CN101374860A - 用作神经递质分泌抑制剂和肌肉松弛诱导物的合成肽 - Google Patents

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本发明描述了涉及阻断神经递质分泌并诱导肌肉松弛的合成肽的材料和方法，以及所述肽作为神经递质分泌和肌肉收缩的抑制剂和作为肌肉松弛诱导物的用途。

Description

用作神经递质分泌抑制剂和肌肉松弛诱导物的合成肽
[0001]本申请要求2005年12月23日申请的美国临时专利申请号60/753,607的优先权，该临时专利申请通过引用结合到本文中。
发明领域
[0002]本发明描述了涉及阻断神经递质分泌并诱导肌肉松弛的合成肽的材料和方法，以及所述肽作为神经递质分泌和肌肉收缩的抑制剂和作为肌肉松弛诱导物的用途。
发明背景
[0003]皱纹和细条纹是衰老的征兆。在想尽可能保持皮肤年轻化的产品中，抗皱霜占了相当大的比例。多年以来，人们一直通过保湿皮肤、改善皮肤再生、防止弹性纤维变性或促进胶原合成来治疗皱纹和细条纹。
[0004]在使人体皮肤变得平滑的化妆品治疗类别中，瑞斯蕾恩(Restylane)和玻丽朗(Perlane)(Q-Med，Uppsala，Sweden)均为遗传工程透明质酸衍生物，可用作一种胶原补充剂。胶原是机体最丰富的蛋白，是一种使皮肤坚韧耐久的弹性聚合物。随着人的衰老，真皮或较深的皮肤层失去胶原，皮肤变得更易起皱纹和僵硬。视黄酸(维生素A)是一种有效的皮肤用非注射治疗剂，经常用于药物疗法以及非处方乳膏剂和洗剂。
[0005]在化妆品市场上有许许多多抗衰老和抗皱乳膏剂用于短期改善皮肤，但经常仅治疗了皮肤的最外层，即表皮。胶原腺体位于真皮内，所以不受这些乳膏剂的影响。为避免此问题，可采用替代疗法。DHEA(脱氢表雄甾酮)是一种由人肾上腺分泌的产物，其血清浓度随着年龄的增长而下降。DHEA由于转变为雄激素和雌激素而具有间接的内分泌和胞内分泌作用。透皮给予类固醇激素前体孕烯醇酮、DHEA以及天然激素孕酮具有某些重要优势。近些年，已售卖出大量含有这些活性成分的产品。用于转运DHEA和孕酮通过皮肤的极佳组合物为水包油乳剂，其中含有皮肤脂肪组织的某些组分以及合适的渗透增强剂，并采用了脂质体和纳米球。
[0006]某些神经递质如乙酰胆碱的分泌是面部肌肉收缩所必需的，抑制这些神经递质是目前大部分针对表情纹的化妆品配方的基础。真核细胞中区室之间的蛋白质分泌和运输由运载囊泡介导，运载囊泡由一个细胞器萌发，再与另一个细胞器融合。该转运部分地由SNARE蛋白介导，SNARE蛋白包括保守的膜结合蛋白如VAMP家族、突触融合蛋白(syntaxin)和SNAP-25家族，它们能介导膜的融合。
[0007]例如，在响应Ca2+流入的突触传递中，含有神经递质的突触囊泡与突触前膜融合，并将其内容物释放到突触间隙中。类似地，在神经肌肉接头处，Ca2+刺激含有乙酰胆碱的突触前囊泡的胞吐作用，乙酰胆碱被释放到突触间隙中。SNARE蛋白，例如VAMP、突触融合蛋白和SNAP25，参与这些囊泡的胞吐作用，这些囊泡含有不同的神经递质，例如儿茶酚胺(去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺)、乙酰胆碱、5-羟色胺和/或肽神经递质，例如脑啡肽。
[0008]乙酰胆碱是一种非常重要的神经递质。乙酰胆碱的释放对肌肉收缩很重要。乙酰胆碱还可能涉及伤害性感受和化学敏感性。抑制乙酰胆碱释放可以是一种用于防止那些导致面部表情纹增加的肌肉收缩的方法。
[0009]目前，大部分针对面部表情纹的化妆品配方都是基于对面部肌肉收缩必需的乙酰胆碱分泌的抑制，其中，肉毒杆菌毒素是抵御表情纹的最常用分子，主要用于眉毛之间、眼睛周围和额头上的皱纹。尽管已发现大部分肉毒杆菌毒素对人用是安全的，但通过肌内注射给予这些物质仍是一种不方便的给药方法，有免疫原性，还可能会有某些副作用。
[0010]在临床试验中关于肉毒杆菌毒素A(BOTOX
Figure A200680052996D0008153312QIETU
)最常报告的不利事件是吞咽困难(19％)、上呼吸道感染(12％)、脖子疼(11％)和头痛(11％)。在将BOTOX
Figure A200680052996D0008153312QIETU
给予患有外周运动神经疾病(例如肌萎缩性侧索硬化、运动神经病)或神经肌肉接头障碍(例如重症肌无力)的个体时要特别小心。此外，不能排除这些毒素可长期储存在中枢神经系统中。在所有情况下，肉毒杆菌毒素都是高度免疫原性的。
[0011]最近，为避免肌内注射毒素，已披露了透皮肉毒杆菌毒素组合物和给药方法(美国专利公布号20050074461、美国专利公布号20050175636)。然而，在皮肤上存在毒素可能是危险的，原因是有可能接触到口、鼻咽部位和消化道。
[0012]尽管众多研究阐明了肉毒杆菌毒素的作用方式，但仍有许多方面尚未被揭示。例如，BOTOX
Figure A200680052996D0008153312QIETU
含有3个截然不同的生物区，其中1个介导细胞特异性结合，第二个介导细胞进入，第三个具有针对多种底物(例如SNARE复合蛋白VAMP、突触融合蛋白和SNAP-25)的蛋白酶活性(Montecucco等，Trends Biochem.18:324-327，1993)。肉毒杆菌毒素特异性切割SNARE复合物中存在的蛋白。这些SNARE蛋白参与含乙酰胆碱的囊泡的胞吐作用。在BOTOX
Figure A200680052996D0008153312QIETU
存在下，SNAP25的最后9个氨基酸被去除掉。此截短形式的SNAP25极为稳定，与野生型SNAP25竞争。类似地，VAMP或突触融合蛋白可被其它类别的肉毒杆菌毒素所切割。
[0013]一种对Botox有吸引力的替代包括生产截短形式的SNAP25、VAMP和突触融合蛋白，它们表现出来的活性类似于肉毒杆菌毒素的活性，或者类似于设计用于通过作用于参与胞吐作用的囊泡而特异性阻断乙酰胆碱释放的肽(SNARE复合物)。业已表明，模拟SNAP-25的C端序列的肽(乙酰六肽-3)(Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2)(SEQ ID NO:24)在嗜铬细胞中抑制分泌性囊泡停靠(Gutierrez等，J.Biol.Chem.272:2634-2639，1997)。该肽还通过阻断胞吐作用来影响神经递质的释放。此乙酰六肽(也称为ARGIRELINE
Figure A200680052996D0008153312QIETU
(阿基瑞林)，Lipotec SA，Barcelona，Spain)是一种抗皱肽，通过松弛面部张力和导致表面条纹和皱纹减少的独特机制起作用。在国际化妆品科学杂志(International Journal of Cosmetic Science)上发表的一项研究中采用了在水包油乳剂中该肽的浓度为10％。结果表明，在30天治疗后皱纹深度减少达30％(V.Kanga，Skin care delivery systems，Happi，47(2004年1月)；International Journal of Cosmetic Science 24:303，2002)。迄今为止，SNAP25分子是BOTOX
Figure A200680052996D0008153312QIETU
或ARGIRELINE
Figure A200680052996D0008153312QIETU
阻断神经递质释放的靶，前一种药物注射使用，后一种药物局部使用。
[0014]基于肽序列，棕榈酰化五肽(Pal-KKTTS)(SEQ ID NO:25)可对皮肤具有有益作用。棕榈酰寡肽是由Sederma SA公司开发的亲脂修饰肽，其所有权属于Croda公司，以MATRIXYL
Figure A200680052996D0008153312QIETU
销售。五肽由氨基酸赖氨酸、苏氨酸和丝氨酸组成，通过连接棕榈酸而变成亲脂性的。这产生序列Pal-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser即Pal-KTTKS(SEQ ID NO:26)，该组合通过向真皮细胞发出合成蛋白(胶原蛋白I、III、IV)和多糖(葡胺聚糖、透明质酸)的信号来模拟天然组织再生的过程，所述蛋白和多糖构成了填充皮肤必需的结缔组织(美国专利6,620,419)。有两组研究人员认为，在改善光老化作用方面棕榈酰五肽与视黄醇等效，但没有常常与视黄醇相关的副作用。有两个由Sederma SA支持的独立试验。第一个研究检验了棕榈酰五肽(3ppm)与视黄醇(700ppm)对光老化皮肤上的鱼尾纹部位的作用。第二个研究检验了棕榈酰五肽(5ppm)对光老化皮肤妇女中的弹性蛋白和胶原蛋白IV的结构的作用。棕榈酰五肽触发弹性蛋白和胶原蛋白IV的生长，并增强弹性蛋白和胶原蛋白IV的结构。该肽与任何副作用都无关，在皱纹修复中是视黄酸类物质的安全有效的替代品。
[0015]通过生物转化黄秋葵(Hibiscus esculentsL.(okra))种子的天然蛋白而获得的寡肽是一种为Myoxinol LS 9736(Cognis，Cincinnati，OH)的有专利的复合物，其主要由低分子量的寡肽组成，使得生物利用度良好。这些植物肽通过抑制导致在面部出现表情纹的机械因素以和肉毒杆菌毒素类似的方式对抗皱纹。此新型活性成分具有双重作用，在生物学上起延迟细胞衰老的作用(抗自由基活性)，并在机械上起抑制面部肌肉收缩的作用。肉毒杆菌毒素防止形成动态性皱纹，例如穿过前额的水平和垂直眉心皱纹、眼睛周围的鱼尾纹和嘴周围的鼻唇皱纹。使用针对受神经支配的肌肉细胞收缩的体外试验检测该成分作为抗皱剂的潜力。通过使用卡立普多(一种已知的肌肉松弛药)作为阳性对照，记录24小时内的收缩频率，评价该成分抑制肌肉细胞自发收缩的能力。Cognis报道，在3周时间段内将含1％ Myoxinol LS9736的乳膏剂应用于鱼尾纹部位，表明有相当大的抗衰老特性。该乳膏剂使皮肤更平滑，皱纹由于肌肉细胞收缩这一导致出现动态面部皱纹的主要机械因素的显著下降而有26％的明显减少。收缩抑制作用在用药后24小时停止。
[0016]模拟SNARE蛋白区段的氨基酸序列的其它合成肽已用于研究牵涉分泌途径的蛋白(例如ESUP-A)的功能性作用(Gutierrez等，J.Biol.Chem.272:2634-2639，1997)。合成肽的使用经常受限于难以进入靶细胞，需要通过皂苷透化细胞的人工系统是介导合成肽的作用所必需的。该问题可通过将合成肽与已知将肽或蛋白转运至细胞内的结构域(例如已知的蛋白转运结构域(PTD))融合而避免。PTD，例如HIV的TAT蛋白的区段，已得到广泛深入研究，已知为将蛋白转导到不同细胞类型中的有效途径(关于综述参见Dietz等，Mol.Cell.Neurosci.27:85-131，2004)。还已经表明HIV的基本转导结构域介导向小鼠多个器官的转运。腹膜内或静脉内注射PTD融合蛋白，使蛋白在包括脑在内的多个器官中传递。相反，在与TAT PTD或9-精氨酸(9R)融合时只有1个过氧化氢酶蛋白局部渗透的实例(Jin等，Free Radical Biologyand Medicine，31:1509-1519，2001)。然而，当单独使用TAT PTD或9-精氨酸(9R)时，没有显示出对神经递质释放的作用。同样，9-聚赖氨酸增强过氧化物歧化酶向哺乳动物皮肤中的渗透(Park等，Moleculesand Cells 13:202-208，2002)。
[0017]除SNAP 25序列以外，还没有报告阻断神经递质释放的其它肽。美国专利6,794,362描述了来源于用于化妆品组合物的弹性蛋白的肽的应用。美国专利6,358,929描述了赖氨酸-脯氨酸-缬氨酸(KPV)肽和衍生物在用于抑制或减少接触性超敏反应的化妆品组合物中作为添加剂的应用。美国专利6,183,759描述了与用于化妆品组合物的羊毛脂衍生的非羟基脂肪酸缀合的肽的合成。
[0018]另外，乙酰胆碱与其在肌肉细胞上的受体的结合后触发肌肉收缩。肌肉收缩涉及肌球蛋白和肌动蛋白的瞬时相互作用。肌球蛋白在粗肌丝中组构，而肌动蛋白在细肌丝中聚合(F-肌动蛋白)。肌肉收缩通过细肌丝和粗肌丝彼此滑过而发生。组装还包括微小肌肉蛋白a-辅肌动蛋白、肌间线蛋白、波形蛋白和伴肌动蛋白。改变肌丝形成，例如改变肌动蛋白聚合，可作为一种避免肌肉收缩和引起肌肉松弛的方法。
[0019]在受损的肌肉中，伤口愈合经常因纤维化过程而延迟。特定的生长因子如TGF-β参与该纤维化过程。TGF-β的过量表达导致发生使引起纤维化的基质蛋白沉积增加的事件。特定酶如前转化酶(例如尤其为弗林蛋白酶)活化/加工TGF-β是纤维化过程中的关键事件。经由前转化酶阻断TGF-β活化可能对伤口愈合有益。
[0020]因此，在本领域仍需要鉴定具有诸如以下多效功能的肽序列并将其用作治疗皱纹和受损肌肉的治疗剂:抑制神经递质释放和抑制肌肉收缩，同时引起肌肉松弛。
发明概述
[0021]本发明涉及用作神经递质释放抑制剂的肽的鉴定以及这些肽在生物功能(例如肌肉收缩)中阻断神经递质释放和诱导肌肉松弛的应用。还公开了这些肽在适用于皮肤的组合物中用于抑制神经递质分泌、防止肌肉收缩和治疗皱纹和细纹的应用。还公开了这些肽针对肌肉细胞诱导肌肉细胞松弛的应用。
[0022]在一个实施方案中。本发明提供含有选自SEQ ID NO:1-23中的一种或多种肽的组合物。一方面，所述组合物含有选自SEQID NO:1-23中的2种以上、3种以上、4种以上、5种以上、6种以上、7种以上、8种以上、9种以上、10种以上、11种以上、12种以上、13种以上、14种以上、15种以上、16种以上、17种以上、18种以上、19种以上、20种以上、21种以上直至22种以上的肽。另一方面，本发明提供含有一种或多种肽的组合物，所述肽与在SEQ ID NO:1-23中所示的肽具有至少80％的同一性。预期所述肽与SEQ ID NO:1-23中所示的任一种肽共享至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一个相关实施方案中，所述组合物含有SEQ IDNO:24-29中的一种或多种。
[0023]又一方面，本发明提供如上所述的肽组合物，其中所述肽含有所需氨基酸的L-对映体或所需氨基酸的D-对映体，或所需氨基酸的L-对映体或D-对映体的混合物。在一个相关方面，本发明预期，肽组合物可为或还可以包含在SEQ ID NO:1-23中所示的一种或多种肽的一种或多种逆向逆型异构体(retro-inverso isomer)。
[0024]在另一个实施方案中，预期本发明的组合物含有一种或多种肽，其中一种或多种肽是融合蛋白。一方面，本发明的肽与第二种蛋白的全部或部分融合。在一个相关方面，组合物中的一种或多种肽与易位结构域融合。另一方面，蛋白易位结构域来源于HIV TAT蛋白。再一方面，蛋白易位结构域是一段富含精氨酸的序列。又一方面，所述肽与脂解肽GKH融合。本发明涉及的其它蛋白易位结构域包括但不限于pentratin-1、触角足蛋白(antennapedia)易位结构域、L-精氨酸寡聚物、D-精氨酸寡聚物、L-赖氨酸寡聚物、D-赖氨酸寡聚物、L-组氨酸寡聚物、D-组氨酸寡聚物、L-鸟氨酸寡聚物、D-鸟氨酸寡聚物、HSV-1蛋白VP22及其片段、具有至少6个连续氨基酸残基(即L-精氨酸、D-精氨酸、L-赖氨酸、D-赖氨酸、L-组氨酸、D-组氨酸、L-鸟氨酸、D-鸟氨酸或其组合)的肽；以及其肽类似物。
[0025]在一个相关方面，本发明的肽与核酸融合，所述核酸包括但不限于DNA、RNA(单链的或双链的)或RNAi。
[0026]在一个变化中，为了与延长保存期、增加稳定性、增加所述肽在哺乳动物中的循环体内半衰期、降低系统毒性等相关的目的，进一步修饰本发明的肽。采用标准药物和制剂化学实现此目标，例如通过糖基化、PEG化、引入不可水解的键、与药学上可接受的稀释剂、辅剂或载体混合，等等。
[0027]一方面，所述肽组合物含有至少一种选自以下的活性剂:保湿剂、脱色剂(de-pigmenting agent)、着色促进剂(pro-pigmentingagent)、剥离剂(desquamating agent)、紫外线吸收剂、防晒活性剂、粘度调节剂、摩擦剂、pH调节剂、抗糖化剂、抗氧化剂、NO合酶抑制剂、刺激真皮和/或表皮大分子合成的物质、防止真皮和/或表皮大分子降解的物质、刺激胶原合成的物质、防止胶原降解的物质、刺激成纤维细胞和/或角质形成细胞增殖或刺激角质形成细胞分化的物质、肌肉松弛剂、皮肤松弛剂、再生剂(rejuvenating agent)、抗污染剂(anti-pollution agent)和自由基清除剂、作用于毛细血管循环的物质、作用于细胞代谢的物质、抗炎剂、止汗剂、抗微生物剂和抗真菌剂，以及辅助性的亲水和亲脂凝胶剂、活性剂、防腐剂、溶剂、芳香剂、填充剂、色素、气味吸收剂。
[0028]在另一个实施方案中，预期肽组合物中的一种或多种肽的浓度为组合物总重量的0.00001％至10％(重量/重量)。一方面，一种或多种肽的浓度为约0.001至1％(重量/重量)。在一个相关实施方案中，本发明提供单位剂量的肽，其优选包含在容器中，该容器上贴有注明容器内容物的标签并附有对受试者给药的说明书。
[0029]在一个实施方案中，本发明的组合物为水包油乳剂。在一个相关实施方案中，组合物为油包水浸渍液。在又一个实施方案中，本发明的肽组合物配制用于局部应用。
[0030]本发明的肽可使用合成技术和重组DNA技术来制备。因此，本发明还提供纯化的和分离的多核苷酸，其含有的核苷酸序列编码本发明的肽；包含这些多核苷酸的载体(尤其是表达载体)；含有所述多核苷酸或载体的宿主细胞；以及使用所述多核苷酸、载体或宿主细胞制备肽的方法。例如，提供了一种转化宿主细胞的方法，该方法包括以下步骤:将含有多核苷酸的载体导入所述宿主细胞中，所述宿主细胞表达多核苷酸，纯化所获肽。还提供通过以上方法转化的宿主细胞。如果肽与配偶体(partner)作为融合体表达，则可能需要切割融合体，以获得纯化的肽。
[0031]由本文描述显而易见，本发明提供众多涉及本发明组合物的方法和应用。在一个实施方案中，本发明提供抑制细胞的神经递质分泌的方法，该方法包括使分泌神经递质的细胞与本发明的组合物接触，组合物的用量有效抑制细胞的神经递质分泌。所考虑的已知表达神经递质的靶细胞包括但不限于:成人脑和神经元细胞、肌肉细胞、上皮细胞和神经上皮细胞、视网膜、神经内分泌细胞和皮肤中的梅克尔细胞(Merkel cell)。在一个优选变化中，接触步骤包括使细胞与含有所述肽和药学上可接受的载体的组合物接触。
[0032]在一个相关实施方案中，本发明提供抑制哺乳动物受试者的肌肉收缩的方法，该方法包括给予哺乳动物受试者含有本发明的一种或多种肽的组合物，组合物的用量有效抑制肌肉收缩。
[0033]在一个相关实施方案中，本发明提供诱导哺乳动物受试者的肌肉松弛的方法，该方法包括给予哺乳动物受试者含有本发明的一种或多种肽的组合物，组合物的用量有效诱导肌肉松弛。
[0034]在又一个实施方案中，本发明提供治疗面部表情纹的方法，该方法包括给予表现出面部表情纹的哺乳动物受试者含有本发明的一种或多种肽的组合物，组合物的用量有效减小皱纹的深度或皱纹尺寸的增加。设想本文使用的面部表情纹是指由重复的面部表情所产生的皱纹，包括通常称为鱼尾纹、眼周皱纹、笑纹、眉沟纹、唇周皱纹、向下的口角纹、眉间皱纹(垂直皱眉线)和颈部皱纹在内的皱纹。要认识到的是，皱纹尺寸等级的任何降低都指示成功治疗。一方面，皱纹深度改善约10-100％。在一个相关方面，皱纹深度改善约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％。在又一方面，皱纹减少或被完全根除。
[0035]在一个变化中，本发明提供增强伤口愈合的方法，该方法包括给予需要伤口愈合的受试者有效量的组合物的步骤，所述组合物含有本发明的一种或多种肽。在另一个变化中，本发明提供通过阻断纤维化过程增强伤口愈合的方法，该方法包括给予需要伤口愈合的受试者有效量的组合物的步骤，所述组合物含有本发明的一种或多种肽。
[0036]在又一个变化中，本发明提供用于治疗与神经递质释放和肌肉收缩相关的其它疾病的方法，所述疾病选自多汗症、局灶性肌张力障碍、非肌张力障碍性疾病、炎症和疼痛，所述方法包括给予有需要的受试者有效量的组合物的步骤，所述组合物含有本发明的一种或多种肽。
[0037]有可能通过将额外的治疗剂与本发明的肽一起递送来增强所述肽的治疗功效。在一个变化中，肽可与其它治疗剂一起共同给予。这样的治疗剂包括但不限于神经递质抑制剂、止痛药、血管收缩药、凋亡抑制剂、抗炎药。
[0038]一方面，本发明提供本发明的肽组合物，该肽组合物还含有一种或多种选自以下的神经递质抑制剂和肌肉松弛药:箭毒、α-银环蛇毒素、芋螺毒素、阿库铵、加拉明(gallamine)、泮库铵、阿曲库铵、维库铵、哌仑西平AF-DX 116 pF-HHSiD、异丙托铵(ipratroprium)、东莨菪碱和阿托品。
[0039]本发明的肽组合物可抑制的神经递质包括乙酰胆碱(ACh)、多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)、5-羟色胺(5-HT)、组胺、肾上腺素、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、缓激肽、β-内啡肽、铃蟾肽、降钙素、缩胆囊素、脑啡肽、强啡肽、胰岛素、胃泌素、P物质、神经加压素、胰高血糖素、分泌素、促生长素抑制素、促胃动素、血管加压素、催产素、催乳素、促甲状腺素、血管紧张素II、睡眠肽(sleep peptide)、甘丙肽、神经肽Y、促甲状腺素释放激素、促性腺激素释放激素(gonadotropnin-releasing hormone)、生长激素释放激素、促黄体激素和血管活性肠肽。
[0040]前述方法可在体外进行，或者可以通过将所述肽给予含靶细胞的生物而在体内进行。一方面，接触通过选自以下的途径进行:皮下、透皮、局部、真皮内和真皮下。
[0041]在又一个变化中，本发明涉及改善皮肤外观的方法，该方法包括局部应用化妆品，所述化妆品含有本发明的组合物和化妆品可接受的溶媒。一方面，所述皮肤是衰老的、光老化的、干燥的、有条纹的或起皱纹的。化妆品可接受的溶媒可包括但不限于水、液体或固体润肤剂、溶剂、保湿剂、增稠剂和底粉，它们在本文有进一步详述。
[0042]还提出了化妆品组合物还含有一种或多种下列成分:雌二醇、孕酮、孕烷醇酮(pregnanalone)、辅酶Q10、甲基磺酰甲烷(methylsolanomethane)(MSM)、铜肽(铜提取物)、浮游生物提取物(磷脂复合物(phytosome))、乙醇酸、曲酸、棕榈酸抗坏血酸酯、全反式视黄醇、杜鹃花酸、水杨酸、溴帕雌烯(broparoestrol)、雌酮、雄烯二酮(adrostenedione)和雄烷二醇(androstanedione)。在一个相关方面，所述组合物还含有防晒剂。在一个变化中，所述化妆品可接受的溶媒为水包油乳剂或油包水乳剂。在第二个变化中，所述组合物选自乳剂、洗剂、喷雾剂、气雾剂、粉剂、软膏剂、乳膏剂和泡沫剂。
附图简述
[0043]图1提供的表给出了本发明设计的肽序列。
[0044]图2显示了肽MRP、L-Tat-MRP、3D-MRP和L-Tat-3D-MRP对PC12细胞的神经分泌的剂量依赖性抑制。
[0045]图3显示了本发明的肽组合对PC12细胞的神经分泌的抑制。
[0046]图4A显示了弗林蛋白酶抑制剂在体外对弗林蛋白酶活性的作用。图4B显示了合成肽在体外对弗林蛋白酶活性的作用。
[0047]图5A图示了不同浓度的9Rac/am肽对弗林蛋白酶活性的作用。图5B图示了不同浓度的L-Bel1肽对弗林蛋白酶活性的作用。图5C显示了L-9K对弗林蛋白酶活性的作用。
[0048]图6图示了多种弗林蛋白酶抑制剂(图6A，离子螯合剂；图6B，弗林蛋白酶抑制剂RVKR；图6C，肽D-Rac/am；和图6D，肽D-6R)在PC12-ES细胞中对弗林蛋白酶活性的作用。
[0049]图7显示了用L-Bel1处理后的PC12-ES细胞的染色情况。图7A显示了单独的L-Bel-1的染色情况，而图7B显示了L-Bel1和抗弗林蛋白酶抗体的染色情况。
[0050]图8图解了用L-Bel1(图8A)、D-9rac(图8B)或肽L-9K(图8C)处理后的PC12-ES细胞的形态。
[0051]图9图示了在用肽D-9Rac/am处理之前(图9A)和之后(图9B)的成肌纤维细胞的图像。
[0052]图10描述了肽L-Bel-1、D-Rac/am和L-9K对成肌纤维细胞介导的胶原收缩的作用。
发明详述
[0053]本发明涉及治疗上有益的肽的鉴定和这些肽的应用。
[0054]本发明的肽。提出本发明的肽，例如在图1中示例的那些肽，作为L氨基酸肽起作用或者作为D氨基酸肽起作用。L氨基酸是那些通常存在于天然合成的肽中的氨基酸。L氨基酸是那些呈L构象的氨基酸。
[0055]D氨基酸是L氨基酸的对映体形式，通常不掺入到天然合成的肽中。提出本发明的肽作为D-对映体氨基酸肽起作用，即从氨基(NH2)端至羧基(COOH)端的序列相同，但每个氨基酸均为D-对映体。
[0056]在一个实施方案中，本发明的肽为不可水解的。为了提供这样的肽，人们可以从不可水解的肽的文库筛选出该肽，例如含有一个或多个D氨基酸的肽或者含有氨基酸通过一个或多个不可水解的肽键连接起来的肽。本发明还包括全D逆向逆型肽(all-D-retro-inversopeptide)。
[0057]术语“逆向逆型肽(retro-inverso peptide)”是指线性肽的异构体，其中序列的方向是相反的，术语“D-逆向逆型异构体(D-retro-inverso isomer)”是指线性肽的异构体，其中序列的方向是相反的，且每个氨基酸残基的手性是反转的。参见例如Jameson等，Nature 368:744-46，1994；Brady等，Nature 368:692-93，1994，Guichard等，J.Med.Chem.39:2030-39，1996。逆向肽通过经典的F-mock合成产生，再通过质谱法作进一步分析。它们使用本领域已知的技术通过HPLC纯化。
[0058]本发明的全D逆向逆型肽应提供具有类似于天然肽的功能特性的肽，其中组成氨基酸的侧基应符合天然肽排列，但应保留蛋白酶抗性骨架。举例说明，如果天然TAT蛋白(由L-氨基酸构成)具有序列RKKRRQRRR(SEQ ID NO:3的氨基酸4-12)，则该肽的逆向逆型肽类似物(由D氨基酸构成)应具有序列RRRQRRKKR(SEQ ID NO:3的氨基酸4-12的反转)。D-氨基酸肽(正向序列或逆向逆型序列)可适用于其它肽，例如阿基瑞林(乙酰六肽)或Pal-KTTKS(SEQ ID NO:26)。
[0059]结合D-对映体和反向合成的最终结果是每个酰胺键中的羰基和氨基的位置发生交换，而由α碳伸出的侧链基团的位置被保留下来。除非另有明确说明，否则假定本发明的任何给定L-氨基酸序列都可通过合成对应天然L-氨基酸序列的反向序列而被制成D-逆向逆型肽。
[0060]在一个实施方案中，提出本发明的肽与本文描述的任一种肽的侧链交联。该方法用于使类似的肽或者本发明的肽彼此交联，以产生分支肽。一方面，分支可位于N端或C端。交联还可以对内部氨基酸进行，产生内部分支，或者在N端或C端和内部位置同时进行。
[0061]本发明的肽可作为经修饰的肽起作用。本发明提出的修饰包括但不限于PEG化(PEG连接)、糖基化、酰胺化、羧基化、磷酸化，或者加入乙酰基、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸或酸性基团，产生酸加成盐、酰胺、酯，尤其是本发明肽的C端酯和N-酰基衍生物。所述肽还可以通过与其它部分形成共价或非共价复合物而修饰，产生肽衍生物。可通过将化学部分与所述肽含有的氨基酸侧链上的或在N端或C端的官能团连接而制备共价结合的复合物。
[0062]本发明的肽可为线性的或环状的，通过天然或合成方法产生。例如，半胱氨酸残基之间的二硫键可以使肽序列环化。双官能试剂可用于提供肽的两个或更多个氨基酸之间的化学键。肽的其它环化方法也是本领域已知的，例如由Anwer等(Int.J Pep.Protein Res.36:392-399，1990)和Rivera-Baeza等(Neuropeptides 30:327-333，1996)描述的那些方法。
[0063]具体地说，提出本发明的肽可以与报告基团缀合，所述报告基团包括但不限于放射性标记、荧光标记、酶(例如催化显色反应或荧光反应的酶)、底物、固体基质或载体(例如生物素或抗生物素蛋白)。这些标记都是本领域技术人员众所周知的。有关标记参见例如美国专利第3,817,837号、美国专利第3,850,752号、美国专利第3,996,345号、美国专利第4,277,437号、美国专利第3,817,837号、美国专利第3,850,752号和美国专利第3,939,350号。本发明的任何肽都可以含有任何这些标记的1种、2种或更多种。
[0064]进一步提出本发明的肽可与抑制性基团(例如氟甲基酮或氯甲基酮)缀合，以封闭酶的活性。本发明的肽还可以用作天然底物的竞争剂。
[0065]还包括本发明肽的类似物或变体。变体和类似物可与本文所述肽基本同源或基本相同。优选的变体和类似物是与本发明肽具有相同特征的那些，所述特征例如为抑制神经分泌或抑制肌肉收缩。肽类似物或变体是与在SEQ ID NO:1-23中所示的肽的氨基酸序列具有最小百分率的氨基酸同一性(例如优选至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性)的那些肽变体。
[0066]取代变体通常在蛋白中的一个或多个位点将肽序列的一个氨基酸换为另一个氨基酸，并可被设计用于调节多肽的一种或多种特性，例如抗蛋白酶剪切的稳定性，而没有失去其它功能或特性。该类取代优选是保守的，即一个氨基酸被另一个如下所述的具有相似形状和电荷的氨基酸所置换。
[0067]本文使用的术语“保守取代”是指一个氨基酸残基被另一个就疏水性、亲水性、阳离子电荷、阴离子电荷、形状、极性等而言在生物学上相似的残基所置换。因此，应当理解的是，在本发明背景下，保守取代在本领域视为一个氨基酸被另一个具有类似特性的氨基酸取代。保守取代的实例包括一个疏水残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个疏水残基，或者一个极性残基取代另一个极性残基，例如精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸或者谷氨酰胺取代天冬酰胺，等等。可彼此取代的中性亲水氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸。术语“保守取代”还包括取代的或修饰的氨基酸替代未取代的亲本氨基酸的应用，只要针对取代的多肽产生的抗体也与未取代的多肽有免疫反应。本发明所述“取代的”或“修饰的”包括已由天然氨基酸改变或修饰的那些氨基酸。
[0068]本发明还包括所述肽作为前肽(propeptide)的应用，所述前肽在宿主细胞内部被切割，产生活性形式的目标肽。前肽的重组合成描述于例如Wu等，Proc NatlAcadSci USA.94:13654-60，1997。
[0069]在一个实施方案中，本发明的肽在不同肽的NH2端或COOH端融合，产生融合蛋白。所述肽可与诸如以下的蛋白融合:靶向蛋白、受体特异性配体、酶、抗体、易位结构域，或者可将肽靶向特定组织或细胞类型以增强本发明肽的实用性的其它蛋白或蛋白结构域。
[0070]提出本发明的肽作为与其它活性肽融合的融合肽起作用，所述活性肽例如为:阿基瑞林乙酰基AGGEEMQRR(SEQ ID NO:27)、F6L9Y10F14(SAAEAFAKLYAEAFAKG)(SEQ ID NO:28)、Pal-KTTKS(SEQ ID NO:26)、ESUP-A(NH2-SNKTRIDEANQRATKMLGSG-COOH(SEQ ID NO:29)、肉毒杆菌毒素A或另外的肉毒杆菌毒素B、C、D、E、F和G(Montecucco等，Curr Opin Pharmacol.5:274-9，2005)。
[0071]在一个相关实施方案中，本发明的肽与诸如DNA、单链或双链RNA或RNAi的核酸融合。
[0072]易位结构域存在于除HIV Tat蛋白之外的许多不同蛋白中。易位肽的其它来源在本领域众所周知。例如。HSV-1蛋白VP22(描述于例如WO 97/05265；Elliott和O′Hare，Cell 88:223-233，1997))或非病毒蛋白(Jackson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10691-10695，1992)表现出易位特性。其它适宜的易位肽或运输肽包括来源于黑腹果蝇触角足蛋白(Drosophila melanogaster antennapedia)(Antp)同源异型基因转录因子的肽、Kaposi成纤维细胞生长因子(MTS)信号序列的h区和乙型肝炎病毒(HBV)的PreS2蛋白(Kelemen等，J.Biol.Chem.277:8741-8748，2002)。
[0073]或者，易位肽是阳离子大分子的多聚体或含有聚精氨酸重复序列的富精氨酸肽。又一方面，所述肽与脂解肽GKH融合，脂解肽GKH也跨膜转运蛋白。本发明提出的其它蛋白易位结构域包括但不限于pentratin-1、触角足蛋白(antennapedia)易位结构域、L-精氨酸寡聚物、D-精氨酸寡聚物、L-赖氨酸寡聚物、D-赖氨酸寡聚物、L-组氨酸寡聚物、D-组氨酸寡聚物、L-鸟氨酸寡聚物、D-鸟氨酸寡聚物、具有至少6个连续氨基酸残基(即L-精氨酸、D-精氨酸、L-赖氨酸、D-赖氨酸、L-组氨酸、D-组氨酸、L-鸟氨酸、D-鸟氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N，N-二甲基-Lys、N，N，N-三甲基赖氨酸、任何非天然碱性氨基酸(例如N-1-(2-吡唑啉基)-精氨酸或任何带有胍基的非天然氨基酸或其组合)的肽；以及其肽类似物。
[0074]可通过以本领域已知的任何适宜方式化学偶联来连接用于本发明的肽和易位或运输序列。许多已知的化学交联方法是非特异性的，即它们不将偶联点导向转运多肽上的任何特定位点。因此，非特异性交联剂的使用可攻击功能位点或在空间上阻断活性位点，使得缀合蛋白在生物学上无活性。
[0075]一种增加偶联特异性的方法是通过将化学偶联导向在要交联的一个或两个多肽中仅出现1次或几次的官能团。例如，在许多蛋白中，唯一含有巯基的蛋白氨基酸半胱氨酸仅出现几次。另外，例如，如果多肽不含赖氨酸残基，则对伯胺特异性的交联试剂对该多肽的氨基端将是选择性的。使用该方法成功增加偶联特异性需要多肽在可被改变而不失去分子的生物活性的分子区域中具有适当罕见且反应性的残基。
[0076]肽的制备方法。本发明的肽可按照常规技术在溶液中或在固相支持体上合成。多种自动化合成仪是市售的，可按照已知方法使用。参见例如Stewart和Young，Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，Pierce Chemical Co.，(1984)；Tam等，J.Am.Chem.Soc.105:6442，1983；Merrifield，Science 232:341-347，1986；以及Barany和Merrifield，ThePeptides，Gross和Meienhofer编辑，Academic Press，New York，1284；Barany等，Int.J.Peptide Protein Res.30:705-739，1987；和美国专利第5,424,398号，所述每个文献都通过引用结合到本文中。
[0077]固相肽合成方法使用含有0.1-1.0mMol胺/g聚合物的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。这些用于肽合成的方法使用α-氨基的丁氧基羰基(t-BOC)或9-芴甲氧基羰基(FMOC)保护。两种方法都涉及分步合成，由此在每个步骤由肽的C端开始加入单个氨基酸(参见Coligan等，Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience，1991，第9单元)。在完成化学合成后，脱去肽的保护基，即通过用酸在降低的温度处理(例如液态HF-10％苯甲醚，在0℃约0.25至约1小时)肽而脱去t-BOC或FMOC氨基酸保护基，因此从聚合物上切下肽。在蒸发试剂后，用1％乙酸溶液将肽由聚合物中萃取出来，然后冻干乙酸溶液，得到粗产物。粗产物一般可通过例如在Sephadex G-15上使用5％乙酸作为乳剂进行凝胶过滤的技术来纯化。冻干柱子的适宜流分将得到均一的肽或肽衍生物，然后其可通过诸如氨基酸分析、薄层层析、高效液相层析、紫外吸收分光光度法、摩尔旋光度、溶解性等标准技术来鉴定，并通过固相Edman降解定量。
[0078]或者，可利用多种包含和表达本发明的肽的表达载体/宿主系统。这些表达载体/宿主系统包括但不限于微生物，例如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)转染的或用细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。
[0079]用于表达重组蛋白的哺乳动物宿主系统也是本领域技术人员众所周知的。可根据加工所表达蛋白或产生将用于提供蛋白活性的某些翻译后修饰的特定能力选择宿主细胞菌株。多肽的这些修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。不同的宿主细胞，例如CHO、HeLa、MDCK、293、W138等，对这些翻译后活性具有特定的细胞机器和特征性机制，并可进行选择，以确保所导入外源蛋白的正确修饰和加工。可用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞包括但不限于VERO细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、COS细胞(例如COS7)、W138、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562和293细胞。下文描述了用于重组表达蛋白的示例性方案。
[0080]还可以使用市售表达系统，例如毕赤酵母表达系统(Invitrogen，San Diego，CA)，按照生产商的说明在酵母中重组表达本发明的肽。该系统也依赖于前-原-α序列引导分泌，但插入片段的转录在通过甲醇诱导时由乙醇氧化酶(AOX1)启动子驱动。
[0081]通过例如用于由细菌和哺乳动物细胞上清液纯化肽的方法，从酵母生长培养基纯化所分泌的肽。
[0082]或者，所述肽可以在昆虫系统中表达。用于蛋白表达的昆虫系统是本领域技术人员众所周知的。在一个这样的系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)用作在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞和粉纹夜蛾(Trichoplusia)幼虫中表达外源基因的载体。将肽编码序列克隆到病毒的非必需区如多角体蛋白基因中，并处于多角体蛋白启动子控制之下。成功插入所述肽将使多角体蛋白基因失活，并产生没有外壳蛋白包裹的重组病毒。然后使用重组病毒感染肽在其中表达的草地贪夜蛾(S.frugiperda)细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia)幼虫(Engelhard等，Proc Nat Acad Sci 91:3224-7，1994)。
[0083]在另一个实例中，编码所述肽的DNA序列通过PCR扩增，并克隆到适宜的载体如pGEX-3X(Pharmacia，Piscataway，NJ)中。pGEX载体设计用于产生由载体编码的含谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白，和由插入到载体的克隆位点中的DNA片段编码的蛋白。可产生含有例如适宜的切割位点的PCR引物。
[0084]在融合配偶体仅用于促进表达或不需要连接目标肽的情况下，则可从融合蛋白的GST部分切下重组融合蛋白。
[0085]或者，编码肽的DNA序列可克隆到含有所需启动子和任选的前导序列的质粒中(参见例如Better等，Science，240:1041-43，1988)。该构建体的序列可通过自动化测序证实。然后使用标准方法如采用CaCl2温育和细菌热激处理的标准方法(Sambrook等，出处同上)，将质粒转化到大肠杆菌菌株MC1061中。让转化的细菌在补加羧苄青霉素的LB培养基中生长，表达蛋白的生产通过在适宜的培养基中生长而诱导。如果存在前导序列的话，则前导序列将影响本发明肽的分泌，并在分泌过程中被切除。
[0086]制剂与给药途径。为了制备用于临床应用的本发明组合物，必须将本发明肽制成药物组合物，即为适合于体内应用的形式。一般而言，用于临床应用的组合物剂型将必须制备基本无热源以及基本无对人或动物可能有害的其它杂质的组合物。关于药物组合物的制备，参见Remington′s Pharmaceutical Science，第18版，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.(1990)。
[0087]人们一般需要使用合适的盐和缓冲液，以使传递载体稳定和允许被靶细胞吸收。在将重组细胞给予患者时还将使用缓冲液。本发明的水性组合物含有对细胞有效量的肽或表达载体，其溶解或分散在药学上可接受的载体或水性介质中。这样的组合物也被称为接种物。术语“药学上可接受的或药理上可接受的”是指在给予动物或人时不产生不利的、变态的或其它不需要的反应的分子实体和组合物。本文使用的“药学上可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣材料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这些介质和辅剂在药物活性剂中的应用在本领域众所周知。除非任何常规的介质或辅剂与本发明的载体或细胞不相容，否则包括其在治疗组合物中的应用。组合物中也可以掺入补充活性成分。
[0088]本发明的活性组合物包括经典的药物制剂。本发明的这些组合物的给药将经由任何普通途径，只要经该途径可到达靶组织。可通过任何常规方法将药物组合物给予受试者，例如通过静脉内、皮内、肌内、眼球后、口服、透皮或局部递药，或通过在特定部位手术植入。治疗可由单剂或一定时间段内的多剂组成。
[0089]活性化合物可制成与表面活性剂如羟丙基纤维素适宜混合的游离碱或药理上可接受的盐的水溶液剂。还可以制备在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中的分散液。在普通储藏和使用条件下，这些制品含有防腐剂，以防止微生物生长。
[0090]适于注射用的药物形式包括无菌水性溶液剂或分散液和用于临时配制无菌注射液或分散液的无菌粉针剂。在所有情况下，所述剂型必须是无菌的，流动性必须达到具有易注射能力的程度，在生产和储藏条件下必须是稳定的，必须针对微生物如细菌和真菌的污染作用进行防腐。载体可为溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适宜的混合物和植物油。适宜的流动性例如可通过使用包衣材料如卵磷脂、就分散剂而言通过维持需要的颗粒大小和通过使用表面活性剂来维持。防止微生物的作用可通过多种抗细菌剂和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延长吸收的物质如单硬脂酸铝和明胶来实现。
[0091]如下制备无菌注射液:将需要量的活性化合物掺入具有以上列举的多种其它成分的适宜溶剂中，在需要时后接过滤除菌。一般而言，如下制备分散液:将多种无菌活性成分掺入无菌溶媒中，所述溶媒含有基础分散介质和来自以上列举的所需的其它成分。对用于制备无菌注射液的无菌粉针剂而言，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这些技术获得粉末状活性成分，加上来自其先前过滤除菌溶液的任何其它所需成分。
[0092]对于口服给药，本发明的多肽中可掺混赋形剂，并以不可摄入的漱口水和洁齿剂的形式使用。可将需要量的活性成分掺入适宜溶剂如硼酸钠溶液(Dobell溶液)中，制备漱口水。或者，活性成分可掺入到含硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的无菌洗涤液中。活性成分还可以分散在洁齿剂中，包括:凝胶剂、糊剂、粉剂和料浆。活性成分可以治疗有效量加入到糊状洁齿剂中，所述洁齿剂可含有水、粘合剂、摩擦剂、调味剂、发泡剂和保湿剂。
[0093]本发明的组合物可配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白的游离氨基形成)，其与无机酸如盐酸或磷酸形成，或与诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等有机酸形成。与游离羧基形成的盐还可以衍生自无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)以及有机碱(例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。
[0094]在配制时，溶液以和剂型相适的方式并以诸如治疗有效的剂量给予。制剂容易以多种剂型给药，例如注射液、释药胶囊剂等。对于以水性溶液剂的胃肠外给药，例如，必要时溶液剂应适宜地缓冲，首先用足量的盐水或葡萄糖使液体稀释剂变成等渗的。这些特定水性溶液剂尤其适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内给药。
[0095]“单位剂量”被定义为分散在适宜载体中的独立量的治疗组合物。胃肠外给药可如下进行:先推注，然后持续滴注，以保持药品的治疗循环水平。本领域普通技术人员容易依据优良药物规范和个体患者的临床病况所确定的来优化有效剂量和给药方案。
[0096]对于局部给药，提出组合物中含有浓度为约5％至约50％重量/体积的本发明的一种或多种肽。还提出用于局部给药的组合物中可含有约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％或约45％的本发明肽。还提供本发明组合物中含有的一种或多种肽的总浓度可为组合物总重量的约0.00001％至约10％(重量/重量)。本发明组合物中可含有总浓度为约0.001％至约5％、约0.001％至约1％、0.01％至约1％重量/重量的一种或多种肽。
[0097]给药频率取决于药物的药代动力学参数和给药途径。本领域技术人员可根据给药途径和所需剂量确定优化的药物制剂。参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版(1990，Mack Publ.Co，Easton PA 18042)，第1435-1712页，该文献通过引用结合到本文中。这类制剂可影响身体状况、所给予药物的稳定性、体内释放速率和体内清除速率。根据给药途径，按照体重、体表面积或器官大小可计算出合适的剂量。本领域普通技术人员无需过多的实验，尤其是按照本文公开的剂量信息和测定以及在动物和人体临床试验中观测的药代动力学数据，就可以常规地进行确定适合治疗剂量必需的进一步精密计算。
[0098]通过使用相关的剂量-反应数据可以确定合适的剂量。主治医师通过考虑改变药物作用的因素，例如药物的比活、损伤的严重性和患者的反应、年龄、身体状况、体重、性别和饮食、任何感染的严重性、给药时间和其它临床因素，来确定最后的剂量方案。随着研究进行，将得到关于具体疾病和病症的适宜剂量水平和治疗时程的进一步信息。
[0099]本发明的这些组合物涉及用于离子电渗疗法或电动药物给药(ElectroMotive Drug Administration)(EMDA)，该方法是一种利用电流将药物递送至受侵袭部位的有效方法，如递送至关节或身体某一很小部位中。该方法是非侵入性的，无痛的，并消除了可在使用口服或注射递送的药物时出现的潜在副作用和有害反应。
[00100]透皮给药可使用标准透皮贴剂、具有用于定期释放组合物的微处理器的贴剂、具有超声装置或电子装置的显微针的贴剂进行。通过在有或没有增强剂的情况下破坏患者皮肤的角质层(化学的或非化学的、摩擦剂去除、胶粘剂去除、赛璐玢胶带、超声、电流)，也可以将肽组合物用于透皮给药。与超氧化物歧化酶融合的Tat可穿过角质层。还可以使用不同透皮给药的组合如摩擦和超声来递送本发明组合物。
[00101]化妆品形式。本发明包括的肽组合物可配制成用于局部应用和用于化妆目的应用的化妆品。本文使用的术语“化妆品”是指保护、恢复或增强组织或皮肤外观的物质或制品。本发明的化合物和组合物还可以用作改变组织、尤其是改变皮肤的药物。术语“改变”用于指本发明改变其要提供、应用或给予的组织的外观、形态、特征和/或物理性质。形态的改变可由单独的下列任一特征或下列各特征的组合反映出来:皮肤外观改善、皮肤柔软性增加、皮肤饱满感增加、皮肤纹理增加、皮肤弹性增加和皮肤皱纹形成降低。
[00102]化妆品的实例包括润肤乳、洗面乳、润泽乳、洁面乳等乳液；润肤霜、按摩霜、清洁霜、化妆霜等霜剂；诸如此类。按照使用者的年龄、性别、预期用途、皮肤受累部分的状况等，每次应用以适宜的剂量或者每天以适宜的频率将这些化妆品应用于皮肤(美国专利6,946,436)。其余的化妆品形式描述于国际化妆品成分辞典和手册(International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook)第4卷(第9版，2002)。国际化妆品成分辞典和手册第4卷的公开内容通过引用结合到本文中。
[00103]在一个实施方案中，提出包含本发明的肽组合物的化妆品可任选地含有其它对皮肤有益的物质。这些物质包括但不限于雌二醇、孕酮、孕烷醇酮(pregnanalone)、辅酶Q10、甲基磺酰甲烷(methylsolanomethane)(MSM)、铜肽(铜提取物)、浮游生物提取物(磷脂复合物(phytosome))、乙醇酸、曲酸、棕榈酸抗坏血酸酯、全反式视黄醇、杜鹃花酸、水杨酸、溴帕雌烯(broparoestrol)、雌酮、雄烯二酮(adrostenedione)、雄烷二醇(androstanediol)等。参见美国专利6,821,524。类固醇一般以低于组合物总重量约2％的浓度存在，而其它皮肤有益物质可以较高水平存在，例如高达10％至15％。
[00104]化妆品组合物还可以含有防晒剂，以降低皮肤对有害UV射线的暴露。防晒剂包括常用于阻断紫外线的那些物质。代表性的化合物是PABA衍生物、肉桂酸酯和水杨酸酯衍生物(非阿魏酰水杨酸酯)。例如，可使用甲氧基肉桂酸辛酯和2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮(也称为氧苯酮)。甲氧基肉桂酸辛酯和2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮是市售的，其商品名分别为Parsol MCX和Benzophenone-3。还可以使用Dermascreen。组合物中使用的防晒剂的精确量可随需要防太阳紫外辐射的保护程度而改变。参见美国专利6,821,524。
[00105]化妆品溶媒。本发明的肽还可以含有化妆品可接受的溶媒，作为肽的稀释剂、分散剂或载体，以便在组合物施用于皮肤时有利于肽的分布。非水溶媒或者除了水之外的溶媒还可包括液体或固体润肤剂、溶剂、保湿剂、增稠剂和底粉。化妆品可接受的溶媒可占组合物重量的5％至99.9％，并可以在没有其它化妆品添加剂的情况下构成组合物的余下部分。
[00106]化妆品组合物可为以下形式:水性溶液剂、水性/醇性溶液剂或油性溶液剂；洗液或血清类型的分散液；无水或亲水凝胶剂；液体或半稠液体的乳液，其通过将脂肪相分散在水相中(OMI)或相反(W/O)而制备；或者平滑、半固体或固体稠度的乳剂或凝胶类型的混悬液或乳液。这些组合物可按照本领域众所周知的通用技术配制。
[00107]当本发明的组合物配制成乳液时，脂肪相的比例可在相对于组合物总重量的5％-80％(重量)范围内。掺入到乳液形式的组合物中的油、乳化剂和辅助乳化剂选自常规用于化妆品领域或皮肤病学领域的那些物质。乳化剂和辅助乳化剂在组合物中可以在相对于组合物总重量的0.3％至30％(重量)范围内的比例存在。当本发明的组合物配制成油性溶液剂或凝胶剂时，脂肪相可占组合物总重量的90％以上。
[00108]本发明的组合物还可以包含化妆品、药学或皮肤病学领域常用的添加剂和辅剂，例如亲水或亲脂胶凝剂、亲水或亲脂活性剂、防腐剂、抗氧化剂、溶剂、芳香剂、填充剂、杀菌剂、气味吸收剂和染料或着色剂。这些不同的添加剂和辅剂的用量是在本领域常规使用的那些量，例如在组合物总重量的0.01％至10％的范围内。根据这些添加剂和辅剂的性质，它们可加到脂肪相中，也可加到水相中。
[00109]可按照本发明使用的示例性油状物包括矿物油(液体石蜡)、植物油(烛果油的液体级分、葵花油)、动物油(全氢化角鲨烯)、合成油(辛酸十六/十八烷酯(purcellin oil))、硅油(环状聚二甲基硅氧烷)和氟化油(全氟聚醚)。脂肪醇、脂肪酸(硬脂酸)和蜡(固体石腊、巴西棕榈蜡和蜂蜡)也可以用作脂肪。
[00110]可使用的乳化剂包括硬脂酸甘油酯、聚山梨醇酯60、PEG-6/PEG-32/硬脂酸甘油酯混合物等。可使用的溶剂包括低级醇，尤其是乙醇和异丙醇以及丙二醇。
[00111]亲水胶凝剂包括羧基乙烯基聚合物(卡波姆)、丙烯酸系共聚物如丙烯酸酯/烷基丙烯酸酯共聚物、聚丙烯酰胺、多糖如羟丙基纤维素、天然树胶和粘土，作为亲脂胶凝剂，代表性的是改性粘土例如膨润土(bentone)，脂肪酸金属盐例如硬脂酸铝和疏水性二氧化硅，或乙基纤维素和聚乙烯。
[00112]可存在油或油性物质以及润肤剂，以提供油包水乳剂或水包油乳剂，这很大程度上取决于所用润肤剂的平均亲水-亲油平衡值(HLB)。这些润肤剂的水平以组合物总重量计可在约0.5％至约50％的范围内。润肤剂可根据这些一般化学类别分类为酯、脂肪酸以及醇、多元醇和烃。
[00113]酯可为单酯或二酯。脂肪酸二酯的实例包括己二酸二丁酯、癸二酸二乙酯、二聚亚油酸二异丙酯(diisopropyl dimerate)和琥珀酸二辛酯。可接受的支链脂肪酸酯包括肉豆蔻酸2-乙基-己基酯、硬脂酸异丙酯和棕榈酸异十八烷基酯。可接受的三元酸酯包括三亚油酸三异丙酯和柠檬酸三月桂酸酯。可接受的直链脂肪酸酯包括棕榈酸月桂基酯、乳酸肉豆蔻基酯、芥酸油酯和油酸十八烷基酯。优选的酯包括椰油醇辛酸酯/癸酸酯(椰油醇辛酸酯和椰油醇癸酸酯的混合物)、肉豆蔻基醚乙酸丙二醇酯、己二酸二异丙酯和辛酸鲸蜡酯。
[00114]适宜的脂肪醇和脂肪酸包括具有10-20个碳原子的那些化合物，例如鲸蜡醇和鲸蜡酸、肉豆蔻醇和肉豆蔻酸、棕榈醇和棕榈酸以及硬脂醇和硬脂酸。多元醇中可用作润肤剂的是直链和支链烷基多羟基化合物。例如，优选丙二醇、山梨醇和甘油。还可以使用聚合多元醇，例如聚丙二醇和聚乙二醇。还尤其优选丁二醇和丙二醇作为渗透增强剂。可用作润肤剂的代表性烃为那些无论何处具有12-30个碳原子烃链的烃，例如矿物油、凡士林、角鲨烯和异构烷烃。
[00115]本发明的化妆品组合物中的另一类功能成分是增稠剂。增稠剂通常以组合物重量的0.1％-20％中的任何量存在。代表性的增稠剂是根据商标卡波姆(Carbopol)可获得的交联聚丙烯酸酯物质。可使用树胶，例如黄原胶、角叉菜胶、明胶、刺梧桐树胶、果胶和刺槐豆胶。在某些情况下，增稠剂功能可由还用作硅酮或润肤剂的物质实现。例如，超过10厘斯(centistoke)的硅橡胶和诸如硬脂酸甘油酯的酯具有双重官能性。
[00116]本发明的化妆品组合物中可掺入底粉。这些底粉包括白垩粉、滑石粉、高岭土、淀粉、蒙脱石粘土、化学改性的硅酸镁铝、有机改性的蒙脱石粘土、水合硅酸铝、热解硅石、辛烯基丁二酸铝淀粉及其混合物。
[00117]本发明的化妆品组合物中也可以掺入其它微量辅助成分。这些成分可包括着色剂、遮光剂和芳香剂。
[00118]一方面，提出使用椰油脂肪酸的蔗糖酯在水性乙醇溶液中的混合物。诸如蔗糖椰油酸酯的混合物已广泛用作化妆品和皮肤病用产品中的药物赋形剂，在亲水和亲油值为15的情况下，其具有作为皮肤润肤剂和保湿剂的性能。使用特定肽的体内试验表明，在蔗糖椰油酸酯中最丰富的蔗糖酯——蔗糖单十二烷酸酯是肽类药物吸收的有效增强剂(Ahsan等，Int.J.Pharm.251:95-203，2003)。这些化学品的特性使蔗糖椰油酸酯成为在本发明肽组合物的化妆品制剂中用作可能的吸收增强剂的有吸引力的候选物。
[00119]提出将肽组合物配制成日用或夜用乳霜。应用部位包括但不限于面部、前额、嘴周围、眼睛周围、眉间部位、颈部、颈至前胸部位、手。
[00120]使用方法。本发明的组合物对需要治疗的受试者具有广泛治疗用途。一方面，受试者是哺乳动物受试者。在一个相关方面，受试者是人。
[00121]一方面，提出本发明的组合物抑制神经递质分泌。组合物可通过阻断小泡运输而作用于神经肌肉板(neuromuscular plate)，阻断小泡运输就阻断了去甲肾上腺素、乙酰胆碱等神经递质的神经分泌。
[00122]另一方面，提出本发明的组合物用于抑制肌肉收缩。在一个相关方面，组合物用于减少由肌肉收缩引起的面部皱纹。例如，组合物可作用于具有收缩特性的成纤维细胞和成肌纤维细胞，或用于抑制肌肉收缩过程中的肌动蛋白丝。这些肽可以抑制涉及收缩活性的肌球蛋白肌钙蛋白复合物或激酶。提出将包含本发明的肽的组合物应用于表现出皱纹或有出现皱纹倾向的面部区域，例如眼睛、鼻子和嘴巴周围的区域，以减低这些部位的皱纹程度，防止形成其它皱纹或更深的皱纹，或者作为预防剂应用，以防止在这些部位出现皱纹。
[00123]另外，所述组合物可在手术中用作短期肌肉松弛药，例如芋螺毒素肽。
[00124]此外，所述肽可以通过影响肌肉丝相互作用和肌肉收缩而用作针对肌肉的肌肉松弛药。
[00125]在一个相关方面，组合物可用于抑制其它类型的肌肉收缩。例如，本发明的组合物可用于治疗肌张力障碍或者运动疾病，其中持续的肌肉收缩引起扭伤和重复的运动或异常姿势。不随意和不时疼痛的动作可累及一块肌肉、一组肌肉，例如在臂、腿或颈或全身的那些肌肉。肌张力障碍可以是局灶性或多灶性肌张力障碍，包括但不限于睑痉挛(眼睑的强迫性闭合)和头颅肌张力障碍(累及头、面部和颈的肌肉)。这些病症的治疗可包括给予本发明的肽和其它药物，例如降低乙酰胆碱水平的药物，包括盐酸苯海索、盐酸苯扎托品、盐酸普罗吩胺和盐酸丙环定。可使用调节神经递质GABA的药物，包括地西泮、劳拉西泮、氯硝西泮和巴氯芬。其它可给予的药物包括作用于多巴胺的那些药物，包括左旋多巴/卡比多巴和溴隐亭、培高利特、普拉克索、罗匹尼罗(ropinerol)、丁苯那嗪和利血平。
[00126]本发明提出的非肌张力失调病症包括偏侧面肌痉挛或震颤，例如与帕金森病相关的那些。本发明的肽可以同一些治疗非肌张力失调病症的药物联合用药，这些药物包括但不限于苯妥英、卡马西平和氯硝西泮。
[00127]本发明的组合物还可以用于治疗全身肌肉痉挛或痉挛状态，全身肌肉痉挛或痉挛状态是指全身上运动神经元障碍，以速度依赖性的肌紧张度增加为特征。痉挛状态可由于多种病因而出现，包括中风、大脑性麻痹、外伤性脑损伤和多发性硬化。由痉挛状态导致的失能包括疼痛、肌肉痉挛、活动度下降和功能性受损。用于痉挛状态的药物，例如巴氯芬、丹曲林和苯二氮
Figure A200680052996D0034154140QIETU
类，可结合本发明的肽一起给予，以治疗这些障碍或病症。
[00128]本发明的组合物可用于治疗多汗症或过度出汗的病症，包括面部多汗、腋下多汗(腋窝出汗)、手掌多汗(手出汗)、脚底多汗和躯干部位出汗。
[00129]还提出本发明的组合物可用于增强伤口愈合。在伤口愈合时，组合物可降低伤口愈合过程中的皮肤修复期间产生的皮肤张力，并增加愈合速率和减少瘢痕量。
[00130]还提出本发明的组合物可用于加速肌肉修复。一方面，本发明的肽通过干扰TGF-β活性而干扰纤维化。纤维化受到首先被转化酶原如弗林蛋白酶活化的TGF-β调节。
[00131]本发明的组合物还可用于改善组织肿胀的方法，该方法包括使细胞与有效量的组合物接触的步骤。在一个相关方面，本发明提供改善皮肤外观的方法，该方法包括局部应用含有本发明的组合物和化妆品可接受的溶媒的化妆品。
[00132]对于治疗应用，提出含有本发明的一种或多种肽的组合物还可以含有第二种药物。提出这些药物在同一制剂中同时给予。还提出将所述药物在单独的制剂中给予和同时给予，同时是指各药物彼此在30分钟内给予。
[00133]另一方面，第二种药物在给予本发明的组合物之前给予。之前给予是指在用本发明的组合物治疗之前1周至给予本发明组合物之前30分钟的范围内给予第二种药物。还提出第二种药物在给予本发明的组合物之后给予。之后给予是指在给予本发明组合物之后30分钟至给予所述组合物之后1周进行给药。
[00134]例如，组合物可含有上下文中记载的有用的第二种药物。例如，组合物可含有用于治疗上述肌肉收缩疾病的第二种药物。还提出组合物可含有作为神经递质抑制剂的第二种药物，包括但不限于箭毒、α-银环蛇毒素、芋螺毒素、阿库铵、加拉明(gallamine)、泮库铵、阿曲库铵、维库铵、哌仑西平AF-DX 116 pF-HHSiD、异丙托铵(ipratroprium)、东莨菪碱和阿托品。
[00135]组合物可含有作为凋亡抑制剂的第二种药物，包括但不限于氯甲基酮(CMK)、氟甲基酮(FMK)(Morwell Diagnostics，Züirich，Switzerland)、R(-)-丙炔苯丙胺盐酸盐、(-)-石杉碱甲((-)-Huperzine A)、Necrostatin-1、抗ARC(具有半胱天冬酶募集结构域的凋亡阻抑物)半胱天冬酶1/ICE抑制剂Z-WEHD、半胱天冬酶-10fmk抑制剂Z-AEVD、半胱天冬酶-13fmk抑制剂Z-LEED、半胱天冬酶-2fmk抑制剂Z-VDVAD、半胱天冬酶-3fmk抑制剂Z-DEVD、半胱天冬酶-4fmk抑制剂Z-YVAD、半胱天冬酶-6fmk抑制剂Z-VEID、半胱天冬酶-8fmk抑制剂Z-IETD、半胱天冬酶-9fmk抑制剂Z-LEHD、泛半胱天冬酶fmk抑制剂如Z-VAD和Z-VKD以及泛半胱天冬酶抑制剂OPH Q-VD。
[00136]本发明的组合物或肽可含有作为用于收缩血管的血管收缩药的第二种药物，包括但不限于鸟氨加压素、去甲肾上腺素、肾上腺素、去氧肾上腺素、萘甲唑啉、羟甲唑啉、安他唑啉、内皮缩血管肽、血栓烷和α-肾上腺素能激动剂。
[00137]本发明的组合物或肽可包含作为止痛药的第二种药物，包括但不限于利多卡因和衍生物、普鲁卡因、美西律、妥卡尼和氟卡尼、丁卡因、苯佐卡因、辣椒辣素、capzasin-P、menthacin和辣椒辣素乳膏(zostrix)。
[00138]本发明的组合物或肽可包含作为抗炎药的第二种药物，包括但不限于镇痛药，包括NSAID和甾族化合物。提出用于本发明的示例性NSAID选自布洛芬、萘普生、Cox-1抑制剂、Cox-2抑制剂和水杨酸盐(酯)。提出的示例性甾族化合物包括但不限于雄激素、雌激素、孕激素、21-氨基类固醇药物、糖皮质类固醇、甾族神经递质(神经活性类固醇)和本领域已知的其它甾族激素。
[00139]本发明还包括一种筛选方法，该方法包括可用于评价本发明肽对神经分泌的作用以及鉴定其它神经递质释放抑制剂的神经分泌测定。筛选测定还可以用于评价本发明组合物的潜在副作用。
[00140]一方面，用于筛选细胞的神经递质分泌抑制剂的方法包括:使含有神经递质的细胞与候选抑制剂接触；然后在有和没有所述抑制剂的情况下，通过测定释放的神经递质量来检测神经递质释放，其中在存在所述候选抑制剂时的神经递质释放与其不存在时的神经递质释放相比下降，将候选物鉴定为神经递质释放抑制剂。本发明的肽可用作测定的阳性或阴性对照，由此确定所述候选抑制剂是否类似地作用于本发明的肽。
[00141]试剂盒和包装。作为又一方面，本发明包括试剂盒，其含有本发明的一种或多种肽或组合物，这些肽或组合物的包装方式有利于它们用于实施本发明的方法。在一个实施方案中，这类试剂盒包含本文描述的化合物或组合物(例如含有单独的或与第二种药物、缓冲剂或治疗化合物组合的一种或多种本发明肽的组合物)，它们包装在诸如密封瓶或密封管的容器中，容器上贴有或包装内附有说明如何应用本发明化合物或组合物实施本发明方法的标签。优选地，化合物或组合物以单位剂量形式包装。试剂盒还可以含有适于按照特定给药途径给予组合物或实施筛选测定的装置。优选地，试剂盒含有说明如何应用本发明组合物的标签。
[00142]另一方面，将少量的本发明化妆品组合物，例如1-100ml，从适宜的容器或涂药器取出后应用于皮肤的裸露部位，必要时，可用手或手指或适宜装置将其涂抹在皮肤上和/或擦在皮肤上。产品可为用作手部或面部治疗而专门配制。
[00143]本发明的化妆品组合物可配制成洗液、霜剂或凝胶剂。组合物可包装在合适的容器中，以适合其粘度和预期用途。例如，洗液或霜剂可包装在瓶子或推进剂驱动的气溶胶装置或配有泵并适于手指操作的容器中。当组合物是霜剂时，其可简单地储存在不会变形的瓶子或挤压容器如管或有盖的瓶子中。因此，本发明还提供装有本文定义的化妆品可接受的组合物的密封容器。
[00144]提供以下的实施例是为了说明本发明，而不是用于限制本发明的范围。
实施例
[00145]实施例1.L-肽和D-肽的合成
[00146]制备合成肽序列并如下表征。在合成过程中使用的所有氨基酸都是如图1所示的L-氨基酸或D-氨基酸(Calbiochem-Novabiochem AG)。
[00147]肽的合成。图1所示的肽(SEQ ID NO 1-23)是通过标准固相Fmoc化学法、在Applied Biosystems 431A肽合成仪上化学合成的。所述肽使用对烷氧基苄基醇树脂(Wang，Bachem，Switzerland)制备，合成中使用了5倍过量的Fmoc氨基酸衍生物、DCCI和HOBt作为活化剂和60分钟偶联时间。侧链保护基包括:三苯基甲基，用于天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和组氨酸(Asn、Gln、Cys和His)；五甲基-色满-磺酰基，用于精氨酸(Arg)；叔丁氧羰基，用于赖氨酸和色氨酸(Lys和Trp)；叔丁基，用于天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸(Asp、Glu、Ser、Thr和Tyr)。肽脱保护后从树脂上切下来，其方法是肽用2.5％H2O、5％三乙基硅烷的TFA溶液于室温处理2小时。在通过过滤去除树脂后，用叔丁基甲基醚使肽沉淀出来，然后离心，将沉淀重悬浮在50％乙酸中，再冻干。然后对冻干的物质实施分析型HPLC和MALDI-TOF MS分析。
[00148]肽的纯化。粗肽用1ml50％乙酸的H2O溶液重配，低分子量杂质通过在Sephadex G-25上进行凝胶过滤去除。
[00149]冻干以空体积洗脱的物质，用1ml 50％乙酸的H2O溶液重配，在Vydac柱(250×22mm，10-15μm)上进行RP-HPLC。以9ml/分钟的流速通过0.1％TFA/乙腈至0.1％TFA/H2O的线性梯度洗脱柱子，在60分钟内从10％到100％流洗。于220nm或280nm监测洗脱液的光密度。收集流分，通过MALDI-TOF分析。合并含有预期分子量的肽的流分并冻干。然后对纯化的物质进行MALDI-TOF MS和在C18 nucleosil柱(250×4mm，5μm)中进行分析型HPLC。该柱以1ml/分钟通过乙腈至0.1％TFA/H2O的线性梯度洗脱，在30分钟内从0％到60％流洗。使用Waters 991光电二极管阵列检测器于220nm或280nm进行检测。
[00150]质谱。α-氰基-4-羟基肉桂酸购自Sigma(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，Mo，USA)。高效液相层析(HPLC)级三氟乙酸购自Fluka(Buchs，Switzerland)，HPLC级H2O得自Romil Ltd(Amman Technik SA，
Figure A200680052996D0038173102QIETU
Switzerland)，乙腈购自Biosolve Ltd(Chemie Brunschwig，Basel)。所有其它化学品都为最高纯度，无需进一步纯化即可使用。MS分析使用以延时引出和线性模式操作的Perseptive BiosystemsMALDI-TOF Voyager DE-RP质谱仪(Framingham，MA，USA)进行。
[00151]实施例2:逆向逆型异构体的合成
[00152]本发明的肽可为反向合成的全D氨基酸肽，以防止天然蛋白酶解(即全D逆向逆型肽)(参见美国专利公开号20050106695)。本发明的全D逆向逆型肽提供了具有类似于天然肽的功能特性的肽。
[00153]用于合成D氨基酸链以形成逆向逆型肽的方法是本领域公知的。参见例如Jameson等，Nature368:744-46，1994；Brady等，Nature368，692-93，1994；Guichard等，J.Med.Chem.39:2030-39，1996。具体地说，逆向肽通过经典的F-moc合成产生，通过如上所述的质谱进一步分析。它们通过HPLC纯化。
[00154]示例性的逆向逆型肽使用Fmoc化学合成，9R-D肽(GYGRRRRRRRRRG)(SEQ ID NO:13)被9Rrev-D肽(GRRRRRRRRRGYG)(SEQ ID NO:14)取代。
[00155]实施例3:神经递质分泌的评价
[00156]分化和神经递质分泌测定。为了评价本发明的肽对神经递质分泌的效力，首先建立了研究小泡神经递质释放的功能性实验模型。
[00157]大鼠嗜铬细胞瘤(PC12)细胞系，来源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤[Greene等，Proc Natl Acad Sci USA，73:2424-8，1976]，常常用作神经分泌细胞和神经元细胞的体外模型(Greene等，Proc Natl AcadSci USA，73:2424-8，1976；Tischler等，Lab Invest.39:77-89，1978)。因为PC12细胞在刺激时显示出小泡儿茶酚胺释放(Chen等，AmJPhysiol，266:C784-93，1994)，并使用在突触神经传递中有功能的相同保守机器(Burgoyne等，AnnNYAcad Sci，710:333-46，1994；Burgoyne等，TrendsNeurosci，18:191-6，1995；Burgoyne等，Bioessays，20:328-35，1998)，所以选择该细胞作为神经分泌测定的模型系统。
[00158]P12细胞的增殖和培养。可获得大量截然不同的PC12细胞系。其中许多表现出聚集倾向性，并表现出较差的细胞培养特性，包括高度可变的乙酰胆碱合成和培养物之间的极端异质性，有关综述参见Martin等，Methods Cell Biol.71:267-86，2003。因此，对P12细胞系(PC12 ES)需要的特性进行了详细表征。如下所述，获得了适用于该细胞系的生长条件。
[00159]PC12细胞系的分化:使用PC12-ES细胞作为对照，对神经突增生进行了分析。对于两种细胞系，在存在神经生长因子(NGF，50ng/ml)或蛋白激酶抑制剂星孢菌素(STSP，100nM)的情况下进行分化(Hashimoto等，Exp Cell Res.184:351-9，1989；Hashimoto等，JNeurochem.53:1675-85，1989)。在完全Dulbecco培养基(DMEM-CM)和仅补加1％马血清的DMEM高葡萄糖(DMEM-DM)中测定PC12-ES细胞的分化。
[00160]为在NGF或STSP存在下检验PC12细胞系的分化形态，通过相差显微镜监测细胞，并在加入分化诱导物后以不同的间隔(1-7天)获取图片。PC12-ES细胞在用STSP诱导后有效分化。细胞在DMEM-CM培养基中于24小时内长出神经突，或者在DMEM-DM中于48小时内长出神经突。在加入神经生长因子(NGF)24小时后还观察到PC12-ES终末分化，但仅在DMEM-DM中才观察到。PC12-ES细胞系在无血清培养基中响应NGF而分化完成(2-3天)。不过，NGF对细胞的作用在复杂培养基中较慢(4-5天)。在未加入NGF或STSP的对照样品中，未观察到神经突增生。这些结果表明，未处理的PC12细胞有助于分裂但不分化，保持圆形形态，没有神经突延伸。
[00161]PC12-ES的神经递质分泌。PC12细胞为研究受调节的分泌提供了众多优势。在这些细胞中，致密核心大泡(LDCV)的胞吐作用易于根据预先标记的细胞的放射性去甲肾上腺素([3H]NE)释放来测定[Greene等，Brain Res，129:247-63，1977；Greene等，J Neurochem，30:579-86，1978；Greene等，JNeurochem.30:549-55，1978；Greene等，Brain Res.138:521-8；1977；Greene等，Nature 268:349-51，1977]。通过用PC12-ES细胞检测[3H]NE激发的分泌，进行了神经分泌测定。测试了不同的分泌缓冲液(例如钙分泌缓冲液CaSB和CaSB-葡萄糖)和促分泌素(80mM钾、0.1mM烟碱或1mM卡巴胆碱(Carbachol)；参见表1)，促分泌素定义为引起或刺激分泌的物质。用未分化的PC12细胞以及NGF或STSP分化细胞，测定了[3H]NE激发的分泌。
[00162]PC12-ES细胞未经处理、用STSP(100nM)处理48小时，或者用NGF(50ng/ml)处理48小时，然后加载[3H]NE，并为释放检测做准备。然后用钾(80mM)、烟碱(0.1mM)或卡巴胆碱(1mM)刺激细胞15分钟。收集培养基，通过液体闪烁计数测定释放的[3H]NE以及总细胞含量。用不含促分泌素的钙分泌缓冲液(CaSB)或补加11mM葡萄糖的CaSB(CaSB-葡萄糖)测量基础分泌。数据在表1中表示为分泌百分率:[释放量/(释放量+细胞裂解物中的量)]×100。净分泌是促分泌素刺激的释放减去基础释放。
[00163]存在相当大的[3H]NE诱发释放(表1)，这些结果与文献报告的结果(Avila等，MolPharmacol.64:974-86，2003)相一致。在所有测试条件下，[3H]NE的释放百分率都是可检测的。未分化的细胞表现出的[3HINE载荷低于分化细胞，但主要缺点的是，这些细胞对天然神经递质分泌抑制剂如肉毒杆菌神经毒素无反应。因此，以后的试验都用分化的PC12-ES细胞进行。
                   表1
 
促分泌素 未分化细胞 NGF分化细胞 STSP分化细胞
CaSB 9.5％ 14％ 21.7％
CaSB-高K+ 42％ 24％ 44.3％
CaSB-烟碱 40.3％ 21％ 47.8％
CaSB-卡巴胆碱 44.7％ 27％ 46.5％
CaSB-葡萄糖 21.3％ 12％ 18.5％
CaSB-葡萄糖高K+ 46.5％ 15.9％ 48.5％
CaSB-葡萄糖烟碱 32.8％ 33.6％ 47.8％
CaSB-葡萄糖卡巴胆碱 37.24％ 32.4％ 57％
[00164]实施例4:神经分泌的抑制
[00165]采用上述神经分泌测定，测试了与TAT-PTD(L-TAT)融合的肽对神经递质的抑制，并与单独使用的L-TAT(SEQ ID NO:3)进行了对比。对在限定条件下生长的PC12细胞系中能够有效和选择性阻断神经递质释放的合成肽进行了体外筛选。
[00166]对于该测定，使用已公布的合成肽，这些合成肽模拟突触结合蛋白、SNAP和SNAP-25[L-Tat-ESUP-A(SEQ ID NO:1)和乙酰基-L-Tat-六肽(SEQ ID NO:2)]的区段的氨基酸序列。已知这些肽通过抑制小泡停靠阻滞嗜铬细胞的Ca2+依赖性分泌。
[00167]PC12细胞用DMEM-WM(Dulbecco改良Eagle培养基(GIBCO，目录号31968，补加青霉素和链霉素各25单位)洗涤，加载DMEM-CM(补加6％马血清和6％胎牛血清的DMEM-WM)中的[3H]去甲肾上腺素(NE；0.5μCi/ml)1-2小时。细胞用DMEM-WM洗涤1小时，然后以5分钟间隔洗涤2次。与CaSB-葡萄糖5mM K+(CaSB-葡萄糖:140mM NaCl，5mM KCl，2mM CaCl2，11mM葡萄糖，[pH7.4])温育15分钟后测定基础释放。在载荷NE之后但在诱导分泌之前将肽以限定浓度加入细胞中。细胞用85mM K+(CaSB-葡萄糖，Na+相应减少)去极化15分钟，以测定所刺激的释放。取过融合物(superfusate)(1ml)加至管中。贴壁细胞溶解在CaSB-葡萄糖-0.1％Triton(1ml/孔)中。通过对澄清的过融合物和细胞裂解物分别进行液体闪烁计数，测定释放的和未释放的放射性标记的神经递质的量。通过加入释放的和保留的放射性计算总摄取，释放百分率计算为(释放的计数/总摄取计数)×100。结果也用神经分泌的抑制百分率表示。
[00168]含有L-TAT-ESUP-A、L-Tat、L-Tat-六肽的培养物表现出对PC12神经递质分泌的剂量依赖性抑制，见下表2。单独的ESUP-A仅显示出最小抑制。
[00169]表2
 
肽 L-Tat-ESUP-A L-Tat L-Tat-六肽 ESUP-A
10μM 30％ >20％ <10％ NA
50μM 40％ 50％ <35％ NA
100μM 50％ 55％ >50％ 20％
250μM 70％ 70％ 60％ NA
[00170]因为上述结果表明L-Tat是有效的神经递质释放抑制剂，所以还测试了D-类似物D-Tat(SEQ ID NO:12)对PC12神经分泌的作用。L-Tat肽和D-Tat肽两者均显示出对PC12细胞的神经递质诱发分泌的明显抑制，大约抑制50％-55％的分泌。测试了其它肽，证实的抑制如下:9R-L(SEQ ID NO:5)大约70％抑制，9K-L(SEQ ID NO:6)大约20％抑制，9R-D(SEQ ID NO:13)大约65％抑制，9Rrev-D(SEQ IDNO:14)大约57％抑制，9R-L-Ac-am(SEQ ID NO:11)大约67％抑制。
[00171]除了ESUP-A，测试的所有肽都显示出对PC12细胞的神经递质诱发分泌的明显抑制。然而，肽L-Tat(SEQ ID NO:3)即便在单独使用时也表现出对诱发神经分泌的60％以上的抑制。该结果出乎意料，以前即便在L-Tat被广泛用作有效的转导结构域时也没有报道过。
[00172]测试L-Tat和D-Tat肽在48小时时间段内的稳定性，确定了抑制PC-12细胞的神经分泌的肽的持续存在性。如上用以100μM温育的L-Tat、D-Tat和L-Tat49-86(SEQ ID NO:4)和MRPEDpep(SEQID NO:7)(100μM)进行神经分泌测定。分泌抑制结果见下表3。
[00173]表3
 
时间 L-Tat D-Tat L-Tat49-86 MRPEDpep
无血清 65％ 35％ 50％ 17％
0小时 50％ 40％ <20％ >20％
1小时 38％ 50％ >10％ 23％
24小时 35％ 45％ 26％ 15％
48小时 39％ 45％ 25％ NA
[00174]在有或没有血清的情况下，将肽9R-D、9Rrev-D、9R-L/Ac-Am和9R-L与PC12细胞一起培养48小时，对这些肽的稳定性的进一步评价表明，在48小时时间段内，所有这些肽都保持约80％至90％的抑制水平，显示出这些肽在培养物中的良好稳定性。
[00175]根据MTT测定的检测，以上的肽没有一个表现出对PC12细胞的任何显著细胞毒性作用。在24小时时出现非常小的毒性，48小时时的细胞毒性仅稍微大于24小时时的细胞毒性。当肽以500μM给予时，细胞毒性一般下降到约90％活细胞的程度。
[00176]评价其它肽如MRP(SEQ ID NO:7)、L-Tat-MRP(SEQ IDNO:9)、3D-MRP(SEQ ID NO:8)、L-Tat-3D-MRP(SEQ ID NO:10)对PC12细胞的神经分泌的抑制。图2显示了所测试的所有肽对神经分泌的剂量依赖性抑制。这些结果还表明，L-T与MRP或3D-MRP肽的连接显著改善了对细胞的神经分泌的抑制。
[00177]L-Bel1(其序列与L-Tat的相同)、其D-氨基酸取代类似物(D-Bel1)和L-Bel2(与L-Tat49-86相同)在该测定中单独的或结合先前测定的L-Tat和其它肽一起进行了测试。
[00178]与L-Tat(25μM)组合培养的ESUP-A(25μM)稍微改善ESUP-A的抑制，但L-Tat与阿基瑞林(25μM)没有协同作用。100μM的肽L-Bel1是有效的抑制剂，对诱发的神经分泌表现出60％以上的抑制。显然，L-Bel1增强显示出非常小的抑制作用的某些肽(例如ESUP-A)的效力(图3)。结果还表明，L-Bel1的抑制作用是剂量依赖性的。此外，由MTT增殖测定证实，L-Bel1对PC12细胞没有显著的细胞毒性。L-Bel1在血清中非常稳定，在PC12细胞存在下在体外测定中也非常稳定。同样，D-Bel1也是有功能的。
[00179]进行了进一步分析来比较单独的9R-D、9R-MRP(SEQID NO:22)和与L-阿基瑞林或D-阿基瑞林混合的9R-D的抑制作用。采用肽9R-D(50μM)、融合肽9R-MRP(50μM)或与D-阿基瑞林混合的9R-D(各50μM)的细胞培养物，全都抑制分泌达约70％。肽9R-D(50μM)表现出约75％的抑制，而与阿基瑞林混合的9R-D(各25μM)表现出约65％的抑制。L-阿基瑞林(50μM)或D-阿基瑞林(50μM)均未表现出对细胞的神经分泌的抑制。
[00180]这些结果表明，本文所述的几种肽是高度有效的神经递质释放抑制剂，例如L-Bel1(L-Tat)、其D-类似物(D-Bel1)。这些肽提供了抑制神经肽分泌的有用物质，并可以为抑制患者的神经递质提供有用的治疗，例如治疗肌肉收缩、皱纹和与神经递质释放相关的其它病症。
[00181]实施例5:碱性合成肽是前原转化酶家族的有效抑制剂
[00182]枯草杆菌蛋白酶样前蛋白/前激素转化酶(PC)家族成员在加工由激素和生长因子至细菌毒素和病毒糖蛋白的各种蛋白前体时起核心作用。在碱性氨基酸残基处发生的蛋白酶解由碱性氨基酸特异性前蛋白转化酶介导，所述前蛋白转化酶包括:PC1/3、PC2、弗林蛋白酶、PACE4、PC4、PC5/6和PC7。相比之下，在非碱性残基处的蛋白酶解通过枯草杆菌蛋白酶/kexin样同工酶-1(SKI-1/S1P)和新鉴定的神经凋亡调节转化酶-1(PCSK9/NARC-1)进行。除了许多生理过程需要它们以外，这些酶还涉及多种病理，例如癌症、肥胖、糖尿病、脂质障碍、感染性疾病、动脉粥样硬化和神经变性性疾病(Scamuffa等，FASEB J.20:1954-63，2006)。这些PC酶可作用于多种底物，例如突触结合蛋白，或者可作用于生长因子，例如TGF-β。
[00183]已表明弗林蛋白酶加工许多前蛋白，包括TGF-β、BMP-4、前-β-NGF、Notchl受体、HIV gp160和几种金属蛋白酶(Dubois等，Am J Pathol 158:305-316，2001)。TGF-β的过量表达与纤维化的发展有关，有可能是通过抑制基质蛋白降解和增加胶原表达(Dubois等，出处同上)。
[00184]为确定本文所述肽是否对涉及诸如纤维化的病症或障碍的PC酶的活性有影响，以抑制弗林蛋白酶底物产荧光叔丁氧羰基(Boc)-RVRR-7-氨基-4-甲基香豆素(MCA)切割的百分率检测所述肽在体外对弗林蛋白酶活性的影响。
[00185]所有体外酶研究都在室温下进行，终体积为50-100μl，采用96孔黑色平底板。缓冲液的组成为100mM HEPES、1mM CaCl2、0.5％TritonX-100和1mM 2-β-巯基乙醇，pH7.5。使用100μM的Boc-RVRR-MCA作为产荧光底物进行测定。在有或没有不同浓度的合成肽D-9Rac/am(SEQ ID NO.15)、L-Bel1(SEQ ID NO.3)或L-9K(SEQ ID NO.6)的情况下，将重组弗林蛋白酶(0.8U活性)与Boc-RVRR-MCA温育。1单位活性定义为于30℃每分钟可由产荧光的Boc-RVRR-MCA释放1pmol MCA的弗林蛋白酶量。通过荧光分光光度计仪器，以370nm/460nm的激发和发射波长监测Boc-RVRR-MCA的高荧光7-氨基4-甲基香豆素(MCA)释放。为测量Ki(app)值，抑制剂浓度在宽得足以产生残余活性在对照值的25-75％范围内变化。
[00186]这些试验表明，弗林蛋白酶活性受特异性弗林蛋白酶抑制剂癸酰基(d)-RVKR-氯甲基酮(CMK)(CALBIOCHEM)抑制(图4A)。另外，螯合剂EDTA和EGTA有效抑制弗林蛋白酶活性。这些结果与表明弗林蛋白酶为Ca2+依赖性细胞内切蛋白酶的其它数据相一致。
[00187]许多本文描述的合成肽(参见例如图1，SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.23)都是有效的PC抑制剂，对弗林蛋白酶表现出较大的特异性。如图4B中所证实，包括D-9Rac/am(SEQ ID NO.15)、D-6R(SEQID NO.19)和L-Bel1(SEQ ID NO.3)在内的碱性肽在与作为底物的Boc-RVRR-MCA相比时完全抑制体外弗林蛋白酶活性(Ki，单位为nM)。似乎D-9Rac/am(SEQ ID NO.15)作为抑制剂要比所有的被测肽都更有效(图5)。因此，尽管0.7μM D-9Rac/am足以完全阻断弗林蛋白酶对Boc-RVRR-CMA的切割(图5A)，但L-Bel1和L-9K需要较高量(分别为3.5μM和>3.5μM)来完全阻断该切割(图5B和图5C)。D-9Rac/am表现出Ki(app)＝170nM，相比之下，对于L-Bel1，Ki(app)＝370nM，对于FI-I(CALBIOCHEM)，Ki＝1nM。因此，在这些条件下进行测试时，D-9Rac/am是最强的弗林蛋白酶抑制剂。
[00188]实施例6:碱性肽抑制胞内弗林蛋白酶活性
[00189]上述试验表明，某些合成肽在酶-底物测定中可以有效抑制弗林蛋白酶活性。但是，有用的是通过测定在表达弗林蛋白酶的PC12-ES细胞中的活性，确定所述肽在细胞环境中是否对弗林蛋白酶活性具有相同作用。
[00190]为监测胞内弗林蛋白酶活性，下述处理之后用冰冷的磷酸缓冲盐溶液(PBS 1x)洗涤80％汇合的PC12-ES细胞2次:于4℃以800×g离心5分钟，重悬浮在100mM HEPES、1mM CaCl2、0.5％TritonX-100和1mM 2-β-巯基乙醇pH7.5中，于4℃超声处理6次，每次10秒，然后于4℃以8000×g离心20分钟。样品中的蛋白浓度使用二金鸡纳酸蛋白测定试剂盒(Pierce Chemical Co.)进行测定。
[00191]胞内弗林蛋白酶活性用弗林蛋白酶特异性荧光底物叔丁氧羰基(Boc)-RVKR-7-氨基-4-甲基香豆素(MCA)检测。简而言之，将如上所述制备的细胞裂解物(20μg-60μg蛋白)与100μMBoc-RVRR-MCA在96孔黑色平底板中于室温温育至少6小时，通过365nm的激发和450nm的发射检测荧光。
[00192]组成型检测了PC12-ES细胞中的弗林蛋白酶活性(图4)。PC12-ES细胞与多种弗林蛋白酶抑制剂的培养物表明，胞内弗林蛋白酶活性受到高浓度EDTA(50mM)、EGTA(50mM)(图6A)和弗林蛋白酶合成抑制剂Dec-RVKR-CMK(50μM，CALBIOCHEM)(图6B)抑制，表明检测的酶活性基本为弗林蛋白酶的酶活性。此外，弗林蛋白酶活性被D-9Rac/am(100μM)(图6C)和D-6R(200μM)(图6D)这二者封闭。与200μM的D-6R(SEQ ID NO.19)相比，仅需要100μMD-9Rac/am(SEQ ID NO.15)就可以封闭细胞裂解物中检测的胞内弗林蛋白酶活性。因此，与以上的酶/底物测定类似，在抑制弗林蛋白酶方面似乎D-9Rac/am(SEQ ID NO.15)是比D-6R(SEQ ID NO.19)更有效的抑制剂。
[00193]实施例7:合成弗林蛋白酶抑制剂和富精氨酸肽对神经分泌的作用
[00194]使用在以上实施例3中描述的神经分泌测定，评价了合成弗林蛋白酶抑制剂癸酰基-Arg-Val-Lys-Arg-CMK(FI-I，CALBIOCHEM)对神经递质分泌的作用。FI-I是肽基氯甲基酮，能结合弗林蛋白酶的催化位点，并阻断其活性，因此，它可以用作病毒糖蛋白的高特异性切割抑制剂和病毒复制阻断剂(Sugrue等，J.Gen.Virol.82:1375-86，2001；Wang等，J.Biol.Chem.276:35953-60，2001)。
[00195]简而言之，使未分化的PC12-ES细胞载荷[3H]NE，并为诱发释放检测做准备。然后用钾(80mM)+/-特异性弗林蛋白酶抑制剂或合成肽刺激细胞15分钟。收集培养基，通过液体闪烁计数测定释放的[3H]NE以及总细胞含量。用补加11mM葡萄糖的钙分泌缓冲液(CaSB-葡萄糖)检测基础分泌。数据在表4中表示为分泌百分率＝[释放量/(释放量+细胞裂解物中的量)]×100。净分泌是促分泌素刺激的释放减去基础释放。
[00196]FI-I对PC12-ES细胞的神经递质诱发的分泌显示出显著抑制。当以100μM使用时，FI-I表现出50％的分泌抑制，相比之下D-9Rac/am为76.2％抑制，D-6R为57.4％抑制(表4)。
[00197]表4:FI-I对PC12-ES细胞的诱发神经递质分泌的作用
 
[肽]μM D-9Rac/am D-6R L-Bel1 FI-I
10 52.4％ 39.6％ 24.6％ 12.6％
100 76.2％ 57.4％ 56.4％ 50％
[00198]如在表4.中所证实，该抑制作用是剂量依赖性的。此外，FI-I对PC12-ES细胞没有明显的细胞毒性，如MTT增殖测定所证实。
[00199]实施例8:肽和弗林蛋白酶的亚细胞定位和共定位
[00200]对两种目标肽L-Bel1(SEQ ID NO.3)和D-9Rac/am(SEQID NO.15)进行了FITC标记(Anaspec)，以追踪它们对PC-12细胞(大鼠嗜铬细胞瘤细胞)的内化。在观察到L-Bel1-FITC缀合物内化后，使用针对弗林内切蛋白酶(furin endoprotease)的单克隆抗体通过共焦显微镜分析进行了共定位研究。
[00201]将PC-12细胞重悬浮在含有6％去补体马血清、6％去补体胎牛血清并补加25U/ml青霉素-链霉素-L-谷氨酰胺的高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(Gibco BRL，Life Technologies)中。将细胞以3×104个细胞/孔(200μl)接种在8孔显微镜载玻片小室(BD Biosciences)中，所述小室预先用胶原I(Roche Diagnostics)溶液(0.0007％)包被。在37℃/5％CO2条件下过夜温育后，使用新鲜的无血清培养基洗涤细胞2次，然后在有或没有所述肽的情况下温育指定时间。然后使用2％BSA/PBS溶液洗涤细胞2次，再用3％多聚甲醛溶液于室温固定10分钟。再次洗涤细胞2次，然后用皂苷缓冲液(0.1％皂苷、2％BSA、10mM HEPES的PBS溶液)于室温透化10分钟。将细胞与针对弗林内切蛋白酶的单克隆抗体温育，用2％BSA/PBS溶液洗涤2次，再与二抗抗mIgG-Alexa red温育。两次温育均于室温进行1小时。在指明时，用DAPI二盐酸盐(0.02μg/ml)于室温处理细胞10分钟，用于核染色。用冷PBS进行最后的洗涤步骤2次，小室上部用去除装置分开。对载玻片进行装片并密封，于4℃避光保存，直至共焦显微镜分析。
[00202]荧光图像通过共焦激光扫描显微镜(Zeiss LSM 510)获得，该显微镜带有氩(488nm)、氦-氖1(543nm)和enterprise(364nm)激光源；与倒置荧光显微镜(Zeiss Axiovert 100 M)相连接，配备有63X/1.4PL APO铬酸盐物镜。发射的荧光通过一组滤光片选择，分辨率以RGB计为512×512像素。
[00203]FITC-标记的肽L-Bel1在所有被测浓度(IμM和100μM)均穿过PC12细胞的基底膜。图7A图解了单独的LBel-1染色，图7B显示了PC-12细胞的L-Bel1和弗林蛋白酶染色。染色结果表明，在温育2分钟后肽内化产生胞质点断信号，但在处理10-30分钟后发展成核(主要是核仁)染色模式。弗林内切蛋白酶染色显示了胞质点断结构，有可能鉴定出含有该酶的未成熟分泌颗粒(图7B)。
[00204]采用FITC-Bel1和抗弗林蛋白酶抗体-Alexa red双染色细胞的初步试验表明没有共定位，即便两种分子都出现胞质定位(图7B)。可使用分泌性囊泡的特异性标记进行进一步测定，以更精确地共定位该蛋白。
[00205]实施例9:肽对肌动蛋白细胞骨架组构的作用
[00206]如上所述，本发明的合成肽被内化进入细胞囊泡。F-肌动蛋白在引导囊泡和蛋白运输以及细胞骨架重排方面起核心作用。基于肌动蛋白与囊泡运输和肽内化入囊泡的关联，检测了所述肽对肌动蛋白细胞骨架组构的影响。
[00207]如前所述制备含有PC-12细胞的载玻片用于定位研究。简而言之，使细胞接触多种浓度的FITC标记肽或未标记肽达30分钟，固定，然后透化。最后，用鬼笔环肽-四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)(Sigma Aldrich)缀合物对F-肌动蛋白进行荧光标记，用皂苷缓冲液(0.25μg/ml)稀释，并用DAPI二盐酸盐(Sigma Aldrich)(0.02μg/ml)于室温核染色最多30分钟。最后，对载玻片进行装片和密封，于4℃避光保存。如先前所述，通过共焦显微镜分析了所述肽对肌动蛋白聚合的影响。
[00208]用标记或未标记的肽L-Bel1和D-9Rac/am以2-10μM的浓度处理PC-12细胞，结果表明主要在粘着斑处的肌动蛋白含量和组构降低(图8A和图8B)。所述肽似乎诱导处理细胞的形态发生改变，例如细胞形状更圆(图8)。L-Bel1和D-9Rac/am肽对处理细胞的作用相当(图8A和图8B)。该作用提示，合成肽可诱导肌动蛋白解聚(或阻断肌动蛋白聚合)。这种作用在未处理细胞或接触过肽L-9K的细胞(其中粘着斑仍被强染色)中未观察到。不过，在较高浓度(100μM)几乎丧失了所述作用，细胞在它们的细胞过程中显示出强肌动蛋白染色。这些结果提示，低浓度的肽L-Bel1(SEQ ID NO.3)和D-9Rac/am(SEQ IDNO.15)足以促进肌动蛋白重构。
[00209]实施例10:肽对细胞收缩的作用
[00210]为研究所述肽对与神经肌肉接点的神经分泌细胞相关的肌肉细胞的作用，将肽与在可模拟收缩作用的起皱基质(硅)上生长的大鼠肺成纤维细胞(LF)培养。这些细胞具有成肌纤维细胞表型，例如产生TGF-β，这使它们适于细胞收缩/松弛研究。
[00211]基本如前所述制备起皱硅氧烷基质(Harris等，Science.208:177-179，1980；Hinz等，Mol Biol Cell.12:2730-41，2001)。简而言之，将50μl硅氧烷(聚二甲基硅氧烷；30,000厘斯，Dow Corning，Midland，MI)沉积在自制观察室底部的35mm圆形玻璃盖玻片上，将其以1,000rpm离心2分钟，以铺开粘性流体。然后通过使硅氧烷表面穿过本生焰(Bunsen flame)使硅氧烷表面发生交联；1秒燃烧时间产生的表面硬度限制了具有高收缩力的成纤维细胞的皱纹形成(Hinz等，出处同上)。最后用10μg/ml胶原I型(Sigma)于37℃包被聚合的硅氧烷表面2小时。将肺成纤维细胞以3.5×103个细胞/cm2的密度接种，在试验前培养1-2天。
[00212]由Sprague Dawley大鼠获得肺活检样品，分成小的组织切片，置于培养皿中，然后于37℃在5％CO2下维持在含10％去补体胎牛血清(FBS)并补加100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、4mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培养基(GibcoBRL，Life Technologie)的有机培养物中。细胞维持2-3周(2-8代)，频繁更换培养基。在汇合时，用0.125％胰蛋白酶-EDTA混合物(Sigma)于37℃使细胞与培养皿剥离达10分钟，将细胞重悬浮在完全培养基中，以3.5×103个细胞/cm2接种在包被硅的组织培养皿上。1-2天后，用合适的肽以10μM或50μM处理细胞，通过活体视频显微镜跟踪肽诱导的细胞收缩/松弛作用1-3小时。还使用保持在类似条件下的平滑肌细胞系(A7r5)跟踪针对这些在硅片上生长的细胞的肽诱导的作用。
[00213]在控制温度和CO2条件下，使用配有旋转盘Nipkow共焦头(Yokogawa CSU10)、Photometrics CoolSNAP-HQ CCD照相机和Metamorph6.0采集软件(Visitron Systems，Puchheim，Germany)的ZeissAxiovert 200M(Zeiss，Oberkochem，Germany)，进行活体视频显微镜检。使用10x(Plan-Neofluar，Ph1，NA 0.3)和20x(Plan-Apochromat，Ph2，NA 0.5)Zeiss物镜以1帧/10秒的速率获得相位对比序列。
[00214]还使用应力胶原网格收缩测定评价了所述肽的作用。对于收缩测定，如先前所述(Hinz等，出处同上)，使肺成纤维细胞以1.75×105个细胞/ml在机械限制的胶原网格(1.0mg/ml大鼠尾胶原I，BD Biosciences)上生长5天。对于收缩检测，使用注射器解除网格，30分钟后在暗视野照明下检测网格直径。每个试验条件评价最少5个网格，计算平均值，网格直径减少对释放前的网格直径标准化(＝％收缩)。在凝胶释放前的60分钟内加入肽。
[00215]接触肽L-Bel1和D-9Rac/am(10μM和50μM)的肺成肌纤维细胞显示出缓慢但恒定的硅基质折皱和细胞脱落消失，表明了对细胞的肽依赖性松弛作用(图9A和图9B)。对与相同肽温育的平滑肌细胞观察到同样的作用。对用肽L-9K处理的细胞未观察到这些作用。该肽诱导的细胞松弛与对用肽L-Bel1和D-9Rac/am处理的PC-12细胞观察到的细胞过程中的肌动蛋白含量减少相一致。减少的肌动蛋白含量和粘着斑的完整性可能有助于细胞由硅基质脱落、细胞形状改变和细胞松弛。
[00216]这些结果表明了在应力胶原网格收缩测定中肽诱导的细胞收缩/松弛作用。初步结果表明，与对照凝胶(未加入肽)和L-9K(SEQID NO.6)处理的凝胶相比，由肽L-Bel1(SEQ ID NO.3)和D-9Rac/am(SEQ ID NO.15)诱导的成肌纤维细胞介导的胶原凝胶收缩降低(图10)。
[00217]这提示，肽L-Bel1和D-9Rac/am诱导细胞松弛，此细胞松弛与和以上公开的肌动蛋白丝相关的结果有关联。
[00218]实施例11:肽组合物的给药
[00219]为测定本发明的肽组合物治疗面部皱纹的功效，进行临床研究。首先在动物模型中测试了肽组合物的乳剂(作为化妆品)，以证实无毒性作用和无刺激性作用。首先，控制肽在乳剂中的完整性和稳定性以及乳化剂的可能改变(乳化剂的完整性)。然后测试乳化肽对小鼠和兔的异常毒性、剂量依赖性毒性以及可能的皮肤反应。优选可使用哺乳动物，更优选使用人、牛、马、猫、狗、猪、山羊、绵羊、大鼠、豚鼠、小鼠、兔或其它适宜的哺乳动物作为皮肤病学研究模型。
[00220]例如，SCID-hu异种移植模型(Boehncke WH ArchDermatol Res 291:367-373，1999)允许人移植物出现在免疫缺陷SCID小鼠中，能够检验对人皮肤的作用。用于测试产品对微型猪细胞的作用的体外模型描述于Wu等，Br J Dermatol.152:1263-67，2005，而Duva等人(Exp Dermatol.12增刊，2:64-70，2003)描述了用于评价化妆品对人皮肤作用的体外模型。其它模型是本领域技术人员众所周知的(例如Dreher等，SkinPharmacol App l Skin Physiol.15增刊1:40-58，2002)。
[00221]在动物模型中测试肽乳剂之后，将组合物给予健康志愿者。通过首先获得健康志愿者的侧眶前区的硅印模(silicon imprint)，进行检测肽组合物有效性的皮肤形貌分析。每天施用2次所述肽的油/水乳剂。志愿者在一个侧眶前区应用含所述肽的乳剂，在相对的一侧施用单独的乳剂。在0、15和30天后得到硅印模，通过共焦激光扫描显微镜分析，评价处理前后的皮肤表面发展。共焦显微镜使用反射模式和三维分析，以评价粗糙度的不同参数。依靠外部白光在放大镜下观察，在处理前和处理后(第15天和第30天)选择相同皮肤部位。如果结果表明调节面部肌肉、松弛面部紧张度和减小已形成的皱纹的深度，则所述肽可有效地治疗皱纹。皱纹深度改善至少30％以及30％-50％被认为是皱纹深度显著改变。
[00222]预期本领域技术人员会联想到如以上说明性实施例所叙述的本发明的众多修改和变化。因此，只有出现在随附权利要求书中的那些限制才适用于本发明。
序列表
Figure A200680052996E00542
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Claims (39)

1.一种含有一种或多种肽的组合物，其中所述一种或多种肽基本上由在SEQ ID NO：1-23中所示的氨基酸序列组成。
2.权利要求1的组合物，其中所述肽包含所需氨基酸的L-对映体。
3.权利要求1的组合物，其中所述肽包含所需氨基酸的D-对映体。
4.权利要求1的组合物，其中所述肽包含所需氨基酸的L-对映体或D-对映体的混合物。
5.权利要求1-5中任一项的组合物，其中所述一种或多种肽是在SEQ ID NO：1-23中所示的肽的逆向逆型异构体。
6.权利要求1-6中任一项的组合物，其中所述一种或多种肽是融合蛋白。
7.权利要求1-6中任一项的组合物，其中所述一种或多种肽与蛋白易位结构域融合。
8.权利要求7的组合物，其中所述蛋白易位结构域由HIV TAT蛋白获得。
9.权利要求7的组合物，其中蛋白易位结构域是富含精氨酸的序列。
10.权利要求7的组合物，其中蛋白易位结构域是富含胍基的序列。
11.权利要求1-6中任一项的组合物，其中所述肽与核酸融合。
12.权利要求1-6中任一项的组合物，其中所述肽与脂解肽GKH融合。
13.权利要求1-6中任一项的组合物，所述组合物为水包油乳剂。
14.权利要求1-6中任一项的组合物，所述组合物为油包水浸渍液。
15.权利要求1-6中任一项的组合物，所述组合物配制成供局部用。
16.权利要求1-6中任一项的组合物，其中所述一种或多种肽的总浓度为组合物总重量的0.00001％至10％(重量/重量)。
17.权利要求16的组合物，其中所述一种或多种肽的总浓度约为0.001至1％(重量/重量)。
18.权利要求1-6中任一项的组合物，所述组合物还含有一种或多种选自以下的神经递质抑制剂：箭毒、α-银环蛇毒素、加拉明、哌仑西平AF-DX 116 pF-HHSiD、异丙托铵、东莨菪碱和阿托品。
19.权利要求1-6中任一项的组合物，所述组合物还含有至少一种选自以下的活性剂：保湿剂、脱色剂、着色促进剂、剥离剂、紫外线吸收剂、防晒活性剂、粘度调节剂、摩擦剂、pH调节剂、抗糖化剂、抗氧化剂、NO合酶抑制剂、刺激真皮和/或表皮大分子合成的物质、防止真皮和/或表皮大分子降解的物质、刺激胶原合成的物质、防止胶原降解的物质、刺激成纤维细胞和/或角质形成细胞增殖或刺激角质形成细胞分化的物质、肌肉松弛剂、皮肤松弛剂、再生剂、抗污染剂和自由基清除剂、作用于毛细血管循环的物质、作用于细胞代谢的物质、抗炎剂、止汗剂、抗微生物剂和抗真菌剂，以及辅助性的亲水和亲脂凝胶剂、活性剂、防腐剂、溶剂、芳香剂、填充剂、色素、气味吸收剂。
20.一种用于改善组织肿胀的方法，所述方法包括使细胞与有效量的权利要求1-6中任一项的组合物接触的步骤。
21.一种用于抑制肌肉收缩的方法，所述方法包括使细胞与有效量的权利要求1-6中任一项的组合物接触的步骤。
22.一种用于抑制神经递质释放的方法，所述方法包括使分泌神经递质的细胞与有效量的权利要求1-6中任一项的组合物接触。
23.权利要求22的方法，其中所述组合物含有由SEQ ID NO：11-22中任一项所示的聚精氨酸组成的肽。
24.权利要求23的方法，其中所述聚精氨酸由D-氨基酸组成。
25.权利要求21或22的方法，其中所述接触通过选自以下的途径进行：透皮、局部、真皮内和真皮下。
26.一种用于增强伤口愈合的方法，所述方法包括给予需要伤口愈合的受试者有效量的权利要求1-6中任一项的组合物。
27.一种用于增强肌肉修复的方法，所述方法包括给予需要伤口愈合的受试者有效量的权利要求1-6中任一项的组合物。
28.一种用于阻断伤口中的纤维化过程的方法，所述方法包括给予需要伤口愈合的受试者有效量的权利要求1-6中任一项的组合物的步骤。
29.一种用于治疗选自以下的疾病的方法：多汗症、局灶性肌张力障碍、非肌张力障碍性疾病、炎症和疼痛，所述方法包括给予有需要的受试者有效量的权利要求1-6中任一项的组合物的步骤。
30.一种纯化和分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1-6中任一项限定的多肽。
31.一种载体，所述载体包含权利要求30的多核苷酸。
32.一种用于转化宿主细胞的方法，所述方法包括将权利要求31的载体导入所述宿主细胞中的步骤。
33.一种宿主细胞，所述宿主细胞通过权利要求32的方法转化。
34.一种用于改善皮肤外观的方法，所述方法包括局部应用含有权利要求1-6中任一项的组合物和化妆品可接受的溶媒的化妆品。
35.权利要求34的方法，其中所述皮肤是衰老的、光老化的、干燥的、有条纹的或起皱纹的皮肤。
36.权利要求35的方法，其中所述组合物还含有一种或多种下列成分：雌二醇、孕酮、孕烷醇酮、辅酶Q10、甲基磺酰甲烷(MSM)、铜肽(铜提取物)、浮游生物提取物(磷脂复合物)、乙醇酸、曲酸、棕榈酸抗坏血酸酯、全反式视黄醇、杜鹃花酸、水杨酸、溴帕雌烯、雌酮、雄烯二酮和雄烷二醇。
37.权利要求34的方法，其中所述组合物还包含防晒剂。
38.权利要求34的方法，其中所述化妆品可接受的溶媒为水包油乳剂或油包水乳剂。
39.权利要求34的方法，其中所述组合物选自乳剂、洗剂、喷雾剂、气雾剂、粉剂、软膏剂、乳膏剂和泡沫剂。
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