CN101355961A - 使用重组植物悬浮培养物制备疫苗主细胞系 - Google Patents

使用重组植物悬浮培养物制备疫苗主细胞系 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于生产蛋白质活性剂的植物细胞培养物，包括表达编码蛋白质活性剂的转基因的稳定转化植物细胞系和生长培养基，其中该培养基支持所述的植物细胞培养物的生长而不支持支原体科生物的生长，并且不含有动物来源的材料。该植物细胞系能够连续传代以致于可以在传代期间维持一致的转基因表达。该植物细胞系也能够被深低温保存以致于一旦从深低温保存中恢复后可以恢复一致的转基因表达。

Description

使用重组植物悬浮培养物制备疫苗主细胞系
相关申请的交叉引用
本申请要求2005年11月4日提交的U.S.临时申请系列号60/733,702的权益。
技术领域
本申请一般地涉及植物细胞培养和在植物细胞培养物中生产蛋白质的领域。具体地，本发明涉及能够生产多种可以用作治疗剂和疫苗的简单和复杂蛋白质的通用生产系统和植物细胞系。
背景技术
重组DNA技术已经在包括疫苗的药物和兽药的安全性、质量、功效和费用方面提供了实质性的改善。Curtiss & Cardineau发明了植物生产的粘膜疫苗。参见U.S.专利号5,654,184；5,679,880和5,686,079，通过引用的方式合并入本申请。其它人公开了表达免疫保护性抗原的转基因植物和生产方法，包括Arntzen，Mason和Lam。参见U.S.专利号5,484,717；5,914,123；6,034,298；6,136,320；6,194,560和6,395,964，通过引用的方式将其整体合并入本申请。
通过在确定成分培养基中进行细胞培养的植物细胞生产避免了在生长培养基中对动物来源组分的需要，从而基本上消除了传播来自生产过程的致病性污染物的风险。植物细胞能够进行翻译后糖基化，并且通常植物细胞生长培养基比目前疫苗生产中使用的常规生长培养基便宜、容易操作和制备。
在植物系统中生产疫苗抗原和具有药学的或者相关的生物活性的蛋白质呈现出超过常规生产系统的许多优势。衍生自植物的亚单元蛋白质不能回复毒力(常规或者重组生产的活载体疫苗的特征)。从常规制备方法生产的亚单位蛋白质由于蛋白质的不稳定性和生物化学提取问题而可能是生产和纯化困难的，并且当在原核生物中生产时要求糖基化的亚单位疫苗组分将不能被糖基化。
植物提供了独特的益处，该益处很难从任何一个常规的或者哺乳动物来源的重组DNA系统中获得。常规地，亚单位疫苗或者蛋白质活性剂(proteinaceous agents)：1)由于低产率的原因而难于从重组或者常规来源纯化，从而使得它们的生产受阻；2)由于纯化过程中的蛋白酶水解、pH或者使用的溶剂而是不稳定的；3)由于是非天然的，或者由于纯化过程引起关键表位变性，故具有较低的有效性；和4)当在哺乳动物系统中生产时受到外来的生物学来源材料的妨碍(如上提及的)
用于生物药生产的“主细胞系”原理(“master cell line”principle)，利用活生物体作为生产过程的一部分，并依赖于一些基本的原则：1)具有确定来源和传代历史的单一培养物，以确定的细胞表型特征和所期望的生产特征被保存；2)保存，典型的深低温保存是持久的(跨越几年或者更长)；3)细胞可以被恢复、扩增、无限地传代为“工作种子”(working seed)，并可以接受另一个时期的深低温保存(要求细胞强壮的原则)；和4)在确定次数的传代之后，细胞不丢失在最开始的冷藏之前所存在的确定的细胞表型特征和所期望的生产特性。
因此，本领域需要在主种子(master seed)原理下能够长期生长、反复深低温保存和稳定地生物生产靶组分的植物细胞和植物细胞培养物。
发明内容
本发明提供适于按照法规和GMP制造标准(优良制造标准)生产蛋白质活性剂的植物细胞培养物和培养和储存植物细胞的方法。在本发明的某些方面，转基因细胞培养物用于表达在疫苗及工业的、医药的和药学的制剂中有用的简单或者复杂的生物药物蛋白质和肽活性剂。本发明的其它方面提供由植物细胞生产的疫苗的生产系统。而且，本文所述的植物主细胞系展现出足以符合监管要求的稳定性和强壮性。
附图简要说明
图1A和1B(SEQ ID NOs：1和2)显示NDV株“Lasota”的HN基因的植物优化的编码序列和蛋白质序列。
图2显示含有由组成型CsVMV(木薯叶脉花叶病毒)启动子驱动，并且由MAS 3’(甘露氨酸合酶)元件终止的植物选择标记PAT(膦丝菌素乙酰转移酶)的pBBV-PHAS-iaaH的图谱。来自土壤杆菌属(Agrobacterium)生物的LB和RB(左和右T-DNA边界)元件确定出待整合入植物基因组的DNA的边界。
图3显示pC！H的图谱，pC！H是“模板载体”，其用作多种用于表达免疫保护性抗原的植物表达载体的起始质粒。
图4显示用于表达NDV HN蛋白的pCHN表达载体的图谱。HN表达载体或者表达盒由组成型CsVMV启动子驱动并由大豆vspB 3’元件终止。
图5显示用于表达NDV HN蛋白的pgHN表达载体的图谱。HN表达盒由具有TEV 5’UTR的块茎特异性GBSS启动子驱动并且由大豆vspB 3’元件终止。
图6显示用于NDV HN蛋白表达的pgHN151表达载体的图谱。HN表达盒由块茎特异性GBSS启动子及其天然5’UTR和内含子驱动，并由大豆vspB 3’元件终止。该载体衍生自pBBV-PHAS-iaaH，含有由CsVMV启动子驱动，并且由MAS 3’元件终止的植物选择标记PAT。LB和RB(左和右T-DNA边界元件)确定待整合入植物基因组的DNA的边界。
图7显示用于NDV HN蛋白表达的pgHN153表达载体的图谱。HN表达盒由块茎特异性GBSS启动子及其天然5’UTR和内含子驱动，并由菜豆的菜豆蛋白3’元件终止。该载体衍生自含有由CsVMV启动子驱动并且由MAS 3’元件终止的植物选择标记PAT的pBBV-PHAS-iaaH。LB和RB(左和右T-DNA边界元件)确定出待整合入植物基因组的DNA的边界。
图8显示表达NDV HN蛋白的pMHN表达载体的图谱。HN表达盒由组成型4OCSΔMAS启动子(P2方向)驱动，并由大豆vspB 3’元件终止。该载体衍生自含有由CsVMV启动子驱动并且由MAS 3’元件终止的植物选择标记PAT的pBBV-PHAS-iaaH。LB和RB(左和右T-DNA边界元件)确定出待整合入植物基因组的DNA的边界。
图9显示用于AIV A/Turkey/wisconsin/68(H5N9)的HA基因的pCHA表达载体的图谱。
图10显示AIV A/Turkey/wisconsin/68(H5N9)的HA基因的DNA和蛋白质序列(SEQ ID NOs：3和4)。
图11显示pGLTB中间载体的图谱。
图12显示pCLT105中间载体的图谱。
图13显示编码VP2的二元载体pDAB2423。
图14显示传染性法氏囊病(IBD)病毒(IBDV)超强毒株Ehime 91的VP2基因的DNA序列(SEQ ID NO：10)。
序列简述
图1A和1B中显示的SEQ ID NOS：1和2是NDV株“Lasota”的HN基因的植物优化的编码序列和蛋白质序列。
图10中显示的SEQ ID NOS：3和4是AIV A/Turkey/wisconsin/68(H5N9)的HA基因的DNA和蛋白质序列。
SEQ ID NO：5是用于末端剪裁(end-tailor)pCP！H上的CsVMV启动子的PCR引物。
SEQ ID NO：6是用于末端剪裁pCP！H上的CsVMV启动子的PCR引物。
SEQ ID NO：7是用于产生Nco I位点的诱变引物。
SEQ ID NO：8是互补于5’区的正向引物。
SEQ ID NO：9是用于产生XhoI I位点的诱变引物。
显示于图14中的SEQ ID NO：10是传染性法氏囊病病毒的VP2基因的DNA序列。
SEQ ID NO：11是编码E/91 VP2变异的植物优化的DNA序列(1425个碱基)。E/91VP2的植物优化的编码区包含碱基第16至1383位(1371个碱基)。在碱基1384至1425位发现六个读框终止。
SEQ ID NO：12包含由E/91 VP2编码区的植物优化的序列(SEQ IDNO：11)编码的E/91 VP2蛋白的序列。
SEQ ID NO：13是在六个读框中编码翻译终止(“终止”)密码子的DNA序列。该序列用于终止在转化过程中DNA整合后无意发生的开放阅读框翻译，并且包括SacI，BstE II和Bgl II限制性酶识别位点(TsukamotoK.，Kojima，C.，Komori，Y.，Tanimura，N.，Mase，M.，和Yamaguchi，S.(1999)，使用表达IBDV VP2的重组MDV可以给予鸡抵抗超强毒性的传染性法氏囊病病毒(IBDV)和马立克氏病病毒(MDV)的保护作用(Protection of chickens against very virulent infectious bursal diseasevirus(IBDV)and Marek’s disease virus(MDV)with a recombinant MDVexpressing IBDV VP2)，Virol.257：352-362)。
发明详述
本发明的某些方面提供用于生产蛋白质活性剂的植物细胞培养物，其包括表达编码蛋白质活性剂的转基因的稳定转化的植物细胞系，和生长培养基，其中所述培养基支持所述植物细胞培养物的生长，但是不支持支原体科生物(Mycoplasmataceae)的生长，并且不包含动物来源的材料。该植物细胞系能够连续传代以致可以在传代期间维持一致的转基因表达，并且能够被深低温保存以致一旦从深低温保存恢复后可以恢复一致的转基因表达。
本发明的其它方面提供生产蛋白质疫苗或者治疗剂的植物细胞培养物，其具有下述一个或者多个特征：a)在培养性培养基/生长培养基中缺少动物产品；b)无可检测水平的植物次生代谢物(例如烟碱代谢物)；或者c)无可检测水平的支原体、病毒、细菌或者真菌。因此，本发明提供的植物细胞培养物可以具有本段落中列出的特征中的任何之一、之二或者全部三个(例如特征a)；或者特征b)或者特征c)；或者特征a)和b)；或者特征a)和c)；或者特征b)和c)；或者特征a)和b)和c))。
本发明还提供了基于稳定转化的植物的疫苗生产系统，该系统包括下述一个或者多个特征：a)可以选择和建立表达蛋白质活性剂的重组植物细胞培养物主细胞系，该细胞系可以被永久保存，并且可以作为所有其它传代细胞(衍生出所有其它的种子和传代细胞)的来源；b)能够创建工作种子(即，衍生自主细胞系并且可以被用于制备生产种子的保存源)和生产种子(即，处于特定范围的传代水平上的重组细胞，其不经进一步的增殖而用于起始由植物制造的蛋白质活性剂的生产)；c)在缺少(不使用)动物来源产品(例如哺乳动物(如马、胎牛等等)来源的血清)的生物反应器中，通过生长稳定转化的植物细胞而可以生产蛋白质活性剂；d)对于经皮、肌内、鼻内或者口服递送而向动物进行的施用是安全的；e)没有可检测水平的植物次生代谢物(例如多环芳烃和亚硝胺，包括新烟草碱、新烟碱、苯并芘、烟碱和去甲烟碱)；f)无支原体、病毒、真菌或者细菌；g)可以生产蛋白质活性剂或者疫苗，其中所述蛋白质活性剂或疫苗在环境条件、冷藏或者冷冻条件下，作为冻干粉末可以长期稳定，该期限多达几年，优选1至10年，并且更优选1至5年；h)经组配(assembled)的蛋白质活性剂(疫苗)(例如，与佐剂组合的疫苗抗原或者蛋白质活性剂)在冷藏条件下可以几个月稳定；i)该系统可以用于在容器条件(containedconditions)下可以实施并且不需要再生可育植物的方法中；j)该系统提供可以以高恢复率融解的主细胞系(例如恢复率达到100％，或者恢复率至少为或者大于90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％恢复)；k)使得可以自深低温保存的主细胞系制备和恢复具有高恢复率的深低温保存的工作种子(例如恢复率达到100％，或者恢复率至少为或者大于90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％恢复)；l)获得的蛋白质活性剂或者疫苗可以被配制为常规疫苗组配物(assemblies)(蛋白质活性剂/疫苗与已知佐剂组合)，或者被配制为新疫苗组配物(例如，cell pastes)，并可以施用以在接种个体中提供血清学转化和/或抗疾病保护作用；m)可以提供常规或者新的疫苗制剂，该制剂具有低于针对家畜或家禽业已建立的耐受水平的2，4-D水平；n)可按比例放大到商业生产过程(例如系统或者细胞可以在从摇瓶至生物反应器的容器中培养，生物反应器的范围是10升至100,000升，优选100升至1,000或5,000或10,000升)；o)产生稳定转化的植物细胞系；和/或p)可以用于制备主参考和工作参考(即，其效力在宿主动物中被直接或者间接地相关的参考材料(例如细胞因子的生物活性或者疫苗抗原的抗原性/免疫原性)。本发明的某些方面提供具有所有上述特征的由植物制备的疫苗生产系统。
如本文使用的，术语“无可检测水平”的次生代谢物应理解为指使用标准的技术(例如GC/MS和LC/MS技术)不能检测到被测的物质。这些技术的检测限为100ng/ml。术语“无支原体、病毒、真菌和细菌”指通过例如本文实施例5中公开的生物学测试法，确定无这样的生物体存在。
家禽的2，4-D耐受水平：对于由防止鸟类疾病病毒而进行的免疫接种所引起的2，4-D残留，保守估计是目前EPA在卵中建立的2，4-D耐受量的无关紧要的0.007％。目前，EPA在家禽中建立的2，4-D耐受量是0.05mg/kg或50μg/kg。对于由防止鸟类病毒而进行的免疫接种所引起的2，4-D残留，保守估计是目前EPA在家禽组织中建立的2，4-D耐受量的无关紧要的0.00079％。
术语“稳定转化”，“稳定转化的植物细胞系”或者“基于稳定转化的植物的疫苗生产系统”或者“一致的转基因表达”指植物细胞系或者基于植物的疫苗生产系统可以持续一百多代旺盛地生长和生产生物学和免疫学活性抗原，并且任选地，如基于遗传分析(例如Southern印迹、PCR或AFLP)证明的，含有不随时间和传代次数而改变的重组插入物(遗传事件)，从而导致表型生长率或者转基因表达水平无显著改变。
本申请所述植物细胞培养物可以包括衍生自低等植物、双子叶植物或者单子叶植物的转化的植物细胞系。可以产生转化细胞系的双子叶植物的非限制性实例是西红柿(tomato)、马铃薯(potato)、甘薯(sweet potato)、木薯(cassava)、豆科植物(legumes)(包括苜蓿(alfalfa)和大豆(soybean))、胡萝卜(carrot)、草莓(strawberry)、莴苣(lettuce)、栎(oak)、槭树(maple)、胡桃(walnut)、玫瑰(rose)、薄荷(mint)、向日葵(sunflower)、红花(safflower)、棉(cotton)、烟草(tabacco)、南瓜(squash)、雏菊(daisy)、Canola或者仙人掌(cactus)。本发明的某些方面使用烟草细胞系，例如NT-1或BY-2。当自单子叶植物产生转化的植物细胞系时，例如，小麦(wheat)、草(turf)，草坪草(turf grass)、谷类(cereal)、玉米(maize)或玉蜀黍(corn)、稻(rice)、燕麦(oat)、小麦、大麦(barley)、高粱(sorghum)、兰(orchid)、鸢尾(iris)、百合(lily)、洋葱(onion)、香蕉(banana)、甘蔗(sugarcane)、高粱或者棕榈(palm)等植物可以被用于建立该植物细胞系。另外，可以从低等植物建立细胞系，低等植物例如是羊齿植物(ferns)、裸子植物(gymnosperms)、针叶树(conifers)、木贼类植物(horestails)、石松类(club mosses)、苔类植物(liverwarts)、角苔类植物(hornworts)、苔藓类(mosses)、红藻类(red algaes)、褐藻类(brown algaes)、蕨类植物(pteridophytes)的配子体、孢子体或者绿藻类(green algaes)。本发明中使用的植物细胞培养物优选为衍生自玉蜀黍、稻或者烟草植物的植物细胞培养物。
蛋白质药物或者疫苗活性剂包括，但不限于酶、毒素、细胞受体、配体、病毒或者细菌蛋白质或者抗原、信号转导物、细胞因子或者其它在转基因植物细胞培养物中表达的治疗蛋白质。编码这些蛋白质药物或者疫苗活性剂的多核苷酸序列可以从商业数据库(例如EMBL、SWISSPROT或NCBI数据库)获得。蛋白质活性剂也可以是一种或者多种来自特定的致病病毒的蛋白质(抗原)，包括但不限于AIV(禽流感病毒)的HA(血凝素)蛋白，1型糖蛋白；鸟类NDV(新城疫病毒)的HN(血凝素/神经氨酸酶)蛋白，2型糖蛋白(参见U.S.专利号5,310,678，通过引用的方式合并入本申请)；传染性法氏囊病病毒(IBDV)的结构蛋白VP2；ADP核糖基转移酶(大肠杆菌(E.coli.)热不稳定性毒素的LT-A亚基)；由两个亚基组成的大肠杆菌细菌毒素LT；人病毒，包括但不限于脊髓灰质炎病毒、人鼻病毒(HRV)、甲型肝炎病毒(HAV)、免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头瘤病毒(HPV)、单纯疱疹病毒(HSV)，小RNA病毒例如口蹄疫病毒(FMDV)，黄病毒例如登革病毒和西尼罗病毒和呼吸道合胞病毒(RSV)。典型地，在转基因植物细胞培养物中生产的蛋白质活性剂在功能或者结构活性方面等同于分离自天然来源的相同蛋白质。在SEQ IDNOs：1、2、3、4、11和12中也列出了病毒抗原的非限制性实例。
免疫接种定义为通过使用含有蛋白质活性剂的免疫原性制剂接种宿主而提供抗病原体的保护作用或者诱导血清转变(例如抗体生成)的手段，其中所述接种导致宿主的免疫系统被刺激，并且防止或者减轻随后的有害病变(与宿主对随后暴露于该病原体的反应相关)。
疫苗是用于免疫接种动物(包括人)的组合物，其含有至少一种蛋白质活性剂，该蛋白质活性剂可以诱导对宿主免疫系统的刺激，并且，防止或者减轻之后的有害病变(与宿主对随后暴露于该病原体的免疫保护性抗原物的反应相关)。
致病生物是在其感染的动物或宿主中引起疾病或者引起诱导的/受控的生理情况的细菌、病毒、真菌或者原生动物。
基于本发明的目的，佐剂是加强、增加、调节或者增强对免疫原或者抗原的免疫应答的物质。典型地，佐剂增强体液和细胞免疫应答两者，但是增加其中任一种应答但不增加另一种应答的物质也定义为佐剂。而且，佐剂及其用途对于免疫学家而言是熟知的，并且典型地，当免疫原的剂量有限时，当免疫原具有差的免疫原性时或者当给药途径不是最佳时，佐剂被用于增强免疫应答。因此，术语“佐剂量(adjuvating amount)”是能够增强对给定免疫原或者抗原的免疫应答的佐剂的量。等于“佐剂量”的量将是变化的并且取决于许多因素，包括但不限于，免疫原的特性、施用的免疫原的数量、宿主物种、给药途径以及施用免疫原的方案。假定一组特定的环境条件，“佐剂量”可以通过常规实验而容易地确定。这是本领域普通技术人员能力所及之事，并且典型地通过针对施用的变化量的免疫原和佐剂进行常规的剂量反应测定来实现。所述反应可以通过使用酶联免疫吸附试验、放射性免疫试验、血细胞凝集试验等等，确定抗该免疫原的血清抗体效价或者细胞介导的应答而测量。
有效剂量是在人或者动物中诱导如下免疫应答所必需的量，其中所述免疫应答足以使得该人或者动物有效地抵抗病原体发动的攻击或者响应动物的生理需求(例如针对糖尿病的自身免疫抗原)。向这样的人或者动物施用的剂量将由医师、兽医或者受过训练的科学工作者考虑相关条件而确定，所述的相关条件包括具体的免疫保护性颗粒或者颗粒的组合、人或者动物的状况以及选择的施用途径。一般地，有效剂量的范围为大约1ng至大约0.5mg，优选大约1μg至大约50μg。对于新城疫病毒(HN抗原)，在家禽中通过SQ途径的有效剂量是大约0.5μg至大约50μg，优选大约2.5μg至大约5μg。通过IN/眼粘膜途径，HN的有效剂量在家禽中是大约0.5μg至大约50μg，优选大约5μg至大约25μg和更优选大约10μg至大约12μg。对于禽流感病毒(HA抗原)，通过IN/眼途径的有效剂量是大约0.5μg至大约50μg，优选大约1μg至大约30μg，并更优选大约24μg至大约26μg，以及通过SQ途径的有效剂量优选是大约1μg至大约5μg。对于传染性法氏囊疾病(VP2抗原)，家禽中通过SQ途径的有效剂量是0.5μg至大约50μg，优选大约5μg至大约25μg，并更优选大约5μg至大约20μg。对于LT抗原，有效的口服剂量的范围是大约50ng至大约250ng，优选大约100ng至大约200ng。对于LT抗原，有效的SQ或IN/眼剂量是大约50ng至大约100μg；优选大约1μg至大约50μg，并更优选大约2μg至大约10μg。这里公开的剂量范围不欲以任何方式限制本发明的范围，并且作为本领域技术人员的一般指导而呈现。
本文定义转基因植物为衍生自转化的植物细胞或者原生质体的植物细胞培养物、植物细胞系、植物组织培养物、低等植物、单子叶植物细胞培养物、双子叶植物细胞培养物或者其后代，其中转化的植物的基因组含有由实验室技术导入的外源DNA，即该DNA最初并不存在于相同物种的天然的、非转基因植物细胞中。术语“转基因植物”和“转化的植物”在本领域中有时被用作同义词，定义为其DNA含有外源DNA分子的植物。
用于转化植物或者转化植物细胞培养物的基因盒的构建可以通过使用熟知的方法容易地完成，所述的方法例如在Sambrook等人(1989)和Ausubel等人，(1987)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons，New York，NY中描述的那些。本发明还包括与公开的编码免疫保护性抗原或者蛋白质活性剂的序列有实质的序列同源性的DNA序列，所述同源性使得所述DNA序列在表达后能够具有公开的效果。如在本申请中使用的，术语“实质的序列同源性”用于指核苷酸序列(DNA或者RNA)或者氨基酸序列(蛋白质或者多肽)与另一个核苷酸序列或者氨基酸序列表现出实质的、功能或者结构上的等价性。在具有实质的序列同源性的两个序列之间，任何的功能或者结构差异是微小的，即这些差别将不影响序列发挥本申请指出的功能的能力。具有与本文公开的序列有实质的序列同源性的序列通常是该公开序列的变体，例如突变体，但是也可以是合成的序列。
在大多数的情况下，与本文具体公开的序列有95％的同源性的序列将作为等价物发挥功能，并且在许多情况下，显著较低的同源性，例如75％或80％，也是可以接受的。定位这些序列中的非关键部分可能是耗时的，但是却是常规的，并且是本领域技术人员所掌握的。用于修饰多核苷酸序列的技术的实例包括使用寡核苷酸介导的定点诱变。参见Zoller等人(1984)；Higuchi等人(1988)；Ho等人(1989)；Horton等人(1989)和PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification，(编辑)Erlich(1989)。
在制备用于本发明的构建体时，可以操作多个DNA片段，以提供具有正确方向并且视情况而定于正确读码框中的DNA序列。可以使用连接物或者接头来连接这些DNA片段，或者可以通过其它操作以提供方便的限制性位点、移除多余的DNA、移除限制性位点等等。
在实施多个步骤时，可以通过克隆以扩增含有用于随后导入期望宿主细胞的目的启动子/基因的载体。可以获得大量的克隆载体，该克隆载体包括在大肠杆菌中有功能的复制系统，和供选择转化的细胞所用的标记。示例性载体包括pBR322、pUC系列、pACYC184、Bluescript系列(Stratagene)等等。因此，可以将序列在合适的限制性位点插入载体，获得的质粒用于转化大肠杆菌宿主(例如大肠杆菌菌株HB101、JM101和DH5α)，该大肠杆菌在合适的营养培养基上生长，以及收获和裂解细胞，并回收质粒。分析可以涉及序列分析、限制性分析、电泳或者等等。在每次操作之后，用于最终构建体的DNA序列可以被限制性酶切并连接到下一个序列上，其中每个部分构建体可以被克隆入相同或者不同的质粒。
可以获得或者可以容易地制备用于转化植物细胞的载体。一般地，质粒或者病毒载体应该含有对于在给定的宿主中维持和表达异源DNA序列两者所必需的所有DNA调控序列。这样的调控序列一般地包括引导序列和编码翻译起始信号密码子、翻译终止密码子的DNA序列，和编码调控信使RNA加工的3’UTR信号的DNA序列。根据本申请公开的教导，本领域普通技术人员将能够选择合适的元件以优化在任何特定的物种中的表达。最后，载体应该如所期望的含有能够提供表型特征的标记基因，其中该表型可以允许鉴定含有该载体的宿主细胞。
插入植物细胞的外源编码序列(例如，免疫保护剂或者蛋白质活性剂)的活性依赖于邻近该插入物的内源植物DNA的影响。一般地，使用任何的转化技术，异源基因的插入似乎是随机的，但是，目前存在用于将DNA定点重组入植物细胞的植物生产技术(参见，WO91/09957)。导致所需要的序列在启动子控制下表达的任何方法或者方法的组合都是可以接受的。
本申请提供的植物细胞培养物不受任何特定的用于转化植物细胞的方法的限制。将DNA导入植物细胞的技术是本领域技术人员熟知的。已经公开了四种用于将外源DNA递送入植物细胞的基本方法。化学方法(Graham和van der Eb，Virology，54(02)：536-539，1973；Zatloukal，Wagner，Cotten，Phillips，Plank，Steinlein，Curiel，Birnstiel，Ann.N.Y.Acad.Sci.，660：136-153，1992)；物理方法包括显微注射(Capecchi，Cell，22(2)：479-488，1980)、电穿孔(Wong和Neumann，Biochim.Biophys.Res.Commun.107(2)：584-587，1982；Fromm，Taylor，Walbot，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82(17)：5824-5828，1985；U.S.专利号5,384,253)和基因枪(Johnston和Tang，Methods Cell.Biol.，43(A)：353-365，1994；Fynan，Webster，Fuller，Haynes，Santoro，Robinson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(24)：11478-11482，1993)；病毒方法(Clapp，Clin.Perinatol.，20(1)：155-168，1993；Lu，Xiao，Clapp，Li，Broxmeyer，J.Exp.Med.178(6)：2089-2096，1993；Eglitis和Anderson，Biotechniques，6(7)：608-614，1988；Eglitis，Kantoff，Kohn，Karson，Moen，Lothrop，Blaese，Anderson，Avd.Exp.Med.Biol.，241：19-27，1988)和受体介导的方法(Curiel，Agarwal，Wagner，Cotten，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88(19)：8850-8854，1991；Curiel，Wagner，Cotten，Birnstiel，Agarwal，Li，Loechel，Hu，Hum.Gen.Ther.，3(2)：147-154，1992；Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89(13)：6099-6103，1992)。
将DNA通过电穿孔的方法导入植物细胞是本领域技术人员熟知的。使用植物细胞壁降解酶(例如果胶降解酶)，以提供比未处理的细胞对电穿孔转化更敏感的受体细胞。为了使用电穿孔有效转化，可以直接使用松散的组织例如细胞的悬浮培养物，或者胚发生愈伤组织、或者未成熟胚或者其它有组织的组织。通常，以控制的方式使用果胶降解酶或者机械损伤方法部分地降解靶植物材料的细胞壁是必要的。这样处理的植物材料容易通过电穿孔接受外源DNA。
另一种用于递送外源转化DNA到植物细胞的方法是通过微粒轰击。在这个方法中，微粒上包被外源DNA并通过推力而被递送入细胞中。这样的微粒典型地由钨、金、铂和相似的金属制成。微粒轰击的优势是不需要分离原生质体(Cristou等人，1988，Plant Physiol.，87：671-674，)也不需要对农杆菌感染具有易感性。通过加速作用将DNA递送入玉米细胞的方法的一个实例性实施方案是生物射弹粒子递送系统(Biolistics ParticleDelivery System)，通过其可以将包被有DNA或者细胞的微粒推过滤膜表面上方的屏，而在该滤膜表面上覆盖有悬浮培养的玉米细胞。该屏使微粒分散，从而使得其不以大的聚集物的形式递送到受体细胞。对于轰击，悬浮的细胞优选在滤膜或者固体培养基上浓缩。作为选择，可以将未成熟胚或者其它靶细胞安排在固体培养基上。将待被轰击的细胞放置在微粒停止板下方的合适距离处。在轰击转化中，可以优化轰击前培养条件和轰击参数，以产生最大数目的稳定转化体。在这个技术中，轰击的物理和生物学参数都是重要的。物理因素是涉及操作DNA/微粒沉淀的那些因素或者是影响微粒的飞行或速率的那些因素。生物学因素包括涉及在轰击前和紧接轰击后操作细胞的所有步骤，调整靶细胞的渗透性以帮助缓解与轰击相关的创伤，以及转化DNA的性质(例如线性化的DNA或者完整的超螺旋质粒)。
农杆菌介导的转移是用于将外源DNA导入植物细胞的广泛适用的系统，因为该DNA可以被导入完整的植物组织，从而不需要从原生质体再生完整的植物。使用农杆菌介导的植物整合载体将DNA导入植物细胞在本领域是熟知的。参见，例如在Fraley等人，1985，Biotechnology，3：629；Rogers等人，1987，Meth.in Enzymol.，153：253-277中公开的方法。另外，Ti-DNA的整合是几乎不导致重排的相对精确的方法。待转移的DNA的区域由边界序列确定，并且间插DNA通常被插入到植物基因组中，如Spielmann等人，1986，Mol.Gen.Genet.，205：34；Jorgensen等人，1987，Mol.Gen.Genet.，207：471所公开的。
现在的农杆菌转化载体能够在大肠杆菌以及农杆菌中复制，使得可以方便地操作。而且，最近在用于农杆菌介导的基因转移的载体上的技术进步，改良了基因和限制性位点在载体中的排列，从而有助于能够表达多种蛋白质或者多肽的载体的构建。侧翼为(用于指导插入的多肽编码基因表达的)启动子和多腺苷酸化位点的、方便的多接头区适用于本发明的目的。另外，含有带甲和卸甲Ti基因的农杆菌可以被用于转化。
通过基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔和这些处理的组合的方法可以实现植物原生质体的转化(参见，例如Potrykus等人，1985，Mol.Gen.Genet.，199：183；Marcotte等人，Nature，335：454，1988)。这些系统在不同的植物物种中的适用性取决于从原生质体再生该特定物种的能力。
对于本发明的实践，优选转化可以培养和迅速扩大的植物细胞系。使用植物细胞培养物避免了开场生产并且极大地降低了基因逃逸和食品污染的机会。优选例如NT-1和BY-2的烟草悬浮细胞培养物(Kato等人1972，Proc.IV IFS：Ferment.Technol.Today 689-695；An，G.，1985，PlantPhysiol.79，568-570；Nagata等人1992，International Review of Cytology132，1-30)，因为这些细胞系尤其易于接受培养操作，并且容易转化、产生稳定整合的事件，并且适于深低温保存。
烟草悬浮细胞系NT-1适用于本发明的实践。NT-1细胞最初开发自烟草栽培品种(Nicotiana tabacum L.cv.)Bright Yellow 2。NT-1细胞系广泛使用并且容易获得，但是，任何的烟草悬浮细胞系都可用于本发明的实践。而且，细胞系是可变的并将响应培养条件而改变。适合用于下述实施例的NT-1细胞可获得自美国典型培养物保藏中心，保藏号ATCC No.74840。也参见U.S.专利号6,140,075，通过引用的方式将其整体合并入本申请。
已经公开了许多植物细胞培养技术和系统，从实验室规模的摇瓶到几千升的生物反应器，并且它们是植物细胞培养领域所熟知的。例如参见Fischer，R.等人，1999 Biotechnol.Appl.Biochem.30，109-112和Doran，P.，2000 Current Opinions in Biotechnology 11，199-204。在将转化的植物细胞培养到所需要的质量后，收获植物细胞，温和的洗涤并放置于用于破裂细胞的合适的缓冲液中。许多不同的缓冲液适用于本发明。一般地，缓冲液是不含有可用于溶解膜的苛刻去污剂的、具有中性pH值或者接近中性pH值的水性等渗缓冲盐溶液。优选的缓冲液包括Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水和含有1mM EDTA的PBS。
在制备稳定转化的植物细胞系之后，通过证实基因插入物(遗传事件)，可以完成本发明的培养物，其中该证实可以使用PCR扩增整个基因插入物，并随后进行限制性酶消化而完成。然后根据9 CFR 113.26中列出的程序，评估主细胞系和工作细胞系的细菌和真菌污染。
主或者工作细胞最初可以在琼脂板上以愈伤组织的形式回收。随后可以将其转移到液体悬浮培养中。针对工作细胞和生产培养物的传代可以是1-50或者100次。
动物来源的成分不用于培养本发明的植物细胞培养物。用于琼脂板和悬浮培养的培养基基于普通的植物培养基(Murashige和Skoog；MS)，并且在本申请中详细公开。主细胞系储存在液氮的气相中。以这种方式维持的培养物可以无限期地储存，并且可以被用于在琼脂培养基上制备愈伤组织培养物。工作细胞系储存在液氮的气相中，并可以无限期地储存和用于制备愈伤组织培养物。
用作生产工作细胞或者疫苗的接种物的主细胞和工作细胞培养物可以通过在琼脂平板上周期循环愈伤组织而维持，或者可以以悬浮培养物形式进行培养。可以将冷冻的主细胞或者工作细胞融化并传至琼脂平板上，在25℃持续大约一至两周传代培养一或多次。然后挑开愈伤组织并用于接种液体悬浮培养基的摇瓶，以产生工作细胞或者生产培养物。用作生产培养物的接种物的工作细胞培养物在室温生长，其间持续搅拌，并在液体悬浮培养基中传代。取决于观察到的生长程度，大约每3-14天传代培养物一次，并且可以每次传代时以1∶3或1∶10分传。
为了从主细胞琼脂平板产生工作细胞系，选择健康的愈伤组织，无菌挑开并将挑开的部分放置入含有液体悬浮培养基的摇瓶中。也可以使用1∶3或1∶10的分传比，将工作细胞系从液体培养到液体培养进行传代，同时增加培养物的体积，直到在摇瓶中达到1升的体积。一至三升的摇瓶培养物可以作为接种物转移到十升的搅拌釜反应器中。生产培养物在具有100升工作体积的搅拌釜反应器中制备。100升的发酵罐可以以1∶10比例接种来自搅拌釜反应器或者多个摇瓶的培养物。在大于10升的搅拌釜反应器中的培养物在没有筛选试剂的液体悬浮培养基中生长。
针对工作细胞培养物，培养物在室温在持续搅拌的条件下生长3-14天。在大多数情况下，工作细胞培养物每7天以1∶10的分传比传代。在工作细胞按比例扩大期间，培养物以1∶10的分传比传代并且生长至少7天。在收获之前生产培养物生长7-15天。每天观察培养物的生长特性，定期无菌移出生产培养物的样品用于显微镜观察和确定收集细胞体积。在收获的时刻，基于目测评估，细胞的密度应该增加到收集细胞体积(PCV)的大约35％，并且应该含有至少50％的健康活细胞。细胞的显微镜检测应该显示细胞中可视的细胞核，但是其它细胞结构应观察不到。
通气可以基于培养物的氧需求而改变。溶解氧应该被控制在大约100％至20％之间。搅拌的速度可以基于氧需求而改变，但是不应超出500rpm。典型地，不必要控制pH。在接种后7至15天之间，可以通过重力或者真空过滤，使用常规的过滤介质，收获生产培养物。然后可以使用常规的蛋白质纯化方法，以分离药用的蛋白质物质。
本申请涉及或者引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物，以与本说明书的明确教导相一致的程度，通过引用的方式，整体地(包括所有的附图和表格)并入本申请。
下文是举例说明用于实施本发明的方法的实施例。这些实施例不应被解释为限制本发明。如无另行说明，所有的百分比是重量百分比，并且所有的溶剂混合物的比例是体积比。
实施例1：载体
基因构建：分析NDV株“Lasota”的HN基因(Genbank检索号AF077761)、AIV株ATurkey/wisconsin/68的HA基因，IBDV株E19的VP2基因(GenBank检索号X00493)和大肠杆菌的LT基因的编码序列的密码子使用，以及不希望的序列基序(所述基序能够介导假mRNA加工和不稳定性，或者基因组DNA的甲基化)的存在。参见Adang MJ，BrodyMS，Cardineau G，Eagan N，Roush RT，Shewmaker CK，Jones A，OakesJV，McBride KE(1993)，在原生质体和马铃薯植物中构建和表达苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因，Plant Mol Biol 21：1131-1145。设计植物优化的编码序列，该序列具有反映西红柿和马铃薯的密码子使用的杂合密码子偏好(Ausubel F.，等人编辑(1994)Current Protocols in Molecular Biology，vol.3，p.A.1C.3 Haq TA，Mason HS，Clements JD，Arntzen CJ(1995)使用在转基因植物中生产的重组细菌抗原口服免疫，Science 268：714-716)。针对HN设计的序列在图1中显示。合成的HN基因由商业供应商(Retrogen)组装，并且在两个分开的质粒中收到，这两个质粒各含有克隆入pCR-Blunt中的该基因的5’(p4187-4203-1)半部分或者3’(p42111-4235-1c-1)半部分。
质粒构建：用于农杆菌介导的植物转化的二元载体基于图2显示的pBBV-PHAS-iaaH载体进行构建，该图2所示载体使用植物选择标记膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)(公开在U.S.专利号5,879,903；5,637,489；5,276,268和5,273,894，其通过引用的方式合并入本申请)，并且该PAT由公开在WO 97/48819中的组成型木薯叶脉花叶病毒启动子(CsVMV)驱动。我们首先通过使用PacI消化pBBV-PHAS-iaaH而删除iaaH基因和菜豆蛋白启动子序列，并且重新连接以形成pCVMV-PAT。然后，我们通过使用Klenow酶填平的方式删除唯一的HindIII位点，并且重新连接以形成pCP！H。我们通过使用引物CVM-Asc(5′-AtggcGCgccagaaggtaattatccaag，SEQ IDNO：5)和CVM-Xho(5′-ATCTCGAGccatggtttggatcca，SEQ ID NO：6)在模板pCP！H上进行PCR而对CsVMV启动子进行末端剪裁，并且将产物克隆入EcoRV消化的、具T尾的pBluescriptKS，以制备pKS-CVM7。pCP！H的图谱在图3中显示。我们通过连接载体pKS-CVM7/NcoI-EcoRI和3个插入片段，即，在NcoI/PstI上的HN 5’半部分、PstI/KpnI上的HN3’半部分和KpnI-EcoRI(Haq 1995)上的大豆vspB 3’元件而构建HN表达盒pKS-CHN。然后通过连接载体pCP！H/AscI-EcoRI和pKS-CHN的AscI-EcoRI片段而组装二元T-DNA载体pCHN。pCHN的图谱在图4中显示。
我们使用U.S.专利号5,824,798(通过引用的方式合并入本申请)中描述的颗粒结合性淀粉合酶(GBSS)启动子制备其它的载体。使用扩增自马铃薯栽培品种(Solanum tuberosum L.cv.)“Desiree”的基因组DNA的启动子片段制备这些构建体，该扩增使用自Genbank检索号X83220中的序列针对中国马铃薯栽培品种“Dongnong”设计的引物。使用诱变引物“GSS-Nco”(5’-[tgccatgGtgatgtgtggtctacaa]SEQ ID NO：7)，和在-1800bp互补于5’区的正向引物“GSS-1.8F”(5’-[gatctgacaagtcaagaaaattg]SEQ IDNO：8)，产生与翻译起始密码子重叠的Nco I位点；将该1825bp PCR产物克隆入T尾pBluescriptKS，以制备pKS-GBN并测序。使用诱变引物“GSS-Xho”(5’-[agctcGAGCTGTGTGAGTGAGTG]SEQ ID NO：9)，和引物“GSS-1.8F”，产生恰好位于转录起始位点3’的XhoI位点；该1550bpPCR产物克隆入T尾pBluescriptKS，以制备pKS-GBX并测序。
通过连接由HindIII/XhoI消化的载体pTH210与pKS-GBX的HindIII/XhoI片段以组装含有TEV 5’UTR(非翻译区，在U.S.专利号5,891,665中公开，通过引用的方式合并入本申请)的GBSS启动子表达盒，其可以实现811bp GBSS启动子对CaMV 35S启动子的替代，以制备pTH252A。参见Haq TA，Mason HS，Clements JD，Arntzen CJ(1995)，使用在转基因植物中生产的重组细菌抗原口服免疫，Science 268：714-716。通过连接NcoI/PstI中的HN 5’半部分和PstI/KpnI中的HN 3’半部分而将HN基因插入到pTH252A/NcoI-KpnI，以制备pHN252A。通过连接由NsiI和EcoRI消化的载体pGLTB(图11显示)和片段pHN252A/NsiI-KpnI和pTH210/KpnI-EcoRI而制备二元T-DNA载体pgHN。pgHN图谱在图5中显示。
通过连接由HindIII/NcoI消化的载体pTH210(Haq 1995)与pKS-GBN的HindIII/NcoI片段而组装含有GBSS 5’UTR(在U.S.专利号5,824,798中公开，通过引用的方式合并入本申请)和其内含子的GBSS启动子表达盒，其可以实现使用1084bp GBSS启动子/5’-UTR对(花椰菜花叶病毒)CaMV 35S启动子/TEV 5’UTR的替代，以制备pTH251A。通过连接载体pCLT105(图12显示)和片段pTH251A/HindIII-NcoI和pHN252A/NcoI-KpnI而制备二元T-DNA载体pgHN151。 pgHN151的图谱在图6中显示。
构建含有GBSS 5’UTR和其内含子和菜豆的菜豆蛋白3’元件(在U.S.专利号5,270,200；6,184,437；6,320,101中公开，通过引用的方式合并入本申请)的GBSS启动子表达盒。首先，在单一的KpnI位点消化pCP！H，使用T4 DNA聚合酶平端化，并重新连接以制备pCP！HK，其中的KpnI位点被去除。使用NsiI消化pCP！HK，并且使用T4 DNA聚合酶平端化，然后再使用PacI消化。获得的载体与SacI消化pgHN151产生的2848bp片段连接，然后使用T4 DNA聚合酶平端化，再使用PacI消化，以制备pgHN153。pgHN153图谱在图7中显示。
使用嵌合组成型启动子(4OCSΔMAS U.S.专利号5,001,060；5,573,932和5,290,924，通过引用的方式合并入本申请)构建另一个HN的表达载体。质粒pAGM149使用EcoRV消化并使用BamHI部分消化。此片段与使用PmeI/PstI消化的pCHN和通过使用BamHI/PstI消化pKS-CHN而获得的合成HN基因的5’半部分连接。获得的pMHN显示在图8中。
含有AIV A/Turkey/wisconsin/68(H5N9)的HA基因的质粒从DavidSuarez(SEPRL，Athens，GA)获得(图10)。通过PCR对其末端进行剪裁，以在5′加入限制性位点NcoI和在3′加入限制性位点KpnI，并插入到含有35S启动子、TEV 5′-UTR和vspB 3′末端的载体pIBT210.1(Haq等人，1995)中。通过使用HindIII和EcoRI(不完全)消化而将表达盒转移到二元载体pGPTV-Kan(Becker等人，Plant Mol Biol 1992；20：1195-7)，以制备pIBT-HAO。通过使用NcoI和EcoRI(不完全)消化而获得来自pIBT-HAO的HA基因/vspB3′末端片段，并插入pKS-CVM7以制备pKS-CHA。使用AscI和EcoRI(不完全)消化，从pKS-CHA获得含有CsVMV启动子，HA基因和vspB3′末端的表达盒，并与pCP！H连接以制备pCHA，显示在图9中。
本领域已知编码大肠杆菌菌株H10407的LT-B基因的植物优化的序列(Mason HS，Haq TA，Clements JD，Arntzen CJ，1998，Vaccine16：1336-1343)。编码大肠杆菌菌株H10407的LT-A基因的植物优化的序列在WO/00/37609中公开，WO/00/37609最初以U.S.临时申请60/113,507提出，其整体通过引用的方式合并入本申请。WO/00/37609公开了三个二元T-DNA载体(pSLT102，pSLT105、pSLT107)的构建，这些载体在实施例2中用于烟草(Nicotiana tabacum)NT-1细胞的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的植物细胞转化。获得的转化的NT-1细胞系(SLT102、SLT105和SLT107)表达和累积完整组装的LT和LT类似物(其由LT-B和LT-A亚基的修饰形式组成)。图12显示pSLT107，其含有由Arg72替代Ala72的修饰的LT-A基因。除了在LT-A基因中含有不同的改变(在pSLT102中Ser63改变为Lys63；在pSLT105中Arg192改变为Gly192)，SLT102和SLT105表达产物相同。这些细胞系含有未确定拷贝数的稳定整合入核染色体DNA的质粒T-DNA区。如通过神经节苷脂依赖的ELISA确定的，转基因NT1细胞以高达总可溶性蛋白质0.4％的水平积累LT-B亚基，该亚基组装为结合神经节苷脂的五聚体。转基因NT1细胞也积累修饰的LT-A亚基，其中的一些与LT-B五聚体组装，如通过使用LT-A特异性抗体的神经节苷脂依赖性ELISA所确定的。
由基础二元载体(pBBV)构建了用于农杆菌介导的植物细胞转化的二元载体，该pBBV载体在唯一的BamHI位点经修饰而具有用于添加VP2和选择标记表达盒的AgeI接头。VP2的侧翼是RB7 MAR元件(U.S.专利号5,773,689；U.S.专利5,773,695；U.S.专利号6,239,328，WO 94/07902和WO 97/27207)和CsVMV启动子，以及根癌农杆菌(Atu)ORF24(GenBank检索号X00493)3’UTR。选择标记PAT由拟南芥(Arabidopsisthaliana)(At)泛素10启动子(Plant J.1997.11(5)：1017；Plant Mol.Biol.1993.21(5)：895；Genetics，1995，139(2)：921)和Atu ORF1(U.S.专利号5428147；Plant Molecular Biology.1983.2：335；GenBank检索号X00493)3’UTR调控；获得的质粒pDAB2423在图13中显示。
基于报道的VP2氨基酸序列(GenBank检索号AB024076)，以及来自UK661株的氨基酸#454-456(GenBank检索号NC_004178)，使用传染性法氏囊病(IBD)病毒超强毒株Ehime 91(J Vet Med Sci.1992.54(1)：153；JVI.2002.76(11)：5637)产生VP2的植物优化的核苷酸序列。VP2的序列参见图14。
实施例2：制备转基因烟草
在转化前的3至4天，通过添加2ml的NT-1培养物到40ml的NT-1培养基中，将1周龄的NT-1培养物亚培养在新鲜的培养基中。将亚培养物在25±1℃，暗处以100rpm在摇床中维持。
NT-1培养基
试剂 每升
MS盐 4.3g
MES贮存液(20X) 50ml
B1肌醇贮存液(100X) 10ml
Miller’s I贮存液 3ml
2，4-D(1mg/ml) 2.21ml
蔗糖 30g
pH调整为5.7±0.03
B1肌醇贮存液(100x)(1升)
盐酸硫胺素(Vit B1)-0.1g
MES(20x)(1升)
MES(2-N-吗啉乙磺酸)-10g
肌醇-10g
Miller′s I(1升)
KH2PO4-60g
MS基础盐  每1升去离子水
改良的MS维生素(100X)肌醇无水磷酸氢二钾MES2，4-D(10mg/ml)蔗糖L-脯氨酸 10ml100mg137.4g0.5g222μl30g
改良的MS维生素 每升去离子水
烟酸 5mg/L
盐酸吡哆醇 50mg/L
盐酸硫胺素 200mg/L
甘氨酸 200mg/L
    2.5M L-脯氨酸贮存液
    M.W＝115.1g/L
    制备100ml的2.5M贮存液
    115.1/10＝11.51X2.5＝28.775g/100ml
将含有目的表达载体的根癌农杆菌从甘油贮存培养物划线到含有50mg/l壮观霉素的LB培养基平板上。将细菌培养物在暗处30℃孵育24至48小时。选择一个形态良好的菌落并转移到3ml含有50mg/L壮观霉素的YM培养基中。液体培养物在暗处，30℃，250rpm的振荡培养器中孵育，直到OD600达到0.5-0.6。这大约需要24hr。
LB培养基
试剂 每升
细菌用胰蛋白胨 10g
酵母提取物 5g
NaCl 10g
Difco细菌用琼脂 15g
YM培养基
试剂 每升
酵母提取物 400mg
甘露糖醇 10g
NaCl 100mg
MgSO4·7H20 200mg
KH2PO4 500mg
(备选的，可以购买粉末形式的YM(Gibco BRL；目录号#10090-011)。为了制备液体培养基，将11.1g加入到1升水中)。
在转化当天，将1μl的20mM乙酰丁香酮添加入每毫升的NT-1培养基中。在转化当天制备乙酰丁香酮的乙醇贮存液。使NT-1细胞受创伤以提高转化效率。对于产生创伤，将悬浮培养物上下抽吸重复通过5ml的无菌宽口移液管(20次)。转移4毫升的悬浮液分别到10个每个为60x15mm的Petri皿。留出一个皿作为未转化的对照。大约50至100μl农杆菌悬浮液分别加入到剩余的9个皿中。用parafilm将皿包好，然后在暗处，25±1℃，100rpm的摇床上孵育3天。
将细胞转移到无菌的50ml圆锥离心管中，并加入NTC培养基(含有高压灭菌之后加入的500mg/L羧苄青霉素的NT-1培养基)使终体积为45ml。混合然后在配备有吊桶式转头的离心机上1000rpm离心10分钟。去除上清，并将获得的沉淀重悬浮于45ml的NTC中。重复洗涤。离心悬浮液，弃掉上清，并将沉淀重悬浮于40ml的NTC中。将5ml的等分试样铺于每个含有NTCB10培养基(使用8g/l琼脂/琼脂固化的NTC培养基，补加10mg/l双丙氨膦(bialaphos)，高压灭菌后加入)的Petri皿(150x15mm)上。使用parafilm将皿包好，然后在暗处，25±1℃存放。在转移到培养室之前，将皿敞口放置于层流罩超净台中，以使得过多的液体蒸发。在6至8周之后，出现推定的转化体。选择并将其转移到新鲜的NTCB5(使用8g/l琼脂/琼脂固化的NTC培养基，补加5mg/l双丙氨膦，高压灭菌后加入)。使用parafilm将皿包好，然后在暗处，25±1℃培养。
在死亡的未转化细胞的背景上，推定的转化体以愈伤组织小簇的形式出现。将这些愈伤组织转移到NTCB5培养基中，并使其生长几周。选择每个推定的转化体的一部分用于ELISA分析。通过至少2轮ELISA之后，选择具有最高抗原水平的细胞系。然后在平板培养基以及偶尔在液体培养基中扩增每个原种系的愈伤组织材料的量。
实施例3：植物制备的蛋白质的稳定性
由于蛋白酶、糖基化酶、脂酶或者与蛋白质和细胞组分共同纯化的其它酶，从重组或者天然来源提取的蛋白质经常是不稳定的。但从NT-1细胞分离的蛋白质和免疫保护性颗粒本身是稳定的并且对许多不同类型的下游加工活动具耐受性。在图14中，从10升发酵罐中收获处于稳定期的CHN-18细胞，过滤，通过离心澄清并且被微流体化(microfluidized)。然后通过0.2或0.45微米的滤膜过滤上清以除去任何可能在经过过滤或者微流体化(microfluidization)的操作期间引入的细菌性成分。不向这些悬浮液中添加稳定剂，稳定性是衍生自这些转基因细胞的蛋白质所固有的。然后将材料储存在2-7℃，25℃或者冻存在-80℃；发现材料在所有的温度都是稳定的，但是最有意义的结果是当维持在25℃(环境温度)时，发现分离的蛋白质是稳定的(图14显示)。尽管在月和月之间观察到信号差异，但是在数月之后分离的蛋白质的量显示出显著的稳定性，从这些数据可以计算出的半衰期显示出：对于0.45微米的样品，外推的半衰期为8个月，而对于0.2微米过滤的样品，半衰期大于一至几年。
应该理解的是，本申请公开的实施例和实施方案仅仅用于举例说明目的，并且根据本中请的实施例和实施方案，多种修饰或者改变是本领域技术人员明了的并且将包括在本申请的精神和范围内以及所附的权利要求的范围内。另外，本申请公开的任何发明或者其实施方案的任何要素或者限定可以与任何和/或所有的其它要素或者限定(单独地或者以本申请公开的任何组合方式)进行组合，或者与任何其它的发明或者其实施方案进行组合，并且所有这些组合均包含在本发明的范围内而不对本发明的范围构成限制。
实施例4：培养基配方
下述是用于在琼脂上和在液体悬浮液中培养天然NT-1细胞和重组NT-1细胞的培养基配方。另外，也给出了用于深低温保存NT-1、重组NT-1细胞的培养基配方。
培养基制备
A.成分
除非另行指出，使用可信赖的供应商提供如下原料化学药品
琼脂 碘化钾
硝酸铵 硝酸钾
硼酸，粉末 磷酸氢二钾，3＊H2O
无水氯化钙 无水磷酸氢二钾
氯化钴，6＊H2O 磷酸二氢钾
硫酸铜(II)，5＊H2O L-脯氨酸
二甲基亚砜(DMSO) 盐酸吡哆醇
EDTA，二钠，2＊H2O RO/DI水
甘氨酸 氯化钠
肌醇 钼酸钠，2＊H2O
硫酸铁(II)，7＊H2O 无水磷酸氢二钠
无水硫酸镁 蔗糖
硫酸锰，1＊H2O 盐酸硫胺素
MES，1＊H2O 硫酸锌，7＊H2O
Murashige和Skoog盐混合物(MS盐) Bialaphos，PhytoTechnology实验室，D-309
烟酸 2，4-D，10mg/ml soln.，PhytoTechnology实验室，B131
氯化钾
B.配方
1.10X Batch salts
a.成分      量/升
硝酸铵 16.5g
硼酸，粉末 62.0mg
氯化钴，6＊H2O 0.25mg
硫酸铜(II)5＊H2O 0.25mg
EDTA，二钠，2＊H2O 372.6mg
硫酸铁(II)7＊H2O 278.0mg
硫酸锰1＊H2O 169.0mg
钼酸钠，2＊H2O 2.5mg
碘化钾 8.3mg
硝酸钾 19.0g
磷酸二氢钾 1.7g
硫酸锌，7＊H2O 86.0mg
无水硫酸镁 1.807g
无水氯化钙 3.322g
盐酸硫胺素 10.0mg
肌醇 1.0g
MES，1＊H2O 5.0g
RO/DI水 1000ml
b.制备
i.将750ml RO/DI水添加到合适容器中。
ii.将容器放置在加热搅拌台上并使用搅拌棒混合。可能必需加热水以溶解所有的组分。
iii.将所有的组分加入水中。
iv.在最后的组分溶解之后，将体积定容到1000ml。
v.通过0.2μ滤膜对溶液过滤除菌。
vi.贮存在室温并标记1年的有效期。
B.2.双丙氨膦(5mg/mL)
a.成分   量/50mL
    双丙氨膦     250.0mg
    RO/DI水     50ml
b.制备
i.将50ml RO/DI水添加到合适容器中。
ii.将容器放置在搅拌台上并使用搅拌棒混合。
iii.将双丙氨膦加入水中并混合直到溶解。
iv.通过0.2μ滤膜过滤除菌。
v.冷冻贮存并标记1年的有效期。
B.3.100X改良的MS维生素
a.成分     量/升
    烟酸     5.0mg
    盐酸吡哆醇     50.0ml
    盐酸硫胺素     50.0mg
    甘氨酸     200.0mg
    RO/DI水     1000ml
b.制备
i.将500ml RO/DI水添加到合适容器中。
ii.将容器放置在搅拌台上并使用搅拌棒混合。
iii.将所有的组分加入水中。
iv.在最后的组分溶解之后，将体积定容到1000ml。
v.通过0.2μ滤膜过滤除菌。
vi.贮存在2℃-10℃并标记1年的有效期。
B.4.L-脯氨酸(2.5M)
a.成分     量/100mL
    L-脯氨酸     28.775g
    RO/DI水     100ml
b.制备
i.将50ml RO/DI水添加到合适容器中。
ii.将容器放置在搅拌台上并使用搅拌棒混合。
iii.将L-脯氨酸加入水中。
iv.当L-脯氨酸溶解之后，将体积定容到100ml。
v.贮存在2℃-10℃并标记3月的有效期。
B.5.NT-1琼脂板
a.成分             量/升
    磷酸氢二钾，3＊H2O     180.0mg
    蔗糖     30.0g
    10X Batch salts     100ml
    2，4-D(10mg/ml)     0.11ml
    琼脂     8.0g
    RO/DI水     1000ml
b.制备
i.将500ml RO/DI水添加到合适容器中。
ii.将容器放置在热搅拌台上并使用搅拌棒混合。
iii.除了琼脂，将所有的组分加入水中。
iv.在最后的组分溶解之后，将体积定容到1000ml。
v.将琼脂添加到溶液中并加热，直到琼脂完全溶解。
vi.当溶液仍然热时，通过0.2μ滤膜对溶液过滤除菌。
vii.使培养基冷却，直到接近室温。
viii.向每个15cm2无菌Petri皿加入大约25mL的琼脂，并允许每个平板完全冷却。
ix.将平板倒置贮存在2℃-10℃并标记3月的有效期。
B.6.NT-1液体培养基
a.成分            量/升
    磷酸氢二钾，3＊H2O     180.0g
    蔗糖     30.0g
    10X Batch salts     100ml
    2，4-D(10mg/ml)     0.11ml
    RO/DI水     1000ml
b.制备
i.将500mLRO/DI水添加到合适容器中。
ii.将容器放置在搅拌台上并使用搅拌棒混合。
iii.将所有的组分加入水中。
iv.在最后的组分溶解之后，将体积定容到1000mL。
v.分配成750ml的等分试样，并且在≥121℃高压灭菌30分钟。
vi.贮存在2℃-10℃并标记1年的有效期。
B.7.NT1VP培养基
a. 成分          量/升
Murashige和Skoog盐混合物 4.33g
100X改良的MS维生素 10.0mL
2，4-D(10mg/mL) 222μL
L-脯氨酸(2.5M) 2.4mL
无水磷酸氢二钾 137.4g
MES 500.0mg
肌醇 100.0mg
蔗糖 30.0g
RO/DI水 1000mL
b.制备
i.将500ml RO/DI水添加到合适容器中。
ii.将容器放置在搅拌台上并使用搅拌棒混合。
iii.将所有的组分加入水中。
iv.在最后的组分溶解之后，将体积定容到1000mL。
v.分配为500ml的等分试样，并在≥121℃高压灭菌30分钟。
vi.贮存在2℃-10℃并标记1年的有效期。
B.8.深低温保存培养基
a.成分          量
    NT1VP培养基     226.64ml
    甘油     46.06g
    蔗糖     342.27g
    DMSO     35.5mL
b.制备
i.将甘油添加到合适容器中。
ii.将容器放置在热搅拌台上并使用搅拌棒混合。
iii.将NT1VP培养基加入容器。
iv.在低热混合并缓慢添加蔗糖直到溶解。
v.添加DMSO。
vi.通过0.2μ滤膜过滤除菌。
vii.在2℃-10℃贮存培养基并标记1年的有效期。
实施例5
对植物细胞生长培养基和悬浮培养物是否支持支原体生长进行评估
本申请公开的重组烟草衍生的植物细胞系CHN-18 NT-1和生长培养基不支持支原体的生长。本研究的目的是确定NT-1生长培养基或者NT-1和CHN-18 NT-1悬浮培养物是否可以支持两个支原体物种(猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)和莱氏无胆甾原体(Acholeplasma laidlawii))的生长。
该方法遵循9 CFR 113.28。在支原体接种之前，在测试的第0天，将供试材料放置于支原体琼脂上，以证明在供试材料中缺乏支原体的存在。在测试的第0天，并未将使用支原体阳性对照物接种的供试材料放置于支原体琼脂上。在第3、7、10和14天将支原体接种的供试材料在支原体琼脂上传代培养。在测试的第一天，阳性对照通过使用支原体阳性对照物接种支原体培养液和琼脂而制备。通过使用支原体培养液接种支原体培养液和琼脂而制备阴性对照。在第3、7、10和14天将阳性和阴性对照在支原体琼脂上传代培养。在接种后10-14天，检测所有的支原体琼脂板上的典型的支原体集落。
供试材料是NT-1植物细胞生长培养基和CHN-18植物细胞生长培养基以及NT-1和CHN-18植物悬浮细胞培养物。在植物悬浮培养物活跃生长时(即，3至4天龄培养物)，使用支原体接种植物悬浮培养物。
NT-1生长培养基不支持支原体的生长(表1)。自使用支原体阳性对照生物体接种的NT-1生长培养基传代培养的任何支原体琼脂板，其上没有观察到支原体集落。在支原体阳性对照物加入之前放置于琼脂板上的NT-1培养基，也没有显示出支原体生长。阳性对照在支原体培养液中混浊生长，并且在所有的支原体琼脂板上观察到支原体集落。阴性对照在支原体培养液中没有生长，并且在任何的支原体琼脂板上没有支原体集落。
Figure A20068005046700351
TNTC：太多以致于不能计数，每板＞100个集落
ND：没有做，在第0天检测没有支原体阳性对照生物体的NT-1培养基，没有支原体集落
NT-1细胞悬浮培养物不支持支原体的生长(表2)。自使用支原体阳性对照生物体接种的NT-1细胞悬浮培养物传代培养的任何支原体琼脂板，其上没有观察到支原体集落。在支原体阳性对照加入之前放置于琼脂板上的NT-1细胞悬浮培养物也没有显示出支原体生长。阳性对照在支原体培养液中混浊生长，并且在所有的支原体琼脂板上观察到支原体集落。阴性对照在支原体培养液中没有生长，并且在任何的支原体琼脂板上没有支原体集落。
Figure A20068005046700361
TNTC：太多以致于不能计数，每板＞100个集落
ND：没有做，在第0天检测没有支原体阳性对照生物体的NT-1细胞悬浮培养物，并且没有支原体集落
CHN-18生长培养基和细胞悬浮培养物不支持支原体的生长(表3)。自使用支原体阳性对照生物体接种的CHN-18生长培养基或者细胞悬浮培养物传代培养的任何支原体琼脂板，在其上没有观察到支原体集落。在支原体阳性对照物加入之前放置于琼脂板上的CHN-18培养基或者CHN-18细胞悬浮培养物，没有观察到支原体生长。阳性对照在支原体培养液中混浊生长，并且在所有的支原体琼脂板上观察到支原体集落。阴性对照在支原体培养液中没有生长，并且在任何的支原体琼脂板上没有支原体集落。
Figure A20068005046700371
TNTC：太多以致于不能计数，每板＞100个集落
ND：没有做，在第0天检测没有支原体阳性对照生物体的CHN-18生长培养基和细胞悬浮培养物，并且没有支原体集落
支原体没有在用于NT-1细胞生产的NT-1生长培养基中生长，也没有在CHN-18生长培养基中生长。而且，NT-1悬浮培养物和CHN-18细胞悬浮培养物都不能支持支原体的生长。这些数据证明NT-1和CHN-18生长培养基，以及NT-1和CHN-18细胞培养物都不能支持支原体的生长。
序列表
<110>Mihaliak，Charles A.
Fanton，Matthew J.
McMillen，Janis K.
<120>使用重组植物悬浮培养物制备疫苗主细胞系
<130>DAS-130X
<150>US 60/733,702
<151>2005-11-04
<160>13
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1753
<212>DNA
<213>新城疫病毒
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1753)
<223>参见图1a和1b
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1753)
<223>新城疫病毒(NDV)株“Lasota”的血凝素/神经氨酸酶(HN)基因的植物优化的编码序列
<400>1
atggacagag cagtttcaca agtggcccta gagaatgatg agagggaagc caagaatacc  60
tggaggctta tattcagaat agccatctta ttccttactg tggtcaccct agcaatctct  120
gttgcatccc tcctctattc tatgggagca agcaccccct cagacttggt gggcataccc  180
acaagaatct ctagggcaga agaaaaaatc accagtaccc ttggctccaa ccaagatgtt  240
gtggacagaa tctacaaaca ggtggcactt gaaagtccac ttgcattact caacacagag  300
actaccatca tgaatgcaat taccagccta tcctatcaaa ttaatggggc tgccaacaat  360
tcaggttggg gagccccaat tcatgatcca gactatattg gaggtattgg caaagagctt    420
attgtagatg atgcttcaga tgttacatct ttctatcctt cagctttcca ggaacacctg    480
aatttcattc ctgcacccac aactgggagt gggtgcacta gaataccctc atttgacatg    540
agtgctacac actactgcta cacacataat gttattctct ctggctgtag ggaccactct    600
cactcttatc aatacttagc tcttggagtt ctcagaacat ctgctactgg tagagtcttt    660
ttctcaactc ttaggagtat caacctagat gatacacaaa ataggaaaag ttgctctgta    720
tctgctacac ctttgggctg tgatatgcta tgcagtaaag taacagaaac tgaagaagag    780
gactataatt ctgctgtccc tacaaggatg gtgcatggca gattgggttt tgatggtcaa    840
tatcatgaaa aagatttgga tgtcactaca ttgtttgggg attgggtagc taattaccca    900
ggagttggag gtggtagctt cattgactcc agagtctggt tctctgtcta tggtggttta    960
aaacctaaca gtcctagtga tactgtgcaa gagggaaagt atgttatcta caagaggtat    1020
aatgatactt gtcctgatga acaggattac cagattagga tggctaagtc atcatacaaa    1080
ccaggaagat ttggaggtaa gaggatacaa caagctattt tgagtattaa ggttagcaca    1140
tcattgggag aggacccagt ccttactgtt ccaccaaaca ctgtaacact catgggagct    1200
gagggaagga ttttaactgt tggtactagc cattttcttt atcagagagg aagttcctat    1260
tttagcccag cattactgta tccaatgact gtgagcaaca agacagctac attacattca    1320
ccatatactt ttaatgcttt tacaagacct ggatcaattc cttgccaggc ttcagctaga    1380
tgtccaaatt catgtgtgac tggagtttac actgatcctt accctttgat attttacaga    1440
aatcatacct tgagaggggt ttttggaaca atgttggatg gtgttcaagc taggctcaat    1500
cctgcctctg ctgtttttga ttctacatca agatcaagaa taaccagggt ttcctctagt    1560
tccactaagg cagcatatac tacctccaca tgtttcaaag ttgtaaagac taacaaaact    1620
tattgtctga gcatagctga gatctctaac actctttttg gggagttcag aattgttcca    1680
cttttggtgg aaattctgaa ggatgatggt gtaagggaag caagatctgg ttaagtcttc    1740
aggtaccgag ctc                1753
<210>2
<211>577
<212>PRT
<213>新城疫病毒
<220>
<221>misc_feature
<223>参见图1a和1b
<220>
<221>misc_feature
<223>新城疫病毒(NDV)株“Lasota”的血凝素/神经氨酸酶(HN)基因的植物优化的蛋白质序列
<400>2
Met Asp Arg Ala Val Ser Gln Val Ala Leu Glu Asn Asp Glu Arg Glu
1               5                   10                  15
Ala Lys Asn Thr Trp Arg Leu Ile Phe Arg Ile Ala Ile Leu Phe Leu
             20                 25                  30
Thr Val Val Thr Leu Ala Ile Ser Val Ala Ser Leu Leu Tyr Ser Met
        35                  40                  45
Gly Ala Ser Thr Pro Ser Asp Leu Val Gly Ile Pro Thr Arg Ile Ser
    50                  55                  60
Arg Ala Glu Glu Lys Ile Thr Ser Thr Leu Gly Ser Asn Gln Asp Val
65                  70                  75                  80
Val Asp Arg Ile Tyr Lys Gln Val Ala Leu Glu Ser Pro Leu Ala Leu
                85                  90                  95
Leu Asn Thr Glu Thr Thr Ile Met Asn Ala Ile Thr Ser Leu Ser Tyr
            100                 105                 110
Gln Ile Asn Gly Ala Ala Asn Asn Ser Gly Trp Gly Ala Pro Ile His
        115                 120                 125
Asp Pro Asp Tyr Ile Gly Gly Ile Gly Lys Glu Leu Ile Val Asp Asp
    130                 135                 140
Ala Ser Asp Val Thr Ser Phe Tyr Pro Ser Ala Phe Gln Glu His Leu
145                 150                 155                 160
Asn Phe Ile Pro Ala Pro Thr Thr Gly Ser Gly Cys Thr Arg Ile Pro
                165                 170                 175
Ser Phe Asp Met Ser Ala Thr His Tyr Cys Tyr Thr His Asn Val Ile
            180                 185                 190
Leu Ser Gly Cys Arg Asp His Ser His Ser Tyr Gln Tyr Leu Ala Leu
        195                 200                 205
Gly Val Leu Arg Thr Ser Ala Thr Gly Arg Val Phe Phe Ser Thr Leu
    210                 215                 220
Arg Ser Ile Asn Leu Asp Asp Thr Gln Asn Arg Lys Ser Cys Ser Val
225                 230                 235                 240
Ser Ala Thr Pro Leu Gly Cys Asp Met Leu Cys Ser Lys Val Thr Glu
                245                 250                 255
Thr Glu Glu Glu Asp Tyr Asn Ser Ala Val Pro Thr Arg Met Val His
            260                 265                 270
Gly Arg Leu Gly Phe Asp Gly Gln Tyr His Glu Lys Asp Leu Asp Val
        275                 280                 285
Thr Thr Leu Phe Gly Asp Trp Val Ala Asn Tyr Pro Gly Val Gly Gly
    290                 295                 300
Gly Ser Phe Ile Asp Ser Arg Val Trp Phe Ser Val Tyr Gly Gly Leu
305                 310                 315                 320
Lys Pro Asn Ser Pro Ser Asp Thr Val Gln Glu Gly Lys Tyr Val Ile
                325                 330                 335
Tyr Lys Arg Tyr Asn Asp Thr Cys Pro Asp Glu Gln Asp Tyr Gln Ile
            340                 345                 350
Arg Met Ala Lys Ser Ser Tyr Lys Pro Gly Arg Phe Gly Gly Lys Arg
        355                 360                 365
Ile Gln Gln Ala Ile Leu Ser Ile Lys Val Ser Thr Ser Leu Gly Glu
    370                 375                 380
Asp Pro Val Leu Thr Val Pro Pro Ash Thr Val Thr Leu Met Gly Ala
385                 390                 395                 400
Glu Gly Arg Ile Leu Thr Val Gly Thr Ser His Phe Leu Tyr Gln Arg
                405                 410                 415
Gly Ser Ser Tyr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Tyr Pro Met Thr Val Ser
            420                 425                 430
Asn Lys Thr Ala Thr Leu His Ser Pro Tyr Thr Phe Asn Ala Phe Thr
        435                 440                 445
Arg Pro Gly Ser Ile Pro Cys Gln Ala Ser Ala Arg Cys Pro Asn Ser
    450                 455                 460
Cys Val Thr Gly Val Tyr Thr Asp Pro Tyr Pro Leu Ile Phe Tyr Arg
465                 470                 475                 480
Asn His Thr Leu Arg Gly Val Phe Gly Thr Met Leu Asp Gly Val Gln
                485                 490                 495
Ala Arg Leu Asn Pro Ala Ser Ala Val Phe Asp Ser Thr Ser Arg Ser
            500                 505                 510
Arg Ile Thr Arg Val Ser Ser Ser Ser Thr Lys Ala Ala Tyr Thr Thr
        515                 520                 525
Ser Thr Cys Phe Lys Val Val Lys Thr Asn Lys Thr Tyr Cys Leu Ser
    530                 535                 540
Ile Ala Glu Ile Ser Asn Thr Leu Phe Gly Glu Phe Arg Ile Val Pro
545                 550                 555                 560
Leu Leu Val Glu Ile Leu Lys Asp Asp Gly Val Arg Glu Ala Arg Ser
                565                 570                 575
Gly
<210>3
<211>1647
<212>DNA
<213>禽流感病毒
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1647)
<223>参见图10
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1647)
<223>禽流感病毒(AIV)A/Turkey/wisconsin/68(H5N9)的血凝素(HA)基因的DNA序列.
<400>3
gaccaaatct gcatcggtta tcatgcaaac aattcaacaa aacaagttga cacaatcatg  60
gagaagaatg tgacggtcac acatgctcaa gatatactgg aaaaagagca caacgggaaa  120
ctctgcagtc tcaaaggagt gaggcccctc attctgaagg attgcagtgt ggctggatgg  180
cttcttggga acccaatgtg tgatgagttc ctaaatgtac cggaatggtc atatattgta  240
gagaaggaca atccaaccaa tggcttatgt tatccgggag acttcaatga ttatgaagaa  300
ctgaagtatt taatgagcaa cacaaaccat tttgagaaaa ttcaaataat ccctaggaac  360
tcttggtcca atcatgatgc ctcatcagga gtgagctcag catgcccata caatggtagg  420
tcttcctttt tcaggagtgt ggtgtggttg atcaagaaga gtaatgtata cccaacaata  480
aagaggacct acaataacac caatgtagag gaccttctga tattgtgggg aatccatcac  540
cctaatgatg cagcggaaca aacggaactc tatcagaact cgaacactta tgtgtctgta  600
ggaacatcaa cactaaatca gaggtcaatt ccagaaatag ctaccaggcc caaagtgaat  660
ggacaaagtg gaagaataga atttttctgg acaatactaa ggccgaacga tgcaatcagc  720
tttgaaagta atgggaactt tatagctcct gaatatgcat acaagatagt taaaaaggga  780
gattcagcaa tcatgagaag cgaactggag tatggcaact gtgataccaa atgtcagacc  840
ccagtgggtg ctataaattc cagtatgcct tttcacaatg ttcatcccct taccattgga  900
gagtgtccca aatatgtcaa atcagataaa ctggtccttg caacaggact gaggaacgtg  960
cctcagagag aaacaagagg tctgtttgga gcaatagcag gattcataga aggggggtgg  1020
caaggaatgg tagatggatg gtatggttac catcatagca acgagcaggg aagtggatat  1080
gctgcagaca aagagtccac tcagaaagca atcgacggga tcaccaataa agtcaactca  1140
atcattgaca aaatgaacac tcaattcgaa gccgttggga aagaattcaa caacttagaa  1200
aggagaatag aaaatttgaa taagaaaatg gaagatggat ttctagatgt atggacttac  1260
aatgcagaac ttctggtgct catggaaaat gaaagaactc tggatttcca tgattcatat  1320
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ggaacgtatg actatccaca atactcagaa gaatcaaggc tgaacagaga ggaaatagat  1500
ggagtcaaat tggagtcaat gggcacctat cagatactat caatttactc aacagtggcg  1560
agttccctag cactggcaat catggtagct ggtctgtctt tttggatgtg ctccaatgga  1620
tcattgcaat gcagaatttg catctag                                      1647
<210>4
<211>548
<212>PRT
<213>禽流感病毒
<220>
<221>misc_feature
<223>参见图10.
<220>
<221>misc_feature
<223>禽流感病毒(AIV)A/Turkey/wisconsin/68(H5N9)的血凝素(HA)基因的蛋白质序列.
<400>4
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Lys Gln Val
1               5                   10                  15
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
            20                  25                  30
Leu Glu Lys Glu His Asn Gly Lys Leu Cys Ser Leu Lys Gly Val Arg
        35                  40                  45
Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
    50                  55                  60
Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
65                  70                  75                  80
Glu Lys Asp Asn Pro Thr Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn
                85                  90                  95
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys Tyr Leu Met Ser Asn Thr Asn His Phe Glu
            100                 105                 110
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Arg Asn Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser
        115                 120                 125
Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Asn Gly Arg Ser Ser Phe Phe
    130                 135                 140
Arg Ser Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Ser Asn Val Tyr Pro Thr Ile
145                 150                 155                 160
Lys Arg Thr Tyr Asn Asn Thr Asn Val Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp
                165                 170                 175
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Glu Leu Tyr Gln
            180                 185                 190
Asn Ser Asn Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
        195                 200                 205
Ser Ile Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
    210                 215                 220
Arg Ile Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Arg Pro Asn Asp Ala Ile Ser
225                 230                 235                 240
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
                245                 250                 255
Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Arg Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
            260                 265                 270
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        275                 280                 285
Met Pro Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
    290                 295                 300
Tyr Val Lys Ser Asp Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val
305                 310                 315                 320
Pro Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile
                325                 330                 335
Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His
            340                 345                 350
Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln
        355                 360                 365
Lys Ala Ile Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys
    370                 375                 380
Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn Leu Glu
385                 390                 395                 400
Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp
                405                 410                 415
Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg
            420                 425                 430
Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Tyr Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val
        435                 440                 445
Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Leu
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465                 470                 475                 480
Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ser Arg Leu Asn Arg
                485                 490                 495
Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Thr Tyr Gln Ile
            500                 505                 510
Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met
        515                 520                 525
Val Ala Gly Leu Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys
    530                 535                 540
Arg Ile Cys Ile
545
<210>5
<211>28
<212>DNA
<213>合成序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(28)
<223>用于末端剪裁pCP！H上的组成型木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子的PCR引物，CVM-Asc
<400>5
atggcgcgcc agaaggtaat tatccaag    28
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>合成序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(24)
<223>用于末端剪裁pCP！H上的木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子的PCR引物，CVM-Xho
<400>6
atctcgagcc atggtttgga tcca                     24
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>合成序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(25)
<223>用于产生Nco I位点的诱变引物
<400>7
tgccatggtg atgtgtggtc tacaa                     25
<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>合成序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(23)
<223>互补于5’区的正向引物
<400>8
gatctgacaa gtcaagaaaa ttg        23
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>合成序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(23)
<223>用于产生XhoI I位点的诱变引物
<400>9
agctcgagct gtgtgagtga gtg        23
<210>10
<211>1368
<212>DNA
<213>传染性法氏囊病病毒
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1368)
<223>参见图14.
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1368)
<223>传染性法氏囊病病毒VP2基因的DNA序列.
<400>10
atgaccaacc tccaagatca aactcaacag attgttccct tcatacgcag ccttctcatg    60
ccaaccactg gacctgcttc cattcctgat gacaccttgg agaagcacac tctccgctct    120
gagacctcaa cctacaactt gactgttggt gacactggct ctgggttgat tgtctttttc    180
cctgggttcc ctggctccat tgtgggtgct cactacacat tgcagtccaa tggcaactac    240
aagtttgatc aaatgctctt gactgcccag aatcttccag cctcctacaa ctattgccgt    300
cttgtgtctc gctccctcac agtgaggtcc tcaacactcc ctggtggagt gtatgcactc    360
aatggcacca tcaacgcagt gactttccaa ggaagccttt cagaattgac tgatgtgagc    420
tacaatgggt tgatgtctgc aacagccaac atcaatgaca agattgggaa tgtccttgtt    480
ggagaaggag tcaccgtcct ctcactccca acatcctatg atcttggcta tgtgagactt    540
ggtgatccca ttcctgccat aggacttgat cccaaaatgg ttgccacatg tgacagctct    600
gatcgtccaa gggtttacac catcacagca gctgatgact accaattctc ctcacagtac    660
caagctggtg gagtcaccat cacactcttc tcagccaaca tagatgccat cacaagcctc    720
agcattggtg gagaacttgt ctttcagaca tctgtccaag ggctcatcct tggtgccacc    780
atctacttga ttggctttga tggcactgct gtcatcacca gagcagtggc tgcagacaat    840
gggctcacag ctggcactga caacctcatg ccattcaaca ttgtgattcc cacctctgag    900
atcacccagc caatcacttc catcaagttg gagatagtga cctcaaagtc cggtggacaa    960
gctggtgatc agatgtcctg gtctgcatct gggagcttgg ctgtgaccat tcatggtggc    1020
aactaccccg gagccctcag acctgtgact ttggttgcct atgaacgcgt tgcaactggc    1080
tctgttgtca ctgttgctgg tgtcagcaac tttgagttga tcccaaatcc tgaacttgca    1140
aagaacttgg tcacagagta tggaaggttt gaccctggtg ccatgaacta cacaaaattg    1200
atcctctcag agagggacag acttggcatc aagactgttt ggccaaccag agagtacact    1260
gacttccgcg agtacttcat ggaggttgct gacctcaaca gccctctcaa gatagctgga    1320
gcctttggtt tcaaagacat cataagggct attcgtcgca tcgctgtt                 1368
<210>11
<211>1425
<212>DNA
<213>传染性法氏囊病病毒
<220>
<221>misc_feature
<223>编码E/91 VP2(传染性法氏囊病病毒的结构蛋白质)变体的多核苷酸(DNA)
<400>11
agatctgaag acaacatgac caacctccaa gatcaaactc aacagattgt tcccttcata  60
cgcagccttc tcatgccaac cactggacct gcttccattc ctgatgacac cttggagaag  120
cacactctcc gctctgagac ctcaacctac aacttgactg ttggtgacac tggctctggg  180
ttgattgtct ttttccctgg gttccctggc tccattgtgg gtgctcacta cacattgcag  240
tccaatggca actacaagtt tgatcaaatg ctcttgactg cccagaatct tccagcctcc  300
tacaactatt gccgtcttgt gtctcgctcc ctcacagtga ggtcctcaac actccctggt  360
ggagtgtatg cactcaatgg caccatcaac gcagtgactt tccaaggaag cctttcagaa  420
ttgactgatg tgagctacaa tgggttgatg tctgcaacag ccaacatcaa tgacaagatt  480
gggaatgtcc ttgttggaga aggagtcacc gtcctctcac tcccaacatc ctatgatctt  540
ggctatgtga gacttggtga tcccattcct gccataggac ttgatcccaa aatggttgcc  600
acatgtgaca gctctgatcg tccaagggtt tacaccatca cagcagctga tgactaccaa  660
ttctcctcac agtaccaagc tggtggagtc accatcacac tcttctcagc caacatagat  720
gccatcacaa gcctcagcat tggtggagaa cttgtctttc agacatctgt ccaagggctc  780
atccttggtg ccaccatcta cttgattggc tttgatggca ctgctgtcat caccagagca  840
gtggctgcag acaatgggct cacagctggc actgacaacc tcatgccatt caacattgtg  900
attcccacct ctgagatcac ccagccaatc acttccatca agttggagat agtgacctca  960
aagtccggtg gacaagctgg tgatcagatg tcctggtctg catctgggag cttggctgtg  1020
accattcatg gtggcaacta ccccggagcc ctcagacctg tgactttggt tgcctatgaa  1080
cgcgttgcaa ctggctctgt tgtcactgtt gctggtgtca gcaactttga gttgatccca  1140
aatcctgaac ttgcaaagaa cttggtcaca gagtatggaa ggtttgaccc tggtgccatg  1200
aactacacaa aattgatcct ctcagagagg gacagacttg gcatcaagac tgtttggcca  1260
accagagagt acactgactt ccgcgagtac ttcatggagg ttgctgacct caacagccct  1320
ctcaagatag ctggagcctt tggtttcaaa gacatcataa gggctattcg tcgcatcgct  1380
gtttgagtag ttagcttaat cacctagagc tcggtcacca gatct                  1425
<210>12
<211>456
<212>PRT
<213>传染性法氏囊病病毒
<220>
<221>misc_feature
<223>由SEQ ID NO：11编码的E/91 VP2(传染性法氏囊病病毒的结构蛋白质)的多肽变异
<400>12
Met Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr
            20                  25                  30
Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr
        35                  40                  45
Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro
    50                  55                  60
Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Ser Asn Gly Asn Tyr
65                  70                  75                  80
Lys Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr
                85                  90                  95
Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr
            100                 105                 110
Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr
        115                 120                 125
Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu
    130                 135                 140
Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val
145                 150                 155                 160
Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly
                165                 170                 175
Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys
            180                 185                 190
Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile
        195                 200                 205
Thr Ala Ala Asp Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Ala Gly Gly
    210                 215                 220
Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu
225                 230                 235                 240
Ser Ile Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val Gln Gly Leu Ile
                245                 250                 255
Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Ala Val Ile
            260                 265                 270
Thr Arg Ala Val Ala Ala Asp Asn Gly Leu Thr Ala Gly Thr Asp Asn
        275                 280                 285
Leu Met Pro Phe Asn Ile Val Ile Pro Thr Ser Glu Ile Thr Gln Pro
    290                 295                 300
Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln
305                 310                 315                 320
Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala Val Thr
                325                 330                 335
Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val
            340                 345                 350
Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val
        355                 360                 365
Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Val
    370                 375                 380
Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu
385                 390                 395              400
Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr
                405             410                 415
Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu
            420             425                 430
Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile
        435             440             445
Arg Ala Ile Arg Arg Ile Ala Val
    450             455
<210>13
<211>42
<212>DNA
<213>传染性法氏囊病病毒
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(42)
<223>编码翻译终止(“终止”)密码子的DNA序列，该序列用于终止在转化过程中DNA整合后无意发生的开放阅读框翻译(包括Sac I，BstE II和Bgl II限制性酶识别位点)
<400>13
tgagtagtta gcttaatcac ctagagctcg gtcaccagat ct     42

Claims (11)

1、用于生产蛋白质活性剂的植物细胞培养物，包括：
a)经稳定转化以表达编码蛋白质活性剂的转基因的植物细胞系；
b)生长培养基，其支持所述植物细胞培养物的生长但是不支持支原体科生物生长，并且不含有动物来源的材料；
其中所述植物细胞系能够连续传代以致可以在传代期间维持一致的转基因表达，并且其中所述的植物细胞系能够被深低温保存以致一旦从深低温保存中恢复后可以恢复一致的转基因表达。
2、权利要求1的植物细胞培养物，其中该转化的植物细胞系是低等植物细胞系、双子叶植物细胞系或者单子叶植物细胞系。
3、权利要求2的植物细胞培养物，其中该转化的植物细胞系是双子叶植物细胞系。
4、权利要求3的植物细胞培养物，其中所述转化的植物细胞系是烟草细胞系。
5、权利要求4的植物细胞培养物，其中所述烟草细胞系选自NT-1或BY-2。
6、权利要求3的植物细胞培养物，其中所述双子叶植物的转化的细胞系衍生自选自西红柿、马铃薯、甘薯、木薯、包括苜蓿和大豆的豆科植物、胡萝卜、草莓、莴苣、栎、槭树、胡桃、玫瑰、薄荷、向日葵、红花、棉、烟草、南瓜、雏菊、Canola或者仙人掌的植物。
7、权利要求2的植物细胞培养物，其中所述单子叶植物的转化的细胞系衍生自选自小麦、草，草坪草、谷物、玉米或玉蜀黍、稻、燕麦、小麦、大麦、高粱、兰、鸢尾、百合、洋葱、香蕉、甘蔗、高粱和棕榈的植物。
8、权利要求2的植物细胞培养物，其中所述转化的低等植物细胞系衍生自羊齿植物、裸子植物、针叶树、木贼类植物、石松类、苔类植物、角苔类植物、苔藓类、红藻类、褐藻类、蕨类植物的配子体、孢子体或者绿藻类。
9、根据在前权利要求中任一项的植物细胞培养物，其中该蛋白质活性剂是来自禽病毒的蛋白质。
10、根据权利要求9的植物细胞培养物，其中该蛋白质是来自新城疫病毒(NDV)的血凝素/神经氨酸酶蛋白、来自禽流感病毒(AIV)的血凝素蛋白或者来自传染性法氏囊病病毒的VP2蛋白。
11、权利要求9的植物细胞培养物，其中所述蛋白质包括SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：12。
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