CN101356285A

CN101356285A - 鉴定陨石色基因的方法

Info

Publication number: CN101356285A
Application number: CN200680036715.6A
Authority: CN
Inventors: 基思·E·墨菲; 利·安妮·克拉克; 杰奎琳·瓦尔; 克里斯汀·里斯
Original assignee: Merlogen LLC
Current assignee: Merlogen LLC
Priority date: 2005-08-16
Filing date: 2006-08-16
Publication date: 2009-01-28
Also published as: AU2006279420A1; EP1945803B1; AU2006279420B2; JP2009504189A; DE06801706T1; EP1945803A1; JP5203202B2; WO2007022335A1; CA2619841C; US20080227102A1; CA2619841A1; US7807370B2

Abstract

SILV基因发生突变的动物表现出陨石色皮毛颜色图案的表现型。本申请描述了用于鉴定在SILV基因中具有突变的动物的方法。SILV基因中的突变可以从任何含有基因组DNA的生物学样品例如细胞或组织中鉴定出来。本申请也描述了使用连锁不平衡作图鉴定的与陨石色(merle)基因一起分离的微卫星标记物。

Description

鉴定陨石色基因的方法

发明背景

总的来说，本发明属于狗的遗传检验领域，具体来说是产生陨石色皮毛色彩的基因的遗传检验。

陨石色(merle)是狗的皮毛图案，其特征为冲淡的颜色与正常的黑色混杂的斑纹(图1B)。它是美国育犬协会(American Kennel Club)承认的几个品种的标准皮毛色彩，包括设得兰牧羊犬(ShetlandSheepdog)、柯利牧羊犬(Collie)、边境牧羊犬(Border Collie)、澳大利亚牧羊犬(Australian Shepherd)、威尔斯柯基犬(Cardigan WelshCorgi)和腊肠犬(Dachshund)。腊肠犬的陨石色表现型也被称为斑纹。尽管在大丹犬(Great Dane)中陨石色不是可以接受的颜色，但陨石色位点(M)和分离的斑色位点(H)的相互作用可以产生所需的斑色(harlequin)图案(O′Sullivan，N.，&Robinson，R.(1989)Genetica 78，215-218)。此外，许多其它育犬协会接受的品种(例如卡他豪拉豹犬(Catahoula Leopard Dog)、挪威猎犬(Norwegian Hound)和比利牛斯山牧羊犬(Pyrenean Shepherd))也具有陨石色图案。

陨石色以常染色体的、不完全显性的方式遗传(Mitchell，A.L.(1935)J.Hered.26，425-430)。尽管很少见，带有陨石色等位基因(merleallele)(Mm)的狗可以表现出无陨石色，这被称为“隐蔽的”陨石色，并可以生出有陨石色的后代。陨石色基因纯合(MM)的狗被称为双陨石色，并且主要是白色的(图1C)。

具有Mm和MM基因型的狗一般具有蓝色的眼睛，并可能表现出广范围的听觉和视觉异常(Sorsby，A.，&Davey，J.B.(1954)J Genet.54，425-440)。Reetz等研究了腊肠犬的听觉能力，并发现54.6％的MM和36.8％的Mm狗具有听觉功能障碍，为从中度到重度的耳聋(Reetz，L，等(1977)Disch.Tierarzil.Wschr.84，273-277)。研究中所有的对照狗(mm)都具有正常的听力。Klinckman等对三组腊肠犬(MM、Mm和mm)进行了视觉研究，并发现陨石色和双陨石色具有明显高频率的视觉异常，包括眼内压增高和屈光不正眼(Klinckmann，V.G.，等，(1987)Disch.Tierarzil.Wschr.94，338-341和Klinckmann，V.G.，&Wegner，W.(1987)Disch.Tierarzil.Wschr.94，337-338)。小眼症(micropthalmia)和眼组织缺损(coloboma)也在陨石色和双陨石色腊肠犬和澳大利亚牧羊犬中被详细地描述(Gelatt，K.N.，&McGill，L.D.(1973)J.Am.Vet.Med.Assoc.162，393-396；Sorsby，A.，&Davey，J.B.(1954)J.Genet.54，425-440；Dausch，D.，et al.，(1977)Disch.Tierarzil.Wschr.84，468-475)。在所有品种中，双陨石色基因型可能是亚致命的，并与多种涉及骨骼、心脏和生殖系统的异常有关(Sponenberg，D.P.，&Bowling，A.T.(1985)J Hered.76，393-394；Sponenberg，D.P.，&Bowling，A.T.(1985)J.Hered.76，393-394.，Little，CC.(1957)狗皮毛色彩的遗传(The Inheritance ofCoat Color in Dogs).Howell Book House Inc.)。由于这些原因，一般来说不实行陨石色与陨石色的杂交育种(Little，CC.(1957)狗皮毛色彩的遗传The Inheritance of Coat Color in Dogs).Howell Book HouseInc.)。

已经假设陨石色位点含有可转座的元件(Whitney，J.B.，&Lamoreux，M.L.(1982)J.Hered.73，12-18)。该假设部分是基于发现了纯合的陨石色狗的交配生出了无陨石色的后代(Whitney，J.B.，&Lamoreux，M.L.(1982)J.Hered.73，12-18and Sponenberg，D.P.(1984)J.Hered.75，78)。随后这些后代的繁殖只生出无陨石色的幼犬，为稳定的生殖回复提供了证据(Sponenberg，D.P.(1984)J.Hered.75，78)。

以前，陨石色的候选基因的选择集中在与小鼠中类似皮毛图案和人的瓦登伯革氏综合症(Waardenburg syndrome)(WS)有关的基因上(Schmutz，S.M.，等，(2002)Anim.Genet.34，65-77)。WS是与感觉神经性听力丧失，皮肤、毛发和眼睛的色素性障碍以及其它发育异常有关的常染色体显性紊乱(Waardenburg，P.J.(1951)Am.J.Hum.Genet.3，195-253)。在四种临床类型的WS中涉及了几个基因：PAX3中的突变导致1型和3型WS(Baldwin，C.T.，等，(1992)Nature 355，637-638和Tassabehji，M.，等，(1992)Nature 355，635-636)，SOX10、EDNRB或EDNR3中的突变导致4型WS(Pingault，V.，等，(1998)Nat.Genet.18，171-173；Puffenberger，E.G.，等，(1994)Cell 79，1257-1266；和Mccallion，A.S.，&Chakravarti，A.(2001)Pigment Cell Res.14，161-169)。MITF中的突变显示出导致2型WS；但是，85％的2型WS病例的遗传基础还未被鉴定出来(Tassabehji，M.，等，(1994)Nat.Genet.8，251-255和Choi，J.H.，et al.，(2004)Korean J.Ophthalmol.18，185-189)。Schaible和Brumbaugh(1976)建议在WS中观察到的异常组织的超微结构在表现型上与陨石色狗中存在的相似(Schaible，R.H.，&Brumbaugh，J.A.(1976)Pigment Cell 3，191-200)。

尽管显然长期以来就感到需要允许鉴定具有陨石色和“隐蔽的”陨石色基因型的动物的遗传检验方法，但到目前为止，导致陨石色的基因还没有被确定。一旦被鉴定，狗的基因可以被用来筛选人同源基因，以确定该基因是否参与了人的听觉或视觉缺陷。

因此，本发明的一个目标是提供导致狗产生陨石颜色的基因突变。

本发明的另一个目标是提供检测狗的陨石色基因中的突变的方法。

本发明的另一个目标是提供检测陨石色基因的人同源物中的突变的方法。

发明简述

在SILV中具有突变的动物表现出陨石色皮毛颜色图案表现型。在SILV基因中具有突变的动物的鉴定方法将在下面进行更详细的描述。该基因已经在多种生物体中被描述过，但从未被暗示与陨石色图案形成有关。实施例1证实了在SILV中具有突变的狗表现出陨石色皮毛颜色图案表现型。一种这样的突变是在SILV的内含子10中插入较短的散在核苷酸元件(″SINE″)，并且存在于多个狗品种中。据认为，在SILV基因中插入SINE引起了拼接位点突变，导致产生了异常的mRNA。SILV基因中的突变的鉴定可以使主人或育种者确定动物的基因型，因为其属于陨石色基因型。在计划配种时，这样的信息是极其有价值的，以便在后代中产生所需的皮毛颜色图案和没有听觉和视觉异常的动物。此外也描述了使用连锁不平衡作图鉴定的与陨石色基因一起分离的微卫星标记物。SILV基因中的突变可以从任何含有基因组DNA的生物学样品，例如细胞或组织中鉴定出来。典型的样品包括发根或面颊拭子(swab)。一种这样的突变是在SILV的内含子10中插入SINE，并且存在于到目前为止被分析的所有品种的狗中。

SILV可能参与了人耳聋紊乱，例如瓦登伯革氏综合症(Waardenburg syndrome)(WS)。人的SILV基因已经被测序和描述，并存在于HSA12上。因此，在正常人和WS病人中人SILV基因的分析可以通过对来自这些个体的基因进行测序，寻找任何类型的突变，包括导致相关表现型的SINEs和LINEs(长的散在核苷酸元件)的插入来进行。

附图说明

图1A、1B和1C是正常的非陨石色、杂合子陨石色和双纯合陨石色设得兰牧羊犬和陨石色SINE的DNA分析的照片。SILV中的SINE插入序列与陨石色表现型分离。(A)三色(黑、深褐、白色)的非陨石色的设得兰牧羊犬(mm)(B)蓝陨石色的设得兰牧羊犬(Mm)和(C)双陨石色的设得兰牧羊犬(MM)。

图2描述了野生型犬SILV的结构和陨石色狗中SINE插入位点的序列。推测的套索分支点序列被加框。剪接受体显示为粗体。在陨石色狗中，剪接受体位于侧接SINE突变的15个碱基对(″bp″)的重复序列中(下划线)。在这里分析的陨石色狗中平均的插入序列大小(不包括重复序列)是253bp。

图3是来自7个品种(设得兰牧羊犬“Sheltie”、柯利牧羊犬、边境牧羊犬、澳大利亚牧羊犬、威尔斯柯基犬、腊肠犬和大丹犬)的8只陨石色狗和来自2个品种(设得兰牧羊犬和大丹犬)的3只具有较小的插入序列的非陨石色狗中的SINE插入序列的序列比对。假设的RNA聚合酶III转录控制所必需的A和B框被显示为灰色。

图4SILV的突变分析及其在6个品种中的分离。对来自深褐/白色柯利牧羊犬(2泳道)、蓝色陨石色柯利牧羊犬(3泳道)、黑/白色边界牧羊犬(4泳道)、蓝色陨石色边界牧羊犬(5泳道)、红色澳大利亚牧羊犬(6泳道)、蓝色陨石色澳大利亚牧羊犬(7泳道)、斑纹威尔斯柯基犬(8泳道)、蓝色陨石色威尔斯柯基犬(9泳道)、黑/黄棕色腊肠犬(10泳道)、红色斑纹腊肠犬(11泳道)、浅黄褐色大丹大(12泳道)、蓝陨石色大丹犬(13泳道)和斑色大丹犬(14和15道)的基因组DNA进行了PCR。

发明详述

定义

本文中使用的“遗传标记物”或“标记物”是指在基因组DNA中存在的可变核苷酸序列(多态性)，可以用特定的寡核苷酸(例如，可以通过进行核酸扩增和对由于多态性引起的核苷酸的大小或序列的差别进行观察来辨别的)鉴定。遗传标记物或标记物的“位点”是指它在染色体上相对于另一个位点的位置。标记物、正如在本文中描述的那样、可以通过本领域的专业人员所熟知的几种技术中的任何一种来鉴定，包括微卫星或短的串联重复(STR)的扩增、限制性片段长度多态性(RFLP)分析、单核苷酸多态性(SNP)分析、缺失或插入位点的检测、以及随机扩增的多态性DNA(RAPD)分析(Cushwa和Medrano，1996，Animal Biotech.7：11-31)。

本文使用的“共分离”是指两个特定位点一起遗传；例如，位点位于同一条染色体上物理位置非常接近，使得位点之间的遗传重组率较低，正如通过对交配中等位基因的遗传图谱进行统计学分析所观察到的那样。

本文使用的“连锁“是指在分析的犬品种中两个位点的共分离。

本文使用的术语“连锁检验“和”分子诊断分析“是指用于确定与SILV基因座相连的一个或多个等位基因变异是否存在的方法，该方法可以用于通过统计概率或通过突变的SILV基因的实际检测来检测SILV或携带者状态。

本文使用的“多态性“是指与来自同样类型或谱系(即家族树)的动物的类似区域相比，具有可辨别的差别(例如大小、电泳迁移、核苷酸序列、在标准条件下与寡核苷酸发生特异性杂交的能力)的标记物。

本文使用的“核酸扩增“或”扩增“是指将核酸序列在数量上扩增的过程。有几种本领域的专业人员所熟知的酶法扩增核酸序列的方法，包括聚合酶链反应(“PCR”)、连接酶链反应(LCR)和基于核酸序列的扩增(NASBA)，它们将在下文中更详细地讨论。

本文中使用的“杂交”是指其序列中足够数量的互补碱基对与被扩增或检测的靶核酸序列发生特异性相互作用(杂交)。正如本领域的专业技术人员所熟知的那样，为了杂交的特异性和灵敏性，需要非常高程度的互补性，尽管不需要100％的互补性。因此，例如，除了几个碱基的改变或取代之外，在核苷酸序列上与本文公开的寡核苷酸同一的寡核苷酸，可能与公开的寡核苷酸具有同等的功能。

本文使用的“隐蔽的”陨石色是指带有陨石色等位基因(Mm)的动物表现出非陨石色，但是可以生出陨石色的后代。

陨石色基因和微卫星标记物

在狗中，完全着色的背景上的大面积的颜色变浅被称为陨石色。在许多犬品种中发现了陨石色皮毛图案，与多种异常有关。

使用40只设得兰牧羊犬进行的陨石色连锁的全基因组扫描显示出在CFA10上与FH2537的连锁不平衡(LD)。该CFA10区域显示出与HSA12q13的共线性的保守性。以前没有在WS图谱中发现与该区域有关的基因。此外，被称为SILV的编码黑素体蛋白的基因作图于HSA12q13-q14上(Kwon，B.S.，等，(1991)Proc.Natl Acad.ScL USA 88，9228-9232；Sturm，R.A，Teasdale，R.D.，&Box，N.F.(2001)Gene 277，49-62)。当SILV在小鼠中作为引起毛发过早泛灰的银色位点被鉴定时，它被显示在黑色素生成中是重要的(Kwon，B.S.，等，(1995)NucleicAcids Research 23，154-158)，它也是许多WS病人的特征。在人中SILV的突变体表现型是未知的(Sturm，R.A.，Teasdale，R.D.，&Box，N.F.(2001)Gene 277，49-62)。

陨石色基因SINE

根据LD数据和SILV在色素沉着中的功能，该基因被选为陨石色位点的候选基因。在被分析的所有陨石色狗的SILV中鉴定到了在结构上与在Minnick等((1992)Gene 110，235-238)中描述的一类犬SINEs相似的SINE。该SINE与以前在犬D2多巴胺受体基因(Jeoung，D.，等，(2000)Anim.Genet 31，334-335)、肌营养不良蛋白基因(Fletcher，S.，等，(2000)Am.J.Vet.Res.12，1964-1968)和与中央核肌病有关的PTPLA基因(Pele，M.，等，(2005)Hum.Mol.Genet.14，1417-1427)中鉴定到的犬SINEs具有高度的序列相似性(95％到97％)。这些SINEs在狗中是tRNA衍生的和高丰度的，占基因组的7％(Kirkness，E.F.，等，(2003)Science 301，1898-1903)。

色素沉着基因SILV(SEQ ID NO：1，在下面显示)作为陨石色图案形成的候选基因被鉴定和评估。

ATGGTACCTTCGTTTTTAGGACCCAGAGACCAGGACTGGCTTGGTGTCCCAAGGCAGCTCAC

AACTAAAGCCTGGAACAGACAGCTGTATCCAGAGTGGACAGAAACCCAGAGGCCTGACTGCT

GGAGAGGTGGGAACTTGGCAATTTCCAGGGAGGGTGGCCAGGTGTCCCTGAAGGTCAGTAAT

GATGGGCCTACACTGGTTGGTGCAAATGCCTCCTTCTCTATTGCCCTGCACTTCCCTGAAAG

CCAAAAGGTACTGCCAGATGGGCAGGTTGTCTGGGCCAACAACACTATCATCGATGGGAGCC

AGGTGTGGGGAGGACAGCCAGTGTATCCCCAGGTACTTGATGATGCCTGCATCTTCCCTGAT

GGGAGGGCCTGCCCATCTGGCCCTTGGTCTCAGACAAGAAGCTTTGTTTATGTCTGGAAGAC

CTGGGTGTCTGGGCTGAGCATTGTGACAGGCAAGGCGGTGCTGGGCACACATACCATGGAAG

TGACTGTCTACCACCGCCGGGAGTCCCAGAGCTACGTGCCCCTTGCTCACTCCTGCTCAGCC

TTCACCATTACTGACCAGGTGCCCTTCTCCGTGAGTGTGTCTCAGCTGCAGGCCTTGGATGG

AGGGAACAAGCATTTCCTGAGAAATCATCCTCTGACCTTTGCCCTCCGGCTCCATGACCCCA

GCGGCTATTTGTCTGGGGCTGACCTCTCCTACACCTGGGACTTTGGAGACCATACCGGGACC

CTGATCTCTCGGGCACTTGTGGTCACTCACACTTACCTAGAGTCTGGCCCAATCACTGCCCA

GGTGGTCCTGCAGGCTGCCATTCCTCTCACTTCCTGTGGCTCCTCCCCAGTTCCAGTCACCA

CAGATGGGCATGCGCCAACTGCAGAGATCCCTGGCACCACAGCTGGGCGAGTGCCTACTGCA

GAAGTCATAAAGCCCTCTGGAACCACAGGCGAGCAGGTAACGACTAAAGAGTCAGTGGAGCC

CACAGCTGGAGAGGGACCCACGCCTGAGACCAAGGGTCCAGATACCAATCTGTTCGTGCCTA

CAGAAGGTATTACAGGTTCCCAGAGCGCCCTGCTGGATGGCACAGCTACCTTAATCCTGGCA

AAGCGAGAAACCCCCCTGGATTGTGTTCTGTATCGATATGGCTCCTTTTCTCTCACCCTGGA

CATTGTCCGGGGTATTGAGAATGCTGAGATCCTGCAGGCTGTGCCATCCAGTGAAGGGGATG

CATTTGAGCTGACTGTGTCTTGCCAAGGCGGACTGCCCAAGGAAGCCTGCATGGACATCTCA

TCACCAGGGTGCCAGCCCCCTGCCCAGAGGCTATGTCAGCCTGTGCCGCCCAGCCCAGCCTG

CCAGCTGGTTTTGCACCAAGTGCTGAAGGGTGGCTCAGGGACCTACTGCCTCAATGTGTCTT

TGGCTGATGCTAACAGTCTGGCAATGGTCAGCACTCAGCTTGTAATGCCTGGTCAAGAAGCA

GGCGTTGGACAGGCTCCCCTGTTCATGGGCATCTTGCTGGTGTTGCTGGCTATGGTGCTGGT

ATCTCTGATATATAGGTGA

犬的银色基因(Silver)cDNA(SEQ ID NO：1)

在多个品种中发现了在内含子10/外显子11边界处的SINE插入序列与陨石色表现型一起分离。本文报道的SINE插入序列也发生在内含子/外显子边界处，可以取代假定的套索分支点序列(图2)。图3中显示了7个品种中的SINE插入序列的序列。有趣的是，某些狗具有缩短版本的SINE插入序列，这对于陨石色表现型的表达有显著的影响。具体来说，这些狗在SINE的多聚A中具有缺失(从39到47个bp)，不具有陨石色图案。

SILV中SINE插入序列的多聚A片段中的缺失可以产生正常的表现型。为保持陨石色表现型所需的重复序列的准确数目尚不知道。已知的是从多聚A删除大约30个bp产生非陨石色的表现型。多聚A片段难以测序，因此多聚A的长度的准确阈值还没有被确定。

核酸分子或片段不需要与SEQ.ID.No.25的序列同一。适合的核酸分子可以通过与编码犬陨石色的基因的核酸序列、优选为SEQ.ID.No.25的杂交来鉴定。在优选实施方案中，适合的核酸分子与该基因的核酸序列在严格条件下杂交。例如，可以分离在严格条件下与含有SEQ.ID.No.25的50个连续的碱基的核苷酸序列的DNA分子杂交的序列，该严格条件的特征为杂交缓冲液含有0.9M柠檬酸钠缓冲液(“SSC”)，在温度37℃下杂交，在37℃下用SSC缓冲液清洗时保持结合，优选在温度42℃下在含有20％甲醛的0.9M盐水/0.09M SSC缓冲液的杂交缓冲液中进行杂交，并且在42℃下用0.2X SSC缓冲液清洗时保持结合。在优选实施方案中，这些杂交的核酸分子长度可以为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或某些中间数值。

陨石色基因微卫星标记物

本申请也描述了使用连锁不平衡作图鉴定的与SILV基因一起分离的微卫星标记物。正如在下面详细描述的那样，用设得兰牧羊犬的陨石色表现型和位于表现出与HSA12q13的共线性保守性的CFA10区域中的微卫星标记物鉴定到了连锁不平衡，。

确定连锁的方法

连锁是两个或多个非等位的基因的共遗传，这是由于它们在相同染色体上的位点非常接近，因此在减数分裂后它们保持连接在一起的频率高于对不连锁基因所预计的50％。在减数分裂过程中，遗传物质发生物理上的杂交，显然在产生生殖细胞的过程中，在个体染色单体之间存在母本和父本遗传贡献的物理交换。这种交换必需分离在染色体区域中在每个父本中连续的基因，然后通过将它们与保留的线性次序(order)混合，产生“重组体”。通过减数分裂杂交而形成重组体的过程是遗传性状的再分配中的基本特征，是理解基因传递的中心。

重组一般发生在大的DNA片段之间。这意味着相邻的DNA段和基因可能一起移动。相反，在给定的染色体上分隔远的DNA区域在交换过程中比紧邻在一起的DNA区域更可能变得分离。

染色体上标记物组的分布模式被称为“单倍型”。因此，在同样的小染色体片段上的等位基因组倾向于作为区块通过谱系传递。通过分析其单倍型已知的双亲的一系列后代中的单倍型，有可能确定哪个染色体的亲本片段被传递给了哪个子女。当没有被重组破坏时，出于作图的目的，单倍型可以被当作在单个高度多态性位点上的等位基因。

与连锁的标记物、例如单核苷酸多态性(SNPs)或微卫星的特定等位基因有关的疾病基因的偏好性出现的存在，被称为“连锁不平衡”(LD)。这种不平衡一般表示大多数染色体带有同样的突变，并且被检验的标记物与带有突变的基因非常接近。通过使用在基因的假定位置周围的几个标记物的组合，可以为染病的和未染病的动物确定单倍型。

对于任何单独的基因紊乱来说，鉴定缺陷的基因可以用于筛选风险人群来鉴定携带者，以努力降低该人群中单基因紊乱的频率。连锁分析是基于首先发现突变基因所位于的大概染色体区域，然后鉴定遗传标记物以表征更小的含有疾病位点的染色体区域(突变基因的位置)。标记物和突变基因在染色体上靠得越近，它们之间在减数分裂期间发生重组事件的可能性越低；即在标记物和突变基因之间存在连锁。标记物和突变基因连锁得越近，鉴定携带者的测试越具有预测性和有用。此外，通过使用两个或多个标记物位点，在连锁分析中可以确定更显著的其他的信息，可以显著增加连锁检验的准确性。例如，在连锁分析中使用多个标记物位点，允许能够筛选各种不同的染病狗品种，以鉴定描述了特定的狗品种中SILV等位基因的特征的品种特异性单倍型。除了在本文公开的实施例中的标记物之外，在通过连锁或物理方法作图中与SILV基因座接近、在这样的衍生的染色体区域中存在任何多态性的标记物，也可以用于分子诊断分析，以检测SILV的携带者状态。

筛选陨石色基因型的方法

可以通过上述的本领域的专业技术人员所熟知的大量方法来筛选SILV基因中的任何类型的突变。在优选实施方案中，确定用于陨石色基因的动物的基因型的方法是基于PCR的检验，然后进行凝胶电泳。例如，在从狗取样的面颊拭子中提取DNA。通过PCR使用与SILV基因杂交的引物扩增DNA。获得的扩增的DNA片段通过电泳分离(resolve)，显示出不同大小的片段，其中较大的在SILV基因中带有SINE突变。该方法可以在少于2天的时间内进行。

其它揭示SINE在SILV基因中的存在的方法包括但不限于使用探针对目的区域进行Southern印迹分析、使用荧光标记的引物扩增所需区域然后使用自动化技术进行分析、使用涵盖(bracket)目的区域的不同引物。

微卫星与SINE插入序列的存在相关。微卫星标记物不能辨别带有在多聚A片段中具有缺失的插入序列的陨石色的狗和非陨石色的狗。必需进行序列分析以查看多聚A片段的长度。一旦建立了长度的阈值，“A数值”将成为狗是否为陨石色的决定因素。缺失的SINE插入序列的存在也暗示了该狗可以用于将来的育种。带有缺失版本的SINE的狗仍然维持了产生陨石色后代的风险。这在该狗将与另一只陨石色狗进行育种的情况下是及其重要的。

使用遗传标记物确定动物在一个或两个等位基因中是否具有突变的SILV基因座的方法、和鉴定在SILV基因中具有突变的动物的方法将在下面更详细描述。

被筛选的生物学样品

在优选实施方案中，生物学样品是任何含有基因组DNA的组织。最优选情况下，生物学样品是血液、毛发、粘膜刮屑、精液、活组织切片或唾液。在最优选实施方案中，生物学样品是血液。

筛选生物学样品中突变的核酸的方法可以使用从生物学样品中分离的脱氧核糖核酸(“DNA”)或信使核糖核酸(“mRNA”)来进行。在基因被表达的时期内，mRNA可能是丰富的和更容易检测的。但是，这些基因被暂时控制，在发育的大多数阶段，优选的筛选材料是DNA。

核酸试剂和方法

试剂典型地由鉴定下列基因的寡核苷酸组成：

(1)插入到SILV基因中的SINE；或

(2)与插入到SILV基因中的SINE有关的微卫星标记物；以及任选的

(3)与插入到SILV基因中的SINE有关的、产生正常表现型的多态性。

本文报道的SINE插入序列发生在内含子/外显子交界处，并可以取代假设的套索分支点序列(图2)。多聚A片段的长度的变化可以允许套索分支点的适当放置，从而产生非陨石色的表现型。

核酸分子可以与其它核酸分子例如载体或标签连接，以便于扩增、纯化或鉴定。这些可以用于任何下面的分析方法或其它本领域的专业技术人员所熟知的用于遗传分析的分析方法中。

寡核苷酸连接分析(“OLA”)(Landegren等，“连接酶介导的基因检测技术”″A Ligase-Mediated Gene Detection Technique，″Science，241：1077-1080(1988)；Landegren等，“DNA诊断学——分子技术和自动化”″DNA Diagnostics-Molecular Techniques and Automation，″Science，242：229-237(1988)；Landegren等的美国专利4,988,617)，是一种在生物学样品中检验遗传物质的方法。OLA方案使用了两条被设计能够与靶的单链的拼合序列杂交的寡核苷酸。一条寡核苷酸是生物素标记的，另一条被可检测地标记。如果在靶分子中发现了精确互补的序列，寡核苷酸将会杂交，以至于它们的末端拼合，产生连接底物。然后连接允许被标记的寡核苷酸能够使用亲和素或其它的生物素配体进行回收。OLA能够检测插入突变。但是，在本技术领域中还有许多用于表征或检测插入突变的方法，那些方法中的任何一种也是适合的。

另一种对插入突变进行表征的方法需要对位于侧接插入序列并包含插入序列的基因座进行直接的DNA测序。这样的分析可以使用“双脱氧介导的链终止方法”、也被称为“Sanger方法”(Sanger等，“使用链终止抑制剂进行DNA测序”″DNA Sequencing withChain-Terminating Inhibitors，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：5463-5467(1977))，或“化学降解方法”、也称为“Maxam-Gilbert方法”(Maxam等，“测序DNA的新方法”″A New Method for Sequencing DNA，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：560-564(1977))来进行。

在Drmanac等的美国专利5,202,231中公开了使用寡核苷酸阵列测序DNA分子的方法的一个例子。它包括了将靶DNA加到连接有大量寡核苷酸的固相支持物上。序列通过靶DNA的片段与寡核苷酸的杂交和重叠的杂交寡核苷酸片段的装配来读取。阵列使用具体长度在11到20个核苷酸之间的所有可能的寡核苷酸，但是关于如何构建该阵列的信息非常少。也可以参见Chetverin等，“在寡核苷酸阵列上测序核酸池”″Sequencing of Pools of Nucleic Acids on Oligonucleotide Arrays，″BioSystems 30：215-31(1993)；Khrapko等的WO 92/16655；Kuznetsova等，“通过与固定在凝胶中的寡核苷酸进行杂交进行DNA测序。化学连接作为扩展该方法的前景的方法”″DNA Sequencing by Hybridizationwith Oligonucleotides Immobilized in Gel.Chemical Ligation as a Methodof Expanding the Prospects for the Method，″Mol.Biol.28(20)：290-99(1994)；Livits等，“通过DNA与凝胶固定的寡核苷酸的杂交形成的双链体的解离”″Dissociation of Duplexes Formed by Hybridizationof DNA with Gel-Immobilized Oligonucleotides，″J.Biomolec.Struct.&Dynam.11(4)：783-812(1994)。

Southern的WO 89/10977公开了带有寡核苷酸阵列的支持物的使用，这些寡核苷酸能够进行杂交反应，用于分析核酸样品中已知的点突变、基因组指纹分析、连锁分析和序列测定。基质通过将核苷酸碱基以选定的方式放置在支持物上而形成。该参考文献表明羟基连接基团可以用于通过笔式绘图机或屏蔽装配有寡核苷酸的支持物。

单链多态性分析(“SSPA”)方法和密切相关的异源双链体分析方法是用于筛选单碱基突变的方法(Orita等，“通过凝胶电泳检测人DNA的多态性作为单链构象多态性”″Detection of Polymorphisms ofHuman DNA by Gel Electrophoresis as Single-Strand ConformationPolymorphisms，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：2766-2770(1989))。在这些方法中，来自临床样本的PCR扩增的检验DNA的泳动性和从正常来源扩增的DNA的泳动性，通过在非变性聚丙烯酰胺或其它类型基质的凝胶的相邻泳道中进行样品的直接电泳进行了比较。单碱基变化通常改变了分子的二级结构，这足够导致在长时间电泳后正常的和突变的PCR产物之间轻微的泳动性差别。

连接酶链反应是另一种筛选突变的核酸的方法(参见Barany，“使用克隆的热稳定连接酶进行遗传疾病检测和DNA扩增”″GeneticDisease Detection and DNA Amplification Using Cloned ThermostableLigase，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：189-193(1991)；Barany，“PCR世界中的连接酶链反应(LCR)”″The Ligase Chain Reaction(LCR)in aPCR World，″PCR Methods and Applications，1：5-16(1991)；Barany等的WO 90/17239；Barany等，“热稳定DNA连接酶编码基因的克隆、过量表达和核苷酸序列”″Cloning，Overexpression and NucleotideSequence of a Thermostable DNA Ligase-Encoding Gene，″Gene，109：1-11(1991)；以及Barany，“使用克隆的热稳定连接酶进行遗传疾病的检测和DNA扩增”″Genetic Disease Detection and DNAAmplification Using Cloned Thermostable Ligase，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：189-193(1991))。一般来说，LCR方法使用两对寡核苷酸探针来进行：一对与被检测的靶序列的一条链结合；另一对与被检测的靶序列的另一条互补链结合。反应如下进行：将靶序列的链进行变性，然后将分离的链与两对寡核苷酸探针在存在热稳定连接酶的情况下反应，以便每对寡核苷酸探针与靶DNA杂交，如果在它们的结合处存在完全的互补性，邻近的探针就被连接到一起。如果缺少这样的互补性，不会发生连接，在变性过程中探针分别与靶序列分离开。然后在变性步骤中分离连接的或未连接的探针。该过程被循环重复直到序列被扩增到所需的程度。然后可以通过电泳或通过在DNA探针的阵列上捕获杂交来进行检测。然后检测连接的和未连接的探针以鉴定突变的存在。

连接酶检测反应(LDR)方法是另一种检测突变的方法，在Barany等的WO 90/17239、Barany等，“热稳定DNA连接酶编码基因的克隆、过量表达和核苷酸序列”″Cloning，Overexpression and NucleotideSequence of a Thermostable DNA Ligase-encoding Gene，″Gene，109：1-11(1991)和Barany，“使用克隆的热稳定连接酶进行遗传疾病的检测和DNA扩增”，″Genetic Disease Detection and DNA Amplification UsingCloned Thermostable Ligase，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：189-193(1991)中有一般性的描述。连接酶检测反应与LCR技术相似；但是，在LDR中，只有一对寡核苷酸探针，它们与靶序列的一条链互补。尽管LCR提供了指数扩增的机会，但LDR实现了线性扩增。

Mundy等(美国专利no.4,656,127)讨论了用于确定出现在特定的多态性位点上的核苷酸的同一性(identity)的替代方法。Mundy的方法使用了特化的外切核酸酶抗性的核苷酸衍生物。将与多态性位点3’-方向上紧邻的等位基因序列互补的引物与从特定动物或人获得的靶分子进行杂交。如果靶分子上的多态性位点含有与存在的特定的外切核酸酶抗性的核苷酸衍生物互补的核苷酸，那么该衍生物将被聚合酶掺入到杂交的引物的末端上。这样的掺入赋予了引物对外切核酸酶的抗性，从而使得它可以被检测。由于样品的外切核酸酶抗性衍生物的同一性是已知的，发现引物变得对外切核酸酶具有抗性，表明在靶分子的多态性位点中存在的核苷酸与在反应中使用的核苷酸衍生物是互补的。几种用于分析DNA中多态性位点(即突变位点)的引物指导的核苷酸掺入方法已经被描述(Kornher等，“使用改变电泳泳动性的核苷酸类似物进行突变检测“″Mutation Detection Using NucleotideAnalogs that Alter Electrophoretic Mobility，″Nucl.Acids.Res.，17：7779-7784(1989)；Sokolov，“引物延伸技术用于检测基因组DNA中的单核苷酸”″Primer Extension Technique for the Detection of SingleNucleotide in Genomic DNA，″Nucl.Acids Res.，18：3671(1990)；Syvanen等，“在载脂蛋白E的基因分型中使用引物指导的核苷酸掺入分析”″APrimer-Guided Nucleotide Incorporation Assay in the Genotyping ofApolipoprotein E，″Genomics，8：684-692(1990)；Kuppuswamy等，“单核苷酸引物延伸检测遗传疾病：血友病B(因子IX)和囊性纤维变性基因的实验应用”″Single Nucleotide Primer Extension to Detect GeneticDiseases：Experimental Application to Hemophilia B(Factor IX)andCystic Fibrosis Genes，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：1143-1147(1991)；Prezant等，“捕获的寡核苷酸核苷酸掺入(TONI)分析，一种简单的筛选点突变的方法”″Trapped-Oligonucleotide Nucleotide Incorporation(TONI)Assay，a Simple Method for Screening Point Mutations，″Hum.Mutat，1：159-164(1992)；Ugozzoli等，“通过使用等位基因特异性引物延伸然后捕获在固相支持物上来检测特定的等位基因”″Detection ofSpecific Alleles by Using Allele-specific Primer Extension Followed byCapture on Solid Support，″GATA，9：107-112(1992)；Nyren等，“通过酶法发光无机焦磷酸盐检测分析方法进行固相DNA微量测序”″SolidPhase DNA Minisequencing by an Enzymatic Luminometric InorganicPyrophosphate Detection Assay，″Anal.Biochem.，208：171-175(1993))。这些方法与Genetic Bit Analysis^TM (“GBA^TM”，在下面详细讨论)有所不同，因为它们都依赖于掺入标记的脱氧核苷酸来辨别多态性位点上的碱基。在这种方式中，因为信号与掺入的脱氧核苷酸的数量成正比，因此发生在同样的核苷酸的操作(run)中的多态性可以产生与区间的长度成正比的信号(Syvanen等，“通过使用PCR和固相微测序分析双等位基因DNA标记物来鉴定个体”″Identification of Individuals byAnalysis of Biallelic DNA Markers，Using PCR and Solid-PhaseMinisequencing，″Amer.J.Hum.Genet，52：46-59(1993))。

Cohen等(法国专利2,650,840；PCT申请No.WO 91/02087)讨论了基于溶液的确定多态性位点的核苷酸同一性的方法。与美国专利4,656,127中的Mundy方法相同，使用了与多态性位点3’-方向上紧邻的等位基因序列互补的引物。该方法使用标记的双脱氧核苷酸衍生物确定该位点的核苷酸的同一性，该标记的双脱氧核苷酸衍生物，如果与多态性位点的核苷酸互补，将掺入到引物的末端上。

一种被称为Genetic Bit Analysis^TM或GBA^TM的替代方法在Goelet等的PCT申请WO 92/15712中被描述。在优选实施方案中，Goelet等的方法使用了标记的终止物和与多态性位点3’-方向的序列互补的引物的混合物。因此，被掺入的标记的终止物，通过与被评估的靶分子的多态性位点中存在的核苷酸来确定并与之互补。与Cohen等的法国专利2,650,840、PCT申请No.WO 91/02087中的方法相比，Goelet等的方法优选为多相分析方法，其中引物或靶分子被固定到固相上。

其它的检测突变的存在的方法包括：差异限制性内切酶消化(DRED)、等位基因特异性寡核苷酸探针分析(ASOP)和连接酶介导的基因检测(LMGD)。其它的分析方法也可以使用在本发明中，例如在Wolf等，“通过非放射性荧光共振能量转移检测核酸杂交”″Detection of Nucleic Acid Hybridization by N onradiative FluorescenceResonance Energy Transfer，″Proc.Nat.Acad.Sci.USA，85：8790-94(1988)中公开的荧光共振能量转移(FRET)。

DRED分析通过下列方式来进行。如果满足条件(1)特定的扩增的cDNA片段含有与多态性的等位基因有区别的序列变异，以及(2)该序列变异被限制性内切酶所识别，那么特定的多聚核苷酸片段被酶的水解可以被用于确定同种异体抗原表现型。在完成该确定的过程中，来自血小板或红细胞mRNA的扩增的cDNA被消化，产生的片段通过大小进行分析。对应于内切核酸酶水解片段的核苷酸片段的存在与否，决定了存在的表现型。

在常规方法的ASOP分析中，合成了寡核苷酸探针，该探针在适当的退火条件下，将专门与特定的扩增的cDNA片段杂交，该扩增的片段含有区别红细胞或血小板膜糖蛋白的一个等位基因与其它等位基因的核苷酸序列。该特异性探针被可辨别地标记，以便当它与等位基因辨别cDNA片段杂交时，可以被检测，从而鉴定特定的等位基因。

在Landegren等的“连接酶介导的基因检测技术”″ALigase-Mediated Gene Detection Technique，″Science，241：1077-80(1988)中公开的LMGD中，合成了一对寡核苷酸探针，其在在适当的退火条件下彼此邻近地杂交，即与cDNA片段在区分一个等位基因与其它等位基因的特定核苷酸处杂交。特异性探针对中的每个以不同的方式标记，当它与等位基因辨别cDNA片段杂交时，两条探针可以通过加入连接酶被连接在一起。当从cDNA片段中分离连接的探针时，两种类型的标记可以被观察到在一起，以证实等位基因特异性核苷酸序列的存在。在上述的不同标记的探针对与含有辨别不同等位基因的核苷酸的核苷酸序列进行结合的位置，探针对不能被连接，在从cDNA片段中分离探针后，两种类型的标记可以被观察到是分开的。

Cantor的WO 94/11530涉及了使用寡核苷酸阵列通过杂交进行测序过程。寡核苷酸是具有突出末端的双链体，靶核酸可以与突出的末端结合，然后被连接到双链体的非突出部分上。阵列使用链亲和素包被的滤纸来构建，所述滤纸捕获在连接前装配的生物素标记的寡核苷酸。

Chetverin的WO 93/17126使用分部分的双寡核苷酸阵列来分类和研究核酸。这些阵列具有与邻近的可变的核苷酸序列连接的恒定的核苷酸序列，都通过共价连接基团与固相支持物结合。恒定的核苷酸序列具有引发区域，从而通过PCR扩增杂交的链。然后通过与可变区的杂交进行分类。也公开了在这些双阵列上对片段化的核酸的测序、分离、分类和操作。在一个具有增强的灵敏度的实施方案中，固定化的寡核苷酸具有较短的与其杂交的互补区域，留下一部分寡核苷酸未被覆盖。然后对阵列使用杂交条件，以便互补的核酸与固定化的寡核苷酸退火。然后使用DNA连接酶连接阵列上的较短的互补区域和互补核酸。

Fodor等的WO 92/10588公开了通过与寡核苷酸阵列杂交对核酸进行测序、指纹分析和作图的方法。寡核苷酸阵列通过允许合成大量不同寡核苷酸的非常大规模的固定化聚合物合成来制备。在该方法中，基底表面被功能化，提供有连接基团，通过它将寡核苷酸装配在基底上。寡核苷酸连接的区域具有被选择性激活的保护性基团(在基底或单个核苷酸亚基上)。一般来说，这包括了使用具有变化的构型的遮光罩用光对阵列进行成像，以便暴露的区域被去保护。被去保护的区域与保护的核苷酸经过化学反应，延伸了被成像的寡核苷酸序列。可以使用二元遮蔽策略，以在给定时间内建立起两个或多个阵列。检测包括对发生了杂交的区域的位置定位。也可以参见Fodor等的美国专利Nos.5,324,633和5,424,186、Pirrung等的美国专利Nos.5,143,854和5,405,783、Pirrung等的WO 90/15070、Pease等的“用于快速DNA序列分析的光产生的寡核苷酸阵列”″Light-generated OligonucleotideArrays for Rapid DNA Sequence Analysis″，Proc.Natl.Acad.Sci USA 91：5022-26(1994)、Beattie等的“基因传感器研究进展”″Advances inGenosensor Research，″Clin.Chem.41(5)：700-09(1995)，公开了将事先装配的寡核苷酸探针与固相支持物的连接。

Landegren等的“读取遗传信息的比特：单核苷酸多态性分析”″Reading Bits of Genetic Information：Methods for Single-NucleotidePolymorphism Analysis，″Genome Research，8：769-776(1998)中公开了用于突变分析的方法的综述。

在另一个实施方案中，测试生物学样品包括在检测生物学样品中存在的任何突变之前扩增陨石色基因的区域以提供扩增的片段。

选定的或靶核酸序列的扩增可以通过任何适合的方法来进行，以便于测序或用于直接检测突变(一般来说可以参见Kwoh等，“基于核酸的诊断方法中的靶扩增系统”″Target Amplification Systems inNucleic Acid-Based Diagnostic Approaches，″Am.Biotechnol.Lab.，8：14-25(1990))。适合的扩增技术的例子包括但不限于聚合酶链反应、连接酶链反应(“LCR”)、链置换扩增(总的来说参见Walker等，“链置换扩增——等温的体外DNA扩增技术”″Strand DisplacementAmplification-An Isothermal，In Vitro DNA Amplification Technique，″Nucleic Acids Res.，20：1691-1696(1992)；Walker等，“通过限制性酶-DNA聚合酶系统等温体外扩增DNA”″Isothermal In-VitroAmplification of DNA By a Restriction Enzyme-DNA PolymeraseSystem，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：392-396(1992))、基于转录的扩增(参见Kwoh等，“基于转录的扩增系统和使用基于珠子的三明治杂交方式检测扩增的1型人免疫缺陷病毒”″Transcription-BasedAmplification System and Detection of Amplified HumanImmunodeficiency Virus Type 1 With a Bead-Based SandwichHybridization Format，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177(1989))、自持续序列复制(或″3SR″)(参见Guatelli等，“反转录病毒复制后通过多酶反应模拟的等温体外核酸扩增”″Isothermal In-VitroAmplification of Nucleic Acids By a Multienzyme Reaction ModeledAfter Retroviral Replication，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878(1990))、Qβ复制酶系统(参见Lizardi等，“重组RNA杂交探针的指数扩增”″Exponential Amplification of Recombinant RNA HybridizationProbes，″Biotechnology，6：1197-1202(1988))、基于核酸序列的扩增(或″NASBA″)、修复链反应(或″RCR″)、以及自返回DNA扩增(boomerangDNA amplification)(或″BDA″)(参见Lewis，“可以与Roche诊断系统的聚合酶链反应(PCR)竞争的开发中的扩增技术的进展综述”″Review of Progress in Developing Amplification Technologies WhichMay Compete With Roche Diagnostic Systems′Polymerase ChainReaction(PCR)，″Genetic Engineering News，12(9)：1，8-9(1992))。目前优选的是聚合酶链反应。

基因组序列特异性扩增技术例如聚合酶链反应(Mullis等，“在体外通过聚合酶链反应特异性酶法扩增DNA”″Specific EnzymaticAmplification of DNA in Vitro the Polymerase Chain Reaction，″ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263-21A(1986)；Erlich等的欧洲专利申请No.50,424；Erlich等的欧洲专利申请No.84,796；Erlich等的欧洲专利申请258,017；Erlich等的欧洲专利申请No.237,362；Mullis等的欧洲专利申请No.201,184；Mullis等的美国专利no.4,683,202；Erlich的美国专利no.4,582,788；Saiki等，“酶法扩增-球蛋白基因组序列和限制性位点分析诊断镰刀形细胞贫血症”″EnzymaticAmplification of Beta Globin Genomic Sequences and Restriction SiteAnalysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia，″Science 230：1350-1354(1985)；以及Saiki等的美国专利no.4,683,194)，可以被用于促进所需多聚核苷酸的回收。在该方法中，与所选序列的相反末端部分互补的引物被用于与热循环相结合启动引物起始的复制的连续的运转。被扩增的序列可以通过各种技术容易地鉴定。该方法对于在含有多聚核苷酸的样品中检测低拷贝序列的存在、例如在体液样品中检测病原体序列、是非常有用的。

检验生物学样品包括使用基因组DNA模板进行PCR和进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。具体来说，使用跨越突变位置的引物进行PCR。从纯合的正常的和染病的狗扩增的DNA片段的大小是不同的。然后，使用PAGE对扩增的DNA片段进行电泳。在一个实施方案中，生物样品中遗传物质的测试通过Taq循环测序进行。基于通过聚合酶链反应线性扩增模板DNA的循环测序方法，在Murray的“使用线性聚合酶链反应的改进的双链测序”″Improved Double StrandedSequencing Using the Linear Polymerase Chain Reaction，″Nucleic AcidsResearch，17：88-89(1989)中被描述。该技术基本上是使用Taq聚合酶的热循环方法与双脱氧测序的组合。原则上说，测序反应包括引物与模板DNA退火，然后在存在dNTPs/ddNTPs的情况下通过Taq聚合酶重复地延伸引物，线性地扩增测序反应产物。目前，循环测序几乎全都是通过非同位素方法使用自动DNA测序仪来进行的。一种流行的测序方法模式由Probe等在“使用荧光链终止双脱氧核苷酸进行快速DNA测序的系统”″A System for Rapid DNA Sequencing with FluorescentChain-Terminating Dideoxynucleotides，″Science，238：336-341(1987)中开发，是基于使用一组4种链终止双脱氧核苷酸，每种与不同的荧光染料偶联，可以通过荧光发射来鉴别。DNA片段通过凝胶电泳在一个测序泳道中分离(resolved)，然后通过带有基于计算机的自动序列鉴定功能的扫描荧光检测系统进行检测。

可以被用来检测突变的一种方法是聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)。基因中的单核苷酸变化是常见的现象。这样的改变、依赖于它们的位置、对于基因的功能来说可能是无害的，也可能是有害的。单个碱基的变化可能改变限制性酶的识别序列，导致产生新的或废除现有的限制性位点，导致DNA片段长度的变化。这种变体被称为限制性片段长度多态性(RFLP)。它们以共显性方式遗传，是等位基因变异体，产生纯合的和杂合的基因型。在哺乳动物基因组中RFLP的鉴定以前是通过Southern印迹分析确定的。使用聚合酶链反应(PCR)检测RFLP以易于使用的方式极大地加速了起始的鉴定和随后对大量样品的分析的步伐。简而言之，两条寡核苷酸引物根据侧接两个等位基因之间的序列中怀疑的变异的基因组区域而设计。这些引物对被用于从基因组DNA通过PCR使用Taq聚合酶和dNTPs在存在最适浓度的氯化镁的情况下扩增涵盖目的区域。带有在基因组的两个等位基因之间具有改变的识别位点的PCR产物用限制性酶进行消化，被消化的DNA片段通过电泳在选定的固相基质(例如琼脂糖或聚丙烯酰胺)中根据片段的大小进行分离。(参见例如Ray等，“分子诊断检验确定爱尔兰长毛猎犬中杆锥发育异常(rcdl)位点的基因型”″Molecular Diagnostic Test for Ascertainment of Genotype at the RodCone Dysplasia(rcdl)Locus in Irish Setters，″Current Eye Research，14：243-247(1995)；Ray等，“犬类转导素α-1亚基基因中高度多态性的RFLP标记物”″A Highly Polymorphic RFLP Marker in the CanineTransducin.alpha.-1Subunit Gene，″Animal Genetics，27：372-373(1996)；Ray等，“犬类视蛋白基因中的PCR/RFLP标记物”″PCR/RFLP Marker inthe Canine Opsin Gene，″Animal Genetics，27：293-294(1996)；Wang等，“犬类转导素基因(GNGT1)中的PCR/RFLP标记物”″PCR/RFLPMarker in the Canine Transducin-.gamma.Gene(GNGT1)，″AnimalGenetics，28：319-320(1997)；Gu等，“单核苷酸多态性的检测”″Detection of Single Nucleotide Polymorphism，″BioTechniques，24：836-837(1998)和Zeiss等，“犬类色素性视网膜炎GTPase调节子(RPGR)基因中的高度多态性的RFLP标记物”″A Highly PolymorphicRFLP Marker in the Canine Retinitis Pigmentosa GTPase Regulator(RPGR)Gene，″Animal Genetics，29：409(1998))。PCR-RFLP技术除了快速之外，它还在核苷酸的变化没有自然产生RFLP的情况下提供了产生等位基因特异性限制性位点的灵活性。这通常是通过精心地在一条引物中掺入误配的核苷酸、从而在两个等位基因中的一个中产生限制性位点来进行的。

Nickerson等描述了一种结合了PCR和OLA的特性的核酸检测分析方法(Nickerson等，“使用基于ELISA的寡核苷酸连接分析方法进行自动DNA诊断”″Automated DNA Diagnostics Using an Elisa-BasedOligonucleotide Ligation Assay，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：8923-8927(1990))。在该方法中，PCR被用于完成靶DNA的指数扩增，然后使用OLA进行检测。

在人中筛选类似基因的方法

黑色素细胞是在许多组织中存在的产生染料的细胞，包括表皮、毛囊、内耳和眼的脉络膜(Steingrimsson，E.，等，(2004)Annu.Rev.Genet.38，365-411)。黑色素细胞种群是在胚胎发育过程中从神经嵴释放的不产染料的成黑素细胞分化而来的(Steingrimsson，E.，等，(2004)Annu.Rev.Genet.38，365-411)。成黑素细胞迁移和分化成黑色素细胞的复杂过程尚未完全了解；但是，对色素分泌异常进行的研究已经帮助阐明了对正常发育来说是重要的基因(Mccallion，A.S.，&Chakravarti，A.(2001)Pigment Cell Res.14，161-169)。

色素细胞在在听觉过程、特别是将声波的机械振动翻译成可以通过神经传递到脑的电脉冲的过程中发挥了重要的作用。内耳含有被称为耳蜗的形状象蜗牛壳的小器官。它含有体液，排列有小的毛状的结构，称为纤毛。声波通过耳道传播，最终振动耳蜗中的体液。这些振动使与神经末梢相连的纤毛摆动。色素细胞在每个纤毛与其相应神经的连接中扮演了重要角色。它将机械振动“翻译”成电脉冲。如果缺乏色素细胞，这种翻译就不能发生。因此，色素细胞越少(即色素越少)，就导致听力损失越大。

瓦登伯革氏综合症(Waardenburg syndrome)(WS)是人中常染色体显性遗传的听觉色素紊乱(每40000个活的新生儿中有1例)，占所有先天性耳聋病例的2％(Nayak和Isaacson 2003)。在最常见的综合症形式1型和2型WS中，已经报道了家族间和家族内的变异性(Choi，J.H.，等，(2004)Korean J.Ophthalmol.18，185-189)。Schaible和Brumbaugh(1976)首先认为在狗的陨石色和人的WS之间存在表现型上的相似性(Schaible，R.H.，&Brumbaugh，J.A.(1976)Pigment Cell 3，191-200)。两种疾病的经典特征是毛发、虹膜和皮肤的色素沉着不足以及神经传导性耳聋。根据临床表现和已经与疾病关联的5个基因PAX3、MITF、SOX10、EDNRB和EDN3中的突变，已经描述了4类WS(Baldwin，C.T.，等，(1992)Nature 355，637-638；Tassabehji，M.，等，(1992)Nature 355，635-636；Pingault，V.，等，(1998)Nat.Genet.18，171-173；Puffenberger，E.G.，等，(1994)Cell 79，1257-1266；Mccallion，A.S，&Chakravarti，A.(2001)Pigment Cell Res.14，161-169；Tassabehji，M，等，(1994)Nat.Genet.8，251-255；和Choi，J.H，等，(2004)Korean J.Ophthalmol.18，185-189)。

在人中，SILV的突变体表现型是未知的(Sturm，R.A.，Teasdale，R.D，&Box，N.F.(2001)Gene 277，49-62)。这里描述的是SILV中第一个引起疾病过程的突变，以及建议其可能参与人听觉-色素紊乱的数据。犬类色素沉着和患有2型WS的病人中的听觉紊乱的相似性，允许通过对SILV基因进行表征来鉴定其它的候选基因。这通过对患有2型WS的病人与正常个体进行比较，并测序以鉴定任一无义、错义的、插入、缺失或剪接突变来进行。

这些结果证明已经鉴定到了第一个在SILV中引起紊乱的突变，以及SILV对于多个器官的正常发育来说是重要的。因为具有陨石色的狗在表现型上在许多方面与患有WS的人相似，具有陨石色的狗成为研究WS的候选模型系统。SILV应该被认为作为WS的候选基因。这些结果也证实了SILV的遗传检验促进了具有“隐蔽的”陨石色的动物和具有单和双陨石色的斑色的鉴定。在SILV中的突变分析也促进了由于其皮毛颜色而使得陨石色难以看见的动物中陨石色的鉴定。这样的皮毛颜色包括但不限于奶油色、斑纹和浅褐色。

通过参考下面的非限制性的实施例，将会对本发明有更进一步的理解。

实施例1：陨石色基因的筛选

材料和方法

样品收集DNA样品从以前在Texas A&M大学的犬类遗传学实验室进行的研究中，以及通过参加的主人和育种者的捐献而获得。从所有的狗收集全血或口腔细胞，并使用Puregene DNA分离试剂盒(Gentra Systems，Minneapolis，MN，USA)分离基因组DNA。

基因分型合成荧光标记的引物，象在Clark等(2004)中描述的那样对MSS-2标记物进行多重PCR。PCR产物使用ABI 3730x1DNA分析仪(PE Biosystems)用内部大小标准(GeneScan 500LIZ，PEBiosystems，Foster City，CA，USA)进行解析。使用

软件v3.5(PE Biosystems)确定基因型。

连锁分析使用41只设得兰牧羊犬对所有基因分型的MSS-2标记物进行LD的分析。对于每个标记物来说，鉴定了更通常与陨石色狗相关的等位基因，以及所有其它被合并成第二个独立的类的等位基因。使用了2×2表格的Fisher′s精确概率检验法评估了陨石色和非陨石色狗之间的等位基因频率。按照惯例，P-值＜0.0001为LD提供了证据。

对于具有LD的证据的一个标记物来说，对另外20只设得兰牧羊犬进行了基因分型，并重新计算了P-值。

测序使用了在Bailin等(Bailin，T.，Lee，S.，&Spritz，R.A.(1996)The Journal of Investigative Dermatology 106，24-27)中报道的Boxer 6X序列和人内含子-外显子边界序列，设计了用于捕获SILV的11个外显子的完整外显子和部分侧接内含子序列的引物。

表1、用于SILV基因的引物

8.45μl PCR体积中的浓度是0.09单位/μl Taq DNA聚合酶、1.2X缓冲液B(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)、3.55mM MgCl₂、1.2XMasterAmp PCR增强剂(Epicentre Technologies，Madison，WI)、0.59mM总dNTPs、5.9ng/μl DNA、正向和反向引物各0.47μM，以及2.8μl水。所有外显子使用单个阶梯降温的热循环程序来扩增：95℃5分钟，然后进行5个循环的95℃30秒、58℃15秒和72℃10秒，然后进行30个循环的95℃20秒、56℃15秒和72℃10秒，最后在72℃延伸5分钟。

PCR产物通过电泳在3％的琼脂糖凝胶上进行分析。使用QiagenXXX试剂盒纯化扩增子。将产物连接到pCR4.0-TOPO中(Invitrogen，Carlsbad，CA)，转化到化学感受态大肠杆菌TOP-10细胞(Invitrogen)中。每个狗选择两个克隆并测序。序列使用Clustal W(欧洲生物信息学研究所的WWW服务)进行比对。

结果

陨石色表现型的LD对于9只陨石色和32只非陨石色设得兰牧羊犬产生了279个MSS-2标记物的基因型数据。只有一个标记物具有在陨石色种群中更普遍出现的等位基因。对于该标记物FH2537来说，获得了统计学上显著的p-值(7.2×10^-6)。为了证实该结果，使用7只陨石色、2只双陨石色、和11只非陨石色设得兰牧羊犬产生了上述标记物的更多的基因型数据。这些数据被用于重新计算p-值，使得显著性增加了(9.0×10^-8)。

候选基因的选择焦点指向参与色素形成系统的基因，并且最接近的是位于CFA10区域中的FH2537，它表现出与HSA12q13的共线性的保守性。SILV，这个小鼠银色基因的人同源物，作图于HSA12q13-q14(Kwon，B.S.，等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci USA 88，9228-9232)，并编码了在色素形成中重要的黑素体蛋白(Sturm，R.A.，Teasdale，R.D.，&Box，N.F.(2001)Gene 277，49-62)。此外，SILV的表达依赖于MITF(Baxter和Pavan 2003)，它已经被暗示与2型WS有关，以前作为陨石色基因的候选者被研究过(Tassabehji，M.，Newton，V.E.，&Read，A.P.(1994)Nat.Genet.8，251-255)。

SINE插入序列使用来自2只非陨石色、1只蓝色陨石色和1只双陨石色设得兰牧羊犬的基因组DNA进行了PCR，获得了来自SILV的每个外显子的扩增子。外显子11的扩增产生了两个产物：预期的206bp的产物和较大的产物(略小于500bp)。在上述的狗中这些扩增子随陨石色表现型分离：非陨石色狗对于206bp的产物是纯合的，蓝色陨石色狗对产物是杂合的，双陨石色狗对于较大的产物是纯合的(图1A、1B和1C)。

外显子11产物的序列分析表明插入了tRNA衍生的SINE，它与首先被Minnick等(Minnick，M.F.，等，(1992)Gene 110，235-238)描述的独特的犬SINEs具有高度的相似性。插入发生在内含子10和外显子11的边界处(图2)。DNA从在连锁分析中使用的61只设得兰牧羊犬中的50只中获得。通过凝胶电泳分析了这50只狗的插入序列。该插入序列在12只陨石色狗中以杂合状态存在，在2只双陨石色狗中以纯合状态存在。该插入也存在于由于是双陨石色狗繁殖得来而被怀疑是隐蔽的非陨石色狗中；尽管到目前为止没有进行试验育种以结论性地将狗分类为隐蔽的。31只非陨石色狗不带有插入序列，4只非陨石色狗是较小的插入的杂合子。来自两只设得兰牧羊犬的该较小的插入序列的序列分析表明在SINE的多聚A中发生了缺失。

实施例2：陨石色基因的品种特异性的确定

为了确定SILV的突变在设得兰牧羊犬群中引起的陨石色图案是否是品种特异性的，对代表6个其它品种(柯利牧羊犬、澳大利亚牧羊犬、腊肠犬、威尔斯柯基犬、边境牧羊犬和大丹犬)的陨石色和非陨石色狗的插入序列进行了分析。来自所有其它品种的陨石色狗对于该插入序列来说都是杂合的(图4)。

11只斑色大丹犬也被分析：对于该插入序列来说9只是杂合的，2只是纯合的。序列分析表明来自上述品种的狗在内含子10中具有同样的SINE插入序列。对于代表26个不具有陨石色的品种的另外29只狗进行了分析，它们不具有插入序列。

结果概述

对用于连锁研究的60只设得兰牧羊犬的插入序列进行了分析，它们完全随着陨石色表现型分离。该插入序列在代表柯利牧羊犬、澳大利亚牧羊犬、腊肠犬、威尔斯柯基犬、边境牧羊犬和大丹犬品种的狗中也随着陨石色分离，序列分析证实了它们具有同样的突变。该发现暗示SINE插入序列可能作为基础事件而发生，在该研究中分析的7个品种共有一个共同的祖先。其它的最近才出现陨石色表现型的品种包括但不限于考克斯班尼犬、波美拉尼亚犬和奇瓦瓦狗。陨石色在许多品种中的出现，以及在1800s年间第一批从工作牧羊犬种群中分叉出来的品种具有了陨石色图案(柯利牧羊犬、老英国牧羊犬和设得兰牧羊犬)，这些事实表明基础的突变可能发生在品种分叉之前(Neff，M.W.，et al.，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci USA 101，11725-11730)。对陨石色位点的历史的研究和使用SINE插入序列中随后发生的突变进行的系统发育分析可以帮助阐述品种的进化史(Shedlock，A.M.et al.，(2004)Trends in Ecology and Evolution 19，545-553)。

斑色是大丹犬中常见的花色，其特征为白色背景上的黑色斑纹。对于斑色的遗传的研究支持了这样的假说，即它是两个基因的结果：显性基因(H)和陨石色位点(M)(Sponenberg，D.P.，&Bowling，A.T.(1985)J.Hered.16，393-394)。斑色与斑色的交配产生较少白色的狗(MM)，这已经提供证据表明H+MM基因型具有降低的存活性(O′Sullivan，N.，&Robinson，R.(1989)Genetica 78，215-218)。在本研究中斑色大丹犬的SINE插入序列的纯合子的鉴定表明斑色狗既可以是H+Mm也可以是H+MM的。这些数据表明H基因对于M来说是显性的，所有白色的狗都具有++MM基因型。这将解释在上述斑色研究中观察到的白色狗的缺少(Sponenberg，D.P.，&Bowling，A.T.(1985)J.Hered.76，393-394和O′Sullivan，N.，&Robinson，R.(1989)Genetica 78，215-218)。

陨石色和非陨石色设得兰牧羊犬中的SILV被表征，并鉴定到了随陨石色表现型一起分离的内含子10/外显子11边界处的短的散在重复元件(SINE)。该插入序列在试验的6个其它品种中在同样的位点被发现：柯利牧羊犬、澳大利亚牧羊犬、腊肠犬、边境牧羊犬、威尔斯柯基犬和大丹犬，并与陨石色图案形成相一致。该插入序列不存在于代表不具有陨石色花色的26个品种的狗中。所有在本研究中检测的斑色大丹犬都以杂合或纯合的状态具有插入序列。1只被检测的隐蔽的陨石色设得兰牧羊犬对于该插入序列来说是杂合的。还在SINE中鉴定到了大约30bp的缺失，它允许在具有SINE插入序列的狗中发生正常的色素形成。

应该理解的是，这里公开的发明不限于描述的特定方法、步骤和试剂，因为这些都可以变化。还应该理解本文使用的术语学只是为了描述具体实施方案的目的，并不是为了限制本发明的范围，而本发明的范围仅仅由随附的权利要求来限定。本领域的专业技术人员将会认识到或能够确定，仅仅使用常规的实验，就可以作出这里描述的发明的具体实施方案的等效物。下面的权利要求打算涵盖这些等效物。

序列表

<110>梅洛根有限责任公司

(Merlogen，LLC)

<120>鉴定陨石色基因的方法

(Methods For Identification of Merle Gene)

<130>SCT080783-47

<160>36

<170>Patentln version 3.3

<210>1

<211>1569 DNA Dog

<212>

<213>

<400>1

atggtacctt cgtttttagg acccagagac caggactggc ttggtgtccc aaggcagctc 60

acaactaaag cctggaacag acagctgtat ccagagtgga cagaaaccca gaggcctgac 120

tgctggagag gtgggaactt ggcaatttcc agggagggtg gccaggtgtc cctgaaggtc 180

agtaatgatg ggcctacact ggttggtgca aatgcctcct tctctattgc cctgcacttc 240

cctgaaagcc aaaaggtact gccagatggg caggttgtct gggccaacaa cactatcatc 300

gatgggagcc aggtgtgggg aggacagcca gtgtatcccc aggtacttga tgatgcctgc 360

atcttccctg atgggagggc ctgcccatct ggcccttggt ctcagacaag aagctttgtt 420

tatgtctgga agacctgggt gtctgggctg agcattgtga caggcaaggc ggtgctgggc 480

acacatacca tggaagtgac tgtctaccac cgccgggagt cccagagcta cgtgcccctt 540

gctcactcct gctcagcctt caccattact gaccaggtgc ccttctccgt gagtgtgtct 600

cagctgcagg ccttggatgg agggaacaag catttcctga gaaatcatcc tctgaccttt 660

gccctccggc tccatgaccc cagcggctat ttgtctgggg ctgacctctc ctacacctgg 720

gactttggag accataccgg gaccctgatc tctcgggcac ttgtggtcac tcacacttac 780

ctagagtctg gcccaatcac tgcccaggtg gtcctgcagg ctgccattcc tctcacttcc 840

tgtggctcct ccccagttcc agtcaccaca gatgggcatg cgccaactgc agagatccct 900

ggcaccacag ctgggcgagt gcctactgca gaagtcataa agccctctgg aaccacaggc 960

gagcaggtaa cgactaaaga gtcagtggag cccacagctg gagagggacc cacgcctgag 1020

accaagggtc cagataccaa tctgttcgtg cctacagaag gtattacagg ttcccagagc 1080

gccctgctgg atggcacagc taccttaatc ctggcaaagc gagaaacccc cctggattgt 1140

gttctgtatc gatatggctc cttttctctc accctggaca ttgtccgggg tattgagaat 1200

gctgagatcc tgcaggctgt gccatccagt gaaggggatg catttgagct gactgtgtct 1260

tgccaaggcg gactgcccaa ggaagcctgc atggacatct catcaccagg gtgccagccc 1320

cctgcccaga ggctatgtca gcctgtgccg cccagcccag cctgccagct ggttttgcac 1380

caagtgctga agggtggctc agggacctac tgcctcaatg tgtctttggc tgatgctaac 1440

agtctggcaa tggtcagcac tcagcttgta atgcctggtc aagaagcagg cgttggacag 1500

gctcccctgt tcatgggcat cttgctggtg ttgctggcta tggtgctggt atctctgata 1560

tataggtga 1569

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Forward Primer for Exon 1 of SILV gene

<400>2

gtagcgggat gtccaggg 18

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Reveerse Primer for Exon 1 of the SILV gene

<400>3

gagaaaaatc agagcaggtg tg 22

<210>4

<211>17

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Forward primer for Exons 2 and 3 of the SILV gene

<400>4

atggtgctgt cccctga 17

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Reverse primer for Exons 2 and 3 of the SILV gene

<400>5

atctgagccc ttggaataa 19

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Forward primer for Exon 4 of the SILV gene

<400>6

ggtttgaggg tgactctgtg t 21

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Reverse primer for Exon 4 of the SILV gene

<400>7

gggcagtgaa gatttaggga a 21

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Forward primer for Exon 5 of the SILV gene

<400>8

ttccctatgc tcagttcttc c 21

<210>9

<211>16

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Reverse primer for Exon 5 of the SILV gene

<400>9

gctttgcccc ttccca 16

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Forward primer for Exon 6a of the SILV gene

<400>10

ggtgtgcctg tgaaagaag 19

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Reverse primer for Exon 6a of the SILV gene

<400>11

caagcgtagtg cctgtgac 19

<210>12

<211>17

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>FOrward primer for Exon 6b of the SILV gene

<400>12

gcagatgacg accacgg 17

<210>13

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Reverse primer for Exon 6b of the SILV gene

<400>13

gtcccacctc aatgaacct 19

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>FOrward primer for Exon 7 of the SILV gene

<400>14

gcctcttcaa tcctctcc 18

<210>15

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Reverse primer for Exon 7 of the SILV gene

<400>15

caaggtatgc tttcactgg 19

<210>16

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Forward primer for exon 8 of the SILV gene

<400>16

gaagcagcct tacggtttt 19

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Reverse primer for Exon 8 of the SILV gene

<400>17

cggagttctc aggacaatca 20

<210>18

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Forward primer for Exon 9 of the SILV gene

<400>18

ccattgccct gacctaagc 19

<210>19

<211>17

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Reverse primer for Exon 9 of the SILV gene

<400>19

agcctgtcca acgcctg 17

<210>20

<211>16

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Forward primer for Exon 10 of the SILV gene

<400>20

tggcggggag cagaca 16

<210>21

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Resverse primer for Exon 10 of the SILV gene

<400>21

aagaatgagc agtggcaaga g 21

<210>22

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Forward primer for Exon 11 of the SILV gene

<400>22

cagtttctcc tttattctcc ca 22

<210>23

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Reverse primer for Exon 11 of the SILV gene

<400>23

cctcgg caaa tcacagca 18

<210>24

<211>64

<212>DNA

<213>Dog

<400>24

ccttgtccat tgctaatcga tttctccttt attctcccaa tgttaggcga agacttctga 60

agca 64

<210>25

<211>79

<212>DNA

<213>Dog

<400>25

ccttgtccat tgctaatcag tttctccttt attctcccaa tgttagggga agacctctta 60

ggcgaagact tctgaagca 79

<210>26

<211>262

<212>DNA

<213>Dog

<400>26

taggggaaga cctctttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60

tttttttttt tttttttttt ttttttttaa atttttattt atttatgata gtcacagaga 120

gagagagagg cgcagagaca caggcagagg gagaagcagg ctccatgcac cgggagcccg 180

acgtgggatt cgatcccggg tctccaggat cgcgccctgg gccaaaggca ggcgccaaac 240

cgctgcgcca cccagggatc cc 262

<210>27

<211>266

<212>DNA

<213>Dog

<400>27

taggggaaga cctctttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60

tttttttttt tttttttttt tttttttttt aaatttttat ttatttatga tagtcacaga 120

gagagagaga gaggcgcaga gacacaggca gagggagaag caggctccat gcaccgggag 180

cccgacgtgg gattcgatcc cgggtctcca ggatcgcgcc ctgggccaaa ggcaggcgcc 240

aaaccgctgc gccacccagg gatccc 266

<210>28

<211>274

<212>DNA

<213>Dog

<400>28

taggggaaga cctctttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60

tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttttaa atttttattt atttatgata 120

gtcacagaga gagagagaga ggcgcagaga cacaggcaga gggagaagca ggctccatgc 180

accgggagcc cgacgtggga ttcgatcccg ggtctccagg atcgcgccct gggccaaagg 240

caggcgccaa accgctgcgc cacccaggga tccc 274

<210>29

<211>272

<212>DNA

<213>Dog

<400>29

taggggaaga cctctttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60

tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttaaat ttttatttat ttatgatagt 120

cacagagaga gagagagagg cgcagagaca caggcagagg gagaagcagg ctccatgcac 180

cgggagcccg gcgtgggatt cgatcccggg tctccaggat cgcgccctgg gccaaaggca 240

ggcgccaaac cgctgcgcca cccagggatc cc 272

<210>30

<211>269

<212>DNA

<213>Dog

<400>30

taggcgaaga cctctttttt tttttttttc tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60

MUR 100 PCT.ST25.txt

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttaaatttt tatttattta tgatagtcac 120

agagagagag agagaggcgc agagacacag gcagagggag aagcaggctc catgcaccgg 180

gagcccgacg tgggattcga tcccgggtct ccaggatcgc gccctgggcc aaaggcaggc 240

gccaaaccgc tgcgccaccc agggatccc 269

<210>31

<211>270

<212>DNA

<213>Dog

<400>31

taggggaaga cctctttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60

tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttaaattt ttatttattt atgatagtca 120

cagagagaga gagagaggcg cagagacaca ggcagaggga gaagcaggct ccatgcaccg 180

ggagcccgac gtgggattcg atcccgggtc tccaggatcg cgccctgggc caaaggcagg 240

cgtcaaaccg ctgcgccacc cagggatccc 270

<210>32

<211>265

<212>DNA

<213>Dog

<400>32

taggggaaga cctctttttt tttttttttt tttttttttt ttcttttttt tttttttttt 60

tttttttttt tttttttttt tttttttttt taaattttta tttatttatg atagtcacag 120

agagagagag aggcgcagag acacaggcag agggagaagc aggctccatg caccgggagc 180

ccgacgtggg attcgatccc gggtctccag gatcgcgccc tgggccaaag gcaggcgcca 240

aaccgctgcg ccacccaggg atccc 265

<210>33

<211>268

<212>DNA

<213>Dog

<400>33

taggggaaga cctctttttt ttttttcttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60

tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttaaattttt atttatttat gatagtcaca 120

cagagagaga gagaggcgca gagacacagg cagagggaga agcaggctcc atgcaccggg 180

agcccgacgt gggattcgat cccgggtctc caggatcgcg ccctgggcca aaggcaggcg 240

ccaaaccgct gcgccaccca gggatccc 268

<210>34

<211>234

<212>DNA

<213>Dog

<400>34

taggcgaaga cttctttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttttaa 60

atttttattt atttatgata gtcacagaga gagagagaga ggcgcagaga cacaggcaga 120

gggagaagca ggctccatgc accgggagcc cgacgtggga ttcgatcccg ggtctccagg 180

atcgcgccct gggccaaagg caggcgccaa accgctgcgc cacccaggga tccc 234

<210>35

<211>235

<212>DNA

<213>Dog

<400>35

taggcgaaga cttctttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttttta 60

aatttttatt tatttatgat agtcacagag agagagagag aggcgcagag acacaggcag 120

agggagaagc aggctccatg caccgggagc ccgacgtggg attcgatccc gggtctccag 180

gatcgcgccc tgggccaaag gcaggcgcca aaccgctgcg ccacccaggg atccc 235

<210>36

<211>227

<212>DNA

<213>Dog

<400>36

taggcgaaga cttctttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt taaattttta 60

tttatttatg atagtcacag agagagagag agaggcgcag agacacaggc agagggagaa 120

gcaggctcca tgcaccggga gcccgacgtg ggattcgatc ccgggtctcc aggatcgcgc 180

cctgggccaa aggcaggcgc caaaccgctg cgccacccag ggatccc 227

Claims

1.鉴定在SILV基因中具有突变的个体的方法，包括：

a)从狗或人获得生物学样品；以及

b)分析所述生物学样品在SILV基因或人等价物中的突变。

2.权利要求1的方法，其中，所述生物体具有陨石色等位基因。

3.权利要求2的方法，其中，所述陨石色等位基因是SEQ ID NO：25或在严格条件下与其杂交的序列。

4.权利要求1的方法，其中，所述狗具有隐蔽的陨石色等位基因。

5.权利要求4的方法，其中，所述隐蔽的陨石色等位基因是SEQID NO：34、35或36，或在严格条件下与其杂交的序列。

6.权利要求1的方法，其中，所述生物学样品是含有从狗获得的基因组DNA的细胞或组织。

7.权利要求1的方法，其中，所述生物学样品通过使用基因组DNA模板进行PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳来进行分析。

8.权利要求1的方法，用于筛选人在类似人基因中的缺陷。

9.权利要求8的方法，其中，所述人具有听觉或视觉缺陷或有生出具有听觉或视觉缺陷的儿童的风险。

10.鉴定引起人听觉或视觉缺陷的基因的方法，包括从患有2型WS的病人和正常的个体获得样品，以及对DNA进行测序来鉴定样品在与SILV基因类似的区域中，在患有2型WS的病人中存在，但在正常个体中不存在的任一的无义、错义、插入、缺失或剪接突变。

11.SEQ ID NO：25或在严格条件下与其杂交的序列。

12.SEQ ID NO：34、35或36或在严格条件下与其杂交的序列。

13.用于筛选狗或人的陨石色基因或在人基因中的类似缺陷的存在的试剂盒，包括SEQ ID NO：25或在严格条件下与其杂交的序列，以及用于确定从人或狗获得的样品中陨石色基因或类似的人基因的存在的试剂。

14.用于筛选狗或人的陨石色基因或在人基因中的类似缺陷的存在的试剂盒，包括SEQ ID NO：25或在严格条件下与其杂交的序列，以及用于确定从狗或人获得的样品中陨石色基因或类似的人基因的存在的试剂。

15.用于筛选狗或人的隐蔽的陨石色基因或在人基因中的类似缺陷的存在的试剂盒，包括SEQ ID NO：34、35或36或在严格条件下与其杂交的序列，以及用于确定从狗或人获得的样品中隐蔽的陨石色基因的存在的试剂。