盘灌注液干细胞在提高移植后着床方面的影响是否归因于重建细胞数量的增加或者协助者(facilitator)细胞的存在。在这个实验中，三组小鼠分别接受了单独的UCB、单独的HPDSC、或HPDSC和UCB的组合。每组小鼠接受了同样数量的CD34⁺细胞。独立的小鼠组也接受了HPDSC和UCB的组合，其中HPDSC或者UCB细胞已经被辐射过以阻止重建能力但仍保留任何促进者效应。因为已知在脐带血和胎盘灌注液的各单位之间存在SCID重建能力的差异，在这些实验中，使用了多重汇总的单位。

方法和实验设计

从Jackson实验室获得8到10周大的雄性NOD/SCID小鼠。依照标准实验室操作无菌处理小鼠并且将其关在微型的隔离笼中。随意提供给小鼠水和食物。

冷冻袋装HPDSC和冷冻袋装人脐带血(UCB)由Celgene CellularTherapeutics提供。

在移植的当天，从液氮中移出并解冻HPDSC和UCB单位。在冲洗后，确定各单位的总的有核细胞数量(TNC)和生存能力。在重建研究的第二部分，HPDSC和UCB细胞被解冻，并且用与第一部分类似的方法制备，除了某些剂量组中HPDSC或UCB细胞被辐射。通过混合适当数量的HPDSC和UCB细胞，制备HPDSC和UCB细胞制剂的组合。

细胞计数通过自动细胞分析仪(Cell-Dyne 1700或CellDyne 320，Abbot；Wiesbaden，德国)进行。细胞制剂的生存能力通过台盼蓝排除法来确定。

在8到10周大的NOD/SCID小鼠中进行SCID细胞重建测试。在移植前，小鼠被来自线性加速器的辐射以暴露速率20cGy/分钟辐射325-350cGy。然后小鼠经由尾静脉外侧静脉移植200μl UCB、或者人胎盘灌注液细胞、或者UCB和人胎盘灌注液细胞的组合。在移植后4周和12周进行移植后着床分析。

通过流式细胞术分析对人类细胞移植后着床进行分析。简单地说，样本用抗体染色，1％多聚甲醛固定，并且使用Becton Dickson FACS Calibur来分析人CD45和其它谱系细胞表面标记组，包括CD34、CD7、CD33、CD10、CD7、和CD3。通过同型对照，确定最佳电压设置和补偿。用从麻醉的小鼠中获得的骨髓抽样进行4周移植后着床分析，且在12周将动物处死并大腿骨和胫骨中冲洗出骨髓细胞。如果人CD45的百分比大于0.5％，小鼠就被认为是被移植后着床的。

实验设计：在移植的当天，辐射动物，并将动物随机分入不同的治疗组，如表9和10所示：

表9：重建研究部分(A)

组	小鼠/组	剂量体积	CD34数/小鼠实际值
组	小鼠/组	剂量体积	CD34数/小鼠实际值	UCB	13	200	1×10⁵
HPDSC	13	200	5.1×10⁴	UCB	13	200	1×10⁵
HPDSC	13	200	5.1×10⁴	UCB+HPDSC	13	200	1×10⁵+5.1×10⁴
高对照	6	200	2.5×10⁵	UCB+HPDSC	13	200	1×10⁵+5.1×10⁴

低对照

5

200

1.25×10⁵

表10：重建研究部分(B)

组	小鼠/组	CD34数/小鼠-估计值	CD34数/小鼠实际值	TNC/小鼠实际值(10⁶)
组	小鼠/组	CD34数/小鼠-估计值	CD34数/小鼠实际值	TNC/小鼠实际值(10⁶)	UCB	15	3.0×10⁵ CD34/小鼠	2.7×10⁵ CD34/小鼠	28.4
PP1	15	3.0×10⁵ CD34/小鼠	2.6×10⁵ CD34/小鼠	17.72	UCB	15	3.0×10⁵ CD34/小鼠	2.7×10⁵ CD34/小鼠	28.4
PP1	15	3.0×10⁵ CD34/小鼠	2.6×10⁵ CD34/小鼠	17.72	UCB+PP1(同样的总CD34细胞剂量)	15	3.0×10⁵ CD34/小鼠(1.5+1.5)	2.7×10⁵ CD34/小鼠(1.4+1.3)	14.8+8.86
UCBirr+PP1(同样的总CD34细胞剂量)	15	3.0×10⁵ CD34/小鼠(1.5+1.5)	2.7×10⁵ CD34/小鼠(1.4+1.3)	14.8+8.86	UCB+PP1(同样的总CD34细胞剂量)	15	3.0×10⁵ CD34/小鼠(1.5+1.5)	2.7×10⁵ CD34/小鼠(1.4+1.3)	14.8+8.86
UCBirr+PP1(同样的总CD34细胞剂量)	15	3.0×10⁵ CD34/小鼠(1.5+1.5)	2.7×10⁵ CD34/小鼠(1.4+1.3)	14.8+8.86	UCB+PP1irr(同样的总CD34细胞剂量)	15	3.0×10⁵ CD34/小鼠(1.5+1.5)	2.7×10⁵ CD34/小鼠(1.4+1.3)	14.8+8.86
对照	5	3.0×10⁵ CD34/小鼠			UCB+PP1irr(同样的总CD34细胞剂量)	15	3.0×10⁵ CD34/小鼠(1.5+1.5)	2.7×10⁵ CD34/小鼠(1.4+1.3)	14.8+8.86

irr＝已辐射的细胞

结果

解冻后细胞生存能力：对于重建研究中使用的单位，UCB和HPDSC的解冻后生存能力大于70％。

NOD/SCID小鼠中人细胞的移植后着床：在输注后四周，在所有组包括单独的HPDSC组中，观察到人类细胞的移植后着床(>0.5％CD45)，UCB组6只小鼠中有2只移植后着床呈阳性(平均CD45％是0.62％)、HPDSC组8只小鼠中有2只(平均CD45％是0.52％)、而同时接受UCB和HPDSC的组中，9只小鼠中有8只(平均CD45％是2.84％)移植后着床呈阳性的。当比较单独的HPDSC组和UCB+HPDSC组(p＝0.006)、还有UCB组和UCB+HPDSC组(p＝0.02)时，可观察到人类移植后着床的显著增长。在移植后12周，在单独的HPDSC组，持续的移植后着床不再被观察到，8只动物中，只有1只移植后着床(CD45％>0.5％)。相反地，尽管单独接受了UCB的小鼠与UCB+HPDSC组小鼠之间在人类移植后着床的整体水平上没有观察到统计差异性(平均CD45％分别是15.1％和13.1％；p＝0.82)，但是，相对于UCB+HPDSC组中9只小鼠中有9只被移植后着床，UCB组6只小鼠中只有3只被移植后着床。人类细胞移植后着床的小鼠也显示了淋巴-骨髓和其它谱系的细胞类型的移植后着床(表11和表12)。这些数据表示，相对于单独的HPDSC或单独的UCB，HPDSC和UCB的联合注入导致短期和长期的人类移植后着床的显著提高。

表11：在单独地或组合地静脉移植源自人类胎盘的干细胞和脐带血4周后，淋巴-骨髓和其它谱系标记的细胞在NOD/SCID小鼠骨髓中移植后着床的百分比

人类细胞移植后着床百分比	UCB	HPDSC	UCB+HPDSC	对照组(高)	对照组(低)
人类细胞移植后着床百分比	UCB	HPDSC	UCB+HPDSC	对照组(高)	对照组(低)	CD45	0.62±0.92	0.52±0.76	2.84±1.89	1.33±0.90	0.09±0.14
CD33	0.51±0.78	0.43±0.67	2.41±1.52	0.91±0.68	0.02±0.5	CD45	0.62±0.92	0.52±0.76	2.84±1.89	1.33±0.90	0.09±0.14
CD33	0.51±0.78	0.43±0.67	2.41±1.52	0.91±0.68	0.02±0.5	CD19	0.17±0.24	0.15±0.31	0.76±1.0	0.44±0.43	0.04±0.08

表12：在单独地或组合地静脉移植源自人类胎盘的干细胞和脐带血12周后，淋巴-骨髓和其它谱系标记的细胞在NOD/SCID小鼠骨髓中移植后着床的百分比

人类细胞移植后着床百分比	UCB	HPDSC	UCB+HPDSC	对照组(高)	对照组(低)
人类细胞移植后着床百分比	UCB	HPDSC	UCB+HPDSC	对照组(高)	对照组(低)	CD45	15.0±22.09	0.65±1.51	13.09±11.56	11.3±8.11	0.04±0.04
CD34	3.67±5.55	0.21±0.54	3.21±3.41	2.76±2.08	0.01±0.01	CD45	15.0±22.09	0.65±1.51	13.09±11.56	11.3±8.11	0.04±0.04
CD34	3.67±5.55	0.21±0.54	3.21±3.41	2.76±2.08	0.01±0.01	CD33	6.33±9.18	0.40±1.04	5.61±5.19	4.18±3.56	0.01±0.01
CD19	9.96±16.66	0.30±0.70	8.52±9.97	8.02±5.67	0.02±0.03	CD33	6.33±9.18	0.40±1.04	5.61±5.19	4.18±3.56	0.01±0.01
CD19	9.96±16.66	0.30±0.70	8.52±9.97	8.02±5.67	0.02±0.03	CD10	12.02±17.51	0.26±0.59	8.74±10.04	8.28±5.60	0.02±0.02
CD7	1.05±1.65	0.21±0.32	1.01±1.36	1.05±0.78	0.01±0.01	CD10	12.02±17.51	0.26±0.59	8.74±10.04	8.28±5.60	0.02±0.02
CD7	1.05±1.65	0.21±0.32	1.01±1.36	1.05±0.78	0.01±0.01	CD3	0.14±0.15	0.03±0.03	0.10±0.07	0.10±0.06	0.02±0.01

协助者效应：相对于单独的UCB组或者HPDSC组，在UCB+HPDSC组中观察到人类移植后着床提高(表13和14)。此外，尽管接受了辐射过的UCB中HPDSC的那组小鼠与单独接受CB或者CB+PP1的一组小鼠相比，每只小鼠仅接受了一半数量的功能性CD34细胞，但在这个组中存在着相等的人类移植后着床，这提示了HPDSC的协助者功能。

脐带血移植后的延迟移植后着床仍然是一个重大的临床问题，甚至在两倍单位的清髓脐带血移植的病例中，其中嗜中性粒细胞移植后着床的中值时间是大约23天。这些结果也说明需要对HPDSC和单一单位或双倍单位脐带血的联合注入移植作为促进更快速移植后着床的潜在方法进行临床研究。

表13：在单独地或组合地静脉移植源自人类胎盘的干细胞和脐带血4周后，淋巴-骨髓和其它谱系标记的细胞在NOD/SCID小鼠骨髓中移植后着床的百分比

人类细胞移植后着床百分比	UCB	HPDSC	UCB+HPDSC	UCB^irr+HPDSC	UCB+HPDSC^irr	对照组
人类细胞移植后着床百分比	UCB	HPDSC	UCB+HPDSC	UCB^irr+HPDSC	UCB+HPDSC^irr	对照组	CD45	11.0±11.52	0.69±0.70	6.84±6.61	0.31±0.48	16.48±19.62	15.83±11.25
CD34	5.45±5.50	0.34±0.34	3.72±3.82	0.08±0.13	9.43±13.99	6.90±5.32	CD45	11.0±11.52	0.69±0.70	6.84±6.61	0.31±0.48	16.48±19.62	15.83±11.25
CD34	5.45±5.50	0.34±0.34	3.72±3.82	0.08±0.13	9.43±13.99	6.90±5.32	CD33	5.94±5.59	0.52±0.59	5.17±5.26	0.26±0.44	11.79±16.62	6.41±5.10
CD19	5.65±8.07	0.09±0.10	2.06±1.92	0.06±0.10	5.75±5.86	8.23±5.52	CD33	5.94±5.59	0.52±0.59	5.17±5.26	0.26±0.44	11.79±16.62	6.41±5.10

表14：在单独地或组合地静脉移植源自人类胎盘的干细胞和脐带血12周后，淋巴-骨髓和其它谱系标记的细胞在NOD/SCID小鼠骨髓中移植后着床的百分比

人类细胞移植后着床百分比	UCB	HPDSC	UCB+HPDSC	UCB^irr+HPDSC	UCB+HPDSC^irr	对照组
人类细胞移植后着床百分比	UCB	HPDSC	UCB+HPDSC	UCB^irr+HPDSC	UCB+HPDSC^irr	对照组	CD45	41.86±28.70	15.10±23.75	48.29±28.18	0.68±0.66	51.62±29.91	33.37±19.18
CD34	8.78±6.20	2.48±3.35	9.32±7.70	0.08±0.09	8.20±6.38	10.29±5.77	CD45	41.86±28.70	15.10±23.75	48.29±28.18	0.68±0.66	51.62±29.91	33.37±19.18
CD34	8.78±6.20	2.48±3.35	9.32±7.70	0.08±0.09	8.20±6.38	10.29±5.77	CD33	7.98±5.12	2.66±4.01	8.32±6.29	0.17±0.20	6.16±4.35	4.23±2.72
CD19	36.99±25.69	13.48±21.35	41.25±0.49	0.49±0.69	47.04±27.07	28.31±16.69	CD33	7.98±5.12	2.66±4.01	8.32±6.29	0.17±0.20	6.16±4.35	4.23±2.72

6.6 实施例6：使用组合干细胞群落治疗肌萎缩性侧索硬化症

肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，也叫作Lou Gehrig’s症，是一种致命的神经退行性疾病，影响皮层、脑干和脊髓的运动性神经元。ALS影响着20,000美国人，每年在美国出现5,000个新病例。主要的ALS病例是散发的(S-ALS)，尽管～5-10％是遗传的(家族的—F-ALS)。当大脑和脊髓中控制随意运动的特定神经细胞逐渐退化的时候，ALS发生。ALS的主要特征是脊髓的运动性神经元损失，引起它们控制下的肌肉削弱和日渐衰弱导致瘫痪。取决于哪块肌肉首先削弱，ALS以不同的方式表现。ALS发生在中年，男性患病的可能是女性的1.5倍。通常在诊断后的5年之内，ALS是致命的。

ALS有家族型和散发型两种，而且家族型现在已经被联系到几个明确的基因位点上。只有大约5-10％的ALS病例是家族的。这其中，15-20％归因于编码Cu/Zn超氧化物歧化酶1(SOD1)的基因的突变。这似乎是“功能获得(gain-of-function)”的突变，其赋予该酶毒性。发现SOD突变为ALS病因为在了解该疾病的过程中获得进展铺平了道路；该疾病的动物模型现在是可得到的，而且正在发展和验证关于导致细胞死亡的分子事件的假说。

以下给出用组合干细胞群落治疗患有ALS的个体的示例方法。该方法包括通过外围临时导管静脉输液。

患有ALS的个体首先通过标准实验室分析来评估。这些分析可以包括代谢图谱、全血细胞计数、脂质图谱、纤维蛋白原水平、血液的ABO rH分型、肝功能测试、和BUN/肌酸水平确定。个体在移植前一天被通知接受如下药物治疗：苯海拉明(BENADRYL^TM)25mg，一日三次；和强的松10mg。

由胎盘灌注液单位和匹配的脐带血单位(即灌注液从获得脐带血的同一个胎盘中取得)制备组合干细胞群落。从灌注液和脐带血分离总的有核细胞群落，而且各个样本在体外以多个比率测试以确定产生最高数量的克隆形成单位的比率。两个群落以近似于那个比率组合以形成组合干细胞群落。该干细胞群落在移植前在温度大约5℃下保持大约两天。

在具有静脉输液、生理监控、和物理观察的所有必需设备的门诊病人临床中心对个体进行移植。大约移植前一小时，个体接受苯海拉明(BENADRYL^TM)25mg×1次口服；和强的松10mg×1次口服。这是预防性的，意在减少急性过敏反应的可能性。在输液的时候，18G留置的外围静脉线路被放入个体的一个肢体中，而且通过以TKO速率注入D5 1/2生理盐水+20mEq KCl使该线路保持开启。个体在移植前被检查，特别注意心率、呼吸频率、体温。可以进行其它监控，例如心电图和血压测量。

然后组合干细胞群落以每小时大约1-2×10⁹个总的有核细胞的速率注入，输液的总体积是60毫升。基于在小鼠中的临床前研究数据，应该施用的总的细胞为每千克体重2.0-2.5×10⁸个。例如，70千克的个体，应该接受大约14-18×10⁹个总的有核细胞。应该监控个体的过敏反应或超敏性的信号，它们是立即停止注入的信号。

注入后，该个体应该以躺卧位置被监控至少60分钟，在这以后，他或她可以重新开始正常活动。

本发明不限于在此描述的具体实施方案的范围。事实上，基于之前的说说明，本文所述之外的对本发明的各种改进对于本领域技术人员而言是显而易见的。这些改进落在所附权利要求范围之内。

在此引用的所有参考文献，全文引入本文以供参考，并且为所有目的以相同程度被引入，如同每个单独的出版物、专利或者专利申请被专门且单独地指明将为所有目的全文引入本文以供参考一样。

任何出版物的引用是为了引用在申请日之前的披露信息，且不应理解为承认本发明由于之前的发明而无权优先于这些出版物。

Claims

1.识别胎盘干细胞和第二来源干细胞的比率的方法，包含识别胎盘干细胞和第二来源干细胞在细胞总量中的比率，当若干所述的胎盘干细胞和第二来源干细胞在足以形成克隆形成单位的条件和时间下一起培养后，该比率比与所述细胞总量相等的单独的胎盘干细胞或单独的第二来源干细胞生成更多数量的克隆形成单位。

2.权利要求1中的方法，其中所述比率通过以下方法来识别：在足以形成克隆形成单位的条件和时间下以多个比率培养所述的胎盘干细胞和第二来源干细胞；并且识别所述多个比率中制备最高数量的克隆形成单位的比率。

3.权利要求1中的方法，其中所述胎盘干细胞来源于单个胎盘。

4.权利要求1中的方法，其中所述胎盘干细胞来源于多个胎盘。

5.权利要求1中的方法，其中所述胎盘干细胞是来自胎盘灌注液的干细胞。

6.权利要求1中的方法，其中所述第二来源干细胞是源自脐带血的干细胞。

7.权利要求1中的方法，其中所述源自脐带血的细胞是造血干细胞。

8.权利要求1中的方法，其中所述干细胞和第二来源干细胞或祖细胞在悬浮液中组合。

9.权利要求1中的方法，进一步包含向所述组合中加入生物活性分子。

10.权利要求9中的方法，其中所述生物活性分子是细胞因子或者生长因子。

11.权利要求1中的方法，其中所述胎盘干细胞从单个个体中获得。

12.权利要求1中的方法，其中所述胎盘干细胞从多个个体中获得。

13.识别胎盘干细胞和第二来源干细胞的比率的方法，包含在多个动物中以多个比率组合胎盘干细胞和第二来源干细胞；以及在所述多个比率中识别在所述多个动物的至少一个组织中产生最高数量的移植后着床细胞的比率。

14.包含一定比率的源自胎盘的干细胞和第二来源干细胞的干细胞库，该比率在克隆形成单位测试中，比与组合干细胞群落中的细胞数量相等的单独的源自胎盘的干细胞，或者与组合干细胞群落中的细胞数量相等的单独的第二来源干细胞，产生更多数量的克隆形成单位。

15.权利要求14中的干细胞库，其中所述胎盘干细胞是来自胎盘灌注液的干细胞。

16.权利要求14中的干细胞库，其中所述源自胎盘的干细胞与所述第二来源干细胞分开保存。

17.权利要求14中的干细胞库，其中所述比率相对于单独的源自胎盘的干细胞或者单独的第二来源干细胞在体内改善移植后着床。

18.权利要求14中的干细胞库，其中所述比率使用克隆形成单位测试来确定。

19.权利要求14中的干细胞库，其中所述第二来源干细胞是成体干细胞。

20.权利要求14中的干细胞库，其中所述第二来源干细胞是脐带血干细胞、骨髓干细胞、或者间充质干细胞。

21.权利要求13中的干细胞库，其中所述第二来源干细胞是造血干细胞。

22.提供组合干细胞群落的方法，包含以一定比率提供多个单位的源自胎盘的干细胞和多个单位的第二来源干细胞，该比率在克隆形成单位测试中，比与组合干细胞群落中的细胞数量相等的单独的源自胎盘的干细胞，或者与组合干细胞群落中的细胞数量相等的单独的第二来源干细胞，产生更高数量的克隆形成单位。

23.干细胞建库的方法，包含提供多个单位的包含胎盘干细胞和第二来源干细胞的干细胞群落，其中所述组合干细胞群落，相对于与组合干细胞群落中的细胞数量相等的单独的胎盘干细胞，或者与组合干细胞群落中的细胞数量相等的单独的第二来源干细胞，呈现了改善或提高的移植后着床。

24.权利要求23中的方法，其中所述多个单位的干细胞群落通过下述方法产生，该方法包含提供多个单位的胎盘干细胞；提供多个第二来源干细胞；将每个所述的胎盘干细胞单位与第二来源干细胞单位匹配；并且识别所述胎盘干细胞和所述第二来源干细胞的比率，当在可以形成克隆形成单位的条件和时间以若干细胞组合后，该比率比与组合干细胞群落中的细胞数量相等的单独的胎盘干细胞，或者与组合干细胞群落中的细胞数量相等的单独的所述第二来源干细胞，产生更多数量的克隆形成单位。

25.权利要求23中的方法，其中所述胎盘干细胞是来自胎盘灌注液中的胎盘干细胞。

26.权利要求23中的方法，其中所述第二来源干细胞是脐带血或者胎盘血干细胞。

27.权利要求23中的方法，其中所述第二来源干细胞是外周血干细胞。

28.权利要求23中的方法，其中所述第二来源干细胞是骨髓干细胞。

29.权利要求23中的方法，其中所述胎盘干细胞和所述第二来源干细胞是随机匹配的。

30.权利要求23中的方法，其中所述胎盘干细胞和所述第二来源干细胞是基于所述胎盘干细胞单位和所述第二来源干细胞单位的特征来匹配的。

31.权利要求30中的方法，其中所述特征是所述胎盘干细胞单位和所述第二来源干细胞单位中的有核细胞总数量。

32.权利要求30中的方法，其中所述特征是所述胎盘干细胞单位和所述第二来源干细胞单位中的干细胞数量。

33.权利要求30中的方法，其中所述特征是所述胎盘干细胞和所述第二来源干细胞显示的免疫学标记。