CN101331237A - 用于核酸测试的对照 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及如下检测试样中的目标生物分子的方法:向试样、阴性对照样品、阳性对照样品和试剂对照样品加入内部对照生物分子,或向试样、阴性对照样品、包含目标生物分子的阳性对照样品加入内部对照生物分子,并提供含目标生物分子的试剂对照样品,测定每个样品中的信号,并验证信号,由此检测目标生物分子。本发明还涉及验证指示存在目标生物分子的信号测定结果的方法。本发明还涉及检测样品中是否存在目标核酸群成员的方法,以及验证指示存在目标核酸群成员的信号检测结果的方法。还考虑了用途和试剂盒。
Description
发明领域
本发明涉及如下检测试样中的目标生物分子的方法:向试样、阴性对照样品、阳性对照样品和试剂对照样品加入内部对照(internalcontrol)生物分子,或向试样、阴性对照样品、包含目标生物分子的阳性对照样品加入内部对照生物分子,提供含目标生物分子的试剂对照样品,测定每个样品中的信号,并验证该信号,由此检测目标生物分子。本发明还涉及验证指示存在目标生物分子之信号的测定结果的方法。本发明还涉及检测样品中是否存在目标核酸群成员的方法,以及验证指示存在目标核酸群成员之信号的测定结果的方法。还考虑了用途和试剂盒。
发明背景
核酸测定已成为分析化学中的重要工具,尤其是在卫生保健中。例如,感染性疾病和遗传状态可基于得自个体的样品中指示所述疾病或状态的核酸的存在情况或量容易地确定。为此,建立了使用核酸、优选寡核苷酸与指示该疾病或遗传状态的目标核酸的序列特异性杂交的方法。许多目标核酸在生物体中以如此低浓度存在,以至于不可能在来源于该生物体的样品中直接检测。这些目标需要在检测前扩增。适宜的扩增方法为例如LCR(美国专利第5,185,243、5,679,524和5,573,907号;EP 0 320 308;WO 90/01069;WO 89/12696;和WO89/09835)、循环探针技术(美国专利第5,011,769、5,403,711、5,660,988和4,876,187号,以及PCT公布申请WO 95/05480、WO 95/14106和WO 95/00667)、InvaderTM技术(美国专利第5,846,717、5,614,402、5,719,028、5,541,311和5,843,669号)、Q-β复制酶技术(美国专利第4,786,600号)、NASBA(美国专利第5,409,818号;EP-0 329 822)、TMA(美国专利第5,399,491、5,888,779、5,705,365、5,710,029号)、SDA(美国专利第5,455,166和5,130,238号)和PCR(US-A-4,683,202)。
为了使核酸测定中的假阳性结果最小化,几个国家的管理机构要求使用对照核酸。尤其是在使用扩增方法时,这样的对照核酸非常重要,因为扩增过程可受到反应条件的强烈影响,可产生令人误解的结果。有时在样品中包含抑制性物质,可产生假阴性结果。有关对照构思的综述由Valentine-Thon,E.,J.Clinical Virol.25(2002)S13-S21提供。
一般来说,人们可区分外部对照(external control)和内部对照。外部对照如经典的阳性对照和阴性对照,模拟阳性和阴性样品,一般用于检查测定是否正确运行或者是否包含污染物。内部对照例如可用于识别样品中可能包含的抑制性物质,或者可以用作定量测定中的定量标准。与一般在单独的反应室中测试的外部对照相反,内部对照优选与待测分析物一起在同一反应室中温育。因此,对照或该对照的扩增产物必须能与分析物或该分析物的扩增产物区分开来。在使用扩增方法时,内部对照核酸基本上将在与目标核酸相同的反应条件下被共同扩增。这些条件包括试剂浓度、温度、抑制剂浓度或酶活性。经常使用的对照序列来源于管家基因(参见Chelly,J.等,Eur.J.Biochem.187(1990)691-698;Mallet,F.等,J.Clin.Microbiol.33(1995)3201-3208),但也可使用非天然序列(参见例如EP 1236805)。
来源于内部对照的扩增核酸可通过它们的不同长度或与不同探针的杂交能力而和来源于目标核酸的扩增核酸区分开来(有关综述参见:Clementi,M.等,PCR Methods Applic.2(1993)191-196;Clementi,M.等,Arch.Virol.140(1995)1523-1539)。在所有情况下,内部对照的核苷酸序列与目标核酸序列部分不同或完全不同(另参见Haentjens-Herwegh,S.等,Recent Res.Devel.Microbiology 4(2000)547-556)。
在扩增反应中其中一个最关键的方面就是引物与目标核酸的结合。因此,使用与目标核酸具有相同引物结合位点的内部对照(参见例如Gilliland,G.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)2725-2729)。
WO 02/18635和WO 99/06594公开了模拟包入病毒衣壳中之核酸的壳体化内部对照序列的应用。
EP 1 319 716公开了用几种可辨别的内部对照核酸来测试核酸分离和扩增。
WO 2004/055205公开了向经历样品制备的样品加入内部对照序列。然后,将来自该IC(内部对照)的信号与未经历样品制备的外部对照比较,以便验证细胞裂解和样品制备的效率以及核酸扩增和/或检测的性能。
US 6,277,560公开了使用外源微生物的DNA作为定量的外部标准以及使用内部对照评价核酸扩增的效率。
Gilliland,G.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)2725-2729公开了应用阴性对照和内部对照进行定量。
Brakenhoff,R.等,Clin.Cancer Res.5(1999)725-732公开了采用用于RNA质量控制的内部标准、用于灵敏度控制的外部标准和阴性对照的PCR测定。WO 2005/061737公开了采用内部对照、阳性对照和阴性对照的试剂盒。
Leushner和Kelly,Qiagennews,第4期,2000,21页公开了通过使用内部对照和阳性对照的多重PCR检测病原性肠细菌的方法。
由Roche,Mannheim,Germany制造的“LightCyclerfoodproof大肠杆菌O157检测试剂盒”在其说明书中公开了使用内部对照和对照模板定量检测大肠杆菌血清型O157的PCR方法。
US2003/077622涉及在信号扩增反应中提供阳性对照以鉴别抑制的方法和组合物。
由Roche Molecular Systems,Branchburg,NJ,USA制造的“用于沙眼衣原体的CT/NG测试”在其手册中公开了使用内部对照和沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)目标DNA来检测沙眼衣原体的PCR方法。
由TaKaRa,Japan制造的CycleavePCRTM肉类菌种(meat species)鉴定试剂盒的手册公开了区分不同肉类菌种的方法,该方法包含对照构思。
发明概述
本发明的目标是提供生物分子检测用的对照方法(controllingmethods)的新构思。
在本发明的实施方案中,提供用于检测在怀疑含有目标生物分子的样品中是否存在目标生物分子的方法,其包括以下步骤:
a)其中该步骤由步骤a1)或a2)组成
a1)将内部对照生物分子加至
-怀疑含有目标生物分子的样品,
-不含目标生物分子的阴性对照样品,
-含有目标生物分子的阳性对照样品,和
-含有目标生物分子的试剂对照样品,
a2)将内部对照生物分子加至
-怀疑含有目标生物分子的样品,
-不含目标生物分子的阴性对照样品,和
-含有目标生物分子的阳性对照样品,
并提供含有目标生物分子的试剂对照样品,
b)任选地由步骤a)的样品纯化所述生物分子,以获得包含所纯化的生物分子的样品,
c)测定在步骤a)或b)中获得的每种样品中是否存在内部对照生物分子信号和目标生物分子信号,
d)如下验证在怀疑含有目标生物分子的样品中目标生物分子信号的存在与否:
-独立于内部对照生物分子信号的存在情况检查怀疑含有目标生物分子之样品的目标生物分子信号存在情况,或在没有目标生物分子信号存在的情况下检查内部对照生物分子信号的存在情况,
-检查阴性对照样品是否存在内部对照生物分子信号和是否不存在目标生物分子信号,
-检查阳性对照样品是否存在目标生物分子信号和是否存在内部对照生物分子信号,和
-检查试剂对照样品在本方法步骤d)中是否存在目标生物分子信号,或检查试剂对照样品是否存在目标生物分子信号以及任选地检查是否存在内部对照生物分子信号,
e)检测目标生物分子的存在与否,由此在步骤c)中测定并在步骤d)中验证的目标生物分子信号和内部对照生物分子信号的存在与否表明了试样中目标生物分子的存在与否。
在本发明的另一个实施方案中,用于验证表明存在目标生物分子的信号测定结果的方法包括以下步骤:
a)提供
-含有内部对照生物分子并怀疑含有目标生物分子的样品,和
-含有内部对照生物分子但不含目标生物分子的阴性对照样品,和
-含有目标生物分子并含有内部对照生物分子的阳性对照样品,
-含有目标生物分子并任选地含有内部对照生物分子的试剂对照样品,
b)测定每个样品中的内部对照生物分子信号和目标生物分子信号,
c)如下验证试样中指示试样中存在目标生物分子的目标生物分子信号的存在情况:
-独立于内部对照生物分子信号的存在情况检查怀疑含有目标生物分子之样品的目标生物分子信号存在情况,或在没有目标生物分子信号的情况下检查内部对照生物分子信号的存在情况,
-检查阴性对照样品是否存在内部对照生物分子信号和是否不存在目标生物分子信号,
-检查阳性对照样品是否存在目标生物分子信号和是否存在内部对照生物分子信号,和
-检查试剂对照样品是否存在目标生物分子信号和任选地检查是否存在内部对照生物分子信号。
在本发明的又一个实施方案中,用于检测在怀疑含有目标核酸群(group of target nucleic acids)成员的样品中目标核酸群成员(或目标核酸)的存在与否的方法如下:
a)将内部对照核酸加至
-怀疑含有目标核酸群成员(或目标核酸)的样品,和
-不含目标核酸群成员(或目标核酸)的阴性对照样品,和
-含有目标核酸群成员(或目标核酸)的阳性对照样品,
b)提供含有目标核酸群并任选地含有内部对照核酸的试剂对照样品,
c)任选地由步骤a)和/或b)的样品纯化所述核酸,以获得包含所纯化的核酸的样品,
d)测定在步骤a)和b)或步骤b)和c)中获得的每个样品中的内部对照核酸信号和目标核酸群成员(或目标核酸)信号的存在与否,
e)如下验证在怀疑含有目标核酸群成员(或目标核酸)的样品中目标核酸群成员(或目标核酸)信号的存在与否:
-独立于内部对照核酸信号的存在情况检查怀疑含有目标核酸群成员(或目标核酸)之样品的目标核酸群成员(或目标核酸)信号存在情况,或在没有目标核酸群成员(或目标核酸)信号的情况下检查内部对照核酸信号的存在情况,
-检查阴性对照样品是否存在内部对照核酸信号和是否不存在目标核酸信号,
-检查试剂对照样品是否存在每个目标核酸群成员(或目标核酸)信号和任选地检查是否存在内部对照核酸信号,和
-检查阳性对照样品是否存在目标核酸群成员(或目标核酸)信号和是否存在内部对照核酸信号,或
f)检测目标核酸群成员(或目标核酸)是否存在,由此在步骤d)中测定并在步骤e)中验证的目标核酸群成员(或目标核酸)信号和内部对照核酸信号的存在和/或不存在,表明了怀疑含有目标核酸群成员(或目标核酸)的样品中目标核酸群成员(或目标核酸)的存在或不存在。
在整个申请中,术语目标核酸群成员或目标核酸群的目标核酸或选自目标核酸群的目标核酸可互换使用。
在本发明的又一个实施方案中,提供验证指示存在目标核酸群成员的信号测定结果的方法,其包括以下步骤:
a)提供
-含有内部对照核酸并怀疑含有目标核酸群成员的样品,
-含有目标核酸群并任选地含有内部对照核酸的试剂对照样品,
-不含目标核酸群成员但含有内部对照核酸的阴性对照样品,和
-含有目标核酸群成员并含有内部对照核酸的阳性对照样品,
b)测定每个样品中的内部对照核酸信号和目标核酸群成员信号,
c)如下验证怀疑含有目标核酸群成员的样品中目标核酸群成员信号的存在情况:
-独立于内部对照核酸信号的存在情况检查怀疑含有目标核酸群成员之样品的目标核酸成员信号存在情况,或在没有目标核酸群成员信号的情况下检查内部对照核酸信号的存在情况,
-检查试剂对照样品是否存在每种目标核酸群成员信号,
-检查阴性对照样品是否不存在目标核酸群成员信号和是否存在内部对照核酸信号,和
-检查阳性对照样品是否存在目标生物分子信号和是否存在内部对照核酸信号。
在本发明的另一个实施方案中,使用任选地含有内部对照生物分子的试剂对照样品和含有内部对照生物分子的阳性对照样品(两种样品均含有目标生物分子),检测在怀疑含有目标生物分子的样品中目标生物分子是否存在,或验证指示存在目标生物分子之信号的测定结果。
在另一个优选实施方案中,提供用于检测目标核酸或目标核酸群成员的试剂盒,其含有:
a)含有目标核酸或目标核酸群成员的试剂对照样品,
b)不含目标核酸或目标核酸群成员的阴性对照样品,
c)含有目标核酸或目标核酸群成员的阳性对照样品,
d)内部对照核酸,和
e)用于检测目标核酸或目标核酸群成员的试剂。
正如本领域所知,“核苷”是碱基-糖组合。核苷的碱基部分一般是杂环碱基。这些杂环碱基的两个最常见类型是嘌呤和嘧啶,更详细地说是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)碱基。尿嘧啶碱基天然包含在核糖核酸中。另一个天然碱基是5-甲基-胞嘧啶或甲基-胞嘧啶,其为在碱基芳环的5-位被甲基取代的胞嘧啶。
“核苷酸”为还包含与核苷的糖部分共价连接的磷酸酯基团的“核苷”。对于那些包含呋喃戊糖基糖的“核苷”,磷酸酯基团可与该糖的2′、3′或5′羟基部分连接。“核苷酸”是“寡核苷酸”的“单体单元”,更一般地在本文被称为“寡聚化合物”或“多核苷酸”,更一般地称为“多聚化合物”。其另一种一般表述是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
“核酸”是本领域技术人员已知的“核苷酸”的多聚化合物。其在本文用于表示要分析的样品中的“核酸”,即要测定其在样品中存在、不存在或量的核酸。因此,换句话说,“核酸”是目标,因此也可称为“目标核酸”。例如,如果必须测定血液是否含有人免疫缺陷病毒,则“目标核酸”是所测定的人免疫缺陷病毒的核酸,或者更具体地说是核酸序列,即碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶的顺序。更具体地说,在本发明范围内,“目标核酸”优选为如本文进一步指明的微生物、细胞或病毒(“目标微生物”、“目标细胞”或“目标病毒”)中包含的核酸,或者更精确地说或更优选为该核酸的一部分。“目标核酸”具有对该微生物、细胞或病毒特异性的核酸序列,为在该微生物、细胞或病毒中所含(总)核酸的一部分。
按照本发明,“寡聚化合物”是由“单体单元”组成的化合物,“单体单元”可为单独的“核苷酸”或“非天然化合物”,更具体地说为单独的“修饰型核苷酸”(或“核苷酸类似物”)或“非核苷酸化合物”或其组合。“寡核苷酸”和“修饰型寡核苷酸”(或“寡核苷酸类似物”)在本发明范围内为“寡聚化合物”的亚组。
在本发明范围内,术语“寡核苷酸”指由多个作为“单体单元”的“核苷酸”形成的“多核苷酸”,即“寡核苷酸”属于具有“单体单元”的核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的“寡聚化合物”或“多聚化合物”的特定亚组。磷酸酯基团通常被称为形成“寡核苷酸”的核苷间主链。RNA和DNA的正常键合或主链为3′至5′磷酸二酯键。
本发明的“寡核苷酸”和“修饰型寡核苷酸”可大体上如本领域所述和本领域技术人员所知来合成。用于制备特定序列的寡聚化合物的方法是本领域已知的,包括例如适宜序列的克隆和限制以及直接化学合成。化学合成方法可包括例如Narang,S.A.等,Methods Enzymol.68(1979)90-98所述的磷酸三酯法、Brown,E.L.等,Methods Enzymol.68(1979)109-151公开的磷酸二酯法、Beaucage,S.L.和Caruthers,M.H.,Tetrahedron Lett.22(1981)1859-1862中公开的亚磷酰胺法、在Garegg,P.J.等,Chem.Scr.25(1985)280-282中公开的H-膦酸酯法以及在US4,458,066中公开的固体支持体法。
如上所述,“核酸”以及“目标核酸”是本领域技术人员已知的“核苷酸”的多聚化合物。其在本文用于表示要分析的样品中的“核酸”,即要测定其在样品中存在、不存在或量的核酸。
本文使用的术语“引物”是本领域技术人员已知的,指“寡聚化合物”,其主要指“寡核苷酸”,但也可以指“修饰型寡核苷酸”,其能够通过模板依赖性DNA聚合酶“引发”DNA合成,即例如寡核苷酸的3′末端提供游离的3′-OH基,模板依赖性DNA聚合酶可在该游离的3′-OH基连接上其它的“核苷酸”,建立3′至5′磷酸二酯键,由此使用脱氧核苷酸三磷酸酯并由此释放焦磷酸。因此,除了预期的功能以外,在本发明的“引物”、“寡核苷酸”或“探针”之间没有根本的差异。
术语“探针”指合成或经生物学方法生产的核酸(DNA或RNA),此核酸通过设计或选择而包含特定的核苷酸序列,所述核苷酸序列允许所述核酸在限定的预定严格性下特异性地(即优先地)与“目标核酸”杂交。“探针”可被鉴别为“捕获探针”,意指其“捕获”目标核酸,使得其可与可能模糊其检测结果的不想要的物质分离。一完成分离,就可使用适宜的程序实现所捕获的“目标核酸”的检测。“捕获探针”经常已经连接至固相。因此,其具体实例为微阵列情况,其中大量“捕获探针”连接至“固相”,它们可“捕获”标记的cRNA或cDNA。
“标记”经常被称为“报告基团”,其一般为使本发明的核酸、尤其是“寡聚化合物”或“修饰型寡核苷酸”以及与其结合的任何核酸可与液体(即样品)的余下部分区分开来的基团(已连接“标记”的核酸还可以被称为标记的核酸结合化合物、标记探针或仅称为探针)。其中,“半抗原”(例如生物素或地高辛配基)、酶(例如碱性磷酸酶或过氧化物酶)或荧光染料(例如荧光素或罗丹明)大体上已被证实适合作为非放射性指示剂分子,或者换句话说适合作为非放射性“标记”。这些“信号基团”或“标记”可通过多种方法连接至核酸或掺入到核酸中。优选的本发明“标记”为例如荧光素染料、罗丹明染料、花菁染料和香豆素染料的染料,或者为例如生物素的半抗原。根据一般性定义,“半抗原”是自身不是免疫原(可引起免疫应答)但具有至少一个抗原元件并可与抗体或另一个较大载体分子结合而变成免疫原性的小分子。
本文使用的“荧光共振能量转移关系”和类似的术语指用“供体荧光标记”标记的“寡聚化合物”和另一种用“受体荧光标记”标记的“寡聚化合物”与“目标核酸”的邻近杂交,使得“供体荧光标记”可将共振能量转移至“受体荧光标记”,从而使“受体荧光标记”产生可检测的荧光发射。如果“供体荧光标记”和“受体荧光标记”间隔太大的距离,则“供体荧光标记”不能将共振能量转移至“受体荧光标记”,以至于“受体荧光标记”不能发射可检测的荧光,因此“供体荧光标记”和“受体荧光标记”没有共振能量转移关系。
在本发明范围内,“杂交”应指互补核苷酸之间形成氢键,其可为Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键。例如,腺嘌呤和胸腺嘧啶是互补核碱基(nucleobase),其通过形成氢键而配对。本文使用的“互补”也指两个核苷酸之间的序列互补性。例如,如果在寡核苷酸某些位置的核苷酸能够与DNA或RNA分子的相同位置上的核苷酸形成氢键,则该寡核苷酸和所述DNA或RNA被认为是在该位置彼此互补。如果每个分子中有足够数目的对应位置被彼此可形成氢键的核苷酸占据,则该寡核苷酸和所述DNA或RNA彼此互补。因此,“可特异性杂交的”和“互补的”是用于表示足够的互补程度以至于在寡核苷酸和DNA或RNA目标之间产生稳定且特异性的结合的术语。要理解的是,寡核苷酸与其可特异性杂交的目标DNA序列不必100%互补。如果寡核苷酸与目标DNA或RNA分子的结合干扰目标DNA或RNA的正常功能,并且存在足够程度的互补性以避免寡核苷酸与非目标序列在需要特异性结合的条件下(即就体内测定或治疗性治疗而言在生理条件下,或就体外测定而言在其中进行测定的条件下)非特异性结合,则该寡核苷酸是可特异性杂交的。
术语“生物分子”指可存在于生物样品中的任何分子。这些分子优选为肽、蛋白、糖如寡糖、脂质、类固醇、前列腺素、前列腺环素和核酸(包括DNA和RNA)。术语“生物样品”指得自微生物、病毒和多细胞生物(如植物、动物和人,尤其是患有疾病的人类患者)的任何固体或液体样品。实例是生物液体,例如血液、血浆、血清、尿、胆汁、脑脊髓液或任何机体分泌物。“生物样品”还可为得自器官或组织的样品,优选为活检品,并包括细胞。术语“目标生物分子”应表示要分析的样品中的“生物分子”,是(分析的)目标,即要测定其在样品中的存在、不存在或量。例如,如果必须确定血液是否含有人免疫缺陷病毒,则“目标生物分子”可为人免疫缺陷病毒的生物分子,或者更具体地说为该病毒的蛋白,其可在免疫学测试中由抗体识别,并具有对所述病毒特异性的氨基酸序列。
复数缩写“spp.”用于指一个属内的所有个体物种,例如山茱萸属(Cornus spp.)指山茱萸属中的所有植物。种是分类学鉴别的基本类目,排在属之下和亚种之上,亚种是其个体具有彼此自由交配潜力的种群或系列种群,其与其它种群或系列种群之间的变异是不连续的。
发明详述
在文献中阐述了分子生物学和核酸化学的常规技术,其在本领域技术范围之内。参见例如Sambrook,J.等,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,New York,1989;Gait,MJ.,Oligonucleotide Synthesis,a practicalapproach,1984年编,IRL Press,Oxford,England;Hames,B.D.和Higgins,S.J.,Nucleic acid Hybridisation,a practial approach,1985年编,IRLPress,Oxford,England;和丛书Methods in Enzymology,Academic Press,Inc.,所有这些文献都在此引入作为参考。本文在上下文提及的所有专利、专利申请和出版物都在此引入作为参考。
在本发明的实施方案中,提供用于检测在怀疑含有目标生物分子的样品中目标生物分子是否存在的方法,其包括以下步骤:
a)其中该步骤由步骤a1)或a2)组成
a1)将内部对照生物分子加至
-怀疑含有目标生物分子的样品,
-不含目标生物分子的阴性对照样品,
-含有目标生物分子的阳性对照样品,和
-含有目标生物分子的试剂对照样品,
a2)将内部对照生物分子加至
-怀疑含有目标生物分子的样品,
-不含目标生物分子的阴性对照样品,和
-含有目标生物分子的阳性对照样品,
并提供包含目标生物分子的试剂对照样品,
b)任选地由步骤a)的样品纯化生物分子,以获得包含所纯化的生物分子的样品,
c)测定在步骤a)或b)中获得的每种样品中是否存在内部对照生物分子信号和目标生物分子信号,
d)如下验证在怀疑含有目标生物分子的样品中目标生物分子信号的存在与否:
-独立于内部对照生物分子信号的存在情况检查怀疑含有目标生物分子之样品的目标生物分子信号存在情况,或在没有目标生物分子信号存在的情况下检查内部对照生物分子信号的存在情况,
-检查阴性对照样品是否存在内部对照生物分子信号和是否不存在目标生物分子信号,
-检查阳性对照样品是否存在目标生物分子信号和是否存在内部对照生物分子信号,和
-检查试剂对照样品在该方法步骤d)中是否存在目标生物分子信号,或检查试剂对照样品是否存在目标生物分子信号和任选地检查是否存在内部对照生物分子信号,
e)检测目标生物分子的存在与否,由此在步骤c)中测定并在步骤d)中验证的目标生物分子信号和内部对照生物分子信号的存在与否表明了试样中目标生物分子的存在与否。
本发明的方法利用多种对照,其允许验证反应的所有步骤是否都正确实施以及所获信号是否可信并可以可靠地用于检测样品中目标生物分子的存在与否。例如,优选在过程的不同步骤中(优选在生物分子纯化之前和之后)引入的两种阳性对照(即本发明的阳性对照和试剂对照)的使用,使得可以检查所述方法(尤其是生物分子纯化)的哪些步骤可能不正确实施,以及错误的来源可能是什么。通过在阴性对照样品中使用内部对照,可检验阴性对照样品中目标生物分子信号的不存在,无论其因目标生物分子确实不存在而产生,还是因抑制性物质无意地导入阴性对照样品中而产生。通过在阳性对照样品和试剂对照样品中使用内部对照,可检验这些样品中目标生物分子信号的潜在的和无意的不存在,无论其是否因抑制性物质无意导入到这些样品中而产生。总之,本发明的方法允许验证和证实用于检测在怀疑含有目标生物分子的样品中目标生物分子是否存在的方法中的多个步骤。这对多重测定特别有利,尤其是对在核酸的情况下连同解链曲线分析的多重测定特别有利,其中所述解链曲线分析允许额外分离由不同目标核酸产生的信号。
内部对照生物分子(或对照生物分子或生物分子)是用作检测目标生物分子的对照的内标。内部对照的使用允许控制纯化、信号测定和检测,由此允许监测测定的性能乃至目标生物分子的定量。其被加入到试样和其它样品中,以控制与其进行的反应,并应允许检测反应之抑制剂的存在情况。由于内部对照生物分子也存在于含有目标生物分子的样品中,并预期提供信号,所以内部对照生物分子或其信号必须与目标生物分子和/或其信号区分开来。
为此,在本发明的优选实施方案中,内部对照生物分子含有目标生物分子的一部分。内部对照生物分子还可以含有目标生物分子的一部分和并非目标生物分子之部分的部分。内部对照生物分子或内部对照生物分子中并非目标生物分子之部分的部分可以非常类似于目标生物分子,即应当具有和目标生物分子类似的生物分子特性。这意味着如果目标生物分子是蛋白质,则内部对照生物分子应为与目标蛋白具有相似氨基酸序列的蛋白,即应当优选具有与目标蛋白的氨基酸序列有60%或80%相同的氨基酸序列,并因此应当具有类似的分子特性,即应当表现得类似目标生物分子或蛋白,但仍应产生不同于目标生物分子的信号。然后,不同的抗原性位点应允许产生与目标蛋白相比不同的信号。
优选地,按照本发明,内部对照生物分子为内部对照生物分子的混合物或内部对照生物分子群(a group of internal controlbiomolecules),即不止一种内部对照生物分子。内部对照生物分子或其混合物一般在含有缓冲液或盐的溶液中提供,即为样品的形式。因此,将含有内部对照核酸的样品加至各自的本发明的其它样品中。
就作为目标生物分子的核酸而言,内部对照核酸包含与目标核酸序列不同但优选与其类似的核酸序列,该核酸序列能够与序列特异性探针杂交,并能够扩增。因此,来源于内部对照核酸的扩增子具有和目标核酸类似的长度以及G和C碱基含量,并可以含有独特的探针结合位点。因此,内部对照核酸应为与目标核酸具有类似核酸序列的核酸,即应当优选具有与目标核酸的核酸序列有60%或80%相同的核酸序列,并因此应当具有类似的分子特性。内部对照核酸通常为克隆入质粒中的核酸,包含目标核酸的一部分和并非目标核酸之部分的部分,后者即用于检测目标核酸并可用于区分内部对照核酸信号和目标核酸信号的部分。优选地,按照本发明,内部对照核酸包含与目标核酸相同的引物结合位点,即使用相同引物来扩增目标核酸和内部对照核酸,内部对照核酸具有的探针结合位点具有与目标核酸的探针结合位点不同的核酸序列,由此允许区分。优选地。按照本发明,内部对照核酸为内部对照核酸的混合物或内部对照核酸群(a group of internalcontrol nucleic acids),即不止一种以上的内部对照核酸。内部对照核酸或其混合物一般在含有缓冲液和盐的溶液中提供。因此,将含有内部对照核酸的样品加入到另一个样品中。含有内部对照核酸的溶液不含有污染的目标核酸,并提供低浓度的内部对照核酸,以允许监测对PCR扩增的抑制。关于构建和使用内部对照核酸的一般方法的详述可见于例如EP 1 236 805、WO 02/18635、Gilliland,G.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)2725-2729以及其中和上文描述的参考文献。
怀疑含有目标生物分子的样品还可以叫做试样,为要测试的样品。除了目标生物分子以外,其还可以含有目标生物分子之外的其它生物分子。这些其它生物分子为通常存在于生物样品中的那些生物分子,是本领域技术人员已知的,例如肽、蛋白质、糖如寡糖、脂质、类固醇、前列腺素、前列腺环素和核酸(包括DNA和RNA)。生物样品指得自微生物、病毒和多细胞生物、尤其是患有疾病的人类患者的任何固体和液体样品。实例是生物液体,例如血液、血浆、血清、尿、胆汁、脑脊髓液或任何机体分泌物。生物样品还可以为得自器官或组织的样品,优选为活检品,并包括细胞。
阴性对照样品为不含目标生物分子的样品。但是,其可以包含非目标生物分子的其它生物分子。这些其它生物分子是上述的那些。在优选的实施方案中,阴性对照样品为含有盐和缓冲物质的溶液(且不含有目标生物分子)。
阳性对照样品为含有目标生物分子的样品,即其应用作阳性对照,阳性对照意指如果其含有目标生物分子则其应当提供和试样相同的信号。优选地,阳性对照样品为含有目标生物分子或其部分的溶液。优选地,样品为以和试样相同的方式(即用于获得其中包含的目标生物分子的纯化步骤)处理的样品。就作为目标生物分子的核酸而言,阳性对照样品通过完整的工作流程处理,包括作为纯化步骤的裂解和核酸分离以及(PCR)扩增和检测。因此,阳性对照样品为在与试样相同的环境中含有目标生物分子的样品。通常目标生物分子为在病毒、细胞或微生物中含有的生物分子,优选为核酸。然后,试样以及阳性对照样品优选含有包含目标生物分子的病毒、细胞或微生物。优选地,阳性对照样品含有被掺入阴性人血液基质中、得自阳性血液培养物的微生物。因此,优选地,阳性对照样品为包含含有目标生物分子的病毒、细胞或微生物,更优选为含有该微生物的样品,由此样品还含有怀疑含有目标生物分子的样品所包含的相同或几乎相同的其它生物分子(即环境)。如果目标生物分子是目标生物分子群,则每种目标生物分子都包含在对应的病毒、细胞或微生物中。然后,阳性对照样品可包含目标生物分子群的一个或多个或所有成员,因为足以观察到样品处理至少对它们中的一种起作用。这在所述病毒、细胞或微生物为致病性的情况下特别重要,因为不必将含有不同的、致病性的并可为具有引起不同疾病的潜力的病毒、细胞或微生物的完整混合物的阳性对照样品出售和递送给客户。因此,在要测试目标生物分子群的情况下,阳性对照样品可仅含有一种目标生物分子。
试剂对照样品也是一种阳性对照样品,即其应用作阳性对照,阳性对照意指如果其含有目标生物分子则其应当提供和试样相同的信号。优选地,试剂对照样品为含有目标生物分子或其部分的溶液。但是,其为不是以和试样、阳性对照样品完全相同的方式处理的阳性对照,即没有例如用于获得其中包含的目标生物分子的纯化步骤。就作为目标生物分子的核酸而言,阳性对照样品通过完整的工作流程处理,包括作为纯化步骤的裂解和核酸分离以及(PCR)扩增和检测,但试剂对照样品仅经历(PCR)扩增和检测。因此,尽管阳性对照样品可为在与试样相同的环境中含有目标生物分子的样品,但经常不是这样的。通常目标生物分子为在病毒、细胞或微生物中包含的生物分子,优选为核酸。那么,试样以及阳性对照样品优选包含含有目标生物分子的病毒、细胞或微生物,但试剂对照样品仅含有目标生物分子。因此,优选地,试剂对照样品为含有并不包含在病毒、细胞或微生物中的目标生物分子的样品,由此该样品可以还含有或不含有其它生物分子。就作为目标生物分子的核酸而言,目标核酸可连接至或接合至其它核酸,例如在质粒中就是这种情况,其中要扩增的核酸-扩增子,被克隆入允许该目标核酸增殖的质粒中。如果目标生物分子为目标生物分子群,则每种目标生物分子都包含在试剂对照样品中,即对于目标核酸群,例如为检测多种病毒或微生物的目标核酸群而言,试剂对照样品优选包含所述目标核酸群,即优选包含含有该目标核酸群的质粒群(a group of plasmids)。优选地,就目标核酸群而言,试剂对照样品含有各个被克隆的目标核酸序列的混合物,该混合物涵盖了所使用的每个杂交探针对的扩增区。
按照本发明,内部对照生物分子可被加入或包含在试剂对照样品中。可通过本领域技术人员已知的方法检验样品中对应信号的存在情况。独立于内部对照生物分子信号的存在情况,检验怀疑含有目标生物分子的样品中目标生物分子信号存在情况,或在没有目标生物分子信号的情况下检验内部对照生物分子信号的存在情况。对于核酸和目标核酸信号的存在情况而言,在使用相同引物进行扩增以及目标核酸可以不允许扩增和检测内部对照核酸的较高量存在时,不一定存在内部对照核酸信号。
在本发明的任选的实施方案中,生物分子或核酸使用例如固相和本领域技术人员已知的方法由样品纯化。样品可含有多细胞生物的细胞,例如人和动物细胞,例如白细胞,以及免疫活性低和高的分子化合物,例如半抗原、抗原、抗体和核酸,血浆、脑液、唾液、粪便、活检标本、骨髓、口腔漱液、血浆、组织、尿或其混合物。在本发明的优选实施方案中,样品是来自人体或动物体的液体。优选地,样品为血液、血浆、血清或尿。血浆优选为经EDTA、肝素或柠檬酸盐处理的血浆。裂解含有核酸的生物样品,以产生含核酸的生物化合物和其它组分的混合物。用于裂解样品的程序是技术人员已知的,性质上可为化学的、酶的或物理的。这些程序的组合同样适用。例如,裂解可使用超声波、高压、剪切力、碱、变性剂或离液盐溶液或蛋白酶或脂酶进行。对于获得核酸的裂解方法,特别要提到Sambrook等:Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring HarbourLaboratory Press,Cold Spring Harbour,NY和Ausubel,F.等:CurrentProtocols in Molecular Biology 1987,J.Wiley and Sons,NY。然后,使用本发明的方法和固相由裂解混合物分离核酸,接着可实施本发明的方法。离液剂也用于裂解细胞,以制备介于核酸和其它生物物质之间的混合物(参见例如Sambrook,J.等,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,New York,1989,或EP 0 389 063)。然后加入含有玻璃或硅石的物质,纯化效果由DNA或RNA在以下这些条件下结合于具有玻璃表面的物质的行为而产生,所述条件即为存在一定浓度的离液剂、较高浓度的有机溶剂或在酸性条件下。也可以使用如在WO 01/37291中所述的磁性玻璃粒。
在又一个优选实施方案中,目标生物分子为目标生物分子群。
在再一个优选实施方案中,生物分子为核酸。
在又一个实施方案中,目标核酸和内部对照核酸在步骤c)之前扩增。在本发明的优选实施方案中,核酸用聚合酶链式反应(PCR;EP 0201 184、EP 0 200 362、US 4,683,202)扩增。扩增方法还可以为连接酶链式反应(LCR,Wu,D.Y.和Wallace,R.B.,Genomics 4(1989)560-9和Barany,F.,Proc Natl Acad Sci USA 88(1991)189-93);聚合酶连接酶链式反应(Barany,F.,PCR Methods Appl 1(1991)5-16);Gap-LCR(PCT专利公布号WO 90/01069);修复链式反应(欧洲专利公布号EP 0439 182 A2)、3SR(Kwoh,D.Y.等,Proc Natl Acad Sci USA 86(1989)1173-7;Guatelli,J.C等,Proc Natl Acad Sci USA 87(1990)1874-8;PCT专利公布号WO 92/08808)和NASBA(美国专利号US 5,130,238)。此外还有链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)和Qβ-扩增(有关综述参见例如Whelen,A.C和Persing,D.H.,Annu Rev Microbiol 50(1996)349-73;Abramson,R.D.和Myers,T.W.,Curr Opin Biotechnol 4(1993)41-7)。
在实施方案中,所述方法包括检测所扩增核酸的步骤。所扩增的核酸可通过本领域技术人员已知的和描述于例如Sambrook等,Molecular Cloning,Cold Spring Harbor University Press(1989);Lottspeich和Zorbas,Bioanalytik(1998),L.a.Zorbas编辑,SpektrumAkademischer Verlag,Heidelberg,Berlin,Germany,或Ausubel,F.等,载于“Current protocols in molecular biology”(1994),F.Ausubel,R.Brent和K.R.E.编辑,Wiley & Sons Verlag,New York的标准分析方法来测定或检测。在检测目标核酸之前还可以有纯化步骤,例如沉淀步骤。检测方法可包括但不限于结合或嵌入特定染料,例如溴化乙锭,其嵌入到双链DNA中并在此后改变其荧光。经纯化的核酸还可以通过电泳法分离,任选地在限制性消化之后,此后使其显现。还有基于探针的测定,该测定利用与特定序列的寡核苷酸杂交,随后检测杂交体。还有可能在本领域技术人员已知的其它步骤之后对目标核酸测序。其它方法将不同的核酸序列施加至硅芯片,特异性探针与之结合,并在互补序列结合时产生信号。
在本发明的特别优选的实施方案中,通过检测在扩增过程中作为荧光信号的荧光强度而检测核酸。该方法使得可以监测实时荧光。因此,在另一个优选实施方案中,目标核酸信号或内部对照核酸信号为荧光信号。荧光信号优选通过连接至探针的标记产生,其中所述探针与目标核酸或内部对照核酸杂交。
特别优选的方法使用同时的扩增和检测,检测通过检测荧光强度进行,该方法在COBAS TaqMan设备中进行,如WO 92/02638和对应的美国专利US 5,210,015、US 5,804,375、US 5,487,972所公开的。该方法利用聚合酶的外切核酸酶活性产生信号。详细地讲,核酸通过包括以下步骤的方法检测:使样品与含有与目标核酸中一区域互补的序列的寡核苷酸以及含有与同一目标核酸链中的第二个区域互补的序列但不含由第一种寡核苷酸限定的核酸序列的标记寡核苷酸接触,以在杂交条件下产生双链体混合物,其中所述双链体含有退火至第一种寡核苷酸和标记的寡核苷酸的目标核酸,使得第一种寡核苷酸的3′末端邻接标记的寡核苷酸的5′末端。然后,该混合物用具有5′至3′核酸酶活性的模板依赖性核酸聚合酶在足以允许聚合酶的5′至3′核酸酶活性切割退火的标记寡核苷酸并释放标记片段的条件下处理。检测和/或测量由标记的寡核苷酸水解产生的信号。用于TaqMan设备的形式消除了对形成固相结合的反应复合物并使其可被检测的需要。在更一般的意义上而言,本发明方法的扩增和/或检测反应是均一溶液相测定。
其它优选方法是用于LightCycler设备的形式(参见例如US6,174,670)。这些形式应用荧光共振能量转移技术(参见例如美国专利第4,996,143、5,565,322、5,849,489和6,162,603号),并基于以下事实:当供体荧光标记和对应的受体荧光标记彼此位于一定距离之内时,在这两种荧光标记之间发生能量转移,这种能量转移可被显现或以其它方法检测和/或定量。本文使用的各自含有荧光标记的两种探针可在特定位置与扩增产物杂交,此杂交由探针与目标核酸的互补性决定。依据本发明的探针的荧光标记可为供体荧光标记或受体荧光标记。在探针与扩增产物于合适位置杂交时,产生FRET信号。可使用例如光子计数落射荧光显微镜系统(含有适宜的分色镜和用于监测特定范围的荧光发射的滤光片)、光子计数光电倍增器系统或荧光计进行荧光分析。启动能量转移的激发可用氩离子激光器、高强度汞(Hg)弧灯、光纤光源或其它被适宜地滤光以在所需范围内激发的高强度光源进行。就供体荧光标记和对应的受体荧光标记而言,本文使用的“对应的”指具有与供体荧光标记的发射光谱重叠的激发光谱的受体荧光标记。因此,可在它们之间产生有效的非放射性能量转移。优选的荧光标记例如为作为供体荧光标记的荧光素,由此受体荧光标记为罗丹明。其它优选标记为花菁染料或标记,优选为如在US 6,174,670中描述的Cy5。因此,更优选地,荧光信号通过与相应核酸杂交的探针对产生,其中所述探针对的成员以彼此相距不超过5个核苷酸的距离与相应的核酸杂交,其中所述探针对的第一个探针用供体荧光标记来标记,其中所述探针对的第二个探针用对应的受体荧光标记来标记,其中第一个探针和第二个探针与相应核酸的杂交使它们获得共振能量转移关系。
在本发明的优选实施方案中,本发明方法的步骤c)包括以下分步骤
c1)将以下物质加至在步骤a)或b)中获得的样品:
-与内部对照核酸和目标核酸杂交的引物对,或两个引物对,其中第一个引物对与内部对照核酸杂交,第二个引物对与目标核酸杂交,
-与内部对照核酸杂交的第一个探针对,其中所述第一个探针对的成员以彼此相距不超过5个核苷酸的距离与内部对照核酸杂交,其中所述第一个探针对的第一个探针用第一供体荧光标记来标记,其中所述第一个探针对的第二个探针用对应的第一受体荧光标记来标记,其中第一个探针和第二个探针与内部对照核酸的杂交使它们获得共振能量转移关系;
-与目标核酸杂交的第二个探针对,其中所述第二个探针对的成员以彼此相距不超过5个核苷酸的距离与目标核酸杂交,其中所述第二个探针对的第一个探针用第二供体荧光标记来标记,其中所述第二个探针对的第二个探针用对应的第二受体荧光标记来标记,其中第一个探针和第二个探针与目标核酸的杂交使它们获得共振能量转移关系;和
-扩增内部对照核酸和目标核酸所必需的热稳定性核酸聚合酶和试剂,
c2)如果在样品中存在内部对照核酸和目标核酸,则扩增对应样品中的内部对照核酸和目标核酸,
c3)独立地测定每个样品中随对应样品温度变化的内部对照核酸和目标核酸的荧光信号是否存在,
-由此通过所述第一个探针对之第一个探针的第一供体荧光标记和第一个探针对之第二个探针的第一受体荧光标记之间的荧光共振能量转移,产生对内部对照核酸特异性的荧光信号,和
-由此通过所述第二个探针对之第一个探针的第一供体荧光标记和第二个探针对之第二个探针的第一受体荧光标记之间的荧光共振能量转移,产生对目标核酸特异性的荧光信号。
可测定随对应样品温度变化的内部对照核酸和目标核酸的荧光信号是否存在(“解链曲线分析”)。对于该分析,持续增加样品的温度,并测定先前在(扩增的)目标核酸和杂交探针之间产生的杂交复合体于此分解的解链温度。甚至可使用此方法以便检测彼此之间仅相差一个核苷酸多态性的目标分子解链温度的差异。换句话说,分析甚至可用于检测或鉴别点突变。这些技术的实例详细公开于WO 97/46707、WO97/46712和WO 97/46714,这些文献的公开内容在此引入作为参考。
业已公开了几种基于目标依赖性荧光信号的检测形式,其能够连续监测PCR扩增产物的产生或在随后的解链曲线分析中鉴别突变(综述于Wittwer,Carl T.等,BioTechniques 22(1997)130-138)。这些检测形式包括但不限于:
-在杂交时增加的荧光共振能量转移
对于该检测形式,使用各自均用荧光部分标记的两种寡核苷酸杂交探针,其能够与扩增产物中一条链上的邻接但不重叠的区域杂交。优选地,一种寡核苷酸在5′末端被标记,第二种寡核苷酸在3′末端被标记。当与目标DNA杂交时,两种荧光标记变得紧密接触,使得两种荧光部分之间可发生荧光共振能量转移。结果,可通过激发供体部分和随后检测第二受体部分的荧光发射来监测杂交(WO 97/46714)。
在类似的实施方案中,仅使用一种荧光标记的探针,其连同一种适宜标记的引物一起还可以用作特异性FRET对(Bernard,P.S.等,Analytical Biochemistry 255(1998)101-107)。
-分子信标
分子信标寡核苷酸用荧光化合物和猝灭化合物标记,这两种化合物由于分子的二级结构而彼此紧邻。在结合至目标DNA时,分子内氢键被打破,连接在探针的一个末端的荧光化合物与连接在探针的相反末端的猝灭化合物分离(Lizardi等,美国专利第5,118,801号)。
解链温度通常通过对样品实施不断的(constitutive)温度增加并连续检测杂交复合物解离为单链而以实验加以确定。解离可通过多种不同方法检测,例如通过UV吸光度漂移、通过表面等离子体共振或优选通过荧光方法。在后一种情况下,杂交探针通常用荧光标记来标记,荧光信号的产生由于某种原因取决于杂交复合物的形成。
在优选的实施方案中,测定以均一检测形式进行:例如,目标核酸可在解链温度测定之前以采用适宜扩增引物的典型PCR反应来扩增。在扩增反应当中已存在适宜的杂交探针。杂交探针优选具有在适宜的激发后可检测的荧光标记。例如,杂交探针可为分子信标(Lizardi等,美国专利第5,118,801号)或一起能够按照所谓的FRET-Hybprobe形式起作用的荧光标记的寡核苷酸对(WO 97/46714)。在完成PCR反应后,不断地增加样品温度。只要杂交探针与目标DNA结合,就可以检测到荧光。但是,在解链温度,杂交探针由其靶释放,荧光信号立即下降至背景水平。这种下降可用适宜的温度-时间图监测,使得可以确定观察到温度下降的确切温度值。
优选地,目标核酸是目标核酸群,探针对是探针对群(a group of apair of probes),由此每个探针对均与目标核酸群的成员杂交。
优选地,标记为荧光素染料、罗丹明染料、花菁染料或香豆素染料。更优选地,标记为荧光素、LC-Red 610、LC-Red 640、LC-Red 670或LC-Red 705。
优选地,目标核酸的核酸序列为对微生物、细胞或病毒特异性的核酸序列。更优选地,微生物为革兰氏阳性或革兰氏阴性微生物或真菌。再更优选地,
a)革兰氏阳性微生物为奇异变形菌(Proteus mirabilis)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或嗜麦寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia),
b)革兰氏阴性微生物为葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)或粪肠球菌(Enterococcus faecalis)或链球菌属(Streptococcus spp.),或
c)真菌为白色念珠菌(Candida albicans)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、克柔念珠菌(Candida krusei)、光滑念珠菌(Candidaglabrata)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)或热带念珠菌(Candidatropicalis)。
在本发明的优选实施方案中,所述方法是自动化的,即所述方法如在WO 99/16781中所述执行自动化过程。自动化过程指该过程的步骤适于用能够在基本没有或没有外部控制或人类影响的情况下操作的装置或设备来实施。自动化方法指可自动化的方法的步骤用能够在基本没有或没有外部控制或人类影响的情况下操作的装置或设备来实施。只有该方法的制备步骤才有可能必须手工进行,例如储存容器必需装填和就位,样品的选择必须由人以及本领域技术人员已知的其它步骤,例如控制计算机的操作来进行。所述装置或设备例如可以自动添加液体、混合样品或于特定温度实施温育步骤。典型地,这样的设备或装置为由计算机控制的机器人,其带有其中指定单个步骤和指令的程序。在本发明的优选实施方案中,所述方法为高通量形式,即自动化方法以高通量形式进行,高通量形式意指所述方法和所使用的机器或装置在短时间内对高通量的样品最佳化。
在本发明的另一个实施方案中,一种用于验证指示存在目标生物分子的信号测定结果的方法包括以下步骤:
a)提供
-含有内部对照生物分子并怀疑含有目标生物分子的样品,和
-含有内部对照生物分子但不含目标生物分子的阴性对照样品,和
-含有目标生物分子并含有内部对照生物分子的阳性对照样品,
-含有目标生物分子并任选地含有内部对照生物分子的试剂对照样品,
b)测定每个样品中的内部对照生物分子信号和目标生物分子信号,
c)如下验证指示试样中存在目标生物分子的试样中目标生物分子信号的存在情况:
-独立于内部对照生物分子信号的存在情况检查怀疑含有目标生物分子之样品的目标生物分子信号存在情况,或在没有目标生物分子信号的情况下检查内部对照生物分子信号的存在情况,
-检查阴性对照样品是否存在内部对照生物分子信号和是否不存在目标生物分子信号,
-检查阳性对照样品是否存在目标生物分子信号和是否存在内部对照生物分子信号,和
-检查试剂对照样品是否存在目标生物分子信号和任选地检查是否存在内部对照生物分子信号。
在本发明的另一个优选实施方案中,内部对照生物分子包含目标生物分子的一部分,阳性对照样品包含含有目标生物分子的病毒、微生物或细胞,或者其中阳性对照样品为含有目标生物分子或其部分的溶液,或者其中试剂对照样品为含有目标生物分子或其部分的溶液。
优选地,目标生物分子为目标生物分子群。
更优选地,生物分子为核酸。
在优选的实施方案中,目标核酸和内部对照核酸在步骤b)之前扩增。优选的扩增步骤如上所述。
优选的扩增和检测方法如上文所述。在又一个优选实施方案中,目标核酸信号或内部对照核酸信号为荧光信号。更优选地,荧光信号通过连接至探针的标记产生,而所述探针与目标核酸或内部对照核酸杂交。
用于验证指示存在目标生物分子的信号测定结果的方法的所有其它优选实施方案和实施方案的具体描述为关于本发明方法所提及的那些,即用于检测在怀疑含有目标生物分子的样品中是否存在目标生物分子的方法(见上文)、用于检测在怀疑含有目标核酸群成员的样品中是否存在目标核酸群成员的方法(见下文)和/或用于验证指示存在核酸群成员的信号测定结果的方法(见下文)。
在本发明的再一个实施方案中,提供用于检测在怀疑含有目标核酸群成员的样品中是否存在目标核酸群成员的方法,其包括以下步骤或如下进行:
a)将内部对照核酸加至
-怀疑含有目标核酸群成员的样品,和
-不含有目标核酸群成员的阴性对照样品,和
-含有目标核酸群成员的阳性对照样品,
b)提供含有目标核酸群并任选地含有内部对照核酸的试剂对照样品,
c)任选地由步骤a)和/或b)的样品纯化所述核酸,以获得包含所纯化的核酸的样品,
d)在步骤a)和b)中或步骤b)和c)中获得的每个样品中测定是否存在内部对照核酸信号和目标核酸群成员信号,
e)如下验证在怀疑含有目标核酸群成员的样品中目标核酸群成员信号的存在与否:
-独立于内部对照核酸信号的存在情况检查怀疑含有目标核酸群成员的样品中目标核酸群成员信号的存在情况,或在没有目标核酸群成员信号的情况下检查内部对照核酸信号的存在情况,
-检查阴性对照样品是否存在内部对照核酸信号和是否不存在目标核酸信号,
-检查试剂对照样品是否存在每个目标核酸群成员信号和任选地检查是否存在内部对照核酸信号,和
-检查阳性对照样品是否存在目标核酸群成员信号和是否存在内部对照核酸信号,或
f)检测目标核酸群成员的存在与否,由此在步骤d)中测定并在步骤e)中验证的目标核酸群成员信号和内部对照核酸信号的存在和/或不存在表明了怀疑含有目标核酸群成员的样品中目标核酸群成员的存在与否。
该方法具有以下优势:含目标核酸群和任选的内部对照核酸的试剂对照样品的使用,允许在以内部对照核酸为对照之外确定用于检测目标核酸群的所有相应成员的试剂(即尤其是引物和探针)是否正确地起作用。
在本发明的优选实施方案中,内部对照生物分子包含目标生物分子的一部分,阳性对照样品包含含有目标生物分子的病毒、微生物或细胞,或者其中阳性对照样品为含有目标生物分子或其部分的溶液,或者试剂对照样品为含有目标生物分子或其部分的溶液。
在本发明的另一个优选实施方案中,目标核酸群成员和内部对照核酸在步骤d)之前扩增。优选的扩增步骤在上文描述。
优选的扩增和检测方法在上文描述。在本发明的另一个优选实施方案中,目标核酸群成员或内部对照核酸的信号为荧光信号。优选地,荧光信号由连接至探针的标记产生,而所述探针与目标核酸群成员或内部对照核酸杂交。更优选地,荧光信号由与目标核酸群成员杂交的探针对群的成员产生,或由与内部对照核酸杂交的探针对成员产生,其中与目标核酸群成员杂交的每个探针对群成员或与内部对照核酸杂交的探针对成员以彼此相距不超过5个核苷酸的距离与相应的核酸杂交,其中探针对的第一个探针用供体荧光标记来标记,其中探针对的第二个探针用对应的受体荧光标记来标记,其中第一个探针和第二个探针与目标核酸群成员或内部对照核酸成员的杂交使它们获得共振能量转移关系。
优选地,本发明方法的步骤d)包含以下分步骤
d1)将以下物质加至在步骤a)和b)中或步骤b)和c)中获得的样品:
-与内部对照核酸和目标核酸群成员杂交的引物对,或与内部对照核酸杂交的引物对以及其每个成员均与目标核酸群成员杂交的引物对群(a group of a pair of primers),
-与内部对照核酸杂交的第一个探针对,其中所述第一个探针对的成员以彼此相距不超过5个核苷酸的距离与内部对照核酸杂交,其中所述第一个探针对的第一个探针用第一供体荧光标记来标记,其中所述第一个探针对的第二个探针用对应的第一受体荧光标记来标记,其中第一个探针和第二个探针与内部对照核酸的杂交使它们获得共振能量转移关系;
-每个成员均与目标核酸群成员杂交的探针对群,其中探针对群成员以彼此相距不超过5个核苷酸的距离与相应目标核酸群成员杂交,其中探针对群成员的第一个探针用第二供体荧光标记来标记,其中探针对群成员的第二个探针用对应的第二受体荧光标记来标记,其中第一个探针和第二个探针与目标核酸群成员的杂交使它们获得共振能量转移关系;和
-扩增内部对照核酸和目标核酸群所必需的热稳定性核酸聚合酶和试剂,
d2)如果在对应样品中存在内部对照核酸和目标核酸群,则扩增样品中的内部对照核酸和目标核酸群,
d3)独立地测定每个样品中随对应样品温度变化的内部对照核酸和/或目标核酸群成员的荧光信号是否存在,
-由此通过所述第一个探针对之第一个探针的第一供体荧光标记和第一个探针对之第二个探针的第一受体荧光标记之间的荧光共振能量转移,产生对内部对照核酸特异性的荧光信号,和
-由此通过所述探针对群成员的第一个探针的第一供体荧光标记和探针对群成员的第二个探针的第一受体荧光标记之间的荧光共振能量转移,产生对目标核酸群成员特异性的荧光。
测定随温度变化的内部对照核酸和/或目标核酸群成员的荧光信号是否存在(“解链曲线分析”)。解链曲线分析的确切描述可见于上文。
优选地,标记为荧光素染料、罗丹明染料、花菁染料或香豆素染料。更优选地,标记为荧光素、LC-Red 610、LC-Red 640、LC-Red 670或LC-Red 705。
在本发明的另一个优选实施方案中,目标核酸群成员包含对微生物、细胞或病毒特异性的核酸序列。优选地,微生物为革兰氏阳性或革兰氏阴性微生物或真菌。更优选地,
a)革兰氏阳性微生物为奇异变形菌(Proteus mirabilis)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或嗜麦寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia),
b)革兰氏阴性微生物为葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)或粪肠球菌(Enterococcus faecalis)或链球菌属(Streptococcus spp.),
c)所述真菌为白色念珠菌(Candida albicans)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、克柔念珠菌(Candida krusei)、光滑念珠菌(Candidaglabrata)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)或热带念珠菌(Candidatropicalis)。
用于检测在怀疑含有目标核酸群成员的样品中是否存在目标核酸群成员的方法的所有其它优选实施方案和实施方案的具体描述为关于本发明方法所提及的那些,即用于检测在怀疑含有目标生物分子的样品中是否存在目标生物分子的方法(见上文)、用于验证指示存在目标生物分子的信号测定结果的方法(见上文)和用于验证指示存在目标核酸群成员的信号测定结果的方法(见下文)。
在本发明的另一个实施方案中,提供用于验证指示存在目标核酸群成员的信号测定结果的方法,其包括以下步骤:
a)提供
-含有内部对照核酸并怀疑含有目标核酸群成员的样品,
-含有目标核酸群并任选地含有内部对照核酸的试剂对照样品
-不含目标核酸群成员而含有内部对照核酸的阴性对照样品,和
-含有目标核酸群成员和内部对照核酸的阳性对照样品
b)测定每个样品中的内部对照核酸和目标核酸群成员的信号,
c)如下验证怀疑含有目标核酸群成员的样品中目标核酸群成员信号的存在情况:
-独立于内部对照核酸信号的存在情况检查怀疑含有目标核酸群成员的样品的目标核酸成员信号存在情况,或在没有目标核酸群成员信号的情况下检查内部对照核酸信号的存在情况,
-检查试剂对照样品是否存在每个目标核酸群成员的信号,
-检查阴性对照样品是否不存在目标核酸群成员信号和是否存在内部对照核酸信号,和
-检查阳性对照样品是否存在目标生物分子信号和是否存在内部对照核酸信号。
在优选的实施方案中,内部对照核酸包含目标核酸群成员的一部分,阳性对照样品包含含有目标核酸的病毒、微生物或细胞,或者其中阳性对照样品为含有目标核酸群成员或其部分的溶液,或者试剂对照样品为含有目标核酸群成员或其部分的溶液。
优选地,目标核酸和内部对照核酸在步骤c)之前扩增。优选的扩增步骤在上文描述。
优选的扩增和检测方法在上文描述。优选地,目标核酸成员或内部对照核酸的信号为荧光信号。更优选地,荧光信号通过连接至探针的标记产生,而所述探针与目标核酸群成员或内部对照核酸杂交。
用于验证指示存在目标核酸群成员的信号测定结果的方法的所有其它优选实施方案和实施方案的具体描述为关于本发明方法所提及的那些,即用于检测在怀疑含有目标生物分子的样品中目标生物分子是否存在的方法(见上文)、用于验证指示存在目标生物分子的信号测定结果的方法(见上文)和用于检测在怀疑含有目标核酸群成员的样品中是否存在目标核酸群成员的方法(见下文)。
在本发明的另一个实施方案中,任选地含有内部对照生物分子的试剂对照样品和含有内部对照生物分子的阳性对照样品(两种样品均含有目标生物分子),用于检测在怀疑含有目标生物分子的样品中是否存在目标生物分子,或用于验证指示存在目标生物分子的信号测定结果。本发明方法的所有优选实施方案也是本发明用途的优选实施方案。
在另一个优选实施方案中,提供用于检测目标核酸或目标核酸群成员的试剂盒,其含有:
a)含有目标核酸或目标核酸群成员的试剂对照样品,
b)不含目标核酸或目标核酸群成员的阴性对照样品,
c)含有目标核酸或目标核酸群成员的阳性对照样品,
d)内部对照核酸,和
e)用于检测目标核酸或目标核酸群成员的试剂。
优选地,在本发明的试剂盒中,用于检测目标核酸或目标核酸群成员的试剂含有:
-探针对和引物对
-热稳定性核酸聚合酶,以及
-用于扩增目标核酸或目标核酸群成员的试剂。
本领域已知的这样的试剂盒还包含可在样品制备程序当中使用的塑料器皿,例如为96孔或384孔形式的微量滴定板或就是例如由Eppendorf,Hamburg,Germany制造的普通反应管,以及用于实施本发明方法的所有其它试剂。因此,所述试剂盒可另外包含对核酸具有亲和力的物质,优选地,对核酸具有亲和力的物质包括具有二氧化硅表面的物质。优选地,具有二氧化硅表面的物质为玻璃。最优选地,对核酸具有亲和力的物质为含有磁性玻璃粒的组合物。所述试剂盒可以进一步或另外地包含允许裂解细胞的裂解缓冲液,其含有例如离液剂、变性剂或醇类或它们的混合物。本发明试剂盒的这些组分可单独地在管或储存容器中提供。根据组分的性质,这些组分甚至可在一个管或储存容器中提供。所述试剂盒可以进一步或另外地包含洗涤溶液,其适于DNA或RNA与磁性玻璃粒结合时的磁性玻璃粒的洗涤步骤。该洗涤溶液可含有乙醇和/或离液剂的缓冲溶液或具有酸性pH、无上述乙醇和/或离液剂的溶液。洗涤溶液或其它溶液经常作为在使用前必须稀释的贮液提供。
所述试剂盒可进一步或另外地包含洗脱剂或洗脱缓冲液,即溶液或缓冲液(例如10mM Tris、1mM EDTA,pH 8.0)或纯水,以洗脱与磁性玻璃粒结合的DNA或RNA。此外,可存在额外的试剂或缓冲溶液,其可用于核酸(即DNA或RNA)的纯化过程。
本发明的用途和试剂盒的所有其它优选实施方案和实施方案的具体描述为关于本发明方法所提及的那些,即用于检测在怀疑含有目标生物分子的样品中目标生物分子是否存在的方法(见上文)、用于验证指示存在目标生物分子的信号测定结果的方法(见上文)、用于检测在怀疑含有目标核酸群成员的样品中是否存在目标核酸群成员的方法(见上文)和用于验证指示存在目标核酸群成员的信号测定结果的方法(见上文)。
提供以下的实施例和附图是为了帮助理解本发明,本发明的真正范围在随附的权利要求中阐明。要理解的是,在不偏离本发明精神的情况下,可对所陈述的步骤进行修改。
附图描述
所有附图都在x轴上显示温度,在y轴上显示荧光强度图的负一阶导数(-dF/dT荧光)。
图1:在图1中显示了对RC G+(反应对照G+)的解链曲线分析的结果。对于在RC G+试剂中所代表的不同目标生物的每一种,个体解链曲线峰(dF/dT;F=荧光;T=温度)可在不同的检测通道和于不同的解链峰温度检测到。
图2:在图2中显示了对RC G-(反应对照G-)的解链曲线分析的结果。对于在RC G-试剂中所代表的不同目标生物的每一种,个体解链曲线峰(dF/dT;F=荧光;T=温度)可在不同的检测通道和于不同的解链峰温度检测到。
图3:在图3中显示了对RC F(反应对照F)的解链曲线分析的结果。对于在RC F试剂中所代表的不同目标生物的每一种,个体解链曲线峰(dF/dT;F=荧光;T=温度)可在不同的检测通道和于不同的解链峰温度检测到。
图4:在图4中显示了对在3个不同的多重试验中获得的RC G-(反应对照G-;检测通道610)的解链曲线分析。在第一个试验中,获得了在RC G-中所代表的全部3种目标生物的解链峰(dF/dT;F=荧光;T=温度),而在第二个和第三个试验中,分别失去目标2和目标1的解链峰。失去的解链曲线峰清楚表明,在试验2和3中所使用的试剂和/或反应条件分别不能用于和/或不适于目标2和目标1的检测。
图5:图5显示了含有粪肠球菌(E.faecalis)和白色念珠菌(C.albicans)的血液样品的解链曲线分析结果。在样品制备前将IC掺入到血液样品中,并与目标核酸一起共纯化。在G+测定和F测定中获得了2种目标生物(粪肠球菌(E.faecalis)、白色念珠菌(C.albicans))的个体解链曲线信号,但在G-测定中没有获得。然而,对于全部3种测定(G+、G-、F),于预期的解链峰温度都检测到对应的IC信号(IC G+、IC G-、IC F)。观察到的IC信号表明了所使用的适宜反应条件,由此证实了全部3种测定所获得的结果的有效性。
实施例
一般说明
所有试剂都需要检查是否被所检测生物污染。只有没有那些生物和源自其的核酸的试剂才可以产生最佳灵敏度。
对照
使用含有介于16s rRNA(核糖体核糖核酸)和23sRNA基因(细菌目标)之间以及介于18s rRNA和28sRNA基因(真菌目标)之间的ITS区(ITS:内部转录间隔区)的质粒DNA(约104个拷贝的质粒DNA)的混合物制备RC G-、RC G+、RC F和IC对照试剂(RC:试剂对照,G-:革兰氏阴性,G+:革兰氏阳性,F:真菌,IC:内部对照)
a)RC G-:
pTE-Smar-1:基于pT3T7BM的质粒,含有粘质沙雷氏菌(S.marcescens)16S/23S-rRNA-间隔区
pTE-Abau-1:基于pT3T7BM的质粒,含有鲍氏不动杆菌(A.baumannii)16S/23S-rRNA-间隔区
pTE-Koxy-1:基于pT3T7BM的质粒,含有产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)16S/23S-rRNA-间隔区
pTE-Eclo-1:基于pT3T7BM的质粒,含有阴沟肠杆菌(E.cloacae)16S/23S-rRNA-间隔区
pTE-Ecol-1:基于pT3T7BM的质粒,含有大肠杆菌(E.coli)16S/23S-rRNA-间隔区
pTE-Pmir-1:基于pT3T7BM的质粒,含有奇异变形菌(P.mirabilis)16S/23S-rRNA-间隔区
pTE-Paer-2:基于pT3T7BM的质粒,含有铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)16S/23S-rRNA-间隔区
pTE-Smal-1:基于的质粒pT3T7BM,含有嗜麦寡养单胞菌(S.maltophilia)16S/23S-rRNA-间隔区
b)RC G+:
pStaph_wt:基于pT3T7BM的质粒,含有金黄色葡萄球菌(S.aureus)16S/23S-rRNA-间隔区
pEntero_1:基于pT3T7BM的质粒,含有粪肠球菌(E.faecalis)16S/23S-rRNA-间隔区
pEntero_2:基于pT3T7BM的质粒,含有屎肠球菌(E.faecium)16S/23S-rRNA-间隔区
pStrep_wt:基于pT3T7BM的质粒,含有肺炎链球菌(S.pneumoniae)16S/23S-rRNA-间隔区
RC F:
pAfum-PC-PF1:基于pT3T7BM的质粒,含有烟曲霉(A.fumigatus)18S/28S-rRNA-间隔区
pCgla-PC-PF1:基于pT3T7BM的质粒,含有光滑念珠菌(C.glabrata)18S/28S-rRNA-间隔区
pCalb-PC-PF1:基于pT3T7BM的质粒,含有白色念珠菌(C.albicans)18S/28S-rRNA-间隔区
pCkru-PC-PF1:基于pT3T7BM的质粒,含有克柔念珠菌(C.krusei)18S/28S-rRNA-间隔区
pCtrop-PC-PF1:基于pT3T7BM的质粒,含有热带念珠菌(C.tropicalis)18S/28S-rRNA-间隔区
pCpara-PC-PF1:基于pT3T7BM的质粒,含有近平滑念珠菌(C.parapsilosis)18S/28S-rRNA-间隔区
c)IC:
pTE-Paer-IC/2:基于pT3T7BM的质粒,含有铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)16S/23S-rRNA-间隔区和IC G-特异性探针结合位点
pIC G+:基于pT3T7BM的质粒,含有屎肠球菌(E.faecium)16S/23S-rRNA-间隔区和IC G+特异性探针结合位点pAfum(FP 10/21)-ICv2-PF1:
基于pT3T7BM的质粒,含有白色念珠菌(C.albicans)18S/28S-rRNA-间隔区和IC F特异性探针结合位点
如果适宜的载体是pT3T7BM,则在实施例中使用的对照带有多个克隆位点连同T3和T7RNA聚合酶的启动子,可得自RocheDiagnostics,Mannheim,Germany。参见载体数据库的序列(http://seq.yeastgenome.org或http://seq.yeastgenome.org/vectordb/vector_descrip/PT3T7BM.html)。
硬件/软件
使用LightCyclerTM 2.0设备(Roche Diagnostics GmbH,Germany)和100μl毛细管转子于610nm、640nm、670nm和705nm进行杂交探针的荧光检测。原始数据的产生和数据分析使用LightCycler软件4.05(Roche Diagnostics GmbH,Germany)进行。
试剂
本文提及的所有寡核苷酸都通过化学合成制备。用于连接标记的试剂可购自Roche Diagnostics GmbH(LightCycler Red 640NHS酯,目录号2015161;LightCycler Red 705亚磷酰胺,目录号2157594;LightCycler荧光素(在以下缩写为‘F’)CPG,目录号3113906)。那些试剂的使用描述于Biochemica第1期(2001),8-13页。Cy5-NHS酯可经要求得自Amersham。LC-Red 610-NHS酯于610nm具有最大发射,使用公开于US 5,750,409的荧光染料按照标准方法合成。
FastStart DNA聚合酶和FastStart Master一般如在LightCyclerFastStartDNA Master杂交探针试剂盒(Roche Diagnostics GmbH,目录号2239272)中推荐的方法使用。按照试剂盒生产商的说明,引物以各自0.3-1μM的终浓度使用,杂交探针以各自约0.2μM的浓度使用。所使用的MgCl2浓度为3.5mM。
试剂和试剂盒可得自Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany。
方法
对样品(尤其是临床样品)进行样品制备,其中核酸由样品的其它组分释放和纯化。这使用MagNA PureTM LC和MagNA PureTM LCDNA分离试剂盒III(细菌、真菌)(Roche Diagnostics GmbH,Germany,目录号3 264 785)进行。样品制备物以在洗脱缓冲液中含有核酸的标本获得。
IC在样品制备当中(例如在MagNA Pure设备中)处理,或者加入到完整的主混合物(mastermix)中(参见下文),这取决于其是要作为样品制备程序的过程中对照还是用于LightCycler设备的每个毛细管中的测定性能的过程中对照。以在经纯化的核酸制备物和对应的对照试剂(RC G+、RC G-、RC F)作为样品,在LightCycler设备中的运行以100μl反应体积使用以下的热循环和解链温度模式进行:
循环 | 时间(秒) | 温度(℃) | 斜率(℃/s) | 获得方式 | |
变性 | 1 | 600 | 95℃ | 20 | 无 |
扩增 | 15 | 15 | 95 | 3 | 无 |
50 | 58 | 20 | 无 | ||
40 | 72 | 3 | 无 | ||
扩增 | 30 | 15 | 95 | 3 | 无 |
50 | 50 | 20 | 单一的 | ||
40 | 72 | 3 | 无 | ||
解链曲线 | 1 | 60 | 95 | 20 | 无 |
60 | 40 | 20 | 无 | ||
0 | 80 | 0.1 | 连续的 | ||
冷却 | 1 | 30 | 40 | 20 | 无 |
Claims (43)
1.一种用于检测在怀疑含有目标生物分子的样品中是否存在目标生物分子的方法,所述方法包括以下步骤:
a)其中该步骤由步骤a1)或a2)组成
a1)将内部对照生物分子加至
-怀疑含有目标生物分子的样品,和
-不含目标生物分子的阴性对照样品,
-含有目标生物分子的阳性对照样品,和
-含有目标生物分子的试剂对照样品
a2)将内部对照生物分子加至
-怀疑含有目标生物分子的样品,和
-不含目标生物分子的阴性对照样品,和
-含有目标生物分子的阳性对照样品,
并提供包含目标生物分子的试剂对照样品,
b)任选地由步骤a)的样品纯化所述生物分子,以获得包含所纯化的生物分子的样品,
c)测定在步骤a)或b)中获得的每个样品中内部对照生物分子信号和目标生物分子信号的存在与否,
d)如下验证在怀疑含有目标生物分子的样品中存在或不存在目标生物分子信号:
-独立于内部对照生物分子信号的存在情况检查怀疑含有目标生物分子之样品的目标生物分子信号的存在情况,或在没有目标生物分子信号的情况下检查内部对照生物分子信号的存在情况,
-检查阴性对照样品是否存在内部对照生物分子信号和是否不存在目标生物分子信号,
-检查阳性对照样品是否存在目标生物分子信号和是否存在内部对照生物分子信号,和
-检查所述方法的步骤d)中的试剂对照样品的目标生物分子信号存在情况,或检查试剂对照样品是否存在目标生物分子信号以及任选地检查是否存在内部对照生物分子信号,
e)检测目标生物分子的存在与否,由此在步骤c)中测定并在步骤d)中验证的目标生物分子信号和内部对照生物分子信号的存在或不存在指示试样中存在或不存在目标生物分子。
2.权利要求1的方法,其中所述阴性对照样品为包含盐和缓冲物质的溶液。
3.权利要求1-2中任一项的方法,其中所述内部对照生物分子包含目标生物分子的一部分。
4.权利要求1-3中任一项的方法,其中所述试剂对照样品和/或阳性对照样品为包含目标生物分子或其部分的溶液。
5.权利要求1-4中任一项的方法,其中所述阳性对照样品包含含有目标生物分子的病毒、微生物或细胞。
6.权利要求1-5中任一项的方法,其中所述目标生物分子为目标生物分子群。
7.权利要求1-6中任一项的方法,其中所述生物分子为核酸。
8.权利要求7的方法,其中所述目标核酸和内部对照核酸在步骤c)之前被扩增。
9.权利要求7-8中任一项的方法,其中所述目标核酸或内部对照核酸的信号为荧光信号。
10.权利要求9的方法,其中所述荧光信号通过连接至探针的标记产生,而所述探针与目标核酸或内部对照核酸杂交。
11.权利要求10的方法,其中所述荧光信号由与相应的核酸杂交的探针对产生,其中所述探针对成员以彼此相距不超过5个核苷酸的距离与相应的核酸杂交,其中所述探针对的第一个探针用供体荧光标记来标记,其中所述探针对的第二个探针用对应的受体荧光标记来标记,其中第一个探针和第二个探针与相应核酸的杂交使它们获得共振能量转移关系。
12.权利要求11的方法,其中步骤c)包括以下分步骤:
c1)将以下物质加至在步骤a)或b)中获得的样品:
-与内部对照核酸和目标核酸杂交的引物对,或两个引物对,其中第一个引物对与内部对照核酸杂交,第二个引物对与目标核酸杂交,
-与内部对照核酸杂交的第一个探针对,其中所述第一个探针对的成员以彼此相距不超过5个核苷酸的距离与内部对照核酸杂交,其中所述第一个探针对的第一个探针用第一供体荧光标记来标记,其中所述第一个探针对的第二个探针用对应的第一受体荧光标记来标记,其中第一个探针和第二个探针与内部对照核酸的杂交使它们获得共振能量转移关系;
-与目标核酸杂交的第二个探针对,其中所述第二个探针对的成员以彼此相距不超过5个核苷酸的距离与目标核酸杂交,其中所述第二个探针对的第一个探针用第二供体荧光标记来标记,其中所述第二个探针对的第二个探针用对应的第二受体荧光标记来标记,其中第一个探针和第二个探针与目标核酸的杂交使它们获得共振能量转移关系;和
-扩增内部对照核酸和目标核酸所必需的热稳定性核酸聚合酶和试剂,
c2)如果在样品中存在内部对照核酸和目标核酸,则扩增对应样品中的内部对照核酸和目标核酸,
c3)独立地测定每个样品中随对应样品温度变化的内部对照核酸和目标核酸的荧光信号是否存在,
由此通过所述第一个探针对之第一个探针的第一供体荧光标记和第一个探针对之第二个探针的第一受体荧光标记之间的荧光共振能量转移,产生对内部对照核酸特异性的荧光信号,和
-由此通过所述第二个探针对之第一个探针的第一供体荧光标记和第二个探针对之第二个探针的第一受体荧光标记之间的荧光共振能量转移,产生对目标核酸特异性的荧光信号。
13.权利要求7-12中任一项的方法,其中所述目标核酸是目标核酸群,所述探针对是探针对群,由此每个探针对都与目标核酸群的成员杂交。
14.权利要求10-12中任一项的方法,其中所述标记是荧光素染料、罗丹明染料、花菁染料或香豆素染料。
15.权利要求7-14中任一项的方法,其中目标核酸的核酸序列是微生物、细胞或病毒特异性的核酸序列。
16.权利要求15的方法,其中所述微生物是革兰氏阳性微生物或革兰氏阴性微生物或真菌。
17.权利要求16的方法,其中
a)所述革兰氏阳性微生物为奇异变形菌(Proteus mirabilis)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或嗜麦寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia),
b)所述革兰氏阴性微生物为葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)或粪肠球菌(Enterococcus faecalis)或链球菌属(Streptococcus spp.),或
c)所述真菌为白色念珠菌(Candida albicans)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、克柔念珠菌(Candida krusei)、光滑念珠菌(Candidaglabrata)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)或热带念珠菌(Candidatropicalis)。
18.一种验证指示存在目标生物分子之信号的测定结果的方法,所述方法包括以下步骤:
a)提供
-含有内部对照生物分子并怀疑含有目标生物分子的样品,和
-含有内部对照生物分子但不含目标生物分子的阴性对照样品,和
-含有目标生物分子并含有内部对照生物分子的阳性对照样品,
-含有目标生物分子并任选地含有内部对照生物分子的试剂对照样品,
b)测定每个样品中的内部对照生物分子信号和目标生物分子,
c)如下验证试样中指示试样中存在目标生物分子的目标生物分子信号的存在情况:,
-独立于内部对照生物分子信号的存在情况检查怀疑含有目标生物分子之样品的目标生物分子信号的存在情况,或在没有目标生物分子信号的情况下检查内部对照生物分子信号的存在情况,
-检查阴性对照样品是否存在内部对照生物分子信号和是否不存在目标生物分子信号,
-检查阳性对照样品是否存在目标生物分子信号和是否存在内部对照生物分子信号,和
-检查试剂对照样品是否存在目标生物分子信号以及任选地检查是否存在内部对照生物分子信号。
19.权利要求18的方法,
-其中所述内部对照生物分子包含目标生物分子的一部分,
-其中所述阳性对照样品包含含有目标生物分子的病毒、微生物或细胞,或者其中所述阳性对照样品为包含目标生物分子或其部分的溶液,或
-其中所述试剂对照样品为包含目标生物分子或其部分的溶液。
20.权利要求18-19中任一项的方法,其中所述目标生物分子为目标生物分子群。
21.权利要求18-20中任一项的方法,其中所述生物分子为核酸。
22.权利要求21的方法,其中所述目标核酸和内部对照核酸在步骤b)之前被扩增。
23.权利要求21-22中任一项的方法,其中所述目标核酸的信号或内部对照核酸的信号为荧光信号。
24.权利要求23的方法,其中所述荧光信号通过连接至探针的标记产生,而所述探针与目标核酸或内部对照核酸杂交。
25.一种如下用于检测在怀疑含有目标核酸群成员的样品中是否存在目标核酸群成员的方法:
a)将内部对照核酸加至
-怀疑含有目标核酸群成员的样品,和
-不包含目标核酸群成员的阴性对照样品,和
-含有目标核酸群成员的阳性对照样品,
b)提供含有目标核酸群并任选地含有内部对照核酸员的试剂对照样品,
c)任选地由步骤a)和/或b)的样品纯化所述核酸,以获得包含所纯化的核酸的样品,
d)测定在步骤a)和b)中或步骤b)和c)中获得的每个样品中是否存在内部对照核酸信号和目标核酸群成员信号,
e)如下验证在怀疑含有目标核酸群成员的样品中目标核酸群成员信号的存在与否:
-独立于内部对照核酸信号的存在情况检查怀疑含有目标核酸群成员的样品的目标核酸群成员信号存在情况,或在没有目标核酸群成员信号的情况下检查内部对照核酸信号的存在情况,
-检查阴性对照样品是否存在内部对照核酸信号和是否不存在目标核酸信号,
-检查试剂对照样品是否存在每个目标核酸群成员信号和任选地检测是否存在内部对照核酸信号,和
-检查阳性对照样品否存在内目标核酸群成员信号和是否存在内部对照核酸信号,或
f)检测目标核酸群成员的存在与否,由此在步骤d)中测定并在步骤e)中验证的目标核酸群成员信号和内部对照核酸信号的存在和/或不存在指示在怀疑含有目标核酸群成员的样品中存在或不存在目标核酸群成员。
26.权利要求25的方法,
-其中所述内部对照生物分子包含目标生物分子的一部分,
-其中所述阳性对照样品包含含有目标生物分子的病毒、微生物或细胞,或者其中所述阳性对照样品为包含目标生物分子或其部分的溶液,或
-其中所述试剂对照样品为包含目标生物分子或其部分的溶液。
27.权利要求25-26中任一项的方法,其中目标核酸群成员和内部对照核酸在步骤d)之前被扩增。
28.权利要求25-27中任一项的方法,其中所述目标核酸群成员信号或内部对照核酸信号为荧光信号。
29.权利要求28的方法,其中所述荧光信号通过连接至探针的标记产生,而所述探针与目标核酸群成员或内部对照核酸杂交。
30.权利要求29的方法,其中所述荧光信号由与目标核酸群成员杂交的探针对群成员或与内部对照核酸杂交的探针对成员产生,其中与目标核酸群成员杂交的探针对群的每个成员或与内部对照核酸杂交的探针对成员以彼此相距不超过5个核苷酸的距离与相应的核酸杂交,其中探针对的第一个探针用供体荧光标记来标记,其中探针对的第二个探针用对应的受体荧光标记来标记,其中第一个探针和第二个探针与目标核酸群成员或内部对照核酸的杂交使它们获得共振能量转移关系。
31.权利要求30的方法,其中步骤d)包含以下分步骤:
d1)将以下物质加至在步骤a)和b)中或步骤b)和c)中获得的样品:
-与内部对照核酸和目标核酸群成员杂交的引物对,或与内部对照核酸杂交的引物对和其每个成员均与目标核酸群成员杂交的引物对群,
-与内部对照核酸杂交的第一个探针对,其中所述第一个探针对的成员以彼此相距不超过5个核苷酸的距离与内部对照核酸杂交,
-其中所述第一个探针对的第一个探针用第一供体荧光标记来标记,其中所述第一个探针对的第二个探针用对应的第一受体荧光标记来标记,其中第一个探针和第二个探针与内部对照核酸的杂交使它们获得共振能量转移关系;
-每个成员均与目标核酸群成员杂交的探针对群,其中探针对群成员以彼此相距不超过5个核苷酸的距离与相应目标核酸群成员杂交,其中探针对群成员的第一个探针用第二供体荧光标记来标记,其中探针对群成员的第二个探针用对应的第二受体荧光标记来标记,其中第一个探针和第二个探针与目标核酸群成员的杂交使它们获得共振能量转移关系;和
-扩增内部对照核酸和目标核酸群所必需的热稳定性核酸聚合酶和试剂,
d2)如果在样品中存在内部对照核酸和目标核酸群,则扩增对应样品中的内部对照核酸和目标核酸群,
d3)独立地测定每个样品中随对应样品温度变化的内部对照核酸和/或目标核酸群成员的荧光信号是否存在,
-由此通过所述第一个探针对之第一个探针的第一供体荧光标记和第一个探针对之第二个探针的第一受体荧光标记之间的荧光共振能量转移,产生对内部对照核酸特异性的荧光信号,和
-由此通过所述探针对群成员的第一个探针的第一供体荧光标记和探针对群成员的第二个探针的第一受体荧光标记之间的荧光共振能量转移,产生对目标核酸群成员特异性的荧光。
32.权利要求25-31中任一项的方法,其中所述标记为荧光素染料、罗丹明染料、花菁染料或香豆素染料。
33.权利要求25-32中任一项的方法,其中目标核酸群成员包含微生物、细胞或病毒特异性的核酸序列。
34.权利要求33的方法,其中所述微生物是革兰氏阳性微生物或革兰氏阴性微生物或真菌。
35.权利要求34的方法,其中
a)所述革兰氏阳性微生物为奇异变形菌、粘质沙雷氏菌、鲍氏不动杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌、产酸克雷伯氏菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌或嗜麦寡养单胞菌,
b)所述革兰氏阴性微生物为葡萄球菌属、屎肠球菌或粪肠球菌或链球菌属,或
c)所述真菌为白色念珠菌、烟曲霉、克柔念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌或热带念珠菌。
36.一种用于验证指示存在目标核酸群成员的信号测定结果的方法,所述方法包括以下步骤:
a)提供
-含有内部对照核酸并怀疑含有目标核酸群成员的样品,和
-含有目标核酸群并任选地含有内部对照核酸的试剂对照样品,
-不含目标核酸群成员而含有内部对照核酸的阴性对照样品,和
-含有目标核酸群成员并含有内部对照核酸的阳性对照样品,
b)测定每个样品中的内部对照核酸信号和目标核酸群成员信号,
c)如下验证在怀疑含有目标核酸群成员的样品中目标核酸群成员信号的存在情况:
-独立于内部对照核酸信号的存在情况检查怀疑含有目标核酸群成员的样品中目标核酸成员的信号存在情况,或在没有目标核酸群成员信号的情况下检查内部对照核酸信号的存在情况,
-检查试剂对照样品是否存在每个目标核酸群成员之信号,
-检查阴性对照样品是否不存在目标核酸群成员信号和是否存在内部对照核酸信号,和
-检查阳性对照样品是否存在目标生物分子信号和是否存在内部对照核酸信号。
37.权利要求36的方法,
-其中所述内部对照核酸包含目标核酸群成员的一部分,
-其中所述阳性对照样品包含含有目标生物分子的病毒、微生物或细胞,或者其中所述阳性对照样品为包含目标核酸群成员或其部分的溶液,或
-其中所述试剂对照样品为包含目标核酸群成员或其部分的溶液。
38.权利要求36-37中任一项的方法,其中所述目标核酸和内部对照核酸在步骤c)之前被扩增。
39.权利要求36-38中任一项的方法,其中所述目标核酸群成员的信号或内部对照核酸的信号为荧光信号。
40.权利要求39的方法,其中所述荧光信号通过连接至探针的标记产生,而所述探针与目标核酸群成员或内部对照核酸杂交。
41.任选地含有内部对照生物分子的试剂对照样品和含有内部对照生物分子的阳性对照样品用于检测在怀疑含有目标生物分子的样品中是否存在目标生物分子或验证指示存在目标生物分子的信号测定结果的用途,其中所述试剂对照样品和阳性对照样品均含有目标生物分子。
42.用于检测目标核酸或目标核酸群成员的试剂盒,所述试剂盒包含:
a)含有目标核酸或目标核酸群成员的试剂对照样品,
b)不含有目标核酸或目标核酸群成员的阴性对照样品,
c)含有目标核酸或目标核酸群成员的阳性对照样品,
d)内部对照核酸,和
e)用于检测目标核酸或目标核酸群成员的试剂。
43.权利要求42的试剂盒,其中用于检测目标核酸或目标核酸群成员的试剂包含:
-探针对和引物对,
-热稳定性核酸聚合酶,和
-用于扩增目标核酸或目标核酸群成员的试剂。
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