CN101268196A - 生物催化的(甲基)丙烯酸酯的生产 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及合成不含可带正电荷/带正电荷基团的丙烯酸和/或甲基丙烯酸的酯的生物催化方法或过程,所述方法或过程包括优选在催化剂(无机、有机或有机金属催化剂,或优选生物催化剂)存在下,使一种或多种不含可带正电荷或带正电荷基团的醇(醇起始物)与(甲基)丙烯酰辅酶A反应,所述催化剂能够将醇基从如上下文定义的醇起始物在除去辅酶A部分转移酶活性,如转移酶或水解酶类的酶下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A。(甲基)丙烯酰辅酶A优选是通过在能量提供物质和例如具有S-乙酰辅酶A合成酶活性的生物催化剂存在下使(甲基)丙烯酸或它的盐与辅酶A反应而形成的或者是通过在生物催化剂存在下使代谢产生的丙烯酸盐或甲基丙烯酸盐的反应而形成的。
Description
本发明涉及合成不含可带正电荷或带正电荷基团的丙烯酸和/或甲基丙烯酸的(一种或多种)酯的生物催化方法或过程,所述方法或过程包括优选在催化剂存在下,使一种或多种不含带正电荷基团的醇(醇起始物)与丙烯酰辅酶A和/或甲基丙烯酰辅酶A反应,所述催化剂可以是无机、有机或有机金属催化剂,或优选生物催化剂,尤其是能够将醇基从如上下文定义的醇起始物在除去辅酶A部分(例如,利用转移酶活性)下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的生物催化剂,如转移酶或水解酶类的酶。(甲基)丙烯酰辅酶A优选在能量提供物质和具有合成酶(特别是辅酶A合成酶,尤其是S-乙酰辅酶A合成酶)活性的生物催化剂存在下通过使(甲基)丙烯酸或它的盐(如丙烯酸钠)与辅酶A反应形成的或者通过使代谢产生(例如通过微生物从糖类例如经过乳酸)的丙烯酸盐或甲基丙烯酸盐的反应形成的;涉及(尤其是转化的,即基因修饰的)能够使醇基从如上下文定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的生物体并且还优选具有合成酶(特别是辅酶A合成酶,尤其是S-乙酰辅酶A合成酶)活性的生物体,和它们在所述过程或方法中的用途;能够将醇基从如上下文定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的生物催化剂在进行所述转移中的用途,以便生产一种或多种上述的酯;以及涉及如下所述的进一步的用途、生物体、过程和方法。
微生物或生物催化介导的生物质(例如,纤维素或淀粉)转化以提供化学原料,并且在工业有用量中代表一种对化石燃料的重要的替代方案,并且在生物精炼中燃料和其它本体化学产品的生产在未来的化石燃料的耗尽以及由于连带的全球气候变化而减少碳排放的社会和政治压力方面变得日益重要。因此,重要的是必须在手边有尽可能多的生物催化反应以允许利用生物体或生物催化方法,尤其是从可再生的碳中性基质,如源于庄稼的碳水化合物来生产它们。
例如,丙烯酸的低级(例如,C1-C7)烷基酯并且特别是丙烯酸的甲基、乙基和正丁基酯已知是在工业上有用的酯。目前通过丙烯酸酯化来生产丙烯酸酯。丙烯酸从石化丙烯经由高耗能的2-步氧化过程以很大规模(大于2mio吨/年,全世界)制造的。超过一半的这种生产转变为所提及的酯或其它的酯,大多数是正丁基酯。这些单体被用于生产用于很广泛应用(包括漆、清漆、墨水、粘合剂、增稠剂等几种)的聚合物的生产中。丙烯酸酯的生产需要相当多的在工厂方面的投资并且是一个高耗能的过程。
为了提供集成的可以利用可再生的或废弃的生物质的生物合成方法,代替这种基本化学反应,生物催化反应将会是高度理想的。
US 5,541,093描述了在脂肪酶存在下,在25-55℃,使醇与有机酸在蒸气状态下反应来制备这种酯。这些酯包括乙酸乙酯和丙酸乙酯。US5,973,203描述通过利用脂肪酶氨基解(甲基)丙烯酸酯来生产(甲基)丙烯酸的酰胺的方法。
另外,用于燃料的乙醇的生物生产急剧地增加并且在2001被报道站在300亿升(Th.Willke和K.-D.Vorlop,Appl.Microbiol.Biotechnol.(2004)66:131-142)。根据这些作者,将正丁醇从生物质通过发酵生产出来直到廉价油时代(1930)之前并且正丁醇目前可以用生物技术以具有竞争性的成本作为燃料添加剂生产。
因此,存在明显的需要和机会在来以显著大的规模在例如生物精炼操作中生产丙烯酸(和甲基丙烯酸)酯,其中在醇的生产之之后跟随经由代谢产生的丙烯酰辅酶A的与丙烯酸的偶合以全绿色和可持续的方式生产所述酯。
在1980年,Dalai等人(Biosources Digest vo.2p 89-97)描述了丙烯酸的代谢合成。作者报道了在埃氏巨球形菌(Megasphera elsdenii)和丙酸梭菌(Clostridium propionicum)中在乳酸盐的无氧脱水中将丙烯酰辅酶A假设为中间体并且报道在丙酸梭菌中它发生在β-基丙酰辅酶A脱水之后。他们还提出在利用丙酸梭菌的休息细胞的反应中,观察到丙烯酸盐积累,丙酸盐作为底物。用于合成丙烯酰辅酶A的代谢方案在方案I中给出。
方案I:在丙酸梭菌中涉及丙烯酰辅酶A的代谢途径(参见Dalai等人,如上)
最近,一些生物制备丙烯酸盐和丙烯酸酯的方法已经被描述,例如在WO 02/042418A2或WO 02/42471A2,还参见WO 00/71738的有关丙烯酸的合成。
这些文献中没有一篇描述直接生产丙烯酸酯的可能性。
丙烯酸和甲基丙烯酸已知是S-乙酰辅酶A合成酶(S-乙酰辅酶A合成酶、乙酸硫激酶或乙酸:辅酶A连接酶)(EC 6.2.1.1)的底物,然而,以前发现产物基本上似乎不对应于乙酰辅酶A硫酯,相反,经由与双键的Michael加成和经由酸的羰基的硫酯的形成而发生两当量的辅酶A的结合,因而发现形成了双加成物(参见,例如Patel和Walt,Anal.Biochem.170,355-60(1988))。所述双加成物具有下式:
与这种背景相反,提供用于合成(甲基)丙烯酸酯的生物方法将会是高度理想的,这种生物方法是简单的和/或现实的替代目前的化学方法的方法,并且还形成了用于集成到更一般的生物技术方法,例如,最终利用可再生的资源的生物技术方法的基础。
令人惊奇地,现已发现任选地或优选地在催化剂的存在下,直接从S-(甲基)丙烯酰基-辅酶A((甲基)丙烯酰辅酶A)出发,通过使一种或多种不含有带正电荷基团的醇与(甲基)丙烯酰辅酶A反应,可能获得不含有带正电荷基团的(甲基)丙烯酸酯,尤其是低级醇的(甲基)丙烯酸酯,其中所述催化剂可以是无机、有机或有机金属催化剂,或更优选是能够使醇基从如上下文定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的生物催化剂。
甚至在具有合成酶活性的生物催化剂的帮助下,利用(甲基)丙烯酸或它的盐,如丙烯酸钠、丙烯酸钾、丙烯酸铵等和辅酶A可能合成前体(甲基)丙烯酰辅酶A,因为可利用的条件是有利的,其中已经在利用具有合成酶活性的生物催化剂,例如通过优化反应物的浓度,特别是相互之间的相对浓度,(甲基)丙烯酸或(甲基)丙烯酸盐的羧基与辅酶A的巯基的反应优越于与双键的加成,因而可以形成比双键加成物或双加成物更多的硫酯。在这方面特别优选的是下面详述的分批加料方法。
在体外条件下允许合成(甲基)丙烯酰辅酶A的令人惊奇的新的洞察力也形成了体内合成的基础或通过将体外和体内的步骤组合来合成(甲基)丙烯酸酯的基础。
这形成了合成丙烯酸酯的生物合成途径的基础,其大体上除去了对石化原料的依赖,例如也通过在将体内或体外的合成(甲基)丙烯酰辅酶A的合成和在体外的酯合成或含有两个体内步骤的酯合成组合。
在第一方面,本发明涉及不含有可带正电荷或带正电荷基团的丙烯酸和/或甲基丙烯酸的酯,尤其是(甲基)丙烯酸正丁酯(很优选的)、(甲基)丙烯酸乙酯(优选的)、(甲基)丙烯酸甲酯(优选的),或还有(甲基)丙烯酸的正丙基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、2-乙基丁基、正戊基、异戊基、1-甲基戊基、1,3-二甲基丁基、正己基、异庚基、1-甲基己基、2-乙基己基、硬脂基或2-羟基乙基酯,或两种或多种这些酯的混合物的生产方法或过程,所述方法包括任选地或优选地在催化剂的存在下,使一种或(不太优选地)多种不含有可带正电荷或带正电荷基团的醇,尤其是正丁醇(很优选的)或乙醇(优选的),或甲醇(优选的),或还有正丙醇、异丙醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇、2-乙基丁醇、正戊醇、异戊醇、1-甲基戊醇、1,3-二甲基丁醇、正己醇、异庚醇、1-甲基己醇、2-乙基己醇、硬脂醇或2-羟基乙醇与(甲基)丙烯酰辅酶A反应,其中所述催化剂可以是无机、有机或有机金属催化剂;或优选是能够将醇基从如上下文定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的生物催化剂。依赖于起始物,可得到相应的产物或产物混合物。
另外,酰胺也可以通过使(甲基)丙烯酰辅酶A与胺反应来生产以得到相应的酰胺。酰胺可以包括,但不限于二甲基丙烯酰胺、异丙基丙烯酰胺、正丁基丙烯酰胺、戊基丙烯酰胺、二甲基氨基丙基(甲基)丙烯酰胺。
在进一步的方面,本发明涉及被一种或多种(优选重组的)核酸转化的基因修饰的生物体(GMO),所述核酸包含一个或多个编码或允许使醇基从如上下文定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的生物催化剂的表达的区。
在另一方面,本发明涉及在上一段中提到的GMO在生产不含有可带正电荷或带正电荷基团的丙烯酸和/或甲基丙烯酸的一种或多种酯,尤其是如上下文定义的那些酯中的用途,其包括向所述微生物的培养物给予一种或多种合适的源于生物质的起始物并且还优选相应的不含有可带正电荷或带正电荷基团的醇,尤其是如上下文定义的那些醇,以及分离所得的(甲基)丙烯酸酯。
本发明还涉及能够将醇基从如上下文定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的生物催化剂在进行使(甲基)丙烯酰基部分从(甲基)丙烯酰辅酶A转移到正丁醇(体外和/或体内)中的用途,以生产丙烯酸正丁酯(很优选的)或将乙醇转移来生产丙烯酸乙酯(优选),或将甲醇转移来生产丙烯酸甲酯(优选)或将2-羟基乙醇转移来生产甲基丙烯酸(2-羟基-乙基)酯或使其它的醇发生类似的反应来生产其它酯。也可以使用醇的混合物来得到酯的混合物。
在一种实施方案中,根据本发明的方法或过程包括具有合成酶活性的生物催化剂在生产(甲基)丙烯酰辅酶A(尤其是用在具有低水平的双加成物形成的体外发生的相应的反应步骤)中的用途。所述合成酶可以是能够形成(甲基)丙烯酰辅酶A的任何合成酶。例如,它可以是辅酶合成酶,尤其是辅酶A合成酶。术语合成酶包括,但不限于酰基合成酶、丁酰基合成酶、丙酰基合成酶或优选乙酰基S-辅酶A合成酶。或者,可以使用能够进行丙烯酸或甲基丙烯酸或(甲基)丙烯酸盐与辅酶A之间的反应的任何合成酶。
形成本发明基础的反应可以用以下反应方案代表:
方案II:
在方案II中,基团R是不含有可带正电荷或带正电荷基团的醇,尤其是如上下文定义的醇的醇残基(不具有OH上的H)。
优选地,根据以下方案III,通过具有合成酶活性,如S-乙酰辅酶A合成酶活性(其是一种用于本发明的优选的合成酶)的生物催化剂,从丙烯酸或甲基丙烯酸和/或盐,例如其碱金属盐,如其钠盐,在下文中通常称为(甲基)丙烯酸盐,在体外或体内合成(甲基)丙烯酰辅酶A:
方案III:
与上述文献形成对照,如果对(体外)反应条件进行适当改进,就可以得到令人吃惊的实质量的(甲基)丙烯酰辅酶A,而不是双加成物,因而提供了一种贡献使得本发明的方法或过程可以导致良好的所述的酯的产率。
因此已经证明反应可以产生更多所要的(甲基)丙烯酰辅酶A,如果(甲基)丙烯酸盐和辅酶A的摩尔比是如此以致(甲基)丙烯酸盐以摩尔过量的方式被使用,例如以超过2倍摩尔过量,优选超过4倍摩尔过量,甚至更优选超过10倍,例如(甲基)丙烯酸盐大约比辅酶A过量15倍;例如,(甲基)丙烯酸盐的浓度可以在50-300,例如120-280mM的范围内,并且辅酶A的浓度是其几分之一,优选正如可以刚刚提到的有利于(甲基)丙烯酸盐的优选的摩尔过量比例推导的分数。
还存在其它所需的成分(例如,Mg2+盐,如MgCl2;ATP(优选以相对于(例如碱金属,如钠)低于化学计量的摩尔量的(甲基)丙烯酸盐,例如以少于(甲基)丙烯酸盐摩尔量的1/5,例如该数量的1/10),以及当然还有生物催化剂,优选S-乙酰辅酶A合成酶,其以合适的活性存在,例如在ATP、乙酸盐或辅酶A存在下在37℃以0.5-15单位/ml存在。优选还存在缓冲物质,例如Tris缓冲液(三(羟甲基)氨基甲烷或其它允许确定合适的pH值,例如在5-9,如6-8(例如,大约pH 6.4-7.3)范围的pH的其它缓冲物质。这些包括任何合适的生物相容的缓冲剂,例如磷酸盐缓冲剂等。然而,在一个替代的实施方案中,反应发生不需要缓冲剂并且可优选不存在缓冲剂以避免反应混合物被缓冲组分污染。
如果在反应过程中辅酶A不是立刻全部被加入的而是以较小批量(很优选的分批加料方法)或连接加入的,则所要的(甲基)丙烯酰辅酶A产物相对于双加成物的产量可以被改善,因而可以允许硫酯形成发生在进一步的辅酶A加成到其产物(甲基)丙烯酰辅酶A的双键上。例如,辅酶A可以以总的最终数量/浓度的1/20-1/3的量以一定间隔在一时间段内分批地加入,例如在至多0.5小时内,例如辅酶A的1/10将分别在0、5分钟、10、15和20分钟时被使用。另外,在加入辅酶A的同时也可以补充ATP。
当需要时,还可以在合适的时间段后补充酶。
因此,在每个单个的时间点,优选将游离的辅酶A的低于化学计量的浓度保持在低于原始(甲基)丙烯酸盐浓度的1∶100的比例,例如1∶150,例如2mM或更低,例如大约1mM或更低,并且更优选地在每个时间点将ATP的浓度保持在低于(甲基)丙烯酸盐的原始浓度的1/20,例如低于10mM,例如处在或低于大约5mM。
本发明的一种有趣的变种涉及利用丙烯酸作为唯一的碳源(例如,同化为乳酸盐和然后同化丙酮酸盐,后者经Krebs循环可以被利用),其也被平行地供应给到方案III中提供的反应中。这种方法尤其可以提供用于合成根据本发明的方法和过程生产的(甲基)丙烯酸酯的良好的条件。
任选地或优选地在催化剂的存在下,也可以使用源于生物质的合适的起始物,代替提供(甲基)丙烯酸或其盐作为与选择的醇反应的前体,所述催化剂可以是无机、有机或有机金属催化剂;或优选是能够将醇部分从如上下文定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的生物催化剂。这些前体是生物过程的产物(包括但不限于废弃的生物质材料,如能够被处理,例如被水解,以释放合适的起始物的农业材料)并且经生化途径可以先转化为(甲基)丙烯酰辅酶A。其例子是糖类(例如来自废弃的生物质材料、淀粉、纤维素或其它多糖)、多元醇(例如来自脂肪)、有机酸(例如来自代谢或来自脂肪酸酯水解)、氨基酸等。如在此所述,然后可以将(甲基)丙烯酰辅酶A转化为(甲基)丙烯酸酯。因为生物质是可再生的,所以该方法就可持续发展和环境保持来说基本上是很有利的。在原理上和有利地,从具有生物质起始物的生化途径也可以衍生其它起始物,尤其是如上下文定义的不含可带正电荷或带正电荷基团的醇。然而,由于实际的原因,这些起始物可以被原样加入。
其中可以将前体加入以合成根据本发明的酯的一些可能的代谢反应途径和可能的连接点以及酶催化活性的实例被显示在上述方案I和下述的方案IV中。
方案IV:
这里,大写字母A-N优选指示下列酶活性:
A:磷酸烯醇丙酮酸羧激酶;
B:天冬氨酸氨基转移酶;
C:天冬氨酸脱羧酶;
D:辅酶A转移酶;
E:β-丙氨酰辅酶A氨裂合酶;
F:乙酰辅酶A羧化酶;
G:丙二酸单酰基辅酶A还原酶;
H:3-羟基丙酰辅酶A脱水酶(=丙烯酰辅酶A水合酶);
I:(乙酰)辅酶A合成酶或(乙酰)辅酶A转移酶(其可以是酶复合物如WO 02/042418中的OS 17的一部分);
K:丙酰辅酶A还原酶(其可以是酶复合物如WO 02/042418中的OS 17的一部分);
L:辅酶A合成酶或辅酶A转移酶;
M:乳酸辅酶A脱水酶;
N:能够将醇部分从如上下文定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的生物催化剂。
为了合成甲基丙烯酸酯,例如,可以利用异丁酸或其代谢前体代替方案IV中的丙酸作为连接点或起始物。
其它方法是可能的,例如利用可以使用旋卷分枝杆菌(Mycobacterium convolutum)或用于生物催化剂以及从其可以得到生物催化剂的基因材料的将丙烯氧化成丙酸盐的途径,分别通过例如赤红球菌(Rhodococcus ruber)或深红红球菌(Rhodococcus rhodochrousthe),利用细菌腈水解酶或腈水合酶与酰胺酶活性组合将丙烯醇氧化成丙烯酸盐(例如,利用荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)或珊瑚诺卡氏菌(Nocardia coralline)或用于生物催化剂以及从中可得到生物催化剂的基因材料)或丙烯腈或甲基丙烯腈。
相应的途径和酶活性可以是形成生物体,尤其是植物(或植物组织)或更优选是微生物(尤其是单细胞生物体),最尤其是原核生物,例如细菌,或(至少在它们生命周期的一部分期间)单细胞真核生物,例如真菌,如酵母的部分天然核酸和基因设备的核酸的基因表达(包括转录和翻译以及可能的翻译后的修饰)的结果,或它们可以是这类细胞的转化结果(然后这类细胞变成导入的外来核酸的宿主,即基因修饰的生物体(GMO)),所述生物体包含来自其它生物体(例如,动物,如啮齿动物或人)的“外来”核酸或其类似物,它们还具有所需的编码或能够表达相应的生物催化剂活性的区,优选具有重组的核酸,例如具有载体(例如质粒、粘性质粒、病毒性或源于病毒的载体),除了一个或多个编码根据本发明的方法的合成(甲基)丙烯酸酯或其前体所需的生物催化剂活性的区之外,所述核酸或其类似物可以包含一个或多个阻遏物、激活剂、启动子和/或转运序列或其它序列,它们在细胞内或穿过细胞膜的整合、维持、转运、翻译后的修饰并且尤其是编码的多肽的表达和它们的活性以及任选的允许筛选尤其是携带一个或多个生物合成相应的酶催化活性所需的遗传信息组分的重组核酸构建体的遗传标记(如半乳糖苷酶或抗生素抗性编码序列)是所需的或有用的。
从WO 02/042418中得到或从中可以推导出可能的多肽和基本的遗传信息/核酸的实例,这些多肽和基本的遗传信息/核酸可用于获得可直接用在它们的母生物体中或不同的宿主细胞的转化中的酶活性,并且该公开和尤其是相应的核酸和氨基酸序列以及其中用于获得它们或其类似物的方法在此通过参考文献引入。在基因技术,尤其是用于分离、重组、表达、转化等中有用的方法是本领域技术人员已知的并且可以例如基于或利用在以下文献中公开的知识、方法和试剂:Sambrook等人,Molecular Cloning-A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring HarborPress,1989或Gassen等,“Gentechnische Methoden-Eine Sammlung vonArbeitsanleitungen für das molekularbiologische Labor”(翻译:“基因工程方法-分子生物学实验室的工作方法集”),Spektrum AkademischerVerlag,Heidelberg 1999,在F.M.Asubel(Hg.)“Short Protocols inMolecular Biology”,第3版,New York,Wiley 1997;或Asubel等人,“Current Protocols in Molecular Biology”,Vol.1-3,Greene PublishingAssociates and Wiley-lnterscience,New York,1987。
作为实例,一个迄今为止未知的分离的具有在本发明中有用的生物催化活性的酶(例如,脂肪酶、酯酶(如乙酰胆碱酯酶)、转移酶(如胆碱乙酰转移酶)或合成酶,尤其是辅酶A合成酶(如S-乙酰辅酶A合成酶)、蛋白酶或酰基转移酶(如氨基酰化酶)可以部分被部分测序,例如,利用用于选择性消化的选择性内切蛋白酶,例如内切蛋白酶Lys-C、内切蛋白酶Glu-C、胰凝乳蛋白酶、嗜热菌蛋白酶或优选胰蛋白酶(从碱性氨基酸精氨酸或赖氨酸的C-末端切割)和,在分离后,例如,在凝胶上进行电泳或通过色谱(例如,HPLC),确定所得肽的末端序列,例如,通过外肽酶,例如羧肽酶,如羧肽酶A、B或P)。优选的是胰蛋白酶消化,然后进行MS/MS分析(TOF)。这样得到的序列然后可用于例如发现相应的编码核酸(例如,RNA或尤其是DNA)序列或它们的非编码反义链,然后可将后者用于设计引物以(例如,通过与基因组或部分(例如,限制性内切核酸酶)消化的DNA杂交)发现编码相应酶的更长的DNA片段(或来自双股DNA中的配偶链的相应的非编码序列),后者然后可以被拼接在一起(例如,通过基因步移)以完成编码的核酸;或来自cDNA库。通过将上一段中提到的参考文献中描述的方法组合,然后可能分离编码具有所需活性中的一种的多肽的DNA。
或者,已经公开的编码相应的生物催化活性的序列的合成或分离的DNA(例如,cDNA)可以被使用和整合到载体中,所述生物催化活性是例如酶,例如脂肪酶,酯酶(如乙酰胆碱酯酶)、转移酶如胆碱乙酰转移酶或合成酶,尤其是辅酶A合成酶如S-乙酰辅酶A合成酶活性、蛋白酶或酰基转移酶(如氨基酰化酶),和/或转运剂,例如用于具有官能团(如酰胺、羟基、醚、酮或酯基)的更大的酯。
术语“核酸”是指多核苷酸,尤其是DNA。提到重组核酸时,目的是具体是指合适的载体形式的核酸,以及由其得到转化的宿主细胞形式的产物(例如,由于整合到还包括质粒等的基因组中和同时发生的变化、重组或类似的事件)。在宿主生物体的转化中有用的重组核酸是,例如,载体(例如,质粒、粘粒、病毒性或源于病毒的载体等),其包含表达相应的生物催化剂活性所需的编码序列。
一般地,“重组体”在用在含有核酸或尤其是DNA的上下文中时,优选具有它的通常含义,例如包括(1)在其被引入或尤其是表达的生物体中不天然存在的序列,或(2)通过人工组合两种以其它方式分离的短序列(例如,通过将编码序列插入质粒或其它载体中)而制成的序列。所述人工组合可以通过化学合成和/或优选通过对核酸的分离的片段进行人工操作而达到,例如通过遗传工程技术,如部分消化,例如用内切核酸酶、连接、剪切等。“重组体”还用于描述已被人工操作并含有同样的调控序列和编码区的核酸分子,所述调控序列和编码区是在从中分离核酸的生物体中发现的。
本发明还特别涉及使用一种或多种基因修饰的生物体(GMO)的(至少部分)生物合成任何一种或多种不含可带正电荷或带正电荷基团的(甲基)丙烯酸酯的途径以及相应的GMO,优选选自基因修饰的优选的(至少在其部分生命周期内)单细胞微生物(尤其是原核生物,最优选细菌,或真菌,最优选酵母,但是也可以使用昆虫细胞,例如使用细胞病毒表达系统),其(已经是其天然形式或被一种或多种合适的核酸转化后)包括:
a)核酸(尤其是DNA),其来自原核生物,优选细菌;或不太优选地真核生物,如酵母、其它昆虫、真菌或植物细胞、真菌或植物的组织或植株;其中每一个都能使GMO以生物催化方式将生物质起始物(优选如上定义的,例如多元醇或糖类如葡萄糖)优选转化成乳酸盐并进一步转化成(甲基)丙烯酰辅酶A;
b)与一种或多种(优选重组的)核酸(尤其是DNA)组合,其中所述核酸编码能够将醇部分从如上下文定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移到(甲基)丙烯酰辅酶A,如转移酶(EC2)或水解酶(EC3),例如脂肪酶、酯酶、蛋白酶或酰基转移酶(如氨基酰化酶)(包括编码一种或多种这样的酶)。这些酶可以源于原核生物如细菌、真核生物或高等生物,如来自念珠菌属(Candida spp.)的脂肪酶、来自哺乳动物细胞的酯酶或胆碱乙酰转移酶,并且可以将它们本身供应到反应。或者,它还可以由来源于所述生物质的合适的起始物生物合成产生。
有利地,如果GMO还没有显示这样的活性,则还可将其另外修饰以确保用作起始物的所选择的醇(如在上下文定义的)能够进入细胞和/或在需要时允许可得到的(尤其是所得的)酯产物离开细胞。将来自微生物,尤其是原核生物或单细胞真核生物或植物的活性或重组基因材料与高等生物的活性或重组基因材料组合的这种构思的实施方案,例如将编码能够使醇部分从如上下文定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移到(甲基)丙烯酰辅酶A的酶的基因材料看作优选的(甲基)丙烯酸酯的合成,如所得的GMO和它们在生产(甲基)丙烯酸酯(如上下文定义)中的用途和/或利用这些GMO在生产(甲基)丙烯酸酯(如上下文定义)的过程或方法是本发明特别优选的变种,尤其是包含编码除已经存在或已经被重组整合至所述GMO中的其它所需活性外还编码所需活性的重组核酸的这类GMO在如上下文定义的(甲基)丙烯酸酯的生产方法中的用途。本发明还涉及生产各自的GMO,尤其是单细胞生物体,尤其是原核生物,如细菌,例如大肠杆菌(E.coli),或真菌或单细胞真核生物,例如酵母,其包括将一种或多种编码在a)和b)下的该段落中提到的活性的核酸组合。优选的是转化的原核生物,尤其是细菌,或转化的真菌,优选酵母,其包含一种或多种(天然或重组的)核酸,所述核酸编码能够使醇部分从如上下文定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的酶。
产物(甲基)丙烯酸酯(如上下文定义)当在细胞(例如,在上一段中提到的GMO)中产生时可以直接从上清液中分离(也在透化处理的细胞的情况下)或(如果其不容易离开细胞)在将细胞透化处理(其也可以允许起始物的进入)后分离,例如用合适的表面活性剂或孔蛋白(例如,来自哺乳动物补充系统)或在将细胞膜破坏(例如,化学的或机械的)后,例如采用一种或多种应用匀浆器、混合器、超声破坏等的方法。在破坏的情况下,剩余细胞可用于进一步的生产,例如,如果只有部分培养物被用于破坏,则连续反应是可能的,但是优选分批的或分批加料方式的生产,尽管在其它情况下所述方法可以用连续或分批的方式进行,将产物从上清液中分离出来。
在任何情况下,还有在体外合成情况下的产物或产物丙烯酸酯的分离,可以采用标准方法进行,例如使用色谱法(尤其包括离子交换色谱的步骤)、电渗析、溶剂洗涤、萃取、分配等,或这些方法的组合。或者,可在原位聚合相应的(甲基)丙烯酸酯单体,或者产生均聚物或者加入其它可聚合的单体,例如丙烯酰胺、苯乙烯等,不需要事先纯化。在特别优选的产物回收方法(尤其可用于生产挥发性的(甲基)丙烯酸酯)中,将反应混合物上方的蒸汽冷凝,并且如有必要或有愿望,则将未反应的起始物在从产物流中部分或全部分离后再循环到反应器中。通过应用热或真空或两者可以帮助这一过程。作为例子,来自乙醇和丙烯酸乙酯的含水混合物的蒸气形成一种重量计由10.1%水、48.3%乙醇和41.6%丙烯酸乙酯组成的共沸物(Azeotropic Data III,由L H Horsley编纂,Advances in Chemistry Series 116,American Chemical Society,Washington DC,1973)。调节压力至165mmHg,这一比例转变为8.6%水、36.3%乙醇和55.1%所需的丙烯酸乙酯。相对于其它组分进一步浓缩所述酯对于本领域技术人员来说是已知的技术,并且将会允许将分离的乙醇再循环到反应器中。通过用这种方式除去所述丙烯酸酯,通过将平衡移向有利于正反应的方向,可以预期得到更高的转化效率。对于水/正丁醇/丙烯酸正丁酯的混合物,在大气压下共沸物蒸气的重量比是50%/37.6%/12.4%,在100mmHg下转变为41%/26%/33%。
也可能减小或(当相应的生物催化活性不是利用此类活性的活的细胞的存活所需要的时)除去某些生物催化剂的活性,例如通过一种或多种方法,如基因破坏、反义核酸、突变、敲除法或者给予可逆的或不可逆的抑制剂等,以便允许所需要的产物或中间体(例如,丙烯酰辅酶A或甲基丙烯酰辅酶A)的积累,通过阻断导致远离这些产物的代谢途径而不是用于其合成且优选进一步反应成如上下文定义的(甲基)丙烯酸酯的途径(例如,方案IV中所示的经过酶活性E、H、K或M催化或引导的一个或多个反应)。这可用于达到更高的合成如上下文定义的(甲基)丙烯酸酯所需的前体,例如,(甲基)丙烯酰辅酶A)的可利用度(浓度)。
虽然在具体情况下在体外和体内反应的差别的边界可能出现模糊,但这些表述被优选定义如下:
“体外”在本公开中使用时,优选意思是相应的过程在采用不再存活的(即,不再显示所有(意思是没有或一点所有)生命的迹象,即活动性、繁殖、代谢、遗传性、有或没有可突变性以及可兴奋性)的细胞或细胞组分(至多纯化的酶)或采用无细胞的体系,例如酶溶液进行。体外还可以指没有存活的生物体的组分(例如,酶、细胞器等),例如纯粹在起始物(如醇和(甲基)丙烯酰辅酶A)存在下。
“体内”是指过程在活的、基本上完整的生物体或细胞(其显示了在上一段中定义的生命特征)存在下或优选主要在所述生物体或细胞内发生。术语“基本上完整的”目的也是要包括具有透化膜的生物体或细胞,例如通过表面活性剂或孔蛋白等,只要还存在在上一段中定义的生命特征。
当要使用(至少基本上)完整的,如(尤其是转化的,导致GMO)细胞或生物体时,在某些情况下(例如,当如上下文定义的起始物醇不容易透过膜或当这导致改进的转运时)是有用的,如果这些细胞或生物体具有一种或多种合适的转运分子(尤其是整合到它们各自的细胞膜的那些转运分子,例如膜蛋白),它们允许醇容易地穿过细胞膜。
当需要或有用(例如,要加快转运,或从细胞内的平衡中除去产物)时,还存在一种或多种用于(甲基)丙烯酸酯产物的转运分子,或者其已经作为所使用的生物体的天然设备的部分或者作为基因重组和转化的结果。
或者,可以使用具有可透化细胞膜(例如,通过已经提到的表面活性剂或孔蛋白)的细胞。
如果将基本上完整的生物体或细胞用作生物催化剂,例如在发酵过程中,需要加入低量的(通常意思是只有最低或没有)的辅助因子,从而这是本发明特别优选的实施方案(虽然有时必要提供营养物,其包括在所述辅助因子的生物合成中有用的前体或维生素)。原因之一是所述细胞能够再循环并且有时甚至能够由自身合成所需的辅助因子(例如,ATP、NAD(P)+、NAD(P)H、FAD、FADH、辅酶A)。
然而,所述生物体/细胞通常只对高浓度的有机底物反应很敏感(底物或产物抑制、溶剂去活化)。因此,在不得不使用特定溶剂或者当底物或产物可能导致反应速率或产率降低时,使用部分纯化的体系也可以是有利的,这形成了本发明的不同实施方案。对于部分纯化,将细胞破坏,并且在需要时除去所述的细胞碎片并且得到无细胞的提取物。
优选如此选择发酵时间以达到就所需的生物催化剂(例如,能够使醇基从如上下文定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰基辅酶A和/或(甲基)丙烯酰辅酶A合成)活性方面来说的优化。例如,当细胞密度达到足够的值时,中断培养。以已知的方式分离出培养液,例如通过离心分离,并以常规的方式分解沉降的细胞,例如通过与精细的特定材料如玻璃珠等摇荡,通过超声处理,使用匀浆器、混合器或法式压榨机等。将不溶解的细胞组分和(如果使用的话)特定的材料如玻璃珠等任选地除去,例如通过离心或过滤,并且将不含颗粒和细胞碎片的残留物用作生物催化剂活性来源(粗提取物)。该残留物作为包含生物催化剂活性的粗提取物可以被直接用于根据本发明的过程中。然而,有利地,为了除去核酸(粘性溶液)以及其它杂质或干扰组分(例如,抑制剂或破坏酶活性等),对该提取物进行进一步的纯化以得到在本发明中有用的更加纯化(更富集的)形式的生物催化活性或活性。优选地,对所述粗提取物进行一步或多步在本领域中已知的纯化步骤,以便从所述提取物中除去干扰组分。或者,能够使醇部分从如上下文定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的生物催化剂可以被微生物分泌到培养介质中,从而所述生物催化剂可以很容易地被回收并就此用作粗制剂。粗制剂是任何溶液,其包含能够将醇部分从如上下文定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的生物催化剂,其包括污染组分如生长介质组分或作为微生物代谢的结果而存在的化合物。
术语“纯化的”优选是指“处于至少部分纯化的形式”(=“处于富集形式”),或更优选地,在更严格的意义上纯化的,即以实际上分离的形式(例如,在分离的蛋白质的情况下,如能够使醇基从如上下文定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的酶或辅酶A合成酶),尤其是与存在的其它寡肽或多肽相比以重量纯度超过50%,最尤其是超过95%)。
进一步地,本发明涉及在本公开中提到的生物体在生产一种或多种所需的生物催化剂,尤其是能够将醇部分从如上下文定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的生物催化剂或替代地或除此之外还有合成酶,尤其是辅酶A(尤其是S-乙酰辅酶A)合成酶活性中的用途,其中提到的生物体(这里与本公开中所有其它提到生物体的地方一样)可优选是如上所述的GMO,如(优选转化的)植物或植物部分或植物组织或昆虫细胞或尤其是微生物,尤其是细胞,更尤其是用于各自的重组基因材料的宿主细胞(如细菌,例如大肠杆菌、乳酸克鲁维酵母(K.Lactis)、乳酸杆菌属物种(Lactobacillus spp.)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)、丙酸梭菌(Clostridiumpropionicum)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、杆菌属物种(Bacillus spp.)或凝结芽胞杆菌(Bacillus coagulans)、红球菌属物种(Rhodococcus spp.)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)、链霉菌属物种(Streptomyces spp.)、巨球形菌属(Megasphera spp.)、对于极端(例如温度和/或pH)条件的例子有古细菌、酵母或其它真菌,如酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、克鲁维酵母属物种(Kluyveromycesspp.)、毕赤酵母属物种(Pichia spp.)、汉森诺罗菌属物种(Hansenulospp.)、念球菌属物种(Candida spp.)、毛孢子菌属物种(Trichosporonspp.)或Yamadazyma spp.),其被合适的核酸转化,所述生物催化剂然后可在根据本发明的合成如上下文定义的(甲基)丙烯酸酯的生产方法(体外、体内或组合的)中使用。
除非已经在上文或进一步在下文中另外指示,在本发明的说明书中使用的其它一般性术语、符号和名称优选具有下述含义(其中更具体的定义在每种情况下单独地或组合地可用于替代更广义的术语,以便定义本发明的更优选的实施方案,也已经关于在上文给出的一般性术语、符号和名称及其解释或优选含义):
可在根据本发明的方法或过程中使用的催化剂可以是任何能够使醇部分从如上下文定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的组分。
术语“生物催化剂”,例如在“能够使醇部分(是指包括OH反应基团的氧的部分)从如上下文定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的生物催化剂”或“具有(=具有)转移酶活性的生物催化剂”,当在这里使用时,涉及具有各自的(例如,能够使醇部分从如上下文定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的酶,如转移酶、脂肪酶、酯酶、酰基转移酶或蛋白酶)活性的生物催化剂,尤其是酶,最优选多肽,其具有所述转移酶活性,优选如在本文中所描述的。如果没有另外指明,所有这些术语不仅包括本发明的多肽的天然存在的“真实的”序列(它是本发明的优选实施方案),而且还包括所有的突种、突变体及其具有各自的活性的片段,优选具有它们所来源的天然的(母本)酶(尤其是分离形式的)的至少1%的相对活性,更优选具有至少10%的相对活性。在有关迄今为止未知的分离的酶的段落中,术语脂肪酶、蛋白酶、酰基转移酶、转移酶和酯酶如上所述是优选的。
术语“具有合成酶活性的生物催化剂”优选涉及在消耗源于三磷酸核苷(如ATP)的能量下,能够将羧酸部分,尤其是丙烯酸盐和/或甲基丙烯酸盐转移至辅酶A的巯基的生物催化剂,例如辅酶A合成酶,如S-乙酰辅酶A合成酶。
“能够将醇部分从如上下文定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的生物催化剂”尤其是指相应的生物催化剂,优选酶,在用于测定所需酶活性的标准测定体系中是有活性的,所述酶催化对于该优选的特定的酶来说天然的反应,因为这样的生物催化剂是EC 2酶,即转移酶,包括但不限于已知的催化化学基团从一个化合物转移至另一化合物的转氨酶、转酰胺基酶、转酮基酶、转磷酸酶或胆碱乙酰转移酶,或第3类EC;“水解酶”也能够催化酯转移反应。合适的水解酶是,例如来自南极假丝酵母的脂肪酶(CAL B)、猪胰脂肪酶(PPL)、皱褶假丝酵母(CRL)、洋葱假单胞菌(PCL)等;酯酶如猪肝酯酶(PLE)乙酰胆碱酯酶;还有蛋白酶如枯草杆菌蛋白酶、例如来自曲霉属物种(Aspergillus spp.)、杆菌属物种(Bacillus spp.)、根霉属物种(Rhizopusspp.)的蛋白酶以及其它水解酶如青霉素酰胺酶或(尤其是L-氨基)酰基转移酶可以是催化转移的合适的酶。在本发明中使用或在至少一个后续的测定中有用的生物催化剂有利地显示超过0.01nmol/分/mg蛋白质的活性,更优选超过0.1nmol/分/mg蛋白质,甚至更优选超过0.4nmol/分/mg蛋白质的活性。例如在测定胆碱乙酰转移酶活性时,用于所述酶活性的测定方法(该方法也适用于与膜结合或缔合的酶的情况,例如测定匀浆物)是已知的,例如使用14C-标记的乙酰辅酶A,参见例如Fonnum,F.,Biochem.J.115,465-79(1969)或Fonnum,F.,J.Neurochem.24,407(1975),或Rylett等,J.Neurochem.45,611-20(1993),例如测定在40μl反应混合物中在37℃的初始反应速率,所述反应混合物含有5-1200μM[1-14C]乙酰辅酶A(Amersham)、0.1-3.5mM胆碱、0.2-10ng具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂、50mM磷酸钠(pH 7.4)、250mM NaCl、1mM EDTA和0.5mg/ml BSA(参见Ohno等人,Proc.Natl.Acad.SciUSA 98(4),2017-22(2001))。在一种优选的实例性方法中,为了测试用于合成目的的生物催化剂的有用性,例如首先使用其天然底物乙酸盐来测定将要测试的生物催化剂的胆碱乙酰转移酶活性。然后在pH 7.46的缓冲液(1.1mM Na2HPO4/0.7mM NaH2PO4)中制备7mM胆碱盐酸盐溶液。将该胆碱溶液(3ml)在37℃温育15分钟。加入乙酰辅酶A(2mg,2.5μmol)和0.1ml pH 7.4胆碱乙酰转移酶或将要测试的生物催化剂(例如就乙酸盐来说具有例如大约5.5-20nmol/min的活性)并随时间变化测定吸光度。一旦反应完成,就将反应混合物冷冻储存直到通过离子色谱法(IC)进行分析。在Dionex DX-300仪器上进行IC分析,所述仪器具有IonPac CSl2A柱子、90%的20mM甲磺酸/10%的90%(v/v)乙腈水溶液的流动相和电导率检测(CSRS自动抑制外部水模式阳离子再生系统)。在435分钟后,可以采用含有具有假定的初始活性为20nmol/min的酶测定0.10mM乙酰胆碱。在本试验体系中具有足够活性的生物催化剂应该在这些条件下有利地提供超过0.02mM乙酰胆碱。更优选地,在任何所采用的用于具有胆碱乙酰转移酶活性(所述生物催化剂在本发明的过程和方法中特别有用)的生物催化剂的乙酰辅酶A的活性测试体系中,甲基丙烯酰辅酶A或优选丙烯酰辅酶A的活性应该超过10%,甚至更优选超过50%。具有胆碱乙酰转移酶活性的酶的例子有来自人类或其它脊椎动物,如小鼠或尤其是大鼠,或更一般地来自其它后生动物的酶。这里还包括重组的胆碱乙酰转移酶,如有利地重组的大鼠胆碱乙酰转移酶AG220,其来自Chemicon International Inc.,Temecula,California或其类似物。
为了测试脂肪酶活性,也可以使用已知的方法,例如在Biotechnology Techniques 10(4),283-286中描述的,使用例如1-十一碳烷醇、9-癸烯-1-醇、10-十一碳烯-1-醇、13-十四碳烯-1-醇、油醇或硬脂醇和另一方面,使用丙烯酸甲基酯或甲基丙烯酸甲酯作为底物。
或者,例如,酯酶或脂肪酶的活性可以通过测定在给定的时间段在37℃、pH7.0下和在0.025%(最终浓度)牛磺胆酸钠存在下由测试酶从三油酸甘油酯乳液(橄榄油)中释放的脂肪酸的量来确定。为了确保所有释放的脂肪酸都被测定,将所有的滴定彻底进行至pH 9.0,并且对底物乳液进行空白滴定以确定任何不是由脂肪酶活性产生的酸。将一个单位定义为在所述测定条件下每分钟释放一微摩尔脂肪酸的酶的量。将比活性用国际FIP单位/mg酶表示。作为设备,使用自动滴定仪、高速匀浆器、水浴和磁力搅拌器。试剂是阿拉伯树胶(欧洲药品级)、三油酸甘油酯(橄榄油)USP、牛磺胆酸钠(FIP级)。将110g阿拉伯树胶或金合欢和125g氯化钙溶解在蒸馏水中并弄至1升,然后在室温下搅拌30分钟以溶解所述材料并离心或过滤以生成透明溶液。在5℃在冰箱中储存。为获得底物溶液,向130ml三油酸甘油酯中加入400ml阿拉伯树胶或金合欢溶液,然后在低于30℃的室温下在混合器中高度乳化。使用微观控制,90%的液滴的直径应当小于2-3微米,其余部分不超过10微米。对于酶溶液,将要测试的酶溶解在1%盐水中,优选浓度对应于2.4-3.6单位脂肪酶/ml。为了所述测试,将24ml底物、2ml牛磺胆酸盐溶液(0.5g牛磺胆酸盐溶于100ml蒸馏水中)和将9ml蒸馏水放在反应容器中并用磁力搅拌平衡至37℃。将pH电极和滴定管的尖端浸入所述溶液中并将pH用NaOH(0.02M)调节至6.7。将自动滴定管调零并加入5ml酶溶液,启动计时器并且在反应进行时保持pH在7.0。10分钟后,通过手工加入NaOH(0.02M)而突然将pH调节至9.0。这是快速地进行的(大约30秒)并且记录NaOH的总体积(N1)。采用水代替酶进行对照滴定并确定滴定值(N2)。可以采用手工滴定,其中始终通过手工加入NaOH来维持pH 7.0。为了计算活性,1ml NaOH对应于中和20微摩尔脂肪酸。例如,当5ml酶溶液释放N1ml NaOH并且对照释放N2ml NaOH,并且其中N1是样品,N2是对照和C是用mg/ml表示的酶浓度,则根据下列公式确定了比活性
(Alphamerix Ltd.,Cambridge,UK)
“具有合成酶活性的生物催化剂”尤其是指相应的生物催化剂,优选酶,在用于测定乙酰辅酶A合成酶活性的标准测定体系中是有活性的。例如,下列监测AMP形成的偶联的酶试验可以被用来测定乙酰辅酶A合成酶的活性:该测试由下列组成:ATP(2.5mg,5×10-3mmol)、CoA(0.46mg,6×10-4mmol)、MgCl2(4mg,2×10-2mmol)、磷酸烯醇丙酮酸(0.19mg,9.4×10-4mmol)、KCl(1.2×10-4mmol)、NADP (0.25mg,3.6×10-4mmol)、乙酸(10-1-10-4mmol)、乙酰辅酶A合成酶或将要测试的生物催化剂(优选具有大约0.5单位的活性)、丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶(1单位)、肌激酶(1单位),并用Tris缓冲液(0.25M,pH 7.2)将其配制至1ml的总体积。通过观察由于NADH氧化为NAD+在340nm处的吸光度的降低来监测反应。通过Lineweaver-Burk和Eadie-Hofstee图计算Vmax和结合常数。其它测定方法是可能的,例如采用经由乳酸脱氢酶和柠檬酸合成酶的与NAD+的还原偶联的乙酰辅酶A的形成,例如按照Cai等人在J.Bacteriol.182,2113-8(2000)或Charles等人在Genetics 146,9877-82(1997)中所述。特别优选的是由Sigma采用的用于测试胆碱乙酰转移酶活性的方法,该方法是对Berg,P.,J.Biol.Chem.222,991-1013(1956)所述方法的改进:这里,采用羟胺将形成的乙酰辅酶转化成乙酰-NHOH。然后将乙酰-NHOH与FeCl3溶液混合以产生棕色的产物,然后在546nm处、以1cm光程测量所述产物的吸光度。简单来说,反应混合物(1.10ml/每瓶)的最终测定浓度是:136mM磷酸钾、4mM氯化镁、9.1mM ATP、45mM氟化钾、9.1mM乙酸钾、9.1mM还原的谷胱甘肽、0.35mM辅酶A、182mM羟胺和0.02-0.04单位S-乙酰辅酶A合成酶,后者在37℃下将剩余溶液平衡后以0.1ml的体积被添加。pH值是7.5。在添加酶后,将混合物立即混合并温育20分钟。在那之后,加入2ml的370mM FeCl3/3.3%三氯乙酸溶液,然后混合转化并转移至测量比色杯中。在空白样品中,没有乙酰辅酶A。优选地,在本发明前述的测定体系中有用的具有S-乙酰辅酶A合成酶活性的生物催化剂具有的活性处在超过0.0005单位/mg蛋白质,更优选处在从0.001至例如15单位/mg蛋白质的区域,将1个单位定义为在37℃和pH7.5时下每分钟由乙酸盐、ATP和辅酶A形成1.0微摩尔S-乙酰辅酶A的生物催化剂的量。为了制备规模上测试辅酶A合成酶的活性,可以如下方式让反应(例如以7ml规模)在10.8Mm磷酸钠/1.4mM氢氧化钠缓冲液中开始和进行:制备7.4mM乙酸钠和0.75mM辅酶A的溶液并在37℃下温育15分钟。加入S-乙酰辅酶A合成酶,其要么来自Sigma,来自面包酵母的目录号A 1765,要么是要测试的生物催化剂(例如,0.2mg)和28.4mg ATP。然后将混合物(pH值大约为7.36)在石英比色杯中在37℃下温育并随时间变化测定所述混合物在232nm处的吸光度。例如,在该测定中发现每分钟形成大约1-600nmol或更多的乙酰辅酶A初始活性。如实施例中所述可有利地显示用于制备(甲基)丙烯酰辅酶A的这种优选活性(作为(甲基)丙烯酰辅酶A合成酶活性的效果)。优选地,在至少一种用于测定具有乙酰辅酶A合成酶活性的在本发明的过程和方法中特别有用的生物催化剂的形成乙酰辅酶A活性的测试体系中,在丙烯酸盐或甲基丙烯酸盐存在下形成甲基丙烯酰辅酶A或优选丙烯酰辅酶A的S-乙酰辅酶A合成酶的活性应超过10%,更优选超过50%。具有乙酰辅酶A合成酶活性的酶的例子有来自酵母,例如面包酵母(例如可从Sigma或Roche得到),来自细菌,例如肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum),来自高等动物,例如牛心或鸽肝或植物的乙酰辅酶A合成酶。
其它酶活性可以如本文所述和/或如在标准工作(如“Methods inEnzymology”系列,Academic Press(现属于Elsevier))中所述进行测定。
在提到酸时,这目的是包括游离酸以及其盐或其混合物,例如金属盐或铵盐等。在本公开中酸通常是指以相应的阴离子形式,例如丙烯酸盐或乙酸盐引用。
“(甲基)丙烯酰基”是指丙烯酰基和/(优选:)或甲基丙烯酰基。(甲基)丙烯酸是指丙烯酸和/(优选:)或甲基丙烯酸和/或它们的盐。(甲基)丙烯酰基是指丙烯酰基、甲基丙烯酰基或甲基丙烯酰基和丙烯酰基。
对于根据本发明方法生成的不含带正电荷(尤其包括可带电的)基团的丙烯酸和/或(优选或)甲基丙烯酸(或(甲基)丙烯酸)的酯(在本发明也称为丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯或(甲基)丙烯酸酯),“不含带正电荷基团”尤其是指不含带正电荷或可带正电荷的伯、仲或叔氨基或带正电荷的季氨基。优选的这样的酯是一种或(在不太优选的同样的生产方法或过程中)多种选自未取代的或取代的(甲基)丙烯酸C1-C20-烷基醇酯的(甲基)丙烯酸酯,其中C1-C20-烷基是未取代的或被一个或多个,尤其是至多3个,独立地选自羟基、C1-C7-烷氧基、C2-C7-烷酰氧基、C2-C7-烷酰氨基、氧代、氨基甲酰基、N-C1-C7-烷基氨基羰基、N,N-二-(C1-C7-烷基)-氨基羰基和C1-C7-烷氧基羰基的部分所取代,所述C1-C20烷基是线性的、被枝化一次或多次并且可以包含一个或多个双键;更优选的是(甲基)丙烯酸正丁酯(很优选的)、(甲基)丙烯酸乙酯(优选的)、(甲基)丙烯酸甲酯(优选的),或还有(甲基)丙烯酸的正丙基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、2-乙基丁基、正戊基、异戊基、1-甲基戊基、1,3-二甲基丁基、正己基、异庚基、1-甲基己基、2-乙基己基、硬脂基或2-羟基乙基酯,或(虽然不太优选的)两种或多种这些酯的混合物。高度优选的是尤其是丙烯酸还有甲基丙烯酸或者两者的正丁酯或乙酯。
在“不含带正电荷基团的醇”和优选用于本发明方法或过程的起始物的醇中,“不含带正电荷基团”尤其是指不含带正电荷的或可带正电荷的伯、仲或叔氨基或带正电荷的季氨基。优选的这样的醇是一种或在不太优选的同样的生产方法或过程中)多种C1-C20-烷基醇,其中C1-C20-烷基是未取代的或被一个或多个,尤其是至多3个独立地选自羟基、C1-C7-烷氧基、C2-C7-烷酰氧基、C2-C7-烷酰氨基、氧代、氨基甲酰基、N-C1-C7-烷基氨基羰基、N,N-二-(C1-C7-烷基)-氨基羰基和C1-C7-烷氧基羰基的部分所取代,所述C1-C20烷基是线性的、被枝化一次或多次并且可以包含一个或多个双键;更优选的是正丁醇(很优选的)、乙醇(优选的)、甲醇(优选的),或还有正丙醇、异丙醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇、2-乙基丁醇、正戊醇、异戊醇、1-甲基戊醇、1,3-二甲基丁醇、正己醇、异庚醇、1-甲基己醇、2-乙基己醇、硬脂醇或2-羟基乙醇,或(虽然不太优选地)两种或多种这些醇的混合物。高度优选的是正丁醇或乙醇。
在本发明进一步优选的实施方案中,本发明涉及一种生产(甲基)丙烯酸乙酯,尤其是丙烯酸乙酯,或(甲基)丙烯酸正丁酯,尤其是丙烯酸正丁酯(优选),或(甲基)丙烯酸甲酯,尤其是丙烯酸甲酯(优选的)的过程或方法,包括任选地或优选在催化剂存在下,使乙醇和/或正丁醇(优选的)和/或甲醇(优选的)和丙烯酰-辅酶A和/或甲基丙烯酰-辅酶A,优选丙烯酰辅酶A反应,所述催化剂可以是无机、有机或有机金属催化剂或更优选具有转移酶活性的生物催化剂,优选如上定义的生物催化剂,所述过程或方法在体外进行。或者,优选在体内进行相应的过程或方法。还优选部分在体外进行、部分在体内进行相应的过程或方法(例如,当首先在体内形成(甲基)丙烯酰辅酶A时,然后(例如,在细胞破坏后)在能够使醇基从如上下文定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的酶存在下在体外将丙烯酰辅酶A用于合成(甲基)丙烯酰酯,形成了本发明的优选实施方案。
本发明的另一优选实施方案涉及能够使醇部分从如上下文定义的醇起始物转在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的所述过程或方法在生物体,尤其是(更优选至少在其单细胞生命周期的一部分期间)微生物,优选如上定义的GMO。在一个进一步的实施方案中,所述生物体是完整的(尤其至少是如上定义的生存的),在另一个实施方案中所述生物体是遭破坏的或可透过的。
在本发明的另一优选实施方案中涉及一种如上所述的过程或方法,其中(甲基)丙烯酰辅酶A是通过辅酶A与(甲基)丙烯酸或它的盐在提供能量的物质,尤其是ATP,和具有合成酶活性,优选辅酶A合成酶(如S-乙酰辅酶A合成酶)活性的生物催化剂存在下反应而得到的。优选地,两个反应((甲基)丙烯酰辅酶A形成和之后的转移至醇)在一锅中进行,优选在至少部分重迭时间段内进行,更优选地同时进行。或者,优选进行一锅反应,以便首先发生由具有合成酶(尤其是S-乙酰辅酶A合成酶)活性的生物催化剂催化的反应并随后采用能够使醇部分从如上下文定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的生物催化剂,将可得到的产物((甲基)丙烯酰辅酶A)转化为(甲基)丙烯酸乙酯,尤其是丙烯酸乙酯,(甲基)丙烯酸甲酯,尤其是丙烯酸甲酯或者优选(甲基)丙烯酸正丁酯或其它丙烯酸酯(优选的)。
更优选的是其中生物催化剂是具有各自活性的酶,尤其是多肽的所有上下文所述的过程和方法,
甚至更优选的是上下文所描述的任何过程或方法,其中(甲基)丙烯酰辅酶A是代谢产生的,尤其是从一种或多种来源于生物质(尤其是如上所述)的起始物代谢产生的。
很优选的是如上下文所述的任何方法,其中甲基丙烯酰辅酶A和/或(优选)丙烯酰辅酶A的生产以代谢方式发生(例如,来自游离的甲基丙烯酸盐和/或丙烯酸盐或者经由其它的代谢前体,如乳酰辅酶A)并且在所选择的醇起始物存在下,或在每一种情况下用于源于生物质的生物合成的起始物,利用能够将醇部分从如上下文定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的生物催化剂转化为产物,是通过优选在基因修饰的生物体(GMO)中进行的,即只要有必要或有愿望,将所述生物修饰以包含所需的生物催化活性,以及当需要时,包括转运剂。优选地,这种方法在体内发生。
进一步很优选的方法是以连续方式进行如上所述的生物转化,其中将所选择的醇加入到含有生物质的反应器,所述生物质具有如上所述的根据本发明的过程或方法所描述的合成能力,利用连续除去顶空蒸气,将这些蒸气进行分馏并将釜脚返回至反应器。
就采用一种或多种核酸转化的GMO来说,所述核酸包含一个或多个编码并允许能够使醇部分从如上下文定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的生物催化剂表达的区,本发明优选涉及此这样的GMO,其是昆虫、昆虫组织或优选是昆虫组织;植物或植物组织;或优选(至少在它的单细胞生命周期的部分)微生物,尤其是原核微生物或真菌微生物,最优选细菌或酵母,其中包含多个编码具有所述活性的生物催化剂的区中的一个的核酸是重组的核酸。
优选的方法是采用如上述段落中的一个中所述的GMO,其中进一步存在一种或多种核酸,所述核酸包含一个或多个编码能够使醇基从如上下文定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的生物催化剂的区,存在一种或多种(在一种优选实施方案中还有重组的,在另一种实施方案中,为外源性的)核酸,所述核酸包含一个或多个编码并允许(S-乙酰辅酶A)合成酶表达的区。
本发明的进一步的实施方案呈现在权利要求中,优选在从属权利要求中,因此将其通过参考文献包括在本文中;其中任何一种或多种表述相互独立地可以用说明书中提供的更具体的定义来替代,因而还产生了本发明的更优选的实施方案。
本发明特别涉及在实施例和/或在那里描述的过程和反应条件中提到的酶用于丙烯酰辅酶A或甲基丙烯酰辅酶A以及丙烯酸乙酯、丙烯酸甲酯和丙烯酸正丁酯合成目的的用途。
实施例
下列实施例用于举例说明本发明,而不限制其保护范围。H-CoA是指游离形式的辅酶A(具有SH基团),CoA是指经由没有氢的-S-连接的相应的自由基。
实施例1:丙烯酸乙酯的体外合成
a)分批加料的丙烯酰辅酶A的制备:
用于以3.5ml体积从丙烯酸盐和H-辅酶A制备丙烯酰辅酶A的起始反应混合物:在3.3g/100ml TRIZMA氢氯化物(三(羟甲基)氨基甲烷氢氯化物,Sigma)和0.49g/100ml TRIZMA碱中进行反应(pH 7.12,在37℃下)。反应混合物的其它组分如下:
组分 | 浓度(mM) |
MgCl2.6H2O | 10 |
丙烯酸钠 | 150 |
ATP | 5 |
H-辅酶A | 1 |
加入S-乙酰辅酶A合成酶(来自面包酵母的乙酸硫激酶,Sigma,Saint Louis,Missouri,USA;目录号1765)(1.9mg/ml)。采用分批加料方法,即分步加入(进料)H-辅酶A,在5、10、15和20分钟之后加入H-辅酶A的等分试样,每次将反应器中H-辅酶A和ATP的浓度增加1mM。在25分钟后,萃取0.154ml样品(留下3.6ml反应混合物)并通过HPLC分析其乙酰辅酶A(仪器:Agilent Technologies HP1090L,其带有HP1100可变波长UV检测器和Chemstation(rev.A.06.01)数据系统;柱子:来自Phenomenex的Luna C18,25cm×4.6mm内径,珠直径5μm;流动相:A:25mM甲酸铵(pH 7.0),B:甲醇;梯度5%B持续0min,然后在20min内转变到30%B;流速1ml/min(大约130巴),炉温40℃,检测器:UV,在254nm处;注射体积5μl,运行时间28min;在下列保留时间处发现峰:ATP在大约3.7min时,辅酶A在大约10.5min时,乙酰辅酶A在大约14.4min时,丙烯酰辅酶A在大约17.5min时,双加成物在大约15.9min时。
在25分钟后,HPLC分析测定25分钟后形成了0.128%丙烯酰辅酶A。
b)丙烯酸乙酯的制备
分批的丙烯酸乙酯的制备
使用3.6ml在实施例1中制备的含有0.128%丙烯酰辅酶A的反应混合物,从乙醇和脂肪酶制备丙烯酸乙酯的起始反应混合物。反应在37℃进行。反应混合物的组分如下:
组分 | 量 |
0.128%丙烯酰辅酶A溶液 | 3.60ml |
脂肪酶(Novozyme 435) | 0.36g |
99%乙醇 | 0.24ml |
首先将0.36g脂肪酶(固定化的Novozyme 435;Sigma)加入到3.6ml丙烯酰辅酶A溶液(0.128%)中。将脂肪酶混合到所述溶液中并加入0.24ml乙醇。在37℃温育混合物并在1、2、3和19小时取样。通过顶空-GC分析来分析样品中丙烯酸乙酯的形成并且在3小时后丙烯酸乙酯的浓度是12ppm。
实施例2:
按照实施例1a中描述的方法制备0.078%丙烯酰辅酶A的溶液。按照实施例1加入Novozym 435(来自由深层发酵通过基因修饰的米曲霉(Aspergillus oryzae)微生物并吸附在大孔树脂上而产生的南极假丝酵母的脂肪酶B;Novozyme Corp.,Bagsvaerd,Denmark)(100mg/ml)和正丁醇(51mg/ml)以及在37℃,3小时后测定丙烯酸正丁酯的浓度是3.2ppm。
实施例3:
按照与实施例1a中所述方法类似的方法制备处于890ppm浓度下的丙烯酰辅酶A的溶液,但是在水中制备并且使1/3量的S-乙酰辅酶A合成酶。按照实施例1b向该溶液中加入44mg/ml乙醇和100mg/mlNovozym 435。在37℃、2小时后发现丙烯酸乙酯的浓度是16.4ppm。
实施例4:
按照实施例3制备处于1260ppm浓度下的丙烯酰辅酶A溶液并向其中加入44mg/ml乙醇和100mg/ml脂肪酶B。在37℃、2小时后丙烯酸乙酯的浓度是4.8ppm。
实施例5:
重复实施例4,但是用来自柱状假丝酵母(Alphamerix Ltd)的脂肪酶C2代替所述酶,得到丙烯酸乙酯的浓度为1.4ppm。
实施例6:
用来自荧光假单胞菌的脂肪酶(Alphamerix Ltd)代替实施例4中的Novozym 435,导致丙烯酸乙酯导致的浓度是7.3ppm。
实施例7:
按照实施例3制备浓度为1460ppm的丙烯酰辅酶A。按照实施例1b所述进行酯化,但是用来自曲霉属的L-氨酰基酰化酶代替Novozym435并且导致丙烯酸乙酯浓度22.7ppm。
实施例8:
重复实施例7,但是使用来自米曲霉的蛋白酶产生浓度为50.1ppm的丙烯酸乙酯。
实施例9:
使用甲醇代替实施例7中的乙醇并使用Novozym 435作为生物催化剂产生浓度为17.4ppm的丙烯酸甲酯。
实施例10(对照)
除去实施例3中的Novozym 435导致没有形成可检测水平的丙烯酸乙酯。
Claims (22)
1、一种生产不含带正电荷基团的丙烯酸和/或甲基丙烯酸的酯的过程或方法,所述过程包括在催化剂的存在下,使不含带正电荷基团的一种或多种醇与丙烯酰辅酶A和/或甲基丙烯酰辅酶A反应,所述催化剂能够使醇基从如上定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A。
2、根据权利要求1的过程或方法,其中所述催化剂是能够使醇基从如在权利要求1中定义的醇起始物转移的生物催化剂。
3、根据权利要求1或2的过程或方法,其是在体外进行的。
4、根据权利要求1或2的过程或方法,其是在体外进行的。
5、根据权利要求1或2的过程或方法,其是部分在体内和部分在体外进行的。
6、根据权利要求1-5任意一项的过程或方法,其中所述生物催化剂在生物体内,尤其是在(优选至少在单细胞的生命周期的一部分期间)微生物内。
7、根据权利要求6的过程或方法,其中所述生物是完整的。
8、根据权利要求6的过程或方法,其中所述生物是遭破裂的。
9、尤其是根据权利要求1、2、3、5或8中任意一项的过程或方法,其中所述能够使醇基从如在权利要求1中定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的生物催化剂是以至少部分纯化的形式存在的。
10、根据权利要求1-9任意一项的过程或方法,其中丙烯酰辅酶A和/或(甲基)丙烯酰辅酶A是通过使辅酶A与(甲基)丙烯酸或它的盐在提供能量的物质,尤其是ATP,和具有合成酶活性,尤其是辅酶A合成酶活性的生物催化剂存在下反应而得到的。
11、根据权利要求10的过程或方法,其中所述合成酶活性是S-乙酰辅酶A合成酶活性。
12、根据权利要求10或11的过程或方法,其中通过能够使醇基从如在权利要求1中定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的生物催化剂催化的反应和通过具有合成酶活性的生物催化剂催化的反应在一锅中,优选在至少部分重迭的时间段,最优选在同一时间段内进行。
13、根据权利要求12的一锅过程或方法,其中首先发生由具有合成酶活性的生物催化剂催化的反应,随后采用能够使醇基从如在权利要求1中定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的生物催化剂将可得到的产物转变为酯产物。
14、根据权利要求1-13中任意一项的过程或方法,其中所述生物催化剂是酶,尤其是具有各自的活性的多肽。
15、根据权利要求1-14中任意一项的过程或方法,其中(甲基)丙烯酰辅酶A前体是代谢产生的,尤其是从一种或多种源于生物质的前体代谢产生的。
16、根据权利要求1-15中任意一项的过程或方法,其中甲基丙烯酰基辅酶A和/或(优选地)丙烯酰辅酶A是代谢产生的并且在如权利要求1中定义的醇存在下,利用能够使醇基从如权利要求1中定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的生物催化剂进行转变,或者在每一种情况下,源于生物质的生物合成的起始物向产物的转变是通过优选地在基因修饰的生物体(GMO)中进行的,只要有必要或者有愿望,将所述有机体改性以包括所需要的生物催化活性并且如果需要的话,包括转运分子。
17、根据权利要求1-16中任意一项的过程或方法,其中将反应混合物上的蒸气连续地除去并进行分馏。
18、根据权利要求1-17中任意一项的过程或方法,用于生产一种或(在不太优选的同一种生产方法或过程中)多种选自未取代的或取代的(甲基)丙烯(酸)C1-C20-烷基醇酯的(甲基)丙烯(酸)酯,其中C1-C20-烷基是未取代的或者被一个或多个,尤其是至多3个独立地选自羟基、C1-C7-烷氧基、C2-C7-烷酰氧基、C2-C7-烷酰基氨基、氧代、氨基甲酰基、N-C1-C7-烷基氨基羰基、N,N-二-(C1-C7-烷基)-氨基羰基和C1-C7-烷氧基羰基的部分所取代,所述C1-C20-烷基是线性的、被枝化一次或多次并且可以包含一个或多个双键;更优选的是(甲基)丙烯酸正丁酯(很优选的)、(甲基)丙烯酸乙酯(优选的)、(甲基)丙烯酸甲酯(优选的),或者还有(甲基)丙烯酸的正丙基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、2-乙基丁基、正戊基、异戊基、1-甲基戊基、1,3-二甲基丁基、正己基、异庚基、1-甲基己基、2-乙基己基、硬脂基或2-羟基乙基酯,或(尽管不太优选地)两种或多种这些酯的混合物;当作为醇起始物时,选自C1-C20-烷基醇的一种或多种,优选一种醇是线性的、被枝化一次或二次并且可以包括一个或多个双键,其中C1-C20-烷基是未取代的或被一个或多个,尤其是至多3个,独立地选自羟基、C1-C7-烷氧基、C2-C7-烷酰氧基、C2-C7-烷醇基氨基、氧代、氨基甲酰基、N-C1-C7-烷基氨基羰基、N,N-二-(C1-C7-烷基)-氨基羰基和C1-C7-烷氧基羰基的部分所取代;更优选正丁醇(很优选的)、乙醇(优选的)、甲醇(优选),或者还有正丙醇、异丙醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇、2-乙基丁醇、正戊醇、异戊醇、1-甲基戊醇、1,3-二甲基丁醇、正己醇、异庚醇、1-甲基己醇、2-乙基己醇、硬脂醇或2-羟基乙醇,或(尽管不太优选)两种或多种这些醇的混合物;其中正丁醇或乙醇或甲醇是高度优选的。
19、被一种或多种核酸转化的基因修饰的生物体(GMO),所述核酸包含一个或多个区,所述编码并且允许能够使醇基从如权利要求1中定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的生物催化剂的表达。
20、根据权利要求19的GMO,其中进一步存在一种或多种核酸,所述核酸包含一个或多个区,所述区编码并且允许能够使醇基从如权利要求1中定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的生物催化剂的表达,存在一种或多种核酸包含一个或多个编码并且允许S-乙酰辅酶A合成酶的表达的区。
21、根据权利要求19或20的GMO用于生产丙烯酸正丁酯、丙烯酸乙酯和/或丙烯酸甲酯的用途,其包括向所述微生物的培养物给予一种或多种合适的源于生物质的起始物并且分离所得的产物。
22、能够使醇基从如权利要求1或18中任意一项中定义的醇起始物在除去辅酶A部分下转移至(甲基)丙烯酰辅酶A的生物催化剂在体外和/或体内进行使甲基丙烯酰和/或丙烯酰部分从甲基丙烯酰和/或丙烯酰辅酶A转移到在权利要求1或优选地在权利要求18中定义的醇的用途。
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