CN101273130A - 用于下调h19的核酸物质及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

公开了能够下调癌细胞中H19 mRNA水平的分离的寡核苷酸。公开了包含能够联合其他抗癌疗法下调H19 mRNA的物质的制品以及通过进行所述制品的给药而治疗癌症的方法。

Description

用于下调H19的核酸物质及其使用方法
技术领域及背景技术
本发明涉及用于下调H19的核酸物质及其用于治疗癌症的用途。
H19是第一种被鉴定为显示仅表达母系等位基因的人类印迹非蛋白编码基因。它还在小鼠中印迹。H19的图谱显示位于人类11号染色体短臂，15.5带，与小鼠7号染色体的区域同源。它属于一组极有可能不编码蛋白产物的基因。H19基因在胚胎发生中丰富表达，但出生后在大部分组织中关闭。然而，不同肿瘤研究已经显示相对于健康组织H19基因的再表达或超表达。另外，在不同病因和谱系的癌症中，在某些情况中观察到等位基因的异常表达模式。尽管除在成熟的某阶段胚胎细胞和在绒毛外滋养母细胞以外，H19显示在发育过程中于大部分组织中为单等位基因表达，但是在越来越多的癌症中，已发现被称为“印迹松弛”或“印迹丧失(LOI)”的该基因的双等位基因表达，例如肝细胞癌，白蛋白SV40 T抗原转基因大鼠的肝新生物(neoplasm)，肺腺癌，食管癌，卵巢癌，横纹肌肉瘤，宫颈鳞状细胞癌，膀胱鳞状细胞癌，头和颈鳞状细胞癌，结肠直肠、子宫以及睾丸生殖细胞肿瘤。目前，几乎30种癌症显示相对于健康组织H19基因表达失调，具有或无LOI。对于最近的评述，参见Matouk等(Matouk等，2005，Gene Ther Mol Biol)。
还显示在软琼脂测定和一些组合的免疫缺陷(SCID)小鼠中异位来源的H19超表达赋予了乳房上皮细胞的增殖优势(Lottin等，2002，Oncogene21，1625-1631)。在通过注射绒毛膜癌衍生的细胞系(JEG-3)和膀胱癌细胞系(T24P)的细胞形成的肿瘤中，H19水平与注射前细胞中的H19水平相比非常高(Rachmilewitz等，1995，Oncogene 11，863-870)。
另外，某些已知的致癌物上调H19基因的表达。在无LOI的吸烟者的气道上皮中检测到H19RNA水平的显著升高(Kaplan等，2003，Cancer Res63，1475-1482)。在大鼠膀胱癌模型中，BBN(已知的膀胱的致癌物)也诱导H19基因的表达(Ariel等，2004，Mol Carcinog 41，69-76)。类似地，在小鼠肝细胞癌模型中，二乙基亚硝胺(已知的肝脏的致癌物)诱导H19基因的表达(Graveel等，2001，Oncogene 20，2704-2712)。所有这些观察结果和其他观察结果与最初H19是肿瘤抑制基因的提议相矛盾。
对两种仅在存在或无H19RNA的情况下不同的同源细胞群中的基因表达模式进行比较，已经鉴定了H19RNA的大量下游效应因子，其中有先前报道在肿瘤发生过程的某些方面起关键作用的一组基因。H19RNA的存在可通过上调在侵袭、迁移和生成血管的途径中起作用的基因而提高细胞的侵袭、迁移和生成血管的能力，并能因此至少导致转移级联的初始步骤。其他研究显示了H19通过作为HGF/SF的应答基因在促进癌症进展和肿瘤转移中的潜在作用。
癌细胞中H19基因的特异性表达促进了其在诊断癌症的临床应用中的用途。
因此，本发明发明人的美国专利No.5,955,273教导了H19基因作为肿瘤特异性标记物的用途。
PCT公布号WO 9524503教导了使用H19基因探针通过原位杂交检测恶性肿瘤及其分级——用于检测儿童维尔姆斯氏肿瘤(Wilms′Tumor)中恶性肿瘤的存在/不存在。
PCT公布号WO 0403159教导了H19下调用于治疗与血管发生有关的疾病，如癌症。然而，H19的下调显示不减小肿瘤大小或体积，所教导的能够下调H19的特异和有效的siRNA物质也是如此。另外，PCT公布号WO 0403159没有教导抗H19物质作为用于治疗癌症的联合疗法的部分。
因此，存在用于癌症治疗的下调H19的方法和组合物的公认需要，并且具有它们是非常有利的。
发明内容
根据本发明的一方面，提供了一种选自SEQ ID NO：1、2、3和4的分离的寡核苷酸。
根据本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和作为活性成分的至少一种选自SEQ ID NO：1、2、3和4的分离的寡核苷酸。
根据本发明的又一方面，提供了一种选自SEQ ID NO：1、2、3和4的分离的寡核苷酸用于制备治疗癌症的药剂的用途。
根据本发明的又一方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括：
(a)给药于具有相应需要的受治疗者能够下调H19mRNA水平和/或活性的治疗有效量的物质或在具有相应需要的受治疗者的细胞中表达能够下调H19mRNA水平和/或活性的治疗有效量的物质，以及
(b)提供给所述受治疗者一种癌症疗法，由此治疗癌症。
根据本发明的又一方面，提供了一种能够下调H19mRNA水平和/或活性的物质用于制备联合一种癌症疗法而治疗癌症的药剂的用途。
根据本发明的又一方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括：给药于具有相应需要的受治疗者治疗有效量的至少一种选自SEQ ID NO：1、2、3和4的寡核苷酸或在具有相应需要的受治疗者的细胞中表达治疗有效量的至少一种选自SEQ ID NO：1、2、3和4的寡核苷酸，由此治疗癌症。
根据本发明的又一方面，提供了一种制品，其包含能够下调H19mRNA水平和/或活性的物质和鉴定为用于治疗癌症的另一种抗癌剂。
根据本发明下文所述的优选实施方案的其他特征，所述能够下调H19mRNA水平和/或活性的物质是一种核酸物质。
根据本发明下文所述的优选实施方案的另一些其他特征，所述核酸物质选自：
(a)用于抑制H19RNA从H19基因转录的单链多核苷酸；
(b)用于与H19mRNA杂交由此导致H19mRNA活性减小的单链多核苷酸；
(c)导致H19mRNA降解的双链多核苷酸；
(d)用于剪切H19mRNA的形成三链体的多核苷酸；
(e)用于剪切H19mRNA的催化的多核苷酸；
(f)用于与H19mRNA杂交而导致其酶解的单链多核苷酸；
(g)编码(a)至(f)任一者的核酸序列。
根据所述的优选实施方案的另一些其他特征，所述核酸物质选自siRNA、核酶和DNA酶(DNAzyme)。
根据所述的优选实施方案的另一些其他特征，所述核酸物质是siRNA。
根据所述的优选实施方案的另一些其他特征，所述siRNA包含选自SEQ ID NO：1-4的核酸序列。
根据所述的优选实施方案的另一些其他特征，所述给药在原位进行。
根据所述的优选实施方案的另一些其他特征，所述癌症选自：儿童实体瘤、维尔姆斯氏肿瘤、肝母细胞瘤、胚胎性横纹肌肉瘤、生殖细胞瘤、滋养层细胞瘤、睾丸生殖细胞瘤、卵巢非成熟型畸胎瘤、骶尾瘤、绒毛膜癌、胎盘部位滋养层细胞瘤、成人上皮细胞瘤、膀胱癌、肝细胞癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、头颈鳞状上皮细胞癌、食道癌、神经原性肿瘤、星形细胞瘤、恶性神经节瘤、神经母细胞瘤。
根据所述的优选实施方案的另一些其他特征，所述癌症是膀胱癌或肝细胞癌。
根据所述的优选实施方案的另一些其他特征，所述能够下调H19mRNA水平和/或活性的物质与其他抗癌剂一起配制。
本发明通过提供单独或联合用于治疗癌症的能够下调H19RNA的核苷酸物质成功解决了目前已知状况的缺点。
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域技术人员公知的相同含义。尽管在本发明的实践或试验中可使用与本文所述的那些相似或等同的方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。本文提到的所有公布、专利申请、专利和其他参考文献通过引用完整并入本申请。在矛盾的情况中，专利说明书，包括定义可控制。另外，所述材料、方法以及实施例仅用作说明而非意于限制。
附图简述
本文仅通过参考附图的举例方式描述了本发明。现在具体提及附图，强调所示细节通过举例说明，并且仅为了描述本发明的优选实施方案，而且出于提供认为是本发明原理和概念方面最有用和容易理解的描述的内容的目的而提供。在这方面，没有试图以比本发明的基本理解所需的更详细的方式显示本发明的结构上的细节，对于附图所作的描述使得本发明的几种形式如何在实践中实施对于本领域技术人员是显而易见的。
在附图中：
图1A-F是描述在人类胚胎和胎盘样品中H19的可选剪接变体的存在的照片和示意图。图1A是显示H19基因位置的11号染色体的示意图，其包括5个外显子(E1-5)(实心框)和4个短内含子(框之间的线)。通过水平箭头标记在PCR反应中使用的引物的位置，它们是转录起始位点下游的117和816位碱基。缺少的剪接片段通过灰色框表示。图1B-D是RT-PCR反应的溴化乙锭染色的凝胶照片。分析了下列细胞：Hep3B和SKHepl(肝细胞癌细胞系)；RT4和Umuc3(膀胱癌细胞系)；胎盘样品：妊娠早期(1sttrim)；胎块，水泡状胎块；妊娠晚期(3rdtrim)；LG-BC，低度恶性膀胱癌；HG-BC，高度恶性膀胱癌；NB，正常膀胱；NC，正常结肠；CClym，转移至淋巴结的结肠癌；CCliv，转移至肝脏的结肠癌；CC，结肠癌；在图1B-D中，由C标记的泳道是指阴性对照；M是指100bp梯标记。产物的大小在右侧显示。图1E是RNA酶保护测定的照片。箭头表示可选的剪接变体344个碱基在妊娠末三个月的胎盘组织中存在。还检测了通过RT-PCR反应不能检测到的表示另一可选的剪接变体存在的两个其他的带。图1F是可选的剪接变体的部分序列分析，揭示了从外显子1开始的366个碱基的跳跃区(skipping region)。下划线的序列表示剪接连接。(核苷酸编号在起始密码子开始)。
图2A-B是溴化乙锭染色凝胶的照片，描述了增加浓度的CoCl2对Hep3B细胞中H19RNA表达水平的影响。图2A描述了Hep3B细胞中H19基因的RT-PCR产物。图2B描述了GADPH基因的RT-PCR产物作为Hep3B细胞中RT-PCR完整性的阳性对照。对于图2A和2B，分别为未处理的Hep3B(泳道1)；50、100、200、300和400μM CoCl2处理的细胞(泳道2、3、4、5及6)。
图3A-F是描述使用本发明的siRNA体外下调H19的效果的条形图和照片。图3A-C是溴化乙锭染色的凝胶，描述了通过RT-PCR分析检测的在正常培养条件(图3A)和低氧模拟条件(图3B)下不同H19siRNA双链体对Hep3B细胞系中H19表达水平的影响。图3A描述了使用非相关的靶向荧光素酶基因的siRNA双链体(泳道1)和使用四种H19siRNA双链体(泳道2-5)(SEQ ID NO：1-4)和它们的等摩尔混合物(泳道6)以及无siRNA的lipofectamine 2000(Mock)(泳道7)转染的Hep3B细胞。注意，所有受检测的siRNA物质(SEQ ID NO：1-4)至少可以50％有效地降低H19的mRNA水平。C＝PCR空白。图3B和3C描述了在正常培养基中使用靶向荧光素酶基因的siRNA双链体(SEQ ID NO：5)(泳道1和5)和使用不同的H19siRNA双链体(SEQ ID NO：1、3及4)(泳道2-4)转染的Hep3B细胞。转染后24小时，更换培养基，并且除了泳道5以外添加含有100μMCoCl2的培养基，泳道5显示了在正常培养基中继续生长的细胞。再培养22小时。显示了H19(图3B)和作为RT-PCR完整性的阳性对照的GADPH(图3C)基因的RT-PCR产物。
图3D-E为溴化乙锭染色的凝胶，描述了通过RT-PCR分析检测的在正常培养条件和低氧条件下H19siRNA双链体(SEQ ID NO：1)对UMUC3细胞系中H19表达水平的影响。对于图3F和3G，分别为在含氧量正常的条件中的GFP siRNA转染的UMUC3细胞(泳道1)和H19siRNA-SEQ IDNO：1(泳道2)，以及在低氧条件中的GFP siRNA转染的UMUC3细胞(泳道3)和H19siRNA(泳道4)。
图3F是条形图，描述了在Hep3B细胞中H19siRNA(SEQ ID NO：3)转染之后低氧恢复后的集落数相对于GFP siRNA对照处理的细胞减少。
图4A-D为条形图和照片，描述了Hep3B细胞中瞬时的H19RNA下调抑制体内肿瘤发生。使用H19siRNA 3(SEQ ID NO：3)或抗-Luc siRNA(SEQ ID NO：5)瞬时转染Hep3B细胞。转染后48小时，使用PBS洗涤细胞两次，使用胰蛋白酶消化并计数。将接受抗H19siRNA和抗-Luc siRNA的1.5×106细胞皮下注射至CD-1裸小鼠的背部(二者均为n＝7，对于转染的模拟物n＝4)。在使用抗-Luc siRNA瞬时转染的Hep3B接种的小鼠中，接种后15天，观察到可触及的肿瘤。随访肿瘤体积并使用测径器测量，直至接种后第30天，之后处死小鼠。观察到平均肿瘤重量(A)(±标准差)和平均肿瘤体积(p＜0.03)(B)(±标准差)显著(p＜0.03)减小约82％。数值表示处死动物之前和之后的端点。还显示了在肿瘤外科暴露之前(C)和它们的体内肿瘤暴露之后(D)各组的2只小鼠的肿瘤的典型特征(1号小鼠和2号小鼠是H19siRNA3(SEQ ID NO：3)处理的动物，3和4号小鼠是抗-LucsiRNA(SEQ ID NO：5)处理的动物)。
图5A-D是条形图和照片，描述了siRNA-H19对人类膀胱癌细胞UMUC3的体内作用。在使用siRNA瞬时转染之后48小时，将1百万个UMUC3细胞皮下注射至无胸腺小鼠(对于GFP siRNA(SEQ ID NO：6)，n＝3，对于siRNA H19(SEQ ID No：1)，n＝5)。在2/3的接受抗GFP-siRNA瞬时转染的UMUC3的小鼠中，6周后观察到可触及的肿瘤，而在接受siRNA H19(n＝5)的那些小鼠中无一观察到可触及的肿瘤。接种后8周处死小鼠。描述了平均的肿瘤体积(B，P＜0.05)和平均的肿瘤重量(A，p＜0.06)。数值表示在处死动物之前和之后的端点。照片描述了使用抗GFP siRNA(C)和siRNAH19(D)转染的UMUC3接种的小鼠肿瘤的外部特征。
图6是条形图，描述了在正常培养条件下，Hep3B细胞中的H19siRNA(SEQ ID NO：3)转染对增殖的影响。
图7A-D是条形图和线图，描述了H19siRNA(SEQ ID NO：1；SEQ IDNO：3)或抗GFP siRNA(SEQ ID NO：6)的瘤内给药对CD-1裸小鼠的先前注射的人类膀胱癌细胞UMUC3(图7A-B)SEQ ID NO：1和Hep3B细胞SEQ ID NO：3(图7C-D)的影响。图7A是线图，描述了在将siRNA-H19(SEQID NO：1)或抗GFP siRNA注射至UMUC-3处理的小鼠之后，肿瘤体积随时间改变。图7B是条形图，描述了在将siRNA-H19或抗GFP siRNA注射至UMUC-3处理的小鼠之后肿瘤重量的变化。图7C是条形图，描述了在将siRNA-H19或抗GFP siRNA注射至Hep3B处理的小鼠之后的肿瘤体积。图7D是条形图，描述了在将siRNA-H19(SEQ ID NO：3)或抗GFP siRNA注射至Hep3B处理的小鼠之后肿瘤重量的变化。
图8A-D是条形图和照片，描述了H19的异位表达对人类膀胱癌细胞TA11(H19阴性)和TA31(H19高表达)体内生长的影响：将等量(2×106)的TA31H19高表达细胞和TA11H19-阴性细胞皮下移植至CD-1小鼠(各自n＝5)。两周后，出现可触及的肿瘤，并使用测径器测量另外2周的肿瘤体积。显示了两组平均肿瘤体积的端点测量值(图8A)，它们的平均肿瘤体积动力学(图8B)以及衍生自TA11H19-阴性(图8C)和TA31H19高表达细胞(图8D)的肿瘤的典型总体形态学。
图9A-C为照片，描述了由Hep3B细胞系的低氧应激诱导H19 RNA，以及针对H19的siRNA非常有效地阻止其诱导。使用抗H19siRNA或抗luc-siRNA接种和转染Hep3B细胞。转染后24小时，将细胞放入Aneoropack矩形瓶(Mitsubishi Chemical Company，Japan)以在1小时内创造类似低氧的条件，或将其放入正常氧浓度下。培养持续24小时，然后进行RNA提取。显示了H19RNA的RT-PCR分析。图9A：分别使用抗luc siRNA(SEQID NO：5)(泳道1、2)和抗H19siRNA(SEQ ID NO：3)(泳道3、4)在正常(泳道1、3)和低氧(泳道2、4)培养条件转染Hep3B细胞。管家基因GAPDH(图9B)和uPAR(图9C)的PCR分析。
优选实施方案的说明
本发明涉及用于下调H19水平和/或活性的核酸物质和药物组合物及其使用方法。特别地，本发明涉及用于治疗癌症的方法和组合物。
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应理解本发明不限于其应用于下列说明中所述或通过实施例举例说明的细节。本发明能够是其他实施方案或以不同方式实践或实施。另外，应理解本文所使用的措辞和术语是为了描述的目的而不应视为是限制。
H19是表现母源单等位基因表达的印迹基因，且很可能不编码蛋白质。它在胚胎发生和胎儿发育过程中丰富表达，但通常在出生后于大部分组织中关闭。然而，在越来越多的不同起源的癌症中，H19RNA的表达上调，并且在某些情况下观察到异常的等位基因表达模式，表明H19在肿瘤发生中起作用。
在简化实践的本发明方法的同时，本发明的发明人通过努力的生物信息学模拟设计了可有效下调H19mRNA的特异性siRNA。使用了四种不同检索引擎选择本发明的siRNA以确保选择最佳siRNA。
如图3A所示，发现所产生的所有siRNA可有效下调H19mRNA。另外，本发明的发明人揭示这些siRNA能够在正常和低氧条件下下调H19mRNA(图3B-E)。这是特别有关联的，因为肿瘤生长与低氧有关，而低氧又与H19RNA的上调有关。
本发明的siRNA能够防止肿瘤形成并甚至通过减小先前建立的肿瘤体积和重量而减轻发展中的疾病。
如实施例4所述，将先前使用H19siRNA转染的人类癌细胞(Hep3B和UMUC3)给药于小鼠，较使用对照siRNA转染的相同细胞给药导致肿瘤重量(图4A和5A)和体积(图4B和5B)非常显著减小。
另外，如实施例6所述，将H19siRNA直接注射至由UMUC3细胞诱导的肿瘤，导致平均肿瘤体积非常显著减小了约90％(图7A)和平均肿瘤重量减小了约88％(图7B)。
在Hep3B诱导的肿瘤中，观察到在H19siRNA的给药后，肿瘤重量约减小40％(图7C)，肿瘤体积减小56％(图7D)。
总而言之，这些结果无疑确定了能够下调H19的物质作为用于预防性和治疗性治疗癌症的现实候选药。
另外，本发明还虑及在联合疗法中使用能够下调H19mRNA的物质。非常确定实体瘤特别是遭遇低氧区域的那些对癌症疗法具有抗性。本发明预期抗H19物质可使患者对先前建立的癌症疗法(如放射疗法，化学疗法)敏感。
因此，根据本发明的一方面，提供了一种制品，其包含能够下调H19mRNA的水平和/或活性的物质和鉴定为用于癌症疗法的其他抗癌剂。
如本文所使用，术语“治疗”是指预防、缓解或减轻与癌症疾病有关的症状。优选地，治疗性治愈，如基本消除与癌症有关的症状。
根据本发明的该方面，可治疗表达H19的任何癌症。根据本发明的方法治疗的优选癌症为在肿瘤发病或进展过程中表达H19mRNA的那些癌症。所述癌症包括但不限于儿童实体瘤、维尔姆斯氏肿瘤、肝母细胞瘤、胚胎性横纹肌肉瘤、生殖细胞瘤、滋养层细胞瘤、睾丸生殖细胞瘤、卵巢非成熟型畸胎瘤、骶尾瘤、绒毛膜癌、胎盘部位滋养层细胞瘤、成人上皮细胞瘤、膀胱癌、肝细胞癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、头颈鳞状上皮细胞癌、食道癌、神经原性肿瘤、星形细胞瘤、恶性神经节瘤、神经母细胞瘤。优选地，所述肿瘤为膀胱癌或肝细胞癌。
如本文所使用，术语“受治疗者”是指任何(如哺乳动物)受治疗者，优选人类受治疗者。
如本文所使用，术语“H19mRNA”是指H19基因的转录产物(GenBank登录号M32053-SEQ ID NO：7)。
本发明已经通过RT-PCR分析(图1B-D)和RNA酶保护测定(图1E)鉴定了H19RNA基因的新型剪接异构体，其在胚胎组织中特异性表达并在癌症细胞中不表达。该新型的剪接异构体显示与SEQ ID NO：7所列的已知H19转录物相比，缺失从转录起始位点的252至588位核苷酸延伸的外显子1的部分。因此，本发明该方面的H19RNA优选包含H19转录物的外显子1，并甚至更优选包含由SEQ ID NO：7的252至588位核酸序列等同物表示的RNA序列。
由于H19不编码蛋白质，下调H19mRNA的水平或活性优选在RNA水平起作用。
优选地，被下调的H19的水平或活性大于10％，更优选大于20％，更优选大于40％，更优选大于60％，更优选大于80％，甚至更优选大于100％。
优选地，所述物质为核酸物质。更优选地，所述物质是寡核苷酸，最优选地为双链寡核苷酸。
H19mRNA的水平的降低可通过下列几种机制实现：通过抑制从H19基因至H19RNA的转录；通过抑制hnRNA至mRNA的成熟过程；通过酶促进细胞质中mRNA的降解(通过形成RNA双链体或三链体；以及通过基于核酸的酶(DNA酶和RNA酶)的催化性剪切)。
因此，根据本发明的抗H19mRNA物质可选自下列：
1)空间抑制H19RNA从其基因转录的单链核酸序列；
2)与H19RNA杂交而导致酶解(例如通过RNA酶)的单链核酸序列；
3)导致H19降解(通过形成siRNA)的双链核酸序列；
4)剪切H19mRNA的催化核酸序列；
5)形成三链体的核苷酸；
6)与H19mRNA杂交从而导致H19mRNA活性减小的单链核酸序列；以及
7)编码(1)至(6)任一者的核酸序列。
根据本发明该方面的一个实施方案，所述物质是一种核酸物质，其含有如上所述能够特异性与本发明的H19RNA杂交(例如，生理条件下在细胞中)的核酸序列。
如本文所使用，术语“核酸物质”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的单链或双链寡聚物或聚合物。该术语包括由自然存在的碱基、糖以及共价的核苷间键合(如骨架)组成的多核苷酸，以及具有与各天然存在部分相似地起作用的非天然存在部分的多核苷酸。
如本文所使用，术语“能够杂交”是指碱基配对，其中所述核酸物质的至少一条链至少部分与H19mRNA同源。
优选地，本发明的核酸物质特异性与本发明的H19RNA杂交，即与非相关的RNA分子(如GAPDH)相比至少5倍优先与H19RNA杂交。
根据本发明教导内容设计的核酸物质可根据本领域已知的任何核酸合成方法产生，包括酶催化合成或固相合成。实施固相合成的设备和试剂可从例如Applied Biosystems商购获得。所述合成的任何其他方法也可以应用，所述核酸物质的实际合成很好地在本领域技术人员的能力范围内，并可经由下列参考文献详细描述的确定的方法而实现：例如，Sambrook，J.和Russell，D.W.(2001)，″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″；Ausubel，R.M.等，编辑(1994，1989)，″Current Protocols in Molecular Biology，″I-III卷，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland；Perbal，B.(1988)，″A PracticalGuide to Molecular Cloning，″John Wiley和Sons，New York；以及Gait，M.J.，编辑(1984)，″Oligonucleotide Synthesis″；还可以通过下述方法实现：使用固相化学，例如氰乙基亚磷酰胺，之后脱保护、脱盐以及通过例如自动的三苯甲基方法(trityl-on method)或HPLC来纯化。
应知道本发明的核酸物质还可使用下文进一步所述的表达载体产生。
优选地，对本发明的核酸物质进行修饰，所述核酸物质可使用本领域已知的多种方法进行修饰。
例如，本发明的核酸物质可包含在3′-至-5′磷酸二酯键成键的杂环核苷，所述杂环核苷包括嘌呤和嘧啶碱基。
优选使用的核酸物质为如下文广泛描述的在骨架、核苷间键合或碱基内修饰的那些。
根据本发明的该方面有用的优选核酸物质的具体实例包括含有修饰的骨架或非天然核苷间键合的寡核苷酸或多核苷酸。具有修饰的骨架的寡核苷酸或多核苷酸包括在骨架中保留磷原子的那些，如下述美国专利所公开的：No.4,469,863；No.4,476,301；No.5,023,243；No.5,177,196；No.5,188,897；No.5,264,423；No.5,276,019；No.5,278,302；No.5,286,717；No.5,321,131；No.5,399,676；No.5,405,939；No.5,453,496；No.5,455,233；No.5,466,677；No.5,476,925；No.5,519,126；No.5,536,821；No.5,541,306；No.5,550,111；No.5,563,253；No.5,571,799；No.5,587,361；以及No.5,625,050。
优选的修饰的寡核苷酸骨架包括，例如：磷硫酰；手性磷硫酰；二硫代磷酸酯；磷酸三酯；氨烷基磷酸三酯；甲基膦酸酯和其他烷基膦酸酯，包括3′-烯基膦酸酯和手性膦酸酯；次磷酸酯；氨基磷酸酯，包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯；硫羰氨基磷酸酯；硫羰烷基氨基磷酸酯；硫羰烷基磷酸三酯；以及具有正常3′-5′键的硼烷磷酸酯(boranophosphate)，其2′-5′连接类似物，以及具有反向极性的那些，其中相邻的核苷单元对为3′-5′至5′-3′或2′-5′至5′-2′连接。还可以使用上述修饰的各种盐、混合盐和自由酸形式。
可选地，其中不包括磷原子的修饰的寡核苷酸骨架具有通过短链烷基或环烷基核苷间键合、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键合或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键合形成的骨架。这些包括具有吗啉代键(部分从核苷的糖部分形成)的骨架、硅氧烷骨架、硫化物、亚砜以及砜骨架；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基骨架；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基骨架；含有烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚胺基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺胺骨架；酰胺骨架；以及其他具有混合的N、O、S以及CH2构成部分的那些，如下列美国专利所公开的：No.5,034,506；No.5,166,315；No.5,185,444；No.5,214,134；No.5,216,141；No.5,235,033；No.5,264,562；No.5,264,564；No.5,405,938；No.5,434,257；No.5,466,677；No.5,470,967；No.5,489,677；No.5,541,307；No.5,561,225；No.5,596,086；No.5,602,240；No.5,610,289；No.5,602,240；No.5,608,046；No.5,610,289；No.5,618,704；No.5,623,070；No.5,663,312；No.5,633,360；No.5,677,437；以及No.5,677,439。
根据本发明可使用的其他核酸物质为在糖和核苷间键合中修饰的那些，即核苷酸单位的骨架被新的基团代替。碱基单位被保留以用于与合适的多核苷酸靶互补。所述寡核苷酸模拟物的实例包括肽核酸(PNA)。PNA寡核苷酸是指其中糖骨架被含有酰胺的骨架、特别是氨基乙基甘氨酸骨架代替的寡核苷酸。碱基保留，并直接或间接与骨架的酰胺部分的氮杂氮原子结合。教导PNA化合物的制备的美国专利包括但不限于美国专利No.5,539,082；No.5,714,331以及No.5,719,262，这些美国专利各自通过引用并入本申请。可用于本发明的其他骨架修饰在美国专利No.6,303,374中公开。
本发明的核酸物质还可包括碱基修饰或取代。如本文所使用，“未修饰的”或“天然的”碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，和嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)以及尿嘧啶(U)。“修饰的”碱基包括但不限于其他合成的和天然的碱基，例如：5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物；2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶以及2-硫胞嘧啶；5-卤代尿嘧啶和5-卤代胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶以及6-偶氮胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫烷基、8-羟基以及其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；5-卤代、特别是5-溴代、5-三氟甲基以及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤；7-去氮杂鸟嘌呤和7-去氮杂腺嘌呤；以及3-去氮杂鸟嘌呤和3-去氮杂腺嘌呤。其他修饰的碱基包括下列文献公开的那些：美国专利No.3,687,808；Kroschwitz，J.L，ed.(1990)，″The ConciseEncyclopedia Of Polymer Science And Engineering，″第858-859页，JohnWiley和Sons；Englisch等(1991)，″Angewandte Chemie，″InternationalEdition，30，613；和Sanghvi，Y.S.，″Antisense Research and Applications，″第15章，第289-302页，S.T.Crooke和B.Lebleu，编辑，CRC Press，1993。这些修饰的碱基特别用于增加本发明的寡聚化合物的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶，以及N-2、N-6和O-6-取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤，5-丙炔基尿嘧啶，以及5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代显示可增加核酸双链体稳定性0.6-1.2℃(Sanghvi，Y.S.等，(1993)，″Antisense Research and Applications，″第276-278页，CRC Press，BocaRaton)，并且是目前优选的碱基取代，甚至更特别地当与2′-O-甲氧乙基糖修饰结合时。
本发明的核酸物质为可特异性与H19RNA杂交的至少10、至少15或至少17个碱基。如实施例1所述，本发明的siRNA为具有两个3′悬突的19个碱基。
应知道本发明还虑及能够下调H19RNA的除了核酸物质以外的物质，例如敲除物质。
小干扰RNA(siRNA)分子为能够下调H19RNA的核酸物质的实例。RNA干扰为两步骤过程。在被称为起始步骤的第一步骤过程中，输入的dsRNA被消化成21-23个核苷酸(nt)的小干扰RNA(siRNA)，这可能是通过dsRNA特异性RNA酶的RNase III家族成员Dicer的作用，所述Dicer以ATP依赖性方式剪切dsRNA(直接引入或经由表达载体、表达盒或病毒引入)。连续的剪切事件将RNA降解成19-21bp双链体(siRNA)，其中各链具有2-核苷酸3′悬突(Hutvagner和Zamore Curr.Opin.Geneticsand Development 12：225-232(2002)；以及Bernstein Nature 409：363-366(2001))。
在效应因子步骤中，siRNA双链体与核酸酶复合物结合形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)。需要siRNA双链体的ATP依赖性解旋用于激活RISC。然后，有活性的RISC通过碱基配对相互作用靶向同源转录物，并从siRNA的3′末端将mRNA剪切成12个核苷酸片段(Hutvagner和ZamoreCurr.Opin.Genetics and Development 12：225-232(2002)；Hammond等，(2001)Nat.Rev.Gen.2：110-119(2001)；以及Sharp Genes.Dev.15：485-90(2001))。尽管剪切的机制仍有待于解释，但研究表明各RISC含有单个的siRNA和RNA酶(Hutvagner和Zamore Curr.Opin.Genetics andDevelopment 12：225-232(2002))。
通过提供前述的siRNA消除“起始步骤”是可能的。
因为RNA干扰的显著潜能，提议了在RNA干扰途径中的扩增步骤。扩增可通过可以产生更多的siRNA的输入dsRNA的拷贝而发生，或通过形成的siRNA的复制而发生。可选地或另外地，扩增可通过RISC的多个轮回事件而发生(Hammond等，Nat.Rev.Gen.2：110-119(2001)，Sharp Genes.Dev.15：485-90(2001)；Hutvagner和Zamore Curr.Opin.Genetics andDevelopment 12：225-232(2002))。对于关于RNA干扰(RNAi)的更多信息，参见下列评述：Tuschl ChemBiochem.2：239-245(2001)；Cullen Nat.Immunol.3：597-599(2002)；和Brantl Biochem.Biophys.Act.1575：15-25(2002)。
适用于本发明的RNA干扰分子的合成可如下实现。首先，向下游扫描H19核酸序列靶的AA二核苷酸序列。将各AA和3′邻近的19个核苷酸的存在记录为潜在的siRNA靶位点。
其次，使用任何序列比对软件，例如NCBI服务器的BLAST软件(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，将潜在的靶位点与合适的基因组数据库(如人类、小鼠、大鼠等)进行比较。过滤出显示与其他编码序列具有显著同一性的推定的靶位点。
将合格的靶序列选为siRNA合成的模板。优选的序列为包括低G/C含量的那些，这是因为这些已经证明比具有高于55％的G/C含量的那些能更有效介导基因沉默。沿着用于评价的靶基因的长度优选选择几个靶位点。为了更好地评价所选择的siRNA，优选结合使用阴性对照。阴性对照siRNA优选包括与siRNA相同但与基因组无显著同一性的核苷酸组合物。因此，优选使用乱序的siRNA的核苷酸序列，条件是它不显示与任何其他基因具有显著同一性。
根据本发明的该方面可使用的能够下调H19的siRNA的实例为SEQID NO：1-4所列的那些。
由于这些分子显示为可有效减小肿瘤大小和体积，本发明还虑及单独和非必需地联合使用这些分子治疗癌症。
能够下调H19RNA表达的另一种物质为能够特异性剪切其编码多核苷酸的DNA酶分子。DNA酶为能够剪切单链和双链靶序列的单链核酸物质(Breaker，R.R.和Joyce，G.Chemistry and Biology 1995；2：655；Santoro，S.W.和Joyce，G.F.Proc.Natl，Acad.Sci.USA 1997；94：4262)。已经提出了DNA酶的普通模型(″10-23″模型)。″10-23″DNA酶具有15个脱氧核糖核苷酸的催化结构域，其侧邻两个各自具有7至9个脱氧核糖核苷酸的底物识别结构域。该类型的DNA酶可有效在嘌呤：嘧啶连接处催化其底物RNA(Santoro，S.W.和Joyce，G.F.Proc.Natl，Acad.Sci.USA 199；对于DNA酶的评述，参见Khachigian，LM(Curr Opin Mol Ther 4：119-21(2002))。
识别单链和双链靶剪切位点的合成的工程DNA酶的构建和扩增的实例公开于授予Joyce等的美国专利No.6,326,174。最近观察到靶向人类尿激酶的相似设计的DNA酶可以抑制尿激酶受体表达，并在体内成功抑制结肠癌细胞转移(Itoh等，20002，Abstract 409，Ann Meeting Am Soc Gen Therwww.asgt.org)。在另一个应用中，与bcr-ab1癌基因互补的DNA酶可成功抑制白血病细胞中的癌基因表达，并减小慢性髓细胞性白血病(CML)和急性淋巴细胞性白血病(ALL)的自身骨髓移植术的复发率。
能够下调H19RNA的另一种物质是能够特异性剪切其编码多核苷酸的核酶分子。核酶通过剪切编码感兴趣的蛋白的mRNA越来越多应用于基因表达的序列特异性抑制(Welch等，Curr Opin Biotechnol.9：486-96(1998))。设计剪切任何特异性靶RNA的核酶的可能性使得它们成为在基础研究和治疗应用中有价值的工具。在治疗领域中，核酶已经被开发用于靶向感染性疾病中的病毒RNA、癌症中的显性癌基因和遗传性疾病中的特异性体细胞突变(Welch等，CHn Diagn Virol.10：163-71(1998))。最值得注意的是，用于HIV患者的几种核酶基因疗法方案已经处于1期试验。最近，核酶已经用于转基因动物研究，基因靶确认和途径说明。几种核酶处于不同阶段的临床试验。ANGIOZYME是第一种在人类临床试验中研究的化学合成的核酶。ANGIOZYME特异性抑制血管发生途径中的关键成分VEGF-r(血管内皮生长因子受体)的形成。Ribozyme Pharmaceuticals公司以及其他公司已经证明了动物模型中抗血管生成治疗的重要性。发现被设计成选择性破坏丙型肝炎病毒(HCV)RNA的核酶HEPTAZYME可有效减少细胞培养测定中的丙型肝炎病毒RNA(Ribozyme Pharmaceuticals公司，http://www.rpi.com/index.html)。
下调H19RNA的其他方法是经由形成三链体的寡核苷酸(TFO)。在最近十年中，研究显示可设计可以以序列特异性方式识别和结合双链螺旋DNA中的多嘌呤/多嘧啶区域的TFO。因此，可靶向编码本发明的H19RNA的DNA序列，由此下调RNA分子。
支配TFO的识别规则由下列文献描述：Maher III，L.J.，等，Science(1989)245：725-730；Moser，H.E.，等，Science(1987)238：645-630；Beal，P.A.，等，Science(1991)251：1360-1363；Cooney，M.，等，Science(1988)241：456-459；以及Hogan，M.E.，等，欧洲公布375408。寡核苷酸的修饰，例如引入插入剂和骨架取代，以及结合条件的优化(pH和阳离子浓度)有助于克服TFO活性的固有障碍，例如电荷排斥和不稳定性，并且最近显示合成的寡核苷酸可靶向特异的序列(对于最近的评述，参见Seidman和Glazer(2003)J Clin Invest；112：487-94)。
通常，形成三链体的寡核苷酸具有下列对应序列：
寡核苷酸：3′--A G G T
二链体：  5′--A G C T
二链体：  3′--T C G A
然而，已经显示A-AT和G-GC三联体具有最大的三联螺旋稳定性(Reither和Jeltsch(2002)，BMC Biochem，，Septl2，Epub)。相同的作者已经证明根据A-AT和G-GC规则设计的TFO不形成非特异性三联体，表明三联体形成确实是序列特异性的。
因此，对于调节区中的任何给定的序列，可设计形成三链体的序列。形成三链体的寡核苷酸优选至少15、更优选25、更优选30或更多核苷酸长度，直至50或100bp。
使用TFO转染细胞(例如经由阳离子脂质体)和随后与靶DNA形成三联螺旋结构，诱导了空间和功能变化，阻碍转录起始和延长，使得在内源性DNA中引入所需序列变化并导致基因表达的特异性下调。在使用TFO处理的细胞中基因表达的这种抑制的实例包括哺乳动物细胞中脂质体supFGl和内源性HPRT基因的敲除(Vasquez等，Nucl Acids Res.(1999)27：1176-81，和Puri，等，J Biol Chem，(2001)276：28991-98)，和在胰腺癌病因中重要的Ets2转录因子表达的序列特异性和靶特异性下调(Carbone等，Nucl Acid Res.(2003)31：833-43)，以及前炎症ICAM-1基因表达的序列特异性和靶特异性下调(Besch等，J Biol Chem，(2002)277：32473-79)。另外，Vuyisich和Beal最近表明序列特异性TFO可结合dsRNA，抑制dsRNA依赖性酶如RNA依赖性激酶的活性(Vuyisich和Beal，Nuc.Acids Res(2000)；28：2369-74)。
另外，根据上述原理设计的TFO可诱导定向诱变，所述定向诱变能够产生DNA修复，因此提供内源性基因表达的下调和上调(Seidman和Glazer，J Clin Invest(2003)112：487-94)。有效TFO的设计、合成以及给药的详细说明可见于Froehler等的美国专利申请No.2003 017068和2003 0096980，Emanuele等的美国专利申请No.2002 0128218和2002 0123476，Lawn的美国专利No.5,721,138。
应知道能够与H19mRNA杂交的核酸物质可以通过防止H19mRNA与其他下游物质结合而下调其活性。
如上所述，本发明的核酸物质(例如siRNA分子，如SEQ ID NO：1、2、3或4所列的那些)可以在细胞中表达。
应该知道本发明物质可以直接在受治疗者中表达(如体内基因疗法)或可以在细胞系统中活体外表达(自体或非自体)且然后给药于受治疗者。
为了在哺乳动物细胞中表达这种物质(即以产生RNA分子)，编码本发明物质的核酸序列优选与适于哺乳动物细胞表达的核酸构建体连接。所述核酸构建体包括以组成型或诱导型引导细胞中的多核苷酸序列转录的启动子序列。
适用于本发明的组成型启动子是在大多数环境条件下和大多数类型的细胞例如细胞巨化病毒(CMV)和鲁斯氏肉瘤病毒(RSV)中具有活性的启动子序列。适用于本发明的诱导型启动子包括例如四环素可诱导的启动子(Zabala M，等，Cancer Res.2004，64(8)：2799-804)。
本发明的核酸构建体(本文也称为“表达载体”)包括使得这种载体适于在原核细胞、真核细胞或优选二者中复制和整合的其他序列(如穿梭载体)。另外，典型的克隆载体也可含有复制和翻译起始序列、转录和翻译终止子和多聚腺苷酸化信号。
真核细胞启动子通常含有两种识别序列，TATA盒和上游的启动子元件。认为位于转录起始位点上游的25-30碱基对的TATA盒与引导RNA聚合酶启动RNA合成有关。其他上游启动子元件决定转录起始的速率。
优选地，本发明的核酸构建体使用的启动子在所转化的特异性细胞群中具有活性。细胞类型特异性和/或组织特异性启动子的实例包括例如肝脏特异性的白蛋白启动子(Pinkert等，(1987)Genes Dev.1：268-277)，淋巴细胞特异性启动子(Calame等，(1988)Adv.Immunol.43：235-275)，特别是T细胞受体启动子(Winoto等，(1989)EMBO J.8：729-733)和免疫球蛋白启动子(Banerji等(1983)Cell 33729-740)，神经元特异性启动子例如神经微丝启动子(Byrne等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5473-5477)，胰腺特异性启动子(Edlunch等(1985)Science 230：912-916)或乳腺特异性启动子例如乳清启动子(美国专利No.4,873,316和欧洲申请公布No.264,166)。
增强子元件可刺激从连接的同源性或异源性启动子转录达1,000倍。当增强子位于自转录起始位点的下游或上游时是具有活性的。许多衍生自病毒的增强子元件具有广泛的宿主范围并且在多种组织中具有活性。例如，SV40早期基因增强子适于许多细胞类型。适于本发明的其他增强子/启动子组合包括衍生自多瘤病毒、人类或鼠巨细胞病毒(CMV)的那些，各种逆转录病毒例如鼠白血病病毒、鼠肉瘤病毒或鲁斯氏肉瘤病毒以及HIV的长期复制子。参见，Enhancers and Eukaryotic Expression，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.1983，该文献通过引用并入本申请。
在表达载体的构建中，启动子优选位于约与自其天然配置中转录起始位点的距离相同的自异源转录起始位点的距离。然而，如本领域已知的，该距离中的一些变化可调节，而不丧失启动子的功能。
也可以将多聚腺苷酸序列添加至表达载体以增加RNA稳定性(Soreq等，1974；J.Mol Biol.88：233-45)。
需要两种不同的序列元件用于准确和有效的多聚腺苷酸化：位于多聚腺苷酸化位点下游的GU或U丰富的序列和位于上游11-30核苷酸的6个核苷酸AAUAAA的高保守序列。适于本发明的终止和多聚腺苷酸化信号包括衍生自SV40的那些。
除了已描述的元件，本发明的表达载体通常含有其他特化的元件，所述元件意于增加克隆的核酸的表达水平或促进携带重组DNA的细胞的鉴定。例如，多种动物病毒含有促进容许细胞中病毒基因组的额外的染色体复制的DNA序列。只要质粒上携带或宿主细胞的基因组具有的基因提供了合适的因子，携带这些病毒复制子的质粒就游离复制。
载体可包括或不包括真核复制子。如果真核复制子存在，那么使用合适的可选择标记，载体可在真核细胞中复制。如果载体不包含真核复制子，游离复制是不可能的。相反，重组DNA整合至工程细胞的基因组中，其中启动子引导所需核酸的表达。
哺乳动物表达载体的实例包括但不限于可从Invitrogen获得的pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、pZeoSV2(+/-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMTl、pNMT41、pNMT81，可从Promega获得的pCI，可从Strategene获得的pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV，可从Clontech获得的pTRES，以及它们的衍生物。
还可以使用含有真核病毒例如逆转录病毒的调节元件的表达载体。SV40载体包括pSVT7和pMT2。衍生自牛乳头状瘤病毒的载体包括pBV-IMTHA，衍生自EB病毒(Epstein Bar virus)的载体包括pHEBO和p2O5。其他实例性载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE，以及在SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或在真核细胞中显示有效表达的其他启动子的引导下使得蛋白质表达的任何其他载体。
如上所述，病毒是进化成在许多情况下逃避宿主防御机制的非常特化的感染因子。通常，病毒在特异的细胞类型中感染和繁殖。病毒载体的靶向特异性利用了其特异性靶向预定的细胞类型的天然特异性，由此将重组基因引入感染的细胞。因此，本发明使用的载体类型取决于所转化的细胞类型。根据所转化的细胞类型选择合适的载体的能力很好地在本领域普通技术人员的能力范围内，本文不提供选择考虑因素的一般描述。例如，骨髓细胞可使用I型人类T细胞白血病病毒(HTLV-I)靶向，肾脏细胞可使用存在于杆状病毒苜蓿银纹夜蛾(Autographa california)核型多角体病毒(AcMNPV)中的异源启动子靶向，如Liang CY等，2004(Arch Virol.149：51-60)所述。
由于重组病毒载体提供诸如横向感染和靶向特异性的优点，可用于本发明的H19下调物质的体内表达。横向感染是例如逆转录病毒的生命周期中固有的，是单个感染的细胞产生许多萌芽的子代病毒颗粒并感染邻近细胞的过程。结果是大面积迅速受感染，其中大部分不是由原始的病毒颗粒起始感染的。这与其中感染因子近通过子代传播的垂直型感染大不相同。还可以制备不能横向传播的病毒载体。如果所需目的是将特定基因仅引入局限数量的靶细胞中，这些特征是有用的。
各种方法可用于将本发明的表达载体引入细胞。这些方法通常描述于：Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringsHarbor Laboratory，New York(1989，1992)；Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley和Sons，Baltimore，Md.(1989)；Chang等，Somatic Gene Therapy，CRC Press，Ann Arbor，Mich.(1995)；Vega等，GeneTargeting，CRC Press，Ann Arbor Mich.(1995)；Vectors：A Survey ofMolecular Cloning Vectors and Their Uses，Butterworths，Boston Mass.(1988)；以及Gilboa等，(Biotechniques 4(6)：504-512，1986)，并且包括，例如稳定转染或瞬时转染、脂质体转染、电穿孔和使用重组病毒载体感染。另外，参见美国专利No.5,464,764和5,487,992的阳性-阴性选择方法。
通过病毒感染引入核酸提供了优于其他方法如脂质体转染和电穿孔的几种优点，这是因为由于病毒的感染性质，可获得较高的转染效率。
目前优选的体内核酸转移技术包括使用病毒或非病毒构建体例如腺病毒、慢病毒、I型单纯疱疹病毒或腺病毒相关病毒(AAV)和基于脂质的系统的转染。对于基因的脂质介导的转移有用的脂质为例如DOTMA、DOPE以及DC-Chol(Tonkinson等，Cancer Investigation，14(1)：54-65(1996))。用于基因疗法的最优选的构建体为病毒，最优选腺病毒、AAV、慢病毒或逆转录病毒。病毒构建体例如逆转录病毒构建体包括至少一个转录启动子/增强子或基因座限定的元件，或通过其他方式例如交替剪接、核RNA输出或信使的翻译后修饰来控制基因表达的其他元件。所述载体构建体还包括包装信号，长末端重复(LTR)或其部分，以及适于所使用的病毒的正链和负链引物结合位点，除非它已经存在于病毒构建体内。任选地，构建体还可以包括引导多聚腺苷酸化的信号，以及一个或多个限制性位点。通过举例，所述构建体通常包括5′LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二链DNA合成的起点，以及3′LTR或其部分。其他可使用的载体为非病毒载体，例如阳离子脂质体，聚赖氨酸以及树状聚体。
除了含有用于插入的编码序列转录的必需元件外，本发明的表达构建体还可以包括被设计以增强表达的RNA的稳定性、产生、纯化、产率或毒性的序列。
如上所述，能够下调H19mRNA的物质可用于单独治疗癌症(如本发明的siRNA)或联合所述疾病的其他确立的或实验性治疗方案治疗癌症。本发明的发明人虑及能够下调H19mRNA的物质可与其他治疗方法或组合物协同起作用，因此具有显著减小所述治疗的有效临床剂量的潜能，由此减轻通常具有破坏性的消极副作用，和治疗的高代价。这可特别与治疗与低氧区有关的实体瘤相关，由此现有确立的化学疗法和放射疗法方案是无效的。
本发明物质可在癌症疗法之前、同时或之后给药。
如本文所使用，术语“癌症疗法”是指可预防、缓解或减轻癌症疾病相关的症状的任何治疗。
适于与本发明物质或编码所述物质的多核苷酸联合用于治疗癌症的治疗方案包括但不限于化学疗法、放射疗法、光疗和光动力疗法、手术、营养疗法、烧蚀疗法、放射疗法和化学疗法联合、臂疗法(brachiotherapy)、质子束疗法、免疫疗法、细胞疗法和光子束放射手术疗法。适于与本发明物质联合用于治疗癌症的其他形式的治疗方案是进行能够调节已知与癌症调节或血管发生调节途径有关的基因的核苷酸物质的给药。
可与本发明化合物联合给药的抗癌药物(即化学治疗剂)包括但不限于：阿西维辛、阿柔比星、盐酸阿考达唑、阿克罗宁、阿霉素、阿多来新、阿地白介素、六甲密胺、安波霉素、醋酸双氢胺蒽醌、氨鲁米特、安吖啶、阿那曲唑、安曲霉素、门冬酰胺酶、曲林菌素、阿扎胞苷、阿扎替派、固氮霉素、巴马司他、苯佐替派、比卡鲁胺、盐酸比生群、二甲磺酸双奈法德、比折来新、硫酸博来霉素、布喹那钠、溴匹立明、白消安、放线菌素C、卡普睾酮、卡醋胺、卡贝替姆、卡铂、卡莫司汀、盐酸卡柔比星、卡折来新、西地芬戈、苯丁酸氮芥、西罗里霉素、顺铂、克拉屈滨、磺酸克立那托、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、盐酸柔红霉素、地西他滨、右奥马铂、地扎胍宁、磺酸地扎胍宁、地吖醌、多西他奇、多柔比星、盐酸多柔比星、屈洛昔芬、柠檬酸屈洛昔芬、丙酸甲雄烷酮、偶氮霉素、依达曲沙、盐酸依氟鸟氨酸、依沙芦星、恩洛铂、恩普氨酯、依匹哌啶、盐酸表柔比星、厄布洛唑、盐酸依索比星、雌莫司汀、雌莫司汀磷酸钠、依他硝唑、依托泊苷、磷酸依托泊苷、氯苯乙嘧胺、盐酸法倔唑、法扎拉滨、芬维A胺、氟脲苷、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟西他滨、磷喹酮、福司曲星钠、吉西他滨、盐酸吉西他滨、羟基脲、盐酸去甲氧基柔红霉素、异环磷酰胺、伊莫福新、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-nl、干扰素α-n3、干扰素β-Ia、干扰素γ-Ib、异丙铂、盐酸伊立替康、醋酸兰瑞肽、来曲唑、醋酸亮丙瑞林、盐酸利阿唑、洛美曲索钠、洛莫司汀、盐酸洛索蒽醌、马索罗酚、美坦生、盐酸氮芥、醋酸甲地孕酮、醋酸美仑孕酮、美法仑、美诺立尔、巯嘌呤、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤钠、氯苯氨啶、美妥替哌、米丁度胺、米托克星、丝裂红素、丝裂吉菌素、丝裂马菌素、丝裂霉素C、米托司培、米托坦、盐酸米托蒽醌、麦考酚酸、诺考达唑、诺加霉素、奥马铂、亚磺酰吡啶、紫杉醇、培门冬酶、佩利霉素、奈莫司汀、硫酸培来霉素、培磷酰胺、哌泊溴烷、哌泊舒凡、盐酸吡罗蒽醌、光辉霉素、普洛美坦、卟吩姆钠、罗迈新、泼尼莫司汀、盐酸丙卡巴肼、博罗霉素、盐酸博罗霉素、吡唑呋喃菌素、利波腺苷、罗谷亚胺、沙芬戈、盐酸沙芬戈、司莫司汀、辛曲秦、磷乙酰天冬氨酸钠、稀疏霉素、盐酸锗螺胺、螺莫司汀、螺铂、链黑菌素、链唑霉素、磺氯苯脲、他利霉索、紫杉酚、替可加兰钠、喃氟啶、盐酸替洛蒽醌、替莫泊芬、替尼泊苷、替罗昔隆、睾内酪、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、塞替派、噻唑呋林、替拉扎明、盐酸拓扑替康、枸橼酸托瑞米芬、曲托龙、磷酸曲西立滨、三甲曲沙、葡萄糖醛酸三甲曲沙、曲普瑞林、盐酸妥布氯唑、乌拉莫司汀、乌瑞替派、伐普肽、维替泊芬、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、长春地辛、硫酸长春地辛、硫酸长春匹定、硫酸长春甘酯、硫酸长春罗新、酒石酸长春瑞滨、硫酸长春瑞滨、硫酸长春利定、伏氯唑、折尼铂、净司他丁、盐酸佐柔比星。其他抗肿瘤物质包括公开于Antineoplastic Agents(Paul Calabresi和Bruce A.Chabner)第52章，及其序论，1202-1263，Goodman和Gilman的″ThePharmacological Basis of Therapeutics″，第八版，1990，McGraw-Hill公司(Health Professions Division)的那些。
如果需要，本发明物质可以以包含含有本发明物质的一个或多个单位剂型的包装或分散装置提供，例如FDA批准的试剂盒。所述物质可以单包装与另外的抗癌剂一起配制，或者所述物质可以以分开的包装与另外的抗癌剂分开配制。所述包装可以包含例如金属或塑料箔，例如泡罩包装。所述包装或分散装置可以附带给药的说明书。所述包装或分散装置还可以以管理药剂的制造、使用或销售的政府机构建议的形式附带与容器相关的通告，所述通告是由组合物或人类或兽医给药的形式的机构批准的。所述通告可以例如是美国食品药品管理局批准用于处方药而贴上标签，或者是批准的产品插入物。在相容的药物载体中配制的包含本发明物质的组合物还可以制备、放置于合适的容器中，并被贴上标签用于治疗癌症。
本发明物质可自身给药于受治疗者，或者于混合有合适的载体或赋形剂的药物组合物中给药于受治疗者。
如本文所使用，“药物组合物”是指本文所述的一种或多种活性成分与其他化学成分例如生理学上合适的载体和赋形剂的制品。药物组合物的目的是便于化合物至生物体的给药。
本文中术语“活性成分”是指具有抗癌作用的物质。
下文中，可互换使用的术语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”是指不会对生物体造成显著刺激并且不消除所给药的化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。助剂包括在这些术语中。
本文中，术语“赋形剂”是指添加至药物组合物以进一步便于活性成分给药的惰性物质。非限制地，赋形剂的实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和多种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
药物配制和给药的技术可见于″Remington′s Pharmaceutical Sciences，″Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版，其内容通过引用并入本申请。
合适的给药途径可包括例如口服，直肠，经粘膜，特别是经鼻粘膜，肠内递送，或胃肠外递送，包括肌肉、皮下和髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
或者，可以以局部而非全身的方式进行所述药物组合物的给药，例如通过直接将所述药物组合物注射至肿瘤内(即原位)。
本发明的药物组合物可以通过本领域公知的方法制备，例如通过传统的混合、溶解、制粒、制糖衣、磨细、乳化、包胶、包埋或低压冻干方法。
根据本发明应用的药物组合物可通过传统方法使用一种或多种生理学上可接受的载体包括赋形剂和助剂来配制，它们可促进所述活性成分加工成可在药学上使用的物质。合适的物质取决于所选的给药途径。
对于注射，所述药学组合物的活性成分可以配制于水溶液，优选生理学上相容的缓冲剂，例如汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲剂。对于经粘膜给药，适于穿透屏障的穿透剂用于所述物质。所述穿透剂为本领域公知。
对于口服给药，可以通过将所述活性化合物与本领域公知的药学上可接受的载体组合而容易地配制所述药物组合物。所述载体能够使药物组合物配制成片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮剂等，以用于患者口服摄取。用于口服的药物物质可使用固体赋形剂制备，任选地，如需要，在添加合适的助剂之后研磨最终的混合物，并加工粒料的混合物，获得片剂或锭剂核。合适的赋形剂，特别是：填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖或山梨糖；纤维素物质，例如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理学上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯酮(PVP)。如需要，可添加崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯酮、琼脂，或海藻酸或其盐，如海藻酸钠。
锭剂核使用合适的包衣提供。为此目的，可使用浓缩的糖溶液，所述糖溶液可任选含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可添加染料或颜料至片剂或锭剂包衣以用于鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。
可口服使用的药物组合物，包括明胶制成的推合(push-fit)式胶囊以及明胶和增塑剂如丙三醇或山梨糖醇制成的软封装胶囊。推合式胶囊可含有活性成分混合诸如乳糖的填充剂、诸如淀粉的粘合剂、诸如滑石或硬脂酸镁的润滑剂，以及任选的稳定剂。在软胶囊中，活性成分可溶解或悬浮于合适的液体，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可添加稳定剂。所有用于口服给药的物质可为适于所选给药途径的剂量。
对于口腔含化给药，所述组合物可采用以传统方法配制的片剂或锭剂的形式。
对于通过鼻吸入给药，根据本发明使用的活性成分可以以使用合适的抛射剂的加压包装或喷雾器的气雾剂喷雾提供形式来递送，所述抛射剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在加压气雾剂的情况中，可通过提供递送测定量的阀来确定剂量单位。可将如于分配器中使用的明胶的胶囊和药筒配制成其含有所述化合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本文所述的药物组合物可配制用于胃肠外给药，例如通过快速浓注或持续输注。用于注射的物质可以以单剂型提供，例如在任选具有添加的防腐剂的安瓿或多剂量容器中。所述组合物可以是于油载体或水载体中的悬浮液、溶液或乳浊液，并且可含有配制物质例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
胃肠外给药的药物组合物包括水溶形式的活性物质的水溶液。另外，可将活性成分的悬浮液配制为合适的基于油或水的注射悬浮液。合适的亲脂溶剂或载体包括脂肪油例如花生油或合成的脂肪酸酯例如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水注射悬浮液可含有增加所述悬浮液粘滞性的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，所述悬浮液还可含有增加所述活性成分的可溶性的合适的稳定剂或试剂，以允许制备高浓溶液。
可选地，所述活性成分可为粉末形式，在使用前使用合适的载体如无菌无热原水重溶。
本发明的药物组合物还可以使用例如传统的栓剂基质(例如可可脂或其他甘油酯)以直肠组合物形式配制，例如栓剂或保留灌肠剂。
适用于本发明上下文的药物组合物包括其中以获得预期目的的有效量含有所述活性成分的组合物。更特别地，“治疗有效量”意思是可有效预防、延迟、减轻或缓解受治疗者的疾病的症状(如局部缺血)或延长受治疗者生存的活性成分(核酸构建体)的量。
治疗有效量的确定很好地在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细内容。
对于用于本发明方法的任何物质，治疗有效量或剂量最初可从体外和细胞培养测定来估计。例如，可以配制动物模型的剂量以实现所需的浓度或滴度。该信息可用于较准确地确定人类的有用剂量。
本文所述的活性成分的毒性和治疗功效可通过在体外、细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定。从这些体外和细胞培养测定以及动物研究获得的数据可用于配制用于人的剂量范围。所述剂量可根据所应用的剂型和使用的给药途径而不同。各医师可根据患者的病症选择确切的物质、给药途径和剂量(如Fingl等，1975，“The Pharmacological Basis ofTherapeutics”中第1章第1页)。
给药量和间隔时间可个别调整，以提供足够诱导或抑制生物学作用的活性成分的血浆浓度或脑水平(最低有效浓度，MEC)。各物质的MEC不同，但可从体外数据估计。获得MEC所需的剂量取决于各自的特征和给药途径。检测分析可用于测定血浆浓度。
根据待治疗的病症的严重性和反应性，给药还可以为单次或多次给药，疗程持续几天至几周或直到实现治愈或获得疾病状态的减弱。
当然，待给药的组合物的量可取决于受治疗者、疾病的严重性、给药方式、开处方的医生的判断等。
如果需要，本发明组合物可以以包含含有本发明物质的一个或多个单位剂型的包装或分散装置提供，例如FDA批准的试剂盒。所述包装可以包含例如金属或塑料箔，例如泡罩包装。所述包装或分散装置可以附带给药的说明书。所述包装或分散装置还可以以管理药剂的制造、使用或销售的政府机构建议的形式装有与容器相关的通告，所述通告是由组合物或人类或兽医给药的形式的机构批准的。所述通告可以例如是美国食品药品管理局批准用于处方药而贴上标签，或者是批准的产品插入物。在相容的药物载体中配制的包含本发明物质的组合物还可以制备、放置于合适的容器中，并被贴上标签用于治疗指定癌症，如同上文进一步详述。
预期在本专利的有效期内，许多相关的癌症疗法将得以开发，术语“癌症疗法”的范围意于包括所有在先的这些新技术。
如本文所使用，术语“约”是指±10％。
通过审查下列实施例，本发明的其他目的、优点和新颖性特征对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的，所述实施例并非意于限制。另外，上述和下文权利要求部分所主张权利的本发明的各实施方案和方面在下列实施例中具有实验性支持。
实施例
现在结合上述说明描述下列实施例，以非限制性方式描述本发明。
通常，本文所使用的术语和本发明所使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在参考文献中有充分解释。参见，例如，″Molecular Cloning：A laboratory Manual″Sambrook等，(1989)；″Current Protocols in Molecular Biology″卷I-III Ausubel，R.M.，编辑(1994)；Ausubel等，″Current Protocols in Molecular Biology″，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，″A Practical Guide to Molecular Cloning″，John Wiley和Sons，New York(1988)；Watson等，″Recombinant DNA″，Scientific American Books，New York；Birren等(编辑)″Genome Analysis：A Laboratory Manual Series″，卷1-4，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)；美国专利No.4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659以及5,272,057提出的方法；″Cell Biology：A Laboratory Handbook″，卷I-III Cellis，J.E.，编辑(1994)；″Culture of Animal Cells-A Manual of BasicTechnique″by Freshney，Wiley-Liss，N.Y.(1994)，第三版；″CurrentProtocols in Immunology″卷I-III Coligan J.E.，编辑(1994)；Stites等(编辑)，″Basic and Clinical Immunology″(第8版)，Appleton和Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(编辑)，″Selected Methods in Cellular Immunology″，W.H.Freeman和Co.，New York(1980)；可用的免疫测定在专利和科学文献中广泛描述，参见，例如美国专利No.3,791,932；No.3,839,153；No.3,850,752；No.3,850,578；No.3,853,987；No.3,867,517；No.3,879,262；No.3,901,654；No.3,935,074；No.3,984,533；No.3,996,345；No.4,034,074；No.4,098,876；No.4,879,219；No.5,011,771以及No.5,281,521；″Oligonucleotide Synthesis″Gait，M.J.，编辑(1984)；″Nucleic Acid Hybridization″Hames，B.D.，和Higgins S.J.，编辑(1985)；″Transcription and Translation″Hames，B.D.，和Higgins S.J.，编辑(1984)；″Animal Cell Culture″Freshney，R.L，编辑(1986)；″Immobilized Cells and Enzymes″IRL Press，(1986)；″A Practical Guide toMolecular Cloning″Perbal，B.，(1984)和″Methods in Enzymology″卷1-317，Academic Press；″PCR Protocols：A Guide To Methods And Applications″，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等，″Strategies for ProteinPurification and Characterization-A Laboratory Course Manual″CSHL Press(1996)；前述所有参考文献通过引用并入本申请，如同完整在本文描述一样。其他常见参考文献在本文中有提供。认为其中的程序为本领域公知并且为了方便读者而提供。其中所包含的所有信息通过引用并入本申请。
实施例1人类胚胎和胎盘样品中H19的可选剪接变体的检测
进行下列实验以确定H19的剪接变体是否限制于特定的细胞类型。
材料与方法
细胞培养：该研究中所使用的所有人类肿瘤细胞系均获得自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)，并维持在含有10％胎牛血清(55℃灭活30分钟)、25mM HEPES(pH7.4)、青霉素(180单位/ml)、链霉素(100μg/ml)以及两性霉素B(0.2μg/ml)的DMEM-F12(1∶1)培养基中。在聚苯乙烯培养皿(NUNC)中铺板4×104细胞/cm2。每4天，使用0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液(Biet Haemek)使得细胞受胰蛋白酶消化10分钟，以相同的初始密度再铺板。
逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)：根据生产商的说明书使用TRIREAGENT(Sigma)从组织和培养细胞系提取总RNA，并使用DNA酶I处理去除前述的基因组DNA污染物(Ayesh和Matouk等，2002，Mol Ther 7，535-541)。根据生产商的说明书，使用p(dT)15引物(Roche，Germany)进行cDNA合成，使用400单位逆转录酶(Gbico BRL)起始5μg总RNA的逆转录。使用Taq聚合酶(Takara，Otsu，Japan)在Diaza dGTP(Roche，Germany)存在下进行PCR反应：94℃5分钟，之后40个循环(94℃1分钟，58℃30秒，72℃40秒)，最后在72℃延伸5分钟。PCR反应中所使用的引物为(5′-AGGAGCACCTTGGACATCTG-3′)(SEQ ID NO：8)和(5′-CCCCTGTGCCTGCTACTAAA-3′)(SEQ ID NO：9)，分别为所公布的H19转录起始位点下游的117和816位碱基(Brannan等，1990，Mol CellBiol 10，28-36)。引物的位置在图1A中显示。将PCR反应的产物在溴化乙锭染色的凝胶上电泳。
探针合成：通过GFXTM PCR，DNA和凝胶条带纯化试剂盒从凝胶纯化表现较小条带的组织的PCR产物，并将其克隆至T-
Figure A20068003027800341
载体(Promega，USA.)。通过限制酶分析确定插入的方向，并由此根据供应商的说明书(Roche，Germany)使用Digoxigenin UTP合成标记的反义链。所产生的探针使用2单位的无RNA酶的DNA酶I处理，沉淀并以合适体积的DEPC处理的双蒸水再悬浮。在4％变性的琼脂糖微型凝胶上电泳来分析所合成的探针的大小，使用地高辛(Digoxigenin)抗体通过斑点印迹分析测定其标记效率(数据未显示)。
RNA酶保护测定：在RNA酶保护测定中使用不同浓度的妊娠末三个月胎盘的RNA(使用RT-PCR显示可选的剪接变体存在)。根据试剂盒说明书RPA IITM(Ambion)，将600pg地高辛标记的探针/10μg来自妊娠末三个月胎盘的总RNA(DNA酶处理的)与等于最高浓度的所使用的RNA的酵母RNA在42℃杂交16小时，并使用RNA酶A和RNA酶Tl消化。通过在5％的聚丙烯酰胺凝胶(含有8M尿素)上电泳分离被保护免受RNA酶消化的RNA片段，并使用CDP Star检测试剂盒(Roche，Germany)根据生产商的说明书检测。
DNA测序：使用ABI PRISM BigDye终止循环测序预备反应试剂盒(PE Applied Biosystem)进行测序反应。
结果
通过RT-PCR分析(图1B-D)和RNA酶保护测定(图1E)证明H19的可选剪接变体存在于胎盘和胚胎组织中，不存在于癌细胞系和癌症患者样品中。测序研究显示可选的剪接变体为344bp长，并且与已知的H19转录物(GenBank登记号No.M32053)相比缺少从转录起始位点的252至588核苷酸延伸的外显子1部分(图1F)。
实施例2 CoCl2对H19基因表达的中度上调
几种在H19RNA存在下被上调的基因还已知受低氧诱导(Ayesh和Matouk等，2002，Mol Carcinog 35，63-74)。还据报道，在类风湿性关节炎滑膜组织中检测到H19RNA(Stuhlmuller等，2003，Am J Pathol 163，901-911)。由于低氧和氧化应激，部分由于在受影响的区域中增加的炎症细胞渗出液的代谢活性，广泛的血管发生的存在通常与类风湿性关节炎有关。
另外，蛋白质组学方法已经揭示在使用含有完整H19基因的基因组DNA稳定转染的人类癌症乳房上皮细胞中的H19超表达导致以转录后水平正性调节硫氧还蛋白基因，硫氧还蛋白是氧化应激反应和脱氧核苷酸生物合成的关键蛋白质(Lottin等，2002，Carcinogesis 23，1885-1895)。
另外，在氧减少的环境中，发生涉及细胞侵袭的许多过程，包括胚泡植入和胎盘发育(Rodesch等，1992，Obstet Gynecol 80，283-285)。这两个生理学过程显示了H19表达的强烈上调(Ariel等，1994，Gynecol Oncol 53，212-219)。
基于这些推理，对H19基因进行分析，以确定它是否对低氧敏感。
材料与方法
在正常培养基条件中培养Hep3B细胞24小时，然后进行CoCl2操作。
将细胞与CoCl2(Sigma，Aldrich)一起再培养22小时，然后进行RNA提取。
如上文实施例1所述使用下列引物进行RT-PCR分析：
5′-CCG GCC TTC CTG AAC A-3′向前(SEQ ID NO：10)和5′-TTCCGA TGG TGT CTT TGA TGT-31相反(SEQ ID NO：11)。
结果
如RT-PCR分析所检测的，对添加增加的浓度的CoCl2(50-400uM)作出反应，在Hep3B细胞中H19基因表达被中度上调(图2A-B)。这种相对于针对真实的低氧条件的强烈上调的中度上调表明HIF-α仅部分起作用。
实施例3 H19RNA于正常和类似低氧的培养条件中在体外被不同siRNA双链体有效下调
材料与方法
siRNA的制备：合成四种靶向人类siRNA和一种阴性对照siRNA(靶向荧光素酶pGL3)(如下表1中所列)，备于通过Proligo使用双链体并将其设计成所推荐的在各链上带有dTdT 3′悬突。使用国立卫生研究院Blast程序评价所有序列的基因特异性。
表1
siRNA     有义链                                 位置      SEQ
名称                                                   ID NO：
H19       5′-UAAGUCAUUUGCACUGGUUdTdT-3′        外显      1
siRNA-1                                       子5
H19       5′-GCAGGACAUGACAUGGUCCdTdT-3′        外显      2
siRNA-2                                       子2
H19       5′-CCAACAUCAAAGACACCAU dTdT-3′       外显      3
siRNA-3                                                 子5
H19      5′-CCAGGCAGAAAGAGCAAGAdTdT-3′                   外显         4
siRNA-4                                                 子1
PGl3     5′-CUUACGCUGAGUZCUUCGAdTdT-3′                   外显         5
siRNA                                                   子1
GFP      5′-GCAAGCUGACCCUGAAGUUCAU                                     6
siRNA
当接收时，各冷冻干燥的siRNA使用无RNA酶水重溶以制备50pmole/ul溶液，并作为等份在-80℃下储存。
细胞培养条件和siRNA的转染：使用lipofectamine 2000(Invitrogen，US)在12孔培养板中进行siRNA的转染。在转染前一天，使用胰蛋白酶消化细胞，计数，并以60,000/孔接种，每孔含有1ml无抗生素的DMEM培养基，这样它们在转染当天将近50％融合。使用100μl无血清OPTI-MEM培养基(Invitrogen，US)温育3μl lipofectamine 2000 15分钟。将其添加至使用100μl无血清OPTI-MEM培养基稀释的100pmole dsRNA，该配制物维持20分钟。将195μl的该混合物应用于Hep3B细胞和UMUC3细胞，并在不更换培养基的情况下再温育48小时。对于低氧模拟条件，在转染后24小时，以100μM的终浓度添加新鲜配制的CoCl2，再培养细胞22小时，然后进行RNA提取。
RNA提取和RT-PCR条件(siRNA)：如上文实施例1所述进行总RNA提取和逆转录，除了使用1μg的总RNA以外。在Taq聚合酶(Takara，Otsu，Japan)的存在下进行H19的PCR反应：94℃5分钟，然后是34个循环(94℃30秒，58℃30秒，72℃30秒)，最后在72℃延伸5分钟，并对于GADPH和组蛋白也是如此。GAP的引物序列：向前5′-GGC TCT CCA GAACAT CAT CCC TGC-3′(SEQ ID NO：12)和相反GGG TGT CGC TGT TGAAGT CAG AGG-31(SEQ ID NO：13)。
结果
Hep3B细胞：检测了siRNA在正常(图3A)或类似低氧的条件(图3B)下降低H19RNA内源性水平的能力。通过RT-PCR分析(转染后48小时)分别检测到使用四种靶向H19的不同siRNA(1-4)(图3A，泳道2-5)或四种siRNA的等摩尔池(图3A，泳道6)对H19表达的显著抑制，但非相关的靶向荧光素酶的PGl3双链体(图3A，泳道1)和模拟物(图3A，泳道7)对H19表达无显著抑制。另外，检测三种不同siRNA(1、3和4)在类似低氧的CoCl2模拟条件中抑制H19基因表达的能力(图3B-C)。当H19RNA被CoCl2模拟条件中度诱导时(对比图3B泳道1的低氧模拟条件和泳道5的正常条件，二者均使用PGl3双链体转染)，使用三种靶向H19转录物的不同siRNA检测到其显著的降低(图3B，泳道2-4)。
UMUC3细胞：对于Hep3B细胞，低氧条件增加H19信使的表达，siRNAH19(SEQ ID NO：1)非常显著地降低了其表达(图3D-E)。
实施例4H19RNA在Hep3B和UMUC3细胞中的活体外下调减轻了体内的肿瘤发生
材料与方法
活体外肿瘤发生测定：如上所示，分别通过针对H19RNA的两种不同的双链体(siRNA SEQ ID NO：3用于Hep3B细胞，siRNA SEQ ID NO：1用于UMUC3细胞)和非相关的对照siRNA(靶向Luc或GFP)在体外转染Hep3B和UMUC3细胞。转染后48小时，将细胞皮下注射至无胸腺裸小鼠的背胁腹部。其他对照组无任何处理。使用胰蛋白酶消化细胞，计数，离心并重悬于无菌的PBS(1X)，这样具有约5×106细胞/ml。将250μl的悬浮液注射至无胸腺小鼠的背胁腹部。注射后15天和30天，肿瘤开始发展，使用测径器测量它们的体积。
使用lipofectamine 2000(Invitrogen，US)在6孔板中进行siRNA转染。在转染前一天，使用胰蛋白酶消化细胞，计数，以100,000/孔接种，每孔含有2ml无抗生素DMEM培养基，这样它们在转染当天将近50％融合。使用250μl无血清OPTI-MEM培养基(Invitrogen，US)温育5μllipofectamine 2000 15分钟。将其添加至使用250μl无血清OPTI-MEM培养基稀释的100μM dsRNA，该配制物维持20分钟。将500μl的该混合物应用于细胞，并在不更换培养基的情况下再温育48小时。各处理组具有7只小鼠。
结果
如图4A-D所示，将先前使用H19siRNA转染的Hep3B细胞给药于小鼠，较使用Luc siRNA转染的Hep3B细胞导致肿瘤重量(图4A)和体积(图4B)非常显著降低。如图5A-D所示，使用H19siRNA转染的UMUC3细胞也较使用Luc siRNA转染的UMUC3细胞导致小鼠肿瘤重量(图5A)和体积(图5B)非常显著降低。
实施例5 H19siRNA的致癌性质
为了确定H19RNA是否是肿瘤相关基因产物或者它自身是否隐含致癌潜能，进行了下列实验。
材料与方法
细胞增殖分析：接种Hep3B细胞并使用抗Luc siRNA或H19siRNA(SEQ ID NO：3)于12孔板中转染。24小时后，使用PBS洗涤细胞两次，使用胰蛋白酶消化细胞并计数。使用含有10％FCS的DMEM培养基将5×103转染的Hep3B细胞以四个复孔接种在96孔培养板，并再培养24小时，然后进行MTS测定。根据供应商(Promega，USA)提供的程序进行MTS测定。使用ELISA读板机记录在940nm处的吸光度。
结果
如图6所示，siRNA H19未能诱导Hep3B细胞增殖的具有显著统计学意义的衰减。
另外，还将低氧恢复后H19对软琼脂中不依赖贴壁的集落形成的抑制作用作为体外肿瘤发生的另外的评价进行分析。如材料与方法部分所述，转染后4小时，将Hep3B细胞暴露于低氧应激。低氧条件之后的24小时，将细胞接种于软琼脂。低氧恢复后，H19siRNA显著削弱了不依赖贴壁的生长，其中集落数和大小非常显著减小(图3F)。
实施例6 H19siRNA双链体的体内瘤内注射
材料与方法
H19siRNA的制备：所使用的转染子为Polyplus的jetPEI TM(x4)浓缩物。使用100μl 5％的葡萄糖溶液稀释850pmole(～11μg siRNA)和10μljetPEI(N/P＝10)，5分钟后，将jetPEI溶液添加至siRNA溶液，该配制物维持20分钟，然后进行瘤内(用于UMUC3)或初始的接种位点(用于Hep3B)的注射。
实验程序：将2×106膀胱癌细胞(UMUC3)和肝细胞癌(Hep3B)细胞悬浮于100μl PBS，并将UMUC3皮下注射至10只无胸腺雄性小鼠的背部，将Hep3B细胞注射至8只无胸腺雄性小鼠的背部。
UMUC3细胞：当UMUC3的肿瘤直径达到约4-8mm时，将小鼠分成两个均质组(n＝5)，并使小鼠接受作为对照的非相关的GFP或H19siRNA(H19siRNA-3-SEQ ID NO：3)的首次瘤内siRNA注射。在首次瘤内注射之后间隔2天和5天进行总的3次注射的给药，在最后一次注射之后使小鼠6天无任何处理。使用测径器测量两个处理组的肿瘤体积，记录它们的最终肿瘤重量。
Hep3B细胞：对于Hep3B细胞，在细胞接种之后的48小时后治疗，观察可触及的肿瘤。将小鼠分成两组(每组n＝4)，在初始接种位点注射。小鼠接受总共5次注射，每两天一次，然后在最后一次注射之后保留一周，然后处死。
通过下列方程式计算肿瘤体积：V＝(L×W2)×0.5(V，体积；L，长度；W，宽度)。
结果
为了确定肿瘤生长中被敲除的H19的功能性结果，将H19siRNA-PEI复合物注射至膀胱癌UMUC3细胞系诱导的小肿瘤中，并且之前在裸小鼠中没有观察到Hep3B癌细胞系的可触及肿瘤。将使用PEI配制的靶向GFP的合成对照siRNA用作对照。如图7A-B所示，H19siRNA3导致UMUC3细胞平均肿瘤体积非常显著减小约90％(图7A)，和平均肿瘤重量非常显著减小约88％(图7B)。
在Hep3B诱导的肿瘤中，使用siRNA1，肿瘤体积和重量的减小的水平不太显著。观察到肿瘤重量减小约40％(图7C)，肿瘤体积减小56％(图7D)。
实施例7TA11和TA31细胞中H19的涉入
起源于相同的母源细胞系T24P的两种人类膀胱癌细胞系TA11和TA31显示在正常培养条件下体外分别为阴性(TA11H19-ve)，或高表达(TA31H19high)(Ayesh等，2002，Mol Carcinog 35，63-74)。进行下列实验以确定H19信使是否影响这些其他细胞谱系的肿瘤生长。
材料与方法
将TA11和TA31(约2×106)细胞皮下植入CD-1小鼠(每组n＝5)。在植入后15天测量肿瘤体积。如图8A-B所示，衍生自TA11H19-ve细胞的肿瘤显著小于衍生自TA31H19high细胞的肿瘤。另外，TA31H19high衍生的肿瘤血管生成较显著(图8C-D)。获得自TA11H19-ve细胞的肿瘤的RT-PCR结果显示在这些肿瘤中H19RNA被诱导，而相比之下H19RNA在这些细胞中无体外表达(数据未显示)。这些结果表明H19RNA促进肿瘤生长。
实施例8Hep3B细胞系中H19RNA被低氧应激诱导以及针对H19的siRNA非常有效地阻碍了其诱导
材料与方法
如上所述，接种Hep3B细胞并使用抗H19siRNA或抗Luc siRNA转染。转染后24小时，将细胞放入Aneoropack矩形瓶(Mitsubishi chemicalcompany Japan)以在1小时内创造低氧条件(1％ O2，20％ CO2)，或维持于正常氧浓度。培养持续24小时，然后进行RNA提取。如上文实施例1所述进行RT-PCR分析。
结果
如图9A所示，H19 RNA分别在正常(图9A，泳道3)和低氧(图9A，泳道4)培养条件被特异性下调。管家基因(GAPDH)的PCR分析示于图9B。uPAR的PCR分析示于图9C。
应知道为了清楚的目的在各实施方案内容中描述的本发明的某些特征还可结合单个的实施方案提供。相反，为了简短的目的在单个实施方案内容中描述的本发明的各种特征还可分开提供或以任何合适的亚组合形式提供。
尽管结合本发明的具体实施方案描述了本发明，显而易见的是许多替换、修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。因此，意于包括落在附属权利要求的精神和宽范围之内的所有这些替换、修改和变化。该说明书中提及的所有公布、专利和专利申请通过引用完整并入本申请，达到这样一种程度，即如同各公布、专利或专利申请特别和各自通过引用并入一样。另外，本申请中的任何参考文献的引用或确认不应理解为承认所述参考文献可用作本发明的现有技术。
序列表
<110>耶路撒冷希伯莱大学伊森姆研究发展公司
     亚弗拉罕·霍奇伯格
     伊麦德·麦托克
<120>用于下调H19的核酸物质及其使用方法
<130>32159
<160>13
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>靶向H19的siRNA双链体
<400>1
uaagucauuu gcacugguut t                                                 21
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>靶向H19的siRNA双链体
<400>2
gcaggacaug acauggucct t                                                 21
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>靶向H19的siRNA双链体
<400>3
ccaacaucaa agacaccaut t                                                21
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>靶向H19的siRNA双链体
<400>4
ccaggcagaa agagcaagat t                                                21
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>靶向荧光素酶的siRNA双链体
<400>5
cuuacgcuga guacuucgat t                                                21
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>靶向GFP的siRNA双链体
<400>6
gcaagcugac ccugaaguuc au                                               22
<210>7
<211>3489
<212>DNA
<213>人类
<220>
<221>misc_feature
<222>(2599)..(2599)
<223>n是a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(2815)..(2815)
<223>n是a、c、g或t
<400>7
ctgcagggcc ccaacaaccc tcaccaaagg ccaaggtggt gaccgacgga cccacagcgg    60
ggtggctggg ggagtcgaaa ctcgccagtc tccactccac tcccaaccgt ggtgccccac    120
gcgggcctgg gagagtctgt gaggccgccc accgcttgtc agtagagtgc gcccgcgagc    180
cgtaagcaca gcccggcaac atgcggtctt cagacaggaa agtggccgcg aatgggaccg    240
gggtgcccag cggctgtggg gactctgtcc tgcggaaacc gcggtgacga gcacaagctc    300
ggtcaactgg atgggaatcg gcctgggggg ctggcaccgc gcccaccagg gggtttgcgg    360
cacttccctc tgcccctcag caccccaccc ctactctcca ggaacgtgag gtctgagccg    420
tgatggtggc aggaaggggc cctctgtgcc atccgagtcc ccagggaccc gcagctggcc    480
cccagccatg tgcaaagtat gtgcagggcg ctggcaggca gggagcagca ggcatggtgt    540
cccctgaggg gagacagtgg tctgggaggg agaggtcctg gaccctgagg gaggtgatgg    600
ggcaatgctc agccctgtct ccggatgcca aaggaggggt gcggggaggc cgtctttgga    660
gaattccagg atgggtgctg ggtgagagag acgtgtgctg gaactgtcca gggcggaggt    720
gggccctgcg ggggccctcg ggagggccct gctctgattg gccggcaggg caggggcggg    780
aattctggcg ggccacccca gttagaaaaa gcccgggcta ggaccgagga gcagggtgag    840
ggagggggtg ggatgggtgg ggggtaacgg gggaaactgg ggaagtgggg aaccgagggg    900
caaccagggg aagatggggt gctggaggag agcttgtggg agccaaggag caccttggac    960
atctggagtc tggcaggagt gatgacgggt ggaggggcta gctcgaggca gggctggtgg    1020
ggcctgaggc cagtgaggag tgtggagtag gtgcccaggc atcgtgcaga cagggcgaca    1080
tcagctgggg acgatgggcc tgagctaggg ctggaaagaa gggggagcca ggcattcatc    1140
ccggtcactt ttggttacag gacgtggcag ctggttggac gaggggagct ggtgggcagg    1200
gtttgatccc agggcctggg caacggaggt gtagctggca gcagcgggca ggtgaggacc    1260
ccatctgccg ggcaggtgag tcccttccct ccccaggcct cgcttcccca gccttctgaa    1320
agaaggaggt ttaggggatc gagggctggc ggggagaagc agacaccctc ccagcagagg    1380
ggcaggatgg gggcaggaga gttagcaaag gtgacatctt ctcgggggga gccgagactg    1440
cgcaaggctg gggggttatg ggcccgttcc aggcagaaag agcaagaggg cagggaggga    1500
gcacaggggt ggccagcgta gggtccagca cgtggggtgg taccccaggc ctgggtcaga    1560
cagggacatg gcaggggaca caggacagag gggtccccag ctgccacctc acccaccgca    1620
attcatttag tagcaggcac aggggcagct ccggcacggc tttctcaggc ctatgccgga    1680
gcctcgaggg ctggagagcg ggaagacagg cagtgctcgg ggagttgcag caggacgtca    1740
ccaggagggc gaagcggcca cgggaggggg gccccgggac attgcgcagc aaggaggctg    1800
caggggctcg gcctgcgggc gccggtccca cgaggcactg cggcccaggg tctggtgcgg    1860
agagggccca cagtggactt ggtgacgctg tatgccctca ccgctcagcc cctggggctg    1920
gcttggcaga cagtacagca tccaggggag tcaagggcat ggggcgagac cagactaggc    1980
gaggcgggcg gggcggagtg aatgagctct caggagggag gatggtgcag gcaggggtga    2040
ggagcgcagc gggcggcgag cgggaggcac tggcctccag agcccgtggc caaggcgggc    2100
ctcgcgggcg gcgacggagc cgggatcggt gcctcagcgt tcgggctgga gacgagggtg    2160
agtttttccc cctctgccac cctcagcccc cacccgcccc tccccacaca accaacacgt    2220
tctccccaca cgactctctc gttctcccca cagccaggtc tccagctggg gtggacgtgc    2280
ccaccagctg ccgaaggcca agacgccagg tccggtggac gtgacaagca ggacatgaca    2340
tggtccggtg tgacggcgag gacagaggag gcgcgtccgg ccttcctggt gagcgtgtct    2400
gccctccctg cgtcaggacg gccctgccca gaccgccccg cgccaccatc tcactgcccc    2460
gacctctgtc ttctacagaa caccttaggc tggtggggct gcggcaagaa gcgggtctgt    2520
ttctttactt cctccacgga gtcggcacac tatggctgcc ctctgggctc ccagaaccca    2580
caacatgaaa ggtgagggnc ttcctgccac acttggggtg gggggcacgc gagaggagct    2640
gagtgggacc tcaactcctt ccccatccac agaaatggtg ctacccagct caagcctggg    2700
cctttgaatc cggacacaaa accctctagc ttggaaatga atatgctgca ctttacaacc    2760
actgcactac ctgactcagg aatcggctct ggaaggtgag caccagcgct ccttnggaag    2820
cctccaggcc cccgagcacc ctgcccccat cccacccacg tgtcgctatc tctaggtgaa    2880
gctagaggaa ccagacctca tcagcccaac atcaaagaca ccatcggaac agcagcgccc    2940
gcagcaccca ccccgcaccg gcgactccat cttcatggcc accccctgcg gtggacggtt    3000
gaccaccagc caccacatca tcccagagct gagctcctcc agcgggatga cgccgtcccc    3060
accacctccc tcttcttctt tttcatcctt ctgtctcttt gtttctgagc tttcctgtct    3120
ttcctttttt ctgagagatt caaagcctcc acgactctgt ttcccccgtc ccttctgaat    3180
ttaatttgca ctaagtcatt tgcactggtt ggagttgtgg agacggcctt gagtctcagt    3240
acgagtgtgc gtgagtgtga gccaccttgg caagtgcctg tgcagggccc ggccgccctc    3300
catctgggcc gggtgactgg gcgccggctg tgtgcccgag gcctcaccct gccctcgcct    3360
agtctggaag ctccgaccga catcacggag cagccttcaa gcattccatt acgccccatc    3420
tcgctctgtg cccctcccca ccagggcttc agcaggagcc ctggactcat catcaataaa    3480
cactgttac                                                           3489
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>8
aggagcacct tggacatctg                                              20
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>9
cccctgtgcc tgctactaaa                                              20
<210>10
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>10
ccggccttcc tgaaca                                                  16
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>11
ttccgatggt gtctttgatg t                                  21
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>12
tctccagaac atcatccctg c                                  21
<210>13
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>13
gggtgtcgct gttgaagtca gagg                               24

Claims (16)

1. 一种选自SEQ ID NO：1、2、3和4的分离的寡核苷酸。
2. 一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和作为活性成分的至少一种选自SEQ ID NO：1、2、3和4的分离的寡核苷酸。
3. 一种选自SEQ ID NO：1、2、3和4的分离的寡核苷酸用于制备治疗癌症的药剂的用途。
4. 一种治疗癌症的方法，其包括：
(a)为具有相应需要的受治疗者施用治疗有效量的能够下调H19mRNA水平和/或活性的物质，或在具有相应需要的受治疗者的细胞中表达治疗有效量的能够下调H19mRNA水平和/或活性的物质，以及
(b)为所述受治疗者提供癌症疗法，由此治疗癌症。
5. 一种能够下调H19mRNA水平和/或活性的物质用于制备与癌症疗法联合治疗癌症的药剂的用途。
6. 一种治疗癌症的方法，其包括：为具有相应需要的受治疗者施用治疗有效量的至少一种选自SEQ ID NO：1、2、3和4的寡核苷酸，或在具有相应需要的受治疗者的细胞中表达治疗有效量的至少一种选自SEQ IDNO：1、2、3和4的寡核苷酸，由此治疗癌症。
7. 一种鉴定为用于治疗癌症的制品，其包含能够下调H19mRNA水平和/或活性的物质和其他的抗癌剂。
8. 如权利要求4、5或7所述的制品、用途或方法，其中所述能够下调H19mRNA水平和/或活性的物质是核酸物质。
9. 如权利要求8所述的制品、用途或方法，其中所述核酸物质选自：
(a)用于抑制H19RNA从H19基因转录的单链多核苷酸；
(b)用于与H19mRNA杂交并由此导致H19mRNA活性减小的单链多核苷酸；
(c)导致H19mRNA降解的双链多核苷酸；
(d)用于剪切H19mRNA的形成三链体的多核苷酸；
(e)用于剪切H19mRNA的催化的多核苷酸；
(f)用于与H19mRNA杂交而导致其酶解的单链多核苷酸；以及
(g)编码(a)至(f)任一者的核酸序列。
10. 如权利要求8所述的制品、用途或方法，其中所述核酸物质选自siRNA、核酶和DNA酶。
11. 如权利要求10所述的制品、用途或方法，其中所述核酸物质是siRNA。
12. 如权利要求11所述的制品、用途或方法，其中所述siRNA包含选自SEQ ID NO：1-4的核酸序列。
13. 如权利要求4或6所述的方法，其中所述给药在原位进行。
14. 如权利要求3、4、5、6或7任一项所述的方法、用途或制品，其中所述癌症选自：儿童实体瘤、维尔姆斯氏肿瘤、肝母细胞瘤、胚胎性横纹肌肉瘤、生殖细胞瘤和滋养层细胞瘤、睾丸生殖细胞瘤、卵巢非成熟型畸胎瘤、骶尾瘤、绒毛膜癌、胎盘部位滋养层细胞瘤、成人上皮细胞瘤、膀胱癌、肝细胞癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、头颈鳞状上皮细胞癌、食道癌、神经原性肿瘤、星形细胞瘤、恶性神经节瘤、神经母细胞瘤。
15. 如权利要求14所述的方法、制品或用途，其中所述癌症是膀胱癌或肝细胞癌。
16. 如权利要求7所述的制品，其中所述能够下调H19mRNA水平和/或活性的物质与所述其他抗癌剂一起配制。
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